本发明涉及应用基因工程技术制备重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）。特别阐明了表达含凝血酶识别多肽的rhGM-CSF融合蛋白。克服了hGM-CSF天然基因不利表达的缺点，使该蛋白工业化生产成为可能的方法。 基因表达技术一般是将克隆的外源基因置于表达载体中，导入适当宿主。通过培养、（诱导）、表达得到目的产物的过程，目的基因一般通过早期的Okayama/Berg法等克隆cDNA或通过近期的PCR技术直接克隆成熟蛋白编码区。表达载体可调节基因转录与翻译，直接控制外源基因编码蛋白在宿主中的合成。
该技术近年来发展很快，目前已可在原核及真核系统中表达多种蛋白。真核表达系统中哺乳类动物细胞表达的蛋白最接近天然蛋白。但一般表达量不理想。目前仅有为数极少的蛋白如HBsAg可用于工业化生产。昆虫及酵母表达系统由于其合成蛋白糖基化修饰差异太大，用于人体易引起不良反应。原核系统如大肠杆菌不具有糖基化修饰功能，因而不适宜于表达糖基化对其生物学活性重要的蛋白，但相当数量的多肽如一些细胞因子，其生物活性与糖基化修饰关联不大，尤其是hGM-CSF.其非糖基化蛋白的生物学活性是糖基化形式的5-6倍（Kaushansky.K.，生物化学，26：4861-4867[1987]）。
hGM CSF是一种多功能细胞因子，主要调节机体的造血功能，促进髓系组细胞的增殖分化。在造血功能障碍的治疗上具有广泛的用途。自从Wong等首次报道hGM-CSF cDNA以来，相继有多家报道了不同人体细胞来源的cDNA克隆（Wong，G.G.等人，科学，228：810-815[1985]和Cantrell.M.A.等人，美国科学院院报.82：6250-6256[1985]）。使hGM-CSF cDNA资料日趋完整;但采用的方法，均耗时、费力、难于推广，对克隆的cDNA改造极其复杂。采用COS细胞仅实现了瞬时表达，采用CHO、酵母和昆虫等一定程度可稳定表达hGM CSF（Okamoto.M.等人.生物/工程.8：550 553[1990]，Ernst.J.F.等人.生物/工程.5：831 834[1987]和Chiou.C.J.等人.欧洲生物化学联合会快讯，259：249-253[1990]）。Libby等利用分泌性载体于大肠杆菌表达hGM-CSF.最后仅可得到每升几个毫克的产量（Libby.R.T.等人。脱氧核糖核酸.6：221-229[1987]）：Greenberg等采用类似方式表达，结果蛋白主要结合于细胞膜上，难于获得活性蛋白（Greenberg.K.等人.当代微生物学.17：321-332[1987]）。Burgess等利用蛋白酶缺陷菌株提高hGM-CSF的表达量至8-10%;张智清等改变hGM-CSF基因5′末端部分密码中地CG为AT而保留编码氨基酸不变，将表达量提高到20%（张智清等人，病毒学报.9：136-143[1993]）;但两者表达的蛋白其N端均多一个Met（甲酰甲硫氨酸）。
本发明提供了一种经原核系统高效表达，纯化后N端不带任何多余氨基酸的rhGM-CSF活性多肽，由127个氨基酸组成，不含糖基化修饰。
本发明提供了一种表达含凝血酶识别多肽的rhGM-CSF融合蛋白，经凝血酶消化，释放出天然型hGM-CSF活性多肽的步骤。
1.采用PCR方法改建hGM-CSF cDNA。
2.制备表达含凝血酶识别多肽的rhGM-CSF融合蛋白的载体。
3.载体转化大肠杆菌。
4.培养转化宿主，诱导表达rhGM-CSF融合蛋白
5.凝血酶消化融合蛋白，释放出天然型rhGM-CSF活性蛋白。
图1A：表达rhGM-CSF融合蛋白的载体。hGM-CSF cDNA上游可以是任何一种细菌蛋白基因如β-gal、CAT、MS2 RNA多聚酶、GST、ZZ等。每一种细菌蛋白基因经适当改造后.再在二者之间嵌入凝血酶接头.表达产物可用凝血酶切开.释放出天然型rhGM-CSF活性多肽。
图1B：显示凝血酶识别多肽与hGM-CSF N端部分序列及切割点（箭头所示）
要得到原核系统高效表达的克隆及具有hGM-CSF生物活性的多肽，应从如下几个方面着手。
1.表达载体应具有强有力的启动子，如PR、PL、PRPL、T7等。有效的转录终止子如rrnB.Tfd、T7等.有效的调控机制如cIts857、Lac I等。
2.改建cDNA.如将5′端部分密码中的CG改为AT，保持编码氨基酸不变，使其mRNA结构利于翻译.变cDNA的终止密码为更为有效的原核系统终止密码TAA等。
3.表达融合蛋白.一般来说.任何一种蛋白在原核系统达到高效表达之后.含相应基因的表达载体均可用作表达融合蛋白的载体.在其基因之后连入目的基因即可表达融合蛋白：但由于插入DNA的特殊要求，如上游蛋白基因不宜含常用内切酶的识别位点.或不含有可利用的位点等限制了上游蛋白的种类。另外，最好在上游蛋白基因的3′端含有多克隆位点.便于插入目的基因.目前可用于表达融合蛋白的载体有：PEX、PMS32b、PL-CAT-3、PR1T2T等。其细菌蛋白基因下游均含有多克隆位点或其中含有可用于克隆的位点，如PLCAT-3系采用如下方式构建而成：将PBR325用内切酶Sau3A消化，获得1.0kb片段.其中含有完整的CAT基因编码区.将其连入PKPL-2D的BglⅡ切点.筛选得到克隆PL-CAT-3，该质粒含有EcoRⅠ、XbaⅠ、HindⅢ，可用于基因克隆。其它有关载体的改建将在实施中说明。
4.目的蛋白以融合蛋白方式表达，除利于表达翻译外，由于其中带部分细菌蛋白，对细菌蛋白酶的降解作用具有更高的耐受力，但表达为融合蛋白后，由于空间构象的变化，其生物活性往往部分或完全被掩盖。要得到活性蛋白.一般需在细菌蛋白与目的蛋白之间设立化学物质或酶的切割点;不同蛋白要求设立特定位点.才能使N-末端不添加或减少氨基酸.以保证切割的准确性和切割的有效性。设立识别位点还应考虑用于切割的物质来源及识别特异性。
5.为防止细菌蛋白酶的降解作用，宜采用蛋白酶缺陷菌株。
根据本发明PCR法改进后的rhGM-CSF cDNA适宜于原核表达。翻译终止更为有效.相对提高mRNA的稳定性，最终提高了表达量.表达的融合蛋白因其中部分为细菌蛋白.对细菌蛋白酶的耐受力增强.易于大规模工业化生产。
表达的融合蛋白经凝血酶消化释放出天然型rhGM-CSF活性多肽.N-末端不带任何多余氨基酸（包括原核表达常带的甲酰甲硫氨酸）.除不含糖基化修饰外.与人体内的hGM-CSF成熟蛋白一级结构完全相同.具有天然hGM-CSF的全部生物学活性，可用于有关实验研究和人体疾病治疗。
综上所述.本发明组建了表达含凝血酶识别多肽的rhGM-CSF融合蛋白的载体.转化适当宿主.如为PR、PL启动子可导入含clts857的大肠杆菌如POP2136、N4380-1;如载体上带clts857基因则可导入任何一种大肠杆菌内？如为T7启动子.则导入含可控制T7RNA多聚酶合成的宿主如JM109（DE3）。适当温度发酵.如PR、PL类载体则30℃增菌.42℃诱导表达;T7类载体则37℃增菌.IPTG诱导。诱导表达后.收集菌体.超声裂解，离心沉淀包涵体.变性、复性即得到可溶性融合蛋白.加入凝血酶消化后.天然型rhGM-CSF即释放出来。采用常规层析（凝胶过滤、离子交换、疏水层析、反相层析）及制备电泳等均可获得纯品.尤其层析纯化后样品可用于各种实验研究和作为药物.单用或合用具有如下疾病治疗作用：1.减少癌症化疗、放疗后的骨髓毒性;2.增强骨髓移植后的再生能力;3.增加再障病人的白细胞数量;4.增强辐射抵抗力;5.治疗MDS;6.增强AIDS患者、年老体弱者、大面积烧伤和重症感染病人等的免疫功能，促进烧伤和创伤愈合等。
下面通过实例，提供实验资料和信息.但也不限此而已
实施例
1.cDNA改建：
按公布的人GM-CSF cDNA（Wong.G.G.等人，科学，228：810-815[1985]）序列设计引物，其中：
5′引物：ATCCATGGCACCCGCCCGCTCGCCGA
3′引物：AAGCTTACTCCTGGACTGGCTCCCA
以PKPL 2D GM CSF质粒DNA（孙英等人.中国免疫学杂志，6：247-250[1990]）为模板.扩增30轮.使其cNDA5′带Nco Ⅰ切点和起始密码.3′带HindⅢ切点和终止密码TAA.后者取代野生型TGA.为大肠杆菌的高效密码子.改建后的cDNA便于克隆化和直接表达天然型蛋白.其序列经Sanger法分析表明与Cantrell（Cantrell.M.A.等人.美国科学院院报.82：6250-6256[1985]）报道完全一致。
2.凝血酶接头的合成：根据纤维蛋白原中凝血酶识别多肽序列设计如下DNA序列及相应编码氨基酸.5′带Cla Ⅰ粘性末端.便于嵌入有关载体.3′为平末端。
C GGC GTA CGT GGT CCG CGC
CG CAT GCA CCA GGC GCG
Gly Val Arg Gly Pro Arg
3.rhGM-CSF融合蛋白表达载体的构建（详见图2）
1）将纯化的hGM-CSF cDNA PCR产物与（Nco Ⅰ、Hind Ⅲ）按一定比例重组连接.筛选含hGM-CSF cDNA的质粒即.将该质粒（Sal Ⅰ、Hind Ⅲ）与（Xho Ⅰ、HindⅢ）重组连接、筛选PMS hGM CSF;Nco Ⅰ切开该质粒，核酸酶S1去突出末端.再用Cla Ⅰ消化，与纯化的凝血酶接头连接.筛选含凝血酶接头的质粒即PMT-hGM-CSF-1。
2）将PMT-hGM-CSF-1经EcoRⅠ消化，短时微量BaⅠ 31核酸酶处理，再连入12mer EcoRⅠ接头构建成PMT-hGM-CSF-2。
3）将PMT-hGM-CSF-1与PEx-2（EcoR Ⅰ、Xba Ⅰ）重组为PEX-hGM-CSF-1，再用Pvu Ⅱ消化，去除两个Pvu Ⅱ切点之间的片段即为PEX-hGM-CSF-2，再用Pvu Ⅱ酶切，加12mer EcoR Ⅰ接头.EcoRⅠ消化.连接即构建成PEX-hGM-CSF-3。
4）将质粒PMT-hGM-CSF-1与PL-CAT-3（EcoR Ⅰ、HindⅢ）重组构建PCAT′-hGM-CSF。
4.rhGM-CSF融合蛋白的诱导表达：将上述四种表达质粒分别转化大肠杆菌POP2136。取其克隆于30℃扩增，42℃诱导表达4-6小时.离心收集菌体，SDS-PAGE分析表明：PMT hGM-CSF-1、和PMT-hGM-CSF-2表达蛋白分子量均约为26KD、其中15kD部分为hGM-CSF.11kD分别为细菌蛋白MS2 RNA多聚酶N端部分及改建产物;表达量约占可溶性细菌蛋白的30%以上。PEX-hGM-CSF-3表达蛋白分子量为25kD，其中15kD部分同前.10kD部分为Cro及β-gal部分蛋白.表达率为27%。PCAT′hGM CSF含两套SD及ATG.有两种表达带.分子量各为26、22kD.其中11和7kD部分均为CAT部分蛋白.表达率在30%以上.所有表达蛋白经裂菌分析.主要以不溶性包涵体存在，需经变性复性方可得到可溶性蛋白。
5.rhGM-CSF融合蛋白的凝血酶消化：将一定量的包涵体经8mol/L尿素、5mmol/L DTT变性溶解后，用0.05mol/LpH8-9硼酸缓冲液透析4-6小时，加入凝血酶，25-30℃作用6～10小时.各种融合蛋白经凝血酶消化后均释放出实施4预计的二种蛋白.其中15KD为hGM-CSF.余下均为细菌蛋白。其中PMT hGM CSF 1和PCAT′hGM CSF表达的融合蛋白凝血酶加量即使达1单位/mg蛋白.仍难达到80%消化;而另二种尤其PEX hGM CSF 3的表达蛋白很易被消化.仅0.01单位/mg蛋白即完全切开.同时经电泳证实其上游细菌蛋白内部也含有潜在凝血酶识别多肽.采用1单位/mg蛋白凝血酶消化时.电泳图谱显示不再有10KD的小片段;而hGM-CSF即使5单位/mg蛋白酶消化时也未显示潜在切点。本发明说明.凝血酶识别多肽上游的蛋白构象包括一级结构对其作用的有效性具有很大的影响。
6.rhGM生物学活性鉴定：一般利用hGM-CSF依赖细胞株鉴定其生物活性，目前国际上可利用的细胞株有AML-193、MO7E、TF-1等.但最受推荐的仅有TF-1细胞株。本发明制备的rhGM-CSF采用如下方式鉴定活性：将对数生长期的TF-1细胞配成5×104/ml.96孔板中每孔100μl细胞，加入一定比例稀释的待测rhGM-CSF.37℃培养44小时.同时设立阴阳性对照，用MTT法测细胞增殖活性。测定结果表明本发明制备的rhGM-CSF有明显的刺激TF-1细胞增殖的效应.其活性单位可达107iu/mg.见图3。另外本发明制备的rhGM-CSF应用于恒河猴体内试验表明：对其造血祖细胞具有明显的增殖分化作用.而且增殖具有剂量依赖关系.主要促进中性粒细胞.嗜酸性粒细胞的分化.在体内可明显促进外周血细胞增高，且主要促进中性粒细胞、嗜酸性粒细胞的增高.未见严重毒付作用。
总之本发明为制备rhGM-CSF提供了一种新方法.而且制备的蛋白其N-末端不带任何多余氨基酸：具有分泌性载体（原核和真核）表达蛋白的优点.但它具有产量大.易于工业化生产的独特优点。目前我们每升可得到60mg以上纯品。另外本发明提供的四种rhGM-CSF融合蛋白为研究凝血酶识别构象提供了一个研究对象.详细研究四种融合蛋白的立体构象将有助于进一步阐明凝血酶的作用机理和条件.为其它外源蛋白采用类似表达途经制备重组分子提供了有益的借鉴经验。