高效去除水体中亚硝态氮、硝态氮和氨氮的施氏假单胞菌CY003及其应用 【技术领域】
本发明属于水环境微生物治理技术领域，具体涉及一株去除水体中亚硝态氮、硝态氮和氨氮的施氏假单胞菌CY003的筛选及应用。
技术背景
目前，我国在水污染防治方面做了很多工作，但是养殖水体和天然水体富营养化问题仍然非常严峻。调查表明(金相灿等，1995)：我国大部分湖泊、水库已达到富营养化或超过富营养化程度。水体的“富营养化”使水体变得腥臭难闻，鱼类和其他生物大量死亡，蓝藻暴发，高温季节很多地方无水可饮。水体中含有的营养盐类元素氮、磷超标是引起富营化的主要原因(Rffollety and Jlhatfield，2002)。而随着我国集约化高密度水产养殖的快速发展，养殖水体中氨氮、亚硝态氮含量超标现象非常严重，水体中的亚硝态氮、氨氮是导致水产动物致病的主要根源之一。据农业部和国家环境保护总局近日联合发布的一份公报显示，2003年由于环境污染造成的可测算天然渔业资源经济损失达到36.36亿元。因此水体中氮素的去除，对于保护环境、发展渔业经济和保障人类健康都具有重要的意义。如何经济、高效地去除水体中的氮素已成为水污染控制领域的研究重点和热点。
氮以有机氮和无机氮两种形态存在于水体中。有机氮有蛋白氮、多肽、氨基酸和尿素等，它们来源于饲料残饵、生活污水、农业废弃物(植物秸秆、牲畜粪便等)和工业废水(如羊毛加工、制革、印染、食品加工等)。无机氮指主要以NH3、NH4+、N2、N2O、NO、NO2-、NO2、NO3-等价态存在(郑平等，2004)，许多研究证明，除了分子态氮以外，所有无机氮素循环中间产物积累均会对人类和环境产生不良影响。氨氮、硝态氮和亚硝态氮是水体中无机氮的主要存在形式。
氮素在水体的转化主要是依靠微生物的作用，生物脱氮(biological nitrogenremoval，BNR)方法是指通过微生物的硝化和反硝化作用来脱除水体中的氮素污染(Prakasam and Loehr，1972)。硝化作用是指硝化菌将氨氮氧化成硝酸盐氮的过程，包括两个步骤：第一步是由亚硝酸菌(Nitrosobacter)将氨氮转化为亚硝酸盐，第二步是由硝酸菌(Nitrobacter)从将亚硝酸盐转化为硝酸盐。反硝化作用是指反硝化细菌将硝态氮(盐)、亚硝态氮(盐)及其它氮氧化物转变为氮气或氮的其它气态氧化物的生物学过程(Kim et al，2005)。反硝化细菌是所有能以NO3-为最终电子受体，HNO3还原为N2的细菌总称，在种类学上没有专门的类群，分散于10个不同的细菌科中。一般条件下，反硝化细菌都是利用氧气作为电子受体，而在含氧量很低或缺氧的条件下能利用硝酸盐及亚硝酸盐中氧进行呼吸，并释放N2。大多数反硝化细菌是异养型兼性厌氧细菌，能够利用多种有机物作为电子受体。自然界中最普遍的反硝化菌属是假单胞菌属(Pseudomonas)，其次是产碱杆菌属(Alcaligenes)。
传统理论认为，细菌的反硝化是一个严格的厌氧过程。反硝化菌优先使用DO(dissolved oxygen)呼吸，阻止了硝酸盐或亚硝酸盐作为最终电子受体。这成为制约传统生物脱氮技术研究应用的瓶颈：一方面，亚硝酸细菌为化能自养菌，生长速率缓慢，导致反应启动时间长，并且亚硝酸细菌对污水组成成分、pH和温度等的改变都敏感(Mobarry et al，1996)。另一方面，硝化过程是在好氧环境中完成的，而反硝化是在缺氧过程中进行的。这使得整个脱氮过程必须经过好氧和缺氧两个环节(Joo et al，2005)。然而，Robertson和Kuenen在实验室中观察到在氧气存在的条件下发生了反硝化现象，细菌好氧反硝化的发现，突破了传统理论的认识，为生物脱氮技术提供了一种崭新的思路。人们在各种不同的环境下诸如土壤，沟渠，池塘，活性污泥，沉积物等都分离出了一些好氧反硝化菌。国内外很多研究者发现并分离出好氧反硝化菌，大致可归为：产碱菌属(Alcaligenes)、副球菌属(Paracoccus)、假单胞菌属(Pseudomonas)及红球菌属(Rhodococcus)等。这些微生物均能在好氧的条件下将硝酸盐或者亚硝酸盐还原。
近年来国内外对氮污染的治理日益重视，生物脱氮技术因其迅速安全倍受青睐。而作为生物脱氮技术之一的细菌好氧反硝化与传统的细菌厌氧反硝化相比更具有以下独特优势：
①细菌能在有氧条件下进行反硝化，使得硝化和反硝化能够同时进行。硝化的产物可直接作为反硝化作用的底物，避免了硝酸、亚硝酸的积累对硝化反应的抑制，加速了硝化-反硝化进程。且反硝化释放出的OH-可部分补偿硝化反应所消耗的碱，能使系统中pH值相对稳定。
②与传统的化学自养硝化菌不同，好氧反硝化菌(多数也是异养硝化菌)可将氨在好氧条件下直接转化成气态产物，且反应可由单一反应器一步完成。这降低了操作难度和运行成本。
③大部分好氧反硝化菌能很好适应厌氧(或缺氧)周期变化，在有氧/缺氧交替时具有生态生长优势。其生长速度快、产量高，要求的溶解氧浓度较低，能在偏酸性环境中生长。细菌培养投资少，且反应速度快，反硝化彻底，适合治理大面积氮污染水域。
④养殖水体和天然水体的溶氧一般在4mg/L以上，厌氧生物脱氮无法实现，而好氧反硝化菌能够在高溶氧条件下快速脱氮，生长繁殖。
【发明内容】
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，在好氧条件下筛选一株能高效好氧反硝化的细菌，该菌具有高效好氧反硝化的特点，可以利用有机碳源，在污水中快速生长和脱氮，同时不产生NO2及N2O，并且能在不同的自然环境温度下生长，有很强的实际应用价值，该细菌的高效脱氮性能在国内尚属首次报道，理论研究意义巨大。
本发明通过以下技术方案实现：
申请人于2006年7月从中国湖北省荆州市护城河底泥中分离得到一株对亚硝态氮有高降解能力的菌株，其在好氧条件下对氨氮及亚硝态氮都有很好的降解能力。经形态观察，生理生化试验和16S rDNA鉴定，该CY003菌株在分类学上属于施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)。申请人于2009年9月10日将该菌株送交湖北省武汉市武汉大学内地中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏编号(CCTCC NO)：M 209196。
与此同时，申请人公开了筛选能去除水体中的亚硝态氮、硝态氮和氨氮的施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)CY003的方法，包括下列步骤：
1.微生物选择富集培养：
将水样静置弃去上清液，取池塘污泥接种于加杜氏小管的试管中(反硝化培养基)，接种量为1～5％，在20～35℃温箱中培养2～3d，将其观察杜氏小管中是否有气体产生；对于把产气的试管，基本可以确定基本没有所需菌株。
2.取产气的试管，从中吸取0.1ml，梯度稀释至合适浓度，涂布在BTB固体培养基平板中，30℃温箱中培养2～3d，平板倒置；
3.从BTB培养基固体培养基中挑取蓝色单菌落，接种于反硝化硝化培养基液体培养基中，接种量5～10％，在30～35℃、120～180rpm的条件下恒温振荡培育2～3d，测定硝酸盐，亚硝酸盐的含量。硝态氮基本消耗的培养液，即为目的菌株。
4.取所筛目的菌株连续转接10代，测定其反硝化，确定是否遗传稳定，遗产稳定即为所需。
本筛选方法可以高通量筛选样品中是否含有反硝化细菌，直观的通过产气验证，并且达到定向富集的作用，减少后续工作量，达到快速筛选的目的，适合从大量样品中分离分析反硝化微生物。所筛选的好氧反硝化细菌可以利用亚硝酸盐作为唯一氮源的培养基中正常生长繁殖，对环境有较强的适应能力，遗传稳定，在实际工程应用中有较大的发展潜力。
以下对本发明作进一步的描述：
本发明所用的菌株分离筛选方法、降解力测定方法及所分离筛选得到的菌株的特性如下：
一、菌株分离筛选、降解力测定及相关培养基的制备：
反硝化培养基：硝酸钾2.0g、七水合硫酸镁0.2g、磷酸氢二钾0.5g、酒石酸钾钠20g、蒸馏水1L、pH 7.2(加20g琼脂即为固体培养基)，121℃湿热灭菌30分钟。
BTB筛选培养基：L-天冬酰胺酸1g、KNO3(或者NaNO2)1g、KH2PO4 1g、琥珀酸钠8.5g、FeCl2.6H2O 0.05g、CaCl2.2H2O 0.2g、MgSO4.7H2O 0.07g、1ml/L BTB[pH指示剂溴百里酚](1％，溶于乙醇)，琼脂20g、pH 7.0～7.2。
二、施氏假单胞菌CY003株的分离和筛选：
将水样静置弃去上清液，取活性污泥接种于加杜氏小管的试管中(反硝化培养基)，接种量为2％，在20～35℃温箱中培养2d，观察杜氏小管中是否有气体产生；没产气的试管，基本可以确定基本没有所需菌株。取产气的试管，从中吸取0.1ml，梯度稀释至合适浓度，涂布在BTB固体培养基平板中，30℃温箱中培养2～3d，平板倒置。从BTB培养基固体培养基中挑取蓝色单菌落，接种于反硝化硝化培养基液体培养基中，接种量1％，在25～30℃、120～180rpm的条件下恒温振荡培育2～3d，测定亚硝态氮、硝态氮和氨氮的含量。亚硝态氮基本消耗的培养液，即为目的菌株。取所筛目的菌株连续转接10代，测定其反硝化，确定是否遗传稳定，遗产稳定即为所需。
将本发明筛选的菌株CY003的16SrDNA序列用常用的细菌16SrDNA测序方法检测(Alfreider等，2002)，该CY003 16SrDNA序列见表1，将CY00316SrDNA序列到NCBI网站进行BLAST序列比对，发现其与多株施氏假单胞菌的序列同源性达到99％，经鉴定，确定本发明分离的菌株为一株施氏假单胞菌，其分类命名为Pseudomonas stutzeri。
表1 CY00316SrDNA序列
CY003 16S rDNA 序列 TCGGAGATCGATCCTCCGTCTTACCGTCCCCCCGAAGGTTAGACTAGCTACTTCT GGAGCAACCCACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTA TTCACCGTGACATTCTGATTCACGATTACTAGCGATTCCGACTTCACGCAGTCGA GTTGCAGACTGCGATCCGGACTACGATCGGTTTTATGGGATTAGCTCCACCTCGC GGCTTGGCAACCCTTTGTACCGACCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGCCGTAA GGGCCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTC TCCTTAGAGTGCCCACCTTAACGTGCTGGTAACTAAGGACAAGGGTTGCGCTCGT TACGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACC TGTGTCAGAGTTCCCGAAGGCACCAATCCATCTCTGGAAAGTTCTCTGCATGTCA AGGCCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTT GTGCGGGCCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTAACCTTGCGGCCGTACTCCCCAGG CGGTCGACTTAATGCGTTAGCTGCGCCACTAAGATCTCAAGGATCCCAACGGCTA GTCGACATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCA CGCTTTCGCACCTCAGTGTCAGTATTAGCCCACGTGGTCGCCTTCGCCACTGGTG TTCCTTCCTATATCTACGCATTTCACCGCTACACAGGAAATTCCACCACCCTCTG CCATACTCTAGCTCGCCAGTTTTGGATGCAGTTCCCAGTTGAGCCCGGGGCTTTC ACATCCACTTAACGACCCACCTACGCGCGCTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAAC GCTTGCACCCTTTCGTATACCGCGCTGCTGGCACGAAGTAAGCGGTGCTATTCTG TTGTAACGTCAAAACACAAGGTATTACTTACTGCCTTTCCTCCCACTTAAGTGCT TACAATCGAAGACTTCTTCACACACGCGGCATGCTGATCAGCTCGCCCATTGTCA GTTCCCCACTGCTGCCTCGTAGGACTGAACGGTTCAGTCCCGTTACAGATACTCT TTGACGTTACGGACTCGCTCTTGGGAGCTATCCAGAATGTCTAATCCGCAAGTCA CTGAATCTGAGCTCGAGTTCGCGATTCCTGGGCCATCGTTGCCTTACGCT
三、施氏假单胞菌菌株CY003的菌学特征：
CY003株为革兰氏阴性菌，杆状，菌落淡黄色；氧化酶、产氨、淀粉水解及硝酸盐还原试验为阳性，甲基红、V.P、硫化氢、明胶液化、精氨酸脱羧、赖氨酸脱羧、尿素水解及柠檬酸盐实验阳性，可以在6.5％ NaCl固体培养基生长，葡萄糖、蔗糖、木糖、乳糖、麦芽糖及甘露醇发酵产酸不产气，生长温度范围4～55℃，最适生长温度范围22～35℃。
四、菌株CY003对亚硝态氮、硝态氮和氨氮的降解性能及测试方法
1、对氨氮的降解和利用：
(1)降解力测定：将菌株CY003接种于反硝化细菌液体培养基，经24h活化后，6000r/min离心5分钟，倒掉上清液用生理盐水将实验菌株做成菌浓度为1×106cfu/mL菌悬液，接种1％菌悬液到氨氮浓度为100mg/L的水样，水体温度25±1℃，pH7.2±0.5，定时取样离心，测定氨氮的降解率。
(2)不同温度下对氨氮的降解情况：将经过24小时活化后浓度为1×106cfu/mL的CY003菌悬液按1％的接种量接入异养硝化细菌培养液，分别放在15℃，28℃，40℃条件下培养，定时取样离心后取上清液，测定不同温度下，菌株CY003对氨氮的降解能力。
对氨氮的降解和利用情况：菌株CY003对氨氮降解的温度范围为15～40℃，在15℃条件下，经过2天的培养，氨氮降解率达到87％以上，在最适温度范围(25～40℃)，菌株CY003能在24小时内将约100mg/L的氨氮降解98％。同时测定培养液上清液中的硝态氮和亚硝态氮，无这两种中间产物产生。
2、对亚硝态氮、硝态氮的降解和利用：
用亚硝酸钠或者硝酸钠代替反硝化培养液中的硫酸铵，使C/N比为8，灭菌后，接入1％24小时活化后浓度为1×106cfu/mL的CY003菌悬液，每隔一定时间取样，离心后取上清液于220nm和275nm处测定硝态氮的含量，于540nm处测定亚硝态氮的含量，对照标准曲线确定硝态氮和亚硝态氮的降解率。
降解情况：好氧培养条件下，菌株CY003可在以亚硝酸钠或硝酸钠为唯一氮源的培养基中生长。经过24h培养，可将初始浓度为100mg/L的硝态氮和100mg/L的亚硝态氮分别降解为0.61mg/L与0mg/L，降解率分别为99.4％和100％。通过测定总氮发现，24％的氮被细胞同化转化为内源氮，其余氮均转化为氮气，无N2O产生。在二者降解过程中均没有检测到亚硝态氮和氨态氮的积累。以硝态氮为氮源时，亚硝态氮的积累量最多只有0.09mg/L。
五、菌株CY003的动物安全性测定
将菌株CY003转接到肉汤液体培养基中，培养24h后离心去掉上清液，制成菌含量为2×1011cfu/mL的液体水剂，分别投加到各养殖水体，观察其对水生动物的安全性。各个浓度组试验鱼为30尾，虾每个浓度组30只，以长74cm×宽78cm×高47cm的玻璃缸作为试验容器，每个玻璃缸装经充分曝气的自来水200L，用加热棒加热并控制水温为25±1℃，pH7.2～7.8。
A、对异育银鲫的急性毒性试验
10ppm、100ppm、1000ppm、5000ppm CY003细菌使用后，9天内试验鱼均摄食活动正常，成活率100％，2×1011cfu/mL浓度的CY003细菌对异育银鲫的96小时LD50＞5000ppm。
B、对鲢鱼的急性毒性试验
10ppm、100ppm、1000ppm、5000ppm CY003细菌使用后，9天内试验鱼均摄食活动正常，成活率100％，2×1011cfu/mL浓度的CY003细菌对鲢鱼的96小时LD50＞5000ppm。
C、对淡水青虾的急性毒性试验
10ppm、100ppm、1000ppm的CY003细菌使用后，9天内试验虾均摄食活动正常，成活率100％，5000ppm的CY003细菌使用48h后，水体变浑浊，虾有缺氧症状，9天后成活率80％。2×1011cfu/mL浓度的CY003细菌对淡水青虾的96小时LD50＞1000ppm。
D、对斑点叉尾鮰的急性毒性试验
10ppm、100ppm、1000ppm、5000ppm的CY003细菌使用后，9天内试验鱼均摄食活动正常，成活率100％，2×1011cfu/mL浓度的CY003细菌对斑点叉尾鮰的96小时LD50＞5000ppm。
E、对小白鼠毒性实验
小白鼠随机分组，每组20只，雌雄各10只，给药前称重。试验分口灌给药、拌料给药两组，各组按照高中低三个剂量给药，其中高剂量组分别口灌和拌料给菌2×1011cfu/只，每天给药一次。同时设实验对照组合空白组。
各组小鼠用CY003细菌投喂后，每天观察小白鼠的外表、行为、饮食等情况。30天试验结束于末次给药后24h，采血测定红细胞总数、血红蛋白、白细胞、淋巴细胞、谷草转氨酶、谷丙转氨酶、AST、ALK指标，并对各结果作方差检验。各组小白鼠采血后立即解剖，观察心、肝、脾、肺、肾、胃、脑、子宫、睾丸的病理变化。
30天试验结束后，各试验组合对照组小白鼠的活动、颜色光泽、呼吸排泄均正常，饲料消耗及小白鼠体重增长均无差异(P＞0.1)，心、肝、脾、肺、肾、胃、脑、子宫、睾丸均正常，试验组和对照组小白鼠的血液学和血液生化指标经t检验结果，表明小白鼠口灌和拌料投喂CY003细菌制剂后，t值均＞0.1，两者无差异，表明CY003细菌对小白鼠无毒性。
F、鲫鱼口灌CY003细菌的致病性试验
将CY003细菌培养液离心，用生理盐水稀释至2×1011cfu/mL，分别灌入2mL、0.6mL、0.2mL的CY003细菌稀释液，每2天一次，连灌三次，同时设口灌2mL灭菌LB培养基的对照组，口灌结束后连续观察15天，各试验组和对照组鲫鱼口灌CY003细菌后均未出现死亡，成活率为100％，与对照组相比体重未有明显变化，体表、和内脏未出现异常变化，试验表明口灌CY003细菌对鲫鱼无致病性。
G、注射CY003细菌的致病性试验。
将CY003细菌培养液离心，用生理盐水稀释至2×1011cfu/mL，分别腹腔注射鲫鱼20尾每组，分为2组，各注射1mL、0.5mL的CY003细菌稀释液，对照组注射灭菌生理盐水0.5mL；中华绒螯蟹于第三足基部注射20只，每只注射0.1mL，对照组注射灭菌生理盐水0.1mL；南美白对虾注射20尾，每尾0.1mL，对照组注射灭菌生理盐水0.1mL；小白鼠20只每组，分为2组，各注射1mL、0.5mL的CY003细菌稀释液，对照组注射灭菌生理盐水0.5mL；各动物组观察15天，试验期间水温为25±1℃，水体溶氧在4.0mg/L以上，pH7.35，室温为28±2℃，各试验组均为出现死亡，与对照组相比体重未有明显变化，体表、和内脏未出现异常变化，试验表明注射CY003细菌对水产动物无致病性。
六、菌株CY003的环境安全性测定
蚤类是淡水生物的重要类群，是淡水生态系统中物质循环和能量流动中的重要环节。它们对各种毒物有很强敏感性。国内外已广泛用其评价各种产品的毒性，进行水污染监测及制定各种水质标准。本试验选择了淡水常见生物多刺裸腹蚤(Moina macrocopaStraus)作为试验生物，研究菌株CY003对其的毒性，为确认菌株CY003对生态环境安全性建立提供必要的参数。
试验动物品种：多刺裸腹蚤(Moina macrocopa Straus)是室内长期培养的孤雌生殖的单个幼蚤，母蚤采自长江水产研究所窑湾基地的成鱼试验场。选用实验室条件下培养3代以上的、出生6～24h的幼蚤为试验蚤，试验蚤应是同一母体的后代，试验时选取健康活泼个体。每小烧杯中放入用稀释水洗净的试验蚤10只。
饲养条件：以高活性干酵母(安琪酵母股份有限公司生产)为饵。在1～2L的圆玻璃缸或烧杯中，加入500～1000mL培育水(自然曝气3d以上的自来水过滤)，加人10～20个多刺裸腹蚤，用40℃左右的水溶化干酵母后投喂，每天早晚各一次。在室内日光灯(距离2～3m)下进行培养，培养温度22±1℃，pH7.2±0.5，溶解氧3mg/m3以上，每周全换培养液1～2次。选择怀卵量高的水蚤10～20个，投喂充足的饵料，在实验前24h用孔径为1mm的筛子将幼蚤滤去，在实验前6～12h进行第二次过筛，所得到新出生的幼水蚤为出生6～24h大小的幼蚤。
试验方法：将CY003细菌液体培养液离心，用生理盐水稀释至2×1011cfu/mL，选择5个试验浓度，并设置对照组。试验水中的菌株CY003的试验浓度分为100ppm、1000ppm、2500ppm、5000ppm、10000ppm共5个试验组，空白对照组中不加菌液。试验时用1000mL烧杯注入800mL试验液，每杯中放入用稀释水洗净的试验蚤10只。然后将小烧杯放入水浴锅中培养，控制温度在22±1℃，每天用日光灯(距离2～3m)照射12h。试验期间不投饵，试验时间24h。蚤死亡的判断方法一般采用肉眼观察，检查蚤类停止活动，需反复转动试验容器，以15s内蚤类活动距离不超过本身的长度为标志，即使触角和鳃还能活动或肠子仍在蠕动也算停止活动。
试验结果：在高浓度组，水质变浑，但蚤类活动能力反而增强，没有集群行为，烧杯中上下都有分布。CY003细菌对多刺裸腹蚤的急性试验结果见表2。由表2可以看出，浓度为2×1011cfu/mL的CY003菌液对多刺裸腹蚤的24h-LC50大于10000ppm，远远大于菌株CY003的脱氮使用浓度，正常使用不会造成环境污染和对水生态的影响。
表2 菌株CY003对多刺裸腹蚤急性毒性试验结果(水温21～23℃)
No C K 1 2 3 4 5 浓度 (mg/L) 0 1 0 0 1 0 0 0 2 5 0 0 5 0 0 0 100 00 死亡率 (％) 0 0 0 0 0 0
七、菌株CY003对实际污水的处理能力测定
将CY003细菌培养液离心，用生理盐水稀释至1×106cfu/mL，按1％的接种量接入生活污水中，室温(22～25℃)培养72h测定水体中氨氮和亚硝酸氮的量，结果显示菌株CY003对两种氮源的去除率分别为93.35％和87.43％。按1‰的接种量接入养殖废水中，室温(22～25℃)培养72h测定水体中氨氮和亚硝酸氮的量，结果显示菌株CY003对两种氮源的去除率分别为98.40％和92.75％。实验结果表明，正常发酵情况下，CY003细菌浓度达到1×1010cfu/mL以上时，每升CY003细菌制剂可以用于1000m3水体用于快速脱氮。
八、菌株CY003液体菌剂制备
该菌剂发酵流程是：斜面菌种→活化→三角瓶液体菌种→发酵罐发酵→检验→包装→成品菌剂。
所述的菌剂具体工艺步骤如下
1)将以上所述的，保藏在CCTCC，保藏编号为：NO.M209196，保藏日期：2009年9月10日，接入反硝化培养基：牛肉膏5.0g，硝酸钾3.0g、七水合硫酸镁0.2g、磷酸氢二钾0.5g、酒石酸钾钠20g、蒸馏水1L、pH 7.2(加20g琼脂即为固体培养基)，121℃湿热灭菌30分钟。37℃条件下培养24小时；
2)制作三角瓶液体菌种：将试管菌株接种于反硝化液体培养基上培养，该培养基按以下方法制作：硝酸钾3.0g、葡萄糖5.0g、牛肉膏5.0g、七水合硫酸镁0.2g、磷酸氢二钾0.5g、酒石酸钾钠20g、蒸馏水1L、pH 7.2，121℃湿热灭菌30分钟。
2)发酵罐发酵：在发酵罐中按以下配方调好料：硝酸钾2.0kg、葡萄糖5.0kg、酵母膏8.0kg、亚硝酸钾钠2.0kg、七水合硫酸镁0.2kg、磷酸氢二钾0.5kg、醋酸钠5kg、过滤无菌水1吨。保持32±2℃，接种5％三角瓶液体菌种，充分通气搅拌发酵，72小时发酵完成，检验，包装。
本方法制备的菌液有效活菌数大于1×1010cfu/mL。
【附图说明】
图1：是本发明筛选的假单胞菌CY003对氨氮的降解曲线。图中纵坐标为氨氮，硝态氮，亚硝态氮浓度及OD600的值，横坐标为不同时间观察。
图2：是本发明的假单胞菌CY003在15，28及40℃条件下对氨氮的降解曲线。图中纵坐标为不同温度下氨氮的浓度，纵坐标为不同时间。
图3：是本发明的假单胞菌CY003对硝态氮的降解曲线。图中纵坐标为氨氮，硝态氮，亚硝态氮浓度，横坐标为不同的时间。
图4：是本发明的假单胞菌CY003对亚硝态氮的降解曲线。图中纵坐标为氨氮，硝态氮，亚硝态氮浓度，横坐标为不同的时间。
【具体实施方式】
实施例1、菌株的分离、筛选与鉴定
一、菌株的分离筛选
1、配制如下培养基：
反硝化培养基：硝酸钾2.0g、七水合硫酸镁0.2g、磷酸氢二钾0.5g、酒石酸钾钠20g、蒸馏水1L、pH 7.2(加20g琼脂即为固体培养基)
BTB筛选培养基：L-天冬酰胺酸1g、KNO3(或者NaNO2)1g、KH2PO4 1g、琥珀酸钠8.5g、FeCl2.6H2O 0.05g、CaCl2.2H2O 0.2g、MgSO4.7H2O 0.07g、1ml/L BTB[pH指示剂溴百里酚](1％，溶于乙醇)，琼脂20g、pH 7.2。
2、好氧反硝化菌筛选
①、微生物选择富集培养：将水样静置弃去上清液，取活性污泥接种于加杜氏小管的试管中(反硝化培养基)，接种量为5％，在28℃温箱中培养48h，观察杜氏小管中是否有气体产生。
②、取产气的试管，从中吸取0.1ml，梯度稀释至合适浓度，涂布在BTB固体培养基平板中，28℃温箱中培养48h，平板倒置。
③、从BTB培养基固体培养基中挑取蓝色单菌落，接种于反硝化硝化培养基液体培养基中，接种量5％，在28℃、160rpm的条件下恒温振荡培育48h，测定硝酸盐，亚硝酸盐的含量。硝态氮基本消耗的培养液，即为目的菌株。
④、取所筛目的菌株连续转接10代，测定其反硝化，确定是否遗传稳定，遗产稳定即为所需。
实施例2、施氏假单胞菌CY003对生活污水和养殖废水氨氮的去除能力测定
试验所用生活污水取之荆州东门护城河排污口，测定其氨氮浓度为62.15mg/L，亚硝酸盐浓度为5.2mg/L、pH6.0-6.8；养殖废水取之长江大学黄鳝养殖基地养殖污水，氨氮浓度为5.72mg/L，亚硝酸盐浓度为0.7mg/L，pH7.5-8.5。将浓度为1×107cfu/mL CY003菌剂，按1‰的接种量接入污水中。室温培养72小时，测定两种污水中氨氮的含量，确定污水脱氮能力，具体实验结果见表1。
表3 菌株CY003对氨氮去除效果
表4 菌株CY003对亚硝态氮去除效果