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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201510300717.2 (22)申请日 2015.06.05 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 104958785 A (43)申请公布日 2015.10.07 (73)专利权人 中国人民解放军军事医学科学院 卫生装备研究所 地址 300161 天津市河东区万东路106号 (72)发明人 李瑞欣 徐成 李东 张西正 武继民 李昊 苏卫华 王强松 侍才洪 赵滨 李煜 (74)专利代理机构 天津市三利专利商标代理有 限公司 12107 代理人 仝林叶 (51)In。
2、t.Cl. A61L 27/24(2006.01) A61L 27/22(2006.01) A61L 27/12(2006.01) A61L 27/50(2006.01) A61L 27/56(2006.01) 审查员 周丹 (54)发明名称 一种具有二级三维结构的复合骨修复材料 及其制备方法 (57)摘要 本发明公开了一种具有二级三维结构的复 合骨修复材料及其制备方法。 本发明利用低温快 速成型技术将纳米羟基磷灰石、 丝素和胶原共混 物按照设计孔径制备出具有大孔结构的三维复 合凝胶， 再通过后期的冷冻干燥使溶剂进行升华 得到微孔， 从而制备出具有二级三维结构的骨修 复支架材料。 该复合材料综。
3、合了纳米羟基磷灰 石、 丝素和胶原三者的优点， 通过调整无机、 有机 的比例提高复合材料的力学性能， 通过调整丝素 和胶原的比例控制复合材料的降解时间， 使其具 有良好的骨传导性、 力学性能和生物降解性， 利 于成骨细胞的粘附和增殖， 大大提高骨缺损的愈 合速度和效果， 是一种理想的三维打印骨修复材 料。 权利要求书1页 说明书5页 附图2页 CN 104958785 B 2017.10.24 CN 104958785 B 1.一种具有二级三维结构的复合骨修复材料的制备方法， 包括下列步骤： a.以桑蚕丝为原料， 通过脱胶、 溶解、 透析、 浓缩制备质量百分比浓度为518的丝素 溶液； b.以。
4、牛腱为原料， 通过脱脂、 粉碎、 溶解、 盐析、 透析制备胶原， 将胶原溶胀于醋酸溶液 中制备成质量百分比为25胶原凝胶； c.将重量配比在13:15:15的纳米羟基磷灰石、 丝素溶液、 胶原凝胶进行混合， 搅 拌至均匀得到复合凝胶； d.设计三维打印的参数， 将打印机的接收装置的温度控制在-20-4， 将复合凝胶 挤出进行低温快速成型； e.复合凝胶的丝条遇低温固化， 将固化后的复合凝胶进行冷冻干燥及后期处理， 所述 后期处理是先用无水乙醇浸泡， 再用质量百分比为0.10.5的NaOH溶液浸泡， 最后用水 将残留的乙醇和NaOH冲洗干净， 得到具有二级三维结构的复合骨修复材料。 2.根据权利。
5、要求1所述的一种具有二级三维结构的复合骨修复材料的制备方法， 其特 征是， 所述复合骨修复材料的孔隙具有大孔结构及微米二级孔隙结构， 其中的大孔结构范 围100500 m， 孔隙由复合凝胶通过针头挤出形成的扫描路径孔隙形成， 而微米级孔隙结 构由打印后的凝胶通过冷冻干燥形成。 3.根据权利要求2所述的一种具有二级三维结构的复合骨修复材料的制备方法， 其特 征是， 所述复合骨修复材料的大孔结构在200400 m。 4.根据权利要求1或2所述的一种具有二级三维结构的复合骨修复材料的制备方法， 其 特征在于， 所述复合骨修复材料的力学性能为： 最大应变10时压缩应力在3347kPa范围 内， 弹性模。
6、量在290430kPa范围内。 5.根据权利要求1或2所述的一种具有二级三维结构的复合骨修复材料的制备方法， 其 特征在于， 所述复合骨修复材料的孔隙率在8597范围内。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 104958785 B 2 一种具有二级三维结构的复合骨修复材料及其制备方法 技术领域 0001 本发明涉及骨组织修复材料领域， 具体说是一种具有二级三维结构的羟基磷灰 石/丝素/胶原复合骨修复材料及其低温快速成型制备方法。 背景技术 0002 随着材料科学、 生命科学、 机械电子等学科的发展， 骨修复材料的研究已发展到有 目的地设计材料组分和结构， 以达到与骨组织的有机结合， 实现。
7、活性修复的目的。 骨支架材 料的构建除了宏观外形结构外， 内部微细结构的构建也是非常重要的。 目前制造具有一定 生物活性的骨支架材料， 多是利用材料本身的多孔性或采用发泡剂来模拟骨骼内部组织的 微孔， 但这些微孔的大小、 形状及分布都不能很好的再现骨组织微细结构的特点， 且微孔之 间的连通率难以保证， 严重影响到骨支架材料中血液的循环和营养的代谢。 具有互通的孔 隙结构是骨修复支架材料所必需具有的特性。 研究显示不同组织细胞生长所需要的孔径不 同， 骨支架材料孔径的大小应满足骨单位和骨细胞生长所需的空间： 当支架材料内部连通 孔隙和孔径为540 m时允许纤维组织长入； 孔径为40100 m时允。
8、许非矿化的骨样组织长 入； 孔径大于150 m时能为骨组织的长入提供理想场所； 孔径大于200 m是骨传导的基本要 求； 孔径为200400 m最有利于新骨生长。 另外， 研究表明具有多尺寸孔径(既有大孔径又 有小孔径)支架的修复效果优于只有大孔径的支架材料。 因此， 骨支架材料的构建不仅要考 虑宏观结构， 还应考虑内部微观结构， 而传统的制备方法很难甚至不可能达到这一要求。 0003 基于快速成形原理的成形方法有望实现大孔、 微孔共存的多级结构， 其中立体光 固化工艺、 熔融沉积工艺等方法可以很好地加工出数百微米的孔隙结构， 但难以成形更小 的孔隙， 另外成形过程由于存在热相变等过程， 对生。
9、物材料的性能尤其是生物活性有不可 避免的影响。 发明内容 0004 为了克服骨组织工程支架材料传统制备方法孔隙连通性差、 单一羟基磷灰石在生 理环境下的脆性及低疲劳强度以及丝素蛋白降解速度慢、 胶原蛋白降解速度快等缺点， 本 发明提供一种制备羟基磷灰石/丝素/胶原复合支架材料的方法。 0005 为此， 本发明采用如下的技术方案： 0006 一种具有二级三维结构的复合骨修复材料， 其特征是， 由重量配比在13:15:1 5的纳米羟基磷灰石、 丝素溶液、 胶原凝胶组成， 所述丝素溶液为质量百分比浓度为5 18， 所述胶原凝胶是将胶原溶胀于醋酸溶液中制备成质量百分比为25凝胶。 0007 一种具有二。
10、级三维结构的复合骨修复材料的制备方法， 包括下列步骤： 0008 a.以桑蚕丝为原料， 通过脱胶、 溶解、 透析、 浓缩制备质量百分比浓度为518的 丝素溶液； 0009 b.以牛腱为原料， 通过脱脂、 粉碎、 溶解、 盐析、 透析制备胶原， 将胶原溶胀于醋酸 溶液中制备成质量百分比为25胶原凝胶； 说 明 书 1/5 页 3 CN 104958785 B 3 0010 c.将重量配比在13:15:15的纳米羟基磷灰石、 丝素溶液、 胶原凝胶进行混 合， 搅拌至均匀得到复合凝胶； 0011 d.设计三维打印的参数(打印针头直径60400 m， 打印速度210mm/s， 针头行走 间距10040。
11、0 m， 接收装置的温度为-300)， 将复合凝胶挤出进行低温快速成型； 0012 e.复合凝胶的丝条遇低温固化， 将固化后的复合凝胶进行冷冻干燥及后期处理 (用无水乙醇浸泡， 再用0.10.5的NaOH溶液浸泡， 最后用水将残留的乙醇和NaOH等冲洗 干净)， 得到具有二级三维结构的复合骨修复材料。 0013 所述复合骨修复材料的孔隙具有大孔结构及微米二级孔隙结构， 其中的大孔结构 范围100500 m， 而根据骨组织工程支架的最佳孔隙范围， 大孔结构设计在200400 m为 佳， 孔隙由复合溶液通过针头挤出形成的扫描路径孔隙形成， 而微米级孔隙结构由打印后 的凝胶通过冷冻干燥形成。 001。
12、4 所述复合骨修复材料的力学性能为： 最大应变10时压缩应力在3347kPa范围 内， 弹性模量在290430kPa范围内。 所述复合骨修复材料的孔隙率在8597范围内。 0015 本发明的有益效果是： 为了解决骨支架材料孔隙连通性差的问题， 本发明采用低 温快速成型法制备具有二级三维结构的复合支架； 为了提高支架材料的力学性能及生物相 容性， 本发明采用纳米羟基磷灰石、 丝素、 胶原为原料通过共混提高复合材料的综合性能。 采用本发明的方法制备的复合支架的具有良好的力学性能， 最大应变10时压缩应力在33 47kPa范围内， 弹性模量在290430kPa范围内。 将成骨前体细胞MC3T3-E1。
13、细胞在所述的 羟基磷灰石/丝素/胶原复合骨修复材料上进行培养， 结果表明本发明的材料具有良好的细 胞相容性。 附图说明 0016 图1a是本发明复合骨修复材料二级三维结构的电镜图； 0017 图1b是图1a的局部放大图； 0018 图2是本发明复合骨修复材料的压缩应力-应变图； 0019 图3是成骨前体细胞MC3T3-E1在本发明复合骨修复材料上培养时在倒置显微镜下 的观察图； 0020 图4a是成骨前体细胞MC3T3-E1在本发明复合骨修复材料上培养的电镜图； 0021 图4b是图4a的局部放大图。 具体实施方式 0022 下面结合具体实施例对本发明做进一步详细描述。 0023 基于离散/堆。
14、积成形原理的低温快速成形技术， 是将溶解于溶剂内的材料均匀混 合之后， 通过低温成型技术制备成多孔结构， 冷冻干燥后有机溶剂升华， 留下大量更为微细 的孔洞， 在可控孔隙结构和用户化植入物的制造方面有传统成形工艺不可比拟的优势。 另 外， 由于在低于0的低温环境中堆积成形， 它比熔融挤出快速成形工艺更有利于保持成形 材料的生物活性。 0024 羟基磷灰石是骨中无机物的主要组成成分， 具有良好的生物相容性， 在骨移植材 料和骨组织工程支架材料中， 因能与骨形成很强的化学结合具有骨传导作用而被广泛应 说 明 书 2/5 页 4 CN 104958785 B 4 用。 丝素蛋白是一种可降解的生物大分。
15、子， 其化学结构和力学性能可调， 骨再生能力良好， 广泛用于骨组织工程支架材料的研究中， 对无机晶体的生长起着模板和调控的作用， 丝素 是具有生物活性的天然高分子材料， 可作为新型仿生材料的制备原料。 胶原在细胞外基质 中含量最高， 以其优越的生物相容性和生物可降解性而被广泛应用于骨组织工程支架材料 中， 骨组织中以I型胶原为主， 它能与成骨细胞表面的特异性受体 1整合素亚单位紧密结 合， 促进成骨细胞的粘附、 增殖、 分化， 并增强其成骨能力； 因表面含有沉积矿物的位点， 对 矿物沉积具有诱导作用。 0025 通过综合分析骨组织工程支架对孔隙结构的要求， 本发明采用羟基磷灰石、 胶原、 丝素。
16、三者为原料通过低温快速成型制备具有二级三维结构的复合支架材料。 0026 本发明中丝素溶液是以桑蚕丝为原料， 通过脱胶、 溶解、 透析、 浓缩制备而成， 脱胶 的方法为将桑蚕丝浸入一定温度、 浓度的碳酸钠溶液中进行， 溶解方法为将脱胶后的丝素 纤维溶解于CaCl2、 乙醇、 水的三元溶液中(摩尔比1:2:8)， 透析、 浓缩方法为采用透析袋或 超滤方法进行。 胶原蛋白的制备是以牛腱为原料， 通过脱脂、 粉碎、 溶解、 盐析、 透析制备胶 原， 将胶原溶胀于醋酸溶液中制备成胶原凝胶。 将纳米羟基磷灰石、 丝素溶液、 胶原凝胶进 行混合， 搅拌至均匀得到复合凝胶， 再采用低温快速成型方法、 冷冻干。
17、燥制备本发明材料。 0027 本发明复合骨修复材料的制备方法采用纳米羟基磷灰石、 丝素、 胶原共混后低温 快速成型制备而成。 纳米羟基磷灰石、 丝素、 胶原的比例(重量比)为13:15:15。 所述 的复合骨修复材料的压缩力学性能为： 最大应变10时压缩应力在3347kPa范围内， 弹性 模量在290430kPa范围内。 0028 将成骨前体细胞MC3T3-E1细胞在所述的复合骨修复材料上进行培养， 结果表明所 述复合骨修复材料具有良好的细胞相容性。 0029 实施例一 0030 市售桑蚕丝， 浸入90Na2CO3水溶液中进行脱胶， Na2CO3水溶液的为质量百分比浓 度0.5， 每次30mi。
18、n， 共3次， 水洗后70干燥； 溶解于60的CaCl2、 乙醇、 水的三元溶液中 (摩尔比1:2:8)， 溶解时间为3h， 装入透析袋， 在流水冲洗下透析； 将透析好的丝素溶液在聚 乙二醇(PEG)水溶液中进行浓缩至质量百分比浓度为10。 胶原蛋白凝胶的制备方法参见 CN1234424C(胶原蛋白基海绵及其制备方法)。 纳米羟基磷灰石、 丝素、 胶原凝胶按照1:1:1 (重量比)的比例进行充分搅拌共混， 共混凝胶装入低温快速成型设备配备的针筒中， 设定 打印参数(打印针头直径120 m， 打印速度4mm/秒， 针头行走间距400 m， 接收装置的温度为- 20)， 打印好的复合凝胶材料大孔为。
19、400 m， 打印出的冷冻复合凝胶再进行冷冻干燥(冷凝 温度-50， 真空度20Pa)， 制备成所需的复合骨支架材料。 0031 将上述得到的复合骨支架材料进行电镜观察， 电镜图如图1a和图1b所示， 表明本 发明材料不仅具有设计的大孔结构， 还有冷冻干燥成型的微米级孔隙结构， 利于细胞的长 入和营养物质、 代谢产物的交换。 0032 图2是上述复合骨修复材料的压缩应力-应变图， 表明本发明材料压缩后具有良好 的回弹性， 利于在今后的临床应用中用于不规则骨缺损部位的填充。 0033 图3是成骨前体细胞MC3T3-E1在上述复合骨修复材料上培养时在倒置显微镜下的 观察图， 表明本发明材料具有良好。
20、的细胞相容性， 利于成骨细胞的粘附、 增殖。 0034 图4a和图4b是成骨前体细胞MC3T3-E1在上述复合骨修复材料上培养的电镜图， 表 说 明 书 3/5 页 5 CN 104958785 B 5 明本发明材料具有良好的细胞相容性， 细胞在复合骨支架材料上伸展良好、 形态正常。 0035 实施例二 0036 市售桑蚕丝， 浸入95Na2CO3水溶液中进行脱胶， Na2CO3水溶液的浓度为0.5， 每 次30min， 共3次， 水洗后60干燥。 溶解于70的CaCl2、 乙醇、 水的三元溶液中(摩尔比1:2: 8)， 溶解时间为4h， 装入透析袋， 在流水冲洗下透析。 将透析好的丝素溶液在。
21、聚乙二醇(PEG) 水溶液中进行浓缩至浓度为15。 胶原蛋白的制备方法参见CN1234424C(胶原蛋白基海绵 及其制备方法)。 纳米羟基磷灰石、 丝素、 胶原凝胶按照1:2:1(重量比)的比例进行充分搅拌 共混， 共混凝胶装入低温快速成型设备配备的针筒中， 设定打印参数(打印针头直径240 m， 打印速度7mm/秒， 针头行走间距300 m， 接收装置的温度为-15)， 打印好的复合凝胶材料 大孔为300 m， 冷冻的复合凝胶再进行冷冻干燥(冷凝温度-50， 真空度20Pa)， 制备成所 需的复合骨支架材料。 0037 实施例三 0038 市售桑蚕丝， 浸入100Na2CO3水溶液中进行脱胶。
22、， Na2CO3水溶液的浓度为0.3， 每次30min， 共3次， 水洗后50干燥。 溶解于65的CaCl2、 乙醇、 水的三元溶液中(摩尔比1: 2:8)， 溶解时间为4h， 装入透析袋， 在流水冲洗下透析。 将透析好的丝素溶液在聚乙二醇 (PEG)水溶液中进行浓缩至浓度为15。 胶原蛋白的制备方法参见CN1234424C(胶原蛋白基 海绵及其制备方法)。 纳米羟基磷灰石、 丝素、 胶原凝胶按照1:2:2(重量比)的比例进行充分 搅拌共混， 共混凝胶装入低温快速成型设备配备的针筒中， 设定打印参数(打印针头直径 240 m， 打印速度7mm/秒， 针头行走间距300 m， 接收装置的温度为-。
23、15)， 调节接收装置的 温度为-15， 打印好的复合凝胶材料大孔为400 m， 冷冻的复合凝胶再进行冷冻干燥(冷凝 温度-50， 真空度20Pa)， 制备成所需的复合骨支架材料。 0039 实施例四 0040 市售桑蚕丝， 浸入100Na2CO3水溶液中进行脱胶， Na2CO3水溶液的浓度为0.3， 每次30min， 共3次， 水洗后60干燥。 溶解于70的CaCl2、 乙醇、 水的三元溶液中(摩尔比1: 2:8)， 溶解时间为4h， 装入透析袋， 在流水冲洗下透析。 将透析好的丝素溶液在聚乙二醇 (PEG)水溶液中进行浓缩至浓度为5。 胶原蛋白的制备方法参见CN1234424C(胶原蛋白基。
24、 海绵及其制备方法)。 纳米羟基磷灰石、 丝素、 胶原凝胶按照1:3:2(重量比)的比例进行充分 搅拌共混， 共混凝胶装入低温快速成型设备配备的针筒中， 设定打印参数(打印针头直径 360 m， 打印速度9mm/秒， 针头行走间距300 m， 接收装置的温度为-30)， 调节接收装置的 温度为-20， 打印好的复合凝胶材料大孔为300 m， 冷冻的复合凝胶再进行冷冻干燥(冷凝 温度-50， 真空度20Pa)， 制备成所需的复合骨支架材料。 0041 实施例五 0042 市售桑蚕丝， 浸入100Na2CO3水溶液中进行脱胶， Na2CO3水溶液的浓度为0.5， 每次30min， 共3次， 水洗后。
25、40干燥。 溶解于70的CaCl2、 乙醇、 水的三元溶液中(摩尔比1: 2:8)， 溶解时间为2.5h， 装入透析袋， 在流水冲洗下透析。 将透析好的丝素溶液在聚乙二醇 (PEG)水溶液中进行浓缩至浓度为8。 胶原蛋白的制备方法参见CN1234424C(胶原蛋白基 海绵及其制备方法)。 纳米羟基磷灰石、 丝素、 胶原凝胶按照3:3:2(重量比)的比例进行充分 搅拌共混， 共混凝胶装入低温快速成型设备配备的针筒中， 设定打印参数(打印针头直径 410 m， 打印速度8mm/秒， 针头行走间距250 m， 接收装置的温度为-30)， 调节接收装置的 说 明 书 4/5 页 6 CN 104958。
26、785 B 6 温度为-10， 打印好的复合凝胶材料大孔为250 m， 冷冻的复合凝胶再进行冷冻干燥(冷凝 温度-50， 真空度20Pa)， 制备成所需的复合骨支架材料。 0043 尽管结合附图对本发明进行了上述描述， 但是本发明并不局限于上述的具体实施 方式， 上述的具体实施方式仅仅是示意性的， 而不是限制性的， 本领域的技术人员在本发明 的启示下， 在不脱离本发明的宗旨下做出的许多变形， 均属于本发明的保护之列。 说 明 书 5/5 页 7 CN 104958785 B 7 图2 说 明 书 附 图 1/2 页 8 CN 104958785 B 8 图3 说 明 书 附 图 2/2 页 9 CN 104958785 B 9 。