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用于在出血性紊乱的治疗和预防性处理中进行非静脉内施 用的白蛋白融合凝血因子
    发明领域 本发明涉及包含用于在出血性紊乱的治疗和预防性处理中进行非静脉内施用的 白蛋白融合凝血因子的药物制剂以及通过将凝血因子与白蛋白融合而提高其在非静脉内 施用后的体内回收 (in vivo recovery) 的方法。
     发明背景
     用于人类治疗和预防用途的若干重组治疗性多肽在市面上有售。 患者通常受益于 重组活性成分的特异作用模式， 但目前所有市售的凝血因子均是通过静脉内给药施加的， 这常常导致注射位置的感染并且是患者通常希望避免的一个措施， 尤其是治疗凝血过程有 缺陷的儿童时。
     Balance 等 (WO 01/79271) 描述了众多的不同治疗多肽的融合多肽， 当它们与人 血清白蛋白融合时预计将具有增加的体内功能半寿期和延长的储存期。 文中描述了一长串 潜在的融合配偶体， 但几乎对所有这些多肽都没有用实验数据显示各自的白蛋白融合蛋白 确实保持了生物学活性并且具有改善的特性。在此份名单中作为例子提及的治疗多肽是 因子 IX 和 FVII/FVIIa。此外还描述了 FIX 和 FVII/FVIIa 的融合， 其中在白蛋白和 FIX 或 FVII/FVIIa 之间有肽接头。不过， 没有披露当非静脉内施加相应的凝血因子时白蛋白融合 体可改善治疗性处理。
     因子 VII 和因子 VIIa
     FVII 是分子量 50kDa 的单链糖蛋白， 它作为 406 个氨基酸的无活性酶原由肝细胞 分泌入血流中。FVII 通过 Arg152-Ile153 处单一肽键的蛋白水解转变为它的活性形式因 子 VIIa， 此水解导致形成了两条多肽链， N- 末端轻链 (24kDa) 和 C- 末端重链 (28kDa)， 它 们通过一个二硫桥连接在一起。与其它维生素 K- 依赖性凝血因子相反， 在活化期间没有 活化肽被裂解下来。因子 VII 的活化裂解可在体外完成， 例如通过因子 Xa， 因子 IXa， 因子 VIIa， 因子 XIIa， 因子七激活蛋白酶 (FSAP) 和凝血酶。Mollerup 等 (Biotechnol.Bioeng. (1995)48 ： 501-505) 报告了在重链的 Arg290 和 / 或 Arg315 处也发生某些裂解。
     因子 VII 以 500ng/ml 的浓度存在于血浆中。约 1％或 5ng/ml 的因子 VII 是作为 激化的因子 VIIa 存在。已发现因子 VII 的终末血浆半衰期是大约 4 小时， 而因子 VIIa 的 是大约 2 小时。
     通过施加超生理水平浓度的因子 VIIa， 可绕开对因子 VIIIa 和因子 IXa 的需要而 完成止血。因子 VII 之 cDNA 的克隆 (US 4,784,950) 使得有可能研发活化的因子 VII 作为 药品。1988 年因子 VIIa 首次被成功施用。从那时起， 因子 VIIa 的适应症量稳步增长， 显示 了其成为通用止血剂来阻止出血的潜能 (Erhardtsen， 2002)。不过， 因子 VIIa 约 2 小时的 短终末半衰期和减少的体内回收限制了它的应用。
     人的 FIX
     人的 FIX 是维生素 K- 依赖型多肽族的一个成员， 它是分子量为 57kDa 的单链糖蛋 白， 以 415 个氨基酸的无活性酶原形式由肝细胞分泌至血流中。 它包含位于多肽 N- 末端 Gla
     结构域的 12 个 γ- 羧基 - 谷氨酸残基。这些 Gla 残基需要维生素 K 用于它们的生物合成。 在 Gla 结构域后面有两个表皮生长因子结构域， 一个活化肽和胰蛋白酶型丝氨酸蛋白酶结 构域。FIX 的进一步翻译后修饰包括羟基化 (Asp 64)， N-(Asn157 和 Asn167) 以及 O- 型糖 基化 (Ser53， Ser61， Thr159， Thr169 和 Thr172)、 硫酸化 (Tyr155) 和磷酸化 (Ser158)。
     FIX 通过在 Arg145-Ala146 和 Arg180-Val181 处水解活化肽而转变成它的活性 形式因子 IXa， 所述水解导致形成了两条多肽链， 即 N- 末端轻链 (18kDa) 和 C- 末端重链 (28kDa)， 它们通过一个二硫桥连接在一起。 因子 IX 的活化裂解可在体外通过例如因子 XIa 或因子 VIIa/TF 来完成。因子 IX 以 5-10μg/ml 的浓度存在于人的血浆中。已发现人的因 子 IX 的终末血浆半衰期是约 15 至 18 小时 (White GC et al.1997.Recombinant factor IX.Thromb Haemost.78 ： 261-265 ； Ewenstein BM et al.2002.Pharmacokinetic analysis of plasma-derived and recombinant F IX concentrates in previously treated patients with moderate or severe hemophilia B.Transfusion 42 ： 190-197)。
     B 型血友病是由因子 IX 的无功能或缺失引起的， 其用来自血浆的因子 IX 浓缩物或 重组形式的因子 IX 治疗。由于 B 型血友病患者常常接受至少两周一次 (biweekly) 的预防 性施用因子 IX 以避免自发的出血， 因此人们希望通过延长因子 IX 产品之半寿期来延长两 次施用之间的时间间隔并避免静脉内施用因子 IX。
     因子 VIII(FVIII)
     FVIII 是分子质量约 260kDa 的血浆糖蛋白， 产生于哺乳动物的肝脏中。它是导致 血液凝固的凝血级联反应的关键组分。此级联反应中的一步是因子 IXa(FIXa) 结合 FVIII 一起将因子 X(FX) 转变成活化形式 FXa。FVIII 在此步中作为辅助因子， 与钙离子和磷脂一 起为 FIXa 活性所必需。最常见的血友病紊乱是由功能性 FVIII 缺乏引起的， 称为 A 型血友 病。
     A 型血友病治疗中的一个重要进展是分离到了编码人 FVIII 之完整 2， 351 个氨基 酸序列的 cDNA 克隆 ( 美国专利申请 No.4,757,006) 以及提供了人 FVIII 基因 DNA 序列和 用于其产生的重组方法。
     对测定自克隆 cDNA 的人 FVIII 的推断一级氨基酸序列进行分析显示它是从较大 的前体多肽加工而来的异二聚体。所述异二聚体由约 80kDa 的 C- 末端轻链以金属离子依 赖型缔合结合约 210kDa 的 N- 末端重链片段组成。( 参阅综述 Kaufman， Transfusion Med. Revs.6 ： 235(1992))。通过由凝血酶对蛋白链进行蛋白水解性裂解使此异二聚体发生生理 激活。凝血酶将重链裂解成 90kDa 的蛋白质， 然后裂解成 54kDa 和 44kDa 片段。凝血酶还 将 80kDa 的轻链裂解成 72kDa 的蛋白质。正是后一蛋白质和两个重链片段 ( 上述 54kDa 和 44kDa) 通过钙离子结合在一起， 组成了活性的 FVIII。当 72kDa 和 54kDa 蛋白质进一步被 凝血酶、 活化蛋白 C 或 FXa 裂解时会发生失活。在血浆中， 此 FVIII 复合物通过与 50 倍过 量的 VWF 蛋白质 (″ VWF″ ) 联合而得以稳定， 后者看起来抑制了如上所述的 FVIII 的蛋白 水解性破坏。
     FVIII 的氨基酸序列被组织入三个结构性结构域 ： 330 个氨基酸的三重 A 结构域、 980 个氨基酸的单一 B 结构域和 150 个氨基酸的双重 C 结构域。B 结构域与其它蛋白质没 有同源性， 且提供了此蛋白质内 25 个潜在天冬酰胺 (N)- 连接之糖基化位点中的 18 个。B 结构域显然在凝结中无功能并且可被缺失， 而 B 结构域缺失的 FVIII 分子仍然具有促凝血活性。 Von Willebrand 因子 (vWF)
     VWF 是存在于哺乳动物血浆中的多聚粘附糖蛋白， 它具有多重生理学功能。 在初期 止血时， VWF 充当血小板表面上特异受体和胞外基质组分诸如胶原蛋白之间的中介物。此 外， VWF 用作促凝剂 FVIII 的载体和稳定蛋白。VWF 以 2813 个氨基酸的前体分子的形式合 成于内皮细胞和巨核细胞中。 该前体多肽， 前原 VWF， 由 22 个残基的单一肽、 741 个残基的原 肽和在成熟血浆 VWF 中发现的 2050 个残基的多肽组成 (Fischer et al.， FEBS Lett.351 ： 345-348， 1994)。 在分泌入血浆时， VWF 以具有不同分子大小的不同种类形式循环。 这些 VWF 分子由 2050 个氨基酸残基的成熟亚基的寡聚体和多聚体组成。 VWF 通常可以一个二聚体至 由 50-100 个二聚体组成的多聚体形式发现于血浆中 (Ruggeri et al.Thromb.Haemost.82 ： 576-584， 1999)。人的 VWF 在人体循环中的体内半衰期是大约 12 至 20 小时。
     在人类中最频繁的遗传性出血紊乱是维勒布兰德氏病 (von Willebrand ′ s disease， VWD)， 它可用包含血浆或重组来源的 VWF 的浓缩物通过替代疗法进行治疗。
     VWF 可按例如 EP 05503991 中所述由人的血浆制备。在专利 EP0784632 中描述了 用于分离重组 VWF 的方法。
     已知 VWF 在体内稳定 FVIII， 起调节 FVIII 之血浆水平的关键作用， 并因此是控制 初级和次级止血的重要因子。此外还已知在对 VWD 患者静脉内施用含 VWF 的药物制剂后， 可观察到在 24 小时内内源 FVIII ： C 增加至 1 至 3 个单位每 ml， 证明了 VWF 对 FVIII 的体 内稳定作用。
     直至今日， A 型血友病和 VWD 的标准治疗仍包括频繁的静脉内输注 FVIII 制剂和 VWF 浓缩物。 B 型血友病的治疗需要两周一次施用因子 IX， 并且在用 FVIIa 治疗抑制型患者 时， 利用每周多次施用 FVIIa 来避免出血。
     这些替代疗法通常是有效的， 不过， 在例如经历预防性治疗的严重 A 型血友病患 者中， 由于因子 VIII 约 12 小时的短血浆半衰期， 不得不每周约 3 次静脉内 (i.v.) 施用因 子 VIII。已经高于非血友病之 FVIII 活性的 1％水平时， 例如， FVIII 水平提高至约 0,01U/ ml 时， 严重的 A 型血友病被转变成中度的 A 型血友病。 在预防性治疗中， 设计剂量给药形式 以使 FVIII 活性的波谷水平不降到低于非血友病个体内之 FVIII 活性的 2-3％的水平。
     经由静脉内施用凝血因子是不方便的、 有痛苦并且承担着感染的风险， 尤其是因 为这大部分是由患者自己或被诊断患 A 型血友病的孩子的父母在家庭治疗中完成的。此 外， 频繁的静脉内注射不可避免的导致了疤痕产生， 妨碍了未来的输注。 由于严重血友病的 预防性治疗在生命的早期就开始了， 对于孩子经常在小于 2 岁时， 所以对如此小的患者每 周 3 次注射 FVIII 到静脉内就更困难了。在有限的一段时间内， 植入端口系统可能是一个 备选方案。尽管可能发生重复感染并且在体育运动时端口可能造成不方便这些事实， 它们 通常仍然被认为相较于静脉内注射而言是更可选的。
     因此对于避免静脉内输注凝血因子存在很大的医疗需求。
     发明简述
     本发明涉及在出血性紊乱的治疗和预防性处理中适于非静脉内施用、 包含白蛋白 融合凝血因子的药物制剂以及通过将其与白蛋白融合而在凝血因子的非静脉内施用后增 加体内回收的方法。
     优选凝血因子是维生素 -K 依赖型凝血因子及其片段和变体。更优选的是 FVIIa 和 FIX 及其片段和变体。此外非限制性地优选白蛋白 - 融合的 FVIII 和 vWF、 纤维蛋白原、 因子 II、 因子 X、 因子 XIII、 凝血酶、 凝血酶原和蛋白 C。
     优选含白蛋白融合凝血因子的制剂通过皮下施用。 不过所有其它非静脉内施用形 式也包括在内， 例如肌肉内或皮内施用。
     在本发明某些实施方案中， 凝血因子可经由可被蛋白酶裂解的肽接头与白蛋白融 合。
     本发明的要旨具体而言通过维生素 K- 依赖型多肽因子 VII 和白蛋白得以证明。 本 发明还涉及其它的凝血因子。 本发明还涉及编码白蛋白融合凝血因子的 cDNA。 编码各自凝 血因子的 cDNA 被遗传性地与编码人血清白蛋白的 cDNA 序列融合， 并且可通过编码可被蛋 白酶裂解的居间肽接头的寡核苷酸连接。本发明还涉及将包含所述融合 cDNA 序列的重组 表达载体用于非静脉内施用。 这可以是例如经由肌肉内注射包含编码白蛋白融合凝血因子 之 cDNA 的表达载体进行的基因治疗。
     发明详述
     “白蛋白融合 ( 的 ) 凝血因子” 在本发明的意义上意指人白蛋白与凝血因子的遗传 性融合体， 其中所得的融合多肽的血浆半衰期相较于相同类型但非融合型的凝血因子而言 有所延长， 并且其中非静脉内施用后的体内回收相较于相同但非融合型的凝血因子在非静 脉内施用后的体内回收而言有所增加。
     本发明优选的实施方案包括白蛋白融合的凝血因子， 其中非静脉内施用后的体 内回收相较于相同但非融合型的凝血因子在非静脉内施用后的体内回收而言增加了至少 10％， 优选至少 25％， 更优选超过 50％， 更优选超过 100％， 还更优选超过 200％。
     “非静脉内施用后的体内回收” 意指在非静脉内施用后可在血浆中发现的生物学 活性凝血因子的量。
     非静脉内施用后的体内回收可利用本领域众所周知的测定相应凝血因子生物学 活性的分析性凝结相关检验确定为例如 “曲线下的面积” ， 或者 “血浆水平峰值” 。 “体内回 收” 在本发明的意义上是意指在施用所述产品后不久在血液或血浆中发现的产品量。 因此， 为了探测体内回收， 通常在施用所述产品后例如 15 分钟、 或 60 分钟或 2 小时或 4 小时或 8 小时或 12 小时或 20 小时测定其血浆含量。
     “凝结相关检验” 在本发明的意义上是测定凝结过程中相关的酶活性或辅助因 子活性或能测定内在或外在凝结级联反应已被激活的任何检验。 “凝结相关” 检验因此 可以是直接的凝结检验， 类似 aPTT， PT， 或者凝血酶产生检验。不过， 其它的检验， 类似例 如应用于特异凝血因子的显色检验也包括在内。所述检验或相应试剂的例子是利用相应 凝血因子缺乏血浆 (Dade Behring) 的 SL(aPTT 检验， Dade Behring) 或 S( 凝血酶原时间测定， Dade Behring)， 利用例如凝血因子缺乏血浆的 凝血酶产生检验试剂盒 (Technoclone， Thrombinoscope)， 显色检验法， 象 Biophen 因子 IX(Hyphen BioMed)， FVIIa-rTF(Roche Diagnostics GmbH)， 因子 VIII ： C/4(Chromogenix)， 或其它。
     作为测定生物学活性凝血因子的替代， 还可测定相应凝血因子的抗原的量。优选 通过类似 ELISA 检验的技术测定抗原水平。
     “凝血因子” 在本发明的意义上是可有助于初级或次级止血的任何多肽。 “凝血因子” 包括但不局限于， 由因子 IX， 因子 VII， 因子 VIII， von Willebrand 因子， 因子 V， 因子 X， 因子 XI， 因子 XII， 因子 XIII， 因子 I， 因子 II( 凝血酶原 )， 蛋白 C， 蛋白 S， GAS6 或蛋白 Z 组 成的多肽以及它们的活化形式。 此外， 有效的凝血因子可以是野生型多肽或可以包含突变。 糖基化或其它翻译后修饰的程度和位置可随所选定宿主细胞和宿主细胞环境特性而变化。 当提到特定氨基酸序列时， 所述序列的翻译后修饰也包含在本申请中。
     白蛋白
     用于此处时， “白蛋白” 总体上指白蛋白多肽或氨基酸序列， 或具有白蛋白的一种 或更多种功能活性 ( 例如生物学活性 ) 的白蛋白片段或变体。特别是， “白蛋白” 指人的白 蛋白或其片段， 尤其是本文中以 SEQ ID No ： 1 所示的成熟形式的人白蛋白或来自其它脊椎 动物的白蛋白或其片段， 或者这些分子的类似物或变体或者其片段。
     白蛋白融合蛋白质中的白蛋白部分可包含如上所述的全长 HA 序列， 或者可能包 含它的能稳定或延长治疗活性的一个或多个片段。这样的片段可以是 10 个或更多个氨基 酸长， 或者可能包含来自 HA 序列的约 15， 20， 25， 30， 50， 或更多个连续氨基酸或者可能包含 HA 的部分或全部特定结构域。 本发明的白蛋白融合蛋白的白蛋白部分可以是正常 HA 的变体， 或天然或人造的。 本发明融合蛋白的治疗多肽部分也可以是如本文所述之相应治疗多肽的变体。 术语 “变体” 包括插入、 缺失和取代， 其或者保守的或不保守， 或天然或人造， 其中所述变化基本上不改 变赋予所述治疗多肽之治疗活性的活性位点或活性结构域。
     特别是， 本发明的白蛋白融合蛋白可包含天然存在的人白蛋白多态变体和人白蛋 白片段。白蛋白可来自任何脊椎动物， 尤其是任何哺乳动物， 例如人、 牛、 绵羊或猪。非哺乳 动物白蛋白包括但不局限于母鸡和鲑鱼。 白蛋白连接多肽的白蛋白部分可来自与治疗多肽 部分来源不同的动物。
     一般而言， 白蛋白片段或变体会是至少 10 个， 优选至少 40 个， 最优选超过 70 个氨 基酸长。白蛋白变体优选由以下部分组成或包含以下部分 ： 白蛋白的至少一个完整结构域 或所说结构域的片段， 例如结构域 1(SEQ ID NO ： 1 的氨基酸 1-194)， 2(SEQ ID NO ： 1 的氨基 酸 195-387)， 3(SEQ ID NO ： 1 的氨基酸 388-585)， 1+2(SEQ ID NO ： 1 的 1-387)， 2+3(SEQ ID NO ： 1 的 195-585) 或 1+3(SEQ ID NO ： 1 的氨基酸 1-194+SEQ ID NO ： 1 的氨基酸 388-585)。 每个结构域自身是由两个同源亚结构域即 1-105， 120-194， 195-291， 316-387， 388-491 和 512-585 组成， 具有包含残基 Lys106 至 Glu119， Glu292 至 Val315 以及 Glu492 至 Ala511 的 柔性亚结构域间连接区域。
     本发明之白蛋白融合蛋白的白蛋白部分可包含 HA 的至少一个亚结构域或结构域 或它们的保守修饰。
     本发明包括作为凝血因子融合配偶体的白蛋白所有片段或变体， 只要它们使得治 疗性融合蛋白在血浆中的半衰期相较于非融合型凝血因子而言延长至少 25％即可。
     ″白蛋白融合 ( 的 ) 凝血因子″用于此申请中意指包含非活化及活化形式的相 应凝血因子的多肽。″白蛋白融合凝血因子” 用于本发明时包括分别具有天然凝血因子和 白蛋白之氨基酸序列的蛋白质。还包括具有轻微修饰的氨基酸序列的蛋白质， 例如， 包含 N- 末端氨基酸缺失或添加的已修饰 N- 末端， 只要那些蛋白质基本上保持各自凝血因子的
     生物学活性即可。以上定义中的 “白蛋白融合凝血因子” 还包括可能在不同个体之间存在 的天然等位基因变异。以上定义中的″白蛋白融合凝血因子” 进一步包括各自凝血因子的 变体和白蛋白的变体。这样的变体在一个或更多个氨基酸残基上与野生型序列不同。所述 差异的例子可包括 N- 和 / 或 C- 末端截短了一个或多个氨基酸残基 ( 例如， 1 至 10 个氨基 酸残基 )， 或 N- 和 / 或 C- 末端添加了一个或多个额外的残基， 例如在 N- 末端添加了甲硫 氨酸残基， 以及保守性的氨基酸取代， 即， 在具有相似特性的氨基酸组内进行取代， 例如 (1) 小氨基酸， (2) 酸性氨基酸， (3) 极性氨基酸， (4) 碱性氨基酸， (5) 疏水氨基酸， (6) 芳香族 氨基酸。所述保守取代的例子如下表所示。
     表1
     (1) (2) (3a) (3b) (4) (5) (6)
     丙氨酸 天冬氨酸 天冬酰胺 丝氨酸 精氨酸 异亮氨酸 苯丙氨酸 甘氨酸 谷氨酸 谷氨酰胺 苏氨酸 组氨酸 亮氨酸 酪氨酸 赖氨酸 甲硫氨酸 色氨酸 缬氨酸本发明融合蛋白的体内半寿期， 通常以终末半寿期或 β- 半寿期测定， 常常比非 融合多肽的体内半寿期长至少约 25％， 优选至少约 50％， 更优选超过 100％。
     一个优选实施方案中的接头区域包含待施用的凝血因子序列或其变体， 它应使得 所表达融合蛋白的新抗原特性 ( 由于在治疗性抗原内出现人蛋白质中不存在的肽而形成 新的潜在免疫原表位 ) 的风险降低。此外在凝血因子是酶原 ( 例如， 需要蛋白水解激活 ) 的情况下， 肽接头裂解的动力学将更接近地反应酶原的凝结相关活化动力学。 因此， 在所述 优选实施方案中， 酶原和相应的接头以相当的动力学被活化和相应地裂解。 因此， 本发明还 特别涉及酶原和白蛋白的融合蛋白。
     在进一步的实施方案中， 接头肽包含针对一个以上蛋白酶的裂解位点。这可通过 可在同一位置被不同蛋白酶裂解的接头肽或通过提供两个或更多个不同裂解位点的接头 肽来实现。这在下述情况下是有利的， 即其中治疗性融合蛋白必须通过蛋白水解性裂解被 激活以达到酶活性， 以及不同蛋白酶可能有助于此活化步骤时。例如 FIX 的活化即是如此， 它可通过 FXIa 或通过 FVIIa/ 组织因子 (TF) 完成。
     本发明的优选实施方案是治疗性融合蛋白， 其中的接头可被蛋白酶裂解， 激活凝 血因子， 从而保证接头的裂解与凝结发生位置处凝血因子的活化相关联。
     依照本发明的其它优选治疗性融合蛋白是其中一旦被激活即可被作为治疗性融 合蛋白一部分的凝血因子裂解所述接头的那些融合蛋白， 这样也保证了融合蛋白的裂解与 凝血事件相关联。依照本发明的其它优选治疗性融合蛋白是其中所述接头可被蛋白酶所裂解的那 些融合蛋白， 所述蛋白酶自身直接或间接被作为治疗性融合蛋白一部分的凝血因子的活性 所激活， 这样也保证了融合蛋白的裂解与凝血事件相关联。
     最优选的一类治疗性融合蛋白是其中接头可被 FXIa 和 / 或被 FVIIa/TF 裂解且凝 血因子是 FIX 的那些融合蛋白。
     本发明的另一实施方案是用含白蛋白融合凝血因子的药物组合物进行非静脉内 施用。施用模式优选皮下的， 但包括所有的血管外施用途径。还包括经由上皮表面的施用 ( 例如， 在皮肤上 )。特别的临床应用是通过贴片施用， 这种局部的施用需要经由皮肤吸收， 不过它可以是相当显著的， 不仅是对表面磨损处也对完整无损的皮肤如此， 它可能包括滴 眼剂和鼻子处的应用。 经由上皮表面的施用包括吸入， 这是合适的， 因为特别大的表面被蛋 白质所覆盖， 导致快速吸收而避免了经过肝脏。在上皮表面的施用包括保持在嘴里或舌头 下的剂型， 即口腔的或舌下的剂型， 可能甚至如口香糖。由于嘴里的 pH 相对中性 ( 与酸性 的胃环境形成对照 )， 这对于不稳定蛋白质诸如 FVIII 是积极的。 也可考虑阴道和甚至直肠 施用， 因为流出直肠的某些静脉直接进入大循环。通常这对于不能经由口服途径摄入物质 的患者最有帮助， 譬如年幼的孩子。 皮内注射 ( 在皮肤内 ) 会是更侵入性的施用方式， 但仍适于无需专门人才帮助或 甚至实施的治疗。皮内施用后是皮下注射 ( 刚好在皮下下 )。通常吸收相当充分并且可通 过温暖或按摩注射区域增加吸收。 或者可实现血管收缩， 产生相反的行为， 即减少吸收但延 长效果。
     还更侵入性的血管外的施用包括肌肉内递送 ( 进入身体的肌肉内 )。这可能通过 绕开脂肪组织提供了好处， 但通常比皮下注射更痛苦， 尤其是对特征在于缺乏凝血系统的 患者而言， 为了通过注射得到改善， 但存在组织损伤的风险， 导致出血。
     本发明的凝血因子以治疗有效剂量施用于患者， 意指足够产生预期效果、 阻止或 减轻待治疗疾病或指征之严重性或蔓延的剂量， 但未到达产生无法忍受的不利副作用的剂 量。 确切剂量取决于许多因素， 诸如指征、 剂型、 施用方式， 并且必须针对每一种相应指征在 预临床和临床试验中确定。
     本发明的凝血因子可用于治疗家族性和获得性 A 型和 B 型血友病病例、 家族性或 获得性 von Willebrand 病、 所有类型的创伤 ( 钝的或穿透性的， 导致从单一器官、 骨头部 分或从多发性创伤处严重出血 ) 中的出血、 外科手术时的出血包括围手术期或手术后的出 血、 心脏手术导致的出血包括经历体外循环的患者和小儿科心脏手术中的血稀释、 大脑内 出血、 蛛网膜下出血、 硬脑膜下或硬脑膜上出血、 由于血液丢失和血液稀释造成的出血、 通 过非血浆体积取代导致受影响患者中凝血因子水平下降、 由于弥散性血管内凝血 (DIC) 和 消耗性凝血病、 凝血细胞功能紊乱、 损耗和凝血病造成的出血， 由于肝硬化、 肝功能障碍和 暴发性肝衰竭、 肝病患者的肝活组织检查造成的出血， 肝脏和其它器官移植后的出血， 来自 胃静脉曲张和胃溃疡出血、 妇科出血例如功能失调性子宫出血 (DUB)、 胎盘的过早剥离、 低 出生体重孩子的室周出血、 产后出血、 新生儿的致命危急状况， 与烧伤相关的出血， 与淀粉 样变性病相关的出血， 与血小板紊乱相关的造血干细胞移植， 与恶性肿瘤相关的出血， 与出 血性病毒相关的感染， 与胰腺炎相关的出血。
     本发明进一步涉及如本申请书所述编码白蛋白融合凝血因子的多核苷酸的使用。
     术语″多核苷酸″通常指任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸， 它们可以是未修饰的 RNA 或 DNA 或者已修饰的 RNA 或 DNA。多核苷酸可以是单链或双链 DNA、 单链或双链 RNA。用 于此处时， 术语″多核苷酸″还包括含有一个或多个被修饰碱基和 / 或不常见碱基例如肌 苷的 DNAs 或 RNAs。应当理解， 为了满足本领域技术人员已知的许多有用的目的， 可对 DNA 和 RNA 进行各种修饰。术语″多核苷酸″用于此处时包含了所述的化学、 酶促或代谢性修 饰形式的多核苷酸， 以及病毒和细胞特征性的 DNA 和 RNA 化学形式， 包括例如简单的和复杂 的细胞。
     技术人员应理解， 由于遗传密码的简并性， 给定的多肽可以由不同的多核苷酸编 码。这些 “变体” 包括在本发明中。
     优选的， 本发明的多核苷酸是纯化的多核苷酸。术语 “纯化的” 多核苷酸指基本上 没有其它核酸序列的多核苷酸， 例如但不局限于其它的染色体的和染色体外的 DNA 和 RNA。 纯化的核苷酸可纯化自宿主细胞。 可用技术人员已知的常规核酸纯化方法获得纯化的多核 苷酸。该术语还包括重组多核苷酸和化学合成的多核苷酸。
     除此以外， 本发明的另一方面是包含本发明多核苷酸的质粒或载体的使用。优选 的， 所述质粒或载体是表达载体。 在一个具体的实施方案中， 所述载体是适用于人基因治疗 的转移载体。
     糖基化或其它翻译后修饰的程度和位置可随选定的宿主细胞和所述宿主细胞环 境特性而变化。当提及特定的氨基酸序列时， 所述序列的翻译后修饰也包含在本申请中。
     术语″重组″意指例如所述变体是通过遗传工程技术在宿主生物体内产生的。 本 发明的 FVIII 或 VWF 变体经常是重组变体。
     所推荐变体的表达 ：
     在合适的宿主细胞内高水平产生重组蛋白质需要将上述修饰的 cDNA 连同合适的 调控元件一起在重组表达载体中装配成有效的转录单元内， 所述表达载体可依照本领域技 术人员已知的方法在各种表达系统中增殖。有效的转录调控元件可来自以动物细胞作为 其天然宿主的病毒或来自动物细胞的染色体 DNA。优选的， 可使用来自猿猴病毒 (Simian Virus)40、 腺病毒、 BK 多形瘤病毒、 人巨细胞病毒或劳氏肉瘤病毒长末端重复片段的启动 子 - 增强子组合， 或者包括动物细胞中强组成型转录基因例如 β- 肌动蛋白或 GRP78 的启 动子 - 增强子组合。为了达到稳定的高水平的从 cDNAs 至 mRNA 的转录， 转录单元应在其 3’ - 近端部分包含编码转录终止聚腺苷酸化序列的 DNA 区。优选的， 此序列来自猿猴病毒 40(Simian Virus40) 早期转录区、 兔 β- 珠蛋白基因或人组织纤溶酶原激活剂基因。
     然后将 cDNAs 整合入适于本发明之白蛋白融合凝血因子表达的合适宿主细胞系 的基因组中。优选此细胞系应是脊椎动物来源的动物细胞系， 以保证正确的折叠、 Gla- 结 构域合成、 二硫键形成、 天冬酰胺连接糖基化、 O- 连接糖基化和其它翻译后修饰以及向培养 基的分泌。其它翻译后修饰的例子是新生多肽链的羟基化和蛋白水解加工。可使用的细胞 系的例子是猴 COS- 细胞、 小鼠 L- 细胞、 小鼠 C127- 细胞、 仓鼠 BHK-21 细胞、 人胚肾 293 细 胞和仓鼠 CHO- 细胞。
     可以若干不同方式将编码相应 cDNAs 的重组表达载体引入动物细胞系中。例如， 可从基于不同动物病毒的载体建立重组表达载体。 这其实例有基于杆状病毒、 牛痘病毒、 腺 病毒 ( 优选牛乳头瘤病毒 ) 的载体。还可将编码相应 DNAs 的转录单元与另一重组基因一起引入动物细胞中， 所述的 另一重组基因可在这些细胞中用作显性的选择标记以方便分离特异的细胞克隆， 它们已将 所述重组 DNA 整合入其基因组中。此类型的显性选择标记基因的例子是 Tn5 氨基糖苷磷酸 转移酶， 赋予抗遗传霉素 (geneticin)(G418) 的抗性 ； 潮霉素磷酸转移酶， 赋予抗潮霉素的 抗性 ； 以及嘌呤霉素乙酰转移酶， 赋予抗嘌呤霉素的抗性。 编码这种选择标记的重组表达载 体可以驻留于与编码预期蛋白质之 cDNA 相同的同一载体上， 或者它可编码于同时引入并 整合入宿主细胞基因组的分开的载体上， 在不同转录单元之间常常产生紧密的物理连锁。
     可与预期蛋白质之 cDNA 一起使用的其它类型选择标记基因是基于编码二氢叶酸 还原酶 (dhfr) 的各种转录单元。 将此类基因引入缺少内源 dhfr- 活性的细胞、 优选 CHO- 细 胞 (DUKX-B11， DG-44) 后， 它使它们能在缺少核苷的培养基中生长。所述培养基的例子是无 次黄嘌呤、 胸苷和甘氨酸的 Ham’ s F12。这些 dhfr- 基因可与凝血因子 cDNA 转录单元一起 引入以上类型的 CHO- 细胞中， 其或者连接于同一载体上或者位于不同载体上， 由此建立产 生重组蛋白质的 dhfr- 阳性细胞系。
     若在细胞毒性 dhfr- 抑制剂氨甲蝶呤存在下培养以上细胞系， 则将形成抗氨甲蝶 呤的新细胞系。由于被连接的 dhfr 和预期蛋白质的转录单元的扩增数量， 这些细胞系可以 增长速率产生重组蛋白质。当在浓度逐步增加的氨甲蝶呤 (1-10000nM) 中增殖这些细胞系 时， 可获得以很高速率产生预期蛋白质的新细胞系。 产生预期蛋白质的以上细胞系可大规模培养于悬浮培养物中或各种固体支持物 上。这些支持物的例子是基于葡聚糖或胶原蛋白基质的微载体， 或中空纤维形式或各种陶 瓷材料的固相支持物。当在细胞悬浮培养物中或微载体上生长时， 可作为分批培养物或灌 注培养物形式进行以上细胞系的培养， 在较长时期内连续生产条件培养基。 因此， 依照本发 明， 以上细胞系很适合于开发工业生产方法用于生产预期的重组蛋白质。
     所述重组蛋白质当积聚于以上类型的分泌细胞的培养基中时， 可通过多种生化和 层析方法进行浓缩和纯化， 包括利用预期蛋白质和细胞培养基中其它物质之间在大小、 电 荷、 疏水性、 溶解性、 特异亲和力等方面差异的方法。
     所述纯化的一个例子是使重组蛋白质吸附在固定于固相支持物上的单克隆抗体 上。吸附后， 用基于以上特性的各种层析技术进一步纯化所述蛋白质。
     优选将本发明之修饰的生物学活性白蛋白融合凝血因子纯化至大于或等于 80％ 的纯度， 更优选大于或等于 95％的纯度， 尤其优选的是相对于污染的大分子、 尤其是其它蛋 白质和核酸而言大于 99.9％纯的药用纯态， 并且没有感染剂和热源剂。 优选的， 本发明之分 离或纯化的改良生物学活性白蛋白融合凝血因子是基本上无其它多肽的， 除非在准备施用 与其它治疗蛋白质之组合的时候。
     本发明中所述的白蛋白融合凝血因子可配制入药物制剂中供治疗用途。 已纯化的 蛋白质可溶于常规的生理上相容的水性缓冲液中， 其中可任选的加入药用赋形剂以得到药 物制剂。
     这样的药用载体和赋形剂以及合适的药用剂型是本领域众所周知的 ( 参阅例如 “Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins” ， Frokjaer et al.， Taylor & Francis(2000) 或 “Handbook of Pharmaceutical excipients” ， 3rd edition， Kibbe et al.， Pharmaceutical Press(2000))。特别是， 包含本发明之多肽变体
     的药物组合物可配制成冻干的或稳定可溶的形式。 可通过本领域已知的多种程序将多肽变 体冻干。 在使用之前通过加入一种或多种药用可接受稀释剂诸如注射用无菌水或无菌生理 盐溶液使冻干的制剂重新溶解。
     通过任何药用合适的非静脉内施用方式将组合物制剂递送给个体。 有多种递送系 统是已知的并且可用于经由任何方便途径施加组合物。优选配制本发明组合物用于皮下， 肌肉内， 腹膜内， 脑内， 肺内， 鼻内或经皮肤给药， 最优选依常规方法用于皮下的、 肌肉内或 经皮肤给药。 所述剂型可通过输注或通过大剂量推注连续施加。 某些剂型包括慢释放系统。
     将本发明的白蛋白融合凝血因子以治疗有效剂量施用于患者， 意指足够产生预期 效果、 阻止或减轻待治疗疾病或指征之严重性或蔓延并且未到达产生无法忍受的不利副作 用的剂量。 确切剂量取决于许多因素， 诸如指征、 剂型、 施用方式， 并且必须在针对每一相应 指征的预临床和临床试验中确定。
     本发明的药物组合物可单独施用或与其它治疗制剂联合施用。 这些制剂可掺入作 为同一药物的一部分。
     图注
     图1： 300μg/kg rVIIa-FP 和 图2： 300μg/kg rVIIa-FP 和 图3： 610μg/kg rIX-FP 和 图4： 610μg/kg rIX-FP 和后 FVII ： Ag 血浆浓度的时间进程 ( 汇 后 FVII ： Ag 血浆浓度的时间进程 ( 汇 后 FIX ： Ag 血浆浓度的时间进程 ( 汇集 ； n 后 FIX ： Ag 血浆浓度的时间进程 ( 汇集 ； n集； n ＝ 3/ 时间点 ； 线性尺度 )
     集； n ＝ 3/ 时间点 ； 对数 - 线性尺度 )
     ＝ 5/ 时间点 ； 线性尺度 )
     ＝ 5/ 时间点 ； 对数 - 线性尺度 ) 实施例 实施例 1 ： 大鼠中皮下施加 rVIIa-FP 的生物利用度评估
     第一个实施例中概述的实验的目的是为了评估血管外注射是否可能是用 rVIIa-FP( 人 ) 进行改良治疗的一个选择。作为血管外治疗的典型代表而言选择皮下注
     射。为了比较 rVIIa-FP 与参比制剂的适合性， 进行表 2 中所详细设计的 后测定血浆水平的非临床药代动力学研究。在对大鼠单次静脉内 / 皮下注射等摩尔剂量的 rVIIa-FP( 如 WO 2007/090584 中第 30 至 31 页所述产生的 pFVII-937) 和 时间进程。对 而言剂量是 300μg/kg。rVIIa-FP 的剂量是基于根据 OD 测量值 (280-320nm) 所确定的蛋白质浓度。 在校正 FP 的白蛋白部分后， 施加了 300μg(FVIIa)/ kg 的剂量。此时， 两种产品均以就治疗有效组分 FVIIa 而言相同的剂量施加。选择大鼠作 为此研究的动物物种， 因为它代表了适于此类型研究的特征清楚且频繁使用的物种。大鼠 (CD 品系 ) 由 Charles River(Sulzfeld， Germany) 提供， 在实验期间称重约 200g。将大鼠 保持在标准的住房条件下。经短期麻醉， 从眼窝后吸取血液样品， 用柠檬酸钙抗凝得到 10 至 20％的柠檬酸盐血液， 加工成血浆并贮存于 -20℃待测定 FVII 血浆水平。取样时间点详 见表 2。 通过夹心 ELISA， 利用绵羊抗 -FVII IgG(Cedarlane/Biozol) 作为捕获抗体， 而 POD缀合的绵羊 -FVII IgG(Cedarlane/Biozol) 作为探测抗体， 测定人 FVII 的血浆浓度。用标 准的人血浆作为参照。rVIIa-FP 的发酵、 纯化和激活在其它地方有描述。
     静脉内注射 rVIIa-FP 产生的初始血浆水平相较于用相同剂量处理而言高大约 60 ％ ( 表 3， 图 1)。只针对用 rVIIa-FP 进行皮下处理的组， 在血浆中探测 到 FVII。注射后约 8 小时时观察到峰浓度并且在处理后 1 至 2 天再次达到基线。对于用 相同剂量
     进行皮下处理的组， 尽管以与 rVIIa-FP 相同之 FVIIa 剂量注射 但在整个观察期间血浆水平均保持在检测极限之下 ( 图 2)。表2： 处理组
     表3： FVII ： Ag 血浆水平的时间进程 ( 血浆集合 ； n ＝ 3/ 时间点 )
     以与 rFVIIa-FP 相同的剂量注射未发现血浆水平。因此令人惊奇的是发现用 rVIIa-FP 进行皮下处理产生了可很好探测到的 FVIIa 血浆水平， 在注射后相当 短的延滞期后 ( 约 8 小时 ) 观察到峰浓度， 然后是长时的持久的衰退， 即至少 1-2 天后。这 甚至比静脉内注射后 rVIIa-FP 的时间进程要持久。 预期 皮下施加 rVIIa-FP 的相对生物可利用度达到了约 10％， 而皮下注射 的约为 rVIIa-FP 之 后未探 50％的较低分子量将有助于其从皮下区室中再吸收。研究的结果证明出现了相反的情况。 测到血浆水平。
     为了判断就其再吸收或向循环运输而言 rVIIa-FP 是否特别有利， 比较 rVIIa-FP和 中造成的。与 外， rVIIa-FP 和的相对生物可利用度可能是不适当的， 因为皮下施加之 rVIIa-FP 的 AUC 相比较， 静脉内输注后的终末半寿期已延长了超过 6 倍。此 的消除特性可能有区别地受到它们从皮下空间向循环传可能由于它的长久终末半寿期而突出， 这是由于 rVIIa-FP 从皮下区室连续释放至循环送或扩散的影响。因此有关此论题的明确结论可能更可靠的是基于峰浓度的评估。对于 血浆浓度从未达到 25ng/mL 的探测极限， 然而对于所述融合蛋白而言， 在注 射后血浆浓度很快达到了约 140ng/mL。
     第一步， 假定其再吸收或向循环的传送是与 rVIIa-FP 完全相同的， 则有可能估 计用 处理后预期的血浆浓度为何。通过对静脉内注射时 rVIIa-FP 之 60％ 皮下处理后阻碍血浆中 FVII 观察的方法 实际上传送至血浆、 但却因为在所 的最佳情形 的较高恢复水平进行校正， 我们可预期最高血浆水平约为 90ng/mL。这明显高于探测极 限， 由此排除了潜在的可能在用 大体上有利于 假设。至于 关于 这是基于 学问题。第二步， 为了估计通过与白蛋白融合达到的最小利益， 我们可设想最佳案例情况 有时间点所达到的峰浓度均停留在刚刚最低限的低于 25ng/mL 探测水平而观察不到这一 可能存在于血浆中的持续时间， 关于 是假设与 rVIIa-FP 有完全相同的时间进程， 尽管它的终末半寿期短了大约 6 倍。得到的 的 AUDC 是 550h*ng/mL， 而关于 rVIIa-FP 的是大约 2200h*ng/mL。因 的情况下， 血管外注射后 rVIIa-FP 的体内回收比 高至少大约 4 倍。 实施例 2 ： 在 B 型血友病模型 (FIX ko 小鼠 ) 中皮下施加 rIX-FP 的生物可利用度 此结论是， 在高度有利于
     的评估 为了评估血管外注射是否可能是用 rIX-FP( 人 ) 进行改良治疗的选项， 选择血管 外治疗的典型代表 - 皮下注射。检验所述实例的非临床药代动力学研究的设计详见表 4。 在对 B 型血友病模型单次静脉内 / 皮下注射 610IU/kg 或 rIX-FP 后测定血浆水 平的时间进程。依照 WO2007/144173 如实施例 1 至 3 中所述产生 rIX-FP(pFIX-1088)。用 FIX ： 凝结活性的相同剂量处理相应的组。用体重约 25g 的 FIX 敲除 (ko) 小鼠作为 B 型血 友病模型。 这些小鼠缺少 FIX 基因的启动子区域， 因此不表达 FIX(Lin et.al.1997， Blood， 90， 3962-3966)。这可以通过对被敲除小鼠血浆中 FIX 活性即功能活性蛋白质进行定量来 分析处理后的 FIX 水平。经短期麻醉， 从眼窝后吸取血液样品， 用柠檬酸钙抗凝得到 10 至 20％的柠檬酸盐血液， 加工成血浆并贮存于 -20℃用于测定 FIX 血浆水平。 取样时间点详见 表 5。通过标准的基于 aPTT 的方法 ( 贝林凝血计时器 ) 进行血浆中 FIX 活性的定量。将动 物在标准的住房条件下饲养。
     对 FIX ko 小鼠皮下注射 610U/kg 导致血浆水平中 FIX 活性相较于静 脉内注射所达到的血浆水平有小的增加 ( 图 3)。皮下施加后的生物可利用度是大约 25％。 皮下注射后， 持续约 1-2 天可探测到 FIX。有关 rFIX-FP 的结果则在若干方面明显不同 ：
     1) 皮下注射 rFIX-FP 后的峰浓度是对于 Berinin 未融合的野生型 FIX 所观察到的 约 2 倍高。
     2)rFIX-FP 皮下施用后的生物可利用度是有关 Berinin 所观察到的大约 2 倍高
     (25％对 45％ )。
     3) 与 Berinin 相反， 在后期， 通过皮下 rFIX-FP 达到的血浆水平甚至超过了通过静 脉内 rFIX-FP 所达到的血浆水平。
     这些结果合起来证明了血管外注射对于用 rIX-FP 进行的改良治疗而言是有价值 的选择。 较高峰浓度展现了不仅针对预防性的还甚至可能在出血事件中急性替代治疗的可 能性。较高的生物可利用度使得可以应用较低的剂量和注射体积， 提高成本效率并改善针 对患者而言的耐受性和安全性。 最后， 在预防性背景下， 皮下施用甚至可以延长处理的时间 间隔， 因为达到波谷水平的时间点比静脉内注射后的要晚。
     表4： 处理组
     表5： 静脉内 / 皮下施加 610IU/kg rIX-FP 和后 FIX ： 凝结血浆水平的时间进程 ( 平均 ±SD， n ＝ 5/ 时间点 )实施例 3 ： 在 A 型血友病模型 (FVIII ko 小鼠 ) 中皮下施加 rVIII-FP 的生物可利 用度的评估
     为了评估血管外注射是否可能是用 rVIII-FP( 人 ) 进行改良治疗的一个选择， 选 用血管外治疗的典型代表 - 皮下注射。所进行的可能性非临床药代动力学研究的设计详见
     表 7。在对 A 型血友病模型单次静脉内 / 皮下注射 ReFacto 或 rFVIII-FP 后测定血浆水平 的时间进程。用 FVIII ： 凝结活性的相同剂量处理相应的组。用体重约 25g 的 FVIII 敲除 (ko) 小鼠作为 A 型血友病模型。这些小鼠缺少外显子 16 和 17， 因此不表达 FVIII(Bi L.et al， Nature genetics， 1995， Vol 10(1)， 119-121 ； Bi L.et al， Blood， 1996， Vol 88(9)， 3446-3450)。这可以通过对被敲除小鼠血浆中 FVIII 活性进行定量来分析处理后的 FVIII 水平。处理细节的可能概要见表 8。经短期麻醉， 从眼窝后吸取血液样品， 用柠檬酸钙抗凝 得到 10 至 20％的柠檬酸盐血液， 加工成血浆并贮存于 -20℃用于测定 FVIII 血浆水平。有 关取样时间点的可能概述详见表 7。通过标准的基于 aPTT 的方法 ( 贝林凝血计时器 ) 进行 血浆中 FVIII 活性的定量。将动物在标准的住房条件下饲养。
     对 FVIII ko 小鼠皮下注射 200U/kg ReFacto 导致血浆水平中 FVIII 活性相较于 静脉内注射所预期的血浆水平有小的增加。比较用 rVIII-FP( 人 ) 进行的相应处理 ( 组 2 和 4)， 得到的结果用于评估血管外注射是否是适于用 rVIII-FP 进行改良治疗的一个选择。
     表6： 处理组
     表7： FVIII ： 凝结血浆水平之时间进程测定的可能概要 ( 平均值 ±SD， n ＝ 3-5/时间点 )
     实施例 4 ： 在 VWD 或 A 型血友病模型 (VWF 或 FVIII ko 小鼠 ) 中皮下施加 rVWF-FP的生物可利用度的评估
     为了评估血管外注射是否可能是用 rVWF-FP( 人 ) 进行改良治疗的一个选择， 选用 血管外治疗的典型代表 - 皮下注射。所进行的非临床药代动力学研究的可能性设计详见表 10。如此表所详述的对组 1、 2 和 4 至 6 进行处理， 若合适的话则注射其它剂量的 VWF ： Ag。 在对 A 型血友病或 von Willebrand 病 (VWD) 模型动物单次静脉内 / 皮下注射 P、 rVWF-FP 或 VWF 的糖基化突变体后测定血浆水平的时间进程。 用相同剂量的 VWF ： Ag 处理 相应的组。用体重约 25g 的 FVIII 敲除 (ko) 小鼠作为 A 型血友病模型。这些小鼠缺少外 显子 16 和 17， 因此不表达 FVIII(BiL.et al， Nature genetics， 1995， Vol 10(1)， 119-121 ； Bi L.et al， Blood， 1996， Vol 88(9)， 3446-3450)。用体重约 25g 的 VWF 敲除 (ko) 小鼠作 为 VWF 模型。这些小鼠缺少 VWF 基因的外显子 4 和 5 并因此不表达 VWF(Denis C.et al， Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 1998， Vol 95， 9524-9529)。
     处理细节见表 6。 经短期麻醉， 从眼窝后吸取血液样品， 用柠檬酸钙抗凝得到 10 至 20％的柠檬酸盐血液， 加工成血浆并贮存于 -20℃用于测定 FVIII 活性。 取样时间点详见表 7。用市售 ELISA 检测试剂盒 Ag 的定量。将动物在标准的住房条件下饲养。
     Diagnostica Stago) 进行血浆中人 VWF ： P 导致血浆中人 VWF ： Ag对小鼠皮下注射约 1400U/kg VWF ： Ag U/kg相较于静脉内注射后所预期的血浆水平有所增加。比较用 rVWF-FP( 人 ) 进行的相应处理 ( 组 2 和 5)， 以及用 VWF 糖基化突变体进行的相应处理 ( 组 3 和 6)， 得到的结果用于评估血 管外注射是否是适于用 rVWF-FP 和 VWF 糖基化突变体进行改良治疗的一个选择。
     表8： 可能的处理组
     表9： 对 FVIII ko 小鼠单次皮下注射 500U/kg FVIII ： C 的不同 VWFP制剂后 VWF ： Ag 血浆水平测定 ( 正常的％ ) 的可能概要 ( 平均值 ±SD ； n ＝ 5， 对于每一时 间点 )
     发明背景
     用于人类治疗和预防用途的若干重组治疗性多肽在市面上有售。 患者通常受益于 重组活性成分的特异作用模式， 但目前所有市售的凝血因子均是通过静脉内给药施加的， 这常常导致注射位置的感染并且是患者通常希望避免的一个措施， 尤其是治疗凝血过程有 缺陷的儿童时。
     Balance 等 (WO 01/79271) 描述了众多的不同治疗多肽的融合多肽， 当它们与人 血清白蛋白融合时预计将具有增加的体内功能半寿期和延长的储存期。 文中描述了一长串 潜在的融合配偶体， 但几乎对所有这些多肽都没有用实验数据显示各自的白蛋白融合蛋白 确实保持了生物学活性并且具有改善的特性。在此份名单中作为例子提及的治疗多肽是 因子 IX 和 FVII/FVIIa。此外还描述了 FIX 和 FVII/FVIIa 的融合， 其中在白蛋白和 FIX 或 FVII/FVIIa 之间有肽接头。不过， 没有披露当非静脉内施加相应的凝血因子时白蛋白融合 体可改善治疗性处理。
     因子 VII 和因子 VIIa
     FVII 是分子量 50kDa 的单链糖蛋白， 它作为 406 个氨基酸的无活性酶原由肝细胞 分泌入血流中。FVII 通过 Arg152-Ile153 处单一肽键的蛋白水解转变为它的活性形式因 子 VIIa， 此水解导致形成了两条多肽链， N- 末端轻链 (24kDa) 和 C- 末端重链 (28kDa)， 它 们通过一个二硫桥连接在一起。与其它维生素 K- 依赖性凝血因子相反， 在活化期间没有 活化肽被裂解下来。因子 VII 的活化裂解可在体外完成， 例如通过因子 Xa， 因子 IXa， 因子 VIIa， 因子 XIIa， 因子七激活蛋白酶 (FSAP) 和凝血酶。Mollerup 等 (Biotechnol.Bioeng. (1995)48 ： 501-505) 报告了在重链的 Arg290 和 / 或 Arg315 处也发生某些裂解。
     因子 VII 以 500ng/ml 的浓度存在于血浆中。约 1％或 5ng/ml 的因子 VII 是作为 激化的因子 VIIa 存在。已发现因子 VII 的终末血浆半衰期是大约 4 小时， 而因子 VIIa 的 是大约 2 小时。
     通过施加超生理水平浓度的因子 VIIa， 可绕开对因子 VIIIa 和因子 IXa 的需要而 完成止血。因子 VII 之 cDNA 的克隆 (US 4,784,950) 使得有可能研发活化的因子 VII 作为 药品。1988 年因子 VIIa 首次被成功施用。从那时起， 因子 VIIa 的适应症量稳步增长， 显示 了其成为通用止血剂来阻止出血的潜能 (Erhardtsen， 2002)。不过， 因子 VIIa 约 2 小时的 短终末半衰期和减少的体内回收限制了它的应用。
     人的 FIX
     人的 FIX 是维生素 K- 依赖型多肽族的一个成员， 它是分子量为 57kDa 的单链糖蛋 白， 以 415 个氨基酸的无活性酶原形式由肝细胞分泌至血流中。 它包含位于多肽 N- 末端 Gla
     结构域的 12 个 γ- 羧基 - 谷氨酸残基。这些 Gla 残基需要维生素 K 用于它们的生物合成。 在 Gla 结构域后面有两个表皮生长因子结构域， 一个活化肽和胰蛋白酶型丝氨酸蛋白酶结 构域。FIX 的进一步翻译后修饰包括羟基化 (Asp 64)， N-(Asn157 和 Asn167) 以及 O- 型糖 基化 (Ser53， Ser61， Thr159， Thr169 和 Thr172)、 硫酸化 (Tyr155) 和磷酸化 (Ser158)。
     FIX 通过在 Arg145-Ala146 和 Arg180-Val181 处水解活化肽而转变成它的活性 形式因子 IXa， 所述水解导致形成了两条多肽链， 即 N- 末端轻链 (18kDa) 和 C- 末端重链 (28kDa)， 它们通过一个二硫桥连接在一起。 因子 IX 的活化裂解可在体外通过例如因子 XIa 或因子 VIIa/TF 来完成。因子 IX 以 5-10μg/ml 的浓度存在于人的血浆中。已发现人的因 子 IX 的终末血浆半衰期是约 15 至 18 小时 (White GC et al.1997.Recombinant factor IX.Thromb Haemost.78 ： 261-265 ； Ewenstein BM et al.2002.Pharmacokinetic analysis of plasma-derived and recombinant F IX concentrates in previously treated patients with moderate or severe hemophilia B.Transfusion 42 ： 190-197)。
     B 型血友病是由因子 IX 的无功能或缺失引起的， 其用来自血浆的因子 IX 浓缩物或 重组形式的因子 IX 治疗。由于 B 型血友病患者常常接受至少两周一次 (biweekly) 的预防 性施用因子 IX 以避免自发的出血， 因此人们希望通过延长因子 IX 产品之半寿期来延长两 次施用之间的时间间隔并避免静脉内施用因子 IX。
     因子 VIII(FVIII)
     FVIII 是分子质量约 260kDa 的血浆糖蛋白， 产生于哺乳动物的肝脏中。它是导致 血液凝固的凝血级联反应的关键组分。此级联反应中的一步是因子 IXa(FIXa) 结合 FVIII 一起将因子 X(FX) 转变成活化形式 FXa。FVIII 在此步中作为辅助因子， 与钙离子和磷脂一 起为 FIXa 活性所必需。最常见的血友病紊乱是由功能性 FVIII 缺乏引起的， 称为 A 型血友 病。
     A 型血友病治疗中的一个重要进展是分离到了编码人 FVIII 之完整 2， 351 个氨基 酸序列的 cDNA 克隆 ( 美国专利申请 No.4,757,006) 以及提供了人 FVIII 基因 DNA 序列和 用于其产生的重组方法。
     对测定自克隆 cDNA 的人 FVIII 的推断一级氨基酸序列进行分析显示它是从较大 的前体多肽加工而来的异二聚体。所述异二聚体由约 80kDa 的 C- 末端轻链以金属离子依 赖型缔合结合约 210kDa 的 N- 末端重链片段组成。( 参阅综述 Kaufman， Transfusion Med. Revs.6 ： 235(1992))。通过由凝血酶对蛋白链进行蛋白水解性裂解使此异二聚体发生生理 激活。凝血酶将重链裂解成 90kDa 的蛋白质， 然后裂解成 54kDa 和 44kDa 片段。凝血酶还 将 80kDa 的轻链裂解成 72kDa 的蛋白质。正是后一蛋白质和两个重链片段 ( 上述 54kDa 和 44kDa) 通过钙离子结合在一起， 组成了活性的 FVIII。当 72kDa 和 54kDa 蛋白质进一步被 凝血酶、 活化蛋白 C 或 FXa 裂解时会发生失活。在血浆中， 此 FVIII 复合物通过与 50 倍过 量的 VWF 蛋白质 (″ VWF″ ) 联合而得以稳定， 后者看起来抑制了如上所述的 FVIII 的蛋白 水解性破坏。
     FVIII 的氨基酸序列被组织入三个结构性结构域 ： 330 个氨基酸的三重 A 结构域、 980 个氨基酸的单一 B 结构域和 150 个氨基酸的双重 C 结构域。B 结构域与其它蛋白质没 有同源性， 且提供了此蛋白质内 25 个潜在天冬酰胺 (N)- 连接之糖基化位点中的 18 个。B 结构域显然在凝结中无功能并且可被缺失， 而 B 结构域缺失的 FVIII 分子仍然具有促凝血活性。 Von Willebrand 因子 (vWF)
     VWF 是存在于哺乳动物血浆中的多聚粘附糖蛋白， 它具有多重生理学功能。 在初期 止血时， VWF 充当血小板表面上特异受体和胞外基质组分诸如胶原蛋白之间的中介物。此 外， VWF 用作促凝剂 FVIII 的载体和稳定蛋白。VWF 以 2813 个氨基酸的前体分子的形式合 成于内皮细胞和巨核细胞中。 该前体多肽， 前原 VWF， 由 22 个残基的单一肽、 741 个残基的原 肽和在成熟血浆 VWF 中发现的 2050 个残基的多肽组成 (Fischer et al.， FEBS Lett.351 ： 345-348， 1994)。 在分泌入血浆时， VWF 以具有不同分子大小的不同种类形式循环。 这些 VWF 分子由 2050 个氨基酸残基的成熟亚基的寡聚体和多聚体组成。 VWF 通常可以一个二聚体至 由 50-100 个二聚体组成的多聚体形式发现于血浆中 (Ruggeri et al.Thromb.Haemost.82 ： 576-584， 1999)。人的 VWF 在人体循环中的体内半衰期是大约 12 至 20 小时。
     在人类中最频繁的遗传性出血紊乱是维勒布兰德氏病 (von Willebrand ′ s disease， VWD)， 它可用包含血浆或重组来源的 VWF 的浓缩物通过替代疗法进行治疗。
     VWF 可按例如 EP 05503991 中所述由人的血浆制备。在专利 EP0784632 中描述了 用于分离重组 VWF 的方法。
    已知 VWF 在体内稳定 FVIII， 起调节 FVIII 之血浆水平的关键作用， 并因此是控制 初级和次级止血的重要因子。此外还已知在对 VWD 患者静脉内施用含 VWF 的药物制剂后， 可观察到在 24 小时内内源 FVIII ： C 增加至 1 至 3 个单位每 ml， 证明了 VWF 对 FVIII 的体 内稳定作用。
     直至今日， A 型血友病和 VWD 的标准治疗仍包括频繁的静脉内输注 FVIII 制剂和 VWF 浓缩物。 B 型血友病的治疗需要两周一次施用因子 IX， 并且在用 FVIIa 治疗抑制型患者 时， 利用每周多次施用 FVIIa 来避免出血。
     这些替代疗法通常是有效的， 不过， 在例如经历预防性治疗的严重 A 型血友病患 者中， 由于因子 VIII 约 12 小时的短血浆半衰期， 不得不每周约 3 次静脉内 (i.v.) 施用因 子 VIII。已经高于非血友病之 FVIII 活性的 1％水平时， 例如， FVIII 水平提高至约 0,01U/ ml 时， 严重的 A 型血友病被转变成中度的 A 型血友病。 在预防性治疗中， 设计剂量给药形式 以使 FVIII 活性的波谷水平不降到低于非血友病个体内之 FVIII 活性的 2-3％的水平。
     经由静脉内施用凝血因子是不方便的、 有痛苦并且承担着感染的风险， 尤其是因 为这大部分是由患者自己或被诊断患 A 型血友病的孩子的父母在家庭治疗中完成的。此 外， 频繁的静脉内注射不可避免的导致了疤痕产生， 妨碍了未来的输注。 由于严重血友病的 预防性治疗在生命的早期就开始了， 对于孩子经常在小于 2 岁时， 所以对如此小的患者每 周 3 次注射 FVIII 到静脉内就更困难了。在有限的一段时间内， 植入端口系统可能是一个 备选方案。尽管可能发生重复感染并且在体育运动时端口可能造成不方便这些事实， 它们 通常仍然被认为相较于静脉内注射而言是更可选的。
     因此对于避免静脉内输注凝血因子存在很大的医疗需求。
     发明简述
     本发明涉及在出血性紊乱的治疗和预防性处理中适于非静脉内施用、 包含白蛋白 融合凝血因子的药物制剂以及通过将其与白蛋白融合而在凝血因子的非静脉内施用后增 加体内回收的方法。
     优选凝血因子是维生素 -K 依赖型凝血因子及其片段和变体。更优选的是 FVIIa 和 FIX 及其片段和变体。此外非限制性地优选白蛋白 - 融合的 FVIII 和 vWF、 纤维蛋白原、 因子 II、 因子 X、 因子 XIII、 凝血酶、 凝血酶原和蛋白 C。
     优选含白蛋白融合凝血因子的制剂通过皮下施用。 不过所有其它非静脉内施用形 式也包括在内， 例如肌肉内或皮内施用。
     在本发明某些实施方案中， 凝血因子可经由可被蛋白酶裂解的肽接头与白蛋白融 合。
     本发明的要旨具体而言通过维生素 K- 依赖型多肽因子 VII 和白蛋白得以证明。 本 发明还涉及其它的凝血因子。 本发明还涉及编码白蛋白融合凝血因子的 cDNA。 编码各自凝 血因子的 cDNA 被遗传性地与编码人血清白蛋白的 cDNA 序列融合， 并且可通过编码可被蛋 白酶裂解的居间肽接头的寡核苷酸连接。本发明还涉及将包含所述融合 cDNA 序列的重组 表达载体用于非静脉内施用。 这可以是例如经由肌肉内注射包含编码白蛋白融合凝血因子 之 cDNA 的表达载体进行的基因治疗。
     发明详述
     “白蛋白融合 ( 的 ) 凝血因子” 在本发明的意义上意指人白蛋白与凝血因子的遗传 性融合体， 其中所得的融合多肽的血浆半衰期相较于相同类型但非融合型的凝血因子而言 有所延长， 并且其中非静脉内施用后的体内回收相较于相同但非融合型的凝血因子在非静 脉内施用后的体内回收而言有所增加。
     本发明优选的实施方案包括白蛋白融合的凝血因子， 其中非静脉内施用后的体 内回收相较于相同但非融合型的凝血因子在非静脉内施用后的体内回收而言增加了至少 10％， 优选至少 25％， 更优选超过 50％， 更优选超过 100％， 还更优选超过 200％。
     “非静脉内施用后的体内回收” 意指在非静脉内施用后可在血浆中发现的生物学 活性凝血因子的量。
     非静脉内施用后的体内回收可利用本领域众所周知的测定相应凝血因子生物学 活性的分析性凝结相关检验确定为例如 “曲线下的面积” ， 或者 “血浆水平峰值” 。 “体内回 收” 在本发明的意义上是意指在施用所述产品后不久在血液或血浆中发现的产品量。 因此， 为了探测体内回收， 通常在施用所述产品后例如 15 分钟、 或 60 分钟或 2 小时或 4 小时或 8 小时或 12 小时或 20 小时测定其血浆含量。
     “凝结相关检验” 在本发明的意义上是测定凝结过程中相关的酶活性或辅助因 子活性或能测定内在或外在凝结级联反应已被激活的任何检验。 “凝结相关” 检验因此 可以是直接的凝结检验， 类似 aPTT， PT， 或者凝血酶产生检验。不过， 其它的检验， 类似例 如应用于特异凝血因子的显色检验也包括在内。所述检验或相应试剂的例子是利用相应 凝血因子缺乏血浆 (Dade Behring) 的 SL(aPTT 检验， Dade Behring) 或 S( 凝血酶原时间测定， Dade Behring)， 利用例如凝血因子缺乏血浆的 凝血酶产生检验试剂盒 (Technoclone， Thrombinoscope)， 显色检验法， 象 Biophen 因子 IX(Hyphen BioMed)， FVIIa-rTF(Roche Diagnostics GmbH)， 因子 VIII ： C/4(Chromogenix)， 或其它。
     作为测定生物学活性凝血因子的替代， 还可测定相应凝血因子的抗原的量。优选 通过类似 ELISA 检验的技术测定抗原水平。
     “凝血因子” 在本发明的意义上是可有助于初级或次级止血的任何多肽。 “凝血因子” 包括但不局限于， 由因子 IX， 因子 VII， 因子 VIII， von Willebrand 因子， 因子 V， 因子 X， 因子 XI， 因子 XII， 因子 XIII， 因子 I， 因子 II( 凝血酶原 )， 蛋白 C， 蛋白 S， GAS6 或蛋白 Z 组 成的多肽以及它们的活化形式。 此外， 有效的凝血因子可以是野生型多肽或可以包含突变。 糖基化或其它翻译后修饰的程度和位置可随所选定宿主细胞和宿主细胞环境特性而变化。 当提到特定氨基酸序列时， 所述序列的翻译后修饰也包含在本申请中。
     白蛋白
     用于此处时， “白蛋白” 总体上指白蛋白多肽或氨基酸序列， 或具有白蛋白的一种 或更多种功能活性 ( 例如生物学活性 ) 的白蛋白片段或变体。特别是， “白蛋白” 指人的白 蛋白或其片段， 尤其是本文中以 SEQ ID No ： 1 所示的成熟形式的人白蛋白或来自其它脊椎 动物的白蛋白或其片段， 或者这些分子的类似物或变体或者其片段。
     白蛋白融合蛋白质中的白蛋白部分可包含如上所述的全长 HA 序列， 或者可能包 含它的能稳定或延长治疗活性的一个或多个片段。这样的片段可以是 10 个或更多个氨基 酸长， 或者可能包含来自 HA 序列的约 15， 20， 25， 30， 50， 或更多个连续氨基酸或者可能包含 HA 的部分或全部特定结构域。 本发明的白蛋白融合蛋白的白蛋白部分可以是正常 HA 的变体， 或天然或人造的。 本发明融合蛋白的治疗多肽部分也可以是如本文所述之相应治疗多肽的变体。 术语 “变体” 包括插入、 缺失和取代， 其或者保守的或不保守， 或天然或人造， 其中所述变化基本上不改 变赋予所述治疗多肽之治疗活性的活性位点或活性结构域。
     特别是， 本发明的白蛋白融合蛋白可包含天然存在的人白蛋白多态变体和人白蛋 白片段。白蛋白可来自任何脊椎动物， 尤其是任何哺乳动物， 例如人、 牛、 绵羊或猪。非哺乳 动物白蛋白包括但不局限于母鸡和鲑鱼。 白蛋白连接多肽的白蛋白部分可来自与治疗多肽 部分来源不同的动物。
     一般而言， 白蛋白片段或变体会是至少 10 个， 优选至少 40 个， 最优选超过 70 个氨 基酸长。白蛋白变体优选由以下部分组成或包含以下部分 ： 白蛋白的至少一个完整结构域 或所说结构域的片段， 例如结构域 1(SEQ ID NO ： 1 的氨基酸 1-194)， 2(SEQ ID NO ： 1 的氨基 酸 195-387)， 3(SEQ ID NO ： 1 的氨基酸 388-585)， 1+2(SEQ ID NO ： 1 的 1-387)， 2+3(SEQ ID NO ： 1 的 195-585) 或 1+3(SEQ ID NO ： 1 的氨基酸 1-194+SEQ ID NO ： 1 的氨基酸 388-585)。 每个结构域自身是由两个同源亚结构域即 1-105， 120-194， 195-291， 316-387， 388-491 和 512-585 组成， 具有包含残基 Lys106 至 Glu119， Glu292 至 Val315 以及 Glu492 至 Ala511 的 柔性亚结构域间连接区域。
     本发明之白蛋白融合蛋白的白蛋白部分可包含 HA 的至少一个亚结构域或结构域 或它们的保守修饰。
     本发明包括作为凝血因子融合配偶体的白蛋白所有片段或变体， 只要它们使得治 疗性融合蛋白在血浆中的半衰期相较于非融合型凝血因子而言延长至少 25％即可。
     ″白蛋白融合 ( 的 ) 凝血因子″用于此申请中意指包含非活化及活化形式的相 应凝血因子的多肽。″白蛋白融合凝血因子” 用于本发明时包括分别具有天然凝血因子和 白蛋白之氨基酸序列的蛋白质。还包括具有轻微修饰的氨基酸序列的蛋白质， 例如， 包含 N- 末端氨基酸缺失或添加的已修饰 N- 末端， 只要那些蛋白质基本上保持各自凝血因子的
     生物学活性即可。以上定义中的 “白蛋白融合凝血因子” 还包括可能在不同个体之间存在 的天然等位基因变异。以上定义中的″白蛋白融合凝血因子” 进一步包括各自凝血因子的 变体和白蛋白的变体。这样的变体在一个或更多个氨基酸残基上与野生型序列不同。所述 差异的例子可包括 N- 和 / 或 C- 末端截短了一个或多个氨基酸残基 ( 例如， 1 至 10 个氨基 酸残基 )， 或 N- 和 / 或 C- 末端添加了一个或多个额外的残基， 例如在 N- 末端添加了甲硫 氨酸残基， 以及保守性的氨基酸取代， 即， 在具有相似特性的氨基酸组内进行取代， 例如 (1) 小氨基酸， (2) 酸性氨基酸， (3) 极性氨基酸， (4) 碱性氨基酸， (5) 疏水氨基酸， (6) 芳香族 氨基酸。所述保守取代的例子如下表所示。
     表1
     (1) (2) (3a) (3b) (4) (5) (6)
     丙氨酸 天冬氨酸 天冬酰胺 丝氨酸 精氨酸 异亮氨酸 苯丙氨酸 甘氨酸 谷氨酸 谷氨酰胺 苏氨酸 组氨酸 亮氨酸 酪氨酸 赖氨酸 甲硫氨酸 色氨酸 缬氨酸本发明融合蛋白的体内半寿期， 通常以终末半寿期或 β- 半寿期测定， 常常比非 融合多肽的体内半寿期长至少约 25％， 优选至少约 50％， 更优选超过 100％。
     一个优选实施方案中的接头区域包含待施用的凝血因子序列或其变体， 它应使得 所表达融合蛋白的新抗原特性 ( 由于在治疗性抗原内出现人蛋白质中不存在的肽而形成 新的潜在免疫原表位 ) 的风险降低。此外在凝血因子是酶原 ( 例如， 需要蛋白水解激活 ) 的情况下， 肽接头裂解的动力学将更接近地反应酶原的凝结相关活化动力学。 因此， 在所述 优选实施方案中， 酶原和相应的接头以相当的动力学被活化和相应地裂解。 因此， 本发明还 特别涉及酶原和白蛋白的融合蛋白。
     在进一步的实施方案中， 接头肽包含针对一个以上蛋白酶的裂解位点。这可通过 可在同一位置被不同蛋白酶裂解的接头肽或通过提供两个或更多个不同裂解位点的接头 肽来实现。这在下述情况下是有利的， 即其中治疗性融合蛋白必须通过蛋白水解性裂解被 激活以达到酶活性， 以及不同蛋白酶可能有助于此活化步骤时。例如 FIX 的活化即是如此， 它可通过 FXIa 或通过 FVIIa/ 组织因子 (TF) 完成。
     本发明的优选实施方案是治疗性融合蛋白， 其中的接头可被蛋白酶裂解， 激活凝 血因子， 从而保证接头的裂解与凝结发生位置处凝血因子的活化相关联。
     依照本发明的其它优选治疗性融合蛋白是其中一旦被激活即可被作为治疗性融 合蛋白一部分的凝血因子裂解所述接头的那些融合蛋白， 这样也保证了融合蛋白的裂解与 凝血事件相关联。依照本发明的其它优选治疗性融合蛋白是其中所述接头可被蛋白酶所裂解的那 些融合蛋白， 所述蛋白酶自身直接或间接被作为治疗性融合蛋白一部分的凝血因子的活性 所激活， 这样也保证了融合蛋白的裂解与凝血事件相关联。
     最优选的一类治疗性融合蛋白是其中接头可被 FXIa 和 / 或被 FVIIa/TF 裂解且凝 血因子是 FIX 的那些融合蛋白。
     本发明的另一实施方案是用含白蛋白融合凝血因子的药物组合物进行非静脉内 施用。施用模式优选皮下的， 但包括所有的血管外施用途径。还包括经由上皮表面的施用 ( 例如， 在皮肤上 )。特别的临床应用是通过贴片施用， 这种局部的施用需要经由皮肤吸收， 不过它可以是相当显著的， 不仅是对表面磨损处也对完整无损的皮肤如此， 它可能包括滴 眼剂和鼻子处的应用。 经由上皮表面的施用包括吸入， 这是合适的， 因为特别大的表面被蛋 白质所覆盖， 导致快速吸收而避免了经过肝脏。在上皮表面的施用包括保持在嘴里或舌头 下的剂型， 即口腔的或舌下的剂型， 可能甚至如口香糖。由于嘴里的 pH 相对中性 ( 与酸性 的胃环境形成对照 )， 这对于不稳定蛋白质诸如 FVIII 是积极的。 也可考虑阴道和甚至直肠 施用， 因为流出直肠的某些静脉直接进入大循环。通常这对于不能经由口服途径摄入物质 的患者最有帮助， 譬如年幼的孩子。 皮内注射 ( 在皮肤内 ) 会是更侵入性的施用方式， 但仍适于无需专门人才帮助或 甚至实施的治疗。皮内施用后是皮下注射 ( 刚好在皮下下 )。通常吸收相当充分并且可通 过温暖或按摩注射区域增加吸收。 或者可实现血管收缩， 产生相反的行为， 即减少吸收但延 长效果。
     还更侵入性的血管外的施用包括肌肉内递送 ( 进入身体的肌肉内 )。这可能通过 绕开脂肪组织提供了好处， 但通常比皮下注射更痛苦， 尤其是对特征在于缺乏凝血系统的 患者而言， 为了通过注射得到改善， 但存在组织损伤的风险， 导致出血。
     本发明的凝血因子以治疗有效剂量施用于患者， 意指足够产生预期效果、 阻止或 减轻待治疗疾病或指征之严重性或蔓延的剂量， 但未到达产生无法忍受的不利副作用的剂 量。 确切剂量取决于许多因素， 诸如指征、 剂型、 施用方式， 并且必须针对每一种相应指征在 预临床和临床试验中确定。
     本发明的凝血因子可用于治疗家族性和获得性 A 型和 B 型血友病病例、 家族性或 获得性 von Willebrand 病、 所有类型的创伤 ( 钝的或穿透性的， 导致从单一器官、 骨头部 分或从多发性创伤处严重出血 ) 中的出血、 外科手术时的出血包括围手术期或手术后的出 血、 心脏手术导致的出血包括经历体外循环的患者和小儿科心脏手术中的血稀释、 大脑内 出血、 蛛网膜下出血、 硬脑膜下或硬脑膜上出血、 由于血液丢失和血液稀释造成的出血、 通 过非血浆体积取代导致受影响患者中凝血因子水平下降、 由于弥散性血管内凝血 (DIC) 和 消耗性凝血病、 凝血细胞功能紊乱、 损耗和凝血病造成的出血， 由于肝硬化、 肝功能障碍和 暴发性肝衰竭、 肝病患者的肝活组织检查造成的出血， 肝脏和其它器官移植后的出血， 来自 胃静脉曲张和胃溃疡出血、 妇科出血例如功能失调性子宫出血 (DUB)、 胎盘的过早剥离、 低 出生体重孩子的室周出血、 产后出血、 新生儿的致命危急状况， 与烧伤相关的出血， 与淀粉 样变性病相关的出血， 与血小板紊乱相关的造血干细胞移植， 与恶性肿瘤相关的出血， 与出 血性病毒相关的感染， 与胰腺炎相关的出血。
     本发明进一步涉及如本申请书所述编码白蛋白融合凝血因子的多核苷酸的使用。
     术语″多核苷酸″通常指任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸， 它们可以是未修饰的 RNA 或 DNA 或者已修饰的 RNA 或 DNA。多核苷酸可以是单链或双链 DNA、 单链或双链 RNA。用 于此处时， 术语″多核苷酸″还包括含有一个或多个被修饰碱基和 / 或不常见碱基例如肌 苷的 DNAs 或 RNAs。应当理解， 为了满足本领域技术人员已知的许多有用的目的， 可对 DNA 和 RNA 进行各种修饰。术语″多核苷酸″用于此处时包含了所述的化学、 酶促或代谢性修 饰形式的多核苷酸， 以及病毒和细胞特征性的 DNA 和 RNA 化学形式， 包括例如简单的和复杂 的细胞。
     技术人员应理解， 由于遗传密码的简并性， 给定的多肽可以由不同的多核苷酸编 码。这些 “变体” 包括在本发明中。
     优选的， 本发明的多核苷酸是纯化的多核苷酸。术语 “纯化的” 多核苷酸指基本上 没有其它核酸序列的多核苷酸， 例如但不局限于其它的染色体的和染色体外的 DNA 和 RNA。 纯化的核苷酸可纯化自宿主细胞。 可用技术人员已知的常规核酸纯化方法获得纯化的多核 苷酸。该术语还包括重组多核苷酸和化学合成的多核苷酸。
     除此以外， 本发明的另一方面是包含本发明多核苷酸的质粒或载体的使用。优选 的， 所述质粒或载体是表达载体。 在一个具体的实施方案中， 所述载体是适用于人基因治疗 的转移载体。
     糖基化或其它翻译后修饰的程度和位置可随选定的宿主细胞和所述宿主细胞环 境特性而变化。当提及特定的氨基酸序列时， 所述序列的翻译后修饰也包含在本申请中。
     术语″重组″意指例如所述变体是通过遗传工程技术在宿主生物体内产生的。 本 发明的 FVIII 或 VWF 变体经常是重组变体。
     所推荐变体的表达 ：
     在合适的宿主细胞内高水平产生重组蛋白质需要将上述修饰的 cDNA 连同合适的 调控元件一起在重组表达载体中装配成有效的转录单元内， 所述表达载体可依照本领域技 术人员已知的方法在各种表达系统中增殖。有效的转录调控元件可来自以动物细胞作为 其天然宿主的病毒或来自动物细胞的染色体 DNA。优选的， 可使用来自猿猴病毒 (Simian Virus)40、 腺病毒、 BK 多形瘤病毒、 人巨细胞病毒或劳氏肉瘤病毒长末端重复片段的启动 子 - 增强子组合， 或者包括动物细胞中强组成型转录基因例如 β- 肌动蛋白或 GRP78 的启 动子 - 增强子组合。为了达到稳定的高水平的从 cDNAs 至 mRNA 的转录， 转录单元应在其 3’ - 近端部分包含编码转录终止聚腺苷酸化序列的 DNA 区。优选的， 此序列来自猿猴病毒 40(Simian Virus40) 早期转录区、 兔 β- 珠蛋白基因或人组织纤溶酶原激活剂基因。
     然后将 cDNAs 整合入适于本发明之白蛋白融合凝血因子表达的合适宿主细胞系 的基因组中。优选此细胞系应是脊椎动物来源的动物细胞系， 以保证正确的折叠、 Gla- 结 构域合成、 二硫键形成、 天冬酰胺连接糖基化、 O- 连接糖基化和其它翻译后修饰以及向培养 基的分泌。其它翻译后修饰的例子是新生多肽链的羟基化和蛋白水解加工。可使用的细胞 系的例子是猴 COS- 细胞、 小鼠 L- 细胞、 小鼠 C127- 细胞、 仓鼠 BHK-21 细胞、 人胚肾 293 细 胞和仓鼠 CHO- 细胞。
     可以若干不同方式将编码相应 cDNAs 的重组表达载体引入动物细胞系中。例如， 可从基于不同动物病毒的载体建立重组表达载体。 这其实例有基于杆状病毒、 牛痘病毒、 腺 病毒 ( 优选牛乳头瘤病毒 ) 的载体。还可将编码相应 DNAs 的转录单元与另一重组基因一起引入动物细胞中， 所述的 另一重组基因可在这些细胞中用作显性的选择标记以方便分离特异的细胞克隆， 它们已将 所述重组 DNA 整合入其基因组中。此类型的显性选择标记基因的例子是 Tn5 氨基糖苷磷酸 转移酶， 赋予抗遗传霉素 (geneticin)(G418) 的抗性 ； 潮霉素磷酸转移酶， 赋予抗潮霉素的 抗性 ； 以及嘌呤霉素乙酰转移酶， 赋予抗嘌呤霉素的抗性。 编码这种选择标记的重组表达载 体可以驻留于与编码预期蛋白质之 cDNA 相同的同一载体上， 或者它可编码于同时引入并 整合入宿主细胞基因组的分开的载体上， 在不同转录单元之间常常产生紧密的物理连锁。
     可与预期蛋白质之 cDNA 一起使用的其它类型选择标记基因是基于编码二氢叶酸 还原酶 (dhfr) 的各种转录单元。 将此类基因引入缺少内源 dhfr- 活性的细胞、 优选 CHO- 细 胞 (DUKX-B11， DG-44) 后， 它使它们能在缺少核苷的培养基中生长。所述培养基的例子是无 次黄嘌呤、 胸苷和甘氨酸的 Ham’ s F12。这些 dhfr- 基因可与凝血因子 cDNA 转录单元一起 引入以上类型的 CHO- 细胞中， 其或者连接于同一载体上或者位于不同载体上， 由此建立产 生重组蛋白质的 dhfr- 阳性细胞系。
     若在细胞毒性 dhfr- 抑制剂氨甲蝶呤存在下培养以上细胞系， 则将形成抗氨甲蝶 呤的新细胞系。由于被连接的 dhfr 和预期蛋白质的转录单元的扩增数量， 这些细胞系可以 增长速率产生重组蛋白质。当在浓度逐步增加的氨甲蝶呤 (1-10000nM) 中增殖这些细胞系 时， 可获得以很高速率产生预期蛋白质的新细胞系。 产生预期蛋白质的以上细胞系可大规模培养于悬浮培养物中或各种固体支持物 上。这些支持物的例子是基于葡聚糖或胶原蛋白基质的微载体， 或中空纤维形式或各种陶 瓷材料的固相支持物。当在细胞悬浮培养物中或微载体上生长时， 可作为分批培养物或灌 注培养物形式进行以上细胞系的培养， 在较长时期内连续生产条件培养基。 因此， 依照本发 明， 以上细胞系很适合于开发工业生产方法用于生产预期的重组蛋白质。
     所述重组蛋白质当积聚于以上类型的分泌细胞的培养基中时， 可通过多种生化和 层析方法进行浓缩和纯化， 包括利用预期蛋白质和细胞培养基中其它物质之间在大小、 电 荷、 疏水性、 溶解性、 特异亲和力等方面差异的方法。
     所述纯化的一个例子是使重组蛋白质吸附在固定于固相支持物上的单克隆抗体 上。吸附后， 用基于以上特性的各种层析技术进一步纯化所述蛋白质。
     优选将本发明之修饰的生物学活性白蛋白融合凝血因子纯化至大于或等于 80％ 的纯度， 更优选大于或等于 95％的纯度， 尤其优选的是相对于污染的大分子、 尤其是其它蛋 白质和核酸而言大于 99.9％纯的药用纯态， 并且没有感染剂和热源剂。 优选的， 本发明之分 离或纯化的改良生物学活性白蛋白融合凝血因子是基本上无其它多肽的， 除非在准备施用 与其它治疗蛋白质之组合的时候。
     本发明中所述的白蛋白融合凝血因子可配制入药物制剂中供治疗用途。 已纯化的 蛋白质可溶于常规的生理上相容的水性缓冲液中， 其中可任选的加入药用赋形剂以得到药 物制剂。
     这样的药用载体和赋形剂以及合适的药用剂型是本领域众所周知的 ( 参阅例如 “Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins” ， Frokjaer et al.， Taylor & Francis(2000) 或 “Handbook of Pharmaceutical excipients” ， 3rd edition， Kibbe et al.， Pharmaceutical Press(2000))。特别是， 包含本发明之多肽变体
     的药物组合物可配制成冻干的或稳定可溶的形式。 可通过本领域已知的多种程序将多肽变 体冻干。 在使用之前通过加入一种或多种药用可接受稀释剂诸如注射用无菌水或无菌生理 盐溶液使冻干的制剂重新溶解。
     通过任何药用合适的非静脉内施用方式将组合物制剂递送给个体。 有多种递送系 统是已知的并且可用于经由任何方便途径施加组合物。优选配制本发明组合物用于皮下， 肌肉内， 腹膜内， 脑内， 肺内， 鼻内或经皮肤给药， 最优选依常规方法用于皮下的、 肌肉内或 经皮肤给药。 所述剂型可通过输注或通过大剂量推注连续施加。 某些剂型包括慢释放系统。
     将本发明的白蛋白融合凝血因子以治疗有效剂量施用于患者， 意指足够产生预期 效果、 阻止或减轻待治疗疾病或指征之严重性或蔓延并且未到达产生无法忍受的不利副作 用的剂量。 确切剂量取决于许多因素， 诸如指征、 剂型、 施用方式， 并且必须在针对每一相应 指征的预临床和临床试验中确定。
     本发明的药物组合物可单独施用或与其它治疗制剂联合施用。 这些制剂可掺入作 为同一药物的一部分。
     图注
    图1： 300μg/kg rVIIa-FP 和 图2： 300μg/kg rVIIa-FP 和 图3： 610μg/kg rIX-FP 和 图4： 610μg/kg rIX-FP 和后 FVII ： Ag 血浆浓度的时间进程 ( 汇 后 FVII ： Ag 血浆浓度的时间进程 ( 汇 后 FIX ： Ag 血浆浓度的时间进程 ( 汇集 ； n 后 FIX ： Ag 血浆浓度的时间进程 ( 汇集 ； n集； n ＝ 3/ 时间点 ； 线性尺度 )
    集； n ＝ 3/ 时间点 ； 对数 - 线性尺度 )
    ＝ 5/ 时间点 ； 线性尺度 )
    ＝ 5/ 时间点 ； 对数 - 线性尺度 ) 实施例 实施例 1 ： 大鼠中皮下施加 rVIIa-FP 的生物利用度评估
     第一个实施例中概述的实验的目的是为了评估血管外注射是否可能是用 rVIIa-FP( 人 ) 进行改良治疗的一个选择。作为血管外治疗的典型代表而言选择皮下注
    射。为了比较 rVIIa-FP 与参比制剂的适合性， 进行表 2 中所详细设计的 后测定血浆水平的非临床药代动力学研究。在对大鼠单次静脉内 / 皮下注射等摩尔剂量的 rVIIa-FP( 如 WO 2007/090584 中第 30 至 31 页所述产生的 pFVII-937) 和 时间进程。对 而言剂量是 300μg/kg。rVIIa-FP 的剂量是基于根据 OD 测量值 (280-320nm) 所确定的蛋白质浓度。 在校正 FP 的白蛋白部分后， 施加了 300μg(FVIIa)/ kg 的剂量。此时， 两种产品均以就治疗有效组分 FVIIa 而言相同的剂量施加。选择大鼠作 为此研究的动物物种， 因为它代表了适于此类型研究的特征清楚且频繁使用的物种。大鼠 (CD 品系 ) 由 Charles River(Sulzfeld， Germany) 提供， 在实验期间称重约 200g。将大鼠 保持在标准的住房条件下。经短期麻醉， 从眼窝后吸取血液样品， 用柠檬酸钙抗凝得到 10 至 20％的柠檬酸盐血液， 加工成血浆并贮存于 -20℃待测定 FVII 血浆水平。取样时间点详 见表 2。 通过夹心 ELISA， 利用绵羊抗 -FVII IgG(Cedarlane/Biozol) 作为捕获抗体， 而 POD缀合的绵羊 -FVII IgG(Cedarlane/Biozol) 作为探测抗体， 测定人 FVII 的血浆浓度。用标 准的人血浆作为参照。rVIIa-FP 的发酵、 纯化和激活在其它地方有描述。
    静脉内注射 rVIIa-FP 产生的初始血浆水平相较于用相同剂量处理而言高大约 60 ％ ( 表 3， 图 1)。只针对用 rVIIa-FP 进行皮下处理的组， 在血浆中探测 到 FVII。注射后约 8 小时时观察到峰浓度并且在处理后 1 至 2 天再次达到基线。对于用 相同剂量
    进行皮下处理的组， 尽管以与 rVIIa-FP 相同之 FVIIa 剂量注射 但在整个观察期间血浆水平均保持在检测极限之下 ( 图 2)。表2： 处理组
    
    表3： FVII ： Ag 血浆水平的时间进程 ( 血浆集合 ； n ＝ 3/ 时间点 )
    以与 rFVIIa-FP 相同的剂量注射未发现血浆水平。因此令人惊奇的是发现用 rVIIa-FP 进行皮下处理产生了可很好探测到的 FVIIa 血浆水平， 在注射后相当 短的延滞期后 ( 约 8 小时 ) 观察到峰浓度， 然后是长时的持久的衰退， 即至少 1-2 天后。这 甚至比静脉内注射后 rVIIa-FP 的时间进程要持久。 预期 皮下施加 rVIIa-FP 的相对生物可利用度达到了约 10％， 而皮下注射 的约为 rVIIa-FP 之 后未探 50％的较低分子量将有助于其从皮下区室中再吸收。研究的结果证明出现了相反的情况。 测到血浆水平。
     为了判断就其再吸收或向循环运输而言 rVIIa-FP 是否特别有利， 比较 rVIIa-FP和 中造成的。与 外， rVIIa-FP 和的相对生物可利用度可能是不适当的， 因为皮下施加之 rVIIa-FP 的 AUC 相比较， 静脉内输注后的终末半寿期已延长了超过 6 倍。此 的消除特性可能有区别地受到它们从皮下空间向循环传可能由于它的长久终末半寿期而突出， 这是由于 rVIIa-FP 从皮下区室连续释放至循环送或扩散的影响。因此有关此论题的明确结论可能更可靠的是基于峰浓度的评估。对于 血浆浓度从未达到 25ng/mL 的探测极限， 然而对于所述融合蛋白而言， 在注 射后血浆浓度很快达到了约 140ng/mL。
     第一步， 假定其再吸收或向循环的传送是与 rVIIa-FP 完全相同的， 则有可能估 计用 处理后预期的血浆浓度为何。通过对静脉内注射时 rVIIa-FP 之 60％ 皮下处理后阻碍血浆中 FVII 观察的方法 实际上传送至血浆、 但却因为在所 的最佳情形 的较高恢复水平进行校正， 我们可预期最高血浆水平约为 90ng/mL。这明显高于探测极 限， 由此排除了潜在的可能在用 大体上有利于 假设。至于 关于 这是基于 学问题。第二步， 为了估计通过与白蛋白融合达到的最小利益， 我们可设想最佳案例情况 有时间点所达到的峰浓度均停留在刚刚最低限的低于 25ng/mL 探测水平而观察不到这一 可能存在于血浆中的持续时间， 关于 是假设与 rVIIa-FP 有完全相同的时间进程， 尽管它的终末半寿期短了大约 6 倍。得到的 的 AUDC 是 550h*ng/mL， 而关于 rVIIa-FP 的是大约 2200h*ng/mL。因 的情况下， 血管外注射后 rVIIa-FP 的体内回收比 高至少大约 4 倍。 实施例 2 ： 在 B 型血友病模型 (FIX ko 小鼠 ) 中皮下施加 rIX-FP 的生物可利用度 此结论是， 在高度有利于
    的评估 为了评估血管外注射是否可能是用 rIX-FP( 人 ) 进行改良治疗的选项， 选择血管 外治疗的典型代表 - 皮下注射。检验所述实例的非临床药代动力学研究的设计详见表 4。 在对 B 型血友病模型单次静脉内 / 皮下注射 610IU/kg 或 rIX-FP 后测定血浆水 平的时间进程。依照 WO2007/144173 如实施例 1 至 3 中所述产生 rIX-FP(pFIX-1088)。用 FIX ： 凝结活性的相同剂量处理相应的组。用体重约 25g 的 FIX 敲除 (ko) 小鼠作为 B 型血 友病模型。 这些小鼠缺少 FIX 基因的启动子区域， 因此不表达 FIX(Lin et.al.1997， Blood， 90， 3962-3966)。这可以通过对被敲除小鼠血浆中 FIX 活性即功能活性蛋白质进行定量来 分析处理后的 FIX 水平。经短期麻醉， 从眼窝后吸取血液样品， 用柠檬酸钙抗凝得到 10 至 20％的柠檬酸盐血液， 加工成血浆并贮存于 -20℃用于测定 FIX 血浆水平。 取样时间点详见 表 5。通过标准的基于 aPTT 的方法 ( 贝林凝血计时器 ) 进行血浆中 FIX 活性的定量。将动 物在标准的住房条件下饲养。
    对 FIX ko 小鼠皮下注射 610U/kg 导致血浆水平中 FIX 活性相较于静 脉内注射所达到的血浆水平有小的增加 ( 图 3)。皮下施加后的生物可利用度是大约 25％。 皮下注射后， 持续约 1-2 天可探测到 FIX。有关 rFIX-FP 的结果则在若干方面明显不同 ：
     1) 皮下注射 rFIX-FP 后的峰浓度是对于 Berinin 未融合的野生型 FIX 所观察到的 约 2 倍高。
     2)rFIX-FP 皮下施用后的生物可利用度是有关 Berinin 所观察到的大约 2 倍高
     (25％对 45％ )。
     3) 与 Berinin 相反， 在后期， 通过皮下 rFIX-FP 达到的血浆水平甚至超过了通过静 脉内 rFIX-FP 所达到的血浆水平。
     这些结果合起来证明了血管外注射对于用 rIX-FP 进行的改良治疗而言是有价值 的选择。 较高峰浓度展现了不仅针对预防性的还甚至可能在出血事件中急性替代治疗的可 能性。较高的生物可利用度使得可以应用较低的剂量和注射体积， 提高成本效率并改善针 对患者而言的耐受性和安全性。 最后， 在预防性背景下， 皮下施用甚至可以延长处理的时间 间隔， 因为达到波谷水平的时间点比静脉内注射后的要晚。
     表4： 处理组
    
    表5： 静脉内 / 皮下施加 610IU/kg rIX-FP 和后 FIX ： 凝结血浆水平的时间进程 ( 平均 ±SD， n ＝ 5/ 时间点 )实施例 3 ： 在 A 型血友病模型 (FVIII ko 小鼠 ) 中皮下施加 rVIII-FP 的生物可利 用度的评估
     为了评估血管外注射是否可能是用 rVIII-FP( 人 ) 进行改良治疗的一个选择， 选 用血管外治疗的典型代表 - 皮下注射。所进行的可能性非临床药代动力学研究的设计详见
     表 7。在对 A 型血友病模型单次静脉内 / 皮下注射 ReFacto 或 rFVIII-FP 后测定血浆水平 的时间进程。用 FVIII ： 凝结活性的相同剂量处理相应的组。用体重约 25g 的 FVIII 敲除 (ko) 小鼠作为 A 型血友病模型。这些小鼠缺少外显子 16 和 17， 因此不表达 FVIII(Bi L.et al， Nature genetics， 1995， Vol 10(1)， 119-121 ； Bi L.et al， Blood， 1996， Vol 88(9)， 3446-3450)。这可以通过对被敲除小鼠血浆中 FVIII 活性进行定量来分析处理后的 FVIII 水平。处理细节的可能概要见表 8。经短期麻醉， 从眼窝后吸取血液样品， 用柠檬酸钙抗凝 得到 10 至 20％的柠檬酸盐血液， 加工成血浆并贮存于 -20℃用于测定 FVIII 血浆水平。有 关取样时间点的可能概述详见表 7。通过标准的基于 aPTT 的方法 ( 贝林凝血计时器 ) 进行 血浆中 FVIII 活性的定量。将动物在标准的住房条件下饲养。
     对 FVIII ko 小鼠皮下注射 200U/kg ReFacto 导致血浆水平中 FVIII 活性相较于 静脉内注射所预期的血浆水平有小的增加。比较用 rVIII-FP( 人 ) 进行的相应处理 ( 组 2 和 4)， 得到的结果用于评估血管外注射是否是适于用 rVIII-FP 进行改良治疗的一个选择。
     表6： 处理组
    表7： FVIII ： 凝结血浆水平之时间进程测定的可能概要 ( 平均值 ±SD， n ＝ 3-5/时间点 )
    实施例 4 ： 在 VWD 或 A 型血友病模型 (VWF 或 FVIII ko 小鼠 ) 中皮下施加 rVWF-FP的生物可利用度的评估
     为了评估血管外注射是否可能是用 rVWF-FP( 人 ) 进行改良治疗的一个选择， 选用 血管外治疗的典型代表 - 皮下注射。所进行的非临床药代动力学研究的可能性设计详见表 10。如此表所详述的对组 1、 2 和 4 至 6 进行处理， 若合适的话则注射其它剂量的 VWF ： Ag。 在对 A 型血友病或 von Willebrand 病 (VWD) 模型动物单次静脉内 / 皮下注射 P、 rVWF-FP 或 VWF 的糖基化突变体后测定血浆水平的时间进程。 用相同剂量的 VWF ： Ag 处理 相应的组。用体重约 25g 的 FVIII 敲除 (ko) 小鼠作为 A 型血友病模型。这些小鼠缺少外 显子 16 和 17， 因此不表达 FVIII(BiL.et al， Nature genetics， 1995， Vol 10(1)， 119-121 ； Bi L.et al， Blood， 1996， Vol 88(9)， 3446-3450)。用体重约 25g 的 VWF 敲除 (ko) 小鼠作 为 VWF 模型。这些小鼠缺少 VWF 基因的外显子 4 和 5 并因此不表达 VWF(Denis C.et al， Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 1998， Vol 95， 9524-9529)。
     处理细节见表 6。 经短期麻醉， 从眼窝后吸取血液样品， 用柠檬酸钙抗凝得到 10 至 20％的柠檬酸盐血液， 加工成血浆并贮存于 -20℃用于测定 FVIII 活性。 取样时间点详见表 7。用市售 ELISA 检测试剂盒 Ag 的定量。将动物在标准的住房条件下饲养。
    Diagnostica Stago) 进行血浆中人 VWF ： P 导致血浆中人 VWF ： Ag对小鼠皮下注射约 1400U/kg VWF ： Ag U/kg相较于静脉内注射后所预期的血浆水平有所增加。比较用 rVWF-FP( 人 ) 进行的相应处理 ( 组 2 和 5)， 以及用 VWF 糖基化突变体进行的相应处理 ( 组 3 和 6)， 得到的结果用于评估血 管外注射是否是适于用 rVWF-FP 和 VWF 糖基化突变体进行改良治疗的一个选择。
     表8： 可能的处理组
    表9： 对 FVIII ko 小鼠单次皮下注射 500U/kg FVIII ： C 的不同 VWFP制剂后 VWF ： Ag 血浆水平测定 ( 正常的％ ) 的可能概要 ( 平均值 ±SD ； n ＝ 5， 对于每一时 间点 )
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