本发明涉及一项新的分子杂交技术，特别是逆向斑点分子杂交技术，更为具体地是涉及人体乙肝病毒的一种新的检测方法。 乙型病毒性肝炎的病原体乙肝病毒（HBV）是一种引起人体肝炎的脱氧核糖核酸（DNA）的病毒。据统计，目前全世界已有二亿多人受到乙肝病毒的感染，大量流行病学资料表明，它的感染与人体原发性肝癌的发生密切相关。
HBV的完整病毒为：含有乙型肝炎表面抗原（HBsAg）的外壳包裹和乙型肝炎核心抗原（HBc Ag）、病毒基因组-DNA与该病毒的脱氧核糖核酸聚合酶（DNA聚合酶）构成的核心，它又称为Dane颗粒。其平均直径为42毫微米。由于表面抗原（HBs Ag）基因在肝细胞内过量表达，因而在乙肝携带者血清内还可发现平均直径为22毫微米的表面抗原颗粒，由于它并不含有该病毒的基因组DNA及其DNA聚合酶，因而这种颗粒无致病性。在已有技术中，已发展了以下几种检测乙型肝炎病毒感染的方法：
1.利用免疫血清学方法测定乙型肝炎两对半抗原及相应的抗体标志，包括乙型肝炎表面抗原（HBs Ag）及其抗体（抗HBs）、e抗原（HBe Ag）及其抗体（抗HBe）以及乙型肝炎核心抗原的核体（抗HBc）。这是目前临床应用的常规方法。由于e抗原在一定程度上代表了核心抗原的存在，因而它的存在对判定乙肝感染性有一定的临床意义。然而，上述两对半标志物，包括e抗原本身并不直接涉及乙肝病毒复制、增殖，因而它们只能是乙型肝炎病毒感染的间接标志。
2.HBV DNA斑试测定，这是近年来发展地一项新技术。其优点是直接测定HBV的病毒基因组，因而是一项测定乙型肝炎感染性的直接标志。但这一方法测定的结果，尚不能排除血清中可能存在游离的HBV DNA片段，它们可能是降价的HBV DNA，同时由于无病毒的外壳及该病毒的聚合酶，因而无感染能力。同时，该方法测定时，首先必须经遗传工程方法扩增含HBV DNA顺序的重组质粒，然后，再把它的载体DNA切除，上述纯化物的HBV DNA应用制品翻译（Nick-trans Iation）的方法制得3eP-HBV DNA探针对血清样品进行斑试测定，因而方法较繁复，成本较高。
3.HBV DNA聚合酶的测定。早在1973年，凯普莱恩（Kaplan）等应用氚标记-三磷酸脱氧胸苷（3H-TTP）及其他三个DNA合成的前生物三磷酸脱氧腺苷、三磷酸脱氧鸟苷和三磷酸脱氧胞苷（dATP、dCTP、dGTP）渗入的方法测定HBV内源的DNA聚合酶，对于HBV DNA聚合酶的测定，反应了复制型的病毒的存在，因而为乙型肝炎的检测提供了直接标志。但该方法仅通过三氯醋酸（TCA）沉淀法测定3H-TTP渗入后的DNA产物的放射强度，经过与几个同时测定的正常血样3H-渗入后的平均值进行数理统计来判定其聚合酶的活力。虽然近年来此方法已有不少改进，如采用三氯醋酸的纸层析来代替三氯醋酸直接沉淀法以减少3H-TTP的污染等，但由于方法颇为复杂，同时又无法排除血清中可能存在的其他病毒如EBV等DNA聚合酶的干扰，因而仍不能成为特异地确定乙型肝炎病毒感染性的理想标志。
本发明的目的在于克服上述各种乙型肝炎病毒感染检测方法所存在的缺点，提供一种简便的检测方法，确定乙肝病毒感染性的直接而可靠的标志，这种方法便是我们在国际上首创的逆向斑点分子杂交技术。
本发明的目的是这样来实现的，根据在Dane颗粒中，HBV DNA由两条长度不等的、具有可变单链区的环形DNA组成。病毒核心中同时存在HBV内源DNA聚合酶。为此，当外环境中存在DNA合成的前生物-三磷酸脱氧核苷（dNTP），包括三磷酸脱氧胸苷（dTTP）、三磷酸脱氧腺苷（dATP）、三磷酸脱氧乌苷（dGTP）和三磷酸脱氧胞苷（dc TP）时，它可以以短链末端为引物。长链的单链区为模板，延长其短链。若在加入的dNTP中有一个是带有一种特殊的、在以后检测过程中可显示的标记物，则延长的短链便带此标记。根据核酸同源顺序能相互杂交的原理，以上述带有特殊标记物的短链为分子探针，与标准的含有全部HBV DNA顺序的重组质粒作逆向斑点分子杂交，并用相应的方法显示，这样即检测了HBV DNA聚合酶的活力，又证明了HBV DNA的存在，从而能可靠地判断感染性乙型肝炎病毒的存在。该测定方法简便、灵敏，实验表明，只要受捡的血清中存在10克的HBV DNA（相当于3×105Dane颗粒）即可获得满意的阳性结果。鉴于这一方法已能克服上述三种检测方法的弊病，因而它将成为确定乙型肝炎病毒感染的直接而又可靠的依据，在乙型肝炎的确诊、药物治疗以及HBV疫苗预防及其疗效考核上具有重要的意义。同时在对生物制剂的监测，防止因HBV污染而产生病毒扩散以及研究乙型肝炎病毒与人体肝癌发生的关系等研究中皆具有重要的社会效益;另外，该检测方法适于以药盒形式推广应用，因而具有商业价值。
本发明将参照附图来加以描述，
图1a至图1i是本发明逆向斑点分子杂交检测方法步骤的次序示意图。其中：
图1a是含有有完整HBV DNA顺序的重组质粒pBR322-的HBV DNA的结构示意图。
图1b是经变性处理后的重组质粒双链打开成单链的示意图。
图1e是硝基纤维杂交滤膜片的组成示意图。
图1d是血清中感染性的乙型肝炎病毒-Dane颗粒的结构示意图。
图1c是Dane颗粒破膜以后释出的HBV DNA以及HBV DNA聚合酶的结构示意图。
图1f表示32P标记的HBV DNA的短链延长过程。
图1g表示变性后成为两根单链32P标记的HBV DNA的分子探针。
图1ha为含有血清HBV DNA杂交产物的滤膜示意图。
图1hb为无血清HBV DNA杂交产物的滤膜示意图。
图1ia表示经自显影得到的阳性结果。
图1ib表示经自显影得到的阴性结果。
图2是20例血清逆向斑点分子杂交放射自显影图。
图3是不同放射强度逆向斑点分子杂交自显影图。
下面结合附图来详细描述本发明的一个最佳实施例。
本发明逆向斑点分子杂交检测方法步骤的次序如图1所示。首先是制备硝基纤维杂交滤膜，其过程如图1（a）至1（c）所示，对含有HBV DNA顺序[1]及载体pBR322-[2]的重组质粒pBR322-HBV DNA（见图1a）作变性处理，方法是在100℃水浴内煮10分钟，使其双链打开成单链，图1b是打开成单链的重组质粒的示意图。然后合即将此重组质粒放入水浴中速冷，以防其单链复性。待冷却后，加入氢氧化钠到0.2克分子溶度，在室温下置10分钟以上，使双链DNA充分变性为单链，然后以1-2微克/微升DNA点样于硝基纤维滤膜[3]上。待滤膜在室温下干燥后，用缓冲系统浸泡中和，缓冲系统可以分别是1克分子浓度三羟甲基氨基甲烷（PH7，3）加上0.6克分子浓度的氯化钠溶液，以及0.5克分子浓度的三羟甲基氨基甲烷（PH7.3）加上1.5克分子浓度的氯化钠溶液，滤膜在上述两者中各浸泡10-20分钟，或者也可使用其他缓冲系统来浸泡中和。然后在80℃下烘2-4小时，使它干燥，并使HBV DNA固定于滤膜上。经这样处理后的中心含有单链HBV DNA顺序的硝基纤维滤膜即可保存在室温干燥处待用。要使用这种滤膜作逆向斑点分子杂交时，必须先将滤膜分割成仅含一个HBV DNA顺序的斑点的小膜片，根据反应容器的大小可采用不同大小的滤膜，例如应用24孔的塑料培养板，滤膜可分成1cm×1cm的小膜片。图1c是其示意图。上述膜片在作逆向斑点杂交前必须先进行予杂交处理以除去其非特异性吸附。方法是将它放在杂交反应容器里，加入预杂交液，并在43℃下预杂交4-24小时，其中预杂交液由0.2%牛血清白蛋白（BSA）、0.2%聚乙烯基吡咯烷酮（PVP）.0.2%聚蔗糖（Focill）、0.9克分子浓度氯化钠及0.09克分子浓度柠檬酸钠组成，各组分的浓度可随预杂交温度的变化而作相应的调整。
以上所述的对重组质粒PBR322-HBV DNA的变性处理除了使用热变性外，还可使用碱变性或甲酰氨变性。并且重组质粒除了用PBR322-HBV DNA，也可以用AM12或用含有HBV长链DNA的M13重组质粒来代替。
Dane颗粒的结构如图1d所示，它外层包膜为乙型肝炎表面抗原HBSAg[4]及磷脂双层[5]，内含乙型肝炎核心抗原HBc Ag[6]及其包裹的病毒基因组脱氧核糖核酸（HBV DNA）[7]与该病毒的脱氧核糖核酸聚合酶（HBV DNA聚合酶）核心[8]。本方法对疑有Dane颗粒的血清内首先加入用于除去病毒外膜表面抗原的非离子去垢剂。在本实施例中，以100微升血清加入20微升5%HP40及1.5%B-基乙醇，在室温下放置10分钟，以使HBV DNA[7]以及HBV DNA聚合酶[8]释出，如图（1e），所示这里使用的非离子去垢剂NP40也可以用Triton x100或用吐温（tween）类表面活性剂代替，而巯基保护剂β-巯基乙醇也可用二硫苏糖醇（Dithiothreitol）代替。然后，再加入100微升反应混合液，在37℃下温浴2-5小时，通常是3小时，使组成HBV DNA的环形双链中的短链延长，如图1f所示，反应混合液由缓冲系统和DNA合成的四种前生物d NTP组成。缓冲系统是由中性缓冲液、氯化镁和氯化铵组成，本实施例中，中性缓冲液使用三羟甲基氨基甲烷（tris-HCL），也可以用磷酸、硼酸或其他常规缓冲液代替。DNA合成的四种前生物d NTP是三磷酸脱氧腺苷（dATP）、三磷酸脱氧胸苷（dTTP）、、三磷酸脱氧鸟苷（dGTP）和三磷酸脱氧胞苷（dc TP），其中至少一种带有放射性同位素，如α-32P-dCTP等。反应混合液的各组分的配比为：每60份血清测定的反应混合液按体积比分别是17∶3∶6的1克分子浓度的三羟甲基氨基甲烷（PH7.3）、1克分子溶度氯化镁及2克分子溶度的氯化铵。而DHA合成的四种前生物至少有一种是α-32P-dNTP（60～120微居里）及浓度各为2毫克分子的非同位素的d NTP各125微升。由于α-32P-dNTP的渗入，使延长的短链带有放射性，从而制得32P-HBV DNA分子探针。32P-标记物也可以用其他放射性同位素诸如125I-或35S-等代替。此外如用α-32P标记，除了可用高比放度α-32P-dNTP外，还可以应用经由2至3个半衰期衰变以后的低比放度的-P-dNTP。
接着，将上述的分子探针加入500微升杂交混合液，在100℃水浴中煮沸5-10分钟，通常是10分钟，使DNA双链变性成为单链，如图1g所示，然后立即将它放到冰浴中冷却，以防止变性后的单链DNA复性。其中杂交混合液含50%甲酰胺、0.3克分子浓度氯化钠，0.03克分子浓度拧檬酸钠、0.2%焦磷酸钠、0.02%牛血清白蛋白、0.02%聚蔗糖、0.02%聚乙烯基吡咯烷酮、10%右旋糖苷硫酸酯及100-200微克/毫升鱼精DNA组成。这里的鱼精DNA是经超声断链及100℃变性的单链鱼精DNA。而杂交混合液中其他组分的浓度均可随杂交温度的变化而进行相应的调整，如果杂交温度升高，则甲酰胺浓度可以相应降低，另外杂交混合液中右旋塘苷硫酸酯（Dextran Su Ifate）用来提高杂交的效率。
上述有放射性同位素32P-的标记的单链NBVbNA分子探针杂交混合液和含有单链HBV DNA顺序的硝基纤维滤膜片在43℃下杂交18-36小时，得到如图1hb所示的结果，图1ha表示受检血清中具有感染性的乙肝病毒存在，经聚合酶反应后生成含标记的HBV DNA，它通过热变性后的单链HBV DNA能与硝基纤维滤膜上的单链HBV DNA斑点杂交并使该斑点带上标记物，而图1hb表示受检血清内无感染性的乙肝病毒存在，虽经聚合酶反应，无含标记物HBV DNA产生，故不能与滤膜上的单链HBV DNA斑点杂交。然后，用洗脱液洗去未杂交的游离的32P标记物。这里，洗脱液先后使用0.3克分子浓度氯化钠和0.03克分子浓度柠檬酸钠和0.1%十二烷基硫酸钠的溶液，并且杂交后的洗脱条件，包括洗脱液的离子强度，十二烷基硫酸钠的浓度及洗脱时间均可根据洗脱时膜片上残留的放射强度酌情改变。
最后，将经洗脱液处理的硝基纤维杂交滤膜片干燥并用X-线感光片在-20--70℃中作放射显影。通常是-70℃温度下感光1-7天。为加速感光，可加置坛感屏，某些血清因含Dane颗粒极少，合成的32P-HBV DNA比放强度甚低，因而需增加感光时间，以避免漏检。观察感光片的放射自显影，若有放射性曝光圆斑显现。如图1ia则结果为阳性，说明受检血清中有感染性的乙肝病毒存在，反之，若无斑点显现，如1ib所示，则为阴性，说明受检血清中不存在感染性的乙肝病毒。
图2是20例血清逆向斑点分子杂交放射自显影图，由图可见，序号2、3、5、6、10、13、、16、18及19为逆向斑点分子杂交阳性结果，而序号1、4、7、8、9、11、12、14、15、17、及20为逆向斑点分子杂交阴性结果。
将经该技术测定获得阳性结果的血清，用放射性-P-dNTP参入的聚合酶反应后，合成的α-32P-DNA，通过琼脂糖凝胶电泳及转移后的放射自显影皆证明具典型的血清HBV DNA存在，从而说明该血清中含有感染性的乙肝病毒，反之，经该技术测定获得阴性结果的血清，证明不存在感染性的乙肝病毒。
下表列出95例受检血清逆向斑点分子杂交结果，由此可看出该项技术用于捡测HBV感染的正确程度。
表
HBV免疫血清标志 受检血清 逆向斑点分子杂交及血
清HBV DNA （+） （-）
斑点分子杂交
H Bs Ag携带者（65例）
H Be Ag（+）/HBV DNA（+） 41 40 1
H Be Ag（+）/HBV DNA（-） 4 4 0
H Be Ag（-）/HBV DNA（+） 6 3 3
H Be Ag（-）/HBV DNA（-） 14 3 11
健康人：（30例）
H Be Ag（-）/HBV DNA（-） 30 0 30
更进一步，通过实施时对本发明技术的捡测方法的灵敏度作了测定，具体步骤为，通过缺口翻译（nick-translation）方法标记不含PBR322顺序的HBV DNA片段的比强度为2.0×10cpm/ng DNA，其中cpm为每分钟脉冲数，加入杂交混合液，在100℃下变性后经不同程度的稀释，得到标准α-32P-HBV DNA，分子探针强度分别为：
1.2.5×106cpm/12.5ng HBV DNA
2.2.5×105cpm/1.25ng HBV DNA
3.2.5×104cpm/0.125ng HBV DNA
4.2.5×103cpm/12.5pg HBV DNA
5.2.5×102cpm/1.25pg HBV DNA
将它们分别与含PBR322HBV DNA单链顺序的硝基纤维滤膜杂交，得到如图3所示的不同放射性强度逆向斑点分子杂交自显影图，其中序号，1至5分别与以上五组放射性强度相对应，实验发现，250cpm/1.25Pg组经二至六天自显影后即见清晰的杂交阳性斑点，从而证明了本发明方法的灵敏度为250cpm/1.25Pg。
上面所描述的实施例是应用放射性同位素渗入的方法经由X-线感光片放射自显影完成的逆向斑点分子杂交过程，然而，这种描述并不意味着对本发明的实际范围作限定，对孰悉本专业的技术人员来说，本发明也可以推广到应用非放射性同位素渗入的方法，即在反应混合液里的DHA合成的四种前生物中至少有一种含有非同位素的其他标志物，并且此种标志物必需在以后的捡测过程中可以显示。例如，用生物素标记的dUTP代替DTTP，在dATP、dCTP、dGTP存在的情况下，通过与血清中HBV DNA聚合酶反应，产生含有生物素的HBV DNA分子探针，经变性及与含单链的HBV DNA顺序重组质粒作逆向斑点分子杂交，最后可利用生物素与抗生物素的特异结合的方法，或用包括抗生蛋白链菌素（streptavidin）腊根过氧化物酶染色法或其他过氧化物酶染色法的酶标方法（ELISA）来测定血清中感染性HBV的存在，此外也可应用抗抗生物素的荧光免疫法及放射免疫法来显示感染性HBV的存在。
上面描述了应用本发明的逆向斑点分子杂交技术，通过简便的方法，同时测定乙肝患者血清中所含的HBV DNA及其DNA聚合酶两项标志，为乙肝的感染性提供了可靠的依据。为此，它在乙肝的诊断及防治中具有重大意义，鉴于HBV在世界范围内的广泛流行，因而该检测方法具有巨大的商业开发价值，可以通过大批量生产含有HBV DNA单链的硝基纤维滤膜及相应的反应容器并配以检测用的各种反应试剂，包括预杂交液、杂交混合液和聚合酶反应试剂，即破除血清中Dane颗粒的去垢剂，聚合酶保护剂和反应混合液以制成逆向斑点分子杂交诊断药盒，供临床及有关单位应用。