技术领域
本发明涉及生物医学材料技术领域，具体涉及一种胶原蛋白海绵及其制备方法。
背景技术
在伤口急救以及外科手术中，创面出血与渗血是经常遇到的难题，血液的大量流失会危及生命。同时，出血或渗血也会增加伤口感染的几率，从而降低手术的成功率。所以，良好的止血技术成为手术成功的关键，是手术技术的核心之一。可降解材料作为止血材料在临床上被广泛应用。
胶原蛋白有促进伤口愈合、肉芽生长以及止血等作用。作为一种天然的止血剂，其不仅和细胞之间存在很强的亲和力，而且和在伤口愈合过程中起到关键作用的生长因子间也存在着特殊的亲和力。在血液凝固后，胶原蛋白还可以通过刺激组织的再生和修复来防止再次出血的发生。随之，可降解的胶原蛋白止血海绵产品逐渐走进人们的视野。
市场上的产品多是以化学交联剂交联制备而成，化学交联剂具有毒性、致癌性和刺激性。此外，其为可容易扩散到交联基质外的小分子，可引起局部或全身损伤。谷氨酰胺转氨酶是一种催化酰基转移反应的酶，能催化蛋白质分子内或分子间的交联、蛋白质和氨基酸之间的连接以及蛋白质分子内谷氨酰氨基的水解，从而改善蛋白质的结构和功能，被誉为“21世纪超级粘合剂”。在食品、医药、纺织、化妆品等领域展现出广泛的前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种胶原蛋白海绵及其制备方法，改善目前胶原蛋白海绵中化学交联剂残留所导致的毒性、致癌性以及刺激性的缺陷。
本发明所采用的技术方案为：
胶原蛋白海绵的制备方法，其特征在于：
以胶原蛋白为主要原料，采用酶低温交联以及真空冷冻干燥相结合的方式制备而成。
所述的胶原蛋白海绵的制备方法，其特征在于：
由以下步骤实现：
步骤一：用去离子水配制质量分数为1%-10%的胶原蛋白水溶液；
步骤二：按照2-20U(酶)/g（蛋白）的比例加入谷氨酰胺转氨酶，充分搅拌至溶解；
步骤三：调节pH值至6-7之间；
步骤四：将步骤三得到的混合物迅速转移至模具中；
步骤五：将模具置于4℃交联24h-48h；
步骤六：将模具转移至-20℃预冻2-4h，转移至-80℃预冻3-6h，之后于真空冷冻干燥机中干燥12-48h；
步骤七：包装、辐照灭菌即得成品。
步骤一中，胶原蛋白为动物源性的全长胶原蛋白、胶原多肽、明胶，或通过基因工程技术制得的胶原蛋白。
步骤二中，谷氨酰胺转氨酶为源于哺乳动物组织的酶或源于微生物发酵制成的酶。
步骤三中的pH调节剂为氢氧化钠溶液或盐酸溶液，摩尔浓度为0.1-1mol/L。
如所述的胶原蛋白海绵的制备方法制得的胶原蛋白海绵。
本发明具有以下优点：
本发明制备胶原蛋白海绵，采用酶作为交联剂，改善了产品的降解特性，使其能很好的粘附于伤口，充分地发挥止血功效，保证了产品的安全性和有效性，具体具有以下优势：
(1)本发明提供的胶原蛋白海绵制备工艺简单，且整个制备过程使用的原料、试剂及溶液均无毒无害；
(2)本发明提供的胶原蛋白海绵以胶原蛋白为主要原料，以谷氨酰胺转氨酶为交联剂，不仅改善了胶原蛋白海绵的降解特性，而且无毒无害，大大增加了产品的安全和有效性；
(3)本发明提供的胶原蛋白海绵具有优良的止血效果。
附图说明
图1为胶原蛋白海绵浸提液体外细胞毒性试验结果。
图中，DMEM为细胞培养液，Collagen sponge为胶原蛋白海绵浸提液，纵轴为细胞成活率，横轴为时间。在培养的整个过程中，细胞在纯培养液及胶原蛋白海绵材料的浸提液中表现出了相当的生存活力，表明材料对细胞基本无毒性，可支持细胞的生长增殖。
图2为胶原蛋白海绵与人胚肺成纤维细胞复合培养14天后的扫描电镜图。
图中，细胞维持着很好的细胞形态，在材料表面生长、增殖并分泌了细胞外基质，表明细胞在材料上生长的很好，胶原蛋白海绵具有很好的细胞相容性。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细的说明。
本发明涉及一种胶原蛋白海绵的制备方法，以胶原蛋白为主要原料，采用酶低温交联以及真空冷冻干燥相结合的方式制备而成。酶交联技术的使用，摒弃了化学交联剂的毒性、致癌性及刺激性，保证了产品的应用安全性，提高了产品的生物相容性。同时，改善了该产品的降解特性，使其能很好的粘附于伤口，充分的发挥止血功效，保证了产品的有效性。该方法具体由以下步骤实现：
步骤一：用去离子水配制质量分数为1%-10%的胶原蛋白水溶液；
步骤二：按照2-20U(酶)/g（蛋白）的比例加入谷氨酰胺转氨酶，充分搅拌至溶解；
步骤三：调节pH值至6-7之间；
步骤四：将步骤三得到的混合物迅速转移至模具中；
步骤五：将模具置于4℃交联24h-48h；
步骤六：将模具转移至-20℃预冻2-4h，转移至-80℃预冻3-6h，之后于真空冷冻干燥机中干燥12-48h；
步骤七：包装、辐照灭菌即得成品。
步骤一中，胶原蛋白为动物源性的全长胶原蛋白、胶原多肽、明胶，或通过基因工程技术制得的胶原蛋白。
步骤二中，谷氨酰胺转氨酶为源于哺乳动物组织的酶或源于微生物发酵制成的酶。
步骤三中的pH调节剂为氢氧化钠溶液或盐酸溶液，摩尔浓度为0.1-1mol/L。
实施例1：
步骤一：用去离子水配制质量分数为1%的胶原蛋白水溶液；
步骤二：按照20U(酶)/g（蛋白）的比例加入谷氨酰胺转氨酶，充分搅拌至溶解；
步骤三：调节pH值至6；
步骤四：将步骤三得到的混合物迅速转移至模具中；
步骤五：将模具置于4℃交联48h；
步骤六：将模具转移至-20℃预冻2h，转移至-80℃预冻6h，之后于真空冷冻干燥机中干燥12h；
步骤七：包装、辐照灭菌即得成品。
步骤一中，胶原蛋白为动物源性的全长胶原蛋白。
步骤二中，谷氨酰胺转氨酶为源于哺乳动物组织的酶。
步骤三中的pH调节剂为氢氧化钠溶液或盐酸溶液，摩尔浓度为0.1mol/L。
实施例2：
步骤一：用去离子水配制质量分数为5%的胶原蛋白水溶液；
步骤二：按照10U(酶)/g（蛋白）的比例加入谷氨酰胺转氨酶，充分搅拌至溶解；
步骤三：调节pH值至6.5；
步骤四：将步骤三得到的混合物迅速转移至模具中；
步骤五：将模具置于4℃交联36h；
步骤六：将模具转移至-20℃预冻3h，转移至-80℃预冻4.5h，之后于真空冷冻干燥机中干燥36h；
步骤七：包装、辐照灭菌即得成品。
步骤一中，胶原蛋白为动物源性的胶原多肽。
步骤二中，谷氨酰胺转氨酶为源于哺乳动物组织的酶。
步骤三中的pH调节剂为氢氧化钠溶液或盐酸溶液，摩尔浓度为0.5mol/L。
实施例3：
步骤一：用去离子水配制质量分数为10%的胶原蛋白水溶液；
步骤二：按照2U(酶)/g（蛋白）的比例加入谷氨酰胺转氨酶，充分搅拌至溶解；
步骤三：调节pH值至7；
步骤四：将步骤三得到的混合物迅速转移至模具中；
步骤五：将模具置于4℃交联24h；
步骤六：将模具转移至-20℃预冻4h，转移至-80℃预冻3h，之后于真空冷冻干燥机中干燥48h；
步骤七：包装、辐照灭菌即得成品。
步骤一中，胶原蛋白为动物源性的明胶。
步骤二中，谷氨酰胺转氨酶为源于微生物发酵制成的酶。
步骤三中的pH调节剂为氢氧化钠溶液或盐酸溶液，摩尔浓度为1mol/L。
实施例4：
步骤一：用去离子水配制质量分数为1.8%的胶原蛋白水溶液；
步骤二：按照4U(酶)/g（蛋白）的比例加入谷氨酰胺转氨酶，充分搅拌至溶解；
步骤三：调节pH值至6-7之间；
步骤四：将步骤三得到的混合物迅速转移至模具中；
步骤五：将模具置于4℃交联48h；
步骤六：将模具转移至-20℃预冻2h，转移至-80℃预冻4h，之后于真空冷冻干燥机中干燥48h；
步骤七：包装、辐照灭菌即得成品。
步骤一中，胶原蛋白为通过基因工程技术制得的胶原蛋白。
步骤二中，谷氨酰胺转氨酶为源于微生物发酵制成的酶。
步骤三中的pH调节剂为氢氧化钠溶液或盐酸溶液，摩尔浓度为0.5mol/L。
表1为兔肝脏止血试验中不同材料的止血时间。
表中可以看出，相比已上市的同类产品，本发明涉及的胶原蛋白海绵止血时间较快，止血效果更佳。
从图1中也可以看出，在培养的整个过程中，细胞在纯培养液及胶原蛋白海绵材料的浸提液中表现出了相当的生存活力，表明材料对细胞基本无毒性，可支持细胞的生长增殖。图2也显示，细胞维持着很好的细胞形态，在材料表面生长、增殖并分泌了细胞外基质，表明细胞在材料上生长的很好，胶原蛋白海绵具有很好的细胞相容性。
本发明的内容不限于实施例所列举，本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要求所涵盖。