水痘带状疱疹人免疫球蛋白及其原料生产方法.pdf

本发明涉及一种生物制品药物及原料制备方法，特别是涉及一种水痘-带状疱疹人免疫球蛋白及其原料的生产方法。本方法获得的免疫球蛋白含量大于总蛋白含量的98％，Ig?G单体和二聚体含量大于99％，水痘抗体效价大于等于100IU/ml，蛋白质含量小于120g/L，大大提高了产品纯度和稳定性、安全性，有效减少患者的副反应和潜在的不良反应。

1.  一种水痘-带状疱疹人免疫球蛋白，其特征是：免疫球蛋白含量大于总蛋白含量的98％，水痘抗体效价大于等于100IU/ml，蛋白质含量小于120g/L。

2.  根据权利要求1所述的水痘-带状疱疹人免疫球蛋白，其特征是：免疫球蛋白中Ig G单体和二聚体含量大于99％。

3.  如权利要求1所述的水痘-带状疱疹人免疫球蛋白的生产方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)制备用于生产水痘-带状疱疹人免疫球蛋白的抗体效价大于8IU/ml的原料血浆；
(2)低温乙醇分级分离；
(3)离子交换层析法纯化；
(4)低pH孵放灭活病毒处理；
(5)DV₅₀nm膜过滤除病毒；
(6)超滤、配液、除菌、分装。

4.  如权利要求3所述的水痘-带状疱疹人免疫球蛋白的生产方法，其特征在于：离子交换层析纯化是将低温乙醇分离后的过滤液先后通过串联的强阴离子层析柱Q-SepharoseFF和弱阴离子层析柱DEAE-Sepharose FF进行纯化。

5.  如权利要求3或4所述的水痘-带状疱疹人免疫球蛋白的生产方法，其特征在于：所述离子交换层析纯化的操作条件如下：
(A)强阴离子交换树脂柱操作条件：选Q-Sepharose FF凝胶，先用pH6.2-7.7的0.04-0.08mol/L的醋酸盐缓冲平衡液平衡柱子至少5倍柱体积，至pH、紫外吸收值稳定。将过滤除菌液上强阴离子交换树脂柱(选Q-SepharoseFF凝胶)，用以吸附大部分的白蛋白、大多数的IgA及IgM；
(B)弱阴离子交换树脂柱操作条件：选DEAE-Sepharose FF凝胶，先用pH6.2-7.7，电导0.8-1.8mS/cm的醋酸盐缓冲平衡液平衡柱子至少5倍柱体积，至pH、紫外吸收值稳定。流穿液调整至pH6.2-7.7，用醋酸盐缓冲液调整电导至0.8-1.8mS/cm，再上已经平衡完毕的弱阴离子交换树脂柱DEAE-SepharoseFF，用来吸附微量IgM和其它杂蛋白等。得到IgG纯化液。

水痘-带状疱疹人免疫球蛋白及其原料生产方法
技术领域
本发明涉及一种生物制品药物及原料制备方法，特别是涉及一种水痘-带状疱疹人免疫球蛋白及其原料的生产方法。
背景技术
目前，全球特异性免疫球蛋白的应用越来越显示其临床重要性，无论是品种、应用领域，还是适应症都在拓展，尤其是特异性高效价免疫球蛋白的应用增长显著。国际市场特异性免疫球蛋白有乙型肝炎免疫球蛋白、抗D-免疫球蛋白、破伤风免疫球蛋白、狂犬病免疫球蛋白、巨细胞病毒免疫球蛋白等，生产厂家多集中于美国、欧洲，如荷兰CLB和德国Biotest等。而我国只有乙肝、破伤风、狂犬病三种特异性免疫球蛋白，水痘-带状疱疹免疫球蛋白尚没有开发生产，随着人们对于可控疾病预防的认识，水痘-带状疱疹免疫球蛋白的应用越来越引起人们重视，国际上临床需求正以每年20％递增，已远远不能满足市场需求。
水痘-带状疱疹病毒在分娩期妇女、新生儿、器官移植手术、恶性血液病、恶性肿瘤、肾病综合症等需要接受免疫抑制剂、细胞毒性药物或放射治疗的特殊人群中可发生致死性感染，特别是孕妇患水痘，在国外的一项临床研究中，27名婴儿中有两名婴儿患有先天畸形，被认为是与其母亲在妊娠前三个月患水痘从而导致子宫内水痘-带状疱疹病毒感染有关。故对于高危易感人群，在暴露后的特定时间内，及时注射水痘-带状疱疹免疫球蛋白可有效的预防水痘-带状疱疹的发病和其并发症的治疗，在国外水痘-带状疱疹免疫球蛋白已成为预防水痘-带状疱疹及其并发症的重要急需用药。另外，由于抗生素的广泛应用及滥用，使细菌耐药发生率逐年提高，严重影响感染性疾病的治疗效果，威胁着人们的身体健康。
本专利产品是通过补充外源性天然活性水痘-带状疱疹免疫球蛋白来预防水痘的发病和其并发症的治疗，并提高机体的免疫机制来达到预防或控制水痘一带状疱疹病毒的感染。目前国内还没有自己的产品上市，完全依靠进口，价格昂贵且属国家限制的进口产品，很多危重病人得不到及时治疗，
故其开发具有重要实际意义。
发明内容
本发明针对现有技术所存在的不足，而提供了一种水痘-带状疱疹人免疫球蛋白及其原料——含高效价水痘抗体血浆的生产方法。
本发明提供的一种水痘-带状疱疹人免疫球蛋白，含有高效价的水痘抗体，纯度超过98％，即免疫球蛋白含量大于总蛋白含量的98％；Ig G单体和二聚体含量大于99％，水痘抗体效价大于等于100IU/ml，蛋白质含量小于120g/L。
所述免疫球蛋白的使用量为每公斤体重用量20IU/kg。
水痘-带状疱疹人免疫球蛋白的生产方法，包括以下步骤：
(1)制备用于生产水痘-带状疱疹人免疫球蛋白的抗体效价大于8IU/ml的原料血浆；
(2)低温乙醇分级分离：
(A)将冷冻血浆在不高于35℃的水槽中融化，破袋混匀，制备条件控制：pH5.95±0.05、乙醇浓度18-20％、离子强度0.09-0.14、温度-5±0.5℃，加入助滤剂，压滤，得组分I+II+III。
(B)沉淀组分II：将组分I+II+III溶解，溶解温度0～5℃，溶解时间≥2小时，条件控制：乙醇浓度12～16％，离子强度0.014-0.016，pH5.20±0.05，沉淀过程中温度控制在-4±1℃。压滤条件控制：进液压力≤0.24Mpa，出液温度-4±1℃，得上清；上清调pH至6.8-7.4，控制乙醇浓度20-26％，温度-8±1℃，压滤得组分II。
(C)组分II沉淀溶解纯化：溶解用水须符合注射用水标准，溶解温度1～8℃，溶解时间≥2小时。然后过滤、澄清，溶液须澄清透亮。超滤结束制品温度≤15℃，残余乙醇量≤0.025％。超滤液采用0.2μm微孔滤芯过滤。
(3)离子交换层析法纯化：
将低温乙醇分离后的过滤除菌液上强阴离子交换树脂柱，选Q-SepharoseFF凝胶，用以吸附大部分的白蛋白、大多数的IgA及I gM；流穿液再上弱阴离子交换树脂柱DEAE-SepharoseFF，用来吸附微量IgM和其它杂蛋白等。得到IgG纯化液。
所述离子交换层析纯化的操作条件如下：
(A)强阴离子交换树脂柱操作条件：选Q-Sepharose FF凝胶，先用pH6.2-7.7的0.04-0.08mol/L的醋酸盐缓冲平衡液平衡柱子至少5倍柱体积，至pH、紫外吸收值稳定。将过滤除菌液上强阴离子交换树脂柱(选Q-SepharoseFF凝胶)，用以吸附大部分的白蛋白、大多数的IgA及IgM；
(B)弱阴离子交换树脂柱操作条件：选DEAE-Sepharose FF凝胶，先用pH6.2-7.7，电导0.8-1.8mS/cm的醋酸盐缓冲平衡液平衡柱子至少5倍柱体积，至pH、紫外吸收值稳定。流穿液调整至pH6.2-7.7，用醋酸盐缓冲液调整电导至0.8-1.8mS/cm，再上已经平衡完毕的弱阴离子交换树脂柱DEAE-SepharoseFF，用来吸附微量IgM和其它杂蛋白等。得到IgG纯化液。
(4)IgG纯化液经低pH孵放灭活病毒处理。
每批制品必须经pH4.1±0.3，温度24±1℃～25℃孵育放置21天以灭活病毒。
(5)DV₅₀nm膜过滤除病毒，增加安全性。；
(6)超滤、配液、除菌、分装，制得水痘-带状疱疹人免疫球蛋白。
上述步骤(1)中高效价原料血浆的制造方法为：
(i)选择身体健康，符合国家《原料血浆采集规程》供浆标准的供血浆者；
(ii)第0、7、14、28天，每次注射一剂人用纯化水痘减毒活疫苗，所使用的人水痘减毒活疫苗效价≥4IU/支；
(iii)检查供血者血浆的抗水痘抗体，当供浆者的血浆水痘抗体效价达到8IU/ml时，采集为合格血浆，封装保存，每次每人份采浆≤600g；
(iv)当血浆抗体效价降至2IU/ml时，在注射1剂水痘减毒活疫苗。
本发明的有益效果可根据对上述方案的叙述得知，本发明所述水痘-带状疱疹人免疫球蛋白以高效价水痘抗体血浆为起始原料，采用低温乙醇分级分离和阴离子柱层析纯化，大大提高了产品纯度和稳定性，有效减少患者的副反应和潜在的不良反应；用世界上公认的效果可靠的低pH孵放法灭活经血液途径传播的病毒，再加纳米膜滤除病毒，确保产品的安全性。水痘免疫球蛋白纯度超过98％、Ig G单体和二聚体含量大于99％，水痘抗体效价≥100IU/ml，蛋白质含量＜120g/L。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明。
实施例1
(1)制备用于生产水痘-带状疱疹人免疫球蛋白的抗体效价大于8IU/ml的原料血浆。
(i)选择身体健康，符合国家《原料血浆采集规程》供浆标准的供血浆者；
(ii)第0、7、14、28天，每次注射一剂人用纯化水痘减毒活疫苗，所使用的水痘减毒活疫苗效价≥4IU/支；
(iii)检查供血者血浆的抗水痘抗体，当供浆者的血浆水痘抗体效价达到8IU/ml时，采集为合格血浆，封装保存，每次每人份采浆≤600g；
(iv)当血浆抗体效价降至2IU/ml时，在注射1剂水痘减毒活疫苗。
(2)低温乙醇分级分离。
(A)制备组分I+II+III：将冷冻血浆在不高于33℃的水槽中融化，破袋混匀，调pH5.95、乙醇浓度19％、离子强度0.11、温度-5℃，搅拌反应30分钟以上，静置10小时，压滤，得组分I+II+III。
(B)沉淀组分III，制备组分II：将组分I+II+III溶解，溶解温度3℃，溶解时2小时，条件控制：乙醇浓度14％，离子强度0.015，pH5.20，沉淀过程中温度控制在-4℃，放置10小时。上清液加0.3％硅藻土及0.3％珍珠岩，压滤澄清，压滤条件控制：进液压力0.24Mpa，出液温度-4℃，得上清；上清调pH至7，控制乙醇浓度23％，温度-8℃，压滤得组分II。
(C)组分II沉淀溶解纯化：溶解用水须符合注射用水标准，溶解温度2℃，溶解2小时。然后过滤、澄清，溶液须澄清透亮。超滤结束制品温度13℃，残余乙醇量0.01％。超滤液采用0.2μm微孔滤芯过滤。
(3)离子交换层析纯化：将低温乙醇分离后的过滤液先后通过串联的强阴离子层析柱Q-SepharoseFF和弱阴离子层析柱DEAE-Sepharose FF进行纯化。
(A)强阴离子交换树脂柱操作条件：选Q-Sepharose FF凝胶，先用pH6.9的0.06mol/L的醋酸盐缓冲平衡液平衡柱子至少5倍柱体积，至pH、紫外吸收值稳定。将过滤除菌液上强阴离子交换树脂柱Q-Sepharose FF凝胶，用以吸附大部分的白蛋白、大多数的IgA及IgM；
(B)弱阴离子交换树脂柱操作条件：选DEAE-Sepharose FF凝胶，先用pH6.9，电导1.3mS/cm的醋酸盐缓冲平衡液平衡柱子至少5倍柱体积，至pH、紫外吸收值稳定。流穿液调整至pH6.9，用醋酸盐缓冲液调整电导至1.3mS/cm，再上已经平衡完毕的弱阴离子交换树脂柱DEAE-Sepharose FF，用来吸附微量IgM和其它杂蛋白等。得到IgG纯化液。
(4)IgG纯化液经低pH孵放灭活病毒处理：制品经pH4.1，温度孵育放置21天以灭活病毒。
(5)DV₅₀nm膜过滤去除可能残留的病毒。
(6)配液及除菌分装：蛋白浓度调整至12％以下，水痘抗体效价控制在100IU/ml，经0.2μm的除菌滤器除菌分装。
经过柱层析纯化的免疫球蛋白其白蛋白、IgA、IgM、PKA、血凝素、ACA含量极低，均达到美国药典要求，与未进行纯化的免疫球蛋白比较见下表。
本方法所获得的产品与柱层析纯化前产品比较分析结果
                       未纯化            纯化后(本发明)        国外某厂产品
纯度                   96.1％            99.8％                96.5％
白蛋白                 少量              未检出                少量
单体和二聚体含量       96.8％            99.4％                96.2％
聚合物和聚集体         2.6％             ＜0.1％               2.8％
ACA(抗补体活性)％      30％              5.2％                 28％
PKA                    ＜21IU/ml         ＜1.8IU/ml            23IU/ml
抗-A                   1∶32             1∶4                  1∶16
抗-B                   1∶32             1∶8                  1∶16
Fc功能                 121％             178％                 116％
亚类分布
IgG1                   61.2％            63.5％                62.1％
IgG2                   27.3％            26.4％                27.6％
IgG3                   9.1％             6.6％                 7.5％
IgG4                   2.4％             3..5％                3.8％
IgA                    54.7mg/l          1.36mg/l              87.6mg/l
IgM                    39.1mg/l          0.16mg/l              49.2mg/l
总蛋白浓度             115g/l            112g/l                174g/l
水痘抗体效价(IU/ml)    171               166                   100
抗HBS(乙肝抗体)        37                32                    16
(IU/ml)
由上表可知，白蛋白由于纯度高，未检出。IgG单体和二聚体的含量≥99％聚合物和聚集体的含量≤1％。