一种提取禽类全血DNA的方法.pdf

本发明涉及提供一种提取禽类全血DNA的方法。该方法将冷冻血液在室温融化以后，取血液22μl加入离心管，再加入缓冲液860μl、裂解液100μl、蛋白酶K?15μl，总体积不超过1000μl，按本发明提取方法得到DNA后，置于真空干燥器中或45℃烘箱中干燥DNA沉淀物，待团块透明后，视沉淀大小，加入100～200μl?TE溶液充分溶解DNA，-20℃冰箱中保存。本发明的提取方法在整个提取过程中不会涉及到苯酚等剧毒药品的使用，对操作人员身体无伤害，相对于现有的提取方法更安全；整个提取过程耗费时间最快4小时内即可完成，提取时间短，相对于现有提取方法更为快速；本发明的提取方法只需要微量的抗凝血即可完成DNA的提取，相对于现有方法更为高效。

1.  一种提取禽类全血DNA的方法，其特征在于，包括下述步骤：
1)冷冻血液在室温融化以后，取血液22μl加入离心管，再加入缓冲液860μl、裂解液100μl、蛋白酶K15μl，总体积不超过1000μl；漩涡振荡5分钟，使其完全混匀；
2)56℃金属浴或水浴消化至少3小时；
3)加入预冷的氯仿500μl，旋转混合5分钟，使其完全混匀；
4)13000r/min离心5分钟，吸取上层水相；
5)在上清液中加入等体积预冷的的异丙醇，缓慢摇动离心管5分钟；
6)13000r/min离心5分钟，使DNA贴到离心管壁上，弃上清液；
7)用预冷的70％乙醇洗涤沉淀物2次，每次洗涤后，13000r/min离心8分钟，弃上清液；
8)于真空干燥器中或45℃烘箱中干燥DNA沉淀物，待团块透明后，视沉淀大小，加入100～200μl TE溶液充分溶解DNA，-20℃冰箱中保存。

2.  根据权利要求1所述的一种提取禽类全血DNA的方法，其特征在于，所述缓冲液由Tris-base 0.6057g、NaCl4.383g、EDTA0.29225g、SDS 5g定容至500ml，用NaOH调节pH，使pH保持在8.0～8.3之间。

3.  根据权利要求1所述的一种提取禽类全血DNA的方法，其特征在于，所述裂解液是浓度为47.765g/100ml的盐酸胍。

4.  根据权利要求1所述的一种提取禽类全血DNA的方法，其特征在于，所述蛋白酶K的浓度为20mg/ml。

5.  根据权利要求1所述的一种提取禽类全血DNA的方法，其特征在于，所述TE溶液由pH 8.0浓度1mol/L的Tris-HCl 10ml，pH8.0浓度为0.5mol/L EDTANa₂2ml，加入ddH2O到1000ml，混匀，调pH至8.0，定溶至1000ml制得。

6.  根据权利要求1所述的一种提取禽类全血DNA的方法，其特征在于，所述预冷的氯仿、预冷的的异丙醇、预冷的70％乙醇其预冷温度均为-20℃。

7.  根据权利要求1所述的一种提取禽类全血DNA的方法，其特征在于，所述步骤4)中吸取上层水相500～600μl到另一干净的离心管中，吸取时不搅动或吸到下面两相。

8.  根据权利要求1所述的一种提取禽类全血DNA的方法，其特征在于，在试验前先对本方法中所用器具、试剂、耗材进行高压灭菌。

9.  根据权利要求1或3所述的一种提取禽类全血DNA的方法，其特征在于，所述裂解液由47.765g盐酸胍溶于100ml灭菌超纯水中制得。

10.  根据权利要求1或4所述的一种提取禽类全血DNA的方法，其特征在于，所述蛋白酶K由20mg蛋白酶K溶于1ml灭菌超纯水中制得。

一种提取禽类全血DNA的方法
技术领域
本发明涉及一种提取禽类全血DNA的方法。
背景技术
基因组DNA包含了细胞中全部的遗传信息，在分子实验中的PCR检测试验和HLA基因分型中，模板基因组DNA制备的质量是实验成功与否的关键。禽类血液基因组DNA提取的方法较多，选择简易、快速、价格低廉、纯度好、得率高的方法是提取基因组DNA的重要条件。而目前使用的DNA提取方法提取时间都较长，在分子实验室中常用的DNA提取方法是“酚-氯仿”法。
“酚-氯仿”法具体步骤如下：
试验前先对所用器具，试剂，耗材进行高压灭菌。
①冻血液在室温融化以后，取50μL移至离心管中，加入500μLSTE缓冲液，10μL SDS，加入10μL蛋白酶K(浓度为10μg/μL)，混合，上下充分摇动，37℃摇床水浴2小时，然后55℃水浴过夜。
②将溶液冷却至室温，加入等体积苯酚，轻摇离心管20分钟，直至两相混合形成乳浊液，4℃，12000r/min离心10分钟。
③取上清，再加入等体积苯酚，轻摇离心管10分钟，4℃，12000r/min离心10分钟。
④取上清，加入等体积酚∶氯仿∶异戊醇混合液(24∶23∶1)，缓慢颠倒离心管10分钟，4℃，12000r/min离心10分钟。
⑤取上清，加入等体积氯仿，缓慢颠倒离心管10分钟，4℃，12000r/min离心10分钟。
⑥取上清，加入2倍体积的预冷-20℃冰乙醇沉淀DNA，缓慢的转动离心管，可见白色DNA沉淀。
⑦4℃，12000r/min离心10分钟，去上清，然后加4℃预冷的70％乙醇快速冲洗两次，12000r/min离心10分钟，去上清。
⑧将DNA置于室温下自然风干干燥(注意不能太干燥)，根据沉淀的量加入适量(100-200μL)TE(pH8.0)缓冲液溶解，置4℃冰箱溶解过夜；溶解后的DNA可贮于4℃、-20℃、-70℃中备用。
注意在抽吸上清液时，尽量小心勿将中间的蛋白质层抽出。
在这种常规提取DNA的方法的缺点：
1、第②③④部均要涉及到苯酚的使用。苯酚属于剧毒物品，可经呼吸道、皮肤和消化道吸收。
苯酚的毒理学：
低浓度酚能使蛋白变性，高浓度能使蛋白沉淀。对皮肤、粘膜有强烈的腐蚀作用，也可抑制中枢神经系统或损害肝、肾功。
水溶液比纯酚易经皮肤吸收，而乳剂更易吸收。吸入的酚大部分滞留在肺内，停止接触很快排出体外。吸收的酚大部分以原形或与硫酸、葡萄糖醛酸或其他酸结合随尿排出，一部分经氧化变为邻苯二酚和对苯二酚随尿排出，使尿呈棕黑色(酚尿)。
人口服致死量报道不一，LD为2～15g，或MLD为140mg/kg，14g/kg。国外报道酚液污染皮肤面积为25％，10分钟死亡，血酚为0.74mmlo/L。
2、提取时间较长：
在这个方法中第一步中需要37℃摇床水浴2小时，然后55℃水浴过夜，这个步骤需要耗时至少12小时，这样使DNA提取的时间变成。
在公开号为CN 101215558A专利中公布了一种全血DNA的提取方法。该方法在提取第一步时要需要置于50℃水浴20～28小时，同时也涉及到加入苯酚，而且需要加入100μL抗凝血。
在实际操作过程中，有血液样本资源十分宝贵，来源有限，不可再生，丢失会造成无法估计的损失，其后果无法挽回。
因此，需要一种高效、快速、安全的DNA提取方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种高效、快速、安全的提取禽类全血DNA的方法。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：一种提取禽类全血DNA的方法，包括下述步骤：1)冷冻血液在室温融化以后，取血液22μl加入离心管，再加入缓冲液860μl、裂解液100μl、蛋白酶K 15μl，总体积不超过1000μl；漩涡振荡5分钟，使其完全混匀；2)56℃金属浴或水浴消化至少3小时；3)加入预冷的氯仿500μl，旋转混合5分钟，使其完全混匀；4)13000r/min离心5分钟，吸取上层水相；5)在上清液中加入等体积预冷的的异丙醇，缓慢摇动离心管5分钟；6)13000r/min离心5分钟，使DNA贴到离心管壁上，弃上清液；7)用预冷的70％乙醇洗涤沉淀物2次，每次洗涤后，13000r/min离心8分钟，弃上清液；8)于真空干燥器中或45℃烘箱中干燥DNA沉淀物，待团块透明后，视沉淀大小，加入100～200μl TE溶液充分溶解DNA，-20℃冰箱中保存。
所述缓冲液由Tris-base 0.6057g、NaCl4.383g、EDTA0.29225g、SDS 5g定容至500ml，用NaOH调节pH，使pH保持在8.0～8.3之间。
所述裂解液是浓度为47.765g/100ml的盐酸胍。
所述蛋白酶K的浓度为20mg/ml。
所述TE溶液由pH 8.0浓度1mol/L的Tris-HCl 10ml，pH 8.0浓度为0.5mol/L EDTANa₂2ml，加入ddH2O到1000ml，混匀，调pH至8.0，定溶至1000ml制得。
所述预冷的氯仿、预冷的的异丙醇、预冷的70％乙醇其预冷温度均为-20℃。
所述步骤4)中吸取上层水相500～600μl到另一干净的离心管中，吸取时不搅动或吸到下面两相。
在试验前先对本方法中所用器具、试剂、耗材进行高压灭菌。
所述裂解液由47.765g盐酸胍溶于100ml灭菌超纯水中制得。
所述蛋白酶K由20mg蛋白酶K溶于1ml灭菌超纯水中制得。
综上，本发明的有益效果是：
1、在本发明的提取方法中，只需要加入22μl微量的抗凝血，且在整个提取过程中不会涉及到苯酚等剧毒药品的使用，因此，本发明的提取方法对操作人员身体无伤害，相对于现有的提取方法更安全。
2、本发明整个提取过程耗费时间最快4小时内即可完成。因此，本发明提取时间短，相对于现有提取方法更为快速。
3、由于血液样本资源十分宝贵，来源有限，不可再生，丢失会造成无法估计的损失，本发明的提取方法只需要微量的抗凝血即可完成DNA的提取，相对于现有方法更为高效。
附图说明
图1是采用酚-氯仿法提取的DNA的检测图；
图2是本发明提取方法提取的DNA的检测图。
具体实施方式
本发明具体步骤如下：试验前先对所用器具，试剂，耗材进行高压灭菌。具体步骤如下：
①冷冻血液在室温融化以后，取血液22μl加入离心管，再加入缓冲液860μl+裂解液100μl+蛋白酶K15μl，总体积不超过1000μl；漩涡振荡5分钟，使其完全混匀；
②56℃金属浴(水浴)消化3小时以上；
③加入预冷的(-20℃)氯仿500μl，旋转混合5分钟，使其完全混匀；
④13000r/min离心5分钟，吸取上层水相(500～600μl)到另一干净的离心管中，注意不要搅动或吸到下面两相；
⑤在上清液中加入等体积预冷的(-20℃)的异丙醇，缓慢摇动离心管5分钟；
⑥13000r/min 离心5分钟，使DNA贴到离心管壁上，弃上清液；
⑦用预冷的(-20℃)70％乙醇洗涤沉淀物2次，每次洗涤后，13000r/min离心8分钟，弃上清液；
⑧于真空干燥器中或45℃烘箱中干燥DNA沉淀物，待团块透明后，视沉淀大小，加入100～200μl TE溶液充分溶解DNA，-20℃冰箱中保存。
1)缓冲液配方：
Tris-base 0.6057g+NaCl4.383g+EDTA 0.29225g+SDS 5g，定容至500ml，用NaOH调节pH，使pH保持在8.0～8.3之间。
2)裂解液配方：盐酸胍47.765g/100ml；取盐酸胍47.765g，溶于100ml灭菌超纯水中。
3)蛋白酶K：20mg/ml；20mg蛋白酶K，溶于1ml灭菌超纯水中。
4)TE(1000ml)：
1mol/L Tris-HCl(pH 8.0)10ml，0.5mol/L EDTANa2(pH 8.0)2ml，加入ddH2O到1000ml，混匀，调pH至8.0，定溶至1000ml。
在本发明的提取方法中，只需要加入22μl微量的抗凝血，且在整个提取过程中不会涉及到苯酚的使用，同时，整个提取过程耗费时间最快4小时内即可完成。因此，本发明具有了高效，只需要微量的抗凝血；快速，一次提取最快4小时内可完成；安全，整个提取过程中不涉及到苯酚等剧毒药品的使用，这三个特点。
为了验证该方法的可行性，先用酚-氯仿法和本专利中提到的新方法进行同一批次30个鸡血液样本DNA抽提进行比较：
将两种不同方法提取DNA后在部分紫外光下检测图列出，酚-氯仿法提取检测图见图1所示，本发明的提取方法提取的DNA的检测图见图2所示，从2个图中可以看出，酚-氯仿法提取DNA后，检查图看到拖尾现象严重，点样孔有亮点，说明DNA纯度不高；图3中用本专利提取的DNA图清晰，无拖尾现象，十分有利于进行下一步试验。
在实验室DNA的纯度检测，一般使用紫外分光光度计测定260nm以及280nm的样品吸收值之比值进行判定DNA，OD260/OD280值约为1.7-1.9，说明DNA纯度较好；若小于1.7有可能有蛋白污染；若大于2.0，说明有RNA污染或DNA已经降解。
先将用2种不同方法提取30只鸡血的OD260/OD280值列于下表中对比：


本对比试验是在同一环境下，同一实验员，在严格按照抽提步骤的前提下进行的DNA提取。从列表中可以看出，用本发明新方法的OD260/OD280值基本都在1.7到1.9之间，说明DNA抽提效果好，利于开展下一步的实验；而酚-氯仿法提取DNA的OD260/OD280比值大多都低于1.7，说明该方法提取DNA有一定的缺陷。