一种用于外源性化合物毒理学评价的动物实验替代方法 一、技术领域
本发明涉及一种生物组织的细胞分离培养方法及其用途，尤其是新生大鼠(或小鼠)肝细胞的分离培养及其作为替代动物实验模型用于外源性化合物毒理学评价的方法。
二、背景技术
肝脏是生理和病理状态下药物代谢的重要器官，通过肝脏代谢后，许多内源性和外源性的物质对生物体地毒性作用被消除，作为这个生物转化过程的重要发生器官，肝脏就必然成为毒理研究中的重要靶器官。同时，肝脏也是承受外源化合物毒性攻击的首要器官，外源毒性化合物引起的肝损伤非常普遍。作为肝脏的主要成分(占肝脏重量90％)和主要功能执行者的肝细胞，对外源化合物的毒性非常敏感，是外源化合物毒性评价和代谢预测的理想模型。传统的毒理学评价方法，主要采用整体动物(如小鼠、大鼠和犬等)实验，不仅耗费大量人力财力，实验周期长，限制了检测效率，且不适用于小量试品的研究。在毒性评价中如何贯彻实验动物替代的3R原则(替代、减少和优化)特别是开展替代方法的研究和推广是国际上非常关注的问题。另外，动物保护主义的呼吁也推动了替代整体动物进行毒性评价的实验方法研究。因此，研究替代动物试验的方法势在必行。
三、发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种用消化液消化简单易行，能得到90％以上均一、稳定、敏感性高的肝实质细胞而且耗费人力财力少，实验周期短，检测效率高，适用于小量试品毒性评价研究的体外培养方法，以解决现有技术用整体动物(如小鼠、大鼠和犬等)实验的缺点。为此，本发明采取以下技术方案：
一种简单易行，能得到90％以上均一、稳定、敏感性高的肝实质细胞体外培养方法，而且耗费人力财力少，实验周期短即可获得肝实质细胞的体外培养方法。原代肝细胞分离无需特殊装置，易于开展。得到的肝细胞可以很好的模拟体内肝脏的生理环境，且排除血液、神经、体液等因素的影响，生长环境易于人工严格控制，兼备了体外试验和整体动物试验的优点；原代肝细胞还具有体内肝细胞的一些功能及活性，特别是保留有药物代谢酶(细胞色素P450氧化酶)的活性，增加了原代肝细胞的研究价值。在研究外源性化合物的生物活性、毒性、毒理机制、代谢命运和致癌性检测等方面被认为是化合物毒性预测的可靠模型。此外，肝细胞的代谢功能使其对外源性化合物的毒性较其他细胞更为敏感，同时冻存技术的不断成熟，增加了肝细胞试验的灵活性，保证了试验的可重复性。
现有技术中，是用成年动物(如小鼠、大鼠等)采用肝脏灌流的方法分离肝细胞，在实验中我们发现用上述方法得到的肝细胞量少、成活率低且实验重复性差。而用本发明得到的肝细胞成活率可以达到90％以上，且得到的细胞均一、稳定、敏感性高且易于人工控制。
一种用消化液消化简单易行、能得到90％以上均一、稳定、敏感性高且易于人工控制的肝实质细胞的体外培养方法，具体制备方法如下：
取1-3日龄的SD大鼠肝脏，通过消化液消化的方法，从肝脏分离肝实质细胞，用于外源化合物毒性评价，以替代整体动物实验。
本发明与现有技术相比具有如下优点：(1)用消化液消化简单易行，能得到90％以上均一、稳定、敏感性高且易于人工控制的肝实质细胞；(2)耗费人力财力少，实验周期短，检测效率高；(3)适于小量外源化合物毒性评价和代谢预测研究；(4)与整体动物实验毒性评价结果具有良好的相关性。
四、附图说明
图1为实施例1所得到的原代肝细胞
图2为实施例2肝细胞毒性检测中损伤的肝细胞
五、具体实施方式
实施例1：原代肝细胞的分离培养
1.1准备以下材料：
1.1.1RPMI-1640(GIBCOTM产品，Lot 2535081)培养液
1.1.2胎牛血清：杭州四季青生物工程材料有限公司
1.1.3胰蛋白酶：AMRESCO产品，Lot 3002B69
1.1.4实验动物：1-3日龄SD大鼠由浙江省实验动物中心提供。
1.2制备方法按如下步骤：
1.2.1实验前各器材高压灭菌后，放超净台紫外照射30分钟。
1.2.2取乳鼠置75％酒精浸泡消毒后，将乳鼠腹部向上固定在泡沫板上，先用碘酊棉球消毒，再用酒精棉球脱碘。
1.2.3取出第一套器材(两个镊子)，用两把镊子拉开皮肤；然后换用第二套器材(镊子和剪刀)，用两把镊子撕开腹肌，剪取肝脏，放入青霉素瓶中。
1.2.4加入适量PBS冲洗血污，至少两次。去掉大部分冲洗液，剪碎肝脏完全去掉冲洗液，进一步剪细肝脏(1mm3)，用PBS将附于剪刀上的肝组织冲到瓶里，把组织液移入离心管，用滴管反复吹打，用3000rpm离心5min。
1.2.5吸弃上清液，加入5倍量的胰酶-EDTA消化液，吹打混匀放入CO2培养箱中30分钟，使细胞分散。
1.2.6加1640培养液(含10％血清)至10ml，吹打混匀，3000rpm离心，5min。弃上清，加2ml培养液，吹打混匀，过100目筛，收集细胞悬液于平皿中，后转移至10ml离心管中，于37℃培养15min。
1.2.7培养结束后，放置冰水中冷却20min。然后用200目筛过滤滤液，再用PBS(或1640)清洗3次，每次清洗用1640重悬，即可得到肝实质细胞悬液。
1.2.8用1640培养液调整细胞浓度至5×105cell/ml，于细胞瓶或培养板中37℃培养8小时左右即可贴壁成单层。
实施例2：化合物毒性检测
2.1准备以下材料：
2.1.1RPMI-1640(GIBCOTM产品，Lot 2535081)培养液
2.1.2胎牛血清：杭州四季青生物工程材料有限公司
2.1.3试验药液(用培养液稀释)
2.1.4MTT(AMRESCO产品，Lot 3544B04)
2.1.5DMSO(分析纯)
2.2制备方法按如下步骤：
2.2.1取分离的新生鼠原代肝细胞于37℃下培养贴壁后，弃去培养液，分别加入不同浓度(3-6个梯度)的试验药液(用培养液稀释)各200μl，每一浓度各设6个复孔，同时设溶剂对照。
2.2.2继续培养48h后：(1)肉眼观察细胞存活情况；(2)吸取细胞上清100μl作为检测样本，按试剂盒说明检测AST和ALT活性；(3)每孔加入10μl MTT(5mg/ml)，作用4h，吸弃上清，加入150μl DMSO，震荡混匀，在570nm波长下，用酶标仪测定吸光度A值，并计算LC50值。
2.2.3根据肉眼观察存活情况、AST/ALT、A值或LC50值综合判断试验样品对原代肝细胞的毒性强弱。根据实际需要，设计试验样品的浓度梯度。