一种能提高酵母含油量的植物脂酰辅酶A合成酶基因及其应用.pdf

本发明公开了一种提高酵母油脂含量的基因及应用，所说的基因是油菜长链脂酰CoA合成酶基因PXT143，它具有SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列，其编码的蛋白质具有SEQ?ID?NO.2所示的氨基酸序列。本发明通过酵母互补实验证明PXT143编码蛋白具有长链脂酰CoA合成酶活性；在重要油料作物油菜中的时空表达谱以及在不同含油量油菜中的表达差异分析显示，在不同时期高含油量品种中PXT143表达水平显著高于低含油量品种；运用基因工程技术提高PXT143表达量显著提高酵母油脂含量。表明PXT143编码的蛋白具有明显提高酵母油脂含量的功能。

1.  一种脂酰辅酶A合成酶基因PXT143，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.  一种由权利要求1所述基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.  含有权利要求1所述的PXT143基因序列的质粒pYES2-PXT143，其特征是PXT143基因片段插入到质粒pYES2的KpnI和Xba I的酶切位点之间。

4.  权利要求1所述的基因在提高酵母含油量中的应用。

5.  根据权利要求4所说的应用，具体是：构建酵母表达载体pYES2-PXT143转化到酵母菌株中，使PXT143在酵母中过量表达。

一种能提高酵母含油量的植物脂酰辅酶A合成酶基因及其应用
技术领域
本发明属于基因工程领域。具体的说，是涉及一种提高酵母含油量的基因，采用分子生物学方法，从油菜中分离克隆脂酰辅酶A合成酶基因(PXT143)；通过在酵母过量表达及其在不同含油量油菜品种中表达谱的分析，证明PXT143具有显著提酵母含油量的功能，并且显示在提高油料作物含油量方面起着重要的作用。本发明还涉及含有该基因的载体和涉及利用该基因提高酵母在工业生产中的应用。
背景技术
我国年消耗食用植物油2000万吨，进口1000万吨，已是世界上最大的油料进口国；年消耗石油近4亿吨，进口1.19亿吨(中华人民共和国中央人民政府门户网站，http://www.gov.cn)，石油为不可再生资源，全球的石油资源正日渐枯竭！目前，世界各国正在寻找清洁、环保和可再生的新能源，其中生物能源首当其冲。美国生物能源目前占整个能源消耗的5％，超过了水利发电的比例。美国能源部和农业部2005年提出研究报告，拟通过增加农作物产量和森林产量，在2030年以前达到年产100亿吨生物质用作生物能源，解决本国5％的电力供应、20％的交通燃油和25％的化工原料(http://www.eere.energy.gov/biomass/publications.html)。根据2001年欧盟的提议，到2020年，欧洲生物燃料替代矿物燃料的比例要达到20％。我国制定了以可再生能源代替化石能源的中长期能源发展战略，其中生物能源是今后重点发展方向之一。
目前，无论是食品油脂还是生物柴油原料油脂，其主要来源现在仍然是植物以及动物脂肪，这已经不能完全满足人们的食用和生活中各种油脂的需求。开辟微生物油脂这一新的油脂资源的开发和研究，不仅会丰富传统的油脂工业技术，而且也将是工业化生产油脂的一个重要途径。
微生物油脂(microbial oils)又称单细胞油脂(SCO：single cell oil)，是由酵母和藻类等微生物在一定的条件下，利用碳水化合物、碳氢化合物和普通油脂作为碳源，在菌体内产生的大量油脂。利用微生物生产油脂，与传统的油脂生产工艺相比除具有油脂含量高外，还有许多优点，如微生物细胞增殖快，生产周期短；生长所需的原料丰富，价格便宜，如淀粉、糖类、特别是食品工业和造纸行业的废弃物都可以加以利用，从而保护了环境；用微生物方法生产油脂，比农业生产油脂所需的劳动力少，同时不受季节、气候变化的限制；能连续大规模生产，生产成本低；并且可以利用细胞融合、细胞诱变等高科技方法，使微生物生产出比动、植物油脂更符合人们需要的高营养油脂或某些特定脂肪酸的油脂。
目前，微生物油脂已成为获取高附加值脂肪酸(Certic and Shimizu，1999)，如λ-亚麻酸(GLA)(Somashekar et al，2002)、花生四烯酸(ARA)(朱法科等，1999)、二十碳五烯酸(EPA)(Bajpai et al，1991)、二十二碳六烯酸(DHA)(Singh and Ward，1997)等的重要原料，而且，由于某些微生物油脂在脂肪酸组成上同植物油，如菜籽油、棕榈油、大豆油等相似，富含饱和和低度不饱和的长链脂肪酸，是生产生物柴油(Bio-diesel)的潜在原料。
尽管现在对产油微生物TAG生物合成和代谢调控机制的研究已取得了重要进展，但国内尚未见成功地通过基因调控手段增加细胞内油脂贮存含量的例子。因此，微生物产油脂领域具有广阔的研究发展空间。
中国有十多种油料作物，世界上有数十种油料作物，油料植物种子和酵母在油脂合成上有着相似的代谢途径，充分发掘和利用在植物中广泛存在的含油量相关基因，来应用于微生物和油料作物油脂含量的提高。以基因工程技术为代表的现代分子生物学的最新研究在产油微生物中的应用可以进一步提高油脂含量，降低产脂微生物培养成本，这对加快微生物油脂产业化有巨大的促进作用。
目前，人们已经分离克隆了编码油脂合成途径中各种酶的众多基因，尝试通过提高或降低其中关键酶的活性来提高生物产油量。丙二酸单酰辅酶A是脂肪酸合成的底物之一，增加乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)的表达量或活性，可能提高脂肪酸含量，但未做深入研究；在质体中，ACCase是由四个不同亚基构成的异聚体酶复合物。在烟草中过量表达ACCase的一个亚基-生物素羧化酶(biotin carboxylase)，使该亚基的含量提高了三倍，其它三个亚基的含量没有明显变化，但是脂肪酸的含量和成份没有明显改变(Shintani et al.1997)。脂肪酸合成酶复合体中的3-酮脂酰-ACP合成酶KASIII是脂肪酸合成的一个限速酶(Jaworski，Post-Beittenmiller et al.1989)。但是，在植物种子中过量表达KASIII只能引起种子中不饱和脂肪酸的轻微改变(Verwoert et al.1994；Tai et al.2001)。目前虽然没有过量表达脂肪酸合成酶的所有亚基，但上述研究结果及其他实验室的研究表明，脂肪酸的合成是一个复杂的代谢过程，改变非关键基因的表达不能够有效地提高脂肪酸的含量。
在高等生物中，长链酰基辅酶A合成酶(LACS，EC6.2.1)在油脂的合成代谢中发挥着重要的作用。其主要功能是酰基转移酶利用脂肪酰辅酶A和甘油-3-磷酸作为底物，通过Kenedy循环合成三酰甘油(TAG)。在这个过程中，LACS在提供脂肪酰辅酶A底物和连接脂肪酸从头合成和TAG装配的过程中，发挥了重要的作用(Ohlrogge 1997)。LACS所催化的反应具有两步机制：首先，游离脂肪酸同ATP反应生成腺苷化的中间体；然后，该中间体和辅酶A(CoA)的硫酯键结合，生成酰基辅酶A(Groot PH 1976)。在发育中的水稻种子中，开花后12天(DAF)之前，TAG含量的增加同LACS活性的增加相一致。在水稻种子发育阶段，对于TAG的生物合成，LACS活性是必需的。并且，LACS同TAG的含量和种类相关。LACS的另一功能是活化脂肪酸，从而进行β-氧化。在真核生物中，脂肪酸最终被降解生成乙酰辅酶A，乙酰辅酶A再进一步被氧化，为新陈代谢提供能源。在油料作物中，以三酰甘油TAG为主要贮存形式的油脂类，首先经过脂肪酶催化水解为甘油和游离脂肪酸。在细胞内游离脂肪酸具有毒性，需要经LACS活化成为无毒的脂酰辅酶A，在进入β-氧化途径。种子在萌发期间，通过β-氧化循环，脂肪酸最终降解成乙酰辅酶A的形式供给幼苗的生长。一系列证据显示它可能是油脂合成的重要基因(Shockey 2002)。
本发明以产油微生物酵母和油料作物油菜两类生物为研究对象，通过控制脂肪酸合成途径中长链脂酰CoA合成酶的活性强弱来调节脂肪酸代谢速率，从而达到提高油脂含量的目的。在研究中，我们采用电子克隆法从甘蓝型油菜中克隆到一种新的长链脂酰CoA合成酶基因PXT143，将其应用于酵母产油生物中，进一步确定了其具有显著提高酵母油脂含量的功能。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高酵母含油量的基因，以及该基因编码的蛋白。
一种脂酰辅酶A合成酶基因PXT143，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
由上述基因PXT143编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的另一个目的是提供该基因在提高酵母含油量中的应用。通过PXT143基因，构建酵母表达载体pYES2-PXT143转化到酵母菌株中，使该基因在酵母中超量表达具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白质，来达到提高酵母含油量的目的。
本发明还公开了含有PXT143基因序列的质粒pYES2-PXT143，PXT143基因片段插入到质粒pYES2的KpnI和Xba I的酶切位点之间。
所说的基因PXT143的克隆方法如下：
(1)通过电子克隆技术获得PXT143基因拼接序列，即首先以拟南芥LACS1(AtLACS1)为探针序列局部对比查询(BLAST)甘蓝型油菜B.napus DNA数据库，得到一组具有高度相似性的序列表达标签(EST)，再通过DNAStar SeqMan软件把这些EST拼接成为一个长度为1641bp的片段。与AtLACS1序列比对，发现该序列具有开放阅读框(ORF)的起始密码子(ATG)；
(2)以甘蓝型油菜(B.napus)花组织的cDNA为模板，以上述步骤(1)中得到的拼接序列为核心序列，通过3’RACE PCR获得了一个长度为821bp的片段。该片段具有43nt长的poly(A)⁺尾巴，并与核心序列具有124bp的重叠，再通过SeqMan软件与核心序列拼接，然后从开放式阅读框(ORF)两侧设计引物，以B.napus花组织的cDNA为模板PCR扩增，获得了长度为2334bp的全长cDNA，命名为PXT143。
通过DNAStar程序进行序列结构分析，发现PXT143最终编码一个长链酰基辅酶A合成酶蛋白，理论pI为6.31，相对分子质量估测为74.54Kda。序列比对显示PXT143在核苷酸水平与AtLACS1具有88％的序列相似性，预测的氨基酸序列同AtLACS1具有89.5％的相似性，与其他植物的LACS或推定的LACS的相似度低于50％。PXT143与一些来自植物，哺乳动物和微生物的其它LACS或预测LACSs的多重序列比对显示在各种生物体中存在三种保守基序。三个blocks出现在这些多肽中和AMP-连接基序-I(Taylor，Barton et al.)[YF]TSG[TS][ST]GXPK，GYGXTE和GW[FL][HK][IVL]G-规则的定位于Block I-III。PXT143上479位置上保守的酪氨酸残基推测与腺苷酸生成有关(图1.A)(Pavela-Vrancic，Pfeifer et al.1994；Fulda，Heinz et al.1997)。比对PXT143，AtLACS1和拟南芥酰基-CoA合成酶At5g36880中心序列，显示PXT143含有一个38个氨基酸残基长度的连接域(图1.B)。这个结果与目前的研究一致(Shockey，Fulda et al.2002)。
通过酵母互补表达系统实验性地证明了PXT143编码LACS活性蛋白。首先把PXT143cDNA克隆到酵母表达载体pYES2中，转化LACS活性缺陷型酵母(S.cerevisiae)菌株YB525中，以pYES2空载体转化酵母YB525作为负对照，来验证PXT143是否具有补救缺陷型的能力(Black and DiRusso 2007)，然后转化子培养在含有18:0脂肪酸作为唯一碳源的缺省尿嘧啶液体培养基(去氨基酸的酵母培养用酵母氮碱(0.67％)，省却尿嘧啶混合物(0.077％))中，30℃培养84h至对数期中期。结果显示，转化pYES2空载体的酵母细胞不能生长或生长受到严重抑制(图3)，转化pYES2-PXT143的转化子正常生长，能够补救酵母LACS活性缺陷，表明PXT143编码LACS活性蛋白。
进一步确定了PXT143可利用的底物种类，从而说明PXT143是否能够参与油脂代谢过程。实验中利用不同脂肪酸(分别为12:0、14:0、16:0、18:0、18:1和22:1)作为唯一碳源的缺省尿嘧啶液体培养基培养转化细胞，经84h培养到对数期中期。结果显示，转化pYES2-PXT143的酵母细胞可以在含有4:0、16:0、18:0、18:1和22:1脂肪酸的缺省尿嘧啶液体培养基上正常生长，而在含有12:0脂肪酸的培养基上不能生长；转化pYES2-PXT143转化子的生长速率明显高于转化pYES2空载体的转化子(图3)；在利用不同脂肪酸作为碳源的培养基上，转化pYES2-PXT143酵母的生长速率也不相同，在含有22:1脂肪酸的培养基上，生长速率最高，如上依次为在含18:0、16:0、18:1和14:0脂肪酸的培养基上。这些结果显示PXT143优先选择长链与饱和的脂肪酸作为底物，长链与饱和的脂肪酸是油料作物种子储存性油脂的主要成分，这说明PXT143能够参与油料作物油脂代谢过程。
为了确定PXT143提高油脂含量的功能，一方面，我们调查了PXT143在油料作物中的生物学功能，实验中采用RT-PCR在油菜的幼苗期和成株期进行组织特异性表达分析，结果显示在成熟的花和茎组织中PXT143高度表达，在萌发的幼苗中不表达(图4)。为了研究BnLACS1表达水平和油菜种子含油量的关系，选用了6个含油量不同的油菜品系EM91、EM97、EM98、EM86、EM71和EM102(含油量分别为29.62％、29.25％、28.47％、50.56％、48.78％和50.59％)35DAF的种子对PXT143进行RT-PCR表达分析。如图5所示，在发育中的种子中，PXT143的表达量不同，最高的表达量出现在高含油量品系EM86中；进一步使用油菜高含油量品系EM102和低含油量品系EM91，在开花后不同时期对PXT143进行实时定量PCR表达分析，结果显示，在开花后45天内高含油量品种EM86种子PXT143表达水平显著高于低含油量EM98种子，在开花后35天内表达量达到低含油量EM98的2.5-2.6倍(图6)。以上结果说明PXT143是参与种子油脂积累的重要基因。
另一方面，我们把PXT143克隆到酵母表达载体pYES2中，转化酵母菌株PEP4，以pYES2空载体转化酵母PEP4作为负对照，酵母PEP4为尿嘧啶缺陷型，是一种蛋白水解酶缺陷型菌株。转化子培养在葡萄糖作为唯一碳源的缺省尿嘧啶液体培养基中，30℃培养24h至对数期，集菌。利用半乳糖作为唯一碳源的缺省尿嘧啶液体培养基诱导4h，然后在YPD培养基培养24h，集菌，进行苏丹黑染色，在紫外分光光度计以OD₅₆₀nm测定，结果显示pYES2-PXT143转化子吸光度明显高于负对照(图7)；通过GC法测定酵母总脂肪酸含量，结果显示，与对照酵母相比，PXT143转基因酵母能够使油脂含量提高31.87％(图8)。这些结果表明PXT143具有显著提高酵母油脂含量的功能。
本发明的优点：
1、基于电子克隆技术从cDNA中克隆基因速度快、效率高。许多油合成相关基因或数量性状基因座(QTL)(quantitative trait locus)都是通过传统图位克隆法克隆得到，首先必须构建一个很好的群体，如重组自交系，DH群体或近等基因系等，再上大量标记，通过基因与标记的共分离，逐渐缩小目标区段，是一个耗时耗力的过程。而通过电子克隆法技术克隆基因简便快捷，完全从另一个不同的角度，打开了克隆油合成相关基因的一扇窗。
2、虽然在拟南芥和油菜中克隆了一些长链酰基辅酶A合成酶基因，但只是对其酶学特性或生化途径中的作用进行了分析，并不知其具体的生物学功能，目前在油菜中还没有对PXT143具体研究的报道，本发明克隆的PXT143的同源基因AtLACS1显著提高拟南芥含油量(谭小力2003)，这对阐明PXT143基因的生物学功能有重要意义。
3、PXT143转基因酵母显著提高含油量31.87％，说明PXT143对提高酵母含油量效果非常明显，通过基因工程技术将PXT143基因应用于产油微生物酵母中具有重要应用前景，将对实现微生物油脂产业化产生较大的影响。
4、本发明在国内首次运用基因工程技术将植物油合成相关基因应用于酵母中，这对怎样将现代分子生物学的最新研究成果应用于产油微生物中具有重要的参考价值。
5、含油量遗传研究对指导育种实践、品种改良及品种推广均具有重要意义，PXT143基因的克隆将有助于培育更适合的品种。并为能够深入探讨油料作物提高含油量基因的分子作用机理，具有重要的理论意义和应用价值。
附图说明：
图1.PXT143与其它LACS的氨基酸序列比对
A：PXT143与其他LACS的氨基酸序列对比。黑色阴影代表高度保守的氨基酸残基，灰色阴影代表低度保守的氨基酸残基。可能参与腺苷酸化的保守酪氨酸由黑色箭头标示。B：核心序列对比。黑色三角号标示连接域的边界。其它LACS包括：拟南芥LACS：AtLACS1(AF503751)、AtLACS3(NM_114758)、AtLACS6(AF503765)；酿酒酵母LACS：ScLACS1(NP_014962)；超嗜热古菌LACS：AfLACS(NP_032007)；小鼠LACS：MmLACS1(NP_082252)；水稻LACS：OsPu-LACS(NP_001043879)、甘蓝型油菜LACS：BnACS1(CAA64327)和BnACS4(CAA96523)
图2.酵母表达载体pYES2-PXT143结构示意图
图3.PXT143酵母互补试验和底物特异性分析
转化子在分别含有12:0、14:0、16:0、18:0、18:1和22:1脂肪酸作为唯一碳源的液体培养基上培养到对数期中期(84h)。生长速率用分光光度计测定的OD600值表示(n＝3)。
图4.PXT143表达的组织特异性
PXT143在根、茎、叶和花中的表达。从宁油16中提取的总RNA(300ng)作为模板进行RT-PCR。Actin作为内参。
图5.PXT143在不同含油量油菜品系中表达分析。
使用油菜品系EM91、EM97、EM98、EM86、EM71和EM102的发育的种子的总RNA(300ng)为模板，进行RT-PCR。Actin作为内参。
图6.高低含油量种子中PXT143表达的实时定量PCR分析。
使用油菜高含油量(50.59％)品系EM102和低含油量(29.62)品系EM91。分别选取25、35、45、50DAP cDNA作为模板，Actin作为内参，进行荧光定量PCR。
图7.苏丹黑法测定转基因酵母脂肪酸含量改变
转化pYES2空载体和pYES2-PXT143到酵母PEP4中，培养后诱导表达；苏丹黑染色法染色后，采用分光光度计测量OD580值来表示细胞油脂含量(n≥3)。
图8.GC法测定转基因酵母脂肪酸含量改变
转化pYES2空载体和pYES2-PXT143到酵母PEP4中，培养后诱导表达。对其脂肪酸甲酯进行GC测定。1，2，3，4和5分别代表脂肪酸16:0，16:1，18:0，18:1和总脂肪酸。
具体实施方式：
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。
本发明实施例中涉及的由发明人保存的生物材料，均可向公众提供20年。
本发明中所使用到的微生物以及载体来源如下：
1、pMD18-T来源于TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司。
2、pYES2由美国华盛顿州立大学的J.I.Gordon教授提供。
3、大肠杆菌DH5α来源于江苏大学生命科学研究院。
4、酵母YB525(LACS缺陷型)由美国华盛顿州立大学的J.I.Gordon教授提供。
5、PEP4细胞的尿嘧啶缺陷型来源于江苏大学生命科学研究院。
6、pBI121-bar来源于江苏大学生命科学研究院。
7、农杆菌GV3101来源于江苏大学生命科学研究院。
实施例一：PXT143基因的克隆
1.植物培养
甘蓝型油菜品种宁油16在自然条件下种植于江苏省镇江市江苏大学试验田。
2.RNA的提取
在开花盛期，取宁油16植株花组织100mg，利用植物Trizol试剂(Invitrogen)抽提其总RNA。其具体方法参考Invitrogen说明书(Cat no.15596-026)。
3.cDNA的合成
取3μl总RNA，利用BU-Script Reverse Transcriptase(Biouniquer)合成cDNA，其具体方法严格按照Biouniquer Synthesis Prottocol(产品号：BU-301-01)。
4.PXT143基因的电子克隆
以AtLACS1核苷酸序列为探针BLAST B.napus DNA数据库，得到一组具有高度相似性的EST(GenBank Acc No.BZ004338，CX195375，CX189606，CX193570和CX193562)。通过SeqMan软件把这些EST拼接成为一个长度为为1641bp的片段。把拼接起来的片段与AtLACS1对比，发现该片段已具有了开放阅读框(ORF)的起始密码子(ATG)。
5.PXT143基因的3’RACE
根据电子克隆得到的拼接片段，使用B.napus花组织的cDNA为模板，以该拼接序列为核心序列，根据核心序列设计以下引物：S1 5’-CGAATCCGGTTGCTAATATCTGG-3’和S25’-GCTGAAATGAGCTACACCCACTC-3’；3’RACE通用引物3-AAP：5’-TACTAGTCGACGCGTGGCCTTTTTTTTTTTT-3’和3-cap：5’-TACTAGTCGACGCGTGGCC-3’；反转录的寡核苷酸引物为3-AAP。所有引物均由上海生工生物工程公司合成。。
3’-RACE的第一轮PCR以S1和3-AAP作为引物，在50μl体系进行。该体系含有1μlcDNA，10μmol/l dNTPs，1×PCR buffer，75μmol/l MgCl₂，1.5U Taq聚合酶(recombinant)，和10μmol/l 3-AAP，10μmol/l S1，PCR条件：94℃4min；然后26个循环(94℃40s，58℃40s，72℃2min)；72℃7min。取1μl的PCR产物为模板，以S2和3-cap为引物，进行巢式PCR，除了模板变为第一轮的PCR产物之外，条件同第一轮PCR。3’RACE产物克隆到pMD18-T载体(TaKaRa Bio-technology Co.)中进行测序。
测序分析显示，3’RACE PCR获得了一个长度为821bp的片段，该片段具有43nt长的poly(A)+尾巴，并与核心序列具有124bp的重叠；再通过SeqMan软件与核心序列拼接，得到包含有最终ORF的核苷酸序列，然后从ORF两侧设计引物F：5’-GAAGGTTGGACCGTATGTGTGG-3’和R：5’-ATAATCCACGGCTCCAGAACC-3’，以宁油16花组织的cDNA为模板PCR扩增，获得了长度为2334bp的cDNA，命名为PXT143，其序列如SEQ ID NO.1所示。
6.PXT143的序列分析
使用DNAstar ORF finder工具，分析发现PXT143具有一个长度为1983bp的ORF，起始密码子位于158nt位置，终止密码子位于2140nt位置。通过DNAStar程序分析，PXT143编码一个含有660个氨基酸残基的蛋白，理论pI为6.31，相对分子质量估测为74.54Kda。序列比对显示PXT143 ORF与AtLACS1具有88％的核酸序列相似性，预测的氨基酸序列同AtLACS1具有89.5％的相似性，但是与其他植物的LACS或推定的LACS的相似度低于50％。PXT143与一些来自植物，哺乳动物和微生物的其它LACS或预测LACSs的多重序列比对显示在各种生物体中存在三种保守基序。三个blocks出现在这些蛋白的氨基酸序列中，AMP-连接基序-I(Taylor，Barton et al.)[YF]TSG[TS][ST]GXPK，GYGXTE和GW[FL][HK][IVL]G-规则的定位于Block I-III中。PXT143的479位置上保守的酪氨酸残基推测与腺苷酸生成有关(图1.A)(Pavela-Vrancic，Pfeifer et al.1994；Fulda，Heinz et al.1997)。比对PXT143，AtLACS1和拟南芥酰基-CoA合成酶At5g36880中心序列，显示PXT143含有一个38个氨基酸残基长度的连接域(图1.B)。这个结果与目前的研究一致(Shockey，Fulda et al.2002)。
实施例二：PXT143的功能及底物分析
1.酵母表达载体的构建
根据PXT143序列，设计引物BnLACS-F(5’-GAAGGTTGGACCGTATGTGTGG-3’(KpnI))和BnLACS-R(5’-ATAATCCACGGC TCCAGAACC-3’(XbaI))，利用LA-Taq酶(TaKaRa Biotechnology Co.)从cDNA中扩增PXT143，PCR扩增条件：94℃4min，然后25cycles(94℃40s，58℃40s，72℃2min，72℃10min)。从琼脂糖凝胶中回收PCR产物，然后连接到pMD18-T载体(TaKaRa Biotechnology Co.)中转化大肠杆菌DH5α并测序。从阳性克隆菌株提取质粒，KpnI/Xba I双酶切，克隆到酵母表达载体pYES2的相应位点，得到酵母表达载体pYES2-PXT143，结构图见图2。
2.酵母的转化
按照Gietz和Schiestl(1995Methods in Molecular and Cellular Biology5[5]：255-269)的方法将酵母表达载体pYES2-PXT143转化到酿酒酵母YB525(LACS缺陷型)中，以转化pYES2空载体作为负对照。
3.转化子的筛选
制备省却尿嘧啶固体培养基，通过酵母YB525和PEP4细胞的尿嘧啶缺陷型筛选转化子。将200μl转化混合液涂选择平板，30℃培养72小时。随机挑选明显的阳性克隆。
省却尿嘧啶(dropout-uracil)液体培养基(1L)：
去氨基酸的酵母培养用酵母氮碱(0.67％)            6.7g
省却尿嘧啶混合物(0.077％)                       0.77g
添加蒸馏水补至                                  900mL
101bf/in²(6.895×10⁴pa)高压下蒸气灭菌20min。灭菌后加100mL 20％葡萄糖溶液，4℃贮存。
省却尿嘧啶(dropout-uracil)固体培养基：省却尿嘧啶(dropout-uracil)液体培养基添加2％细菌培养用琼脂。
4.酵母互补表达
为了确定PXT143是否具备LACS活性，把cDNA克隆到酵母表达载体pYES2中，再转化缺乏LACS活性的酵母(S.cerevisiae)菌株YB525中来验证PXT143是否具有补救缺陷型的能力(Black and DiRusso 2007)。
随机挑选明显的阳性克隆，接种到省却尿嘧啶液体培养基中培养至对数期的中期或后期。8000rpm离心15s收集细胞，并用2mol/L山梨醇洗两遍。加入3～5mL添加了2％半乳糖、不含葡萄糖的省却尿嘧啶液体培养基中，30℃220rpm震荡培养4小时，以诱导外源基因大量表达。吸取30μL培养液加入到3mL省却尿嘧啶液体培养基中。该省却尿嘧啶液体培养基含2％半乳糖，不含葡萄糖，并添加98μmol/L的脂肪酸18:0，作为唯一碳源，并且添加0.1％Triton X-100来溶解脂肪酸。30℃震荡培养3到4天。
以pYES2空载体转化酵母YB525作为负对照。转化子培养在含有18:0脂肪酸作为唯一碳源的缺省尿嘧啶液体培养基中，经过84小时培养至对数期中期。转化pYES2-PXT143的转化子能够正常生长，而转化pYES2空载体的酵母细胞不能生长(图3)。这说明PXT143能够互补酵母缺陷型。
5.PXT143底物偏好性分析
为了确定PXT143利用的底物，利用不同脂肪酸(分别为12:0、14:0、16:0、18:0、18:1和22:1)作为唯一碳源的缺省尿嘧啶液体培养基培养转化细胞，经84h培养到对数期中期。转化pYES2-PXT143的酵母细胞可以在含有4:0、16:0、18:0、18:1和22:1脂肪酸的省却尿嘧啶液体培养基上正常生长，而在含有12:0脂肪酸的培养基上不能生长(方法参考酵母互补表达方法)。转化pYES2-PXT143转化子的生长速率明显高于转化pYES2空载体的转化子(图3)。在利用不同脂肪酸作为碳源的培养基上，转化pYES2-PXT143酵母的生长速率也不相同。在含有22:1脂肪酸的培养基上，生长速率最高，如上依次为在含18:0、16:0、18:1和14:0脂肪酸的培养基上。结果显示PXT143可能优先选择长链与饱和的脂肪酸作为底物。
实施例三：PXT143在不同含油量油菜品系中的表达分析
1.RNA提取及cDNA合成：
取宁油16种子用自来水浸泡5～10h后，24℃暗培养。分别取培养2、3、4、5、6、7天的白化苗保存于-70℃冰箱备用。不同含油量的油菜品系EM91、EM97、EM98、EM86、EM71和EM102(含油量分别为29.62％、29.25％、28.47％、50.56％、48.78％和50.59％，含油量使用近红外方法测定)用于分析BnLACS1与含油量的关系。取开花后35天(35DAF)的角果，分离角果皮和种子，存于70℃冰箱备用。RNA提取及cDNA合成参考实施例一。
2.RT-PCR表达分析
为了确定PXT143在油菜中的生物学功能，在不同时期对不同含油量油菜中，对PXT143进行RT-PCR表达分析。RT-PCR分析使用10μg总RNA作为模板进行反转录，条件同实施例一。然后取300ng cDNA作为模板，使用BnLA1RT F(5’-GAAGGTTG GACCGTATGTGTGG-3’)和BnLA1RT R(5’-ATAATCCACGGCTCCAGAAC C-3’)作为引物进行PCR。反应条件：95℃预变性5min，然后经35个循环(95℃30s、58℃30s、72℃30s)，72℃10min。同样的cDNA也作为模板，使用Actin F(5’-ATGGCCGATGGTGAGGA CAT TC-3’)和Actin R(5’-GGTGCGACCACCTTGATCTT C-3’)作为引物，扩增Actin作为内参。取15μL PCR产物在1％的琼脂糖凝胶上进行电泳，E.B.染色。
结果显示，在萌发2、3、4、5、6、7天的白化苗中，均没有检测到PXT143的表达，表明该基因不参与萌发期的脂肪酸降解过程；在成熟植株中，PXT143在根和叶中的表达量很低，而在花和茎中的表达量相对较高(图4)。花是油脂大量合成的组织，在花中PXT143的大量表达说明PXT143能够参与油脂的合成代谢。
为了研究PXT143表达水平和油菜种子含油量的关系，选用了6个含油量不同的油菜品系EM91、EM97、EM98、EM86、EM71和EM102(含油量分别为29.62％、29.25％、28.47％、50.56％、48.78％和50.59％)35DAF的种子进行RT-PCR分析。在发育中的种子中，PXT143的表达量不同。最高的表达量出现在高含油量品系EM86中(图5)。在花和发育中的种子中油脂合成速率很高(Slocombe，Piffanelli et al.1994)，PXT143也很高，而在萌发的幼苗中，没有检测到PXT143的表达。以上结果说明PXT143参与油脂的合成代谢。
实施例四：高低含油量种子中PXT143表达的实时定量PCR分析
RNA提取以及cDNA合成
分别选取高含油量品种EM86和低含油量品种EM98的25DAF(days after flowering)、35DAF、45DAF、50DAF的种子。抽提各个时期的种子的总RNA合成cDNA，反转录的方法同实施例一。合成的cDNA第一链稀释10倍后用于Real-time PCR。PXT143荧光定量PCR引物为lacsRT F(5′TGAATCGTGGATACTCGCATAG’)和lacsRT R(5’TTCAGCCACCTCCTCAAGC3’)；以Bn-Actin为内参照，内参引物为Bn-Actin F：GTTGCTATCCAGGCTGTTCT和Bn-Actin R：ACTGCTCTTAGCCGTCTCC。
荧光定量PCR反应体系及程序
反应液的配置：
SYBRMix(2×)            10μl
cDNA                    1μl
PrimerF(1μM)           2μl
PrimerR(1μM)           2μl
去离子水                5μl
反应条件：94℃预变性1min，94℃20s，57/58℃30s，72℃20，循环40～45次。溶解曲线的制作：95℃1min，57℃30s，95℃30s，从55℃升温到95℃的速度为0.1℃/s。仪器(STRATAGENE Mx 3000P^TM)自动收集荧光信号，并自动制作熔解曲线。
结果显示，在开花后45天内高含油量品种EM86种子PXT143表达水平显著高于低含油量EM98种子，在开花后35天内表达量达到低含油量EM98的2.5-2.6倍(图6)。以上结果说明PXT143是参与种子油脂积累的重要基因。
实施例五：PXT143转基因酵母显著提高油脂含量
1.酵母的转化和筛选
将酵母表达载体pYES2-PXT143转化到酵母菌株PEP4中，酵母PEP4为蛋白水解酶缺陷型，且为尿嘧啶缺陷型；以转化pYES2空载体作为负对照。转化筛选方法同上。
2.苏丹黑染色法测定酵母油脂含量
随机挑选阳性克隆，接种到YPD培养基中培养，30℃，210rpm培养约24h，至对数期的中期或后期，集菌，无菌水洗涤两次，然后利用半乳糖作为唯一碳源的缺省尿嘧啶液体培养基30℃，210rpm诱导4h，集菌，然后进行苏丹黑染色，来测定酵母油脂含量。
苏丹黑染色方法如下：
无菌水悬浮酵母菌体，利用分光光度计在OD600处将菌液浓度调到一致，然后取等体积悬液5000rpm离心10min收集。用0.3％的苏丹黑(苏丹黑0.3g，70％乙醇100ml)染色15min倾去染料。70％乙醇悬浮菌液清洗三次。然后在紫外分光光度计测定OD_580nm值。
结果显示，pYES2-PXT143转化子OD_580nm值明显高于负对照(图7)，表明PXT143具有显著提高酵母油脂含量的功能。
3.GC测定酵母总脂肪酸含量
脂肪酸提取方法：取100mg酵母干燥样品，用液氮研磨成粉末，加入1.5ml提取buffer(甲醇含2.5％v/v浓硫酸)，80℃2小时，冷却至室温后加入2ml 0.9％(v/v)NaCl和1ml正己烷，同时加入20μl C17:0(10g/μL，Sigma公司，中国代理)作为内标。振荡混匀，4000rpm离心10分钟，室温。取上清，真空抽干，沉淀溶于50μL乙酸乙酯。取1μL上机检测脂肪酸含量。
脂肪酸含量测定：所用GC/MS为TurboMass(PerkinElmer公司)，GC柱为30m×0.25mm BPX-70柱；GC升温程序为：初始温度120℃，保持1min，以每分钟10℃的速率升至150℃，然后以每分钟4℃的速率升温至230℃，保持10min。所用内标为C17:0脂肪酸。脂肪酸含量的计算公式是：样品含量＝(样品峰图面积/内标峰图面积)X内标含量/样品重量。
结果显示，与对照酵母相比，PXT143在酵母中过量表达能够使油脂含量提高31.87％(图8)。
参考文献：
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谭小力(2003).″拟南芥长链脂肪酰辅酶A合成酶基因的克隆及功能鉴定[D].″西北农林科技大学.
SEQUENCE LISTING
<110>江苏大学
<120>一种能提高酵母含油量的植物脂酰辅酶A合成酶基因及其应用
<130>
<160>2
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>2334
<212>DNA
<213>Brassica napus
<220>
<221>CDS
<222>(158)..(2140)
<400>1
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Lys Val Glu Glu Gly Val Lys Gly Glu Asn Gly Lys Pro Ser Val Gly
            10                  15                  20
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        25                  30                  35
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Ser Asp Ile Thr Thr Ala Trp Asp Ile Phe Cys Lys Ser Val Glu Lys
    40                  45                  50
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Phe Pro Gly Asn Lys Met Leu Gly Trp Arg Pro Ile Val Asp Lys Lys
55                  60                  65                  70
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                75                  80                  85
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Leu Gln Ile Gly Ser Ala Leu Arg Thr Leu Gly Ala Glu Pro Gly Cys
            90                  95                  100
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        105                 110                 115
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Glu Ala Cys Ala Ala His Thr Leu Ile Cys Val Pro Leu Tyr Asp Thr
    120                 125                 130
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Leu Gly Ser Gly Ala Val Asp Tyr Ile Val Asp His Ala Glu Ile Asp
135                 140                 145                 150
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Phe Val Phe Val Gln Asp Thr Lys Ile Lys Gly Leu Leu Glu Pro Asp
                155                 160                 165
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Ser Ile Cys Ser Lys Arg Leu Lys Ala Ile Val Ser Phe Thr Asn Val
            170                 175                 180
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        185                 190                 195
tct tgg ctc gat ttt ctt cat atg gga cgt gag aaa ccg gaa gag att    799
Ser Trp Leu Asp Phe Leu His Met Gly Arg Glu Lys Pro Glu Glu Ile
    200                 205                 210
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215                 220                 225                 230
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                235                 240                 245
act ttc gtt gtt ggg gtg gat ctc ttc atg gac cag ttc gaa gac aag    943
Thr Phe Val Val Gly Val Asp Leu Phe Met Asp Gln Phe Glu Asp Lys
            250                 255                 260
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Met Thr His Glu Asp Val Tyr Leu Ser Phe Leu Pro Leu Ala His Ile
        265                 270                 275
ctt gac cgt atg aat gag gaa tac ttc ttt cgc aaa ggg gct tcc gtt    1039
Leu Asp Arg Met Asn Glu Glu Tyr Phe Phe Arg Lys Gly Ala Ser Val
    280                 285                 290
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Gly Tyr Tyr His Gly Asp Leu Asn Val Leu His Asp Asp Ile Gln Glu
295                 300                 305                 310
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Leu Lys Pro Thr Tyr Leu Ala Gly Val Pro Arg Val Phe Glu Arg Ile
                315                 320                 325
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His Glu Gly Ile Gln Lys Ala Leu Gln Glu Leu Asn Pro Arg Arg Arg
            330                 335                 340
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Phe Ile Phe Asn Ala Leu Tyr Lys His Lys Leu Ser Trp Leu Asn Arg
        345                 350                 355
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    360                 365                 370
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Arg Lys Ile Arg Asp Lys Leu Gly Gly Arg Ile Arg Leu Leu Ile Ser
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Gly Gly Ala Pro Leu Ser Pro Glu Ile Glu Glu Phe Leu Arg Val Thr
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Gly Thr Ala Met Cys Ile Pro Asp Glu Met Cys Met Leu Gly Thr Val
        425                 430                 435
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Gly Ile Pro Ala Val Tyr Asn Glu Ile Arg Leu Glu Glu Val Ala Glu
    440                 445                 450
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455                 460                 465                 470
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Arg Gly Lys Cys Phe Ile Ser Gly Tyr Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr
                475                 480                 485
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Asp Glu Val Leu Lys Asp Gly Trp Phe His Thr Gly Asp Ile Gly Glu
            490                 495                 500
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Ile Gln Pro Asn Gly Val Leu Lys Ile Ile Asp Arg Lys Lys Asn Leu
        505                 510                 515
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Ile Lys Leu Ser Gln Gly Glu Tyr Val Ala Leu Glu Asn Leu Glu Asn
    520                 525                 530
atc tac ggt caa aac tct gtt gtc caa gat ata tgg gtt tat gga gac    1807
Ile Tyr Gly Gln Asn Ser Val Val Gln Asp Ile Trp Val Tyr Gly Asp
535                 540                 545                 550
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Ser Phe Lys Ser Met Leu Val Ala Val Ile Val Pro Asn Pro Glu Val
                555                 560                 565
gtg aac cgg tgg gct aaa gat ctc ggt tta aat aaa ccg ttc gaa gaa    1903
Val Asn Arg Trp Ala Lys Asp Leu Gly Leu Asn Lys Pro Phe Glu Glu
            570                 575                 580
cta tgt ttt ctc acg gag ttg caa gaa cac atc att tta gaa ctg aag    195l
Leu Cys Phe Leu Thr Glu Leu Gln Glu His Ile Ile Leu Glu Leu Lys
        585                 590                 595
tcc ccg gca gag aag aac aag cta aaa agg ttc gag tac atc aaa gca    1999
Ser Pro Ala Glu Lys Asn Lys Leu Lys Arg Phe Glu Tyr Ile Lys Ala
    600                 605                 610
gtg acg gtg gag atg aaa cct ttc gac tta gag aga gac ttg gtg act    2047
Val Thr Val Glu Met Lys Pro Phe Asp Leu Glu Arg Asp Leu Val Thr
615                 620                 625                 630
gcg acg ctc aag aat aag agg aac aat ctt ttc aag tat tat cag gca    2095
Ala Thr Leu Lys Asn Lys Arg Asn Asn Leu Phe Lys Tyr Tyr Gln Ala
                635                 640                 645
caa gtc gac gag atg tac cga aaa ttg gcg tca aag aaa att tga        2140
Gln Val Asp Glu Met Tyr Arg Lys Leu Ala Ser Lys Lys Ile
            650                 655                 660
aagtattgcc atgatgtatg tgtgtgctgt tattgatagt tatgtaccaa taattgatcg  2200
aaatgagcct tatgctctct gtaatgtttt atttctattc tatgttgtat gatcatttgc  2260
atgacaatta ttagtatttt tttcgttccg gaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa  2320
aaaaaaaaaa aaaa                                                    2334
<210>2
<211>660
<212>PRT
<213>Brassica napus
<400>2
Met Lys Ser Phe Ala Ala Lys Val Glu Glu Gly Val Lys Gly Glu Asn
1               5                   10                  15
Gly Lys Pro Ser Val Gly Pro Val Tyr Arg Asn Leu Leu Ser Glu Lys
            20                  25                  30
Gly Phe Pro Pro Ile Asp Ser Asp Ile Thr Thr Ala Trp Asp Ile Phe
        35                  40                  45
Cys Lys Ser Val Glu Lys Phe Pro Gly Asn Lys Met Leu Gly Trp Arg
    50                  55                  60
Pro Ile Val Asp Lys Lys Val Gly Pro Tyr Val Trp Lys Thr Tyr Lys
65                  70                  75                  80
Glu Ala Tyr Glu Glu Val Leu Gln Ile Gly Ser Ala Leu Arg Thr Leu
                85                  90                  95
Gly Ala Glu Pro Gly Cys Arg Val Gly Ile Tyr Gly Ile Asn Cys Pro
            100                 105                 110
Gln Trp Ile Ile Ala Met Glu Ala Cys Ala Ala His Thr Leu Ile Cys
        115                 120                 125
Val Pro Leu Tyr Asp Thr Leu Gly Ser Gly Ala Val Asp Tyr Ile Val
    130                 135                 140
Asp His Ala Glu Ile Asp Phe Val Phe Val Gln Asp Thr Lys Ile Lys
145                 150                 155                 160
Gly Leu Leu Glu Pro Asp Ser Ile Cys Ser Lys Arg Leu Lys Ala Ile
                165                 170                 175
Val Ser Phe Thr Asn Val Ser Lys Glu Asp Ser Ile Lys Ala Ser Glu
            180                 185                 190
Ile Gly Val Lys Thr Tyr Ser Trp Leu Asp Phe Leu His Met Gly Arg
        195                 200                 205
Glu Lys Pro Glu Glu Ile Ser Pro Pro Lys Pro Phe Asn Thr Cys Thr
    210                 215                 220
Ile Met Tyr Thr Ser Gly Thr Ser Gly Asp Pro Lys Gly Val Val Leu
225                 230                 235                 240
Thr His Glu Ala Val Ala Thr Phe Val Val Gly Val Asp Leu Phe Met
                245                 250                 255
Asp Gln Phe Glu Asp Lys Met Thr His Glu Asp Val Tyr Leu Ser Phe
            260                 265                 270
Leu Pro Leu Ala His Ile Leu Asp Arg Met Asn Glu Glu Tyr Phe Phe
        275                 280                 285
Arg Lys Gly Ala Ser Val Gly Tyr Tyr His Gly Asp Leu Asn Val Leu
    290                 295                 300
His Asp Asp Ile Gln Glu Leu Lys Pro Thr Tyr Leu Ala Gly Val Pro
305                 310                 315                 320
Arg Val Phe Glu Arg Ile His Glu Gly Ile Gln Lys Ala Leu Gln Glu
                325                 330                 335
Leu Asn Pro Arg Arg Arg Phe Ile Phe Asn Ala Leu Tyr Lys His Lys
            340                 345                 350
Leu Ser Trp Leu Asn Arg Gly Tyr Ser His Ser Lys Ala Ser Pro Met
        355                 360                 365
Ala Asp Leu Ile Ala Phe Arg Lys Ile Arg Asp Lys Leu Gly Gly Arg
    370                 375                 380
Ile Arg Leu Leu Ile Ser Gly Gly Ala Pro Leu Ser Pro Glu Ile Glu
385                 390                 395                 400
Glu Phe Leu Arg Val Thr Cys Cys Cys Phe Val Leu Gln Gly Tyr Gly
                405                 4l0                 415
Leu Thr Glu Thr Leu Gly Gly Thr Ala Met Cys Ile Pro Asp Glu Met
            420                 425                 430
Cys Met Leu Gly Thr Val Gly Ile Pro Ala Val Tyr Asn Glu Ile Arg
        435                 440                 445
Leu Glu Glu Val Ala Glu Met Ser Tyr Asp Pro Leu Gly Glu Asn Pro
    450                 455                 460
Ala Gly Glu Ile Cys Ile Arg Gly Lys Cys Phe Ile Ser Gly Tyr Tyr
465                 470                 475                 480
Lys Asn Pro Lys Leu Thr Asp Glu Val Leu Lys Asp Gly Trp Phe His
                485                 490                 495
Thr Gly Asp Ile Gly Glu Ile Gln Pro Asn Gly Val Leu Lys Ile Ile
            500                 505                 510
Asp Arg Lys Lys Asn Leu Ile Lys Leu Ser Gln Gly Glu Tyr Val Ala
        515                 520                 525
Leu Glu Asn Leu Glu Asn Ile Tyr Gly Gln Asn Ser Val Val Gln Asp
    530                 535                 540
Ile Trp Val Tyr Gly Asp Ser Phe Lys Ser Met Leu Val Ala Val Ile
545                 550                 555                 560
Val Pro Asn Pro Glu Val Val Asn Arg Trp Ala Lys Asp Leu Gly Leu
                565                 570                 575
Asn Lys Pro Phe Glu Glu Leu Cys Phe Leu Thr Glu Leu Gln Glu His
            580                 585                 590
Ile Ile Leu Glu Leu Lys Ser Pro Ala Glu Lys Asn Lys Leu Lys Arg
        595                 600                 605
Phe Glu Tyr Ile Lys Ala Val Thr Val Glu Met Lys Pro Phe Asp Leu
    610                 615                 620
Glu Arg Asp Leu Val Thr Ala Thr Leu Lys Asn Lys Arg Asn Asn Leu
625                 630                 635                 640
Phe Lys Tyr Tyr Gln Ala Gln Val Asp Glu Met Tyr Arg Lys Leu Ala
                645                 650                 655
Ser Lys Lys Ile
            660