技术领域
本发明涉及一种用于胰腺脱细胞支架的试剂盒、支架的制备及再种植方法。
背景技术
糖尿病是由胰岛素分泌缺陷或其生物作用受损，或两者兼有引起的以高血糖为特征的代谢性疾病。通过调节饮食、体育锻炼，口服降糖药和外源性胰岛素注射能够在一定程度上降低糖尿病微血管和大血管病变及相关并发症的发生率，然而并不能达到治愈的效果，高血糖相关的器官损害仍然是糖尿病病人死亡的首要原因。
β细胞具有分泌胰岛素的功能，通过胰腺或者胰岛细胞移植，是目前唯一能够在1型糖尿病病人中起到长期稳定控制血糖水平的治疗方法。在目前，理想的可用于移植的胰腺或胰岛的数量不足的条件下，制备可供移植的组织工程胰腺十分必要。胰腺组织工程是构建可移植胰腺的一条创新性途径，然而，由于缺乏合适的支架材料，通常所构建的组织工程胰腺结构简单，血管网络不够完善而不能达到替代治疗的目的。
去细胞胰腺支架作为一种天然的生物支架，不仅保留有细胞粘附、增殖所依赖的细胞外基质成分，包括：蛋白质、多糖、生长因子和细胞因子；而且保留有细胞高密度生长所需要的管道结构，在移植到体内后可以维持生理血压，也可以使祖细胞分化为器官特异性表型。
然而，如何选择合适的去细胞试剂，降低去细胞残余洗涤剂对胰腺生物学特性的影响，获得有利于细胞再种植的胰腺生物支架，是目前构建可移植胰腺生物支架迫切需要解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种制备胰腺去细胞生物支架的试剂盒、胰腺去细胞支架的制备及再种植获得可移植胰腺支架的方法。所述试剂盒费用低、细胞脱除彻底、易于去除洗涤剂、细胞外基质及血管系统结构保存完好，有利于外源及内源性细胞的再种植和生长，并方便移植到糖尿病实验动物。
本发明的技术解决方案是：
一种用于胰腺脱细胞支架的试剂盒，其特征是：包括灌注液1、灌注液2和灌注液3；其中灌注液1包括0.25 g/L EDTA、10000 U/L肝素钠及PBS缓冲液；灌注液2包括1% Triton-X 100和0.1% 氨水；灌注液3包括0.01 g/L DNaseⅠ；
其中，灌注液1中PBS缓冲液的PH=7-8；灌注液2的溶剂为PH=7-8的双蒸水；灌注液3的溶剂为PH=7-8的双蒸水。
灌注液1的配制方法为：将0.25 g EDTA、10000 U肝素钠溶于1 L PH=7-8的PBS缓冲液中；
灌注液2的配制方法为：将10 mL Triton-X 100和1mL 氨水溶于1 L PH=7-8的去离子水中；
灌注液3的配制方法为：将0.01 g DNase Ⅰ溶于1 L PH=7-8的去离子水中。
一种胰腺脱细胞支架的制备方法，其特征是：包括下列步骤：
（1）将小鼠离体胰腺用蠕动泵经门静脉缓慢灌注100ml灌注液1，控制速度为5 ml/min；灌注液1冲洗胰腺内的血液，使胰腺由淡红色变为淡黄色；
（2）将离体胰腺置于-80℃冰箱中，一天后将其取出于常温下融化；
（3）利用蠕动泵经门静脉缓慢灌注1L灌注液2，速度控制在2 ml/min；灌注1 L灌注液2后，小鼠胰腺由淡黄色变为透明状；
（4）利用蠕动泵经门静脉灌注200 ml DNase Ⅰ溶液，后继续灌注2 L去离子水，以去除离体胰腺中残余的灌注液，获得全胰腺脱细胞支架，灌注速度控制在5 ml/min。
一种胰腺脱细胞支架的再种植方法，其特征是：包括下列步骤：
（1）将胰腺生物支架采用γ射线辐照灭菌；
（2）灭菌过后的全胰腺脱细胞支架在三维循环培养系统中循环灌注500 ml含有10%胎牛血清的DMEM高糖培养基，流速控制在5 ml/min；
（3）将1×107细胞消化后重悬至3 ml含有10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中；经门静脉中的留置针注入1 ml细胞悬液，间隔20 min再次注入1 ml，间隔20 min第三次注入1ml细胞悬液；细胞注射完成后将胰腺支架静置在培养基中2 h，以利于细胞的贴壁；
（4）经门静脉中的留置针循环灌注培养基，流速控制在4 ml/min，培养基隔天更换一次，共培养5天。
本发明剂盒费用低、细胞脱除彻底、易于去除洗涤剂、细胞外基质及血管系统结构保存完好，有利于外源及内源性细胞的再种植和生长，并方便移植到糖尿病实验动物。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图 1 是小鼠胰腺去细胞支架的大体直观图；
图2 是小鼠胰腺脱细胞前后的HE染色图和扫描电镜图；
其中A和C是胰腺脱细胞之前的HE染色和扫描电镜图；B和D是胰腺经由本专利的方法处理脱细胞后制备的胰腺生物支架的HE染色和扫描电镜图。
图3 是小鼠胰腺脱细胞支架再种植MIN-6细胞后的HE染色图和免疫组化图。
其中(A) HE染色图；(B) 免疫组化图。
具体实施方式
本实施例制备小鼠全胰腺生物支架的试剂盒包括灌注液1、灌注液2和灌注液3。
其中，灌注液1为0.25 g/L EDTA、10000U/L肝素钠的PBS缓冲液；灌注液2为1% Triton-X 100和0.1% 氨水的混合液，灌注液3为0.01 g DNase Ⅰ。
其中，灌注液1中磷酸缓冲液的PH=7.35；灌注液2、3中溶剂去离子水的PH=7.35。
在本实施中，灌注液1、灌注液2和灌注液3的配制方法如下：
灌注液1的配置：取125 mg EDTA及0.4 ml肝素钠溶于PH为7.35的1*PBS液中，定容至500 ml，其中0.4 ml肝素钠含10000 U的肝素钠。
灌注液2的配置：取10 ml Triton X-100和1 ml氨水溶于PH=7.35的去离子水中，定容至1000 ml。
灌注液3的配置：准确称量10 mg DNase Ⅰ溶于PH=7.35的去离子水中，定容至1000 ml。
所述试剂盒在制备小鼠全胰腺生物支架中的应用。
利用本实施例的试剂盒制备小鼠全胰腺生物支架的方法如下：
A. 小鼠离体胰腺的获得
在小鼠腹腔注射水合氯醛以麻醉小鼠，再将1 ml肝素注射至小鼠体内实现全身肝素化。经门静脉逆行插管（蓝色留置针22 G），1号丝线双重固定。将肠系膜上静脉的远端及脾动静脉的大分支依次小心结扎以防止渗漏，最后将胰腺和周围的组织结构小心分离，如胃、小肠、脾脏和肠系膜组织。整个操作过程中保持动作轻柔以保证获得胰腺的完整性。
B. 利用蠕动泵经门静脉缓慢灌注100 ml灌注液1，控制速度为5 ml/min。
灌注液1冲洗胰腺内的血液，使胰腺由淡红色变为淡黄色。
灌注液1的作用包括：通过EDTA螯合Ca2+，以松解细胞与细胞支架的连接，使后续的脱细胞过程较为容易。通过肝素钠的冲洗能防止胰腺内的微血管形成血栓，使得灌注液能充分与细胞接触。
C. 将离体胰腺置于-80℃冰箱中，一天后将其取出于常温下融化。
D. 利用蠕动泵经门静脉缓慢灌注1L灌注液2，速度控制在2 ml/min。
灌注1 L灌注液2后，小鼠胰腺由淡黄色变为透明状。
E. 利用蠕动泵经门静脉灌注200 ml DNase Ⅰ溶液，后继续灌注2 L去离子水，以去除离体胰腺中残余的灌注液，获得全胰腺脱细胞支架，灌注速度控制在5 ml/min。
上述步骤A、B、C、D及E依次进行，一个灌注步骤完成，再进行下一个灌注步骤。
胰腺生物支架采用γ射线辐照灭菌。
灭菌过后的全胰腺脱细胞支架在三维循环培养系统中循环灌注500 ml含有10%胎牛血清的DMEM高糖培养基，流速控制在5 ml/min。
将1×107细胞消化后重悬至3 ml含有10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中。经门静脉中的留置针注入1 ml细胞悬液，间隔20 min再次注入1 ml，间隔20 min第三次注入1ml细胞悬液。细胞注射完成后将胰腺支架静置在培养基中2 h，以利于细胞的贴壁。
经门静脉中的留置针循环灌注培养基，流速控制在4 ml/min，培养基隔天更换一次，共培养5天。
下面通过具体的方法验证本实施例制备的全胰腺生物支架符合胰腺组织工程的需要。
请参阅图2，其中A和C是胰腺脱细胞之前的HE染色和扫描电镜图；B和D是胰腺经由本专利的方法处理脱细胞后制备的胰腺生物支架的HE染色和扫描电镜图。
请参阅图3，为通过本专利方法制备的全胰腺生物支架种植小鼠MIN-6细胞后，循环灌注培养五天后的HE染色和免疫组化染色图。
需要指出的是，本实施例的试剂盒及利用其制备全胰腺生物支架的方法，同样适用于制备大鼠、豚鼠、猪等其他动物的全胰腺生物支架。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。