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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610420637.5 (22)申请日 2016.06.13 (71)申请人 深圳市光明创博生物制品发展有限 公司 地址 518100 广东省深圳市宝安区新安68 区留仙二路美生创谷科技创新园二期 智谷4楼401 (72)发明人 边俊杰 毕晓寰 (74)专利代理机构 杭州千克知识产权代理有限 公司 33246 代理人 黎双华 (51)Int.Cl. A61L 27/36(2006.01) A61L 27/54(2006.01) A61K 35/32(2015.01) A61。
2、K 38/18(2006.01) A61P 19/08(2006.01) (54)发明名称 一种制备骨诱导成骨制剂的方法 (57)摘要 本发明提供一种制备骨诱导成骨制剂的方 法， 该方法包括如下步骤： 1.对2份牙基质进行脱 钙处理； 2.然后再对经过脱钙处理的2份牙基质 进行提取骨形态发生蛋白； 3.最后让提取的骨形 态发生蛋白与其中的1份脱钙处理的牙基质进行 混合， 从而形成诱导成骨制剂。 权利要求书1页 说明书8页 附图2页 CN 106075581 A 2016.11.09 CN 106075581 A 1.一种制备骨诱导成骨制剂的方法， 该方法包括如下步骤： 1.对2份牙基质进行脱钙。
3、处 理； 2.然后再对经过脱钙处理的2份牙基质进行提取骨形态发生蛋白； 3.最后让提取的骨形 态发生蛋白与其中的1份脱钙处理的牙基质进行混合， 从而形成诱导成骨制剂。 2.根据权利要求1所述的方法， 其中， 提取骨形态发生蛋白的方法如下： 让脱钙的牙基 质粉末悬浮在PH7.2的磷酸盐缓冲液中； 在水浴锅内加热处理磷酸盐缓冲液280小时， 温 度为35-40摄氏度， 在加热处理的过程中， 不断的搅拌； 然后进行离心， 分离上清液和沉淀物 质， 对上清液进行常规分子筛分离目的蛋白的纯化和浓缩， 最终获得BMP蛋白活性提取物。 3.根据权利要求1或2所述的方法， 其中， 提取的活性BMP蛋白的分子量。
4、为20-50kda。 4.根据权利要求3所述的方法， 其中， 把提取获得的BMP小分子蛋白与1份通过脱钙和提 取蛋白后的牙基质颗粒剂或者冻干粉进行混合处理， 让BMP小分子和颗粒剂或者冻干粉进 行结合。 5.根据权利要求4所述的方法， 其中， 所述的结合处理的方法如下： 首先让脱钙， 经过蛋 白提取的2份牙基质粉末中的1份悬浮在PH7.0的磷酸盐缓冲液中， 然后把从2份牙基质中 提取的BMP蛋白用磷酸盐缓冲液溶解， 然后两者混合在一起， 放到搅拌机器上进行匀速缓慢 搅拌， 搅拌的速率为20-120转/分钟， 同时在室温下或者25-30摄氏度下进行搅拌12-56小 时， 在搅拌的时候， 每隔3小。
5、时测量一次混合溶液的BMP蛋白的浓度， 直到浓度下降到初始 BMP浓度的1015以下停止搅拌， 然后通过离心， 去掉上清液体， 剩下的粉末进行过滤， 然后经过低温干燥。 6.一种通过权利要求1-5之一制备的骨诱导成骨颗粒剂或者冻干粉制剂， 其中所述的 制剂的颗粒剂或者冻干粉呈圆棒状， 长度约为80180nm， 直径约为30一70nm。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 106075581 A 2 一种制备骨诱导成骨制剂的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种修复骨损伤的制剂， 特别的， 尤其涉及一种一种诱导骨生成， 促进 骨组织形成或者修复骨损伤的制剂以及方法。 背景技术 0002 。
6、骨诱导成骨技术是目前外科整复和牙周重建常用的一种技术， 主要利用骨诱导因 子激活骨增长和生产功能产生新骨。 骨诱导因子较多， 现研究主要集中于骨形态发生蛋白 (bone morphogenetic protein。 BMP)家族蛋白研究， 骨形态发生蛋白属低分子糖蛋白类， 现已发现了骨形态发生蛋白l-14多种蛋白成分， 其中骨形态发生蛋白2的骨诱导活性最强， 其它骨形态发生蛋白成分对骨形态发生蛋白2有协同作用， 共同参与诱导成骨过程。 有学者 认为骨形态发生蛋白是转化生长因子13(TGF一13)超家族的一种， 它具有明显的骨再生和 骨整合能力， 能够诱导软骨和骨形成， 并且能够诱导血管周围的间。
7、充质细胞转化为骨干细 胞， 它与细胞外基质大分子相互作用形成的骨形态发生蛋白是调节骨形成作用的基础。 骨 形态发生蛋白广泛存在于哺乳动物的骨基质和牙基质中， 是一种无种属特异性的， 属局部 生长因子的酸性糖蛋白， 但骨中骨形态发生蛋白随年龄的增大而逐渐减少， 而牙基质中的 骨形态发生蛋白未见减少。 还有研究显示脱钙牙基质(demineralized dental matrix， DDM)中骨形态发生蛋白的粗提物是同质量脱钙骨基质(demineralized bone matrix， DBM) 中的10倍， 相应地脱钙牙基质在肌肉中诱导成骨量应为同质量脱钙骨基质的10倍。 但是， 单 纯的骨形态。
8、发生蛋白在体内扩散太快， 也易被蛋白酶分解， 因而不能在有效的时间内作用 于更多的靶细胞， 其诱导活性难以得到充分的发挥； 骨形态发生蛋白的纯化制取比较困难， 成本较高， 难以在临床广泛推广使用； 有研究发现纯化高的骨形态发生蛋白并不能取得较 高的生物诱导活性， 只有与相应骨基质联合使用， 才能有效诱导成骨， 这是因为胶原和基质 可能影响了羟基磷灰石晶体中的钙和磷酸盐根离子， 有机物也可能扮演了一个结晶化的中 心。 关于骨形态发生蛋白的载体研究虽有许多报道， 如采用羟基磷灰石、 磷酸盐三钙、 聚酯、 胶原、 脱矿骨基质、 氧化钛、 血块等载体， 但是骨形态发生蛋白与载体间的结合方式、 复合方 。
9、法、 复合比例， 仍未有统一的结论。 因此， 当前研究的方向转为复合性骨诱导材料的研制。 0003 研究认为脱钙牙基质(demineralized dentin matrix， DDM)是一种富含骨形态发 生蛋白、 胶原及其它蛋白多糖的复合物， 是一种新型的具有骨诱导作用的人类同源性的生 物活性材料， 它富含多种骨诱导蛋白及其载体的复合物， 形成了一种骨形态发生蛋白的天 然缓慢释放系统。 例如中国发明专利95112416 .1； 或者中国发明专利申请， 申请号 201310602830.7； 申请号201310602878.8中介绍了通过处理牙齿获得这些可以促进骨头伤 口愈合或者再生的材料。 。
10、另外， 也在牙基质中添加一些成分， 进而改进牙基质的效果， 例如 中国发明专利申请， 申请号201510089391.3和申请号201110129457.9中的描述。 0004 当然， 还有采用体外表达BMP蛋白然后和骨骼粉末或者其他粉末混合， 这种方法制 备的修复材料， 实际效果并不理想， 主要是BMP蛋白在体外容易失去活性， 和这些粉末混合 后， 被施加到损伤的骨骼中， 容易被酶降解也失去活性。 因此只有在体内保持BMP的活性， 才 说 明 书 1/8 页 3 CN 106075581 A 3 能更好的达到促进骨组织的生长。 0005 以上描述的方法， 虽然对骨头损伤的修复具有一定的效果，。
11、 但是仍然存在很多固 有的缺陷， 主要体现在以下几点： (1)牙齿作为活性BMP的来源有限， 不能满足日益增长的市 场需要， 毕竟光靠牙基质作为原料， 限制了行业的发展； (2)对牙齿、 骨骼进行粉碎处理后， 通常在酸性溶液进行脱钙， 获得含有活性蛋白BMP的粉末， 但酸碱等处理虽然可以释放钙离 子， 暴露BMP蛋白， 同时也对BMP的蛋白具有极大的损伤， 因为BMP容易在酸性条件下变性而 失去活性； 这样就降低了BMP蛋白的利用效率。 0006 因此， 有必要对现行方法进行改进， 或者采用新的方法获得骨修复材料。 发明内容 0007 一方面， 本发明提供一种制备骨诱导成骨制剂的方法， 该方法。
12、包括如下步骤： 1.对 牙基质进行脱钙处理； 2.然后再向经过脱钙处理的牙基质中添加外源活性蛋白BMP， 即骨形 态发生蛋白， 从而形成诱导成骨制剂。 0008 另一方面， 本发明提供一种制备骨诱导成骨制剂的方法， 该方法包括如下步骤： 1. 对2份牙基质进行脱钙处理； 2.然后再对经过脱钙处理的2份牙基质进行去除骨形态发生蛋 白处理； 3.最后让提取的骨形态发生蛋白与其中的1份脱钙处理的牙基质进行混合， 从而形 成诱导成骨制剂。 0009 另一方面， 本发明提供一种制备骨诱导成骨制剂的方法， 该方法包括如下步骤： 1. 对外源骨基质进行脱钙处理； 2.然后再对经过脱钙处理的骨基质进行去除蛋白。
13、处理； 3.让 外源骨形态发生蛋白与经过步骤2处理的骨基质进行混合， 让外源蛋白与骨基质形成诱导 成骨制剂。 0010 在一些优选的实施方式中， 对一种脱钙人牙齿进行脱钙处理的方法包括如下步 骤： (1)、 用机械方法将牙组织粉碎成颗粒剂或者冻干粉； (2)、 将牙组织颗粒剂或者冻干粉 置于到0.65-0.72当量盐酸液浸泡， 在36摄氏度下浸泡12小时完成脱钙； (3)、 脱钙后产品低 温干燥获得冻干粉末。 0011 优选的， 冻干粉末在摄氏35度3的双氧水中浸泡30分钟即得到脱钙人牙基质。 0012 优选的， 所述的人牙基质冻干粉末或者颗粒， 在摄氏温度5的条件下置于70酒 精液中贮存备用。
14、。 0013 优选的， 脱钙后产品为人牙基质颗粒置于酒精液中贮存备用。 其中， 酒精的浓度为 任意浓度下的酒精溶液， 例如70， 60， 50， 75， 78， 80， 85或者95。 0014 在优选的方式中， 先将牙用50的消毒液(例如含有有效成分1.2的次氯酸钠) 浸泡消毒原料牙， 浸泡消毒时间为45分钟、 温度为摄氏36度； 用机械方法去除牙体上无使用 价值的部分； 用1.2次氯酸钠浸泡消毒粉碎成颗粒剂或者冻干粉的牙组织， 浸泡消毒时间为 45分钟、 温度为摄氏36度。 然后在进行牙齿的粉碎处理。 0015 这里的牙可以是人的牙齿， 也可是任何哺乳动物的牙齿。 优选的为人牙。 0016。
15、 在一些优选的方式中， 对已经经过脱钙处理的牙齿基质添加外源BMP蛋白， 添加外 源蛋白的方法如下： 首先让脱钙的牙基质粉末悬浮在PH6.0-7.5的磷酸盐缓冲液中(100 克配置1升缓冲液)， 然后把外源BMP用相同PH6.0-7.5的磷酸盐缓冲液溶解(浓度为1.0M 每升)， 然后两者混合在一起， 放到搅拌机器上进行匀速缓慢搅拌， 搅拌的速率为12-120转/ 说 明 书 2/8 页 4 CN 106075581 A 4 分钟， 同时在室温下进行搅拌12-24小时， 在搅拌的时候， 每隔3小时测量一次混合溶液中 BMP蛋白的浓度， 直到浓度下降到初始BMP浓度的2035(0.2-0.35M。
16、/L)以下停止搅拌， 然后离心， 去掉上清液体， 剩下的粉末进行过滤， 然后经过低温干燥得到人牙基质， 在摄氏 温度5的条件下置于70酒精液中贮存备用。 0017 在一些优选的方式中， 对2份人牙基质进行脱钙处理， 然后对脱钙处理的基质进行 蛋白的提取， 然后让提取的BMP蛋白与其中的一份人牙基质进行混合处理。 处理方法为： 首 先让经过脱钙， 脱蛋白(BMP活性蛋白和或者其他杂蛋白)提取的牙基质粉末悬浮在PH7.0 的磷酸盐缓冲液中(120克配置1升缓冲液)， 然后把外源BMP(从2份基质中提取的BMP蛋白) 用磷酸盐缓冲液(PH7.0)溶解， 然后两者混合在一起， 放到搅拌机器上进行匀速缓。
17、慢搅 拌， 搅拌的速率为为15-120转/分钟， 同时在室温下进行搅拌12-24小时， 在搅拌的时候， 每 隔3小时测量一次混合溶液的BMP蛋白的浓度， 直到浓度下降到初始BMP浓度的2035 以下停止搅拌， 然后离心， 去掉上清液体， 剩下的粉末进行过滤， 然后低温干燥得到人牙基 质。 优选的， 在摄氏温度5的条件下置于酒精液中贮存备用. 0018 在一些优选的方式中， 对新鲜的外源骨骼(人骨或者哺乳动物的骨头)(这里的人 骨主要是医生从患者身体上取下的人体骨骼或者捐献的新鲜的人体骨骼)进行脱钙处理， 脱钙处理的方法如下： 用机械方法将骨骼组织粉碎成颗粒剂或者冻干粉； (2)、 将骨骼制成 。
18、的颗粒剂或者冻干粉置于到0.65-0.72当量的盐酸液中浸泡， 在36摄氏度下浸泡24-48小时 完成脱钙； (3)脱钙后产品低温干燥获得脱钙的骨骼粉末或者颗粒。 再用35摄氏度3的双 氧水浸泡30分钟即得到脱钙基质； 或者， 所述的基质， 在摄氏温度5的条件下置于酒精液 中贮存备用。 优选的， 脱钙后产品为人牙基质颗粒置于酒精液中贮存备用。 其中， 酒精的浓 度为任意浓度下的酒精溶液， 例如70， 60， 50， 75， 78， 80， 85或者95。 0019 然后对脱钙的骨骼粉末进行脱蛋白的处理， 脱蛋白的处理过程如下： 脱钙后的骨 骼粉末加适量水， 在水浴锅内加热处理56-72小时， 。
19、温度为35-40摄氏度， 然后进行离心， 去 掉上清液体， 对上清液体进行BMP蛋白的提取、 浓缩和杂蛋白的去除。 或者， 骨骼粉末加入胰 酶或者木瓜酶缓冲溶液中， 在温度为37-40摄氏度下处理3-4天以上， 然后进行离心去上清 液体， 从而通过酶处理让蛋白分解， 保留离心后的沉淀， 从而提供脱蛋白的骨骼粉末。 0020 优选的， 让脱钙和脱蛋白处理的骨骼粉末与外源BMP蛋白混合处理， 处理的步骤如 下： 首先让脱钙后经过BMP蛋白提取的骨骼粉末悬浮在PH7.0的磷酸盐缓冲液中(120克每 升， 然后把外源BMP用磷酸盐缓冲液溶解(1.2M每升)， 然后两者混合在一起， 放到搅拌机器 上进行。
20、匀速缓慢搅拌， 搅拌的速率为为30-80转/分钟， 同时在室温下或者25-30摄氏度下进 行搅拌12-24小时， 在搅拌的时候， 每隔3小时测量一次混合溶液的B MP蛋白的浓度， 直到浓 度下降到初始BMP浓度的2025(0.24-0.25M/L)以下停止搅拌， 然后通过离心， 去掉上 清液体， 剩下的粉末进行过滤， 然后经过低温干燥得到基质。 优选的， 在摄氏温度5的条件 下置于70酒精液中贮存备用。 0021 优选的， 外源BMP蛋白为BMP-2、 BMP-4和BMP-7(上海麦仓生物技术有限公司)。 优选 的， 外源BMP蛋白为BMP-2。 或者， 优选的， 其中， 所述的外源BMP蛋白。
21、为BMP-2、 BMP-1、 BMP- 3BMP-4、 BMP-5、 BMP-6或BMP-7中的一种或者几种。 这些商用的BMP活性蛋白都可以通过商用 的途径购买得到。 0022 这里的粉末或者制剂都为冻干粉末或者其它形式的制剂。 这里的制剂与试剂、 成 说 明 书 3/8 页 5 CN 106075581 A 5 分或者物质为等同的意思。 0023 有益效果 0024 经过本发明提供的促进骨骼组织生长或者修复的制剂和常规人牙基质的效果相 当， 有的还好于现有的人牙基质， 从而提供一些可以替代的产品， 降低产品的成本， 满足日 益增长的市场需要。 附图说明 0025 图1为实施例子1-3和对照。
22、CK对成骨细胞增殖的影响比较结果图。 0026 图2为实施例子1,4,5和对照CK对成骨细胞增殖的影响比较结果图。 0027 图3为实施例子1-3和对照CK对MC-3T3细胞ALP活性影响比较试验结果图。 0028 图4为实施例子1， 4和5与对照CK对MC-3T3细胞ALP活性影响比较试验结果图。 具体实施方式 0029 实施例子1： 人牙基质进行脱钙处理添加外源BMP蛋白。 0030 1.人牙基质进行脱钙处理的步骤如下： 0031 (1)、 将收集的人牙置于清水容器内， 在5摄氏度以下条件储存； 0032 (2)、 用1.2次氯酸钠浸泡消毒原料牙， 时间为55分钟、 温度为30摄氏度(或者。
23、其 它问题， 例如35、 30、 ,38、 40摄氏度)； 0033 (3)、 去除牙体上无使用价值的部分； 0034 (4)、 用机械方法将牙组织粉碎成颗粒剂或者冻干粉， 平均粒径为0.25毫米(例如 可以为0.2、 0.5、 0.6、 0.7、 0.8、 1.0、 1.2毫米)； 0035 (5)、 再用1.2次氯酸钠浸泡消毒粉碎成颗粒剂或者冻干粉的牙组织， 浸泡消毒 时间为45分钟， 温度为摄氏35-40度； 0036 (6)、 将牙组织颗粒剂或者冻干粉置于到0.65(或者0.67、 0.68、 0.67、 0.72)当量盐 酸液浸泡， 在38摄氏度下浸泡16小时完成脱钙； 0037 (。
24、7)、 低温干燥， 再用35摄氏度3的双氧水浸泡30分钟。 经过检测， 经过该方法脱 钙处理的牙基质颗粒剂或者冻干粉细小均匀， 形态一致， 呈圆棒状， 长度约为100-200nm， 直 径约为50-lOOnm。 0038 2， 外源BMP蛋白的添加。 0039 a、 对步骤(7)已经经过脱钙牙基质处理的牙齿基质1000克添加外源BMP蛋白， 添加 外源蛋白的方法如下： 0040 b、 首先把步骤(7)处理的脱钙牙基质除去双氧水， 用灭菌水冲洗多次直至无双氧 水存在； 获得100克的人牙基质粉末； 0041 c、 然后让脱钙的牙基质粉末悬浮在1升PH7.2的磷酸盐缓冲液中； 0042 d、 把外。
25、源BMP-2(1.0克， 购买自上海麦仓生物技术有限公司)用相同体积的PH 7.2的磷酸盐缓冲液溶解， 然后两者混合在一起， 放到搅拌机器上进行匀速缓慢搅拌， 搅拌 的速率为30-80转/分钟进行搅拌， 同时处于变温的水浴锅内， 温度顺次如下： 26摄氏度， 8小 时； 30摄氏度； 6小时； 28摄氏度； 8小时， 28摄氏度， 12小时； 然后保持在恒温30摄氏度下进行 继续搅拌， 每隔3小时测量一次混合溶液中BMP-2蛋白的浓度， 直到浓度下降到初始BMP-2浓 说 明 书 4/8 页 6 CN 106075581 A 6 度的2025以下停止搅拌， 然后通过离心， 去掉上清液体， 剩下。
26、的粉末进行过滤， 然后 经过低温干燥得到人牙基质冻干粉末。 经过检测， 经过该方法脱钙处理的牙基质颗粒剂或 者冻干粉细小均匀， 形态一致， 呈圆棒状， 长度约为100220nm， 直径约为40一11Onm。 0043 实施例子2： 人牙基质进行脱钙处理添加外源BMP蛋白。 0044 与实施例子1不同之处在于， 外源蛋白为BMP-7， 其它条件都一样。 0045 实施例子3： 人牙基质进行脱钙处理添加外源BMP蛋白。 0046 与实施例子1不同之处在于， 同时处于恒温的水浴锅内， 温度为15、 20、 35、 38摄氏 度， 时间为34小时以上， 每隔3小时测量一次混合溶液中BMP-2蛋白的浓度。
27、， 直到浓度下降到 初始BMP-2浓度的2025以下停止搅拌， 然后通过离心， 去掉上清液体， 剩下的粉末进 行过滤， 然后经过低温干燥得到人牙基质， 在摄氏温度5的条件下置于70酒精液中贮存 备用。 经过检测， 经过该方法脱钙处理的牙基质颗粒剂或者冻干粉细小均匀， 形态一致， 呈 圆棒状， 长度约为100220nm， 直径约为40一11Onm。 0047 实施例子4： 2份人牙基质进行脱钙和脱蛋白(BMP)处理， 处理把提取的BMP蛋蛋白 和一份经过脱钙脱蛋白处理的人牙基质粉末混合。 0048 1.人牙基质进行脱钙处理的步骤如下： 0049 (1)、 将收集的人牙置于清水容器内， 在5摄氏度。
28、以下条件储存； 0050 (2)、 用1.2次氯酸钠浸泡消毒原料牙， 时间为55分钟、 温度为摄氏30度(或者其 它问题， 例如35、 30、 38、 40摄氏度)； 0051 (3)、 去除牙体上无使用价值的部分； 0052 (4)、 用机械方法将牙组织粉碎成颗粒剂或者冻干粉， 平均粒径为0.25毫米(例如 可以为0.2、 0.5、 0.6、 0.7、 0.8、 1.0、 1.2毫米)； 0053 (5)、 再用1.0次氯酸钠浸泡消毒粉碎成颗粒剂或者冻干粉的牙组织， 浸泡消毒 时间为45分钟， 温度为摄氏35-40度； 0054 (6)、 将牙组织颗粒剂或者冻干粉置于到0.65(或者0.67。
29、、 0.68、 0.67、 0.72)当量盐 酸液浸泡， 在38摄氏度下浸泡20小时完成脱钙； 0055 (7)、 低温干燥， 再用35摄氏度3的双氧水浸泡30分钟。 0056 2.进行BMP蛋白的提取处理。 0057 对步骤(7)已经经过脱钙牙基质处理的牙齿基质1000克粉末进行提取蛋白的处 理， 提取BMP的蛋白的方法如下： 0058 a、 首先把步骤(7)处理的脱钙牙基质除去双氧水， 用灭菌水冲洗多次直至无双氧 水存在； 获得1000克的人牙基质粉末； 0059 b、 然后让脱钙的牙基质粉末1000克悬浮在5升PH7.2的磷酸盐缓冲液中； 0060 c、 在水浴锅内加热处理b步骤的磷酸盐。
30、缓冲液280小时， 温度为40摄氏度， 在加热 处理的过程中， 不断的搅拌； 然后进行离心， 分离上清液和沉淀物质， 对上清液用分子筛分 离目的蛋白的纯化和浓缩， 最终获得BMP蛋白活性提取物， 经过测定， 其分子量为BMP的分子 量为20-50kda。 对沉淀粉末进行过滤， 干燥， 回收， 获得980克经过脱蛋白处理的牙基质粉 末。 0061 d、 让脱钙和脱蛋白处理的牙基质粉末与提取的BMP蛋白混合处理， 处理的步骤如 下： 首先让脱钙后经过BMP蛋白提取的牙基质粉末悬浮在PH7.0的磷酸盐缓冲液中(100克 说 明 书 5/8 页 7 CN 106075581 A 7 每升， 配置5升溶。
31、液， 合计500克)然后把从1000克人牙基质中提取的BMP蛋白(步骤c)用磷酸 盐缓冲液溶解， 然后两者混合在一起， 放到搅拌机器上进行匀速缓慢搅拌， 搅拌的速率为为 30-80转/分钟， 同时在室温下或者25-30摄氏度下进行搅拌12-24小时， 在搅拌的时候， 每隔 3小时测量一次混合溶液的BMP蛋白的浓度， 直到浓度下降到初始BMP浓度的1015以 下停止搅拌， 然后通过离心， 去掉上清液体， 剩下的粉末进行过滤， 然后经过低温干燥得到 基质， 在摄氏温度5的条件下置于70酒精液中贮存备用。 0062 经过检测， 经过该方法脱钙处理的牙基质颗粒剂或者冻干粉细小均匀， 形态一致， 呈圆棒。
32、状， 长度约为80180nm， 直径约为30一7Onm。 0063 实施例子5： 外源人骨进行脱钙、 脱蛋白处理， 然后添加外源BMP蛋白。 0064 1.人骨进行脱钙处理的步骤如下： 0065 (1)、 将收集的人骨放入清水容器内， 在5摄氏度以下条件储存； 0066 (2)、 用2.0次氯酸钠浸泡消毒原料骨骼， 时间为55分钟、 温度为37摄氏度(或者 其它温度， 例如35、 30、 38、 40摄氏度)； 0067 (3)、 去除骨骼上无使用价值的部分； 0068 (4)、 用机械方法将骨骼组织粉碎成颗粒剂， 平均粒径为0.25毫米(例如可以为 0.2、 0.5、 0.6、 0.7、 0。
33、.8、 1.0、 1.2毫米， 或者其他粒径的纳米颗粒， 例如50-100,120-200纳米 的颗粒)； 0069 (5)、 再用1.5次氯酸钠浸泡消毒粉碎成颗粒剂， 浸泡消毒时间为45分钟、 温度为 35-40摄氏度； 0070 (6)、 将骨骼组织颗粒剂或置于0.65(或者0.67、 0.68、 0.67、 0.72)当量的盐酸液中 浸泡， 在38摄氏度下浸泡16小时完成脱钙； 0071 (7)、 低温干燥获得冻干粉末或者颗粒， 再用35摄氏度3的双氧水浸泡30分钟。 0072 经过检测， 该方法脱钙处理后的骨骼质颗粒剂或者冻干粉细小均匀， 形态一致， 呈 圆棒状， 长度约为120240。
34、nm， 直径约为60一120nm。 0073 2.进行BMP蛋白的降解处理。 0074 对步骤(7)中已经经过脱钙骨骼处理后的骨骼基质1000克粉末提取蛋白的处理方 法如下： 0075 a、 首先除去步骤(7)脱钙处理骨骼基质中的双氧水， 用灭菌水冲洗多次直至无双 氧水存在； 获得1000克的骨骼基质粉末； 然后让1000克脱钙的骨骼粉末悬浮在2升PH7.2 的磷酸盐缓冲液中； 0076 b、 为使酶解反应达到理想的程度， 并结合生产投入成本， 在实验中选用胰酶， 酶解 锅内温度调至48-50， pH值调至8.5时加入胰酶O.35g； 酶的反应时间均为12-56小时， 进行 蛋白降解处理； 处。
35、理结束后， 进行离心分离上清液和沉淀， 去除上清液， 保留沉淀， 并进行干 燥， 获得900克脱钙脱蛋白的骨骼粉末。 0077 c、 然后让脱钙脱蛋白的骨骼粉末1000克悬浮在5升PH7.2的磷酸盐缓冲液中； 0078 d、 把外源BMP-2(1.0克， 购买自上海麦仓生物技术有限公司)用相同体积的PH 7.2的磷酸盐缓冲液溶解， 然后两者混合在一起， 放到搅拌机器上进行匀速缓慢搅拌， 搅拌 的速率为30-80转/分钟进行搅拌， 同时处于变温的水浴锅内， 温度顺次如下： 26摄氏度， 8小 时； 30摄氏度； 6小时； 28摄氏度； 8小时， 28摄氏度， 12小时； 然后保持在恒温30摄氏度。
36、下进行 说 明 书 6/8 页 8 CN 106075581 A 8 继续搅拌， 每隔3小时测量一次混合溶液中BMP-2蛋白的浓度， 直到浓度下降到初始BMP-2浓 度的56以下停止搅拌， 然后离心， 去掉上清液体， 剩下的粉末进行过滤， 然后经过低 温干燥得到骨骼基质， 在摄氏温度5的条件下置于70酒精液中贮存备用。 0079 经过检测， 经过该方法脱钙处理的骨骼基质颗粒剂或者冻干粉细小均匀， 形态一 致， 呈圆棒状， 长度约为122240nm， 直径约为60一110nm。 0080 实施例子6： 骨诱导成骨制剂的效果验证 0081 1.材料和方法 0082 1.1实验仪器 0083 酶标板。
37、(24孔， 96孔)， 酶标仪(Model 550)， 电动离心机(80-2型)， 细胞培养箱 (Heraeus BB6220型)， 双向磁力加热搅拌器(江苏省金坛市医疗仪器厂)， 酸度计(上海精密 科学仪器有限公司)， 恒温水浴锅(江苏省金坛市医疗仪器厂)， 医用超净工作台(苏州净化 设备厂。 0084 1.2实验材料 0085 来源于本发明的实施例子1-5的材料和深圳市光明创博生物制品发展有限公司的 商用牙基质进行平行对照(CK)处理实验， 类标准胎牛血清(杭州四季青)， DMEM培养基 (Sigma)， 0.25胰蛋白酶(Sigma)， Tritonx-100(上海生工)， ALP标准制。
38、剂盒(上海生工)。 0086 2实验方法 0087 2.1 MC-3T3成骨细胞培养： 0088 MC-3T3成骨细胞常规复苏于含10胎牛血清的培养基， 在50ml/L CO2、 饱和湿度、 37环境下培养， 24h后换液， 生长至80后， 2.5/L胰蛋白酶消化后， 转代， 以3-4代细胞做 实验 0089 2.2 MC-3T3成骨细胞增殖研究 0090 实验前将本发明的实施例子1-5的基质粉末和深圳市光明创博生物制品发展有限 公司的商用牙基质粉末称取0.1克加入24孔板， 每种样品平均3孔， 紫外线照射30分钟灭菌。 将对数生长期的细胞消化制成细胞悬浮液， 调整浓度， 使接种密度为1104。
39、/ml， 加入24孔 板， 每孔1ml， 在50ml/L CO2： 饱和湿度、 37环境下培养2、 4、 6d后， 于各培养板依次选定4 孔， 加入MTT液160ul(微升)， 继续培养4h， 弃去培养液， 加入DMSO1.2ml， 振荡10min， 将200 l (微升)置于96孔板中， 每样平均三孔， 以酶联免疫检测仪在490nm波长测定吸光度A值， 采用 MTT法细胞计数标准曲线估算细胞密度。 通过SPSS统计软件的单因变量多因素方差分析对 以上实验结果进行分析。 0091 结果如下: 0092 不同处理的MTT测试结果见图1-2。 随着培养时间的延长， 各组细胞数量均有所增 加。 本发。
40、明的实施方式1、 3、 4、 5的材料接种组细胞增殖数明显高于对照组CK， 经统计学分 析， 实施方式1、 3、 4、 5的材料与对照CK之间有统计学意义(PO.05)(图1和图2)。 这样进一步 说明本发明获得的成骨基质相比现有技术中的商用基质具有更高的活性。 具有极大的应用 前景。 0093 2.3 MC-3T3细胞ALP活性测定 0094 细胞接种方法同上， 培养2， 4， 6d后， 弃去培养液， PBS(0.01mol/L)冲洗3次， 加入 2ml/L Triton X 800 l(微升)， 4冰箱过夜， 再加入300微升ALP底物， 37保持40min， 说 明 书 7/8 页 9 。
41、CN 106075581 A 9 以0.1mol/L KOH中止反应， 将200 l(微升)移入96孔板， 每样平均三孔， 以酶联免疫检测仪 在410纳米处测定吸光度A值， 即代表细胞碱性磷酸酶活性。 为排除增殖率不同对碱性磷酸 酶活性的影响， 进行如下修正： 成骨细胞平均碱性磷酸酶活性测得吸光度A值/同期成骨 细胞增殖率。 通过SPSS统计软件的单因变量多因素方差分析对以上实验结果进行分析。 0095 结果如下： 0096 见图3、 4。 从图3可以看出， 本发明的实施例子1和3获得的牙基质的活性明显高于 现有技术中牙基质的活性。 另外， 也进一步证实了BMP-2蛋白为主要的活性蛋白， 对于。
42、骨骼 修复或增长具有重要的作用。 随培养时间延长， 各组细胞碱性磷酸酶活性都有所增加， 实施 例子1和3的碱性磷酸酶活性高于对照组， 经统计学分析， 实施例子1与对照CK， 实施例子3、 4 和5分别与对照CK两组之间有统计学意义(P0.05)， 呈显著性差异。 这样进一步说明本发明 获得的成骨基质相比现有技术中的商用基质具有更高的活性。 0097 另外， 通过我们另外的实验证明(采用的方法如实施例子1中添加外源蛋白和实施 例子5中添加的外源蛋白)， 在所有外源BMP蛋白中， 例如， 外源BMP蛋白为BMP-2、 BMP-1、 BMP- 3、 BMP-4、 BMP-5、 BMP-6或BMP-7。
43、中的一种或者几种， 单独采用一种外源蛋白的时候， 外源蛋 白BMP-2， BMP-3和BMP-7的效果要好于其它的蛋白。 0098 另外， ,我们对实施例子1、 3、 4、 5获得的基质颗粒或者干粉和深圳市光明创博生物 制品发展有限公司的商用牙基质进行平行对照(CK)处理实验， 考察对于老年性骨折、 二次 骨折以及三期， 四期股骨头坏死骨的修复效果。 结果发现， 相对于现有的商业销售的牙基质 材料(成骨颗粒或者制剂)， 本发明的实施例子1、 3、 4、 5获得的基质颗粒或者干粉的疗效明 显好于目前商用的牙基质材料， 特别是实施例子1、 3、 4获得的牙基质的材料的疗效最好， 特 别是实施例子1。
44、和4效果更好。 这可能是因为， 现有牙基质材料是直接经过脱钙处理的， 其中 含有的活性蛋白本来就比较少， 而且在酸性脱钙处理过程中， 可能对活性BMP蛋白造成大量 的变性损害， 从而效果不是很理想， 而且脱钙处理具有较大的随意性， 产品的性能具有很大 的批间差异。 而本发明通过简单的处理， 可以明显提高疗效； 另外， 从2014年1月-2016年1月 在常温下保存， 进行活性实验的结果表明， 常温保藏下2年左右， 活性虽然有所稍微降低(大 约降低了5-10左右)(具体实验过程和具体数据略)， 但是仍然保持较高的活性， 储存2年 后， 活性几乎是目前商用产品活性2-4倍。 这为大量进行标准化商业化生产， 效果更为显著 的诱导成骨产品提供了一个新的途径。 说 明 书 8/8 页 10 CN 106075581 A 10 图1 图2 说 明 书 附 图 1/2 页 11 CN 106075581 A 11 图3 图4 说 明 书 附 图 2/2 页 12 CN 106075581 A 12 。