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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201410177248.5 (22)申请日 2014.04.29 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 103933619 A (43)申请公布日 2014.07.23 (73)专利权人 深圳清华大学研究院 地址 518057 广东省深圳市高新技术工业 村高新南七道 (72)发明人 敖强 刘伟强 王臻 (74)专利代理机构 北京德琦知识产权代理有限 公司 11018 代理人 孔丽君 王珍仙 (51)Int.Cl. A61L 31/04(2006.01) A61L 31。
2、/16(2006.01) A61K 38/19(2006.01) A61K 47/42(2006.01) A61K 47/36(2006.01) A61K 47/04(2006.01) A61P 25/00(2006.01) (56)对比文件 CN 102120033 A,2011.07.13,说明书具体 实施方式. CN 1546182 A,2004.11.17,说明书具体实 施实例. 审查员 张凌 (54)发明名称 神经修复材料及其制备方法 (57)摘要 本申请公开了一种神经修复材料及其制备 方法， 所述神经修复材料包括： 能够促进神经生 长的细胞因子的组合， 以及所述细胞因子的控释 载体。
3、， 其中所述载体主要由纤维蛋白原、 纤粘连 蛋白、 肝素、 纤维蛋白稳定因子、 凝血酶和氯化钙 形成， 所述能够促进神经生长的细胞因子的组合 优选选自神经生长因子、 脑源性神经营养因子、 碱性成纤维细胞生长因子和血管内皮细胞生长 因子中的至少两种， 所述能够促进神经生长的细 胞因子的组合包埋于所述载体中。 本发明的神经 修复材料利用控释载体的 “智能释放” ， 根据神经 修复的进程调节释放细胞因子的速度， 从而循序 渐进地发挥细胞因子的功能； 同时利用细胞因子 的协同作用， 进一步促进神经的修复。 权利要求书2页 说明书8页 附图6页 CN 103933619 B 2017.02.15 CN 。
4、103933619 B 1.一种神经修复材料， 包括： 能够促进神经生长的细胞因子的组合， 以及所述细胞因子的控释载体， 其中所述载体主要由纤维蛋白原、 纤粘连蛋白、 肝素、 纤维蛋白稳定因子、 凝血酶和氯 化钙形成， 其中所述纤维蛋白原和所述纤粘连蛋白溶液在所述凝血酶和所述纤维蛋白稳定 因子的作用下形成彼此共价交联的凝胶体系， 在同一反应体系中所述能够促进神经生长的 细胞因子与所述肝素结合， 而所述肝素连接到所述凝胶体系， 从而使得所述能够促进神经 生长的细胞因子牢固地包埋在所述凝胶体系中， 形成缓释系统， 所述能够促进神经生长的细胞因子的组合包埋于所述载体中， 其中所述载体和所述能够促进神。
5、经生长的细胞因子的组合预装于壳聚糖形成的神经 修复导管内部。 2.如权利要求1所述的神经修复材料， 其中所述载体和所述能够促进神经生长的细胞 因子的组合预装于壳聚糖形成的神经修复导管内部， 并进一步制成多通道神经修复导管。 3.如权利要求1所述的神经修复材料， 其中所述能够促进神经生长的细胞因子的组合 选自神经生长因子、 脑源性神经营养因子、 碱性成纤维细胞生长因子和血管内皮细胞生长 因子中的至少两种。 4.如权利要求3所述的神经修复材料， 其中所述能够促进神经生长的细胞因子的组合 为神经生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的组合。 5.如权利要求1所述的神经修复材料， 其中所述载体中纤粘连蛋白与。
6、肝素的摩尔比在 1:1至10:1范围内。 6.如权利要求1所述的神经修复材料， 其中所述纤维蛋白原在所述载体中的含量为 90wt以上。 7.如权利要求1所述的神经修复材料， 其中所述纤维蛋白稳定因子与纤维蛋白原的比 例关系为： 每1mg纤维蛋白原对应0.3IU至1.2IU的纤维蛋白稳定因子。 8.一种制备如权利要求1至7中任一项所述的神经修复材料的方法， 包括如下步骤： (1)将能够促进神经生长的细胞因子的组合作为组分I， 配制含有纤维蛋白原、 纤粘连 蛋白、 肝素和纤维蛋白稳定因子的溶液作为组分II； (2)配制含有凝血酶和氯化钙的溶液作为组分III； (3)将组分II加入组分I， 以溶解组。
7、分I； 和 (4)将组分III加入组分II和I的混合溶液， 以形成神经修复因子缓释系统。 9.如权利要求8所述的方法， 进一步包括步骤： (5)将所述神经修复因子缓释系统注入 神经修复导管中。 10.如权利要求8所述的方法， 其中所述能够促进神经生长的细胞因子的组合选自神经 生长因子、 脑源性神经营养因子、 碱性成纤维细胞生长因子、 血管内皮细胞生长因子中的至 少两种。 11.如权利要求8所述的方法， 其中所述步骤(1)中的纤维蛋白原在组分II中的浓度为 4mg/ml至120mg/ml。 12.如权利要求8所述的方法， 其中所述步骤(2)中的凝血酶在组分III中的浓度为40至 800IU/ml。
8、， 所述氯化钙在组分III中的浓度为35至45 mol/ml。 13.如权利要求8所述的方法， 其中所述组分II和组分III的pH值为6.8至8。 权 利 要 求 书 1/2 页 2 CN 103933619 B 2 14.如权利要求8所述的方法， 其中所述步骤(3)中将组分II加入组分I之后， 在33至 37水浴中放置15至30分钟。 15.如权利要求8所述的方法， 其中所述步骤(4)中将组分III加入到组分II和I的混合 溶液之后， 放入37的温箱孵育0.5至1小时。 权 利 要 求 书 2/2 页 3 CN 103933619 B 3 神经修复材料及其制备方法 技术领域 0001 本申请。
9、涉及一种神经修复材料， 特别涉及一种利用多种能够促进神经生长的细胞 因子的协同作用和缓释系统的高效神经修复材料。 背景技术 0002 我国每年因各种创伤或外科手术(如肿瘤切除)而导致的周围神经损伤的病人超 过100万人。 这些病人如得不到及时有效的修复治疗， 将造成相关部位神经功能的永久性丧 失。 神经损伤时神经间隙处增生的瘢痕组织是外周神经自我修复的主要障碍。 间隙较大的 外周神经损伤， 需要用自体神经移植进行修复； 但自体神经移植存在诸多缺点， 如供区神经 障碍、 供区神经瘤形成、 供区神经有限、 供区神经与受区神经难以匹配， 等等。 因此， 寻找和 研制促进周围神经损伤后再生的桥梁系统是。
10、全世界医学界普遍关注并投入巨资广泛研究 的重大难题。 0003 目前有关神经再生的理论主要归纳为以下三点： 神经营养理论， 也就是神经远 段雪旺细胞分泌营养因子诱导轴突再生， 这个理论虽然已经被许多实验所证实， 然而似乎 难以解释有些实验现象。 例如在神经缺损间隙有微小增加的情况下神经轴突通过率大幅度 下降， 因为距离微小的增加不会引起营养因子浓度的急剧下降， 因而不足以解释神经轴突 通过率的骤降。 而且， 导管促进神经再生的能力却由于加入有方向性基质材料而增加(参见 )， 这也是神经营养理论不能解释的。 接触引导理论认为， 轴突的延伸需要接触合适的 基质， 有方向性的导管内基质构型可以促进成。
11、纤维细胞和雪旺细胞增殖、 迁移， 进而引导轴 突延伸。 基膜管理论认为， 周围神经节段缺损后成纤维细胞首先增殖迁移到神经缺损间 隙， 形成纤维缆连接两神经断端； 雪旺细胞随后沿着纤维缆形成柱状基膜管， 大约直径10- 20微米。 轴突延伸长入基膜管后形成髓鞘。 因此， 利于雪旺细胞轴向迁移的导管构型有助于 引导有髓神经纤维生长。 0004 目前虽然对各种神经生长或营养因子有诸多研究， 但是这种神经生长或营养因子 的实际应用却始终存在一个 “瓶颈” 问题： 小分子在体内快速降解， 使得很多神经生长或营 养因子还没来得及发挥作用就已经降解或失活， 从而大大降低了其有效性。 此外， 神经修复 机制复。
12、杂， 神经损伤后的微环境对神经修复的影响多样， 因此虽有多种学说， 目前尚无能够 完整解释整个修复过程的理论， 除自体移植之外， 也没有很好的神经再生修复手段， 而自体 移植显然存在着供体严重不足的缺陷， 其应用存在种种限制。 由于以上种种原因， 对于神经 修复的手段和神经修复材料， 仍然存在迫切的需求。 发明内容 0005 本发明的目的是提供一种能够有效利用能够促进神经生长的细胞因子的神经修 复材料， 并且通过利用细胞因子间的协同作用， 使其促进神经生长的效果最大化， 从而达到 修复神经损伤的目的。 0006 本发明提供了一种神经修复材料， 包括： 能够促进神经生长的细胞因子的组合， 以 说。
13、 明 书 1/8 页 4 CN 103933619 B 4 及所述细胞因子的控释载体， 其中所述载体主要由纤维蛋白原、 纤粘连蛋白、 肝素、 纤维蛋 白稳定因子、 凝血酶和氯化钙形成， 所述能够促进神经生长的细胞因子的组合优选选自神 经生长因子、 脑源性神经营养因子、 碱性成纤维细胞生长因子和血管内皮细胞生长因子中 的至少两种， 所述能够促进神经生长的细胞因子的组合包埋于所述载体中。 本发明的神经 修复材料利用控释载体的 “智能释放” ， 根据神经修复的进程调节释放细胞因子的速度， 从 而循序渐进地发挥细胞因子的功能； 同时利用细胞因子的协同作用， 进一步促进神经的修 复。 0007 神经生长。
14、因子、 脑源性神经营养因子、 碱性成纤维细胞生长因子和血管内皮生长 因子分别作用于不同神经修复相关细胞， 例如神经生长因子(NGF)主要促进感觉神经元存 活和轴突生长， 脑源性神经营养因子(BDNF)主要支持运动神经元存活和轴突生长， 碱性成 纤维细胞生长因子(bFGF)增强轴突再生和血管生成， 血管内皮生长因子促进血管内皮的生 长和新血管的生成。 本发明利用了各细胞因子分别对各种神经细胞的生长促进或营养作 用， 从而产生了优于单种细胞修复之和的协同作用效果。 0008 本发明所 用载体系统曾 用于骨生长因子的 控释 ， 参见发明人早期专利 CN200810065863.1。 众所周知， 骨组。
15、织与神经组织有着截然不同的组织结构、 微环境和修复 机制。 然而原本用于模拟骨组织修复早期的临时基质的载体系统， 在本发明的神经修复中 也得到了意料不到的技术效果， 发明人分析其原理为： 缓释各种神经因子， 从而延长了神经 因子发挥功能的时间， 并促进了神经修复的进行。 0009 在一个优选的实施方式中， 其中所述能够促进神经生长的细胞因子的组合包括神 经生长因子和碱性成纤维细胞生长因子。 0010 在一个优选实施方式中， 所述载体中纤粘连蛋白与肝素的摩尔比在1:1至10:1范 围内。 在此范围内， 能够达到更优的保护细胞因子的作用。 0011 在一个优选实施方式中， 所述纤维蛋白原在所述载体。
16、中的含量为90wt以上。 此 条件下的载体更加稳定。 0012 在一个优选实施方式中， 所述神经修复材料中所述纤维蛋白稳定因子与纤维蛋白 原的比例关系为： 每1mg纤维蛋白原对应0.3IU至1.2IU的纤维蛋白稳定因子。 0013 在一个优选的实施方式中， 所述载体和所述能够促进神经生长的细胞因子的组合 预装于神经导管的内部， 以便于固定其在组织中的位置， 增强其修复作用的导向性、 靶向性 和针对性， 并进一步避免细胞因子在组织中的流失和浪费。 所述神经导管可以是天然材料 或人工材料制成， 例如壳聚糖、 聚乳酸、 PLGA、 明胶、 胶原等或其组合。 所述神经导管可以是 编织管、 多通道管等各。
17、种组成结构， 优选多通道神经修复导管。 最优选将所述载体和所述能 够促进神经生长的细胞因子的组合预装于所述神经导管的内部之后， 再进一步制备成多通 道神经修复导管。 也就是说， 所述载体和所述能够促进神经生长的细胞因子的组合本身也 通过冻干形成了多通道的形式。 0014 在一个优选实施方式中， 所述多通道神经修复导管由多种天然与人工材料管壁和 具有轴向多通道的生物可降解填充基质组成。 所述生物可降解填充基质包括纤维蛋白原、 纤粘连蛋白、 肝素、 纤维蛋白稳定因子、 凝血酶和氯化钙， 以及上述能够促进神经生长的细 胞因子的组合。 0015 本发明还提供了一种制备上述神经修复材料的方法， 包括如下。
18、步骤： 说 明 书 2/8 页 5 CN 103933619 B 5 0016 (1)将上述能够促进神经生长的细胞因子的组合作为组分I， 配制含有纤维蛋白 原、 纤粘连蛋白、 肝素和纤维蛋白稳定因子的溶液作为组分II， 其中所述能够促进神经生长 的细胞因子的组合优选选自神经生长因子、 脑源性神经营养因子、 碱性成纤维细胞生长因 子、 血管内皮细胞生长因子中的至少两种； 0017 (2)配制含有凝血酶和氯化钙的溶液作为组分III； 0018 (3)将组分II加入组分I， 以溶解组分I； 和 0019 (4)将组分III加入组分II和I的混合溶液， 以形成神经修复因子缓释系统， 0020 优选地，。
19、 进一步包括步骤： 0021 (5)将所述神经修复因子缓释系统注入多通道神经修复导管的通道中。 0022 在一个优选的实施方式中， 其中所述步骤(1)中的纤维蛋白原在组分II中的浓度 可为4mg/ml至120mg/ml。 所述步骤(2)中的凝血酶在组分III中的浓度可为40-800IU/ml， 所 述氯化钙在组分III中的浓度可为35-45 mol/ml。 所述组分II和组分III的pH值优选为6.8 至8。 0023 在一个优选实施方式中， 在所述步骤(3)中将组分II加入组分I之后， 可在33至 37水浴中放置15至30分钟。 所述步骤(4)中将组分III加入到组分II和I的混合溶液之后，。
20、 放入37温箱孵育0.5至1小时。 0024 本发明的神经修复材料除了利用了细胞因子之间的协同作用之外， 还利用了仿生 学的载体缓释系统， 即纤维蛋白原和纤粘连蛋白溶液在凝血酶和纤维蛋白稳定因子的作用 下形成彼此共价交联的凝胶体系； 在同一反应体系中能够促进神经生长的细胞因子与肝素 结合， 而肝素因与纤粘连蛋白具有高亲和力而连接到该凝胶体系， 从而使得能够促进神经 生长的细胞因子能够牢固地包埋在凝胶基质中， 形成缓释系统。 fXIII因子作为纤维蛋白稳 定因子是形成所述凝胶基质所必需的， 肝素不但把能够促进神经生长的细胞因子组合包埋 在凝胶基质结构中， 还保护其免受抑制和降解， 提升其生物学活。
21、性。 0025 本发明的神经修复材料具有如下技术效果： 1、 能够通过主要由细胞介导的材料降 解而产生主动缓释； 2、 其缓释特征为微量、 高效、 平稳， 无初始爆发性释放， 仅需较少量能够 促进神经生长的细胞因子组合， 就可以维持有效长期释放， 从而长期发挥作用； 3、 肝素有保 护各种能够促进神经生长的细胞因子的作用， 阻止其灭活， 有效提高其生物活性； 4、 能够根 据修复的过程 “智能” 释放： 酸性环境中， 能够促进神经生长的细胞因子组合以较高速率释 放； 在中性和碱性环境下， 释放速度降低， 这与损伤阻止修复过程的pH变化匹配： 早期初损 伤时， 损伤部位的pH值较低， 随着组织修。
22、复的进行， pH值逐渐恢复到正常的生理值， 能够促 进神经生长的细胞因子组合的释放速率会随着损伤修复的进行而由快到慢， 以适应损伤后 不同时期神经再生的需要； 5、 释放速率可以通过改变缓释系统载体的构成参数进行调节， 以满足不同移植位点的需要； 6、 神经损伤初期的修复很重要， 因此越快完成修复对于预后 越好， 本发明由于结合了多通道神经修复导管， 可以制备成成品出售， 不需临床应用时现场 制备， 节省了时间， 从而改善了修复效果， 增加了良好预后的几率。 附图说明 0026 图1为根据本发明一个实施方式的神经修复材料的成分构成示意图； 0027 图2为根据本发明示例性实施方式的三种构型外壁。
23、的壳聚糖神经导管的扫描电镜 说 明 书 3/8 页 6 CN 103933619 B 6 照片(A至C)和光学照片(D至F)， 其中A和D为旋转蒸发法制备的壳聚糖神经导管， B和E为冷 冻干燥法制备的壳聚糖神经导管； C和F为编织法制备的壳聚糖神经导管； 0028 图3为根据本发明一个实施方式的一种多通道神经导管结构示意图； 0029 图4为用模具制备的不同形状的生长因子控释凝胶块； 0030 图5为用壳聚糖材料制备的神经导管(A)和其中装有本发明所述载体和所述能够 促进神经生长的细胞因子的组合的控释体系的神经导管(B)； 0031 图6为用ELISA方法检测生长因子(bFGF， NGF)体内。
24、释放曲线。 FG： 纤维蛋白胶； Fn： 纤粘连蛋白； Hep： 肝素； bFGF： 碱性成纤维细胞生长因子； NGF： 神经生长因子； 0032 图7为用ELISA方法检测生长因子(bFGF， NGF)体外释放曲线。 FG： 纤维蛋白胶； Fn： 纤粘连蛋白； Hep： 肝素； bFGF： 碱性成纤维细胞生长因子； NGF： 神经生长因子。 0033 图8为术后8周神经吻合口中段神经冰冻切片NF200和S100免疫荧光观察(200)。 其中图a、 b、 c分别为A组、 B组、 C组染色结果， 图d为正常大鼠坐骨神经染色； 原照片中绿色为 NF-200， 红色为S100， 因专利法要求将图片转。
25、为灰度之后， 浅色为NF-200， 深色为S100； 0034 图9为术后8周各组标本神经吻合口中段新生神经纤维髓鞘观察(甲苯胺蓝染色 200)； 0035 图10为术后8周各组标本神经吻合口中段新生神经纤维透射电镜观察神经， 其中 图a、 b、 c分别为A组、 B组、 C组， 图d为正常神经(20000)。 具体实施方式 0036 在本发明中， 发明人将具有协同作用机制的能够促进神经生长细胞因子组合， 如 神经生长因子(NGF， 主要促进感觉神经元存活和轴突生长)、 脑源性神经营养因子(BDNF， 主 要支持运动神经元存活和轴突生长)、 碱性成纤维细胞生长因子(bFGF， 增强轴突再生和血 。
26、管生成)和血管内皮生长因子利用控释载体系统制备成控释体系。 载体系统所用控释基质 材料主要为纤维蛋白原(FG)、 纤粘连蛋白(FN)、 硫酸肝素(HS)等， 三者在组织修复起始过程 中起着重要作用(参见图1)。 发明人分析其原理可能在于： 纤维蛋白原和纤粘连蛋白之间形 成牢固的共价键， 不易被组织液的pH所影响； 而纤粘连蛋白和肝素之间、 以及肝素和因子 (bFGF)之间是由氢键连接， 所以适于在损伤区随着pH的变化， 而调解因子的释放速度， 即根 据修复的过程 “智能” 释放： 酸性环境中， 能够促进神经生长的细胞因子组合以较高速率释 放； 在中性和碱性环境下， 释放速度降低， 这与损伤阻止。
27、修复过程的pH变化匹配： 早期初损 伤时， 损伤部位的pH值较低， 随着组织修复的进行， pH值逐渐恢复到正常的生理值， 能够促 进神经生长的细胞因子组合的释放速率会随着损伤修复的进行而由快到慢， 以适应损伤后 不同时期神经再生的需要。 0037 在控释载体中， 进一步包括凝血酶和纤维蛋白稳定因子例如XIII因子(fXIII)。 发 明人分析其原理可能在于， 组织损伤后凝血酶裂解纤维蛋白原， 形成纤维蛋白单体， 单体聚 合形成凝胶网络。 同时还裂解XIII因子， 产生活化的XIII因子。 活化的XIII因子催化纤维蛋 白单体间以及纤维蛋白单体和FN间发生共价交联。 FN广泛地介导细胞与细胞外基。
28、质的相互 作用， 在细胞黏附、 迁移、 生长和分化中起重要作用。 它除了通过整合素结合到细胞表面外， 还结合肝素和纤维蛋白。 肝素可以结合和调节许多蛋白的活动， 例如FN、 bFGF、 BDNF和NGF 等。 说 明 书 4/8 页 7 CN 103933619 B 7 0038 在一个优选实施方式中， 所述能够促进神经生长的细胞因子的组合选自神经生长 因子、 脑源性神经营养因子、 碱性成纤维细胞生长因子和血管内皮细胞生长因子中的至少 两种， 所述能够促进神经生长的细胞因子的组合包埋于所述载体中。 神经生长因子、 脑源性 神经营养因子、 碱性成纤维细胞生长因子和血管内皮生长因子分别作用于不同神。
29、经修复相 关细胞， 例如神经生长因子(NGF)主要促进感觉神经元存活和轴突生长， 脑源性神经营养因 子(BDNF)主要支持运动神经元存活和轴突生长， 碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)增强轴突 再生和血管生成， 血管内皮生长因子促进血管内皮的生长和新血管的生成。 在本发明中， 具 有不同功能的细胞因子协同作用， 起到了优于单独细胞因子之和的修复效果。 0039 在一个优选的实施方式中， 所述能够促进神经生长的细胞因子组合包括神经生长 因子和碱性成纤维细胞生长因子。 0040 在一个优选实施方式中， 将此能够促进神经生长的细胞因子组合控释凝胶体系注 入壳聚糖导管内， 模拟正常神经的束膜管和基膜管。
30、结构， 壳聚糖导管的结构及制备参见图 2， 其中A和D为旋转蒸发法制备的壳聚糖神经导管， B和E为冷冻干燥法制备的壳聚糖神经导 管； C和F为编织法制备的壳聚糖神经导管。 在进一步优选的实施方式中， 采用新型模具和热 致相分离技术， 在该含有该控释凝胶体系的壳聚糖导管内部制备出具有智能型生物活性仿 生微结构的神经组织工程修复导管， 例如具有多通道结构的导管， 其结构示意图参见图3。 导管内的生物活性因子 “智能” 型释放主要体现在： 在酸性环境中， 活性因子以较高的速率 释放； 在中性和碱性的环境下， 释放速度较低。 由于损伤组织pH值降低， 随着组织的修复pH 值逐渐恢复到正常的生理值， 活。
31、性因子的释放速率就会由快到慢， 以适应损伤后不同时期 神经再生的需要。 通过对壳聚糖材料分子量和脱乙酰度的调节可得到不同的降解速度和力 学强度， 适合不同类型神经损伤修复的需要。 用此智能生物活性仿生微结构神经修复导管 桥接神经缺损断端， 导管内部定向微结构引导雪旺细胞和轴突延伸， 导管外壁阻挡纤维结 缔组织侵入， 内部基质中多种生物活性因子 “智能” 型释放， 为周围神经再生提供理想的微 环境， 有望改善较长距离周围神经缺损的修复效果。 0041 在一个优选的实施方式中， 促进神经生长的细胞因子缓释系统可预装于各种天然 或人工材料神经导管内部， 然后通过模具和冷冻干燥法进一步可以制成多通道神。
32、经修复导 管， 其结构示意图参见图3。 多通道结构对于神经的再生可以起到导向和支撑等作用， 进一 步促进了神经的修复。 0042 根据需要， 上述能够促进神经生长的细胞因子的组合的控释体系凝胶可以制备成 各种所需的形状， 参见图4。 所述需要可以是损伤大小、 位置等参数。 0043 在本发明中， 对于上述能够促进神经生长的细胞因子的组合的控释体系凝胶来 说， 更加优选的方式是装入导管中。 除了在组织中的支撑作用和定型外， 装入导管中还有一 个优点是能够制备成成品， 方便其在临床中的应用， 节省了手术的时间。 对于寸秒寸金的神 经外科手术来说， 节省时间就增加了修复成功的几率， 大大优于需要手术。
33、时现用现配的复 杂材料。 参见图5， 其中列出了用壳聚糖材料制备的神经修复导管中装入本发明的细胞因子 组合缓释体系成品的照片。 0044 用壳聚糖材料制备的神经导管外壁降解时间达到了国家标准要求的1-1.5年(A)， 本发明的纤维蛋白原、 纤粘连蛋白以及硫酸肝素等材料构成的控释体系降解时间为4-8周 (B)， 因此壳聚糖导管足以在释放完成之前保护凝胶不受周围组织的压迫， 以避免外力的破 说 明 书 5/8 页 8 CN 103933619 B 8 坏。 0045 下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明， 应理解的是， 下述实施例仅为 示例性实施例， 不用于限定本发明要求保护的范围。 004。
34、6 实施例1 0047 神经生长因子/碱性成纤维细胞生长因子/载体缓释系统的制备 0048 (1)将神经生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的组合作为组分I， 配制含有纤维 蛋白原、 纤粘连蛋白、 肝素和纤维蛋白稳定因子的溶液作为组分II； 0049 (2)配制含有凝血酶和氯化钙的溶液作为组分III； 0050 (3)将组分II加入组分I， 以溶解组分I； 0051 (4)将组分III加入组分II和I的混合溶液， 以形成神经生长因子/碱性成纤维细胞 生长因子/载体缓释系统 0052 (5)上述步骤(1)中的纤维蛋白原在组分II中的浓度可为4mg/ml。 所述步骤(2)中 的凝血酶在组分III中的浓。
35、度可为40IU/ml， 所述氯化钙在组分III中的浓度可为35 mol/ ml。 所述组分II和组分III的pH值优选为6.8。 0053 (6)在上述步骤(3)中将组分II加入组分I之后， 可在33水浴中放置30分钟。 所述 步骤(4)中将组分III加入到组分II和I的混合溶液之后， 放入培养箱(37温箱)孵育0.5小 时。 神经生长因子在最终体系中浓度为1 g/ml， 碱性成纤维细胞生长因子在最终体系中浓 度为50ng/ml。 0054 实施例2 0055 包含神经生长因子/血管内皮细胞生长因子/载体缓释系统的多通道神经修复导 管的制备 0056 (1)将神经生长因子和血管内皮细胞生长因子。
36、的组合作为组分I， 配制含有纤维蛋 白原、 纤粘连蛋白、 肝素和纤维蛋白稳定因子的溶液作为组分II； 0057 (2)配制含有凝血酶和氯化钙的溶液作为组分III； 0058 (3)将组分II加入组分I， 以溶解组分I； 0059 (4)将组分III加入组分II和I的混合溶液， 以形成神经生长因子/血管内皮细胞生 长因子/载体缓释系统； 0060 (5)将所述神经生长因子/血管内皮细胞生长因子/载体缓释系统注入壳聚糖神经 导管中， 用模具和冷冻干燥技术制备成多通道神经导管； 0061 (6)上述步骤(1)中的纤维蛋白原在组分II中的浓度可为120mg/ml。 所述步骤(2) 中的凝血酶在组分II。
37、I中的浓度可为800IU/ml， 所述氯化钙在组分III中的浓度可为45 mol/ml。 所述组分II和组分III的pH值优选为8。 0062 (7)在上述步骤(3)中将组分II加入组分I之后， 可在37水浴中放置15分钟。 所述 步骤(4)中将组分III加入到组分II和I的混合溶液之后， 放入培养箱(37温箱)孵育1小 时。 神经生长因子在最终体系中浓度为1 g/ml， 血管内皮细胞生长因子在最终体系中浓度 为100ng/ml。 0063 评价例1 0064 体内、 体外缓释曲线及其分析 0065 分别在体内和体外条件下检测本发明的细胞因子控释凝胶体系中细胞因子的释 说 明 书 6/8 页 。
38、9 CN 103933619 B 9 放曲线， 结果见图6和图7。 0066 图6为用ELISA方法检测生长因子(bFGF， NGF)体内释放曲线。 FG： 纤维蛋白胶； Fn： 纤粘连蛋白； Hep： 肝素； bFGF： 碱性成纤维细胞生长因子； NGF： 神经生长因子。 由图6可见， 生 长因子缓释系统FG/Fn/Hep/-bFGF和FG/Fn/Hep/-bFGF在体内接近线性释放， 而生长因子与 FG简单的物理混合凝胶在体内植入后3天内出现爆释。 0067 图7为用ELISA方法检测生长因子(bFGF， NGF)体外释放曲线。 FG： 纤维蛋白胶； Fn： 纤粘连蛋白； Hep： 肝素；。
39、 bFGF： 碱性成纤维细胞生长因子； NGF： 神经生长因子。 本实验发现， 生长因子缓释系统FG/Fn/Hep/-bFGF和FG/Fn/Hep/-bFGF在体外缓冲盐溶液中释放非常缓 慢， 在第20天的时候加入纤维蛋白溶解酶(plasmin)， 出现生长因子的爆释； 而生长因子与 FG简单的物理混合凝胶在体外缓冲盐溶液中释放很快， 浸泡10天已经释放90。 0068 综上可知， 本发明的控释(缓释)系统有效地达到了对其中加入的细胞因子的缓释 作用， 避免了爆释现象， 相应延长了细胞因子释放的时间， 从而能够持续地促进神经的修 复。 0069 评价例2 0070 神经修复结果检测 0071 。
40、利用结合有生长因子NGF、 bFGF的控释凝胶修复了大鼠坐骨神经离断伤， 具体实验 方法和实验结果如下： 0072 方法： 0073 SD大鼠27只随机分为A、 B、 C三组， 每组9只。 建立大鼠坐骨神经横断模型： A组： 以含 有神经生长因子(NGF)与碱性成纤维生长因子(bFGF)控释凝胶的神经导管桥接神经远近端 (间隙3mm)； B组： 以含有生理盐水的神经导管桥接神经远近端(间隙3mm)： C组： 采用神经远 近端直接缝合。 术后8周进行坐骨神经指数(SFI)、 神经电生理、 肌肉湿重比检查以及组织学 和免疫组化观察。 0074 结果： 0075 从数据上看， A组在SFI、 神经传。
41、导速度、 肌肉湿重比、 再生神经纤维密度及髓鞘化 等方面均高于B组和C组， 但三组的SFI、 肌肉湿重比及新生轴突直径和髓鞘厚度均无显著性 差异(P0.05)。 A组与B组的神经传导速度差异无统计学意义(P0.05)， 两组均明显高于C组 (P0.05)。 至于再生神经纤维密度， 三组间差异具有统计学意义(P0.05)(参见表1)。 0076 结论： 小间隙吻合结合控释生长因子对神经再生有明显的促进作用。 0077 表1术后8周各组神经吻合口中段新生神经纤维参数(Xs,N9) 说 明 书 7/8 页 10 CN 103933619 B 10 0078 0079 注： 生长因子组(A组)、 生理。
42、盐水组(B组)以及直接缝合组(C组)新生神经纤维轴突 直径和髓鞘厚度都低于正常神经(P0.05)； 有髓神经纤维数 在A组、 B组以及C组间均有显著性差异(P0.05)。 *p0.05， 与正常神经组比较。 0080 评价例3 0081 将评价例2中的大鼠在术后8周神经吻合口中段神经冰冻切片， 用神经纤维200 (NF200)和雪旺氏细胞标记物100(S100)免疫荧光观察(200)。 参见图8， 其中图a、 b、 c分别 为A组、 B组、 C组染色结果， 图d为正常大鼠坐骨神经染色； 原照片中绿色为NF-200， 红色为 S100， 因专利法要求将图片转为灰度之后， 浅色为NF-200， 深。
43、色为S100。 由图8的结果可见， A 组利用本发明神经修复材料的动物的神经修复效果优于B组和C组。 0082 评价例4 0083 将评价例2中的大鼠在术后8周取各组标本神经吻合口中段新生神经纤维髓鞘观 察(甲苯胺蓝染色200)。 其中， 图a、 b、 c分别为A组、 B组、 C组， 图d为正常神经。 结果参见图 9。 0084 由图9可见， 利用本发明神经修复材料的大鼠中更多地形成了新生神经纤维髓鞘。 0085 评价例5 0086 利用评价例2中所用的动物， 在术后8周取各组标本神经吻合口中段新生神经纤维 透射电镜观察神经， 电镜照片参见图10。 其中图a、 b、 c分别为A组、 B组、 C。
44、组， 图d为正常神经 (20000)。 0087 由图10可见， 本发明的神经修复材料组中的神经修复效果优于对照组。 0088 虽然本文中通过结合各个具体的实施例阐述了本发明的理念和发明点， 但是这些 实施例仅仅为说明性示例， 并不用于限制本发明的保护范围。 本发明的保护范围以所附权 利要求书中限定的为准， 本领域技术人员在此基础上结合公知常识所作出的等同替换、 简 单改变等均应落入本发明的保护范围内。 说 明 书 8/8 页 11 CN 103933619 B 11 图1 图2 说 明 书 附 图 1/6 页 12 CN 103933619 B 12 图3 图4 图5 图6A 说 明 书 附 图 2/6 页 13 CN 103933619 B 13 图6B 图7A 说 明 书 附 图 3/6 页 14 CN 103933619 B 14 图7B 说 明 书 附 图 4/6 页 15 CN 103933619 B 15 图8 说 明 书 附 图 5/6 页 16 CN 103933619 B 16 图9 图10 说 明 书 附 图 6/6 页 17 CN 103933619 B 17 。