技术领域
本发明属于医学皮肤组织工程技术领域，具体涉及一种异种高性能脱细胞真皮基质敷料的制备方法。
技术背景
皮肤是人体最大的器官，也是人体与外界环境设置的第一道防线，其对保护机体内环境的稳定，抵御外界环境的刺激和病原菌入侵起到重要的作用。由于各种原因常常容易导致皮肤缺损，如烧伤、烫伤以及外界各种不可抗力等因素等。而随着社会的发展及人口老龄化程度的加剧，越来越多的人正遭受着由褥创、糖尿病足、血运障碍性溃疡等难愈合创面带来的痛苦。据统计，我国每年烧伤与溃疡患者达1500万，其中需要进行皮肤移植的有350万之多。然而，在临床中，经常面临没有完整或足够的自身皮肤来移植的困境。所以，研究者一直在寻找人体皮肤的替代品。
脱细胞真皮基质是一种无细胞成分、免疫活性低、且保留了表皮和真皮间基底膜的材料，可由动物皮肤加工制得，用于移植后可形成真皮面和基底膜面，因而具有广阔的市场应用前景。但由于现有制备技术难以做到既彻底去除脱细胞免疫成分使其免疫原性最低，又完整保留细胞外基质，同时提高其渗透性。因此，突破传统技术的瓶颈，制造出功能多样、结构完整的脱细胞真皮基质是这一产品推广应用急需解决的技术问题。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有脱细胞真皮基质，尤其对于异种脱细胞真皮基质在临床使用过程中表现出的不足，提供一种异种高性能脱细胞真皮基质敷料的制备方法。本发明采用的技术方案是：
一种异种高性能脱细胞真皮基质敷料的制备方法，具体包括以下步骤：
S1. 取皮：选取健康新鲜的哺乳动物皮肤为皮源，对取皮区进行脱毛、消毒，用取皮刀切取带有表皮层和真皮层的断层皮片，裁成所需尺寸，用质量浓度0.1%的苯扎氯铵溶液浸泡20～40min，消毒杀菌；
S2. 脱脂：用取皮鼓去除脂肪，切取一定厚度的真皮层浸泡于质量浓度0.1~1%的乳酸中，使其接近先皮状态，取出后低温干燥；
S3. 角蛋白酶处理：将S2所得脱脂后的皮片置于角蛋白酶溶液中反应30~60min，其中角蛋白酶溶液与皮片的质量比为2~5，溶液pH保持在9~11之间，角蛋白酶的质量浓度0.1~0.5%，溶液中SDS的质量浓度0.3~0.6%；
S4. 脱细胞：将角蛋白酶处理后的皮片放入液氮中浸泡5~10min，取出后自然复温，然后于微波炉中在解冻状态下微波处理3~10min，然后放入质量浓度3%的高渗氯化钠溶液中浸泡10~30min，再经数控超声清洗器以阴阳离子洗脱液浸泡，超声振荡洗涤36~72h，并于每6h更换一次洗脱液，之后再用蒸馏水在超声振荡下清洗12~24h，每4h更换一次蒸馏水，再经低温干燥即制得异种脱细胞真皮基质。
S5. 取上述2~10g异种脱细胞真皮基质置于100mL蒸馏水中，溶胀30~60min，然后滴加0.001~0.002mol/L的硝酸铈溶液，充分搅拌，形成均匀混合液；
S6. 向上述混合液中加入总质量为0.04~2g、由海藻酸丙二醇酯和多胺化合物形成的混合物，在37℃下振荡反应12~24h，得到经改性的异种脱细胞真皮基质；
S7. 取出经改性的异种脱细胞真皮基质，冷冻干燥，然后按要求的规格尺寸进行分切、包装、灭菌，即得成品。
优选地，所述步骤S6的混合物海藻酸丙二醇酯和多胺化合物的摩尔比为（0.8～1.2）：1。
优选地，所述的述多胺化合物为乙二胺、丙二胺、己二胺、二乙烯三胺、三乙烯四胺中的一种。
本发明产品的有益效果为：（1）采用冻融结合微波对细胞的破碎彻底去除真皮细胞。以猪体躯干部位皮肤为原材料，在脱脂后采用低温冻融、微波解冻、阴阳离子清洗液洗脱的方法，使细胞在微波破碎之后，其碎片易与含丰富清水基团的阴阳离子结合，细胞碎片洗脱彻底。（2）高渗透性脱细胞真皮基质的制备技术。选择特殊的化学脱脂方法，将碱与表面活性剂SDS相结合，充分去除脂肪，同时结合后续的微波处理工艺，使真皮基质中胶原纤维束被分散成许多细小的纤维，其空间排列更疏松，纤维束之间产生较大的孔隙，从而提高脱细胞真皮基质的渗透性。（3）引入功能基团对脱细胞真皮基质进行改性。采用特殊的混合物海藻酸丙二醇酯和多胺化合物改性脱细胞猪真皮基质，引入了具有一定吸湿性和抗菌功能的季铵基团，从而赋予脱细胞真皮基质敷料较好的亲水性和抗菌性能。
附图说明
图1为本发明实施例5中电子显微镜观察到的实验组的三维结构与微观形貌；
图2为本发明实施例5中电子显微镜观察到的对照组的三维结构与微观形貌；
图3为本发明实施例6中空白样0h接触细菌生长图；
图4为本发明实施例6中空白样18h接触细菌生长图；
图5为本发明实施例6中实验组0h接触细菌生长图；
图6为本发明实施例6中实验组18h接触细菌生长图；
图7为本发明实施例6中对照组0h接触细菌生长图；
图8为本发明实施例6中对照组18h接触细菌生长图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步的说明。
实施例1
一种异种高性能脱细胞真皮基质敷料的制备方法，其制备过程如下：
（1）取2g异种脱细胞真皮基质置于100mL蒸馏水中，溶胀30min，然后滴加0.001mol/L的硝酸铈溶液，充分搅拌，形成均匀混合液；
（2）向上述混合液中加入总质量为2g、由海藻酸丙二醇酯和乙二胺形成的混合物（二者的摩尔比为4：5），在37℃下振荡反应12h，得到经改性的高性能脱细胞真皮基质；
（3）取出皮片基质，冷冻干燥，然后按要求的规格尺寸进行分切、包装、灭菌，即得高性能脱细胞真皮基质敷料。
上述步骤中，所述的异种脱细胞真皮基质，其制备工艺过程如下：
（1）取皮：选取健康新鲜的猪皮肤为皮源，对取皮区进行脱毛、消毒，用取皮刀切取带有表皮层和真皮层的断层皮片，裁成所需尺寸，用1‰的苯扎氯铵溶液浸泡20min，消毒杀菌；
（2）脱脂：用取皮鼓去除脂肪，切取一定厚度的真皮层浸泡于0.1%的乳酸中，使其接近先皮状态，取出后低温干燥；
（3）角蛋白酶处理：脱脂后的皮样置于角蛋白酶溶液中反应60min，其中液比（用水量与皮样的质量比值）为2，溶液pH保持在9~11之间，角蛋白酶的质量浓度0.1%，溶液中SDS的质量浓度0.4%；
（4）脱细胞：将角蛋白酶处理后的皮片放入液氮中浸泡5min，取出后自然复温，然后于微波炉中在解冻状态下微波处理3min，然后放入3%的高渗氯化钠溶液中浸泡15min，再经数控超声清洗器以阴阳离子洗脱液浸泡，超声振荡洗涤36h，并于每6h更换一次洗脱液，之后再用蒸馏水在超声振荡下清洗洗脱液12h，每4h更换一次蒸馏水，再经低温干燥即制得脱细胞真皮基质材料。
实施例2
（1）取10g异种脱细胞真皮基质置于100mL蒸馏水中，溶胀60min，然后滴加0.002mol/L的硝酸铈溶液，充分搅拌，形成均匀混合液；
（2）向上述混合液中加入总质量为0.04g、由海藻酸丙二醇酯和丙二胺形成的混合物（二者的摩尔比为6：5），在37℃下振荡反应24h，得到经改性的高性能脱细胞真皮基质；
（3）取出皮片基质，冷冻干燥，然后按要求的规格尺寸进行分切、包装、灭菌，即得高性能脱细胞真皮基质敷料。
上述步骤中，所述的异种脱细胞真皮基质，其制备工艺过程如下：
（1）取皮：选取健康新鲜的牛皮肤为皮源，对取皮区进行脱毛、消毒，用取皮刀切取带有表皮层和真皮层的断层皮片，裁成所需尺寸，用1‰的苯扎氯铵溶液浸泡40min，消毒杀菌；
（2）脱脂：用取皮鼓去除脂肪，切取一定厚度的真皮层浸泡于1%的乳酸中，使其接近先皮状态，取出后低温干燥；
（3）角蛋白酶处理：脱脂后的皮样置于角蛋白酶溶液中反应40min，其中液比（用水量与皮样的质量比值）为4，溶液pH保持在9~11之间，角蛋白酶的质量浓度0.5%，溶液中SDS的质量浓度0.3%；
（4）脱细胞：将角蛋白酶处理后的皮片放入液氮中浸泡10min，取出后自然复温，然后于微波炉中在解冻状态下微波处理10min，然后放入3%的高渗氯化钠溶液中浸泡30min，再经数控超声清洗器以阴阳离子洗脱液浸泡，超声振荡洗涤48h，并于每6h更换一次洗脱液，之后再用蒸馏水在超声振荡下清洗洗脱液18h，每4h更换一次蒸馏水，再经低温干燥即制得脱细胞真皮基质材料。
实施例3
（1）取5g异种脱细胞真皮基质置于100mL蒸馏水中，溶胀40min，然后滴加0.002mol/L的硝酸铈溶液，充分搅拌，形成均匀混合液；
（2）向上述混合液中加入总质量为1g、由海藻酸丙二醇酯和已二胺形成的混合物（二者的摩尔比为1：1），在37℃下振荡反应18h，得到经改性的高性能脱细胞真皮基质；
（3）取出皮片基质，冷冻干燥，然后按要求的规格尺寸进行分切、包装、灭菌，即得高性能脱细胞真皮基质敷料。
上述步骤中，所述的异种脱细胞真皮基质，其制备工艺过程如下：
（1）取皮：选取健康新鲜的羊皮肤为皮源，对取皮区进行脱毛、消毒，用取皮刀切取带有表皮层和真皮层的断层皮片，裁成所需尺寸，用1‰的苯扎氯铵溶液浸泡30min，消毒杀菌；
（2）脱脂：用取皮鼓去除脂肪，切取一定厚度的真皮层浸泡于0.5%的乳酸中，使其接近先皮状态，取出后低温干燥；
（3）角蛋白酶处理：脱脂后的皮样置于角蛋白酶溶液中反应45min，其中液比（用水量与皮样的质量比值）为3，溶液pH保持在9~11之间，角蛋白酶的质量浓度0.4%，溶液中SDS的质量浓度0.5%；
（4）脱细胞：将角蛋白酶处理后的皮片放入液氮中浸泡8min，取出后自然复温，然后于微波炉中在解冻状态下微波处理6min，然后放入3%的高渗氯化钠溶液中浸泡10min，再经数控超声清洗器以阴阳离子洗脱液浸泡，超声振荡洗涤60h，并于每6h更换一次洗脱液，之后再用蒸馏水在超声振荡下清洗洗脱液24h，每4h更换一次蒸馏水，再经低温干燥即制得脱细胞真皮基质材料。
实施例4
（1）取8g异种脱细胞真皮基质置于100mL蒸馏水中，溶胀50min，然后滴加0.002mol/L的硝酸铈溶液，充分搅拌，形成均匀混合液；
（2）向上述混合液中加入总质量为0.5g、由海藻酸丙二醇酯和三乙烯三胺形成的混合物（二者的摩尔比为9：10），在37℃下振荡反应20h，得到经改性的高性能脱细胞真皮基质；
（3）取出皮片基质，冷冻干燥，然后按要求的规格尺寸进行分切、包装、灭菌，即得高性能脱细胞真皮基质敷料。
上述步骤中，所述的异种脱细胞真皮基质，其制备工艺过程如下：
（1）取皮：选取健康新鲜的猪皮肤为皮源，对取皮区进行脱毛、消毒，用取皮刀切取带有表皮层和真皮层的断层皮片，裁成所需尺寸，用1‰的苯扎氯铵溶液浸泡35min，消毒杀菌；
（2）脱脂：用取皮鼓去除脂肪，切取一定厚度的真皮层浸泡于0.8%的乳酸中，使其接近先皮状态，取出后低温干燥；
（3）角蛋白酶处理：脱脂后的皮样置于角蛋白酶溶液中反应30min，其中液比（用水量与皮样的质量比值）为5，溶液pH保持在9~11之间，角蛋白酶的质量浓度0.2%，溶液中SDS的质量浓度0.6%；
（4）脱细胞：将角蛋白酶处理后的皮片放入液氮中浸泡9min，取出后自然复温，然后于微波炉中在解冻状态下微波处理8min，然后放入3%的高渗氯化钠溶液中浸泡20min，再经数控超声清洗器以阴阳离子洗脱液浸泡，超声振荡洗涤72h，并于每6h更换一次洗脱液，之后再用蒸馏水在超声振荡下清洗洗脱液20h，每4h更换一次蒸馏水，再经低温干燥即制得脱细胞真皮基质材料。
实施例5 异种高性能脱细胞真皮基质敷料的理化指标和微观情况
选取实施例2制得的产品作为实验组与市面产品作为对照组进行以下测试：
（1）氨基酸分析：取约50mgADM，剪碎后浸于6mol/LHCl溶液中，110℃下水解24h，氨基酸自动分析仪测定羟脯氨酸(HYP)的含量。HYP是胶原蛋白的特异性氨基酸且含量稳定，约占胶原蛋白中氨基酸总量的10%，用以计算胶原蛋白量。
（2）材料孔隙率测试：取制备得到的脱细胞真皮基质，切成1cm×1cm的小块，置于一定体积（V1）乙醇中，循环抽真空至无气泡逸出，材料和乙醇总体积记为V2，将含乙醇的材料移出后剩余乙醇体积记为V3，按以下公式计算孔隙率：[(V1－V3)/(V2－V3)]×100%。
（3）扫描电子显微镜(SEM)观察：将冷冻干燥的ADM剪成3mm×3mm的小片，在压强8.2Pa、电流30mA真空环境中喷金镀膜40s，SEM观察其三维结构与细微形貌。
测试结果如下：
表1 异种脱细胞真皮基质的氨基酸分析
平行次数 1 2 3 4 平均值 对照组 每100gADM中HYP含量(mg) 9561.27 9612.56 9490.38 9590.76 9563.74 8211.43
表2 脱细胞真皮基质敷料的孔隙率
从图1~2及以上的测试结果分析可知，本发明所制务的异种脱细胞真皮基质胶原蛋白含量（氨基酸含量）、孔隙率等方面明显优于对照组，且从扫描电镜中可进一步观察到本发明的孔隙率有实质性的提升。
实施例6 抗菌性测试
实验组：以实施例2制备的异种高性能脱细胞真皮基质敷料为实验组；
对照组：以市面上脱细胞真皮基质敷料为对照组；
将实验组与对照组采用同样方法进行抗菌性能测试，根据GB/T 20944.3-2008纺织品抗菌性能的评价第3部分：振荡瓶法，测定其抗菌性能。所用菌种为白色念珠菌(Candida albicans)，菌液浓度为105~107cfu/mL。首先在三角瓶中加入缓冲生理盐水及敷料产品，在0.1MPa蒸汽及121℃高温中灭菌20min，冷却至室温，用1mL无菌刻度吸管移取1mL菌液，加入上述三角瓶中。为使试样和细菌强行接触，在37℃摇床振荡数小时。取振荡前及振荡后溶液0.1mL涂于营养琼脂培养基上，经37℃、24h恒温培养后比较，每次抗菌试验均同时进行空白对照试验，其结果如图3~8所示。从图3~8系列图中对比可知，本发明产品对白色念珠菌的抑菌率可达100%，而对照组产品不具备抗菌性。
应当指出的是，具体实施方式只是本发明比较有代表性的例子，显然本发明的技术方案不限于上述实施例，还可以有很多变形。本领域的普通技术人员，以本发明所明确公开的或根据文件的书面描述毫无异议的得到的，均应认为是本专利所要保护的范围。