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产生具有免疫调节作用的乳的食物的筛选方法
    技术领域 本发明涉及产生具有免疫调节作用的乳的食物的筛选方法， 其适用于食品和动物 饲料等领域。
     背景技术 生物体免疫基本上是为了对抗外来攻击的 “防御” 目的而起作用。例如， 相当于所 述 “防御” 的癌细胞的防御和消除， 和在此情况中有效作用的免疫的增强。
     另 一 方 面， 免 疫 的 反 应 过 度， 即 “超 免 疫” ， 可 不 利 地 影 响 生 物 体。 其 实 例 包 括过敏反应、 自身免疫病和慢性炎症等。已知， 在这种情况下， 通过抑制炎性细胞因子 (inflammatory cytokines) 如 IL-6、 TNF-α 和 IL-1 的产生来改善症状。
     另外， 逐渐变的明确的是， 为了对抗外来攻击的 “防御” 目的而起作用的免疫增强 作用和为了抑制由超免疫反应诱导的过敏反应、 自身免疫病、 慢性炎症等而起作用的免疫 抑制作用受到微小 RNA(microRNA)( 下文还简称为 “miRNA” ) 的调节。
     在 miRNA 从基因组转录后， 其进行两次切割变为约 22 个碱基的非编码小 RNA。已 知， 作为其功能， miRNA 以序列互补的方式结合至靶 mRNA 的 3′非翻译区来抑制靶 mRNA 的 翻译。一种 miRNA 抑制细胞中多种 mRNA 的翻译从而调节细胞的各种功能。特别是对其与 癌症发生和进展的关系已进行许多报道， 并且 miRNA 和疾病间的关系引起了关注。
     例如， 就 miR-181 而言， 已报道其涉及 B 细胞的发育、 T 细胞的活化以及免疫的发 育 ( 非专利文献 1 至 3)。
     就 miR-155 而言， 已知其通过活化先天免疫 ( 非专利文献 1 和 4) 和调节 T 细胞和 B 细胞的分化和功能 ( 非专利文献 1 和 5) 涉及免疫发育， 通过， 其通过调节 Th1/Th2 平衡 ( 非专利文献 1 和 6) 以及维持调节 T 细胞 ( 其抑制超免疫反应 ) 的功能 ( 非专利文献 7) 涉及抗过敏和抗炎作用。
     miR-17 和 miR-92 协同调节 B 细胞和 T 细胞的分化和发育， 从而参与免疫发育 ( 非 专利文献 1、 8 和 9)。
     已知 miR-223 通过控制嗜中性粒细胞的增殖和活化参与防御 ( 非专利文献 1 和 10)， miR-150 通过抑制 B 细胞的分化参与防御 ( 非专利文献 1 和 11)， 以及 let-7i 通过控 制胆管细胞中 TLR4 的表达参与防御 ( 非专利文献 12)。
     已知 miR-125 通过抑制 TNF-α 的产生参与抗炎作用 ( 非专利文献 1 和 13)。
     已知 miR-146 通过负调控先天免疫参与防御 ( 非专利文献 1 和 14)， 并且通过控制 Th 1/Th2 平衡参与抗过敏 ( 非专利文献 15)。
     最近已报道在细胞内作为翻译调节分子而起作用的 miRNA 存在于称为外泌体 (exo some) 的脂双层内， 并分泌出细胞 ( 非专利文献 16)。由于还证实分泌的 miRNA 被其 他细胞所吸收， 提示存在依靠 miRNA 的细胞间相互作用。另外， 已知外泌体存在于各种人体 体液中。特别地， 已报道在人血浆和血清中存在 miRNA， 已提出其作为前列腺癌或子宫癌的 生物标记的可能用途 ( 非专利文献 17)。
     除血浆和血清外， 包含外泌体的体液包括唾液、 尿、 羊水和母乳 ( 非专利文献 17)。 在这些中， 母乳是由哺乳动物在特定时期产生的体液， 并负责个体间即母婴间物质的转移。 此外， 母乳不仅是孩子的营养补给， 而且还将母体获得的免疫物质给予孩子。
     母乳包含分泌型 IgA、 乳铁蛋白、 溶菌酶和细胞因子等， 母乳被认为保护婴儿免受 感染， 并促进婴儿的免疫发育 ( 非专利文献 19)。 实际上， 已知依靠母乳成长的孩子， 与不以 此方式成长的孩子， 涉及较低的支气管或肠道感染的风险。母乳包含显示抗菌活性的 IgA、 乳铁蛋白、 糖蛋白、 糖脂等， 以及调节免疫细胞的细胞因子。 然而， 迄今研究中分析的对象主 要为包含于母乳中的蛋白质， 尽管有关于包含于母乳中的核酸的报道， 但对包含于母乳并 具有特定序列的核酸的研究还未报道。
     此外， 还已知受环氧酶 2 表达控制的乳腺细胞 (mammaryglandular cell) 的发育 是由 miR-101a 调节的 ( 非专利文献 20)。然而， 这并不表明 miRNA 存在于乳中。
     另 外， 在本 申请的优 先权日 后， 有报 道称微 小 RNA 存 在于来 源 于牛乳 的 微 泡 (microve sicle) 中 ( 非专利文献 21)， 并且在不同哺乳期的新鲜牛乳、 商购液体乳和奶粉 中鉴定出微小 RNA( 非专利文献 22)。
     现有技术文献
     [ 非专利文献 ]
     非专利文献 1 ： Lindsay， M.A.， Trends Immunol， 29 ： 343-351， 2008
     非专利文献 2 ： Li， Qi-Jing 等人， Cell， 129 ： 147-161， 2007
     非专利文献 3 ： Chen， Chang-Zheng 等人， Science， 303 ： 83-86， 2004
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     非专利文献 5 ： Vigorito， E. 等人， Immunity， 27 ： 847-859， 2007
     非专利文献 6 ： Rodriguez， A. 等人， S cience， 316 ： 608-611， 2007
     非专利文献 7 ： Kohlhaas， S. 等人， J.Immunol.， 182 ： 2578-2582， 2009
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     非专利文献 11 ： Zhou， B. 等人， PNAS， 104(17) ： 7080-7085， 2007
     非 专 利 文 献 12 ： Chen， Xian-Ming 等 人， J.Biol.Chem.， 282(39) ： 28929-28938， 2007
     非专利文献 13 ： Tili， E. 等人， J.Immunol.， 179 ： 5082-5089， 2007
     非专利文献 14 ： Taganov， K.D. 等人， PNAS， 103(33) ： 12481-12486， 2006
     非专利文献 15 ： Monticelli， S. 等人， Genome Biol.， 6， R71， 2005
     非专利文献 16 ： Valadi， H. 等人， Nat.Cell Biol.， 9： 654-659， 2007
     非专利文献 17 ： Gilad， S. 等人， PLoS One， 3(9) ： e3148， 2008
     非专利文献 18 ： Admyre， C.， J.Immunol.， 179 ： 1969-1978， 2007
     非专利文献 19 ： Goldman， A.S.， Breastfeed Med.， 2(4) ： 195-204， 2007
     非专利文献 20 ： Tanaka， T. 等人， Differentiation， 77 ： 181-187， 2009
     非专利文献 21 ： Hata， T. 等人， Biochem.Biophys.Res.Commun.， 396(2) ： 528-533， 2010非专利文献 22 ： Chen， X. 等人， Cell Research， (2010) ： 1-10发明内容 发明要解决的问题
     本发明的目的为提供产生具有免疫调节作用的乳的食物的筛选方法、 一种具有免 疫调节作用的新型食品及其生产方法。
     用于解决问题的方案
     本发明的发明人根据注意到母乳影响婴儿免疫系统成熟的事实进行了研究。结 果， 他们发现与免疫相关的 miRNA 在母乳中高度表达， 并且完成了本发明。
     因此本发明提供食物或物质的筛选方法， 所述食物或物质产生具有免疫调节作用 的母乳， 所述方法包括通过利用乳中微小 RNA 谱 (profile) 与由哺乳动物摄取的食物或包 含于所述食物中的物质的相关性作为指标来鉴定使存在于所述哺乳动物乳中的微小 RNA 的量增加或减少的所述食物或物质。
     在前述方法的实施方案中， 所述免疫调节作用为免疫增强作用， 并且当微小 RNA 的量增加时， 判定为所述食物或物质产生具有免疫增强作用的母乳。
     在前述方法的优选实施方案中， 比较食物摄取前后所观察到的乳中的微小 RNA 谱， 并且当摄取后所观察到的至少一种微小 RNA 的量高于摄取前所观察到的量时， 判定所 述食物使所述乳中的所述微小 RNA 的量增加。
     在前述方法的另一优选实施方案中， 比较所述乳中的微小 RNA 谱和血清或血浆中 的微小 RNA 谱， 当包含于所述乳和所述血清或血浆二者中的微小 RNA 的存在量在摄取所述 食物后使包含于所述乳中的微小 RNA 的存在量是所述血清或血浆中的微小 RNA 的存在量的 1.2 倍以上时， 判定所述食物使所述乳中的所述微小 RNA 的量增加。
     在前述方法的另一实施方案中， 所述免疫调节作用为免疫抑制作用， 并且当所述 微小 RNA 的量减少时， 判定所述食物或物质产生具有免疫抑制作用的母乳。
     在前述方法的优选实施方案中， 比较所述食物摄取前后所观察到的所述乳中的微 小 RNA 谱， 并且当摄取后所观察到的至少一种微小 RNA 的量低于摄取前所观察到的量时， 判 定所述食物使所述乳中的所述微小 RNA 的量减少。
     在前述方法的优选实施方案中， 比较所述乳中的微小 RNA 谱和血清或血浆中的微 小 RNA 谱， 当包含于所述乳和所述血清或血浆二者中的微小 RNA 的存在量在摄取所述食物 后使所述乳中的微小 RNA 的存在量为在血清或血浆中的微小 RNA 的存在量的 0.8 倍以下 时， 判定所述食物使所述乳中的所述微小 RNA 的量减少。
     在前述方法的优选实施方案中， 所述哺乳动物为人类。
     在前述方法的优选实施方案中， 所述微小 RNA 谱由微小 RNA 的量组成， 所述微 小 RNA 选自由以下组成的组 ： miR-10、 miR-15、 miR-16、 miR-17、 miR-18、 miR-19、 miR-20、 miR-21、 miR-22、 miR-23、 miR-24、 miR-25、 miR-26、 miR-27、 miR-28、 miR-29、 miR-30、 miR-31、 miR-33、 miR-34、 miR-92、 miR-93、 miR-96、 miR-98、 miR-99、 miR-100、 miR-101、 miR-103、 miR-106、 miR-107、 miR-125、 miR-126、 miR-128、 miR-129、 miR-130、 miR-133、 miR-134、 miR-139、 miR-140、 miR-141、 miR-143、 miR-146、 miR-148、 miR-151、 miR-152、 miR-155、 miR-181、 miR-182、 miR-183、 miR-184、 miR-185、 miR-186、 miR-188、 miR-192、 miR-193、
     miR-195、 miR-196、 miR-199、 miR-200、 miR-203、 miR-204、 miR-205、 miR-206、 miR-210、 miR-212、 miR-214、 miR-218、 miR-219、 miR-221、 miR-222、 miR-223、 miR-290、 miR-291、 miR-292、 miR-294、 miR-296、 miR-301、 miR-320、 miR-322、 miR-324、 miR-327、 miR-328、 miR-331、 miR-338、 miR-340、 miR-341、 miR-342、 miR-345、 miR-347、 miR-352、 miR-361、 miR-362、 miR-365、 miR-370、 miR-375、 miR-378、 miR-409、 miR-425、 miR-429、 miR-452、 miR-455、 miR-465、 miR-466、 miR-483、 mi R-484、 miR-486、 miR-494、 miR-497、 miR-500、 miR-503、 miR-532、 miR-542、 miR-584、 miR-652、 miR-664、 miR-672、 miR-685、 miR-708、 miR-760、 miR-872、 miR-874、 miR-877、 miR-1224、 miR-1300、 miR-1307、 let-7a、 let-7b、 let-7c、 let-7d、 le-7e、 let-7f 和 let-7i。
     在前述方法的优选实施方案中， 所述微小 RNA 谱由微小 RNA 的量组成， 所述微 小 RNA 选自由以下组成的组 ： miR-15、 miR-16、 miR-17、 miR-18、 miR-19、 miR-20、 miR-21、 miR-23、 miR-24、 miR-26、 miR-27、 miR-29、 miR-30、 miR-33、 miR-34、 miR-92、 miR-93、 miR-99、 miR-100、 miR-101、 miR-106、 miR-107、 miR-125、 miR-130、 miR-140、 miR-141、 miR-143、 miR-146、 miR-155、 miR-181、 miR-185、 miR-186、 miR-192、 miR-193、 miR-195、 miR-200、 miR-205、 miR-210、 miR-218、 miR-219、 miR-221、 miR-222、 miR-223、 miR-301、 miR-322、 miR-340、 miR-361、 miR-370、 miR-429、 miR-455、 miR-466、 miR-497、 miR-500、 miR-503、 miR-532、 miR-542、 let-7d 和 let-7i。 在前述方法的优选实施方案中， 所述微小 RNA 谱由微小 RNA 的量组成， 所述微 小 RNA 选自由以下组成的组 ： miR-15、 miR-16、 miR-19、 miR-21、 miR-23、 miR-24、 miR-26、 miR-27、 miR-30、 miR-34、 miR-99、 miR-106、 miR-107、 miR-125、 miR-130、 miR-140、 miR-181、 miR-193、 miR-210、 miR-222、 miR-223、 miR-361、 miR-370、 miR-429、 miR-500、 miR-532、 let-7d 和 let-7i。
     本发明还提供一种生产具有免疫调节作用的乳或乳制品的方法， 其包括给予哺乳 动物 ( 除人以外 ) 食物或物质的步骤， 所述食物或物质通过前述筛选方法被鉴定为使所述 哺乳动物的乳中微小 RNA 的量增加或减少， 以及收集所述哺乳动物的乳的步骤。
     在前述方法的实施方案中， 所述免疫调节作用为免疫增强作用， 并且将所述食物 或物质鉴定为使所述微小 RNA 的量增加。
     在前述方法的实施方案中， 所述免疫调节作用为免疫抑制作用， 并且将所述食物 或物质鉴定为使所述微小 RNA 的量减少。
     本发明还提供一种具有免疫增强作用的口服摄取用组合物， 其包括口服摄取用组 合物的基质和添加至所述基质的微小 RNA。
     在 所 述 口 服 摄 取 用 组 合 物 的 优 选 实 施 方 案 中， 所 述 微 小 RNA 选 自 由 miR-10、 miR-15、 miR-16、 miR-17、 miR-18、 miR-19、 miR-20、 miR-21、 miR-22、 miR-23、 miR-24、 miR-25、 miR-26、 miR-27、 miR-28、 miR-29、 miR-30、 miR-31、 miR-33、 miR-34、 miR-92、 miR-93、 miR-96、 miR-98、 miR-99、 miR-100、 miR-101、 miR-103、 miR-106、 miR-107、 miR-125、 miR-126、 miR-128、 miR-129、 miR-130、 miR-133、 miR-134、 miR-139、 miR-140、 miR-141、 miR-143、 miR-146、 miR-148、 miR-151、 miR-152、 miR-155、 miR-181、 miR-182、 miR-183、 miR-184、 miR-185、 miR-186、 miR-188、 miR-192、 miR-193、 miR-195、 miR-196、 miR-199、 miR-200、 miR-203、 miR-204、 miR-205、 miR-206、 miR-210、 miR-212、 miR-214、 miR-218、 miR-219、
     miR-221、 miR-222、 miR-223、 miR-290、 miR-291、 miR-292、 miR-294、 miR-296、 miR-301、 miR-320、 miR-322、 miR-324、 miR-327、 miR-328、 miR-331、 miR-338、 miR-340、 miR-341、 miR-342、 miR-345、 miR-347、 miR-352、 miR-361、 miR-362、 miR-365、 miR-370、 miR-375、 miR-378、 miR-409、 miR-425、 miR-429、 miR-452、 miR-455、 miR-465、 miR-466、 miR-483、 miR-484、 miR-486、 miR-494、 miR-497、 miR-500、 miR-503、 miR-532、 miR-542、 miR-584、 miR-652、 miR-664、 miR-672、 miR-685、 mi R-708、 miR-760、 miR-872、 miR-874、 miR-877、 miR-1224、 miR-1300、 miR-1307、 let-7a、 let-7b、 let-7c、 let-7d、 le-7e、 let-7f 和 let-7i 组成的组。
     在 所 述 口 服 摄 取 用 组 合 物 的 优 选 实 施 方 案 中， 所 述 微 小 RNA 选 自 由 miR-15、 miR-16、 miR-17、 miR-18、 miR-19、 miR-20、 miR-21、 miR-23、 miR-24、 miR-26、 miR-27、 miR-29、 miR-30、 miR-33、 miR-34、 miR-92、 miR-93、 miR-99、 miR-100、 miR-101、 miR-106、 miR-107、 miR-125、 miR-130、 miR-140、 miR-141、 miR-143、 miR-146、 miR-155、 miR-181、 miR-185、 miR-186、 miR-192、 miR-193、 miR-195、 miR-200、 miR-205、 miR-210、 miR-218、 miR-219、 miR-221、 miR-222、 miR-223、 miR-301、 miR-322、 miR-340、 miR-361、 miR-370、 miR-429、 miR-455、 miR-466、 miR-497、 miR-500、 miR-503、 miR-532、 miR-542、 let-7d 和 let-7i 组成 的组。 在 所 述 口 服 摄 取 用 组 合 物 的 优 选 实 施 方 案 中， 所 述 微 小 RNA 选 自 由 miR-15、 miR-16、 miR-19、 miR-21、 miR-23、 miR-24、 miR-26、 miR-27、 miR-30、 miR-34、 miR-99、 miR-106、 miR-107、 miR-125、 miR-130、 miR-140、 miR-181、 miR-193、 miR-210、 miR-222、 miR-223、 miR-361、 miR-370、 miR-429、 miR-500、 miR-532、 let-7d 和 let-7i 组成的组。
     在所述口服摄取用组合物的优选实施方案中， 所述组合物为婴儿用食品或幼儿用 食品。
     在所述口服摄取用组合物的优选实施方案中， 所述婴儿用食品或幼儿用食品为婴 儿配方 (formula) 或较大婴儿配方 (follow-up formula)。
     附图说明
     图 1 示出通过微阵列分析 (microarray analysis) 获得的人母乳中 miRNA 的检测结果。 图 2 示出出生后前六个月和其后六个月的母乳中 miR-181a 水平的比较。 hsa 表示 人类， cel 表示线虫 ( 秀丽隐杆线虫 Caenorhabditis elegans)( 下图应同样应用 )。
     图 3 示出出生后前六个月和其后六个月的母乳中 miR-155、 miR-17 和 miR-92 水平 的比较。
     图 4 示出人母乳和血清中免疫相关 miRNA 水平的比较
     图 5 示出冻融前后所观察到的 miRNA 水平的比较。
     图 6 示出低 pH(pH1) 下保存前后所观察到的 miRNA 水平的比较。
     图 7 示出 RNase 处理后和无 RNase 处理所观察到的 miRNA 水平的比较。
     具体实施方式
     本发明的方法为食物或物质的筛选方法， 所述食物或物质产生具有免疫调节作用的母乳， 所述筛选方法包括基于乳中的微小 RNA 谱与哺乳动物摄取的食物或包含于所述食 物中的物质的相关性来鉴定使存在于哺乳动物乳中的微小 RNA 的量增加或减少的所述食 物或物质。
     在本发明的前述方法的实施方案中， 所述免疫调节作用为免疫增强作用， 并且当 微小 RNA 的量增加时， 判定所述食物或物质产生具有免疫增强作用的母乳。在本发明的前 述方法的另一实施方案中， 所述免疫调节作用为免疫抑制作用， 并且当所述微小 RNA 的量 减少时， 判定所述食物或物质产生具有免疫抑制作用的母乳。
     本发明基于以下观点 ： 期望通过 miRNA 的口服给药来获得免疫调节作用， 这是由 于新发现 miRNA 包含于乳中， 和即使在胃中的酸性条件下 miRNA 也可稳定地存在以及母乳 促进摄取母乳的婴儿中免疫发育的事实 ( 例如， Breastfeed Med.， 2(4) ： 195-204， 2007)。 并且， 基于乳中 miRNA 谱受饮食影响的预测， 构想鉴定可使存在于乳中的 miRNA 的量增加或 减少的食物或包含于食物的活性成分。
     为本发明的筛选方法、 乳和乳制品等所定义的免疫调节作用包括， 例如， 两种作 用： 为对抗外来攻击的 “防御” 目的而起作用的增加免疫增强作用的作用 ( 免疫增强作用 ) 和为对抗免疫过度反应即过敏反应、 自身免疫病、 慢性炎症等 ( 其中 “超免疫反应” 不利地 影响生物体 ) 而起抑制作用的免疫抑制作用。
     术语 “免疫增强作用” 和 “免疫抑制作用” 以相对含义使用。当对于某一哺乳动 物母乳通常观察到的免疫增强作用在摄取食物或物质后增强时， 所述母乳具有免疫增强作 用， 而当免疫增强作用降低时， 所述母乳具有免疫抑制作用。 当食物或物质被哺乳动物摄取 后所观察到的免疫增强作用与摄取前所观察的作用相比增强时， 所述哺乳动物的母乳具有 免疫增强作用， 而当免疫增强作用与摄取前所观察到的作用相比降低时， 所述母乳具有免 疫抑制作用。
     可以例如以如下所述来研究哺乳动物乳中的 miRNA 谱和被所述哺乳动物摄取的 食物或包含于所述食物中的物质的相关性。
     收集来自摄取食物的哺乳动物的乳， 检测乳中的 miRNA 谱。
     所述哺乳动物不特别限定， 实例包括人、 牛、 山羊、 绵羊、 猪、 猿、 狗、 猫、 大鼠、 小鼠、 仓鼠和豚鼠等。所述哺乳动物优选人或牛。
     本发明中， 所述 miRNA 谱由 miRNA 的种类和量组成。 所述 miRNA 可由一种 miRNA 组 成或由两种以上 miRNA 组成。miRNA 的种类不特别限定， 只要选择存在于乳中的那些即可， 并且实例包括 miR-10、 miR-15、 miR-16、 miR-17、 miR-18、 miR-19、 miR-20、 miR-21、 miR-22、 miR-23、 miR-24、 miR-25、 miR-26、 miR-27、 miR-28、 miR-29、 miR-30、 miR-31、 miR-33、 miR-34、 miR-92、 miR-93、 miR-96、 miR-98、 miR-99、 miR-100、 miR-101、 miR-103、 miR-106、 miR-107、 miR-125、 miR-126、 miR-128、 miR-129、 miR-130、 miR-133、 miR-134、 miR-139、 miR-140、 miR-141、 miR-143、 miR-146、 miR-148、 miR-151、 miR-152、 miR-155、 miR-181、 miR-182、 miR-183、 miR-184、 miR-185、 miR-186、 miR-188、 miR-192、 miR-193、 miR-195、 miR-196、 miR-199、 miR-200、 miR-203、 miR-204、 miR-205、 miR-206、 miR-210、 miR-212、 miR-214、 miR-218、 miR-219、 miR-221、 miR-222、 miR-223、 mi R-290、 miR-291、 miR-292、 miR-294、 miR-296、 miR-301、 miR-320、 miR-322、 miR-324、 miR-327、 miR-328、 miR-331、 miR-338、 miR-340、 miR-341、 miR-342、 miR-345、 miR-347、 miR-352、 miR-361、 miR-362、 miR-365、miR-370、 miR-375、 miR-378、 miR-409、 miR-425、 miR-429、 miR-452、 miR-455、 miR-465、 miR-466、 miR-483、 miR-484、 miR-486、 miR-494、 miR-497、 miR-500、 miR-503、 miR-532、 miR-542、 miR-584、 miR-652、 miR-664、 miR-672、 miR-685、 miR-708、 miR-760、 miR-872、 miR-874、 miR-877、 miR-1224、 miR-1300、 miR-1307、 let-7a、 let-7b、 let-7c、 let-7d、 le-7e、 let-7f 和 let-7i 等。
     这些 miRNA 为证实存在于或者人母乳、 大鼠初乳或者牛初乳之一中的那些。如 上所述， 已知母乳促进摄取母乳的婴儿中的免疫发育 ( 例如， Breastfeed Med.， 2(4) ： 195-205， 2007)。此外， 已报道被认为对婴儿 ( 包括动物幼仔 ) 的免疫系统重要的许多组分 通常包含于初乳中 (J.Anim.Sci.， 2009， 87 ： (Suppl.1) ： 3-9)。因此， 提示已证实存在于乳 中的前述 miRNA 参与免疫作用。
     在以上提及的那些中， 优选的是 miR-15、 miR-16、 miR-17、 miR-18、 miR-19、 miR-20、 miR-21、 miR-23、 miR-24、 miR-26、 miR-27、 miR-29、 miR-30、 miR-33、 miR-34、 miR-92、 miR-93、 miR-99、 miR-100、 miR-101、 miR-106、 miR-107、 miR-125、 miR-130、 miR-140、 miR-141、 miR-143、 miR-146、 miR-155、 miR-181、 miR-185、 miR-186、 miR-192、 miR-193、 miR-195、 miR-200、 miR-205、 miR-210、 miR-218、 miR-219、 miR-221、 miR-222、 miR-223、 miR-301、 miR-322、 miR-340、 miR-361、 miR-370、 miR-429、 miR-455、 miR-466、 miR-497、 miR-500、 miR-503、 miR-532、 miR-542、 let-7d 和 let-7i。这些是已报道其免疫调节作用的 miRNA、 已 证实存在于大鼠和牛二者的初乳中的 miRNA 或在服用双歧杆菌属 (Bifidobacterium) 细菌 的大鼠的初乳中量增加的 miRNA。 此外， 在以上提及的 miRNA 中， 特别优选的是 miR-15、 miR-16、 miR-19、 miR-21、 miR-23、 miR-24、 miR-26、 miR-27、 miR-30、 miR-34、 miR-99、 miR-106、 miR-107、 miR-125、 miR-130、 miR-140、 miR-181、 miR-193、 miR-210、 miR-222、 miR-223、 miR-361、 miR-370、 miR-429、 miR-500、 miR-532、 let-7d 和 let-7i。这些是已证实存在于大鼠和牛二者的初乳 中的 miRNA。
     某些 miRNA 具有亚型， 例如对于 miR-181、 miR-92、 miR-125 和 miR-146 等各自已 知 2 至 4 种亚型， 如分别为 miR-181a、 miR-181b、 miR-181c、 miR-181d、 miR-92a、 miR-92b、 miR-125a、 miR-125a-3P、 miR-125a-5P、 miR-125b、 miR-146a、 miR-146b、 miR-146b-3P 和 miR-146b-5P。某些其他 miRNA 也具有亚型， 并且在本发明中， miRNA 可为这样的任何亚型。 所述亚型的实例包括下文描述的实施例中 ( 指实施例 1、 3、 4 和 5) 证实存在于乳中的那些。
     人 miR-155 前 体 has-mir-155(MI0000681)， 及 其 活 性 位 点 has-miR-155(MIMAT 0009241) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NOS ： 1 和 2。 示于括号内的为 miRNA 数据库的登录 号 (miRBase::Sequences， http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/index.shtml)( 以 下描述应同样适用 )。
     牛 miR-155 前 体 bta-miR-155(MI0009752) ， 及 其 活 性 位 点 bta-miR-155(MIMAT0000646) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NOS ： 3 和 4。
     人 miR-181 前体 hsa-mir-181a-1(MI0000289) 和 hsa-mir-181a-2(MI0000269)， 及 其活性位点 hsa-miR-181a(MIMAT0000256) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NO S ： 5、 6 和 7。
     人 miR-181b 前体 hsa-mir-181b-1(MI0000270) 和 hsa-mir-181b-2(MI0000683)， 及其活性位点 hsa-miR-181b(MIMAT0000257) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NO S ： 8、 9和
     10。 牛 miR-181a 前体 bta-mir-181a(MI0004757) 和 bta-mir-181a-1(MI0010484)， 及 其活性位点 bta-miR-181a(MIMAT0003543) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NO S ： 11、 12 和 13。
     牛 miR-181b 前 体 bta-mir-181b-1(MI0010485) 和 bta-mir-181b-2(MI0005013)， 及其活性位点 bta-miR-181b(MIMAT0003793) 的核苷酸序列 分别示于 SEQ ID NOS ： 14、 15 和 16。
     人 miR-223 前 体 hsa-mir-223(MI0000300) ， 及 其 活 性 位 点 hsa-miR-223(MIMAT0000280) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NOS ： 17 和 18。
     牛 miR-223 前 体 bta-mir-223(MI0009782) ， 及 其 活 性 位 点 bta-miR-223(MIMAT0009270) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NOS ： 19 和 20。
     人 miR-17 前 体 的 核 苷 酸 序 列 hsa-mir-17(MI0000071)，及 其 活 性 位 点 hsa-miR-17(MIMAT0000070)( 又称 hsa-miR-17-5p)， 分别示于 SEQ ID NO S ： 21 和 22。
     牛 miR-17 前 体 bta-mir-17(MI0005031) 及 其 活 性 位 点 bta-miR-17-5p(MIMAT0003815) 和 bta-miR-17-3p(MIMAT0003816) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NO S ： 23、 24 和 25。
     人 miR-92a 前体 hsa-mir-92a-1(MI0000093) 和 hsa-mir-92a-2(MI0000094) 及其 活性位点 hsa-miR-92a(MIMAT0000092) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NO S ： 26、 27 和 28。
     人 miR-92b 前 体 hsa-mir-92b(MI0003560) 及 其 活 性 位 点 hsa-miR-92b(MIMAT0003218) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NOS ： 29 和 30。
     牛 miR-92 前 体 bta-mir-92(MI0005024) 及 其 活 性 位 点 bta-miR-92(MIMAT0003808) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NOS ： 31 和 32。
     牛 miR-92a 前 体 bta-mir-92a(MI0009905) 及 其 活 性 位 点 bta-miR-92a(MIMAT0009383) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NOS ： 33 和 34。
     牛 miR-92b 前 体 bta-mir-92b(MI0009906) 及 其 活 性 位 点 bta-miR-92b(MIMAT 0009384) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NOS ： 35 和 36。
     人 let-7i 前 体 hsa-let-7i(MI0000434) 及 其 活 性 位 点 hsa-let-7i(MIMAT0000415) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NOS ： 37 和 38。
     牛 let-7i 前 体 bta-let-7i(MI0005065) 及 其 活 性 位 点 bta-let-7i(MIMAT0003851) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NOS ： 39 和 40。
     人 miR-125a 前 体 hsa-mir-125a(MI0000469) 及 其 活 性 位 点 hsa-miR-125a-5p(MIMAT0000443) 和 hsa-miR-125a-3p(MIMAT0004602) 的核苷酸序列分别 示于 SEQ ID NO S ： 41、 42 和 43。
     人 miR-125b 前 体 hsa-mir-125b-1(MI0000446) 和 hsa-mir-125b-2(MI0000470) 及其活性位点 hsa-miR-125b(MIMAT0000423) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NO S ： 44、 45 和 46。
     牛 miR-125a 前 体 bta-mir-125a(MI0004752) 及 其 活 性 位 点 bta-miR-125a(MIMAT0003538) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NOS ： 47 和 48。
     牛 miR-125b 前 体 bta-mir-125b-1(MI0004753) 和 bta-mir-125b-2(MI0005457)
     及其活性位点 bta-miR-125b(MIMAT0003539) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NO S ： 49、 50 和 51。
     人 miR-146a 前 体 hsa-mir-146a(MI0000477) 及 其 活 性 位 点 hsa-miR-146a(MIMAT0000449) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NOS ： 52 和 53。
     人 miR-146b 前 体 的 核 苷 酸 序 列 hsa-mir-146b(MI0003129) 及 其 活 性 位 点 hsa-miR-146b-5p(MIMAT0002809)( 也 称 为 hsa-miR-146b) 和 hsa-miR-146b-3p(MIMAT 0004766) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NOS ： 54、 55 和 56。
     牛 miR-146a 前 体 bta-mir-146a(MI0009746) 及 其 活 性 位 点 bta-miR-146a(MIMAT0009236) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NOS ： 57 和 58。
     牛 miR-146b 前 体 bta-mir-146b(MI0009745) 及 其 活 性 位 点 bta-miR-146b(MIMAT0009235) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NOS ： 59 和 60。
     人 miR-150 前 体 hsa-mir-150(MI0000479) 及 其 活 性 位 点 hsa-miR-150(MIMAT 0000451) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NOS ： 61 和 62。
     牛 miR-150 前 体 bta-mir-150(MI0005058) 及 其 活 性 位 点 bta-miR-150(MIMAT0003845) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NOS ： 63 和 64。 除前述 miRNA 外， 将已证实存在于大鼠或牛的乳中的 miRNA 和与这些 miRNA 相应 的其他动物的 miRNA 示于表 1 至 10。
     表1
     表2
     表3
     表4
     表5
     表6
     表7
     表8
     表9
     表 10miRNA 不限制为具有前述序列的那些， 所述 miRNA 可包括一个或几个核苷酸的替 换、 缺失、 插入、 增添或倒位， 只要 miRNA 具有作为 miRNA 的功能， 即， miRNA 可调节靶基因的 表达即可。特别地， 此类 miRNA 的实例包括具有与前述任一序列显示 80％以上、 优选 90％ 以上、 更优选 95％以上的同源性的核苷酸序列的 RNA。
     miRNA 的量可为绝对量或相对量。 相对量可为基于动物中的平均量的相对量， 或可
     为基于食物摄取前所观察到的量， 在食物摄取后所观察到的相对量。 对于核酸量的测定， 可 采用通常用于 miRNA 量测定的方法如定量逆转录 PCR(qRT-PCR)。miRNA 的量还可通过微阵 列法测定。关于乳中 miRNA 的提取， 可采用通常用于 miRNA 提取的方法， 还可使用商购可得 的 miRNA 分离试剂盒。
     另外， 存在于乳中的 miRNA 的量还可通过测定乳腺细胞中 miRNA 的表达量来间接 测定。
     检测哺乳动物乳中的 miRNA 谱和由该哺乳动物摄取的食物或包含于所述食物中 的物质的相关性。哺乳动物乳中的 miRNA 谱和由该哺乳动物摄取的食物或包含于所述食物 中的物质的相关性是指 miRNA 谱与所述物质的存在或缺失或者所述物质的量的相关性。例 如， 如果已摄取某一物质的动物的乳中一种以上 miRNA 的量大于或小于未摄取该物质的动 物中所观察到的那些， 则该物质和 miRNA 谱分别具有正或负相关性。另外， 如果某一物质的 摄取不影响 miRNA 谱， 则该物质和 miRNA 谱互不相关。
     具体地， 例如， 当比较食物摄取前后所观察到的乳中的 miRNA 谱时， 摄取后所观察 到的一种、 优选两种以上、 更优选五种以上 miRNA 的量大于摄取前所观察到的那些， 则判定 该食物使存在于乳中的 miRNA 的量增加。
     另外， 当比较食物摄取前后所观察到的乳中的 miRNA 谱时， 摄取后所观察到的一 种、 优选两种以上、 更优选五种以上 miRNA 的量小于摄取前所观察到的那些， 则判定该食物 使存在于乳中的 miRNA 的量降低。
     此外， 食物摄取前 miRNA 谱的测定并不是不可缺少的， 食物和 miRNA 量的相关性还 可通过比较在摄取食物后测定的 miRNA 谱与预先测定的对象哺乳动物的普通 miRNA 谱来测 定。
     在另一实施方案中， 比较乳中的 miRNA 谱和血清或血浆中的 miRNA 谱， 如果乳和 血清或血浆二者中包含的 miRNA 的存在量， 通过摄取食物使乳中所观察到的 miRNA 的存 在量比血清或血浆中所观察到的 miRNA 的存在量更高的话， 则判定该食物使存在于乳中的 miRNA 的存在量增加。 与血清或血浆中的 miRNA 的存在量相比， 乳中 miRNA 的存在量高的程 度为例如 1.2 倍以上、 优选 2 倍以上、 更优选 5 倍以上、 还更优选 10 倍以上。
     另外， 当比较乳中的 miRNA 谱和血清或血浆中的 miRNA 谱时， 如果乳和血清或血浆 二者中包含的 miRNA 的量， 通过摄取食物而使乳中的量比血清或血浆中所观察到的量更低 的话， 则判定该食物使存在于乳中的 miRNA 的量减少。与血清或血浆中所观察到的 miRNA 存在量相比， 乳中 miRNA 的存在量低的程度为例如 0.8 倍以下、 优选 0.5 倍以下、 更优选 0.2 倍以下、 还更优选 0.1 倍以下。
     所述食物可由单一物质组成或可为组合物， 只要其可口服摄取即可。另外， “摄取 前” 和 “摄取后” 可意为 “一次食物摄取之前和之后” 或 “两次以上食物摄取之前和之后” 。 另外， 两次以上食物摄取可为两次以上相同食物的摄取， 或两种以上食物的摄取。
     所述食物可为根据既定计划摄取或自由摄取。后一种情况中， 所述食物和乳中 miRNA 谱的相关性人类情况中可通过获取 (hearing) 所摄取的食物的含量来检测。当根据 既定计划摄取或服用所述食物时， 所述食物可被认为是 “试样” 。所述食物可为普通食物或 包含试验物质的普通食物。摄取的食物量、 摄取的时间和摄取的次数不特别限定。
     如果选择使乳中 miRNA 的量增加的食物， 则包含于所述食物并使乳中 miRNA 的量增加的物质可用如上述相同的方式鉴定。另外， 如果选择使乳中 miRNA 的量减少的食物， 则 包含于所述食物并使乳中 miRNA 的量减少的物质可用如上述相同的方式鉴定。
     如果鉴定出增加或减少乳中 miRNA 的量的食物或物质， 则可设计使乳中 miRNA 的 量增加或减少的食物。即， 认为使乳中 miRNA 的量增加的食物或包含于其中的物质是产生 具有免疫增强作用的乳所优选的， 而使乳中 miRNA 的量减少的食物或包含于其中的物质不 是产生具有免疫增强作用的乳所优选的。
     另外， 认为使乳中 miRNA 的量减少的食物或包含于其中的物质是产生具有免疫抑 制作用的乳所优选的， 而使乳中 miRNA 的量增加的食物或包含于其中的物质不是产生具有 免疫抑制作用的乳所优选的。
     可如上所述进行产生具有免疫调节作用的母乳的食物或物质， 或不适于产生具有 免疫调节作用的母乳的食物或物质的筛选。如下文所述实施例中所示， 在大鼠和牛的初乳 中证实存在各种 miRNA。 这支持了本发明的观点， 即期望 miRNA 的口服给药提供免疫调节作 用。 另外， 如下文所述实施例中所示， 当将双歧杆菌属细菌 ( 长双歧杆菌 (Bifidobacterium longum)) 对大鼠口服给药时， 52 种 miRNA 的量增加。
     已知双歧杆菌属细菌作为益生菌行使功能， 并特别地具有免疫调节作用。 因此， 服 用双歧杆菌属细菌使乳中 miRNA 的量增加的事实也支持乳中 miRNA 参与免疫调节。通过服 用双歧杆菌属细菌诱导的乳中 miRNA 的量增加的论证， 即双歧杆菌属细菌与 miRNA 谱的相 关性， 显示出本发明的筛选方法是可行的。 另外， 尽管还存在通过服用双歧杆菌属细菌不改 变其在乳中的量的 miRNA， 但不否认可通过另一种食物或包含于其中的物质使那些 miRNA 的量增加的可能性。
     作为双歧杆菌属细菌的益生菌功能， 已知防御或改善呼吸道感染、 急性感染性腹 泻、 抗生素相关性腹泻、 艰难梭菌 (Clostridium dificile) 相关性腹泻、 坏死性肠结肠 炎 (necrotizing enterocolitis)、 旅行者腹泻 (traveler’ s diarrhea) 和幽门螺杆菌 (Helicobacter pylori) 感染等 (The Journal of Nutrition， 2010Mar ； 140(3) ： 698S-712S Epub 2010Jan 27)。表明通过服用双歧杆菌属细菌而使其在乳中的量增加的 miRNA 不仅调 节免疫， 而且在摄取双歧杆菌属细菌的动物中显示的功能类似于前述益生菌的功能。
     通过给予哺乳动物如上所述选择的使乳中 miRNA 量增加的食物或物质， 并从该动 物中收集乳， 可获得具有免疫增强作用的乳或其免疫增强作用增强的乳。 另外， 通过减少或 避免哺乳动物摄取上述选择的使乳中 miRNA 量减少的食物或物质， 可增强乳的免疫增强作 用， 或可预防免疫增强作用的降低。
     另外， 可将使乳中 miRNA 量增加的食物或物质的摄取以及减少或避免使乳中 miRNA 量减少的食物或物质的摄取结合起来。另外， 通过给予哺乳动物上述选择的使乳中 miRNA 量减少的食物或物质， 并从该动物中收集乳， 可获得具有免疫抑制作用的乳或其免疫 增强作用减少的乳。另外， 通过减少或避免哺乳动物摄取上述选择的使乳中 miRNA 量增加 的食物或物质， 可增强乳的免疫抑制作用， 或可降低乳的免疫增强作用。另外， 可将使乳中 miRNA 量减少的食物或物质的摄取以及减少或避免使乳中 miRNA 量增加的食物或物质的摄 取结合起来。
     通过处理上述获得的具有免疫调节作用的乳， 可产生具有免疫调节作用的乳制 品。乳制品的类型不特别限定， 只要 miRNA 在维持其功能的情况下可存在于乳制品中 即可， 实例包括加工乳、 婴儿配方、 乳饮料、 婴儿配方奶粉 (powdered infant formula)、 发 酵乳、 奶油、 黄油、 奶酪和冰淇淋等。作为乳制品， 优选婴儿或幼儿用乳制品。
     根据本发明， 已证实乳中 miRNA 的存在， 特别是已知参与免疫增强例如免疫发育、 抗过敏、 抗炎和预防感染的 miRNA。此外， 众所周知， 母乳对摄取其的婴儿给予免疫增强作 用。 因此， 参与免疫调节的 miRNA 可调节摄取其的生物体例如人类的免疫是合理地预测。 由 于 miRNA 是调节各种基因表达的物质， 因此认为此类调节分子从母体至婴儿的转移特别是 对具有未发育的免疫系统的婴儿来说是极其重要的。
     本发明的另一方面是具有免疫增强作用的口服摄取用组合物， 其通过向口服摄取 用组合物的基质中添加 miRNA 而制备。
     所述 miRNA 的实例包括 miR-10、 miR-15、 miR-16、 miR-17、 miR-18、 miR-19、 miR-20、 miR-21、 miR-22、 miR-23、 miR-24、 miR-25、 miR-26、 miR-27、 miR-28、 miR-29、 miR-30、 miR-31、 miR-33、 miR-34、 miR-92、 miR-93、 miR-96、 miR-98、 miR-99、 miR-100、 miR-101、 miR-103、 miR-106、 miR-107、 miR-125、 miR-126、 miR-128、 miR-129、 miR-130、 miR-133、 miR-134、 miR-139、 miR-140、 miR-141、 miR-143、 miR-146、 miR-148、 miR-151、 miR-152、 miR-155、 miR-181、 miR-182、 miR-183、 miR-184、 miR-185、 miR-186、 miR-188、 miR-192、 miR-193、 miR-195、 miR-196、 miR-199、 miR-200、 miR-203、 miR-204、 miR-205、 miR-206、 miR-210、 miR-212、 miR-214、 miR-218、 miR-219、 miR-221、 miR-222、 miR-223、 miR-290、 miR-291、 miR-292、 miR-294、 miR-296、 miR-301、 miR-320、 miR-322、 miR-324、 miR-327、 miR-328、 miR-331、 miR-338、 miR-340、 miR-341、 miR-342、 miR-345、 miR-347、 miR-352、 miR-361、 miR-362、 miR-365、 miR-370、 miR-375、 miR-378、 miR-409、 miR-425、 miR-429、 miR-452、 miR-455、 miR- 465、 miR-466、 miR-483、 miR-484、 miR-486、 miR-494、 miR-497、 miR-500、 miR-503、 miR-532、 miR-542、 miR-584、 miR-652、 miR-664、 miR-672、 miR-685、 miR-708、 miR-760、 miR-872、 miR-874、 miR-877、 miR-1224、 miR-1300、 miR-1307、 let-7a、 let-7b、 let-7c、 let-7d、 le-7e、 let-7f 和 let-7i 等。
     在 上 述 miRNA 中， miR-15、 miR-16、 miR-17、 miR-18、 miR-19、 miR-20、 miR-21、 miR-23、 miR-24、 miR-26、 miR-27、 miR-29、 miR-30、 miR-33、 miR-34、 miR-92、 miR-93、 miR-99、 miR-100、 miR-101、 miR-106、 miR-107、 miR-125、 miR-130、 miR-140、 miR-141、 miR-143、 miR-146、 miR-155、 miR-181、 miR-185、 miR-186、 miR-192、 miR-193、 miR-195、 miR-200、 miR-205、 miR-210、 miR-218、 miR-219、 miR-221、 miR-222、 miR-223、 miR-301、 miR-322、 miR-340、 miR-361、 miR-370、 miR-429、 miR-455、 miR-466、 miR-497、 miR-500、 miR-503、 miR-532、 miR-542、 let-7d 和 let-7i 是优选的， 而 miR-15、 miR-16、 miR-19、 miR-21、 miR-23、 miR-24、 miR-26、 miR-27、 miR-30、 miR-34、 miR-99、 miR-106、 miR-107、 m iR-125、 miR-130、 miR-140、 miR-181、 miR-193、 miR-210、 miR-222、 miR-223、 miR-361、 miR-370、 miR-429、 miR-500、 miR-532、 let-7d 和 let-7i 是更优选的。
     所述 miRNA 可由单种 miRNA 组成或由任意的两种以上 miRNA 组成。
     口服摄取用组合物的基质不特别限定， 只要选择 miRNA 可在其中维持其功能而存 在的口服摄取的或可给药的基质即可， 实例包括食品、 饮品、 药品基质和动物饲料等。
     食品可以为任何形式， 并包括饮品。 食品包括成人用食品、 婴儿用食品和幼儿用食品等。
     成人用食品的实例包括肠内营养物、 流体食物例如浓缩的流体食物和营养增补食品等。 婴儿用食品或幼儿用食品的实例包括， 例如调制乳类 (modified milk)( 例如， 婴 儿配方、 低出生体重 (birth weight) 婴儿用婴儿配方、 较大婴儿配方等以及过敏型婴儿用 婴儿配方、 无乳糖乳、 先天性代谢缺陷婴儿的特殊乳等， 和由这些制备的奶粉 )、 母乳增补粉 或婴儿配方奶粉和婴儿食品等。
     此处所指的婴儿配方是通过使用乳或乳制品作为主原料并添加婴儿所需的营养 物生产的食品， 并主要用作婴儿期母乳的替代食品， 以及作为幼年时期母乳的替代食品或 营养补充食品。 所述婴儿配方的其他实例包括为适合于具有特定的先天或后天疾病的婴儿 有助于营养摄取为目的而生产的食品。
     miRNA 相对耐冻融、 低 pH 如 pH1 的酸性条件和 RNase 如 RNase A 和 RNase T， 因而 适合作为添加到食品中的活性成分。低 pH 下的稳定性表明 miRNA 分子耐婴儿胃内环境， 并 可被婴儿的主要免疫器官之一的肠道吸收， 因此其可影响婴儿的免疫系统。 另外， 母乳的保 存和冻融不会使 miRNA 变性， 这对通常给予冷藏保存的母乳的低出生体重婴儿和住院婴儿 在营养上是重要的。此外， miRNA 对 RNase 的耐受性表明 miRNA 可存在于复合体例如母乳 中的外泌体和微泡中。
     从前述发现中， 似乎母亲给予婴儿这样定制 (custom-made) 的母乳， 婴儿便可适 应环境。 有报道表明源于母乳的外泌体使 Foxp3+CD4+CD25+ 调节 T 细胞的数量增加。 如果免 疫相关的 miRNA 包含于母乳外泌体中， 则其可能有助于婴儿消化道内 Foxp3+CD4+CD25+ 调 节 T 细胞的增加。这是由于母乳中检测出的免疫相关的 miRNA 如 miR-181a 和 miR-181b 高 度表达， 其参与 T 细胞的分化。此外， 由于已知大量包含于母乳中的 miR-181 和 miR-155 诱 导 B 细胞的分化， 而抑制 B 细胞分化的 miR-150 在母乳中几乎不存在， 因而母乳中的 miRNA 可诱导 B 细胞的分化。
     尽管组合物中 miRNA 的含量不特别限定， 并可适当选择， 然而其总计例如为 10 至 10,000ng/ml， 优选 20 至 10,000ng/ml， 更优选 50 至 10,000ng/ml。另外， 摄取的 miRNA 的 量， 总计例如 5μg 至 120mg/ 天， 优选 10μg 至 120mg/ 天， 更优选 25μg 至 120mg/ 天。
     可通过制备部分双链 RNA 作为 miRNA 前体 (pri-miRNA) 并用 Dicer 酶消化来获得 miRNA。作为 Dicer 酶， 可使用商购可得的酶。双链 RNA 可通过例如使用具有互补序列的双 链 DNA 作为模板的 RNA 聚合酶反应来制备。所述双链 DNA 可通过使用哺乳动物的染色体 DNA 作为模板以及为能够扩增 miRNA 序列而设计的引物基于 PCR 的扩增来制备。
     可通过用 Dicer 酶等消化如上所述获得的双链 RNA 来获得 miRNA。
     另外， miRNA 还可通过化学合成来制备。即， 可通过合成正义链和反义链并将其退 火来获得 miRNA。
     另外， 可将允许通过哺乳动物的内源 Dicer 酶产生靶 miRNA 的双链 RNA 添加到口 服摄取用组合物中。
     当本发明的口服摄取用组合物为药剂时， 可通过用药物学上可接受的口服给药用 载体与 miRNA 组合来制备组合物。药物制剂的形式不特别限定， 实例包括片剂、 丸剂、 散剂、 溶液剂、 悬浮剂 (suspension)、 乳剂、 颗粒剂、 胶囊剂和糖浆剂等。对于剂型， 可使用广泛用
     于通常的药剂的添加剂作为口服给药用药物载体， 如赋形剂、 结合剂、 崩解剂、 润滑剂、 稳定 剂、 矫味剂 (corrigent)、 稀释剂和表面活性剂。另外， 除非本发明的效果降低， 否则 miRNA 可与另一具有免疫调节作用的药物一起使用。
     尽管包含于药剂中的 miRNA 的量不特别限定， 但其总计例如为 2μg/kg 至 2mg/kg， 优选 4μg/kg 至 2mg/kg， 更优选 10μg/kg 至 2mg/kg。
     当口服摄取用组合物为食品时， 其可用于利用免疫增强作用的任何各种用途。所 述用途的实例包括， 例如作为适用于显示抵抗力低下人群的食品的用途和作为用于降低或 消除由免疫低下引起的各种疾病的风险因素的食品或饮品的用途等。
     本发明的食品或饮品可作为食品出售， 并附有描述该食品用于免疫调节的指示。
     前述术语 “指示” 包括告知消费者前述用途的所有行为， 并且任何提醒或类推前述 用途的指示落入本发明 “指示” 的范围内， 而不管指示的目的、 内容、 对象物、 媒体等如何。 然而， 所述指示优选用允许消费者直接识别前述用途的表述制成。具体实例包括在与本发 明的食品相关的商品或商品包装上指示前述用途的行为， 在上面指示了前述用途的该商品 或商品的包装的分派 (assigning)、 交付 (delivering)、 为分派、 交付目的的展示或进口行 为， 或者与商品相关的展示或分配广告、 价格表或商业单据 (business papers)、 或者通过 电磁法 ( 互联网等 ) 提供包括作为指示前述用途的内容的那些信息等的行为。 所述指示优选为经行政机构等批准的指示 ( 例如， 基于认可的形式的指示， 该认 可基于由行政机构提供的各种法律制度之一而授权 )， 特别优选在销售现场在广告材料上 的指示， 例如包装、 容器、 目录、 宣传册和 POP 及其他文件等。
     所述指示的实例进一步包括， 例如， 作为健康食品、 功能性食品、 肠道营养食品、 特膳用途食品 (food for special dietary uses)、 具有营养功能声明的食品和准药 (quasi-drug) 等的指示， 以及经卫生部、 厚生劳动省 (Labor and Welfare) 批准的指示， 例 如基于特定保健用食品 (food for specified health uses) 体系及类似体系而批准的指 示。后者的实例包括作为特定保健用食品的指示、 作为具有授权的保健声明的特定保健用 食品的指示、 影响身体结构和功能的指示和减少疾病风险声明的指示等， 更精确地， 典型的 实例包括在健康促进法 (Health Promotion Law) 实施条例 ( 日本卫生部、 厚生劳动省内部 条例第 86 号， 2003 年 4 月 30 日 ) 中提供的作为特定保健用食品的指示 ( 特别是用于保健 的指示 ) 以及类似的指示。
     实施例
     以下将参考实施例进一步详细解释本发明。 然而， 本发明不受以下实施例的限定。
     实施例 1 ： 母乳中 miRNA 的分析
     将人母乳在 2,000×g 下离心 10 分钟以移除细胞和大沉淀物， 进一步将除构成表 层的脂质外的上清液在 12,000×g 下离心 30 分钟以移除细胞碎片和细胞尘 (dust)。使用 mirVana miRNA 分离试剂盒根据制造商的实验步骤 (protocol) 从上清液中提取总 RNA。来 自血清的 RNA 的提取以与对于母乳使用的相同的方式进行。
     通过使用生物分析仪来分析提取的 RNA。 尽管相当大量的 RNA 包含于母乳中， 但几 乎不包含或根本不包含核糖体 RNA(18S rRNA、 28S rRNA)。
     通过使用微阵列分析系统 ( 使用由 Agilent Technologies 生产的系统 ) 来检测 miRNA。通过使用 Gene Spring GX11.0( 由 Agilent Technologies 生产 ) 分析 miRNA 的表
     达水平。结果示于图 1。结果， 以显著水平检测出 miR-181a、 miR-181b、 miR-155、 miR-125b、 miR-146b、 miR-223 和 let-7i。无法检出控制 T 细胞和 B 细胞的 miR-150。另外， 几乎不能 检测出多器官特异的 miRNA 如 miR-122( 肝脏 )、 miR-216、 miR-217( 胰腺 )、 miR-142-5p、 miR-142-3p( 造血细胞 )。此外， 检出小量 miR-124( 脑 )。
     通过定量 RT-PCR 分析的出生后前六个月 (n ＝ 5) 和接下来的六个月 (n ＝ 13) 的 母乳中的 miR-181a 水平的比较结果示于图 2。对 miR-155、 miR-17 和 miR-92a 进行的类 似分析的结果也示于图 3 中。为了使由 RNA 分离过程诱导的样品中的变化标准化， 将变性 的 cel-miR-39( 由 Qiagen 合成 )( 为线虫 ( 秀丽隐杆线虫 ) 的合成 miRNA) 添加到样品中 (5ml 总体积中寡核苷酸量为 25fmol)， miRNA 的量作为基于 cel-miR-39 的量的相对量来示 出 ( 以下实验应同样应用 )。
     结果， 出生后前六个月的乳与接下来六个月的乳相比 miR-181a 的量较大 ( 图 2)。 对于 miR-155、 miR-17 和 miR-92a 也观察到类似的趋势 ( 图 3)。
     作为 RT-PCR 用引物， 使用由 Applied Biosystems 生产并由以下 Assay ID 鉴定的 那些。
     -miR-181a ： 000480
     -miR-155 ： 002623
     -miR-17 ： 002308
     -miR-92a ： 000431
     -Cel-miR-39 ： 000200
     产后 6 个月内七名健康人的母乳和血清中与免疫相关的 miRNA 水平的比较结果示 于图 4( 母乳 ： n ＝ 5、 血清 ： n ＝ 6)。母乳中 miRNA 谱不同于血清中的那些。例如， 控制粒细 胞的 miRNAmiR-223 在正常人血清和血浆中以最高水平存在， 然而与血清中的相比其在母 乳中的表达量极低。另外， 不大量存在于血清中的 miR-146b 却大量地存在于母乳中。
     另一方面， 与血清中所观察到的那些相比， 在表达量上母乳中大量存在 miR-181 和 miR-155。 有趣的是， 在产后六个月 ( 其为婴儿食品摄入前的阶段 ) 的母乳中高度表达多 种免疫相关的 miRNA。
     miRNA 的细胞间转移表明 miRNA 不仅控制细胞内分子， 还是在细胞间通讯中像 细胞因子一样起作用的分子。前述结果表明 miRNA 为可从母体转移至孩子的 “遗传物质 7 (genetic materal)” 。据计算， 约 0.15pg/L/ 天 (1.3×10 个拷贝 /L/ 天 ) 的 miR-181 经 母乳被婴儿摄取。
     此外， 作为聚类分析的结果， 已发现不同母亲的母乳的 miRNA 谱是相似的。
     实施例 2 ： miRNA 的物理化学性质
     将母乳在室温下静置 24 小时， 或反复进行冷冻 (-20 ℃ ) 和融解至 3 次。通过 TaqMan qRT-PCR 测定 miRNA(miR-21、 miR-181a) 的水平。结果示于图 5。另外， 在低 pH 溶 液 (pH 1) 中处理母乳 3 小时， 用 TaqMan qRT-PCR 测定处理前后 miRNA(miR-181a) 的水平。 结果示于图 6。
     另外， 将 RNase A/T 溶液 (RNase A(500U/ml) 和 RNaseT1(20,000U/ml) 的混合溶 液， 由 Ambion 生产 ) 以母乳的 2％体积加入母乳中， 37℃下处理混合物 3 小时， 通过 TaqMan qRT-PCR 测定处理前后 miRNA(miR-181a) 的水平。结果示于图 7。作为用于 TaqMan qRT-PCR 的引物， 使用由 Applied Biosystems 生产并由以下 Assay ID 鉴定的那些。
     -miR-181a ： 000480
     -miR-21 ： 000397
     -Cel-miR-39 ： 000200
     证实 miRNA 对冻融、 低 pH 和 RNase 相对稳定。
     实施例 3 ： 产生具有免疫调节作用的乳的食物或物质的鉴定
     购买怀孕 9 至 10 天的 SD 大鼠， 在怀孕 13 至 20 天期间， 以每只大鼠 1ml/ 天的 体积将双歧杆菌属细菌、 长双歧杆菌 BB536(ATCC BAA-999) 的 PBS( 磷酸盐缓冲盐水 ) 9 (1×10 cfu/ml) 悬浮液给药到试验组 (n ＝ 3) 的大鼠。
     另外， 作为对照组 (n ＝ 3)， 以每只大鼠 1ml 每天的体积给药 PB S。长双歧杆 菌 (B.longum)AT CC BAA-999 菌株可从美国模式培养物集存库 (American Type Culture Collection) 购买 ( 地址 ： 12301 Parklawn Drive， 罗克维尔市， 马里兰州 20852， 美国 )。
     所有大鼠在怀孕 21 天时产仔， 并且在其分娩后第一天在用乙醚麻醉下产奶。所获 初乳样品离心两次来移除脂质层和细胞碎片， 离心条件为 1,200×g、 4℃、 10 分钟。
     随后， 在 21,500×g 和 4 ℃下离心上清液 40 分钟， 并进一步在相同条件下离心 1 小时来移除酪蛋白组分， 从而获得乳清。通过使用 miRNeasy 迷你试剂盒 (Mini Kit)( 由 Qiagen 生产 ) 从所获乳清样品中获得总 RNA。
     通过使用 100ng 所获 RNA 样品， 使用微阵列系统 ( 由 Agilent Technologie s 生 产 ) 以常规方式检测 miRNA。通过使用 GeneSpring GX11.0( 由 Agilent Technologies 生 产 ) 分析结果。
     当通过使用 Gene Spring G X11.0 进行微阵列数据的统计学分析时， 发现在检测 微小 RNA 的试验组和对照组中已证实表达的微小 RNA 的类型数总计为 155。这些微小 RNA 如下所示。此外， 未检出 miR-150。
     在试验组和对照组中证实表达的微小 RNA， 155 种 ：
     miR-16、 miR-17-5p、 miR-18(miR-18a)、 miR-19(miR-19b)、 miR-20(miR-20a)、 miR-21 、 miR-23(miR-23a) 、 miR-27(miR-27a 、 miR-27b) 、 miR-29(miR-29a 、 miR-29b 、 miR-29c、 miR-29c*)、 miR-30(miR-30a、 miR-30c、 miR-30d、 miR-30e*)、 miR-33、 miR-34b、 miR-92a、 miR-93、 miR-100、 miR-101(miR-101a、 miR-101b)、 miR-106b、 miR-130b、 miR-140*、 miR-141、 miR-143、 miR-146a、 miR-185、 miR-186、 miR-192、 miR-193、 miR-195、 miR-200a、 miR-205、 miR-218、 miR-219-5p、 miR-221、 miR-301a、 miR-322、 miR-340-5p、 miR-361、 miR-429、 miR-455、 miR-466b、 miR-497、 miR-500、 miR-503、 miR-532-5p、 miR-542-3p
     let-7a 、let-7a* 、let-7b 、let-7c 、let-7d 、le-7e 、let-7f 、let-7i 、 miR-10(miR-10a-5p、 miR-10b)、 miR-15(miR-15b)、 miR-19(miR-19a)、 miR-20(miR-20a*)、 miR-22 、 miR-23(miR-23b) 、 miR-24 、 miR-25 、 miR-26(miR-26a ， miR-26b) 、 miR-28 、 miR-30(miR-30a* 、miR-30b-5p 、miR-30c-1* 、miR-30c-2* 、miR-30e) 、miR-31 、 miR-34(miR-34a) 、 miR-96 、 miR-98 、 miR-99(miR-99a 、 miR-99b) 、 miR-103 、 miR-107 、 miR-125(miR-125a-3p 、miR-125a-5p 、miR-125b-3p 、miR-125b-5p) 、miR-128 、 miR-130(miR-130a)、 miR-133(miR-133a、 miR-133b)、 miR-134、 miR-139(miR-139-3p)、m i R - 1 4 0 、m i R - 1 4 6 ( m i R - 1 4 6 b ) 、m i R - 1 4 8 ( m i R - 1 4 8 b - 3 p ) 、m i R - 1 5 1 、m i R - 1 5 2 、 miR-181(miR-181a、 miR-181a*、 miR-181b、 miR-181c、 miR-181d)、 miR-182、 miR-183、 miR-188、 miR-196(miR-196c)、 miR-199(miR-199a-3p)、 miR-200(miR-200b、 miR-200c)、 miR-203、 miR-204、 miR-206、 miR-210、 miR-212、 miR-214、 miR-222、 miR-223、 miR-290、 miR-291(miR-291a-5p)、 miR-292(miR-292-5p)、 miR-294、 miR-296(miR-296*)、 miR-320、 miR-324(miR-324-3p 、 miR-324-5p)、 miR-327、 miR-328、 miR-331、 miR-340(miR-340-3p)、 miR-341、 miR-342(miR-342-3p)、 miR-345(miR-345-5p)、 miR-347、 miR-352、 miR-365、 miR-370、 miR-375、 miR-378(miR-378、 miR-378*)、 miR-425、 miR-465、 miR-483、 miR-484、 miR-494、 miR-542(miR-542-5p)、 miR-652、 miR-672、 miR-685、 miR-760(miR-760-3p)、 miR-872、 miR-874、 miR-1224
     在 miR- 序号后带括号说明的所列 miRNA 具有亚型， 括号内所说明的亚型实际表 达。
     另外， 当通过使用曼 - 惠特尼 U 检验 (Mann-Whitney U-test) 在统计学上比较双 歧杆菌属细菌 BB 536 给药组和对照组中前述微小 RNA 的表达量时， 发现以下 52 种微小 RNA 类型在双歧杆菌属细菌 BB 536 给药组中以小于 5％的概率水平增加。 所述 miRNA 在表达上 的变化倍率示于表 11。
     在双歧杆菌属细菌 BB 536 给药组中证实增加的微小 RNA， 52 种 ：
     miR-16、 miR-17-5p、 miR-18(miR-18a)、 miR-19(miR-19b)、 miR-20(miR-20a)、 miR-21 、 miR-23(miR-23a) 、 miR-27(miR-27a 、 miR-27b) 、 miR-29(miR-29a 、 miR-29b 、 miR-29c、 miR-29c*)、 miR-30(miR-30a、 miR-30c、 miR-30d、 miR-30e*)、 miR-33、 miR-34b、 miR-92a、 miR-93、 miR-100、 miR-101(miR-101a、 miR-101b)、 miR-106b、 miR-130b、 miR-140*、 miR-141、 miR-143、 miR-146a、 miR-185、 miR-186、 miR-192、 miR-193、 miR-195、 miR-200a、 miR-205、 miR-218、 miR-219-5p、 miR-221、 miR-301a、 miR-322、 miR-340-5p、 miR-361、 miR-429、 miR-455、 miR-466b、 miR-497、 miR-500、 miR-503、 miR-532-5p、 miR-542-3p
     表 11
     从表 11 所示结果可看出， 发现对于证实增加的所有 52 种微小 RNA 观察到的变化 倍率为 1.2 倍以上。
     即， 发现基于这样的 52 种微小 RNA 的检测可将双歧杆菌属细菌 BB 536 菌株筛选 为产生具有免疫调节作用的乳的食物或物质。
     实施例 4 ： 大鼠初乳中表达的微小 RNA 的检测
     购买三只怀孕 14 天的 F344 大鼠。所有购买的大鼠在怀孕 21 天时产仔， 并且在其 分娩后第二天在乙醚麻醉下产奶以收集初乳。
     各初乳样品在 1,200×g 和 4℃下离心 10 分钟两次来移除脂质层和细胞碎片。
     随后， 在 21,500×g 和 4℃下离心上清液 40 分钟， 并进一步在相同条件下离心 1 小 时来移除酪蛋白组分， 从而获得乳清。
     通过使用 miRNeasy 迷你试剂盒 ( 由 Qiagen 生产 ) 从所获乳清样品中获得总 RNA。
     将 100ng 的量的所获 RNA 样品以常规方式用于微阵列 ( 由 Agilent Technologies 生产 ) 实验。通过使用 GeneSpring GX11.0( 由 Agilent Technologies 生产 ) 分析微阵列 实验结果。
     结 果， 证 实 除 了 在 实 施 例 3 中 证 实 的 155 种 微 小 RNA 外， 还表达四种微小 RNA(miR-193*、 miR-409-3p、 miR-664、 miR-877)。
     实施例 5 ： 牛初乳中表达的微小 RNA 的检测 准备产后 1 至 3 天的荷斯坦牛 (Holstein cow) 的五个乳样品作为初乳样品。另 外， 准备产后 8 天至 8 个月的荷斯坦牛的五个乳样品作为正常乳样品。
     各乳样品 ( 初乳和正常乳 ) 在 1,200×g 和 4℃下离心 10 分钟两次来移除脂质层 和细胞碎片。
     随后， 在 21,500×g 和 4℃下离心上清液 40 分钟， 并进一步在相同条件下离心 1 小 时来移除酪蛋白组分， 从而获得乳清。
     通过使用 miRNeasy 迷你试剂盒 ( 由 Qiagen 生产 ) 从所获乳清样品中获得总 RNA。
     将 20ng 的量的所获 RNA 样品以常规方式用于微阵列 ( 由 Agilent Technologies 生产 ) 实验。通过使用 GeneSpringGX11.0( 由 Agilent Technologies 生产 ) 分析微阵列 实验结果。
     结果， 在初乳样品和正常乳样品中证实总计表达 102 种 miRNA。特别地， 在该 102 种 miRNA 中， 证实 49 种 miRNA 仅在初乳中表达。
     证实仅在初乳中表达的 49 种微小 RNA 如下所述。
     证实仅在初乳中表达的微小 RNA， 49 种 ：
     let-7d、 let-7i、 miR-15a、 miR-15b、 miR-16b、 miR-17-3p、 miR-19b、 miR-21、 miR-23b-3p、 miR-24-3p、 miR-26b、 miR-27b、 miR-30a-5p、 miR-30c、 miR-30f、 miR-34a、 miR-99a、 miR-106、 miR-106b、 miR-107、 miR-125b、 miR-126、 miR-129-3p、 miR-130a、 miR-130b、 miR-140、 miR-155、 miR-181b、 miR-184、 miR-193a-3p、 miR-193a-5p、 miR-196a、 miR-210、 miR-222、 miR-223、 miR-338、 miR-361、 miR-362-5p、 miR-370、 miR-429、 miR-452、 miR-486、 miR-500、 miR-532、 miR-584、 miR-708、 miR-877、 miR-1300b、 miR-1307
     产业上的可利用性
     根据本发明， 可筛选产生具有免疫调节作用的乳的食物或包含于其中的物质。本 发明还提供生产具有免疫调节作用的乳制品的方法。 本发明的口服摄取用组合物具有免疫 增强作用， 并特别适用于婴儿。
     背景技术 生物体免疫基本上是为了对抗外来攻击的 “防御” 目的而起作用。例如， 相当于所 述 “防御” 的癌细胞的防御和消除， 和在此情况中有效作用的免疫的增强。
     另 一 方 面， 免 疫 的 反 应 过 度， 即 “超 免 疫” ， 可 不 利 地 影 响 生 物 体。 其 实 例 包 括过敏反应、 自身免疫病和慢性炎症等。已知， 在这种情况下， 通过抑制炎性细胞因子 (inflammatory cytokines) 如 IL-6、 TNF-α 和 IL-1 的产生来改善症状。
     另外， 逐渐变的明确的是， 为了对抗外来攻击的 “防御” 目的而起作用的免疫增强 作用和为了抑制由超免疫反应诱导的过敏反应、 自身免疫病、 慢性炎症等而起作用的免疫 抑制作用受到微小 RNA(microRNA)( 下文还简称为 “miRNA” ) 的调节。
     另 一 方 面， 免 疫 的 反 应 过 度， 即 “超 免 疫” ， 可 不 利 地 影 响 生 物 体。 其 实 例 包 括过敏反应、 自身免疫病和慢性炎症等。已知， 在这种情况下， 通过抑制炎性细胞因子 (inflammatory cytokines) 如 IL-6、 TNF-α 和 IL-1 的产生来改善症状。
     另外， 逐渐变的明确的是， 为了对抗外来攻击的 “防御” 目的而起作用的免疫增强 作用和为了抑制由超免疫反应诱导的过敏反应、 自身免疫病、 慢性炎症等而起作用的免疫 抑制作用受到微小 RNA(microRNA)( 下文还简称为 “miRNA” ) 的调节。
    在 miRNA 从基因组转录后， 其进行两次切割变为约 22 个碱基的非编码小 RNA。已 知， 作为其功能， miRNA 以序列互补的方式结合至靶 mRNA 的 3′非翻译区来抑制靶 mRNA 的 翻译。一种 miRNA 抑制细胞中多种 mRNA 的翻译从而调节细胞的各种功能。特别是对其与 癌症发生和进展的关系已进行许多报道， 并且 miRNA 和疾病间的关系引起了关注。
     例如， 就 miR-181 而言， 已报道其涉及 B 细胞的发育、 T 细胞的活化以及免疫的发 育 ( 非专利文献 1 至 3)。
     就 miR-155 而言， 已知其通过活化先天免疫 ( 非专利文献 1 和 4) 和调节 T 细胞和 B 细胞的分化和功能 ( 非专利文献 1 和 5) 涉及免疫发育， 通过， 其通过调节 Th1/Th2 平衡 ( 非专利文献 1 和 6) 以及维持调节 T 细胞 ( 其抑制超免疫反应 ) 的功能 ( 非专利文献 7) 涉及抗过敏和抗炎作用。
     miR-17 和 miR-92 协同调节 B 细胞和 T 细胞的分化和发育， 从而参与免疫发育 ( 非 专利文献 1、 8 和 9)。
     已知 miR-223 通过控制嗜中性粒细胞的增殖和活化参与防御 ( 非专利文献 1 和 10)， miR-150 通过抑制 B 细胞的分化参与防御 ( 非专利文献 1 和 11)， 以及 let-7i 通过控 制胆管细胞中 TLR4 的表达参与防御 ( 非专利文献 12)。
     已知 miR-125 通过抑制 TNF-α 的产生参与抗炎作用 ( 非专利文献 1 和 13)。
     已知 miR-146 通过负调控先天免疫参与防御 ( 非专利文献 1 和 14)， 并且通过控制 Th 1/Th2 平衡参与抗过敏 ( 非专利文献 15)。
     最近已报道在细胞内作为翻译调节分子而起作用的 miRNA 存在于称为外泌体 (exo some) 的脂双层内， 并分泌出细胞 ( 非专利文献 16)。由于还证实分泌的 miRNA 被其 他细胞所吸收， 提示存在依靠 miRNA 的细胞间相互作用。另外， 已知外泌体存在于各种人体 体液中。特别地， 已报道在人血浆和血清中存在 miRNA， 已提出其作为前列腺癌或子宫癌的 生物标记的可能用途 ( 非专利文献 17)。
     例如， 就 miR-181 而言， 已报道其涉及 B 细胞的发育、 T 细胞的活化以及免疫的发 育 ( 非专利文献 1 至 3)。
     就 miR-155 而言， 已知其通过活化先天免疫 ( 非专利文献 1 和 4) 和调节 T 细胞和 B 细胞的分化和功能 ( 非专利文献 1 和 5) 涉及免疫发育， 通过， 其通过调节 Th1/Th2 平衡 ( 非专利文献 1 和 6) 以及维持调节 T 细胞 ( 其抑制超免疫反应 ) 的功能 ( 非专利文献 7) 涉及抗过敏和抗炎作用。
     miR-17 和 miR-92 协同调节 B 细胞和 T 细胞的分化和发育， 从而参与免疫发育 ( 非 专利文献 1、 8 和 9)。
     已知 miR-223 通过控制嗜中性粒细胞的增殖和活化参与防御 ( 非专利文献 1 和 10)， miR-150 通过抑制 B 细胞的分化参与防御 ( 非专利文献 1 和 11)， 以及 let-7i 通过控 制胆管细胞中 TLR4 的表达参与防御 ( 非专利文献 12)。
     已知 miR-125 通过抑制 TNF-α 的产生参与抗炎作用 ( 非专利文献 1 和 13)。
     已知 miR-146 通过负调控先天免疫参与防御 ( 非专利文献 1 和 14)， 并且通过控制 Th 1/Th2 平衡参与抗过敏 ( 非专利文献 15)。
     最近已报道在细胞内作为翻译调节分子而起作用的 miRNA 存在于称为外泌体 (exo some) 的脂双层内， 并分泌出细胞 ( 非专利文献 16)。由于还证实分泌的 miRNA 被其 他细胞所吸收， 提示存在依靠 miRNA 的细胞间相互作用。另外， 已知外泌体存在于各种人体 体液中。特别地， 已报道在人血浆和血清中存在 miRNA， 已提出其作为前列腺癌或子宫癌的 生物标记的可能用途 ( 非专利文献 17)。
     除血浆和血清外， 包含外泌体的体液包括唾液、 尿、 羊水和母乳 ( 非专利文献 17)。 在这些中， 母乳是由哺乳动物在特定时期产生的体液， 并负责个体间即母婴间物质的转移。 此外， 母乳不仅是孩子的营养补给， 而且还将母体获得的免疫物质给予孩子。
     母乳包含分泌型 IgA、 乳铁蛋白、 溶菌酶和细胞因子等， 母乳被认为保护婴儿免受 感染， 并促进婴儿的免疫发育 ( 非专利文献 19)。 实际上， 已知依靠母乳成长的孩子， 与不以 此方式成长的孩子， 涉及较低的支气管或肠道感染的风险。母乳包含显示抗菌活性的 IgA、 乳铁蛋白、 糖蛋白、 糖脂等， 以及调节免疫细胞的细胞因子。 然而， 迄今研究中分析的对象主 要为包含于母乳中的蛋白质， 尽管有关于包含于母乳中的核酸的报道， 但对包含于母乳并 具有特定序列的核酸的研究还未报道。
     此外， 还已知受环氧酶 2 表达控制的乳腺细胞 (mammaryglandular cell) 的发育 是由 miR-101a 调节的 ( 非专利文献 20)。然而， 这并不表明 miRNA 存在于乳中。
     另 外， 在本 申请的优 先权日 后， 有报 道称微 小 RNA 存 在于来 源 于牛乳 的 微 泡 (microve sicle) 中 ( 非专利文献 21)， 并且在不同哺乳期的新鲜牛乳、 商购液体乳和奶粉 中鉴定出微小 RNA( 非专利文献 22)。
     现有技术文献
     [ 非专利文献 ]
     非专利文献 1 ： Lindsay， M.A.， Trends Immunol， 29 ： 343-351， 2008
     非专利文献 2 ： Li， Qi-Jing 等人， Cell， 129 ： 147-161， 2007
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     非 专 利 文 献 12 ： Chen， Xian-Ming 等 人， J.Biol.Chem.， 282(39) ： 28929-28938， 2007
     非专利文献 13 ： Tili， E. 等人， J.Immunol.， 179 ： 5082-5089， 2007
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     非专利文献 18 ： Admyre， C.， J.Immunol.， 179 ： 1969-1978， 2007
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     本发明的目的为提供产生具有免疫调节作用的乳的食物的筛选方法、 一种具有免 疫调节作用的新型食品及其生产方法。
     用于解决问题的方案
     本发明的发明人根据注意到母乳影响婴儿免疫系统成熟的事实进行了研究。结 果， 他们发现与免疫相关的 miRNA 在母乳中高度表达， 并且完成了本发明。
     因此本发明提供食物或物质的筛选方法， 所述食物或物质产生具有免疫调节作用 的母乳， 所述方法包括通过利用乳中微小 RNA 谱 (profile) 与由哺乳动物摄取的食物或包 含于所述食物中的物质的相关性作为指标来鉴定使存在于所述哺乳动物乳中的微小 RNA 的量增加或减少的所述食物或物质。
     在前述方法的实施方案中， 所述免疫调节作用为免疫增强作用， 并且当微小 RNA 的量增加时， 判定为所述食物或物质产生具有免疫增强作用的母乳。
    在前述方法的优选实施方案中， 比较食物摄取前后所观察到的乳中的微小 RNA 谱， 并且当摄取后所观察到的至少一种微小 RNA 的量高于摄取前所观察到的量时， 判定所 述食物使所述乳中的所述微小 RNA 的量增加。
     在前述方法的另一优选实施方案中， 比较所述乳中的微小 RNA 谱和血清或血浆中 的微小 RNA 谱， 当包含于所述乳和所述血清或血浆二者中的微小 RNA 的存在量在摄取所述 食物后使包含于所述乳中的微小 RNA 的存在量是所述血清或血浆中的微小 RNA 的存在量的 1.2 倍以上时， 判定所述食物使所述乳中的所述微小 RNA 的量增加。
     在前述方法的另一实施方案中， 所述免疫调节作用为免疫抑制作用， 并且当所述 微小 RNA 的量减少时， 判定所述食物或物质产生具有免疫抑制作用的母乳。
     在前述方法的优选实施方案中， 比较所述食物摄取前后所观察到的所述乳中的微 小 RNA 谱， 并且当摄取后所观察到的至少一种微小 RNA 的量低于摄取前所观察到的量时， 判 定所述食物使所述乳中的所述微小 RNA 的量减少。
     在前述方法的优选实施方案中， 比较所述乳中的微小 RNA 谱和血清或血浆中的微 小 RNA 谱， 当包含于所述乳和所述血清或血浆二者中的微小 RNA 的存在量在摄取所述食物 后使所述乳中的微小 RNA 的存在量为在血清或血浆中的微小 RNA 的存在量的 0.8 倍以下 时， 判定所述食物使所述乳中的所述微小 RNA 的量减少。
     在前述方法的优选实施方案中， 所述哺乳动物为人类。
     在前述方法的优选实施方案中， 所述微小 RNA 谱由微小 RNA 的量组成， 所述微 小 RNA 选自由以下组成的组 ： miR-10、 miR-15、 miR-16、 miR-17、 miR-18、 miR-19、 miR-20、 miR-21、 miR-22、 miR-23、 miR-24、 miR-25、 miR-26、 miR-27、 miR-28、 miR-29、 miR-30、 miR-31、 miR-33、 miR-34、 miR-92、 miR-93、 miR-96、 miR-98、 miR-99、 miR-100、 miR-101、 miR-103、 miR-106、 miR-107、 miR-125、 miR-126、 miR-128、 miR-129、 miR-130、 miR-133、 miR-134、 miR-139、 miR-140、 miR-141、 miR-143、 miR-146、 miR-148、 miR-151、 miR-152、 miR-155、 miR-181、 miR-182、 miR-183、 miR-184、 miR-185、 miR-186、 miR-188、 miR-192、 miR-193、
     miR-195、 miR-196、 miR-199、 miR-200、 miR-203、 miR-204、 miR-205、 miR-206、 miR-210、 miR-212、 miR-214、 miR-218、 miR-219、 miR-221、 miR-222、 miR-223、 miR-290、 miR-291、 miR-292、 miR-294、 miR-296、 miR-301、 miR-320、 miR-322、 miR-324、 miR-327、 miR-328、 miR-331、 miR-338、 miR-340、 miR-341、 miR-342、 miR-345、 miR-347、 miR-352、 miR-361、 miR-362、 miR-365、 miR-370、 miR-375、 miR-378、 miR-409、 miR-425、 miR-429、 miR-452、 miR-455、 miR-465、 miR-466、 miR-483、 mi R-484、 miR-486、 miR-494、 miR-497、 miR-500、 miR-503、 miR-532、 miR-542、 miR-584、 miR-652、 miR-664、 miR-672、 miR-685、 miR-708、 miR-760、 miR-872、 miR-874、 miR-877、 miR-1224、 miR-1300、 miR-1307、 let-7a、 let-7b、 let-7c、 let-7d、 le-7e、 let-7f 和 let-7i。
     在前述方法的优选实施方案中， 所述微小 RNA 谱由微小 RNA 的量组成， 所述微 小 RNA 选自由以下组成的组 ： miR-15、 miR-16、 miR-17、 miR-18、 miR-19、 miR-20、 miR-21、 miR-23、 miR-24、 miR-26、 miR-27、 miR-29、 miR-30、 miR-33、 miR-34、 miR-92、 miR-93、 miR-99、 miR-100、 miR-101、 miR-106、 miR-107、 miR-125、 miR-130、 miR-140、 miR-141、 miR-143、 miR-146、 miR-155、 miR-181、 miR-185、 miR-186、 miR-192、 miR-193、 miR-195、 miR-200、 miR-205、 miR-210、 miR-218、 miR-219、 miR-221、 miR-222、 miR-223、 miR-301、 miR-322、 miR-340、 miR-361、 miR-370、 miR-429、 miR-455、 miR-466、 miR-497、 miR-500、 miR-503、 miR-532、 miR-542、 let-7d 和 let-7i。 在前述方法的优选实施方案中， 所述微小 RNA 谱由微小 RNA 的量组成， 所述微 小 RNA 选自由以下组成的组 ： miR-15、 miR-16、 miR-19、 miR-21、 miR-23、 miR-24、 miR-26、 miR-27、 miR-30、 miR-34、 miR-99、 miR-106、 miR-107、 miR-125、 miR-130、 miR-140、 miR-181、 miR-193、 miR-210、 miR-222、 miR-223、 miR-361、 miR-370、 miR-429、 miR-500、 miR-532、 let-7d 和 let-7i。
     本发明还提供一种生产具有免疫调节作用的乳或乳制品的方法， 其包括给予哺乳 动物 ( 除人以外 ) 食物或物质的步骤， 所述食物或物质通过前述筛选方法被鉴定为使所述 哺乳动物的乳中微小 RNA 的量增加或减少， 以及收集所述哺乳动物的乳的步骤。
     在前述方法的实施方案中， 所述免疫调节作用为免疫增强作用， 并且将所述食物 或物质鉴定为使所述微小 RNA 的量增加。
     在前述方法的实施方案中， 所述免疫调节作用为免疫抑制作用， 并且将所述食物 或物质鉴定为使所述微小 RNA 的量减少。
     本发明还提供一种具有免疫增强作用的口服摄取用组合物， 其包括口服摄取用组 合物的基质和添加至所述基质的微小 RNA。
     在 所 述 口 服 摄 取 用 组 合 物 的 优 选 实 施 方 案 中， 所 述 微 小 RNA 选 自 由 miR-10、 miR-15、 miR-16、 miR-17、 miR-18、 miR-19、 miR-20、 miR-21、 miR-22、 miR-23、 miR-24、 miR-25、 miR-26、 miR-27、 miR-28、 miR-29、 miR-30、 miR-31、 miR-33、 miR-34、 miR-92、 miR-93、 miR-96、 miR-98、 miR-99、 miR-100、 miR-101、 miR-103、 miR-106、 miR-107、 miR-125、 miR-126、 miR-128、 miR-129、 miR-130、 miR-133、 miR-134、 miR-139、 miR-140、 miR-141、 miR-143、 miR-146、 miR-148、 miR-151、 miR-152、 miR-155、 miR-181、 miR-182、 miR-183、 miR-184、 miR-185、 miR-186、 miR-188、 miR-192、 miR-193、 miR-195、 miR-196、 miR-199、 miR-200、 miR-203、 miR-204、 miR-205、 miR-206、 miR-210、 miR-212、 miR-214、 miR-218、 miR-219、
     miR-221、 miR-222、 miR-223、 miR-290、 miR-291、 miR-292、 miR-294、 miR-296、 miR-301、 miR-320、 miR-322、 miR-324、 miR-327、 miR-328、 miR-331、 miR-338、 miR-340、 miR-341、 miR-342、 miR-345、 miR-347、 miR-352、 miR-361、 miR-362、 miR-365、 miR-370、 miR-375、 miR-378、 miR-409、 miR-425、 miR-429、 miR-452、 miR-455、 miR-465、 miR-466、 miR-483、 miR-484、 miR-486、 miR-494、 miR-497、 miR-500、 miR-503、 miR-532、 miR-542、 miR-584、 miR-652、 miR-664、 miR-672、 miR-685、 mi R-708、 miR-760、 miR-872、 miR-874、 miR-877、 miR-1224、 miR-1300、 miR-1307、 let-7a、 let-7b、 let-7c、 let-7d、 le-7e、 let-7f 和 let-7i 组成的组。
     在 所 述 口 服 摄 取 用 组 合 物 的 优 选 实 施 方 案 中， 所 述 微 小 RNA 选 自 由 miR-15、 miR-16、 miR-17、 miR-18、 miR-19、 miR-20、 miR-21、 miR-23、 miR-24、 miR-26、 miR-27、 miR-29、 miR-30、 miR-33、 miR-34、 miR-92、 miR-93、 miR-99、 miR-100、 miR-101、 miR-106、 miR-107、 miR-125、 miR-130、 miR-140、 miR-141、 miR-143、 miR-146、 miR-155、 miR-181、 miR-185、 miR-186、 miR-192、 miR-193、 miR-195、 miR-200、 miR-205、 miR-210、 miR-218、 miR-219、 miR-221、 miR-222、 miR-223、 miR-301、 miR-322、 miR-340、 miR-361、 miR-370、 miR-429、 miR-455、 miR-466、 miR-497、 miR-500、 miR-503、 miR-532、 miR-542、 let-7d 和 let-7i 组成 的组。 在 所 述 口 服 摄 取 用 组 合 物 的 优 选 实 施 方 案 中， 所 述 微 小 RNA 选 自 由 miR-15、 miR-16、 miR-19、 miR-21、 miR-23、 miR-24、 miR-26、 miR-27、 miR-30、 miR-34、 miR-99、 miR-106、 miR-107、 miR-125、 miR-130、 miR-140、 miR-181、 miR-193、 miR-210、 miR-222、 miR-223、 miR-361、 miR-370、 miR-429、 miR-500、 miR-532、 let-7d 和 let-7i 组成的组。
     在所述口服摄取用组合物的优选实施方案中， 所述组合物为婴儿用食品或幼儿用 食品。
     在所述口服摄取用组合物的优选实施方案中， 所述婴儿用食品或幼儿用食品为婴 儿配方 (formula) 或较大婴儿配方 (follow-up formula)。
    【附图说明】
    图 1 示出通过微阵列分析 (microarray analysis) 获得的人母乳中 miRNA 的检测结果。 图 2 示出出生后前六个月和其后六个月的母乳中 miR-181a 水平的比较。 hsa 表示 人类， cel 表示线虫 ( 秀丽隐杆线虫 Caenorhabditis elegans)( 下图应同样应用 )。
     图 3 示出出生后前六个月和其后六个月的母乳中 miR-155、 miR-17 和 miR-92 水平 的比较。
     图 4 示出人母乳和血清中免疫相关 miRNA 水平的比较
     图 5 示出冻融前后所观察到的 miRNA 水平的比较。
     图 6 示出低 pH(pH1) 下保存前后所观察到的 miRNA 水平的比较。
     图 7 示出 RNase 处理后和无 RNase 处理所观察到的 miRNA 水平的比较。
    具体实施方式
     本发明的方法为食物或物质的筛选方法， 所述食物或物质产生具有免疫调节作用的母乳， 所述筛选方法包括基于乳中的微小 RNA 谱与哺乳动物摄取的食物或包含于所述食 物中的物质的相关性来鉴定使存在于哺乳动物乳中的微小 RNA 的量增加或减少的所述食 物或物质。
     在本发明的前述方法的实施方案中， 所述免疫调节作用为免疫增强作用， 并且当 微小 RNA 的量增加时， 判定所述食物或物质产生具有免疫增强作用的母乳。在本发明的前 述方法的另一实施方案中， 所述免疫调节作用为免疫抑制作用， 并且当所述微小 RNA 的量 减少时， 判定所述食物或物质产生具有免疫抑制作用的母乳。
     本发明基于以下观点 ： 期望通过 miRNA 的口服给药来获得免疫调节作用， 这是由 于新发现 miRNA 包含于乳中， 和即使在胃中的酸性条件下 miRNA 也可稳定地存在以及母乳 促进摄取母乳的婴儿中免疫发育的事实 ( 例如， Breastfeed Med.， 2(4) ： 195-204， 2007)。 并且， 基于乳中 miRNA 谱受饮食影响的预测， 构想鉴定可使存在于乳中的 miRNA 的量增加或 减少的食物或包含于食物的活性成分。
     为本发明的筛选方法、 乳和乳制品等所定义的免疫调节作用包括， 例如， 两种作 用： 为对抗外来攻击的 “防御” 目的而起作用的增加免疫增强作用的作用 ( 免疫增强作用 ) 和为对抗免疫过度反应即过敏反应、 自身免疫病、 慢性炎症等 ( 其中 “超免疫反应” 不利地 影响生物体 ) 而起抑制作用的免疫抑制作用。
     术语 “免疫增强作用” 和 “免疫抑制作用” 以相对含义使用。当对于某一哺乳动 物母乳通常观察到的免疫增强作用在摄取食物或物质后增强时， 所述母乳具有免疫增强作 用， 而当免疫增强作用降低时， 所述母乳具有免疫抑制作用。 当食物或物质被哺乳动物摄取 后所观察到的免疫增强作用与摄取前所观察的作用相比增强时， 所述哺乳动物的母乳具有 免疫增强作用， 而当免疫增强作用与摄取前所观察到的作用相比降低时， 所述母乳具有免 疫抑制作用。
     可以例如以如下所述来研究哺乳动物乳中的 miRNA 谱和被所述哺乳动物摄取的 食物或包含于所述食物中的物质的相关性。
     收集来自摄取食物的哺乳动物的乳， 检测乳中的 miRNA 谱。
     所述哺乳动物不特别限定， 实例包括人、 牛、 山羊、 绵羊、 猪、 猿、 狗、 猫、 大鼠、 小鼠、 仓鼠和豚鼠等。所述哺乳动物优选人或牛。
     本发明中， 所述 miRNA 谱由 miRNA 的种类和量组成。 所述 miRNA 可由一种 miRNA 组 成或由两种以上 miRNA 组成。miRNA 的种类不特别限定， 只要选择存在于乳中的那些即可， 并且实例包括 miR-10、 miR-15、 miR-16、 miR-17、 miR-18、 miR-19、 miR-20、 miR-21、 miR-22、 miR-23、 miR-24、 miR-25、 miR-26、 miR-27、 miR-28、 miR-29、 miR-30、 miR-31、 miR-33、 miR-34、 miR-92、 miR-93、 miR-96、 miR-98、 miR-99、 miR-100、 miR-101、 miR-103、 miR-106、 miR-107、 miR-125、 miR-126、 miR-128、 miR-129、 miR-130、 miR-133、 miR-134、 miR-139、 miR-140、 miR-141、 miR-143、 miR-146、 miR-148、 miR-151、 miR-152、 miR-155、 miR-181、 miR-182、 miR-183、 miR-184、 miR-185、 miR-186、 miR-188、 miR-192、 miR-193、 miR-195、 miR-196、 miR-199、 miR-200、 miR-203、 miR-204、 miR-205、 miR-206、 miR-210、 miR-212、 miR-214、 miR-218、 miR-219、 miR-221、 miR-222、 miR-223、 mi R-290、 miR-291、 miR-292、 miR-294、 miR-296、 miR-301、 miR-320、 miR-322、 miR-324、 miR-327、 miR-328、 miR-331、 miR-338、 miR-340、 miR-341、 miR-342、 miR-345、 miR-347、 miR-352、 miR-361、 miR-362、 miR-365、miR-370、 miR-375、 miR-378、 miR-409、 miR-425、 miR-429、 miR-452、 miR-455、 miR-465、 miR-466、 miR-483、 miR-484、 miR-486、 miR-494、 miR-497、 miR-500、 miR-503、 miR-532、 miR-542、 miR-584、 miR-652、 miR-664、 miR-672、 miR-685、 miR-708、 miR-760、 miR-872、 miR-874、 miR-877、 miR-1224、 miR-1300、 miR-1307、 let-7a、 let-7b、 let-7c、 let-7d、 le-7e、 let-7f 和 let-7i 等。
     这些 miRNA 为证实存在于或者人母乳、 大鼠初乳或者牛初乳之一中的那些。如 上所述， 已知母乳促进摄取母乳的婴儿中的免疫发育 ( 例如， Breastfeed Med.， 2(4) ： 195-205， 2007)。此外， 已报道被认为对婴儿 ( 包括动物幼仔 ) 的免疫系统重要的许多组分 通常包含于初乳中 (J.Anim.Sci.， 2009， 87 ： (Suppl.1) ： 3-9)。因此， 提示已证实存在于乳 中的前述 miRNA 参与免疫作用。
     在以上提及的那些中， 优选的是 miR-15、 miR-16、 miR-17、 miR-18、 miR-19、 miR-20、 miR-21、 miR-23、 miR-24、 miR-26、 miR-27、 miR-29、 miR-30、 miR-33、 miR-34、 miR-92、 miR-93、 miR-99、 miR-100、 miR-101、 miR-106、 miR-107、 miR-125、 miR-130、 miR-140、 miR-141、 miR-143、 miR-146、 miR-155、 miR-181、 miR-185、 miR-186、 miR-192、 miR-193、 miR-195、 miR-200、 miR-205、 miR-210、 miR-218、 miR-219、 miR-221、 miR-222、 miR-223、 miR-301、 miR-322、 miR-340、 miR-361、 miR-370、 miR-429、 miR-455、 miR-466、 miR-497、 miR-500、 miR-503、 miR-532、 miR-542、 let-7d 和 let-7i。这些是已报道其免疫调节作用的 miRNA、 已 证实存在于大鼠和牛二者的初乳中的 miRNA 或在服用双歧杆菌属 (Bifidobacterium) 细菌 的大鼠的初乳中量增加的 miRNA。 此外， 在以上提及的 miRNA 中， 特别优选的是 miR-15、 miR-16、 miR-19、 miR-21、 miR-23、 miR-24、 miR-26、 miR-27、 miR-30、 miR-34、 miR-99、 miR-106、 miR-107、 miR-125、 miR-130、 miR-140、 miR-181、 miR-193、 miR-210、 miR-222、 miR-223、 miR-361、 miR-370、 miR-429、 miR-500、 miR-532、 let-7d 和 let-7i。这些是已证实存在于大鼠和牛二者的初乳 中的 miRNA。
     某些 miRNA 具有亚型， 例如对于 miR-181、 miR-92、 miR-125 和 miR-146 等各自已 知 2 至 4 种亚型， 如分别为 miR-181a、 miR-181b、 miR-181c、 miR-181d、 miR-92a、 miR-92b、 miR-125a、 miR-125a-3P、 miR-125a-5P、 miR-125b、 miR-146a、 miR-146b、 miR-146b-3P 和 miR-146b-5P。某些其他 miRNA 也具有亚型， 并且在本发明中， miRNA 可为这样的任何亚型。 所述亚型的实例包括下文描述的实施例中 ( 指实施例 1、 3、 4 和 5) 证实存在于乳中的那些。
     人 miR-155 前 体 has-mir-155(MI0000681)， 及 其 活 性 位 点 has-miR-155(MIMAT 0009241) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NOS ： 1 和 2。 示于括号内的为 miRNA 数据库的登录 号 (miRBase::Sequences， http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/index.shtml)( 以 下描述应同样适用 )。
     牛 miR-155 前 体 bta-miR-155(MI0009752) ， 及 其 活 性 位 点 bta-miR-155(MIMAT0000646) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NOS ： 3 和 4。
     人 miR-181 前体 hsa-mir-181a-1(MI0000289) 和 hsa-mir-181a-2(MI0000269)， 及 其活性位点 hsa-miR-181a(MIMAT0000256) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NO S ： 5、 6 和 7。
     人 miR-181b 前体 hsa-mir-181b-1(MI0000270) 和 hsa-mir-181b-2(MI0000683)， 及其活性位点 hsa-miR-181b(MIMAT0000257) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NO S ： 8、 9和
     10。 牛 miR-181a 前体 bta-mir-181a(MI0004757) 和 bta-mir-181a-1(MI0010484)， 及 其活性位点 bta-miR-181a(MIMAT0003543) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NO S ： 11、 12 和 13。
     牛 miR-181b 前 体 bta-mir-181b-1(MI0010485) 和 bta-mir-181b-2(MI0005013)， 及其活性位点 bta-miR-181b(MIMAT0003793) 的核苷酸序列 分别示于 SEQ ID NOS ： 14、 15 和 16。
     人 miR-223 前 体 hsa-mir-223(MI0000300) ， 及 其 活 性 位 点 hsa-miR-223(MIMAT0000280) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NOS ： 17 和 18。
     牛 miR-223 前 体 bta-mir-223(MI0009782) ， 及 其 活 性 位 点 bta-miR-223(MIMAT0009270) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NOS ： 19 和 20。
     人 miR-17 前 体 的 核 苷 酸 序 列 hsa-mir-17(MI0000071)，及 其 活 性 位 点 hsa-miR-17(MIMAT0000070)( 又称 hsa-miR-17-5p)， 分别示于 SEQ ID NO S ： 21 和 22。
     牛 miR-17 前 体 bta-mir-17(MI0005031) 及 其 活 性 位 点 bta-miR-17-5p(MIMAT0003815) 和 bta-miR-17-3p(MIMAT0003816) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NO S ： 23、 24 和 25。
    人 miR-92a 前体 hsa-mir-92a-1(MI0000093) 和 hsa-mir-92a-2(MI0000094) 及其 活性位点 hsa-miR-92a(MIMAT0000092) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NO S ： 26、 27 和 28。
     人 miR-92b 前 体 hsa-mir-92b(MI0003560) 及 其 活 性 位 点 hsa-miR-92b(MIMAT0003218) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NOS ： 29 和 30。
     牛 miR-92 前 体 bta-mir-92(MI0005024) 及 其 活 性 位 点 bta-miR-92(MIMAT0003808) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NOS ： 31 和 32。
     牛 miR-92a 前 体 bta-mir-92a(MI0009905) 及 其 活 性 位 点 bta-miR-92a(MIMAT0009383) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NOS ： 33 和 34。
     牛 miR-92b 前 体 bta-mir-92b(MI0009906) 及 其 活 性 位 点 bta-miR-92b(MIMAT 0009384) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NOS ： 35 和 36。
     人 let-7i 前 体 hsa-let-7i(MI0000434) 及 其 活 性 位 点 hsa-let-7i(MIMAT0000415) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NOS ： 37 和 38。
     牛 let-7i 前 体 bta-let-7i(MI0005065) 及 其 活 性 位 点 bta-let-7i(MIMAT0003851) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NOS ： 39 和 40。
     人 miR-125a 前 体 hsa-mir-125a(MI0000469) 及 其 活 性 位 点 hsa-miR-125a-5p(MIMAT0000443) 和 hsa-miR-125a-3p(MIMAT0004602) 的核苷酸序列分别 示于 SEQ ID NO S ： 41、 42 和 43。
     人 miR-125b 前 体 hsa-mir-125b-1(MI0000446) 和 hsa-mir-125b-2(MI0000470) 及其活性位点 hsa-miR-125b(MIMAT0000423) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NO S ： 44、 45 和 46。
     牛 miR-125a 前 体 bta-mir-125a(MI0004752) 及 其 活 性 位 点 bta-miR-125a(MIMAT0003538) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NOS ： 47 和 48。
     牛 miR-125b 前 体 bta-mir-125b-1(MI0004753) 和 bta-mir-125b-2(MI0005457)
     及其活性位点 bta-miR-125b(MIMAT0003539) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NO S ： 49、 50 和 51。
     人 miR-146a 前 体 hsa-mir-146a(MI0000477) 及 其 活 性 位 点 hsa-miR-146a(MIMAT0000449) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NOS ： 52 和 53。
     人 miR-146b 前 体 的 核 苷 酸 序 列 hsa-mir-146b(MI0003129) 及 其 活 性 位 点 hsa-miR-146b-5p(MIMAT0002809)( 也 称 为 hsa-miR-146b) 和 hsa-miR-146b-3p(MIMAT 0004766) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NOS ： 54、 55 和 56。
     牛 miR-146a 前 体 bta-mir-146a(MI0009746) 及 其 活 性 位 点 bta-miR-146a(MIMAT0009236) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NOS ： 57 和 58。
     牛 miR-146b 前 体 bta-mir-146b(MI0009745) 及 其 活 性 位 点 bta-miR-146b(MIMAT0009235) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NOS ： 59 和 60。
     人 miR-150 前 体 hsa-mir-150(MI0000479) 及 其 活 性 位 点 hsa-miR-150(MIMAT 0000451) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NOS ： 61 和 62。
     牛 miR-150 前 体 bta-mir-150(MI0005058) 及 其 活 性 位 点 bta-miR-150(MIMAT0003845) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NOS ： 63 和 64。 除前述 miRNA 外， 将已证实存在于大鼠或牛的乳中的 miRNA 和与这些 miRNA 相应 的其他动物的 miRNA 示于表 1 至 10。
     表1
    
    
    表2
    
    表3
    
    表4
    
    表5
    
    表6
    
    表7
    
    表8
    
    表9
    
    表 10miRNA 不限制为具有前述序列的那些， 所述 miRNA 可包括一个或几个核苷酸的替 换、 缺失、 插入、 增添或倒位， 只要 miRNA 具有作为 miRNA 的功能， 即， miRNA 可调节靶基因的 表达即可。特别地， 此类 miRNA 的实例包括具有与前述任一序列显示 80％以上、 优选 90％ 以上、 更优选 95％以上的同源性的核苷酸序列的 RNA。
     miRNA 的量可为绝对量或相对量。 相对量可为基于动物中的平均量的相对量， 或可
     为基于食物摄取前所观察到的量， 在食物摄取后所观察到的相对量。 对于核酸量的测定， 可 采用通常用于 miRNA 量测定的方法如定量逆转录 PCR(qRT-PCR)。miRNA 的量还可通过微阵 列法测定。关于乳中 miRNA 的提取， 可采用通常用于 miRNA 提取的方法， 还可使用商购可得 的 miRNA 分离试剂盒。
     另外， 存在于乳中的 miRNA 的量还可通过测定乳腺细胞中 miRNA 的表达量来间接 测定。
     检测哺乳动物乳中的 miRNA 谱和由该哺乳动物摄取的食物或包含于所述食物中 的物质的相关性。哺乳动物乳中的 miRNA 谱和由该哺乳动物摄取的食物或包含于所述食物 中的物质的相关性是指 miRNA 谱与所述物质的存在或缺失或者所述物质的量的相关性。例 如， 如果已摄取某一物质的动物的乳中一种以上 miRNA 的量大于或小于未摄取该物质的动 物中所观察到的那些， 则该物质和 miRNA 谱分别具有正或负相关性。另外， 如果某一物质的 摄取不影响 miRNA 谱， 则该物质和 miRNA 谱互不相关。
     具体地， 例如， 当比较食物摄取前后所观察到的乳中的 miRNA 谱时， 摄取后所观察 到的一种、 优选两种以上、 更优选五种以上 miRNA 的量大于摄取前所观察到的那些， 则判定 该食物使存在于乳中的 miRNA 的量增加。
     另外， 当比较食物摄取前后所观察到的乳中的 miRNA 谱时， 摄取后所观察到的一 种、 优选两种以上、 更优选五种以上 miRNA 的量小于摄取前所观察到的那些， 则判定该食物 使存在于乳中的 miRNA 的量降低。
     此外， 食物摄取前 miRNA 谱的测定并不是不可缺少的， 食物和 miRNA 量的相关性还 可通过比较在摄取食物后测定的 miRNA 谱与预先测定的对象哺乳动物的普通 miRNA 谱来测 定。
     在另一实施方案中， 比较乳中的 miRNA 谱和血清或血浆中的 miRNA 谱， 如果乳和 血清或血浆二者中包含的 miRNA 的存在量， 通过摄取食物使乳中所观察到的 miRNA 的存 在量比血清或血浆中所观察到的 miRNA 的存在量更高的话， 则判定该食物使存在于乳中的 miRNA 的存在量增加。 与血清或血浆中的 miRNA 的存在量相比， 乳中 miRNA 的存在量高的程 度为例如 1.2 倍以上、 优选 2 倍以上、 更优选 5 倍以上、 还更优选 10 倍以上。
     另外， 当比较乳中的 miRNA 谱和血清或血浆中的 miRNA 谱时， 如果乳和血清或血浆 二者中包含的 miRNA 的量， 通过摄取食物而使乳中的量比血清或血浆中所观察到的量更低 的话， 则判定该食物使存在于乳中的 miRNA 的量减少。与血清或血浆中所观察到的 miRNA 存在量相比， 乳中 miRNA 的存在量低的程度为例如 0.8 倍以下、 优选 0.5 倍以下、 更优选 0.2 倍以下、 还更优选 0.1 倍以下。
     所述食物可由单一物质组成或可为组合物， 只要其可口服摄取即可。另外， “摄取 前” 和 “摄取后” 可意为 “一次食物摄取之前和之后” 或 “两次以上食物摄取之前和之后” 。 另外， 两次以上食物摄取可为两次以上相同食物的摄取， 或两种以上食物的摄取。
     所述食物可为根据既定计划摄取或自由摄取。后一种情况中， 所述食物和乳中 miRNA 谱的相关性人类情况中可通过获取 (hearing) 所摄取的食物的含量来检测。当根据 既定计划摄取或服用所述食物时， 所述食物可被认为是 “试样” 。所述食物可为普通食物或 包含试验物质的普通食物。摄取的食物量、 摄取的时间和摄取的次数不特别限定。
     如果选择使乳中 miRNA 的量增加的食物， 则包含于所述食物并使乳中 miRNA 的量增加的物质可用如上述相同的方式鉴定。另外， 如果选择使乳中 miRNA 的量减少的食物， 则 包含于所述食物并使乳中 miRNA 的量减少的物质可用如上述相同的方式鉴定。
     如果鉴定出增加或减少乳中 miRNA 的量的食物或物质， 则可设计使乳中 miRNA 的 量增加或减少的食物。即， 认为使乳中 miRNA 的量增加的食物或包含于其中的物质是产生 具有免疫增强作用的乳所优选的， 而使乳中 miRNA 的量减少的食物或包含于其中的物质不 是产生具有免疫增强作用的乳所优选的。
     另外， 认为使乳中 miRNA 的量减少的食物或包含于其中的物质是产生具有免疫抑 制作用的乳所优选的， 而使乳中 miRNA 的量增加的食物或包含于其中的物质不是产生具有 免疫抑制作用的乳所优选的。
     可如上所述进行产生具有免疫调节作用的母乳的食物或物质， 或不适于产生具有 免疫调节作用的母乳的食物或物质的筛选。如下文所述实施例中所示， 在大鼠和牛的初乳 中证实存在各种 miRNA。 这支持了本发明的观点， 即期望 miRNA 的口服给药提供免疫调节作 用。 另外， 如下文所述实施例中所示， 当将双歧杆菌属细菌 ( 长双歧杆菌 (Bifidobacterium longum)) 对大鼠口服给药时， 52 种 miRNA 的量增加。
     已知双歧杆菌属细菌作为益生菌行使功能， 并特别地具有免疫调节作用。 因此， 服 用双歧杆菌属细菌使乳中 miRNA 的量增加的事实也支持乳中 miRNA 参与免疫调节。通过服 用双歧杆菌属细菌诱导的乳中 miRNA 的量增加的论证， 即双歧杆菌属细菌与 miRNA 谱的相 关性， 显示出本发明的筛选方法是可行的。 另外， 尽管还存在通过服用双歧杆菌属细菌不改 变其在乳中的量的 miRNA， 但不否认可通过另一种食物或包含于其中的物质使那些 miRNA 的量增加的可能性。
     作为双歧杆菌属细菌的益生菌功能， 已知防御或改善呼吸道感染、 急性感染性腹 泻、 抗生素相关性腹泻、 艰难梭菌 (Clostridium dificile) 相关性腹泻、 坏死性肠结肠 炎 (necrotizing enterocolitis)、 旅行者腹泻 (traveler’ s diarrhea) 和幽门螺杆菌 (Helicobacter pylori) 感染等 (The Journal of Nutrition， 2010Mar ； 140(3) ： 698S-712S Epub 2010Jan 27)。表明通过服用双歧杆菌属细菌而使其在乳中的量增加的 miRNA 不仅调 节免疫， 而且在摄取双歧杆菌属细菌的动物中显示的功能类似于前述益生菌的功能。
     通过给予哺乳动物如上所述选择的使乳中 miRNA 量增加的食物或物质， 并从该动 物中收集乳， 可获得具有免疫增强作用的乳或其免疫增强作用增强的乳。 另外， 通过减少或 避免哺乳动物摄取上述选择的使乳中 miRNA 量减少的食物或物质， 可增强乳的免疫增强作 用， 或可预防免疫增强作用的降低。
     另外， 可将使乳中 miRNA 量增加的食物或物质的摄取以及减少或避免使乳中 miRNA 量减少的食物或物质的摄取结合起来。另外， 通过给予哺乳动物上述选择的使乳中 miRNA 量减少的食物或物质， 并从该动物中收集乳， 可获得具有免疫抑制作用的乳或其免疫 增强作用减少的乳。另外， 通过减少或避免哺乳动物摄取上述选择的使乳中 miRNA 量增加 的食物或物质， 可增强乳的免疫抑制作用， 或可降低乳的免疫增强作用。另外， 可将使乳中 miRNA 量减少的食物或物质的摄取以及减少或避免使乳中 miRNA 量增加的食物或物质的摄 取结合起来。
     通过处理上述获得的具有免疫调节作用的乳， 可产生具有免疫调节作用的乳制 品。乳制品的类型不特别限定， 只要 miRNA 在维持其功能的情况下可存在于乳制品中 即可， 实例包括加工乳、 婴儿配方、 乳饮料、 婴儿配方奶粉 (powdered infant formula)、 发 酵乳、 奶油、 黄油、 奶酪和冰淇淋等。作为乳制品， 优选婴儿或幼儿用乳制品。
     根据本发明， 已证实乳中 miRNA 的存在， 特别是已知参与免疫增强例如免疫发育、 抗过敏、 抗炎和预防感染的 miRNA。此外， 众所周知， 母乳对摄取其的婴儿给予免疫增强作 用。 因此， 参与免疫调节的 miRNA 可调节摄取其的生物体例如人类的免疫是合理地预测。 由 于 miRNA 是调节各种基因表达的物质， 因此认为此类调节分子从母体至婴儿的转移特别是 对具有未发育的免疫系统的婴儿来说是极其重要的。
     本发明的另一方面是具有免疫增强作用的口服摄取用组合物， 其通过向口服摄取 用组合物的基质中添加 miRNA 而制备。
     所述 miRNA 的实例包括 miR-10、 miR-15、 miR-16、 miR-17、 miR-18、 miR-19、 miR-20、 miR-21、 miR-22、 miR-23、 miR-24、 miR-25、 miR-26、 miR-27、 miR-28、 miR-29、 miR-30、 miR-31、 miR-33、 miR-34、 miR-92、 miR-93、 miR-96、 miR-98、 miR-99、 miR-100、 miR-101、 miR-103、 miR-106、 miR-107、 miR-125、 miR-126、 miR-128、 miR-129、 miR-130、 miR-133、 miR-134、 miR-139、 miR-140、 miR-141、 miR-143、 miR-146、 miR-148、 miR-151、 miR-152、 miR-155、 miR-181、 miR-182、 miR-183、 miR-184、 miR-185、 miR-186、 miR-188、 miR-192、 miR-193、 miR-195、 miR-196、 miR-199、 miR-200、 miR-203、 miR-204、 miR-205、 miR-206、 miR-210、 miR-212、 miR-214、 miR-218、 miR-219、 miR-221、 miR-222、 miR-223、 miR-290、 miR-291、 miR-292、 miR-294、 miR-296、 miR-301、 miR-320、 miR-322、 miR-324、 miR-327、 miR-328、 miR-331、 miR-338、 miR-340、 miR-341、 miR-342、 miR-345、 miR-347、 miR-352、 miR-361、 miR-362、 miR-365、 miR-370、 miR-375、 miR-378、 miR-409、 miR-425、 miR-429、 miR-452、 miR-455、 miR- 465、 miR-466、 miR-483、 miR-484、 miR-486、 miR-494、 miR-497、 miR-500、 miR-503、 miR-532、 miR-542、 miR-584、 miR-652、 miR-664、 miR-672、 miR-685、 miR-708、 miR-760、 miR-872、 miR-874、 miR-877、 miR-1224、 miR-1300、 miR-1307、 let-7a、 let-7b、 let-7c、 let-7d、 le-7e、 let-7f 和 let-7i 等。
     在 上 述 miRNA 中， miR-15、 miR-16、 miR-17、 miR-18、 miR-19、 miR-20、 miR-21、 miR-23、 miR-24、 miR-26、 miR-27、 miR-29、 miR-30、 miR-33、 miR-34、 miR-92、 miR-93、 miR-99、 miR-100、 miR-101、 miR-106、 miR-107、 miR-125、 miR-130、 miR-140、 miR-141、 miR-143、 miR-146、 miR-155、 miR-181、 miR-185、 miR-186、 miR-192、 miR-193、 miR-195、 miR-200、 miR-205、 miR-210、 miR-218、 miR-219、 miR-221、 miR-222、 miR-223、 miR-301、 miR-322、 miR-340、 miR-361、 miR-370、 miR-429、 miR-455、 miR-466、 miR-497、 miR-500、 miR-503、 miR-532、 miR-542、 let-7d 和 let-7i 是优选的， 而 miR-15、 miR-16、 miR-19、 miR-21、 miR-23、 miR-24、 miR-26、 miR-27、 miR-30、 miR-34、 miR-99、 miR-106、 miR-107、 m iR-125、 miR-130、 miR-140、 miR-181、 miR-193、 miR-210、 miR-222、 miR-223、 miR-361、 miR-370、 miR-429、 miR-500、 miR-532、 let-7d 和 let-7i 是更优选的。
     所述 miRNA 可由单种 miRNA 组成或由任意的两种以上 miRNA 组成。
     口服摄取用组合物的基质不特别限定， 只要选择 miRNA 可在其中维持其功能而存 在的口服摄取的或可给药的基质即可， 实例包括食品、 饮品、 药品基质和动物饲料等。
     食品可以为任何形式， 并包括饮品。 食品包括成人用食品、 婴儿用食品和幼儿用食品等。
    成人用食品的实例包括肠内营养物、 流体食物例如浓缩的流体食物和营养增补食品等。 婴儿用食品或幼儿用食品的实例包括， 例如调制乳类 (modified milk)( 例如， 婴 儿配方、 低出生体重 (birth weight) 婴儿用婴儿配方、 较大婴儿配方等以及过敏型婴儿用 婴儿配方、 无乳糖乳、 先天性代谢缺陷婴儿的特殊乳等， 和由这些制备的奶粉 )、 母乳增补粉 或婴儿配方奶粉和婴儿食品等。
     此处所指的婴儿配方是通过使用乳或乳制品作为主原料并添加婴儿所需的营养 物生产的食品， 并主要用作婴儿期母乳的替代食品， 以及作为幼年时期母乳的替代食品或 营养补充食品。 所述婴儿配方的其他实例包括为适合于具有特定的先天或后天疾病的婴儿 有助于营养摄取为目的而生产的食品。
     miRNA 相对耐冻融、 低 pH 如 pH1 的酸性条件和 RNase 如 RNase A 和 RNase T， 因而 适合作为添加到食品中的活性成分。低 pH 下的稳定性表明 miRNA 分子耐婴儿胃内环境， 并 可被婴儿的主要免疫器官之一的肠道吸收， 因此其可影响婴儿的免疫系统。 另外， 母乳的保 存和冻融不会使 miRNA 变性， 这对通常给予冷藏保存的母乳的低出生体重婴儿和住院婴儿 在营养上是重要的。此外， miRNA 对 RNase 的耐受性表明 miRNA 可存在于复合体例如母乳 中的外泌体和微泡中。
     从前述发现中， 似乎母亲给予婴儿这样定制 (custom-made) 的母乳， 婴儿便可适 应环境。 有报道表明源于母乳的外泌体使 Foxp3+CD4+CD25+ 调节 T 细胞的数量增加。 如果免 疫相关的 miRNA 包含于母乳外泌体中， 则其可能有助于婴儿消化道内 Foxp3+CD4+CD25+ 调 节 T 细胞的增加。这是由于母乳中检测出的免疫相关的 miRNA 如 miR-181a 和 miR-181b 高 度表达， 其参与 T 细胞的分化。此外， 由于已知大量包含于母乳中的 miR-181 和 miR-155 诱 导 B 细胞的分化， 而抑制 B 细胞分化的 miR-150 在母乳中几乎不存在， 因而母乳中的 miRNA 可诱导 B 细胞的分化。
     尽管组合物中 miRNA 的含量不特别限定， 并可适当选择， 然而其总计例如为 10 至 10,000ng/ml， 优选 20 至 10,000ng/ml， 更优选 50 至 10,000ng/ml。另外， 摄取的 miRNA 的 量， 总计例如 5μg 至 120mg/ 天， 优选 10μg 至 120mg/ 天， 更优选 25μg 至 120mg/ 天。
     可通过制备部分双链 RNA 作为 miRNA 前体 (pri-miRNA) 并用 Dicer 酶消化来获得 miRNA。作为 Dicer 酶， 可使用商购可得的酶。双链 RNA 可通过例如使用具有互补序列的双 链 DNA 作为模板的 RNA 聚合酶反应来制备。所述双链 DNA 可通过使用哺乳动物的染色体 DNA 作为模板以及为能够扩增 miRNA 序列而设计的引物基于 PCR 的扩增来制备。
     可通过用 Dicer 酶等消化如上所述获得的双链 RNA 来获得 miRNA。
     另外， miRNA 还可通过化学合成来制备。即， 可通过合成正义链和反义链并将其退 火来获得 miRNA。
     另外， 可将允许通过哺乳动物的内源 Dicer 酶产生靶 miRNA 的双链 RNA 添加到口 服摄取用组合物中。
     当本发明的口服摄取用组合物为药剂时， 可通过用药物学上可接受的口服给药用 载体与 miRNA 组合来制备组合物。药物制剂的形式不特别限定， 实例包括片剂、 丸剂、 散剂、 溶液剂、 悬浮剂 (suspension)、 乳剂、 颗粒剂、 胶囊剂和糖浆剂等。对于剂型， 可使用广泛用
     于通常的药剂的添加剂作为口服给药用药物载体， 如赋形剂、 结合剂、 崩解剂、 润滑剂、 稳定 剂、 矫味剂 (corrigent)、 稀释剂和表面活性剂。另外， 除非本发明的效果降低， 否则 miRNA 可与另一具有免疫调节作用的药物一起使用。
     尽管包含于药剂中的 miRNA 的量不特别限定， 但其总计例如为 2μg/kg 至 2mg/kg， 优选 4μg/kg 至 2mg/kg， 更优选 10μg/kg 至 2mg/kg。
     当口服摄取用组合物为食品时， 其可用于利用免疫增强作用的任何各种用途。所 述用途的实例包括， 例如作为适用于显示抵抗力低下人群的食品的用途和作为用于降低或 消除由免疫低下引起的各种疾病的风险因素的食品或饮品的用途等。
     本发明的食品或饮品可作为食品出售， 并附有描述该食品用于免疫调节的指示。
     前述术语 “指示” 包括告知消费者前述用途的所有行为， 并且任何提醒或类推前述 用途的指示落入本发明 “指示” 的范围内， 而不管指示的目的、 内容、 对象物、 媒体等如何。 然而， 所述指示优选用允许消费者直接识别前述用途的表述制成。具体实例包括在与本发 明的食品相关的商品或商品包装上指示前述用途的行为， 在上面指示了前述用途的该商品 或商品的包装的分派 (assigning)、 交付 (delivering)、 为分派、 交付目的的展示或进口行 为， 或者与商品相关的展示或分配广告、 价格表或商业单据 (business papers)、 或者通过 电磁法 ( 互联网等 ) 提供包括作为指示前述用途的内容的那些信息等的行为。 所述指示优选为经行政机构等批准的指示 ( 例如， 基于认可的形式的指示， 该认 可基于由行政机构提供的各种法律制度之一而授权 )， 特别优选在销售现场在广告材料上 的指示， 例如包装、 容器、 目录、 宣传册和 POP 及其他文件等。
     所述指示的实例进一步包括， 例如， 作为健康食品、 功能性食品、 肠道营养食品、 特膳用途食品 (food for special dietary uses)、 具有营养功能声明的食品和准药 (quasi-drug) 等的指示， 以及经卫生部、 厚生劳动省 (Labor and Welfare) 批准的指示， 例 如基于特定保健用食品 (food for specified health uses) 体系及类似体系而批准的指 示。后者的实例包括作为特定保健用食品的指示、 作为具有授权的保健声明的特定保健用 食品的指示、 影响身体结构和功能的指示和减少疾病风险声明的指示等， 更精确地， 典型的 实例包括在健康促进法 (Health Promotion Law) 实施条例 ( 日本卫生部、 厚生劳动省内部 条例第 86 号， 2003 年 4 月 30 日 ) 中提供的作为特定保健用食品的指示 ( 特别是用于保健 的指示 ) 以及类似的指示。
     实施例
     以下将参考实施例进一步详细解释本发明。 然而， 本发明不受以下实施例的限定。
     实施例 1 ： 母乳中 miRNA 的分析
     将人母乳在 2,000×g 下离心 10 分钟以移除细胞和大沉淀物， 进一步将除构成表 层的脂质外的上清液在 12,000×g 下离心 30 分钟以移除细胞碎片和细胞尘 (dust)。使用 mirVana miRNA 分离试剂盒根据制造商的实验步骤 (protocol) 从上清液中提取总 RNA。来 自血清的 RNA 的提取以与对于母乳使用的相同的方式进行。
     通过使用生物分析仪来分析提取的 RNA。 尽管相当大量的 RNA 包含于母乳中， 但几 乎不包含或根本不包含核糖体 RNA(18S rRNA、 28S rRNA)。
     通过使用微阵列分析系统 ( 使用由 Agilent Technologies 生产的系统 ) 来检测 miRNA。通过使用 Gene Spring GX11.0( 由 Agilent Technologies 生产 ) 分析 miRNA 的表
     达水平。结果示于图 1。结果， 以显著水平检测出 miR-181a、 miR-181b、 miR-155、 miR-125b、 miR-146b、 miR-223 和 let-7i。无法检出控制 T 细胞和 B 细胞的 miR-150。另外， 几乎不能 检测出多器官特异的 miRNA 如 miR-122( 肝脏 )、 miR-216、 miR-217( 胰腺 )、 miR-142-5p、 miR-142-3p( 造血细胞 )。此外， 检出小量 miR-124( 脑 )。
     通过定量 RT-PCR 分析的出生后前六个月 (n ＝ 5) 和接下来的六个月 (n ＝ 13) 的 母乳中的 miR-181a 水平的比较结果示于图 2。对 miR-155、 miR-17 和 miR-92a 进行的类 似分析的结果也示于图 3 中。为了使由 RNA 分离过程诱导的样品中的变化标准化， 将变性 的 cel-miR-39( 由 Qiagen 合成 )( 为线虫 ( 秀丽隐杆线虫 ) 的合成 miRNA) 添加到样品中 (5ml 总体积中寡核苷酸量为 25fmol)， miRNA 的量作为基于 cel-miR-39 的量的相对量来示 出 ( 以下实验应同样应用 )。
     结果， 出生后前六个月的乳与接下来六个月的乳相比 miR-181a 的量较大 ( 图 2)。 对于 miR-155、 miR-17 和 miR-92a 也观察到类似的趋势 ( 图 3)。
     作为 RT-PCR 用引物， 使用由 Applied Biosystems 生产并由以下 Assay ID 鉴定的 那些。
     -miR-181a ： 000480
     -miR-155 ： 002623
     -miR-17 ： 002308
     -miR-92a ： 000431
     -Cel-miR-39 ： 000200
     产后 6 个月内七名健康人的母乳和血清中与免疫相关的 miRNA 水平的比较结果示 于图 4( 母乳 ： n ＝ 5、 血清 ： n ＝ 6)。母乳中 miRNA 谱不同于血清中的那些。例如， 控制粒细 胞的 miRNAmiR-223 在正常人血清和血浆中以最高水平存在， 然而与血清中的相比其在母 乳中的表达量极低。另外， 不大量存在于血清中的 miR-146b 却大量地存在于母乳中。
     另一方面， 与血清中所观察到的那些相比， 在表达量上母乳中大量存在 miR-181 和 miR-155。 有趣的是， 在产后六个月 ( 其为婴儿食品摄入前的阶段 ) 的母乳中高度表达多 种免疫相关的 miRNA。
     miRNA 的细胞间转移表明 miRNA 不仅控制细胞内分子， 还是在细胞间通讯中像 细胞因子一样起作用的分子。前述结果表明 miRNA 为可从母体转移至孩子的 “遗传物质 7 (genetic materal)” 。据计算， 约 0.15pg/L/ 天 (1.3×10 个拷贝 /L/ 天 ) 的 miR-181 经 母乳被婴儿摄取。
     此外， 作为聚类分析的结果， 已发现不同母亲的母乳的 miRNA 谱是相似的。
     实施例 2 ： miRNA 的物理化学性质
     将母乳在室温下静置 24 小时， 或反复进行冷冻 (-20 ℃ ) 和融解至 3 次。通过 TaqMan qRT-PCR 测定 miRNA(miR-21、 miR-181a) 的水平。结果示于图 5。另外， 在低 pH 溶 液 (pH 1) 中处理母乳 3 小时， 用 TaqMan qRT-PCR 测定处理前后 miRNA(miR-181a) 的水平。 结果示于图 6。
     另外， 将 RNase A/T 溶液 (RNase A(500U/ml) 和 RNaseT1(20,000U/ml) 的混合溶 液， 由 Ambion 生产 ) 以母乳的 2％体积加入母乳中， 37℃下处理混合物 3 小时， 通过 TaqMan qRT-PCR 测定处理前后 miRNA(miR-181a) 的水平。结果示于图 7。作为用于 TaqMan qRT-PCR 的引物， 使用由 Applied Biosystems 生产并由以下 Assay ID 鉴定的那些。
     -miR-181a ： 000480
     -miR-21 ： 000397
     -Cel-miR-39 ： 000200
     证实 miRNA 对冻融、 低 pH 和 RNase 相对稳定。
     实施例 3 ： 产生具有免疫调节作用的乳的食物或物质的鉴定
     购买怀孕 9 至 10 天的 SD 大鼠， 在怀孕 13 至 20 天期间， 以每只大鼠 1ml/ 天的 体积将双歧杆菌属细菌、 长双歧杆菌 BB536(ATCC BAA-999) 的 PBS( 磷酸盐缓冲盐水 ) 9 (1×10 cfu/ml) 悬浮液给药到试验组 (n ＝ 3) 的大鼠。
     另外， 作为对照组 (n ＝ 3)， 以每只大鼠 1ml 每天的体积给药 PB S。长双歧杆 菌 (B.longum)AT CC BAA-999 菌株可从美国模式培养物集存库 (American Type Culture Collection) 购买 ( 地址 ： 12301 Parklawn Drive， 罗克维尔市， 马里兰州 20852， 美国 )。
     所有大鼠在怀孕 21 天时产仔， 并且在其分娩后第一天在用乙醚麻醉下产奶。所获 初乳样品离心两次来移除脂质层和细胞碎片， 离心条件为 1,200×g、 4℃、 10 分钟。
     随后， 在 21,500×g 和 4 ℃下离心上清液 40 分钟， 并进一步在相同条件下离心 1 小时来移除酪蛋白组分， 从而获得乳清。通过使用 miRNeasy 迷你试剂盒 (Mini Kit)( 由 Qiagen 生产 ) 从所获乳清样品中获得总 RNA。
     通过使用 100ng 所获 RNA 样品， 使用微阵列系统 ( 由 Agilent Technologie s 生 产 ) 以常规方式检测 miRNA。通过使用 GeneSpring GX11.0( 由 Agilent Technologies 生 产 ) 分析结果。
     当通过使用 Gene Spring G X11.0 进行微阵列数据的统计学分析时， 发现在检测 微小 RNA 的试验组和对照组中已证实表达的微小 RNA 的类型数总计为 155。这些微小 RNA 如下所示。此外， 未检出 miR-150。
     在试验组和对照组中证实表达的微小 RNA， 155 种 ：
     miR-16、 miR-17-5p、 miR-18(miR-18a)、 miR-19(miR-19b)、 miR-20(miR-20a)、 miR-21 、 miR-23(miR-23a) 、 miR-27(miR-27a 、 miR-27b) 、 miR-29(miR-29a 、 miR-29b 、 miR-29c、 miR-29c*)、 miR-30(miR-30a、 miR-30c、 miR-30d、 miR-30e*)、 miR-33、 miR-34b、 miR-92a、 miR-93、 miR-100、 miR-101(miR-101a、 miR-101b)、 miR-106b、 miR-130b、 miR-140*、 miR-141、 miR-143、 miR-146a、 miR-185、 miR-186、 miR-192、 miR-193、 miR-195、 miR-200a、 miR-205、 miR-218、 miR-219-5p、 miR-221、 miR-301a、 miR-322、 miR-340-5p、 miR-361、 miR-429、 miR-455、 miR-466b、 miR-497、 miR-500、 miR-503、 miR-532-5p、 miR-542-3p
     let-7a 、let-7a* 、let-7b 、let-7c 、let-7d 、le-7e 、let-7f 、let-7i 、 miR-10(miR-10a-5p、 miR-10b)、 miR-15(miR-15b)、 miR-19(miR-19a)、 miR-20(miR-20a*)、 miR-22 、 miR-23(miR-23b) 、 miR-24 、 miR-25 、 miR-26(miR-26a ， miR-26b) 、 miR-28 、 miR-30(miR-30a* 、miR-30b-5p 、miR-30c-1* 、miR-30c-2* 、miR-30e) 、miR-31 、 miR-34(miR-34a) 、 miR-96 、 miR-98 、 miR-99(miR-99a 、 miR-99b) 、 miR-103 、 miR-107 、 miR-125(miR-125a-3p 、miR-125a-5p 、miR-125b-3p 、miR-125b-5p) 、miR-128 、 miR-130(miR-130a)、 miR-133(miR-133a、 miR-133b)、 miR-134、 miR-139(miR-139-3p)、m i R - 1 4 0 、m i R - 1 4 6 ( m i R - 1 4 6 b ) 、m i R - 1 4 8 ( m i R - 1 4 8 b - 3 p ) 、m i R - 1 5 1 、m i R - 1 5 2 、 miR-181(miR-181a、 miR-181a*、 miR-181b、 miR-181c、 miR-181d)、 miR-182、 miR-183、 miR-188、 miR-196(miR-196c)、 miR-199(miR-199a-3p)、 miR-200(miR-200b、 miR-200c)、 miR-203、 miR-204、 miR-206、 miR-210、 miR-212、 miR-214、 miR-222、 miR-223、 miR-290、 miR-291(miR-291a-5p)、 miR-292(miR-292-5p)、 miR-294、 miR-296(miR-296*)、 miR-320、 miR-324(miR-324-3p 、 miR-324-5p)、 miR-327、 miR-328、 miR-331、 miR-340(miR-340-3p)、 miR-341、 miR-342(miR-342-3p)、 miR-345(miR-345-5p)、 miR-347、 miR-352、 miR-365、 miR-370、 miR-375、 miR-378(miR-378、 miR-378*)、 miR-425、 miR-465、 miR-483、 miR-484、 miR-494、 miR-542(miR-542-5p)、 miR-652、 miR-672、 miR-685、 miR-760(miR-760-3p)、 miR-872、 miR-874、 miR-1224
     在 miR- 序号后带括号说明的所列 miRNA 具有亚型， 括号内所说明的亚型实际表 达。
     另外， 当通过使用曼 - 惠特尼 U 检验 (Mann-Whitney U-test) 在统计学上比较双 歧杆菌属细菌 BB 536 给药组和对照组中前述微小 RNA 的表达量时， 发现以下 52 种微小 RNA 类型在双歧杆菌属细菌 BB 536 给药组中以小于 5％的概率水平增加。 所述 miRNA 在表达上 的变化倍率示于表 11。
     在双歧杆菌属细菌 BB 536 给药组中证实增加的微小 RNA， 52 种 ：
     miR-16、 miR-17-5p、 miR-18(miR-18a)、 miR-19(miR-19b)、 miR-20(miR-20a)、 miR-21 、 miR-23(miR-23a) 、 miR-27(miR-27a 、 miR-27b) 、 miR-29(miR-29a 、 miR-29b 、 miR-29c、 miR-29c*)、 miR-30(miR-30a、 miR-30c、 miR-30d、 miR-30e*)、 miR-33、 miR-34b、 miR-92a、 miR-93、 miR-100、 miR-101(miR-101a、 miR-101b)、 miR-106b、 miR-130b、 miR-140*、 miR-141、 miR-143、 miR-146a、 miR-185、 miR-186、 miR-192、 miR-193、 miR-195、 miR-200a、 miR-205、 miR-218、 miR-219-5p、 miR-221、 miR-301a、 miR-322、 miR-340-5p、 miR-361、 miR-429、 miR-455、 miR-466b、 miR-497、 miR-500、 miR-503、 miR-532-5p、 miR-542-3p
     表 11
    从表 11 所示结果可看出， 发现对于证实增加的所有 52 种微小 RNA 观察到的变化 倍率为 1.2 倍以上。
     即， 发现基于这样的 52 种微小 RNA 的检测可将双歧杆菌属细菌 BB 536 菌株筛选 为产生具有免疫调节作用的乳的食物或物质。
     实施例 4 ： 大鼠初乳中表达的微小 RNA 的检测
     购买三只怀孕 14 天的 F344 大鼠。所有购买的大鼠在怀孕 21 天时产仔， 并且在其 分娩后第二天在乙醚麻醉下产奶以收集初乳。
     各初乳样品在 1,200×g 和 4℃下离心 10 分钟两次来移除脂质层和细胞碎片。
     随后， 在 21,500×g 和 4℃下离心上清液 40 分钟， 并进一步在相同条件下离心 1 小 时来移除酪蛋白组分， 从而获得乳清。
     通过使用 miRNeasy 迷你试剂盒 ( 由 Qiagen 生产 ) 从所获乳清样品中获得总 RNA。
     将 100ng 的量的所获 RNA 样品以常规方式用于微阵列 ( 由 Agilent Technologies 生产 ) 实验。通过使用 GeneSpring GX11.0( 由 Agilent Technologies 生产 ) 分析微阵列 实验结果。
     结 果， 证 实 除 了 在 实 施 例 3 中 证 实 的 155 种 微 小 RNA 外， 还表达四种微小 RNA(miR-193*、 miR-409-3p、 miR-664、 miR-877)。
     实施例 5 ： 牛初乳中表达的微小 RNA 的检测 准备产后 1 至 3 天的荷斯坦牛 (Holstein cow) 的五个乳样品作为初乳样品。另 外， 准备产后 8 天至 8 个月的荷斯坦牛的五个乳样品作为正常乳样品。
     各乳样品 ( 初乳和正常乳 ) 在 1,200×g 和 4℃下离心 10 分钟两次来移除脂质层 和细胞碎片。
     随后， 在 21,500×g 和 4℃下离心上清液 40 分钟， 并进一步在相同条件下离心 1 小 时来移除酪蛋白组分， 从而获得乳清。
     通过使用 miRNeasy 迷你试剂盒 ( 由 Qiagen 生产 ) 从所获乳清样品中获得总 RNA。
     将 20ng 的量的所获 RNA 样品以常规方式用于微阵列 ( 由 Agilent Technologies 生产 ) 实验。通过使用 GeneSpringGX11.0( 由 Agilent Technologies 生产 ) 分析微阵列 实验结果。
     结果， 在初乳样品和正常乳样品中证实总计表达 102 种 miRNA。特别地， 在该 102 种 miRNA 中， 证实 49 种 miRNA 仅在初乳中表达。
     证实仅在初乳中表达的 49 种微小 RNA 如下所述。
     证实仅在初乳中表达的微小 RNA， 49 种 ：
     let-7d、 let-7i、 miR-15a、 miR-15b、 miR-16b、 miR-17-3p、 miR-19b、 miR-21、 miR-23b-3p、 miR-24-3p、 miR-26b、 miR-27b、 miR-30a-5p、 miR-30c、 miR-30f、 miR-34a、 miR-99a、 miR-106、 miR-106b、 miR-107、 miR-125b、 miR-126、 miR-129-3p、 miR-130a、 miR-130b、 miR-140、 miR-155、 miR-181b、 miR-184、 miR-193a-3p、 miR-193a-5p、 miR-196a、 miR-210、 miR-222、 miR-223、 miR-338、 miR-361、 miR-362-5p、 miR-370、 miR-429、 miR-452、 miR-486、 miR-500、 miR-532、 miR-584、 miR-708、 miR-877、 miR-1300b、 miR-1307
     产业上的可利用性
     根据本发明， 可筛选产生具有免疫调节作用的乳的食物或包含于其中的物质。本 发明还提供生产具有免疫调节作用的乳制品的方法。 本发明的口服摄取用组合物具有免疫 增强作用， 并特别适用于婴儿。
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     母乳包含分泌型 IgA、 乳铁蛋白、 溶菌酶和细胞因子等， 母乳被认为保护婴儿免受 感染， 并促进婴儿的免疫发育 ( 非专利文献 19)。 实际上， 已知依靠母乳成长的孩子， 与不以 此方式成长的孩子， 涉及较低的支气管或肠道感染的风险。母乳包含显示抗菌活性的 IgA、 乳铁蛋白、 糖蛋白、 糖脂等， 以及调节免疫细胞的细胞因子。 然而， 迄今研究中分析的对象主 要为包含于母乳中的蛋白质， 尽管有关于包含于母乳中的核酸的报道， 但对包含于母乳并 具有特定序列的核酸的研究还未报道。
     此外， 还已知受环氧酶 2 表达控制的乳腺细胞 (mammaryglandular cell) 的发育 是由 miR-101a 调节的 ( 非专利文献 20)。然而， 这并不表明 miRNA 存在于乳中。
     另 外， 在本 申请的优 先权日 后， 有报 道称微 小 RNA 存 在于来 源 于牛乳 的 微 泡 (microve sicle) 中 ( 非专利文献 21)， 并且在不同哺乳期的新鲜牛乳、 商购液体乳和奶粉 中鉴定出微小 RNA( 非专利文献 22)。
     现有技术文献
     [ 非专利文献 ]
     非专利文献 1 ： Lindsay， M.A.， Trends Immunol， 29 ： 343-351， 2008
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     非专利文献 3 ： Chen， Chang-Zheng 等人， Science， 303 ： 83-86， 2004
     非专利文献 4 ： O′ Connel， R.M. 等人， PNAS， 104(5) ： 1604-1609， 2007
     非专利文献 5 ： Vigorito， E. 等人， Immunity， 27 ： 847-859， 2007
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     非专利文献 21 ： Hata， T. 等人， Biochem.Biophys.Res.Commun.， 396(2) ： 528-533， 2010非专利文献 22 ： Chen， X. 等人， Cell Research， (2010) ： 1-10发明内容 发明要解决的问题
     本发明的目的为提供产生具有免疫调节作用的乳的食物的筛选方法、 一种具有免 疫调节作用的新型食品及其生产方法。
     用于解决问题的方案
     本发明的发明人根据注意到母乳影响婴儿免疫系统成熟的事实进行了研究。结 果， 他们发现与免疫相关的 miRNA 在母乳中高度表达， 并且完成了本发明。
     因此本发明提供食物或物质的筛选方法， 所述食物或物质产生具有免疫调节作用 的母乳， 所述方法包括通过利用乳中微小 RNA 谱 (profile) 与由哺乳动物摄取的食物或包 含于所述食物中的物质的相关性作为指标来鉴定使存在于所述哺乳动物乳中的微小 RNA 的量增加或减少的所述食物或物质。
     在前述方法的实施方案中， 所述免疫调节作用为免疫增强作用， 并且当微小 RNA 的量增加时， 判定为所述食物或物质产生具有免疫增强作用的母乳。
    在前述方法的优选实施方案中， 比较食物摄取前后所观察到的乳中的微小 RNA 谱， 并且当摄取后所观察到的至少一种微小 RNA 的量高于摄取前所观察到的量时， 判定所 述食物使所述乳中的所述微小 RNA 的量增加。
     在前述方法的另一优选实施方案中， 比较所述乳中的微小 RNA 谱和血清或血浆中 的微小 RNA 谱， 当包含于所述乳和所述血清或血浆二者中的微小 RNA 的存在量在摄取所述 食物后使包含于所述乳中的微小 RNA 的存在量是所述血清或血浆中的微小 RNA 的存在量的 1.2 倍以上时， 判定所述食物使所述乳中的所述微小 RNA 的量增加。
     在前述方法的另一实施方案中， 所述免疫调节作用为免疫抑制作用， 并且当所述 微小 RNA 的量减少时， 判定所述食物或物质产生具有免疫抑制作用的母乳。
     在前述方法的优选实施方案中， 比较所述食物摄取前后所观察到的所述乳中的微 小 RNA 谱， 并且当摄取后所观察到的至少一种微小 RNA 的量低于摄取前所观察到的量时， 判 定所述食物使所述乳中的所述微小 RNA 的量减少。
     在前述方法的优选实施方案中， 比较所述乳中的微小 RNA 谱和血清或血浆中的微 小 RNA 谱， 当包含于所述乳和所述血清或血浆二者中的微小 RNA 的存在量在摄取所述食物 后使所述乳中的微小 RNA 的存在量为在血清或血浆中的微小 RNA 的存在量的 0.8 倍以下 时， 判定所述食物使所述乳中的所述微小 RNA 的量减少。
     在前述方法的优选实施方案中， 所述哺乳动物为人类。
     在前述方法的优选实施方案中， 所述微小 RNA 谱由微小 RNA 的量组成， 所述微 小 RNA 选自由以下组成的组 ： miR-10、 miR-15、 miR-16、 miR-17、 miR-18、 miR-19、 miR-20、 miR-21、 miR-22、 miR-23、 miR-24、 miR-25、 miR-26、 miR-27、 miR-28、 miR-29、 miR-30、 miR-31、 miR-33、 miR-34、 miR-92、 miR-93、 miR-96、 miR-98、 miR-99、 miR-100、 miR-101、 miR-103、 miR-106、 miR-107、 miR-125、 miR-126、 miR-128、 miR-129、 miR-130、 miR-133、 miR-134、 miR-139、 miR-140、 miR-141、 miR-143、 miR-146、 miR-148、 miR-151、 miR-152、 miR-155、 miR-181、 miR-182、 miR-183、 miR-184、 miR-185、 miR-186、 miR-188、 miR-192、 miR-193、
     miR-195、 miR-196、 miR-199、 miR-200、 miR-203、 miR-204、 miR-205、 miR-206、 miR-210、 miR-212、 miR-214、 miR-218、 miR-219、 miR-221、 miR-222、 miR-223、 miR-290、 miR-291、 miR-292、 miR-294、 miR-296、 miR-301、 miR-320、 miR-322、 miR-324、 miR-327、 miR-328、 miR-331、 miR-338、 miR-340、 miR-341、 miR-342、 miR-345、 miR-347、 miR-352、 miR-361、 miR-362、 miR-365、 miR-370、 miR-375、 miR-378、 miR-409、 miR-425、 miR-429、 miR-452、 miR-455、 miR-465、 miR-466、 miR-483、 mi R-484、 miR-486、 miR-494、 miR-497、 miR-500、 miR-503、 miR-532、 miR-542、 miR-584、 miR-652、 miR-664、 miR-672、 miR-685、 miR-708、 miR-760、 miR-872、 miR-874、 miR-877、 miR-1224、 miR-1300、 miR-1307、 let-7a、 let-7b、 let-7c、 let-7d、 le-7e、 let-7f 和 let-7i。
     在前述方法的优选实施方案中， 所述微小 RNA 谱由微小 RNA 的量组成， 所述微 小 RNA 选自由以下组成的组 ： miR-15、 miR-16、 miR-17、 miR-18、 miR-19、 miR-20、 miR-21、 miR-23、 miR-24、 miR-26、 miR-27、 miR-29、 miR-30、 miR-33、 miR-34、 miR-92、 miR-93、 miR-99、 miR-100、 miR-101、 miR-106、 miR-107、 miR-125、 miR-130、 miR-140、 miR-141、 miR-143、 miR-146、 miR-155、 miR-181、 miR-185、 miR-186、 miR-192、 miR-193、 miR-195、 miR-200、 miR-205、 miR-210、 miR-218、 miR-219、 miR-221、 miR-222、 miR-223、 miR-301、 miR-322、 miR-340、 miR-361、 miR-370、 miR-429、 miR-455、 miR-466、 miR-497、 miR-500、 miR-503、 miR-532、 miR-542、 let-7d 和 let-7i。 在前述方法的优选实施方案中， 所述微小 RNA 谱由微小 RNA 的量组成， 所述微 小 RNA 选自由以下组成的组 ： miR-15、 miR-16、 miR-19、 miR-21、 miR-23、 miR-24、 miR-26、 miR-27、 miR-30、 miR-34、 miR-99、 miR-106、 miR-107、 miR-125、 miR-130、 miR-140、 miR-181、 miR-193、 miR-210、 miR-222、 miR-223、 miR-361、 miR-370、 miR-429、 miR-500、 miR-532、 let-7d 和 let-7i。
     本发明还提供一种生产具有免疫调节作用的乳或乳制品的方法， 其包括给予哺乳 动物 ( 除人以外 ) 食物或物质的步骤， 所述食物或物质通过前述筛选方法被鉴定为使所述 哺乳动物的乳中微小 RNA 的量增加或减少， 以及收集所述哺乳动物的乳的步骤。
     在前述方法的实施方案中， 所述免疫调节作用为免疫增强作用， 并且将所述食物 或物质鉴定为使所述微小 RNA 的量增加。
     在前述方法的实施方案中， 所述免疫调节作用为免疫抑制作用， 并且将所述食物 或物质鉴定为使所述微小 RNA 的量减少。
     本发明还提供一种具有免疫增强作用的口服摄取用组合物， 其包括口服摄取用组 合物的基质和添加至所述基质的微小 RNA。
     在 所 述 口 服 摄 取 用 组 合 物 的 优 选 实 施 方 案 中， 所 述 微 小 RNA 选 自 由 miR-10、 miR-15、 miR-16、 miR-17、 miR-18、 miR-19、 miR-20、 miR-21、 miR-22、 miR-23、 miR-24、 miR-25、 miR-26、 miR-27、 miR-28、 miR-29、 miR-30、 miR-31、 miR-33、 miR-34、 miR-92、 miR-93、 miR-96、 miR-98、 miR-99、 miR-100、 miR-101、 miR-103、 miR-106、 miR-107、 miR-125、 miR-126、 miR-128、 miR-129、 miR-130、 miR-133、 miR-134、 miR-139、 miR-140、 miR-141、 miR-143、 miR-146、 miR-148、 miR-151、 miR-152、 miR-155、 miR-181、 miR-182、 miR-183、 miR-184、 miR-185、 miR-186、 miR-188、 miR-192、 miR-193、 miR-195、 miR-196、 miR-199、 miR-200、 miR-203、 miR-204、 miR-205、 miR-206、 miR-210、 miR-212、 miR-214、 miR-218、 miR-219、
     miR-221、 miR-222、 miR-223、 miR-290、 miR-291、 miR-292、 miR-294、 miR-296、 miR-301、 miR-320、 miR-322、 miR-324、 miR-327、 miR-328、 miR-331、 miR-338、 miR-340、 miR-341、 miR-342、 miR-345、 miR-347、 miR-352、 miR-361、 miR-362、 miR-365、 miR-370、 miR-375、 miR-378、 miR-409、 miR-425、 miR-429、 miR-452、 miR-455、 miR-465、 miR-466、 miR-483、 miR-484、 miR-486、 miR-494、 miR-497、 miR-500、 miR-503、 miR-532、 miR-542、 miR-584、 miR-652、 miR-664、 miR-672、 miR-685、 mi R-708、 miR-760、 miR-872、 miR-874、 miR-877、 miR-1224、 miR-1300、 miR-1307、 let-7a、 let-7b、 let-7c、 let-7d、 le-7e、 let-7f 和 let-7i 组成的组。
     在 所 述 口 服 摄 取 用 组 合 物 的 优 选 实 施 方 案 中， 所 述 微 小 RNA 选 自 由 miR-15、 miR-16、 miR-17、 miR-18、 miR-19、 miR-20、 miR-21、 miR-23、 miR-24、 miR-26、 miR-27、 miR-29、 miR-30、 miR-33、 miR-34、 miR-92、 miR-93、 miR-99、 miR-100、 miR-101、 miR-106、 miR-107、 miR-125、 miR-130、 miR-140、 miR-141、 miR-143、 miR-146、 miR-155、 miR-181、 miR-185、 miR-186、 miR-192、 miR-193、 miR-195、 miR-200、 miR-205、 miR-210、 miR-218、 miR-219、 miR-221、 miR-222、 miR-223、 miR-301、 miR-322、 miR-340、 miR-361、 miR-370、 miR-429、 miR-455、 miR-466、 miR-497、 miR-500、 miR-503、 miR-532、 miR-542、 let-7d 和 let-7i 组成 的组。 在 所 述 口 服 摄 取 用 组 合 物 的 优 选 实 施 方 案 中， 所 述 微 小 RNA 选 自 由 miR-15、 miR-16、 miR-19、 miR-21、 miR-23、 miR-24、 miR-26、 miR-27、 miR-30、 miR-34、 miR-99、 miR-106、 miR-107、 miR-125、 miR-130、 miR-140、 miR-181、 miR-193、 miR-210、 miR-222、 miR-223、 miR-361、 miR-370、 miR-429、 miR-500、 miR-532、 let-7d 和 let-7i 组成的组。
     在所述口服摄取用组合物的优选实施方案中， 所述组合物为婴儿用食品或幼儿用 食品。
     在所述口服摄取用组合物的优选实施方案中， 所述婴儿用食品或幼儿用食品为婴 儿配方 (formula) 或较大婴儿配方 (follow-up formula)。
    【附图说明】
    图 1 示出通过微阵列分析 (microarray analysis) 获得的人母乳中 miRNA 的检测结果。 图 2 示出出生后前六个月和其后六个月的母乳中 miR-181a 水平的比较。 hsa 表示 人类， cel 表示线虫 ( 秀丽隐杆线虫 Caenorhabditis elegans)( 下图应同样应用 )。
     图 3 示出出生后前六个月和其后六个月的母乳中 miR-155、 miR-17 和 miR-92 水平 的比较。
     图 4 示出人母乳和血清中免疫相关 miRNA 水平的比较
     图 5 示出冻融前后所观察到的 miRNA 水平的比较。
     图 6 示出低 pH(pH1) 下保存前后所观察到的 miRNA 水平的比较。
     图 7 示出 RNase 处理后和无 RNase 处理所观察到的 miRNA 水平的比较。
    具体实施方式
     本发明的方法为食物或物质的筛选方法， 所述食物或物质产生具有免疫调节作用的母乳， 所述筛选方法包括基于乳中的微小 RNA 谱与哺乳动物摄取的食物或包含于所述食 物中的物质的相关性来鉴定使存在于哺乳动物乳中的微小 RNA 的量增加或减少的所述食 物或物质。
     在本发明的前述方法的实施方案中， 所述免疫调节作用为免疫增强作用， 并且当 微小 RNA 的量增加时， 判定所述食物或物质产生具有免疫增强作用的母乳。在本发明的前 述方法的另一实施方案中， 所述免疫调节作用为免疫抑制作用， 并且当所述微小 RNA 的量 减少时， 判定所述食物或物质产生具有免疫抑制作用的母乳。
     本发明基于以下观点 ： 期望通过 miRNA 的口服给药来获得免疫调节作用， 这是由 于新发现 miRNA 包含于乳中， 和即使在胃中的酸性条件下 miRNA 也可稳定地存在以及母乳 促进摄取母乳的婴儿中免疫发育的事实 ( 例如， Breastfeed Med.， 2(4) ： 195-204， 2007)。 并且， 基于乳中 miRNA 谱受饮食影响的预测， 构想鉴定可使存在于乳中的 miRNA 的量增加或 减少的食物或包含于食物的活性成分。
     为本发明的筛选方法、 乳和乳制品等所定义的免疫调节作用包括， 例如， 两种作 用： 为对抗外来攻击的 “防御” 目的而起作用的增加免疫增强作用的作用 ( 免疫增强作用 ) 和为对抗免疫过度反应即过敏反应、 自身免疫病、 慢性炎症等 ( 其中 “超免疫反应” 不利地 影响生物体 ) 而起抑制作用的免疫抑制作用。
     术语 “免疫增强作用” 和 “免疫抑制作用” 以相对含义使用。当对于某一哺乳动 物母乳通常观察到的免疫增强作用在摄取食物或物质后增强时， 所述母乳具有免疫增强作 用， 而当免疫增强作用降低时， 所述母乳具有免疫抑制作用。 当食物或物质被哺乳动物摄取 后所观察到的免疫增强作用与摄取前所观察的作用相比增强时， 所述哺乳动物的母乳具有 免疫增强作用， 而当免疫增强作用与摄取前所观察到的作用相比降低时， 所述母乳具有免 疫抑制作用。
     可以例如以如下所述来研究哺乳动物乳中的 miRNA 谱和被所述哺乳动物摄取的 食物或包含于所述食物中的物质的相关性。
     收集来自摄取食物的哺乳动物的乳， 检测乳中的 miRNA 谱。
     所述哺乳动物不特别限定， 实例包括人、 牛、 山羊、 绵羊、 猪、 猿、 狗、 猫、 大鼠、 小鼠、 仓鼠和豚鼠等。所述哺乳动物优选人或牛。
     本发明中， 所述 miRNA 谱由 miRNA 的种类和量组成。 所述 miRNA 可由一种 miRNA 组 成或由两种以上 miRNA 组成。miRNA 的种类不特别限定， 只要选择存在于乳中的那些即可， 并且实例包括 miR-10、 miR-15、 miR-16、 miR-17、 miR-18、 miR-19、 miR-20、 miR-21、 miR-22、 miR-23、 miR-24、 miR-25、 miR-26、 miR-27、 miR-28、 miR-29、 miR-30、 miR-31、 miR-33、 miR-34、 miR-92、 miR-93、 miR-96、 miR-98、 miR-99、 miR-100、 miR-101、 miR-103、 miR-106、 miR-107、 miR-125、 miR-126、 miR-128、 miR-129、 miR-130、 miR-133、 miR-134、 miR-139、 miR-140、 miR-141、 miR-143、 miR-146、 miR-148、 miR-151、 miR-152、 miR-155、 miR-181、 miR-182、 miR-183、 miR-184、 miR-185、 miR-186、 miR-188、 miR-192、 miR-193、 miR-195、 miR-196、 miR-199、 miR-200、 miR-203、 miR-204、 miR-205、 miR-206、 miR-210、 miR-212、 miR-214、 miR-218、 miR-219、 miR-221、 miR-222、 miR-223、 mi R-290、 miR-291、 miR-292、 miR-294、 miR-296、 miR-301、 miR-320、 miR-322、 miR-324、 miR-327、 miR-328、 miR-331、 miR-338、 miR-340、 miR-341、 miR-342、 miR-345、 miR-347、 miR-352、 miR-361、 miR-362、 miR-365、miR-370、 miR-375、 miR-378、 miR-409、 miR-425、 miR-429、 miR-452、 miR-455、 miR-465、 miR-466、 miR-483、 miR-484、 miR-486、 miR-494、 miR-497、 miR-500、 miR-503、 miR-532、 miR-542、 miR-584、 miR-652、 miR-664、 miR-672、 miR-685、 miR-708、 miR-760、 miR-872、 miR-874、 miR-877、 miR-1224、 miR-1300、 miR-1307、 let-7a、 let-7b、 let-7c、 let-7d、 le-7e、 let-7f 和 let-7i 等。
     这些 miRNA 为证实存在于或者人母乳、 大鼠初乳或者牛初乳之一中的那些。如 上所述， 已知母乳促进摄取母乳的婴儿中的免疫发育 ( 例如， Breastfeed Med.， 2(4) ： 195-205， 2007)。此外， 已报道被认为对婴儿 ( 包括动物幼仔 ) 的免疫系统重要的许多组分 通常包含于初乳中 (J.Anim.Sci.， 2009， 87 ： (Suppl.1) ： 3-9)。因此， 提示已证实存在于乳 中的前述 miRNA 参与免疫作用。
     在以上提及的那些中， 优选的是 miR-15、 miR-16、 miR-17、 miR-18、 miR-19、 miR-20、 miR-21、 miR-23、 miR-24、 miR-26、 miR-27、 miR-29、 miR-30、 miR-33、 miR-34、 miR-92、 miR-93、 miR-99、 miR-100、 miR-101、 miR-106、 miR-107、 miR-125、 miR-130、 miR-140、 miR-141、 miR-143、 miR-146、 miR-155、 miR-181、 miR-185、 miR-186、 miR-192、 miR-193、 miR-195、 miR-200、 miR-205、 miR-210、 miR-218、 miR-219、 miR-221、 miR-222、 miR-223、 miR-301、 miR-322、 miR-340、 miR-361、 miR-370、 miR-429、 miR-455、 miR-466、 miR-497、 miR-500、 miR-503、 miR-532、 miR-542、 let-7d 和 let-7i。这些是已报道其免疫调节作用的 miRNA、 已 证实存在于大鼠和牛二者的初乳中的 miRNA 或在服用双歧杆菌属 (Bifidobacterium) 细菌 的大鼠的初乳中量增加的 miRNA。 此外， 在以上提及的 miRNA 中， 特别优选的是 miR-15、 miR-16、 miR-19、 miR-21、 miR-23、 miR-24、 miR-26、 miR-27、 miR-30、 miR-34、 miR-99、 miR-106、 miR-107、 miR-125、 miR-130、 miR-140、 miR-181、 miR-193、 miR-210、 miR-222、 miR-223、 miR-361、 miR-370、 miR-429、 miR-500、 miR-532、 let-7d 和 let-7i。这些是已证实存在于大鼠和牛二者的初乳 中的 miRNA。
     某些 miRNA 具有亚型， 例如对于 miR-181、 miR-92、 miR-125 和 miR-146 等各自已 知 2 至 4 种亚型， 如分别为 miR-181a、 miR-181b、 miR-181c、 miR-181d、 miR-92a、 miR-92b、 miR-125a、 miR-125a-3P、 miR-125a-5P、 miR-125b、 miR-146a、 miR-146b、 miR-146b-3P 和 miR-146b-5P。某些其他 miRNA 也具有亚型， 并且在本发明中， miRNA 可为这样的任何亚型。 所述亚型的实例包括下文描述的实施例中 ( 指实施例 1、 3、 4 和 5) 证实存在于乳中的那些。
     人 miR-155 前 体 has-mir-155(MI0000681)， 及 其 活 性 位 点 has-miR-155(MIMAT 0009241) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NOS ： 1 和 2。 示于括号内的为 miRNA 数据库的登录 号 (miRBase::Sequences， http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/index.shtml)( 以 下描述应同样适用 )。
     牛 miR-155 前 体 bta-miR-155(MI0009752) ， 及 其 活 性 位 点 bta-miR-155(MIMAT0000646) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NOS ： 3 和 4。
     人 miR-181 前体 hsa-mir-181a-1(MI0000289) 和 hsa-mir-181a-2(MI0000269)， 及 其活性位点 hsa-miR-181a(MIMAT0000256) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NO S ： 5、 6 和 7。
     人 miR-181b 前体 hsa-mir-181b-1(MI0000270) 和 hsa-mir-181b-2(MI0000683)， 及其活性位点 hsa-miR-181b(MIMAT0000257) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NO S ： 8、 9和
     10。 牛 miR-181a 前体 bta-mir-181a(MI0004757) 和 bta-mir-181a-1(MI0010484)， 及 其活性位点 bta-miR-181a(MIMAT0003543) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NO S ： 11、 12 和 13。
     牛 miR-181b 前 体 bta-mir-181b-1(MI0010485) 和 bta-mir-181b-2(MI0005013)， 及其活性位点 bta-miR-181b(MIMAT0003793) 的核苷酸序列 分别示于 SEQ ID NOS ： 14、 15 和 16。
     人 miR-223 前 体 hsa-mir-223(MI0000300) ， 及 其 活 性 位 点 hsa-miR-223(MIMAT0000280) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NOS ： 17 和 18。
     牛 miR-223 前 体 bta-mir-223(MI0009782) ， 及 其 活 性 位 点 bta-miR-223(MIMAT0009270) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NOS ： 19 和 20。
     人 miR-17 前 体 的 核 苷 酸 序 列 hsa-mir-17(MI0000071)，及 其 活 性 位 点 hsa-miR-17(MIMAT0000070)( 又称 hsa-miR-17-5p)， 分别示于 SEQ ID NO S ： 21 和 22。
     牛 miR-17 前 体 bta-mir-17(MI0005031) 及 其 活 性 位 点 bta-miR-17-5p(MIMAT0003815) 和 bta-miR-17-3p(MIMAT0003816) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NO S ： 23、 24 和 25。
    人 miR-92a 前体 hsa-mir-92a-1(MI0000093) 和 hsa-mir-92a-2(MI0000094) 及其 活性位点 hsa-miR-92a(MIMAT0000092) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NO S ： 26、 27 和 28。
     人 miR-92b 前 体 hsa-mir-92b(MI0003560) 及 其 活 性 位 点 hsa-miR-92b(MIMAT0003218) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NOS ： 29 和 30。
     牛 miR-92 前 体 bta-mir-92(MI0005024) 及 其 活 性 位 点 bta-miR-92(MIMAT0003808) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NOS ： 31 和 32。
     牛 miR-92a 前 体 bta-mir-92a(MI0009905) 及 其 活 性 位 点 bta-miR-92a(MIMAT0009383) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NOS ： 33 和 34。
     牛 miR-92b 前 体 bta-mir-92b(MI0009906) 及 其 活 性 位 点 bta-miR-92b(MIMAT 0009384) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NOS ： 35 和 36。
     人 let-7i 前 体 hsa-let-7i(MI0000434) 及 其 活 性 位 点 hsa-let-7i(MIMAT0000415) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NOS ： 37 和 38。
     牛 let-7i 前 体 bta-let-7i(MI0005065) 及 其 活 性 位 点 bta-let-7i(MIMAT0003851) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NOS ： 39 和 40。
     人 miR-125a 前 体 hsa-mir-125a(MI0000469) 及 其 活 性 位 点 hsa-miR-125a-5p(MIMAT0000443) 和 hsa-miR-125a-3p(MIMAT0004602) 的核苷酸序列分别 示于 SEQ ID NO S ： 41、 42 和 43。
     人 miR-125b 前 体 hsa-mir-125b-1(MI0000446) 和 hsa-mir-125b-2(MI0000470) 及其活性位点 hsa-miR-125b(MIMAT0000423) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NO S ： 44、 45 和 46。
     牛 miR-125a 前 体 bta-mir-125a(MI0004752) 及 其 活 性 位 点 bta-miR-125a(MIMAT0003538) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NOS ： 47 和 48。
     牛 miR-125b 前 体 bta-mir-125b-1(MI0004753) 和 bta-mir-125b-2(MI0005457)
     及其活性位点 bta-miR-125b(MIMAT0003539) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NO S ： 49、 50 和 51。
     人 miR-146a 前 体 hsa-mir-146a(MI0000477) 及 其 活 性 位 点 hsa-miR-146a(MIMAT0000449) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NOS ： 52 和 53。
     人 miR-146b 前 体 的 核 苷 酸 序 列 hsa-mir-146b(MI0003129) 及 其 活 性 位 点 hsa-miR-146b-5p(MIMAT0002809)( 也 称 为 hsa-miR-146b) 和 hsa-miR-146b-3p(MIMAT 0004766) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NOS ： 54、 55 和 56。
     牛 miR-146a 前 体 bta-mir-146a(MI0009746) 及 其 活 性 位 点 bta-miR-146a(MIMAT0009236) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NOS ： 57 和 58。
     牛 miR-146b 前 体 bta-mir-146b(MI0009745) 及 其 活 性 位 点 bta-miR-146b(MIMAT0009235) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NOS ： 59 和 60。
     人 miR-150 前 体 hsa-mir-150(MI0000479) 及 其 活 性 位 点 hsa-miR-150(MIMAT 0000451) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NOS ： 61 和 62。
     牛 miR-150 前 体 bta-mir-150(MI0005058) 及 其 活 性 位 点 bta-miR-150(MIMAT0003845) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NOS ： 63 和 64。 除前述 miRNA 外， 将已证实存在于大鼠或牛的乳中的 miRNA 和与这些 miRNA 相应 的其他动物的 miRNA 示于表 1 至 10。
     表1
    
    
    表2
    
    表3
    
    表4
    
    表5
    
    表6
    
    表7
    
    表8
    
    表9
    
    表 10miRNA 不限制为具有前述序列的那些， 所述 miRNA 可包括一个或几个核苷酸的替 换、 缺失、 插入、 增添或倒位， 只要 miRNA 具有作为 miRNA 的功能， 即， miRNA 可调节靶基因的 表达即可。特别地， 此类 miRNA 的实例包括具有与前述任一序列显示 80％以上、 优选 90％ 以上、 更优选 95％以上的同源性的核苷酸序列的 RNA。
     miRNA 的量可为绝对量或相对量。 相对量可为基于动物中的平均量的相对量， 或可
     为基于食物摄取前所观察到的量， 在食物摄取后所观察到的相对量。 对于核酸量的测定， 可 采用通常用于 miRNA 量测定的方法如定量逆转录 PCR(qRT-PCR)。miRNA 的量还可通过微阵 列法测定。关于乳中 miRNA 的提取， 可采用通常用于 miRNA 提取的方法， 还可使用商购可得 的 miRNA 分离试剂盒。
     另外， 存在于乳中的 miRNA 的量还可通过测定乳腺细胞中 miRNA 的表达量来间接 测定。
     检测哺乳动物乳中的 miRNA 谱和由该哺乳动物摄取的食物或包含于所述食物中 的物质的相关性。哺乳动物乳中的 miRNA 谱和由该哺乳动物摄取的食物或包含于所述食物 中的物质的相关性是指 miRNA 谱与所述物质的存在或缺失或者所述物质的量的相关性。例 如， 如果已摄取某一物质的动物的乳中一种以上 miRNA 的量大于或小于未摄取该物质的动 物中所观察到的那些， 则该物质和 miRNA 谱分别具有正或负相关性。另外， 如果某一物质的 摄取不影响 miRNA 谱， 则该物质和 miRNA 谱互不相关。
     具体地， 例如， 当比较食物摄取前后所观察到的乳中的 miRNA 谱时， 摄取后所观察 到的一种、 优选两种以上、 更优选五种以上 miRNA 的量大于摄取前所观察到的那些， 则判定 该食物使存在于乳中的 miRNA 的量增加。
     另外， 当比较食物摄取前后所观察到的乳中的 miRNA 谱时， 摄取后所观察到的一 种、 优选两种以上、 更优选五种以上 miRNA 的量小于摄取前所观察到的那些， 则判定该食物 使存在于乳中的 miRNA 的量降低。
     此外， 食物摄取前 miRNA 谱的测定并不是不可缺少的， 食物和 miRNA 量的相关性还 可通过比较在摄取食物后测定的 miRNA 谱与预先测定的对象哺乳动物的普通 miRNA 谱来测 定。
     在另一实施方案中， 比较乳中的 miRNA 谱和血清或血浆中的 miRNA 谱， 如果乳和 血清或血浆二者中包含的 miRNA 的存在量， 通过摄取食物使乳中所观察到的 miRNA 的存 在量比血清或血浆中所观察到的 miRNA 的存在量更高的话， 则判定该食物使存在于乳中的 miRNA 的存在量增加。 与血清或血浆中的 miRNA 的存在量相比， 乳中 miRNA 的存在量高的程 度为例如 1.2 倍以上、 优选 2 倍以上、 更优选 5 倍以上、 还更优选 10 倍以上。
     另外， 当比较乳中的 miRNA 谱和血清或血浆中的 miRNA 谱时， 如果乳和血清或血浆 二者中包含的 miRNA 的量， 通过摄取食物而使乳中的量比血清或血浆中所观察到的量更低 的话， 则判定该食物使存在于乳中的 miRNA 的量减少。与血清或血浆中所观察到的 miRNA 存在量相比， 乳中 miRNA 的存在量低的程度为例如 0.8 倍以下、 优选 0.5 倍以下、 更优选 0.2 倍以下、 还更优选 0.1 倍以下。
     所述食物可由单一物质组成或可为组合物， 只要其可口服摄取即可。另外， “摄取 前” 和 “摄取后” 可意为 “一次食物摄取之前和之后” 或 “两次以上食物摄取之前和之后” 。 另外， 两次以上食物摄取可为两次以上相同食物的摄取， 或两种以上食物的摄取。
     所述食物可为根据既定计划摄取或自由摄取。后一种情况中， 所述食物和乳中 miRNA 谱的相关性人类情况中可通过获取 (hearing) 所摄取的食物的含量来检测。当根据 既定计划摄取或服用所述食物时， 所述食物可被认为是 “试样” 。所述食物可为普通食物或 包含试验物质的普通食物。摄取的食物量、 摄取的时间和摄取的次数不特别限定。
     如果选择使乳中 miRNA 的量增加的食物， 则包含于所述食物并使乳中 miRNA 的量增加的物质可用如上述相同的方式鉴定。另外， 如果选择使乳中 miRNA 的量减少的食物， 则 包含于所述食物并使乳中 miRNA 的量减少的物质可用如上述相同的方式鉴定。
     如果鉴定出增加或减少乳中 miRNA 的量的食物或物质， 则可设计使乳中 miRNA 的 量增加或减少的食物。即， 认为使乳中 miRNA 的量增加的食物或包含于其中的物质是产生 具有免疫增强作用的乳所优选的， 而使乳中 miRNA 的量减少的食物或包含于其中的物质不 是产生具有免疫增强作用的乳所优选的。
     另外， 认为使乳中 miRNA 的量减少的食物或包含于其中的物质是产生具有免疫抑 制作用的乳所优选的， 而使乳中 miRNA 的量增加的食物或包含于其中的物质不是产生具有 免疫抑制作用的乳所优选的。
     可如上所述进行产生具有免疫调节作用的母乳的食物或物质， 或不适于产生具有 免疫调节作用的母乳的食物或物质的筛选。如下文所述实施例中所示， 在大鼠和牛的初乳 中证实存在各种 miRNA。 这支持了本发明的观点， 即期望 miRNA 的口服给药提供免疫调节作 用。 另外， 如下文所述实施例中所示， 当将双歧杆菌属细菌 ( 长双歧杆菌 (Bifidobacterium longum)) 对大鼠口服给药时， 52 种 miRNA 的量增加。
     已知双歧杆菌属细菌作为益生菌行使功能， 并特别地具有免疫调节作用。 因此， 服 用双歧杆菌属细菌使乳中 miRNA 的量增加的事实也支持乳中 miRNA 参与免疫调节。通过服 用双歧杆菌属细菌诱导的乳中 miRNA 的量增加的论证， 即双歧杆菌属细菌与 miRNA 谱的相 关性， 显示出本发明的筛选方法是可行的。 另外， 尽管还存在通过服用双歧杆菌属细菌不改 变其在乳中的量的 miRNA， 但不否认可通过另一种食物或包含于其中的物质使那些 miRNA 的量增加的可能性。
     作为双歧杆菌属细菌的益生菌功能， 已知防御或改善呼吸道感染、 急性感染性腹 泻、 抗生素相关性腹泻、 艰难梭菌 (Clostridium dificile) 相关性腹泻、 坏死性肠结肠 炎 (necrotizing enterocolitis)、 旅行者腹泻 (traveler’ s diarrhea) 和幽门螺杆菌 (Helicobacter pylori) 感染等 (The Journal of Nutrition， 2010Mar ； 140(3) ： 698S-712S Epub 2010Jan 27)。表明通过服用双歧杆菌属细菌而使其在乳中的量增加的 miRNA 不仅调 节免疫， 而且在摄取双歧杆菌属细菌的动物中显示的功能类似于前述益生菌的功能。
     通过给予哺乳动物如上所述选择的使乳中 miRNA 量增加的食物或物质， 并从该动 物中收集乳， 可获得具有免疫增强作用的乳或其免疫增强作用增强的乳。 另外， 通过减少或 避免哺乳动物摄取上述选择的使乳中 miRNA 量减少的食物或物质， 可增强乳的免疫增强作 用， 或可预防免疫增强作用的降低。
     另外， 可将使乳中 miRNA 量增加的食物或物质的摄取以及减少或避免使乳中 miRNA 量减少的食物或物质的摄取结合起来。另外， 通过给予哺乳动物上述选择的使乳中 miRNA 量减少的食物或物质， 并从该动物中收集乳， 可获得具有免疫抑制作用的乳或其免疫 增强作用减少的乳。另外， 通过减少或避免哺乳动物摄取上述选择的使乳中 miRNA 量增加 的食物或物质， 可增强乳的免疫抑制作用， 或可降低乳的免疫增强作用。另外， 可将使乳中 miRNA 量减少的食物或物质的摄取以及减少或避免使乳中 miRNA 量增加的食物或物质的摄 取结合起来。
     通过处理上述获得的具有免疫调节作用的乳， 可产生具有免疫调节作用的乳制 品。乳制品的类型不特别限定， 只要 miRNA 在维持其功能的情况下可存在于乳制品中 即可， 实例包括加工乳、 婴儿配方、 乳饮料、 婴儿配方奶粉 (powdered infant formula)、 发 酵乳、 奶油、 黄油、 奶酪和冰淇淋等。作为乳制品， 优选婴儿或幼儿用乳制品。
     根据本发明， 已证实乳中 miRNA 的存在， 特别是已知参与免疫增强例如免疫发育、 抗过敏、 抗炎和预防感染的 miRNA。此外， 众所周知， 母乳对摄取其的婴儿给予免疫增强作 用。 因此， 参与免疫调节的 miRNA 可调节摄取其的生物体例如人类的免疫是合理地预测。 由 于 miRNA 是调节各种基因表达的物质， 因此认为此类调节分子从母体至婴儿的转移特别是 对具有未发育的免疫系统的婴儿来说是极其重要的。
     本发明的另一方面是具有免疫增强作用的口服摄取用组合物， 其通过向口服摄取 用组合物的基质中添加 miRNA 而制备。
     所述 miRNA 的实例包括 miR-10、 miR-15、 miR-16、 miR-17、 miR-18、 miR-19、 miR-20、 miR-21、 miR-22、 miR-23、 miR-24、 miR-25、 miR-26、 miR-27、 miR-28、 miR-29、 miR-30、 miR-31、 miR-33、 miR-34、 miR-92、 miR-93、 miR-96、 miR-98、 miR-99、 miR-100、 miR-101、 miR-103、 miR-106、 miR-107、 miR-125、 miR-126、 miR-128、 miR-129、 miR-130、 miR-133、 miR-134、 miR-139、 miR-140、 miR-141、 miR-143、 miR-146、 miR-148、 miR-151、 miR-152、 miR-155、 miR-181、 miR-182、 miR-183、 miR-184、 miR-185、 miR-186、 miR-188、 miR-192、 miR-193、 miR-195、 miR-196、 miR-199、 miR-200、 miR-203、 miR-204、 miR-205、 miR-206、 miR-210、 miR-212、 miR-214、 miR-218、 miR-219、 miR-221、 miR-222、 miR-223、 miR-290、 miR-291、 miR-292、 miR-294、 miR-296、 miR-301、 miR-320、 miR-322、 miR-324、 miR-327、 miR-328、 miR-331、 miR-338、 miR-340、 miR-341、 miR-342、 miR-345、 miR-347、 miR-352、 miR-361、 miR-362、 miR-365、 miR-370、 miR-375、 miR-378、 miR-409、 miR-425、 miR-429、 miR-452、 miR-455、 miR- 465、 miR-466、 miR-483、 miR-484、 miR-486、 miR-494、 miR-497、 miR-500、 miR-503、 miR-532、 miR-542、 miR-584、 miR-652、 miR-664、 miR-672、 miR-685、 miR-708、 miR-760、 miR-872、 miR-874、 miR-877、 miR-1224、 miR-1300、 miR-1307、 let-7a、 let-7b、 let-7c、 let-7d、 le-7e、 let-7f 和 let-7i 等。
     在 上 述 miRNA 中， miR-15、 miR-16、 miR-17、 miR-18、 miR-19、 miR-20、 miR-21、 miR-23、 miR-24、 miR-26、 miR-27、 miR-29、 miR-30、 miR-33、 miR-34、 miR-92、 miR-93、 miR-99、 miR-100、 miR-101、 miR-106、 miR-107、 miR-125、 miR-130、 miR-140、 miR-141、 miR-143、 miR-146、 miR-155、 miR-181、 miR-185、 miR-186、 miR-192、 miR-193、 miR-195、 miR-200、 miR-205、 miR-210、 miR-218、 miR-219、 miR-221、 miR-222、 miR-223、 miR-301、 miR-322、 miR-340、 miR-361、 miR-370、 miR-429、 miR-455、 miR-466、 miR-497、 miR-500、 miR-503、 miR-532、 miR-542、 let-7d 和 let-7i 是优选的， 而 miR-15、 miR-16、 miR-19、 miR-21、 miR-23、 miR-24、 miR-26、 miR-27、 miR-30、 miR-34、 miR-99、 miR-106、 miR-107、 m iR-125、 miR-130、 miR-140、 miR-181、 miR-193、 miR-210、 miR-222、 miR-223、 miR-361、 miR-370、 miR-429、 miR-500、 miR-532、 let-7d 和 let-7i 是更优选的。
     所述 miRNA 可由单种 miRNA 组成或由任意的两种以上 miRNA 组成。
     口服摄取用组合物的基质不特别限定， 只要选择 miRNA 可在其中维持其功能而存 在的口服摄取的或可给药的基质即可， 实例包括食品、 饮品、 药品基质和动物饲料等。
     食品可以为任何形式， 并包括饮品。 食品包括成人用食品、 婴儿用食品和幼儿用食品等。
    成人用食品的实例包括肠内营养物、 流体食物例如浓缩的流体食物和营养增补食品等。 婴儿用食品或幼儿用食品的实例包括， 例如调制乳类 (modified milk)( 例如， 婴 儿配方、 低出生体重 (birth weight) 婴儿用婴儿配方、 较大婴儿配方等以及过敏型婴儿用 婴儿配方、 无乳糖乳、 先天性代谢缺陷婴儿的特殊乳等， 和由这些制备的奶粉 )、 母乳增补粉 或婴儿配方奶粉和婴儿食品等。
     此处所指的婴儿配方是通过使用乳或乳制品作为主原料并添加婴儿所需的营养 物生产的食品， 并主要用作婴儿期母乳的替代食品， 以及作为幼年时期母乳的替代食品或 营养补充食品。 所述婴儿配方的其他实例包括为适合于具有特定的先天或后天疾病的婴儿 有助于营养摄取为目的而生产的食品。
     miRNA 相对耐冻融、 低 pH 如 pH1 的酸性条件和 RNase 如 RNase A 和 RNase T， 因而 适合作为添加到食品中的活性成分。低 pH 下的稳定性表明 miRNA 分子耐婴儿胃内环境， 并 可被婴儿的主要免疫器官之一的肠道吸收， 因此其可影响婴儿的免疫系统。 另外， 母乳的保 存和冻融不会使 miRNA 变性， 这对通常给予冷藏保存的母乳的低出生体重婴儿和住院婴儿 在营养上是重要的。此外， miRNA 对 RNase 的耐受性表明 miRNA 可存在于复合体例如母乳 中的外泌体和微泡中。
     从前述发现中， 似乎母亲给予婴儿这样定制 (custom-made) 的母乳， 婴儿便可适 应环境。 有报道表明源于母乳的外泌体使 Foxp3+CD4+CD25+ 调节 T 细胞的数量增加。 如果免 疫相关的 miRNA 包含于母乳外泌体中， 则其可能有助于婴儿消化道内 Foxp3+CD4+CD25+ 调 节 T 细胞的增加。这是由于母乳中检测出的免疫相关的 miRNA 如 miR-181a 和 miR-181b 高 度表达， 其参与 T 细胞的分化。此外， 由于已知大量包含于母乳中的 miR-181 和 miR-155 诱 导 B 细胞的分化， 而抑制 B 细胞分化的 miR-150 在母乳中几乎不存在， 因而母乳中的 miRNA 可诱导 B 细胞的分化。
     尽管组合物中 miRNA 的含量不特别限定， 并可适当选择， 然而其总计例如为 10 至 10,000ng/ml， 优选 20 至 10,000ng/ml， 更优选 50 至 10,000ng/ml。另外， 摄取的 miRNA 的 量， 总计例如 5μg 至 120mg/ 天， 优选 10μg 至 120mg/ 天， 更优选 25μg 至 120mg/ 天。
     可通过制备部分双链 RNA 作为 miRNA 前体 (pri-miRNA) 并用 Dicer 酶消化来获得 miRNA。作为 Dicer 酶， 可使用商购可得的酶。双链 RNA 可通过例如使用具有互补序列的双 链 DNA 作为模板的 RNA 聚合酶反应来制备。所述双链 DNA 可通过使用哺乳动物的染色体 DNA 作为模板以及为能够扩增 miRNA 序列而设计的引物基于 PCR 的扩增来制备。
     可通过用 Dicer 酶等消化如上所述获得的双链 RNA 来获得 miRNA。
     另外， miRNA 还可通过化学合成来制备。即， 可通过合成正义链和反义链并将其退 火来获得 miRNA。
     另外， 可将允许通过哺乳动物的内源 Dicer 酶产生靶 miRNA 的双链 RNA 添加到口 服摄取用组合物中。
     当本发明的口服摄取用组合物为药剂时， 可通过用药物学上可接受的口服给药用 载体与 miRNA 组合来制备组合物。药物制剂的形式不特别限定， 实例包括片剂、 丸剂、 散剂、 溶液剂、 悬浮剂 (suspension)、 乳剂、 颗粒剂、 胶囊剂和糖浆剂等。对于剂型， 可使用广泛用
     于通常的药剂的添加剂作为口服给药用药物载体， 如赋形剂、 结合剂、 崩解剂、 润滑剂、 稳定 剂、 矫味剂 (corrigent)、 稀释剂和表面活性剂。另外， 除非本发明的效果降低， 否则 miRNA 可与另一具有免疫调节作用的药物一起使用。
     尽管包含于药剂中的 miRNA 的量不特别限定， 但其总计例如为 2μg/kg 至 2mg/kg， 优选 4μg/kg 至 2mg/kg， 更优选 10μg/kg 至 2mg/kg。
     当口服摄取用组合物为食品时， 其可用于利用免疫增强作用的任何各种用途。所 述用途的实例包括， 例如作为适用于显示抵抗力低下人群的食品的用途和作为用于降低或 消除由免疫低下引起的各种疾病的风险因素的食品或饮品的用途等。
     本发明的食品或饮品可作为食品出售， 并附有描述该食品用于免疫调节的指示。
     前述术语 “指示” 包括告知消费者前述用途的所有行为， 并且任何提醒或类推前述 用途的指示落入本发明 “指示” 的范围内， 而不管指示的目的、 内容、 对象物、 媒体等如何。 然而， 所述指示优选用允许消费者直接识别前述用途的表述制成。具体实例包括在与本发 明的食品相关的商品或商品包装上指示前述用途的行为， 在上面指示了前述用途的该商品 或商品的包装的分派 (assigning)、 交付 (delivering)、 为分派、 交付目的的展示或进口行 为， 或者与商品相关的展示或分配广告、 价格表或商业单据 (business papers)、 或者通过 电磁法 ( 互联网等 ) 提供包括作为指示前述用途的内容的那些信息等的行为。 所述指示优选为经行政机构等批准的指示 ( 例如， 基于认可的形式的指示， 该认 可基于由行政机构提供的各种法律制度之一而授权 )， 特别优选在销售现场在广告材料上 的指示， 例如包装、 容器、 目录、 宣传册和 POP 及其他文件等。
     所述指示的实例进一步包括， 例如， 作为健康食品、 功能性食品、 肠道营养食品、 特膳用途食品 (food for special dietary uses)、 具有营养功能声明的食品和准药 (quasi-drug) 等的指示， 以及经卫生部、 厚生劳动省 (Labor and Welfare) 批准的指示， 例 如基于特定保健用食品 (food for specified health uses) 体系及类似体系而批准的指 示。后者的实例包括作为特定保健用食品的指示、 作为具有授权的保健声明的特定保健用 食品的指示、 影响身体结构和功能的指示和减少疾病风险声明的指示等， 更精确地， 典型的 实例包括在健康促进法 (Health Promotion Law) 实施条例 ( 日本卫生部、 厚生劳动省内部 条例第 86 号， 2003 年 4 月 30 日 ) 中提供的作为特定保健用食品的指示 ( 特别是用于保健 的指示 ) 以及类似的指示。
     实施例
     以下将参考实施例进一步详细解释本发明。 然而， 本发明不受以下实施例的限定。
     实施例 1 ： 母乳中 miRNA 的分析
     将人母乳在 2,000×g 下离心 10 分钟以移除细胞和大沉淀物， 进一步将除构成表 层的脂质外的上清液在 12,000×g 下离心 30 分钟以移除细胞碎片和细胞尘 (dust)。使用 mirVana miRNA 分离试剂盒根据制造商的实验步骤 (protocol) 从上清液中提取总 RNA。来 自血清的 RNA 的提取以与对于母乳使用的相同的方式进行。
     通过使用生物分析仪来分析提取的 RNA。 尽管相当大量的 RNA 包含于母乳中， 但几 乎不包含或根本不包含核糖体 RNA(18S rRNA、 28S rRNA)。
     通过使用微阵列分析系统 ( 使用由 Agilent Technologies 生产的系统 ) 来检测 miRNA。通过使用 Gene Spring GX11.0( 由 Agilent Technologies 生产 ) 分析 miRNA 的表
     达水平。结果示于图 1。结果， 以显著水平检测出 miR-181a、 miR-181b、 miR-155、 miR-125b、 miR-146b、 miR-223 和 let-7i。无法检出控制 T 细胞和 B 细胞的 miR-150。另外， 几乎不能 检测出多器官特异的 miRNA 如 miR-122( 肝脏 )、 miR-216、 miR-217( 胰腺 )、 miR-142-5p、 miR-142-3p( 造血细胞 )。此外， 检出小量 miR-124( 脑 )。
     通过定量 RT-PCR 分析的出生后前六个月 (n ＝ 5) 和接下来的六个月 (n ＝ 13) 的 母乳中的 miR-181a 水平的比较结果示于图 2。对 miR-155、 miR-17 和 miR-92a 进行的类 似分析的结果也示于图 3 中。为了使由 RNA 分离过程诱导的样品中的变化标准化， 将变性 的 cel-miR-39( 由 Qiagen 合成 )( 为线虫 ( 秀丽隐杆线虫 ) 的合成 miRNA) 添加到样品中 (5ml 总体积中寡核苷酸量为 25fmol)， miRNA 的量作为基于 cel-miR-39 的量的相对量来示 出 ( 以下实验应同样应用 )。
     结果， 出生后前六个月的乳与接下来六个月的乳相比 miR-181a 的量较大 ( 图 2)。 对于 miR-155、 miR-17 和 miR-92a 也观察到类似的趋势 ( 图 3)。
     作为 RT-PCR 用引物， 使用由 Applied Biosystems 生产并由以下 Assay ID 鉴定的 那些。
     -miR-181a ： 000480
     -miR-155 ： 002623
     -miR-17 ： 002308
     -miR-92a ： 000431
     -Cel-miR-39 ： 000200
     产后 6 个月内七名健康人的母乳和血清中与免疫相关的 miRNA 水平的比较结果示 于图 4( 母乳 ： n ＝ 5、 血清 ： n ＝ 6)。母乳中 miRNA 谱不同于血清中的那些。例如， 控制粒细 胞的 miRNAmiR-223 在正常人血清和血浆中以最高水平存在， 然而与血清中的相比其在母 乳中的表达量极低。另外， 不大量存在于血清中的 miR-146b 却大量地存在于母乳中。
     另一方面， 与血清中所观察到的那些相比， 在表达量上母乳中大量存在 miR-181 和 miR-155。 有趣的是， 在产后六个月 ( 其为婴儿食品摄入前的阶段 ) 的母乳中高度表达多 种免疫相关的 miRNA。
     miRNA 的细胞间转移表明 miRNA 不仅控制细胞内分子， 还是在细胞间通讯中像 细胞因子一样起作用的分子。前述结果表明 miRNA 为可从母体转移至孩子的 “遗传物质 7 (genetic materal)” 。据计算， 约 0.15pg/L/ 天 (1.3×10 个拷贝 /L/ 天 ) 的 miR-181 经 母乳被婴儿摄取。
     此外， 作为聚类分析的结果， 已发现不同母亲的母乳的 miRNA 谱是相似的。
     实施例 2 ： miRNA 的物理化学性质
     将母乳在室温下静置 24 小时， 或反复进行冷冻 (-20 ℃ ) 和融解至 3 次。通过 TaqMan qRT-PCR 测定 miRNA(miR-21、 miR-181a) 的水平。结果示于图 5。另外， 在低 pH 溶 液 (pH 1) 中处理母乳 3 小时， 用 TaqMan qRT-PCR 测定处理前后 miRNA(miR-181a) 的水平。 结果示于图 6。
     另外， 将 RNase A/T 溶液 (RNase A(500U/ml) 和 RNaseT1(20,000U/ml) 的混合溶 液， 由 Ambion 生产 ) 以母乳的 2％体积加入母乳中， 37℃下处理混合物 3 小时， 通过 TaqMan qRT-PCR 测定处理前后 miRNA(miR-181a) 的水平。结果示于图 7。作为用于 TaqMan qRT-PCR 的引物， 使用由 Applied Biosystems 生产并由以下 Assay ID 鉴定的那些。
     -miR-181a ： 000480
     -miR-21 ： 000397
     -Cel-miR-39 ： 000200
     证实 miRNA 对冻融、 低 pH 和 RNase 相对稳定。
     实施例 3 ： 产生具有免疫调节作用的乳的食物或物质的鉴定
     购买怀孕 9 至 10 天的 SD 大鼠， 在怀孕 13 至 20 天期间， 以每只大鼠 1ml/ 天的 体积将双歧杆菌属细菌、 长双歧杆菌 BB536(ATCC BAA-999) 的 PBS( 磷酸盐缓冲盐水 ) 9 (1×10 cfu/ml) 悬浮液给药到试验组 (n ＝ 3) 的大鼠。
     另外， 作为对照组 (n ＝ 3)， 以每只大鼠 1ml 每天的体积给药 PB S。长双歧杆 菌 (B.longum)AT CC BAA-999 菌株可从美国模式培养物集存库 (American Type Culture Collection) 购买 ( 地址 ： 12301 Parklawn Drive， 罗克维尔市， 马里兰州 20852， 美国 )。
     所有大鼠在怀孕 21 天时产仔， 并且在其分娩后第一天在用乙醚麻醉下产奶。所获 初乳样品离心两次来移除脂质层和细胞碎片， 离心条件为 1,200×g、 4℃、 10 分钟。
     随后， 在 21,500×g 和 4 ℃下离心上清液 40 分钟， 并进一步在相同条件下离心 1 小时来移除酪蛋白组分， 从而获得乳清。通过使用 miRNeasy 迷你试剂盒 (Mini Kit)( 由 Qiagen 生产 ) 从所获乳清样品中获得总 RNA。
     通过使用 100ng 所获 RNA 样品， 使用微阵列系统 ( 由 Agilent Technologie s 生 产 ) 以常规方式检测 miRNA。通过使用 GeneSpring GX11.0( 由 Agilent Technologies 生 产 ) 分析结果。
     当通过使用 Gene Spring G X11.0 进行微阵列数据的统计学分析时， 发现在检测 微小 RNA 的试验组和对照组中已证实表达的微小 RNA 的类型数总计为 155。这些微小 RNA 如下所示。此外， 未检出 miR-150。
     在试验组和对照组中证实表达的微小 RNA， 155 种 ：
     miR-16、 miR-17-5p、 miR-18(miR-18a)、 miR-19(miR-19b)、 miR-20(miR-20a)、 miR-21 、 miR-23(miR-23a) 、 miR-27(miR-27a 、 miR-27b) 、 miR-29(miR-29a 、 miR-29b 、 miR-29c、 miR-29c*)、 miR-30(miR-30a、 miR-30c、 miR-30d、 miR-30e*)、 miR-33、 miR-34b、 miR-92a、 miR-93、 miR-100、 miR-101(miR-101a、 miR-101b)、 miR-106b、 miR-130b、 miR-140*、 miR-141、 miR-143、 miR-146a、 miR-185、 miR-186、 miR-192、 miR-193、 miR-195、 miR-200a、 miR-205、 miR-218、 miR-219-5p、 miR-221、 miR-301a、 miR-322、 miR-340-5p、 miR-361、 miR-429、 miR-455、 miR-466b、 miR-497、 miR-500、 miR-503、 miR-532-5p、 miR-542-3p
     let-7a 、let-7a* 、let-7b 、let-7c 、let-7d 、le-7e 、let-7f 、let-7i 、 miR-10(miR-10a-5p、 miR-10b)、 miR-15(miR-15b)、 miR-19(miR-19a)、 miR-20(miR-20a*)、 miR-22 、 miR-23(miR-23b) 、 miR-24 、 miR-25 、 miR-26(miR-26a ， miR-26b) 、 miR-28 、 miR-30(miR-30a* 、miR-30b-5p 、miR-30c-1* 、miR-30c-2* 、miR-30e) 、miR-31 、 miR-34(miR-34a) 、 miR-96 、 miR-98 、 miR-99(miR-99a 、 miR-99b) 、 miR-103 、 miR-107 、 miR-125(miR-125a-3p 、miR-125a-5p 、miR-125b-3p 、miR-125b-5p) 、miR-128 、 miR-130(miR-130a)、 miR-133(miR-133a、 miR-133b)、 miR-134、 miR-139(miR-139-3p)、m i R - 1 4 0 、m i R - 1 4 6 ( m i R - 1 4 6 b ) 、m i R - 1 4 8 ( m i R - 1 4 8 b - 3 p ) 、m i R - 1 5 1 、m i R - 1 5 2 、 miR-181(miR-181a、 miR-181a*、 miR-181b、 miR-181c、 miR-181d)、 miR-182、 miR-183、 miR-188、 miR-196(miR-196c)、 miR-199(miR-199a-3p)、 miR-200(miR-200b、 miR-200c)、 miR-203、 miR-204、 miR-206、 miR-210、 miR-212、 miR-214、 miR-222、 miR-223、 miR-290、 miR-291(miR-291a-5p)、 miR-292(miR-292-5p)、 miR-294、 miR-296(miR-296*)、 miR-320、 miR-324(miR-324-3p 、 miR-324-5p)、 miR-327、 miR-328、 miR-331、 miR-340(miR-340-3p)、 miR-341、 miR-342(miR-342-3p)、 miR-345(miR-345-5p)、 miR-347、 miR-352、 miR-365、 miR-370、 miR-375、 miR-378(miR-378、 miR-378*)、 miR-425、 miR-465、 miR-483、 miR-484、 miR-494、 miR-542(miR-542-5p)、 miR-652、 miR-672、 miR-685、 miR-760(miR-760-3p)、 miR-872、 miR-874、 miR-1224
     在 miR- 序号后带括号说明的所列 miRNA 具有亚型， 括号内所说明的亚型实际表 达。
     另外， 当通过使用曼 - 惠特尼 U 检验 (Mann-Whitney U-test) 在统计学上比较双 歧杆菌属细菌 BB 536 给药组和对照组中前述微小 RNA 的表达量时， 发现以下 52 种微小 RNA 类型在双歧杆菌属细菌 BB 536 给药组中以小于 5％的概率水平增加。 所述 miRNA 在表达上 的变化倍率示于表 11。
     在双歧杆菌属细菌 BB 536 给药组中证实增加的微小 RNA， 52 种 ：
     miR-16、 miR-17-5p、 miR-18(miR-18a)、 miR-19(miR-19b)、 miR-20(miR-20a)、 miR-21 、 miR-23(miR-23a) 、 miR-27(miR-27a 、 miR-27b) 、 miR-29(miR-29a 、 miR-29b 、 miR-29c、 miR-29c*)、 miR-30(miR-30a、 miR-30c、 miR-30d、 miR-30e*)、 miR-33、 miR-34b、 miR-92a、 miR-93、 miR-100、 miR-101(miR-101a、 miR-101b)、 miR-106b、 miR-130b、 miR-140*、 miR-141、 miR-143、 miR-146a、 miR-185、 miR-186、 miR-192、 miR-193、 miR-195、 miR-200a、 miR-205、 miR-218、 miR-219-5p、 miR-221、 miR-301a、 miR-322、 miR-340-5p、 miR-361、 miR-429、 miR-455、 miR-466b、 miR-497、 miR-500、 miR-503、 miR-532-5p、 miR-542-3p
     表 11
    从表 11 所示结果可看出， 发现对于证实增加的所有 52 种微小 RNA 观察到的变化 倍率为 1.2 倍以上。
     即， 发现基于这样的 52 种微小 RNA 的检测可将双歧杆菌属细菌 BB 536 菌株筛选 为产生具有免疫调节作用的乳的食物或物质。
     实施例 4 ： 大鼠初乳中表达的微小 RNA 的检测
     购买三只怀孕 14 天的 F344 大鼠。所有购买的大鼠在怀孕 21 天时产仔， 并且在其 分娩后第二天在乙醚麻醉下产奶以收集初乳。
     各初乳样品在 1,200×g 和 4℃下离心 10 分钟两次来移除脂质层和细胞碎片。
     随后， 在 21,500×g 和 4℃下离心上清液 40 分钟， 并进一步在相同条件下离心 1 小 时来移除酪蛋白组分， 从而获得乳清。
     通过使用 miRNeasy 迷你试剂盒 ( 由 Qiagen 生产 ) 从所获乳清样品中获得总 RNA。
     将 100ng 的量的所获 RNA 样品以常规方式用于微阵列 ( 由 Agilent Technologies 生产 ) 实验。通过使用 GeneSpring GX11.0( 由 Agilent Technologies 生产 ) 分析微阵列 实验结果。
     结 果， 证 实 除 了 在 实 施 例 3 中 证 实 的 155 种 微 小 RNA 外， 还表达四种微小 RNA(miR-193*、 miR-409-3p、 miR-664、 miR-877)。
     实施例 5 ： 牛初乳中表达的微小 RNA 的检测 准备产后 1 至 3 天的荷斯坦牛 (Holstein cow) 的五个乳样品作为初乳样品。另 外， 准备产后 8 天至 8 个月的荷斯坦牛的五个乳样品作为正常乳样品。
     各乳样品 ( 初乳和正常乳 ) 在 1,200×g 和 4℃下离心 10 分钟两次来移除脂质层 和细胞碎片。
     随后， 在 21,500×g 和 4℃下离心上清液 40 分钟， 并进一步在相同条件下离心 1 小 时来移除酪蛋白组分， 从而获得乳清。
     通过使用 miRNeasy 迷你试剂盒 ( 由 Qiagen 生产 ) 从所获乳清样品中获得总 RNA。
     将 20ng 的量的所获 RNA 样品以常规方式用于微阵列 ( 由 Agilent Technologies 生产 ) 实验。通过使用 GeneSpringGX11.0( 由 Agilent Technologies 生产 ) 分析微阵列 实验结果。
     结果， 在初乳样品和正常乳样品中证实总计表达 102 种 miRNA。特别地， 在该 102 种 miRNA 中， 证实 49 种 miRNA 仅在初乳中表达。
     证实仅在初乳中表达的 49 种微小 RNA 如下所述。
     证实仅在初乳中表达的微小 RNA， 49 种 ：
     let-7d、 let-7i、 miR-15a、 miR-15b、 miR-16b、 miR-17-3p、 miR-19b、 miR-21、 miR-23b-3p、 miR-24-3p、 miR-26b、 miR-27b、 miR-30a-5p、 miR-30c、 miR-30f、 miR-34a、 miR-99a、 miR-106、 miR-106b、 miR-107、 miR-125b、 miR-126、 miR-129-3p、 miR-130a、 miR-130b、 miR-140、 miR-155、 miR-181b、 miR-184、 miR-193a-3p、 miR-193a-5p、 miR-196a、 miR-210、 miR-222、 miR-223、 miR-338、 miR-361、 miR-362-5p、 miR-370、 miR-429、 miR-452、 miR-486、 miR-500、 miR-532、 miR-584、 miR-708、 miR-877、 miR-1300b、 miR-1307
     产业上的可利用性
     根据本发明， 可筛选产生具有免疫调节作用的乳的食物或包含于其中的物质。本 发明还提供生产具有免疫调节作用的乳制品的方法。 本发明的口服摄取用组合物具有免疫 增强作用， 并特别适用于婴儿。
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     本发明的目的为提供产生具有免疫调节作用的乳的食物的筛选方法、 一种具有免 疫调节作用的新型食品及其生产方法。
     用于解决问题的方案
     本发明的发明人根据注意到母乳影响婴儿免疫系统成熟的事实进行了研究。结 果， 他们发现与免疫相关的 miRNA 在母乳中高度表达， 并且完成了本发明。
     因此本发明提供食物或物质的筛选方法， 所述食物或物质产生具有免疫调节作用 的母乳， 所述方法包括通过利用乳中微小 RNA 谱 (profile) 与由哺乳动物摄取的食物或包 含于所述食物中的物质的相关性作为指标来鉴定使存在于所述哺乳动物乳中的微小 RNA 的量增加或减少的所述食物或物质。
     在前述方法的实施方案中， 所述免疫调节作用为免疫增强作用， 并且当微小 RNA 的量增加时， 判定为所述食物或物质产生具有免疫增强作用的母乳。
    在前述方法的优选实施方案中， 比较食物摄取前后所观察到的乳中的微小 RNA 谱， 并且当摄取后所观察到的至少一种微小 RNA 的量高于摄取前所观察到的量时， 判定所 述食物使所述乳中的所述微小 RNA 的量增加。
     在前述方法的另一优选实施方案中， 比较所述乳中的微小 RNA 谱和血清或血浆中 的微小 RNA 谱， 当包含于所述乳和所述血清或血浆二者中的微小 RNA 的存在量在摄取所述 食物后使包含于所述乳中的微小 RNA 的存在量是所述血清或血浆中的微小 RNA 的存在量的 1.2 倍以上时， 判定所述食物使所述乳中的所述微小 RNA 的量增加。
     在前述方法的另一实施方案中， 所述免疫调节作用为免疫抑制作用， 并且当所述 微小 RNA 的量减少时， 判定所述食物或物质产生具有免疫抑制作用的母乳。
     在前述方法的优选实施方案中， 比较所述食物摄取前后所观察到的所述乳中的微 小 RNA 谱， 并且当摄取后所观察到的至少一种微小 RNA 的量低于摄取前所观察到的量时， 判 定所述食物使所述乳中的所述微小 RNA 的量减少。
     在前述方法的优选实施方案中， 比较所述乳中的微小 RNA 谱和血清或血浆中的微 小 RNA 谱， 当包含于所述乳和所述血清或血浆二者中的微小 RNA 的存在量在摄取所述食物 后使所述乳中的微小 RNA 的存在量为在血清或血浆中的微小 RNA 的存在量的 0.8 倍以下 时， 判定所述食物使所述乳中的所述微小 RNA 的量减少。
     在前述方法的优选实施方案中， 所述哺乳动物为人类。
     在前述方法的优选实施方案中， 所述微小 RNA 谱由微小 RNA 的量组成， 所述微 小 RNA 选自由以下组成的组 ： miR-10、 miR-15、 miR-16、 miR-17、 miR-18、 miR-19、 miR-20、 miR-21、 miR-22、 miR-23、 miR-24、 miR-25、 miR-26、 miR-27、 miR-28、 miR-29、 miR-30、 miR-31、 miR-33、 miR-34、 miR-92、 miR-93、 miR-96、 miR-98、 miR-99、 miR-100、 miR-101、 miR-103、 miR-106、 miR-107、 miR-125、 miR-126、 miR-128、 miR-129、 miR-130、 miR-133、 miR-134、 miR-139、 miR-140、 miR-141、 miR-143、 miR-146、 miR-148、 miR-151、 miR-152、 miR-155、 miR-181、 miR-182、 miR-183、 miR-184、 miR-185、 miR-186、 miR-188、 miR-192、 miR-193、
     在前述方法的另一优选实施方案中， 比较所述乳中的微小 RNA 谱和血清或血浆中 的微小 RNA 谱， 当包含于所述乳和所述血清或血浆二者中的微小 RNA 的存在量在摄取所述 食物后使包含于所述乳中的微小 RNA 的存在量是所述血清或血浆中的微小 RNA 的存在量的 1.2 倍以上时， 判定所述食物使所述乳中的所述微小 RNA 的量增加。
     在前述方法的另一实施方案中， 所述免疫调节作用为免疫抑制作用， 并且当所述 微小 RNA 的量减少时， 判定所述食物或物质产生具有免疫抑制作用的母乳。
     在前述方法的优选实施方案中， 比较所述食物摄取前后所观察到的所述乳中的微 小 RNA 谱， 并且当摄取后所观察到的至少一种微小 RNA 的量低于摄取前所观察到的量时， 判 定所述食物使所述乳中的所述微小 RNA 的量减少。
     在前述方法的优选实施方案中， 比较所述乳中的微小 RNA 谱和血清或血浆中的微 小 RNA 谱， 当包含于所述乳和所述血清或血浆二者中的微小 RNA 的存在量在摄取所述食物 后使所述乳中的微小 RNA 的存在量为在血清或血浆中的微小 RNA 的存在量的 0.8 倍以下 时， 判定所述食物使所述乳中的所述微小 RNA 的量减少。
     在前述方法的优选实施方案中， 所述哺乳动物为人类。
     在前述方法的优选实施方案中， 所述微小 RNA 谱由微小 RNA 的量组成， 所述微 小 RNA 选自由以下组成的组 ： miR-10、 miR-15、 miR-16、 miR-17、 miR-18、 miR-19、 miR-20、 miR-21、 miR-22、 miR-23、 miR-24、 miR-25、 miR-26、 miR-27、 miR-28、 miR-29、 miR-30、 miR-31、 miR-33、 miR-34、 miR-92、 miR-93、 miR-96、 miR-98、 miR-99、 miR-100、 miR-101、 miR-103、 miR-106、 miR-107、 miR-125、 miR-126、 miR-128、 miR-129、 miR-130、 miR-133、 miR-134、 miR-139、 miR-140、 miR-141、 miR-143、 miR-146、 miR-148、 miR-151、 miR-152、 miR-155、 miR-181、 miR-182、 miR-183、 miR-184、 miR-185、 miR-186、 miR-188、 miR-192、 miR-193、
     miR-195、 miR-196、 miR-199、 miR-200、 miR-203、 miR-204、 miR-205、 miR-206、 miR-210、 miR-212、 miR-214、 miR-218、 miR-219、 miR-221、 miR-222、 miR-223、 miR-290、 miR-291、 miR-292、 miR-294、 miR-296、 miR-301、 miR-320、 miR-322、 miR-324、 miR-327、 miR-328、 miR-331、 miR-338、 miR-340、 miR-341、 miR-342、 miR-345、 miR-347、 miR-352、 miR-361、 miR-362、 miR-365、 miR-370、 miR-375、 miR-378、 miR-409、 miR-425、 miR-429、 miR-452、 miR-455、 miR-465、 miR-466、 miR-483、 mi R-484、 miR-486、 miR-494、 miR-497、 miR-500、 miR-503、 miR-532、 miR-542、 miR-584、 miR-652、 miR-664、 miR-672、 miR-685、 miR-708、 miR-760、 miR-872、 miR-874、 miR-877、 miR-1224、 miR-1300、 miR-1307、 let-7a、 let-7b、 let-7c、 let-7d、 le-7e、 let-7f 和 let-7i。
     在前述方法的优选实施方案中， 所述微小 RNA 谱由微小 RNA 的量组成， 所述微 小 RNA 选自由以下组成的组 ： miR-15、 miR-16、 miR-17、 miR-18、 miR-19、 miR-20、 miR-21、 miR-23、 miR-24、 miR-26、 miR-27、 miR-29、 miR-30、 miR-33、 miR-34、 miR-92、 miR-93、 miR-99、 miR-100、 miR-101、 miR-106、 miR-107、 miR-125、 miR-130、 miR-140、 miR-141、 miR-143、 miR-146、 miR-155、 miR-181、 miR-185、 miR-186、 miR-192、 miR-193、 miR-195、 miR-200、 miR-205、 miR-210、 miR-218、 miR-219、 miR-221、 miR-222、 miR-223、 miR-301、 miR-322、 miR-340、 miR-361、 miR-370、 miR-429、 miR-455、 miR-466、 miR-497、 miR-500、 miR-503、 miR-532、 miR-542、 let-7d 和 let-7i。 在前述方法的优选实施方案中， 所述微小 RNA 谱由微小 RNA 的量组成， 所述微 小 RNA 选自由以下组成的组 ： miR-15、 miR-16、 miR-19、 miR-21、 miR-23、 miR-24、 miR-26、 miR-27、 miR-30、 miR-34、 miR-99、 miR-106、 miR-107、 miR-125、 miR-130、 miR-140、 miR-181、 miR-193、 miR-210、 miR-222、 miR-223、 miR-361、 miR-370、 miR-429、 miR-500、 miR-532、 let-7d 和 let-7i。
     本发明还提供一种生产具有免疫调节作用的乳或乳制品的方法， 其包括给予哺乳 动物 ( 除人以外 ) 食物或物质的步骤， 所述食物或物质通过前述筛选方法被鉴定为使所述 哺乳动物的乳中微小 RNA 的量增加或减少， 以及收集所述哺乳动物的乳的步骤。
     在前述方法的实施方案中， 所述免疫调节作用为免疫增强作用， 并且将所述食物 或物质鉴定为使所述微小 RNA 的量增加。
     在前述方法的实施方案中， 所述免疫调节作用为免疫抑制作用， 并且将所述食物 或物质鉴定为使所述微小 RNA 的量减少。
     本发明还提供一种具有免疫增强作用的口服摄取用组合物， 其包括口服摄取用组 合物的基质和添加至所述基质的微小 RNA。
     在 所 述 口 服 摄 取 用 组 合 物 的 优 选 实 施 方 案 中， 所 述 微 小 RNA 选 自 由 miR-10、 miR-15、 miR-16、 miR-17、 miR-18、 miR-19、 miR-20、 miR-21、 miR-22、 miR-23、 miR-24、 miR-25、 miR-26、 miR-27、 miR-28、 miR-29、 miR-30、 miR-31、 miR-33、 miR-34、 miR-92、 miR-93、 miR-96、 miR-98、 miR-99、 miR-100、 miR-101、 miR-103、 miR-106、 miR-107、 miR-125、 miR-126、 miR-128、 miR-129、 miR-130、 miR-133、 miR-134、 miR-139、 miR-140、 miR-141、 miR-143、 miR-146、 miR-148、 miR-151、 miR-152、 miR-155、 miR-181、 miR-182、 miR-183、 miR-184、 miR-185、 miR-186、 miR-188、 miR-192、 miR-193、 miR-195、 miR-196、 miR-199、 miR-200、 miR-203、 miR-204、 miR-205、 miR-206、 miR-210、 miR-212、 miR-214、 miR-218、 miR-219、
     本发明还提供一种生产具有免疫调节作用的乳或乳制品的方法， 其包括给予哺乳 动物 ( 除人以外 ) 食物或物质的步骤， 所述食物或物质通过前述筛选方法被鉴定为使所述 哺乳动物的乳中微小 RNA 的量增加或减少， 以及收集所述哺乳动物的乳的步骤。
     在前述方法的实施方案中， 所述免疫调节作用为免疫增强作用， 并且将所述食物 或物质鉴定为使所述微小 RNA 的量增加。
     在前述方法的实施方案中， 所述免疫调节作用为免疫抑制作用， 并且将所述食物 或物质鉴定为使所述微小 RNA 的量减少。
     本发明还提供一种具有免疫增强作用的口服摄取用组合物， 其包括口服摄取用组 合物的基质和添加至所述基质的微小 RNA。
     在 所 述 口 服 摄 取 用 组 合 物 的 优 选 实 施 方 案 中， 所 述 微 小 RNA 选 自 由 miR-10、 miR-15、 miR-16、 miR-17、 miR-18、 miR-19、 miR-20、 miR-21、 miR-22、 miR-23、 miR-24、 miR-25、 miR-26、 miR-27、 miR-28、 miR-29、 miR-30、 miR-31、 miR-33、 miR-34、 miR-92、 miR-93、 miR-96、 miR-98、 miR-99、 miR-100、 miR-101、 miR-103、 miR-106、 miR-107、 miR-125、 miR-126、 miR-128、 miR-129、 miR-130、 miR-133、 miR-134、 miR-139、 miR-140、 miR-141、 miR-143、 miR-146、 miR-148、 miR-151、 miR-152、 miR-155、 miR-181、 miR-182、 miR-183、 miR-184、 miR-185、 miR-186、 miR-188、 miR-192、 miR-193、 miR-195、 miR-196、 miR-199、 miR-200、 miR-203、 miR-204、 miR-205、 miR-206、 miR-210、 miR-212、 miR-214、 miR-218、 miR-219、
     miR-221、 miR-222、 miR-223、 miR-290、 miR-291、 miR-292、 miR-294、 miR-296、 miR-301、 miR-320、 miR-322、 miR-324、 miR-327、 miR-328、 miR-331、 miR-338、 miR-340、 miR-341、 miR-342、 miR-345、 miR-347、 miR-352、 miR-361、 miR-362、 miR-365、 miR-370、 miR-375、 miR-378、 miR-409、 miR-425、 miR-429、 miR-452、 miR-455、 miR-465、 miR-466、 miR-483、 miR-484、 miR-486、 miR-494、 miR-497、 miR-500、 miR-503、 miR-532、 miR-542、 miR-584、 miR-652、 miR-664、 miR-672、 miR-685、 mi R-708、 miR-760、 miR-872、 miR-874、 miR-877、 miR-1224、 miR-1300、 miR-1307、 let-7a、 let-7b、 let-7c、 let-7d、 le-7e、 let-7f 和 let-7i 组成的组。
     在 所 述 口 服 摄 取 用 组 合 物 的 优 选 实 施 方 案 中， 所 述 微 小 RNA 选 自 由 miR-15、 miR-16、 miR-17、 miR-18、 miR-19、 miR-20、 miR-21、 miR-23、 miR-24、 miR-26、 miR-27、 miR-29、 miR-30、 miR-33、 miR-34、 miR-92、 miR-93、 miR-99、 miR-100、 miR-101、 miR-106、 miR-107、 miR-125、 miR-130、 miR-140、 miR-141、 miR-143、 miR-146、 miR-155、 miR-181、 miR-185、 miR-186、 miR-192、 miR-193、 miR-195、 miR-200、 miR-205、 miR-210、 miR-218、 miR-219、 miR-221、 miR-222、 miR-223、 miR-301、 miR-322、 miR-340、 miR-361、 miR-370、 miR-429、 miR-455、 miR-466、 miR-497、 miR-500、 miR-503、 miR-532、 miR-542、 let-7d 和 let-7i 组成 的组。 在 所 述 口 服 摄 取 用 组 合 物 的 优 选 实 施 方 案 中， 所 述 微 小 RNA 选 自 由 miR-15、 miR-16、 miR-19、 miR-21、 miR-23、 miR-24、 miR-26、 miR-27、 miR-30、 miR-34、 miR-99、 miR-106、 miR-107、 miR-125、 miR-130、 miR-140、 miR-181、 miR-193、 miR-210、 miR-222、 miR-223、 miR-361、 miR-370、 miR-429、 miR-500、 miR-532、 let-7d 和 let-7i 组成的组。
     在所述口服摄取用组合物的优选实施方案中， 所述组合物为婴儿用食品或幼儿用 食品。
     在所述口服摄取用组合物的优选实施方案中， 所述婴儿用食品或幼儿用食品为婴 儿配方 (formula) 或较大婴儿配方 (follow-up formula)。
     在所述口服摄取用组合物的优选实施方案中， 所述组合物为婴儿用食品或幼儿用 食品。
     在所述口服摄取用组合物的优选实施方案中， 所述婴儿用食品或幼儿用食品为婴 儿配方 (formula) 或较大婴儿配方 (follow-up formula)。
    【附图说明】
     图 1 示出通过微阵列分析 (microarray analysis) 获得的人母乳中 miRNA 的检测结果。 图 2 示出出生后前六个月和其后六个月的母乳中 miR-181a 水平的比较。 hsa 表示 人类， cel 表示线虫 ( 秀丽隐杆线虫 Caenorhabditis elegans)( 下图应同样应用 )。
     图 3 示出出生后前六个月和其后六个月的母乳中 miR-155、 miR-17 和 miR-92 水平 的比较。
     图 4 示出人母乳和血清中免疫相关 miRNA 水平的比较
     图 5 示出冻融前后所观察到的 miRNA 水平的比较。
     图 6 示出低 pH(pH1) 下保存前后所观察到的 miRNA 水平的比较。
     图 7 示出 RNase 处理后和无 RNase 处理所观察到的 miRNA 水平的比较。
     图 3 示出出生后前六个月和其后六个月的母乳中 miR-155、 miR-17 和 miR-92 水平 的比较。
     图 4 示出人母乳和血清中免疫相关 miRNA 水平的比较
     图 5 示出冻融前后所观察到的 miRNA 水平的比较。
     图 6 示出低 pH(pH1) 下保存前后所观察到的 miRNA 水平的比较。
     图 7 示出 RNase 处理后和无 RNase 处理所观察到的 miRNA 水平的比较。
    【具体实施方式】
     本发明的方法为食物或物质的筛选方法， 所述食物或物质产生具有免疫调节作用的母乳， 所述筛选方法包括基于乳中的微小 RNA 谱与哺乳动物摄取的食物或包含于所述食 物中的物质的相关性来鉴定使存在于哺乳动物乳中的微小 RNA 的量增加或减少的所述食 物或物质。
     在本发明的前述方法的实施方案中， 所述免疫调节作用为免疫增强作用， 并且当 微小 RNA 的量增加时， 判定所述食物或物质产生具有免疫增强作用的母乳。在本发明的前 述方法的另一实施方案中， 所述免疫调节作用为免疫抑制作用， 并且当所述微小 RNA 的量 减少时， 判定所述食物或物质产生具有免疫抑制作用的母乳。
     本发明基于以下观点 ： 期望通过 miRNA 的口服给药来获得免疫调节作用， 这是由 于新发现 miRNA 包含于乳中， 和即使在胃中的酸性条件下 miRNA 也可稳定地存在以及母乳 促进摄取母乳的婴儿中免疫发育的事实 ( 例如， Breastfeed Med.， 2(4) ： 195-204， 2007)。 并且， 基于乳中 miRNA 谱受饮食影响的预测， 构想鉴定可使存在于乳中的 miRNA 的量增加或 减少的食物或包含于食物的活性成分。
     为本发明的筛选方法、 乳和乳制品等所定义的免疫调节作用包括， 例如， 两种作 用： 为对抗外来攻击的 “防御” 目的而起作用的增加免疫增强作用的作用 ( 免疫增强作用 ) 和为对抗免疫过度反应即过敏反应、 自身免疫病、 慢性炎症等 ( 其中 “超免疫反应” 不利地 影响生物体 ) 而起抑制作用的免疫抑制作用。
     术语 “免疫增强作用” 和 “免疫抑制作用” 以相对含义使用。当对于某一哺乳动 物母乳通常观察到的免疫增强作用在摄取食物或物质后增强时， 所述母乳具有免疫增强作 用， 而当免疫增强作用降低时， 所述母乳具有免疫抑制作用。 当食物或物质被哺乳动物摄取 后所观察到的免疫增强作用与摄取前所观察的作用相比增强时， 所述哺乳动物的母乳具有 免疫增强作用， 而当免疫增强作用与摄取前所观察到的作用相比降低时， 所述母乳具有免 疫抑制作用。
     可以例如以如下所述来研究哺乳动物乳中的 miRNA 谱和被所述哺乳动物摄取的 食物或包含于所述食物中的物质的相关性。
     收集来自摄取食物的哺乳动物的乳， 检测乳中的 miRNA 谱。
     所述哺乳动物不特别限定， 实例包括人、 牛、 山羊、 绵羊、 猪、 猿、 狗、 猫、 大鼠、 小鼠、 仓鼠和豚鼠等。所述哺乳动物优选人或牛。
     本发明中， 所述 miRNA 谱由 miRNA 的种类和量组成。 所述 miRNA 可由一种 miRNA 组 成或由两种以上 miRNA 组成。miRNA 的种类不特别限定， 只要选择存在于乳中的那些即可， 并且实例包括 miR-10、 miR-15、 miR-16、 miR-17、 miR-18、 miR-19、 miR-20、 miR-21、 miR-22、 miR-23、 miR-24、 miR-25、 miR-26、 miR-27、 miR-28、 miR-29、 miR-30、 miR-31、 miR-33、 miR-34、 miR-92、 miR-93、 miR-96、 miR-98、 miR-99、 miR-100、 miR-101、 miR-103、 miR-106、 miR-107、 miR-125、 miR-126、 miR-128、 miR-129、 miR-130、 miR-133、 miR-134、 miR-139、 miR-140、 miR-141、 miR-143、 miR-146、 miR-148、 miR-151、 miR-152、 miR-155、 miR-181、 miR-182、 miR-183、 miR-184、 miR-185、 miR-186、 miR-188、 miR-192、 miR-193、 miR-195、 miR-196、 miR-199、 miR-200、 miR-203、 miR-204、 miR-205、 miR-206、 miR-210、 miR-212、 miR-214、 miR-218、 miR-219、 miR-221、 miR-222、 miR-223、 mi R-290、 miR-291、 miR-292、 miR-294、 miR-296、 miR-301、 miR-320、 miR-322、 miR-324、 miR-327、 miR-328、 miR-331、 miR-338、 miR-340、 miR-341、 miR-342、 miR-345、 miR-347、 miR-352、 miR-361、 miR-362、 miR-365、miR-370、 miR-375、 miR-378、 miR-409、 miR-425、 miR-429、 miR-452、 miR-455、 miR-465、 miR-466、 miR-483、 miR-484、 miR-486、 miR-494、 miR-497、 miR-500、 miR-503、 miR-532、 miR-542、 miR-584、 miR-652、 miR-664、 miR-672、 miR-685、 miR-708、 miR-760、 miR-872、 miR-874、 miR-877、 miR-1224、 miR-1300、 miR-1307、 let-7a、 let-7b、 let-7c、 let-7d、 le-7e、 let-7f 和 let-7i 等。
     这些 miRNA 为证实存在于或者人母乳、 大鼠初乳或者牛初乳之一中的那些。如 上所述， 已知母乳促进摄取母乳的婴儿中的免疫发育 ( 例如， Breastfeed Med.， 2(4) ： 195-205， 2007)。此外， 已报道被认为对婴儿 ( 包括动物幼仔 ) 的免疫系统重要的许多组分 通常包含于初乳中 (J.Anim.Sci.， 2009， 87 ： (Suppl.1) ： 3-9)。因此， 提示已证实存在于乳 中的前述 miRNA 参与免疫作用。
     在以上提及的那些中， 优选的是 miR-15、 miR-16、 miR-17、 miR-18、 miR-19、 miR-20、 miR-21、 miR-23、 miR-24、 miR-26、 miR-27、 miR-29、 miR-30、 miR-33、 miR-34、 miR-92、 miR-93、 miR-99、 miR-100、 miR-101、 miR-106、 miR-107、 miR-125、 miR-130、 miR-140、 miR-141、 miR-143、 miR-146、 miR-155、 miR-181、 miR-185、 miR-186、 miR-192、 miR-193、 miR-195、 miR-200、 miR-205、 miR-210、 miR-218、 miR-219、 miR-221、 miR-222、 miR-223、 miR-301、 miR-322、 miR-340、 miR-361、 miR-370、 miR-429、 miR-455、 miR-466、 miR-497、 miR-500、 miR-503、 miR-532、 miR-542、 let-7d 和 let-7i。这些是已报道其免疫调节作用的 miRNA、 已 证实存在于大鼠和牛二者的初乳中的 miRNA 或在服用双歧杆菌属 (Bifidobacterium) 细菌 的大鼠的初乳中量增加的 miRNA。 此外， 在以上提及的 miRNA 中， 特别优选的是 miR-15、 miR-16、 miR-19、 miR-21、 miR-23、 miR-24、 miR-26、 miR-27、 miR-30、 miR-34、 miR-99、 miR-106、 miR-107、 miR-125、 miR-130、 miR-140、 miR-181、 miR-193、 miR-210、 miR-222、 miR-223、 miR-361、 miR-370、 miR-429、 miR-500、 miR-532、 let-7d 和 let-7i。这些是已证实存在于大鼠和牛二者的初乳 中的 miRNA。
     某些 miRNA 具有亚型， 例如对于 miR-181、 miR-92、 miR-125 和 miR-146 等各自已 知 2 至 4 种亚型， 如分别为 miR-181a、 miR-181b、 miR-181c、 miR-181d、 miR-92a、 miR-92b、 miR-125a、 miR-125a-3P、 miR-125a-5P、 miR-125b、 miR-146a、 miR-146b、 miR-146b-3P 和 miR-146b-5P。某些其他 miRNA 也具有亚型， 并且在本发明中， miRNA 可为这样的任何亚型。 所述亚型的实例包括下文描述的实施例中 ( 指实施例 1、 3、 4 和 5) 证实存在于乳中的那些。
     人 miR-155 前 体 has-mir-155(MI0000681)， 及 其 活 性 位 点 has-miR-155(MIMAT 0009241) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NOS ： 1 和 2。 示于括号内的为 miRNA 数据库的登录 号 (miRBase::Sequences， http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/index.shtml)( 以 下描述应同样适用 )。
     牛 miR-155 前 体 bta-miR-155(MI0009752) ， 及 其 活 性 位 点 bta-miR-155(MIMAT0000646) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NOS ： 3 和 4。
     人 miR-181 前体 hsa-mir-181a-1(MI0000289) 和 hsa-mir-181a-2(MI0000269)， 及 其活性位点 hsa-miR-181a(MIMAT0000256) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NO S ： 5、 6 和 7。
     人 miR-181b 前体 hsa-mir-181b-1(MI0000270) 和 hsa-mir-181b-2(MI0000683)， 及其活性位点 hsa-miR-181b(MIMAT0000257) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NO S ： 8、 9和
     某些 miRNA 具有亚型， 例如对于 miR-181、 miR-92、 miR-125 和 miR-146 等各自已 知 2 至 4 种亚型， 如分别为 miR-181a、 miR-181b、 miR-181c、 miR-181d、 miR-92a、 miR-92b、 miR-125a、 miR-125a-3P、 miR-125a-5P、 miR-125b、 miR-146a、 miR-146b、 miR-146b-3P 和 miR-146b-5P。某些其他 miRNA 也具有亚型， 并且在本发明中， miRNA 可为这样的任何亚型。 所述亚型的实例包括下文描述的实施例中 ( 指实施例 1、 3、 4 和 5) 证实存在于乳中的那些。
     人 miR-155 前 体 has-mir-155(MI0000681)， 及 其 活 性 位 点 has-miR-155(MIMAT 0009241) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NOS ： 1 和 2。 示于括号内的为 miRNA 数据库的登录 号 (miRBase::Sequences， http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/index.shtml)( 以 下描述应同样适用 )。
     牛 miR-155 前 体 bta-miR-155(MI0009752) ， 及 其 活 性 位 点 bta-miR-155(MIMAT0000646) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NOS ： 3 和 4。
     人 miR-181 前体 hsa-mir-181a-1(MI0000289) 和 hsa-mir-181a-2(MI0000269)， 及 其活性位点 hsa-miR-181a(MIMAT0000256) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NO S ： 5、 6 和 7。
     人 miR-181b 前体 hsa-mir-181b-1(MI0000270) 和 hsa-mir-181b-2(MI0000683)， 及其活性位点 hsa-miR-181b(MIMAT0000257) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NO S ： 8、 9和
     10。 牛 miR-181a 前体 bta-mir-181a(MI0004757) 和 bta-mir-181a-1(MI0010484)， 及 其活性位点 bta-miR-181a(MIMAT0003543) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NO S ： 11、 12 和 13。
     牛 miR-181b 前 体 bta-mir-181b-1(MI0010485) 和 bta-mir-181b-2(MI0005013)， 及其活性位点 bta-miR-181b(MIMAT0003793) 的核苷酸序列 分别示于 SEQ ID NOS ： 14、 15 和 16。
     人 miR-223 前 体 hsa-mir-223(MI0000300) ， 及 其 活 性 位 点 hsa-miR-223(MIMAT0000280) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NOS ： 17 和 18。
     牛 miR-223 前 体 bta-mir-223(MI0009782) ， 及 其 活 性 位 点 bta-miR-223(MIMAT0009270) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NOS ： 19 和 20。
     人 miR-17 前 体 的 核 苷 酸 序 列 hsa-mir-17(MI0000071)，及 其 活 性 位 点 hsa-miR-17(MIMAT0000070)( 又称 hsa-miR-17-5p)， 分别示于 SEQ ID NO S ： 21 和 22。
     牛 miR-17 前 体 bta-mir-17(MI0005031) 及 其 活 性 位 点 bta-miR-17-5p(MIMAT0003815) 和 bta-miR-17-3p(MIMAT0003816) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NO S ： 23、 24 和 25。
     牛 miR-181b 前 体 bta-mir-181b-1(MI0010485) 和 bta-mir-181b-2(MI0005013)， 及其活性位点 bta-miR-181b(MIMAT0003793) 的核苷酸序列 分别示于 SEQ ID NOS ： 14、 15 和 16。
     人 miR-223 前 体 hsa-mir-223(MI0000300) ， 及 其 活 性 位 点 hsa-miR-223(MIMAT0000280) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NOS ： 17 和 18。
     牛 miR-223 前 体 bta-mir-223(MI0009782) ， 及 其 活 性 位 点 bta-miR-223(MIMAT0009270) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NOS ： 19 和 20。
     人 miR-17 前 体 的 核 苷 酸 序 列 hsa-mir-17(MI0000071)，及 其 活 性 位 点 hsa-miR-17(MIMAT0000070)( 又称 hsa-miR-17-5p)， 分别示于 SEQ ID NO S ： 21 和 22。
     牛 miR-17 前 体 bta-mir-17(MI0005031) 及 其 活 性 位 点 bta-miR-17-5p(MIMAT0003815) 和 bta-miR-17-3p(MIMAT0003816) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NO S ： 23、 24 和 25。
    人 miR-92a 前体 hsa-mir-92a-1(MI0000093) 和 hsa-mir-92a-2(MI0000094) 及其 活性位点 hsa-miR-92a(MIMAT0000092) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NO S ： 26、 27 和 28。
     人 miR-92b 前 体 hsa-mir-92b(MI0003560) 及 其 活 性 位 点 hsa-miR-92b(MIMAT0003218) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NOS ： 29 和 30。
     牛 miR-92 前 体 bta-mir-92(MI0005024) 及 其 活 性 位 点 bta-miR-92(MIMAT0003808) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NOS ： 31 和 32。
     牛 miR-92a 前 体 bta-mir-92a(MI0009905) 及 其 活 性 位 点 bta-miR-92a(MIMAT0009383) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NOS ： 33 和 34。
     牛 miR-92b 前 体 bta-mir-92b(MI0009906) 及 其 活 性 位 点 bta-miR-92b(MIMAT 0009384) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NOS ： 35 和 36。
     人 let-7i 前 体 hsa-let-7i(MI0000434) 及 其 活 性 位 点 hsa-let-7i(MIMAT0000415) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NOS ： 37 和 38。
     牛 let-7i 前 体 bta-let-7i(MI0005065) 及 其 活 性 位 点 bta-let-7i(MIMAT0003851) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NOS ： 39 和 40。
     人 miR-125a 前 体 hsa-mir-125a(MI0000469) 及 其 活 性 位 点 hsa-miR-125a-5p(MIMAT0000443) 和 hsa-miR-125a-3p(MIMAT0004602) 的核苷酸序列分别 示于 SEQ ID NO S ： 41、 42 和 43。
     人 miR-125b 前 体 hsa-mir-125b-1(MI0000446) 和 hsa-mir-125b-2(MI0000470) 及其活性位点 hsa-miR-125b(MIMAT0000423) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NO S ： 44、 45 和 46。
     牛 miR-125a 前 体 bta-mir-125a(MI0004752) 及 其 活 性 位 点 bta-miR-125a(MIMAT0003538) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NOS ： 47 和 48。
     牛 miR-125b 前 体 bta-mir-125b-1(MI0004753) 和 bta-mir-125b-2(MI0005457)
     人 miR-92b 前 体 hsa-mir-92b(MI0003560) 及 其 活 性 位 点 hsa-miR-92b(MIMAT0003218) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NOS ： 29 和 30。
     牛 miR-92 前 体 bta-mir-92(MI0005024) 及 其 活 性 位 点 bta-miR-92(MIMAT0003808) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NOS ： 31 和 32。
     牛 miR-92a 前 体 bta-mir-92a(MI0009905) 及 其 活 性 位 点 bta-miR-92a(MIMAT0009383) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NOS ： 33 和 34。
     牛 miR-92b 前 体 bta-mir-92b(MI0009906) 及 其 活 性 位 点 bta-miR-92b(MIMAT 0009384) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NOS ： 35 和 36。
     人 let-7i 前 体 hsa-let-7i(MI0000434) 及 其 活 性 位 点 hsa-let-7i(MIMAT0000415) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NOS ： 37 和 38。
     牛 let-7i 前 体 bta-let-7i(MI0005065) 及 其 活 性 位 点 bta-let-7i(MIMAT0003851) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NOS ： 39 和 40。
     人 miR-125a 前 体 hsa-mir-125a(MI0000469) 及 其 活 性 位 点 hsa-miR-125a-5p(MIMAT0000443) 和 hsa-miR-125a-3p(MIMAT0004602) 的核苷酸序列分别 示于 SEQ ID NO S ： 41、 42 和 43。
     人 miR-125b 前 体 hsa-mir-125b-1(MI0000446) 和 hsa-mir-125b-2(MI0000470) 及其活性位点 hsa-miR-125b(MIMAT0000423) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NO S ： 44、 45 和 46。
     牛 miR-125a 前 体 bta-mir-125a(MI0004752) 及 其 活 性 位 点 bta-miR-125a(MIMAT0003538) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NOS ： 47 和 48。
     牛 miR-125b 前 体 bta-mir-125b-1(MI0004753) 和 bta-mir-125b-2(MI0005457)
     及其活性位点 bta-miR-125b(MIMAT0003539) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NO S ： 49、 50 和 51。
     人 miR-146a 前 体 hsa-mir-146a(MI0000477) 及 其 活 性 位 点 hsa-miR-146a(MIMAT0000449) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NOS ： 52 和 53。
     人 miR-146b 前 体 的 核 苷 酸 序 列 hsa-mir-146b(MI0003129) 及 其 活 性 位 点 hsa-miR-146b-5p(MIMAT0002809)( 也 称 为 hsa-miR-146b) 和 hsa-miR-146b-3p(MIMAT 0004766) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NOS ： 54、 55 和 56。
     牛 miR-146a 前 体 bta-mir-146a(MI0009746) 及 其 活 性 位 点 bta-miR-146a(MIMAT0009236) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NOS ： 57 和 58。
     牛 miR-146b 前 体 bta-mir-146b(MI0009745) 及 其 活 性 位 点 bta-miR-146b(MIMAT0009235) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NOS ： 59 和 60。
     人 miR-150 前 体 hsa-mir-150(MI0000479) 及 其 活 性 位 点 hsa-miR-150(MIMAT 0000451) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NOS ： 61 和 62。
     牛 miR-150 前 体 bta-mir-150(MI0005058) 及 其 活 性 位 点 bta-miR-150(MIMAT0003845) 的核苷酸序列分别示于 SEQ ID NOS ： 63 和 64。 除前述 miRNA 外， 将已证实存在于大鼠或牛的乳中的 miRNA 和与这些 miRNA 相应 的其他动物的 miRNA 示于表 1 至 10。
     表1
    
    
    表2
    
    表3
    
    表4
    
    表5
    
    表6
    
    表7
    
    表8
    
    表9
    
    表 10miRNA 不限制为具有前述序列的那些， 所述 miRNA 可包括一个或几个核苷酸的替 换、 缺失、 插入、 增添或倒位， 只要 miRNA 具有作为 miRNA 的功能， 即， miRNA 可调节靶基因的 表达即可。特别地， 此类 miRNA 的实例包括具有与前述任一序列显示 80％以上、 优选 90％ 以上、 更优选 95％以上的同源性的核苷酸序列的 RNA。
     miRNA 的量可为绝对量或相对量。 相对量可为基于动物中的平均量的相对量， 或可
     为基于食物摄取前所观察到的量， 在食物摄取后所观察到的相对量。 对于核酸量的测定， 可 采用通常用于 miRNA 量测定的方法如定量逆转录 PCR(qRT-PCR)。miRNA 的量还可通过微阵 列法测定。关于乳中 miRNA 的提取， 可采用通常用于 miRNA 提取的方法， 还可使用商购可得 的 miRNA 分离试剂盒。
     另外， 存在于乳中的 miRNA 的量还可通过测定乳腺细胞中 miRNA 的表达量来间接 测定。
     检测哺乳动物乳中的 miRNA 谱和由该哺乳动物摄取的食物或包含于所述食物中 的物质的相关性。哺乳动物乳中的 miRNA 谱和由该哺乳动物摄取的食物或包含于所述食物 中的物质的相关性是指 miRNA 谱与所述物质的存在或缺失或者所述物质的量的相关性。例 如， 如果已摄取某一物质的动物的乳中一种以上 miRNA 的量大于或小于未摄取该物质的动 物中所观察到的那些， 则该物质和 miRNA 谱分别具有正或负相关性。另外， 如果某一物质的 摄取不影响 miRNA 谱， 则该物质和 miRNA 谱互不相关。
     具体地， 例如， 当比较食物摄取前后所观察到的乳中的 miRNA 谱时， 摄取后所观察 到的一种、 优选两种以上、 更优选五种以上 miRNA 的量大于摄取前所观察到的那些， 则判定 该食物使存在于乳中的 miRNA 的量增加。
     另外， 当比较食物摄取前后所观察到的乳中的 miRNA 谱时， 摄取后所观察到的一 种、 优选两种以上、 更优选五种以上 miRNA 的量小于摄取前所观察到的那些， 则判定该食物 使存在于乳中的 miRNA 的量降低。
     此外， 食物摄取前 miRNA 谱的测定并不是不可缺少的， 食物和 miRNA 量的相关性还 可通过比较在摄取食物后测定的 miRNA 谱与预先测定的对象哺乳动物的普通 miRNA 谱来测 定。
     在另一实施方案中， 比较乳中的 miRNA 谱和血清或血浆中的 miRNA 谱， 如果乳和 血清或血浆二者中包含的 miRNA 的存在量， 通过摄取食物使乳中所观察到的 miRNA 的存 在量比血清或血浆中所观察到的 miRNA 的存在量更高的话， 则判定该食物使存在于乳中的 miRNA 的存在量增加。 与血清或血浆中的 miRNA 的存在量相比， 乳中 miRNA 的存在量高的程 度为例如 1.2 倍以上、 优选 2 倍以上、 更优选 5 倍以上、 还更优选 10 倍以上。
     另外， 当比较乳中的 miRNA 谱和血清或血浆中的 miRNA 谱时， 如果乳和血清或血浆 二者中包含的 miRNA 的量， 通过摄取食物而使乳中的量比血清或血浆中所观察到的量更低 的话， 则判定该食物使存在于乳中的 miRNA 的量减少。与血清或血浆中所观察到的 miRNA 存在量相比， 乳中 miRNA 的存在量低的程度为例如 0.8 倍以下、 优选 0.5 倍以下、 更优选 0.2 倍以下、 还更优选 0.1 倍以下。
     所述食物可由单一物质组成或可为组合物， 只要其可口服摄取即可。另外， “摄取 前” 和 “摄取后” 可意为 “一次食物摄取之前和之后” 或 “两次以上食物摄取之前和之后” 。 另外， 两次以上食物摄取可为两次以上相同食物的摄取， 或两种以上食物的摄取。
     所述食物可为根据既定计划摄取或自由摄取。后一种情况中， 所述食物和乳中 miRNA 谱的相关性人类情况中可通过获取 (hearing) 所摄取的食物的含量来检测。当根据 既定计划摄取或服用所述食物时， 所述食物可被认为是 “试样” 。所述食物可为普通食物或 包含试验物质的普通食物。摄取的食物量、 摄取的时间和摄取的次数不特别限定。
     如果选择使乳中 miRNA 的量增加的食物， 则包含于所述食物并使乳中 miRNA 的量增加的物质可用如上述相同的方式鉴定。另外， 如果选择使乳中 miRNA 的量减少的食物， 则 包含于所述食物并使乳中 miRNA 的量减少的物质可用如上述相同的方式鉴定。
     如果鉴定出增加或减少乳中 miRNA 的量的食物或物质， 则可设计使乳中 miRNA 的 量增加或减少的食物。即， 认为使乳中 miRNA 的量增加的食物或包含于其中的物质是产生 具有免疫增强作用的乳所优选的， 而使乳中 miRNA 的量减少的食物或包含于其中的物质不 是产生具有免疫增强作用的乳所优选的。
     另外， 认为使乳中 miRNA 的量减少的食物或包含于其中的物质是产生具有免疫抑 制作用的乳所优选的， 而使乳中 miRNA 的量增加的食物或包含于其中的物质不是产生具有 免疫抑制作用的乳所优选的。
     可如上所述进行产生具有免疫调节作用的母乳的食物或物质， 或不适于产生具有 免疫调节作用的母乳的食物或物质的筛选。如下文所述实施例中所示， 在大鼠和牛的初乳 中证实存在各种 miRNA。 这支持了本发明的观点， 即期望 miRNA 的口服给药提供免疫调节作 用。 另外， 如下文所述实施例中所示， 当将双歧杆菌属细菌 ( 长双歧杆菌 (Bifidobacterium longum)) 对大鼠口服给药时， 52 种 miRNA 的量增加。
     已知双歧杆菌属细菌作为益生菌行使功能， 并特别地具有免疫调节作用。 因此， 服 用双歧杆菌属细菌使乳中 miRNA 的量增加的事实也支持乳中 miRNA 参与免疫调节。通过服 用双歧杆菌属细菌诱导的乳中 miRNA 的量增加的论证， 即双歧杆菌属细菌与 miRNA 谱的相 关性， 显示出本发明的筛选方法是可行的。 另外， 尽管还存在通过服用双歧杆菌属细菌不改 变其在乳中的量的 miRNA， 但不否认可通过另一种食物或包含于其中的物质使那些 miRNA 的量增加的可能性。
     作为双歧杆菌属细菌的益生菌功能， 已知防御或改善呼吸道感染、 急性感染性腹 泻、 抗生素相关性腹泻、 艰难梭菌 (Clostridium dificile) 相关性腹泻、 坏死性肠结肠 炎 (necrotizing enterocolitis)、 旅行者腹泻 (traveler’ s diarrhea) 和幽门螺杆菌 (Helicobacter pylori) 感染等 (The Journal of Nutrition， 2010Mar ； 140(3) ： 698S-712S Epub 2010Jan 27)。表明通过服用双歧杆菌属细菌而使其在乳中的量增加的 miRNA 不仅调 节免疫， 而且在摄取双歧杆菌属细菌的动物中显示的功能类似于前述益生菌的功能。
     通过给予哺乳动物如上所述选择的使乳中 miRNA 量增加的食物或物质， 并从该动 物中收集乳， 可获得具有免疫增强作用的乳或其免疫增强作用增强的乳。 另外， 通过减少或 避免哺乳动物摄取上述选择的使乳中 miRNA 量减少的食物或物质， 可增强乳的免疫增强作 用， 或可预防免疫增强作用的降低。
     另外， 可将使乳中 miRNA 量增加的食物或物质的摄取以及减少或避免使乳中 miRNA 量减少的食物或物质的摄取结合起来。另外， 通过给予哺乳动物上述选择的使乳中 miRNA 量减少的食物或物质， 并从该动物中收集乳， 可获得具有免疫抑制作用的乳或其免疫 增强作用减少的乳。另外， 通过减少或避免哺乳动物摄取上述选择的使乳中 miRNA 量增加 的食物或物质， 可增强乳的免疫抑制作用， 或可降低乳的免疫增强作用。另外， 可将使乳中 miRNA 量减少的食物或物质的摄取以及减少或避免使乳中 miRNA 量增加的食物或物质的摄 取结合起来。
     通过处理上述获得的具有免疫调节作用的乳， 可产生具有免疫调节作用的乳制 品。乳制品的类型不特别限定， 只要 miRNA 在维持其功能的情况下可存在于乳制品中 即可， 实例包括加工乳、 婴儿配方、 乳饮料、 婴儿配方奶粉 (powdered infant formula)、 发 酵乳、 奶油、 黄油、 奶酪和冰淇淋等。作为乳制品， 优选婴儿或幼儿用乳制品。
     根据本发明， 已证实乳中 miRNA 的存在， 特别是已知参与免疫增强例如免疫发育、 抗过敏、 抗炎和预防感染的 miRNA。此外， 众所周知， 母乳对摄取其的婴儿给予免疫增强作 用。 因此， 参与免疫调节的 miRNA 可调节摄取其的生物体例如人类的免疫是合理地预测。 由 于 miRNA 是调节各种基因表达的物质， 因此认为此类调节分子从母体至婴儿的转移特别是 对具有未发育的免疫系统的婴儿来说是极其重要的。
     本发明的另一方面是具有免疫增强作用的口服摄取用组合物， 其通过向口服摄取 用组合物的基质中添加 miRNA 而制备。
     所述 miRNA 的实例包括 miR-10、 miR-15、 miR-16、 miR-17、 miR-18、 miR-19、 miR-20、 miR-21、 miR-22、 miR-23、 miR-24、 miR-25、 miR-26、 miR-27、 miR-28、 miR-29、 miR-30、 miR-31、 miR-33、 miR-34、 miR-92、 miR-93、 miR-96、 miR-98、 miR-99、 miR-100、 miR-101、 miR-103、 miR-106、 miR-107、 miR-125、 miR-126、 miR-128、 miR-129、 miR-130、 miR-133、 miR-134、 miR-139、 miR-140、 miR-141、 miR-143、 miR-146、 miR-148、 miR-151、 miR-152、 miR-155、 miR-181、 miR-182、 miR-183、 miR-184、 miR-185、 miR-186、 miR-188、 miR-192、 miR-193、 miR-195、 miR-196、 miR-199、 miR-200、 miR-203、 miR-204、 miR-205、 miR-206、 miR-210、 miR-212、 miR-214、 miR-218、 miR-219、 miR-221、 miR-222、 miR-223、 miR-290、 miR-291、 miR-292、 miR-294、 miR-296、 miR-301、 miR-320、 miR-322、 miR-324、 miR-327、 miR-328、 miR-331、 miR-338、 miR-340、 miR-341、 miR-342、 miR-345、 miR-347、 miR-352、 miR-361、 miR-362、 miR-365、 miR-370、 miR-375、 miR-378、 miR-409、 miR-425、 miR-429、 miR-452、 miR-455、 miR- 465、 miR-466、 miR-483、 miR-484、 miR-486、 miR-494、 miR-497、 miR-500、 miR-503、 miR-532、 miR-542、 miR-584、 miR-652、 miR-664、 miR-672、 miR-685、 miR-708、 miR-760、 miR-872、 miR-874、 miR-877、 miR-1224、 miR-1300、 miR-1307、 let-7a、 let-7b、 let-7c、 let-7d、 le-7e、 let-7f 和 let-7i 等。
     在 上 述 miRNA 中， miR-15、 miR-16、 miR-17、 miR-18、 miR-19、 miR-20、 miR-21、 miR-23、 miR-24、 miR-26、 miR-27、 miR-29、 miR-30、 miR-33、 miR-34、 miR-92、 miR-93、 miR-99、 miR-100、 miR-101、 miR-106、 miR-107、 miR-125、 miR-130、 miR-140、 miR-141、 miR-143、 miR-146、 miR-155、 miR-181、 miR-185、 miR-186、 miR-192、 miR-193、 miR-195、 miR-200、 miR-205、 miR-210、 miR-218、 miR-219、 miR-221、 miR-222、 miR-223、 miR-301、 miR-322、 miR-340、 miR-361、 miR-370、 miR-429、 miR-455、 miR-466、 miR-497、 miR-500、 miR-503、 miR-532、 miR-542、 let-7d 和 let-7i 是优选的， 而 miR-15、 miR-16、 miR-19、 miR-21、 miR-23、 miR-24、 miR-26、 miR-27、 miR-30、 miR-34、 miR-99、 miR-106、 miR-107、 m iR-125、 miR-130、 miR-140、 miR-181、 miR-193、 miR-210、 miR-222、 miR-223、 miR-361、 miR-370、 miR-429、 miR-500、 miR-532、 let-7d 和 let-7i 是更优选的。
     所述 miRNA 可由单种 miRNA 组成或由任意的两种以上 miRNA 组成。
     口服摄取用组合物的基质不特别限定， 只要选择 miRNA 可在其中维持其功能而存 在的口服摄取的或可给药的基质即可， 实例包括食品、 饮品、 药品基质和动物饲料等。
     食品可以为任何形式， 并包括饮品。 食品包括成人用食品、 婴儿用食品和幼儿用食品等。
    成人用食品的实例包括肠内营养物、 流体食物例如浓缩的流体食物和营养增补食品等。 婴儿用食品或幼儿用食品的实例包括， 例如调制乳类 (modified milk)( 例如， 婴 儿配方、 低出生体重 (birth weight) 婴儿用婴儿配方、 较大婴儿配方等以及过敏型婴儿用 婴儿配方、 无乳糖乳、 先天性代谢缺陷婴儿的特殊乳等， 和由这些制备的奶粉 )、 母乳增补粉 或婴儿配方奶粉和婴儿食品等。
     此处所指的婴儿配方是通过使用乳或乳制品作为主原料并添加婴儿所需的营养 物生产的食品， 并主要用作婴儿期母乳的替代食品， 以及作为幼年时期母乳的替代食品或 营养补充食品。 所述婴儿配方的其他实例包括为适合于具有特定的先天或后天疾病的婴儿 有助于营养摄取为目的而生产的食品。
     miRNA 相对耐冻融、 低 pH 如 pH1 的酸性条件和 RNase 如 RNase A 和 RNase T， 因而 适合作为添加到食品中的活性成分。低 pH 下的稳定性表明 miRNA 分子耐婴儿胃内环境， 并 可被婴儿的主要免疫器官之一的肠道吸收， 因此其可影响婴儿的免疫系统。 另外， 母乳的保 存和冻融不会使 miRNA 变性， 这对通常给予冷藏保存的母乳的低出生体重婴儿和住院婴儿 在营养上是重要的。此外， miRNA 对 RNase 的耐受性表明 miRNA 可存在于复合体例如母乳 中的外泌体和微泡中。
     从前述发现中， 似乎母亲给予婴儿这样定制 (custom-made) 的母乳， 婴儿便可适 应环境。 有报道表明源于母乳的外泌体使 Foxp3+CD4+CD25+ 调节 T 细胞的数量增加。 如果免 疫相关的 miRNA 包含于母乳外泌体中， 则其可能有助于婴儿消化道内 Foxp3+CD4+CD25+ 调 节 T 细胞的增加。这是由于母乳中检测出的免疫相关的 miRNA 如 miR-181a 和 miR-181b 高 度表达， 其参与 T 细胞的分化。此外， 由于已知大量包含于母乳中的 miR-181 和 miR-155 诱 导 B 细胞的分化， 而抑制 B 细胞分化的 miR-150 在母乳中几乎不存在， 因而母乳中的 miRNA 可诱导 B 细胞的分化。
     尽管组合物中 miRNA 的含量不特别限定， 并可适当选择， 然而其总计例如为 10 至 10,000ng/ml， 优选 20 至 10,000ng/ml， 更优选 50 至 10,000ng/ml。另外， 摄取的 miRNA 的 量， 总计例如 5μg 至 120mg/ 天， 优选 10μg 至 120mg/ 天， 更优选 25μg 至 120mg/ 天。
     可通过制备部分双链 RNA 作为 miRNA 前体 (pri-miRNA) 并用 Dicer 酶消化来获得 miRNA。作为 Dicer 酶， 可使用商购可得的酶。双链 RNA 可通过例如使用具有互补序列的双 链 DNA 作为模板的 RNA 聚合酶反应来制备。所述双链 DNA 可通过使用哺乳动物的染色体 DNA 作为模板以及为能够扩增 miRNA 序列而设计的引物基于 PCR 的扩增来制备。
     可通过用 Dicer 酶等消化如上所述获得的双链 RNA 来获得 miRNA。
     另外， miRNA 还可通过化学合成来制备。即， 可通过合成正义链和反义链并将其退 火来获得 miRNA。
     另外， 可将允许通过哺乳动物的内源 Dicer 酶产生靶 miRNA 的双链 RNA 添加到口 服摄取用组合物中。
     当本发明的口服摄取用组合物为药剂时， 可通过用药物学上可接受的口服给药用 载体与 miRNA 组合来制备组合物。药物制剂的形式不特别限定， 实例包括片剂、 丸剂、 散剂、 溶液剂、 悬浮剂 (suspension)、 乳剂、 颗粒剂、 胶囊剂和糖浆剂等。对于剂型， 可使用广泛用
     于通常的药剂的添加剂作为口服给药用药物载体， 如赋形剂、 结合剂、 崩解剂、 润滑剂、 稳定 剂、 矫味剂 (corrigent)、 稀释剂和表面活性剂。另外， 除非本发明的效果降低， 否则 miRNA 可与另一具有免疫调节作用的药物一起使用。
     尽管包含于药剂中的 miRNA 的量不特别限定， 但其总计例如为 2μg/kg 至 2mg/kg， 优选 4μg/kg 至 2mg/kg， 更优选 10μg/kg 至 2mg/kg。
     当口服摄取用组合物为食品时， 其可用于利用免疫增强作用的任何各种用途。所 述用途的实例包括， 例如作为适用于显示抵抗力低下人群的食品的用途和作为用于降低或 消除由免疫低下引起的各种疾病的风险因素的食品或饮品的用途等。
     本发明的食品或饮品可作为食品出售， 并附有描述该食品用于免疫调节的指示。
     前述术语 “指示” 包括告知消费者前述用途的所有行为， 并且任何提醒或类推前述 用途的指示落入本发明 “指示” 的范围内， 而不管指示的目的、 内容、 对象物、 媒体等如何。 然而， 所述指示优选用允许消费者直接识别前述用途的表述制成。具体实例包括在与本发 明的食品相关的商品或商品包装上指示前述用途的行为， 在上面指示了前述用途的该商品 或商品的包装的分派 (assigning)、 交付 (delivering)、 为分派、 交付目的的展示或进口行 为， 或者与商品相关的展示或分配广告、 价格表或商业单据 (business papers)、 或者通过 电磁法 ( 互联网等 ) 提供包括作为指示前述用途的内容的那些信息等的行为。 所述指示优选为经行政机构等批准的指示 ( 例如， 基于认可的形式的指示， 该认 可基于由行政机构提供的各种法律制度之一而授权 )， 特别优选在销售现场在广告材料上 的指示， 例如包装、 容器、 目录、 宣传册和 POP 及其他文件等。
     所述指示的实例进一步包括， 例如， 作为健康食品、 功能性食品、 肠道营养食品、 特膳用途食品 (food for special dietary uses)、 具有营养功能声明的食品和准药 (quasi-drug) 等的指示， 以及经卫生部、 厚生劳动省 (Labor and Welfare) 批准的指示， 例 如基于特定保健用食品 (food for specified health uses) 体系及类似体系而批准的指 示。后者的实例包括作为特定保健用食品的指示、 作为具有授权的保健声明的特定保健用 食品的指示、 影响身体结构和功能的指示和减少疾病风险声明的指示等， 更精确地， 典型的 实例包括在健康促进法 (Health Promotion Law) 实施条例 ( 日本卫生部、 厚生劳动省内部 条例第 86 号， 2003 年 4 月 30 日 ) 中提供的作为特定保健用食品的指示 ( 特别是用于保健 的指示 ) 以及类似的指示。
     实施例
     以下将参考实施例进一步详细解释本发明。 然而， 本发明不受以下实施例的限定。
     实施例 1 ： 母乳中 miRNA 的分析
     将人母乳在 2,000×g 下离心 10 分钟以移除细胞和大沉淀物， 进一步将除构成表 层的脂质外的上清液在 12,000×g 下离心 30 分钟以移除细胞碎片和细胞尘 (dust)。使用 mirVana miRNA 分离试剂盒根据制造商的实验步骤 (protocol) 从上清液中提取总 RNA。来 自血清的 RNA 的提取以与对于母乳使用的相同的方式进行。
     通过使用生物分析仪来分析提取的 RNA。 尽管相当大量的 RNA 包含于母乳中， 但几 乎不包含或根本不包含核糖体 RNA(18S rRNA、 28S rRNA)。
     通过使用微阵列分析系统 ( 使用由 Agilent Technologies 生产的系统 ) 来检测 miRNA。通过使用 Gene Spring GX11.0( 由 Agilent Technologies 生产 ) 分析 miRNA 的表
     达水平。结果示于图 1。结果， 以显著水平检测出 miR-181a、 miR-181b、 miR-155、 miR-125b、 miR-146b、 miR-223 和 let-7i。无法检出控制 T 细胞和 B 细胞的 miR-150。另外， 几乎不能 检测出多器官特异的 miRNA 如 miR-122( 肝脏 )、 miR-216、 miR-217( 胰腺 )、 miR-142-5p、 miR-142-3p( 造血细胞 )。此外， 检出小量 miR-124( 脑 )。
     通过定量 RT-PCR 分析的出生后前六个月 (n ＝ 5) 和接下来的六个月 (n ＝ 13) 的 母乳中的 miR-181a 水平的比较结果示于图 2。对 miR-155、 miR-17 和 miR-92a 进行的类 似分析的结果也示于图 3 中。为了使由 RNA 分离过程诱导的样品中的变化标准化， 将变性 的 cel-miR-39( 由 Qiagen 合成 )( 为线虫 ( 秀丽隐杆线虫 ) 的合成 miRNA) 添加到样品中 (5ml 总体积中寡核苷酸量为 25fmol)， miRNA 的量作为基于 cel-miR-39 的量的相对量来示 出 ( 以下实验应同样应用 )。
     结果， 出生后前六个月的乳与接下来六个月的乳相比 miR-181a 的量较大 ( 图 2)。 对于 miR-155、 miR-17 和 miR-92a 也观察到类似的趋势 ( 图 3)。
     作为 RT-PCR 用引物， 使用由 Applied Biosystems 生产并由以下 Assay ID 鉴定的 那些。
     -miR-181a ： 000480
     -miR-155 ： 002623
     -miR-17 ： 002308
     -miR-92a ： 000431
     -Cel-miR-39 ： 000200
     产后 6 个月内七名健康人的母乳和血清中与免疫相关的 miRNA 水平的比较结果示 于图 4( 母乳 ： n ＝ 5、 血清 ： n ＝ 6)。母乳中 miRNA 谱不同于血清中的那些。例如， 控制粒细 胞的 miRNAmiR-223 在正常人血清和血浆中以最高水平存在， 然而与血清中的相比其在母 乳中的表达量极低。另外， 不大量存在于血清中的 miR-146b 却大量地存在于母乳中。
     另一方面， 与血清中所观察到的那些相比， 在表达量上母乳中大量存在 miR-181 和 miR-155。 有趣的是， 在产后六个月 ( 其为婴儿食品摄入前的阶段 ) 的母乳中高度表达多 种免疫相关的 miRNA。
     miRNA 的细胞间转移表明 miRNA 不仅控制细胞内分子， 还是在细胞间通讯中像 细胞因子一样起作用的分子。前述结果表明 miRNA 为可从母体转移至孩子的 “遗传物质 7 (genetic materal)” 。据计算， 约 0.15pg/L/ 天 (1.3×10 个拷贝 /L/ 天 ) 的 miR-181 经 母乳被婴儿摄取。
     此外， 作为聚类分析的结果， 已发现不同母亲的母乳的 miRNA 谱是相似的。
     实施例 2 ： miRNA 的物理化学性质
     将母乳在室温下静置 24 小时， 或反复进行冷冻 (-20 ℃ ) 和融解至 3 次。通过 TaqMan qRT-PCR 测定 miRNA(miR-21、 miR-181a) 的水平。结果示于图 5。另外， 在低 pH 溶 液 (pH 1) 中处理母乳 3 小时， 用 TaqMan qRT-PCR 测定处理前后 miRNA(miR-181a) 的水平。 结果示于图 6。
     另外， 将 RNase A/T 溶液 (RNase A(500U/ml) 和 RNaseT1(20,000U/ml) 的混合溶 液， 由 Ambion 生产 ) 以母乳的 2％体积加入母乳中， 37℃下处理混合物 3 小时， 通过 TaqMan qRT-PCR 测定处理前后 miRNA(miR-181a) 的水平。结果示于图 7。作为用于 TaqMan qRT-PCR 的引物， 使用由 Applied Biosystems 生产并由以下 Assay ID 鉴定的那些。
     -miR-181a ： 000480
     -miR-21 ： 000397
     -Cel-miR-39 ： 000200
     证实 miRNA 对冻融、 低 pH 和 RNase 相对稳定。
     实施例 3 ： 产生具有免疫调节作用的乳的食物或物质的鉴定
     购买怀孕 9 至 10 天的 SD 大鼠， 在怀孕 13 至 20 天期间， 以每只大鼠 1ml/ 天的 体积将双歧杆菌属细菌、 长双歧杆菌 BB536(ATCC BAA-999) 的 PBS( 磷酸盐缓冲盐水 ) 9 (1×10 cfu/ml) 悬浮液给药到试验组 (n ＝ 3) 的大鼠。
     另外， 作为对照组 (n ＝ 3)， 以每只大鼠 1ml 每天的体积给药 PB S。长双歧杆 菌 (B.longum)AT CC BAA-999 菌株可从美国模式培养物集存库 (American Type Culture Collection) 购买 ( 地址 ： 12301 Parklawn Drive， 罗克维尔市， 马里兰州 20852， 美国 )。
     所有大鼠在怀孕 21 天时产仔， 并且在其分娩后第一天在用乙醚麻醉下产奶。所获 初乳样品离心两次来移除脂质层和细胞碎片， 离心条件为 1,200×g、 4℃、 10 分钟。
     随后， 在 21,500×g 和 4 ℃下离心上清液 40 分钟， 并进一步在相同条件下离心 1 小时来移除酪蛋白组分， 从而获得乳清。通过使用 miRNeasy 迷你试剂盒 (Mini Kit)( 由 Qiagen 生产 ) 从所获乳清样品中获得总 RNA。
     通过使用 100ng 所获 RNA 样品， 使用微阵列系统 ( 由 Agilent Technologie s 生 产 ) 以常规方式检测 miRNA。通过使用 GeneSpring GX11.0( 由 Agilent Technologies 生 产 ) 分析结果。
     当通过使用 Gene Spring G X11.0 进行微阵列数据的统计学分析时， 发现在检测 微小 RNA 的试验组和对照组中已证实表达的微小 RNA 的类型数总计为 155。这些微小 RNA 如下所示。此外， 未检出 miR-150。
     在试验组和对照组中证实表达的微小 RNA， 155 种 ：
     miR-16、 miR-17-5p、 miR-18(miR-18a)、 miR-19(miR-19b)、 miR-20(miR-20a)、 miR-21 、 miR-23(miR-23a) 、 miR-27(miR-27a 、 miR-27b) 、 miR-29(miR-29a 、 miR-29b 、 miR-29c、 miR-29c*)、 miR-30(miR-30a、 miR-30c、 miR-30d、 miR-30e*)、 miR-33、 miR-34b、 miR-92a、 miR-93、 miR-100、 miR-101(miR-101a、 miR-101b)、 miR-106b、 miR-130b、 miR-140*、 miR-141、 miR-143、 miR-146a、 miR-185、 miR-186、 miR-192、 miR-193、 miR-195、 miR-200a、 miR-205、 miR-218、 miR-219-5p、 miR-221、 miR-301a、 miR-322、 miR-340-5p、 miR-361、 miR-429、 miR-455、 miR-466b、 miR-497、 miR-500、 miR-503、 miR-532-5p、 miR-542-3p
     let-7a 、let-7a* 、let-7b 、let-7c 、let-7d 、le-7e 、let-7f 、let-7i 、 miR-10(miR-10a-5p、 miR-10b)、 miR-15(miR-15b)、 miR-19(miR-19a)、 miR-20(miR-20a*)、 miR-22 、 miR-23(miR-23b) 、 miR-24 、 miR-25 、 miR-26(miR-26a ， miR-26b) 、 miR-28 、 miR-30(miR-30a* 、miR-30b-5p 、miR-30c-1* 、miR-30c-2* 、miR-30e) 、miR-31 、 miR-34(miR-34a) 、 miR-96 、 miR-98 、 miR-99(miR-99a 、 miR-99b) 、 miR-103 、 miR-107 、 miR-125(miR-125a-3p 、miR-125a-5p 、miR-125b-3p 、miR-125b-5p) 、miR-128 、 miR-130(miR-130a)、 miR-133(miR-133a、 miR-133b)、 miR-134、 miR-139(miR-139-3p)、m i R - 1 4 0 、m i R - 1 4 6 ( m i R - 1 4 6 b ) 、m i R - 1 4 8 ( m i R - 1 4 8 b - 3 p ) 、m i R - 1 5 1 、m i R - 1 5 2 、 miR-181(miR-181a、 miR-181a*、 miR-181b、 miR-181c、 miR-181d)、 miR-182、 miR-183、 miR-188、 miR-196(miR-196c)、 miR-199(miR-199a-3p)、 miR-200(miR-200b、 miR-200c)、 miR-203、 miR-204、 miR-206、 miR-210、 miR-212、 miR-214、 miR-222、 miR-223、 miR-290、 miR-291(miR-291a-5p)、 miR-292(miR-292-5p)、 miR-294、 miR-296(miR-296*)、 miR-320、 miR-324(miR-324-3p 、 miR-324-5p)、 miR-327、 miR-328、 miR-331、 miR-340(miR-340-3p)、 miR-341、 miR-342(miR-342-3p)、 miR-345(miR-345-5p)、 miR-347、 miR-352、 miR-365、 miR-370、 miR-375、 miR-378(miR-378、 miR-378*)、 miR-425、 miR-465、 miR-483、 miR-484、 miR-494、 miR-542(miR-542-5p)、 miR-652、 miR-672、 miR-685、 miR-760(miR-760-3p)、 miR-872、 miR-874、 miR-1224
     在 miR- 序号后带括号说明的所列 miRNA 具有亚型， 括号内所说明的亚型实际表 达。
     另外， 当通过使用曼 - 惠特尼 U 检验 (Mann-Whitney U-test) 在统计学上比较双 歧杆菌属细菌 BB 536 给药组和对照组中前述微小 RNA 的表达量时， 发现以下 52 种微小 RNA 类型在双歧杆菌属细菌 BB 536 给药组中以小于 5％的概率水平增加。 所述 miRNA 在表达上 的变化倍率示于表 11。
     在双歧杆菌属细菌 BB 536 给药组中证实增加的微小 RNA， 52 种 ：
     miR-16、 miR-17-5p、 miR-18(miR-18a)、 miR-19(miR-19b)、 miR-20(miR-20a)、 miR-21 、 miR-23(miR-23a) 、 miR-27(miR-27a 、 miR-27b) 、 miR-29(miR-29a 、 miR-29b 、 miR-29c、 miR-29c*)、 miR-30(miR-30a、 miR-30c、 miR-30d、 miR-30e*)、 miR-33、 miR-34b、 miR-92a、 miR-93、 miR-100、 miR-101(miR-101a、 miR-101b)、 miR-106b、 miR-130b、 miR-140*、 miR-141、 miR-143、 miR-146a、 miR-185、 miR-186、 miR-192、 miR-193、 miR-195、 miR-200a、 miR-205、 miR-218、 miR-219-5p、 miR-221、 miR-301a、 miR-322、 miR-340-5p、 miR-361、 miR-429、 miR-455、 miR-466b、 miR-497、 miR-500、 miR-503、 miR-532-5p、 miR-542-3p
     表 11
    从表 11 所示结果可看出， 发现对于证实增加的所有 52 种微小 RNA 观察到的变化 倍率为 1.2 倍以上。
     即， 发现基于这样的 52 种微小 RNA 的检测可将双歧杆菌属细菌 BB 536 菌株筛选 为产生具有免疫调节作用的乳的食物或物质。
     实施例 4 ： 大鼠初乳中表达的微小 RNA 的检测
     购买三只怀孕 14 天的 F344 大鼠。所有购买的大鼠在怀孕 21 天时产仔， 并且在其 分娩后第二天在乙醚麻醉下产奶以收集初乳。
     各初乳样品在 1,200×g 和 4℃下离心 10 分钟两次来移除脂质层和细胞碎片。
     随后， 在 21,500×g 和 4℃下离心上清液 40 分钟， 并进一步在相同条件下离心 1 小 时来移除酪蛋白组分， 从而获得乳清。
     通过使用 miRNeasy 迷你试剂盒 ( 由 Qiagen 生产 ) 从所获乳清样品中获得总 RNA。
     将 100ng 的量的所获 RNA 样品以常规方式用于微阵列 ( 由 Agilent Technologies 生产 ) 实验。通过使用 GeneSpring GX11.0( 由 Agilent Technologies 生产 ) 分析微阵列 实验结果。
     结 果， 证 实 除 了 在 实 施 例 3 中 证 实 的 155 种 微 小 RNA 外， 还表达四种微小 RNA(miR-193*、 miR-409-3p、 miR-664、 miR-877)。
     实施例 5 ： 牛初乳中表达的微小 RNA 的检测 准备产后 1 至 3 天的荷斯坦牛 (Holstein cow) 的五个乳样品作为初乳样品。另 外， 准备产后 8 天至 8 个月的荷斯坦牛的五个乳样品作为正常乳样品。
     各乳样品 ( 初乳和正常乳 ) 在 1,200×g 和 4℃下离心 10 分钟两次来移除脂质层 和细胞碎片。
     随后， 在 21,500×g 和 4℃下离心上清液 40 分钟， 并进一步在相同条件下离心 1 小 时来移除酪蛋白组分， 从而获得乳清。
     通过使用 miRNeasy 迷你试剂盒 ( 由 Qiagen 生产 ) 从所获乳清样品中获得总 RNA。
     将 20ng 的量的所获 RNA 样品以常规方式用于微阵列 ( 由 Agilent Technologies 生产 ) 实验。通过使用 GeneSpringGX11.0( 由 Agilent Technologies 生产 ) 分析微阵列 实验结果。
     结果， 在初乳样品和正常乳样品中证实总计表达 102 种 miRNA。特别地， 在该 102 种 miRNA 中， 证实 49 种 miRNA 仅在初乳中表达。
     证实仅在初乳中表达的 49 种微小 RNA 如下所述。
     证实仅在初乳中表达的微小 RNA， 49 种 ：
     let-7d、 let-7i、 miR-15a、 miR-15b、 miR-16b、 miR-17-3p、 miR-19b、 miR-21、 miR-23b-3p、 miR-24-3p、 miR-26b、 miR-27b、 miR-30a-5p、 miR-30c、 miR-30f、 miR-34a、 miR-99a、 miR-106、 miR-106b、 miR-107、 miR-125b、 miR-126、 miR-129-3p、 miR-130a、 miR-130b、 miR-140、 miR-155、 miR-181b、 miR-184、 miR-193a-3p、 miR-193a-5p、 miR-196a、 miR-210、 miR-222、 miR-223、 miR-338、 miR-361、 miR-362-5p、 miR-370、 miR-429、 miR-452、 miR-486、 miR-500、 miR-532、 miR-584、 miR-708、 miR-877、 miR-1300b、 miR-1307
     产业上的可利用性
     根据本发明， 可筛选产生具有免疫调节作用的乳的食物或包含于其中的物质。本 发明还提供生产具有免疫调节作用的乳制品的方法。 本发明的口服摄取用组合物具有免疫 增强作用， 并特别适用于婴儿。
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