一株纤维素分解复合菌系及其与硫酸盐还原菌共培养的方法 【技术领域】
本发明涉及微生物技术领域。特别是涉及具有分解纤维素能力的厌氧细菌复合菌系及其培养方法以及该菌系与硫酸盐还原菌(SRB即：Sulfate-reducing Bcteria)共培养，以提供SRB生长所需的碳源的方法。
背景技术
利用硫酸盐还原菌处理酸性矿山废水是将酸性矿山废水中的硫酸盐还原为H2S，在不同的pH条件下，可以利用H2S选择沉淀不同重金属形成金属硫化物，以去除废水中的重金属离子并回收有价金属，生物还原反应中生成的碱度可以中和酸性矿山废水。该方法具有成本低、适用性强、无二次污染、可以回收酸性矿山废水中的重金属等特点。然而硫酸盐还原菌的生长需要外加额外的碳源才能完成，目前现有工艺中使用的碳氮源通常为化学药品，价格较贵，药剂消耗成本高，不利于在工业生产中的推广应用。因此选择适于细菌生长的、廉价的、甚至于作为废弃物的有机质，作为硫酸盐还原菌的碳源用以培养菌种是实现工业应用的重要环节。
木质纤维素是我国最丰富的生物质资源，包括大量的农作物秸秆，工业与林业废弃物以及城市固体废弃物等。尤其是农作物秸秆，是我国最丰富的资源之一，它具有产量大，分布广，品种多的特点，应用潜力巨大。木质纤维素主要由纤维素、半纤维素和木质素三种成分组成，它们相互结合形成复杂的超分子复合物。由于其结构复杂难于分解，目前这类资源大部分未能被充分利用。有许多种类的微生物可以将木质纤维素分解为小分子有机物，进而可用作肥料以改善和保持土壤肥力；可用作畜禽饲料以促进畜牧业发展等。本发明通过富集分离能够分解纤维素的厌氧细菌复合菌系，并将此分离到的厌氧细菌与SRB共培养于含有纤维素材料的培养基中，利用厌氧细菌分解纤维素的小分子产物作为碳源培养硫酸盐还原菌(SRB)。
【发明内容】
本发明的第一个目的是提供一株纤维素分解复合菌系，该菌种对滤纸具有很强的分解能力，对稻草亦表现了较强的分解能力。
本发明的第二个目的是提供一种可以富集、分离、培养纤维素分解菌的培养基。
本发明的第三个目的是提供一种纤维素分解菌系与SRB共培养的培养基，将分离到的纤维素分解厌氧细菌复合菌系与SRB共培养，利用纤维素的分解产物作碳源培养SRB。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的：
本发明所用的富集分离纤维素分解菌的样品为活性污泥。
所述的菌种(Clostridium sp.Lwy-2，保藏登记号为CCTCC NO：M208161，保藏日：2008年10月17日，保藏单位中国典型培养物保藏中心，地址：武汉大学内)，其特征在于：该菌种对滤纸具有很强的分解能力，对稻草亦表现了较强的分解能力。
本发明使用的菌种富集分离培养基为：Tyrptone，1-10g；CaCl2·H2O，0.5-2.5g；NaHCO3，0.2-1.5g；NH4Cl，0.1-3g；12×120mm的滤纸条，蒸馏水，1L；pH为6.8-8.0。
本发明使用的与纤维素分解菌共培养的SRB(名称为Desulfovibrio halophilusRETECH-SRB-I，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址武汉大学内，保藏日：2007年5月11日，保藏登记号：CCTCC NO：M207060)。
本发明使用的共培养培养基为：CaCl2·H2O，0.5-2.5g；NaHCO3，0.2-1.5g；K2HPO4，0.1-3g；MgSO4·7H2O，0.1-3g；NaCl，0.1-5g；NH4Cl，0.1-3g；KH2PO4；trace element，10-15ml；trace vitamin，10-15ml；(NH4)2Fe(SO4)2·6H2O，0.1-2g；滤纸，3-10g；蒸馏水，1L；pH为6.8-8.0。
培养基制作：称取相应药品倒入事先装有部分蒸馏水的烧杯中，药品充分溶解后用蒸馏水定容至990ml，调pH到7.2，最后定容到1000ml。将20ml培养基分装到18×150mm的螺口厌氧管(预先放置12×120mm的滤纸条)中，并用真空抽换气装置除氧，121℃高压蒸汽灭菌。
纤维素分解菌的富集培养：将0.2-0.6g活性污泥接种到装有培养基的试管中。接种后在30-40℃条件下静置培养。滤纸分解后，用相同的培养基转接驯化，接种量为5％(v/v)。转接4-5次后-4℃保存。
菌种形态观察：滤纸分解后用相差显微镜观察菌体形态。
分解稻草和甘蔗渣：在分离培养基中，分别用3％(w/v)稻草和甘蔗渣代替滤纸条配置培养基。接入10％(v/v)培养好的菌种，30-40℃条件下静置培养。观察分解情况。
复合菌系微生物种群组成分析：本发明采用16S rDNA克隆文库技术对纤维素分解复合菌系中微生物种群组成进行分析，该菌系由Clostridium属的4种不同地种类组成。
纤维素分解复合菌系(Clostridium sp.Lwy-2，保藏登记号为CCTCC NO：M208161，保藏日：2008年10月17日，保藏单位中国典型培养物保藏中心，地址：武汉大学内)与SRB(名称为Desulfovibrio halophilus RETECH-SRB-I，保藏单位：中国国家典型培养物保藏中心，地址武汉大学内，保藏日：2007年5月11日，保藏登记号：CCTCCNO：M207060)共培养：配制共培养用培养基，将纤维素分解复合菌系与SRB以1∶1比例混合，按10-20％接种量接种，30-40℃条件下静置培养，检测SRB生长情况以及黑色沉淀FeS的形成情况。
本发明的纤维素分解复合菌系可用于其它的硫酸盐还原菌。
【附图说明】
图1为本发明菌种的相差显微镜照片
图2为共培养生长情况(大量FeS黑色沉淀形成)
图3共培养SRB的扫描电镜照片
以下结合实施例对本发明作进一步说明
【具体实施方式】
实施例1
首先配制富集培养纤维素分解菌的培养基(Tyrptone，3g；CaCl2·H2O，2g；NaHCO3，1g；NH4Cl，1g；蒸馏水，1L；pH为7.2)。将培养基分装到装有滤纸条(12×120mm)的厌氧螺口试管中。经过真空抽气除氧后，高压蒸汽灭菌(121℃)。将0.5g厌氧活性污泥接入到灭好菌的培养基中，放入35℃培养箱中静置培养。滤纸分解后用相同培养条件逐次转接培养。在转接过程中，菌系对滤纸的分解能力不断加强，最终在48小时之内即可将滤纸条完全降解。将富集分离到的纤维素分解菌系保藏(该菌名称为Clostridium sp.Lwy-2，保藏单位：中国国家典型培养物保藏中心，地址武汉大学内，保藏日：2008年10月21日，保藏登记号：CCTCC NO：M208161)。
用相差显微镜观察菌体形态。
用16S rDNA克隆文库技术分析纤维素分解菌系中微生物种群组成。将1ml菌液离心得到菌泥，提取总DNA，利用PCR技术以原核生物通用引物530f和1490r扩增16S rDNA片段。PCR产物纯化后与Promega的T-easy载体连接，转化大肠杆菌DH5α。挑取的白色菌落通过菌落PCR确定阳性菌落，经酶切分型，对4个克隆测序。所得序列经Blast比较表明，该菌系由4种不同的Clostridium种组成。
将新鲜稻草切成1cm的小段，按1％(w/v)装入厌氧管中替代滤纸条。用Tyrptone，3g；CaCl2·H2O，2g；NaHCO3，1g；NH4Cl，1g；蒸馏水，1L；pH为7.2配制成培养基并分装、除氧、灭菌。以2％(v/v)的量接种菌种，35℃培养箱中静置培养。两周后大部分稻草被分解。
配制纤维素分解菌与SRB共培养的培养基(CaCl2·H2O，2g；NaHCO3，1g；K2HPO4，1.2g；MgSO4·7H2O，0.9g；NaCl，2g；NH4Cl，0.8g；KH2PO4，1g；trace element，10-15ml；trace vitamin，10-15ml；(NH4)2Fe(SO4)2·6H2O，0.5g；滤纸，3g；蒸馏水，1L；pH为7.2)，该培养基是利用纤维素分解菌系对滤纸的降解产物作为SRB生长的碳源。将纤维素分解复合菌系(Clostridium sp.Lwy-2，保藏登记号为CCTCC NO：M208161，保藏日：2008年10月17日，保藏单位中国国家典型培养物保藏中心，地址：武汉大学内)与SRB(名称为Desulfovibrio halophilus RETECH-SRB-I，保藏单位：中国国家典型培养物保藏中心，地址武汉大学内，保藏日：2007年5月11日，保藏登记号：CCTCC NO：M207060)以1∶1比例混合，按10％(v/v)接种量接种，30-40℃条件下静置培养3天，滤纸全部崩解并有大量FeS黑色沉淀产生(SRB生长产生大量H2S，H2S与Fe2+反应形成FeS黑色沉淀)。