一种微生物固定化载体及其制备方法 【技术领域】
本发明涉及发酵工业技术领域，尤其是涉及一种用于固定化微生物的载体及其制备方法。
背景技术
固定化细胞技术自问世以来，显示出广阔的发展前景。固定化细胞在乙醇发酵工业上成果较为显著，固定化酵母细胞用于发酵酒精与传统发酵工艺相比，具有速度快、周期短、生产能力高、工艺设备简单，易于实现连续化及自动化和产物容易提取等优点，并在一定程度上减少发酵工厂的设备投资和环境污染.
选择适宜的固定化细胞载体是实现工业化的关键，而载体的好坏又取决于载体的机械强度、寿命和包埋微生物细胞的容量和活性。固定载体中应用最广泛的是海藻酸钙，虽易成形、无毒、成本低廉，但强度差，使用寿命短，对醪液中PO 43-敏感。其它的一些天然高分子化合物，如琼脂，明胶和卡拉胶等，虽强度得到改善，但价格偏高。聚乙烯醇作为包埋载体的优点有机械强度高、化学性能稳定、抗微生物分解能力强、对微生物无毒、价格低廉和使用寿命长等一系列优点。
展望本世纪高分子科学的发展，有机高分子和无机材料杂化复合技术日益引起人们的关注，高分子表面功能化是其中的一个重要发展趋势。运用这种方法所制备的材料兼有有机和无机材料的特性，可以满足实际应用中多种不同需要。其中具有特殊功能团的高分子材料如吸附高分子、导磁高分子等是人们研究的热点，特别是磁性功能高分子载体在科学工作者的努力下，已经实现了部分产业化。
目前磁性高分子载体主要是磁性高分子微球(magneticm icrospheres)，是指通过适当方法使有机高分子与磁性材料相结合所形成的具有一定磁性及特殊结构的微球。这种磁性载体具有两个显著特点：一是它的超顺磁性，即在磁场存在时显示出磁性，当磁场撤走时磁性又迅速消失，从而避免生物高分子载体被永久磁化；二是可以对其表面进行化学修饰从而赋予其表面多种功能团(如-OH、-COON，-NH2等)。正因为具有这两方面的特性，磁性载体在许多领域显示出强大的生命力：以其作载体在细胞分离、生物医学、固定化酶和固定化微生物中展现出广阔的应用前景。
细胞的标记与分离是磁性高分子微球最早的应用研究之一，自上世纪年代以来便有很多学者致力于该领域的研究。磁性微球作为不溶载体，在其表面接具有生物活性的吸附剂或其它配体如抗体、荧光物质、外源凝结素等活性物质，在外加磁场作用下，利用他们与特定细胞的特异性结合，可快速有效地将细胞分离、分类或检测细胞的种类或及数量分布。
磁性高分子微球在固定化酶方面研究较为成熟，其研究成果也较为理想。与传统非磁性材料相比，磁性高分子微球具有以下优点：(1)有利于固定化酶从反应体系中分离和回收，操作简便，对于双酶反应体系，当一种酶的失活较快时，就可以用磁性材料来固载另一种酶，回收后反复使用，降低成本；(2)磁性微球固定化酶放入磁场稳定的流动床反应器中，可以减少持续反应体系中的操作，适合于大规模连续化操作；(3)利用外部磁场可以控制磁性材料固定化酶的运动方式和方向，替代传统的机械搅拌方式，提高固定化酶的催化效率；(4)可以改善酶的生物相容性、免疫活性、亲疏水性提高酶的稳定性。利用紫外线照射聚苯乙烯磁性微球得到羧基，然后将微球加入含酶的磷酸缓冲液中，35℃水浴下搅拌150min，得到固定化酶，这种微球在外部磁场的作用下在流动反应器中可以不停的运动，磁性微球对弱磁场有较好的响应性，而且本身不会聚集。但是这些磁性微球对菌体的吸附作用力较弱，菌体容易脱落，重复利用率低，球体容易堆积，空间占用多，而且死亡菌体下沉后会落在底部的球体表面，影响传质效果，而且微球的生产过程复杂，生产成本高。
【发明内容】
本发明的目的是提供一种可以固定微生物的载体的制备方法，使用该方法制得的载体吸附菌体作用力强，重复利用率高，制备方法简单，成本低廉。
本发明的另一目的是提供一种微生物固定化载体，该载体对菌体的吸附力强，空间占用少，提高菌体与载体之间的接触面积，传质效果好。
本发明的技术解决方案是：一种微生物固定化载体的制备方法，它包括以下步骤：
磁性聚乙烯醇膜载体的制备：用蒸馏水充分溶解聚乙烯醇，在90℃温度下搅拌，制成的聚乙烯醇水溶液；将磁流体倒入聚乙烯醇溶液中混匀，依序加入25％戊二醛的水溶液、浓盐酸和2％海藻酸钠的水溶液，继续搅拌1h后，将溶液倒至表面覆盖尼龙网的不锈钢网上，用磁场分离沉淀，沉淀依次用50％酒精和蒸馏水反复洗涤，常温下干燥，得到磁性聚乙烯醇薄膜载体；
螺旋管状构造制备：将磁性聚乙烯醇薄膜载体卷曲成螺旋管状构造；
固定化菌体：将微生物菌体加入到含有磁性聚乙烯醇薄膜载体的发酵培养液中，搅拌24h后，用2％NaCl水溶液洗脱未被固定化的目的微生物，然后用无菌水反复洗涤载体，至上清液中无目的微生物洗出为止。
本发明的方法中，聚乙烯醇即PVA是由聚醋酸乙烯酯经皂化而成地高分子化合物，是一种水溶性的高聚物。由于它具有独特的强力粘接性、皮膜柔韧性、平滑性、耐油性、耐溶剂性、保护胶体性、气体阻绝性、耐磨性以及经特殊处理所具有的耐水性；而且具有良好的生物相容性，对微生物活细胞没有毒害作用，将其经过磁化修饰，可使载体具有磁性，使微生物定向移动，并快速吸附在载体表面，吸附力强，不易脱落，将载体卷曲成螺旋管状，结构稳定，重复利用率高，可以增大接触面积，方便微生物在载体表面累积，同时死亡微生物下沉不会落在载体表面，传质效果好。
它在步骤b前还设有载体激活的步骤d：使用1，1-羧基二咪唑羧基化磁性聚乙烯醇薄膜表面的羟基，再将磁性聚乙烯醇薄膜加入到体积浓度为20％1，1-羧基二咪唑的丙酮溶液中，在室温条件搅拌24h后，用磁场分离沉淀，沉淀用丙酮反复洗涤，真空干燥。这样处理，可以得到激活的磁性聚乙烯醇薄膜载体，增强其生物活性，进一步提高其稳定性。
所述步骤a中，制成的聚乙烯醇水溶液浓度为10％。所述的磁流体选用Fe3O4，所述不锈钢网的目数为200目。这样制备方便，选材容易。
所述的微生物菌体为丙酮丁醇梭菌，可以获得发酵液中高浓度的丙酮丁醇均，最大限量的利用底物发酵生产丁醇，同时有利于解除发酵过程中产物抑制作用。
本发明的另一技术解决方案是：一种微生物固定化载体，该固定化载体呈螺旋管状体，其由不锈钢网和尼龙网叠合后卷绕形成，在不锈钢网和尼龙网外覆盖有磁性化后的聚乙烯醇薄膜层。使用不锈钢网可以提高载体整体的机械强度，保证其结构不发生变形，尼龙网有利于沉淀生成附着。这样制成的载体结构强度高，重复利用率高，同时，吸附效果好。
本发明的优点是：
1.膜状其表面接触面积大，吸附的微生物菌体多，操作简单，无需制备成微球，减少生产操作步骤，降低成本。
2.由于聚乙烯醇膜磁性化，具有磁性，在外加磁场下，可以使具体定向移动，按照一定的顺序，有序而且牢固地吸附在磁性聚乙烯醇膜表面上，不易脱落。
3.通过磁性聚乙烯醇膜的表面修饰和激活，其载体的活性增强外，其稳定性也增强，可到达多次重复利用的目的。
4.磁性聚乙烯醇膜螺旋管状结构，不仅减小了占用空用，同时也使菌体与载体有更多的接触空间，一方面使菌体在磁性聚乙烯醇膜处大量累积，产物产率得到提高；另一方面死亡的菌体下沉，不至于落到载体表面，影响传质效果发酵结束后，可以直接取出螺旋管状结构的载体，清洗后即可直接用于下批发酵，为连续发酵奠定了基础。
【附图说明】
附图1为本发明载体的结构示意图；
附图2为本发明载体的剖视示意图；
1、不锈钢网，2、尼龙网，3、聚乙烯醇薄膜层。
【具体实施方式】
实施例：
参阅图1和2，一种微生物固定化载体的制备方法，它包括以下步骤：
1、磁性PVA膜载体制备：
用蒸馏水充分溶解PVA，在90℃温度下搅拌，制成10％的PVA水溶液。将2.5g磁流体Fe3O4倒入200mL PVA溶液中混匀，在圆底烧瓶中与分散介质混合，然后在50℃水浴中以700r/min速度搅拌10min，依序加入3.75mL 25％戊二醛的水溶液、3.0mL浓盐酸和3.0mL 2％海藻酸钠水溶液，继续搅拌1h；将溶液倒至200目的表面覆盖尼龙网的不锈钢丝网上(长240mm×宽80mm)，最后用磁场分离沉淀，沉淀依次用50％酒精和蒸馏水反复洗涤，干燥，最终得到磁性聚乙烯醇薄膜载体。所使用的分散介质由400mL食用油和10mL Tween-20混合而成。
2、磁性PVA膜载体的激活：
为了使微生物更牢固地固定到磁性PVA薄膜表面上，先用1，1-羧基二咪唑(CDI)羧基化磁性PVA薄膜表面的羟基。将20g磁性薄膜加入到40mL 20％1，1-羧基二咪唑(CDI)的丙酮溶液中，在室温条件以700r/min的速度搅拌24h，然后用磁场分离沉淀。沉淀用丙酮反复洗涤，最后真空干燥得到激活的磁性PVA薄膜载体。
3、螺旋管状构造制备
将已经修饰激活的磁性PVA膜载体，卷曲成螺旋型的管状构造，如图2所述，尼龙网2覆盖于不锈钢网1的表面，网孔3和网孔4内填充有菌体5。其中不锈钢网1的孔隙率为200目，比表面积为400m2/m3，体密度为200kg/m3。此外，卷曲后各层之间具有1-2mm的垂直间距，能够使进流气体和溶液通过，有足够的空间附着较多量的菌体。
4、磁性PVA膜固定化细胞：
将100mL需要固定化的微生物菌液加入到100mL含有0.5g磁性PVA薄膜的发酵培养基中，37℃下以700r/min速度搅拌24h后，用30mL浓度为0.5mol/L的NaCl水溶液洗脱未被固定化的目的微生物，然后用无菌水反复洗涤固定化细胞至上清液无目的微生物洗出为止。本实施例中固定化的微生物为丙酮丁醇梭菌。
以下通过实验进一步说明本发明的有益效果：
1、实验材料：
150mL CM149培养基其中含有葡萄糖8％，可溶淀粉0.1％，蛋白胨1％，牛肉膏1％，酵母粉0.3％，NaCl 0.5％，醋酸钠0.3％，分成三份，分装于250mL三角瓶中，115℃灭菌20min后待用；
2、实验方法：
将丙酮丁醇菌游离细胞、PVA固定化载体、本发明载体，分别接种于上述三个三角瓶中，37℃静止培养24h。将增殖培养后的细胞，分别接种于5L自制的发酵罐中，装液量为2L，底物糖浓度7％，37℃恒温培养。每隔24h取样检测一次，GC检测产物浓度，酸度由酸碱滴定中和法检测，菌体浓度通过干重法和显微镜计数法检测。
3、实验效果：
通过对比丙酮丁醇菌固定化发酵与游离菌体发酵，我们可以很清楚地了解到，
游离丙酮丁醇菌发酵方式中菌体最高浓度为0.3g/L，丁醇最高产量为1.1％，底物转化率为23％；
PVA固定化载体发酵方式中，丙酮丁醇菌发酵菌体最高浓度为0.7g/L，丁醇最高产量为1.2％以上，底物转化率为27％；
本发明载体发酵方式中，丁醇菌发酵菌体最高浓度为1.2g/L，丁醇最高产量为1.5％以上，底物转化率为33％。
与游离细胞发酵方式相比，使用本发明的磁性PVA膜载体在发酵过程中的表面现象看，产气量较游离细胞发酵方式大，且溶液对流急；
使用本发明载体发酵方式中达到酸峰的时间为10h左右，而游离细胞发酵方式达到酸峰时间为20h左右；
使用本发明载体发酵方式的发酵过程中达到酸峰时酸度较游离细胞发酵方式要高0.5-1.0；从发酵速率看，也较使用游离细胞发酵方式快，即发酵周期短，发酵1个月后细胞流失量不明显。载体机械强度高，细胞的通透性比较明显，载体在整个发酵过程中都显示了良好的热稳定性，而且溶液中丁醇含量相对于游离细胞有明显地提高。因此上述丙酮丁醇菌固定化发酵也为厌氧菌发酵提供了一条可行性的通道。
在连续发酵过程中，本发明进一步突出了自身的特点：首先，由于是网架螺旋机构，使得实际发酵过程中，沉降物不至于附着在载体表面影响传质，更有利于连续发酵，发酵完的发酵液可即使的排出发酵罐，操作简单；而PVA膜固定化发酵由于表面附着沉降物而导致分离困难，难以连续机械化，操作困难。其次本发明中PVA膜带有磁性，可以更加牢固地吸附菌体，使得发酵过程中有足够的菌体量，保证发酵的顺利进行。在连续发酵过程中，丁醇菌发酵菌体最高浓度为1.2g/L，而PVA膜固定化发酵过程中，丁醇菌发酵菌体最高浓度为0.7g/L，生物量大大提高，从而为后期丁醇发酵提供有利保障。最后，磁性PVA膜固定化发酵中，由于磁流体的存在，使得菌体自身的酶结构发生变化，导致发酵代谢过程发生变化，代谢流向丁醇方向转移，从而丁醇的产量得到提高。PVA膜固定化发酵，丁醇最高产量为1.2％以上，底物转化率为27％，而磁性PVA膜固定化发酵，丁醇最高产量为1.5％以上，底物转化率为33％。丁醇产率和转化率得到大幅度的提高。
上列详细说明是针对本发明之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本案的专利范围中。