技术领域
本发明涉及生物可吸收合成非织造织物、该非织造织物的制造方 法以及包含所述非织造织物的止血物，所述非织造织物的特点在于其 中带有凝血酶作为有效成分。
背景技术
在医疗领域，止血处理非常重要。当活体中的血管被损坏后，各 种凝血因子在该局部区域被激活并且纤维蛋白最终形成从而止血。在 这个过程中，凝血酶是最重要的酶，其作用于纤维蛋白原从而将其转 化成纤维蛋白。纤维蛋白原本身，虽然存在于血液中，但没有止血功 能。要依靠凝血酶的作用才能发挥止血功能。也就是说，在活体的止 血反应中凝血酶起最重要的作用。
发明内容
(本发明要解决的技术问题)
常规凝血酶制剂是液体或粉末形式的，因而当施用于流血区域时 经常被冲走，导致凝血酶的止血效果不充分。为了消除这个缺点，已 有各种关于在生物可吸收材料上带有凝血酶的片材的报道(例如WO 90/13320和日本专利公告No.61/59737)。这些片材中的一种是将来 自血液的凝血酶固定在由明胶制成的片材上得到的片材。但是如下面 的实施例所示，该片材没有展示出充分的止血效果，并且由于制造困 难以及实际使用时的问题，该片材距离实际使用还有很远的距离。存 在其中牛明胶与牛凝血酶混在一起的凝胶形式的止血剂，但这类止血 剂也是不利的，因为有感染例如BSE的危险并且使用时不便压缩。
另一类止血剂是其中凝血酶与其它凝血因子相结合的纤维蛋白 粘合剂。纤维蛋白粘合剂，主要包括凝血酶和纤维蛋白原，是生物组 织粘合剂，其通过凝血酶的作用利用纤维蛋白原向纤维蛋白的转变， 并且广泛应用于临床领域中的粘合、止血和封合用途。但是，对在例 如外科手术中的用途，通过溶解制备凝血酶溶液和纤维蛋白原溶液需 要时间，因而对于使用特别是紧急情况非常不方便。
考虑到这些不方便，通过使用片材直接按压到流血区域而施用的 纤维蛋白粘合剂也已经实际应用。但是，目前可用的片材类型的粘合 剂并不理想，因为其包括作为基本材料的马胶原蛋白和得自牛的凝血 酶，也就是得自非人动物种的材料，因而有可能引出抗异种蛋白的抗 体以及人畜共患性感染如朊病毒病的危险。所以，目前可用的局部止 血剂在操作和安全方面并不令人满意地方便。
为了解决上述问题，需要含有得自人并且没有感染性试剂的凝血 因子的止血物，所述止血物是由严格挑选并设计为具备完全的止血效 果并且对活体安全的材料制成的片材形式。
(解决问题的方法)
考虑到上述的各种问题，发明人进行了深入细致的研究并完成了 关于局部止血物的本发明。因而，从各种生物可吸收材料中挑选以非 织造织物形式加工的生物可吸收合成材料，本发明涉及带有凝血酶作 为止血有效成分的生物可吸收合成非织造织物、制造该非织造织物的 方法以及含有所述非织造织物的止血物。
(比现有技术更加有效的效果)
本发明的带有凝血酶的生物可吸收合成非织造织物具有如下所 列的优异性质，因而是理想的局部止血物。
(1)具有优异的止血效果；
(2)在紧急情况下容易处理；
(3)安全性高；
(4)随时间推移被吸收；
(5)表现出优异的弹性和柔软性；
(6)能够对宽阔区域进行止血；
(7)引起轻微的或没有发炎反应。
因此，本发明提供了包含生物可吸收合成非织造织物的止血物， 该止血物允许在各种不同领域手术中对需要组织封合的外科手术进 行安全止血。
发明的最佳实施方式
本发明所使用的生物可吸收合成非织造织物可以是由生物可吸 收合成纤维制成的任意的非织造织物。本发明的非织造织物优选具有 适当的柔软性以确保其肯定能够覆盖任何损伤区域。例如，能够形成 这样的非织造织物的合成纤维包括聚乙醇酸、聚乳酸或乙醇酸和乳酸 的共聚物等等，这些合成纤维可在加工成非织造织物后使用。在这些 非织造织物之中，由聚乙醇酸通过加工成非织造织物而制备的生物可 吸收合成非织造织物是用于本发明目的最优选的材料。
本发明的非织造织物可以是任意形状，但考虑到对不同应用的通 用性优选片状形式。
对于凝血酶，得自人血液的凝血酶和通过DNA重组技术得到的 重组凝血酶都可使用。除了凝血酶，也可添加可药用的稳定剂和添加 剂。这样的稳定剂和添加剂的例子包括例如白蛋白、聚乙二醇、精氨 酸、透明质酸钠、甘油、甘露醇和氯化钙等。
本发明的带有凝血酶的生物可吸收合成非织造织物可用例如如 下描述的方法制造。
将凝血酶溶于盐水或缓冲液中并任选进一步向其中加入作为稳 定剂或添加剂的白蛋白、聚乙二醇、精氨酸、透明质酸、甘油、甘露 醇或氯化钙等。然后将生物可吸收合成非织造织物浸入该溶液中，在 -80℃冷冻2小时，冻干得到所需产品。
本发明带有凝血酶的生物可吸收非织造织物可以被按压到出血 区域通过压力防止血液流出，并且除此之外，该片状止血物含有的凝 血酶立刻和血液中的纤维蛋白原反应，使得纤维蛋白原转变为纤维蛋 白，由此在此局部区域达到止血效果。所形成的纤维蛋白可以附着于 周围的组织上。
由聚乙醇酸制成的生物可吸收非织造织物早已用于医疗目的，并 且它的安全性已经由其被吸收进活体并被分解为水和二氧化碳所证 明。
工业实用性
这样，本发明带有凝血酶的生物可吸收非织造织物可以容易并且 迅速地施用于局部出血并且可以通过压力和血液凝固反应有效止 血。除此之外，因为在所述生物可吸收非织造织物中使用的每一种材 料对活体都是安全的，因此该生物可吸收非织造织物可不经考虑就用 于临床情况。
通过下面的实施例更加详细地解释本发明，但本发明不限于实施 例。
实施例1：重组凝血酶的制备
如日本专利申请No.2001/206919所述制备重组凝血酶。简单地 说，培养导入了人前凝血酶(prethrombin)基因的动物细胞，然后从 所得的培养基中纯化前凝血酶。另一方面，从导入了ecarin基因的动 物细胞培养基中纯化ecarin。前凝血酶被所得到的ecarin激活从而得 到可被纯化的凝血酶。
实施例2：带有凝血酶的片的制备
通过以下描述的方法制备本发明带有凝血酶的片。
向含有0.001-0.01％透明质酸钠(nacalai tesque；18237-41)或 0.5-2％甘油(nacalai tesque；17018)的溶液中加入最终浓度为0.5-1.5％ 的甘露醇(nacalai tesque；21303)和40mM氯化钙，接着加入最终 浓度为1000U/mL的重组凝血酶。将该溶液滴加到由聚乙醇酸制成的 生物可吸收合成非织造织物(3cm×3cm；Neoveil，Gunze Limited， 厚度0.15mm)中，滴加量为0.05mL/cm2。该片在-80℃冷冻2小时并 冻干后，用作带有重组凝血酶的片状样品。类似地，制备带有得自血 液的凝血酶的片，所用凝血酶得自人血液而不是重组凝血酶。
作为对照，使用了没有用凝血酶处理的生物可吸收合成非织造织 物、如WO 90/13320实施例描述所制备的明胶制成的止血海绵以及市 场上可买到的片状纤维蛋白粘合剂。
组1：带有得自血液的凝血酶的片
使用一种片，其中在聚乙醇酸制成的非织造织物中带有50U/cm2的得自人血液的凝血酶。
组2：带有重组凝血酶的片
使用一种片，其中在聚乙醇酸制成的非织造织物中带有50U/cm2的重组凝血酶。
组3：没有凝血酶的片
使用一种片，其中聚乙醇酸制成的非织造织物除了没有凝血酶外 按组1的方法处理。
组4：带有固定凝血酶的止血海绵
使用一种止血海绵，该止血海绵由含有得自人血液的凝血酶的明 胶制成，并按照如WO 90/13320(Spongostan，Johnson & Johnson K.K.)实施例的描述制备。
组5：片状纤维蛋白粘合剂
使用一种其中纤维蛋白粘合剂的组分固定于胶原蛋白片 (TachoComb，Torii Pharmaceutical Co.，Ltd.)上的片状纤维蛋白粘 合剂，其中组分如纤维蛋白原和凝血酶通过冻干法固定于由马胶原蛋 白制成的海绵片的一侧。
实施例3：在渗出性出血中检测止血性
使用兔子作为动物模型以评估止血性。将兔子剖腹并切除部分肝 脏，对整个伤口区域向其流血区域施用如实施例2制备的各组止血物 并按压一分钟。所用的评估如下所示。
(1)将用戊巴比妥麻醉的兔子实施剖腹术。
(2)静脉给药300U/kg肝素。
(3)将右叶、内侧左叶或外侧左叶的肝脏表面切除直径为1.5cm 厚度为4mm的圆形。
(4)用纱布吸收从切除伤口流出的血液10秒钟并称重。形成切 除伤口后流血量约为0.50g。
(5)尝试用上述各种止血物止血。每一次治疗的实施都没有驱 血但有血液流出。
(6)用纱布吸收并称重5分钟的流血量，包括止血治疗需要的 时间。5分钟后当观察到伤口表面流血时，重复进行止血治疗和流血 的称重。
(7)止血治疗最多重复四次，通过止血所需的止血治疗次数和 从止血治疗开始直到止血的流血的全部重量进行评估(表1)。
表1 组 经过每次止血治疗能够止血的病例的数目 止血治疗后 的总流血量/g 第一次 第二次 第三次 第四次 1 7 1 0 0 0.51±0.31 2 7 1 0 0 0.34±0.15 3 2 3 3 0 2.03±0.95 4 0 2 4 2* 6.28±1.67 5 0 4 1 3* 6.70±2.64
*：即使经过第四次止血治疗后，所观察到的不能止血的病例。
如表1所示，与对照止血片的止血效果相比，带有得自血液的凝 血酶(组1)和重组凝血酶(组2)的本发明的止血片展示出了更加 优异的止血效果。只有非织造织物而未经凝血酶处理(组3)，几乎 没有观察到止血效果，但也比WO 90/13320描述的由明胶制成的带有 固定凝血酶的止血海绵(组4)的止血效果高。这表明，在已知的生 物可吸收材料中，用于本发明作为基质的生物可吸收非织造织物是最 适合用于止血的材料。另外，还表明在该非织造织物中带有凝血酶可 以更快速和更有效地止血。除此之外，由对比测试结果清晰可见，与 本发明带有凝血酶的止血片相比，其中胶原蛋白用作基质的片状纤维 蛋白粘合剂(组5)表现出差得多的止血效果。