一种3-去乙酰基-7-氨基头孢烷酸的制备方法 【技术领域】
本发明涉及一种药品原料的制备方法，具体地说是一种3-去乙酰基-7-氨基头孢烷酸的制备方法。
背景技术
3-去乙酰基-7-氨基头孢烷酸简称D-7-ACA，由于D-7-ACA的7位氨基和3位羟基较活泼，因而可以根据需要引入不同侧链合成一系列头孢类抗生素，如头孢呋辛、头孢匹罗、头孢卡品酯、头孢克肟、头孢地尼、头孢他定等。头孢类抗生素具有广谱抗菌性，毒副作用小等特点，是目前临床应用最广泛的抗生素品种，用量很大，而随着头孢类抗生素用量的增加和对新型头孢类抗生素的开发，对D-7-ACA的需求也在不断增加。
目前制备D-7-ACA的方法主要有两种：a.头孢菌素C钠盐(或锌盐)通过酯化、氯化、醚化和水解四步反应得到7-ACA(7-氨基头孢烷酸)溶液，加氨水结晶，然后再将7-ACA溶解，用氢氧化钠或头孢菌素酯酶裂解得到D-7-ACA。b.头孢菌素C钠盐用D-氨基酸氧化酶和戊二酰-7-ACA酰化酶催化得到7-ACA溶液，加盐酸结晶，然后再将7-ACA溶解，用氢氧化钠或头孢菌素酯酶裂解得到D-7-ACA。上述现有的D-7-ACA制备方法：工艺路线长且都要经历头孢菌素C钠盐(或锌盐)、7-ACA、D-7-ACA三次结晶过程，由于结晶过程收率损失多，导致收率低，测算方法a和b从头孢菌素C提取液到D-7-ACA的摩尔收率分别为65.2％和67.8％，此外，方法a采用化学裂解，其过程耗用大量深冷与溶媒，而反应物料中使用的二氯甲烷、苯胺、氯硅烷等还均为有毒有害的强污染物，使得D-7-ACA的生产要承担较重的能耗成本与治污成本；方法b采用酶法制备得到7-ACA，然后再用化学法或酶法裂解得到D-7-ACA，由于酶法裂解7-ACA结晶时面临结晶产品发粘、难以离心和干燥的问题，需要添加溶媒辅助结晶，并使用大量的分离设备，导致能耗和人工成本增加。
【发明内容】
本发明所要解决的技术问题是克服上述现有技术的不足，而提供一种工艺路线短、产品收率高、制造成本低且适用于大规模生产的3-去乙酰基-7-氨基头孢烷酸的制备方法。
本发明解决其技术问题所采取的技术方案为：这种工艺路线短、产品收率高、制造成本低且适用于大规模生产的3-去乙酰基-7-氨基头孢烷酸的制备方法，它是：
a.以浓度为30～50g/L的头孢菌素C提取液为原料，用D-氨基酸氧化酶催化制备戊二酰-7-ACA溶液，其中投入D-氨基酸氧化酶的量以1L头孢菌素C提取液的投料量投入2.5～6.0KU D-氨基酸氧化酶计；
b.将戊二酰-7-ACA酰化酶和头孢菌素酯酶按一定比例混合后加入制备的戊二酰-7-ACA溶液中，催化戊二酰-7-ACA制得3-去乙酰基-7-氨基头孢烷酸溶液，其中投入戊二酰-7-ACA酰化酶的量以1L头孢菌素C提取液的投料量投入3.0～7.0KU戊二酰-7-ACA酰化酶计，投入头孢菌素酯酶的量以1L头孢菌素C提取液的投料量投入1.0～3.5KU头孢菌素酯酶计；
c.通过加酸结晶、洗涤、干燥得到固体3-去乙酰基-7-氨基头孢烷酸。
具体的制备过程可以是：
1.取浓度为60～100g/L的头孢菌素C提取液(碳酸氢钠解析的头孢菌素C纳滤浓缩液、醋酸钠解析的头孢菌素C纳滤浓缩液或醋酸铵解析的头孢菌素C浓缩液)用无盐水配制成30～50g/L的溶液，投入到酶反应器I中；
2.以1L头孢菌素C提取液的投料量投入2.5～6.0KU D-氨基酸氧化酶计，称取D-氨基酸氧化酶投入到酶反应器I中，滴加浓度为3mol/L的氨水，反应控制的pH为7.1～7.6，温度为20～28℃，通氧量为0.1～0.3vvm，罐压为1.0～2.0bar，反应时间60～120min。反应结束后，通过酶反应器底部筛网截留酶，将生成的戊二酰-7-ACA溶液转移到酶反应器II中；
3.以1L头孢菌素C提取液的投料量投入3.0～7.0KU戊二酰-7-ACA酰化酶、1.0～3.5KU头孢菌素酯酶计，称取戊二酰-7-ACA酰化酶和头孢菌素酯酶混合后投入到酶反应器II中，滴加浓度为3mol/L的氨水，反应控制的pH为8.0～8.5，温度为20～28℃，反应时间80～110min。反应结束后，通过酶反应器底部筛网截留酶，将生成的D-7-ACA溶液转移到烧杯中；
4.将D-7-ACA溶液降温到0～10℃，滴加10％盐酸调节pH至5.0～5.8到溶液混浊，养晶30min，然后继续滴加盐酸至pH3.8～4.2，养晶4h，抽滤，用1∶1丙酮水混合液洗涤，再40～50℃干燥2～4h得到固体3-去乙酰基-7-氨基头孢烷酸。
本发明所提供的这种3-去乙酰基-7-氨基头孢烷酸的制备方法，制备3-去乙酰基-7-氨基头孢烷酸只需两步常温反应和一次结晶过程，工艺路线短，且基本不使用溶媒，从头孢菌素C提取液到3-去乙酰基-7-氨基头孢烷酸的摩尔收率可达到71.5％，产品收率高，此外，与现有技术相比，无论是能源消耗，还是动力成本、人工成本、环保成本都比现有技术的方法a和b低很多，使用本方法生产成本比现有技术的方法a可降低40％左右，比现有技术的方法b可降低30％左右。
【具体实施方式】
实施例中分析方法：
1.D-氨基酸氧化酶(DAAO)的酶活测定：
配制5％的头孢菌素C(CPC)溶液(用100mmol/L pH8.0的磷酸缓冲液配制)，取50ml配制液置于100ml烧杯中，控制温度25℃，通入氧气(流量40L/h)，搅拌并计时5min，取样用HPLC检测，记录初始头孢菌素C峰面积。取2g D-氨基酸氧化酶倒入上述反应液中，控制温度25℃，通入氧气(流量40L/h)，搅拌，计时10min，取样用HPLC检测，记录头孢菌素C峰面积。D-氨基酸氧化酶酶活的定义为：1个D-氨基酸氧化酶酶活单位(U)是指25℃时，在测试条件下，每分钟转化1μmol的头孢菌素C所需酶的量。
2.戊二酰-7-ACA酰化酶(GAC)的酶活测定：
配制2％的戊二酰-7-ACA(GL-7-ACA)溶液(用50mmol/L pH8.0的磷酸缓冲液配制)，取50ml配制液置于100ml烧杯中，控制温度25℃，用0.1mol/L的氢氧化钠控制pH8.0，称取0.5g戊二酰-7-ACA酰化酶倒入上述反应液中，计时10min，记录2min、10min的氢氧化钠消耗量。戊二酰-7-ACA酰化酶酶活的定义为：1个戊二酰-7-ACA酰化酶酶活单位(U)是指在25℃时，PH8.0，1分钟内将1μmol戊二酰-7-ACA转化成7-ACA所需酶的量。
3.头孢菌素酯酶(CE)的酶活测定：
配制5％的头孢菌素C(CPC)溶液(用20mmol/L pH8.0的磷酸缓冲液配制)，取40ml配制液置于100ml烧杯中，控制温度25℃，用0.1mol/L的氢氧化钠控制pH8.0，称取0.3g头孢菌素酯酶倒入上述反应液中，计时5min，记录2min、5min地氢氧化钠消耗量。头孢菌素酯酶酶活的定义为：1个头孢菌素酯酶酶活单位(U)是指在25℃时，PH8.0，1分钟内将1μmol头孢菌素C转化成去乙酰头孢菌素C(D-CPC)所需酶的量。
4.HPLC检测条件
色谱柱：C18 5μm，250×4.6mm
流动相：20mmol/L pH6.0的醋酸铵缓冲液∶乙腈＝960∶40，流速1.5ml/min
检测波长：260nm
检测方法：精确取1ml样品稀释到适宜浓度，用0.45μm膜过滤，注射20μl溶液到HPLC。
保留时间：D-CPC 2.0min，D-7-ACA 2.2min，CPC 5.8min，7-ACA6.8min，GL-7-ACA 9.0min
实施例1
一种工艺路线短、产品收率高、制造成本低且适用于大规模生产的3-去乙酰基-7-氨基头孢烷酸的制备方法，具体的制备过程是：
1.取浓度为83.3g/L的碳酸氢钠解析的头孢菌素C纳滤浓缩液用无盐水配制1L浓度为31.5g/L的头孢菌素C溶液，投入到1.5L酶反应器I中；
2.称取2.5KU D-氨基酸氧化酶，用无盐水洗涤后投入到酶反应器I中，搅拌速度400rpm，用3mol/L的氨水控制pH为7.1～7.5，温度20℃，通氧量0.1vvm，罐压1.0～1.2bar，反应60min后，将反应液转入酶反应器II中(D-氨基酸氧化酶被酶反应器底部筛网截留)；
3.分别称取3.0KU戊二酰-7-ACA酰化酶和1.0KU头孢菌素酯酶混合后用无盐水洗涤，投入到酶反应器II中，搅拌速度400rpm，用3mol/L的氨水控制pH为8.0，温度20℃，反应80min后，将反应液转入2L烧杯中(戊二酰-7-ACA酰化酶和头孢菌素酯酶被酶反应器底部筛网截留)；
4.将反应液降温到5℃，滴加10％盐酸调节pH至5.56，静置养晶30min，然后继续滴加盐酸至pH4.01，养晶4h，抽滤，用100ml水洗二次，用100ml的1∶1丙酮水洗二次，50℃干燥3h得到固体3-去乙酰基-7-氨基头孢烷酸，总摩尔收率72.5％。
实施例2
一种工艺路线短、产品收率高、制造成本低且适用于大规模生产的3-去乙酰基-7-氨基头孢烷酸的制备方法，具体的制备过程是：
1.取浓度为95.1g/L的醋酸钠解析的头孢菌素C纳滤浓缩液用无盐水配制1L浓度为33.5g/L的头孢菌素C溶液，投入到1.5L酶反应器I中；
2.称取4.0KU D-氨基酸氧化酶，用无盐水洗涤后投入到酶反应器I中，搅拌速度400rpm，用3mol/L的氨水控制pH为7.1～7.6，温度20℃，通氧量0.2vvm，罐压1.4～1.5bar，反应60min后，将反应液转入酶反应器II中(D-氨基酸氧化酶被酶反应器底部筛网截留)；
3.分别称取5.0KU戊二酰-7-ACA酰化酶和2.0KU头孢菌素酯酶混合后用无盐水洗涤，投入到酶反应器II中，搅拌速度400rpm，用3mol/L的氨水控制pH为8.5，温度22℃，反应80min后，将反应液转入2L烧杯中(戊二酰-7-ACA酰化酶和头孢菌素酯酶被酶反应器底部筛网截留)；
4.将反应液降温到5℃，滴加10％盐酸调节pH至5.51，静置养晶30min，然后继续滴加盐酸至pH 4.12，养晶4h，抽滤，用100ml水洗二次，用100ml的1∶1丙酮水洗二次，50℃干燥3h得到固体3-去乙酰基-7-氨基头孢烷酸，总摩尔收率73.1％。
实施例3
一种工艺路线短、产品收率高、制造成本低且适用于大规模生产的3-去乙酰基-7-氨基头孢烷酸的制备方法，具体的制备过程是：
1.取浓度为67.3g/L的醋酸铵解析的头孢菌素C浓缩液用无盐水配制1L浓度为40.2g/L的头孢菌素C溶液，投入到1.5L酶反应器I中；
2.称取6.0KU D-氨基酸氧化酶用无盐水洗涤后投入到酶反应器I中，搅拌速度400rpm，用3mol/L的氨水控制pH为7.1～7.6，温度20℃，通氧量0.3vvm，罐压1.4～1.5bar，反应70min后，将反应液转入酶反应器II中(D-氨基酸氧化酶被酶反应器底部筛网截留)；
3.分别称取7.0KU戊二酰-7-ACA酰化酶和3.5KU头孢菌素酯酶混合后用无盐水洗涤，投入到酶反应器II中，搅拌速度400rpm，用3mol/L的氨水控制pH为8.5，温度28℃，反应80min后，将反应液转入2L烧杯中(戊二酰-7-ACA酰化酶和头孢菌素酯酶被酶反应器底部筛网截留)；
4.将反应液降温到5℃，滴加10％盐酸调节pH至5.70，静置养晶30min，然后继续滴加盐酸至pH3.91，养晶4h，抽滤，用100ml水洗二次，用100ml的1∶1丙酮水洗二次，50℃干燥3h得到固体3-去乙酰基-7-氨基头孢烷酸，总摩尔收率71.5％。