一种制备甲基万古霉素的方法 【技术领域】
本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种制备甲基万古霉素(M43D)的方法。
背景技术
甲基万古霉素(M43D)是K.E.Merkel等1985年在东方拟无枝酸菌Amycolatopsisorientalis NRRL2450中作为万古霉素的小组份而被发现的。如图1所示，M43D是一种糖肽类抗生素，结构与万古霉素类似，在N端一位氨基酸的氮上比万古霉素多一个甲基，对革兰氏阳性菌有较强的抗菌活性。
2000年，D.P.O’Brain等克隆了万古霉素类似物chloroeremomycin的生物合成基因簇中的N端甲基转移酶，并以去甲万古霉素，去甲万古霉素七肽骨架等为底物进行催化反应。在以去甲万古霉素七肽骨架为底物的催化反应中，除了得到单甲基化的万古霉素七肽骨架外，还发现了少部分可能是双甲基化的产物，但未继续研究。而在以去甲万古霉素为底物的反应中，只发现了单甲基化的产物即万古霉素，却并未发现双甲基化的产物。因此，M43D只能由Amycolatopsis orientalis NRRL2450菌株发酵所得，且M43D在该菌株的产物中为小组分，难以大量制备。
在申请号为200710036861.5的中国发明专利申请中，本申请的发明人公开了万古霉素生物合成基因簇中的26个基因，其中的vcm12基因编码N-甲基转移酶。该酶主要负责催化甲基转移到万古霉素七肽骨架的第一个氨基酸亮氨酸的N端氮原子上，是万古霉素生物合成途径中的一个重要的后修饰酶。
【发明内容】
本发明的目的在于，提供一种制备M43D的方法，以用于生产M43D。
本发明提供的制备M43D的方法为利用N甲基转移酶催化去甲万古霉素或万古霉素制备M43D。
根据本发明的一个优选实施例，本发明中使用的N甲基转移酶通过发酵表达N甲基转移酶的菌株获得。
进一步地，所述N甲基转移酶由万古霉素生物合成基因簇中编码N-甲基转移酶的vcm12基因编码；所述编码N-甲基转移酶的vcm12基因来源于东方拟无枝酸菌ATCC43491。
本发明提供的M43D的制备方法，可用于工业化生产M43D。
【附图说明】
图1是M43D与万古霉素的结构图，其中，R＝CH3，当R1＝H时，为万古霉素；当R1＝CH3时，为M43D。
图2是菌株E.coli BL21(DE3)/pLYLH13诱导表达后的菌体的电泳检测结果，其中，泳道1是细胞破碎液沉淀的电泳结果，泳道2是细胞破碎液上清的电泳结果。
图3是以去甲万古霉素为底物的催化反应的HPLC检测结果，其中，(1)是万古霉素标准品的HPLC检测结果；(2)E.coli BL21(DE3)/pLYLH13的粗酶液催化的反应的HPLC检测结果；(3)E.coli BL21(DE3)/pET30a(+)的粗酶液催化的反应的HPLC检测结果。
图4是M43D的质谱检测结果。
图5是M43D的NMR检测结果，其中，图5a是M43D的H1NMR图谱，图5b是M43D的C13NMR图谱。
图6是以万古霉素为底物的催化反应的HPLC检测结果。
【具体实施方式】
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验室手册》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件进行。
本发明使用的菌株和质粒分别为：
pMD18-T Simple Vector，具有ampR，购于TaKaRa公司。
pET30a(+)，具有T7promoter，T7teminater，kanR，购于NOVAGEN。
大肠杆菌E.coliBL21(DE3)，具有F- ompT hsdSB(rB- mB-)gal dcm(DE3)，购于NOVAGEN。
大肠杆菌E.coli DH5α，购于TaKaRa公司。
本发明使用到的LB培养基配方为：胰蛋白胨10g/L，酵母抽提物10g/L，NaCl 5g/L，pH7.4。
向LB培养基中加入20g/L琼脂粉即得LB固体培养基。
本发明使用的酶制剂均购自TaKaRa公司；DNA Marker均为Fermentase的GeneRulerTM 1kb DNA ladder；蛋白质Marker均为TaKaRa公司的Protein Molecular WeightMarker(Low)；胰蛋白胨，酵母抽提物购自Oxoid公司；其他常规试剂均为国产或进口分装。
本发明先通过PCR反应克隆得到万古霉素生物合成基因簇中的N端甲基转移酶基因vcm12，然后将vcm12基因片段连接到pET30a(+)载体中，获得vcm12表达载体pLYLH13。然后将pLYLH13转入表达宿主E.coli BL21(DE3)中，获得目的表达菌株E.coliBL21(DE3)/pLYLH13，将其发酵并经IPTG诱导得到N端甲基转移酶，用于转化去甲万古霉素和万古霉素，以制备M43D。
实施例1、vcm12基因片段制备
1.1、引物的设计
根据东方拟无枝酸菌ATCC 43491的基因序列，设计基因vcm12的上下游引物P7和P8，以用于扩增vcm12基因片段，引物P7和P8地序列分别如下所示：
P7：CATATGACCGATCAACTGGACCGC；
P8：AAGCTTCTTCGCGTCTGCCGTGAC。
其中，引物P7和P8的下划线部分分别为在引物序列上引入的NdeI和HindIII酶切位点。
1.2、PCR扩增
抽提东方拟无枝酸菌ATCC 43491的基因组，作为模板，以引物P7和P8为引物对，通过PCR扩增制备vcm12基因片段，具体如下：
PCR反应体系(50μL)为：0.5μmol/L每条引物，1×Buffer，50μmol/L dNTPs，5％DMSO，2.5U Ex Taq聚合酶，Mg2+1.5mmol/L。
PCR反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性45s，50℃退火45s，72℃延伸60s，30个循环；72℃延伸5min。
取上述PCR产物，然后参考使用手册，使用杭州维特洁生化技术有限公司的纯化试剂盒，纯化获得的PCR产物约为850bp，经测序为vcm12基因片段。
实施例2、构建vcm12基因的表达载体和表达菌株
根据TaKaRa公司的产品说明，将步骤1.2中获得的vcm12基因片段连接到pMD18-TSimple Vector中，并转化到宿主E.coli DH5α中，抽提质粒并测序。结果显示，得到的载体pLYLH12中含有目的基因vcm12。
用限制性内切酶NdeI和HindIII酶切pLYLH12，纯化得到约850bp的目的片段。同时用限制性内切酶NdeI和HindIII酶切pET30a(+)，纯化得到约5.4kb的片段。连接两片段，得到vcm12基因的表达载体pLYLH13，然后将表达载体pLYLH13转化到表达载体E.coli BL21(DE3)中，得到vcm12基因的表达菌株E.coli BL21(DE3)/pLYLH13。
同时将质粒pET30a(+)转化到表达载体E.coli BL21(DE3)中，得到菌株E.coliBL21(DE3)/pET30a，用于酶催化反应时做对照。
实施例3、N甲基转移酶的诱导表达
挑新鲜的表达菌株E.coli BL21(DE3)/pLYLH13的单克隆到添加含卡那霉素的LB培养基中，于37℃过夜培养。取1ml菌液加入到含卡那霉素的100ml LB中，培养到OD600为0.6～0.8后，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，于30℃诱导4h。
离心收集菌体，超声破碎后，离心收集上清，蛋白电泳检测，结果如图2所示。根据图2的结果，上清中含有目标蛋白N甲基转移酶。
实施例4、转化去甲万古霉素
4.1、转化去甲万古霉素
使用步骤3中获得的E.coli BL21(DE3)/pLYLH13破碎离心后所得的粗酶液上清催化去甲万古霉素，具体如下：
反应体系为(1ml)：2mM腺苷甲硫氨酸(SAM)100μl，0.5mg/ml去甲万古霉素(dmV2)300μl，粗酶液100μl，缓冲体系为Tris/HCl(50mM，PH 7.5)。
反应条件为：25℃，反应24hr。
同时，按步骤3和4.1中的方法，以E.coli BL21(DE3)/pET30a处理去甲万古霉素，作为对照。
4.2、HPLC检测反应结果
使用HPLC检测步骤4.1中获得的反应液，同时以步骤3中的对照反应液以及万古霉素标准品为HPLC检测的对照，具体方法如下：
流动相配制：用0.2％的三乙胺溶液，磷酸调pH至3.2作为缓冲液。缓冲液与乙睛和四氢呋喃按92∶7∶1的比例混合，摇匀，作为A液；缓冲液与乙睛和四氢呋喃按70∶29∶1的比例混合，摇匀，作为B液，A液和B液的加入方式如表1所示。
色谱条件：
色谱柱：DiamonsilTM C18，ODS，ID 4.6*200mm
柱温：40℃
检测器：DAD(HP1100)检测器
检测波长：240nm
流速：1ml/min
进样量：5μl
洗脱方法：梯度洗脱。
表1、A液和B液的加入方式
检测结果如图3所示，根据图3结果，反应中没有去甲万古霉素的峰，却多了两个峰，这两个新的峰一个在7min左右，与标准品比对后应该为万古霉素。而另一个在12min的峰为一未知的峰，将该物质命名为化合物X，而以E.coli BL21(DE3)/pET30a为对照所得的结果中却只有去甲万古霉素，而无其他的万古霉素类似物。
4.3、化合物X的结构确认
参考U.S.Patent：4547488中提供的方法，分离纯化化合物X，并进行质谱和NMR检测，结果如图4和图5所示。
图4结果显示，化合物X的分子量为1461，与M43D的分子量相同。
根据图4的质谱检测结果和图5的H1NMR和C13NMR图谱的结果，并参考图3，可以确定化合物X为M43D。
实施例5、转化万古霉素
按步骤4.1中的方法，使用步骤3中获得的E.coli BL21(DE3)/pLYLH13破碎离心后所得的粗酶液上清催化万古霉素，并收集反应液上清，其中，将实施例4的反应体系中去甲万古霉素使用万古霉素替代，作为反应的底物。
按步骤4.2中的方法，使用HPLC检测反应液上清，检测结果溶液图6所示，将保留时间为12min的物质命名为化合物Y。
按步骤4.3中的方法，分离纯化化合物Y，并对化合物Y进行质谱和NMR检测。
根据检测结果，化合物Y为M43D。
综上所述，本发明提供了一种M43D的制备方法，使用该方法可工业化生产M43D。