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1、(10)申请公布号 CN 102671239 A (43)申请公布日 2012.09.19 CN 102671239 A *CN102671239A* (21)申请号 201210133901.9 (22)申请日 2012.05.03 A61L 27/34(2006.01) A61L 27/30(2006.01) A61L 27/54(2006.01) A61L 29/10(2006.01) A61L 29/08(2006.01) A61L 29/16(2006.01) A61L 31/10(2006.01) A61L 31/08(2006.01) A61L 31/16(2006.01) (7。
2、1)申请人 浙江大学 地址 310027 浙江省杭州市西湖区浙大路 38 号 (72)发明人 计剑 王佰亮 杨富春 郑树森 (74)专利代理机构 杭州求是专利事务所有限公 司 33200 代理人 张法高 (54) 发明名称 一种广谱长效抗菌壳聚糖纳米复合凝胶涂层 制备方法 (57) 摘要 本发明公开了一种广谱长效抗菌壳聚糖纳米 复合凝胶涂层制备方法。 在 pH 值为 4.0 的醋酸缓 冲溶液中依次加入硝酸银、 聚乙烯吡咯烷酮和壳 聚糖， 搅拌 2h， 以旋涂、 浸涂或喷涂的方式涂敷在 基材表面上， 经自然干燥处理 12h 和真空干燥处 理 12h， 然后在 90 180原位热还原 0.5 6h。
3、， 得到纳米银颗粒粒度为550nm的广谱长效抗菌 壳聚糖纳米复合凝胶涂层。该涂层具有良好的广 谱抗细菌黏附和杀菌的能力， 并具有良好的细胞 相容性。 该方法工艺简单、 快捷， 条件温和， 易于旋 涂、 浸涂、 喷涂等可工业实的方式实现， 适用范围 广， 能够有效地的改善医用装置表面的抗菌性能， 生物相容性和润滑性。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 1/1 页 2 1. 一种广谱长效抗菌壳聚糖纳米复合凝胶涂层制备方法， 其特征在于 ： 在 pH 值为 4.0 的醋酸缓冲溶液。
4、中依次加入硝酸银、 聚乙烯吡咯烷酮和壳聚糖， 搅拌 2h， 以旋涂、 浸涂或喷 涂的方式涂敷在基材表面上， 经自然干燥处理 12h 和真空干燥处理 12h， 然后在 90 180 原位热还原0.56h， 得到纳米银颗粒粒度为550nm的广谱长效抗菌壳聚糖纳米复合凝 胶涂层， 其中， 壳聚糖质量浓度为 520mg/ml， 聚乙烯吡咯烷酮的质量浓度为 120mg/ml， 硝 酸银的质量浓度为 0.01 0.1 mg/ml。 2. 根据权利要求 1 所述的一种广谱长效抗菌壳聚糖纳米复合凝胶涂层制备方法， 其特 征在于所述的基材为玻璃、 石英、 云母、 不锈钢、 聚酯膜或聚乳酸膜。 3. 根据权利要求。
5、 1 所述的一种广谱长效抗菌壳聚糖纳米复合凝胶涂层制备方法， 其特 征在于， 所述的以旋涂的方式涂敷在基材表面上的方法为 ： 开动旋涂仪， 转速为 1000rad/ min， 用滴管吸取 0.1ml 涂膜液滴在基材上， 旋涂 10s， 然后在 2500rad/min 下旋涂 2min， 干 燥， 重复旋涂 3-5 次。 4. 根据权利要求 1 所述的一种广谱长效抗菌壳聚糖纳米复合凝胶涂层制备方法， 其特 征在于， 所述的以浸涂的方式涂敷在基材表面上的方法为 ： 用镊子夹住基材， 浸入涂膜液中 5s， 取出， 使表面的液体均匀覆盖， 然后放置于玻璃平板上， 干燥后用刀片剥离基材。 5. 根据权利。
6、要求 1 所述的一种广谱长效抗菌壳聚糖纳米复合凝胶涂层制备方法， 其特 征在于， 所述的以喷涂的方式涂敷在基材表面上的方法为 ： 将喷涂液加入到雾化器中， 喷涂 在基材上 1s， 60烘箱干燥 20min， 此操作重复 5 次。 权 利 要 求 书 CN 102671239 A 2 1/5 页 3 一种广谱长效抗菌壳聚糖纳米复合凝胶涂层制备方法 技术领域 0001 本发明涉及一种广谱长效抗菌壳聚糖纳米复合凝胶涂层制备方法。 背景技术 0002 细菌、 真菌等病原微生物常常引发机体组织发生病变， 严重威胁着人类的身心健 康。 据直接卫生组织 （World Health Organization，。
7、 WHO） 1998 年统计数字表明， 1995年全 世界死亡人口为 5200 万， 其中因细菌感染造成的死亡人数约占 33%， 如今这一比例还在进 一步提高。因此抗菌材料和制品的开发受到越来越多的关注。如今临床术后和医疗植入体 抗感染的主要方式是使用抗生素， 然而随着抗生素的大量使用， 细菌的耐药性也大大提高， 特别是一旦形成生物膜， 细菌的抗药性将极大提高， 需要几百甚至上千倍的抗生素杀死， 处 理效果并不理想。 临床处理的方式往往是再次手术取出植入体， 清洗或者更换新的植入体， 这样的处理方式不但增加病人的痛苦， 而且增加病人经济负担， 因此寻求一种简单有效的 长效抗菌涂层具有重要的意义。
8、。 0003 通过对各种医用装置的表面修饰， 在保持原有性能的条件下， 改善生物医用装 置生物相容性成为现代医疗装置应用中的重要问题。感染发生的一般过程是 ： 细菌的黏 附 ； 定植和繁殖， 形成菌落 ； 分泌胞外基质， 菌落通过胞外基质连接在一起， 形成生物膜 （biofilm） ， 生物膜释放浮游菌体和毒素， 引发感染。 针对细菌感染的第一个步骤， 制备一种 亲水的凝胶涂层将增加涂层的溶胀能力和亲水性， 能够实现涂层的抗细菌黏附性能。然而 单纯的亲水涂层并不能实现长效抗菌的能力， 也不能杀灭植入体周围的病菌。壳聚糖是一 种天然的聚阳离子抗菌分子， 并且具有良好的生物相容性和涂层形成能力， 。
9、抗菌机理是接 触式杀菌。 纳米银是一种高效杀菌材料， 相对分子状态的银能够实现可控和长期释放， 以壳 聚糖分子为模板， 原位形成纳米银， 并且由于氢键作用， 壳聚糖和聚乙烯吡咯烷酮能够稳定 的复合。聚合物共混技术具有简单、 易于操作的特点， 并且使膜层具有其组分的复合功能， 通过对基材的预处理解决了涂层溶胀带来的稳定性问题， 有望得到兼具抗细菌黏附和杀菌 的性能。 发明内容 0004 本发明的目的是提供一种广谱长效抗菌壳聚糖纳米复合凝胶涂层制备方法。 0005 广谱长效抗菌壳聚糖纳米复合凝胶涂层制备方法 ： 在 pH 值为 4.0 的醋酸缓冲溶 液中依次加入硝酸银、 聚乙烯吡咯烷酮和壳聚糖， 。
10、搅拌 2h， 以旋涂、 浸涂或喷涂的方式涂敷 在基材表面上， 经自然干燥处理 12h 和真空干燥处理 12h， 然后在 90 180原位热还原 0.5 6h， 得到纳米银颗粒粒度为 5 50nm 的广谱长效抗菌壳聚糖纳米复合凝胶涂层， 其 中， 壳聚糖质量浓度为 520mg/ml， 聚乙烯吡咯烷酮的质量浓度为 120mg/ml， 硝酸银的质 量浓度为 0.01 0.1 mg/ml。 0006 所述的基材为玻璃、 石英、 云母、 不锈钢、 聚酯膜或聚乳酸膜。 0007 所述的以旋涂的方式涂敷在基材表面上的方法为 ： 开动旋涂仪， 转速为 1000rad/ 说 明 书 CN 102671239 A。
11、 3 2/5 页 4 min， 用滴管吸取 0.1ml 涂膜液滴在基材上， 旋涂 10s， 然后在 2500rad/min 下旋涂 2min， 干 燥， 重复旋涂 3-5 次。 0008 所述的以浸涂的方式涂敷在基材表面上的方法为 ： 用镊子夹住基材， 浸入涂膜液 中 5s， 取出， 使表面的液体均匀覆盖， 然后放置于玻璃平板上， 干燥后用刀片剥离基材。 0009 所述的以喷涂的方式涂敷在基材表面上的方法为 ： 将喷涂液加入到雾化器中， 喷 涂在基材上 1s， 60烘箱干燥 20min， 此操作重复 5 次。 0010 本发明涂层溶液配制简便， 能实现无污染操作， 可采用旋涂、 浸涂、 喷涂等。
12、可工业 实现的方式， 适用范围广， 能够对具有复杂体型结构的生物医用装置进行涂层修饰 ； 涂层可 改善医用装置表面的多种抗菌性能， 润滑性， 生物相容性， 在人体环境下以水凝胶的形式存 在， 这种性质使生物材料表面润滑， 减少材料表面和粘膜组织之间的摩接阻力 ； 涂层材料化 学结构稳定， 耐疲劳、 剪切， 能适应人体的内环境 ； 涂层能够实现广谱的多功能抗菌的能力。 具体实施方式 0011 广谱长效抗菌壳聚糖纳米复合凝胶涂层制备方法 ： 在 pH 值为 4.0 的醋酸缓冲溶 液中依次加入硝酸银、 聚乙烯吡咯烷酮和壳聚糖， 搅拌 2h， 以旋涂、 浸涂或喷涂的方式涂敷 在基材表面上， 经自然干燥。
13、处理 12h 和真空干燥处理 12h， 然后在 90 180原位热还原 0.5 6h， 得到纳米银颗粒粒度为 5 50nm 的广谱长效抗菌壳聚糖纳米复合凝胶涂层， 其 中， 壳聚糖质量浓度为 520mg/ml， 聚乙烯吡咯烷酮的质量浓度为 120mg/ml， 硝酸银的质 量浓度为 0.01 0.1 mg/ml。 0012 所述的基材为玻璃、 石英、 云母、 不锈钢、 聚酯膜或聚乳酸膜。 所述的以旋涂的方式 涂敷在基材表面上的方法为 ： 开动旋涂仪， 转速为 1000rad/min， 用滴管吸取 0.1ml 涂膜液 滴在基材上， 旋涂 10s， 然后在 2500rad/min 下旋涂 2min，。
14、 干燥， 重复旋涂 3-5 次。所述的以 浸涂的方式涂敷在基材表面上的方法为 ： 用镊子夹住基材， 浸入涂膜液中 5s， 取出， 使表面 的液体均匀覆盖， 然后放置于玻璃平板上， 干燥后用刀片剥离基材。所述的以喷涂的方式 涂敷在基材表面上的方法为 ： 将喷涂液加入到雾化器中， 喷涂在基材上 1s， 60烘箱干燥 20min， 此操作重复 5 次。 0013 实施例 1 ： 依次在pH值为4.0的醋酸缓冲溶液中加入硝酸银、 聚乙烯吡咯烷酮和壳聚糖， 搅拌2h， 涂膜液中壳聚糖和聚乙烯吡咯烷酮的质量浓度分别为 10mg/ml 和 1mg/ml， 硝酸银的浓度为 0.1 mg/ml。将喷涂液加入到雾。
15、化器中， 喷涂在石英上 1s， 60烘箱干燥 20min， 此操作重复 5 次。涂层在 110原位热还原 4h， 获得了一种广谱长效抗菌壳聚糖纳米复合凝胶涂层。 0014 断面场发射扫描电镜测试涂层的厚度为 3.560.45m。透射电镜结果表明 ： 纳 米银颗粒粒度分布于 5 12nm， 平均 8nm。摇瓶培养和稀释涂平板法测试膜层的杀菌性能， 结果显示该膜层能在 10min 杀死 100% 的大肠杆菌和 100% 的金黄色葡萄球菌。采用 MTT 和 FDA实验结果发现对人脐静脉内皮细胞细胞毒性较低， 细胞活性超过TCPS的92%， 因此具有 良好的细胞相容性。 0015 实施例 2 ： 依次。
16、在pH值为4.0的醋酸缓冲溶液中加入硝酸银、 聚乙烯吡咯烷酮和壳聚糖， 搅拌2h， 涂膜液中壳聚糖和聚乙烯吡咯烷酮的质量浓度分别为 5mg/ml 和 2mg/ml， 硝酸银的浓度为 说 明 书 CN 102671239 A 4 3/5 页 5 0.2 mg/ml。将喷涂液加入到雾化器中， 喷涂在基材上 1s， 60烘箱干燥 20min， 此操作重复 5 次。涂层在 90原位热还原 6h， 获得了一种广谱长效抗菌壳聚糖纳米复合凝胶涂层。 0016 原子力显微镜观察形貌发现表面具有很低的粗糙度， RMS 为 3.720.34 nm。透射 电镜结果表明 ： 纳米银颗粒粒度分布于 7 15nm， 平均。
17、 10nm。摇瓶培养和稀释涂平板法测 试膜层的杀菌性能， 结果显示该膜层能在 10min 杀死 100% 的大肠杆菌和 100% 的金黄色葡 萄球菌。采用 MTT 和 FDA 实验结果发现对人脐静脉内皮细胞细胞毒性较低， 细胞活性超过 TCPS 的 85%， 因此具有良好的细胞相容性。 0017 实施例 3 ： 依次在pH值为4.0的醋酸缓冲溶液中加入硝酸银、 聚乙烯吡咯烷酮和壳聚糖， 搅拌2h， 涂膜液中壳聚糖和聚乙烯吡咯烷酮的质量浓度分别为 7mg/ml 和 5mg/ml， 硝酸银的浓度为 0.3 mg/ml。开动旋涂仪， 转速为 1000rad/min， 用滴管吸取 0.1ml 涂膜液滴。
18、在玻璃上， 旋涂 10s， 然后在 2500rad/min 下旋涂 2min， 干燥， 重复旋涂 3-5 次。涂层在 150原位热还原 0.5h， 获得了一种广谱长效抗菌壳聚糖纳米复合凝胶涂层。 0018 断面场发射扫描电镜测试膜层的厚度为 2.550.38m。静态接触角测试膜层 显示出一定的亲水性， 为 66.671.62， 原子力显微镜观察形貌发现表面具有很低的粗 糙度， RMS 为 2.440.26 nm。透射电镜结果表明 ： 纳米银颗粒粒度分布于 9 19nm， 平 均 15nm。摇瓶培养和稀释涂平板法测试膜层的杀菌性能， 结果显示该膜层能在 10min 杀死 100%的大肠杆菌和10。
19、0%的金黄色葡萄球菌。 抗细菌黏附实验发现和未涂膜的基材相比， 该 共混膜降低了 100% 的大肠杆菌黏附和 98% 的金黄色葡萄球菌的黏附。采用 MTT 和 FDA 实 验结果发现对人脐静脉内皮细胞细胞毒性较低， 细胞活性超过 TCPS 的 82%， 因此具有良好 的细胞相容性。 0019 实施例 4 ： 依次在pH值为4.0的醋酸缓冲溶液中加入硝酸银、 聚乙烯吡咯烷酮和壳聚糖， 搅拌2h， 涂膜液中壳聚糖和聚乙烯吡咯烷酮的质量浓度分别为 13mg/ml 和 10mg/ml， 硝酸银的浓度 为 0.3 mg/ml。用镊子夹住云母， 浸入涂膜液中 5s， 取出， 使表面的液体均匀覆盖， 然后放。
20、置 于玻璃平板上， 干燥后用刀片剥离聚酯膜。涂层在 180原位热还原 0.5h， 获得了一种广谱 长效抗菌壳聚糖纳米复合凝胶涂层。 0020 断面场发射扫描电镜测试膜层的厚度为 4.630.63m。静态接触角测试膜层 显示出一定的亲水性， 为 54.451.44， 原子力显微镜观察形貌发现表面具有很低的粗 糙度， RMS 为 2.530.34 nm。透射电镜结果表明 ： 纳米银颗粒粒度分布于 12 24nm， 平 均 18nm。摇瓶培养和稀释涂平板法测试膜层的杀菌性能， 结果显示该膜层能在 10min 杀死 100% 的大肠杆菌和 100% 的金黄色葡萄球菌。采用 MTT 和 FDA 实验结果。
21、发现对人脐静脉内 皮细胞细胞毒性较低， 细胞活性超过 TCPS 的 75%， 因此具有一定的细胞相容性。 0021 实施例 5 ： 依次在pH值为4.0的醋酸缓冲溶液中加入硝酸银、 聚乙烯吡咯烷酮和壳聚糖， 搅拌2h， 涂膜液中壳聚糖和聚乙烯吡咯烷酮的质量浓度分别为 5mg/ml 和 15mg/ml， 硝酸银的浓度为 0.5 mg/ml。用镊子夹住云母， 浸入涂膜液中 5s， 取出， 使表面的液体均匀覆盖， 然后放置于 玻璃平板上， 干燥后用刀片剥离聚酯膜。涂层在 125原位热还原 3h， 获得了一种广谱长效 抗菌壳聚糖纳米复合凝胶涂层。 说 明 书 CN 102671239 A 5 4/5 。
22、页 6 0022 断面场发射扫描电镜测试膜层的厚度为 2.930.34m。静态接触角测试膜层 显示出一定的亲水性， 为 48.341.64， 原子力显微镜观察形貌发现表面具有很低的粗 糙度， RMS 为 2.140.35 nm。透射电镜结果表明 ： 纳米银颗粒粒度分布于 15 27nm， 平 均 20nm。摇瓶培养和稀释涂平板法测试膜层的杀菌性能， 结果显示该膜层能在 10min 杀死 100%的大肠杆菌和100%的金黄色葡萄球菌。 抗细菌黏附实验发现和未涂膜的的基材相比， 该共混膜降低了 95% 的大肠杆菌黏附和 98% 的金黄色葡萄球菌的黏附。 0023 实施例 6 ： 依次在pH值为4.。
23、0的醋酸缓冲溶液中加入硝酸银、 聚乙烯吡咯烷酮和壳聚糖， 搅拌2h， 涂膜液中壳聚糖和聚乙烯吡咯烷酮的质量浓度分别为 20mg/ml 和 20mg/ml， 硝酸银的浓度 为0.6 mg/ml。 将喷涂液加入到雾化器中， 喷涂在聚乳酸膜上1s， 60烘箱干燥20min， 此操 作重复 5 次。涂层在 130原位热还原 3h， 获得了一种广谱长效抗菌壳聚糖纳米复合凝胶 涂层。 0024 断面场发射扫描电镜测试膜层的厚度为 5.850.56m。静态接触角测试膜层 显示出一定的亲水性， 为 63.452.44， 原子力显微镜观察形貌发现表面具有很低的粗 糙度， RMS 为 3.230.44 nm。透射。
24、电镜结果表明 ： 纳米银颗粒粒度分布于 15 30nm， 平 均 22nm。摇瓶培养和稀释涂平板法测试膜层的杀菌性能， 结果显示该膜层能在 10min 杀死 100%的大肠杆菌和100%的金黄色葡萄球菌。 抗细菌黏附实验发现和未涂膜的的基材相比， 该共混膜降低了 96% 的大肠杆菌黏附和 95% 的金黄色葡萄球菌的黏附。 0025 实施例 7 ： 依次在pH值为4.0的醋酸缓冲溶液中加入硝酸银、 聚乙烯吡咯烷酮和壳聚糖， 搅拌2h， 涂膜液中壳聚糖和聚乙烯吡咯烷酮的质量浓度分别为 12mg/ml 和 9mg/ml， 硝酸银的浓度为 0.8mg/ml。开动旋涂仪， 转速为 1000rad/min。
25、， 用滴管吸取 0.1ml 涂膜液滴在聚酯膜上， 旋 涂 10s， 然后在 2500rad/min 下旋涂 2min， 干燥， 重复旋涂 3-5 次。涂层在 135原位热还原 2.5h， 获得了一种广谱长效抗菌壳聚糖纳米复合凝胶涂层。 0026 断面场发射扫描电镜测试膜层的厚度为 4.540.43m。静态接触角测试膜层显 示出一定的亲水性， 为 52.452.54， 原子力显微镜观察形貌发现表面具有很低的粗糙 度， RMS 为 2.330.36 nm。透射电镜结果表明 ： 纳米银颗粒粒度分布于 16 35nm， 平均 25nm。把该涂层浸泡在 PBS 中释放 35d， 摇瓶培养和稀释涂平板法测。
26、试膜层的杀菌性能， 结 果显示该膜层能在 30min 杀死 100% 的大肠杆菌和 100% 的金黄色葡萄球菌。 0027 实施例 8 ： 依次在pH值为4.0的醋酸缓冲溶液中加入硝酸银、 聚乙烯吡咯烷酮和壳聚糖， 搅拌2h， 涂膜液中壳聚糖和聚乙烯吡咯烷酮的质量浓度分别为 11mg/ml 和 11mg/ml， 硝酸银的浓度 为 1.0 mg/ml。用镊子夹住不锈钢， 浸入涂膜液中 5s， 取出， 使表面的液体均匀覆盖， 然后放 置于玻璃平板上， 干燥后用刀片剥离聚酯膜。涂层在 100原位热还原 3h， 获得了一种广谱 长效抗菌壳聚糖纳米复合凝胶涂层。 0028 断面场发射扫描电镜测试膜层的厚。
27、度为 3.840.32m。静态接触角测试膜层显 示出一定的亲水性， 为 54.452.04， 原子力显微镜观察形貌发现表面具有很低的粗糙 度， RMS 为 2.530.23 nm。该涂层在 PBS 中浸泡 35d， 用场发射扫描电镜观察断面， 发现该 膜层均匀和稳定存在于硅片表面， 表明预处理提高了膜层的粘结性能。 透射电镜结果表明 ： 说 明 书 CN 102671239 A 6 5/5 页 7 纳米银颗粒粒度分布于 22 50nm， 平均 30nm。摇瓶培养和稀释涂平板法测试膜层的杀菌 性能， 结果显示该膜层能在 30min 杀死 100% 的大肠杆菌和 100% 的金黄色葡萄球菌。 说 明 书 CN 102671239 A 7 。