一株用于生产L天冬酰胺酶Ⅱ的工程菌及其构建方法和应用.pdf

本发明是关于一株新的用于生产L-天冬酰胺酶II的工程菌，其胞外表达产物具备L-天冬酰胺酶II蛋白活性。本发明也公开了其构建方法和发酵培养条件。其中，该工程菌由重组质粒pET-ASP转化大肠杆菌BL21而得到；重组质粒pET-ASP的结构如图1所示。所述重组工程菌是将L-天冬酰胺酶II基因连接在表达质粒pET22b上，得重组质粒pET-ASP；再用重组质粒pET-ASP转化大肠杆菌BL21。将该工程菌进行发酵培养能大规模生产L-天冬酰胺酶II，且原料来源广，成本低，产物在发酵液中，分离纯化步骤少，得率高。

1.  一株用于生产L-天冬酰胺酶II的重组工程菌，其特征在于：该工程菌由重组质粒pET-ASP转化大肠杆菌BL21而得到；其中重组质粒pET-ASP的构建如图1所示。

2.  权利要求1所述重组工程菌的构建方法，包括以下步骤：
1)将L-天冬酰胺酶II基因连接在表达质粒pET22b上，得重组质粒pET-ASP；
2)用重组质粒pET-ASP转化大肠杆菌BL21得到重组工程菌。

3.  根据权利要求2所述的重组工程菌的构建方法，其特征在于，所说的L-天冬酰胺酶II基因是通过下述步骤获得：从E.coli JM109中分离提取染色体DNA；用PCR方法从上述染色体DNA中钓取L-天冬酰胺酶II基因。

4.  一种用权利要求1所述重组工程菌生产L-天冬酰胺酶II的方法，其特征在于，是将重组工程菌进行培养发酵，表达产生L-天冬酰胺酶II。

5.  如权利要求4所述的生产L-天冬酰胺酶II的方法，其特征在于：用于重组工程菌培养的培养基为：
种子培养基配方为：牛肉膏含量5g/L～25g/L，蛋白胨含量5g/L～20g/L，NaCl含量8g/L～15g/L，氨苄青霉素含量为0.02g/L～1.85g/L，pH值为6.5～7.8；
摇瓶培养基配方为：酵母浸出膏含量15g/L～40g/L，蛋白胨含量8g/L～30g/L，甘油含量2g/L～10g/L，pH值为6.5～7.8；
发酵培养基配方：玉米浆含量50g/L～150g/L，甘油含量为5g/L～30g/L，pH为6.5～7.5。

6.  如权利要求5所述的生产L-天冬酰胺酶II的方法，其特征在于：所述种子培养配方为：牛肉膏含量5g/L～10g/L，蛋白胨含量9g/L～15g/L，NaCl含量9g/L～13g/L，氨苄青霉素含量为0.08g/L～1.25g/L，pH值为6.9～7.3；
所述的摇瓶培养基配方为：酵母浸出膏含量20g/L～25g/L，蛋白胨含量11g/L～15g/L，甘油含量3g/L～6g/L，pH值为6.9～7.3；
所述的发酵培养基配方为：玉米浆含量为70g/L～100g/L，甘油含量为9g/L～14g/L，pH为6.9～7.3。

7.  如权利要求4所述的生产L-天冬酰胺酶II的方法，其特征在于：培养条件如下：
摇瓶培养条件：接种量0.5％～5％，温度30℃～40℃，振荡转速180rpm～300rpm，装液量8％～25％，培养0h～10h后加入诱导剂IPTG，终浓度为1g/L～10g/L，诱导8h～24h。优选的摇瓶培养条件为：接种量1％～2％，温度35℃～38℃，振荡转速200rpm～230rpm，装液量10％～15％，培养1h～4h后加入诱导剂IPTG，终浓度为2g/L～4g/L，诱导1h～4h；
发酵培养条件：接种量1％～10％，发酵温度30℃～40℃，搅拌速度160rpm～280rpm，罐压0.02MPa～0.10MPa，装液量40％～75％，通风量1∶0.4VVM～1∶2.0VVM，培养2h～14h后加入诱导剂乳糖，终浓度为1g/L～3g/L，诱导8h～24h。优选的发酵培养条件为：接种量1％～5％，发酵温度35℃～38℃，搅拌转速190rpm～230rpm，罐压0.04MPa～0.08MPa，装液量55％～70％，通风量1∶0.7VVM～1∶1.0VVM，培养8h～11h后加入诱导剂乳糖，终浓度为3g/L～6g/L，诱导10h～14h。

一株用于生产L-天冬酰胺酶Ⅱ的工程菌及其构建方法和应用
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体涉及一株胞外表达L-天冬酰胺酶II的工程菌，及其构建方法和应用。本发明是利用现代生物技术、基因工程方法来构建胞外表达L-天冬酰胺酶II的工程菌，并选择合适的培养基和培养方法，使得到的酶活力达到较高水平。
背景技术
L-天冬酰胺酶(E.C.3.5.1.1)可催化L-天冬酰胺水解成天冬氨酸和氨，人们已从不同细菌源获得了L-天冬酰胺酶。
1953年，Kidd发现豚鼠血清有抗肿瘤作用。后来，Broome证实了豚鼠血清的抗肿瘤因子是血清中的L-天冬酰胺酶。L-天冬酰胺酶能使敏感肿瘤细胞氨基酸、蛋白质和核酸的代谢紊乱，从而抑制肿瘤生长。
大肠杆菌含有天冬酰胺酶的两种同工酶：L-天冬酰胺酶I和L-天冬酰胺酶II。L-天冬酰胺酶I位于胞质溶胶中，对天冬酰胺的亲和性低。L-天冬酰胺酶II(Accession：NP 417432)位于周质，对天冬酰胺具有高亲和性。因此，L-天冬酰胺酶II可通过去除细胞外的天冬酰胺，来治疗依赖L-天冬酰胺进行蛋白质合成的肿瘤或癌症，其在治疗白血病，例如急性淋巴细胞白血病中特别有效。
基因重组技术的出现，使人们可以根据自己的意愿表达蛋白质。通过国内外专利及文献检索发现，已有用基因工程菌来表达并生产L-天冬酰胺酶，但酶都定位于细胞内周质空间中，胞外表达的报道极少，还没有用于工业生产。本发明的目的是将原本存于在细胞内周质中的L-天冬酰胺酶II转移到细胞外，以便于产物回收。
本发明提供了一种不同于CN1705880A中所公开的工程菌的构建方法以及培养条件。
发明内容
本发明提供了表达L-天冬酰胺酶II工程菌，及其构建和发酵培养方法。
本发明所说的表达L-天冬酰胺酶II工程菌，由重组质粒pET-ASP转化大肠杆菌BL21而得到；其中重组质粒pET-ASP的结构如图1所示。
上述重组工程菌的构建方法，包括以下步骤：
1)将L-天冬酰胺酶II基因连接在表达质粒pET22b上，得重组质粒pET-ASP；
2)用重组质粒pET-ASP转化大肠杆菌BL21得到重组工程菌。
所说的L-天冬酰胺酶II基因，可通过基因工程技术从大肠杆菌中获得。作为本发明的一个实例，所说的L-天冬酰胺酶II基因是从E.coli JM109中分离提取染色体DNA，再用PCR方法从上述染色体DNA中钓取得到。
应用本发明重组工程菌生产L-天冬酰胺酶II的方法，是将重组工程菌进行培养发酵，表达产生L-天冬酰胺酶II。将发酵液离心或过滤除去菌体，清液过亲和层析柱，洗脱液脱盐后冷冻干燥，即可得到产品。
上述生产方法中，具体地，用于重组工程菌培养的培养基为：
1)种子培养基配方为：牛肉膏含量5g/L～25g/L，蛋白胨含量5g/L～20g/L，NaCl含量8g/L～15g/L，氨苄青霉素含量为0.02g/L～1.85g/L，pH值为6.5～7.8；优选的配方为：牛肉膏含量5g/L～10g/L，蛋白胨含量9g/L～15g/L，NaCl含量9g/L～13g/L，氨苄青霉素含量为0.08g/L～1.25g/L，pH值为6.9～7.3；
2)摇瓶培养基配方为：酵母浸出膏含量15g/L～40g/L，蛋白胨含量8g/L～30g/L，甘油含量2g/L～10g/L，pH值为6.5～7.8；优选的配方为：酵母浸出膏含量20g/L～25g/L，蛋白胨含量11g/L～15g/L，甘油含量3g/L～6g/L，pH值为6.9～7.3；
3)发酵培养基配方为：玉米浆含量50g/L～150g/L，甘油含量为5g/L～30g/L，pH为6.5～7.5；优选的配方为：玉米浆含量为70g/L～100g/L，甘油含量为9g/L～14g/L，pH为6.9～7.3。
上述生产方法中，具体地，培养条件如下：
摇瓶培养条件：接种量0.5％～5％，温度30℃～40℃，振荡转速180rpm～300rpm，装液量8％～25％，培养0h～10h后加入诱导剂IPTG，终浓度为1g/L～10g/L，诱导8h～24h。优选的摇瓶培养条件为：接种量1％～2％，温度35℃～38℃，振荡转速200rpm～230rpm，装液量10％～15％，培养1h～4h后加入诱导剂IPTG，终浓度为2g/L～4g/L，诱导1h～4h；
发酵培养条件：接种量1％～10％，发酵温度30℃～40℃，搅拌速度160rpm～280rpm，罐压0.02MPa～0.10MPa，装液量40％～75％，通风量1∶0.4VVM～1∶2.0VVM，培养2h～14h后加入诱导剂乳糖，终浓度为1g/L～30g/L，诱导8h～24h。优选的发酵培养条件为：接种量1％～5％，发酵温度35℃～38℃，搅拌转速190rpm～230rpm，罐压0.04MPa～0.08MPa，装液量55％～70％，通风量1∶0.7VVM～1∶1.0VVM，培养8h～11h后加入诱导剂乳糖，终浓度为3g/L～6g/L，诱导10h～14h。
本发明的优点：可进行大规模生产L-天冬酰胺酶II，原料来源广，成本低，产物在发酵液中，分离纯化步骤少，得率高。
附图说明
图1是重组质粒pET-ASP结构示意图。
图2是重组质粒pET-ASP构建示意图。
具体实施方式
本发明包括如下一些工艺步骤：从能够合成L-天冬酰胺酶II的原始菌株中分离染色体DNA、引物设计、用PCR方法钓取酶的基因、基因序列测定、重组质粒的构建、重组质粒在宿主菌中表达、工程菌的发酵培养。本发明重组质粒的构建及工程菌的培养方法的上述各步详细内容如下：
1.从合成L-天冬酰胺酶II的原始菌株中分离染色体DNA
原始菌株为大肠杆菌JM109(购自Sigma公司)，在LB培养基中37℃培养过夜，离心收集菌体，加溶菌酶至终浓度1mg/mL，0℃作用15min，加RNase至终浓度100μg/mL，37℃作用30min，加蛋白酶K至终浓度100μg/mL，37℃作用2h后用苯酚∶氯仿(1∶1)将蛋白抽提5次，移出水相，加入1/10体积3mol/L乙酸钠溶液，加入2.5倍体积-20℃预冷的无水乙醇，小心混匀后用无菌牙签顺时针缠绕取出沉淀DNA，放至4℃TE缓冲液中逆时针释放DNA，即得提取的染色体DNA。
2.引物设计和PCR方法钓取酶基因
用于构建重组质粒的L-天冬酰胺酶II的基因是通过PCR方法从上述染色体DNA中扩增得到的。两个引物是根据已报导的大肠杆菌L-天冬酰胺酶II的基因序列及表达质粒的多克隆酶切位点而设计的。Nco I在酶基因的5’端，并以其中的ATG为起始密码子，Xho I在酶基因的3’端。其中：
primer-1：5’-_CCA TGG CAT TAC CCA ATA TCA-3’
primer-2：5’ -CTC GAG GTA CTG ATT GAA GAT CT-3’
以上述染色体DNA为模板，在上述一对引物的引导下进行PCR，产物为比大肠杆菌JM109的L-天冬酰胺酶基因N端少63bp的核酸序列。
PCR反应：染色体DNA模板1.5μg，2.5UTaq聚合酶，100pmol DNA引物，2.5mMdNTP 2μL，10×缓冲液2.5μL，加无菌水至终体积25μL，每循环中95℃变性30sec，55℃退火40sec，72℃延伸90sec，循环30次后72℃延伸10min。
所得PCR产物在1％agarose中电泳，产物大小约1kb。
3.重组质粒的构建
重组质粒的构建分两个步骤：构建重组T-载体和构建重组表达载体。详细内容如下：
1)构建重组T-载体
所采用的T-载体购自Takara公司，其特点是：质粒载体已经切开成直链状，且在两端加上poly T形成的黏性末端，便于与PCR产物连接，T-载体上含有抗氨苄青霉素基因(Amp^r)。
PCR产物与T-载体在T4-DNA连接酶的作用下连接成重组T-载体T-ASP(图2)，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，其转化方法和条件如下：用CaCl₂法制备宿主菌感受态细胞(《分子克隆实验指南》)。将5μL重组T-载体与100μL感受态细胞混合，于冰上放置30min，42℃90sec，后置于冰上2min，加入900μL LB培养基，于37℃培养1h，后取100μL涂布于LB平板上(100μg/mL Amp)，平板上预先涂布40μL X-gal(20mg/mL)和4μL IPTG(200mg/mL)。平板37℃放置过夜，挑取白色菌落于LB液体培养基中，37℃过夜培养后提取质粒。质粒提取采用碱裂解法：37℃过夜培养的菌体离心，沉淀加入100μL溶液I，完全打开沉淀后加入200μL溶液II，小心混匀后冰上放置5min，加入150μL溶液III，小心混匀后冰上放置5min，离心，上清液用苯酚∶氯仿(1∶1)抽提1次，水相用2.5倍体积的无水乙醇沉淀重组质粒DNA，沉淀用75％乙醇洗涤，干燥后用4℃ TE溶液溶解。
提取得到的重组质粒DNA用Nco I和Xho I双酶切，酶切产物经低熔点胶电泳，切下所需的带(L-ASP gene)进行回收纯化。
2)构建重组表达载体
所用表达载体pET22b购自Novagen公司，其主要特点是：在多克隆位点中设计了pelB信号肽序列，可以将插入其后的基因表达产物引导至细胞外；在多克隆位点下游设计有6×His标签，有利于产物的分离纯化。
表达质粒pET22b用Nco I和Xho I酶切，酶切产物经低熔点胶电泳，切下所需的带(大片断)进行回收纯化。将两次胶回收产物用上述同样的方法进行连接，得到重组表达载体pET-ASP(如图1、图2)。
4.重组表达载体转化宿主获得重组工程菌
将重组表达载体转入至大肠杆菌BL21中，即可得到将L-天冬酰胺酶分泌到细胞外的工程菌。其转化方法和条件如下：用CaCl₂法制备宿主菌感受态细胞(《分子克隆实验指南》)，宿主菌BL21购自Sigma公司。将5μL重组质粒与100μL感受态细胞混合，于冰上放置30min，42℃90sec，后放冰上2min，加入900μL LB培养基，于37℃培养1h，后取100μL涂布于LB平板上(100μg/mL Amp)，37℃放置过夜，即得到含重组表达载体的工程菌pET-ASP。
5.工程菌的发酵培养
工程菌的种子培养基是：牛肉膏含量5g/L～25g/L，蛋白胨含量5g/L～20g/L，NaCl含量8g/L～15g/L，氨苄青霉素含量为0.02g/L～1.85g/L，pH值为6.5～7.8。0.15MPa灭菌20min，冷却后加入氨苄青霉素，终浓度0.002％～0.185％。
工程菌的摇瓶培养基是：酵母浸出膏含量15g/L～40g/L，蛋白胨含量8g/L～30g/L，甘油含量2g/L～10g/L，pH值6.5～7.8，0.15MPa灭菌20min。
工程菌的发酵培养基是：玉米浆含量50g/L～150g/L，甘油含量为5g/L～30g/L，pH 6.5～7.5，0.15MPa灭菌30min。
摇瓶发酵：用过夜培养的工程菌作为种子液，接种量为0.5％～5％，30℃～40℃培养0h～10h后加入诱导剂IPTG，终浓度为1g/L～10g/L，继续培养8h～24h后停止发酵。
发酵罐发酵：用过夜培养的工程菌作为种子液，接种量为1％～10％，30℃～40℃培养2h～14h后加入诱导剂乳糖，终浓度为1g/L～30g/L，继续培养8h～24h后停止发酵。
酶活力测定方法：取1mL发酵液，6000rpm离心10min，取上清液为待测酶液。测定步骤：取0.50mL 0.04mol/L L-天冬酰胺溶液作为底物，加入0.45mL 0.05mol/L Tris缓冲液，0.05mL待测酶液，37℃下反应10min，加入0.10mL 1.5mol/L三氯乙酸终止反应。离心后取上清液，加入3.50mL蒸馏水和1.0mL奈氏试剂，混合均匀后放置10min，于480nm波长处用比色法测定吸光度值。
酶活力定义：在上述条件下，每分钟催化L-天冬酰胺水解释放1μmol氨所需的酶量定义为一个酶活力单位。
通过以上的技术实施，本发明得到了一个含L-天冬酰胺酶基因的重组质粒pET-asp，该重组质粒在大肠杆菌BL21中转化后得到一个重组基因工程菌，该工程菌可以将L-天冬酰胺酶分泌到细胞外，在发酵培养诱导后，基质中的酶活力可达20～45U/mL。
实施例1
按照上述五步工艺方法构建L-天冬酰胺酶工程菌和培养该工程菌，一具体实施例如下：
首先取已知菌种大肠杆菌JM109分离提取染色体DNA。主要是：37℃培养过夜的JM109培养液离心收集菌体，加溶菌酶至终浓度1mg/mL，0℃作用15min，加RNase至终浓度100μg/mL，37℃作用30min，加蛋白酶K至终浓度100μg/mL，37℃作用2h后用苯酚∶氯仿(1∶1)将蛋白抽提5次，移出水相，加入1/10体积3mol/L乙酸钠溶液，加入2.5倍体积-20℃预冷的无水乙醇，小心混匀后用无菌牙签顺时针缠绕取出沉淀DNA，放至4℃TE缓冲液中逆时针释放DNA，即得提取的染色体DNA。
然后用PCR方法钓取酶基因。方法如下：染色体DNA模板1.5μg，2.5U Taq聚合酶，100pmol DNA引物，2.5mM dNTP 2μL，10×缓冲液2.5μL，加无菌水至终体积25μL，每循环中95℃变性30sec，55℃退火40sec，72℃延伸90sec，循环30次后72℃延伸10min。
所得的PCR产物与T载体连接，得到的重组T-载体转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，其转化方法和条件如下：用CaCl₂法制备宿主菌感受态细胞(《分子克隆实验指南》)。将5μL重组T-载体与100μL感受态细胞混合，于冰上放置30min，42℃90sec，后放冰上2min，加入900μLLB培养基，于37℃培养1h，后取100μL涂布于LB平板上(100μg/mL Amp)，平板上预先涂布40μL X-gal(20mg/mL)和4μL IPTG(200mg/mL)。平板37℃放置过夜，挑取白色菌落于LB液体培养基中，37℃过夜培养后提取质粒。质粒提取采用碱裂解法：37℃过夜培养的菌体离心，沉淀加入100μL溶液I，完全打开沉淀后加入200μL II，小心混匀后冰上放置5min，加入150μL溶液III，小心混匀后冰上放置5min，离心，上清液用苯酚∶氯仿(1∶1)抽提1次，水相用2.5倍体积的无水乙醇沉淀重组质粒DNA，沉淀用75％乙醇洗涤，干燥后用4℃ TE溶液溶解。
将所得到的重组质粒用Nco I和Xho I双酶切，酶切产物经低熔点胶电泳，回收小片段。将此小片段用T4-DNA连接酶连接在用相同方法处理后回收的pET-22b大片段上，得到重组表达质粒。
将此重组表达质粒转化在大肠杆菌JM109中，方法与上述重组质粒转化DH5α相同，最后取100μL涂布于LB平板(100μg/mLAmp)上，37℃放置过夜。
最后摇瓶培养工程菌：1个装有3mL种子培养基(5g/L牛肉膏，10g/L蛋白胨，10g/L NaCl，pH7.2)的10mL小试管，经0.15MPa灭菌20min后接入氨苄青霉素，终浓度0.1g/L，再接入工程菌斜面，37℃振荡培养过夜，以此作为种子液。
在250mL三角瓶中装入30mL摇瓶培养基(20g/L酵母浸出物，16g/L蛋白胨，5g/L甘油，pH7.0)，0.15MPa灭菌20min，接入0.3mL上述过夜培养种子液，37℃振荡培养4h，加入诱导剂IPTG，终浓度3g/L，继续培养14h，最后发酵液中L-天冬酰胺酶活力为40.4U/mL。
实施例2
本实施例中，方法和条件与实施例1相同，不同之处仅在于加入诱导剂的终浓度为5g/L。最后所得发酵液中L-天冬酰胺酶活力为39.6U/mL。
实施例3
本实施例中，方法和条件与实施例1相同，不同之处仅在于工程菌的发酵培养在5升发酵罐中进行，诱导剂由IPTG改为乳糖。
将工程菌斜面接入已灭好菌的装有50mL种子培养基的250mL三角瓶中，37℃培养过夜。
在5L发酵罐中装入3L发酵培养基(70g/L玉米浆，8g/L甘油，pH7.2)，0.15MPa灭菌30min，接入30mL上述过夜培养液。37℃培养8h，接入诱导剂乳糖，终浓度3g/L，继续培养12h，最后发酵液中L-天冬酰胺酶活力为32.4U/mL。
实施例4
本实施例中，方法和部分条件与实施例3相同，不同之处仅在于诱导剂乳糖的浓度为5g/L，37℃培养10h后加入乳糖，最后所得发酵液中L-天冬酰胺酶活力为36.8U/mL。
实施例5
取实施例1所得的发酵液25mL，6000rpm离心10min，取上清液20mL以1mL/min的流速通过镍琼脂糖凝胶柱(1.6×20cm，柱体积10mL)，用50mmol/LpH7.4的磷酸缓冲液冲洗，流速为2mL/min，然后用pH7.4的50mmol/L咪唑-磷酸缓冲液洗脱，流速为2mL/min。经检测，收集的洗脱液中L-天冬酰胺酶的纯度提高了2.4倍，相对于培养介质中最初的重组L-天冬酰胺酶，回收得率为85％。