《物理包埋活性物质的组织工程支架材料及其制备方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《物理包埋活性物质的组织工程支架材料及其制备方法.pdf（10页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 CN 102552976 A (43)申请公布日 2012.07.11 CN 102552976 A *CN102552976A* (21)申请号 201210038292.9 (22)申请日 2012.02.20 A61L 27/26(2006.01) A61L 27/24(2006.01) A61L 27/22(2006.01) A61L 27/20(2006.01) A61L 27/36(2006.01) A61L 27/18(2006.01) A61L 27/54(2006.01) (71)申请人 汪泱 地址 330006 江西省南昌市东湖区民德路 1 号 3 幢 。
2、4 单元 602 室 (72)发明人 汪泱 聂华荣 邓志锋 易应萍 郭菲 (74)专利代理机构 上海科盛知识产权代理有限 公司 31225 代理人 杨元焱 (54) 发明名称 物理包埋活性物质的组织工程支架材料及其 制备方法 (57) 摘要 物理包埋活性物质的组织工程支架材料及其 制备方法。一种物理包埋活性物质的组织工程支 架材料， 由可生物降解的高分子物质和活性物质 制备而成， 以高分子物质为 100 重量份计， 活性物 质为 0-20 重量份但不为零 ； 100 重量份高分子物 质由 50-100 重量份的合成高分子物质和 0-50 重 量份的天然高分子物质组成 ； 高分子物质和活性 物质。
3、通过静电纺丝形成高分子纳米纤维膜或复合 高分子纳米纤维膜， 活性物质均匀键合在纤维膜 表面。本发明的物理包埋活性物质的组织工程 支架材料， 具有良好的生物相容性、 足够的力学强 度、 可生物降解、 适合干细胞增殖及定向分化、 具 有促进细胞迁移粘附及捕获干细胞从而诱导骨、 软骨、 神经及皮肤等组织再生功能。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 6 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 6 页 附图 1 页 1/2 页 2 1. 一种物理包埋活性物质的组织工程支架材料， 其特征在于 ： 由可生物降解的高分子 物质。
4、和活性物质制备而成， 以高分子物质为 100 重量份计， 活性物质为 0-20 重量份但不为 零 ； 所述 100 重量份高分子物质由 50-100 重量份的合成高分子物质和 0-50 重量份的天然 高分子物质组成 ； 所述可生物降解的高分子物质和活性物质通过静电纺丝形成高分子纳米纤维膜或复 合高分子纳米纤维膜， 所述的活性物质均匀分布包埋在纤维膜内。 2. 如权利要求 1 所述的物理包埋活性物质的组织工程支架材料， 其特征在于 ： 所述的 合成高分子物质的分子量为520万， 选自乳酸-羟基乙酸的共聚物PLGA、 聚乳酸、 聚己内 酯或聚乙交酯中的一种或几种的混合物 ； 所述的天然高分子物质的。
5、分子量为5100万， 选自透明质酸、 丝蛋白、 硫酸软骨素、 肝 素、 胶原蛋白、 明胶、 壳聚糖、 核酸、 血清纤维结合蛋白或多肽中的一种或几种的混合物 ； 所述的活性物质选自表皮生长因子 EGF、 成纤维细胞生长因子 bFGF、 内皮细胞生长因 子 VEGF、 转化生长因子 TGF-、 胰岛素样生长因子 IGF、 CD31 抗体、 CD24 抗体、 层粘连蛋白、 趋化因子SDF-1、 神经细胞生长因子NGF、 骨形成蛋白BMP-2、 成骨生长肽OPG、 血小板衍生生 长因子 PDGF、 含多种生长因子的富血小板血浆中的一种或几种的混合物。 3. 如权利要求 1 所述的物理包埋活性物质的组织。
6、工程支架材料的制备方法， 其特征在 于， 包括以下步骤 ： a、 高分子纺丝液的配制 ： 将合成高分子物质溶解在溶剂中， 然后加入活性物质， 得到高 分子纺丝液 ； b、 支架材料的制备 ： 选用多喷头或单喷头纺丝装置， 将步骤 a 所得高分子纺丝液装入 静电纺丝设备的储液装置中进行静电纺丝， 得到可作为物理包埋活性物质的组织工程支架 材料的高分子纳米纤维膜材料， 纤维直径为 50nm 5000nm。 4. 如权利要求 1 所述的物理包埋活性物质的组织工程支架材料的制备方法， 其特征在 于， 包括以下步骤 ： a、 高分子纺丝液的配制 ： 将合成高分子物质和天然高分子物质混合溶解在溶剂中， 然。
7、 后加入活性物质， 得到高分子纺丝液 ； b、 支架材料的制备 ： 选用多喷头或单喷头纺丝装置， 将步骤 a 所得高分子纺丝液装入 静电纺丝设备的储液装置中进行静电纺丝， 得到高分子纳米纤维膜， 纤维直径为 50nm 5000nm ； c、 将步骤 b 所获得的高分子纳米纤维膜材料浸泡到交联剂溶液中， 对其中的天然高分 子物质组分进行交联， 于室温反应612小时后， 用大量的去离子水浸泡冲洗， 得到可作为 物理包埋活性物质的组织工程支架材料的高分子纳米纤维膜材料。 5. 如权利要求 1 所述的物理包埋活性物质的组织工程支架材料的制备方法， 其特征在 于， 包括以下步骤 ： a、 高分子纺丝液的。
8、配制 ： 将合成高分子物质溶解在第一溶剂中， 配制成第一溶液 ； 将 活性物质和天然高分子物质溶解在第二溶剂中， 配制成第二溶液 ； b、 支架材料的制备 ： 选用多喷头纺丝装置或核壳电纺装置， 将步骤 a 所得第一溶液和 第二溶液分别装入不同输液通路中进行静电纺丝， 得到复合高分子纳米纤维膜， 其中合成 高分子纤维的直径为 100-1000nm， 天然高分子纤维的直径为 50-500nm， 纤维膜的厚度为 权 利 要 求 书 CN 102552976 A 2 2/2 页 3 0.1-0.5mm ； c、 将步骤 b 所获得的复合高分子纳米纤维膜浸泡到交联剂溶液中， 对其中的天然高分 子物质组。
9、分进行交联， 于室温反应612小时后， 用大量的去离子水浸泡冲洗， 得到可作为 物理包埋活性物质的组织工程支架材料的复合高分子纳米纤维膜材料。 6. 如权利要求 3 或 4 所述的物理包埋活性物质的组织工程支架材料， 其特征在于 ： 所 述的溶剂选自水、 氟代试剂、 氯仿、 DMF、 THF 中的一种或几种的混合物。 7.如权利要求3或4或5所述的物理包埋活性物质的组织工程支架材料， 其特征在于 ： 所述的静电纺丝的工艺条件为 ： 溶液的供料速率为 5 50ul/min， 喷丝头与接地的收集器 之间的距离为 8 20cm ； 环境温度为 20 50 ； 静电压为 10 30kV。 8. 如权利。
10、要求 4 或 5 所述的物理包埋活性物质的组织工程支架材料， 其特征在于 ： 所 述的交联剂溶液是由碳二亚胺与丙酮和水的混合溶剂新配制的溶液， 温度为 4， 其中碳二 亚胺的浓度为 50mM 200mM， 丙酮和水的混合溶剂中， 丙酮与水的重量比为 80 20。 9. 如权利要求 5 所述的物理包埋活性物质的组织工程支架材料， 其特征在于 ： 所述的 第一溶剂选自氯仿、 DMF、 THF 中的一种或几种的混合物 ； 所述的第二溶剂选自水、 或水与乙 醇的混合物、 或水与甲醇的混合物。 权 利 要 求 书 CN 102552976 A 3 1/6 页 4 物理包埋活性物质的组织工程支架材料及其制。
11、备方法 技术领域 0001 本发明涉及生物材料， 特别涉及具有捕获干细胞并诱导干细胞增殖及定向分化功 能、 对组织具有诱导再生作用的生物支架材料及其制备方法和医学用途。 背景技术 0002 组织工程最主要的思路是设计制备出三维仿生组织， 构建具有类似天然细胞外基 质结构和功能的生物材料支架， 为细胞在体外的生长、 发育和细胞间通讯提供理想的微环 境。 0003 静电纺丝技术能够连续制备纳米级或亚微米级纳米纤维， 其构建的支架具有较高 的孔隙率、 较好的孔道连通以及高比表面积， 是目前国内外研究的热点。通过调节溶液浓 度、 纺丝设备参数可以很好地控制支架材料的结构、 化学和几何形貌、 纤维取向、。
12、 拓扑形态 及表面图案等， 从而可调节细胞的迁移、 粘附、 增殖与分化等行为。 如研究表明， 通过静电纺 丝制备的聚己内脂 (PCL) 纳米纤维支架能够支持体外培养的干细胞分化成软骨细胞， 维持 细胞表型并促进细胞增殖。 Yang通过选择合适工艺形成由纳米、 微米级纤维并以有序、 无序 排列形成的四种支架， 首次培养神经干细胞 (NSC)， 探索其在神经修复中的应用。激光扫描 共聚焦显微镜观察发现， 神经细胞和轴突沿纤维取向伸展和生长， 与微米级纤维支架相比， 细胞在 PLLA 纳米级纤维上的分化率更高， 在平行纤维上有助于轴突生长， 表明静电纺纳米 纤维支架在神经修复中具有重要的应用价值。 。
13、Xu等也发现培养在定向排列的P(LLA-CL)纳 米纤维上的血管平滑肌细胞沿纳米纤维方向定向生长， 并呈现梭样收缩表型。 Basle等的研 究表明， 体外培养的成骨细胞能沿着胶原纤维的排列方向进行迁移。 Han等发现细胞外基质 的拓扑形态会在细胞分化中占据重要的角色， 通过电纺丝技术调整支架结构， 初步现实了 对细胞生长的控制。 此外， 近年来不断有文献报道， 细胞能够感应材料表面图案结构的细微 变化并对此作出应答。如 Zong 等研究了取向静电纺丝支架的结构和功能对心肌细胞生长 的影响， 发现这种由纳米纤维构成的非织造基体能促进心肌细胞进行各向同性或各向异性 的生长， 心肌细胞在一定程度上能。
14、够进入到纤维， 研究结果表明， 工程构建的心脏组织的结 构和功能都可以通过支架的化学和几何形貌 ( 纳米和微米表面结构 ) 得到调整。Biggs 认 为细胞在基质表面粘附能力下降与表面拓扑结构影响相关基因的表达有关， 而某些信号蛋 白的过表达也会影响细胞与基质表面纳米沟槽的结合和粘附。 微纳米图案化能够影响细胞 的生长行为， 其对人间充质干细胞的刺激的结果与使用化学刺激的作用是相似的， 不同种 类的细胞对相同微纳米图案做出的反应也可能不同。在某些尺寸范围内， 支架材料的表面 图案化能够抑制或诱导细胞行为。 0004 尽管经过二十多年的努力， 组织工程已完成了大量基础研究工作。目前国际上已 有组。
15、织工程皮肤、 组织工程软骨产品面世， 并得到美国 FDA 批准进入市场。在我国， 西安组 织工程技术研究中心成功开发了我国第一个组织工程产品 - 组织工程皮肤。然而， 组织工 程因为涉及到 8 周以上的自体细胞分离培养、 组织体外构建与培养， 因此， 传统的组织工程 研究手段不具备普适性， 对产业化和临床应用存在制约性。 另外， 长时间的细胞培养和体外 说 明 书 CN 102552976 A 4 2/6 页 5 组织构建， 可能导致细胞表现型、 基因以及功能的变化， 并且细胞被细菌污染的几率大大增 加， 这些问题对其产业化和临床应用也极为不利。 因此， 组织工程的研究需要跳出原来的思 维模式。
16、， 寻求一种生产更为简单、 操作性更强， 适合临床应用的研究方法。 0005 近年， 组织诱导性生物材料的概念逐渐在生物材料科学领域形成。其概念是基于 对材料的微观微孔结构设计、 化学修饰和复合生物活性物质， 赋予材料诱导组织再生的活 性， 使组织再生和修复在体内完成。将这种支架材料植入体内后， 利用体内的组织环境， 通 过干细胞迁移、 黏附、 增殖和细胞外基质的分泌， 迅速完成组织的修复和再生。 0006 本发明从干细胞增殖及定向分化的微环境出发， 根据特定组织的结构特点及生物 环境要求， 以生物可降解高分子材料为基础材料， 采用静电纺丝技术， 通过混纺或后期物理 吸附的方法， 引入与干细胞。
17、迁移、 粘附、 增殖分化相关的天然生物活性材料及活性因子等， 设计构建出具有良好生物相容性、 足够的力学强度、 可生物降解、 适合干细胞增殖及定向分 化、 具有促进细胞迁移粘附及捕获干细胞从而诱导骨、 软骨、 神经及皮肤等组织再生功能的 物理包埋活性物质的组织工程支架材料。 发明内容 0007 本发明的目的之一是提供一种负载有活性物质、 具有良好生物相容性、 足够的力 学强度、 可生物降解、 具有促进细胞迁移粘附及捕获干细胞从而诱导组织再生等功能的物 理包埋活性物质的组织工程支架材料。 0008 本发明的目的之二是提供上述物理包埋活性物质的组织工程支架材料的制备方 法。 0009 为实现上述目。
18、的， 本发明采用以下技术方案 ： 一种物理包埋活性物质的组织工程 支架材料， 由可生物降解的高分子物质和活性物质制备而成， 以高分子物质为 100 重量份 计， 活性物质为0-20重量份但不为零 ； 所述100重量份高分子物质由50-100重量份的合成 高分子物质和 0-50 重量份的天然高分子物质组成 ； 0010 所述可生物降解的高分子物质和活性物质通过静电纺丝形成高分子纳米纤维膜 或复合高分子纳米纤维膜， 所述的活性物质均匀分布包埋在纤维膜内。 0011 所述的合成高分子物质的分子量为 5 20 万， 选自乳酸 - 羟基乙酸的共聚物 PLGA、 聚乳酸、 聚己内酯或聚乙交酯中的一种或几种。
19、的混合物 ； 0012 所述的天然高分子物质的分子量为 5 100 万， 选自透明质酸、 丝蛋白、 硫酸软骨 素、 肝素、 胶原蛋白、 明胶、 壳聚糖、 核酸、 血清纤维结合蛋白或多肽中的一种或几种的混合 物 ； 0013 所述的活性物质选自表皮生长因子 EGF、 成纤维细胞生长因子 bFGF、 内皮细胞生 长因子 VEGF、 转化生长因子 TGF-、 胰岛素样生长因子 IGF、 CD31 抗体、 CD24 抗体、 层粘连 蛋白、 趋化因子 SDF-1、 神经细胞生长因子 NGF、 骨形成蛋白 BMP-2、 成骨生长肽 OPG、 血小板 衍生生长因子 PDGF、 含多种生长因子的富血小板血浆中。
20、的一种或几种的混合物。 0014 上述物理包埋活性物质的组织工程支架材料的一种制备方法， 包括以下步骤 ： 0015 a、 高分子纺丝液的配制 ： 将合成高分子物质溶解在溶剂中， 然后加入活性物质， 得 到高分子纺丝液 ； 0016 b、 支架材料的制备 ： 选用多喷头或单喷头纺丝装置， 将步骤 a 所得高分子纺丝液 说 明 书 CN 102552976 A 5 3/6 页 6 装入静电纺丝设备的储液装置中进行静电纺丝， 得到可作为物理包埋活性物质的组织工程 支架材料的高分子纳米纤维膜材料， 纤维直径为 50nm 5000nm。 0017 上述物理包埋活性物质的组织工程支架材料的一种制备方法，。
21、 包括以下步骤 ： 0018 a、 高分子纺丝液的配制 ： 将合成高分子物质和天然高分子物质混合溶解在溶剂 中， 然后加入活性物质， 得到高分子纺丝液 ； 0019 b、 支架材料的制备 ： 选用多喷头或单喷头纺丝装置， 将步骤 a 所得高分子纺丝 液装入静电纺丝设备的储液装置中进行静电纺丝， 得到高分子纳米纤维膜， 纤维直径为 50nm 5000nm ； 0020 c、 将步骤 b 所获得的高分子纳米纤维膜材料浸泡到交联剂溶液中， 对其中的天然 高分子物质组分进行交联， 于室温反应612小时后， 用大量的去离子水浸泡冲洗， 得到可 作为物理包埋活性物质的组织工程支架材料的高分子纳米纤维膜材料。
22、。 0021 上述物理包埋活性物质的组织工程支架材料的一种制备方法， 包括以下步骤 ： 0022 a、 高分子纺丝液的配制 ： 将合成高分子物质溶解在第一溶剂中， 配制成第一溶液 ； 将活性物质和天然高分子物质溶解在第二溶剂中， 配制成第二溶液 ； 0023 b、 支架材料的制备 ： 选用多喷头纺丝装置或核壳电纺装置， 将步骤 a 所得第一溶 液和第二溶液分别装入不同输液通路中进行静电纺丝， 得到复合高分子纳米纤维膜， 其中 合成高分子纤维的直径为 100-1000nm， 天然高分子纤维的直径为 50-500nm， 纤维膜的厚度 为 0.1-0.5mm ； 0024 c、 将步骤 b 所获得的。
23、复合高分子纳米纤维膜浸泡到交联剂溶液中， 对其中的天然 高分子物质组分进行交联， 于室温反应612小时后， 用大量的去离子水浸泡冲洗， 得到可 作为物理包埋活性物质的组织工程支架材料的复合高分子纳米纤维膜材料。 0025 所述的溶剂选自水、 氟代试剂、 氯仿、 DMF、 THF 中的一种或几种的混合物。 0026 所述的静电纺丝的工艺条件为 ： 溶液的供料速率为 5 50ul/min， 喷丝头与接地 的收集器之间的距离为 8 20cm ； 环境温度为 20 50 ； 静电压为 10 30kV。 0027 所述的交联剂溶液是由碳二亚胺与丙酮和水的混合溶剂新配制的溶液， 温度为 4， 其中碳二亚胺。
24、的浓度为 50mM 200mM， 丙酮和水的混合溶剂中， 丙酮与水的重量比为 80 20。 0028 所述的第一溶剂选自氯仿、 DMF、 THF 中的一种或几种的混合物 ； 所述的第二溶剂 选自水、 或水与乙醇的混合物、 或水与甲醇的混合物。 0029 本发明突破了组织工程以往的研究理念， 突破无生命的材料不可能诱导组织形成 的传统观点， 从干细胞增殖及定向分化的微环境出发， 根据特定组织的结构特点及生物环 境要求， 以生物可降解高分子材料为基础材料， 通过纳米电纺技术及材料表面改性等技术， 对材料的微观微孔结构设计和化学修饰等技术进行深入研究， 引入与干细胞迁移、 粘附、 增 殖分化相关的天。
25、然生物活性材料及活性因子等， 设计构建出了具有良好生物相容性、 足够 的力学强度、 可生物降解、 适合干细胞增殖及定向分化、 具有促进细胞迁移粘附及捕获干细 胞从而诱导骨、 软骨、 神经及皮肤等组织再生功能的仿生三维立体组织工程支架。 实现仅通 过支架材料自身即可实现受损组织的再生与重建， 为再生医学产业的发展提供新思路和新 途径。 说 明 书 CN 102552976 A 6 4/6 页 7 附图说明 0030 图 1 是本发明实施例 1 新生组织的生长状态图。 具体实施方式 0031 下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。 0032 实施例 1 0033 高分子纺丝液的配制 ： 将。
26、聚己内酯 (PCL， 分子量 10 万 )、 明胶 (GE， 分子量 10 万 ) 与活性物质(成纤维细胞生长因子bFGF、 内皮细胞生长因子VEGF或一定比例的富血小板血 浆 PRP) 溶解在三氟代乙醇中， 配制成总浓度为 12w/v的混合溶液作为高分子纺丝液， 其 中 PCL、 GE、 活性物质的质量比为 70 25 5。 0034 支架材料的制备 ： 选用单喷头纺丝装置， 将所得高分子纺丝液装入静电纺丝设备 的储液装置中， 调整溶液的供料速率为 20ul/min， 喷丝头与接地的收集器之间的距离为 12cm ； 环境温度为 25 ； 静电压为 20kV， 在收集器上得到高分子纳米纤维， 。
27、纤维平均直径为 400nm。 0035 将所获得的高分子纳米纤维浸泡到新配制的、 在 4冰箱中储存 2h 以上的、 含 50mM 200mM 的碳二亚胺的 80/20 的丙酮和水的混合溶液中， 于 4冰箱中交联反应 12h 后， 用大量的去离子水浸泡冲洗， 得到本发明的一种可作为物理包埋活性物质的组织工程 支架材料的高分子纳米纤维膜材料。 0036 复制新西兰大白兔全层皮肤缺损动物模型， 将制备的高分子纳米纤维膜材料消毒 灭菌后移植于皮肤缺损处， 分别于不同时间观察缺损皮肤的修复状况。 结果随着时间增加， 白色纤维移植物逐渐降解， 创面及移植物新鲜湿润， 4 周左右移植物完全形成新生皮肤 ； 。
28、冰 冻切片 HE 染色结果显示形成的新生皮肤结构和正常皮肤基本相同， 形成了正常的表皮层、 皮下组织层及真皮层， 并可见有皮肤附属器毛发、 皮脂腺、 汗腺等形成。( 参见图 1)。 0037 实施例 2 0038 高分子纺丝液的配制 ： 将聚己内酯 (PCL， 分子量 10 万 ) 溶解在 80 20 的氯仿与 甲醇的混合溶剂中， 配制成 8w/v的 PCL 溶液 ； 将明胶 (GE， 分子量 30 万 ) 与活性物质 ( 骨 形成蛋白 BMP-2、 转化生长因子 TGF- 或一定比例的富血小板血浆 PRP) 溶解在水中， 配制 成总浓度为 15w/v的混合溶液， 其中 GE 与活性物质的质量。
29、比为 90 10。 0039 支架材料的制备 ： 选用双喷头纺丝装置， 将上述配制的 PCL 溶液与含有活性物质 的 GE 混合溶液分别装入两个不同的输液通路中， 调整溶液的供料速率为 15ul/min， 喷丝头 与接地的收集器之间的距离为12cm ； 环境温度为25； PCL电纺静电压为18kV， GE电纺静电 压为 22kV， 在收集器上得到含活性物质的厚度为 0.2-0.4mm 的纤维膜材料， 且 PCL GE 活性物质的质量比为 35 48 7。其中 PCL 平均纤维直径在 150-600nm， GE 平均纤维直 径约 100-400nm。 0040 将所获得的纤维膜浸泡到新配置的、 。
30、在 4冰箱中储存 2h 以上的、 含 50mM 200mM 的碳二亚胺的 80/20 的丙酮和水的混合溶液中， 于 4冰箱中交联反应 12h 后， 用大 量的去离子水浸泡冲洗， 得到可作为物理包埋活性物质的组织工程支架材料的复合高分子 纳米纤维膜材料。 0041 实施例 3 说 明 书 CN 102552976 A 7 5/6 页 8 0042 高分子纺丝液的配制 ： 将聚己内酯 (PCL， 分子量 10 万 ) 与活性物质 ( 内皮细胞生 长因子 VEGF、 富血小板血浆 PRP) 溶解在 80 20 的氯仿与甲醇的混合溶剂中， 配制成 8w/ v的纺丝液， 其中 PCL 和活性物质的质量比。
31、为 85 15。 0043 支架材料的制备 ： 选用单喷头纺丝装置， 将所得高分子纺丝液装入静电纺丝设备 的储液装置中， 调整溶液的供料速率为 20ul/min， 喷丝头与接地的收集器之间的距离为 12cm ； 环境温度为 25 ； 静电压为 20kV， 在收集器上得到 0.4mm 厚的高分子纳米纤维， 纤维 平均直径为 500nm。 0044 实施例 4 0045 (1) 高分子纺丝液的配置 ： 将 PLGA( 分子量 10 万 ) 溶解在 80/20 的 DMF 与丙酮的 混合溶剂中， 获得浓度为 10w/v的 PLGA 溶液 ； 将透明质酸 ( 分子量为 200 万 ) 与活性分 子 (。
32、 内皮细胞生长因子 VEGF、 CD31 抗体 ) 溶解在 3/2 的 DMF 与水的混合溶剂中， 配制得浓 度为 3w/v的混合溶液， 其中透明质酸与活性分子质量比为 50/50。 0046 (2) 纳米纤维膜材料的制备 ： 选用多喷头纺丝装置， 将 PLGA 溶液与透明质酸的混 合溶液分别填装到不同的输液通路中进行静电纺丝， 电纺工艺参数为 ： 静电压为 25kV ； 供 料速率为 20ul/min， 接受距离为 8cm ； 环境温度为 50， 在收集器上得到 0.3mm 厚的高分子 纤维膜材料， 且 PLGA 透明质酸活性物质的质量比为 77 11.5 11.5， PLGA 纤维直径 为。
33、 200-1000nm， 透明质酸纤维直径为 50-200nm。 0047 (3) 将步骤 (2) 所获得的纤维膜浸泡到含 200mM 碳二亚胺的 80/20 的乙醇和水的 混合溶液中， 对透明质酸组分进行交联， 于 4冰箱中交联反应 12h 后， 用大量的去离子水 浸泡冲洗， 得到可作为物理包埋活性物质的组织工程支架材料的复合高分子纳米纤维膜材 料。 0048 实施例 5 0049 (1) 高分子纺丝液的配置 ： 将 PLA( 分子量 12 万 ) 溶解在 70/30 的 DMF 与氯仿的 混合溶剂中， 获得浓度为 10w/v的 PLA 溶液 ； 将胶原蛋白 ( 分子量为 100 万 ) 与。
34、活性分子 ( 内皮细胞生长因子 VEGF、 CD31 抗体 ) 溶解在 9/1 的水与乙醇的混合溶剂中， 配制得浓度 为 3w/v的混合溶液， 其中透明质酸与活性分子质量比为 80/20。 0050 (2) 纳米纤维膜材料的制备 ： 选用多喷头纺丝装置， 将 PLA 溶液与胶原蛋白的混 合溶液分别填装到不同的输液通路中进行静电纺丝， 电纺工艺参数为 ： 静电压为 22kV ； 供 料速率为 20ul/min， 接受距离为 8cm ； 环境温度为 50， 在收集器上得到 0.2mm 厚的高分 子纤维膜材料， 且 PLA 胶原蛋白活性物质的质量比为 77 18 5， PLA 纤维直径为 200-8。
35、00nm， 胶原蛋白纤维直径为 100-400nm。 0051 (3) 将步骤 (2) 所获得的纤维膜浸泡到含 100mM 碳二亚胺的 80/20 的乙醇和水的 混合溶液中， 对胶原蛋白组分进行交联， 于 4冰箱中交联反应 12h 后， 用大量的去离子水 浸泡冲洗， 得到可作为物理包埋活性物质的组织工程支架材料的复合高分子纳米纤维膜材 料。 0052 (4) 复制兔全层皮肤缺损模型 ( 在制备皮肤缺损模型前抽取骨髓提取培养骨髓间 充质干细胞， 并进行GFP转基因标记)， 将步骤(3)制备的纤维膜覆盖于兔背皮肤伤口处， 同 时静脉注射100万个经GFP标记的自体骨髓间充质干细胞， 于不同时间分批。
36、取出移植物， 荧 光显微镜下观察干细胞迁移粘附情况。 结果发现， 移植的纤维膜上有绿色荧光细胞， 说明所 说 明 书 CN 102552976 A 8 6/6 页 9 构建材料可吸引干细胞迁移粘附， 即具有募集干细胞的作用。 0053 实施例 6 0054 (1) 高分子纺丝液的配置 ： 将 PLGA( 分子量 10 万 ) 溶解在 80/20 的 DMF 与丙酮的 混合溶剂中， 获得浓度为 12w/v的 PLGA 溶液 ； 将壳聚糖 ( 分子量为 20 万 ) 与活性分子 ( 层粘连蛋白、 bFGF、 EGF、 CD24 抗体 ) 溶解在 80/20 的水与乙酸的混合溶剂中， 配制得浓度 为。
37、 5w/v的混合溶液， 其中壳聚糖与活性分子质量比为 50 50。 0055 (2) 纳米纤维膜材料的制备 ： 选用多喷头纺丝装置， 将 PLGA 溶液与壳聚糖的混 合溶液分别填装到不同的输液通路中进行静电纺丝， 电纺工艺参数为 ： 静电压为 22kV ； 供 料速率为 20ul/min， 接受距离为 8cm ； 环境温度为 50， 在收集器上得到 0.15mm 厚的高分 子纤维膜材料， 且 PLGA 壳聚糖活性物质的质量比为 70 15 15， PLGA 纤维直径为 200-1000nm， 壳聚糖纤维直径在 50-100nm。 0056 (3)将步骤(2)所获得的纤维膜至于戊二醛蒸汽中对纤维。
38、膜进行交联， 在反应12h 后， 至于真空干燥室进行干燥， 得到可作为物理包埋活性物质的组织工程支架材料的复合 高分子纳米纤维膜材料。 0057 (4) 将步骤 (3) 制备的纤维膜置于含神经干细胞 (NSC) 的生物反应器中进行立体 动态培养， 不同时间取出纤维膜观察干细胞粘附增殖情况。 结果显示随着培养时间的延长， 纤维膜上的 NSC 逐渐增多， 且细胞伸出触角轴突呈神经细胞形态并表达神经元标志 NSE 和 神经胶质细胞标志 GFAP， 表明所构建的纤维膜可粘附干细胞并促进其增殖分化。 0058 实施例 7 0059 (1) 高分子纺丝液的配置 ： 将 PLGA( 分子量 10 万 ) 溶。
39、解在 80/20 的 DMF 与丙酮的 混合溶剂中， 获得浓度为 10w/v的 PLGA 溶液 ； 将透明质酸 ( 分子量为 200 万 )、 明胶 ( 胶 冻强度 ： Approx.220Bloom) 与活性分子 (CD24 抗体、 趋化因子 SDF-1、 表皮生长因子 EGF、 成 纤维细胞生长因子 bFGF) 溶解在 90/10 的水与乙醇的混合溶剂中， 配制得浓度为 5w/v的 混合溶液， 其中透明质酸、 明胶与活性分子质量比为 25 25 50。 0060 (2) 纳米纤维膜材料的制备 ： 选用多喷头纺丝装置， 将 PLGA 溶液与透明质酸的混 合溶液分别填装到不同的输液通路中进行静。
40、电纺丝， 电纺工艺参数为 ： 静电压为 22kV ； 供 料速率为 20ul/min， 接受距离为 8cm 环境温度为 50， 在收集器上得到厚为 0.12mm 厚的高 分子纤维膜材料， 且 PLGA 天然高分子活性物质的质量比为 67 16.5 16.5， PLGA 纤 维直径为 200-1000nm， 天然高分子混合纤维直径在 50-300nm。 0061 (3) 将步骤 (2) 所获得的纤维膜浸泡到含 200mM 碳二亚胺的 80/20 的乙醇和水的 混合溶液中， 对透明质酸与明胶组分进行交联， 于 4冰箱中交联反应 12h 后， 用大量的去 离子水浸泡冲洗， 得到可作为物理包埋活性物质的组织工程支架材料的复合高分子纳米纤 维膜材料。 0062 (4) 复制兔全层皮肤缺损模型 ( 在制备皮肤缺损模型前抽取骨髓提取培养骨髓间 充质干细胞， 并进行GFP转基因标记)， 将步骤(3)制备的纤维膜覆盖于兔背皮肤伤口处， 同 时静脉注射100万个经GFP标记的自体骨髓间充质干细胞， 于不同时间分批取出移植物， 荧 光显微镜下观察干细胞迁移粘附情况。 结果发现， 移植的纤维膜上有绿色荧光细胞， 说明所 构建材料可吸引干细胞迁移粘附， 即具有募集干细胞的作用。 说 明 书 CN 102552976 A 9 1/1 页 10 图 1 说 明 书 附 图 CN 102552976 A 10 。