丝氨酸蛋白酶抑制物及其制备方法 【技术领域】
本发明属生物技术领域，涉及丝氨酸蛋白酶抑制物的长效重组，且涉及其制备方法。
背景技术
丝氨酸蛋白酶抑制物(TFPI)，分子量约40kd，前体有304个氨基酸，成熟蛋白则有276个氨基酸，后者由氨基末端、三个串联的Kunitz型结构域和梭基末端组成，动物和人体实验证实TFPI能有效治疗严重感染、浓毒血症、弥漫性血管内凝血(DIC)、多脏器功能衰竭(MOF)、高凝状态、血栓栓塞性疾病和肿瘤等具有良好疗效，是一种具有良好应用前景的蛋白质。大多数TFPI由血管内皮细胞合成和分泌，平滑肌细胞、心肌细胞和纤维母细胞在一定条件下也可产生TFPI。无论是人体自身的TFPI，还是给予的重组野生型TFPI，它的半衰期都很短，只有2分钟左右，会很快从血液中清除。TFPI进入血液循环后，迅速与肝细胞膜上的LRP结合，然后被降解和代谢。半衰期短是TFPI在发挥治疗作用时最大的缺点，必须连续72一96小时给药才能保持疗效，每个疗程约需160一犯omg，如此大的剂量给病人带来了巨大的经济负担。因此，延长TFPI的半衰期，减少其用药量，是急需解决的问题。
【发明内容】
本发明的目的是提供半衰期长，具有良好抗凝功能的丝氨酸蛋白酶抑制物。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为，本发明首先在计算机工作站上模建了TFPI和LRP分子，然后将两者进行对接，发现TFPI梭基末端的某些关键氨基酸在TFPI和LRP的相互作用发挥关键作用。本发明将TFPI梭基末端267一304区域内的某些氨基酸进行不同程度的替代和缺失突变后，两者的结合能力出现了不同程度的下降，所述LTFPI的半衰期较TFPI延长10倍以上，并具备抗组织因子、凝血因子V工工/Vlla和凝血因子X/Xa功能。其中将269、252、288和289位赖氨酸全部替换为丙氨酸的突变效果为佳。
本发明还提供了制备LTFPI的方法，包括制备至少包含表达生物活性的LTFPI编码序列部分的cDNA，在适合表达的载体中克隆CDNA片断，用该载体转染宿主细胞，在适于表达该cDNA片断的条件下培养该宿主细胞，以及从培养物中回收和纯化所需LTFPI。
本发明中LTFPI基因的制备包括经过点突变后的基因，与相关质粒重组，DNA限制性内切酶酶切鉴定筛选阳性克隆，核普酸序列分析验证基因是否正确。将本发明的LTFPI CDNA片断与表达载体重组，形成重组表达质粒。本发明不限于特定的表达质粒，包括真核表达载体pP工CgK或原核表达载体pET28或pLY一4。
本发明使用pET28原核表达载体，上述重组表达载体可按常规方法导入适宜宿主细胞，包括原核表达宿主细胞是BLZI或JFll25和真核表达宿主细胞GSll5。本发明使用大肠杆菌BLZI作为特定的宿主细胞，本发明的表达产物以包涵体形式存在于宿主细胞的胞体中，破菌分离包涵体，高浓度尿素或盐酸肌溶解包涵体，分离纯化LTFPI，经适当复性后即获得有活性的LTFP。
以上技术方案中所有基本分子生物学操作均参照<分子克隆实验指南>。
本发明的有益效果
本发明应用基因工程方法对LTFPI进行生产，所得产品具有高效的抗凝、抗血小板和抗炎功能，与野生TFPI性质比较表明，LTFPI半衰期明显延长，其余功能类似。LT即工为注射剂和非注射剂研究提供了原料，可用于预防和治疗严重感染性疾病和血栓栓塞性疾病等。
【具体实施方式】
实施例1
(1)TFPI和LRP在计算机工作站上的对接与分析
应用InsightH软件，在计算机工作站上对TFPI和L即进行对接，寻找到了TFP工梭基末端269、282、288和289位赖氨酸是两者相互作用的关键位点。
(2)LTFPI的设计、制备和性质鉴定
将TFPI梭基末端269、282、288和289位赖氨酸替换为丙氨酸。序列使用PCR点突变获得基因，与pUC19重组，酶解筛选阳性克隆，核普酸序列分析证实基因序列正确。然后将LTFP工基因切出，与原核表达载体pET28重组，构成原核表达质粒rLTFP工一pET28。转化大肠杆菌JM109，提取质粒，以相应限制性内切酶酶解鉴定，获得特征性片断，证实获得阳性克隆。
实施例2
LTFP工基因获取方法如下：
(1)采用重叠延伸法，选用pET28多克隆位点Notl后400bp的一段序列设计下游引物：5’>CCA CTA CGT GAA CCA TCA CCC TAA TCA AGT<3’重叠延伸引物1：其中斜体密码从左到右依次为K254A，K241A。5’>口尤AAT TAG GCC TCC TTI’TGA ‘队T TCT TTG GAT GAA ACC ‘况，TTT ACATGC CCT CAG ACA<3’重叠延伸引物2：斜体密码从左到右依次为K254A，K260A，K261A。5’>AAA GGA GGC CTA ATT优谷ACC AAA AGA AAA AGA陇谷优若CAG AGA GTG AAA ATA GCA TAT<3’以质粒pET28一TFPI为模板，上游引物与重叠延伸引物1配对，下游引物与重叠延伸引物2配对，分别pCR，回收产物后用作中间体，加上游引物和下游引物做PCR，Ncol+Notl双酶切PCR产物，即得K241A，K254A，K260A，K261A突变的LTFPIO限制性内切酶购自BRL公司，大肠杆菌JM109、质粒puC19Invitrogen公司。pLy4的构建按已知方法进行。
(2)筛选高拷贝高效表达菌株
将质粒rLTFP I一pLy4电转化大肠杆菌BL21，使其与大肠杆菌染色体发生重组，G418筛选高效表达菌株。
宿主菌：大肠杆菌BL21
培养液：LBK
Kan工作浓度：30ug/ml
IPTG工作浓度：lmM
①挑单克隆菌落接种至5ml LBK medium，37oC X 250rpm至OD600＝l一2。②接种至500ml LBK medium，37℃x250rpm至OD60o＝l一2。
②接种至25L LBK medium，37℃x 600rpm，溶氧50％，至OD6的＝0.6一0.5。④加IM IPTG至终浓度I lnM，诱导表达3h。
③4℃x4000rpmx35min，收集菌体。
④50mM Tri 5.HCI pHS.0洗涤菌体1次，收集菌体，称重。
⑤挑取上述阳性克隆接种于IOml低营养液BMG巨.34％YNB，(4x10一5)生物素，1％甘油习中，30℃快速振遥(250RPM)，培养过夜。次日测定光密度0，离心弃除BMG培液，用无菌水洗涤后用BMM培液巨.34％YNB，(4x10一5)生物素，0.5％甲醇习稀释至OD6训＝1。每天补加体积百分数为0.5％的甲醇。甲醇诱导培养7天，每隔24小时取样lml，测定抗TF/Fvlla(rhTFPI一API)或抗Fxa(rhTFPI一APZ)活性。离心弃沉淀，上清于一20℃保存。直接取培液上清与Zx上样缓冲液等体积混合后取20ul上样，作还原性SDS一以GE电泳。考马斯亮蓝R一250染色后，Pharmacia 工 magenastervDs扫描定纯度、分子量。可见诱导后上清液在分子量约6kd处有一浓集的条带，经扫描，目的蛋白约占上清总蛋白的84％：结果表明表达产物rhTFPI一API有明显的抗TF/FVlla作用，rhTFPI一APZ有明显的抗FXa作用。上述还原性SDS一PA(况按LaeI’nInli方法进行。
(3)发酵表达工程菌
按上述筛选高表达菌株作为工程菌，然后以5L发酵罐进行高密度发酵。从一70℃深低温冰箱中取出种子菌，室温下解冻，在种子菌培养室100级洁净度条件下划YPD平板，30℃温箱培养2一3天。从平板上挑取单菌落，同样在100级洁净度条件下接种于IOml BMG培养液中，30℃培养过夜，此为一级种子液。再将一级种子液加入140ml培养液中，30℃培养6一8小时，直至OD6。。＝6，此为二级种子液。种子菌接入后，自然增值，待基础培养基中预加的甘油被耗尽以后，开始补充甘油，补充速度16ml/L/h，待0D60。达到120左右，停止补加甘油。待培养液中甘油全部耗尽后，开始甲醇诱导。甲醇补料速度从lml/L/h逐渐升高至12ml/L/h，以后一直维持此速度。本发明的发酵技术是用低盐培养基扩增工程菌，诱导前用含微量元素的甘油溶液进行补料，到达一定菌体浓度后用含微量元素的甲醇溶液进行诱导表达。
甲醇诱导40h以后，停止发酵，从发酵罐中立即放出菌液进行离心，分离沉淀菌体，收集上清进行纯化。上清中rhTFPI一API对TF/FVlla的抑制常数达Ki＝0.12uM，rhTFP工一APZ对FXa的抑制常数达Ki＝0.09uM。发酵参数为：温度30℃，氧容量控制在35士5％，pH＝5，搅拌速度与D0连动。
(4)超滤浓缩脱盐
将离心所获上清以1∶10稀释，经Mi llipore超滤装置(NMWL：3000，Millipore公司)超滤浓缩至1.0L，脱去无机盐。
(5)凝胶过滤
SephadexG一50(Pharmacia公司)柱用20nunol/L PB(pH7.4)平衡后，将超滤浓缩液上样，加样时注意勿搅动SephadexG一50胶面。然后用PB洗脱，流速IOml/min，收集活性峰。
(6)Q一Sepharose Fast Flow柱层析
以10倍体积的50mmol/L PB(pH 7.4)平衡Q一Sepharose F.F.(Pharmacia公司)柱，凝胶过滤后收集的抗凝活力部分以SOml/min的速率将其吸附到Q一Sepharose F.F.柱上。用PB洗柱直至ODZ、《)达0.00，然后用0一lmol/L NaCI(50Inlnol/L PB PH 7.4)线性梯度洗脱，收集有抗凝活性部分，分装，冷冻干燥，一40℃保存。
本发明的色谱操作均为常规操作。
(7)纯度鉴定及分子量测定
样品进行16.5％SDS一PAGE电泳，考马斯亮蓝R一250染色后，Pharmacia 工 nagemaster⑧VDS扫描测定纯度、分子量。所得产品纯度97％以上，分子量约6kD。
(8)抗TF/FVlla活性测定：使用稀释后的凝血酶原时间(d l l utedprothrombin time，dPT)测定，方法如下。
将凝血活酶干粉试剂加ZmL生理盐水稀释至终浓度5000U/L，此为凝血活酶原液，再用生理盐水分别稀释10、100和500倍，置37℃备用。取100pL正常人混合血浆，加10pL蛋白溶液，分别加100协L不同浓度的凝血活酶溶液，37℃孵育lmin，加100p L 30Inlnol/L Cac12溶液，开始计时血浆凝固时间。反应体系中TFPll一276和TFPll一161终浓度均为0.2p mol/L，取3次实验平均值记为实验结果，所有试剂均需37℃预热，全部操作2h内完成。结果表明LTFP工使dPT明显延长。
(9)抗FXa测定：应用发色低物发测定，方法如下：
采正常人全血，109mM构椽酸钠1∶9抗凝，4℃离心15min，4000r/min，等体积混合30份正常人新鲜血浆，56℃孵育巧min，置37℃备用，此为参照血浆。每毫升此参照血浆中的TFPI定义为1个活性单位(lU)。
将野生型TFPI和LTFpl分别溶于TS(20mM TriS/HCI pH 7.8+150InM NaCI)96孔板，每孔加100pL待测定溶液，再加100pL反应液(100ng/mL FXa+0.2％BSA)，室温孵育30min，加发色底物SpeCtrozymeXa至终浓度0.25InM，测OD10：。结果表明LTFPI地抗Xa活性与野生型TFPI类似。