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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610128542.6 (22)申请日 2016.03.08 A61L 27/38(2006.01) A61L 27/22(2006.01) A61L 27/18(2006.01) A61L 27/20(2006.01) A61L 27/58(2006.01) A61L 27/02(2006.01) (71)申请人 北京航空航天大学 地址 100191 北京市海淀区学院路 37 号 (72)发明人 刘海霞 梁振江 戴向国 刘凯铭 张忠钢 (54) 发明名称 一种基于介电泳吸附原理的细胞三维组装方 法 (57) 摘要 本发明公开一种基。
2、于介电泳吸附原理的细胞 三维组装方法， 属于组织和器官的人工制造技术 领域。该方法首先配制导电可降解生物材料作为 细胞组装的支架主体导电层， 不导电生物相容性 好的材料作为支架绝缘层， 用计算机建立具有标 定上述材料区域的类组织层片信息模型， 由此信 息模型直接驱动多喷头快速成形设备制造可导电 三维组织工程支架并冷冻干燥， 将灭菌的三维支 架安装电极对并浸入选定的细胞悬浮液， 接通一 定幅值的交流电， 持续一段时间以实现细胞三维 组装。本发明基于导电可降解生物材料支架及介 电泳吸附原理， 能够实现含有一种或多种细胞的 三维组装。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (。
3、12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 附图1页 CN 105688280 A 2016.06.22 CN 105688280 A 1.一种基于介电泳吸附原理的细胞三维组装方法， 其特征在于该方法按如下步骤进 行： 1)将导电可降解生物材料均匀混合于聚酯类材料中制成重量与体积百分比浓度为5 15的溶液； 2)将导电性极差或者不导电的生物可降解材料配制成重量与体积百分比浓度为5 10的溶液， 置于无菌410环境下5min20min预凝胶化， 具体凝胶化时间由材料的 浓度决定； 3)根据预先设计的CAD结构模型， 在计算机控制下， 将所述两种及以上配制材料分别装 入料腔并装载在成形设备上并。
4、配以相应的喷头， 在成形平台的同步运动下逐层堆积成与预 设计一致的三维结构体； 4)将堆积成形的亚稳态三维结构体于-80低温储存5min后冷冻干燥形成三维支架， 使用时装入正负电极并紫外灭菌； 5)将带有正负电极的三维支架浸入待组装的细胞溶液中并接通一定幅值的交流电， 维 持一段时间以完成细胞组装。 2.按照权利要求1所述的一种基于介电泳吸附原理的细胞三维组装方法， 其特征在于： 所述的导电可降解生物材料为聚吡咯(Polypyrrole， PPy)或者是聚(3,4-乙烯二氧噻吩)- 聚苯乙烯磺酸(ploy(3,4-ethylenedioxythiophene)polystyrene sulfo。
5、nate， PEDOT:PSS) 包裹的镁颗粒， 聚酯类材料为聚乳酸-羟基乙酸共聚物(ploy(lactic-co-glycolic acid)， PLGA)。 3.按照权利要求1所述的一种基于介电泳吸附原理的细胞三维组装方法， 其特征在于： 所述导电性差的材料采用明胶、 胶原、 壳聚糖、 卡拉胶和海藻酸钠中的一种或者几种。 4.按照权利要求1所述的一种基于介电泳吸附原理的细胞三维组装方法， 其特征在于： 所述的三维支架由导电层和不导电层交互叠加， 导电层具有均匀分布的微尖端， 层厚为50 m100 m。 5.按照权利要求1所述的一种基于介电泳吸附原理的细胞三维组装方法， 其特征在于： 所述的。
6、一定幅值的交流电为30Vpp90Vpp， 根据不同细胞正负特性， 设置导电层与不导电 层电极正负性。 6.按照权利要求1所述的一种基于介电泳吸附原理的细胞三维组装方法， 其特征在于： 所述的维持一段时间为5min10min。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 105688280 A 2 一种基于介电泳吸附原理的细胞三维组装方法 技术领域 0001 本发明公开一种基于介电泳吸附原理的细胞三维组装方法， 属于组织和器官的人 工制造技术领域。 背景技术 0002 20世纪80年代中期， 美国麻省理工学院的化学工程师Langer R与哈佛医学院的外 科学副教授Vacanti J P提出了组织工。
7、程(Tissue Engineering)的概念。 组织工程的本质 在于细胞通过某种方式与基质(Matrix)或载体支架(Scaffold)结合起来制造新组织。 组织 工程为克服以往临床应用的组织器官修复与重建技术的诸多缺点开创了新途径， 在全世界 范围内得到广泛关注和迅速发展。 基于细胞与载体支架相结合方式的组织工程研究， 具体 是先成形支架， 然后种植细胞， 也可称为细胞间接受控组装。 目前已经在构建结构性组织如 皮肤、 软骨、 骨、 血管和神经等简单组织器官及小尺寸组织方面取得了很大的进展。 细胞组 装过程中常用的组装技术有动态混合、 搅拌、 灌流种植、 真空深度吸滤等细胞组装技术， 这。
8、 些方式虽提高了细胞的组装率， 但很难控制初始细胞种植数目和分布空间， 多种细胞在三 维空间定点粘附和沉积的可操作性也差， 而初始细胞种植数目、 细胞的初始分布空间对随 后组织生长过程具有决定性的影响。 特别是对于构建大尺寸实体结构的工程化组织， 在支 架中心部位的细胞由于组织液的渗透能力降低而发生营养不良， 从而导致生长迟缓， 缺乏 血管化， 最终导致 “夹心” 的现象发生。 研究者围绕其中的困难和矛盾进行了大量的研究， 包 括研究新的细胞组装技术、 改进支架的特性及材料的表面性能等。 0003 使用电场力操控微粒的介电泳技术于1978年被波尔发现， 至今已经得到广泛的应 用。 当一个介电颗。
9、粒被放置在一个非均匀场， 这一微颗粒会变的有极性， 非接触式的介电泳 力就会作用于微颗粒。 这一技术主要被应用在对不同微粒的筛选、 移动和转运。 最近的研究 显示电场可以同时布置多种细胞以满足组织工程的潜在应用。 然而现有介电泳力的应用都 仅使用了二维的电极结构。 正方形和菱形排布是两种常用的用于产生非均匀电场的介电泳 电极尖端设计方法， 也有集成微观尖端在两个同心螺旋电极间进而提高局部电场梯度,电 极对产生的介电泳力只是操控周围的细胞贴附于电极表面的二维图案上。 基于介电泳力的 三维细胞操控技术近期出现报道， 通过使用简单的金属电极提供三维电场以定位和定向目 标细胞， 通过设计具有不同高度电。
10、极尖端用以捕获或者分离特定的细胞。 Henry K.Chu等在 期刊lab on chip上发表文章 “Dielectrophoresis-based Automatic 3D Cell Manipulation and Patterning through a Micro-electrode Integrated Multi-layer Scaffold” 阐述了基于介电泳技术的三维细胞操控， 有望将这一技术应用在组织工程中， 然 而 由 于 文 中 采 用的 材 料 是 碳 黑 与 聚 二 甲 基 硅 氧 烷( c a r b o n b l a c k a n d polydimethy。
11、lsiloxane， CB-PDMS)的共混物， 这两种材料是完全无法在体内降解的， 故无法 应用于以组织工程为目的细胞三维组装中， 其次论文采用的支架制造技术是通过手工叠加 单层立体光刻的导电材料， 无法精确的构造类组织结构体。 0004 提出一种基于介电泳吸附原理的细胞三维组装方法， 通过制造具有导电性的组织 说 明 书 1/5 页 3 CN 105688280 A 3 工程支架， 将不同细胞(成体细胞、 干细胞、 内皮细胞或内皮祖细胞)被导电的组织工程支架 吸附， 实现精确控制细胞的分布和相对复杂结构体的成形， 通过调选支架上导电区域控制 不同细胞组装， 进而实现具有血管网络的多种细胞组。
12、织工程支架的制造。 0005 由于介电泳被认为是一种可以大批量非接触式操控带电粒子的无损伤技术， 研发 超过二维空间环境应用的介电泳技术， 结合快速成形技术制造可导电的组织工程支架， 通 过对其结构的设计和组装细胞介质中电场梯度分布及强弱调控， 进而实现特定细胞在标定 结构上的空间分布。 这一技术中的组织工程支架在兼有生物相容性、 可降解性、 结构强度等 特点外， 还具有导电性及管网络， 这是基于支架制造的组织工程领域的一个新挑战。 基于此 技术制造可模拟自然组织器官的结构， 将多种细胞及生物因子等， 定量定位组装于不同空 间位置， 组装成具有活性的复杂结构体， 预期可发育为一定功能的类组织前。
13、体， 或是为研究 不同细胞之间及与生物信号分子(生物因子， 药物分子等)之间在类自然组织三维结构中的 生物反应等提供必要的基础技术支持。 可预见到， 本技术在组织工程器官构建、 多种细胞相 互作用研究、 药物系统筛选、 生物传感器等诸多领域有重要的应用价值。 发明内容 0006 本发明的目的在于通过采用快速成形方法与可导电可降解的生物材料， 制造可导 电的组织工程支架， 进而通过介电泳力吸附及调控实现将不同细胞(成体细胞、 干细胞、 内 皮细胞或内皮祖细胞)粘附于导电的组织工程支架上， 实现精确控制细胞的分布和相对复 杂结构体的成形， 甚至实现具有血管网络的类组织器官的人工制造。 0007 本。
14、发明的技术方案如下： 0008 一种基于介电泳吸附原理的细胞三维组装方法， 其特征在于该方法按如下步骤进 行： 0009 1)将导电可降解生物材料均匀混合于聚酯类材料中制成重量与体积百分比浓度 为515的溶液； 0010 2)将导电性极差或者不导电的生物可降解材料配制成重量与体积百分比浓度为5 10的溶液， 置于无菌410环境下5min20min预凝胶化， 具体凝胶化时间由材料 的浓度及环境温度决定； 0011 3)根据预先设计的CAD结构模型， 在计算机控制下， 将所述两种及以上配制材料分 别装入料腔并装载在成形设备上并配以相应的喷头， 在成形平台的同步运动下逐层堆积成 与预设计一致的三维结。
15、构体； 0012 4)将堆积成形的亚稳态三维结构体于-80低温储存5min后冷冻干燥形成三维支 架， 使用时装入正负电极并紫外灭菌； 0013 5)将带有正负电极的三维支架浸入待组装的细胞溶液中并接通一定幅值的交流 电， 维持一段时间以完成细胞组装； 0014 本发明所述的导电可降解生物材料为聚吡咯(Polypyrrole， PPy)或者是聚(3,4- 乙烯二氧噻吩)-聚苯乙烯磺酸(ploy(3,4-ethylenedioxythiophene)polystyrene sulfonate， PEDOT:PSS)包裹的无氧化镁颗粒， 聚酯类材料为聚乳酸-羟基乙酸共聚物(ploy (lactic-。
16、co-glycolic acid)， PLGA)； 所述的导电性差的材料采用明胶、 胶原、 壳聚糖、 卡拉 胶和海藻酸钠中的一种或者几种； 所述的三维支架由导电层和不导电层交互叠加， 导电层 说 明 书 2/5 页 4 CN 105688280 A 4 具有均匀分布的微尖端， 层厚为50 m100 m； 所述的一定幅值的交流电为30Vpp90Vpp； 维持时间为510min。 0015 本发明具有以下优点及突出性效果： 0016 1)本发明采用的工艺介电泳被认为是一种可以大批量非接触式操控带电粒子的 无损伤技术， 将其应用于细胞组装， 则在细胞组装过程中组装效率很高， 而细胞的损伤率很 低。 。
17、0017 2)通过分步分时通电不同的组织工程支架材料区域， 可实现不同细胞(成体细胞、 干细胞、 内皮细胞或内皮祖细胞)吸附及组装， 进而实现特定细胞在标定结构上的空间分 布。 0018 3)本发明所采用的导电材料是可以用于快速成形及三维打印工艺的， 实现精确控 制细胞的分布和相对复杂结构体的成形， 结构体强度高， 可以支持大尺寸结构体的体内外 长期生长， 进而实现具有血管网络的类组织器官的人工制造。 附图说明 0019 图1为基于介电泳吸附原理的细胞三维组装方法的工艺流程示意图。 0020 图2为实现本发明的可导电组织工程支架成形系统示意图。 0021 图1为本发明的工艺流程示意图。 将导电。
18、可降解生物材料与聚酯类材料按一定比 例配制成几种不同导电率的导电可降解复合材料， 重量与体积百分比浓度为515的溶 胶状溶液， 同时配制重量与体积百分比浓度为510的不导电生物可降解材料并预凝胶 化； 将上述配制的材料分别装入成形设备的料腔中， 在具有层片信息的三维支架几何模型 的直接驱动下成形出可导电的组织工程支架结构体， 将结构体冷冻干燥并灭菌备用； 将已 制备好并灭菌的导电组织工程支架接装电极对并浸入需要组装的细胞悬浮液， 在一定幅值 电压下保持一段时间， 实现细胞被介电泳力作用进而粘附于支架上。 0022 图2为实现本发明中提及的可导电组织工程支架成形系统示意图。 制备一种或多 种导电。
19、可降解生物材料及不导电生物材料溶胶溶液， 装入挤压/喷射组装成形设备中， 其系 统组成示意图如图2所示。 整个成形装置包括三维运动平台(21)、 温控成形室(22)、 挤压/喷 射喷头组件(23)、 挤压/喷射驱动装置(24)、 控制软硬件(25)等； 在计算机CAD模型直接驱动 下， 通过控制各喷头的挤压喷射运动及三维运动平台的运动， 将上述各种材料通过不同的 喷头挤压/喷射成材料微单元并堆积到空间指定位置； 在相应的温控环境条件下保持亚稳 态结构， 通过逐点逐层的堆积， 得到具有一定预定义的组织工程支架。 具体实施方式 0023 实施例1： 通过该方法制造软骨类组织三维结构体。 将明胶制备。
20、成水溶液， 浓度为 100g/L， 称为材料A； 将50的戊二醛用灭菌的磷酸缓冲液稀释50倍形成1戊二醛溶液， 0.22 m滤膜过滤后备用， 称为材料B； 取浓度为1106/mL软骨细胞悬液100mL备用， 称为材 料C； 将由聚吡咯或者是聚(3,4-乙烯二氧噻吩)-聚苯乙烯磺酸包裹的无氧化镁颗粒与聚乳 酸-羟基乙酸共聚物(50： 50)配制成溶胶溶液， 其重量与体积百分比浓度为8， 称为材料D； 将材料A及材料D分别装入料腔并配装喷头； 根据预先设计的结构和定义规划的路径， 将上 述混合物在温控成形室通过微流挤压的方法堆积成形； 将成形的结构体在材料B中交联1分 说 明 书 3/5 页 5 。
21、CN 105688280 A 5 钟后， 用灭菌的0.9生理盐水冲洗3次， 后冷冻干燥并紫外灭菌20分钟以备用， 将灭菌的可 导电组织工程支架装上无菌的一对电极对并浸入材料C中， 接通幅值为60Vpp的交流电并保 持5min， 最终得到可用于体外培养或者体内植入的含有软骨细胞的三维结构体。 0024 实施例2： 通过该方法制造骨-软骨类组织三维结构体。 将明胶制备成水溶液， 浓度 为100g/L， 称为材料A； 将50的戊二醛用灭菌的磷酸缓冲液稀释50倍形成1戊二醛溶液， 0.22 m滤膜过滤后备用， 称为材料B； 取浓度为5106/mL软骨细胞悬液100mL备用， 称为材 料C1； 取浓度为。
22、1106/mL成骨细胞悬液100mL备用， 称为材料C2； 将由聚吡咯或者是聚(3, 4-乙烯二氧噻吩)-聚苯乙烯磺酸包裹的无氧化镁颗粒与聚乳酸-羟基乙酸共聚物(50： 50) 配制成溶胶溶液， 其重量与体积百分比浓度为8， 称为材料D； 将材料A及材料D分别装入料 腔并配装喷头； 根据预先设计的结构和定义规划的路径， 将上述混合物在温控成形室通过 微流挤压的方法堆积成形； 将成形的结构体在材料B中交联1分钟后， 用灭菌的0.9生理盐 水冲洗3次， 后冷冻干燥并紫外灭菌20分钟以备用， 将灭菌的可导电组织工程支架装上无菌 的两对电极对， 一对电极对(称为E1)装入预吸附成骨细胞的材料区域， 一。
23、对电极对(称为 E2)装入预吸附软骨细胞的材料区域， 随后依次浸入材料C1及C2中， 并分别接通幅值为 60Vpp的交流电并保持5min， 幅值为80Vpp的交流电并保持5min， 最终得到可用于体外培养 或者体内植入的含有骨-软骨细胞的类组织三维结构体。 0025 实施例3： 通过该方法制造肝实质细胞-肝基质细胞-血管内皮细胞的类肝组织三 维结构体。 将明胶制备成水溶液， 浓度为100g/L， 称为材料A； 将50的戊二醛用灭菌的磷酸 缓冲液稀释50倍形成1戊二醛溶液， 0.22 m滤膜过滤后备用， 称为材料B； 取浓度为1 107/mL肝实质细胞悬液100mL备用， 称为材料C1； 取浓度。
24、为2106/mL肝基质细胞悬液100mL 备用， 称为材料C2； 取浓度为5106/mL血管内皮细胞悬液100mL备用， 称为材料C3； 将由聚 吡咯或者是聚(3,4-乙烯二氧噻吩)-聚苯乙烯磺酸包裹的无氧化镁颗粒与聚乳酸-羟基乙 酸共聚物(50： 50)配制成溶胶溶液， 其重量与体积百分比浓度为10， 称为材料D； 将材料A 及材料D分别装入料腔并配装喷头； 根据预先设计的结构和定义规划的路径， 将上述混合物 在温控成形室通过微流挤压的方法堆积成形； 将成形的结构体在材料B中交联1分钟后， 用 灭菌的0.9生理盐水冲洗3次， 后冷冻干燥并紫外灭菌20分钟以备用， 将灭菌的可导电组 织工程支架。
25、装上无菌的三对电极对， 一对电极对(称为E1)装入预吸附肝实质细胞的材料区 域， 一对电极对(称为E2)装入预吸附肝基质细胞的材料区域， 一对电极对(称为E3)装入预 吸附血管内皮细胞的材料区域， 随后依次浸入材料C1、 C2及C3中， 并分别接通幅值为60Vpp 的交流电并保持5min， 幅值为80Vpp的交流电并保持5min， 幅值为90Vpp的交流电并保持 5min， 最终得到可用于体外培养或者体内植入的含有肝实质细胞-肝基质细胞-血管内皮细 胞的类肝组织三维结构体。 0026 实施例4： 通过该方法制造心肌细胞-血管内皮细胞的类心肌组织三维结构体。 将 明胶制备成水溶液， 浓度为100。
26、g/L， 称为材料A； 将50的戊二醛用灭菌的磷酸缓冲液稀释 50倍形成1戊二醛溶液， 0.22 m滤膜过滤后备用， 称为材料B； 取浓度为1107/mL血管内 皮细胞悬液100mL备用， 称为材料C1； 取浓度为2106/mL心肌细胞悬液100mL备用， 称为材 料C2； 将由聚吡咯或者是聚(3,4-乙烯二氧噻吩)-聚苯乙烯磺酸包裹的无氧化镁颗粒与聚 乳酸-羟基乙酸共聚物(50： 50)配制成溶胶溶液， 其重量与体积百分比浓度为15， 称为材 料D； 将材料A及材料D分别装入料腔并配装喷头； 根据预先设计的结构和定义规划的路径， 说 明 书 4/5 页 6 CN 105688280 A 6 。
27、将上述混合物在温控成形室通过微流挤压的方法堆积成形； 将成形的结构体在材料B中交 联1分钟后， 用灭菌的0.9生理盐水冲洗3次， 后冷冻干燥并紫外灭菌20分钟以备用， 将灭 菌的可导电组织工程支架装上无菌的两对电极对， 一对电极对(称为E1)装入预吸附血管内 皮细胞的材料区域， 一对电极对(称为E2)装入预吸附心肌细胞的材料区域， 随后依次浸入 材料C1及C2中， 并分别接通幅值为80Vpp的交流电并保持5min， 幅值为90Vpp的交流电并保 持5min， 最终得到可用于体外培养或者体内植入的含有心肌细胞-血管内皮细胞的类心肌 组织三维结构体。 说 明 书 5/5 页 7 CN 105688280 A 7 图1 图2 说 明 书 附 图 1/1 页 8 CN 105688280 A 8 。