一种淫羊藿苷化学对照品的分离制备方法 【技术领域】
本发明涉及一种从淫羊藿提取物中分离获得纯度大于98％的淫羊藿苷化学对照品的制备方法，主要包括初步柱分离或醇沉除杂脱色以及快速的高效液相制备方法规模化制备。
背景技术
淫羊藿(Herba Epimedii)是我国使用最为悠久的中药之一，具有补肾阳、强筋骨、祛风湿的功效。现代研究表明，淫羊藿具有抗骨质疏松、增强性功能、增加心脑血管血流量、促进造血功能、增强免疫、抗衰老、抗炎、抗肿瘤等多方面药理作用。淫羊藿苷是淫羊藿的主要活性成分，也是我国2005版国家药典中淫羊藿药材的含量测定成分，并规定其在药材中的含量应达0.5％以上。淫羊藿苷的结构式如下：
淫羊藿苷的分离制备方法主要有：胡云峰等(中国专利CN200510061251.1，2007年公开)采用浸提、脱杂、萃取、树脂吸附、干燥五大工序获取不同含量的淫羊藿苷(5％-50％)；田景振等(山东中医药大学学报.2004，28(6)：456-458)用大孔吸附树脂法可获得60.30％含量的淫羊藿苷；梁冉等(西北农业学报2005，14(2)：141～14)采用30％乙醇超声波辅助提取、聚酰胺柱及乙酸乙酯萃取的工艺可获得60％含量的淫羊藿苷，进一步重结晶可获得90.94％含量的淫羊藿苷。文献(Liu Renmin，et al.Journal of Chromatography A，1064，2005，53-57)还报道了高速逆流色谱法制备98％含量的淫羊藿苷，但仅仅是实验室规模且使用特殊的设备和昂贵有毒的流动相。目前，高效液相制备色谱用于大规模(克级以上)制备98％含量的淫羊藿苷的工作还未见报道。
【发明内容】
本发明在整合各种淫羊藿苷制备方法基础上，通过样品预处理研究、高效液相色谱填料的选择、快速色谱条件的开发、进样体积及浓度的优化，以及检测波长的选择等多方面研究，发明了一种低成本、快速的高效液相制备色谱方法，制备规模可达20g/月并且保证纯度(＞98％)及产品色泽。本发明的目的是开发出一种可以获得十克级规模并且纯度在98％以上的淫羊藿苷化学对照品的制备新方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案：
一种淫羊藿苷化学对照品的分离制备方法，以质量含量≥20％，优选50％以上淫羊藿苷提取物为原料，经初步柱分离或醇沉除杂脱色，以制备型高效液相色谱为分离手段，以一定比例的含乙腈水溶液为洗脱体系，获得月产20g规模且纯度大于98％的淫羊藿苷化学对照品；具体步骤为：
1)初步柱分离或醇沉除杂脱色：
柱分离除杂脱色：淫羊藿苷提取物用水或体积浓度40-80％乙醇水溶液溶解，上树脂柱或聚酰胺柱分离，以乙醇-水溶液梯度洗脱，其中乙醇的体积浓度从0％-70％变化，收集体积浓度50-70％乙醇洗脱物，浓缩干燥得黄色粉末；
或醇沉除杂脱色：将淫羊藿苷提取物用40-80％乙醇水溶液溶解，离心得沉淀物、或静置≥4小时过滤沉淀物，沉淀物烘干后可得黄色粉末；
2)高效液相制备：
黄色粉末用体积浓度40-80％的乙醇水溶液溶解，配置成浓度为50～150mg/ml的供试品溶液，经0.45μm微孔滤膜过滤；采用柱长为10-50cm、直径为1-10cm的高效液相制备色谱柱进行分离，六通阀或泵进样，进样体积为1-50ml，以体积浓度为15-55％的乙腈水溶液为洗脱体系，流速控制在10-400ml/min，在线紫外检测，收集纯度大于98％的淫羊藿苷流份；
3)淫羊藿苷化学对照品的获得：
上述流份直接浓缩至干、或用甲醇或乙醇重结晶即可得到纯度大于98％的黄白色淫羊藿苷对照品。
上述方法中，初步柱分离用树脂以非极性大孔吸附树脂较好。高效液相制备过程采用的流动相中乙腈的体积浓度为20-30％；高效液相制备柱的填料为C6、C8或C18键合相填料，其粒径为5～20μm，紫外检测波长优选270nm、318nm或349nm，具体检测波长根据样品中淫羊藿苷信号的超载情况而定。
以本发明从淫羊藿提取物中分离淫羊藿苷化学对照品具有如下优点和进步：
1.本发明以制备型高效液相为分离手段，使淫羊藿苷得到高效分离，可以获得纯度在98％以上的淫羊藿苷化学对照品。
2.本发明发展的高效液相制备方法为快速制备方法，单针分离时间在10-20分钟之间，非常适合大批量化学对照品的制备；同时加上制备溶剂的回收再利用，可实现批量制备的低成本。
3.本发明采用紫外检测器在线检测，淫羊藿苷的分离情况可以直接检测，可直接选择性收集高纯度流份，从而实现纯度保证下的高回收率。
4.本发明在制备高效液相之前增加了除杂脱色步骤，一方面可有效延长色谱柱的使用寿命，另一方面保证了产品具有好的色泽度。
总之，本发明工艺步骤简单、周期短、纯度高、色泽好，并且可大规模生产。
【附图说明】
图1为重结晶前淫羊藿苷的HPLC分析图谱(270nm)，其积分报告如下：
Name Retention Time Area ％Area 1 1.661 15090 0.05 2 2.522 1909 0.01 3 2.722 10334 0.03 4 3.390 8783 0.03 5 4.709 53338 0.17 6 8.354 11070 0.04 7 9.097 59791 0.19 8 淫羊藿苷 11.261 30832346 99.48
图2为重结晶后淫羊藿苷的HPLC分析图谱(270nm)，其积分报告如下：
Name Retention Time Area ％Area 1 1.666 12113 0.03 2 2.635 77282 0.21 3 3.396 4958 0.01 4 4.385 4795 0.01 5 4.613 12192 0.03 6 8.931 66448 0.18 7 淫羊藿苷 11.119 36908028 99.52
【具体实施方式】
现结合实施例和附图对本发明做进一步详细说明，实施例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。
实施例1：
本实施例中，以50％地淫羊藿苷提取物为原料，以10μmC18键合相填料为吸附剂，以含有乙腈-水(30∶70，体积比)溶液为洗脱溶剂，具体工艺步骤如下：
1)脱色
提取物用70％乙醇水溶液溶解，静置12小时，过滤，沉淀物烘干后得黄色粉末。
2)高效液相制备
上述黄色粉末用70％乙醇水溶液溶解，配置成浓度为50mg/ml的供试品溶液，经0.45μm微孔滤膜过滤；制备型高效液相柱填料品牌为ChromatorexC18键合相填料，粒径为10μm；柱长19cm，直径7.5cm；六通阀进样，进样体积为10ml；以30％乙腈-水溶液为洗脱体系，流速控制在160ml/min，在线紫外检测，收集含有淫羊藿苷的高纯度流份；
3)淫羊藿苷化学对照品的获得
上述流份直接浓缩至干即可得到纯度为99.48％的淫羊藿苷对照品(黄白色粉末)(图1)；黄白色粉末用甲醇重结晶得到纯度为99.52％的淫羊藿苷对照品(黄白色结晶)(图2)。
实施例2
本实施例中，以50％淫羊藿苷提取物为原料，以5μm的C18键合相填料为吸附剂，以含有乙腈-水(25∶75，体积比)溶液为洗脱溶剂，具体工艺步骤如下：
1)脱色
提取物用70％乙醇水溶液溶解，离心，过滤，沉淀物烘干后得黄色粉末。
2)高效液相制备
上述黄色粉末用60％乙醇水溶液溶解，配置成浓度为80mg/ml的供试品溶液，经0.45μm微孔滤膜过滤；制备型高效液相柱填料品牌为McirosorbC18键合相填料，粒径为5μm；柱长17cm，直径5cm；六通阀进样，进样体积为2ml；以25％乙腈-水溶液为洗脱体系，流速控制在60ml/min，在线紫外检测，优选检测波长270nm，收集含有淫羊藿苷的高纯流份；
3)淫羊藿苷化学对照品的获得
上述流份直接浓缩至干即可得到纯度为98.84％的淫羊藿苷对照品(黄白色粉末)；黄白色粉末用甲醇重结晶得到纯度为99.45％的淫羊藿苷对照品(黄白色结晶)。
实施例3：
本实施例中，以20％的淫羊藿苷提取物为原料，以10μm C18键合相填料为吸附剂，以含有乙腈-水(30∶70，体积比)溶液为洗脱溶剂，具体工艺步骤如下：
1)脱色
提取物用40％乙醇水溶液溶解，上HPD树脂柱(I.D.6×68)，乙醇-水梯度洗脱，收集50％乙醇洗脱物，浓缩干燥得黄色粉末。
2)高效液相制备
黄色粉末用70％乙醇水溶液溶解，配置成浓度为100mg/ml的供试品溶液，经0.45μm微孔滤膜过滤；制备型高效液相柱填料品牌为ChromatorexC18键合相填料，粒径为10μm，柱长22cm，直径7.5cm；泵进样，进样体积为20ml；以30％乙腈-水溶液为洗脱体系，流速控制在160ml/min，在线紫外检测，优选检测波长318nm或349nm，收集含有淫羊藿苷的高纯流份；
3)淫羊藿苷化学对照品的获得
上述流份直接浓缩至干即可得到纯度为98.16％的淫羊藿苷对照品(黄白色粉末)。黄白色粉末用甲醇重结晶得到纯度为99.10％的淫羊藿苷对照品(黄白色结晶)。
实施例4
本实施例中，以33％的淫羊藿苷提取物为原料，以5μm的C18键合相填料为吸附剂，以含有乙腈-水(28∶72，体积比)溶液为洗脱溶剂，具体工艺步骤如下：
1)脱色
提取物用60％乙醇水溶液溶解，离心，过滤，沉淀物烘干后得黄色粉末。
2)高效液相制备
黄色粉末用70％乙醇水溶液溶解，配置成浓度为60mg/ml的供试品溶液，经0.45μm微孔滤膜过滤；制备型高效液相柱填料品牌为Mcirosorb C18键合相填料；粒径为5μm；柱长17cm，直径5cm；六通阀进样，进样体积为5ml；以28％乙腈-水溶液为洗脱体系，流速控制在60ml/min，在线紫外检测，收集含有淫羊藿苷的高纯流份；
3)淫羊藿苷化学对照品的获得
上述流份直接浓缩至干即可得到纯度为98.84％的淫羊藿苷对照品(黄白色粉末)；黄白色粉末用甲醇重结晶得到纯度为99.45％的淫羊藿苷对照品(黄白色结晶)。