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用作 PI3K 抑制剂的 2- 羧酰胺环氨基脲
    本发明涉及作为新磷脂酰肌醇 (PI)3- 激酶抑制剂化合物的取代的 2- 羧酰胺环氨 基脲、 它们的可药用盐、 其前药及它们的制备方法。 本发明还涉及单独或与至少一种其它治 疗剂组合的这些化合物和任选的可药用载体的组合物。 本发明还进一步涉及使用单独或与 至少一种其它治疗剂组合的这些化合物预防或治疗多种疾病、 具体来说生长因子、 受体酪 氨酸激酶、 蛋白质丝氨酸 / 苏氨酸激酶、 G 蛋白偶联受体和磷脂激酶及磷酸酶的一种或多种 异常活性介导的疾病的方法。
     磷脂酰肌醇 3- 激酶 (PI3K) 包含脂质激酶家族， 该家族催化磷酸转移至肌醇脂 质的 D-3′位置以产生磷酸肌醇 -3- 磷酸 (PIP)、 磷酸肌醇 -3， 4- 二磷酸 (PIP2) 和磷酸肌 醇 -3， 4， 5- 三磷酸 (PIP3)， 后者又通过将含有普列克底物蛋白 - 同源物、 FYVE、 Phox 和其它 磷脂结合结构域的蛋白质对接至通常位于质膜的多种信号传导复合物中而在信号传导级 联中起第二信使的作用 ((Vanhaesebroeck 等人， Annu.Rev.Biochem 70 ： 535(2001) ； Katso 等人， Annu.Rev.Cell Dev.Biol.17 ： 615(2001))。两种 1 类 PI3K 中， 1A 类 PI3K 是由催化 p110 亚单元 (α、 β、 δ 同种型 ) 与可为 p85α、 p55α、 p50α、 p85β 或 p55γ 的调节亚 单元组成型结合而构成的异二聚体。1B 类亚类具有一个家族成员， 其为由催化 p110γ 亚 单元和两种调节亚单元 p101 或 p84 之一结合而构成的异二聚体 (Fruman 等人， Annu Rev. Biochem.67 ： 481(1998) ； Suire 等人， Curr.Biol.15 ： 566(2005))。p85/55/50 亚单元的模 块结构域包括 Src 同源 (SH2) 结构域， 其在特定序列背景下结合于激活受体和细胞质酪氨 酸激酶上的磷酸酪氨酸残基， 导致 1A 类 PI3K 激活和定位。1B 类 PI3K 由结合多种肽和非肽
     配体的 G 蛋白耦合受体直接激活 (Stephens 等人， Cell89 ： 105(1997)) ； Katso 等人， Annu. Rev.Cell Dev.Biol.17 ： 615-675(2001))。因此， 所得 1A 类 PI3K 的磷脂产物使上游受体和 下游细胞活性联系起来， 所述细胞活性包括增殖、 存活、 趋化作用、 细胞转运、 运动性、 代谢、 炎症和过敏反应、 转录和翻译 (Cantley 等人， Cell 64 ： 281(1991) ； Escobedo 和 Williams， Nature 335 ： 85(1988) ； Fantl 等人， Cell 69 ： 413(1992))。
     在很多情况下， PIP2 和 PIP3 募集 Akt( 病毒致癌基因 v-Akt 的人类同源产物 ) 至 质膜， 在那里其作为对生长和存活极为重要的许多细胞内信号传导路径的节点 (Fantl 等 人， Cell 69 ： 413-423(1992) ； Bader 等人， Nature Rev.Cancer 5 ： 921(2005) ； Vivanco 和 Sawyer， Nature Rev.Cancer 2 ： 489(2002))。PI3K 的异常调节 ( 其通常通过 Akt 激活来增 加存活 ) 是人类癌症中最普遍事件之一， 且已显示以多种水平发生。肿瘤抑制基因 PTEN 使 肌醇环 3′位处的磷酸肌醇去磷酸化， 且由此拮抗 PI3K 活性， 该基因在多种肿瘤中功能缺 失。 在其它肿瘤中， 110α 同种型 PIK3CA 的基因和 Akt 的基因被扩增， 且已在数种人癌症中 证实其基因产物的蛋白表达增加。此外， 已在人类癌症中描述了用以上调 p85-p110 复合物 的 p85α 的突变和易位。最后， 已在多种人癌症中以相当高频率描述了激活下游信号传导 路径的 PIK3CA 的体细胞错义突变 (Kang 等人， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102 ： 802(2005) ； Samuels 等人， Science 304 ： 554(2004) ； Samuels 等人， Cancer Cell 7 ： 561-573(2005))。 该观察显示， 磷酸肌醇 -3 激酶和该信号传导路径的上游及下游组件失调是与人类癌症和 增殖性疾病有关的最常见失调之一 (Parsons 等人， Nature 436 ： 792(2005) ； Hennessey 等人， Nature Rev.Drug Disc.4 ： 988-1004(2005))。
     鉴于以上， PI3K 抑制剂将在治疗增殖性疾病和其它病症中具有特殊价值。期望对 PI3Kα 同种型具有选择性， 且期望的其它特性包括改良的药动学特性和 / 或化学稳定性。
     WO2004/096797 公开了作为 PI3 激酶抑制剂的某些噻唑衍生物及其用作药物的用 途。
     WO 2005/021519 也公开了作为 PI3 激酶抑制剂的某些噻唑衍生物及其用作药物 的用途。
     现已发现， 下文给出的式 I 的 2- 羧酰胺环氨基脲具有有利的药理学特性且抑制 例如 PI3 激酶 ( 磷脂酰肌醇 3- 激酶 )。具体来说， 优选地， 在生物化学和 / 或细胞测定中 相对于 β 和 / 或 δ 和 / 或 γ 亚型， 这些化合物显示 PI3Kα 的选择性。优选期望式 I 化 合物具有的另一特性包括改良的稳定性， 例如在固体形式和 / 或缓冲溶液中改良的化学稳 定性。因此， 式 I 化合物适用于例如治疗依赖于 PI3 激酶的疾病 ( 尤其 PI3Kα， 例如显示 PIK3CA 体细胞突变或种系突变或 PTEN 体细胞突变的那些 )， 尤其是增殖性疾病例如肿瘤疾 病和白血病。
     第一方面， 本发明提供式 I 化合物或其盐、 溶剂合物、 水合物或前药，
     其中，
     A 未取代或取代的芳环或未取代或取代的杂环， 其在符号 * 所示的位置处稠合于 该分子的其余部分 ；
     X-Y 是 (CH2)r 或 O(CH2)t 或 (CH2)tO， 其中，
     r 是 1、 2或3；
     t是1或2；
     n 是 0、 1或2； q 是 0、 1、 2、 3或4； 1 R 在每次出现时独立地表示 卤素 ； 羟基 ； 未取代的或取代的芳基 ； 未取代的或取代的氨基 ； 未取代的 C1-C7- 烷基 ； C1-C7- 烷基， 其被下列基团取代一次或多次 ： 羟基、 C1-C7- 烷氧基、 未取代的或取代的氨基、 芳基或杂环基， 并且其中芳基可被卤素单取代或多取代 ； 或两个 R1 取代基一起形成烷二基以形成任 选被羟基或卤素取代的环状部分。
     可参照以下说明书、 包括下文术语表和最后的实例更全面地理解本发明。如本文 所用， 术语 “包括” 、 “含有” 和 “包含” 在本文中是以其开放且非限制性意义使用。
     本文给出的任何通式意欲代表具有由结构式所绘示的结构的化合物以及某些变 体或形式。 具体来说， 本文给出的任何通式的化合物可具有不对称中心， 因此可以以不同立 体异构形式例如不同对映异构形式存在。如果至少一个不对称碳原子存在于式 I 化合物 中， 那么该化合物可以以旋光形式或以旋光异构体混合物的形式、 例如以外消旋混合物形 式存在。 因此， 不对称碳原子可以以 (R)-、 (S)- 或 (R， S)- 构型存在， 优选以 (R)- 或 (S)- 构 型存在。所有旋光异构体和其混合物、 包括外消旋混合物均是本发明的一部分。因此， 本文 给出的任何通式意欲代表外消旋物、 一种或多种对映异构形式、 一种或多种非对映异构形 式、 一种或多种阻转异构形式及其混合物。此外， 某些结构可以以几何异构体 ( 例如顺式及 反式异构体 )、 以互变异构体或以阻转异构体形式存在。例如， 在双键或环上的取代基可以 以顺式 ( ＝ Z-) 或反式 ( ＝ E-) 形式存在。因此， 本发明化合物可以以异构体混合物、 或优 选以纯异构体、 优选以对映异构体 - 纯非对映异构体或纯对映异构体形式存在。
     本文给出的任何通式意欲代表此类化合物的水合物、 溶剂合物和多晶型物、 及其混合物。 本文给出的任何通式也意欲代表此类化合物的未标记形式和同位素标记形式。 同 位素标记化合物具有本文所给出的各通式所绘示的结构， 只是一个或多个原子被具有所选 原子质量或质量数的原子替换。 可纳入本发明化合物中的同位素的实例包括氢、 碳、 氮、 氧、 2 3 11 13 14 15 31 32 18 35 36 125 磷、 氟和氯的同位素， 例如 H、 H、 C、 C、 C、 N、 P、 P、 F、 S、 Cl、 I。各种同位素标记的 13 本发明化合物是例如纳入放射性同位素例如 3H、 C 和 14C 的那些。此类同位素标记化合物 可用于代谢研究 ( 优选使用 14C)、 反应动力学研究 ( 使用例如 2H 或 3H)、 检测或成像技术， 例 如正电子发射断层摄影术 (PET) 或单光子发射计算机断层摄影术 (SPECT)， 包括药物或底 18 物组织分布分析， 或用于患者的放射性治疗。具体来说， F 或标记化合物对于 PET 或 SPECT 研究可能尤其优选。此外， 用例如更重的同位素如氘 ( 即 2H) 取代可因较强的代谢稳定性 而提供某些治疗优势， 例如体内半衰期延长或所需剂量减低。同位素标记的本发明化合物 及其前药通常可经由实施流程中或下文所述实例和制备中所公开的程序、 通过用易于获得 的同位素标记的试剂取代未经同位素标记的试剂来制备。
     此外， 用较重同位素、 尤其是氘 ( 即 2H 或 D) 取代可因较强的代谢稳定性而提供某 些治疗优势， 例如体内半衰期延长或所需剂量降低或治疗指数提高。 应理解， 在此情况下氘 被视为式 (I) 化合物中的取代基。该较重同位素、 具体而言是氘的浓度可通过同位素富集 因子来界定。 本文所用的术语 “同位素富集因子” 是指特定同位素的同位素丰度与天然丰度 的比值。 如果本发明化合物中的取代基以氘表示， 则对于各指定氘原子， 该化合物具有至少 3500( 在各指定氘原子处具有 52.5％氘纳入 )、 至少 4000(60％氘纳入 )、 至少 4500(67.5％ 氘纳入 )、 至少 5000(75％氘纳入 )、 至少 5500(82.5％氘纳入 )、 至少 6000(90％氘纳入 )、 至少 6333.3(95 ％氘纳入 )、 至少 6466.7(97 ％氘纳入 )、 至少 6600(99 ％氘纳入 ) 或至少 6633.3(99.5％氘纳入 ) 的同位素富集因子。在本发明化合物中， 未特别指定为特定同位素 的任一原子意指代表该原子的任一稳定同位素。除非另有指出， 否则当将一位置特别指定
     为 “H” 或 “氢” 时， 该位置应理解为以其天然丰度同位素组成具有氢。因此， 在本发明化合 物中， 特别指定为氘 (D) 的任一原子意指代表氘， 例如在上文给出的范围内。
     当提及本文给出的任何通式时， 从具体变量的可能种类列表选择特定部分并不意 欲界定在其它地方出现的该变量的部分。 换言之， 在变量出现一次以上时， 从特定列表的种 类选择独立于通式中其它地方的相同变量的种类选择 ( 其中上文和下文中表征为优选的 实施方案中的一个或多个直至全部更多通用表述可分别用更具体定义替换， 因此得到本发 明的更优选的实施方案 )。
     在使用复数形式 ( 例如化合物、 盐、 药物制品、 疾病等 ) 的情况下， 这包括单数 ( 例 如单一化合物、 单一盐、 单一药物制剂、 单一疾病等 )。 “一种化合物” 不排除 ( 例如在药物 制剂中 ) 存在一种以上的式 (I) 化合物 ( 或其盐 )。
     如果式 (I) 化合物携带成盐基团， 那么盐优选为式 (I) 化合物的可药用盐。形成 盐所需的酸 / 碱通常为本领域已知。
     除非另有说明， 否则以下通用定义将应用于本说明书中 ：
     卤素 ( 或卤代 ) 表示氟、 溴、 氯或碘， 特别氟、 氯。被卤素取代的基团和部分如被卤 素取代的烷基 ( 卤烷基 ) 可被单 -、 多 - 或全 - 卤化。
     杂原子是除碳和氢之外的原子， 优选氮 (N)、 氧 (O) 或硫 (S)， 特别氮。
     “烷基” 是指直链或支链烷基， 且包括 C1-7 烷基且更优选 C1-4 烷基。 此类烷基包括例 如甲基、 乙基、 正丙基或异丙基、 正丁基、 异丁基、 仲丁基或叔丁基、 正戊基、 正己基、 正庚基， 特别优选甲基、 乙基、 正丙基、 异丙基、 正丁基和异丁基。烷基可未被取代或被取代。示例性 取代基包括但不限于羟基、 烷氧基、 卤素 ( 尤其是氟 )、 氨基和二取代的氨基、 单 - 或二 - 烷 基取代的氨基、 乙酰基氨基、 吗啉基、 芳基。取代的烷基的实例是三氟甲基。环烷基也可以 是烷基的取代基。此类情况的一个实例是部分 ( 烷基 )- 环烷基， 例如 ( 烷基 )- 环丙基或 ( 烷基 )- 环丁基， 例如甲基 - 环丙基或甲基 - 环丁基。( 烷基 )- 环烷基部分的更具体实例 包括偕型的取代模式， 例如 1- 烷基环烷基、 例如 1- 甲基环丙基。环烷基作为烷基的取代基 的另一实例是烷二基 - 环烷基， 例如烷二基 - 环丙基、 例如 -CH2- 环丙基。C1-C7- 烷基是具 有从 1 个 ( 且包括 1 个 ) 直至 7 个 ( 且包括 7 个 ) 碳原子的烷基， 优选具有从 1 个 ( 且包 括 1 个 ) 直至 4 个 ( 且包括 4 个 ) 碳原子 (C1-C4- 烷基 )， 且为直链或支链 ； 优选地， 低级烷 基是丁基， 例如正丁基、 仲丁基、 异丁基、 叔丁基、 丙基， 例如正丙基或异丙基、 乙基或优选甲 基。
     其它基团的各烷基部分如 “烷氧基” “烷氧基烷基” 、 “烷氧基羰基” 、 “烷氧基 - 羰基 、 烷基” 、 “烷基磺酰基” 、 “烷基砜 (alkylsulfoxyl)” 、 “烷基氨基” 、 “卤烷基” 应具有与 “烷基” 的上述定义中所述相同的含义。
     “C3-7- 环烷基” 是指饱和或部分饱和、 单环、 稠合多环或螺多环状碳环， 每一碳环具 有 3 个至 7 个环原子。环烷基的示例性实例包括以下部分 ： 环丙基、 环丁基、 环戊基和环己 基。C3-C7- 环烷基可未被取代或被取代 ； 示例性取代基提供于对烷基的定义中。C3-C7- 环 烷基也可为其它基团例如烷基上的取代基。
     “芳基” 是指优选具有不多于 16 个碳原子、 尤其不多于 10 个碳原子、 例如具有 6 个 至 16 个、 优选 6 个至 10 个环碳原子的环系统的未饱和碳环芳族环系统， 优选为单环或二 环， 且未被取代或取代。例如， 芳基是未取代的或取代的苯基。
     “杂环基” 是指杂环基团， 其在键合环中是不饱和 ( 特别最大程度不饱和， 例如环中携带最高可能数的共轭双键例如杂芳基 )、 饱和或部分饱和且优选为单环或在本发明更 广泛方面为二环状环 ； 其具有 3-16 个环原子， 更优选 4-10 个环原子， 其中至少在键合至式 (I) 分子的基团的环中一个或多个、 优选 1-4 个环原子、 尤其一个或两个环原子是选自氮、 氧和硫的杂原子 ； 该键合环优选具有 4-12 个环原子、 尤其 4-7 个环原子、 例如 6-10 个环原 子、 尤其对于杂芳基， 例如 5、 6、 9 或 10 个环原子。杂环基可被未取代或被一个或多个、 尤其 1 个至 3 个取代基取代， 所述取代基独立地选自烷基或上文对于取代的烷基所定义的取代 基和 / 或选自一个或多个以下取代基 ： 氧代 ( ＝ O)、 硫代羰基 ( ＝ S)、 亚氨基 ( ＝ NH)、 亚 氨基 - 低级烷基， 且对于含氮杂芳基， 包括其 N- 氧化物。
     “治疗” 包括预防性和治疗性治疗以及延长疾病或病症的进展。
     “PI3 激酶介导的疾病” ( 尤其是 PI3Kα 介导的疾病 ) 具体而言是以有益方式 ( 例 如一个或多个症状改善、 疾病发作延迟、 直至疾病暂时或完全治愈 ) 响应 PI3 激酶的抑制、 尤其 PI3Kα 的抑制的病症 ( 其中待治疗的疾病可包括显示 PIK3CA 体细胞突变或种系突变 或 PTEN 体细胞突变的那些 )。 待治疗的疾病尤其包括增殖性疾病， 例如肿瘤疾病， 可提及的 包括实体肿瘤、 白血病、 胶质母细胞瘤、 乳癌和前列腺癌。 “盐” (以 “其盐” 表示 ) 可单独或以与游离式 I 化合物的混合物存在， 且优选为可药 用盐。式 (I) 化合物中的成盐基团是具有碱性或酸性特性的基团或原子团。具有至少一个 碱性基团或至少一个碱性原子团例如氨基、 不形成肽键的仲氨基或吡啶基的化合物可形成 酸加成盐， 例如与盐酸、 硫酸或磷酸等无机酸 ； 或与适宜的有机羧酸或磺酸例如脂族单 - 或 二 - 羧酸， 例如三氟乙酸、 乙酸、 丙酸、 羟基乙酸、 琥珀酸、 马来酸、 富马酸、 羟基马来酸、 苹果 酸、 酒石酸、 柠檬酸或草酸 ； 或氨基酸， 例如精氨酸或赖氨酸 ； 芳族羧酸， 例如苯甲酸 ； 2- 苯 氧基 - 苯甲酸 ； 2- 乙酰氧基 - 苯甲酸 ； 水杨酸 ； 4- 氨基水杨酸 ； 芳族 - 脂族羧酸， 例如扁桃 酸或肉桂酸 ； 杂芳族羧酸， 例如烟酸或异烟酸 ； 脂族磺酸， 例如甲烷 -、 乙烷 - 或 2- 羟基乙 磺酸 ； 或芳族磺酸， 例如苯 -、 对甲苯 - 或萘 -2- 磺酸。存在若干碱性基团时， 可形成单 - 或 多 - 酸加成盐。
     具有酸性基团羧基或酚羟基的式 (I) 化合物可形成金属盐或铵盐， 例如碱金属或 碱土金属盐， 例如钠盐、 钾盐、 镁盐或钙盐 ； 或与氨或适宜有机胺形成的铵盐， 例如叔单胺， 例如三乙胺或三 (2- 羟基乙基 )- 胺， 或杂环碱， 例如 N- 乙基 - 哌啶或 N， N′ - 二甲基哌嗪。 盐的混合物是可能的。
     具有酸性和碱性基团的式 (I) 化合物可形成内盐。
     出于分离或纯化目的， 亦可使用药学上不可接受的盐， 例如苦味酸盐或高氯酸盐。 对于治疗用途， 仅使用可药用盐或游离化合物 ( 酌情为药物制剂形式 )， 且因此这些是优选 的。鉴于游离形式的新型化合物与其盐形式的化合物、 包括在例如新化合物的纯化或鉴定 中可用作中间体的那些盐之间的密切关系， 上下文中关于游离化合物的任何相关内容均应 该视需要及方便被理解为也指对应盐。
     本发明化合物也可形成溶剂合物和水合物， 且因此任何提及式 (I) 化合物均应该 视需要及方便被理解为也提及式 (I) 化合物的对应的溶剂合物和 / 或水合物。
     本发明还涉及在体内转化为式 (I) 化合物本身的式 (I) 化合物的前药。因此， 任 何提及式 (I) 化合物均应该视需要及方便被理解为也提及式 (I) 化合物的对应的前药。
     组合是指一种剂量单元形式中的固定组合或用于组合施用的药盒， 其中式 I 化合 物与组合伴侣 ( 例如如下文所示的其它药物， 也称为 “治疗剂” 或 “辅助药剂” ) 可独立地 同时或单独地在一定时间间隔内施用， 尤其当这些时间间隔使得组合伴侣显示合作、 例如 协同效应时。本文所用的术语 “共施用” 或 “组合施用” 等意欲包括向有需要的单个受试者 ( 例如患者 ) 施用所选组合伴侣， 且意欲包括其中无需以相同施用路径或在相同时间施用 药剂的治疗方案。本文所用的术语 “药物组合” 意指由混合或组合一种以上活性成分而获 得的产物， 且包括活性成分的固定和非固定组合。术语 “固定组合” 意指将活性成分例如式 I 化合物与组合伴侣二者以单一实体或剂量的形式同时施用至患者。术语 “非固定组合” 意 指活性成分例如式 I 化合物与组合伴侣二者作为分开的实体同时、 并行或相继且无具体时 间限制地施用至患者， 其中此施用可在患者体内提供两种化合物的治疗有效量。后者亦适 用于鸡尾酒疗法， 例如施用三种或更多种活性成分。
     在优选的实施方案中 ( 该实施方案独立地、 共同地或以任一组合或亚组合优选 )， 本发明涉及游离碱形式或盐形式的式 I 化合物， 其中取代基如本文所定义。
     如式 I 所示， α- 酰胺取代基是在吡咯烷环的 2 位上， 且该位置的立体化学如图所 绘示。 环 A 优选是含有 1 个或 2 个选自 N、 S 或 O 的杂原子、 其中至少一个杂原子是 N 的 未取代的或取代的 5- 或 6- 元杂环状环 ( 优选杂芳基 )。
     更优选地， 环 A 选自未取代的或取代的吡啶环、 未取代的或取代的嘧啶环、 未取代 的或取代的噻唑环、 未取代的或取代的吡唑环或未取代的或取代的噁唑环。更优选的是未 取代的或取代的吡啶环、 未取代的或取代的嘧啶环或未取代的或取代的噻唑环。
     优选地， 环 A 通过环 A 的碳原子稠合至式 I 分子的其它部分。
     环 A 优选被一个、 两个或三个 R2 基团、 优选两个 R2 基团、 最优选一个 R2 基团取代， 该 R2 基团在每次出现时独立地选自 ：
     未取代的或取代的 C1-C7- 烷基 ；
     未取代的或取代的氨基 ；
     未取代的或取代的 C3-C7- 环烷基。
     优选地， R2 选自
     未取代的 C1-C7- 烷基 ；
     二 (C1-C7- 烷基 ) 氨基 ；
     C1-C7- 烷基， 其被 C3-C7- 环烷基或卤代 ( 优选氟 ) 取代一次或多次 ；
     未取代的 C3-C7- 环烷基 ；
     C3-C7- 环烷基， 其被卤代 ( 优选氟 )、 ( 卤代 -C1-C7- 烷基 ) 或 C1-C7- 烷基取代一次 或多次 ；
     更优选地， R2 选自甲基、 叔丁基、 二乙基氨基、 环丙基甲基、 2- 氟 -1， 1- 二甲基乙基 或 2， 2， 2- 三氟 -1， 1- 二甲基 - 乙基。
     在另一实施方案中， R2 选自甲基、 叔丁基、 二乙基氨基、 环丙基甲基或 2- 氟 -1， 1- 二甲基乙基。
     环 A 更优选选自 A1 或 A2 或 A3 或 A4 或 A5 或 A6 ：
     其中 Z 是 N 或 CH 且 R2 如上所定义。
     优选地， 环 A 选自 A1 或 A2。
     X-Y 优选表示 (CH2)r 或 O(CH2)t， 其中 r 是 1、 2或3； t是1或2；
     X-Y 更优选表示 (CH2)r 或 O(CH2)t， 其中 r 是 2 且 t 是 1。为避免产生疑问， 即 X-Y 优选为 -CH2-CH2- 或 -O-CH2-， 如此在后一种情况下， X-Y 中的 X 是 -O-CH2- 中的 O。 1
     R 优选在每次出现时独立地表示
     卤素 ；
     羟基 ；
     未取代的或取代的苯基 ；
     二 (C1-C7- 烷基 ) 氨基 ；
     未取代的 C1-C7- 烷基 ；
     C1-C7- 烷基， 其被下列基团取代一次或多次 ：
     羟基、 C1-C7- 烷氧基、 二 (C1-C7- 烷基 ) 氨基、 二 -( 全氘代 C1-C7- 烷基 ) 氨基、 苯 基、 吗啉基、 乙酰基氨基、 或 N-(C1-C7- 烷基 )-N-( 苯基 C1-C7- 烷基 ) 氨基， 且其中各苯基可 独立地被卤代单取代或多取代。
     R1 更优选在每次出现时独立地表示
     氟；
     羟基 ；
     未取代的苯基 ；
     二甲基氨基 ；
     甲基 ；
     甲基， 其被以下基团取代一次或多次 ( 优选取代一次 )
     羟基、 甲氧基、 二甲基氨基、 二 -( 全氘代甲基 ) 氨基、 苯基、 吗啉基、 乙酰基氨基、 或 N-( 甲基 )-N-( 苯基甲基 ) 氨基， 且其中各苯基可独立地被氟单取代或多取代。 1
     R 最优选在每次出现时独立地表示
     氟；
     羟基 ；
     未取代的苯基 ；
     二甲基氨基 ；
     甲基 ；
     羟基甲基 ；
     甲氧基甲基 ；
     二甲基氨基甲基 ；
     二 -( 全氘代甲基 ) 氨基甲基 ；
     苄基 ；
     吗啉 -4- 基甲基 ；
     N- 乙酰基氨基甲基 ；
     N-( 甲基 )-N-(3- 氟 - 苯基甲基 ) 氨基甲基。
     本发明的一实施方案包括式 I 的化合物， 其中 n 是 0 或 1。优选地， n 是 1。
     本发明的另一实施方案包括式 I 的化合物， 其中 q 是 0， 即其中含氮杂环仅在 2 位 被酰胺取代。在该实施方案中， 优选 n 是 0 或 1， 更优选 1。
     本发明的另一实施方案包括式 I 化合物， 其中 q 是 1， 即其中含氮杂环仅被酰胺在 1 2 位和单一 R 基团取代。在该实施方案中， 优选 n 是 0 或 1， 更优选 1。在该实施方案中， R1 基团可在含氮杂环的 2 位 ( 即在与被酰胺基团取代的碳相同的碳上 ) 或 3 位或 4 位或 5 位 取代。
     优选地， 在该实施方案中， R1 基团在含氮杂环的 3 位被取代， 即式 IA 的化合物 ：
     其中取代基如对于式 (I) 化合物所定义。
     优选地在式 IA 化合物中， n 是 1， 因此提供其中含氮杂环是吡咯烷环、 在 2 位被具 1 有所绘示的立体化学的酰胺取代、 且在 3 位被 R 基团取代的化合物。 1
     优选地， R 基团具有相对于 2 位的酰胺为顺式的立体化学， 即根据式 (IA’ ) 的化 合物 ：
     其中取代基如对于式 (I) 化合物所定义。
     优选在式 IA′化合物中， n 是 1， 因此提供其中含氮杂环是吡咯烷环、 在 2 位被具 1 有所绘示的立体化学的酰胺取代、 且在 3 位被具有所绘示的立体化学的 R 基团取代的化合 物， 因此酰胺和 R1 基团相对于彼此呈顺式的化合物。
     本发明的又一实施方案包括其中 q 是 2 或 3、 因此存在至少两个 R1 取代基的式 I 化合物， 各 R1 独立地选自如本文对于式 I 所定义的基团。在该实施方案中， 优选两个 R1 中 的至少每一个键合于吡咯烷环的 3 位， 且任选的第三 R1 基团 ( 若存在 ) 键合在含氮杂环的 其它地方。进一步优选， n 是 1 且第三 R1 基团 ( 若存在 ) 键合在所得吡咯烷环的 4 位或 5 位， 即提供式 IB 化合物 ：
     其中取代基如对于式 (I) 化合物所定义。
     在根据式 IB 的化合物中， 优选第三 R1 键合在吡咯烷环的 4 位上。
     本发明的又一实施方案包括如下式 I 化合物 ： 其中 n 是 1、 且其中两个 R1 基团键合 在吡咯烷环的 3 位， 并且一起形成烷二基， 优选 C3-C8- 环烷基， 特别是环丙基， 即提供式 IC 化合物 ：
     其中取代基如对于式 (I) 化合物所定义， 且第三 R1 基团是任选的， 且如果存在， 优 选键合在吡咯烷环的 4 位。
     在式 (IA)、 (IA’ )、 (IB) 或 (IC) 的任一个中， 若无另外说明， 则对于环 A、 X-Y、 R1 和 n 的优选定义亦可适用。
     本发明另外涉及式 (I)、 (IA)、 (IA’ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物的可药用前药。 本发明另外涉及式 (I)、 (IA)、 (IA’ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物的可药用代谢产物。 本发明尤其涉及实施例以及本文所述制备方法中给出的式 (I)、 (IA)、 (IA’ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物。
     本发明还涉及用于制备式 (I)、 (IA)、 (IA’ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物的方法。原 则上， 将两种不同胺转化为相应脲衍生物的所有已知方法均适宜， 且可通过使用各自原料 来实施。
     因此， 本发明特别涉及一种方法， 其包括将式 II 化合物
     其中取代基如上所定义， 与式 IIIA 化合物
     其中取代基如上所定义， 在活化剂存在下反应 ( “方法 A” )， 或与式 IIIB 化合物反应
     其中 R1 如上所定义 ； RG 代表反应基团 ( 例如咪唑基羰基 )(“方法 B” )， 在每种情 况下， 任选在稀释剂存在下和任选在反应助剂存在下， 以及回收游离形式或盐形式的所得 式 I 化合物， 以及
     任选地将根据方法 A 或方法 B 可获得的式 I 化合物转化成不同的式 I 化合物， 和/ 或将可获得的式 I 化合物的盐转化成其不同的盐， 和 / 或将可获得的游离式 I 化合物转化 成其盐， 和 / 或从一种或多种不同的可获得的式 I 异构体分离可获得的式 I 化合物的异构 体。
     反应条件
     该方法可根据本领域已知方法或如下文实施例中所公开来实施。例如， 可将式 II
     化合物与式 IIIA 或 IIIB 化合物于溶剂例如二甲基甲酰胺中、 在碱例如有机胺例如三乙胺 存在下反应。
     在上文或下文中给出温度时， 应添加 “约” ， 因为来自所给出数值的微小偏差 ( 例 如 ±10％的差异 ) 通常可以接受。
     所有反应均可在一种或多种稀释剂和 / 或溶剂存在下进行。可使用等摩尔量的原 料； 可选地， 可使用过量化合物， 以例如用作溶剂或使平衡偏移或通常加快反应速率。
     如本领域已知， 根据反应所需且符合通常已知程序， 可添加适宜量的反应助剂例 如酸、 碱或催化剂。
     保护基
     若一种或多种其他官能团、 例如羧基、 羟基、 氨基、 巯基等在本文中所述的原料或 任何其他前体物中已经加以保护或需要保护， 因为其不应参与反应或者干扰反应， 则这些 基团是常用于合成肽化合物、 合成头孢菌素和青霉素、 以及合成核酸衍生物和糖类的基团。 保护基团是一旦被转移就不再存在于最终化合物中的基团， 而仍然作为取代基的基团在本 文所用意义上并不是保护基团， 保护基团是在原料或中间体阶段添加且被移除以获得最终 化合物的基团。而且， 在将式 (I)、 (IA)、 (IA’ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 的化合物转化成不同的 式 (I)、 (IA)、 (IA’ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物的情况下， 如果有用或需要， 可引入保护基团 并予以移除。 保护基团可能已经存在于前体中且应保护所涉及的官能团以避免不期望的副反 应， 例如酰化、 醚化、 酯化、 氧化、 溶剂分解及类似反应。保护基团的特征在于其适于容易地 即无不期望的副反应、 例如在类似于生理条件的条件下通过乙酰解作用、 质子分解、 溶剂分 解、 还原、 光解或者也可借助酶活性而移除， 而其不存在于终产物中。专业人员都知道或者 可容易确定哪些保护基团适用于上下文所提及的反应。
     此类保护基团对该官能团的保护、 保护基团本身及其移除反应都阐述于 ( 例如 ) 标 准 参 考 著 作 中， 例 如 J.F.W.McOmie， “Protective Groups in Organic Chemistry” ， Plenum Press ， London and New York 1973 ； T.W.Greene ， “Protective Groups in Organic Synthesis” ， 第 3 版， Wiley， New York 1999 ； “The Peptides” ； 第 3 卷 ( 编者 ： E.Gross 和 J.Meienhofer)， Academic Press， London and New York 1981 ； “Methoden der organischen Chemie ″ (Methods of organic chemistry)， Houben Weyl， 第 4 版， 第 15/I 卷， Georg Thieme Verlag， Stuttgart 1974， in H.-D.Jakubke 及 H.Jescheit，
     “Peptide， Proteine” (Amino acids， peptides， proteins)， VerlagChemie， Weinheim， Deerfield Beach and Basel 1982 ； 及 Jochen Lehmann， “Chemie der Kohlenhydrate ： Monosaccharide und Derivate” (Chemistry of carbohydrates ： monosaccharides and derivatives)， Georg Thieme Verlag， Stuttgart 1974。
     任选的反应及转化
     可将式 (I)、 (IA)、 (IA’ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 的化合物转化成不同的式 (I)、 (IA)、 (IA’ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 的化合物。
     在取代基带有氨基或氨基 -C1-C7- 烷基取代基的式 (I)、 (IA)、 (IA’ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 的化合物中， 可通过在叔胺碱如三乙胺或吡啶存在下、 在不存在或存在合适溶剂如二 氯甲烷下、 在例如在 -20℃至 50℃范围的温度、 例如在约室温与对应的 C1-C7- 烷酰卤、 例如对应氯化物反应， 将氨基转化成酰基氨基， 例如 C1-C7- 烷酰基氨基。
     具有成盐基团的式 (I)、 (IA)、 (IA’ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 的化合物的盐可以用众人 皆知的方式制备。因此， 式 (I)、 (IA)、 (IA’ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 的化合物的酸加成盐可通 过用酸或用适宜的阴离子交换试剂处理而获得。具有两个酸分子的盐 ( 例如式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物的二卤化物 ) 也可以转化成每一化合物具有一个酸分子 的盐 ( 例如单卤化物 ) ； 这可通过加热成熔体或例如通过在高温、 例如 130℃至 170℃和高 真空下作为固体加热而进行， 每分子式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 的化合物释放 一个酸分子。盐通常可例如通过用适宜碱性化合物处理而转化成游离化合物， 例如用碱金 属碳酸盐、 碱金属碳酸氢盐或碱金属氢氧化物、 通常为碳酸钾或氢氧化钠。
     立体异构混合物、 例如非对映异构体的混合物可通过适宜分离方法、 以众人皆知 的方式分离成其对应的异构体。例如， 非对映异构体混合物可通过分级结晶、 层析、 溶剂分 布和类似程序分离成其单独非对映异构体。该分离可在起始化合物层面发生或在式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物本身发生。对映异构体可通过以下方式分离 ： 形成 非对映异构体盐， 例如， 通过与对映体纯的手性酸形成盐 ； 或通过层析， 例如通过 HPLC， 使 用带手性配体的层析底物。
     应强调的是， 与本文所提及转化类似的反应也可以在适宜中间体层面进行 ( 且因 此可用于制备对应原料 )。
     原料 ：
     式 II 和 III 的原料以及本文、 例如下文所提及的其他原料可按照或类似于本领域 已知方法制备、 已经为本领域所熟知和 / 或市售可得。尽管没有具体阐述原料的制备， 但该 化合物是已知的或可类似于本领域已知的方法、 例如在 WO 05/021519 或 WO04/096797 中所 述或如下文所公开来制备。新原料及其制备方法同样是本发明的实施方案。在优选的实施 方案中， 使用该原料且选择所选反应以便能够获得优选的化合物。
     在需要和方便时也可以以盐使用和 / 或获得的原料 ( 包括中间体 ) 中， 取代基优 选如对式 (I)、 (IA)、 (IA’ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物所定义。
     药物组合物、 用途及治疗方法
     本发明还涉及本文所公开的式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物作为 药物的用途。在一个实施方案中， 本发明包括包含式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物的组合物， 例如用于人类或兽医使用， 例如在需要抑制 PI3K 的情况下。
     在一个实施方案中， 本发明涉及治疗细胞增殖性疾病， 如肿瘤 ( 良性或恶性 ) 和 / 或癌细胞生长， 例如通过 PI3K 介导的。疾病可包括显示 PIK3CA 体细胞突变或种系突变 或 PTEN 体细胞突变的那些。具体来说， 该化合物可用于治疗人或动物 ( 例如鼠科动物 ) 癌 症， 包括例如肉瘤 ； 肺癌 ； 支气管癌 ； 前列腺癌 ； 乳癌 ( 包括散发性乳癌和 Cowden 病患者 ) ； 胰腺癌 ； 胃肠癌 ； 结肠癌 (colon cancer) ； 直肠癌 ； 结肠癌 (colon carcinoma) ； 结肠直肠 腺瘤 ； 甲状腺癌 ； 肝癌 ； 肝内胆管癌 ； 肝细胞癌 ； 肾上腺癌 ； 胃癌 (stomach cacer 或 gastric cacer) ； 神经胶质瘤 ； 胶质母细胞瘤 ； 子宫内膜癌 ； 黑素瘤 ； 肾癌 ； 肾盂癌 ； 膀胱癌 ； 子宫体 (uterine corpus) 癌 ； 子宫颈癌 ； 阴道癌 ； 卵巢癌 ； 多发性骨髓瘤 ； 食道癌 ； 白血病 ； 急性骨 髓性白血病 ； 慢性骨髓性白血病 ； 淋巴细胞性白血病 ； 髓性白血病 ； 脑癌 ； 脑癌瘤 ； 口腔癌 及咽癌 ； 喉癌 ； 小肠癌 ； 非霍奇金淋巴瘤 ； 黑素瘤 ； 绒毛状结肠腺瘤 ； 瘤形成 (neoplasia) ；上皮性瘤形成 ； 淋巴瘤 ； 乳腺癌 (mammary carcinoma) ； 基底细胞癌 ； 鳞状细胞癌 ； 光化性角 化病 ； 肿瘤疾病， 包括实体肿瘤 ； 颈部或头部肿瘤 ； 真性红细胞增多症 ； 原发性血小板增多 症和骨髓纤维化伴骨髓外化生。
     在其它实施方案中， 疾患或病症 ( 例如 PI3K 介导的 ) 选自 ： 表皮增殖过度、 前列腺 增生、 瘤形成、 上皮性瘤形成、 Cowden 综合征、 莱尔米特 - 杜克洛病 (Lhermitte-Dudos 病 ) 或 Bannayan-Zonana 综合征、 哮喘、 COPD、 ARDS、 吕弗勒综合征 (Loffler′ s syndrome)、 嗜 酸性粒细胞性肺炎、 寄生虫 ( 尤其后生动物 ) 侵染 ( 包括热带肺嗜酸性粒细胞增多症 )、 支 气管肺曲霉病、 结节性多动脉炎 ( 包括 Churg-Strauss 综合征 )、 嗜酸细胞肉芽肿、 由药物反 应引起的侵袭气道的嗜酸性粒细胞相关病症、 银屑病、 接触性皮炎、 特应性皮炎、 斑秃、 多形 性红斑、 疱疹样皮炎、 硬皮病、 白癜风、 变应性血管炎、 荨麻疹、 大疱性类天疱疮、 红斑狼疮、 天疱疮、 获得性大疱性表皮松解、 自身免疫性血液学病症 ( 例如溶血性贫血、 再生障碍性贫 血、 纯红细胞贫血和特发性血小板减少 )、 系统性红斑狼疮、 多发性软骨炎、 硬皮病、 韦格纳 肉芽肿病 (Wegener granulomatosis)、 皮肌炎、 慢性活动性肝炎、 重症肌无力、 斯 - 琼氏综 合征 (Steven-Johnson syndrome)、 特发性口炎性腹泻、 自身免疫性炎性肠病 ( 例如溃疡性 结肠炎及局限性回肠炎 )、 内分泌性眼病、 格雷夫斯氏病 (Grave’ s 病 )、 结节病、 牙槽炎 / 肺 泡炎、 慢性过敏性肺炎、 多发性硬化、 原发性胆汁性肝硬化、 ( 前及后 ) 葡萄膜炎、 间质性肺 纤维化、 银屑病性关节炎、 肾小球肾炎、 心血管疾病、 动脉粥样硬化、 高血压、 深部静脉血栓 形成、 中风、 心肌梗塞、 不稳定型心绞痛、 血栓栓塞、 肺栓塞、 血栓溶解疾病、 急性动脉缺血、 外周血栓性闭塞和冠状动脉疾病、 再灌注损伤、 视网膜病变如糖尿病性视网膜病变或高压 氧诱导的视网膜病变、 和以眼内压升高或分泌眼房水为特征的疾患， 例如青光眼。
     对于上述用途， 所需剂量当然会根据施用方式、 拟治疗的特定疾患及所期望的治 疗效果而变化。通常， 将满意结果指定为通过全身性施用日剂量约 0.03-10.0mg/kg 体重获 得。 较大哺乳动物例如人类的指定日剂量是在约 0.5mg 至约 1g 的范围内， 其可方便地施用， 例如， 多达一天四次地分剂量施用或以延迟形式施用。适用于口服施用的单位剂型包含约 0.1-500mg 活性成分。
     式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物可通过任意一种常规途径施用， 尤 其经肠， 例如经口， 例如以片剂或胶囊剂的形式 ； 或胃肠外， 例如以可注射溶液或混悬液的 形式 ； 局部， 例如以洗剂、 凝胶、 软膏或乳膏形式 ； 通过吸入、 鼻内 ； 或以栓剂形式。
     式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物可以以游离形式或以如上文所述 可药用盐的形式施用。该盐可以采用常规方式制备并显示与游离化合物相同级别的活性。
     因此， 本发明还提供 ：
     ●预防和治疗需要该治疗的受试者中的如上文所述的由 PI3、 例如 PI3 激酶 α 酶激活而介导的疾患、 病症或疾病的方法， 该方法包含向所述受试者给予有效量的式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物或其可药用盐。
     ●游离形式或可药用盐形式的式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物作 为药物、 例如在本文所述的任一方法中的用途。
     ●游离形式或可药用盐形式的式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物， 用 作药物， 例如用于本文所述任一方法中， 特别用于一种或多种磷脂酰肌醇 3- 激酶介导的疾 病。●游离形式或可药用盐形式的式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物在 本文所述任一方法中的用途， 特别用于治疗一种或多种磷脂酰肌醇 3- 激酶介导的疾病。
     ●游离形式或可药用盐形式的式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物在 本文所述任一方法中的用途， 特别用于制备治疗一种或多种磷脂酰肌醇 3- 激酶介导的疾 病的药物。
     PI3K 可用作整合平行的信号传导路径的第二信使节点， 陆续有证据显示 PI3K 抑 制剂与其它路径抑制剂的联合可用于治疗人类癌症及增殖性疾病。约 20-30％的人类乳癌 过度表达 Her-2/neu-ErbB2， 即药物曲妥珠单抗 (trastuzumab) 的靶点。 尽管曲妥珠单抗已 经在一些表达 Her-2/neu-ErbB2 的受试者中显示持久响应， 但仅这些受试者中的亚群有反 应。最近的成果已经显示， 曲妥珠单抗与 PI3K 或 PI3K/AKT 路径的抑制剂的联合可显著改 善该有限的响应率 (Chan 等人， Breast Can.Res.Treat.91 ： 187(2005) ； Woods Ignatoski 等人， Brit.J.Cancer 82 ： 666(2000) ； Nagata 等人， Cancer Cell 6 ： 117(2004))。
     多种人类恶性肿瘤表达 Her1/EGFR 激活突变或 Her1/EGFR 含量增加， 且已经研发 出多种抗体和小分子抑制剂来对抗此受体酪氨酸激酶， 包括塔西法 (tarceva)、 吉非替尼 (gefitinib) 及艾比特思 (erbitux)。 然而， 尽管 EGFR 抑制剂对某些人类肿瘤 ( 例如 NSCLC) 显示抗肿瘤活性， 但其不能提高所有表达 EGFR 肿瘤患者中的总体患者存活率。这可通过以 下事实合理解释 ： 多种恶性肿瘤中， Her1/EGFR 的许多下游靶点以高频率突变或失调， 包括 PI3K/Akt 路径。例如， 在体外测定中， 吉非替尼抑制腺癌细胞系的生长。尽管如此， 仍可选 择对吉非替尼具有抗性、 证实 PI3/Ak 路径激活增加的该类细胞系的亚克隆。该路径的下调 或抑制使抗性亚克隆对吉非替尼敏感 (Kokubo 等人， Brit.J.Cancer 92 ： 1711(2005))。此 外， 在荷有 PTEN 突变且过度表达 EGFR 的细胞系的体外乳癌模型中， 抑制 PI3K/Akt 路径和 EGFR 二者产生协同效应 (She 等人， Cancer Cell 8 ： 287-297(2005))。这些结果显示， 吉非 替尼与 PI3K/Akt 路径抑制剂的联合将是有吸引力的癌症治疗策略。
     AEE778(Her-2/neu/ErbB2、 VEGFR 和 EGFR 的抑制剂 ) 与 RAD001(Akt 的下游靶点 mTOR 的抑制剂 ) 的联合在胶质母细胞瘤异种移植物模型中产生较单独任一药剂更强的联 合功效 (Goudar 等人， Mol.Cancer.Ther.4 ： 101-112(2005))。
     抗雌激素药例如他莫昔芬 (tamoxifen) 通过诱导细胞周期停滞来抑制乳癌生长， 这需要细胞周期抑制剂 p27Kip 的作用。近年， 已经证实， Ras-Raf-MAP 激酶路径的激活会 改变 p27Kip 的磷酸化状态， 由此消弱其遏阻细胞周期的抑制活性， 从而造成抗雌激素抗性 (Donovan 等人， J.Biol.Chem.276 ： 40888， (2001))。如 Donovan 等人报道， 通过使用 MEK 抑 制剂治疗来抑制 MAPK 信号传导逆转了激素难治性乳癌细胞系中 p27 的异常磷酸化状态， 从而恢复激素敏感性。类似地， Akt 对 p27Kip 的磷酸化也消除了其使细胞周期停滞的作用 (Viglietto 等人， Nat Med.8 ： 1145(2002))。
     因此， 另一方面， 本发明还提供式 (I)、 (IA)、 (IA’ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物， 用 于治疗激素依赖性癌症如乳癌及前列腺癌。 该用途旨在逆转使用常规抗癌剂时这类癌症中 常见的激素抗性。
     在血液学癌症如慢性髓性白血病 (CML) 中， 染色体易位是组成型激活 BCR-Abl 酪 氨酸激酶的原因。患病患者由于 Abl 激酶活性受到抑制而对小分子酪氨酸激酶抑制剂伊 马替尼 (imatinib) 产生反应。然而， 许多患有晚期疾病的患者开始对伊马替尼反应， 但是后来由于 Abl 激酶结构域中产生赋予抗性的突变而复发。体外研究已显示 BCR-Abl 采用 Ras-Raf 激酶路径来引发其效应。 此外， 抑制相同路径中的一种以上的激酶可提供对抗赋予 抗性突变的额外保护。
     因此， 另一方面， 本发明还提供式 (I)、 (IA)、 (IA’ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物， 用于 联合至少一种选自激酶抑制剂的其他药剂， 例如格列卫 (Gleevec ) 以治疗血液学癌症， 例如慢性髓性白血病 (CML)。该用途旨在逆转或预防对所述至少一种其他药剂的抗性。 由于 PI3K/Akt 路径的激活会驱动细胞存活， 因此， 抑制该路径并联合促使癌细 胞凋亡的疗法、 包括放射疗法及化学疗法， 会带来改良的反应 (Ghobrial 等人， CA Cancer J.Clin 55 ： 178-194(2005))。作为一个实例， PI3K 激酶抑制剂与卡铂联合在体外细胞增 殖和细胞凋亡测定中和在异种移植物卵巢癌模型的体内肿瘤功效中均显示了协同效应 (Westfall 和 Skinner， Mol.Cancer Ther.4 ： 1764-1771(2005))。
     除癌症和增殖性疾病外， 越来越多的证据显示 1A 类及 1B 类 P13 激酶抑制剂在其 他疾病领域中具有治疗用途。已经显示 p110β(PIK3CB 基因的 P13K 同种型产物 ) 的抑制 牵涉于剪切力诱导的血小板激活 (Jackson 等人， Nature Medicine 11 ： 507-514(2005))。 因此， 抑制 p110β 的 PI3K 抑制剂可在抗血栓疗法中作为单一药剂使用或联合使用。同 种型 p110δ 即 PIK3CD 基因的产物， 在细胞功能和分化 (Clayton 等人， J.Exp.Med.196 ： 753-763(2002))、 T- 细 胞 依 赖 性 及 非 依 赖 性 抗 原 反 应 (Jou 等 人， Mol.Cell.Biol.22 ： 8580-8590(2002) 和肥大细胞分化 (Ali 等人， Nature 431 ： 1007-1011(2004)) 中非常重 要。因此， 预期 p110δ- 抑制剂可用于治疗 B- 细胞驱动的自身免疫疾病和哮喘。最后，
     p110γPI3KC基因的同种型产的抑制会导致降低的 T 细但非 B 细反应 .(Reif等人， J.Immunol.173 ： 2236-2240(2004)， 且其抑制在自身免疫疾病的动物模型中显示了功 效 (Camps 等人， Nature Medicine 11 ： 936-943(2005) ； Barber 等人， Nature Medicine 11 ： 933-935(2005)。
     本发明进一步提供药物组合物， 包含至少一种式 (I)、 (IA)、 (IA’ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物与适于给人或动物受试者施用的药用赋形剂， 其单独或与另一治疗剂、 例如另 一抗癌剂联合。
     本发明进一步提供治疗患有细胞增殖性疾病如癌症的人或动物受试者的方法。 因 此， 本发明提供需要该治疗的人和动物的治疗方法， 其包括向该受试者施用单独或与一种 或多种其他治疗剂如其他抗癌剂组合的治疗有效量的式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物。 具体而言， 组合物或者以联合治疗剂共同配制或单独施用。 适宜与式 I 化合物 一起使用的抗癌剂包括但不限于一种或多种选自下列的化合物 ： 激酶抑制剂、 抗雌激素药、 抗雄激素药、 其他抑制剂、 癌症化疗药物、 烷化剂、 螯合剂、 生物反应调节剂、 癌症疫苗、 用于 反义疗法的药物， 如下所述 ：
     A. 激酶抑制剂 ： 作为抗癌剂与式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物联 合使用的激酶抑制剂包括表皮生长因子受体 (EGFR) 激酶抑制剂， 例如小分子喹唑啉类， 例如吉非替尼 (US 5457105、 US 5616582 和 US 5770599)、 ZD-6474(WO 01/32651)、 厄洛 替尼 (erlotinib)( 塔西法 ， US 5,747,498 和 WO 96/30347) 及拉帕替尼 (lapatinib)(US 6,727,256 和 WO 02/02552) ； 血 管 内 皮 生 长 因 子 受 体 (VEGFR) 激 酶 抑 制 剂， 包括SU-11248(WO 01/60814)、 SU 5416(US 5,883,113 和 WO 99/61422)、 SU 6668(US 5,883,113 和 WO 99/61422)、 CHIR-258(US 6,605,617 和 US 6,774,237)、 瓦他拉尼 (vatalanib) 或 PTK-787(US 6,258,812)、 VEGF-Trap(WO 02/57423)、 B43- 染料木黄酮 (WO-09606116)、 芬 维 a 胺 (fenretinide)( 视黄酸对羟基苯基胺 )(US 4,323,581)、 IM-862(WO 02/62826)、 贝 伐珠单抗 (bevacizumab) 或 Avastin (WO 94/10202)、 KRN-951、 3-[5-( 甲基磺酰基哌啶甲 基 )- 吲哚基 ]- 喹诺酮、 AG-13736 和 AG-13925、 吡咯并 [2， 1-f][1， 2， 4] 三嗪类、 ZK-304709、 Veglin 、 VMDA-3601、 EG-004、 CEP-701(US 5,621,100)、 Cand5(WO 04/09769) ； Erb2 酪氨 酸激酶抑制剂， 例如帕妥珠单抗 (pertuzumab)(WO 01/00245)、 曲妥珠单抗及利妥昔单抗 (rituximab) ； Akt 蛋白激酶抑制剂， 如 RX-0201 ； 蛋白激酶 C(PKC) 抑制剂， 如 LY-317615(WO 95/17182) 及哌立福辛 (perifosine)(US 2003171303) ； Raf/Map/MEK/Ras 激酶抑制剂包 括索拉非尼 (sorafenib)(BAY 43-9006)、 ARQ-350RP、 LErafAON、 BMS-354825AMG-548 和 WO 03/82272 中公开的其他抑制剂 ； 纤维母细胞生长因子受体 (FGFR) 激酶抑制剂 ； 细胞依赖 血小 性激酶 (CDK) 抑制剂， 包括 CYC-202 或 roscovitine(WO 97/20842 和 WO 99/02162) ； 板衍生性生长因子受体 (PDGFR) 激酶抑制剂如 CHIR-258、 3G3mAb、 AG-13736、 SU-11248 和 SU6668 ； 及 Bcr-Abl 激酶抑制剂和融合蛋白如 STI-571 或格列卫 (Gleevec )( 伊马替尼 )。
     B. 抗雌激素药 ： 用于与式 (I)、 (IA)、 (IA’ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物联合用 于抗癌疗法中的雌激素靶向剂包括选择性雌激素受体调节剂 (SERMs)， 包括他莫西芬、 托 瑞米芬 (toremifene)、 雷洛昔芬 (raloxifene) ； 芳香酶抑制剂， 包括瑞宁得 (Arimidex 或氟维司群) 或阿那曲唑 (anastrozole) ； 雌激素受体下调剂 (ERDs)， 包括 Faslodex(fulvestrant)。
     C. 抗雄激素药 ： 用于与式 (I)、 (IA)、 (IA’ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物联合用于 抗癌疗法中的雄激素靶向剂包括氟他胺 (flutamide)、 比卡鲁胺 (bicalutamide)、 非那雄 胺 (finasteride)、 氨鲁米特 (aminoglutethamide)、 酮康唑 (ketoconazole) 及皮质类固醇 (corticosteroid)。
     D. 其他抑制剂 ： 作为抗癌剂与式 (I)、 (IA)、 (IA ′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物 联合使用的其他抑制剂包括蛋白法尼基转移酶抑制剂， 包括替比伐尼 (tipifarnib) 或 R-115777(US 2003134846 和 WO 97/21701)、 BMS-214662、 AZD-3409 及 FTI-277 ； 拓扑异构 酶抑制剂， 包括美巴龙 (merbarone) 和双氟莫替康 (diflomotecan)(BN-80915) ； 有丝分裂 驱动蛋白纺锤体蛋白 (KSP) 抑制剂， 包括 SB-743921 和 MKI-833 ； 蛋白酶体调节剂， 例如硼 替佐米 (bortezomib) 或 Velcade (US 5,780,454)、 XL-784 ； 和环加氧酶 (COX-2) 抑制剂， 包括非甾类抗炎药物 I(NSAID)。
     E. 癌症化疗药物 ： 作为抗癌剂与式 (I)、 (IA)、 (IA ′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合 物联合使用的特定癌症化疗剂包括阿那曲唑 (Arimidex )、 比卡鲁胺 (Casodex )、 硫 酸博来霉素 (bleomycin sulfate)(Blenoxane 安注射液 (Busulfex )、 白消安 (busulfan)(Myleran )、 白消)、 卡培他滨 (capecitabine)(Xeloda )、 卡莫司汀 (BiCNU)、 N4- 戊氧基羰基 -5- 去氧 -5- 氟胞苷、 卡铂 (Paraplatin (Leukeran)、 苯丁酸氮芥 (chlorambucil))、 顺 铂 (cisplatin)(Platinol22)、 克 拉 屈 滨 (cladribine)(LeustatinCN 102471351 A说明书或 Neosar17/81 页)、 环 磷 酰 胺 (cyclophosphamide)(Cytoxan)、 阿 糖 胞 苷 (cytarabine)、 )、 阿糖胞苷脂质体注射液胞 嘧 啶 阿 糖 胞 苷 (cytosine arabinoside)(Cytosar-U (DepoCyt )、 达 卡 巴 嗪 (dacarbazine)(DTIC-Dome)、 更 生 霉 素 (dactinomycin)( 放 )、 柔红霉素柠檬线 菌 素 D(Actinomycin D)、 Cosmegan)、 盐 酸 柔 红 霉 素 (Cerubidine 酸盐脂质体注射液 (DaunoXome (Taxotere)、 地塞米松 (dexamethasone)、 多西他赛 (docetaxel) 、 Rubex )、， US 2004073044)、 盐酸多柔比星 (doxorubicin)(Adriamycin )、 磷酸氟达拉滨 (Fludara依托泊苷 (etoposide)(Vepesid 、 Efudex )、 氟他胺 (Eulexin)、 5- 氟尿嘧啶 (Adrucil)、 替扎他滨 (tezacitibine)、 吉西他滨 (Gemcitabine) )、 伊达比星 (Idarubicin)(Idamycin )、 L- 天( 二氟去氧胞苷 )、 羟基脲 (hydroxyurea)(Hydrea )、 异 环 磷 酰 胺 (ifosfamide)(IFEX 冬 酰 胺 酶 (ELSPAR (Alkeran)、 伊 立 替 康 (irinotecan)(Camptosar)、 甲 酰 四 氢 叶 酸 钙 (leucovorin calcium)、 美 法 仑 (melphalan) )、 氨甲喋呤 (methotrexate)(Folex )、 米托)、 6- 巯基嘌呤 (Purinethol蒽醌 (mitoxantrone)(Novantrone)、 麦罗塔 (mylotarg)、 紫杉醇 (Taxol)、 菲尼克斯(phoenix)(Yttrium90/MX-DTPA)、 喷 司 他 丁 (pentostatin)、 聚 苯 丙 生 20(polifeprosan 20) 与 卡 莫 司 汀 植 入 物 (Gliadel )、 柠 檬 酸 他 莫 西 芬 (Nolvadex )、 替尼泊苷 (teniposide)(Vumon (Tirazone )、 6- 硫 鸟 嘌 呤、 噻 替 哌 (thiotepa)、 替 拉 扎 明 (tirapazamine) )、 长春碱 (vinblastine)(Velban )。)、 注射用托泊替康盐酸盐 (Hycamptin)、 长春新碱 (vincristine)(Oncovin
     ) 和长春瑞滨 (vinorelbine)(NavelbineF. 烷 化 剂 ： 用 于 与 式 (I)、 (IA)、 (IA ′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化 合 物 联 合 使 用 的 烷 基 化 剂 包 括 VNP-40101M 或 克 瑞 替 嗪 (cloretizine)、 奥 沙 利 铂 (oxaliplatin) (US 4,169,846、 WO 03/24978 和 WO 03/04505)、 葡 磷 酰 胺 (glufosfamide)、 马磷酰胺 (mafosfamide)、 凡 毕 复 (etopophos)(US 5,041,424)、 泼 尼 莫 司 汀 (prednimustine)、 曲 奥舒凡 (treosulfan) ； 白消安 ； 伊罗夫文 (irofluven)( 酰基富烯 (acylfulvene)) ； 本可 麦 定 (penclomedine) ； 吡 唑 啉 吖 啶 (pyrazoloacridine)(PD-115934) ； O6- 苄 基 鸟 嘌 呤 ； 地西他滨 (decitabine)(5- 氮杂 -2- 去氧胞苷 ) ； 伯斯坦尼辛 (brostallicin) ； 丝裂霉素 C(mitomycin C)(MitoExtra) ； TLK-286(Telcyta ) ； 替莫唑胺 (temozolomide) ； 曲贝替定 (trabectedin)(US 5,478,932) ； AP-5280( 顺铂的铂酸盐制剂 ) ； 泊非霉素 (porfiromycin) 和克拉兹德 (clearazide)( 氮芥 (meclorethamine))。
     G. 螯 合 剂 ： 用 于 与 式 (I)、 (IA)、 (IA ′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化 合 物 联 合 使 用 的 螯 合 剂 包 括 四 硫 钼 酸 盐 (tetrathiomolybdate)(WO 01/60814) ； RP-697 ； 嵌合 T84.66(cT84.66) ； 钆膦维司 (gadofosveset)(Vasovist ) ； 去铁敏 (deferoxamine) 及任 选与电穿孔 (EPT) 联合的博来霉素。
     H. 生物反应调节剂 ： 用于与式 (I)、 (IA)、 (IA ′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物联 合使用的生物反应调节剂如免疫调节剂包括星形孢霉素 (staurosprine) 和其大环类似 物， 包括 UCN-01、 CEP-701 和米哚妥林 (midostaurin)( 参见 WO 02/30941、 WO 97/07081、WO 89/07105、 US 5,621,100、 WO 93/07153、 WO 01/04125、 WO 02/30941、 WO 93/08809、 WO 94/06799、 WO 00/27422、 WO 96/13506 和 WO 88/07045) ； 角 鲨 胺 (squalamine)(WO 01/79255) ； DA-9601(WO 98/04541 和 US 6,025,387) ； 阿 仑 珠 单 抗 (alemtuzumab) ； 干扰 素 ( 例如 IFN-a、 IFN-b 等 ) ； 白介素、 尤其 IL-2 或阿地白介素 (aldesleukin) 以及 IL-1、 IL-3、 IL-4、 IL-5、 IL-6、 IL-7、 IL-8、 IL-9、 IL-10、 IL-11、 IL-12 及其具有大于天然人类序 列的 70％的氨基酸序列的活性生物变异体 ； 六甲蜜胺 (altretamine)(Hexalen ) ； SU 101 或来氟米特 (leflunomide)(WO 04/06834 和 US 6,331,555) ； 咪唑并喹啉类， 如瑞喹莫德 (resiquimod) 和咪喹莫德 (imiquimod)(US 4,689,338、 5,389,640、 5,268,376、 4,929,624、 5,266,575 、 5,352,784 、 5,494,916 、 5,482,936 、 5,346,905 、 5,395,937 、 5,238,944 和 5,525,612) ； 和 SMIP， 包括苯并吡咯类、 蒽醌类、 缩胺基硫脲类 (thiosemicarbazones) 及色 胺酮 (tryptanthrin)(WO 04/87153、 WO 04/64759 和 WO 04/60308)。
     I. 癌 症 疫 苗 ： 用 于 与 式 (I)、 (IA)、 (IA ′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化 合 物 联 合 使 用 的 抗 癌 疫 苗 包 括 Avicine (Tetrahedron Lett.26 ： 2269-70(1974)) ； 奥戈伏单 抗 (oregovomab)(OvaRex )； Theratope (STn-KLH) ； 黑色素瘤疫苗； GI-4000 系 列(GI-4014、 GI-4015 和 GI-4016)， 其 针 对 Ras 蛋 白 的 五 种 突 变 ； GlioVax-1 ； MelaVax ； Advexin 或 INGN-201(WO 95/12660) ； Sig/E7/LAMP-1， 其编码 HPV-16 E7 ； MAGE-3 疫苗或 M3TK(WO 94/05304) ； HER-2VAX ； ACTIVE， 其刺激对肿瘤具有特异性的 T- 细胞 ； GM-CSF 癌症 疫苗 ； 及基于单核细胞增多性李斯特菌 (Listeria monocytogenes) 的疫苗。
     J. 反义疗法 ： 用于与式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物联合使用的 抗癌剂也包括反义组分， 例如 AEG-35156(GEM-640) ； AP-12009 和 AP-11014(TGF-β2- 特异 性反义寡核苷酸 ) ； AVI-4126 ； AVI-4557 ； AVI-4472 ； 奥利莫森 (oblimersen)(Genasense )； JFS2 ； 安普利森 (aprinocarsen)(WO 97/29780) ； GTI-2040(R2 核糖核酸还原酶 mRNA 反 义寡聚物 )(WO 98/05769) ； GTI-2501(WO 98/05769) ； 脂质体包封的 c-Raf 反义寡去氧核苷 酸 (LErafAON)(WO 98/43095) ； 和 Sirna-027( 基于 RNAi 的靶向 VEGFR-1 mRNA 的治疗剂 )。
     式 (I)、 (IA)、 (IA ′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物也可以与支气管扩张药物或抗 组胺药物物质联合在药物组合物中。该类支气管扩张药物包括抗胆碱能药物或抗毒蕈 碱剂， 尤其格隆溴铵 (glycopyrrolate)、 异丙托溴铵 (ipratropium bromide)、 氧托溴铵 (oxitropium bromide) 和噻托溴铵 (tiotropium bromide)、 OrM3、 阿地溴铵 (aclidinium)、 CHF5407、 GSK233705 和 β-2- 肾 上 腺 素 能 受 体 激 动 剂， 例 如 舒 喘 灵 (salbutamol)、 特 普 他 林 (terbutaline)、 沙 美 特 罗 (salmeterol)、 卡 莫 特 罗 (carmoterol)、 米维特罗 (milveterol) 及尤其是茚达特罗 (indacaterol) 和福莫特罗 (formoterol)。共同治疗 性抗组胺药物物质包括盐酸西替利嗪 (cetirizine hydrochloride)、 富马酸氯马斯汀 (clemastine fumarate)、 异丙嗪 (promethazine)、 氯雷他定 (loratadine)、 地氯雷他定 (desloratadine)、 苯海拉明 (diphenhydramine) 和盐酸非索非那定。
     本发明在另一方面提供包含式 (I)、 (IA)、 (IA ′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物和 一种或多种可用于治疗血栓溶解疾病、 心脏病、 中风等的化合物的组合。该类组合物包括 阿司匹林、 链激酶、 纤维蛋白溶酶原 (plasminogen) 激活剂、 尿激酶、 抗凝血剂、 抗血小板药 ( 例如 PLAVIX ； 硫酸氢氯吡格雷 (clopidogrel bisulfate)、 他汀类药物 (statin)( 例如LIPITOR 或阿伐他汀钙 (Atorvastatin calcium)、 ZOCOR( 辛伐他汀 )、 CRESTOR( 瑞舒伐他 汀 (Rosuvastatin)) 等 )、 β 阻断剂 ( 例如阿替洛尔 (Atenolol))、 NORVASC( 苯磺酸氨氯地 平 (amlodipine besylate)) 和 ACE 抑制剂 ( 例如赖诺普利 (lisinopril))。
     本发明在另一方面提供包含式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物和一 种或多种可用于抗高血压治疗的化合物的组合。该类化合物包括 ACE 抑制剂 ； 降脂剂如他 汀类药物、 LIPITOR( 阿托伐他汀钙 ) ； 钙通道阻断剂， 例如 NORVASC( 苯磺酸氨氯地平 )。
     本发明在另一方面提供包含式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物和一 种或多种选自下列的化合物的组合 ： 贝特类药物 (fibrates)、 β 阻断剂、 NEPI 抑制剂、 血管 紧张素 -2 受体抗结剂和血小板聚集抑制剂。
     本发明在另一方面提供包含式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物和适于 治疗炎症疾病、 包括类风湿性关节炎的化合物的组合。该类化合物可选自 ： TNF-α 抑制剂， 如抗 -TNF-α 单克隆抗体 ( 如 REMICADE、 CDP-870) 和 D2E7(HUMIRA) 及 TNF 受体免疫球蛋白 融合分子 ( 例如 ENBREL)、 IL-1 抑制剂、 受体拮抗剂或可溶性 IL-1Rα( 例如 KINERET 或 ICE 抑制剂 )、 非甾体抗炎药 (NSAIDS)、 吡罗昔康 (piroxicam)、 双氯芬酸 (diclofenac)、 萘普 生 (naproxen)、 氟比洛芬 (flurbiprofen)、 非诺洛芬 (fenoprofen)、 酮洛芬 (ketoprofen)、 布 洛 芬 (ibuprofen)、 灭 酸 类 (fenamates)、 甲 芬 那 酸 (mefenamic acid)、 吲哚美辛 (indomethacin)、 舒林酸 (sulindac)、 阿扎丙宗 (apazone)、 吡唑啉酮类 (pyrazolones)、 保 泰松 (phenylbutazone)、 阿司匹林 (aspirin)、 COX-2 抑制剂 ( 例如 CELEBREX( 塞来昔布 (celecoxib))、 PREXIGE( 鲁米考昔 (lumiracoxib)))、 金属蛋白酶抑制剂 ( 优选 MMP-13 选 择性抑制剂 )、 p2x7 抑制剂、 α2α 抑制剂、 NEUROTIN、 普瑞巴林 (pregabalin)、 低剂量氨甲 喋呤、 来氟米特、 羟氯喹、 d- 青霉胺、 金诺芬 (auranofin) 或胃肠外或口服金。
     本发明在另一方面提供包含式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物和适于 治疗骨关节炎的化合物的组合。 该类化合物可选自 ： 标准非甾体抗炎药 ( 下文称为 NSAID)， 例如吡罗昔康、 双氯芬酸 ； 丙酸类， 例如萘普生、 氟比洛芬、 非诺洛芬、 酮洛芬和布洛芬 ； 灭 酸类 (fenamates)， 例如甲芬那酸、 吲哚美辛、 舒林酸、 阿扎丙宗 ； 吡唑啉酮类， 例如保泰松 ； 水杨酸类， 例如阿司匹林 ； COX-2 抑制剂， 例如塞来昔布、 伐地考昔 (valdecoxib)、 鲁米考昔 和伊诺考昔 (etoricoxib) ； 镇痛药及关节内疗法， 例如皮质类固醇及透明质酸， 例如海尔 根 (hyalgan) 和欣维可 (synvisc)。
     本发明在另一方面提供包含式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物和抗 病毒药和 / 或防腐化合物的组合。该类抗病毒药可选自泛罗赛 (Viracept)、 AZT、 阿昔洛韦 (acyclovir) 和泛昔洛韦 (famciclovir)。该防腐化合物可选自 Valant。
     本发明在另一方面提供包含式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物和一 种或多种选自下列的药剂的组合 ： CNS 药剂， 例如抗抑郁药 ( 舍曲林 (sertraline))、 抗-帕 金森药物 ( 如盐酸司立吉林 (deprenyl)、 左旋多巴 (L-dopa)、 雷奎普 (Requip)、 Mirapex ； MAOB 抑 制 剂 ( 例 如 司 来 吉 兰 (selegine) 和 雷 沙 吉 兰 (rasagiline) ； comP 抑 制 剂 ( 如 Tasmar) ； A-2 抑制剂 ； 多巴胺再摄取抑制剂 ； NMDA 拮抗剂 ； 尼古丁激动剂 ； 多巴胺激动剂 ； 及神经元型一氧化氮合酶抑制剂。
     本发明在另一方面提供包含式 (I)、 (IA)、 (IA ′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物和 一种或多种抗阿尔茨海默病药物的组合。该类抗阿尔茨海默病药物可选自 ： 多奈哌齐(donepezil)、 他克林 (tacrine)、 α2δ 抑制剂、 NEUROTIN、 普瑞巴林 (pregabalin)、 COX-2 抑制剂、 丙戊茶碱 (propentofylline) 或美曲膦酯 (metryfonate)。
     本发明在另一方面提供包含式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物和抗 骨质疏松药和 / 或免疫抑制剂的组合。该类骨质疏松药可选自 ： EVISTA( 盐酸雷洛昔芬 )、 屈洛昔芬 (droloxifene)、 拉索昔芬 (lasofoxifene) 或福善美 (fosomax)。该类免疫抑制 剂可选自 FK-506 和雷帕霉素。
     在优选的实施方案的一方面， 提供了包括一种或多种式 (I)、 (IA)、 (IA’ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物和本文所公开组合伴侣的药盒。代表性药盒包括 PI3K 抑制剂化合物 ( 例 如式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物 ) 和包括通过施用 PI3K 抑制量的化合物 来治疗细胞增殖性疾病的指导的包装说明书或其它标识。
     通常， 式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物可通过用于具有类似效用的 药剂的任一种公认的施用方式以治疗有效量施用。式 (I)、 (IA)、 (IA’ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物即活性成分的实际量应视多种因素而定， 如待治疗疾病的严重度、 患者的年龄及相 对健康状况、 所用化合物的效能、 施用途径和形式、 及其他因素。药物的施用可以每天 1 次 以上， 优选每天 1 次或 2 次。所有这些因素均为主治医师所熟知。式 I 化合物的治疗有效 量可在约 0.05 至约 50mg/ 公斤接受者体重 / 天的范围内 ； 优选为约 0.1 至 25mg/kg/ 天， 更 优选为 0.5 至 10mg/kg/ 天。因此， 对于给 70kg 患者施用， 该剂量范围最优选为约 35-70mg/ 天。
     通常， 式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物可作为药物组合物通过任一 以下途径施用 ： 经口、 全身 ( 例如经皮、 鼻内或通过栓剂 )、 或胃肠外 ( 例如肌内、 静脉内或 皮下 ) 施用。优选的施用方式是使用可根据痛苦程度调节的方便日剂量方案经口施用。组 合物可采取如下形式 ： 片剂、 丸剂、 胶囊、 半固体剂、 粉剂、 缓释制剂、 溶液、 混悬液、 酏剂、 气 溶胶或任何其他合适组合物。用于施用式 I 化合物的另一优选方式是吸入。其是将治疗剂 直接递送至呼吸道的有效方法。
     制剂的选择取决于各种因素， 例如药物施用方式和药物物质的生物利用度。对于 经由吸入传递而言， 可将化合物配制成液体溶液、 混悬液、 气溶胶推进剂或干粉剂并装填至 用于施用的适宜分配器中。 有几种类型的药物吸入装置 - 喷雾器吸入器、 定量吸入器 (MDI) 及干粉吸入器 (DPI)。 喷雾器装置产生高速气流， 使治疗剂 ( 其以液体形式配制 ) 以雾形式 喷出， 被载入患者的呼吸道中。MDI 通常是用压缩气体封装的制剂。在启动后， 该装置由压 缩气体释放出定量的治疗剂， 由此提供一种施用定量药剂的可靠方法。 DPI 以自由流动粉剂 形式分配治疗剂， 该自由流动粉剂在呼吸期间可通过该装置分散于患者的吸入气流中。为 了获得自由流动粉剂， 可用赋形剂例如乳糖配制该治疗剂。测定量的治疗剂以胶囊形式储 存并在每次启动时进行分配。
     本发明还涉及式 I 化合物的粒径介于 10-1000nm、 优选 10-400nm 之间的制剂。 已经 根据增加表面积即缩小粒径可提高生物利用度的原理， 研发出特别适用于那些低生物利用 度药物的这类药物制剂。 例如， U.S.4,107,288 描述了一种具有 10nm 至 1000nm 的粒径范围 的颗粒的药物制剂， 其中活性成分载于大分子交联基质上。 U.S.5,145,684 描述了一种药物 制剂的制备， 其中将药物物质在表面活性剂存在下粉碎成纳米颗粒 ( 平均粒径为 400nm)， 然后将这些纳米颗粒分散于液体介质中， 得到具有相当高生物利用度的药物制剂。两个文件均通过引用并入。
     另一方面， 本发明提供包含 ( 治疗有效量的 ) 式 (I)、 (IA)、 (IA’ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物和至少一种可药用赋形剂的组合物。 可接受的赋形剂无毒性， 有助于施用， 且不 会对式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物的治疗效果造成不利影响。此赋形剂 可以是任何固体、 液体、 半固体或在气溶胶组合物的情况下为气体赋形剂， 其通常可由本领 域技术人员获得。 ，
     固体药物赋形剂包括淀粉、 纤维素、 滑石、 葡萄糖、 乳糖、 蔗糖、 明胶、 麦芽、 稻米、 面 粉、 白垩、 硅胶、 硬脂酸镁、 硬脂酸钠、 甘油单硬脂酸酯、 氯化钠、 脱脂奶粉等。
     液体和半固体赋形剂可选自甘油、 丙二醇、 水、 乙醇及各种油， 包括源于石油、 动 物、 植物或合成来源的油， 例如花生油、 大豆油、 矿物油、 芝麻油等。 优选的液体载体、 尤其是 用于可注射溶液包括水、 盐水、 含水右旋糖和二醇类。
     压缩气体可用于将式 I 化合物以气溶胶形式分散。适用于此目的的惰性气体 有 氮 气、 二 氧化碳 等。 其他适合的 药 用赋 形剂 及其 制剂 记载 于由 E.W.Martin 编 辑的 Remington′ s Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Company， 第 18 版， 1990)。
     制剂中化合物的量可在本领域技术人员采用的整个范围内变化。通常， 以重量百 分比 ( 重量％ ) 计， 该制剂可含有总制剂的约 0.01-99.99 重量％的式 I 化合物， 其余部分 为一种或多种适合的药用赋形剂。优选地， 该化合物是以约 1-80％重量％的水平存在。
     本发明另外涉及包含 ( 即含有或由…组成 ) 至少一种式 (I)、 (IA)、 (IA’ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物和至少一种可药用赋形剂的药物组合物。
     包含游离形式或可药用盐形式的式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物 与至少一种可药用赋形剂 ( 例如载体和 / 或稀释剂 ) 的药物组合物可以以常规方式通过混 合此类组分来制备。
     包含游离形式或可药用盐形式的式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物 且另外包含组合伴侣 ( 在一个剂量单元形式中或作为药盒 ) 与至少一种可药用载体和 / 或 稀释剂的组合药物组合物可以以常规方式、 通过将可药用载体和 / 或稀释剂与所述活性成 分混合来制备。
     因此， 本发明在其它方面提供
     ■组合药物组合物， 例如用于任一本文所述的方法， 其包含游离形式或可药用盐 形式的式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物与可药用稀释剂和 / 或载体。
     ■组合药物组合物， 包含游离形式或可药用盐形式的式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物作为活性成分 ； 一种或多种可药用载体物质和 / 或稀释剂和任选的一种 或多种其它药物物质。此类组合药物组合物可呈一种剂量单位形式或作为药盒。
     ■组合药物组合物， 其包含治疗有效量的游离形式或可药用盐形式的式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物和第二药物物质， 同时或相继施用。
     ■如上文所定义的方法， 包括共施用、 例如伴随或顺次施用治疗有效且无毒量的 式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物或其可药用盐， 和至少第二药物物质， 例如 如上文所述。
     ■药物组合物， 例如药盒， 其包含 a) 第一药剂， 其为游离形式或可药用盐形式的 如本文所公开的式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物， 和 b) 至少一种辅助药剂，例如如上文所述 ； 由此该药盒可包含其施用说明书。
     化合物式 (I)、 (IA)、 (IA’ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 的下列实施例阐明本发明， 但并不 限制其范围。描述了用于制备此类化合物的方法。
     以摄氏度测量温度。除非另有说明， 否则反应是在室温发生且使用 ESI 获得 MS。 在中间体和实施例的制备和分析中使用下列 HPLC/MS 方法 ：
     方法 A1 至 A3(LCMS ： 分析型 HPLC/MS) ：
     系统 ： Agilent 1100 系列， 其装备有 Waters Micromass ZQ 2000 ESI+ 和 / 或 ESI
     柱： XBridge C18， 3x 30mm， 2.5 微米
     温度 ： 50℃
     洗脱剂 A ： H2O， 其含有 5％ CH3CN 和 0.8％ HCOOH
     洗脱剂 B ： CH3CN， 其含有 0.6％ HCOOH
     流速 ： 1.2-2.4mL/min
     方法 A1 ： 方法 Polar4a_p_100-900 和方法 Polar4a_pn_100-900 ：
     梯度 ： 0-2.9min ： 1％至 95％的 B
     方法 A2 ： 方法 Fast4_p_100-900 和方法 Fast4a_pn_100-900 ： 梯度 ： 0-2.4min ： 10％至 95％的 B
     方法 A3 ： 方法 Slow4a_pn_100-900 ：
     梯度 ： 0-4.4min ： 5％至 95％的 B
     方法 B( 制备型 HPLC) 仪器 ： Waters 制备型 HPLC 系统， 柱： SunfireTM Prep C18OBDTM 5 微米 30X 100mm， 温度 ： 25℃， 洗脱剂 ： 于 0.05％ TFA 水溶液中的 5-100％ CH3CN 梯度， 洗脱 20 分钟， 流速 ： 30mL/ 分钟， 检测 ： UV 254nm。
     方法 C( 制备型 HPLC) 仪器 ： Waters 制备型 HPLC 系统， 柱： SunfireTM Prep C18 OBDTM 5 微米 30X 100mm， 温度 ： 25℃， 洗脱剂 ： 于 0.05％ TFA 水溶液中的 5-50％ CH3CN 梯度， 洗脱 20 分钟， 流速 ： 30mL/ 分钟， 检测 ： UV 254nm。
     方法 D( 分析型 HPLC) ： 线性梯度 2-100％ CH3CN(0.1％ TFA) 和 H2O(0.1％ TFA) 进 行 5min+100％ CH3CN(0.1％ TFA) 进行 1.5min ； 在 215nm 检测， 在 30℃流速为 1mL/min。柱 ： Nucleosil 100-3C18(70x 4mm)
     方法 E( 制备型 HPLC/MS) 仪器 ： Gilson 制备型 HPLC 系统， 柱： SunfireTM Prep C18 OBDTM 5 微米 30X 100mm， 温度 ： 25℃， 洗脱剂 ： 于 0.05％ TFA 水溶液中的 5-100％ CH3CN 梯 度， 进行 20 分钟， 流速 ： 30mL/ 分钟， 检测 ： UV 254nm。
     方 法 F( 分 析 型 HPLC) 仪 器 ： Shimadzu SIL-10A， 方法： 线 性 梯 度 2-100 ％ CH3CN(0.1 ％ TFA) 和 H2O(0.1 ％ TFA) 进 行 4min+100 ％ CH3CN(0.1 ％ TFA) 进 行 2min ； 3min 回 到 -100 ％ CH3CN(0.1 ％ TFA) ； 在 215nm 检 测， RT 流 速 2mL/min. 柱 ： Nucleosil OD-5-100C18(150x 4.6mm)
     方法 G( 分析型 HPLC) 仪器 ：
     系统 ： Agilent 1100 系列，
     柱： HPHypersil BDS C18， 4x 125mm， 5 微米
     温度 ： 25℃
     洗脱剂 A ： H2O， 其含有 0.1％ v/v TFA
     洗脱剂 B ： CH3CN， 其含有 0.1％ v/v TFA
     梯度 ： 在 5min 内 10％→ 100％ B， 100％ B 进行 2.5min， 然后 1min → 10％ B
     流速 ： 1.5mL/min
     检测 ： UV 215nm
     方法 H( 分析型 HPLC) 仪器 ：
     系统 ： Agilent 1100 系列
     柱： Macherey-Nagel Nucleosil 100-3 C18HD， 4x 125mm， 3 微米
     温度 ： 30℃
     洗脱剂 A ： H2O， 其含有 0.1％ v/v TFA
     洗脱剂 B ： CH3CN， 其含有 0.1％ v/v TFA
     梯度 ： 在 7min 内 2％→ 100％ B， 100％ B 进行 2min， 然后 1min → 2％ B
     流速 ： 1.0mL/min
     检测 ： UV 215nm
     方法 I(LCMS ： 分析型 HPLC/MS) ：
     系统 ： Waters Acquity UPLC， 其装备有 Waters Micromass ZQ 2000 ESI+/
     柱： Acquity HSS T3 C18， 2.1x 50mm， 1.8 微米
     温度 ： 50℃
     洗脱剂 A ： H2O， 其含有 0.05％ v/v HCOOH 和 3.75mM 乙酸铵
     洗脱剂 B ： CH3CN， 其含有 0.04％ HCOOH
     梯度 ： 在 4.3min 内 2％→ 98％ B， 98％ B 进行 0.7min， 然后 0.1min → 2％ B 以及 用 2％ B 进行 0.9min
     流速 ： 1.0mL/min
     方法 J(LCMS ： 分析型 HPLC/MS) ：
     系统 ： Agilent 1100 系列 ； MS ： G1946D
     柱： Symmetry C8， 2.1x 50mm， 3.5 微米
     洗脱剂 A ： H2O， 其含有 0.1％ v/v HCOOH
     洗脱剂 B ： CH3CN， 其含有 0.1％ v/v HCOOH
     梯度 ： 0-3.3min ： 5％至 95％的 B
     流速 ： 1.0mL/min
     方法 K(LCMS ： 分析型 HPLC/MS) ：
     系统 ： Waters Acquity UPLC
     柱： Acquity HSS T3 C18， 2.1x 50mm， 1.8 微米
     洗脱剂 A ： H2O， 其含有 0.05％ v/v HCOOH 和 0.05％乙酸铵
     洗脱剂 B ： 乙腈， 其含有 0.04％ HCOOH
     梯度 ： 在 1.7min 内 2％→ 98％ B， 用 98％ B 进行 0.45min， 然后 0.04min → 2％ B
     流速 ： 1.2mL/min
     方法 L(LCMS ： 分析型 HPLC/MS) ：
     系统 ： Waters Aquity UPLC ； MS ： Waters AQ Detector
     柱： Aquity HSS， 1.8m 2.1x 50mm， 3/pk洗脱剂 A ： H2O， 其含有 0.1％ v/v HCOOH 洗脱剂 B ： CH3CN， 其含有 0.1％ v/v HCOOH 梯度 ： 0-1.5min ： 10％至 95％的 B， 然后 1min ： 95％ B 流速 ： 1.2mL/min ESI-MS ： 仪器 ： Micromass Platform II 洗脱剂 ： 含有 0.2％ v/v 的 25％氢氧化铵溶液的 H2O 中的 15％ v/v MeOH 流速 ： 0.05mL/min 在以下实例中， 使用下文所给出的缩写 ：
     中间体 A： 咪 唑 -1- 甲 酸 (8- 叔 丁 基 -4， 5- 二 氢 - 噻 唑 并 [4， 5-h] 喹 唑 啉 -2- 基 )- 酰胺
     在氩气气氛下将 8- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基胺 ( 阶段 A.1， 0.319g， 1.225mmol) 和 CDI(278mg， 1.715mmol) 加 至 DCM(5ml) 和 DMF(0.25ml)。18h 后， 将残余物冷却至 4℃， 过滤收集沉淀。将固体在 50℃高真空干燥， 得到为淡黄色固体的 标题化合物。(8- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 氨基甲酸甲酯的 LCMS ： tR 0.95min 和 M+H319.0( 方法 A2) ； 其为在制备 MeOH 溶液样品的过程中标题化合物 与 MeOH 的反应产物。
     阶段 A.1 ： 8- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基胺
     中间体 A.1 通过两条不同的路径获得。两条路径从 2- 氨基 -5， 6- 二氢 -4H- 苯并 噻唑 -7- 酮开始并且如下所述 ：
     路径 1 ：
     向 N ′ -{6-[1- 二甲基氨基 - 甲 -(E)- 亚基 ]-7- 氧代 -4， 5， 6， 7- 四氢 - 苯并噻 唑 -2- 基 }-N， N- 二甲基 - 甲脒 ( 阶段 A.2， 2.2g， 7.90mmol) 在 2- 甲氧基乙醇 (20ml) 中 的混合物在室温加入氢氧化钠 (1.185g， 29.6mmol) 和 2， 2- 二甲基 - 丙脒盐酸盐 (1.620g， 11.85mmol)。将 RM 在 125℃搅拌 3h。冷却至室温后， 用 MeOH 稀释 RM， 吸附到硅胶上， 通过 快速层析法纯化 (CombiFlash Companion 系统 使用 RediSep 硅胶柱， 洗脱剂 ： DCM/ MeOH/ 氨 95 ∶ 5 ∶ 0.5)。LC ： tR 3.64min( 方 法 D)。MS ： M+H ＝ 261.1H-NMR( 在 DMSO-d6 中)： 8.24(s， 1H) ； 7.70(s， 2H) ； 2.89-2.84(m， 2H) ； 2.76-2.71(m， 2H) ； 1.28(s， 9H)。
     阶段 A.2 ： N′ -{6-[1- 二甲基氨基 - 甲 -(E)- 亚基 ]-7- 氧代 -4， 5， 6， 7- 四氢 - 苯 并噻唑 -2- 基 }-N， N- 二甲基 - 甲脒
     在搅拌下、 将 2- 氨基 -5， 6- 二氢 -4H- 苯并噻唑 -7- 酮 (3.5g， 20.81mmol) 在二甲 氧基甲基二甲胺 (12mL， 90mmol) 中的悬液在 100℃加热 65h。然后将 RM 真空蒸发至干， 将
     残余物悬浮于 EtOAc 中。在 4℃ 1 小时后， 滤掉固体， 用 EtOAc 洗涤， 然后在 60℃高真空干 燥， 得到为褐色晶体的纯标题产物。LC ： tR 3.25min( 方法 D)。MS ： M+H ＝ 279.1H-NMR( 在 DMSO-d6 中 ) ： 8.40(s， 1H) ； 7.23(s， 1H) ； 3.15(s， 3H) ； 3.05(s， 6H) ； 2.97(s， 3H) ； 2.91(t， 2H) ； 2.67(t， 2H)。
     路径 2 ：
     将碳酸钾 (0.434g， 3.14mmol) 加至 N-(8- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹 唑啉 -2- 基 )- 乙酰胺 ( 阶段 A.3， 0.38g， 1.257mmol) 在 MeOH 中的混合物。将 RM 在 50 ℃ 搅拌 52h， 然后冷却至室温， 真空蒸发， 得到红色物质。加入水 (20ml)， 将混合物在室温另外 搅拌 3h。然后将红色悬液冷却至 4℃， 过滤， 在高真空下干燥后得到为米色固体的标题化合 物。LCMS ： tR 0.99min 且 M+H ＝ 261( 方法 A3)。1H-NMR( 在 DMSO-d6 中 )， 400MHz ： 8.24(s， 1H) ； 7.70(s， 2H) ； 2.89-2.84(m， 2H) ； 2.76-2.71(m， 2H) ； 1.28(s， 9H)。
     阶段 A.3 ： N-(8- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 乙酰胺
     将吡啶 (13ml) 加至 N-(6- 甲酰基 -7- 氧代 -4， 5， 6， 7- 四氢 - 苯并噻唑 -2- 基 )- 乙 酰胺 ( 阶段 A.4， 3.05g， 12.8mmol) 和叔丁基脒盐酸盐 (1.788g， 12.8mmol)， 将混合物在密封 容器中于 160℃加热 6.5h。冷却后， 将反应混合物过滤， 得到固体。蒸发过滤母液， 得到更 多的固体物质。使用热 CH3CN 反复研磨合并的固体， 蒸发 CH3CN 母液， 得到固体， 显示该固体 主要为标题产物。将粗产物溶解于约 10ml 在 MeOH 中的 10％ DMSO， 得到略微混浊的橙色溶 液， 过滤并在室温边搅拌边滴加至水 (100ml) 中。过滤收集沉淀固体， 得到为橙色固体的标 1 题化合物。LCMS ： tR 1.37min 且 M+H ＝ 303.0( 方法 A3)。 H-NMR( 在 DMSO-d6 中 )， 400MHz ： 12.40(s， 1H) ； 8.44(s， 1H) ； 2.88-3.00(m， 4H) ； 2.17(s， 3H) ； 1.32(s， 9H)。
     阶段 A.4 ： N-(6- 甲酰基 -7- 氧代 -4， 5， 6， 7- 四氢 - 苯并噻唑 -2- 基 )- 乙酰胺
     在 氩 气 气 氛 下、 将 LiHMDS 溶 液 (1M， 27.7ml) 经 10min 添 加 至 在 -78 ℃ 冷 却 的 N-(7- 氧代 -4， 5， 6， 7- 四氢 - 苯并噻唑 -2- 基 )- 乙酰胺 ( 阶段 A.5， 2.0g， 9.23mmol) 在干 燥 THF(20ml) 中的悬液。然后将 RM 在 -78℃搅拌 2.5h， 经 30min 滴加甲酸甲酯 (2.308mL， 36.9mmol)。然后将 RM 逐渐升温至室温， 然后在室温搅拌 18h。将 RM 浸没于 1M HCl 水 溶液 (70ml) 中， 用 DCM 萃取 3X， 经 Na2SO4 干燥， 蒸发， 得到为固体的标题化合物。HPLC ： 1 tR3.65min( 方法 D)。MS ： M-H ＝ 237。 H-NMR( 在 DMSO-d6 中 )(400MHz) ： 12.50(s， br， 1H) ； 7.55(s， 1H) ； 2.90-2.60(m， 4H) ； 2.15(s， 3H)。
     阶段 A.5 ： N-(7- 氧代 -4， 5， 6， 7- 四氢 - 苯并噻唑 -2- 基 )- 乙酰胺
     在室温向乙酸酐 (80ml) 中添加 2- 氨基 -5， 6- 二氢 -4H- 苯并噻唑 -7- 酮 (10g， 59.4mmol)， 将所得悬液加热回流。 回流搅拌 1.75h 后， 边搅拌边冷却 RM， 在室温搅拌 18h， 随 后使用冰 /NaCl 浴进一步冷却， 过滤收集固体。 使用回流丙酮 (10ml， 然后 15ml) 将固体研磨 两次， 随后过滤， 在真空下于 40℃干燥， 得到为米色固体的标题产物。HPLC ： tR 3.47min( 方 1 法 D)。MS ： M-H ＝ 211.1. H-NMR( 于 DMSO-d6 中 )(600MHz) ： 12.55(s， br， 1H) ； 2.84(t， 2H) ； 2.48(t， 2H) ； 2.17(s， 3H) ； 2.065(qt， 2H)。
     中间体 B ： (2S， 4R)-4- 二甲基氨基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺
     将 (2S， 4R)-4- 二甲基氨基 - 吡咯烷 -2- 甲酸甲酯 ( 阶段 B.1， 225mg) 和含 7M 氨 的 MeOH(7ml) 在密封容器中于室温静置 18h。蒸发， 用 Et2O 研磨， 得到为白色固体的标题化 合物。
     阶段 B.1(2S， 4R)-4- 二甲基氨基 - 吡咯烷 -2- 甲酸甲酯
     在氢气气氛下、 将 (2S， 4R)-4- 二甲基氨基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 1- 苄基酯 2- 甲酯 ( 阶段 B.2， 420mg)、 10％披钯碳 (80mg) 和 MeOH(10ml) 的混合物搅拌 16h。过滤， 蒸发， 得到标题化合物， 其未经纯化即用于以下步骤中。
     阶段 B.2(2S， 4R)-4- 二甲基氨基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 1- 苄基酯 2- 甲酯
     将氰基硼氢化钠 (200mg) 加至 (2S， 4R)-4- 氨基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 1- 苄基酯 2- 甲酯 (400mg)、 福尔马林 (0.68ml)、 乙酸 (0.72ml)、 三乙胺 (0.2ml) 和 MeOH(2ml) 的混合 物中， 将混合物在室温搅拌 2h。然后将 RM 在 DCM 与 NaHCO3 水溶液之间分配， 蒸发 DCM 层， 通过正相层析法 ( 洗脱液 ； 梯度自 EtOAc 至的 20％ EtOH/EtOAc) 纯化， 得到大部分 UV 活性 组分。将层析的物质吸收于 1M HCl 中， 用 Et2O 洗涤 2X， 水层用 NaHCO3 碱化， 用 Et2O 萃取 3X， 经 Na2SO4 干燥， 蒸发， 得到为浅黄色油状物的标题化合物。
     中间体 C ： 咪 唑 -1- 甲 酸 (8- 二 乙 基 氨 基 -4， 5- 二 氢 - 噻 唑 并 [4， 5-h] 喹 唑 啉 -2- 基 )- 酰胺向 2- 氨基 -8-N， N- 二乙基氨基 -4， 5- 二氢噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 ( 阶段 C.1， 1g， 3.63mmol) 在 DCM(35ml) 中的混合物加入 CDI(1.178g， 7.26mmol)。将 RM 在 40 ℃搅拌 90h。冷却至室温后， 过滤收集固体， 得到标题化合物。HPLC ： tR 4.11min( 方法 D)。MS ： M+H ＝ 334， 标题化合物与 MeOH 的反应产物 (8- 二乙基氨基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑 啉 -2- 基 )- 氨基甲酸甲酯。
     阶段 C.1 ： 2- 氨基 -8- 二乙基氨基 -4， 5- 二氢噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉
     在氩气下、 于室温向 N′ -{6-[1- 二甲基氨基 - 甲 -(E)- 亚基 ]-7- 氧代 -4， 5， 6， 7- 四氢 - 苯并噻唑 -2- 基 }-N， N- 二甲基 - 甲脒 ( 阶段 A.2， 1g， 3.59mmol) 在 2- 甲氧基乙 醇 (10ml) 中的溶液加入 NaOH(0.539g， 13.47mmol) 和 N， N- 二乙基胍 (0.454g， 3.94mmol)。 将 RM 在 125℃搅拌 3.5h， 然后冷却至室温。真空蒸发后， 将残余物溶解于 0.1M HCl(50ml)中， 用 EtOAc 洗涤。然后将水层用 6N NaOH 碱化， 用 EtOAc 萃取 3X。将有机层经 Na2SO4 干 燥， 蒸发， 于 60℃高真空下干燥， 得到为橙色晶体的标题化合物。LC ： tR 3.60min( 方法 D)。 MS ： M+H ＝ 276.1H-NMR( 于 DMSO-d6 中 ) ： 7.91(s， 1H) ； 7.59(s， 2H) ； 3.50(q， 4H) ； 2.69(dd， 4H) ； 1.07(t， 6H)。
     中间体 D ： (2S， 3S)-3- 甲基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺
     在室温、 将在 1， 4- 二噁烷中的 4M HCl 溶液 (1.5ml) 加至 (2S， 3S)-3- 甲基吡咯 烷 -2- 甲酸 (0.5g) 在 EtOH(5ml) 中的悬液， 将混合物在回流下加热 20h。蒸发 RM， 加入在 MeOH 中的 7M 氨溶液 (5.6ml)。 将 RM 在室温静置 6 天， 然后蒸发， 将残余物用 MeOH(0.5ml) 研 磨， 过滤， 用冷 MeOH(2ml) 洗涤， 得到为白色固体的标题化合物。1H-NMR(d6-DMSO， 400MHz) ： 8.06(s， 1H)， 7.67(s， 1H)， 3.60(d， 1H)， 3.25-3.14(m， 2H)， 2.24-2.15(m， 1H)， 2.09-1.98(m， 1H)， 1.57-1.45(m， 1H)， 1.13(d， 3H)。
     中间体 E ： (R)-2- 苄基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺
     将 (3R， 7aR)-7a- 苄基 -3- 三氯甲基 - 四氢 - 吡咯并 [1， 2-c] 噁唑 -1- 酮 (1.40g， 如 Wang 和 Germanas Synlett 1999， 33-36 所述制备 ) 和在 MeOH 中的 7M 氨 (15ml) 的混合 物在密封容器中于 50℃加热 3 天。然后将冷却的 RM 蒸发， 用氯仿研磨， 得到为白色固体的 标题化合物。
     中间体 F(S)-2- 甲基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺
     将 (S)-2- 甲基 - 吡咯烷 -2- 甲酸丁酯 ( 阶段 F.1， 2.3g) 在 7M 氨的 MeOH 溶液 (22.2ml) 中的溶液在高压气体贮罐中于 70 ℃加热 10 天。蒸发 RM， 用己烷 (20ml) 研磨， 1 得 到 为 灰 白 色 固 体 的 标 题 化 合 物。 H-NMR(d6-DMSO， 400MHz) ： 7.40(s， 1H)， 6.89(s， 1H)， 2.95-2.84(m， 1H)， 2.72-2.60(m， 1H)， 2.06-1.95(m， 1H)， 1.66-1.44(m， 2H)， 1.42-1.30(m， 1H)， 1.22(s， 3H)。
     阶段 F.1 ： (S)-2- 甲基 - 吡咯烷 -2- 甲酸丁酯
     将浓 HCl(2ml) 加至 (S)-2- 甲基 - 吡咯烷 -2- 甲酸 (2g) 在丁 -1- 醇 (50ml) 中的 悬液， 在 60℃加热 18h， 然后回流 4 天。蒸发 RM， 在饱和 NaHCO3 水溶液和 DCM 之间分配， 用 DCM 萃取 3X， 经 Na2SO4 干燥， 蒸发。然后将分离的油状物在 10mbar 下 kugelrohr 蒸馏， 在 100-120℃的烘箱温度将馏分蒸馏， 得到为澄清无色油状物的标题化合物。
     中间体 G ： (R)-2- 甲氧基甲基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺
     将 (3R， 7aR)-7a- 甲氧基甲基 -3- 三氯甲基 - 四氢 - 吡咯并 [1， 2-c] 噁唑 -1- 酮 ( 阶段 G.1， 0.6g) 和含 7M 氨的 MeOH(6ml) 的混合物在密封容器中于室温静置 2 天。然后蒸 发 RM， 得到为浅黄色油状物的标题化合物， 其不需进一步纯化即可使用。
     阶段 G.1 ： (3R， 7aR)-7a- 甲氧基甲基 -3- 三氯甲基 - 四氢 - 吡咯并 [1， 2-c] 噁 唑 -1- 酮
     在 -78℃、 将二异丙基氨基锂在己烷 /THF 的 3 ∶ 5 混合物中的 1M 溶液 (8.25ml) 滴加至含 (3R， 7aS)-3- 三氯甲基 - 四氢 - 吡咯并 [1， 2-c] 噁唑 -1- 酮 (1.51g， 如 Wang 和 Germanas Synlett 1999， 33-36. 所述制备 ) 的 THF(5ml) 中。在 -78℃搅拌 30 分钟后， 加 入甲基氯甲醚 (1.14ml)。然后经 3h 将 RM 升温至 -30℃， 加入水。将水层用 DCM 萃取， 将合 并的有机层蒸发， 然后将残余物通过用 DCM 洗脱的正相层析法纯化， 得到为浅黄色油状物 的标题化合物。
     中间体 H ： (R)-2- 二甲基氨基甲基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺
     将 (3R， 7aR)-7a- 二 甲 基 氨 基 甲 基 -3- 三 氯 甲 基 - 四 氢 - 吡 咯 并 [1， 2-c] 噁 唑 -1- 酮 ( 阶段 H.1， 0.26g) 和在 MeOH(4ml) 中的 7M 氨的混合物在密封容器中于 50℃加 热 3 天。然后将冷却的 RM 蒸发， 得到为褐色油状物的标题化合物， 其不需进一步纯化即可 使用。MS ： M+H ＝ 172.1。
     阶段 H.1 ： (3R， 7aR)-7a- 二甲基氨基甲基 -3- 三氯甲基 - 四氢 - 吡咯并 [1， 2-c] 噁唑 -1- 酮
     在 -78℃， 将二异丙基氨基锂在己烷 /THF 的 3 ∶ 5 混合物中的 1M 溶液 (8.25ml) 滴 加至在 THF(5ml) 中的 (3R， 7aS)-3- 三氯甲基 - 四氢 - 吡咯并 [1， 2-c] 噁唑 -1- 酮 (1.51g， 如 Wang 和 Germanas Synlett 1999， 33-36 所述制备 .)。在 -78 ℃搅拌 30 分钟后， 加入 Eschenmoser 盐 (2.78g)。然后经 1h 将 RM 在剧烈搅拌下升温至 -40℃， 在 -40℃维持 2h。 然后加入水， 将水层用 DCM 萃取， 将合并的有机层经 Na2SO4 干燥， 蒸发。然后将残余物通过
     正相层析法纯化， 用 DCM 至 DCM 中的 20％ EtOAc 的梯度洗脱， 得到为浅黄色油状物的标题化 合物 (M+H ＝ 301/303/3053 ∶ 3 ∶ 1)。
     中间体 I ： d6-(R)-2- 二甲基氨基甲基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺
     将 d6-(3R， 7aR)-7a- 二甲基氨基甲基 -3- 三氯甲基 - 四氢 - 吡咯并 [1， 2-c] 噁 唑 -1- 酮 ( 阶 段 I.1， 440mg， 1.430mmol) 在 密 封 容 器 中 溶 解 于 氨 的 MeOH 溶 液 (10.2mL， 71.4mmol)， 在 75℃加热 5 天。蒸发反应混合物， 用 CHCl3 研磨 2X， 得到为淡褐色固体的标 题产物。
     阶段 I.1 ： d6-(3R， 7aR)-7a- 二甲基氨基甲基 -3- 三氯甲基 - 四氢 - 吡咯并 [1， 2-c] 噁唑 -1- 酮
     在氩气下将 (3R， 7aR)-1- 氧代 -3- 三氯甲基 - 二氢 - 吡咯并 [1， 2-c] 噁唑 -7a- 甲醛 ( 如 J.Org.Chem.2006， 71(1)， 97-102 所 述 获 得， 1g， 3.67mmol)、在 THF 中 的 二 甲 胺 -d7(1.0mL， 14.09mmol)、 乙酸 (0.525mL， 9.17mmol) 和 DCE(4ml) 合并， 分批加入三乙酰氧 基硼氢化钠 (1.089g， 5.14mmol)。在室温搅拌 3h 后， 将 RM 溶于 DCM 中， 用 1M NaOH 分配， 再 用 DCM 萃取 1 次。然后将有机层合并， 用水洗涤两次， 然后经 Na2SO4 干燥。蒸发溶液至其体 积一半， 加入 1M HCl H2O 溶液， 分离各层， 将水层用 DCM 洗涤两次。用饱和 Na2CO3 溶液将水 层的 pH 调节至～ 8， 用 DCM 萃取三次。将有机层经 Na2SO4 干燥， 蒸发， 得到为浅黄色油状物 的所需标题产物。
     中间体 J ： (R)-2- 羟基甲基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺
     在氩气下、 将 (3R， 7aR)-7a- 羟基甲基 -3- 三氯甲基 - 四氢 - 吡咯并 [1， 2-c] 噁 唑 -1- 酮 ( 阶段 J.1， 308mg， 1.122mmol) 加至在 MeOH 中的 7M 氨溶液 (8.014mL， 56.1mmol)， 在密封容器中于 75℃加热 72h， 然后蒸发， 得到为粘稠的淡褐色油状物的标题化合物， 其不 需进一步纯化即可使用。 阶 段 J.1 ： (3R， 7aR)-7a- 羟 基 甲 基 -3- 三 氯 甲 基 - 四 氢 - 吡 咯 并 [1， 2-c] 噁
     唑 -1- 酮
     将三乙酰氧基硼氢化钠 (544mg， 2.57mmol) 加至在 DCE(4ml) 中的 (3R， 7aR)-1- 氧 代 -3- 三氯甲基 - 二氢 - 吡咯并 [1， 2-c] 噁唑 -7a- 甲醛 ( 如 J.Org.Chem.2006， 71(1)， 97-102 中所述获得， 500mg， 1.835mmol)。将 RM 在室温搅拌 18h， 然后溶解于 DCM 中， 将有机 层用水洗涤， 经 Na2SO4 干燥， 蒸发。使用 20g RediSep 硅胶柱 ( 洗脱剂 ： DCM 至在 DCM 中 的 10％ MeOH) 纯化粗产物， 得到为澄清淡黄色油状物的标题化合物。
     中间体 K ： (R)-2-{[(3- 氟 - 苄基 )- 甲基 - 氨基 ]- 甲基 }- 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺
     在氩气下、 将 (3R， 7aR)-7a-{[(3- 氟 - 苄基 )- 甲基 - 氨基 ]- 甲基 }-3- 三氯甲 基 - 四氢 - 吡咯并 [1， 2-c] 噁唑 -1- 酮 ( 阶段 K.1， 385mg， 0.973mmol) 加至在 MeOH 中的 7M 氨 (6.950mL， 48.7mmol)， 在密封容器中于 50℃加热 6 天， 然后在 75℃加热 5 天。然后蒸发 RM， 将残余物通过使用 12g RediSep 硅胶柱 ( 洗脱剂 ： 于 DCM 中的 5％ MeOH) 的快速层析
     法纯化， 得到为黄色油状物的标题化合物。
     阶段 K.1 ： (3R， 7aR)-7a-{[(3- 氟 - 苄基 - 甲基 - 氨基 ]- 甲基 }-3- 三氯甲基 - 四 氢 - 吡咯并 [1， 2-c] 噁唑 -1- 酮
     在 氩 气 气 氛 下、将 三 乙 酰 氧 基 硼 氢 化 钠 (889mg， 4.19mmol) 加 至 (3R， 7aR)-7a-[(3- 氟 - 苄基氨基 )- 甲基 ]-3- 三氯甲基 - 四氢 - 吡咯并 [1， 2-c] 噁唑 -1- 酮 ( 阶段 K.2， 400mg， 1.048mmol)、 甲醛 (37％于 H2O 中， 0.102mL， 1.36mmol) 和乙酸 (0.150mL， 2.62mmol) 在 DCE(4ml) 中的混合物。在室温搅拌 2h 后， 将 RM 在 DCM 与水之间分配。将合 并的有机层经 Na2SO4 干燥， 蒸发， 得到为淡褐色油状物的标题化合物， 其不需进一步纯化即 可使用。
     阶段 K.2 ： (3R， 7aR)-7a-[(3- 氟 - 苄基氨基 )- 甲基 ]-3- 三氯甲基 - 四氢 - 吡咯 并 [1， 2-c] 噁唑 -1- 酮
     在氩气气氛下、 将三乙酰氧基硼氢化钠 (544mg， 2.57mmol) 加至 (3R， 7aR)-1- 氧 代 -3- 三氯甲基 - 二氢 - 吡咯并 [1， 2-c] 噁唑 -7a- 甲醛 ( 如 J.Org.Chem.2006， 71(1)， 97-102 中 所 述 获 得， 500mg， 1.835mmol)、 3- 氟 苄 基 胺 (0.251mL， 2.20mmol) 和 乙 酸 (0.263mL， 4.59mmol) 和 DCE(4ml) 中。将 RM 在室温搅拌 3h， 然后在水与 DCM 之间分配， 将 合并的有机物经 Na2SO4 干燥， 蒸发， 得到为浅黄色油状物的标题化合物， 其不需进一步纯化 即可使用。
     中间体 L ： (S)- 氮杂环丁烷 -2- 甲酸酰胺
     在氢气气氛下、 将 (S)-2- 氨基甲酰基 - 氮杂环丁烷 -1- 甲酸苄酯 ( 阶段 L.1， 1.8g) 和 10％披钯碳 (0.2g) 在 MeOH(25ml) 中的混合物在室温搅拌 5h。过滤和蒸发得到标题化 合物， 其不需进一步纯化即可使用。
     阶段 L.1 ： (S)-2- 氨基甲酰基 - 氮杂环丁烷 -1- 甲酸苄酯
     将 (S)- 氮杂环丁烷 -1， 2- 二甲酸 1- 苄基酯 2- 甲酯 (2.5g) 和于 MeOH 中的 7M 氨 溶液 (10ml) 的混合物在密封容器中于室温静置 18h。然后蒸发 RM， 得到为白色固体的标题 化合物， 其不需进一步纯化即可使用。MS ： M+H235.1 和 M-H 233.1。
     中间体 M ： (2S， 4R)-4- 氟 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺
     在 室 温、 将 HCl 于 EtOH 中 的 1.25M 溶 液 (2.3ml) 加 至 (2S， 4R)-4- 氟 - 吡 咯 烷 -2- 甲酸 (0.25g) 在 EtOH(2ml) 中的溶液， 将混合物于 55℃加热 62h。蒸发 RM， 加入氨 在 MeOH 中的 7M 溶液 (5.6ml)。将 RM 在室温静置 36h， 然后蒸发， 将残余物用 MeOH(0.5ml) 1 研磨， 过滤， 得到为白色固体的标题化合物。H-NMR(d6-DMSO， 400MHz) ： 7.68(s， 1H)， 7.37(s，
     1H)， 5.30(d， 1H)， 3.96(t， 1H)， 3.40-3.12(m， 2H)， 2.48-2.31(m， 1H)， 2.02-1.81(m， 1H)。
     中间体 N ： (2S， 4S)-4- 氟 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺
     将 (2S， 4S)-2- 氨基甲酰基 -4- 氟 - 吡咯烷 -1- 甲酸叔丁酯 (1.0g)、 浓 HCl(0.6ml) 和 1- 丁醇 (10ml) 的混合物在 50℃加热 48h。蒸发 RM， 在 DCM 与 NaHCO3 水溶液之间分配， 将 DCM 层经 Na2SO4 干燥， 蒸发。将在甲醇中的 7M 氨溶液 (10ml) 加至残余物， 将混合物在密 封容器中于室温静置 60h。蒸发， 用 EtOH 研磨， 得到为白色固体的标题化合物。
     中间体 O ： (1S， 5R)-2- 氮杂 - 二环 [3.1.0] 己烷 -1- 甲酸酰胺
     将 (1S， 5R)-2- 氮 杂 - 二 环 [3.1.0] 己 烷 -1- 甲 酸 乙 酯 (2.5g， 通 过 Hercouet Tetrahedron Asymmetry 1996， 7， 1267-1268 的程序制备 ) 和在 MeOH 中的 7M 氨溶液 (20ml) 的混合物在密封容器中于 80℃加热 5 天。蒸发冷却的 RM， 用己烷 /DCM 研磨， 得到为米色固
     体的标题化合物。1H-NMR(DMSO-d6， 400MHz) ： 7.15(s， 1H)， ， 7.04(s， 1H)， 3.00-2.91(m， 1H)， 2.67(q， 1H)， 1.94-1.83(m， 1H)， 1.74-1.67(m， 1H)， 1.64-1.55(m， 1H)， 1.38-1.31(m， 1H)， 0.90(t， 1H))。
     中间体 P ： (2S， 3R)-3- 甲基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺
     在 H2 气氛下、 在室温将在 MeOH(20ml) 中的 (2S， 3R)-3- 甲基 -1-((S)-1- 苯基 - 乙 基 )- 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺 ( 阶段 P.1， 1.1g， 4.76mmol) 和披钯炭 10％ (0.101g， 0.947mmol) 振荡 46h。 然后将 RM 滤过 Fluoropore 滤膜 (0.2μm FG)， 蒸发。 将残余物溶解于 DCM 中， 蒸发 1 至干， 得到为白色晶体的标题化合物。MS ： M+H ＝ 129.0. H-NMR(d6-DMSO， 600MHz) ： 7.34(s， br， 1H)， 7.10(s， br， 1H)， 3.48(d， 1H)， 3.0.2-2.97(m， 1H)， 2.80-2.75(m， 1H)， 2.35-2.28(m， 1H)， 1.88-1.81(m， 1H)， 1.39-1.32(m， 1H)， 0.83(d， 3H)。
     阶段 P.1 ： (2S， 3R)-3- 甲基 -1-((S)-1- 苯基 - 乙基 )- 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺
     在 氩 气 气 氛 下、 于 0 ℃ 将 在 甲 苯 中 的 三 甲 基 铝 (2M， 3.23ml) 滴 加 至 氯 化 铵 (0.346g， 6.47mmol) 在甲苯 (3.2ml) 中的混合物， 形成甲烷气体。 然后将 RM 升温至室温， 在 室温再搅拌 15min。 然后缓慢加入 (2S， 3R)-3- 甲基 -1-((S)-1- 苯基 - 乙基 )- 吡咯烷 -2- 甲 酸甲酯 ( 如 Tetr.Lett.1997， 38(1)， 85-88 中所述制备 ； 1.6g， 6.47mmol)。将 RM 在室温搅 拌 56h， 然后在冷却下加入 1M HCl， 将 RM 用 DCM 洗涤 3X。将水相用 Na2CO3 碱化， 用 DCM 萃
     取 3X， 将合并的有机层经 Na2SO4 干燥。蒸发， 得到为黄色油状物的标题化合物。MS ： M+H ＝ 1 233.2.HPLC ： tR 3.17min( 方 法 D)。 H-NMR(d6-DMSO， 600MHz) ： 7.37-7.33(m， 2H)， 7.30(t， 2H) ， 7.25(s ， br ， 1H) ， 7.21(t ， 1H) ， 7.12(s ， br ， 1H) ， 3.55(q ， 1H) ， 3.40(d ， 1H) ， 2.71(t ， 1H)， 2.28-2.22(m， 1H)， 2.21-2.16(m， 1H)， 1.71(qt， 1H)， 1.38-1.31(m， 1H)， 1.21(d， 3H)， 0.90(d， 3H)。
     中间体 Q ： (2S， 4S)-4- 二甲基氨基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺将 (2S， 4S)-4- 二甲基氨基 - 吡咯烷 -2- 甲酸丁酯 ( 阶段 Q.1， 326mg) 和 7M 氨 / MeOH 的溶液 (8ml) 在密封容器中于室温静置 18h。过滤， 蒸发， 用 Et2O/MeOH 研磨， 得到为
     米色固体的标题化合物。
     阶段 Q.1 ： (2S， 4S)-4- 二甲基氨基 - 吡咯烷 -2- 甲酸丁酯
     将浓 HCl(0.3ml) 加至 (2S， 4S)-4- 二甲基氨基 - 吡咯烷 -2- 甲酸甲酯二盐酸盐 (400mg) 和 1- 丁醇 (4ml) 的混合物， 在 115 ℃加热 18h。冷却后， 蒸发 RM， 然后在 DCM 与 NaHCO3 水溶液之间分配， 干燥 DCM 层， 蒸发， 得到为褐色油状物的标题化合物， 其不需进一步 纯化即可使用。
     中间体 R ： (2S， 4S)-4- 羟基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺
     将 (2S， 4S)-4- 羟基 - 吡咯烷 -2- 甲酸甲酯盐酸盐 (1g) 在 7M 氨 MeOH 溶液中的溶 液 (10ml) 搅拌 18h， 然后蒸发， 用 Et2O 研磨。将残余物溶解于最小体积的热 MeOH 中， 在 4℃ 静置 4h。过滤分离标题化合物， 为白色固体。
     中间体 S ： (2S， 4R)-4- 羟基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺将 (2S， 4R)-4- 羟基 - 吡咯烷 -2- 甲酸苄酯 (1g) 在 880 氨 (5ml) 中的溶液搅拌 18h， 然后蒸发， 用 Et2O 研磨， 得到为白色固体的标题化合物。1H-NMR(d6-DMSO， 400MHz) ： 9.15(s， br， 1H)， 8.04(s， 1H)， 7.63(s， 1H)， 5.56(s， 1H)， 4.40(s， 1H)， 4.27-4.16(m， 1H)， 3.27(d， 1H)， 3.02(d， 1H)， 2.33-2.19(m， 1H)， 1.89-1.76(m， 1H)。
     中间体 T ： 咪唑 -1- 甲酸 (7- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 苯并 [1， 2-d ； 3， 4-d ′ ] 双噻 唑 -2- 基 )- 酰胺
     将 7- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 苯并 [1， 2-d ； 3， 4-d ′ ] 双噻唑 -2- 基胺 ( 阶段 T.1， 175mg， 0.659mmol) 溶解于 DCM(10ml) 中， 然后加入 CDI(297mg， 1.648mmol)， 将 RM 在室温搅 拌 2h。过滤分离标题化合物， 用 DCM 洗涤， 在 HV 下干燥。
     阶段 T.1 ： 7- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 苯并 [1， 2-d ； 3， 4-d′ ] 双噻唑 -2- 基胺
     将 N-(7- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 苯并 [1， 2-d ； 3， 4-d′ ] 双噻唑 -2- 基 )- 乙酰胺 ( 阶 段 T.2， 225mg， 0.732mmol) 溶解于 EtOH(10ml) 中， 然后加入 HCl 36％ (1.48g， 14.64mmol)， 将 RM 加热至回流。回流 18 小时后， 将 RM 冷却至室温， 通过加入 5％碳酸氢钠水溶液调节至 pH 8-9， 用 EtOAc 萃取， 用 H2O 洗涤两次。将有机层经 Na2SO4 干燥， 蒸发， 得到标题产物 (tR 4.408min( 方法 F))。
     阶段 T.2 ： N-(7- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 苯并 [1， 2-d ； 3， 4-d′ ] 双噻唑 -2- 基 )- 乙 酰胺
     将 N-(6- 溴 -7- 氧 代 -4， 5， 6， 7- 四 氢 - 苯 并 噻 唑 -2- 基 )- 乙 酰 胺 ( 阶 段 T.3， 473mg， 1.635mmol) 溶 解 于 MeOH(10ml) 中， 加 入 2， 2- 二 甲 基 硫 代 丙 酰 胺 (230mg， 1.962mmol) 和钼磷酸铵 (307mg， 0.164mmol)， 将 RM 在 25℃搅拌 20h。然后将 RM 静置 2 天， 蒸发。用 30g 之后在 50℃搅拌 24h。将混合物用 EtOAc/H2O 萃取。将有机层经 Na2SO4 干燥， 硅胶对粗物质进行层析， 洗脱剂为 DCM/MeOH ＝ 99 ∶ 1。蒸发含有产物的馏分， 从二噁烷冻 干， 得到 225mg 为白色固体的标题化合物 (M+H ＝ 308 ； M-H ＝ 306 ； tR 5.525min( 方法 F))。
     阶段 T.3 ： N-(6- 溴 -7- 氧代 -4， 5， 6， 7- 四氢 - 苯并噻唑 -2- 基 )- 乙酰胺
     将 N-(7- 氧代 -4， 5， 6， 7- 四氢 - 苯并噻唑 -2- 基 )- 乙酰胺 ( 阶段 T.4， 2.286g， 10.87mmol) 溶 解 于 AcOH(60ml) 中， 然 后 缓 慢 加 入 溶 解 于 AcOH(10ml) 中 的 溴 (1.74g， 10.87mmol)， 将 RM 加热至 75℃达 20h。颜色由红色变为米色。蒸发混合物， 将残余物溶解 于 MeOH(10ml) 中， 用 H2O 沉淀。过滤混合物， 在 HV 上干燥。用 MPLC C18H2O 0.1 ％ TFA/ CH3CN 0.1 ％ TFA( 梯度 0-50 ％ ) 对粗物质进行层析。将含有产物的馏分用 NaHCO3 中和， 用 EtOAc 萃取， 从二噁烷冻干， 得到为白色固体的标题化合物 (M+H ＝ 291 ； M-H ＝ 289 ； tR 1 4.29( 方 法 F))。 H-NMR(d6-DMSO， 600.13MHz)12.75(s， 1H)4.95(t， 1H)， 2.95-2.84(m， 2H)， 2.62-2.52(m， 1H)， 2.40-2.30(m， 1H)， 2.20(s， 3H)。
     阶段 T.4 ： N-(7- 氧代 -4， 5， 6， 7- 四氢 - 苯并噻唑 -2- 基 )- 乙酰胺
     在室温、 向乙酸酐 (80ml) 加入 2- 氨基 -5， 6- 二氢 -4H- 苯并噻唑 -7- 酮 (10g， 59.4mmol)， 将黄色悬液加热回流。 在此温度搅拌 1.75h 后， 在搅拌下冷却 RM， 在室温搅拌过 夜。用冰 /NaCl 浴进一步冷却， 过滤悬液。然后将固体用丙酮回流两次 (10ml， 然后 15ml)， 过滤。于 40 ℃、 将所得固体在真空下干燥过夜， 提供为米色固体的标题化合物 (HPLC ： tR 1 3.47min( 方 法 A3)， M-H ＝ 211.1)， H-NMR( 于 DMSO-d6 中 )(600MHz) ： 12.55(s， br， 1H) ； 2.84(t， 2H) ； 2.48(t， 2H) ； 2.17(s， 3H) ； 2.065(qt， 2H))。
     中间体 U ： 咪唑 -1- 甲酸 [7-(2- 氟 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )-4， 5- 二氢 - 苯并 [1， 2-d ； 3， 4-d′ ] 双噻唑 -2- 基 ]- 酰胺
     将 7-(2- 氟 -1， 1- 二 甲 基 - 乙 基 )-4， 5- 二 氢 - 苯 并 [1， 2-d ； 3， 4-d ′ ] 双 噻 唑 -2- 基 胺 ( 阶 段 U.161.6mg， 0.217mmol) 溶 解 于 DCM(2ml) 中，加 入 CDI(297mg， 1.648mmol)， 得到澄清无色溶液。将 RM 在室温静置过夜， 得到白色悬液。将混合物在 4℃冷 却 1h， 然后过滤， 用 DCM 洗涤， 在真空下干燥， 得到为白色固体的标题化合物 ( 对在 MeOH 中 的样品进行分析 ； M+H ＝ 342.0 显示氨基甲酸甲酯产物的 MS ； tR 2.14min( 方法 A3))。
     阶段 U.17-(2- 氟 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )-4， 5- 二氢 - 苯并 [1， 2-d ； 3， 4-d ′ ] 双 噻唑 -2- 基胺
     将 3- 氟 -2， 2- 二甲基 - 硫代丙酰胺 ( 阶段 U.2， 394mg， 2.331mmol) 溶解于 EtOH中， 然后加入 N-(6- 溴 -7- 氧代 -4， 5， 6， 7- 四氢 - 苯并噻唑 -2- 基 )- 乙酰胺 ( 阶段 T.3， 473mg， 1.635mmol) 和钼磷酸铵 (80mg， 0.042mmol)， 得到黄色悬液。将 RM 加热至回流， 得到 暗蓝绿色悬液。将反应混合物在 65℃搅拌 3 天。过滤 RM， 将滤液蒸发。将残余物溶解于 DMF 中， 通过制备型 HPLC( 方法 E) 纯化。将含有产物的馏分合并， 蒸发， 得到为白色固体的 标题化合物 (M+H ＝ 284.1 ； tR 1.30min( 方法 A3))。
     阶段 U.23- 氟 -2， 2- 二甲基 - 硫代丙酰胺
     通过 Boys， M.L. ； Downs， V.L.Synth.Commun.2006， 36， 295 的程序制备标题化合 物。在室温、 将硫氢化钠水合物 (3.89g， 69.4mmol， 吸湿 ) 加至 3- 氟 -2， 2- 二甲基 - 丙腈 ( 阶段 U.3， 1.17g， 11.57mmol) 和二乙基胺盐酸盐 (7.61g， 69.4mmol) 在 1， 4- 二噁烷 (7ml) 和 H2O(7ml) 中的溶液。将 RM 加热至 55 ℃， 然后在此温度搅拌 3 天。将反应混合物用水 (50ml) 稀释， 用 EtOAc(50ml) 萃取 5X。 将有机层经 Na2SO4 干燥， 蒸发得到橙色油状物。 然后 加入 DCM(5ml)， 得到白色悬液。过滤悬液， 将滤液通过用 DCM 洗脱的硅胶快速层析法纯化。 将含产物的馏分蒸发， 得到为浅黄色油状物的标题化合物。(M+H ＝ 136.1， M-H ＝ 134.1 ； tR
     0.69min( 方法 A3))。19F-NMR(d6-DMSO， 400MHz 218ppm(t， 1F))。
     阶段 U.33- 氟 -2， 2- 二甲基 - 丙腈
     将 3- 氟 -2， 2- 二 甲 基 - 丙 酰 胺 ( 阶 段 U.4， 1.82g， 15.28mmol) 和 五 氧 化 二 磷 (2.168g， 15.28mmol) 合并， 得到自由流动的白色粉末， 其在氩气气氛下经 50 分钟用油浴加 热至 180℃的浴温。 然后缓慢应用 300mbar 真空对流动的澄清无色油状物进行蒸馏， 静置标 19 题化合物后形成低熔点蜡状固体。 F-NMR(d6-DMSO， 400MHz 219.5ppm(t， 1F))。
     阶段 U.43- 氟 -2， 2- 二甲基 - 丙酰胺
     将 3- 氟 -2， 2- 二 甲 基 - 丙 酰 氟 (DE3326874 和 DE3611195， 2.5g， 20.47mmol) 在 0℃加至氨水 (10ml) 和 THF(20ml) 的混合物。然后将 RM 升温至室温， 在室温静置过夜。在 真空下将体积减少 50％， 得到粘稠的白色悬液。 将悬液用 DCM/H2O 萃取。 将有机层经 Na2SO4 干燥， 蒸发， 得到为白色结晶固体的标题化合物。
     中间体 V ： 咪唑 -1- 甲酸 (7- 环丙基甲基 -4， 5- 二氢 - 苯并 [1， 2- ； 3， 4-d′ ] 双噻 唑 -2- 基 )- 酰胺
     将 7- 环丙基甲基 -4， 5- 二氢 - 苯并 [1， 2-d ； 3， 4-d ′ ] 双噻唑 -2- 基胺 ( 阶段 V.1， 72mg， 0.273mmol) 溶解于 5ml DCM 中， 加入 CDI(73.9mg， 0.410mmol)， 将 RM 在室温搅拌 20h。加入另外的 CDI(37mg， 0.205mmol)， 将 RM 在室温再搅拌 2 小时。过滤混合物， 用 DCM 洗涤， 蒸发滤液， 得到标题化合物 (M+H ＝ 322.1 ； M-H ＝ 320.2MS-ES( 于 MeOH 中 ) 显示氨基 甲酸甲酯产物 )。
     阶段 V.17- 环丙基甲基 -4， 5- 二氢 - 苯并 [1， 2-d ； 3， 4-d′ ] 双噻唑 -2- 基胺
     将 N-(7- 环丙基甲基 -4， 5- 二氢 - 苯并 [1， 2-d ； 3， 4-d′ ] 双噻唑 -2- 基 )- 乙酰胺 ( 阶段 V.2， 180mg， 0.589mmol) 溶解于 EtOH(10ml) 中， 加入 36％ HCl(1.193g， 11.79mmol)。 将 RM 加热至 90℃达 16h， 然后冷却， 用 EtOAc/H2O 萃取。将有机层经 Na2SO4 干燥， 蒸发。用 MPLC C18H2O 0.1％ TFA/CH3CN0.1％ TFA( 梯度 0-50％ ) 对粗物质进行层析。将含产物的 馏分用 NaHCO3 中和， 用 EtOAc 萃取， 从二噁烷冻干， 得到标题化合物 (M+H ＝ 264.2 ； M-H ＝ 262.1 ； tR 4.183min( 方法 F))。
     阶 段 V.2N-(7- 环 丙 基 甲 基 -4， 5- 二 氢 - 苯 并 [1， 2-d ； 3， 4-d ′ ] 双 噻 唑 -2- 基 )- 乙酰胺
     将 N-(6- 溴 -7- 氧代 -4， 5， 6， 7- 四氢 - 苯并噻唑 -2- 基 )- 乙酰胺 ( 阶段 T.3， 347mg， 1.200mmol) 溶解于 MeOH(10ml) 中， 加入 2- 环丙基 - 硫代乙酰胺 (Can.J.Chem 1995 Vol.73 1468-1477， 166mg， 1.440mmol) 和钼磷酸铵 (225mg， 0.120mmol)。将 RM 在室温搅拌 20h， 然后在 50℃加热 3h， 在 60℃加热 2h， 然后回流 24h。将 RM 在 EtOAc/H2O 之间分配。将 有机层经 Na2SO4 干燥， 蒸发。 用 MPLC C18H2O 0.1％ TFA/CH3CN 0.1％ TFA( 梯度 0-50％ ) 对 原料进行层析。将含产物的馏分用 NaHCO3 中和， 用 EtOAc 萃取， 从二噁烷冻干， 得到为白色 固体的标题化合物 (M+H ＝ 306.2 ； M-H ＝ 304.2 ； tR 5.12min( 方法 F))。
     实施例 1 ： (2S， 4R)-4- 二甲基氨基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 叔丁 基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
     向咪唑 -1- 甲酸 (8- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ( 中间体 A， 45.1mg， 0.127mmol) 在 DMF(1ml) 中的溶液加入 (2S， 4R)-4- 二甲基氨基 - 吡咯 烷 -2- 甲酸酰胺 ( 中间体 B， 22mg， 0.140mmol) 和三乙胺 (0.053mL， 0.382mmol)。 然后将 RM 在 室温搅拌 17h， 通过制备型 HPLC( 方法 B) 纯化。 将含产物的馏分合并， 通过 Bond Elut-SCX， 300mg 柱洗脱。然后将柱用在 MeOH 中的 7M 氨溶液洗涤， 蒸发， 得到标题化合物。MS ： M+H ＝ 444.HPLC ： tR 3.17min( 方法 D)。
     实施例 2 ： (2S， 3S)-3- 甲基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 二乙基氨基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
     将 (2S， 3S)-3- 甲基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺 ( 中间体 D， 6.24mg， 0.049mmol)、 咪 唑 -1- 甲酸 (8- 二乙基氨基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ( 中间体 C， 18mg， 0.049mmol) 和三乙胺 (0.020mL， 0.146mmol) 在 DMF(0.4ml) 中的混合物在室温搅拌 6h。然后将 RM 通过制备型 HPLC( 方法 B) 直接纯化。然后将含产物的馏分滤过 300mgBond Elut-SCX 柱。 然后将柱用在 MeOH 中的 7M 氨溶液洗脱， 蒸发洗脱剂， 得到为黄色固体的标题 1 化合物。MS ： M+H ＝ 430.1.HPLC ： tR 3.72min( 方法 D)。 H-NMR(DMSO-d6， 600MHz) ： 11.05(s， 1H) ； 8.04(s， 1H) ； 7.44(s， br， 1H) ； 6.95(s， br， 1H) ； 3.78(s， br， 1H) ； 3.60-3.50(m， 6H) ； 2.82(s， br， 4H) ； 2.18(s， br， 1H) ； 2.03(s， br， 1H) ； 1.55(s， br， 1H) ； 1.10(t， 6H) ； 1.05(d， 3H)。
     实施例 3 ： (R)-2- 苄基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 二乙基氨基 -4， 5- 二 氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
     向咪唑 -1- 甲酸 (8- 二乙基氨基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰 胺 ( 中间体 C， 50mg， 0.135mmol) 在 DMF(1ml) 中混合物加入 (R)-2- 苄基 - 吡咯烷 -2- 甲酸 酰胺 ( 中间体 E， 33.2mg， 0.162mmol) 和三乙胺 (0.057mL， 0.406mmol)。将 RM 在 40℃搅拌 21h， 然后用制备型 HPLC( 方法 B) 直接纯化。 将含产物的馏分通过 300mg Bond Elut-SCX 柱
     洗脱。然后将柱用在 MeOH 中的 7M 氨溶液洗脱， 蒸发， 得到为黄色固体的标题化合物。MS ： M+H ＝ 506.1.HPLC ： tR 4.38min( 方法 D)。
     实施例 4 ： (S)-2- 甲基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 二乙基氨基 -4， 5- 二 氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
     向咪唑 -1- 甲酸 (8- 二乙基氨基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰 胺 ( 中间体 C， 75mg， 0.203mmol) 在 DMF(2ml) 中的混合物加入 (S)-2- 甲基 - 吡咯烷 -2- 甲 酸酰胺 ( 中间体 F， 39mg， 0.305mmol) 和三乙胺 (0.085mL， 0.609mmol)。将 RM 在 40℃搅拌 17h， 然后用制备型 HPLC( 方法 B) 直接纯化。将含产物的馏分滤过 300mg Bond Elut-SCX 柱。然后将柱用在 MeOH 中的 7M 氨溶液洗脱， 蒸发， 得到为黄色固体的标题化合物。MS ： M+H ＝ 430.2.HPLC ： tR 3.80min( 方法 D)。
     实施例 5 ： (R)-2- 甲氧基甲基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 二乙基氨 基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
     将咪唑 -1- 甲酸 (8- 二乙基氨基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰 胺 ( 中间体 C， 75mg， 0.203mmol)、 (R)-2- 甲氧基甲基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺 ( 中间体 G， 35.3mg， 0.223mmol) 和三乙胺 (0.085mL， 0.609mmol) 在 DMF(2ml) 中的混合物在 40℃搅拌 6h。冷却至室温后， 将 RM 溶解于 MeOH(1ml) 中， 通过制备型 HPLC( 方法 B) 直接纯化。将含 产物的馏分通过 300mg Bond Elut-SCX 柱洗脱。然后将柱用在 MeOH 中的 7M 氨溶液洗脱， 蒸发， 得到为黄色固体的标题产物。MS ： M+H ＝ 460.1.HPLC ： tR 3.94min( 方法 D)。 实施例 6 ： (R)-2- 二甲基氨基甲基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 叔丁 基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
     在 室 温、 将 咪 唑 -1- 甲 酸 (8- 叔 丁 基 -4， 5- 二 氢 - 噻 唑 并 [4， 5-h] 喹 唑 啉 -2- 基 )- 酰 胺 ( 中 间 体 A， 132mg， 0.372mmol) 加 至 (R)-2- 二 甲 基 氨 基 甲 基 - 吡 咯
     烷 -2- 甲酸酰胺 ( 中间体 H， 70mg， 0.409mmol) 和三乙胺 (0.155mL， 1.115mmol) 在 DMF(1ml) 中的混合物。18 小时后， 加入 MeOH(0.5ml)。将 RM 滤过 PTFE 滤膜， 通过制备型 HPLC( 方法 B) 纯化。 将含产物的馏分合并， 蒸发以去除 CH3CN， 然后通过加入固体 NaHCO3 碱化， 得到黄白 色沉淀。冷却至 4℃后， 过滤重新收集固体， 然后通过制备型 HPLC( 方法 C) 进一步纯化。将 含产物的馏分通过 300mg Bond Elut-SCX 柱洗脱。 然后将柱用在 MeOH 中的 7M 氨溶液洗脱， 蒸发， 得到为黄色无定形玻璃状物的标题产物。 LCMS ： tR 0.98min 且 M+H ＝ 458.1( 方法 A3)。 1 H-NMR(CD3OD， 400MHz) ： 8.28(s， 1H) ； 3.92-3.82(m， 1H) ； 3.67-3.44(m， 2H) ； 3.04-2.88(m， 4H) ； 2.85-2.71(m， 1H) ； 2.56(s， br， 6H) ； 2.29-2.19(m， 1H) ； 2.08-1.87(m， 3H) ； 1.37(s， 9H)。
     实施例 7 ： d6-(R)-2- 二甲基氨基甲基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 叔丁 基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
     在氩气气氛下、 将咪唑 -1- 甲酸 (8- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑 啉 -2- 基 )- 酰 胺 ( 中 间 体 A， 91mg， 0.256mmol) 和 三 乙 胺 (0.036mL， 0.256mmol) 加 至 悬 浮于 DMF(2ml) 中的 d6-(R)-2- 二甲基氨基甲基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺 ( 中间体 I， 50mg， 0.282mmol)。然后将 RM 在 40℃搅拌 2.75h， 然后通过制备型 HPLC 直接纯化两次 ( 方法 B， 然后方法 C)。每次， 将含产物的馏分合并， 通过 300mg Bond Elut-SCX 柱洗脱。然后将柱用 在 MeOH 中的 7M 氨溶液洗脱， 蒸发， 得到黄色固体。将固体悬浮于 DCM 中， 过滤， 真空干燥， 得到为黄色固体的标题化合物。LCMS ： tR 1.21min 且 M+H ＝ 464.0( 方法 A1)。
     实施例 8 ： (R)-2- 羟基甲基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 二乙基氨基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
     在 室 温、 将 咪 唑 -1- 甲 酸 (8- 二 乙 基 氨 基 -4， 5- 二 氢 - 噻 唑 并 [4， 5-h] 喹 唑 啉 -2- 基 )- 酰胺 ( 中间体 C， 50mg， 0.135mmol) 加至 (R)-2- 羟基甲基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰 胺 ( 中间体 J， 25.4mg， 0.176mmol) 和三乙胺 (0.047mL， 0.338mmol) 在 DMF(1ml) 中的混合 物。在室温 18h 后， 将 RM 通过 PTFE 膜过滤， 通过制备型 HPLC( 方法 B) 纯化。将含产物的
     馏分合并， 滤过 Bond Elut-SCX 柱。将柱用在 MeOH 中的 7M 氨溶液洗脱， 蒸发， 得到橙色玻 璃状物， 其从 MeOH/ 水重结晶， 提供为黄色固体的标题化合物。LCMS ： tR 1.09min 且 M+H ＝ 446.0( 方法 A3)。
     实施例 9 ： (R)-2- 羟基甲基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 叔丁基 -4， 5- 二 氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
     将咪唑 -1- 甲酸 (8- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ( 中间体 A， 124mg， 0.350mmol) 加至 (R)-2- 羟基甲基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺 ( 中间体 J， 63mg， 0.350mmol) 和三乙胺 (0.049mL， 0.350mmol) 在 DMF(2ml) 中的混合物。将 RM 在 40℃ 搅拌 2h， 然后在室温静置 18h， 然后通过制备型 HPLC( 方法 B) 直接纯化。将含产物的馏分 通过 300mg Bond Elut-SCX 柱洗脱。然后将柱用在 MeOH 中的 7M 氨溶液洗脱， 蒸发， 得到黄 色固体。然后将分离的固体悬浮于 DCM 中， 过滤， 干燥， 得到为淡黄色 / 白色固体的标题化 合物。LCMS ： tR 1.31min 且 M+H ＝ 430.9( 方法 A1)。 实施例 10 ： (R)-2-{[(3- 氟 - 苄基 )- 甲基 - 氨基 ]- 甲基 }- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
     在氩气下、 于室温将咪唑 -1- 甲酸 (8- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑 啉 -2- 基 )- 酰胺 ( 中间体 A， 40.1mg， 0.113mmol) 和三乙胺 (0.047mL， 0.339mmol) 加至悬 浮于 DMF(1ml) 中的 (R)-2-{[(3- 氟 - 苄基 )- 甲基 - 氨基 ]- 甲基 }- 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺 ( 中间体 K， 30mg， 0.113mmol)。将 RM 在 40℃搅拌 2.5h， 然后通过制备型 HPLC( 方法 C) 直 接纯化。将含产物的馏分通过 Bond Elut-SCX， 300mg 柱洗脱。然后将柱用在 MeOH 中的 7M 氨溶液洗脱， 蒸发， 得到黄色固体。将固体用 DCM 研磨， 过滤， 干燥， 得到为淡黄色固体的标 题化合物。LCMS ： tR 0.81min 且 M+H ＝ 552.3( 方法 A2)。
     实施例 11 ： (S)-2- 甲基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 叔丁基 -4， 5- 二 氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
     在氩气下、 于室温将 (S)-2- 甲基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺 ( 中间体 F， 22.14mg， 0.169mmol) 和三乙胺 (0.035mL， 0.254mmol) 加至在 DMF(1ml) 中的咪唑 -1- 甲酸 (8- 叔丁 基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ( 中间体 A， 30mg， 0.085mmol)。在 室温搅拌 16h 后， 将 RM 通过制备型 HPLC( 方法 B) 直接纯化。将含产物的馏分通过 300mg Bond Elut-SCX 柱洗脱。然后将柱用在 MeOH 中的 7M 氨溶液洗脱， 蒸发， 得到为黄色结晶固 体的标题化合物。MS ： M+H ＝ 415.1.HPLC ： tR 3.73min( 方法 D)。
     实施例 12 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 二乙基氨基 -4， 5- 二氢 - 噻 唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
     在 氩 气 下、 于 室 温 将 (S)- 吡 咯 烷 -2- 甲 酸 酰 胺 (148mg， 1.299mmol) 和 三 乙 胺 (0.272mL， 1.949mmol) 加至在 DMF(1ml) 中的咪唑 -1- 甲酸 (8- 二乙基氨基 -4， 5- 二氢 - 噻 唑 并 [4， 5-h] 喹 唑 啉 -2- 基 )- 酰 胺 ( 中 间 体 C， 240mg， 0.65mmol)。 将 RM 在 室 温 搅 拌 15.5h， 然后用制备型 HPLC( 方法 C) 纯化。将含产物的馏分合并， 滤过 Bond Elut-SCX 柱。 然后将柱用在 MeOH 中的 7M 氨溶液洗脱， 蒸发， 得到为橙色晶体的标题化合物。MS ： M+H ＝ 416.1.HPLC ： tR 3.56min( 方法 D)。
     实施例 13 ： (S)- 氮杂环丁烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 二乙基氨基 -4， 5- 二 氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
     将 (S)- 氮杂环丁烷 -2- 甲酸酰胺 ( 中间体 L， 26.4mg， 0.264mmol)、 咪唑 -1- 甲 酸 (8- 二乙基氨基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ( 中间体 C， 75mg， 0.203mmol) 和三乙胺 (0.085mL， 0.609mmol) 在 DMF(2ml) 中的混合物在 40℃搅拌 2h。然后 将 RM 通过制备型 HPLC( 方法 B) 直接纯化。将含产物的馏分通过 300mg Bond Elut-SCX 柱 洗脱。然后将柱用在 MeOH 中的 7M 氨溶液洗脱， 蒸发， 得到为白色结晶固体的标题化合物。 MS ： M+H ＝ 402.1.HPLC ： tR 3.56min( 方法 D)。
     实施例 14 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并
     [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
     于室温、 将 (S)- 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺 (16mg， 0.14mmol) 加至咪唑 -1- 甲酸 (8- 叔 丁基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ( 中间体 A， 45mg， 0.127mmol) 和三 乙胺 (0.053mL， 0.381mmol) 在 DMF(1ml) 中的混合物。将 RM 在室温静置过夜， 然后蒸发， 将 1 残余物从 MeOH 和水结晶。 过滤收集标题化合物。 MS ： M+H ＝ 401.1(MS-ESI)。 H-NMR(CD3OD， 400MHz) ： 8.31(s， 1H)， 4.46(d， 1H)， 3.77-3.54(m， 2H)， 3.08-2.90(m， 4H)， 2.33-2.23(m， 1H)， 2.13-2.00(m， 3H)， 1.38(s， 9H))。
     实施例 15 ： 5- 甲基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 二乙基氨基 -4， 5- 二 氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
     向咪唑 -1- 甲酸 (8- 二乙基氨基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰 胺 ( 中间体 C， 75mg， 0.203mmol) 在 DMF(2ml) 中的悬液加入 5- 甲基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰 胺 ( 如 Arch.Pharm.， 1936， 274， 40 中 所 述 制 备 ； 39mg， 0.305mmol) 和 三 乙 胺 (0.085mL， 0.609mmol)。将 RM 在 40℃搅拌 2.5h， 然后通过制备型 HPLC( 方法 B) 直接纯化。将含产物 的馏分通过 Bond Elut-SCX 柱洗脱。然后将柱用在 MeOH 中的 7M 氨溶液洗脱， 蒸发， 将残 余物用 DCM 研磨， 得到为黄色固体的标题化合物。LCMS ： tR 0.77min 且 M+H ＝ 430.0( 方法 A2)。
     实施例 16 ： (2S， 4R)-4- 氟 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 二乙基氨基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
     向在 DCM(2ml) 中的咪唑 -1- 甲酸 (8- 二乙基氨基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ( 中间体 C， 75mg， 0.203mmol) 加入 (2S， 4R)-4- 氟 - 吡咯烷 -2- 甲酸 酰胺 ( 中间体 M， 40.2mg， 0.305mmol) 和三乙胺 (0.085mL， 0.609mmol)。将 RM 在 40℃搅拌 17.5h， 然后通过制备型 HPLC( 方法 B) 直接纯化。 将含产物的馏分通过 Bond Elut-SCX 柱洗 脱。然后将柱用在 MeOH 中的 7M 氨溶液洗脱， 蒸发， 得到为黄色固体的标题化合物。HPLC ：
     tR 3.66min( 方法 D)。MS ： M+H ＝ 434.1。
     实施例 17 ： (2S， 4S)-4- 氟 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 二乙基氨基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
     向在 DMF(0.4ml) 中的咪唑 -1- 甲酸 (8- 二乙基氨基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ( 中间体 C， 17mg， 0.046mmol) 加入 (2S， 4S)-4- 氟 - 吡咯烷 -2- 甲酸 酰胺 ( 中间体 N， 6.08mg， 0.046mmol) 和三乙胺 (0.019mL， 0.138mmol)。将 RM 在 40℃搅拌 17h， 然后通过制备型 HPLC( 方法 B) 直接纯化。将含产物的馏分通过 Bond Elut-SCX 柱洗 脱。然后将柱用在 MeOH 中的 7M 氨溶液洗脱， 蒸发， 得到为黄色固体的标题化合物。HPLC ： tR3.55min( 方法 D)。MS ： M+H ＝ 434.1。
     实施例 18 ： (1S， 5R)-2- 氮杂 - 二环 [3.1.0] 己烷 -1， 2- 二甲酸 1- 酰胺 2-[(8- 叔 丁基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
     在 室 温、 将 (1S， 5R)-2- 氮 杂 - 二 环 [3.1.0] 己 烷 -1- 甲 酸 酰 胺 ( 中 间 体 O， 208mg， 1.65mmol) 加至搅拌的咪唑 -1- 甲酸 (8- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑 啉 -2- 基 )- 酰胺 ( 中间体 A， 532mg， 1.5mmol) 和三乙胺 (0.627mL， 4.50mmol) 在 DMF(4ml) 中的混合物。 56 和 80 小时后， 加入 (1S， 5R)-2- 氮杂 - 二环 [3.1.0] 己烷 -1- 甲酸酰胺 ( 中 间体 O， 104mg， 0.825mmol) 的另外部分， 将 RM 在室温静置 18h。然后将 RM 通过 PTFE 膜过 滤， 通过制备型 HPLC( 方法 B) 纯化。将含产物的馏分通过 Bond Elut-SCX 柱洗脱。然后将 柱用在 MeOH 中的 7M 氨溶液洗脱， 蒸发。 通过制备型 HPLC( 方法 B) 再次纯化残余物， 以相同 方法分离。然后将粗产物从水 /MeOH 的 1 ∶ 1 混合物重结晶， 得到为黄色结晶固体的标题 1 化合物。LCMS ： tR 1.22min 且 M+H ＝ 413.1( 方法 A3)。 H-NMR(d6-DMSO， 400MHz) ： 11.22(s，
     1H)， 8.40(s， 1H) ； 7.33(s， br， 1H) ； 7.05(s， br， 1H) ； 3.97-3.84(m， 1H) ； 3.64-3.52(m， 1H) ； 3.01-2.83(m， 4H) ； 2.28-2.13(m， 1H) ； 1.95-1.74(m， 3H) ； 1.33(s， 9H) ； 1.04-0.97(m， 1H))。
     实施例 19 ： (1S， 5R)-2- 氮杂 - 二环 [3.1.0] 己烷 -1， 2- 二甲酸 1- 酰胺 2-[(8- 二 乙基氨基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
     向在 DCM(2ml) 中的咪唑 -1- 甲酸 (8- 二乙基氨基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ( 中间体 C， 75mg， 0.203mmol) 加入 (1S， 5R)-2- 氮杂 - 二环 [3.1.0] 己烷 -1- 甲酸酰胺 ( 中间体 O， 38.4mg， 0.305mmol) 和三乙胺 (0.085mL， 0.609mmol)。将 RM 在 40℃搅拌 17.5h， 然后通过制备型 HPLC( 方法 B) 直接纯化。将含产物的馏分通过 Bond Elut-SCX 柱洗脱。 然后将柱用在 MeOH 中的 7M 氨溶液洗脱， 蒸发， 得到为黄色固体的标题化 合物。HPLC ： tR 3.73min( 方法 D)。MS ： M+H ＝ 428.1。
     实施例 20 ： (2S， 3R)-3- 甲基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
     向在 DMF(1ml) 中的咪唑 -1- 甲酸 (8- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑 啉 -2- 基 )- 酰胺 ( 中间体 A， 60mg， 0.169mmol) 加入 (2S， 3R)-3- 甲基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰 胺 ( 中间体 P， 32.5mg， 0.254mmol) 和三乙胺 (0.071mL， 0.508mmol)。在氩气下将 RM 于室温 搅拌 2h， 然后通过制备型 HPLC( 方法 B) 直接纯化。 将 CH3CN 从含产物的馏分蒸发， 然后将剩 余的液体通过 Bond Elut-SCX 柱洗脱。 然后将柱用在 MeOH 中的 7M 氨溶液洗脱， 蒸发。 将残 余物在甲醇中研磨， 过滤和干燥后， 收集为白色晶体的标题化合物。 HPLC ： tR 3.66( 方法 D)。 1 MS ： M+H ＝ 415.1. H-NMR(CD3OD， 600MHz) ： 7.96(s， 1H)， 4.04(d， 1H)， 3.47(t， 1H)， 3.18(q， 1H)， 2.71-2.67(m， 2H)， 2.64-2.58(m， 2H)， 2.24-2.15(m， 1H)， 1.76(s， br， 1H)， 1.53(s， br， 1H)， 1.03(s， 9H)， 0.78(d， 3H)。
     实施例 21 ： (2S， 3R)-3- 甲基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 二乙基氨基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
     在氩气下、 向在 DMF(1.5ml) 中的咪唑 -1- 甲酸 (8- 二乙基氨基 -4， 5- 二氢 - 噻唑 并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ( 中间体 C， 82mg， 0.222mmol) 加入 (2S， 3R)-3- 甲基 - 吡 咯烷 -2- 甲酸酰胺 ( 中间体 P， 42.7mg， 0.333mmol) 和三乙胺 (0.093mL， 0.666mmol)。将 RM 在室温搅拌 2h， 然后通过制备型 HPLC( 方法 B) 直接纯化。将 CH3CN 在真空下从含产物的馏 分除去， 然后将剩余的溶液通过 Bond Elut-SCX 柱洗脱。然后将柱用在 MeOH 中的 7M 氨溶
     液洗脱， 蒸发， 将残余物用甲醇研磨， 得到为白色结晶固体的标题化合物。 HPLC ： tR 3.74( 方 1 法 D)。MS ： M+H ＝ 430.1. H-NMR(CD3OD， 600MHz) ： 7.62(s， 1H)， 4.03(d， 1H)， 3.46(t， 1H)， 3.26(q， 4H)， 3.17(q， 1H)， 2.54(s， 4H)， 2.24-2.15(m， 1H)， 1.80-1.72(m， 1H)， 1.58-1.47(m， 1H)， 0.83(t， 6H)， 0.77(d， 3H)。
     实施例 22 ： (2S， 4S)-4- 二甲基氨基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 二乙基 氨基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
     向 在 DMF(1.5ml) 中 的 咪 唑 -1- 甲 酸 (8- 二 乙 基 氨 基 -4， 5- 二 氢 - 噻 唑 并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ( 中间体 C， 60mg， 0.162mmol) 加入 (2S， 4S)-4- 二甲基氨基 - 吡 咯烷 -2- 甲酸酰胺 ( 中间体 Q， 28.1mg， 0.179mmol) 和三乙胺 (0.068mL， 0.487mmol)。将 RM 在 40℃搅拌 17h， 然后通过制备型 HPLC( 方法 B) 直接纯化。将含产物的馏分通过 Bond Elut-SCX 柱。 然后将柱用在 MeOH 中的 7M 氨溶液洗脱。 将溶液蒸发， 得到标题化合物。 HPLC ： M+H ＝ 459.1。 tR3.23min( 方法 D)。MS ：
     实施例 23 ： 5- 苯基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 二乙基氨基 -4， 5- 二 氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
     向咪唑 -1- 甲酸 (8- 二乙基氨基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰 胺 ( 中间体 C， 65mg， 0.176mmol) 在 DMF(2ml) 中的悬液加入 5- 苯基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰 胺 ( 如 US 专 利 3164597 实 施 例 42 所 述 制 备， 50.2mg， 0.264mmol) 和 三 乙 胺 (0.074mL， 0.528mmol)。将 RM 在 40℃搅拌 2h， 然后通过制备型 HPLC( 方法 B) 直接纯化。将含产物的 馏分通过 Bond Elut-SCX 柱。然后将柱用在 MeOH 中的 7M 氨溶液洗脱。将溶液蒸发， 将残 余物在 DCM 中研磨， 得到为黄色固体的标题化合物。LCMS ： tR 0.99min 且 M+H ＝ 492.0( 方
     法 A2)。
     实施例 24 ： 氮杂环丁烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]向咪唑 -1- 甲酸 (8- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ( 中 间体 A， 100mg， 0.282mmol) 在 DMF(2ml) 中的溶液加入氮杂环丁烷 -2- 甲酸酰胺 (56.5mg， 0.564mmol) 和三乙胺 (0.118mL， 0.846mmol)。将 RM 在氩气气氛下于室温搅拌 16h， 然后通 过制备型 HPLC( 方法 B) 直接纯化。将含产物的馏分通过 Bond Elut-SCX 柱。然后将柱用 在 MeOH 中的 7M 氨溶液洗脱。将溶液蒸发， 将残余物通过硅胶快速层析法纯化， 用含 0.5％ 880 HN3 的 DCM/MeOH 95 ∶ 5 洗脱， 得到为黄色固体的标题化合物。HPLC ： tR 3.55min( 方法 D)。MS ： M+H ＝ 387.1。
     实施例 25 ： (S)- 氮杂环丁烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 噻 唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
     在室温、 将 (S)- 氮杂环丁烷 -2- 甲酸酰胺 ( 中间体 L， 68.1mg， 0.680mmol) 加至 搅拌的咪唑 -1- 甲酸 (8- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ( 中 间体 A， 241mg， 0.680mmol) 和三乙胺 (0.284mL， 2.040mmol) 在 DMF(3ml) 中的混合物。将 RM 在室温静置 66h， 然后通过制备型 HPLC( 方法 B) 直接纯化。将含产物的馏分蒸发， 除去 CH3CN， 然后用 NaHCO3 碱化。然后将水相用 10％ MeOH 的 DCM 溶液萃取 4X， 将合并的有机层 经 Na2SO4 干燥， 蒸发得到固体， 将该固体用 MeOH/ 水研磨， 得到为灰白色结晶固体的标题化 合物。LCMS ： tR 1.08min 且 M+H ＝ 386.9( 方法 A3)。
     实施例 26 ： (2S， 4S)-4- 羟基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 二乙基氨基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
     向咪唑 -1- 甲酸 (8- 二乙基氨基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰 胺 ( 中间体 C， 75mg， 0.203mmol) 在 DMF(2ml) 中的悬液加入 (2S， 4S)-4- 羟基 - 吡咯烷 -2- 甲 酸酰胺 ( 中间体 R， 39.6mg， 0.305mmol) 和三乙胺 (0.113mL， 0.812mmol)。将 RM 在 40℃搅 拌 2.5h， 然后通过制备型 HPLC( 方法 B) 直接纯化。将含产物的馏分通过 Bond Elut-SCX 柱。然后将柱用在 MeOH 中的 7M 氨溶液洗脱。将溶液蒸发， 得到为黄色固体的标题化合物。HPLC ： tR 3.44min( 方法 D)。MS ： M+H ＝ 432.1。
     实施例 27 ： (2S， 4R)-4- 羟基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 二乙基氨基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
     向咪唑 -1- 甲酸 (8- 二乙基氨基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰 胺 ( 中间体 C， 75mg， 0.203mmol) 在 DMF(2ml) 中的悬液加入 (2S， 4R)-4- 羟基 - 吡咯烷 -2- 甲 酸酰胺 ( 中间体 S， 39.6mg， 0.305mmol) 和三乙胺 (0.113mL， 0.812mmol)。 将 RM 在 40℃搅拌 4.5h， 然后通过制备型 HPLC( 方法 B) 直接纯化。将含产物的馏分通过 Bond Elut-SCX 柱。 然后将柱用在 MeOH 中的 7M 氨溶液洗脱。将溶液蒸发， 将残余物从 DCM 重结晶， 得到为黄色 固体的标题化合物。HPLC ： tR 3.31min( 方法 D)。MS ： M+H ＝ 432.1。
     实施例 28 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(7- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 苯并 [1， 2-d ； 3， 4-d′ ] 双噻唑 -2- 基 )- 酰胺 ]
     将 L- 脯 氨 酰 胺 (59.4mg， 0.521mmol) 和 TEA(0.121mL， 0.868mmol) 加 至 在 DMF(1ml) 中 的 咪 唑 -1- 甲 酸 (7- 叔 丁 基 -4， 5- 二 氢 - 苯 并 [1， 2-d ； 3， 4-d ′ ] 双 噻 唑 -2- 基 )- 酰胺 ( 中间体 T， 156mg， 0.434mmol)。将 RM 在室温搅拌 10min。将混合物用 EtOAc/H2O 萃取。将有机层经 Na2SO4 干燥， 蒸发。用 MPLCC18H2O 0.1 ％ TFA/CH3CN 0.1 ％ TFA( 梯度 0-50 ％ ) 对粗物质层析。将含产物的馏分用 NaHCO3 中和， 用 EtOAc 萃取， 从 二 噁 烷 冻 干， 得 到 为 白 色 固 体 的 标 题 化 合 物 (M+H ＝ 406 ； M-H ＝ 404 ； tR 4.75min( 方 1 法 F) 。 H-NMR(d 6-DMSO ， 600.13MHz)10.80(s ， 1H)7.40(s ， 1H) ， 6.98(s ， 1H) ， 4.30(s ， 1H)3.65-3.55(m 1H)， 3.48-3.38(m， 1H)， 3.10(t， 2H)， 2.94(t， 2H)， 2.14-2.05(m， 1H)， 1.95-1.78(m， 3H)， 1.40(s， 9H))。
     实施例 29 ： (S)-2- 甲基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(7- 叔丁基 -4， 5- 二 氢 - 苯并 [1， 2-d ； 3， 4-d′ ] 双噻唑 -2- 基 )- 酰胺 ]
     将 (S)-2- 甲 基 - 吡 咯 烷 -2- 甲 酸 酰 胺 ( 中 间 体 F， 7.7mg， 0.060mmol) 和 TEA(0.014mL， 0.100mmol) 加至在 DMF(3ml) 中的咪唑 -1- 甲酸 (7- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 苯并 [1， 2-d ； 3， 4-d′ ] 双噻唑 -2- 基 )- 酰胺 ( 中间体 T， 18mg， 0.050mmol)。将 RM 在室温搅拌 10min。 然后用 EtOAc/H2O 萃取。 将有机层经 Na2SO4 干燥， 蒸发。 用 MPLC C18H2O 0.1％ TFA/ CH3CN 0.1％ TFA( 梯度 0-50％ ) 对粗物质层析。 将含产物的馏分用 NaHCO3 中和， 用 EtOAc 萃 取， 从二噁烷冻干， 得到为白色固体的标题化合物 (M+H ＝ 420 ； M-H ＝ 418 ； tR 4.875min( 方 1 法 F)。 H-NMR(d6-DMSO， 600.13MHz)10.60(s， br， 1H)7.68(s， 1H)， 6.86(s， 1H)， 3.68-3.60(m 1H)， 3.60-3.50(m 1H)， 3.08(t， 2H)， 2.90(t， 2H)， 2.10-1.98(m， 1H)， 1.90-1.68(m， 3H)， 1.48(s， 3H)， 1.37(s， 9H))。
     实施例 30 ： (S)- 氮杂环丁烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(7- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 苯 并 [1， 2-d ； 3， 4-d′ ] 双噻唑 -2- 基 )- 酰胺 ]
     将 (S)- 氮杂环丁烷 -2- 甲酸酰胺 ( 中间体 L， 37.1mg， 0.370mmol) 和 TEA(0.14mL， 1.010mmol) 加至在 DMF(2ml) 中的咪唑 -1- 甲酸 (7- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 苯并 [1， 2-d ； 3， 4-d′ ] 双噻唑 -2- 基 )- 酰胺 ( 中间体 T， 121mg， 0.337mmol)。将 RM 搅拌 5min， 然后在室 温静置 2 天。过滤 RM， 通过制备型 HPLC( 方法 E) 直接纯化。将含产物的馏分合并， 滤过 BondElute-SCX， 300mg 柱。 然后将柱用在 MeOH 中的 7M 氨溶液 (2ml) 洗涤。 蒸发滤液， 得到为 1 白色固体的标题化合物 (M+H ＝ 391.8 ； M-H ＝ 389.8 ； tR1.84min( 方法 A3)。H-NMR(d6-DMSO， 400MHz)11.12(s， 1H)7.52(s， 1H)， 7.30(s， 1H)， 4.74-4.62(m， 1H)， 3.92(t， 2H)， 3.08(t， 2H)， 2.90(t， 2H)， 2.46-2.36(m， 1H)， 2.18-2.02(m， 1H)， 1.39(s， 9H))。
     实施例 31 ： (2S， 4R)-4- 二甲基氨基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(7- 叔丁 基 -4， 5- 二氢 - 苯并 [1， 2-d ； 3， 4-d′ ] 双噻唑 -2- 基 )- 酰胺 ]
     将 (2S， 4R)-4- 二甲基氨基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺 ( 中间体 B， 9.33mg， 0.059mmol) 和 TEA(0.019mL， 0.135mmol) 加 至 在 DMF(1ml) 中 的 咪 唑 -1- 甲 酸 (7- 叔 丁 基 -4， 5- 二 氢 - 苯并 [1， 2-d ； 3， 4-d′ ] 双噻唑 -2- 基 )- 酰胺 ( 中间体 T， 19.4mg， 0.054mmol)。将 RM 搅拌 5min， 然后在室温静置过夜。将 RM 过滤， 通过制备型 HPLC( 方法 E) 直接纯化。将含 产物的馏分合并， 滤过 Bond Elute-SCX， 300mg 柱。然后将柱用在 MeOH 中的 7M 氨溶液洗 涤。蒸发滤液， 得到为白色固体的标题化合物 (M+H ＝ 449.1 ； M-H ＝ 447.3 ； tR1.47min( 方
     法 A3)。1H-NMR(d6-DMSO， 400MHz)7.40(s， 1H)， 7.00(s， 1H)， 4.44-4.25(m， 1H)， 3.86-3.76(m 1H) ， 3.35-3.25(m 1H) ， 3.08(t ， 2H) ， 2.92(t ， 2H) ， 2.96-2.78(m ， 1H) ， 1.18(s ， br ， 6H) ， 2.08-1.85(m， 2H)， 1.38(s， 9H))。
     实施例 32 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-{[7-(2- 氟 -1， 1- 二甲基 - 乙 基 )-4， 5- 二氢 - 苯并 [1， 2-d ； 3， 4-d′ ] 双噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
     将 L- 脯 氨 酰 胺 (23.98mg， 0.210mmol) 和 TEA(0.080mL， 0.573mmol) 加 至 在 DMF(1ml) 中 的 咪 唑 -1- 甲 酸 [7-(2- 氟 -1， 1- 二 甲 基 - 乙 基 )-4， 5- 二 氢 - 苯 并 [1， 2-d ； 3， 4-d ′ ] 双噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 ( 中间体 U， 72.1mg， 0.191mmol)。将 RM 搅拌 5min， 然后在室温静置过夜。蒸发 RM， 然后用 MeOH(2ml) 和 H2O(1ml) 研磨。将混合物冷却至 将固体于 40 ℃在 HV 下干燥， 得到为白色 4 ℃。过滤悬液， 用冷 MeOH/H2O ＝ 2 ∶ 1 洗涤， 1 固体的标题化合物 (M+H ＝ 424.0 ； M-H ＝ 422.1 ； tR 1.7min( 方法 A3)。 H-NMR(d6-DMSO， 400MHz)7.19(s， 1H)， 6.96(s， 1H)， 4.58(s， 1H)4.44(s， 1H)， 4.28(s， br， 1H)3.64-3.50(m 1H)， 3.48-3.38(m 1H)， 3.10(t， 2H)， 2.92(t， 2H)， 2.18-1.98(m， 1H)， 1.94-1.78(m， 3H)， 19 1.38(s， 6H) F-NMR(d6-DMSO， 600.13MHz)219ppm(t， 1F))。
     实施例 33 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(7- 环丙基甲基 -4， 5- 二氢 - 苯 并 [1， 2-d ； 3， 4-d′ ] 双噻唑 -2- 基 )- 酰胺 ]
     将 L- 脯 氨 酰 胺 (16.7mg， 0.147mmol) 和 TEA(0.027mL， 0.196mmol) 加 至 在 DMF(1.5ml) 中的咪唑 -1- 甲酸 (7- 环丙基甲基 -4， 5- 二氢 - 苯并 [1， 2- ； 3， 4-d ′ ] 双噻 唑 -2- 基 )- 酰胺 ( 中间体 V， 35mg， 0.098mmol)。 将 RM 在室温搅拌 15min， 然后用 EtOAc/H2O 萃取。将有机层经 Na2SO4 干燥， 蒸发。用 MPLC C18H2O 0.1％ TFA/CH3CN 0.1％ TFA( 梯度 0-50％ ) 对粗物质层析。 将含产物的馏分用 NaHCO3 中和， 用 EtOAc 萃取， 从二噁烷冻干， 得到 1 为白色固体的标题化合物 (M+H ＝ 404 ； M-H ＝ 402 ； tR 4.49min( 方法 F)。 H-NMR(d6-DMSO， 600.13MHz)10.78(s ， 1H)7.40(s ， 1H) ， 6.98(s ， 1H) ， 4.28(s ， br ， 1H)3.65-3.55(m ， 1H) ， 3.48-3.38(m， 1H)， 3.08(t， 2H)， 2.97(t， 2H)， 2.84(d， 2H)， 2.14-2.04(m， 1H)， 1.93-1.72(m， 3H)， 1.10(q， 1H)， 0.60-0.50(m， 2H)， 0.40-0.38(m， 2H))。
     实施例 34 ： (2S， 3S)-3- 甲基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(7- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 苯并 [1， 2-d ； 3， 4-d′ ] 双噻唑 -2- 基 )- 酰胺 ]
     将 (2S， 3S)-3- 甲基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺 ( 中间体 D， 13.37mg， 0.104mmol) 和 TEA(0.039mL， 0.278mmol) 加至在 DMF(2ml) 中的咪唑 -1- 甲酸 (7- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 苯 并 [1， 2-d ； 3， 4-d ′ ] 双 噻 唑 -2- 基 )- 酰 胺 ( 中 间 体 T， 25mg， 0.070mmol)。 将 RM 在 室 温搅拌 10min， 然后用 EtOAc/H2O 萃取。将有机层经 Na2SO4 干燥， 蒸发。将粗物质不经进 一步纯化从二噁烷冻干， 得到为白色固体的标题化合物 (M+H ＝ 420.1 ； M-H ＝ 418.1 ； tR 1 4.85min( 方 法 F)。 H-NMR(d6-DMSO， 600.13MHz)10.78(s， br， 1H)7.44(s， br， 1H)， 6.97(s， br， 1H)， 3.90-3.70(m， 1H)3.62-3.42(m， 2H)， 3.08(t， 2H)， 2.94(t， 2H)， 2.22-2.12(m， 1H)， 2.06-1.94(m， 1H)， 1.58-1.48(m， 1H)， 1.39(s， 9H)， 1.04(d， 3H))。
     实施例 35 ： (1S， 5R)-2- 氮杂 - 二环 [3.1.0] 己烷 -1， 2- 二甲酸 1- 酰胺 2-[(7- 叔 丁基 -4， 5- 二氢 - 苯并 [1， 2-d ； 3， 4-d′ ] 双噻唑 -2- 基 )- 酰胺 ]
     使用中间体 O 替代中间体 D， 以与实施例 34 所述类似的方法合成标题化合物。
     (M+H ＝ 418.0 ； M-H ＝ 416.1 ； t R 4.90min( 方 法 F) 。 1H-NMR(d 6-DMSO ， 600.13MHz)10.78(s ，br ， 1H)7.40(s ，br ， 1H) ， 7.06(s ，br ， 1H) ， 3.92-3.82(m ， 1H)3.62-3.52(m ， 1H) ， 3.08(t ， 2H) ， 2.94(t ， 2H) ， 2.26-2.14(m ， 1H) ， 1.92-1.72(m ， 3H) ， 1.39(s， 9H)， 1.05-0.95(m， 1H))。
     实 施 例 36 ： (2S， 3S)-3-( 乙 酰 基 氨 基 - 甲 基 )- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-[(8- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
     在室温、 将三乙胺 (0.339mmol) 加至咪唑 -1- 甲酸 (8- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 噻唑 并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ( 中间体 A)(0.113mmol) 和 (2S， 3S)-3-( 乙酰基氨基 - 甲 基 )- 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺 ( 阶段 36.1)(0.135mmol) 的溶液。搅拌 85min 后， 将反应混 合物浓缩。将残余物通过硅胶柱层析法纯化， 然后用 Et2O 研磨， 提供为黄色固体的标题化 合物。HPLC ： tR ＝ 4.20min( 方法 H) ； LCMS ： tR ＝ 1.48min， [M+H]+472( 方法 I) ； TLC ： Rf ＝1 0.14(9 ∶ 1CH2Cl2/MeOH) ； H-NMR(d6-DMSO， 600MHz) ： 11.15(br s， 1H)， 8.41(s， 1H)， 7.81(br s， 1H)， 7.53(br s， 1H)， 7.13(br s， 1H)， 4.28(m， 1H)， 3.74(m， 1H)， 3.40(m， 1H)， 3.25(m， 1H)， 2.98(m， 2H)， 2.93(m， 3H)， 2.42(m， 1H)， 2.02(m， 1H)， 1.82(s， 3H)， 1.74(m， 1H)， 1.33(s， 9H)。
     阶段 36.1 ： (2S， 3S)-3-( 乙酰基氨基 - 甲基 )- 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺
     将 (2S， 3S)-3-( 乙 酰 基 氨 基 - 甲 基 )-1-((S)-1- 苯 基 - 乙 基 )- 吡 咯 烷 -2- 甲 酸 酰 胺 ( 阶 段 36.2)(0.48mmol) 和 10 ％ 披 钯 炭 ( 用 50 ％ H2O 润 湿 )(Aldrich330108) (0.096mmol) 在 MeOH(5ml) 中 的 混 合 物 在 室 温 氢 化 6.5h。 然 后 将 反 应 混 合 物 滤 过 Fluoropore 滤膜 (0.2μm FG)， 蒸发。将残余物溶解于 CH2Cl2 中， 蒸发至干， 提供为灰白色 + 固体的标题化合物。ESI-MS ： [M+H] 186 ； TLC ： Rf ＝ 0.08(200 ∶ 20 ∶ 1CH2Cl2/MeOH/ 浓 NH4OH)。
     阶 段 36.2 ： (2S， 3S)-3-( 乙 酰 基 氨 基 - 甲 基 )-1-((S)-1- 苯 基 - 乙 基 )- 吡 咯 烷 -2- 甲酸酰胺
     在室温、 将硫代乙酸 (2.312mmol) 加至 (2S， 3S)-3- 叠氮基甲基 -1-((S)-1- 苯 基 - 乙基 )- 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺 ( 阶段 36.3)(0.578mmol)， 形成氮气。搅拌 16h 后， 将反 应混合物用 Et2O 稀释， 过滤除去固体， 浓缩滤液。将残余物通过硅胶柱层析法纯化， 提供 为浅黄色油状物的标题化合物 ( 硫醇气味 )。HPLC ： tR ＝ 3.71min( 方法 H) ； LC-MS ： tR ＝ + 0.64min， [M+H] 290( 方法 I) ； TLC ： Rf ＝ 0.38(200 ∶ 20 ∶ 1CH2Cl2/MeOH/ 浓 NH4OH)。
     阶段 36.3 ： (2S， 3S)-3- 叠氮基甲基 -1-((S)-1- 苯基 - 乙基 )- 吡咯烷 -2- 甲酸酰 胺
     在 0 ℃、 将在甲苯中三甲基铝 (2M， 15.95mmol) 滴加至 NH4Cl(15.95mmol) 在甲苯 (2ml) 中的混合物， 形成甲烷气体。将反应混合物升至室温， 另外搅拌 15min， 然后缓慢地 用 (2S， 3S)-3- 叠氮基甲基 -1-((S)-1- 苯基 - 乙基 )- 吡咯烷 -2- 甲酸甲酯 ( 阶段 36.4) (7.98mmol) 在甲苯 (8ml) 中的溶液处理。 18h 后加入由在甲苯 (2ml) 中的 NH4Cl(15.95mmol) 和在甲苯中的三甲基铝 (2M， 15.95mmol) 在 0 ℃制备的另外的试剂。搅拌 44h 后， 将混合
     物冷却至 0℃， 用 1M HCl 淬灭， 然后用 CH2Cl2(3X) 洗涤。将水相用 1 ∶ 1 的 NaHCO3 饱和溶 液 /Rochelle 盐饱和溶液碱化， 用 THF(10X) 萃取。将合并的有机层干燥 (Na2SO4)， 干燥， 浓缩。将残余物使用 RediSep 硅胶柱纯化， 提供为黄色油状物的标题化合物。HPLC ： tR ＝ 2.50min( 方法 G) ； ESI-MS ： [M+H]+ 274 ； TLC ： Rf ＝ 0.26(3 ∶ 1Hex/EtOAc)。
     阶段 36.4 ： (2S， 3S)-3- 叠氮基甲基 -1-((S)-1- 苯基 - 乙基 )- 吡咯烷 -2- 甲酸甲 酯
     在室温、 将叠氮化钠 (5.34mmol) 加至 (2S， 3R)-3- 碘甲基 -1-((S)-1- 苯基 - 乙 基 )- 吡咯烷 -2- 甲酸甲酯 ( 阶段 36.5)(3.56mmol) 在 DMF(30ml) 中的溶液。18h 后， 将反 应混合物倒入水中， 用 TBE(2X) 萃取。将合并的有机相用盐水洗涤， 干燥 (Na2SO4)， 过滤， 浓缩。将残余物使用 RediSep 硅胶柱纯化， 提供为褐色油状物的标题化合物。HPLC ： tR ＝
     3.26min( 方法 G) ； ESI-MS ： [M+H]+289。
     阶段 36.5 ： (2S， 3R)-3- 碘甲基 -1-((S)-1- 苯基 - 乙基 )- 吡咯烷 -2- 甲酸甲酯
     在 -78 ℃、将 [ 丁 -3- 烯 基 -((S)-1- 苯 基 - 乙 基 )- 氨 基 ]- 乙 酸 甲 酯 [432555-77-6](20.22mmol) 在 THF(10ml) 中的溶液缓慢加至二异丙基氨基锂 (24.26mmol) 在 1 ∶ 2 己烷 /THF(30ml) 中的溶液。将反应混合物升温至 0 ℃， 搅拌 1h， 然后再冷却 至 -78 ℃。加入溴化锌 (50.5mmol) 在 Et2O(40ml) 中的溶液， 然后将反应混合物升温至室 温。搅拌 1h 后， 将混合物冷却至 0℃， 分批加入碘 (22.24mmol)。将反应混合物在 0℃搅拌 2h， 在室温再搅拌 2h， 用 Et2O 稀释， 然后用 Na2S2O3 饱和溶液和 NH4Cl 饱和溶液连续洗涤。将 水层各自用 Et2O 反萃取。将合并的有机相干燥 (Na2SO4)， 过滤， 浓缩。将残余物通过硅胶 柱层析法纯化， 提供为红色油状物的标题化合物。HPLC ： tR ＝ 3.46min( 方法 G) ； ESI-MS ：
     [M+H]+374。
     实施例 37 ： (2S， 3S)-3- 吗啉 -4- 基甲基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 叔 丁基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
     在室温、 将三乙胺 (0.423mmol) 加至咪唑 -1- 甲酸 (8- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 噻 唑 并 [4， 5-h] 喹 唑 啉 -2- 基 )- 酰 胺 ( 中 间 体 A)(0.141mmol) 和 (2S， 3S)-3-( 乙 酰 基 氨 基 - 甲基 )- 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺 ( 阶段 37.1)(0.155mmol) 在 DMF(0.5ml) 中的溶液。搅 拌 3h 后， 浓缩反应混合物。将残余物通过硅胶柱层析法纯化， 提供为白色固体的标题化 合 物。HPLC ： tR ＝ 4.04min( 方 法 H) ； LCMS ： tR ＝ 1.36min， [M+H]+ 500( 方 法 I) ； TLC ： Rf 1 ＝ 0.09(19 ∶ 1CH2Cl2/MeOH) ； H-NMR(d6-DMSO， 600MHz) ： 11.15(br s， 1H)， 8.39(m， 1H)， 7.37(br s， 1H)， 7.05(s， 1H)， 4.27(m， 1H)， 3.70(m， 1H)， 3.59(m， 4H)， 3.42(m， 1H)， 2.97(m， 2H)， 2.90(m， 2H)， 2.58(m， 1H)， 2.38(m， 4H)， 2.35(m， 1H)， 2.17(m， 1H)， 2.02(m， 1H)， 1.75(m， 1H)， 1.32(s， 9H)。
     阶段 37.1 ： (2S， 3S)-3- 吗啉 -4- 基甲基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺
     将 (2S， 3S)-3- 吗 啉 -4- 基 甲 基 -1-((S)-1- 苯 基 - 乙 基 )- 吡 咯 烷 -2- 甲 酸 酰 胺 ( 阶 段 37.2)(1.046mmol) 和 10 ％ 披 钯 炭 ( 用 50 ％ H2O 润 湿 )(Aldrich 330108) (0.105mmol) 在 MeOH(5ml) 中 的 混 合 物 在 室 温 氢 化 6.5h。 然 后 将 反 应 混 合 物 滤 过 Fluoropore 滤膜 (0.2μm FG)， 蒸发。 将残余物溶解于 CH2Cl2， 蒸发至干， 提供为无色油状物 + 的标题化合物。ESI-MS ： [M+H] 214 ； TLC ： Rf ＝ 0.14(200 ∶ 20 ∶ 1CH2Cl2/MeOH/ 浓 NH4OH)。
     阶段 37.2 ： (2S， 3S)-3- 吗啉 -4- 基甲基 -1-((S)-1- 苯基 - 乙基 )- 吡咯烷 -2- 甲 酸酰胺
     在 0 ℃、 将在甲苯中的三甲基铝 (2M， 2.89mmol) 滴加至 NH4Cl(2.89mmol) 在甲苯 (3ml) 中的混合物， 形成甲烷气体。将反应混合物升温至室温， 再搅拌 15min， 然后缓慢地用 (2S， 3S)-3- 吗啉 -4- 基甲基 -1-((S)-1- 苯基 - 乙基 )- 吡咯烷 -2- 甲酸甲酯 ( 阶段 37.3) (1.444mmol) 在甲苯 (9ml) 中的溶液处理。 18h 后加入由在甲苯 (2ml) 中的 NH4Cl(2.89mmol) 和在甲苯中的三甲基铝 (2M， 2.89mmol) 在 0℃制备的另外的试剂。 搅拌 60h 后， 将混合物冷 却至 0℃， 用 1M HCl 淬灭， 然后用 CH2Cl2(3X) 洗涤。将水相用 1 ∶ 1 的 NaHCO3 饱和溶液 / Rochelle 盐饱和溶液碱化， 用 THF(10X) 萃取。 将合并的有机层干燥 (Na2SO4)， 过滤， 浓缩。 将 残余物通过硅胶柱层析法纯化， 提供为黄色油状物的标题化合物。HPLC ： tR ＝ 2.18min( 方 + 法 G) ； ESI-MS ： [M+H] 318。
     阶段 37.3 ： (2S， 3S)-3- 吗啉 -4- 基甲基 -1-((S)-1- 苯基 - 乙基 )- 吡咯烷 -2- 甲 酸甲酯
     将 (2S， 3R)-3- 碘甲基 -1-((S)-1- 苯基 - 乙基 )- 吡咯烷 -2- 甲酸甲酯 ( 阶段 36.5) (7.07mmol)、 K2CO3(21.22mmol) 和吗啉 (10.61mmol) 在 CH3CN(24ml) 中的混合物在 50℃搅 拌 62h。将反应混合物倒入冰水中， 用 EtOAc 萃取 (3X)。将合并的有机层连续用水和盐水 洗涤， 干燥 (Na2SO4)， 过滤， 浓缩。将残余物使用 RediSep 硅胶柱纯化， 提供为黄色油状物的标题化合物。HPLC ： tR ＝ 2.56min( 方法 G) ； ESI-MS ： [M+H]+ 333。
     实施例 38 ： (2S， 3R)-3- 羟基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
     使用 (2S， 3R)-3- 羟基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺 (H.Fukushima 等人， Bioorg.Med. Chem.2004， 12， 6053 ； H.Ji 等人， J.Med.Chem.2006， 49(21)， 6254) 替代中间体 P， 使用如实 施例 20 所述的方法合成标题化合物。
     LCMS ： tR ＝ 1.45min， M+H ＝ 417.0， M-H ＝ 415( 方 法 J)。1H-NMR(d6-DMSO， 600.13MHz) ： 12-11(s， br， 1H)8.4(s， 1H)， 7.2-6.9(m， 2H)， 5.2(s， 1H)， 4.4(s， 1H)， 4.25(s， br， 1H)， 3.6(m， 1H) ； 3.45(m， 1H)， 2.95(m， 2H)， 2.9(m， 2H)， 2.0(m， 1H)， 1.9(m， 1H)， 1.3(s， 9H)。
     实施例 39 ： (2S， 3R)-3- 甲基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(7- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 苯并 [1， 2-d ； 3， 4-d′ ] 双噻唑 -2- 基 )- 酰胺 ]
     使用 (2S， 3R)-3- 甲基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺 ( 中间体 P) 替代中间体 D， 使用如实 施例 34 所述的方法合成标题化合物。
     LCMS ： tR ＝ 1.32min， M+H ＝ 420.0， M-H ＝ 418.1( 方 法 J)。1H-NMR(d6-DMSO， 400MHz) ： 10.65(s， br， 1H)7.39(s， br， 1H)， 6.99(s， br， 1H)， 4.2(m， 1H)， 3.67(t， 1H)， 3.3(m， 1H)， 3.08(t， 2H)， 2.93(t， 2H)， 2.38(m， 1H)， 1.95(m， 1H)， 1.7(m， 1H)， 1.39(s， 9H)， 0.97(d 3H)。
     合成流程 ：实施例 40 ： (2S， 3R)-3- 甲基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 甲基 -4H-5- 氧 杂 -1- 硫杂 -3， 7- 二氮杂 - 环戊二烯并 [a] 萘 -2- 基 )- 酰胺 ]
     利用在制备实施例 20 中所述的合成方法， 从咪唑 -1- 甲酸 (8- 甲基 -4H-5- 氧 杂 -1- 硫杂 -3， 7- 二氮杂 - 环戊二烯并 [a] 萘 -2- 基 )- 酰胺 ( 阶段 40.1) 开始制备标题 化合物。
     LCMS ： tR ＝ 0.29min， M+H ＝ 374.0， M-H ＝ 372( 方法 J)。1H-NMR 1H-NMR(CD3OD， 400MHz) ： 7.9(s， 1H)， 7.0(s， 1H)， 5.27(s， 2H)， 4.38(d， 1H)， 3.8(dd， 1H)， 3.5(m， 1H)， 2.5(m， 1H)， 2.4(s， 1H)， 2.08(m， 1H)， 1.95(m， 1H)， 1.12(d， 3H)。
     阶段 40.1 ： 咪唑 -1- 甲酸 (8- 甲基 -4H-5- 氧杂 -1- 硫杂 -3， 7- 二氯杂 - 环戊二 烯并 [a] 萘 -2- 基 )- 酰胺
     利用在制备中间体 A 中所述的合成方法， 从 N-(8- 甲基 -4H-5- 氧杂 -1- 硫杂 -3， 7- 二氮杂 - 环戊二烯并 [a] 萘 -2- 基 )- 乙酰胺 ( 阶段 40.2) 制备咪唑 -1- 甲酸 (8- 甲 基 -4H-5- 氧杂 -1- 硫杂 -3， 7- 二氮杂 - 环戊二烯并 [a] 萘 -2- 基 )- 酰胺。
     阶 段 40.2 ： N-(8- 甲 基 -4H-5- 氧 杂 -1- 硫 杂 -3， 7- 二 氮 杂 - 环 戊 二 烯 并 [a] 萘 -2- 基 )- 乙酰胺
     在氩气下、 将 463mg(1.53mmol)N-[4-(4- 溴 -6- 甲基 - 吡啶 -3- 基氧基甲基 )- 噻 唑 -2- 基 ]- 乙酰胺 ( 阶段 40.3)、 900mg(2.71mmol) 碳酸铯、 30.4mg(0.135mmol) 醋酸钯和 81mg(0.271mmol) 三丁基膦四氟硼酸盐在 3mlDMF 中的混合物在 115℃搅拌 7h。 然后将反应 混合物倒入水中， 加入 EtOAc， 经 Hyflo Super Gel 介质 (Fluka 56678) 层过滤后， 用 EtOAc 萃取滤液 (2X)。将合并的有机层用水和盐水洗涤， 干燥 (MgSO4)， 过滤。将滤液真空浓缩， 得到残余物， 其通过硅胶 ( ＝ -100％ EtOAc 的庚烷溶液 ) 纯化， 提供 93mg 为固体的标题化 合物。LCMS ： tR ＝ 0.27min， M+H ＝ 262， M-H260( 方法 J)。
     阶段 40.3 ： N-[4-(4- 溴 -6- 甲基 - 吡啶 -3- 基氧基甲基 )- 噻唑 -2- 基 ]- 乙酰胺
     向 270mg(1.44mmol)4- 溴 -6- 甲基 - 吡啶 -3- 醇 ( 阶段 40.4) 在 DMF(5ml) 中的 溶液加入 44.8mg NaH(1.87mmol)， 将该混合物在室温搅拌 1h。加入 301mg(1.58mmol)2- 乙 酰胺基 -4-( 氯甲基 )-1， 3- 噻唑 (Apollo OR15549)， 在室温再继续搅拌 17h。将反应混合 物倒入水中， 用 EtOAc 萃取 (2X)。将合并的有机层用水和盐水洗涤， 干燥 (MgSO4)， 过滤。将 滤液真空浓缩， 得到 350mg 标题化合物 ( 白色固体 )， 其被认为足够纯而不需进一步纯化。 79 81 LCMS ： tR ＝ 1.36min， M+H ＝ 342( Br)， 344( Br)( 方法 J)。
     阶段 40.4 ： 4- 溴 -6- 甲基 - 吡啶 -3- 醇
     将 920mg(3.05mmol)4- 溴 -5- 甲氧基甲氧基 -2- 甲基 - 吡啶 ( 阶段 40.5) 溶解 于 5ml MeOH 中， 加入浓 HCl(1mL， 12mmol)， 将反应混合物在室温搅拌 2h。在真空浓缩混合 物时， 标题化合物 ( 以盐酸盐形式 ) 结晶。过滤提供 570mg 白色晶体。1H-NMR(d6-DMSO， 400MHz) ： 8.19(s， 1H)， 8.04(s， 1H)， 2.53(s， 3H)。
     阶段 40.5 ： 4- 溴 -5- 甲氧基甲氧基 -2- 甲基 - 吡啶
     将 1000mg(6.53mmol)5- 甲 氧 基 甲 氧 基 -2- 甲 基 - 吡 啶 (J.-P.Behr 等 人， Bioorg.Med.Chem.Lett.2003， 13(10)， 1713) 在 10ml THF 中的溶液冷却至 -78 ℃， 其中加 入 4.03mL(6.85mmol)t-BuLi(1.7M 的戊烷溶液 )。将所得混合物在氩气下搅拌 1h， 然后加 入 2.126g(6.53mmol)1， 2- 二溴四氯乙烷 ( 于 5ml THF 中 )。在 -78 ℃继续搅拌 1h， 将反 应混合物升温至室温。加入饱和 NH4Cl 溶液， 将含水混合物用 EtOAc 萃取 (2X)。将合并的 有机层用 H2O 和盐水洗涤， 干燥 (MgSO4)， 过滤。将滤液真空浓缩， 得到残余物， 其通过硅胶 (EtOAc/ 己烷＝ 1 ∶ 1) 纯化， 提供 920mg 为油状物的标题化合物。LCMS ： tR ＝ 0.29min， M+H 79 81 ＝ 232( Br)， 234( Br)( 方法 J)。
     实施例 41 ： (2S， 3S)-3- 吗啉 -4- 基甲基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(7- 叔 丁基 -4， 5- 二氢 - 苯并 [1， 2-d ； 3， 4-d′ ] 双噻唑 -2- 基 )- 酰胺 ]
     使用 (2S， 3S)-3- 吗啉 -4- 基甲基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺 ( 阶段 37.1) 替代中间 体 D， 利用如实施例 34 所述的方法合成标题化合物。LCMS ： tR ＝ 0.68min， M+H ＝ 505.3.0， M-H ＝ 503.2( 方 法 J)。1H-NMR(d6-DMSO， 600.13MHz) ： 10.65(s， b， 1H)， 7.4(s， b， 1H)， 7.05(s， b， 1H)， 4.3(s， b， 1H)， 3.7(m， 1H)， 3.6(m ， 4H) ， 3.3(m ， 1H) ， 3.1(t ， 2H) ， 2.9(t ， 2H) ， 2.6(m ， 1H) ， 2.4(m ， 1H) ， 2.35(m ， 4H) ， 2.15(m， 1H)， 2.0(m， 1H)， 1.75(m， 1H)， 1.35(s， 9H)。
     实施例 42 ： (2S， 3R)-3- 甲氧基甲基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 叔丁 基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
     在室温、 将三乙胺 (0.525mmol) 加至咪唑 -1- 甲酸 (8- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 噻唑 并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ( 中间体 A)(0.175mmol) 和 (2S， 3R)-3- 甲氧基甲基 - 吡 咯烷 -2- 甲酸酰胺 ( 阶段 42.1)(0.192mmol) 在 DMF(0.7ml) 中的溶液。搅拌 3h 后， 浓缩 反应混合物。将残余物通过硅胶柱层析法纯化， 提供为白色固体的标题化合物。HPLC ： tR ＝ 2.84min( 方 法 G) ； LCMS ： tR ＝ 1.71min， [M+H]+445( 方 法 I) ； TLC ： Rf ＝ 0.41(19 ∶ 1 1 CH2Cl2/MeOH) ； H-NMR(d6-DMSO， 600MHz) ： 11.15(br s， 1H)， 8.40(s， 1H)， 7.42(br s， 1H)， 7.05(br s， 1H)， 4.27(m， 1H)， 3.74(m， 1H)， 3.46(m， 1H)， 3.42(m， 1H)， 3.24(s， 3H)， 3.16(m， 1H)， 2.98(m， 2H)， 2.91(m， 2H)， 2.54(m， 1H)， 2.03(m， 1H)， 1.77(m， 1H)， 1.32(s， 9H)。
     阶段 42.1 ： (2S， 3R)-3- 甲氧基甲基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺
     类似于在阶段 37.1 中所述的程序制备标题化合物， 但使用 (2S， 3R)-3- 甲氧基甲 基 -1-((S)-1- 苯基 - 乙基 )- 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺 ( 阶段 42.2) 替代 (2S， 3S)-3- 吗啉 -4- 基 甲基 -1-((S)-1- 苯基 - 乙基 )- 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺。
     获得为白色固体的标题化合物。ESI-MS ： [M+H]+ 159。
     阶段 42.2 ： (2S， 3R)-3- 甲氧基甲基 -1-((S)-1- 苯基 - 乙基 )- 吡咯烷 -2- 甲酸酰 胺
     类似于阶段 37.2 中所述的程序制备标题化合物， 但使用 (2S， 3R)-3- 甲氧基甲 基 -1-((S)-1- 苯基 - 乙基 )- 吡咯烷 -2- 甲酸甲酯 ( 阶段 42.3) 替代 (2S， 3S)-3- 吗啉 -4- 基 甲基 -1-((S)-1- 苯基 - 乙基 )- 吡咯烷 -2- 甲酸甲酯。
     获 得 为黄 色油状物 的标题 化合物。HPLC ： tR ＝ 2.35min( 方法 G) ； LC-MS ： tR ＝ + 0.47min， [M+H] 263( 方法 K) ； TLC ： Rf ＝ 0.05(1 ∶ 1 庚烷 /EtOAc)。
     阶段 42.3 ： (2S， 3R)-3- 甲氧基甲基 -1-((S)-1- 苯基 - 乙基 )- 吡咯烷 -2- 甲酸甲 酯
     将 (3aR， 6aS)-1-((S)-1- 苯 基 - 乙 基 )- 六 氢 - 呋 喃 并 [3， 4-b] 吡 咯 -6- 酮 [805246-48-4](17.05mmol)、 KOH(71.60mmol) 和碘甲烷 (68.20mmol) 在甲苯 (79ml) 中的混 合物在 80℃搅拌 1.5h。将反应混合物冷却至室温， 在水与 MTBE 之间分配。将水层用 MTBE 萃取 (3X)。 将合并的有机层干燥 (Na2SO4)， 过滤， 浓缩。 将残余物通过硅胶柱层析法纯化， 提 供为黄色油状物的标题化合物。 HPLC ： tR ＝ 2.98min( 方法 G) ； LC-MS ： tR ＝ 0.69min， [M+H]+ 278( 方法 K) ； TLC ： Rf ＝ 0.25(1 ∶ 3 庚烷 /EtOAc)。
     实施例 43 ： (2S， 3S)-3- 二甲基氨基甲基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 叔 丁基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
     在室温、 将三乙胺 (0.305mmol) 加至咪唑 -1- 甲酸 (8- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 噻 唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ( 中间体 A)(0.102mmol) 和 (2S， 3S)-3- 二甲基氨基 甲 基 - 吡 咯 烷 -2- 甲 酸 酰 胺 ( 阶 段 43.1)(0.102mmol) 在 DMF(0.3ml) 中 的 溶 液。 搅 拌 0.5h 后， 浓缩反应混合物， 在真空下于 50℃过夜干燥。将残余物悬浮于 EtOAc(1ml) 中， 过 滤， 在真空下干燥， 提供为白色固体的标题化合物。HPLC ： tR ＝ 4.01min( 方法 H) ； LCMS ： + 1 tR ＝ 1.33min， [M+H] 458( 方 法 I) ； TLC ： Rf ＝ 0.08(4 ∶ 1CH2Cl2/MeOH) ； H-NMR(d6-DMSO， 600MHz) ： 11.14(br s， 1H)， 8.40(s， 1H)， 7.42(br s， 1H)， 7.06(br s， 1H)， 4.27(m， 1H)， 3.71(m， 1H)， 3.42(m， 1H)， 2.98(m， 2H)， 2.90(m， 2H)， 2.52(m， 1H)， 2.33(m， 1H)， 2.18(m， 1H)， 2.18(s， 6H)， 2.01(m， 1H)， 1.72(m， 1H)， 1.32(s， 9H)。
     阶段 43.1 ： (2S， 3S)-3- 二甲基氨基甲基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺
     类似于阶段 37.1 中所述的程序制备标题化合物， 但使用 (2S， 3S)-3- 二甲基氨基 甲基 -1-((S)-1- 苯基 - 乙基 )- 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺 ( 阶段 43.2) 替代 (2S， 3S)-3- 吗 啉 -4- 基甲基 -1-((S)-1- 苯基 - 乙基 )- 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺。并且， 在 4bar 压力下进行 氢化。
     获得为黄色油状物的标题化合物。ESI-MS ： [M+H]+ 172。
     阶段 43.2 ： (2S， 3S)-3- 二甲基氨基甲基 -1-((S)-1- 苯基 - 乙基 )- 吡咯烷 -2- 甲 酸酰胺
     将 (2S， 3S)-3- 氨基甲基 -1-((S)-1- 苯基 - 乙基 )- 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺 ( 阶 段 43.3)(0.418mmol)、 氰 基 硼 氢 化 钠 (2.86mmol) 和 37 ％ 甲 醛 水 溶 液 (2.14mmol) 在 MeOH(3.3ml) 中的混合物在 55℃搅拌 16h。将反应混合物冷却至室温， 浓缩。将残余物使 用 RediSep 硅胶柱纯化， 提供为白色泡沫状物的标题化合物。HPLC ： tR 3.59min( 方法 H) ；
     LC-MS ： tR ＝ 0.86min， [M+H]+ 276( 方法 I) ； TLC ： Rf ＝ 0.13(9 ∶ 1CH2Cl2/MeOH)。
     阶段 43.3 ： (2S， 3S)-3- 氨基甲基 -1-((S)-1- 苯基 - 乙基 )- 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺
     将 (2S， 3S)-3- 叠氮基甲基 -1-((S)-1- 苯基 - 乙基 )- 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺 ( 阶 段 36.3)(0.723mmol) 和三苯基膦 (0.867mmol) 在 THF(3ml) 中的混合物在室温搅拌 25h。 浓缩反应混合物， 提供为浅褐色固体的粗标题化合物。 HPLC ： tR 3.53min( 方法 H) ； ESI-MS ： + [M+H] 248。
     实 施 例 44 ： (2S， 3R)-3- 甲 基 - 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-{[8-(2， 2， 2- 三 氟 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )-4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 ]- 酰胺 }
     在室温、 将三乙胺 (1.714mmol) 加至咪唑 -1- 甲酸 [8-(2， 2， 2- 三氟 -1， 1- 二甲 基 - 乙基 )-4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 ]- 酰胺 ( 阶段 44.1)(0.490mmol) 和 (2S， 3R)-3- 甲基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺 ( 中间体 P)(0.979mmol) 在 DMF(1.5ml) 中的溶液。 搅拌 1.5h 后， 浓缩反应混合物。 将残余物用 NaHCO3 饱和溶液稀释， 用 EtOAc 萃取 (2X)。 将合 并的有机层连续用水和盐水洗涤， 干燥 (Na2SO4)， 过滤， 浓缩。将残余物使用 RediSep 硅胶 柱纯化， 提供为米色固体的标题化合物。 HPLC ： tR ＝ 5.77min( 方法 H) ； LCMS ： tR ＝ 2.18min， + 1 [M+H] 469( 方 法 I) ； TLC ： Rf ＝ 0.16(19 ∶ 1 CH2Cl2/MeOH) ； H-NMR(d6-DMSO， 600MHz) ： 11.19(br s， 1H)， 8.50(s， 1H)， 7.43(br s， 1H)， 7.01(br s， 1H)， 4.18(m， 1H)， 3.72(m， 1H)， 3.40(m， 1H)， 3.03(m， 2H)， 2.94(m， 2H)， 2.38(m， 1H)， 1.97(m， 1H)， 1.70(m， 1H)， 1.58(s， 6H)， 0.99(d， 3H)。
     阶段 44.1 ： 咪唑 -1- 甲酸 [8-(2， 2， 2- 三氟 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )-4， 5- 二氢 - 噻
     唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 ]- 酰胺
     类似于对于中间体 A 所述的程序制备标题化合物， 但在阶段 A.3 中使用 3， 3， 3- 三 氟 -2， 2- 二甲基 - 丙脒盐酸盐 ( 阶段 44.2) 替代叔丁基脒盐酸盐。
     获得为米色固体的标题化合物。 HPLC ： tR ＝ 6.73min( 方法 H) ； LCMS ： tR ＝ 1.11min， + [M+H] 373( 方法 J)。注意 ： 出于鉴定的目的， 将标题化合物溶解于 MeOH-- ＞氨基甲酸甲酯 衍生物。
     阶段 44.2 ： 3， 3， 3- 三氟 -2， 2- 二甲基 - 丙脒盐酸盐
     在室温、 将 3， 3， 3- 三氟 -2， 2- 二甲基 - 丙腈 ( 阶段 44.3)(12.40mmol) 加至甲醇钠 ( 由 48.40mmol 金属钠和 102ml MeOH 新鲜制备 ) 溶液。4h 后， 缓慢加入乙酸 (48.40mmol) 和 NH4Cl(14.88mmol)， 然后将反应混合物加热至 70 ℃达 40h。浓缩 (40 ℃， 100mbar) 反应 混合物后， 将残余物悬浮于丙酮中， 过滤， 在真空下干燥， 提供为白色固体的标题化合物。 + ESI-MS ： [M+H] 155。
     阶段 44.3 ： 3， 3， 3- 三氟 -2， 2- 二甲基 - 丙腈
     将 3， 3， 3- 三氟 -2， 2- 二甲基 - 丙酰胺 ( 阶段 44.4)(121.2mmol) 和五氧化二磷 (121.2mmol) 的混合物缓慢加热至 200℃， 收集所得的馏出液。获得为无色液体的标题化合 物。
     阶段 44.4 ： 3， 3， 3- 三氟 -2， 2- 二甲基 - 丙酰胺
     在 0 ℃、将 草 酰 氯 (140.8mmol) 滴 加 至 3， 3， 3- 三 氟 -2， 2- 二 甲 基 - 丙 酸 [889940-13-0](128mmol) 在 CH2Cl2(128ml) 中的溶液。 加入几滴 DMF 直至观察到气体放出，
     然后继续搅拌 30min。升温至室温并且搅拌过夜后， 浓缩反应混合物 (40℃， 00mbar)。将残 余物溶解于 THF(128ml) 中， 冷却至 0℃， 然后缓慢用浓氨水溶液 (64ml) 处理。在 0℃搅拌 30min 后， 然后在室温搅拌 4h， 将反应混合物浓缩至其一半体积， 得到粘稠的白色悬液。过 + 滤和干燥后， 获得为白色固体的标题化合物。ESI-MS ： [M+H] 156。
     实施例 45 ： (2S， 3R)-3- 甲氧基甲基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-{[8-(2， 2， 2- 三氟 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )-4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 ]- 酰胺 }
     在室温、 将三乙胺 (1.714mmol) 加至咪唑 -1- 甲酸 [8-(2， 2， 2- 三氟 -1， 1- 二甲 基 - 乙基 )-4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 ]- 酰胺 ( 阶段 44.1)(0.490mmol) 和 (2S， 3R)-3- 甲氧基甲基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺 ( 阶段 42.1)(0.0.979mmol) 在 DMF(1.5ml) 中的溶液。搅拌 2h 后， 浓缩反应混合物。将残余物用 NaHCO3 饱和溶液稀释， 用 EtOAc 萃
     取 (2X)。将合并的有机层连续用水和盐水洗涤， 干燥 (Na2SO4)， 过滤， 浓缩。将残余物使用 RediSep 硅胶柱纯化， 提供为米色固体的标题化合物。 HPLC ： tR ＝ 5.71min( 方法 H) ； LCMS ： + 1 tR ＝ 2.15min， [M+H] 499( 方法 I) ； TLC ： Rf ＝ 0.40(19 ∶ 1CH2Cl2/MeOH) ； H-NMR(d6-DMSO， 600MHz) ： 11.23(br s， 1H)， 8.50(s， 1H)， 7.42(br s， 1H)， 7.06(br s， 1H)， 4.27(m， 1H)， 3.74(m， 1H)， 3.46(m， 1H)， 3.42(m， 1H)， 3.24(s， 3H)， 3.16(m， 1H)， 3.03(m， 2H)， 2.94(m， 2H)， 2.55(m， 1H)， 2.03(m， 1H)， 1.77(m， 1H)， 1.58(s， 6H)。
     实 施 例 46 ： (2S， 3R)-3- 甲 基 - 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-[(8- 叔 丁 基 -4H-5- 氧杂 -1- 硫杂 -3， 7- 二氮杂 - 环戊二烯并 [a] 萘 -2- 基 )- 酰胺 ]
     LCMS ： tR ＝ 0.50min， M+H ＝ 416， M-H ＝ 414( 方法 L)。1H-NMR(d6-DMSO， 400MHz) ： 8.05(s， 1H)， 7.37(bs， 1H)， 7.09(s， 1H)， 6.97(bs， 1H)， 5.31(s， 2H)， 4.18(m， 1H)， 3.69(dd， 1H)， 3.39(m， 1H)， 2.35(m， 1H)， 1.95(m， 1H)， 1.71(m， 1H)， 1.27(s， 9H)， 0.975(d， 3H)。
     利用在制备实施例 40 中所述的合成方法， 从 2- 叔丁基 -5- 甲氧基甲氧基 - 吡啶 制备标题化合物。如下所述由 2- 溴 -5- 甲氧基甲氧基 - 吡啶制备原料 2- 叔丁基 -5- 甲氧 基甲氧基 - 吡啶 ：
     2- 叔丁基 -5- 甲氧基甲氧基 - 吡啶 ：
     将在 15ml 干燥 THF 中的 6.69g(74.7mmol) 氰化铜 (I) 冷却至 -75 ℃， 其中滴加 149mL(149mmol)1M 叔丁基氯化镁溶液。继续搅拌 40min。之后， 滴加溶解于 30ml 干燥 THF 中的 4.07g(18.67mmol)2- 溴 -5- 甲氧基甲氧基 - 吡啶 (Zhong， W. 等人， WO2008147547)。 将反应混合物在 -75℃搅拌 1h， 然后升温至室温， 再继续搅拌 6h。然后将 30ml 25％氨水 溶液加至反应混合物。过滤混合物， 用 CH2Cl2 萃取两次。将合并的有机层用水洗涤， 干燥 (MgSO4)， 过滤， 真空浓缩。将残余物通过硅胶层析法 (EtOAc， 庚烷 ) 纯化， 得到 2.64g 为油 状物的纯标题化合物。LCMS ： tR ＝ 0.55min， M+H ＝ 196( 方法 K)。
     实施例 47 ： (2S， 3S)-3- 二甲基氨基甲基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 叔 丁基 -4H-5- 氧杂 -1- 硫杂 -3， 7- 二氮杂 - 环戊二烯并 [a] 萘 -2- 基 )- 酰胺 ]
     利用对于制备实施例 46 所述的合成方法， 并且在合成的最后一步中使用 (2S， 3S)-3- 二甲基氨基甲基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺 ( 阶段 43.1) 替代 (2S， 3R)-3- 甲基 - 吡咯 烷 -2- 甲酸酰胺， 制备标题化合物。LC-MS ： tR ＝ 0.24min， M-H ＝ 457( 方法 L)。1H-NMR(d6-DMSO， 400MHz) ： 11.15(bs， 1H)， 8.03(s， 1H)， 7.35(s， 1H)， 7.07(s， 1H)， 7.0(s， 1H)， 5.28(s， 2H)， 4.23(m， 1H)， 3.65(m， 1H) ， 3.40(m ， 1H) ， 2.6-2.45(m ， 2H) ， 2.30(m ， 1H) ， 2.17(s ， 6H) ， 2.15(m ， 1H)1.70(m ， 1H) ， 1.27(s， 9H)。
     实 施 例 48 ： (2S， 3R)-3- 甲 基 - 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-{[8-(2， 2， 2- 三 氟 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )-4H-5- 氧杂 -1- 硫杂 -3， 7- 二氮杂 - 环戊二烯并 [a] 萘 -2- 基 ]- 酰 胺}
     LC-MS ： tR ＝ 1.59min， M+H ＝ 470( 方法 F)。1H-NMR(d6-DMSO， 400MHz) ： 11.25(bs， 1H)， 8.15(s， 1H)， 7.42(s， 1H)， 7.34(s， 1H)， 7.00(s， 1H)， 5.40(s， 2H)， 4.19(s， 1H)， 3.71(m， 1H)， ca.3.4(m， 1H)， 2.5-2.35(m， 1H)， 1.99(m， 1H)， 1.68(m， 1H)， 1.56(s， 6H)， 0.99(d， 3H)。
     利用在制备实施例 40 和 42 中所述的合成方法， 由 4- 溴 -5- 甲氧基甲氧基 -2-(2， 2， 2- 三氟 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )- 吡啶制备标题化合物。
     如下制备 4- 溴 -5- 甲氧基甲氧基 -2-(2， 2， 2- 三氟 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )- 吡啶 ：
     a)4- 溴 -5- 甲氧基甲氧基 -2-(2， 2， 2- 三氟 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )- 吡啶 ：利用在制备实施例 40 阶段 40.5 中所述的合成方法， 获得为油状物的标题化合物。 79 81 LCMS( 方法 L) ： tR ＝ 1.26min， M+H ＝ 328( Br)， 330( Br).
     b)5- 甲氧基甲氧基 -2-(2， 2， 2- 三氟 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )- 吡啶
     将 1.7g(4.13mmol) 甲磺酸 2， 2， 2- 三氟 -1-(5- 甲氧基甲氧基 - 吡啶 -2- 基 )-1- 甲 基 - 乙 酯 溶 解 于 20ml 二 氯 甲 烷 中。 将 反 应 混 合 物 冷 却 至 0 ℃， 其中缓慢加入 2.065mL(4.13mmol) 三甲基铝。将反应混合物在室温搅拌 20h。之后， 缓慢加入水， 将混合 物用 EtOAc 萃取 2 次。将合并的有机层用水和盐水洗涤， 干燥 (MgSO4)， 过滤， 真空浓缩。将 残余物通过硅胶层析法 (EtOAc， 庚烷 ) 纯化， 得到 0.55g 纯标题化合物。LCMS( 方法 L) ： tR ＝ 1.09min， M+H ＝ 250。
     c) 甲磺酸 2， 2， 2- 三氟 -1-(5- 甲氧基甲氧基 - 吡啶 -2- 基 )-1- 甲基 - 乙酯
     在 0 ℃、 向 搅 拌 的 0.213g(8.44mmol) 氢 化 钠 在 6ml 干 燥 THF 中 的 混 合 物 滴 加 1.06g(4.22mmol)1， 1， 1- 三氟 -2-(5- 甲氧基甲氧基 - 吡啶 -2- 基 )- 丙 -2- 醇 ( 溶解于 4.9ml 干燥 THF 中 )。添加结束后， 在室温继续搅拌 3h。在室温加入甲烷磺酰氯 ( 溶解于 7.3ml 干燥 THF 中 )， 再继续搅拌 2h。然后加入水和 NaHCO3 饱和溶液。将混合物用 EtOAc 萃取 2 次。将合并的有机层用水和盐水洗涤， 干燥 (MgSO4)， 过滤， 真空浓缩， 提供 1.7g 标题 化合物， 其直接用于下一步骤。LCMS( 方法 L) ： tR ＝ 0.96min， M+H ＝ 330。
     d)1， 1， 1- 三氟 -2-(5- 甲氧基甲氧基 - 吡啶 -2- 基 )- 丙 -2- 醇
     将 1.48g(4.58mmol)5- 甲氧基甲氧基 -2-(2， 2， 2- 三氟 -1- 甲基 -1- 三甲基甲硅烷 基氧基 - 乙基 )- 吡啶和 5ml(10mmol) 2N HCl 在 15ml THF 中的混合物在室温搅拌 2h。之 后， 将反应混合物倒入水中， 通过添加 2N HCl 将 pH 调节至 1-2。 将反应混合物用 EtOAc 萃取 2 次。 将合并的有机层用水和盐水洗涤， 干燥 (MgSO4)， 过滤， 真空浓缩， 提供 1.06g 为油状物 的标题化合物 (88％纯度 )， 其不需纯化即可用于下一步骤。LCMS( 方法 L) ： tR ＝ 0.88min， M+H ＝ 252。
     e)5- 甲 氧 基 甲 氧 基 -2-(2， 2， 2- 三 氟 -1- 甲 基 -1- 三 甲 基 甲 硅 烷 基 氧 基 - 乙 基 )- 吡啶
     将 1.12g(6.18mmol)1-(5- 甲氧基甲氧基 - 吡啶 -2- 基 )- 乙酮、 1.055g(7.42mmol) 三甲基 ( 三氟甲基 ) 甲硅烷和 0.025g(0.309mmol) 乙酸钠在 9mlDMF 中的混合物在 0℃搅拌 1h， 在室温搅拌 1h。之后， 将反应混合物倒入水中， 通过添加 2N HCl 将 pH 调节至 1-2。将 反应混合物用 EtOAc 萃取 2 次。将合并的有机层用水和盐水洗涤， 干燥 (MgSO4)， 过滤， 真空 浓缩。将残余物通过硅胶层析法 (EtOAc， 庚烷 ) 纯化， 得到 1.87g 为油状物的纯标题化合 物。LCMS( 方法 L) ： tR ＝ 1.38min， M+H ＝ 324。
     f)1-(5- 甲氧基甲氧基 - 吡啶 -2- 基 )- 乙酮 ：在 0℃、 将 NaH 加至 1g(7.29mmol)1-(5- 羟基 - 吡啶 -2- 基 )- 乙酮 (Anichem) 在 15ml DMF 中的溶液。将该混合物搅拌 1h 后， 在 0℃加入 0.78mL(8.75mmol)MOMCl。然后在 室温将反应混合物搅拌 2h。将反应混合物倒入水中， 用 EtOAc 萃取 2 次。将合并的有机层
     用水和盐水洗涤， 干燥 (MgSO4)， 过滤， 真空浓缩。将残余物通过硅胶层析法 (EtOAc， 庚烷 ) 纯化， 得到 1.12g 为油状物的纯标题化合物。LCMS( 方法 L) ： tR ＝ 0.66min， M+H ＝ 182。
     实 施 例 49 ： (2S， 3R)-3- 甲 基 - 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-{[7-(2， 2， 2- 三 氟 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )-4， 5- 二氢 - 苯并 [1， 2-d ； 3， 4-d′ ] 双噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
     LCMS ： tR ＝ 0.97min， M+H ＝ 474， M-H ＝ 414( 方法 L)。1H-NMR(d6-DMSO， 400MHz) ： 10.7(bs， 1H)， 7.37(s， 1H)， 6.97(s， 1H)， 4.18(m， 1H)， 3.69(dd， 1H)， 3.39(m， 1H)， 3.14(t， 2H)， 2.95(t， 2H)， 2.34(m， 1H)， 1.94(m， 1H)， 1.68(m， 1H)， 1.62(s， 6H)， 0.965(d， 3H)。
     利用在制备实施例 39 中所述的合成方法， 由 2， 2- 二甲基 - 硫代丙酰胺制备标题 化合物。如下所述制备原料 3， 3， 3- 三氟 -2， 2- 二甲基 - 硫代丙酰胺 ：
     3， 3， 3- 三氟 -2， 2- 二甲基 - 硫代丙酰胺的制备 ：
     a)3， 3， 3- 三氟 -2， 2- 二甲基 - 丙酰胺将 2g(12.81mmol)3， 3， 3- 三氟 -2， 2- 二甲基丙酸 (Aldrich)、 2.077g(12.81mmol) 羰基 - 二咪唑和 5.55mL(64.1mmol) 氨水溶液在 50ml CH2Cl2 中的混合物在室温搅拌 20h。 之后， 加入乙醚， 将所得混合物用 0.1N HCL、 0.1N NaOH、 水和盐水洗涤。将有机层干燥 (MgSO4)， 过滤， 真空浓缩， 提供 1.15g 为白色晶体的标题化合物， 其不需进一步纯化即可用 于下一步骤。MS ： M+H ＝ 156。
     b)3， 3， 3- 三氟 -2， 2- 二甲基 - 硫代丙酰胺
     将 1.05g(6.77mmol)3， 3， 3- 三 氟 -2， 2- 二 甲 基 - 丙 酰 胺 和 1.48g(3.66mmol) Lawesson 试剂在 32ml 干燥 THF 中的混合物在回流温度搅拌 20h。之后， 将反应混合物冷却 至室温， 真空浓缩。将残余物通过硅胶层析法 ( 庚烷， EtOAc) 纯化， 提供 0.81g 为纯白色晶 体的标题化合物。MS ： M+H ＝ 172。
     在合成的最后一步中使用 (2S， 3R)-3- 甲氧基甲基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺 ( 阶段 42.1)， 以相同的方法制备以下实施例 ：
     实施例 50 ： (2S， 3R)-3- 甲氧基甲基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-{[7-(2， 2， 2- 三氟 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )-4， 5- 二氢 - 苯并 [1， 2-d ； 3， 4-d′ ] 双噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
     LC-MS ： tR ＝ 0.96min， M+H ＝ 504， M-H ＝ 502( 方法 L)。1H-NMR(d6-DMSO， 400MHz) ： 10.76(bs， 1H)， 7.34(bs， 1H)， 7.02(bs， 1H)， 4.29(m， 1H)， 3.45(m， 1H)， 3.42(m， 2H)， 3.22(s， 3H)， 3.14(m， 3H)， 2.97(m， 2H)， 2.48(m， 1H)， 1.97(m， 1H)， 1.75(m， 1H)， 1.62(s， 6H)。
     实施例 51 ： (2S， 3S)-3- 二甲基氨基甲基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(7- 叔 丁基 -4， 5- 二氢 - 苯并 [1， 2-d ； 3， 4-d′ ] 双噻唑 -2- 基 )- 酰胺 ]
     利 用 对 于 制 备 实 施 例 39 所 述 的 合 成 方 法， 在 合 成 的 最 后 一 步 中 使 用 (2S， 3S)-3- 二甲基氨基甲基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺 ( 阶段 43.1) 替代 (2S， 3R)-3- 甲基 - 吡咯 烷 -2- 甲酸酰胺， 制备标题化合物。
     LC-MS ： tR ＝ 0.91min， M+H ＝ 463， M-H ＝ 461( 方法 L)。1H-NMR(d6-DMSO， 400MHz) ： 10.7(bs， 1H)， 7.36(s， 1H)， 7.01(bs， 1H)， 4.28(m， 1H)， 3.67(dd， 1H)， 3.39(m， 1H)， 3.07(m， 2H)， 2.92(m， 2H)， 2.5-2.44(m， 2H)， 2.30(m， 1H)， 2.14(s， 6H)， 1.95(m， 1H)， 1.40(m， 1H)， 1.36(s， 9H)。
     作为 PI3 激酶抑制剂的效力
     PI3K 激酶 Glo 测定 ： 将 50nL 化合物稀释液分配至黑 384- 孔小体积非结合苯乙烯 (NBS) 板 (Costar 目录号为 NBS#3676)。将以 10mg/ml 甲醇溶液形式提供的 L-a- 磷脂酰肌 醇 (PI) 转移至玻璃管中， 并在氮束中干燥。随后通过涡旋将其再悬浮于 3％辛基糖苷 (OG) 中并储存于 4℃。激酶 Glo 发光激酶测定 (Promega， Madison/WI， USA) 是通过定量激酶反 应后溶液中剩余 ATP 的量来测量激酶活性的均一 HTS 方法。
     添加 5μL PI/OG 与 PI3K 亚型的混合物 ( 表 1)。 通过添加含有 10mM TRIS-HCl pH 7.5、 3mM MgCl2、 50mM NaCl、 0.05％ CHAPS、 1mM DTT 和 1μm ATP 的 5μl ATP- 混合物 ( 最 终体积为 10μL) 开始激酶反应， 且在室温发生。使用 10μl 激酶 Glo 终止反应， 并在 10 分 钟后在 Synergy2 读数仪中使用每孔 0.1 秒的积分时间读板。将 2.5μM 泛 1 类 PI3 激酶抑 制剂 ( 标准物 ) 加至测定板中以产生对激酶反应的 100％抑制， 且使用溶剂媒介物 ( 水中的 90％ DMSO) 得到 0％抑制。使用标准物作为参考化合物， 且以 16 个稀释点形式一式两份地 包括于所有分析板中。
     表 1 藉由激酶 Glo 测定 PI3K ： 测定条件和试剂方案
     PI3K 的克隆
     PI3Kα、 PI3Kβ 和 PI3Kδ 构建体是 p85αiSH2 结构域与各自 p110 同种型的融 合物。p85α 片段和 p110 同种型基因是通过 PCR 从第一链 cDNA 制备， 该第一链 cDNA 是如 下文所述通过 RT-PCR 从来自胎盘、 睾丸和脑的市售 RNA 产生。PI3Kγ 构建体购自 Roger Williams 实验室， MRC Laboratory of Molecular Biology， Cambridge， UK(2003 年 11 月 )， 且已有描述 (Pacold， Michael E. ； Suire， Sabine ； Perisic， Olga ； Lara-Gonzalez， Samuel ； Davis， Colin T. ； Walker， Edward H. ； Hawkins， Phillip T. ； Stephens， Len ； Eccleston， John F. ； Williams， Roger L.Crystal structure and functional analysis of Ras
     binding to its effector phosphoinositide 3-kinase gamma( 结合其效应子磷酸肌醇 3- 激酶 γ 的 Ras 的晶体结构和功能分析 ).Cell(2000)， 103(6)， 931-943)。
     PI3Kα 构建体和蛋白
     PI3Kαwt
     BV1075 p85iSH2(461-568)-GGGGGGGGGGGG-p110α(21-1068)-HisBV1075 ： 杆状病毒 BV-1075 的构建体是通过包含克隆至载体 pBlueBac4.5 中的 p110α 片段和 p85 片段的三部分片段连接来制备。p85 片段衍生自使用 Nhe/Spe 消化的 质粒 p1661-2。通过测序来验证衍生自克隆的 p110α 片段， 且其在 LR410 中用作 SpeI/ HindIII 片段。为了产生杆状病毒表达载体 LR410， 利用 Gateway LR 反应将插入物转移 至 Gateway 修 饰 的 pBlueBac4.5(Invitrogen) 载 体 中。 用 Nhe/HindIII 消 化 克 隆 载 体 pBlueBac4.5(Invitrogen)。这产生构建体 PED 153.8。p85 组件 (iSH2) 是通过 PCR、 使用 ORF 318( 上文所述 ) 作为模板且使用一种正向引物 KAC1028(5’ -GCTAGCATGCGAGAATATGAT AGAT-TATATGAAG-AATATACC)(SEQ ID No.1) 和两种反向引物 KAC1029(5’ -GCCTCCACCAC-CT CCGCCTG-GTTTAATGCTGTTCATACGTTTGTC)(SEQ ID No.2) 和 KAC1039(5’ -TACTAGTC-CGCCTCC AC-CACCTCCGCCTCCACCACCTCCGCC)(SEQ ID No.3) 来产生。该两种反向引物重叠， 并将 12x Gly 接头和 p110α 基因的 N- 末端序列引入 SpeI 位点。该 12x Gly 接头替换 BV1052 构建 体中的单一 Gly 接头。将 PCR 片段克隆至 pCR2.1TOPO(Invitrogen) 中。所得克隆中， 通过 测序测定 p1661-2 是正确的。用 Nhe 和 SpeI 消化该质粒， 将所得片段进行凝胶分离及纯化 以用于亚克隆。
     p110α 克隆片段是通过使用 Spe I 和 HindIII 对克隆 LR410 进行酶促消化 ( 见上文 ) 来制备。SpeI 位点位于 p110α 基因的编码区中。对所得片段进行凝胶分离及纯化以 用于亚克隆。克隆载体 pBlueBac4.5(Invitrogen) 是通过使用 Nhe 和 HindIII 进行酶促消 化来制备。 使用 Qiagen 柱来纯化切割载体， 然后使用牛小肠碱性磷酸酶 (CIP)(BioLabs) 去 磷酸化。CIP 反应结束后， 再次对切割载体进行柱纯化以产生最终载体。使用 Roche Rapid 连接酶和供应商说明书来实施三部分连接。通过测序来验证最终的质粒。
     激酶结构域。
     BV1075 的蛋白序列 ：
     PI3Kβ 构建体和蛋白BV949 p85iSH2(461-N58K-568)-GGGGGG-p110β(2-1070)-HisPI3Kβ
     BV949 ： 产生 p85 PI3Kα、 PI3Kβ 和 PI3Kδ 亚单元的中间 SH2 结构域 (iSH2) 和全 长 p110β 亚单元的 PCR 产物， 并通过重叠 PCR 融合。 iSH2PCR 产物获自第一链 cDNA， 该第一 链是通过 RT-PCR 从来自胎盘、 睾丸和脑的市售人 RNA(Clontech) 制备， 最初使用引物 gwG13 0-p01(5’ -CGAGAATATGATAGATTATATGAAGAAT-3’ )(SEQ ID No.5) 和 gwG130-p02(5’ -TGGTTT-A ATGCTGTTCATACGTTTGTCAAT-3’ )(SEQ ID No.6)。 随后， 在二级 PCR 反应中， 使用引物 gwG130 -p03(5’ -GGGACAAGTT-TGTACAAAAAAGCAGGCTACGAAGGAGATATACATATGCGAGAATATGATAGATTATAT GAAGAAT-3’ )(SEQ ID No.7) 和 gwG130-p05(5’ -ACTGAAGCATCCTCCTC-CTCCTCCT-CCTGGTTTAATGCTGTTCATACGTTTGTC-3’ )(SEQ ID No.8) 分别在 p85iSH2 片段的 5’ 端和 3’ 端添加 Gateway 重组 AttB1 位点和接头序列。p110β 片段通过 PCR、 使用 p110β 克隆 ( 来自经序列验证的 未知来源 ) 作为模板并且使用含有接头序列和 p110β5’ 端的引物 gwG130-p04(5’ -ATTAAAC CAGGAGGAGGAGGAGGAGGATGCTT-CAGTTTCATAATGCCTCCTGCT-3’ )(SEQ ID No.9) 和含有融合至 组氨酸标签的 p110-β3’ 端序列的引物 gwG130-p06(5’ -AGCTCCGTGATGGTGATGGTGATGTGCTC CAGATC-TGTAGTCTTTCCGAA-CTGTGTG-3’ )(SEQ ID No.10) 来获得。p85-iSH2/p110β 融合蛋 白是通过重叠 PCR 来组装， 其为 iSH2 片段的 3’ 端及 p110β 片段的 5’ 端处接头的反应， 其 使用上文提到的 gwG130-p03 引物及含有重叠组氨酸标签和 AttB2 重组序列的引物 (5’ -GG GACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTAAGCTCCGTGATGGTGATGGTGATGTGCTCC-3’ )(SEQ ID No.11)。 以 Gateway(Invitrogen)OR 反应将该最终产物重组至供体载体 pDONR201(Invitrogen) 以 产生 ORF253 入门克隆。通过测序来验证该克隆并用于 Gateway LR 反应 (Invitrogen) 中 以将插入物转移至 Gateway 修饰的 pBlueBac4.5(Invitrogen) 载体中， 以产生杆状病毒表 达载体 LR280。该 LR280 在 p85 序列中具有氨基酸突变。
     激酶结构域 .
     BV949 的蛋白序列 ：
     激酶结构域 . PI3Kγ 构建体和蛋白p110γ(Δ143-[Met144-1102])-His构建体获自 Roger Williams 实验室， MRC Laboratory of Molecular Biology， Cambridge， UK(2003 年 11 月 )。对构建体的描述见 (Pacold， Michael E. ； Suire， Sabine ； Perisic， Olga ； Lara-Gonzalez， Samuel ； Davis， Colin T. ； Walker， Edward H. ； Hawkins， Phillip T. ； Stephens， Len ； Eccleston， John F. ； Williams， Roger L.Crystal structure and functional analysis of Ras binding to its effector phosphoinositide 3-kinase gamma( 结 合 其 效 应 子 磷 酸 肌 醇 3- 激 酶 γ 的 Ras 的 晶 体 结 构 和 功 能 分 析 ).Cell(2000)， 103(6)， 931-943)。构建体缺少 N- 末端 144aa。
     BV950 的蛋白序列 ：
     PI3Kδ 构建体和蛋白PI3Kδ BV1060 p85iSH2(461-568)-GGGGGG-p110δ(2-1044)-HisBV1060 ： 产生 p85 亚单元的中间 SH2 结构域 (iSH2) 和 p110δ 亚单元的全长 PCR 产 物， 并通过重叠 PCR 融合。 该 iSH2PCR 产物是通过使用 ORF318( 见上文 ) 作为模板及使用引 物 gwG130-p03(5’ -GGGACAAG-TTTGTACAAAAAAGCAGGCTACGAAGGAGATATACATATGC-GAGAATATGA TAGATTATATGAAGAAT-3’ )(SEQ ID No.7) 和 gwG154-p04(5’ -TCCTCCTCCT-CCTCCTCCTGGTTTAAT GCTGTTCATACGTTTGTC-3’ )(SEQ ID No.14) 来产生。 该 p110δ 片段获自第一链 cDNA， 该第一 链是通过 RT-PCR 从来自胎盘、 睾丸和脑的市售人 RNA(Clontech) 产生， 最初使用引物 gwG15 4-p01(5’ -ATGCCCCCTGGGGTGGACTGCCCCAT-3’ )(SEQ ID No.15) 和 gwG154-p02(5’ -CTACTGCC
     TGT-TGTCTTTGGACACGT-3’ )(SEQ ID No.16)。 在随后 PCR 反应中， 使用引物 gw154-p03(5’ -A TTAAACCAGGAGGAGGAGGAGGAGGACCCCCTGGGGTGGAC-TGCCCCATGGA-3’ )(SEQ ID No.17) 和 gwG15 4-p06(5’ -AGCTCCGTGATGGTGATGGTGAT-GTGCT-CCCTGCCTGTTGTCTTTGGACACGTTGT-3’ )(SEQ ID No.18) 分别在 p110δ 片段的 5’ 端和 3’ 端添加接头序列和组氨酸标签。p85-iSH2/p110δ 融合蛋白是在第三 PCR 反应中、 通过位于 iSH2 片段的 3’ 端和 p110δ 片段的 5’ 端的重叠 接头、 使用上文提到的 gwG130-p03 引物和含有重叠组氨酸标签和 Gateway(Invitrogen) AttB2 重组序列的引物 (5’ -GGG-ACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTAA-GCTCCGTGATGGTGATGGT GAGTGCTCC-3’ )(SEQ ID No.19) 来组装。 以 Gateway OR 反应将该最终产物重组至供体载体 pDONR201(Invitrogen) 以产生 ORF319 入口克隆。通过测序来验证该克隆并用于 Gateway LR 反应 (Invitrogen) 中以将插入物转移至 Gateway 修饰的 pBlueBac4.5(Invitrogen) 载 体中， 以产生杆状病毒表达载体 LR415。
     BV1060 的蛋白质序列 ：
     PI3Kα、 PI3Kβ 和 PI3Kγ 构建体的纯化
     PI3Kα、 PI3Kβ 和 PI3Kγ 在 两 个 层 析 步 骤 中 纯 化 ： Ni 琼 脂 糖 树 脂 (GE Healthcare) 上 的 固 定 金 属 亲 和 层 析 (IMAC) 及 使 用 Superdex 200 26/60 柱 (GE Healthcare) 的凝胶过滤。将所有缓冲液均冷冻至 4℃， 且在冰上冷冻下进行裂解。在室 温进行柱分级分离。用于纯化 PI3Kβ 的所有缓冲液除含有下文所述之外还含有 0.05 ％ Triton X100。
     通常， 将来自 10L Tn5 细胞培养液的冷冻细胞以 1 ∶ 6v/v 沉淀物对裂解缓冲液
     的比率再悬浮于 “裂解缓冲液” 20mM Tris-Cl pH 7.5、 500mM NaCl、 5％甘油、 5mM 咪唑、 1mM NaF、 0.1ug/mL 软海绵酸 (okadaic acid)(OAA)、 5mM BME、 1x 完全蛋白酶抑制剂合剂 - 不 含 EDTA(20 片剂 /1L 缓冲液， Roche Applied Sciences)、 核酸酶 (Benzonase)(25U/mL 缓 冲液， EMD Biosciences)， 并通过使用装配紧密的研棒匀化 20 次来机械裂解。将裂解液在 45,000g 下离心 30 分钟， 将上清液装载到预平衡的 IMAC 柱 (3ml 树脂 /100ml 裂解液 )。使 用 3-5 柱体积的裂解缓冲液洗涤柱， 随后使用 3-5 柱体积的 20mM Tris-Cl pH 7.5、 500mM NaCl、 5％甘油、 45mM 咪唑、 1mM NaF、 0.1μg/mL OAA、 5mM BME、 1x 完全蛋白酶抑制剂合剂 - 不 含 EDTA 进行第二次洗涤。 使用 20mM Tris-Cl pH 7.5、 0.5M NaCl、 5％甘油、 250mM 咪唑、 1mM NaF、 0.1μg/mL OAA、 5mM BME、 1x 完全蛋白酶抑制剂合剂 - 不含 EDTA 来洗脱蛋白质。通过 SDS-PAGE 来分析相关馏分， 相应地汇集。 通过在 Superdex 200 26/60 柱上凝胶过滤对蛋白 质进行进一步纯化， 该柱在 20mM Tris-Cl pH 7.5、 0.5M NaCl、 5％甘油、 1mM NaF、 5mM DTT、 1x 完全蛋白酶抑制剂合剂 - 不含 EDTA 中平衡。通过 SDS-PAGE 来分析相关馏分， 相应地汇 集。将等体积的透析缓冲液 (20mM Tris-Cl pH 7.5、 500mM NaCl、 50％甘油、 5mM NaF、 5mM DTT) 加至汇集物， 随后在透析缓冲液中透析来进行两次交换 ( 一次交换持续过夜 )。将蛋 白质储存于 -20℃。
     PI3Kδ 的纯化
     PI3Kδ 在三个层析步骤中纯化 ： Ni 琼脂糖树脂 (GE Healthcare) 上的固定金属亲 和层析， 使用 Superdex 200 26/60 柱 (GE Healthcare) 的凝胶过滤及最后的在 Q-HP 柱 (GE Healthcare) 上的离子交换步骤。所有缓冲液均冷冻至 4℃， 且在冰上冷冻下进行裂解。在 室温进行柱分级分离。
     通常， 将来自 10L Tn5 细胞培养液的冷冻细胞以 1 ∶ 10v/v 沉淀物对裂解缓冲液 的比率再悬浮于 “裂解缓冲液” 20mM Tris-Cl pH 7.5、 500mM NaCl、 5％甘油、 5mM 咪唑、 1mM NaF、 0.1μg/mL 软海绵酸 (OAA)、 5mM BME、 1x 完全蛋白酶抑制剂合剂 - 不含 EDTA(20 片剂 /1L 缓冲液， Roche Applied Sciences)、 核酸酶 (25U/mL 缓冲液， EMD Biosciences)， 并通 过使用装配紧密的研棒匀化 20 次来机械裂解。将裂解液在 45,000g 下离心 30 分钟， 将上 清液装载到预平衡的 IMAC 柱 (5ml 树脂 /100ml 裂解液 )。使用 3-5 柱体积的裂解缓冲液洗 涤柱， 随后使用 3-5 柱体积的 20mM Tris-Cl pH 7.5、 500mM NaCl、 5％甘油、 40mM 咪唑、 1mM NaF、 0.1μg/mL OAA、 5mM BME、 1x 完全蛋白酶抑制剂合剂 - 不含 EDTA 进行第二次洗涤。使 用 20mM Tris-Cl pH 7.5、 500mM NaCl、 5％甘油、 250mM 咪唑、 1mM NaF、 0.1μg/mL OAA、 5mM BME、 1x 完全蛋白酶抑制剂合剂 - 不含 EDTA 来洗脱蛋白质。通过 SDS-PAGE 分析相关馏分， 相应地汇集。通过在 Superdex 200 上凝胶过滤对蛋白质进一步纯化， 该 Superdex 200 在 20mM Tris-Cl pH 7.5、 500mM NaCl、 5％甘油、 1mM NaF、 0.1μg/mL OAA、 5mM DTT、 1x 完全蛋 白酶抑制剂合剂 - 不含 EDTA 中平衡。 通过 SDS-PAGE 分析相关馏分， 相应地汇集。 这些馏分 以 1 ∶ 10v/v 汇集体积对缓冲液的比率、 使用 “缓冲液 A” 20mM Tris-Cl pH 8.2、 5％甘油、 1mM NaF、 0.1μg/mL OAA、 5mM DTT 稀释， 并装载到制备好的 Q-HP 柱。 在试样装载完成后， 使 用缓冲液 A 和 5％“缓冲液 B” 20mM Tris-Cl pH 8.2、 1M NaCl、 5％甘油、 1mM NaF、 0.1μg/ mL OAA、 5mM DTT 洗涤 3-5 柱体积。使用 5％ -30％梯度的缓冲液 B 洗脱蛋白质。通常蛋白 质在～ 200mM NaCl 下洗脱。通过 SDS-PAGE 分析相关馏分， 相应地汇集。将等体积的透析 缓冲液 (20mM Tris-Cl pH 7.5、 500mM NaCl、 50％甘油、 1mM NaF、 0.1μg/mL OAA、 5mM DTT)加至汇集物， 随后在透析缓冲液中透析进行两次交换 ( 一次交换持续过夜 )。 将蛋白质储存 于 -20℃。
     使用上述测定法获得以下结果 ：
     磷脂酰肌醇 3- 激酶 (PI3K) 包含脂质激酶家族， 该家族催化磷酸转移至肌醇脂 质的 D-3′位置以产生磷酸肌醇 -3- 磷酸 (PIP)、 磷酸肌醇 -3， 4- 二磷酸 (PIP2) 和磷酸肌 醇 -3， 4， 5- 三磷酸 (PIP3)， 后者又通过将含有普列克底物蛋白 - 同源物、 FYVE、 Phox 和其它 磷脂结合结构域的蛋白质对接至通常位于质膜的多种信号传导复合物中而在信号传导级 联中起第二信使的作用 ((Vanhaesebroeck 等人， Annu.Rev.Biochem 70 ： 535(2001) ； Katso 等人， Annu.Rev.Cell Dev.Biol.17 ： 615(2001))。两种 1 类 PI3K 中， 1A 类 PI3K 是由催化 p110 亚单元 (α、 β、 δ 同种型 ) 与可为 p85α、 p55α、 p50α、 p85β 或 p55γ 的调节亚 单元组成型结合而构成的异二聚体。1B 类亚类具有一个家族成员， 其为由催化 p110γ 亚 单元和两种调节亚单元 p101 或 p84 之一结合而构成的异二聚体 (Fruman 等人， Annu Rev. Biochem.67 ： 481(1998) ； Suire 等人， Curr.Biol.15 ： 566(2005))。p85/55/50 亚单元的模 块结构域包括 Src 同源 (SH2) 结构域， 其在特定序列背景下结合于激活受体和细胞质酪氨 酸激酶上的磷酸酪氨酸残基， 导致 1A 类 PI3K 激活和定位。1B 类 PI3K 由结合多种肽和非肽
    配体的 G 蛋白耦合受体直接激活 (Stephens 等人， Cell89 ： 105(1997)) ； Katso 等人， Annu. Rev.Cell Dev.Biol.17 ： 615-675(2001))。因此， 所得 1A 类 PI3K 的磷脂产物使上游受体和 下游细胞活性联系起来， 所述细胞活性包括增殖、 存活、 趋化作用、 细胞转运、 运动性、 代谢、 炎症和过敏反应、 转录和翻译 (Cantley 等人， Cell 64 ： 281(1991) ； Escobedo 和 Williams， Nature 335 ： 85(1988) ； Fantl 等人， Cell 69 ： 413(1992))。
     在很多情况下， PIP2 和 PIP3 募集 Akt( 病毒致癌基因 v-Akt 的人类同源产物 ) 至 质膜， 在那里其作为对生长和存活极为重要的许多细胞内信号传导路径的节点 (Fantl 等 人， Cell 69 ： 413-423(1992) ； Bader 等人， Nature Rev.Cancer 5 ： 921(2005) ； Vivanco 和 Sawyer， Nature Rev.Cancer 2 ： 489(2002))。PI3K 的异常调节 ( 其通常通过 Akt 激活来增 加存活 ) 是人类癌症中最普遍事件之一， 且已显示以多种水平发生。肿瘤抑制基因 PTEN 使 肌醇环 3′位处的磷酸肌醇去磷酸化， 且由此拮抗 PI3K 活性， 该基因在多种肿瘤中功能缺 失。 在其它肿瘤中， 110α 同种型 PIK3CA 的基因和 Akt 的基因被扩增， 且已在数种人癌症中 证实其基因产物的蛋白表达增加。此外， 已在人类癌症中描述了用以上调 p85-p110 复合物 的 p85α 的突变和易位。最后， 已在多种人癌症中以相当高频率描述了激活下游信号传导 路径的 PIK3CA 的体细胞错义突变 (Kang 等人， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102 ： 802(2005) ； Samuels 等人， Science 304 ： 554(2004) ； Samuels 等人， Cancer Cell 7 ： 561-573(2005))。 该观察显示， 磷酸肌醇 -3 激酶和该信号传导路径的上游及下游组件失调是与人类癌症和 增殖性疾病有关的最常见失调之一 (Parsons 等人， Nature 436 ： 792(2005) ； Hennessey 等人， Nature Rev.Drug Disc.4 ： 988-1004(2005))。
     鉴于以上， PI3K 抑制剂将在治疗增殖性疾病和其它病症中具有特殊价值。期望对 PI3Kα 同种型具有选择性， 且期望的其它特性包括改良的药动学特性和 / 或化学稳定性。
     WO2004/096797 公开了作为 PI3 激酶抑制剂的某些噻唑衍生物及其用作药物的用 途。
     WO 2005/021519 也公开了作为 PI3 激酶抑制剂的某些噻唑衍生物及其用作药物 的用途。
     现已发现， 下文给出的式 I 的 2- 羧酰胺环氨基脲具有有利的药理学特性且抑制 例如 PI3 激酶 ( 磷脂酰肌醇 3- 激酶 )。具体来说， 优选地， 在生物化学和 / 或细胞测定中 相对于 β 和 / 或 δ 和 / 或 γ 亚型， 这些化合物显示 PI3Kα 的选择性。优选期望式 I 化 合物具有的另一特性包括改良的稳定性， 例如在固体形式和 / 或缓冲溶液中改良的化学稳 定性。因此， 式 I 化合物适用于例如治疗依赖于 PI3 激酶的疾病 ( 尤其 PI3Kα， 例如显示 PIK3CA 体细胞突变或种系突变或 PTEN 体细胞突变的那些 )， 尤其是增殖性疾病例如肿瘤疾 病和白血病。
     第一方面， 本发明提供式 I 化合物或其盐、 溶剂合物、 水合物或前药，
     其中，
     A 未取代或取代的芳环或未取代或取代的杂环， 其在符号 * 所示的位置处稠合于 该分子的其余部分 ；
     X-Y 是 (CH2)r 或 O(CH2)t 或 (CH2)tO， 其中，
     r 是 1、 2或3；
     t是1或2；
     A 未取代或取代的芳环或未取代或取代的杂环， 其在符号 * 所示的位置处稠合于 该分子的其余部分 ；
     X-Y 是 (CH2)r 或 O(CH2)t 或 (CH2)tO， 其中，
     r 是 1、 2或3；
     t是1或2；
    
     n 是 0、 1或2； q 是 0、 1、 2、 3或4； 1 R 在每次出现时独立地表示 卤素 ； 羟基 ； 未取代的或取代的芳基 ； 未取代的或取代的氨基 ； 未取代的 C1-C7- 烷基 ； C1-C7- 烷基， 其被下列基团取代一次或多次 ： 羟基、 C1-C7- 烷氧基、 未取代的或取代的氨基、 芳基或杂环基， 并且其中芳基可被卤素单取代或多取代 ； 或两个 R1 取代基一起形成烷二基以形成任 选被羟基或卤素取代的环状部分。
     可参照以下说明书、 包括下文术语表和最后的实例更全面地理解本发明。如本文 所用， 术语 “包括” 、 “含有” 和 “包含” 在本文中是以其开放且非限制性意义使用。
     本文给出的任何通式意欲代表具有由结构式所绘示的结构的化合物以及某些变 体或形式。 具体来说， 本文给出的任何通式的化合物可具有不对称中心， 因此可以以不同立 体异构形式例如不同对映异构形式存在。如果至少一个不对称碳原子存在于式 I 化合物 中， 那么该化合物可以以旋光形式或以旋光异构体混合物的形式、 例如以外消旋混合物形 式存在。 因此， 不对称碳原子可以以 (R)-、 (S)- 或 (R， S)- 构型存在， 优选以 (R)- 或 (S)- 构 型存在。所有旋光异构体和其混合物、 包括外消旋混合物均是本发明的一部分。因此， 本文 给出的任何通式意欲代表外消旋物、 一种或多种对映异构形式、 一种或多种非对映异构形 式、 一种或多种阻转异构形式及其混合物。此外， 某些结构可以以几何异构体 ( 例如顺式及 反式异构体 )、 以互变异构体或以阻转异构体形式存在。例如， 在双键或环上的取代基可以 以顺式 ( ＝ Z-) 或反式 ( ＝ E-) 形式存在。因此， 本发明化合物可以以异构体混合物、 或优 选以纯异构体、 优选以对映异构体 - 纯非对映异构体或纯对映异构体形式存在。
    本文给出的任何通式意欲代表此类化合物的水合物、 溶剂合物和多晶型物、 及其混合物。 本文给出的任何通式也意欲代表此类化合物的未标记形式和同位素标记形式。 同 位素标记化合物具有本文所给出的各通式所绘示的结构， 只是一个或多个原子被具有所选 原子质量或质量数的原子替换。 可纳入本发明化合物中的同位素的实例包括氢、 碳、 氮、 氧、 2 3 11 13 14 15 31 32 18 35 36 125 磷、 氟和氯的同位素， 例如 H、 H、 C、 C、 C、 N、 P、 P、 F、 S、 Cl、 I。各种同位素标记的 13 本发明化合物是例如纳入放射性同位素例如 3H、 C 和 14C 的那些。此类同位素标记化合物 可用于代谢研究 ( 优选使用 14C)、 反应动力学研究 ( 使用例如 2H 或 3H)、 检测或成像技术， 例 如正电子发射断层摄影术 (PET) 或单光子发射计算机断层摄影术 (SPECT)， 包括药物或底 18 物组织分布分析， 或用于患者的放射性治疗。具体来说， F 或标记化合物对于 PET 或 SPECT 研究可能尤其优选。此外， 用例如更重的同位素如氘 ( 即 2H) 取代可因较强的代谢稳定性 而提供某些治疗优势， 例如体内半衰期延长或所需剂量减低。同位素标记的本发明化合物 及其前药通常可经由实施流程中或下文所述实例和制备中所公开的程序、 通过用易于获得 的同位素标记的试剂取代未经同位素标记的试剂来制备。
     此外， 用较重同位素、 尤其是氘 ( 即 2H 或 D) 取代可因较强的代谢稳定性而提供某 些治疗优势， 例如体内半衰期延长或所需剂量降低或治疗指数提高。 应理解， 在此情况下氘 被视为式 (I) 化合物中的取代基。该较重同位素、 具体而言是氘的浓度可通过同位素富集 因子来界定。 本文所用的术语 “同位素富集因子” 是指特定同位素的同位素丰度与天然丰度 的比值。 如果本发明化合物中的取代基以氘表示， 则对于各指定氘原子， 该化合物具有至少 3500( 在各指定氘原子处具有 52.5％氘纳入 )、 至少 4000(60％氘纳入 )、 至少 4500(67.5％ 氘纳入 )、 至少 5000(75％氘纳入 )、 至少 5500(82.5％氘纳入 )、 至少 6000(90％氘纳入 )、 至少 6333.3(95 ％氘纳入 )、 至少 6466.7(97 ％氘纳入 )、 至少 6600(99 ％氘纳入 ) 或至少 6633.3(99.5％氘纳入 ) 的同位素富集因子。在本发明化合物中， 未特别指定为特定同位素 的任一原子意指代表该原子的任一稳定同位素。除非另有指出， 否则当将一位置特别指定
     为 “H” 或 “氢” 时， 该位置应理解为以其天然丰度同位素组成具有氢。因此， 在本发明化合 物中， 特别指定为氘 (D) 的任一原子意指代表氘， 例如在上文给出的范围内。
     当提及本文给出的任何通式时， 从具体变量的可能种类列表选择特定部分并不意 欲界定在其它地方出现的该变量的部分。 换言之， 在变量出现一次以上时， 从特定列表的种 类选择独立于通式中其它地方的相同变量的种类选择 ( 其中上文和下文中表征为优选的 实施方案中的一个或多个直至全部更多通用表述可分别用更具体定义替换， 因此得到本发 明的更优选的实施方案 )。
     在使用复数形式 ( 例如化合物、 盐、 药物制品、 疾病等 ) 的情况下， 这包括单数 ( 例 如单一化合物、 单一盐、 单一药物制剂、 单一疾病等 )。 “一种化合物” 不排除 ( 例如在药物 制剂中 ) 存在一种以上的式 (I) 化合物 ( 或其盐 )。
     如果式 (I) 化合物携带成盐基团， 那么盐优选为式 (I) 化合物的可药用盐。形成 盐所需的酸 / 碱通常为本领域已知。
     除非另有说明， 否则以下通用定义将应用于本说明书中 ：
     卤素 ( 或卤代 ) 表示氟、 溴、 氯或碘， 特别氟、 氯。被卤素取代的基团和部分如被卤 素取代的烷基 ( 卤烷基 ) 可被单 -、 多 - 或全 - 卤化。
     杂原子是除碳和氢之外的原子， 优选氮 (N)、 氧 (O) 或硫 (S)， 特别氮。
     “烷基” 是指直链或支链烷基， 且包括 C1-7 烷基且更优选 C1-4 烷基。 此类烷基包括例 如甲基、 乙基、 正丙基或异丙基、 正丁基、 异丁基、 仲丁基或叔丁基、 正戊基、 正己基、 正庚基， 特别优选甲基、 乙基、 正丙基、 异丙基、 正丁基和异丁基。烷基可未被取代或被取代。示例性 取代基包括但不限于羟基、 烷氧基、 卤素 ( 尤其是氟 )、 氨基和二取代的氨基、 单 - 或二 - 烷 基取代的氨基、 乙酰基氨基、 吗啉基、 芳基。取代的烷基的实例是三氟甲基。环烷基也可以 是烷基的取代基。此类情况的一个实例是部分 ( 烷基 )- 环烷基， 例如 ( 烷基 )- 环丙基或 ( 烷基 )- 环丁基， 例如甲基 - 环丙基或甲基 - 环丁基。( 烷基 )- 环烷基部分的更具体实例 包括偕型的取代模式， 例如 1- 烷基环烷基、 例如 1- 甲基环丙基。环烷基作为烷基的取代基 的另一实例是烷二基 - 环烷基， 例如烷二基 - 环丙基、 例如 -CH2- 环丙基。C1-C7- 烷基是具 有从 1 个 ( 且包括 1 个 ) 直至 7 个 ( 且包括 7 个 ) 碳原子的烷基， 优选具有从 1 个 ( 且包 括 1 个 ) 直至 4 个 ( 且包括 4 个 ) 碳原子 (C1-C4- 烷基 )， 且为直链或支链 ； 优选地， 低级烷 基是丁基， 例如正丁基、 仲丁基、 异丁基、 叔丁基、 丙基， 例如正丙基或异丙基、 乙基或优选甲 基。
     其它基团的各烷基部分如 “烷氧基” “烷氧基烷基” 、 “烷氧基羰基” 、 “烷氧基 - 羰基 、 烷基” 、 “烷基磺酰基” 、 “烷基砜 (alkylsulfoxyl)” 、 “烷基氨基” 、 “卤烷基” 应具有与 “烷基” 的上述定义中所述相同的含义。
     “C3-7- 环烷基” 是指饱和或部分饱和、 单环、 稠合多环或螺多环状碳环， 每一碳环具 有 3 个至 7 个环原子。环烷基的示例性实例包括以下部分 ： 环丙基、 环丁基、 环戊基和环己 基。C3-C7- 环烷基可未被取代或被取代 ； 示例性取代基提供于对烷基的定义中。C3-C7- 环 烷基也可为其它基团例如烷基上的取代基。
     “芳基” 是指优选具有不多于 16 个碳原子、 尤其不多于 10 个碳原子、 例如具有 6 个 至 16 个、 优选 6 个至 10 个环碳原子的环系统的未饱和碳环芳族环系统， 优选为单环或二 环， 且未被取代或取代。例如， 芳基是未取代的或取代的苯基。
     “杂环基” 是指杂环基团， 其在键合环中是不饱和 ( 特别最大程度不饱和， 例如环中携带最高可能数的共轭双键例如杂芳基 )、 饱和或部分饱和且优选为单环或在本发明更 广泛方面为二环状环 ； 其具有 3-16 个环原子， 更优选 4-10 个环原子， 其中至少在键合至式 (I) 分子的基团的环中一个或多个、 优选 1-4 个环原子、 尤其一个或两个环原子是选自氮、 氧和硫的杂原子 ； 该键合环优选具有 4-12 个环原子、 尤其 4-7 个环原子、 例如 6-10 个环原 子、 尤其对于杂芳基， 例如 5、 6、 9 或 10 个环原子。杂环基可被未取代或被一个或多个、 尤其 1 个至 3 个取代基取代， 所述取代基独立地选自烷基或上文对于取代的烷基所定义的取代 基和 / 或选自一个或多个以下取代基 ： 氧代 ( ＝ O)、 硫代羰基 ( ＝ S)、 亚氨基 ( ＝ NH)、 亚 氨基 - 低级烷基， 且对于含氮杂芳基， 包括其 N- 氧化物。
     “治疗” 包括预防性和治疗性治疗以及延长疾病或病症的进展。
     “PI3 激酶介导的疾病” ( 尤其是 PI3Kα 介导的疾病 ) 具体而言是以有益方式 ( 例 如一个或多个症状改善、 疾病发作延迟、 直至疾病暂时或完全治愈 ) 响应 PI3 激酶的抑制、 尤其 PI3Kα 的抑制的病症 ( 其中待治疗的疾病可包括显示 PIK3CA 体细胞突变或种系突变 或 PTEN 体细胞突变的那些 )。 待治疗的疾病尤其包括增殖性疾病， 例如肿瘤疾病， 可提及的 包括实体肿瘤、 白血病、 胶质母细胞瘤、 乳癌和前列腺癌。 “盐” (以 “其盐” 表示 ) 可单独或以与游离式 I 化合物的混合物存在， 且优选为可药 用盐。式 (I) 化合物中的成盐基团是具有碱性或酸性特性的基团或原子团。具有至少一个 碱性基团或至少一个碱性原子团例如氨基、 不形成肽键的仲氨基或吡啶基的化合物可形成 酸加成盐， 例如与盐酸、 硫酸或磷酸等无机酸 ； 或与适宜的有机羧酸或磺酸例如脂族单 - 或 二 - 羧酸， 例如三氟乙酸、 乙酸、 丙酸、 羟基乙酸、 琥珀酸、 马来酸、 富马酸、 羟基马来酸、 苹果 酸、 酒石酸、 柠檬酸或草酸 ； 或氨基酸， 例如精氨酸或赖氨酸 ； 芳族羧酸， 例如苯甲酸 ； 2- 苯 氧基 - 苯甲酸 ； 2- 乙酰氧基 - 苯甲酸 ； 水杨酸 ； 4- 氨基水杨酸 ； 芳族 - 脂族羧酸， 例如扁桃 酸或肉桂酸 ； 杂芳族羧酸， 例如烟酸或异烟酸 ； 脂族磺酸， 例如甲烷 -、 乙烷 - 或 2- 羟基乙 磺酸 ； 或芳族磺酸， 例如苯 -、 对甲苯 - 或萘 -2- 磺酸。存在若干碱性基团时， 可形成单 - 或 多 - 酸加成盐。
     具有酸性基团羧基或酚羟基的式 (I) 化合物可形成金属盐或铵盐， 例如碱金属或 碱土金属盐， 例如钠盐、 钾盐、 镁盐或钙盐 ； 或与氨或适宜有机胺形成的铵盐， 例如叔单胺， 例如三乙胺或三 (2- 羟基乙基 )- 胺， 或杂环碱， 例如 N- 乙基 - 哌啶或 N， N′ - 二甲基哌嗪。 盐的混合物是可能的。
     具有酸性和碱性基团的式 (I) 化合物可形成内盐。
     出于分离或纯化目的， 亦可使用药学上不可接受的盐， 例如苦味酸盐或高氯酸盐。 对于治疗用途， 仅使用可药用盐或游离化合物 ( 酌情为药物制剂形式 )， 且因此这些是优选 的。鉴于游离形式的新型化合物与其盐形式的化合物、 包括在例如新化合物的纯化或鉴定 中可用作中间体的那些盐之间的密切关系， 上下文中关于游离化合物的任何相关内容均应 该视需要及方便被理解为也指对应盐。
     本发明化合物也可形成溶剂合物和水合物， 且因此任何提及式 (I) 化合物均应该 视需要及方便被理解为也提及式 (I) 化合物的对应的溶剂合物和 / 或水合物。
     本发明还涉及在体内转化为式 (I) 化合物本身的式 (I) 化合物的前药。因此， 任 何提及式 (I) 化合物均应该视需要及方便被理解为也提及式 (I) 化合物的对应的前药。
     组合是指一种剂量单元形式中的固定组合或用于组合施用的药盒， 其中式 I 化合 物与组合伴侣 ( 例如如下文所示的其它药物， 也称为 “治疗剂” 或 “辅助药剂” ) 可独立地 同时或单独地在一定时间间隔内施用， 尤其当这些时间间隔使得组合伴侣显示合作、 例如 协同效应时。本文所用的术语 “共施用” 或 “组合施用” 等意欲包括向有需要的单个受试者 ( 例如患者 ) 施用所选组合伴侣， 且意欲包括其中无需以相同施用路径或在相同时间施用 药剂的治疗方案。本文所用的术语 “药物组合” 意指由混合或组合一种以上活性成分而获 得的产物， 且包括活性成分的固定和非固定组合。术语 “固定组合” 意指将活性成分例如式 I 化合物与组合伴侣二者以单一实体或剂量的形式同时施用至患者。术语 “非固定组合” 意 指活性成分例如式 I 化合物与组合伴侣二者作为分开的实体同时、 并行或相继且无具体时 间限制地施用至患者， 其中此施用可在患者体内提供两种化合物的治疗有效量。后者亦适 用于鸡尾酒疗法， 例如施用三种或更多种活性成分。
     在优选的实施方案中 ( 该实施方案独立地、 共同地或以任一组合或亚组合优选 )， 本发明涉及游离碱形式或盐形式的式 I 化合物， 其中取代基如本文所定义。
     如式 I 所示， α- 酰胺取代基是在吡咯烷环的 2 位上， 且该位置的立体化学如图所 绘示。 环 A 优选是含有 1 个或 2 个选自 N、 S 或 O 的杂原子、 其中至少一个杂原子是 N 的 未取代的或取代的 5- 或 6- 元杂环状环 ( 优选杂芳基 )。
     更优选地， 环 A 选自未取代的或取代的吡啶环、 未取代的或取代的嘧啶环、 未取代 的或取代的噻唑环、 未取代的或取代的吡唑环或未取代的或取代的噁唑环。更优选的是未 取代的或取代的吡啶环、 未取代的或取代的嘧啶环或未取代的或取代的噻唑环。
     优选地， 环 A 通过环 A 的碳原子稠合至式 I 分子的其它部分。
     环 A 优选被一个、 两个或三个 R2 基团、 优选两个 R2 基团、 最优选一个 R2 基团取代， 该 R2 基团在每次出现时独立地选自 ：
     未取代的或取代的 C1-C7- 烷基 ；
     未取代的或取代的氨基 ；
     未取代的或取代的 C3-C7- 环烷基。
     优选地， R2 选自
     未取代的 C1-C7- 烷基 ；
     二 (C1-C7- 烷基 ) 氨基 ；
     C1-C7- 烷基， 其被 C3-C7- 环烷基或卤代 ( 优选氟 ) 取代一次或多次 ；
     未取代的 C3-C7- 环烷基 ；
     C3-C7- 环烷基， 其被卤代 ( 优选氟 )、 ( 卤代 -C1-C7- 烷基 ) 或 C1-C7- 烷基取代一次 或多次 ；
     更优选地， R2 选自甲基、 叔丁基、 二乙基氨基、 环丙基甲基、 2- 氟 -1， 1- 二甲基乙基 或 2， 2， 2- 三氟 -1， 1- 二甲基 - 乙基。
     在另一实施方案中， R2 选自甲基、 叔丁基、 二乙基氨基、 环丙基甲基或 2- 氟 -1， 1- 二甲基乙基。
     环 A 更优选选自 A1 或 A2 或 A3 或 A4 或 A5 或 A6 ：
    
     其中 Z 是 N 或 CH 且 R2 如上所定义。
     优选地， 环 A 选自 A1 或 A2。
     X-Y 优选表示 (CH2)r 或 O(CH2)t， 其中 r 是 1、 2或3； t是1或2；
     X-Y 更优选表示 (CH2)r 或 O(CH2)t， 其中 r 是 2 且 t 是 1。为避免产生疑问， 即 X-Y 优选为 -CH2-CH2- 或 -O-CH2-， 如此在后一种情况下， X-Y 中的 X 是 -O-CH2- 中的 O。 1
     R 优选在每次出现时独立地表示
     卤素 ；
     羟基 ；
     未取代的或取代的苯基 ；
     二 (C1-C7- 烷基 ) 氨基 ；
     未取代的 C1-C7- 烷基 ；
     C1-C7- 烷基， 其被下列基团取代一次或多次 ：
     羟基、 C1-C7- 烷氧基、 二 (C1-C7- 烷基 ) 氨基、 二 -( 全氘代 C1-C7- 烷基 ) 氨基、 苯 基、 吗啉基、 乙酰基氨基、 或 N-(C1-C7- 烷基 )-N-( 苯基 C1-C7- 烷基 ) 氨基， 且其中各苯基可 独立地被卤代单取代或多取代。
     R1 更优选在每次出现时独立地表示
    氟；
     羟基 ；
     未取代的苯基 ；
     二甲基氨基 ；
     甲基 ；
     甲基， 其被以下基团取代一次或多次 ( 优选取代一次 )
     羟基、 甲氧基、 二甲基氨基、 二 -( 全氘代甲基 ) 氨基、 苯基、 吗啉基、 乙酰基氨基、 或 N-( 甲基 )-N-( 苯基甲基 ) 氨基， 且其中各苯基可独立地被氟单取代或多取代。 1
     R 最优选在每次出现时独立地表示
     氟；
     羟基 ；
     未取代的苯基 ；
     二甲基氨基 ；
     甲基 ；
     羟基甲基 ；
     甲氧基甲基 ；
     二甲基氨基甲基 ；
     二 -( 全氘代甲基 ) 氨基甲基 ；
     苄基 ；
     吗啉 -4- 基甲基 ；
     N- 乙酰基氨基甲基 ；
     N-( 甲基 )-N-(3- 氟 - 苯基甲基 ) 氨基甲基。
     本发明的一实施方案包括式 I 的化合物， 其中 n 是 0 或 1。优选地， n 是 1。
     本发明的另一实施方案包括式 I 的化合物， 其中 q 是 0， 即其中含氮杂环仅在 2 位 被酰胺取代。在该实施方案中， 优选 n 是 0 或 1， 更优选 1。
     本发明的另一实施方案包括式 I 化合物， 其中 q 是 1， 即其中含氮杂环仅被酰胺在 1 2 位和单一 R 基团取代。在该实施方案中， 优选 n 是 0 或 1， 更优选 1。在该实施方案中， R1 基团可在含氮杂环的 2 位 ( 即在与被酰胺基团取代的碳相同的碳上 ) 或 3 位或 4 位或 5 位 取代。
     优选地， 在该实施方案中， R1 基团在含氮杂环的 3 位被取代， 即式 IA 的化合物 ：
    其中取代基如对于式 (I) 化合物所定义。
     优选地在式 IA 化合物中， n 是 1， 因此提供其中含氮杂环是吡咯烷环、 在 2 位被具 1 有所绘示的立体化学的酰胺取代、 且在 3 位被 R 基团取代的化合物。 1
     优选地， R 基团具有相对于 2 位的酰胺为顺式的立体化学， 即根据式 (IA’ ) 的化 合物 ：
    
    其中取代基如对于式 (I) 化合物所定义。
     优选在式 IA′化合物中， n 是 1， 因此提供其中含氮杂环是吡咯烷环、 在 2 位被具 1 有所绘示的立体化学的酰胺取代、 且在 3 位被具有所绘示的立体化学的 R 基团取代的化合 物， 因此酰胺和 R1 基团相对于彼此呈顺式的化合物。
     本发明的又一实施方案包括其中 q 是 2 或 3、 因此存在至少两个 R1 取代基的式 I 化合物， 各 R1 独立地选自如本文对于式 I 所定义的基团。在该实施方案中， 优选两个 R1 中 的至少每一个键合于吡咯烷环的 3 位， 且任选的第三 R1 基团 ( 若存在 ) 键合在含氮杂环的 其它地方。进一步优选， n 是 1 且第三 R1 基团 ( 若存在 ) 键合在所得吡咯烷环的 4 位或 5 位， 即提供式 IB 化合物 ：
    
    其中取代基如对于式 (I) 化合物所定义。
     在根据式 IB 的化合物中， 优选第三 R1 键合在吡咯烷环的 4 位上。
     本发明的又一实施方案包括如下式 I 化合物 ： 其中 n 是 1、 且其中两个 R1 基团键合 在吡咯烷环的 3 位， 并且一起形成烷二基， 优选 C3-C8- 环烷基， 特别是环丙基， 即提供式 IC 化合物 ：
    
    其中取代基如对于式 (I) 化合物所定义， 且第三 R1 基团是任选的， 且如果存在， 优 选键合在吡咯烷环的 4 位。
     在式 (IA)、 (IA’ )、 (IB) 或 (IC) 的任一个中， 若无另外说明， 则对于环 A、 X-Y、 R1 和 n 的优选定义亦可适用。
     本发明另外涉及式 (I)、 (IA)、 (IA’ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物的可药用前药。 本发明另外涉及式 (I)、 (IA)、 (IA’ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物的可药用代谢产物。 本发明尤其涉及实施例以及本文所述制备方法中给出的式 (I)、 (IA)、 (IA’ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物。
     本发明还涉及用于制备式 (I)、 (IA)、 (IA’ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物的方法。原 则上， 将两种不同胺转化为相应脲衍生物的所有已知方法均适宜， 且可通过使用各自原料 来实施。
     因此， 本发明特别涉及一种方法， 其包括将式 II 化合物
    
    
    其中取代基如上所定义， 与式 IIIA 化合物
    其中取代基如上所定义， 在活化剂存在下反应 ( “方法 A” )， 或与式 IIIB 化合物反应
    其中 R1 如上所定义 ； RG 代表反应基团 ( 例如咪唑基羰基 )(“方法 B” )， 在每种情 况下， 任选在稀释剂存在下和任选在反应助剂存在下， 以及回收游离形式或盐形式的所得 式 I 化合物， 以及
     任选地将根据方法 A 或方法 B 可获得的式 I 化合物转化成不同的式 I 化合物， 和/ 或将可获得的式 I 化合物的盐转化成其不同的盐， 和 / 或将可获得的游离式 I 化合物转化 成其盐， 和 / 或从一种或多种不同的可获得的式 I 异构体分离可获得的式 I 化合物的异构 体。
     反应条件
     该方法可根据本领域已知方法或如下文实施例中所公开来实施。例如， 可将式 II
     化合物与式 IIIA 或 IIIB 化合物于溶剂例如二甲基甲酰胺中、 在碱例如有机胺例如三乙胺 存在下反应。
     在上文或下文中给出温度时， 应添加 “约” ， 因为来自所给出数值的微小偏差 ( 例 如 ±10％的差异 ) 通常可以接受。
     所有反应均可在一种或多种稀释剂和 / 或溶剂存在下进行。可使用等摩尔量的原 料； 可选地， 可使用过量化合物， 以例如用作溶剂或使平衡偏移或通常加快反应速率。
     如本领域已知， 根据反应所需且符合通常已知程序， 可添加适宜量的反应助剂例 如酸、 碱或催化剂。
     保护基
     若一种或多种其他官能团、 例如羧基、 羟基、 氨基、 巯基等在本文中所述的原料或 任何其他前体物中已经加以保护或需要保护， 因为其不应参与反应或者干扰反应， 则这些 基团是常用于合成肽化合物、 合成头孢菌素和青霉素、 以及合成核酸衍生物和糖类的基团。 保护基团是一旦被转移就不再存在于最终化合物中的基团， 而仍然作为取代基的基团在本 文所用意义上并不是保护基团， 保护基团是在原料或中间体阶段添加且被移除以获得最终 化合物的基团。而且， 在将式 (I)、 (IA)、 (IA’ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 的化合物转化成不同的 式 (I)、 (IA)、 (IA’ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物的情况下， 如果有用或需要， 可引入保护基团 并予以移除。 保护基团可能已经存在于前体中且应保护所涉及的官能团以避免不期望的副反 应， 例如酰化、 醚化、 酯化、 氧化、 溶剂分解及类似反应。保护基团的特征在于其适于容易地 即无不期望的副反应、 例如在类似于生理条件的条件下通过乙酰解作用、 质子分解、 溶剂分 解、 还原、 光解或者也可借助酶活性而移除， 而其不存在于终产物中。专业人员都知道或者 可容易确定哪些保护基团适用于上下文所提及的反应。
     此类保护基团对该官能团的保护、 保护基团本身及其移除反应都阐述于 ( 例如 ) 标 准 参 考 著 作 中， 例 如 J.F.W.McOmie， “Protective Groups in Organic Chemistry” ， Plenum Press ， London and New York 1973 ； T.W.Greene ， “Protective Groups in Organic Synthesis” ， 第 3 版， Wiley， New York 1999 ； “The Peptides” ； 第 3 卷 ( 编者 ： E.Gross 和 J.Meienhofer)， Academic Press， London and New York 1981 ； “Methoden der organischen Chemie ″ (Methods of organic chemistry)， Houben Weyl， 第 4 版， 第 15/I 卷， Georg Thieme Verlag， Stuttgart 1974， in H.-D.Jakubke 及 H.Jescheit，
    “Peptide， Proteine” (Amino acids， peptides， proteins)， VerlagChemie， Weinheim， Deerfield Beach and Basel 1982 ； 及 Jochen Lehmann， “Chemie der Kohlenhydrate ： Monosaccharide und Derivate” (Chemistry of carbohydrates ： monosaccharides and derivatives)， Georg Thieme Verlag， Stuttgart 1974。
     任选的反应及转化
     可将式 (I)、 (IA)、 (IA’ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 的化合物转化成不同的式 (I)、 (IA)、 (IA’ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 的化合物。
     在取代基带有氨基或氨基 -C1-C7- 烷基取代基的式 (I)、 (IA)、 (IA’ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 的化合物中， 可通过在叔胺碱如三乙胺或吡啶存在下、 在不存在或存在合适溶剂如二 氯甲烷下、 在例如在 -20℃至 50℃范围的温度、 例如在约室温与对应的 C1-C7- 烷酰卤、 例如对应氯化物反应， 将氨基转化成酰基氨基， 例如 C1-C7- 烷酰基氨基。
     具有成盐基团的式 (I)、 (IA)、 (IA’ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 的化合物的盐可以用众人 皆知的方式制备。因此， 式 (I)、 (IA)、 (IA’ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 的化合物的酸加成盐可通 过用酸或用适宜的阴离子交换试剂处理而获得。具有两个酸分子的盐 ( 例如式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物的二卤化物 ) 也可以转化成每一化合物具有一个酸分子 的盐 ( 例如单卤化物 ) ； 这可通过加热成熔体或例如通过在高温、 例如 130℃至 170℃和高 真空下作为固体加热而进行， 每分子式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 的化合物释放 一个酸分子。盐通常可例如通过用适宜碱性化合物处理而转化成游离化合物， 例如用碱金 属碳酸盐、 碱金属碳酸氢盐或碱金属氢氧化物、 通常为碳酸钾或氢氧化钠。
     立体异构混合物、 例如非对映异构体的混合物可通过适宜分离方法、 以众人皆知 的方式分离成其对应的异构体。例如， 非对映异构体混合物可通过分级结晶、 层析、 溶剂分 布和类似程序分离成其单独非对映异构体。该分离可在起始化合物层面发生或在式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物本身发生。对映异构体可通过以下方式分离 ： 形成 非对映异构体盐， 例如， 通过与对映体纯的手性酸形成盐 ； 或通过层析， 例如通过 HPLC， 使 用带手性配体的层析底物。
     应强调的是， 与本文所提及转化类似的反应也可以在适宜中间体层面进行 ( 且因 此可用于制备对应原料 )。
     原料 ：
     式 II 和 III 的原料以及本文、 例如下文所提及的其他原料可按照或类似于本领域 已知方法制备、 已经为本领域所熟知和 / 或市售可得。尽管没有具体阐述原料的制备， 但该 化合物是已知的或可类似于本领域已知的方法、 例如在 WO 05/021519 或 WO04/096797 中所 述或如下文所公开来制备。新原料及其制备方法同样是本发明的实施方案。在优选的实施 方案中， 使用该原料且选择所选反应以便能够获得优选的化合物。
     在需要和方便时也可以以盐使用和 / 或获得的原料 ( 包括中间体 ) 中， 取代基优 选如对式 (I)、 (IA)、 (IA’ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物所定义。
     药物组合物、 用途及治疗方法
     本发明还涉及本文所公开的式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物作为 药物的用途。在一个实施方案中， 本发明包括包含式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物的组合物， 例如用于人类或兽医使用， 例如在需要抑制 PI3K 的情况下。
     在一个实施方案中， 本发明涉及治疗细胞增殖性疾病， 如肿瘤 ( 良性或恶性 ) 和 / 或癌细胞生长， 例如通过 PI3K 介导的。疾病可包括显示 PIK3CA 体细胞突变或种系突变 或 PTEN 体细胞突变的那些。具体来说， 该化合物可用于治疗人或动物 ( 例如鼠科动物 ) 癌 症， 包括例如肉瘤 ； 肺癌 ； 支气管癌 ； 前列腺癌 ； 乳癌 ( 包括散发性乳癌和 Cowden 病患者 ) ； 胰腺癌 ； 胃肠癌 ； 结肠癌 (colon cancer) ； 直肠癌 ； 结肠癌 (colon carcinoma) ； 结肠直肠 腺瘤 ； 甲状腺癌 ； 肝癌 ； 肝内胆管癌 ； 肝细胞癌 ； 肾上腺癌 ； 胃癌 (stomach cacer 或 gastric cacer) ； 神经胶质瘤 ； 胶质母细胞瘤 ； 子宫内膜癌 ； 黑素瘤 ； 肾癌 ； 肾盂癌 ； 膀胱癌 ； 子宫体 (uterine corpus) 癌 ； 子宫颈癌 ； 阴道癌 ； 卵巢癌 ； 多发性骨髓瘤 ； 食道癌 ； 白血病 ； 急性骨 髓性白血病 ； 慢性骨髓性白血病 ； 淋巴细胞性白血病 ； 髓性白血病 ； 脑癌 ； 脑癌瘤 ； 口腔癌 及咽癌 ； 喉癌 ； 小肠癌 ； 非霍奇金淋巴瘤 ； 黑素瘤 ； 绒毛状结肠腺瘤 ； 瘤形成 (neoplasia) ；上皮性瘤形成 ； 淋巴瘤 ； 乳腺癌 (mammary carcinoma) ； 基底细胞癌 ； 鳞状细胞癌 ； 光化性角 化病 ； 肿瘤疾病， 包括实体肿瘤 ； 颈部或头部肿瘤 ； 真性红细胞增多症 ； 原发性血小板增多 症和骨髓纤维化伴骨髓外化生。
     在其它实施方案中， 疾患或病症 ( 例如 PI3K 介导的 ) 选自 ： 表皮增殖过度、 前列腺 增生、 瘤形成、 上皮性瘤形成、 Cowden 综合征、 莱尔米特 - 杜克洛病 (Lhermitte-Dudos 病 ) 或 Bannayan-Zonana 综合征、 哮喘、 COPD、 ARDS、 吕弗勒综合征 (Loffler′ s syndrome)、 嗜 酸性粒细胞性肺炎、 寄生虫 ( 尤其后生动物 ) 侵染 ( 包括热带肺嗜酸性粒细胞增多症 )、 支 气管肺曲霉病、 结节性多动脉炎 ( 包括 Churg-Strauss 综合征 )、 嗜酸细胞肉芽肿、 由药物反 应引起的侵袭气道的嗜酸性粒细胞相关病症、 银屑病、 接触性皮炎、 特应性皮炎、 斑秃、 多形 性红斑、 疱疹样皮炎、 硬皮病、 白癜风、 变应性血管炎、 荨麻疹、 大疱性类天疱疮、 红斑狼疮、 天疱疮、 获得性大疱性表皮松解、 自身免疫性血液学病症 ( 例如溶血性贫血、 再生障碍性贫 血、 纯红细胞贫血和特发性血小板减少 )、 系统性红斑狼疮、 多发性软骨炎、 硬皮病、 韦格纳 肉芽肿病 (Wegener granulomatosis)、 皮肌炎、 慢性活动性肝炎、 重症肌无力、 斯 - 琼氏综 合征 (Steven-Johnson syndrome)、 特发性口炎性腹泻、 自身免疫性炎性肠病 ( 例如溃疡性 结肠炎及局限性回肠炎 )、 内分泌性眼病、 格雷夫斯氏病 (Grave’ s 病 )、 结节病、 牙槽炎 / 肺 泡炎、 慢性过敏性肺炎、 多发性硬化、 原发性胆汁性肝硬化、 ( 前及后 ) 葡萄膜炎、 间质性肺 纤维化、 银屑病性关节炎、 肾小球肾炎、 心血管疾病、 动脉粥样硬化、 高血压、 深部静脉血栓 形成、 中风、 心肌梗塞、 不稳定型心绞痛、 血栓栓塞、 肺栓塞、 血栓溶解疾病、 急性动脉缺血、 外周血栓性闭塞和冠状动脉疾病、 再灌注损伤、 视网膜病变如糖尿病性视网膜病变或高压 氧诱导的视网膜病变、 和以眼内压升高或分泌眼房水为特征的疾患， 例如青光眼。
     对于上述用途， 所需剂量当然会根据施用方式、 拟治疗的特定疾患及所期望的治 疗效果而变化。通常， 将满意结果指定为通过全身性施用日剂量约 0.03-10.0mg/kg 体重获 得。 较大哺乳动物例如人类的指定日剂量是在约 0.5mg 至约 1g 的范围内， 其可方便地施用， 例如， 多达一天四次地分剂量施用或以延迟形式施用。适用于口服施用的单位剂型包含约 0.1-500mg 活性成分。
     式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物可通过任意一种常规途径施用， 尤 其经肠， 例如经口， 例如以片剂或胶囊剂的形式 ； 或胃肠外， 例如以可注射溶液或混悬液的 形式 ； 局部， 例如以洗剂、 凝胶、 软膏或乳膏形式 ； 通过吸入、 鼻内 ； 或以栓剂形式。
     式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物可以以游离形式或以如上文所述 可药用盐的形式施用。该盐可以采用常规方式制备并显示与游离化合物相同级别的活性。
     因此， 本发明还提供 ：
     ●预防和治疗需要该治疗的受试者中的如上文所述的由 PI3、 例如 PI3 激酶 α 酶激活而介导的疾患、 病症或疾病的方法， 该方法包含向所述受试者给予有效量的式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物或其可药用盐。
     ●游离形式或可药用盐形式的式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物作 为药物、 例如在本文所述的任一方法中的用途。
     ●游离形式或可药用盐形式的式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物， 用 作药物， 例如用于本文所述任一方法中， 特别用于一种或多种磷脂酰肌醇 3- 激酶介导的疾 病。●游离形式或可药用盐形式的式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物在 本文所述任一方法中的用途， 特别用于治疗一种或多种磷脂酰肌醇 3- 激酶介导的疾病。
     ●游离形式或可药用盐形式的式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物在 本文所述任一方法中的用途， 特别用于制备治疗一种或多种磷脂酰肌醇 3- 激酶介导的疾 病的药物。
     PI3K 可用作整合平行的信号传导路径的第二信使节点， 陆续有证据显示 PI3K 抑 制剂与其它路径抑制剂的联合可用于治疗人类癌症及增殖性疾病。约 20-30％的人类乳癌 过度表达 Her-2/neu-ErbB2， 即药物曲妥珠单抗 (trastuzumab) 的靶点。 尽管曲妥珠单抗已 经在一些表达 Her-2/neu-ErbB2 的受试者中显示持久响应， 但仅这些受试者中的亚群有反 应。最近的成果已经显示， 曲妥珠单抗与 PI3K 或 PI3K/AKT 路径的抑制剂的联合可显著改 善该有限的响应率 (Chan 等人， Breast Can.Res.Treat.91 ： 187(2005) ； Woods Ignatoski 等人， Brit.J.Cancer 82 ： 666(2000) ； Nagata 等人， Cancer Cell 6 ： 117(2004))。
     多种人类恶性肿瘤表达 Her1/EGFR 激活突变或 Her1/EGFR 含量增加， 且已经研发 出多种抗体和小分子抑制剂来对抗此受体酪氨酸激酶， 包括塔西法 (tarceva)、 吉非替尼 (gefitinib) 及艾比特思 (erbitux)。 然而， 尽管 EGFR 抑制剂对某些人类肿瘤 ( 例如 NSCLC) 显示抗肿瘤活性， 但其不能提高所有表达 EGFR 肿瘤患者中的总体患者存活率。这可通过以 下事实合理解释 ： 多种恶性肿瘤中， Her1/EGFR 的许多下游靶点以高频率突变或失调， 包括 PI3K/Akt 路径。例如， 在体外测定中， 吉非替尼抑制腺癌细胞系的生长。尽管如此， 仍可选 择对吉非替尼具有抗性、 证实 PI3/Ak 路径激活增加的该类细胞系的亚克隆。该路径的下调 或抑制使抗性亚克隆对吉非替尼敏感 (Kokubo 等人， Brit.J.Cancer 92 ： 1711(2005))。此 外， 在荷有 PTEN 突变且过度表达 EGFR 的细胞系的体外乳癌模型中， 抑制 PI3K/Akt 路径和 EGFR 二者产生协同效应 (She 等人， Cancer Cell 8 ： 287-297(2005))。这些结果显示， 吉非 替尼与 PI3K/Akt 路径抑制剂的联合将是有吸引力的癌症治疗策略。
     AEE778(Her-2/neu/ErbB2、 VEGFR 和 EGFR 的抑制剂 ) 与 RAD001(Akt 的下游靶点 mTOR 的抑制剂 ) 的联合在胶质母细胞瘤异种移植物模型中产生较单独任一药剂更强的联 合功效 (Goudar 等人， Mol.Cancer.Ther.4 ： 101-112(2005))。
     抗雌激素药例如他莫昔芬 (tamoxifen) 通过诱导细胞周期停滞来抑制乳癌生长， 这需要细胞周期抑制剂 p27Kip 的作用。近年， 已经证实， Ras-Raf-MAP 激酶路径的激活会 改变 p27Kip 的磷酸化状态， 由此消弱其遏阻细胞周期的抑制活性， 从而造成抗雌激素抗性 (Donovan 等人， J.Biol.Chem.276 ： 40888， (2001))。如 Donovan 等人报道， 通过使用 MEK 抑 制剂治疗来抑制 MAPK 信号传导逆转了激素难治性乳癌细胞系中 p27 的异常磷酸化状态， 从而恢复激素敏感性。类似地， Akt 对 p27Kip 的磷酸化也消除了其使细胞周期停滞的作用 (Viglietto 等人， Nat Med.8 ： 1145(2002))。
     因此， 另一方面， 本发明还提供式 (I)、 (IA)、 (IA’ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物， 用 于治疗激素依赖性癌症如乳癌及前列腺癌。 该用途旨在逆转使用常规抗癌剂时这类癌症中 常见的激素抗性。
     在血液学癌症如慢性髓性白血病 (CML) 中， 染色体易位是组成型激活 BCR-Abl 酪 氨酸激酶的原因。患病患者由于 Abl 激酶活性受到抑制而对小分子酪氨酸激酶抑制剂伊 马替尼 (imatinib) 产生反应。然而， 许多患有晚期疾病的患者开始对伊马替尼反应， 但是后来由于 Abl 激酶结构域中产生赋予抗性的突变而复发。体外研究已显示 BCR-Abl 采用 Ras-Raf 激酶路径来引发其效应。 此外， 抑制相同路径中的一种以上的激酶可提供对抗赋予 抗性突变的额外保护。
     因此， 另一方面， 本发明还提供式 (I)、 (IA)、 (IA’ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物， 用于 联合至少一种选自激酶抑制剂的其他药剂， 例如格列卫 (Gleevec ) 以治疗血液学癌症， 例如慢性髓性白血病 (CML)。该用途旨在逆转或预防对所述至少一种其他药剂的抗性。 由于 PI3K/Akt 路径的激活会驱动细胞存活， 因此， 抑制该路径并联合促使癌细 胞凋亡的疗法、 包括放射疗法及化学疗法， 会带来改良的反应 (Ghobrial 等人， CA Cancer J.Clin 55 ： 178-194(2005))。作为一个实例， PI3K 激酶抑制剂与卡铂联合在体外细胞增 殖和细胞凋亡测定中和在异种移植物卵巢癌模型的体内肿瘤功效中均显示了协同效应 (Westfall 和 Skinner， Mol.Cancer Ther.4 ： 1764-1771(2005))。
     除癌症和增殖性疾病外， 越来越多的证据显示 1A 类及 1B 类 P13 激酶抑制剂在其 他疾病领域中具有治疗用途。已经显示 p110β(PIK3CB 基因的 P13K 同种型产物 ) 的抑制 牵涉于剪切力诱导的血小板激活 (Jackson 等人， Nature Medicine 11 ： 507-514(2005))。 因此， 抑制 p110β 的 PI3K 抑制剂可在抗血栓疗法中作为单一药剂使用或联合使用。同 种型 p110δ 即 PIK3CD 基因的产物， 在细胞功能和分化 (Clayton 等人， J.Exp.Med.196 ： 753-763(2002))、 T- 细 胞 依 赖 性 及 非 依 赖 性 抗 原 反 应 (Jou 等 人， Mol.Cell.Biol.22 ： 8580-8590(2002) 和肥大细胞分化 (Ali 等人， Nature 431 ： 1007-1011(2004)) 中非常重 要。因此， 预期 p110δ- 抑制剂可用于治疗 B- 细胞驱动的自身免疫疾病和哮喘。最后，
    p110γPI3KC基因的同种型产的抑制会导致降低的 T 细但非 B 细反应 .(Reif等人， J.Immunol.173 ： 2236-2240(2004)， 且其抑制在自身免疫疾病的动物模型中显示了功 效 (Camps 等人， Nature Medicine 11 ： 936-943(2005) ； Barber 等人， Nature Medicine 11 ： 933-935(2005)。
     本发明进一步提供药物组合物， 包含至少一种式 (I)、 (IA)、 (IA’ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物与适于给人或动物受试者施用的药用赋形剂， 其单独或与另一治疗剂、 例如另 一抗癌剂联合。
     本发明进一步提供治疗患有细胞增殖性疾病如癌症的人或动物受试者的方法。 因 此， 本发明提供需要该治疗的人和动物的治疗方法， 其包括向该受试者施用单独或与一种 或多种其他治疗剂如其他抗癌剂组合的治疗有效量的式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物。 具体而言， 组合物或者以联合治疗剂共同配制或单独施用。 适宜与式 I 化合物 一起使用的抗癌剂包括但不限于一种或多种选自下列的化合物 ： 激酶抑制剂、 抗雌激素药、 抗雄激素药、 其他抑制剂、 癌症化疗药物、 烷化剂、 螯合剂、 生物反应调节剂、 癌症疫苗、 用于 反义疗法的药物， 如下所述 ：
     A. 激酶抑制剂 ： 作为抗癌剂与式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物联 合使用的激酶抑制剂包括表皮生长因子受体 (EGFR) 激酶抑制剂， 例如小分子喹唑啉类， 例如吉非替尼 (US 5457105、 US 5616582 和 US 5770599)、 ZD-6474(WO 01/32651)、 厄洛 替尼 (erlotinib)( 塔西法 ， US 5,747,498 和 WO 96/30347) 及拉帕替尼 (lapatinib)(US 6,727,256 和 WO 02/02552) ； 血 管 内 皮 生 长 因 子 受 体 (VEGFR) 激 酶 抑 制 剂， 包括SU-11248(WO 01/60814)、 SU 5416(US 5,883,113 和 WO 99/61422)、 SU 6668(US 5,883,113 和 WO 99/61422)、 CHIR-258(US 6,605,617 和 US 6,774,237)、 瓦他拉尼 (vatalanib) 或 PTK-787(US 6,258,812)、 VEGF-Trap(WO 02/57423)、 B43- 染料木黄酮 (WO-09606116)、 芬 维 a 胺 (fenretinide)( 视黄酸对羟基苯基胺 )(US 4,323,581)、 IM-862(WO 02/62826)、 贝 伐珠单抗 (bevacizumab) 或 Avastin (WO 94/10202)、 KRN-951、 3-[5-( 甲基磺酰基哌啶甲 基 )- 吲哚基 ]- 喹诺酮、 AG-13736 和 AG-13925、 吡咯并 [2， 1-f][1， 2， 4] 三嗪类、 ZK-304709、 Veglin 、 VMDA-3601、 EG-004、 CEP-701(US 5,621,100)、 Cand5(WO 04/09769) ； Erb2 酪氨 酸激酶抑制剂， 例如帕妥珠单抗 (pertuzumab)(WO 01/00245)、 曲妥珠单抗及利妥昔单抗 (rituximab) ； Akt 蛋白激酶抑制剂， 如 RX-0201 ； 蛋白激酶 C(PKC) 抑制剂， 如 LY-317615(WO 95/17182) 及哌立福辛 (perifosine)(US 2003171303) ； Raf/Map/MEK/Ras 激酶抑制剂包 括索拉非尼 (sorafenib)(BAY 43-9006)、 ARQ-350RP、 LErafAON、 BMS-354825AMG-548 和 WO 03/82272 中公开的其他抑制剂 ； 纤维母细胞生长因子受体 (FGFR) 激酶抑制剂 ； 细胞依赖 血小 性激酶 (CDK) 抑制剂， 包括 CYC-202 或 roscovitine(WO 97/20842 和 WO 99/02162) ； 板衍生性生长因子受体 (PDGFR) 激酶抑制剂如 CHIR-258、 3G3mAb、 AG-13736、 SU-11248 和 SU6668 ； 及 Bcr-Abl 激酶抑制剂和融合蛋白如 STI-571 或格列卫 (Gleevec )( 伊马替尼 )。
    B. 抗雌激素药 ： 用于与式 (I)、 (IA)、 (IA’ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物联合用 于抗癌疗法中的雌激素靶向剂包括选择性雌激素受体调节剂 (SERMs)， 包括他莫西芬、 托 瑞米芬 (toremifene)、 雷洛昔芬 (raloxifene) ； 芳香酶抑制剂， 包括瑞宁得 (Arimidex 或氟维司群) 或阿那曲唑 (anastrozole) ； 雌激素受体下调剂 (ERDs)， 包括 Faslodex(fulvestrant)。
     C. 抗雄激素药 ： 用于与式 (I)、 (IA)、 (IA’ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物联合用于 抗癌疗法中的雄激素靶向剂包括氟他胺 (flutamide)、 比卡鲁胺 (bicalutamide)、 非那雄 胺 (finasteride)、 氨鲁米特 (aminoglutethamide)、 酮康唑 (ketoconazole) 及皮质类固醇 (corticosteroid)。
     D. 其他抑制剂 ： 作为抗癌剂与式 (I)、 (IA)、 (IA ′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物 联合使用的其他抑制剂包括蛋白法尼基转移酶抑制剂， 包括替比伐尼 (tipifarnib) 或 R-115777(US 2003134846 和 WO 97/21701)、 BMS-214662、 AZD-3409 及 FTI-277 ； 拓扑异构 酶抑制剂， 包括美巴龙 (merbarone) 和双氟莫替康 (diflomotecan)(BN-80915) ； 有丝分裂 驱动蛋白纺锤体蛋白 (KSP) 抑制剂， 包括 SB-743921 和 MKI-833 ； 蛋白酶体调节剂， 例如硼 替佐米 (bortezomib) 或 Velcade (US 5,780,454)、 XL-784 ； 和环加氧酶 (COX-2) 抑制剂， 包括非甾类抗炎药物 I(NSAID)。
     E. 癌症化疗药物 ： 作为抗癌剂与式 (I)、 (IA)、 (IA ′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合 物联合使用的特定癌症化疗剂包括阿那曲唑 (Arimidex )、 比卡鲁胺 (Casodex )、 硫 酸博来霉素 (bleomycin sulfate)(Blenoxane 安注射液 (Busulfex )、 白消安 (busulfan)(Myleran )、 白消)、 卡培他滨 (capecitabine)(Xeloda )、 卡莫司汀 (BiCNU)、 N4- 戊氧基羰基 -5- 去氧 -5- 氟胞苷、 卡铂 (Paraplatin (Leukeran)、 苯丁酸氮芥 (chlorambucil))、 顺 铂 (cisplatin)(Platinol22)、 克 拉 屈 滨 (cladribine)(LeustatinCN 102471351 A说明书或 Neosar17/81 页)、 环 磷 酰 胺 (cyclophosphamide)(Cytoxan)、 阿 糖 胞 苷 (cytarabine)、 )、 阿糖胞苷脂质体注射液胞 嘧 啶 阿 糖 胞 苷 (cytosine arabinoside)(Cytosar-U (DepoCyt )、 达 卡 巴 嗪 (dacarbazine)(DTIC-Dome)、 更 生 霉 素 (dactinomycin)( 放 )、 柔红霉素柠檬线 菌 素 D(Actinomycin D)、 Cosmegan)、 盐 酸 柔 红 霉 素 (Cerubidine 酸盐脂质体注射液 (DaunoXome (Taxotere)、 地塞米松 (dexamethasone)、 多西他赛 (docetaxel) 、 Rubex )、， US 2004073044)、 盐酸多柔比星 (doxorubicin)(Adriamycin )、 磷酸氟达拉滨 (Fludara依托泊苷 (etoposide)(Vepesid 、 Efudex )、 氟他胺 (Eulexin)、 5- 氟尿嘧啶 (Adrucil)、 替扎他滨 (tezacitibine)、 吉西他滨 (Gemcitabine) )、 伊达比星 (Idarubicin)(Idamycin )、 L- 天( 二氟去氧胞苷 )、 羟基脲 (hydroxyurea)(Hydrea )、 异 环 磷 酰 胺 (ifosfamide)(IFEX 冬 酰 胺 酶 (ELSPAR (Alkeran)、 伊 立 替 康 (irinotecan)(Camptosar)、 甲 酰 四 氢 叶 酸 钙 (leucovorin calcium)、 美 法 仑 (melphalan) )、 氨甲喋呤 (methotrexate)(Folex )、 米托)、 6- 巯基嘌呤 (Purinethol蒽醌 (mitoxantrone)(Novantrone)、 麦罗塔 (mylotarg)、 紫杉醇 (Taxol)、 菲尼克斯(phoenix)(Yttrium90/MX-DTPA)、 喷 司 他 丁 (pentostatin)、 聚 苯 丙 生 20(polifeprosan 20) 与 卡 莫 司 汀 植 入 物 (Gliadel )、 柠 檬 酸 他 莫 西 芬 (Nolvadex )、 替尼泊苷 (teniposide)(Vumon (Tirazone )、 6- 硫 鸟 嘌 呤、 噻 替 哌 (thiotepa)、 替 拉 扎 明 (tirapazamine) )、 长春碱 (vinblastine)(Velban )。)、 注射用托泊替康盐酸盐 (Hycamptin)、 长春新碱 (vincristine)(Oncovin
    ) 和长春瑞滨 (vinorelbine)(NavelbineF. 烷 化 剂 ： 用 于 与 式 (I)、 (IA)、 (IA ′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化 合 物 联 合 使 用 的 烷 基 化 剂 包 括 VNP-40101M 或 克 瑞 替 嗪 (cloretizine)、 奥 沙 利 铂 (oxaliplatin) (US 4,169,846、 WO 03/24978 和 WO 03/04505)、 葡 磷 酰 胺 (glufosfamide)、 马磷酰胺 (mafosfamide)、 凡 毕 复 (etopophos)(US 5,041,424)、 泼 尼 莫 司 汀 (prednimustine)、 曲 奥舒凡 (treosulfan) ； 白消安 ； 伊罗夫文 (irofluven)( 酰基富烯 (acylfulvene)) ； 本可 麦 定 (penclomedine) ； 吡 唑 啉 吖 啶 (pyrazoloacridine)(PD-115934) ； O6- 苄 基 鸟 嘌 呤 ； 地西他滨 (decitabine)(5- 氮杂 -2- 去氧胞苷 ) ； 伯斯坦尼辛 (brostallicin) ； 丝裂霉素 C(mitomycin C)(MitoExtra) ； TLK-286(Telcyta ) ； 替莫唑胺 (temozolomide) ； 曲贝替定 (trabectedin)(US 5,478,932) ； AP-5280( 顺铂的铂酸盐制剂 ) ； 泊非霉素 (porfiromycin) 和克拉兹德 (clearazide)( 氮芥 (meclorethamine))。
     G. 螯 合 剂 ： 用 于 与 式 (I)、 (IA)、 (IA ′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化 合 物 联 合 使 用 的 螯 合 剂 包 括 四 硫 钼 酸 盐 (tetrathiomolybdate)(WO 01/60814) ； RP-697 ； 嵌合 T84.66(cT84.66) ； 钆膦维司 (gadofosveset)(Vasovist ) ； 去铁敏 (deferoxamine) 及任 选与电穿孔 (EPT) 联合的博来霉素。
     H. 生物反应调节剂 ： 用于与式 (I)、 (IA)、 (IA ′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物联 合使用的生物反应调节剂如免疫调节剂包括星形孢霉素 (staurosprine) 和其大环类似 物， 包括 UCN-01、 CEP-701 和米哚妥林 (midostaurin)( 参见 WO 02/30941、 WO 97/07081、WO 89/07105、 US 5,621,100、 WO 93/07153、 WO 01/04125、 WO 02/30941、 WO 93/08809、 WO 94/06799、 WO 00/27422、 WO 96/13506 和 WO 88/07045) ； 角 鲨 胺 (squalamine)(WO 01/79255) ； DA-9601(WO 98/04541 和 US 6,025,387) ； 阿 仑 珠 单 抗 (alemtuzumab) ； 干扰 素 ( 例如 IFN-a、 IFN-b 等 ) ； 白介素、 尤其 IL-2 或阿地白介素 (aldesleukin) 以及 IL-1、 IL-3、 IL-4、 IL-5、 IL-6、 IL-7、 IL-8、 IL-9、 IL-10、 IL-11、 IL-12 及其具有大于天然人类序 列的 70％的氨基酸序列的活性生物变异体 ； 六甲蜜胺 (altretamine)(Hexalen ) ； SU 101 或来氟米特 (leflunomide)(WO 04/06834 和 US 6,331,555) ； 咪唑并喹啉类， 如瑞喹莫德 (resiquimod) 和咪喹莫德 (imiquimod)(US 4,689,338、 5,389,640、 5,268,376、 4,929,624、 5,266,575 、 5,352,784 、 5,494,916 、 5,482,936 、 5,346,905 、 5,395,937 、 5,238,944 和 5,525,612) ； 和 SMIP， 包括苯并吡咯类、 蒽醌类、 缩胺基硫脲类 (thiosemicarbazones) 及色 胺酮 (tryptanthrin)(WO 04/87153、 WO 04/64759 和 WO 04/60308)。
     I. 癌 症 疫 苗 ： 用 于 与 式 (I)、 (IA)、 (IA ′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化 合 物 联 合 使 用 的 抗 癌 疫 苗 包 括 Avicine (Tetrahedron Lett.26 ： 2269-70(1974)) ； 奥戈伏单 抗 (oregovomab)(OvaRex )； Theratope (STn-KLH) ； 黑色素瘤疫苗； GI-4000 系 列(GI-4014、 GI-4015 和 GI-4016)， 其 针 对 Ras 蛋 白 的 五 种 突 变 ； GlioVax-1 ； MelaVax ； Advexin 或 INGN-201(WO 95/12660) ； Sig/E7/LAMP-1， 其编码 HPV-16 E7 ； MAGE-3 疫苗或 M3TK(WO 94/05304) ； HER-2VAX ； ACTIVE， 其刺激对肿瘤具有特异性的 T- 细胞 ； GM-CSF 癌症 疫苗 ； 及基于单核细胞增多性李斯特菌 (Listeria monocytogenes) 的疫苗。
     J. 反义疗法 ： 用于与式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物联合使用的 抗癌剂也包括反义组分， 例如 AEG-35156(GEM-640) ； AP-12009 和 AP-11014(TGF-β2- 特异 性反义寡核苷酸 ) ； AVI-4126 ； AVI-4557 ； AVI-4472 ； 奥利莫森 (oblimersen)(Genasense )； JFS2 ； 安普利森 (aprinocarsen)(WO 97/29780) ； GTI-2040(R2 核糖核酸还原酶 mRNA 反 义寡聚物 )(WO 98/05769) ； GTI-2501(WO 98/05769) ； 脂质体包封的 c-Raf 反义寡去氧核苷 酸 (LErafAON)(WO 98/43095) ； 和 Sirna-027( 基于 RNAi 的靶向 VEGFR-1 mRNA 的治疗剂 )。
     式 (I)、 (IA)、 (IA ′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物也可以与支气管扩张药物或抗 组胺药物物质联合在药物组合物中。该类支气管扩张药物包括抗胆碱能药物或抗毒蕈 碱剂， 尤其格隆溴铵 (glycopyrrolate)、 异丙托溴铵 (ipratropium bromide)、 氧托溴铵 (oxitropium bromide) 和噻托溴铵 (tiotropium bromide)、 OrM3、 阿地溴铵 (aclidinium)、 CHF5407、 GSK233705 和 β-2- 肾 上 腺 素 能 受 体 激 动 剂， 例 如 舒 喘 灵 (salbutamol)、 特 普 他 林 (terbutaline)、 沙 美 特 罗 (salmeterol)、 卡 莫 特 罗 (carmoterol)、 米维特罗 (milveterol) 及尤其是茚达特罗 (indacaterol) 和福莫特罗 (formoterol)。共同治疗 性抗组胺药物物质包括盐酸西替利嗪 (cetirizine hydrochloride)、 富马酸氯马斯汀 (clemastine fumarate)、 异丙嗪 (promethazine)、 氯雷他定 (loratadine)、 地氯雷他定 (desloratadine)、 苯海拉明 (diphenhydramine) 和盐酸非索非那定。
     本发明在另一方面提供包含式 (I)、 (IA)、 (IA ′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物和 一种或多种可用于治疗血栓溶解疾病、 心脏病、 中风等的化合物的组合。该类组合物包括 阿司匹林、 链激酶、 纤维蛋白溶酶原 (plasminogen) 激活剂、 尿激酶、 抗凝血剂、 抗血小板药 ( 例如 PLAVIX ； 硫酸氢氯吡格雷 (clopidogrel bisulfate)、 他汀类药物 (statin)( 例如LIPITOR 或阿伐他汀钙 (Atorvastatin calcium)、 ZOCOR( 辛伐他汀 )、 CRESTOR( 瑞舒伐他 汀 (Rosuvastatin)) 等 )、 β 阻断剂 ( 例如阿替洛尔 (Atenolol))、 NORVASC( 苯磺酸氨氯地 平 (amlodipine besylate)) 和 ACE 抑制剂 ( 例如赖诺普利 (lisinopril))。
     本发明在另一方面提供包含式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物和一 种或多种可用于抗高血压治疗的化合物的组合。该类化合物包括 ACE 抑制剂 ； 降脂剂如他 汀类药物、 LIPITOR( 阿托伐他汀钙 ) ； 钙通道阻断剂， 例如 NORVASC( 苯磺酸氨氯地平 )。
     本发明在另一方面提供包含式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物和一 种或多种选自下列的化合物的组合 ： 贝特类药物 (fibrates)、 β 阻断剂、 NEPI 抑制剂、 血管 紧张素 -2 受体抗结剂和血小板聚集抑制剂。
     本发明在另一方面提供包含式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物和适于 治疗炎症疾病、 包括类风湿性关节炎的化合物的组合。该类化合物可选自 ： TNF-α 抑制剂， 如抗 -TNF-α 单克隆抗体 ( 如 REMICADE、 CDP-870) 和 D2E7(HUMIRA) 及 TNF 受体免疫球蛋白 融合分子 ( 例如 ENBREL)、 IL-1 抑制剂、 受体拮抗剂或可溶性 IL-1Rα( 例如 KINERET 或 ICE 抑制剂 )、 非甾体抗炎药 (NSAIDS)、 吡罗昔康 (piroxicam)、 双氯芬酸 (diclofenac)、 萘普 生 (naproxen)、 氟比洛芬 (flurbiprofen)、 非诺洛芬 (fenoprofen)、 酮洛芬 (ketoprofen)、 布 洛 芬 (ibuprofen)、 灭 酸 类 (fenamates)、 甲 芬 那 酸 (mefenamic acid)、 吲哚美辛 (indomethacin)、 舒林酸 (sulindac)、 阿扎丙宗 (apazone)、 吡唑啉酮类 (pyrazolones)、 保 泰松 (phenylbutazone)、 阿司匹林 (aspirin)、 COX-2 抑制剂 ( 例如 CELEBREX( 塞来昔布 (celecoxib))、 PREXIGE( 鲁米考昔 (lumiracoxib)))、 金属蛋白酶抑制剂 ( 优选 MMP-13 选 择性抑制剂 )、 p2x7 抑制剂、 α2α 抑制剂、 NEUROTIN、 普瑞巴林 (pregabalin)、 低剂量氨甲 喋呤、 来氟米特、 羟氯喹、 d- 青霉胺、 金诺芬 (auranofin) 或胃肠外或口服金。
     本发明在另一方面提供包含式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物和适于 治疗骨关节炎的化合物的组合。 该类化合物可选自 ： 标准非甾体抗炎药 ( 下文称为 NSAID)， 例如吡罗昔康、 双氯芬酸 ； 丙酸类， 例如萘普生、 氟比洛芬、 非诺洛芬、 酮洛芬和布洛芬 ； 灭 酸类 (fenamates)， 例如甲芬那酸、 吲哚美辛、 舒林酸、 阿扎丙宗 ； 吡唑啉酮类， 例如保泰松 ； 水杨酸类， 例如阿司匹林 ； COX-2 抑制剂， 例如塞来昔布、 伐地考昔 (valdecoxib)、 鲁米考昔 和伊诺考昔 (etoricoxib) ； 镇痛药及关节内疗法， 例如皮质类固醇及透明质酸， 例如海尔 根 (hyalgan) 和欣维可 (synvisc)。
     本发明在另一方面提供包含式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物和抗 病毒药和 / 或防腐化合物的组合。该类抗病毒药可选自泛罗赛 (Viracept)、 AZT、 阿昔洛韦 (acyclovir) 和泛昔洛韦 (famciclovir)。该防腐化合物可选自 Valant。
     本发明在另一方面提供包含式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物和一 种或多种选自下列的药剂的组合 ： CNS 药剂， 例如抗抑郁药 ( 舍曲林 (sertraline))、 抗-帕 金森药物 ( 如盐酸司立吉林 (deprenyl)、 左旋多巴 (L-dopa)、 雷奎普 (Requip)、 Mirapex ； MAOB 抑 制 剂 ( 例 如 司 来 吉 兰 (selegine) 和 雷 沙 吉 兰 (rasagiline) ； comP 抑 制 剂 ( 如 Tasmar) ； A-2 抑制剂 ； 多巴胺再摄取抑制剂 ； NMDA 拮抗剂 ； 尼古丁激动剂 ； 多巴胺激动剂 ； 及神经元型一氧化氮合酶抑制剂。
     本发明在另一方面提供包含式 (I)、 (IA)、 (IA ′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物和 一种或多种抗阿尔茨海默病药物的组合。该类抗阿尔茨海默病药物可选自 ： 多奈哌齐(donepezil)、 他克林 (tacrine)、 α2δ 抑制剂、 NEUROTIN、 普瑞巴林 (pregabalin)、 COX-2 抑制剂、 丙戊茶碱 (propentofylline) 或美曲膦酯 (metryfonate)。
     本发明在另一方面提供包含式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物和抗 骨质疏松药和 / 或免疫抑制剂的组合。该类骨质疏松药可选自 ： EVISTA( 盐酸雷洛昔芬 )、 屈洛昔芬 (droloxifene)、 拉索昔芬 (lasofoxifene) 或福善美 (fosomax)。该类免疫抑制 剂可选自 FK-506 和雷帕霉素。
     在优选的实施方案的一方面， 提供了包括一种或多种式 (I)、 (IA)、 (IA’ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物和本文所公开组合伴侣的药盒。代表性药盒包括 PI3K 抑制剂化合物 ( 例 如式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物 ) 和包括通过施用 PI3K 抑制量的化合物 来治疗细胞增殖性疾病的指导的包装说明书或其它标识。
     通常， 式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物可通过用于具有类似效用的 药剂的任一种公认的施用方式以治疗有效量施用。式 (I)、 (IA)、 (IA’ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物即活性成分的实际量应视多种因素而定， 如待治疗疾病的严重度、 患者的年龄及相 对健康状况、 所用化合物的效能、 施用途径和形式、 及其他因素。药物的施用可以每天 1 次 以上， 优选每天 1 次或 2 次。所有这些因素均为主治医师所熟知。式 I 化合物的治疗有效 量可在约 0.05 至约 50mg/ 公斤接受者体重 / 天的范围内 ； 优选为约 0.1 至 25mg/kg/ 天， 更 优选为 0.5 至 10mg/kg/ 天。因此， 对于给 70kg 患者施用， 该剂量范围最优选为约 35-70mg/ 天。
     通常， 式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物可作为药物组合物通过任一 以下途径施用 ： 经口、 全身 ( 例如经皮、 鼻内或通过栓剂 )、 或胃肠外 ( 例如肌内、 静脉内或 皮下 ) 施用。优选的施用方式是使用可根据痛苦程度调节的方便日剂量方案经口施用。组 合物可采取如下形式 ： 片剂、 丸剂、 胶囊、 半固体剂、 粉剂、 缓释制剂、 溶液、 混悬液、 酏剂、 气 溶胶或任何其他合适组合物。用于施用式 I 化合物的另一优选方式是吸入。其是将治疗剂 直接递送至呼吸道的有效方法。
     制剂的选择取决于各种因素， 例如药物施用方式和药物物质的生物利用度。对于 经由吸入传递而言， 可将化合物配制成液体溶液、 混悬液、 气溶胶推进剂或干粉剂并装填至 用于施用的适宜分配器中。 有几种类型的药物吸入装置 - 喷雾器吸入器、 定量吸入器 (MDI) 及干粉吸入器 (DPI)。 喷雾器装置产生高速气流， 使治疗剂 ( 其以液体形式配制 ) 以雾形式 喷出， 被载入患者的呼吸道中。MDI 通常是用压缩气体封装的制剂。在启动后， 该装置由压 缩气体释放出定量的治疗剂， 由此提供一种施用定量药剂的可靠方法。 DPI 以自由流动粉剂 形式分配治疗剂， 该自由流动粉剂在呼吸期间可通过该装置分散于患者的吸入气流中。为 了获得自由流动粉剂， 可用赋形剂例如乳糖配制该治疗剂。测定量的治疗剂以胶囊形式储 存并在每次启动时进行分配。
     本发明还涉及式 I 化合物的粒径介于 10-1000nm、 优选 10-400nm 之间的制剂。 已经 根据增加表面积即缩小粒径可提高生物利用度的原理， 研发出特别适用于那些低生物利用 度药物的这类药物制剂。 例如， U.S.4,107,288 描述了一种具有 10nm 至 1000nm 的粒径范围 的颗粒的药物制剂， 其中活性成分载于大分子交联基质上。 U.S.5,145,684 描述了一种药物 制剂的制备， 其中将药物物质在表面活性剂存在下粉碎成纳米颗粒 ( 平均粒径为 400nm)， 然后将这些纳米颗粒分散于液体介质中， 得到具有相当高生物利用度的药物制剂。两个文件均通过引用并入。
     另一方面， 本发明提供包含 ( 治疗有效量的 ) 式 (I)、 (IA)、 (IA’ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物和至少一种可药用赋形剂的组合物。 可接受的赋形剂无毒性， 有助于施用， 且不 会对式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物的治疗效果造成不利影响。此赋形剂 可以是任何固体、 液体、 半固体或在气溶胶组合物的情况下为气体赋形剂， 其通常可由本领 域技术人员获得。 ，
     固体药物赋形剂包括淀粉、 纤维素、 滑石、 葡萄糖、 乳糖、 蔗糖、 明胶、 麦芽、 稻米、 面 粉、 白垩、 硅胶、 硬脂酸镁、 硬脂酸钠、 甘油单硬脂酸酯、 氯化钠、 脱脂奶粉等。
     液体和半固体赋形剂可选自甘油、 丙二醇、 水、 乙醇及各种油， 包括源于石油、 动 物、 植物或合成来源的油， 例如花生油、 大豆油、 矿物油、 芝麻油等。 优选的液体载体、 尤其是 用于可注射溶液包括水、 盐水、 含水右旋糖和二醇类。
     压缩气体可用于将式 I 化合物以气溶胶形式分散。适用于此目的的惰性气体 有 氮 气、 二 氧化碳 等。 其他适合的 药 用赋 形剂 及其 制剂 记载 于由 E.W.Martin 编 辑的 Remington′ s Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Company， 第 18 版， 1990)。
     制剂中化合物的量可在本领域技术人员采用的整个范围内变化。通常， 以重量百 分比 ( 重量％ ) 计， 该制剂可含有总制剂的约 0.01-99.99 重量％的式 I 化合物， 其余部分 为一种或多种适合的药用赋形剂。优选地， 该化合物是以约 1-80％重量％的水平存在。
     本发明另外涉及包含 ( 即含有或由…组成 ) 至少一种式 (I)、 (IA)、 (IA’ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物和至少一种可药用赋形剂的药物组合物。
     包含游离形式或可药用盐形式的式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物 与至少一种可药用赋形剂 ( 例如载体和 / 或稀释剂 ) 的药物组合物可以以常规方式通过混 合此类组分来制备。
     包含游离形式或可药用盐形式的式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物 且另外包含组合伴侣 ( 在一个剂量单元形式中或作为药盒 ) 与至少一种可药用载体和 / 或 稀释剂的组合药物组合物可以以常规方式、 通过将可药用载体和 / 或稀释剂与所述活性成 分混合来制备。
     因此， 本发明在其它方面提供
     ■组合药物组合物， 例如用于任一本文所述的方法， 其包含游离形式或可药用盐 形式的式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物与可药用稀释剂和 / 或载体。
     ■组合药物组合物， 包含游离形式或可药用盐形式的式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物作为活性成分 ； 一种或多种可药用载体物质和 / 或稀释剂和任选的一种 或多种其它药物物质。此类组合药物组合物可呈一种剂量单位形式或作为药盒。
     ■组合药物组合物， 其包含治疗有效量的游离形式或可药用盐形式的式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物和第二药物物质， 同时或相继施用。
     ■如上文所定义的方法， 包括共施用、 例如伴随或顺次施用治疗有效且无毒量的 式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物或其可药用盐， 和至少第二药物物质， 例如 如上文所述。
     ■药物组合物， 例如药盒， 其包含 a) 第一药剂， 其为游离形式或可药用盐形式的 如本文所公开的式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物， 和 b) 至少一种辅助药剂，例如如上文所述 ； 由此该药盒可包含其施用说明书。
     化合物式 (I)、 (IA)、 (IA’ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 的下列实施例阐明本发明， 但并不 限制其范围。描述了用于制备此类化合物的方法。
     以摄氏度测量温度。除非另有说明， 否则反应是在室温发生且使用 ESI 获得 MS。 在中间体和实施例的制备和分析中使用下列 HPLC/MS 方法 ：
     方法 A1 至 A3(LCMS ： 分析型 HPLC/MS) ：
     系统 ： Agilent 1100 系列， 其装备有 Waters Micromass ZQ 2000 ESI+ 和 / 或 ESI
     柱： XBridge C18， 3x 30mm， 2.5 微米
     温度 ： 50℃
     洗脱剂 A ： H2O， 其含有 5％ CH3CN 和 0.8％ HCOOH
     洗脱剂 B ： CH3CN， 其含有 0.6％ HCOOH
     流速 ： 1.2-2.4mL/min
     方法 A1 ： 方法 Polar4a_p_100-900 和方法 Polar4a_pn_100-900 ：
     梯度 ： 0-2.9min ： 1％至 95％的 B
     方法 A2 ： 方法 Fast4_p_100-900 和方法 Fast4a_pn_100-900 ： 梯度 ： 0-2.4min ： 10％至 95％的 B
     方法 A3 ： 方法 Slow4a_pn_100-900 ：
     梯度 ： 0-4.4min ： 5％至 95％的 B
     方法 B( 制备型 HPLC) 仪器 ： Waters 制备型 HPLC 系统， 柱： SunfireTM Prep C18OBDTM 5 微米 30X 100mm， 温度 ： 25℃， 洗脱剂 ： 于 0.05％ TFA 水溶液中的 5-100％ CH3CN 梯度， 洗脱 20 分钟， 流速 ： 30mL/ 分钟， 检测 ： UV 254nm。
     方法 C( 制备型 HPLC) 仪器 ： Waters 制备型 HPLC 系统， 柱： SunfireTM Prep C18 OBDTM 5 微米 30X 100mm， 温度 ： 25℃， 洗脱剂 ： 于 0.05％ TFA 水溶液中的 5-50％ CH3CN 梯度， 洗脱 20 分钟， 流速 ： 30mL/ 分钟， 检测 ： UV 254nm。
     方法 D( 分析型 HPLC) ： 线性梯度 2-100％ CH3CN(0.1％ TFA) 和 H2O(0.1％ TFA) 进 行 5min+100％ CH3CN(0.1％ TFA) 进行 1.5min ； 在 215nm 检测， 在 30℃流速为 1mL/min。柱 ： Nucleosil 100-3C18(70x 4mm)
     方法 E( 制备型 HPLC/MS) 仪器 ： Gilson 制备型 HPLC 系统， 柱： SunfireTM Prep C18 OBDTM 5 微米 30X 100mm， 温度 ： 25℃， 洗脱剂 ： 于 0.05％ TFA 水溶液中的 5-100％ CH3CN 梯 度， 进行 20 分钟， 流速 ： 30mL/ 分钟， 检测 ： UV 254nm。
     方 法 F( 分 析 型 HPLC) 仪 器 ： Shimadzu SIL-10A， 方法： 线 性 梯 度 2-100 ％ CH3CN(0.1 ％ TFA) 和 H2O(0.1 ％ TFA) 进 行 4min+100 ％ CH3CN(0.1 ％ TFA) 进 行 2min ； 3min 回 到 -100 ％ CH3CN(0.1 ％ TFA) ； 在 215nm 检 测， RT 流 速 2mL/min. 柱 ： Nucleosil OD-5-100C18(150x 4.6mm)
     方法 G( 分析型 HPLC) 仪器 ：
     系统 ： Agilent 1100 系列，
     柱： HPHypersil BDS C18， 4x 125mm， 5 微米
     温度 ： 25℃
     洗脱剂 A ： H2O， 其含有 0.1％ v/v TFA
     洗脱剂 B ： CH3CN， 其含有 0.1％ v/v TFA
     梯度 ： 在 5min 内 10％→ 100％ B， 100％ B 进行 2.5min， 然后 1min → 10％ B
     流速 ： 1.5mL/min
     检测 ： UV 215nm
     方法 H( 分析型 HPLC) 仪器 ：
     系统 ： Agilent 1100 系列
     柱： Macherey-Nagel Nucleosil 100-3 C18HD， 4x 125mm， 3 微米
     温度 ： 30℃
     洗脱剂 A ： H2O， 其含有 0.1％ v/v TFA
     洗脱剂 B ： CH3CN， 其含有 0.1％ v/v TFA
     梯度 ： 在 7min 内 2％→ 100％ B， 100％ B 进行 2min， 然后 1min → 2％ B
     流速 ： 1.0mL/min
     检测 ： UV 215nm
     方法 I(LCMS ： 分析型 HPLC/MS) ：
     系统 ： Waters Acquity UPLC， 其装备有 Waters Micromass ZQ 2000 ESI+/
     柱： Acquity HSS T3 C18， 2.1x 50mm， 1.8 微米
     温度 ： 50℃
     洗脱剂 A ： H2O， 其含有 0.05％ v/v HCOOH 和 3.75mM 乙酸铵
     洗脱剂 B ： CH3CN， 其含有 0.04％ HCOOH
     梯度 ： 在 4.3min 内 2％→ 98％ B， 98％ B 进行 0.7min， 然后 0.1min → 2％ B 以及 用 2％ B 进行 0.9min
     流速 ： 1.0mL/min
     方法 J(LCMS ： 分析型 HPLC/MS) ：
     系统 ： Agilent 1100 系列 ； MS ： G1946D
     柱： Symmetry C8， 2.1x 50mm， 3.5 微米
     洗脱剂 A ： H2O， 其含有 0.1％ v/v HCOOH
     洗脱剂 B ： CH3CN， 其含有 0.1％ v/v HCOOH
     梯度 ： 0-3.3min ： 5％至 95％的 B
     流速 ： 1.0mL/min
     方法 K(LCMS ： 分析型 HPLC/MS) ：
     系统 ： Waters Acquity UPLC
     柱： Acquity HSS T3 C18， 2.1x 50mm， 1.8 微米
     洗脱剂 A ： H2O， 其含有 0.05％ v/v HCOOH 和 0.05％乙酸铵
     洗脱剂 B ： 乙腈， 其含有 0.04％ HCOOH
     梯度 ： 在 1.7min 内 2％→ 98％ B， 用 98％ B 进行 0.45min， 然后 0.04min → 2％ B
     流速 ： 1.2mL/min
     方法 L(LCMS ： 分析型 HPLC/MS) ：
     系统 ： Waters Aquity UPLC ； MS ： Waters AQ Detector
     柱： Aquity HSS， 1.8m 2.1x 50mm， 3/pk洗脱剂 A ： H2O， 其含有 0.1％ v/v HCOOH 洗脱剂 B ： CH3CN， 其含有 0.1％ v/v HCOOH 梯度 ： 0-1.5min ： 10％至 95％的 B， 然后 1min ： 95％ B 流速 ： 1.2mL/min ESI-MS ： 仪器 ： Micromass Platform II 洗脱剂 ： 含有 0.2％ v/v 的 25％氢氧化铵溶液的 H2O 中的 15％ v/v MeOH 流速 ： 0.05mL/min 在以下实例中， 使用下文所给出的缩写 ：
    中间体 A： 咪 唑 -1- 甲 酸 (8- 叔 丁 基 -4， 5- 二 氢 - 噻 唑 并 [4， 5-h] 喹 唑 啉 -2- 基 )- 酰胺
    
    在氩气气氛下将 8- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基胺 ( 阶段 A.1， 0.319g， 1.225mmol) 和 CDI(278mg， 1.715mmol) 加 至 DCM(5ml) 和 DMF(0.25ml)。18h 后， 将残余物冷却至 4℃， 过滤收集沉淀。将固体在 50℃高真空干燥， 得到为淡黄色固体的 标题化合物。(8- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 氨基甲酸甲酯的 LCMS ： tR 0.95min 和 M+H319.0( 方法 A2) ； 其为在制备 MeOH 溶液样品的过程中标题化合物 与 MeOH 的反应产物。
     阶段 A.1 ： 8- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基胺
    
    中间体 A.1 通过两条不同的路径获得。两条路径从 2- 氨基 -5， 6- 二氢 -4H- 苯并 噻唑 -7- 酮开始并且如下所述 ：
     路径 1 ：
     向 N ′ -{6-[1- 二甲基氨基 - 甲 -(E)- 亚基 ]-7- 氧代 -4， 5， 6， 7- 四氢 - 苯并噻 唑 -2- 基 }-N， N- 二甲基 - 甲脒 ( 阶段 A.2， 2.2g， 7.90mmol) 在 2- 甲氧基乙醇 (20ml) 中 的混合物在室温加入氢氧化钠 (1.185g， 29.6mmol) 和 2， 2- 二甲基 - 丙脒盐酸盐 (1.620g， 11.85mmol)。将 RM 在 125℃搅拌 3h。冷却至室温后， 用 MeOH 稀释 RM， 吸附到硅胶上， 通过 快速层析法纯化 (CombiFlash Companion 系统 使用 RediSep 硅胶柱， 洗脱剂 ： DCM/ MeOH/ 氨 95 ∶ 5 ∶ 0.5)。LC ： tR 3.64min( 方 法 D)。MS ： M+H ＝ 261.1H-NMR( 在 DMSO-d6 中)： 8.24(s， 1H) ； 7.70(s， 2H) ； 2.89-2.84(m， 2H) ； 2.76-2.71(m， 2H) ； 1.28(s， 9H)。
     阶段 A.2 ： N′ -{6-[1- 二甲基氨基 - 甲 -(E)- 亚基 ]-7- 氧代 -4， 5， 6， 7- 四氢 - 苯 并噻唑 -2- 基 }-N， N- 二甲基 - 甲脒
    
    在搅拌下、 将 2- 氨基 -5， 6- 二氢 -4H- 苯并噻唑 -7- 酮 (3.5g， 20.81mmol) 在二甲 氧基甲基二甲胺 (12mL， 90mmol) 中的悬液在 100℃加热 65h。然后将 RM 真空蒸发至干， 将
     残余物悬浮于 EtOAc 中。在 4℃ 1 小时后， 滤掉固体， 用 EtOAc 洗涤， 然后在 60℃高真空干 燥， 得到为褐色晶体的纯标题产物。LC ： tR 3.25min( 方法 D)。MS ： M+H ＝ 279.1H-NMR( 在 DMSO-d6 中 ) ： 8.40(s， 1H) ； 7.23(s， 1H) ； 3.15(s， 3H) ； 3.05(s， 6H) ； 2.97(s， 3H) ； 2.91(t， 2H) ； 2.67(t， 2H)。
     路径 2 ：
    将碳酸钾 (0.434g， 3.14mmol) 加至 N-(8- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹 唑啉 -2- 基 )- 乙酰胺 ( 阶段 A.3， 0.38g， 1.257mmol) 在 MeOH 中的混合物。将 RM 在 50 ℃ 搅拌 52h， 然后冷却至室温， 真空蒸发， 得到红色物质。加入水 (20ml)， 将混合物在室温另外 搅拌 3h。然后将红色悬液冷却至 4℃， 过滤， 在高真空下干燥后得到为米色固体的标题化合 物。LCMS ： tR 0.99min 且 M+H ＝ 261( 方法 A3)。1H-NMR( 在 DMSO-d6 中 )， 400MHz ： 8.24(s， 1H) ； 7.70(s， 2H) ； 2.89-2.84(m， 2H) ； 2.76-2.71(m， 2H) ； 1.28(s， 9H)。
     阶段 A.3 ： N-(8- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 乙酰胺
    
    将吡啶 (13ml) 加至 N-(6- 甲酰基 -7- 氧代 -4， 5， 6， 7- 四氢 - 苯并噻唑 -2- 基 )- 乙 酰胺 ( 阶段 A.4， 3.05g， 12.8mmol) 和叔丁基脒盐酸盐 (1.788g， 12.8mmol)， 将混合物在密封 容器中于 160℃加热 6.5h。冷却后， 将反应混合物过滤， 得到固体。蒸发过滤母液， 得到更 多的固体物质。使用热 CH3CN 反复研磨合并的固体， 蒸发 CH3CN 母液， 得到固体， 显示该固体 主要为标题产物。将粗产物溶解于约 10ml 在 MeOH 中的 10％ DMSO， 得到略微混浊的橙色溶 液， 过滤并在室温边搅拌边滴加至水 (100ml) 中。过滤收集沉淀固体， 得到为橙色固体的标 1 题化合物。LCMS ： tR 1.37min 且 M+H ＝ 303.0( 方法 A3)。 H-NMR( 在 DMSO-d6 中 )， 400MHz ： 12.40(s， 1H) ； 8.44(s， 1H) ； 2.88-3.00(m， 4H) ； 2.17(s， 3H) ； 1.32(s， 9H)。
     阶段 A.4 ： N-(6- 甲酰基 -7- 氧代 -4， 5， 6， 7- 四氢 - 苯并噻唑 -2- 基 )- 乙酰胺
     在 氩 气 气 氛 下、 将 LiHMDS 溶 液 (1M， 27.7ml) 经 10min 添 加 至 在 -78 ℃ 冷 却 的 N-(7- 氧代 -4， 5， 6， 7- 四氢 - 苯并噻唑 -2- 基 )- 乙酰胺 ( 阶段 A.5， 2.0g， 9.23mmol) 在干 燥 THF(20ml) 中的悬液。然后将 RM 在 -78℃搅拌 2.5h， 经 30min 滴加甲酸甲酯 (2.308mL， 36.9mmol)。然后将 RM 逐渐升温至室温， 然后在室温搅拌 18h。将 RM 浸没于 1M HCl 水 溶液 (70ml) 中， 用 DCM 萃取 3X， 经 Na2SO4 干燥， 蒸发， 得到为固体的标题化合物。HPLC ： 1 tR3.65min( 方法 D)。MS ： M-H ＝ 237。 H-NMR( 在 DMSO-d6 中 )(400MHz) ： 12.50(s， br， 1H) ； 7.55(s， 1H) ； 2.90-2.60(m， 4H) ； 2.15(s， 3H)。
     阶段 A.5 ： N-(7- 氧代 -4， 5， 6， 7- 四氢 - 苯并噻唑 -2- 基 )- 乙酰胺
    
    在室温向乙酸酐 (80ml) 中添加 2- 氨基 -5， 6- 二氢 -4H- 苯并噻唑 -7- 酮 (10g， 59.4mmol)， 将所得悬液加热回流。 回流搅拌 1.75h 后， 边搅拌边冷却 RM， 在室温搅拌 18h， 随 后使用冰 /NaCl 浴进一步冷却， 过滤收集固体。 使用回流丙酮 (10ml， 然后 15ml) 将固体研磨 两次， 随后过滤， 在真空下于 40℃干燥， 得到为米色固体的标题产物。HPLC ： tR 3.47min( 方 1 法 D)。MS ： M-H ＝ 211.1. H-NMR( 于 DMSO-d6 中 )(600MHz) ： 12.55(s， br， 1H) ； 2.84(t， 2H) ； 2.48(t， 2H) ； 2.17(s， 3H) ； 2.065(qt， 2H)。
     中间体 B ： (2S， 4R)-4- 二甲基氨基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺
    
    将 (2S， 4R)-4- 二甲基氨基 - 吡咯烷 -2- 甲酸甲酯 ( 阶段 B.1， 225mg) 和含 7M 氨 的 MeOH(7ml) 在密封容器中于室温静置 18h。蒸发， 用 Et2O 研磨， 得到为白色固体的标题化 合物。
     阶段 B.1(2S， 4R)-4- 二甲基氨基 - 吡咯烷 -2- 甲酸甲酯
    
    在氢气气氛下、 将 (2S， 4R)-4- 二甲基氨基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 1- 苄基酯 2- 甲酯 ( 阶段 B.2， 420mg)、 10％披钯碳 (80mg) 和 MeOH(10ml) 的混合物搅拌 16h。过滤， 蒸发， 得到标题化合物， 其未经纯化即用于以下步骤中。
     阶段 B.2(2S， 4R)-4- 二甲基氨基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 1- 苄基酯 2- 甲酯
    将氰基硼氢化钠 (200mg) 加至 (2S， 4R)-4- 氨基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 1- 苄基酯 2- 甲酯 (400mg)、 福尔马林 (0.68ml)、 乙酸 (0.72ml)、 三乙胺 (0.2ml) 和 MeOH(2ml) 的混合 物中， 将混合物在室温搅拌 2h。然后将 RM 在 DCM 与 NaHCO3 水溶液之间分配， 蒸发 DCM 层， 通过正相层析法 ( 洗脱液 ； 梯度自 EtOAc 至的 20％ EtOH/EtOAc) 纯化， 得到大部分 UV 活性 组分。将层析的物质吸收于 1M HCl 中， 用 Et2O 洗涤 2X， 水层用 NaHCO3 碱化， 用 Et2O 萃取 3X， 经 Na2SO4 干燥， 蒸发， 得到为浅黄色油状物的标题化合物。
    
    
    中间体 C ： 咪 唑 -1- 甲 酸 (8- 二 乙 基 氨 基 -4， 5- 二 氢 - 噻 唑 并 [4， 5-h] 喹 唑 啉 -2- 基 )- 酰胺向 2- 氨基 -8-N， N- 二乙基氨基 -4， 5- 二氢噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 ( 阶段 C.1， 1g， 3.63mmol) 在 DCM(35ml) 中的混合物加入 CDI(1.178g， 7.26mmol)。将 RM 在 40 ℃搅拌 90h。冷却至室温后， 过滤收集固体， 得到标题化合物。HPLC ： tR 4.11min( 方法 D)。MS ： M+H ＝ 334， 标题化合物与 MeOH 的反应产物 (8- 二乙基氨基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑 啉 -2- 基 )- 氨基甲酸甲酯。
     阶段 C.1 ： 2- 氨基 -8- 二乙基氨基 -4， 5- 二氢噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉
    
    在氩气下、 于室温向 N′ -{6-[1- 二甲基氨基 - 甲 -(E)- 亚基 ]-7- 氧代 -4， 5， 6， 7- 四氢 - 苯并噻唑 -2- 基 }-N， N- 二甲基 - 甲脒 ( 阶段 A.2， 1g， 3.59mmol) 在 2- 甲氧基乙 醇 (10ml) 中的溶液加入 NaOH(0.539g， 13.47mmol) 和 N， N- 二乙基胍 (0.454g， 3.94mmol)。 将 RM 在 125℃搅拌 3.5h， 然后冷却至室温。真空蒸发后， 将残余物溶解于 0.1M HCl(50ml)中， 用 EtOAc 洗涤。然后将水层用 6N NaOH 碱化， 用 EtOAc 萃取 3X。将有机层经 Na2SO4 干 燥， 蒸发， 于 60℃高真空下干燥， 得到为橙色晶体的标题化合物。LC ： tR 3.60min( 方法 D)。 MS ： M+H ＝ 276.1H-NMR( 于 DMSO-d6 中 ) ： 7.91(s， 1H) ； 7.59(s， 2H) ； 3.50(q， 4H) ； 2.69(dd， 4H) ； 1.07(t， 6H)。
     中间体 D ： (2S， 3S)-3- 甲基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺
    在室温、 将在 1， 4- 二噁烷中的 4M HCl 溶液 (1.5ml) 加至 (2S， 3S)-3- 甲基吡咯 烷 -2- 甲酸 (0.5g) 在 EtOH(5ml) 中的悬液， 将混合物在回流下加热 20h。蒸发 RM， 加入在 MeOH 中的 7M 氨溶液 (5.6ml)。 将 RM 在室温静置 6 天， 然后蒸发， 将残余物用 MeOH(0.5ml) 研 磨， 过滤， 用冷 MeOH(2ml) 洗涤， 得到为白色固体的标题化合物。1H-NMR(d6-DMSO， 400MHz) ： 8.06(s， 1H)， 7.67(s， 1H)， 3.60(d， 1H)， 3.25-3.14(m， 2H)， 2.24-2.15(m， 1H)， 2.09-1.98(m， 1H)， 1.57-1.45(m， 1H)， 1.13(d， 3H)。
     中间体 E ： (R)-2- 苄基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺
    
    将 (3R， 7aR)-7a- 苄基 -3- 三氯甲基 - 四氢 - 吡咯并 [1， 2-c] 噁唑 -1- 酮 (1.40g， 如 Wang 和 Germanas Synlett 1999， 33-36 所述制备 ) 和在 MeOH 中的 7M 氨 (15ml) 的混合 物在密封容器中于 50℃加热 3 天。然后将冷却的 RM 蒸发， 用氯仿研磨， 得到为白色固体的 标题化合物。
     中间体 F(S)-2- 甲基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺
    
    将 (S)-2- 甲基 - 吡咯烷 -2- 甲酸丁酯 ( 阶段 F.1， 2.3g) 在 7M 氨的 MeOH 溶液 (22.2ml) 中的溶液在高压气体贮罐中于 70 ℃加热 10 天。蒸发 RM， 用己烷 (20ml) 研磨， 1 得 到 为 灰 白 色 固 体 的 标 题 化 合 物。 H-NMR(d6-DMSO， 400MHz) ： 7.40(s， 1H)， 6.89(s， 1H)， 2.95-2.84(m， 1H)， 2.72-2.60(m， 1H)， 2.06-1.95(m， 1H)， 1.66-1.44(m， 2H)， 1.42-1.30(m， 1H)， 1.22(s， 3H)。
     阶段 F.1 ： (S)-2- 甲基 - 吡咯烷 -2- 甲酸丁酯
    
     将浓 HCl(2ml) 加至 (S)-2- 甲基 - 吡咯烷 -2- 甲酸 (2g) 在丁 -1- 醇 (50ml) 中的 悬液， 在 60℃加热 18h， 然后回流 4 天。蒸发 RM， 在饱和 NaHCO3 水溶液和 DCM 之间分配， 用 DCM 萃取 3X， 经 Na2SO4 干燥， 蒸发。然后将分离的油状物在 10mbar 下 kugelrohr 蒸馏， 在 100-120℃的烘箱温度将馏分蒸馏， 得到为澄清无色油状物的标题化合物。
     中间体 G ： (R)-2- 甲氧基甲基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺
    
    将 (3R， 7aR)-7a- 甲氧基甲基 -3- 三氯甲基 - 四氢 - 吡咯并 [1， 2-c] 噁唑 -1- 酮 ( 阶段 G.1， 0.6g) 和含 7M 氨的 MeOH(6ml) 的混合物在密封容器中于室温静置 2 天。然后蒸 发 RM， 得到为浅黄色油状物的标题化合物， 其不需进一步纯化即可使用。
     阶段 G.1 ： (3R， 7aR)-7a- 甲氧基甲基 -3- 三氯甲基 - 四氢 - 吡咯并 [1， 2-c] 噁 唑 -1- 酮
    
    在 -78℃、 将二异丙基氨基锂在己烷 /THF 的 3 ∶ 5 混合物中的 1M 溶液 (8.25ml) 滴加至含 (3R， 7aS)-3- 三氯甲基 - 四氢 - 吡咯并 [1， 2-c] 噁唑 -1- 酮 (1.51g， 如 Wang 和 Germanas Synlett 1999， 33-36. 所述制备 ) 的 THF(5ml) 中。在 -78℃搅拌 30 分钟后， 加 入甲基氯甲醚 (1.14ml)。然后经 3h 将 RM 升温至 -30℃， 加入水。将水层用 DCM 萃取， 将合 并的有机层蒸发， 然后将残余物通过用 DCM 洗脱的正相层析法纯化， 得到为浅黄色油状物 的标题化合物。
     中间体 H ： (R)-2- 二甲基氨基甲基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺
    
    将 (3R， 7aR)-7a- 二 甲 基 氨 基 甲 基 -3- 三 氯 甲 基 - 四 氢 - 吡 咯 并 [1， 2-c] 噁 唑 -1- 酮 ( 阶段 H.1， 0.26g) 和在 MeOH(4ml) 中的 7M 氨的混合物在密封容器中于 50℃加 热 3 天。然后将冷却的 RM 蒸发， 得到为褐色油状物的标题化合物， 其不需进一步纯化即可 使用。MS ： M+H ＝ 172.1。
     阶段 H.1 ： (3R， 7aR)-7a- 二甲基氨基甲基 -3- 三氯甲基 - 四氢 - 吡咯并 [1， 2-c] 噁唑 -1- 酮
    在 -78℃， 将二异丙基氨基锂在己烷 /THF 的 3 ∶ 5 混合物中的 1M 溶液 (8.25ml) 滴 加至在 THF(5ml) 中的 (3R， 7aS)-3- 三氯甲基 - 四氢 - 吡咯并 [1， 2-c] 噁唑 -1- 酮 (1.51g， 如 Wang 和 Germanas Synlett 1999， 33-36 所述制备 .)。在 -78 ℃搅拌 30 分钟后， 加入 Eschenmoser 盐 (2.78g)。然后经 1h 将 RM 在剧烈搅拌下升温至 -40℃， 在 -40℃维持 2h。 然后加入水， 将水层用 DCM 萃取， 将合并的有机层经 Na2SO4 干燥， 蒸发。然后将残余物通过
    正相层析法纯化， 用 DCM 至 DCM 中的 20％ EtOAc 的梯度洗脱， 得到为浅黄色油状物的标题化 合物 (M+H ＝ 301/303/3053 ∶ 3 ∶ 1)。
     中间体 I ： d6-(R)-2- 二甲基氨基甲基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺
    将 d6-(3R， 7aR)-7a- 二甲基氨基甲基 -3- 三氯甲基 - 四氢 - 吡咯并 [1， 2-c] 噁 唑 -1- 酮 ( 阶 段 I.1， 440mg， 1.430mmol) 在 密 封 容 器 中 溶 解 于 氨 的 MeOH 溶 液 (10.2mL， 71.4mmol)， 在 75℃加热 5 天。蒸发反应混合物， 用 CHCl3 研磨 2X， 得到为淡褐色固体的标 题产物。
    阶段 I.1 ： d6-(3R， 7aR)-7a- 二甲基氨基甲基 -3- 三氯甲基 - 四氢 - 吡咯并 [1， 2-c] 噁唑 -1- 酮
    
    在氩气下将 (3R， 7aR)-1- 氧代 -3- 三氯甲基 - 二氢 - 吡咯并 [1， 2-c] 噁唑 -7a- 甲醛 ( 如 J.Org.Chem.2006， 71(1)， 97-102 所 述 获 得， 1g， 3.67mmol)、在 THF 中 的 二 甲 胺 -d7(1.0mL， 14.09mmol)、 乙酸 (0.525mL， 9.17mmol) 和 DCE(4ml) 合并， 分批加入三乙酰氧 基硼氢化钠 (1.089g， 5.14mmol)。在室温搅拌 3h 后， 将 RM 溶于 DCM 中， 用 1M NaOH 分配， 再 用 DCM 萃取 1 次。然后将有机层合并， 用水洗涤两次， 然后经 Na2SO4 干燥。蒸发溶液至其体 积一半， 加入 1M HCl H2O 溶液， 分离各层， 将水层用 DCM 洗涤两次。用饱和 Na2CO3 溶液将水 层的 pH 调节至～ 8， 用 DCM 萃取三次。将有机层经 Na2SO4 干燥， 蒸发， 得到为浅黄色油状物 的所需标题产物。
     中间体 J ： (R)-2- 羟基甲基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺
    在氩气下、 将 (3R， 7aR)-7a- 羟基甲基 -3- 三氯甲基 - 四氢 - 吡咯并 [1， 2-c] 噁 唑 -1- 酮 ( 阶段 J.1， 308mg， 1.122mmol) 加至在 MeOH 中的 7M 氨溶液 (8.014mL， 56.1mmol)， 在密封容器中于 75℃加热 72h， 然后蒸发， 得到为粘稠的淡褐色油状物的标题化合物， 其不 需进一步纯化即可使用。 阶 段 J.1 ： (3R， 7aR)-7a- 羟 基 甲 基 -3- 三 氯 甲 基 - 四 氢 - 吡 咯 并 [1， 2-c] 噁
    唑 -1- 酮
    将三乙酰氧基硼氢化钠 (544mg， 2.57mmol) 加至在 DCE(4ml) 中的 (3R， 7aR)-1- 氧 代 -3- 三氯甲基 - 二氢 - 吡咯并 [1， 2-c] 噁唑 -7a- 甲醛 ( 如 J.Org.Chem.2006， 71(1)， 97-102 中所述获得， 500mg， 1.835mmol)。将 RM 在室温搅拌 18h， 然后溶解于 DCM 中， 将有机 层用水洗涤， 经 Na2SO4 干燥， 蒸发。使用 20g RediSep 硅胶柱 ( 洗脱剂 ： DCM 至在 DCM 中 的 10％ MeOH) 纯化粗产物， 得到为澄清淡黄色油状物的标题化合物。
     中间体 K ： (R)-2-{[(3- 氟 - 苄基 )- 甲基 - 氨基 ]- 甲基 }- 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺
    
    在氩气下、 将 (3R， 7aR)-7a-{[(3- 氟 - 苄基 )- 甲基 - 氨基 ]- 甲基 }-3- 三氯甲 基 - 四氢 - 吡咯并 [1， 2-c] 噁唑 -1- 酮 ( 阶段 K.1， 385mg， 0.973mmol) 加至在 MeOH 中的 7M 氨 (6.950mL， 48.7mmol)， 在密封容器中于 50℃加热 6 天， 然后在 75℃加热 5 天。然后蒸发 RM， 将残余物通过使用 12g RediSep 硅胶柱 ( 洗脱剂 ： 于 DCM 中的 5％ MeOH) 的快速层析
     法纯化， 得到为黄色油状物的标题化合物。
     阶段 K.1 ： (3R， 7aR)-7a-{[(3- 氟 - 苄基 - 甲基 - 氨基 ]- 甲基 }-3- 三氯甲基 - 四 氢 - 吡咯并 [1， 2-c] 噁唑 -1- 酮
    在 氩 气 气 氛 下、将 三 乙 酰 氧 基 硼 氢 化 钠 (889mg， 4.19mmol) 加 至 (3R， 7aR)-7a-[(3- 氟 - 苄基氨基 )- 甲基 ]-3- 三氯甲基 - 四氢 - 吡咯并 [1， 2-c] 噁唑 -1- 酮 ( 阶段 K.2， 400mg， 1.048mmol)、 甲醛 (37％于 H2O 中， 0.102mL， 1.36mmol) 和乙酸 (0.150mL， 2.62mmol) 在 DCE(4ml) 中的混合物。在室温搅拌 2h 后， 将 RM 在 DCM 与水之间分配。将合 并的有机层经 Na2SO4 干燥， 蒸发， 得到为淡褐色油状物的标题化合物， 其不需进一步纯化即 可使用。
     阶段 K.2 ： (3R， 7aR)-7a-[(3- 氟 - 苄基氨基 )- 甲基 ]-3- 三氯甲基 - 四氢 - 吡咯 并 [1， 2-c] 噁唑 -1- 酮
    
    在氩气气氛下、 将三乙酰氧基硼氢化钠 (544mg， 2.57mmol) 加至 (3R， 7aR)-1- 氧 代 -3- 三氯甲基 - 二氢 - 吡咯并 [1， 2-c] 噁唑 -7a- 甲醛 ( 如 J.Org.Chem.2006， 71(1)， 97-102 中 所 述 获 得， 500mg， 1.835mmol)、 3- 氟 苄 基 胺 (0.251mL， 2.20mmol) 和 乙 酸 (0.263mL， 4.59mmol) 和 DCE(4ml) 中。将 RM 在室温搅拌 3h， 然后在水与 DCM 之间分配， 将 合并的有机物经 Na2SO4 干燥， 蒸发， 得到为浅黄色油状物的标题化合物， 其不需进一步纯化 即可使用。
     中间体 L ： (S)- 氮杂环丁烷 -2- 甲酸酰胺
    
    在氢气气氛下、 将 (S)-2- 氨基甲酰基 - 氮杂环丁烷 -1- 甲酸苄酯 ( 阶段 L.1， 1.8g) 和 10％披钯碳 (0.2g) 在 MeOH(25ml) 中的混合物在室温搅拌 5h。过滤和蒸发得到标题化 合物， 其不需进一步纯化即可使用。
     阶段 L.1 ： (S)-2- 氨基甲酰基 - 氮杂环丁烷 -1- 甲酸苄酯
    
    将 (S)- 氮杂环丁烷 -1， 2- 二甲酸 1- 苄基酯 2- 甲酯 (2.5g) 和于 MeOH 中的 7M 氨 溶液 (10ml) 的混合物在密封容器中于室温静置 18h。然后蒸发 RM， 得到为白色固体的标题 化合物， 其不需进一步纯化即可使用。MS ： M+H235.1 和 M-H 233.1。
     中间体 M ： (2S， 4R)-4- 氟 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺
    
    在 室 温、 将 HCl 于 EtOH 中 的 1.25M 溶 液 (2.3ml) 加 至 (2S， 4R)-4- 氟 - 吡 咯 烷 -2- 甲酸 (0.25g) 在 EtOH(2ml) 中的溶液， 将混合物于 55℃加热 62h。蒸发 RM， 加入氨 在 MeOH 中的 7M 溶液 (5.6ml)。将 RM 在室温静置 36h， 然后蒸发， 将残余物用 MeOH(0.5ml) 1 研磨， 过滤， 得到为白色固体的标题化合物。H-NMR(d6-DMSO， 400MHz) ： 7.68(s， 1H)， 7.37(s，
    1H)， 5.30(d， 1H)， 3.96(t， 1H)， 3.40-3.12(m， 2H)， 2.48-2.31(m， 1H)， 2.02-1.81(m， 1H)。
     中间体 N ： (2S， 4S)-4- 氟 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺
    将 (2S， 4S)-2- 氨基甲酰基 -4- 氟 - 吡咯烷 -1- 甲酸叔丁酯 (1.0g)、 浓 HCl(0.6ml) 和 1- 丁醇 (10ml) 的混合物在 50℃加热 48h。蒸发 RM， 在 DCM 与 NaHCO3 水溶液之间分配， 将 DCM 层经 Na2SO4 干燥， 蒸发。将在甲醇中的 7M 氨溶液 (10ml) 加至残余物， 将混合物在密 封容器中于室温静置 60h。蒸发， 用 EtOH 研磨， 得到为白色固体的标题化合物。
     中间体 O ： (1S， 5R)-2- 氮杂 - 二环 [3.1.0] 己烷 -1- 甲酸酰胺
    
    将 (1S， 5R)-2- 氮 杂 - 二 环 [3.1.0] 己 烷 -1- 甲 酸 乙 酯 (2.5g， 通 过 Hercouet Tetrahedron Asymmetry 1996， 7， 1267-1268 的程序制备 ) 和在 MeOH 中的 7M 氨溶液 (20ml) 的混合物在密封容器中于 80℃加热 5 天。蒸发冷却的 RM， 用己烷 /DCM 研磨， 得到为米色固
     体的标题化合物。1H-NMR(DMSO-d6， 400MHz) ： 7.15(s， 1H)， ， 7.04(s， 1H)， 3.00-2.91(m， 1H)， 2.67(q， 1H)， 1.94-1.83(m， 1H)， 1.74-1.67(m， 1H)， 1.64-1.55(m， 1H)， 1.38-1.31(m， 1H)， 0.90(t， 1H))。
     中间体 P ： (2S， 3R)-3- 甲基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺
    在 H2 气氛下、 在室温将在 MeOH(20ml) 中的 (2S， 3R)-3- 甲基 -1-((S)-1- 苯基 - 乙 基 )- 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺 ( 阶段 P.1， 1.1g， 4.76mmol) 和披钯炭 10％ (0.101g， 0.947mmol) 振荡 46h。 然后将 RM 滤过 Fluoropore 滤膜 (0.2μm FG)， 蒸发。 将残余物溶解于 DCM 中， 蒸发 1 至干， 得到为白色晶体的标题化合物。MS ： M+H ＝ 129.0. H-NMR(d6-DMSO， 600MHz) ： 7.34(s， br， 1H)， 7.10(s， br， 1H)， 3.48(d， 1H)， 3.0.2-2.97(m， 1H)， 2.80-2.75(m， 1H)， 2.35-2.28(m， 1H)， 1.88-1.81(m， 1H)， 1.39-1.32(m， 1H)， 0.83(d， 3H)。
     阶段 P.1 ： (2S， 3R)-3- 甲基 -1-((S)-1- 苯基 - 乙基 )- 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺
    
    在 氩 气 气 氛 下、 于 0 ℃ 将 在 甲 苯 中 的 三 甲 基 铝 (2M， 3.23ml) 滴 加 至 氯 化 铵 (0.346g， 6.47mmol) 在甲苯 (3.2ml) 中的混合物， 形成甲烷气体。 然后将 RM 升温至室温， 在 室温再搅拌 15min。 然后缓慢加入 (2S， 3R)-3- 甲基 -1-((S)-1- 苯基 - 乙基 )- 吡咯烷 -2- 甲 酸甲酯 ( 如 Tetr.Lett.1997， 38(1)， 85-88 中所述制备 ； 1.6g， 6.47mmol)。将 RM 在室温搅 拌 56h， 然后在冷却下加入 1M HCl， 将 RM 用 DCM 洗涤 3X。将水相用 Na2CO3 碱化， 用 DCM 萃
    取 3X， 将合并的有机层经 Na2SO4 干燥。蒸发， 得到为黄色油状物的标题化合物。MS ： M+H ＝ 1 233.2.HPLC ： tR 3.17min( 方 法 D)。 H-NMR(d6-DMSO， 600MHz) ： 7.37-7.33(m， 2H)， 7.30(t， 2H) ， 7.25(s ， br ， 1H) ， 7.21(t ， 1H) ， 7.12(s ， br ， 1H) ， 3.55(q ， 1H) ， 3.40(d ， 1H) ， 2.71(t ， 1H)， 2.28-2.22(m， 1H)， 2.21-2.16(m， 1H)， 1.71(qt， 1H)， 1.38-1.31(m， 1H)， 1.21(d， 3H)， 0.90(d， 3H)。
    
    中间体 Q ： (2S， 4S)-4- 二甲基氨基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺将 (2S， 4S)-4- 二甲基氨基 - 吡咯烷 -2- 甲酸丁酯 ( 阶段 Q.1， 326mg) 和 7M 氨 / MeOH 的溶液 (8ml) 在密封容器中于室温静置 18h。过滤， 蒸发， 用 Et2O/MeOH 研磨， 得到为
     米色固体的标题化合物。
     阶段 Q.1 ： (2S， 4S)-4- 二甲基氨基 - 吡咯烷 -2- 甲酸丁酯
    将浓 HCl(0.3ml) 加至 (2S， 4S)-4- 二甲基氨基 - 吡咯烷 -2- 甲酸甲酯二盐酸盐 (400mg) 和 1- 丁醇 (4ml) 的混合物， 在 115 ℃加热 18h。冷却后， 蒸发 RM， 然后在 DCM 与 NaHCO3 水溶液之间分配， 干燥 DCM 层， 蒸发， 得到为褐色油状物的标题化合物， 其不需进一步 纯化即可使用。
     中间体 R ： (2S， 4S)-4- 羟基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺
    
    将 (2S， 4S)-4- 羟基 - 吡咯烷 -2- 甲酸甲酯盐酸盐 (1g) 在 7M 氨 MeOH 溶液中的溶 液 (10ml) 搅拌 18h， 然后蒸发， 用 Et2O 研磨。将残余物溶解于最小体积的热 MeOH 中， 在 4℃ 静置 4h。过滤分离标题化合物， 为白色固体。
    
    
    中间体 S ： (2S， 4R)-4- 羟基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺将 (2S， 4R)-4- 羟基 - 吡咯烷 -2- 甲酸苄酯 (1g) 在 880 氨 (5ml) 中的溶液搅拌 18h， 然后蒸发， 用 Et2O 研磨， 得到为白色固体的标题化合物。1H-NMR(d6-DMSO， 400MHz) ： 9.15(s， br， 1H)， 8.04(s， 1H)， 7.63(s， 1H)， 5.56(s， 1H)， 4.40(s， 1H)， 4.27-4.16(m， 1H)， 3.27(d， 1H)， 3.02(d， 1H)， 2.33-2.19(m， 1H)， 1.89-1.76(m， 1H)。
     中间体 T ： 咪唑 -1- 甲酸 (7- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 苯并 [1， 2-d ； 3， 4-d ′ ] 双噻 唑 -2- 基 )- 酰胺
    
    将 7- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 苯并 [1， 2-d ； 3， 4-d ′ ] 双噻唑 -2- 基胺 ( 阶段 T.1， 175mg， 0.659mmol) 溶解于 DCM(10ml) 中， 然后加入 CDI(297mg， 1.648mmol)， 将 RM 在室温搅 拌 2h。过滤分离标题化合物， 用 DCM 洗涤， 在 HV 下干燥。
     阶段 T.1 ： 7- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 苯并 [1， 2-d ； 3， 4-d′ ] 双噻唑 -2- 基胺
    
    将 N-(7- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 苯并 [1， 2-d ； 3， 4-d′ ] 双噻唑 -2- 基 )- 乙酰胺 ( 阶 段 T.2， 225mg， 0.732mmol) 溶解于 EtOH(10ml) 中， 然后加入 HCl 36％ (1.48g， 14.64mmol)， 将 RM 加热至回流。回流 18 小时后， 将 RM 冷却至室温， 通过加入 5％碳酸氢钠水溶液调节至 pH 8-9， 用 EtOAc 萃取， 用 H2O 洗涤两次。将有机层经 Na2SO4 干燥， 蒸发， 得到标题产物 (tR 4.408min( 方法 F))。
     阶段 T.2 ： N-(7- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 苯并 [1， 2-d ； 3， 4-d′ ] 双噻唑 -2- 基 )- 乙 酰胺
    
    将 N-(6- 溴 -7- 氧 代 -4， 5， 6， 7- 四 氢 - 苯 并 噻 唑 -2- 基 )- 乙 酰 胺 ( 阶 段 T.3， 473mg， 1.635mmol) 溶 解 于 MeOH(10ml) 中， 加 入 2， 2- 二 甲 基 硫 代 丙 酰 胺 (230mg， 1.962mmol) 和钼磷酸铵 (307mg， 0.164mmol)， 将 RM 在 25℃搅拌 20h。然后将 RM 静置 2 天， 蒸发。用 30g 之后在 50℃搅拌 24h。将混合物用 EtOAc/H2O 萃取。将有机层经 Na2SO4 干燥， 硅胶对粗物质进行层析， 洗脱剂为 DCM/MeOH ＝ 99 ∶ 1。蒸发含有产物的馏分， 从二噁烷冻 干， 得到 225mg 为白色固体的标题化合物 (M+H ＝ 308 ； M-H ＝ 306 ； tR 5.525min( 方法 F))。
     阶段 T.3 ： N-(6- 溴 -7- 氧代 -4， 5， 6， 7- 四氢 - 苯并噻唑 -2- 基 )- 乙酰胺
    
    将 N-(7- 氧代 -4， 5， 6， 7- 四氢 - 苯并噻唑 -2- 基 )- 乙酰胺 ( 阶段 T.4， 2.286g， 10.87mmol) 溶 解 于 AcOH(60ml) 中， 然 后 缓 慢 加 入 溶 解 于 AcOH(10ml) 中 的 溴 (1.74g， 10.87mmol)， 将 RM 加热至 75℃达 20h。颜色由红色变为米色。蒸发混合物， 将残余物溶解 于 MeOH(10ml) 中， 用 H2O 沉淀。过滤混合物， 在 HV 上干燥。用 MPLC C18H2O 0.1 ％ TFA/ CH3CN 0.1 ％ TFA( 梯度 0-50 ％ ) 对粗物质进行层析。将含有产物的馏分用 NaHCO3 中和， 用 EtOAc 萃取， 从二噁烷冻干， 得到为白色固体的标题化合物 (M+H ＝ 291 ； M-H ＝ 289 ； tR 1 4.29( 方 法 F))。 H-NMR(d6-DMSO， 600.13MHz)12.75(s， 1H)4.95(t， 1H)， 2.95-2.84(m， 2H)， 2.62-2.52(m， 1H)， 2.40-2.30(m， 1H)， 2.20(s， 3H)。
     阶段 T.4 ： N-(7- 氧代 -4， 5， 6， 7- 四氢 - 苯并噻唑 -2- 基 )- 乙酰胺
    在室温、 向乙酸酐 (80ml) 加入 2- 氨基 -5， 6- 二氢 -4H- 苯并噻唑 -7- 酮 (10g， 59.4mmol)， 将黄色悬液加热回流。 在此温度搅拌 1.75h 后， 在搅拌下冷却 RM， 在室温搅拌过 夜。用冰 /NaCl 浴进一步冷却， 过滤悬液。然后将固体用丙酮回流两次 (10ml， 然后 15ml)， 过滤。于 40 ℃、 将所得固体在真空下干燥过夜， 提供为米色固体的标题化合物 (HPLC ： tR 1 3.47min( 方 法 A3)， M-H ＝ 211.1)， H-NMR( 于 DMSO-d6 中 )(600MHz) ： 12.55(s， br， 1H) ； 2.84(t， 2H) ； 2.48(t， 2H) ； 2.17(s， 3H) ； 2.065(qt， 2H))。
     中间体 U ： 咪唑 -1- 甲酸 [7-(2- 氟 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )-4， 5- 二氢 - 苯并 [1， 2-d ； 3， 4-d′ ] 双噻唑 -2- 基 ]- 酰胺
    
    将 7-(2- 氟 -1， 1- 二 甲 基 - 乙 基 )-4， 5- 二 氢 - 苯 并 [1， 2-d ； 3， 4-d ′ ] 双 噻 唑 -2- 基 胺 ( 阶 段 U.161.6mg， 0.217mmol) 溶 解 于 DCM(2ml) 中，加 入 CDI(297mg， 1.648mmol)， 得到澄清无色溶液。将 RM 在室温静置过夜， 得到白色悬液。将混合物在 4℃冷 却 1h， 然后过滤， 用 DCM 洗涤， 在真空下干燥， 得到为白色固体的标题化合物 ( 对在 MeOH 中 的样品进行分析 ； M+H ＝ 342.0 显示氨基甲酸甲酯产物的 MS ； tR 2.14min( 方法 A3))。
     阶段 U.17-(2- 氟 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )-4， 5- 二氢 - 苯并 [1， 2-d ； 3， 4-d ′ ] 双 噻唑 -2- 基胺
    
    将 3- 氟 -2， 2- 二甲基 - 硫代丙酰胺 ( 阶段 U.2， 394mg， 2.331mmol) 溶解于 EtOH中， 然后加入 N-(6- 溴 -7- 氧代 -4， 5， 6， 7- 四氢 - 苯并噻唑 -2- 基 )- 乙酰胺 ( 阶段 T.3， 473mg， 1.635mmol) 和钼磷酸铵 (80mg， 0.042mmol)， 得到黄色悬液。将 RM 加热至回流， 得到 暗蓝绿色悬液。将反应混合物在 65℃搅拌 3 天。过滤 RM， 将滤液蒸发。将残余物溶解于 DMF 中， 通过制备型 HPLC( 方法 E) 纯化。将含有产物的馏分合并， 蒸发， 得到为白色固体的 标题化合物 (M+H ＝ 284.1 ； tR 1.30min( 方法 A3))。
     阶段 U.23- 氟 -2， 2- 二甲基 - 硫代丙酰胺
    通过 Boys， M.L. ； Downs， V.L.Synth.Commun.2006， 36， 295 的程序制备标题化合 物。在室温、 将硫氢化钠水合物 (3.89g， 69.4mmol， 吸湿 ) 加至 3- 氟 -2， 2- 二甲基 - 丙腈 ( 阶段 U.3， 1.17g， 11.57mmol) 和二乙基胺盐酸盐 (7.61g， 69.4mmol) 在 1， 4- 二噁烷 (7ml) 和 H2O(7ml) 中的溶液。将 RM 加热至 55 ℃， 然后在此温度搅拌 3 天。将反应混合物用水 (50ml) 稀释， 用 EtOAc(50ml) 萃取 5X。 将有机层经 Na2SO4 干燥， 蒸发得到橙色油状物。 然后 加入 DCM(5ml)， 得到白色悬液。过滤悬液， 将滤液通过用 DCM 洗脱的硅胶快速层析法纯化。 将含产物的馏分蒸发， 得到为浅黄色油状物的标题化合物。(M+H ＝ 136.1， M-H ＝ 134.1 ； tR
    0.69min( 方法 A3))。19F-NMR(d6-DMSO， 400MHz 218ppm(t， 1F))。
     阶段 U.33- 氟 -2， 2- 二甲基 - 丙腈
    将 3- 氟 -2， 2- 二 甲 基 - 丙 酰 胺 ( 阶 段 U.4， 1.82g， 15.28mmol) 和 五 氧 化 二 磷 (2.168g， 15.28mmol) 合并， 得到自由流动的白色粉末， 其在氩气气氛下经 50 分钟用油浴加 热至 180℃的浴温。 然后缓慢应用 300mbar 真空对流动的澄清无色油状物进行蒸馏， 静置标 19 题化合物后形成低熔点蜡状固体。 F-NMR(d6-DMSO， 400MHz 219.5ppm(t， 1F))。
     阶段 U.43- 氟 -2， 2- 二甲基 - 丙酰胺
    
    将 3- 氟 -2， 2- 二 甲 基 - 丙 酰 氟 (DE3326874 和 DE3611195， 2.5g， 20.47mmol) 在 0℃加至氨水 (10ml) 和 THF(20ml) 的混合物。然后将 RM 升温至室温， 在室温静置过夜。在 真空下将体积减少 50％， 得到粘稠的白色悬液。 将悬液用 DCM/H2O 萃取。 将有机层经 Na2SO4 干燥， 蒸发， 得到为白色结晶固体的标题化合物。
     中间体 V ： 咪唑 -1- 甲酸 (7- 环丙基甲基 -4， 5- 二氢 - 苯并 [1， 2- ； 3， 4-d′ ] 双噻 唑 -2- 基 )- 酰胺
    
     将 7- 环丙基甲基 -4， 5- 二氢 - 苯并 [1， 2-d ； 3， 4-d ′ ] 双噻唑 -2- 基胺 ( 阶段 V.1， 72mg， 0.273mmol) 溶解于 5ml DCM 中， 加入 CDI(73.9mg， 0.410mmol)， 将 RM 在室温搅拌 20h。加入另外的 CDI(37mg， 0.205mmol)， 将 RM 在室温再搅拌 2 小时。过滤混合物， 用 DCM 洗涤， 蒸发滤液， 得到标题化合物 (M+H ＝ 322.1 ； M-H ＝ 320.2MS-ES( 于 MeOH 中 ) 显示氨基 甲酸甲酯产物 )。
     阶段 V.17- 环丙基甲基 -4， 5- 二氢 - 苯并 [1， 2-d ； 3， 4-d′ ] 双噻唑 -2- 基胺
    
    将 N-(7- 环丙基甲基 -4， 5- 二氢 - 苯并 [1， 2-d ； 3， 4-d′ ] 双噻唑 -2- 基 )- 乙酰胺 ( 阶段 V.2， 180mg， 0.589mmol) 溶解于 EtOH(10ml) 中， 加入 36％ HCl(1.193g， 11.79mmol)。 将 RM 加热至 90℃达 16h， 然后冷却， 用 EtOAc/H2O 萃取。将有机层经 Na2SO4 干燥， 蒸发。用 MPLC C18H2O 0.1％ TFA/CH3CN0.1％ TFA( 梯度 0-50％ ) 对粗物质进行层析。将含产物的 馏分用 NaHCO3 中和， 用 EtOAc 萃取， 从二噁烷冻干， 得到标题化合物 (M+H ＝ 264.2 ； M-H ＝ 262.1 ； tR 4.183min( 方法 F))。
     阶 段 V.2N-(7- 环 丙 基 甲 基 -4， 5- 二 氢 - 苯 并 [1， 2-d ； 3， 4-d ′ ] 双 噻 唑 -2- 基 )- 乙酰胺
    
    将 N-(6- 溴 -7- 氧代 -4， 5， 6， 7- 四氢 - 苯并噻唑 -2- 基 )- 乙酰胺 ( 阶段 T.3， 347mg， 1.200mmol) 溶解于 MeOH(10ml) 中， 加入 2- 环丙基 - 硫代乙酰胺 (Can.J.Chem 1995 Vol.73 1468-1477， 166mg， 1.440mmol) 和钼磷酸铵 (225mg， 0.120mmol)。将 RM 在室温搅拌 20h， 然后在 50℃加热 3h， 在 60℃加热 2h， 然后回流 24h。将 RM 在 EtOAc/H2O 之间分配。将 有机层经 Na2SO4 干燥， 蒸发。 用 MPLC C18H2O 0.1％ TFA/CH3CN 0.1％ TFA( 梯度 0-50％ ) 对 原料进行层析。将含产物的馏分用 NaHCO3 中和， 用 EtOAc 萃取， 从二噁烷冻干， 得到为白色 固体的标题化合物 (M+H ＝ 306.2 ； M-H ＝ 304.2 ； tR 5.12min( 方法 F))。
     实施例 1 ： (2S， 4R)-4- 二甲基氨基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 叔丁 基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
     向咪唑 -1- 甲酸 (8- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ( 中间体 A， 45.1mg， 0.127mmol) 在 DMF(1ml) 中的溶液加入 (2S， 4R)-4- 二甲基氨基 - 吡咯 烷 -2- 甲酸酰胺 ( 中间体 B， 22mg， 0.140mmol) 和三乙胺 (0.053mL， 0.382mmol)。 然后将 RM 在 室温搅拌 17h， 通过制备型 HPLC( 方法 B) 纯化。 将含产物的馏分合并， 通过 Bond Elut-SCX， 300mg 柱洗脱。然后将柱用在 MeOH 中的 7M 氨溶液洗涤， 蒸发， 得到标题化合物。MS ： M+H ＝ 444.HPLC ： tR 3.17min( 方法 D)。
     实施例 2 ： (2S， 3S)-3- 甲基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 二乙基氨基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
    
    将 (2S， 3S)-3- 甲基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺 ( 中间体 D， 6.24mg， 0.049mmol)、 咪 唑 -1- 甲酸 (8- 二乙基氨基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ( 中间体 C， 18mg， 0.049mmol) 和三乙胺 (0.020mL， 0.146mmol) 在 DMF(0.4ml) 中的混合物在室温搅拌 6h。然后将 RM 通过制备型 HPLC( 方法 B) 直接纯化。然后将含产物的馏分滤过 300mgBond Elut-SCX 柱。 然后将柱用在 MeOH 中的 7M 氨溶液洗脱， 蒸发洗脱剂， 得到为黄色固体的标题 1 化合物。MS ： M+H ＝ 430.1.HPLC ： tR 3.72min( 方法 D)。 H-NMR(DMSO-d6， 600MHz) ： 11.05(s， 1H) ； 8.04(s， 1H) ； 7.44(s， br， 1H) ； 6.95(s， br， 1H) ； 3.78(s， br， 1H) ； 3.60-3.50(m， 6H) ； 2.82(s， br， 4H) ； 2.18(s， br， 1H) ； 2.03(s， br， 1H) ； 1.55(s， br， 1H) ； 1.10(t， 6H) ； 1.05(d， 3H)。
     实施例 3 ： (R)-2- 苄基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 二乙基氨基 -4， 5- 二 氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
    
    向咪唑 -1- 甲酸 (8- 二乙基氨基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰 胺 ( 中间体 C， 50mg， 0.135mmol) 在 DMF(1ml) 中混合物加入 (R)-2- 苄基 - 吡咯烷 -2- 甲酸 酰胺 ( 中间体 E， 33.2mg， 0.162mmol) 和三乙胺 (0.057mL， 0.406mmol)。将 RM 在 40℃搅拌 21h， 然后用制备型 HPLC( 方法 B) 直接纯化。 将含产物的馏分通过 300mg Bond Elut-SCX 柱
     洗脱。然后将柱用在 MeOH 中的 7M 氨溶液洗脱， 蒸发， 得到为黄色固体的标题化合物。MS ： M+H ＝ 506.1.HPLC ： tR 4.38min( 方法 D)。
     实施例 4 ： (S)-2- 甲基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 二乙基氨基 -4， 5- 二 氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
    向咪唑 -1- 甲酸 (8- 二乙基氨基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰 胺 ( 中间体 C， 75mg， 0.203mmol) 在 DMF(2ml) 中的混合物加入 (S)-2- 甲基 - 吡咯烷 -2- 甲 酸酰胺 ( 中间体 F， 39mg， 0.305mmol) 和三乙胺 (0.085mL， 0.609mmol)。将 RM 在 40℃搅拌 17h， 然后用制备型 HPLC( 方法 B) 直接纯化。将含产物的馏分滤过 300mg Bond Elut-SCX 柱。然后将柱用在 MeOH 中的 7M 氨溶液洗脱， 蒸发， 得到为黄色固体的标题化合物。MS ： M+H ＝ 430.2.HPLC ： tR 3.80min( 方法 D)。
    
    
    实施例 5 ： (R)-2- 甲氧基甲基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 二乙基氨 基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
    将咪唑 -1- 甲酸 (8- 二乙基氨基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰 胺 ( 中间体 C， 75mg， 0.203mmol)、 (R)-2- 甲氧基甲基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺 ( 中间体 G， 35.3mg， 0.223mmol) 和三乙胺 (0.085mL， 0.609mmol) 在 DMF(2ml) 中的混合物在 40℃搅拌 6h。冷却至室温后， 将 RM 溶解于 MeOH(1ml) 中， 通过制备型 HPLC( 方法 B) 直接纯化。将含 产物的馏分通过 300mg Bond Elut-SCX 柱洗脱。然后将柱用在 MeOH 中的 7M 氨溶液洗脱， 蒸发， 得到为黄色固体的标题产物。MS ： M+H ＝ 460.1.HPLC ： tR 3.94min( 方法 D)。 实施例 6 ： (R)-2- 二甲基氨基甲基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 叔丁 基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
    
    在 室 温、 将 咪 唑 -1- 甲 酸 (8- 叔 丁 基 -4， 5- 二 氢 - 噻 唑 并 [4， 5-h] 喹 唑 啉 -2- 基 )- 酰 胺 ( 中 间 体 A， 132mg， 0.372mmol) 加 至 (R)-2- 二 甲 基 氨 基 甲 基 - 吡 咯
     烷 -2- 甲酸酰胺 ( 中间体 H， 70mg， 0.409mmol) 和三乙胺 (0.155mL， 1.115mmol) 在 DMF(1ml) 中的混合物。18 小时后， 加入 MeOH(0.5ml)。将 RM 滤过 PTFE 滤膜， 通过制备型 HPLC( 方法 B) 纯化。 将含产物的馏分合并， 蒸发以去除 CH3CN， 然后通过加入固体 NaHCO3 碱化， 得到黄白 色沉淀。冷却至 4℃后， 过滤重新收集固体， 然后通过制备型 HPLC( 方法 C) 进一步纯化。将 含产物的馏分通过 300mg Bond Elut-SCX 柱洗脱。 然后将柱用在 MeOH 中的 7M 氨溶液洗脱， 蒸发， 得到为黄色无定形玻璃状物的标题产物。 LCMS ： tR 0.98min 且 M+H ＝ 458.1( 方法 A3)。 1 H-NMR(CD3OD， 400MHz) ： 8.28(s， 1H) ； 3.92-3.82(m， 1H) ； 3.67-3.44(m， 2H) ； 3.04-2.88(m， 4H) ； 2.85-2.71(m， 1H) ； 2.56(s， br， 6H) ； 2.29-2.19(m， 1H) ； 2.08-1.87(m， 3H) ； 1.37(s， 9H)。
     实施例 7 ： d6-(R)-2- 二甲基氨基甲基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 叔丁 基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
    在氩气气氛下、 将咪唑 -1- 甲酸 (8- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑 啉 -2- 基 )- 酰 胺 ( 中 间 体 A， 91mg， 0.256mmol) 和 三 乙 胺 (0.036mL， 0.256mmol) 加 至 悬 浮于 DMF(2ml) 中的 d6-(R)-2- 二甲基氨基甲基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺 ( 中间体 I， 50mg， 0.282mmol)。然后将 RM 在 40℃搅拌 2.75h， 然后通过制备型 HPLC 直接纯化两次 ( 方法 B， 然后方法 C)。每次， 将含产物的馏分合并， 通过 300mg Bond Elut-SCX 柱洗脱。然后将柱用 在 MeOH 中的 7M 氨溶液洗脱， 蒸发， 得到黄色固体。将固体悬浮于 DCM 中， 过滤， 真空干燥， 得到为黄色固体的标题化合物。LCMS ： tR 1.21min 且 M+H ＝ 464.0( 方法 A1)。
     实施例 8 ： (R)-2- 羟基甲基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 二乙基氨基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
    
    在 室 温、 将 咪 唑 -1- 甲 酸 (8- 二 乙 基 氨 基 -4， 5- 二 氢 - 噻 唑 并 [4， 5-h] 喹 唑 啉 -2- 基 )- 酰胺 ( 中间体 C， 50mg， 0.135mmol) 加至 (R)-2- 羟基甲基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰 胺 ( 中间体 J， 25.4mg， 0.176mmol) 和三乙胺 (0.047mL， 0.338mmol) 在 DMF(1ml) 中的混合 物。在室温 18h 后， 将 RM 通过 PTFE 膜过滤， 通过制备型 HPLC( 方法 B) 纯化。将含产物的
     馏分合并， 滤过 Bond Elut-SCX 柱。将柱用在 MeOH 中的 7M 氨溶液洗脱， 蒸发， 得到橙色玻 璃状物， 其从 MeOH/ 水重结晶， 提供为黄色固体的标题化合物。LCMS ： tR 1.09min 且 M+H ＝ 446.0( 方法 A3)。
     实施例 9 ： (R)-2- 羟基甲基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 叔丁基 -4， 5- 二 氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
    将咪唑 -1- 甲酸 (8- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ( 中间体 A， 124mg， 0.350mmol) 加至 (R)-2- 羟基甲基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺 ( 中间体 J， 63mg， 0.350mmol) 和三乙胺 (0.049mL， 0.350mmol) 在 DMF(2ml) 中的混合物。将 RM 在 40℃ 搅拌 2h， 然后在室温静置 18h， 然后通过制备型 HPLC( 方法 B) 直接纯化。将含产物的馏分 通过 300mg Bond Elut-SCX 柱洗脱。然后将柱用在 MeOH 中的 7M 氨溶液洗脱， 蒸发， 得到黄 色固体。然后将分离的固体悬浮于 DCM 中， 过滤， 干燥， 得到为淡黄色 / 白色固体的标题化 合物。LCMS ： tR 1.31min 且 M+H ＝ 430.9( 方法 A1)。 实施例 10 ： (R)-2-{[(3- 氟 - 苄基 )- 甲基 - 氨基 ]- 甲基 }- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
    
    在氩气下、 于室温将咪唑 -1- 甲酸 (8- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑 啉 -2- 基 )- 酰胺 ( 中间体 A， 40.1mg， 0.113mmol) 和三乙胺 (0.047mL， 0.339mmol) 加至悬 浮于 DMF(1ml) 中的 (R)-2-{[(3- 氟 - 苄基 )- 甲基 - 氨基 ]- 甲基 }- 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺 ( 中间体 K， 30mg， 0.113mmol)。将 RM 在 40℃搅拌 2.5h， 然后通过制备型 HPLC( 方法 C) 直 接纯化。将含产物的馏分通过 Bond Elut-SCX， 300mg 柱洗脱。然后将柱用在 MeOH 中的 7M 氨溶液洗脱， 蒸发， 得到黄色固体。将固体用 DCM 研磨， 过滤， 干燥， 得到为淡黄色固体的标 题化合物。LCMS ： tR 0.81min 且 M+H ＝ 552.3( 方法 A2)。
     实施例 11 ： (S)-2- 甲基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 叔丁基 -4， 5- 二 氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
    
    在氩气下、 于室温将 (S)-2- 甲基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺 ( 中间体 F， 22.14mg， 0.169mmol) 和三乙胺 (0.035mL， 0.254mmol) 加至在 DMF(1ml) 中的咪唑 -1- 甲酸 (8- 叔丁 基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ( 中间体 A， 30mg， 0.085mmol)。在 室温搅拌 16h 后， 将 RM 通过制备型 HPLC( 方法 B) 直接纯化。将含产物的馏分通过 300mg Bond Elut-SCX 柱洗脱。然后将柱用在 MeOH 中的 7M 氨溶液洗脱， 蒸发， 得到为黄色结晶固 体的标题化合物。MS ： M+H ＝ 415.1.HPLC ： tR 3.73min( 方法 D)。
     实施例 12 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 二乙基氨基 -4， 5- 二氢 - 噻 唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
    
    在 氩 气 下、 于 室 温 将 (S)- 吡 咯 烷 -2- 甲 酸 酰 胺 (148mg， 1.299mmol) 和 三 乙 胺 (0.272mL， 1.949mmol) 加至在 DMF(1ml) 中的咪唑 -1- 甲酸 (8- 二乙基氨基 -4， 5- 二氢 - 噻 唑 并 [4， 5-h] 喹 唑 啉 -2- 基 )- 酰 胺 ( 中 间 体 C， 240mg， 0.65mmol)。 将 RM 在 室 温 搅 拌 15.5h， 然后用制备型 HPLC( 方法 C) 纯化。将含产物的馏分合并， 滤过 Bond Elut-SCX 柱。 然后将柱用在 MeOH 中的 7M 氨溶液洗脱， 蒸发， 得到为橙色晶体的标题化合物。MS ： M+H ＝ 416.1.HPLC ： tR 3.56min( 方法 D)。
     实施例 13 ： (S)- 氮杂环丁烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 二乙基氨基 -4， 5- 二 氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
    
    将 (S)- 氮杂环丁烷 -2- 甲酸酰胺 ( 中间体 L， 26.4mg， 0.264mmol)、 咪唑 -1- 甲 酸 (8- 二乙基氨基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ( 中间体 C， 75mg， 0.203mmol) 和三乙胺 (0.085mL， 0.609mmol) 在 DMF(2ml) 中的混合物在 40℃搅拌 2h。然后 将 RM 通过制备型 HPLC( 方法 B) 直接纯化。将含产物的馏分通过 300mg Bond Elut-SCX 柱 洗脱。然后将柱用在 MeOH 中的 7M 氨溶液洗脱， 蒸发， 得到为白色结晶固体的标题化合物。 MS ： M+H ＝ 402.1.HPLC ： tR 3.56min( 方法 D)。
     实施例 14 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并
     [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
    于室温、 将 (S)- 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺 (16mg， 0.14mmol) 加至咪唑 -1- 甲酸 (8- 叔 丁基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ( 中间体 A， 45mg， 0.127mmol) 和三 乙胺 (0.053mL， 0.381mmol) 在 DMF(1ml) 中的混合物。将 RM 在室温静置过夜， 然后蒸发， 将 1 残余物从 MeOH 和水结晶。 过滤收集标题化合物。 MS ： M+H ＝ 401.1(MS-ESI)。 H-NMR(CD3OD， 400MHz) ： 8.31(s， 1H)， 4.46(d， 1H)， 3.77-3.54(m， 2H)， 3.08-2.90(m， 4H)， 2.33-2.23(m， 1H)， 2.13-2.00(m， 3H)， 1.38(s， 9H))。
     实施例 15 ： 5- 甲基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 二乙基氨基 -4， 5- 二 氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
    
    向咪唑 -1- 甲酸 (8- 二乙基氨基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰 胺 ( 中间体 C， 75mg， 0.203mmol) 在 DMF(2ml) 中的悬液加入 5- 甲基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰 胺 ( 如 Arch.Pharm.， 1936， 274， 40 中 所 述 制 备 ； 39mg， 0.305mmol) 和 三 乙 胺 (0.085mL， 0.609mmol)。将 RM 在 40℃搅拌 2.5h， 然后通过制备型 HPLC( 方法 B) 直接纯化。将含产物 的馏分通过 Bond Elut-SCX 柱洗脱。然后将柱用在 MeOH 中的 7M 氨溶液洗脱， 蒸发， 将残 余物用 DCM 研磨， 得到为黄色固体的标题化合物。LCMS ： tR 0.77min 且 M+H ＝ 430.0( 方法 A2)。
     实施例 16 ： (2S， 4R)-4- 氟 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 二乙基氨基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
    
    向在 DCM(2ml) 中的咪唑 -1- 甲酸 (8- 二乙基氨基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ( 中间体 C， 75mg， 0.203mmol) 加入 (2S， 4R)-4- 氟 - 吡咯烷 -2- 甲酸 酰胺 ( 中间体 M， 40.2mg， 0.305mmol) 和三乙胺 (0.085mL， 0.609mmol)。将 RM 在 40℃搅拌 17.5h， 然后通过制备型 HPLC( 方法 B) 直接纯化。 将含产物的馏分通过 Bond Elut-SCX 柱洗 脱。然后将柱用在 MeOH 中的 7M 氨溶液洗脱， 蒸发， 得到为黄色固体的标题化合物。HPLC ：
     tR 3.66min( 方法 D)。MS ： M+H ＝ 434.1。
     实施例 17 ： (2S， 4S)-4- 氟 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 二乙基氨基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
    向在 DMF(0.4ml) 中的咪唑 -1- 甲酸 (8- 二乙基氨基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ( 中间体 C， 17mg， 0.046mmol) 加入 (2S， 4S)-4- 氟 - 吡咯烷 -2- 甲酸 酰胺 ( 中间体 N， 6.08mg， 0.046mmol) 和三乙胺 (0.019mL， 0.138mmol)。将 RM 在 40℃搅拌 17h， 然后通过制备型 HPLC( 方法 B) 直接纯化。将含产物的馏分通过 Bond Elut-SCX 柱洗 脱。然后将柱用在 MeOH 中的 7M 氨溶液洗脱， 蒸发， 得到为黄色固体的标题化合物。HPLC ： tR3.55min( 方法 D)。MS ： M+H ＝ 434.1。
     实施例 18 ： (1S， 5R)-2- 氮杂 - 二环 [3.1.0] 己烷 -1， 2- 二甲酸 1- 酰胺 2-[(8- 叔 丁基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
    
    在 室 温、 将 (1S， 5R)-2- 氮 杂 - 二 环 [3.1.0] 己 烷 -1- 甲 酸 酰 胺 ( 中 间 体 O， 208mg， 1.65mmol) 加至搅拌的咪唑 -1- 甲酸 (8- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑 啉 -2- 基 )- 酰胺 ( 中间体 A， 532mg， 1.5mmol) 和三乙胺 (0.627mL， 4.50mmol) 在 DMF(4ml) 中的混合物。 56 和 80 小时后， 加入 (1S， 5R)-2- 氮杂 - 二环 [3.1.0] 己烷 -1- 甲酸酰胺 ( 中 间体 O， 104mg， 0.825mmol) 的另外部分， 将 RM 在室温静置 18h。然后将 RM 通过 PTFE 膜过 滤， 通过制备型 HPLC( 方法 B) 纯化。将含产物的馏分通过 Bond Elut-SCX 柱洗脱。然后将 柱用在 MeOH 中的 7M 氨溶液洗脱， 蒸发。 通过制备型 HPLC( 方法 B) 再次纯化残余物， 以相同 方法分离。然后将粗产物从水 /MeOH 的 1 ∶ 1 混合物重结晶， 得到为黄色结晶固体的标题 1 化合物。LCMS ： tR 1.22min 且 M+H ＝ 413.1( 方法 A3)。 H-NMR(d6-DMSO， 400MHz) ： 11.22(s，
    1H)， 8.40(s， 1H) ； 7.33(s， br， 1H) ； 7.05(s， br， 1H) ； 3.97-3.84(m， 1H) ； 3.64-3.52(m， 1H) ； 3.01-2.83(m， 4H) ； 2.28-2.13(m， 1H) ； 1.95-1.74(m， 3H) ； 1.33(s， 9H) ； 1.04-0.97(m， 1H))。
     实施例 19 ： (1S， 5R)-2- 氮杂 - 二环 [3.1.0] 己烷 -1， 2- 二甲酸 1- 酰胺 2-[(8- 二 乙基氨基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
    向在 DCM(2ml) 中的咪唑 -1- 甲酸 (8- 二乙基氨基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ( 中间体 C， 75mg， 0.203mmol) 加入 (1S， 5R)-2- 氮杂 - 二环 [3.1.0] 己烷 -1- 甲酸酰胺 ( 中间体 O， 38.4mg， 0.305mmol) 和三乙胺 (0.085mL， 0.609mmol)。将 RM 在 40℃搅拌 17.5h， 然后通过制备型 HPLC( 方法 B) 直接纯化。将含产物的馏分通过 Bond Elut-SCX 柱洗脱。 然后将柱用在 MeOH 中的 7M 氨溶液洗脱， 蒸发， 得到为黄色固体的标题化 合物。HPLC ： tR 3.73min( 方法 D)。MS ： M+H ＝ 428.1。
     实施例 20 ： (2S， 3R)-3- 甲基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
    
    向在 DMF(1ml) 中的咪唑 -1- 甲酸 (8- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑 啉 -2- 基 )- 酰胺 ( 中间体 A， 60mg， 0.169mmol) 加入 (2S， 3R)-3- 甲基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰 胺 ( 中间体 P， 32.5mg， 0.254mmol) 和三乙胺 (0.071mL， 0.508mmol)。在氩气下将 RM 于室温 搅拌 2h， 然后通过制备型 HPLC( 方法 B) 直接纯化。 将 CH3CN 从含产物的馏分蒸发， 然后将剩 余的液体通过 Bond Elut-SCX 柱洗脱。 然后将柱用在 MeOH 中的 7M 氨溶液洗脱， 蒸发。 将残 余物在甲醇中研磨， 过滤和干燥后， 收集为白色晶体的标题化合物。 HPLC ： tR 3.66( 方法 D)。 1 MS ： M+H ＝ 415.1. H-NMR(CD3OD， 600MHz) ： 7.96(s， 1H)， 4.04(d， 1H)， 3.47(t， 1H)， 3.18(q， 1H)， 2.71-2.67(m， 2H)， 2.64-2.58(m， 2H)， 2.24-2.15(m， 1H)， 1.76(s， br， 1H)， 1.53(s， br， 1H)， 1.03(s， 9H)， 0.78(d， 3H)。
     实施例 21 ： (2S， 3R)-3- 甲基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 二乙基氨基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
    
    在氩气下、 向在 DMF(1.5ml) 中的咪唑 -1- 甲酸 (8- 二乙基氨基 -4， 5- 二氢 - 噻唑 并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ( 中间体 C， 82mg， 0.222mmol) 加入 (2S， 3R)-3- 甲基 - 吡 咯烷 -2- 甲酸酰胺 ( 中间体 P， 42.7mg， 0.333mmol) 和三乙胺 (0.093mL， 0.666mmol)。将 RM 在室温搅拌 2h， 然后通过制备型 HPLC( 方法 B) 直接纯化。将 CH3CN 在真空下从含产物的馏 分除去， 然后将剩余的溶液通过 Bond Elut-SCX 柱洗脱。然后将柱用在 MeOH 中的 7M 氨溶
     液洗脱， 蒸发， 将残余物用甲醇研磨， 得到为白色结晶固体的标题化合物。 HPLC ： tR 3.74( 方 1 法 D)。MS ： M+H ＝ 430.1. H-NMR(CD3OD， 600MHz) ： 7.62(s， 1H)， 4.03(d， 1H)， 3.46(t， 1H)， 3.26(q， 4H)， 3.17(q， 1H)， 2.54(s， 4H)， 2.24-2.15(m， 1H)， 1.80-1.72(m， 1H)， 1.58-1.47(m， 1H)， 0.83(t， 6H)， 0.77(d， 3H)。
     实施例 22 ： (2S， 4S)-4- 二甲基氨基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 二乙基 氨基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
    向 在 DMF(1.5ml) 中 的 咪 唑 -1- 甲 酸 (8- 二 乙 基 氨 基 -4， 5- 二 氢 - 噻 唑 并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ( 中间体 C， 60mg， 0.162mmol) 加入 (2S， 4S)-4- 二甲基氨基 - 吡 咯烷 -2- 甲酸酰胺 ( 中间体 Q， 28.1mg， 0.179mmol) 和三乙胺 (0.068mL， 0.487mmol)。将 RM 在 40℃搅拌 17h， 然后通过制备型 HPLC( 方法 B) 直接纯化。将含产物的馏分通过 Bond Elut-SCX 柱。 然后将柱用在 MeOH 中的 7M 氨溶液洗脱。 将溶液蒸发， 得到标题化合物。 HPLC ： M+H ＝ 459.1。 tR3.23min( 方法 D)。MS ：
     实施例 23 ： 5- 苯基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 二乙基氨基 -4， 5- 二 氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
    
    向咪唑 -1- 甲酸 (8- 二乙基氨基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰 胺 ( 中间体 C， 65mg， 0.176mmol) 在 DMF(2ml) 中的悬液加入 5- 苯基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰 胺 ( 如 US 专 利 3164597 实 施 例 42 所 述 制 备， 50.2mg， 0.264mmol) 和 三 乙 胺 (0.074mL， 0.528mmol)。将 RM 在 40℃搅拌 2h， 然后通过制备型 HPLC( 方法 B) 直接纯化。将含产物的 馏分通过 Bond Elut-SCX 柱。然后将柱用在 MeOH 中的 7M 氨溶液洗脱。将溶液蒸发， 将残 余物在 DCM 中研磨， 得到为黄色固体的标题化合物。LCMS ： tR 0.99min 且 M+H ＝ 492.0( 方
    法 A2)。
    
    实施例 24 ： 氮杂环丁烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]向咪唑 -1- 甲酸 (8- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ( 中 间体 A， 100mg， 0.282mmol) 在 DMF(2ml) 中的溶液加入氮杂环丁烷 -2- 甲酸酰胺 (56.5mg， 0.564mmol) 和三乙胺 (0.118mL， 0.846mmol)。将 RM 在氩气气氛下于室温搅拌 16h， 然后通 过制备型 HPLC( 方法 B) 直接纯化。将含产物的馏分通过 Bond Elut-SCX 柱。然后将柱用 在 MeOH 中的 7M 氨溶液洗脱。将溶液蒸发， 将残余物通过硅胶快速层析法纯化， 用含 0.5％ 880 HN3 的 DCM/MeOH 95 ∶ 5 洗脱， 得到为黄色固体的标题化合物。HPLC ： tR 3.55min( 方法 D)。MS ： M+H ＝ 387.1。
     实施例 25 ： (S)- 氮杂环丁烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 噻 唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
    
    在室温、 将 (S)- 氮杂环丁烷 -2- 甲酸酰胺 ( 中间体 L， 68.1mg， 0.680mmol) 加至 搅拌的咪唑 -1- 甲酸 (8- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ( 中 间体 A， 241mg， 0.680mmol) 和三乙胺 (0.284mL， 2.040mmol) 在 DMF(3ml) 中的混合物。将 RM 在室温静置 66h， 然后通过制备型 HPLC( 方法 B) 直接纯化。将含产物的馏分蒸发， 除去 CH3CN， 然后用 NaHCO3 碱化。然后将水相用 10％ MeOH 的 DCM 溶液萃取 4X， 将合并的有机层 经 Na2SO4 干燥， 蒸发得到固体， 将该固体用 MeOH/ 水研磨， 得到为灰白色结晶固体的标题化 合物。LCMS ： tR 1.08min 且 M+H ＝ 386.9( 方法 A3)。
     实施例 26 ： (2S， 4S)-4- 羟基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 二乙基氨基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
    
    向咪唑 -1- 甲酸 (8- 二乙基氨基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰 胺 ( 中间体 C， 75mg， 0.203mmol) 在 DMF(2ml) 中的悬液加入 (2S， 4S)-4- 羟基 - 吡咯烷 -2- 甲 酸酰胺 ( 中间体 R， 39.6mg， 0.305mmol) 和三乙胺 (0.113mL， 0.812mmol)。将 RM 在 40℃搅 拌 2.5h， 然后通过制备型 HPLC( 方法 B) 直接纯化。将含产物的馏分通过 Bond Elut-SCX 柱。然后将柱用在 MeOH 中的 7M 氨溶液洗脱。将溶液蒸发， 得到为黄色固体的标题化合物。HPLC ： tR 3.44min( 方法 D)。MS ： M+H ＝ 432.1。
     实施例 27 ： (2S， 4R)-4- 羟基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 二乙基氨基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
    向咪唑 -1- 甲酸 (8- 二乙基氨基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰 胺 ( 中间体 C， 75mg， 0.203mmol) 在 DMF(2ml) 中的悬液加入 (2S， 4R)-4- 羟基 - 吡咯烷 -2- 甲 酸酰胺 ( 中间体 S， 39.6mg， 0.305mmol) 和三乙胺 (0.113mL， 0.812mmol)。 将 RM 在 40℃搅拌 4.5h， 然后通过制备型 HPLC( 方法 B) 直接纯化。将含产物的馏分通过 Bond Elut-SCX 柱。 然后将柱用在 MeOH 中的 7M 氨溶液洗脱。将溶液蒸发， 将残余物从 DCM 重结晶， 得到为黄色 固体的标题化合物。HPLC ： tR 3.31min( 方法 D)。MS ： M+H ＝ 432.1。
     实施例 28 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(7- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 苯并 [1， 2-d ； 3， 4-d′ ] 双噻唑 -2- 基 )- 酰胺 ]
    
    将 L- 脯 氨 酰 胺 (59.4mg， 0.521mmol) 和 TEA(0.121mL， 0.868mmol) 加 至 在 DMF(1ml) 中 的 咪 唑 -1- 甲 酸 (7- 叔 丁 基 -4， 5- 二 氢 - 苯 并 [1， 2-d ； 3， 4-d ′ ] 双 噻 唑 -2- 基 )- 酰胺 ( 中间体 T， 156mg， 0.434mmol)。将 RM 在室温搅拌 10min。将混合物用 EtOAc/H2O 萃取。将有机层经 Na2SO4 干燥， 蒸发。用 MPLCC18H2O 0.1 ％ TFA/CH3CN 0.1 ％ TFA( 梯度 0-50 ％ ) 对粗物质层析。将含产物的馏分用 NaHCO3 中和， 用 EtOAc 萃取， 从 二 噁 烷 冻 干， 得 到 为 白 色 固 体 的 标 题 化 合 物 (M+H ＝ 406 ； M-H ＝ 404 ； tR 4.75min( 方 1 法 F) 。 H-NMR(d 6-DMSO ， 600.13MHz)10.80(s ， 1H)7.40(s ， 1H) ， 6.98(s ， 1H) ， 4.30(s ， 1H)3.65-3.55(m 1H)， 3.48-3.38(m， 1H)， 3.10(t， 2H)， 2.94(t， 2H)， 2.14-2.05(m， 1H)， 1.95-1.78(m， 3H)， 1.40(s， 9H))。
     实施例 29 ： (S)-2- 甲基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(7- 叔丁基 -4， 5- 二 氢 - 苯并 [1， 2-d ； 3， 4-d′ ] 双噻唑 -2- 基 )- 酰胺 ]
    
    将 (S)-2- 甲 基 - 吡 咯 烷 -2- 甲 酸 酰 胺 ( 中 间 体 F， 7.7mg， 0.060mmol) 和 TEA(0.014mL， 0.100mmol) 加至在 DMF(3ml) 中的咪唑 -1- 甲酸 (7- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 苯并 [1， 2-d ； 3， 4-d′ ] 双噻唑 -2- 基 )- 酰胺 ( 中间体 T， 18mg， 0.050mmol)。将 RM 在室温搅拌 10min。 然后用 EtOAc/H2O 萃取。 将有机层经 Na2SO4 干燥， 蒸发。 用 MPLC C18H2O 0.1％ TFA/ CH3CN 0.1％ TFA( 梯度 0-50％ ) 对粗物质层析。 将含产物的馏分用 NaHCO3 中和， 用 EtOAc 萃 取， 从二噁烷冻干， 得到为白色固体的标题化合物 (M+H ＝ 420 ； M-H ＝ 418 ； tR 4.875min( 方 1 法 F)。 H-NMR(d6-DMSO， 600.13MHz)10.60(s， br， 1H)7.68(s， 1H)， 6.86(s， 1H)， 3.68-3.60(m 1H)， 3.60-3.50(m 1H)， 3.08(t， 2H)， 2.90(t， 2H)， 2.10-1.98(m， 1H)， 1.90-1.68(m， 3H)， 1.48(s， 3H)， 1.37(s， 9H))。
     实施例 30 ： (S)- 氮杂环丁烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(7- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 苯 并 [1， 2-d ； 3， 4-d′ ] 双噻唑 -2- 基 )- 酰胺 ]
    将 (S)- 氮杂环丁烷 -2- 甲酸酰胺 ( 中间体 L， 37.1mg， 0.370mmol) 和 TEA(0.14mL， 1.010mmol) 加至在 DMF(2ml) 中的咪唑 -1- 甲酸 (7- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 苯并 [1， 2-d ； 3， 4-d′ ] 双噻唑 -2- 基 )- 酰胺 ( 中间体 T， 121mg， 0.337mmol)。将 RM 搅拌 5min， 然后在室 温静置 2 天。过滤 RM， 通过制备型 HPLC( 方法 E) 直接纯化。将含产物的馏分合并， 滤过 BondElute-SCX， 300mg 柱。 然后将柱用在 MeOH 中的 7M 氨溶液 (2ml) 洗涤。 蒸发滤液， 得到为 1 白色固体的标题化合物 (M+H ＝ 391.8 ； M-H ＝ 389.8 ； tR1.84min( 方法 A3)。H-NMR(d6-DMSO， 400MHz)11.12(s， 1H)7.52(s， 1H)， 7.30(s， 1H)， 4.74-4.62(m， 1H)， 3.92(t， 2H)， 3.08(t， 2H)， 2.90(t， 2H)， 2.46-2.36(m， 1H)， 2.18-2.02(m， 1H)， 1.39(s， 9H))。
     实施例 31 ： (2S， 4R)-4- 二甲基氨基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(7- 叔丁 基 -4， 5- 二氢 - 苯并 [1， 2-d ； 3， 4-d′ ] 双噻唑 -2- 基 )- 酰胺 ]
    
    将 (2S， 4R)-4- 二甲基氨基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺 ( 中间体 B， 9.33mg， 0.059mmol) 和 TEA(0.019mL， 0.135mmol) 加 至 在 DMF(1ml) 中 的 咪 唑 -1- 甲 酸 (7- 叔 丁 基 -4， 5- 二 氢 - 苯并 [1， 2-d ； 3， 4-d′ ] 双噻唑 -2- 基 )- 酰胺 ( 中间体 T， 19.4mg， 0.054mmol)。将 RM 搅拌 5min， 然后在室温静置过夜。将 RM 过滤， 通过制备型 HPLC( 方法 E) 直接纯化。将含 产物的馏分合并， 滤过 Bond Elute-SCX， 300mg 柱。然后将柱用在 MeOH 中的 7M 氨溶液洗 涤。蒸发滤液， 得到为白色固体的标题化合物 (M+H ＝ 449.1 ； M-H ＝ 447.3 ； tR1.47min( 方
     法 A3)。1H-NMR(d6-DMSO， 400MHz)7.40(s， 1H)， 7.00(s， 1H)， 4.44-4.25(m， 1H)， 3.86-3.76(m 1H) ， 3.35-3.25(m 1H) ， 3.08(t ， 2H) ， 2.92(t ， 2H) ， 2.96-2.78(m ， 1H) ， 1.18(s ， br ， 6H) ， 2.08-1.85(m， 2H)， 1.38(s， 9H))。
     实施例 32 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-{[7-(2- 氟 -1， 1- 二甲基 - 乙 基 )-4， 5- 二氢 - 苯并 [1， 2-d ； 3， 4-d′ ] 双噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
    将 L- 脯 氨 酰 胺 (23.98mg， 0.210mmol) 和 TEA(0.080mL， 0.573mmol) 加 至 在 DMF(1ml) 中 的 咪 唑 -1- 甲 酸 [7-(2- 氟 -1， 1- 二 甲 基 - 乙 基 )-4， 5- 二 氢 - 苯 并 [1， 2-d ； 3， 4-d ′ ] 双噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 ( 中间体 U， 72.1mg， 0.191mmol)。将 RM 搅拌 5min， 然后在室温静置过夜。蒸发 RM， 然后用 MeOH(2ml) 和 H2O(1ml) 研磨。将混合物冷却至 将固体于 40 ℃在 HV 下干燥， 得到为白色 4 ℃。过滤悬液， 用冷 MeOH/H2O ＝ 2 ∶ 1 洗涤， 1 固体的标题化合物 (M+H ＝ 424.0 ； M-H ＝ 422.1 ； tR 1.7min( 方法 A3)。 H-NMR(d6-DMSO， 400MHz)7.19(s， 1H)， 6.96(s， 1H)， 4.58(s， 1H)4.44(s， 1H)， 4.28(s， br， 1H)3.64-3.50(m 1H)， 3.48-3.38(m 1H)， 3.10(t， 2H)， 2.92(t， 2H)， 2.18-1.98(m， 1H)， 1.94-1.78(m， 3H)， 19 1.38(s， 6H) F-NMR(d6-DMSO， 600.13MHz)219ppm(t， 1F))。
     实施例 33 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(7- 环丙基甲基 -4， 5- 二氢 - 苯 并 [1， 2-d ； 3， 4-d′ ] 双噻唑 -2- 基 )- 酰胺 ]
    
    将 L- 脯 氨 酰 胺 (16.7mg， 0.147mmol) 和 TEA(0.027mL， 0.196mmol) 加 至 在 DMF(1.5ml) 中的咪唑 -1- 甲酸 (7- 环丙基甲基 -4， 5- 二氢 - 苯并 [1， 2- ； 3， 4-d ′ ] 双噻 唑 -2- 基 )- 酰胺 ( 中间体 V， 35mg， 0.098mmol)。 将 RM 在室温搅拌 15min， 然后用 EtOAc/H2O 萃取。将有机层经 Na2SO4 干燥， 蒸发。用 MPLC C18H2O 0.1％ TFA/CH3CN 0.1％ TFA( 梯度 0-50％ ) 对粗物质层析。 将含产物的馏分用 NaHCO3 中和， 用 EtOAc 萃取， 从二噁烷冻干， 得到 1 为白色固体的标题化合物 (M+H ＝ 404 ； M-H ＝ 402 ； tR 4.49min( 方法 F)。 H-NMR(d6-DMSO， 600.13MHz)10.78(s ， 1H)7.40(s ， 1H) ， 6.98(s ， 1H) ， 4.28(s ， br ， 1H)3.65-3.55(m ， 1H) ， 3.48-3.38(m， 1H)， 3.08(t， 2H)， 2.97(t， 2H)， 2.84(d， 2H)， 2.14-2.04(m， 1H)， 1.93-1.72(m， 3H)， 1.10(q， 1H)， 0.60-0.50(m， 2H)， 0.40-0.38(m， 2H))。
     实施例 34 ： (2S， 3S)-3- 甲基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(7- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 苯并 [1， 2-d ； 3， 4-d′ ] 双噻唑 -2- 基 )- 酰胺 ]
     将 (2S， 3S)-3- 甲基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺 ( 中间体 D， 13.37mg， 0.104mmol) 和 TEA(0.039mL， 0.278mmol) 加至在 DMF(2ml) 中的咪唑 -1- 甲酸 (7- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 苯 并 [1， 2-d ； 3， 4-d ′ ] 双 噻 唑 -2- 基 )- 酰 胺 ( 中 间 体 T， 25mg， 0.070mmol)。 将 RM 在 室 温搅拌 10min， 然后用 EtOAc/H2O 萃取。将有机层经 Na2SO4 干燥， 蒸发。将粗物质不经进 一步纯化从二噁烷冻干， 得到为白色固体的标题化合物 (M+H ＝ 420.1 ； M-H ＝ 418.1 ； tR 1 4.85min( 方 法 F)。 H-NMR(d6-DMSO， 600.13MHz)10.78(s， br， 1H)7.44(s， br， 1H)， 6.97(s， br， 1H)， 3.90-3.70(m， 1H)3.62-3.42(m， 2H)， 3.08(t， 2H)， 2.94(t， 2H)， 2.22-2.12(m， 1H)， 2.06-1.94(m， 1H)， 1.58-1.48(m， 1H)， 1.39(s， 9H)， 1.04(d， 3H))。
     实施例 35 ： (1S， 5R)-2- 氮杂 - 二环 [3.1.0] 己烷 -1， 2- 二甲酸 1- 酰胺 2-[(7- 叔 丁基 -4， 5- 二氢 - 苯并 [1， 2-d ； 3， 4-d′ ] 双噻唑 -2- 基 )- 酰胺 ]
    
    使用中间体 O 替代中间体 D， 以与实施例 34 所述类似的方法合成标题化合物。
     (M+H ＝ 418.0 ； M-H ＝ 416.1 ； t R 4.90min( 方 法 F) 。 1H-NMR(d 6-DMSO ， 600.13MHz)10.78(s ，br ， 1H)7.40(s ，br ， 1H) ， 7.06(s ，br ， 1H) ， 3.92-3.82(m ， 1H)3.62-3.52(m ， 1H) ， 3.08(t ， 2H) ， 2.94(t ， 2H) ， 2.26-2.14(m ， 1H) ， 1.92-1.72(m ， 3H) ， 1.39(s， 9H)， 1.05-0.95(m， 1H))。
     实 施 例 36 ： (2S， 3S)-3-( 乙 酰 基 氨 基 - 甲 基 )- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-[(8- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
    
    在室温、 将三乙胺 (0.339mmol) 加至咪唑 -1- 甲酸 (8- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 噻唑 并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ( 中间体 A)(0.113mmol) 和 (2S， 3S)-3-( 乙酰基氨基 - 甲 基 )- 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺 ( 阶段 36.1)(0.135mmol) 的溶液。搅拌 85min 后， 将反应混 合物浓缩。将残余物通过硅胶柱层析法纯化， 然后用 Et2O 研磨， 提供为黄色固体的标题化 合物。HPLC ： tR ＝ 4.20min( 方法 H) ； LCMS ： tR ＝ 1.48min， [M+H]+472( 方法 I) ； TLC ： Rf ＝1 0.14(9 ∶ 1CH2Cl2/MeOH) ； H-NMR(d6-DMSO， 600MHz) ： 11.15(br s， 1H)， 8.41(s， 1H)， 7.81(br s， 1H)， 7.53(br s， 1H)， 7.13(br s， 1H)， 4.28(m， 1H)， 3.74(m， 1H)， 3.40(m， 1H)， 3.25(m， 1H)， 2.98(m， 2H)， 2.93(m， 3H)， 2.42(m， 1H)， 2.02(m， 1H)， 1.82(s， 3H)， 1.74(m， 1H)， 1.33(s， 9H)。
     阶段 36.1 ： (2S， 3S)-3-( 乙酰基氨基 - 甲基 )- 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺
    将 (2S， 3S)-3-( 乙 酰 基 氨 基 - 甲 基 )-1-((S)-1- 苯 基 - 乙 基 )- 吡 咯 烷 -2- 甲 酸 酰 胺 ( 阶 段 36.2)(0.48mmol) 和 10 ％ 披 钯 炭 ( 用 50 ％ H2O 润 湿 )(Aldrich330108) (0.096mmol) 在 MeOH(5ml) 中 的 混 合 物 在 室 温 氢 化 6.5h。 然 后 将 反 应 混 合 物 滤 过 Fluoropore 滤膜 (0.2μm FG)， 蒸发。将残余物溶解于 CH2Cl2 中， 蒸发至干， 提供为灰白色 + 固体的标题化合物。ESI-MS ： [M+H] 186 ； TLC ： Rf ＝ 0.08(200 ∶ 20 ∶ 1CH2Cl2/MeOH/ 浓 NH4OH)。
     阶 段 36.2 ： (2S， 3S)-3-( 乙 酰 基 氨 基 - 甲 基 )-1-((S)-1- 苯 基 - 乙 基 )- 吡 咯 烷 -2- 甲酸酰胺
    
    在室温、 将硫代乙酸 (2.312mmol) 加至 (2S， 3S)-3- 叠氮基甲基 -1-((S)-1- 苯 基 - 乙基 )- 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺 ( 阶段 36.3)(0.578mmol)， 形成氮气。搅拌 16h 后， 将反 应混合物用 Et2O 稀释， 过滤除去固体， 浓缩滤液。将残余物通过硅胶柱层析法纯化， 提供 为浅黄色油状物的标题化合物 ( 硫醇气味 )。HPLC ： tR ＝ 3.71min( 方法 H) ； LC-MS ： tR ＝ + 0.64min， [M+H] 290( 方法 I) ； TLC ： Rf ＝ 0.38(200 ∶ 20 ∶ 1CH2Cl2/MeOH/ 浓 NH4OH)。
     阶段 36.3 ： (2S， 3S)-3- 叠氮基甲基 -1-((S)-1- 苯基 - 乙基 )- 吡咯烷 -2- 甲酸酰 胺
    
    在 0 ℃、 将在甲苯中三甲基铝 (2M， 15.95mmol) 滴加至 NH4Cl(15.95mmol) 在甲苯 (2ml) 中的混合物， 形成甲烷气体。将反应混合物升至室温， 另外搅拌 15min， 然后缓慢地 用 (2S， 3S)-3- 叠氮基甲基 -1-((S)-1- 苯基 - 乙基 )- 吡咯烷 -2- 甲酸甲酯 ( 阶段 36.4) (7.98mmol) 在甲苯 (8ml) 中的溶液处理。 18h 后加入由在甲苯 (2ml) 中的 NH4Cl(15.95mmol) 和在甲苯中的三甲基铝 (2M， 15.95mmol) 在 0 ℃制备的另外的试剂。搅拌 44h 后， 将混合
     物冷却至 0℃， 用 1M HCl 淬灭， 然后用 CH2Cl2(3X) 洗涤。将水相用 1 ∶ 1 的 NaHCO3 饱和溶 液 /Rochelle 盐饱和溶液碱化， 用 THF(10X) 萃取。将合并的有机层干燥 (Na2SO4)， 干燥， 浓缩。将残余物使用 RediSep 硅胶柱纯化， 提供为黄色油状物的标题化合物。HPLC ： tR ＝ 2.50min( 方法 G) ； ESI-MS ： [M+H]+ 274 ； TLC ： Rf ＝ 0.26(3 ∶ 1Hex/EtOAc)。
     阶段 36.4 ： (2S， 3S)-3- 叠氮基甲基 -1-((S)-1- 苯基 - 乙基 )- 吡咯烷 -2- 甲酸甲 酯
    在室温、 将叠氮化钠 (5.34mmol) 加至 (2S， 3R)-3- 碘甲基 -1-((S)-1- 苯基 - 乙 基 )- 吡咯烷 -2- 甲酸甲酯 ( 阶段 36.5)(3.56mmol) 在 DMF(30ml) 中的溶液。18h 后， 将反 应混合物倒入水中， 用 TBE(2X) 萃取。将合并的有机相用盐水洗涤， 干燥 (Na2SO4)， 过滤， 浓缩。将残余物使用 RediSep 硅胶柱纯化， 提供为褐色油状物的标题化合物。HPLC ： tR ＝
    3.26min( 方法 G) ； ESI-MS ： [M+H]+289。
     阶段 36.5 ： (2S， 3R)-3- 碘甲基 -1-((S)-1- 苯基 - 乙基 )- 吡咯烷 -2- 甲酸甲酯
    在 -78 ℃、将 [ 丁 -3- 烯 基 -((S)-1- 苯 基 - 乙 基 )- 氨 基 ]- 乙 酸 甲 酯 [432555-77-6](20.22mmol) 在 THF(10ml) 中的溶液缓慢加至二异丙基氨基锂 (24.26mmol) 在 1 ∶ 2 己烷 /THF(30ml) 中的溶液。将反应混合物升温至 0 ℃， 搅拌 1h， 然后再冷却 至 -78 ℃。加入溴化锌 (50.5mmol) 在 Et2O(40ml) 中的溶液， 然后将反应混合物升温至室 温。搅拌 1h 后， 将混合物冷却至 0℃， 分批加入碘 (22.24mmol)。将反应混合物在 0℃搅拌 2h， 在室温再搅拌 2h， 用 Et2O 稀释， 然后用 Na2S2O3 饱和溶液和 NH4Cl 饱和溶液连续洗涤。将 水层各自用 Et2O 反萃取。将合并的有机相干燥 (Na2SO4)， 过滤， 浓缩。将残余物通过硅胶 柱层析法纯化， 提供为红色油状物的标题化合物。HPLC ： tR ＝ 3.46min( 方法 G) ； ESI-MS ：
    [M+H]+374。
     实施例 37 ： (2S， 3S)-3- 吗啉 -4- 基甲基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 叔 丁基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
    在室温、 将三乙胺 (0.423mmol) 加至咪唑 -1- 甲酸 (8- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 噻 唑 并 [4， 5-h] 喹 唑 啉 -2- 基 )- 酰 胺 ( 中 间 体 A)(0.141mmol) 和 (2S， 3S)-3-( 乙 酰 基 氨 基 - 甲基 )- 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺 ( 阶段 37.1)(0.155mmol) 在 DMF(0.5ml) 中的溶液。搅 拌 3h 后， 浓缩反应混合物。将残余物通过硅胶柱层析法纯化， 提供为白色固体的标题化 合 物。HPLC ： tR ＝ 4.04min( 方 法 H) ； LCMS ： tR ＝ 1.36min， [M+H]+ 500( 方 法 I) ； TLC ： Rf 1 ＝ 0.09(19 ∶ 1CH2Cl2/MeOH) ； H-NMR(d6-DMSO， 600MHz) ： 11.15(br s， 1H)， 8.39(m， 1H)， 7.37(br s， 1H)， 7.05(s， 1H)， 4.27(m， 1H)， 3.70(m， 1H)， 3.59(m， 4H)， 3.42(m， 1H)， 2.97(m， 2H)， 2.90(m， 2H)， 2.58(m， 1H)， 2.38(m， 4H)， 2.35(m， 1H)， 2.17(m， 1H)， 2.02(m， 1H)， 1.75(m， 1H)， 1.32(s， 9H)。
     阶段 37.1 ： (2S， 3S)-3- 吗啉 -4- 基甲基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺
    将 (2S， 3S)-3- 吗 啉 -4- 基 甲 基 -1-((S)-1- 苯 基 - 乙 基 )- 吡 咯 烷 -2- 甲 酸 酰 胺 ( 阶 段 37.2)(1.046mmol) 和 10 ％ 披 钯 炭 ( 用 50 ％ H2O 润 湿 )(Aldrich 330108) (0.105mmol) 在 MeOH(5ml) 中 的 混 合 物 在 室 温 氢 化 6.5h。 然 后 将 反 应 混 合 物 滤 过 Fluoropore 滤膜 (0.2μm FG)， 蒸发。 将残余物溶解于 CH2Cl2， 蒸发至干， 提供为无色油状物 + 的标题化合物。ESI-MS ： [M+H] 214 ； TLC ： Rf ＝ 0.14(200 ∶ 20 ∶ 1CH2Cl2/MeOH/ 浓 NH4OH)。
     阶段 37.2 ： (2S， 3S)-3- 吗啉 -4- 基甲基 -1-((S)-1- 苯基 - 乙基 )- 吡咯烷 -2- 甲 酸酰胺
    
    在 0 ℃、 将在甲苯中的三甲基铝 (2M， 2.89mmol) 滴加至 NH4Cl(2.89mmol) 在甲苯 (3ml) 中的混合物， 形成甲烷气体。将反应混合物升温至室温， 再搅拌 15min， 然后缓慢地用 (2S， 3S)-3- 吗啉 -4- 基甲基 -1-((S)-1- 苯基 - 乙基 )- 吡咯烷 -2- 甲酸甲酯 ( 阶段 37.3) (1.444mmol) 在甲苯 (9ml) 中的溶液处理。 18h 后加入由在甲苯 (2ml) 中的 NH4Cl(2.89mmol) 和在甲苯中的三甲基铝 (2M， 2.89mmol) 在 0℃制备的另外的试剂。 搅拌 60h 后， 将混合物冷 却至 0℃， 用 1M HCl 淬灭， 然后用 CH2Cl2(3X) 洗涤。将水相用 1 ∶ 1 的 NaHCO3 饱和溶液 / Rochelle 盐饱和溶液碱化， 用 THF(10X) 萃取。 将合并的有机层干燥 (Na2SO4)， 过滤， 浓缩。 将 残余物通过硅胶柱层析法纯化， 提供为黄色油状物的标题化合物。HPLC ： tR ＝ 2.18min( 方 + 法 G) ； ESI-MS ： [M+H] 318。
     阶段 37.3 ： (2S， 3S)-3- 吗啉 -4- 基甲基 -1-((S)-1- 苯基 - 乙基 )- 吡咯烷 -2- 甲 酸甲酯
    
    
    将 (2S， 3R)-3- 碘甲基 -1-((S)-1- 苯基 - 乙基 )- 吡咯烷 -2- 甲酸甲酯 ( 阶段 36.5) (7.07mmol)、 K2CO3(21.22mmol) 和吗啉 (10.61mmol) 在 CH3CN(24ml) 中的混合物在 50℃搅 拌 62h。将反应混合物倒入冰水中， 用 EtOAc 萃取 (3X)。将合并的有机层连续用水和盐水 洗涤， 干燥 (Na2SO4)， 过滤， 浓缩。将残余物使用 RediSep 硅胶柱纯化， 提供为黄色油状物的标题化合物。HPLC ： tR ＝ 2.56min( 方法 G) ； ESI-MS ： [M+H]+ 333。
     实施例 38 ： (2S， 3R)-3- 羟基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
    使用 (2S， 3R)-3- 羟基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺 (H.Fukushima 等人， Bioorg.Med. Chem.2004， 12， 6053 ； H.Ji 等人， J.Med.Chem.2006， 49(21)， 6254) 替代中间体 P， 使用如实 施例 20 所述的方法合成标题化合物。
     LCMS ： tR ＝ 1.45min， M+H ＝ 417.0， M-H ＝ 415( 方 法 J)。1H-NMR(d6-DMSO， 600.13MHz) ： 12-11(s， br， 1H)8.4(s， 1H)， 7.2-6.9(m， 2H)， 5.2(s， 1H)， 4.4(s， 1H)， 4.25(s， br， 1H)， 3.6(m， 1H) ； 3.45(m， 1H)， 2.95(m， 2H)， 2.9(m， 2H)， 2.0(m， 1H)， 1.9(m， 1H)， 1.3(s， 9H)。
     实施例 39 ： (2S， 3R)-3- 甲基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(7- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 苯并 [1， 2-d ； 3， 4-d′ ] 双噻唑 -2- 基 )- 酰胺 ]
    
    使用 (2S， 3R)-3- 甲基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺 ( 中间体 P) 替代中间体 D， 使用如实 施例 34 所述的方法合成标题化合物。
     LCMS ： tR ＝ 1.32min， M+H ＝ 420.0， M-H ＝ 418.1( 方 法 J)。1H-NMR(d6-DMSO， 400MHz) ： 10.65(s， br， 1H)7.39(s， br， 1H)， 6.99(s， br， 1H)， 4.2(m， 1H)， 3.67(t， 1H)， 3.3(m， 1H)， 3.08(t， 2H)， 2.93(t， 2H)， 2.38(m， 1H)， 1.95(m， 1H)， 1.7(m， 1H)， 1.39(s， 9H)， 0.97(d 3H)。
     合成流程 ：实施例 40 ： (2S， 3R)-3- 甲基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 甲基 -4H-5- 氧 杂 -1- 硫杂 -3， 7- 二氮杂 - 环戊二烯并 [a] 萘 -2- 基 )- 酰胺 ]
    
    利用在制备实施例 20 中所述的合成方法， 从咪唑 -1- 甲酸 (8- 甲基 -4H-5- 氧 杂 -1- 硫杂 -3， 7- 二氮杂 - 环戊二烯并 [a] 萘 -2- 基 )- 酰胺 ( 阶段 40.1) 开始制备标题 化合物。
     LCMS ： tR ＝ 0.29min， M+H ＝ 374.0， M-H ＝ 372( 方法 J)。1H-NMR 1H-NMR(CD3OD， 400MHz) ： 7.9(s， 1H)， 7.0(s， 1H)， 5.27(s， 2H)， 4.38(d， 1H)， 3.8(dd， 1H)， 3.5(m， 1H)， 2.5(m， 1H)， 2.4(s， 1H)， 2.08(m， 1H)， 1.95(m， 1H)， 1.12(d， 3H)。
     阶段 40.1 ： 咪唑 -1- 甲酸 (8- 甲基 -4H-5- 氧杂 -1- 硫杂 -3， 7- 二氯杂 - 环戊二 烯并 [a] 萘 -2- 基 )- 酰胺
    
    利用在制备中间体 A 中所述的合成方法， 从 N-(8- 甲基 -4H-5- 氧杂 -1- 硫杂 -3， 7- 二氮杂 - 环戊二烯并 [a] 萘 -2- 基 )- 乙酰胺 ( 阶段 40.2) 制备咪唑 -1- 甲酸 (8- 甲 基 -4H-5- 氧杂 -1- 硫杂 -3， 7- 二氮杂 - 环戊二烯并 [a] 萘 -2- 基 )- 酰胺。
     阶 段 40.2 ： N-(8- 甲 基 -4H-5- 氧 杂 -1- 硫 杂 -3， 7- 二 氮 杂 - 环 戊 二 烯 并 [a] 萘 -2- 基 )- 乙酰胺
    
    在氩气下、 将 463mg(1.53mmol)N-[4-(4- 溴 -6- 甲基 - 吡啶 -3- 基氧基甲基 )- 噻 唑 -2- 基 ]- 乙酰胺 ( 阶段 40.3)、 900mg(2.71mmol) 碳酸铯、 30.4mg(0.135mmol) 醋酸钯和 81mg(0.271mmol) 三丁基膦四氟硼酸盐在 3mlDMF 中的混合物在 115℃搅拌 7h。 然后将反应 混合物倒入水中， 加入 EtOAc， 经 Hyflo Super Gel 介质 (Fluka 56678) 层过滤后， 用 EtOAc 萃取滤液 (2X)。将合并的有机层用水和盐水洗涤， 干燥 (MgSO4)， 过滤。将滤液真空浓缩， 得到残余物， 其通过硅胶 ( ＝ -100％ EtOAc 的庚烷溶液 ) 纯化， 提供 93mg 为固体的标题化 合物。LCMS ： tR ＝ 0.27min， M+H ＝ 262， M-H260( 方法 J)。
     阶段 40.3 ： N-[4-(4- 溴 -6- 甲基 - 吡啶 -3- 基氧基甲基 )- 噻唑 -2- 基 ]- 乙酰胺
    
    向 270mg(1.44mmol)4- 溴 -6- 甲基 - 吡啶 -3- 醇 ( 阶段 40.4) 在 DMF(5ml) 中的 溶液加入 44.8mg NaH(1.87mmol)， 将该混合物在室温搅拌 1h。加入 301mg(1.58mmol)2- 乙 酰胺基 -4-( 氯甲基 )-1， 3- 噻唑 (Apollo OR15549)， 在室温再继续搅拌 17h。将反应混合 物倒入水中， 用 EtOAc 萃取 (2X)。将合并的有机层用水和盐水洗涤， 干燥 (MgSO4)， 过滤。将 滤液真空浓缩， 得到 350mg 标题化合物 ( 白色固体 )， 其被认为足够纯而不需进一步纯化。 79 81 LCMS ： tR ＝ 1.36min， M+H ＝ 342( Br)， 344( Br)( 方法 J)。
     阶段 40.4 ： 4- 溴 -6- 甲基 - 吡啶 -3- 醇
    
    将 920mg(3.05mmol)4- 溴 -5- 甲氧基甲氧基 -2- 甲基 - 吡啶 ( 阶段 40.5) 溶解 于 5ml MeOH 中， 加入浓 HCl(1mL， 12mmol)， 将反应混合物在室温搅拌 2h。在真空浓缩混合 物时， 标题化合物 ( 以盐酸盐形式 ) 结晶。过滤提供 570mg 白色晶体。1H-NMR(d6-DMSO， 400MHz) ： 8.19(s， 1H)， 8.04(s， 1H)， 2.53(s， 3H)。
     阶段 40.5 ： 4- 溴 -5- 甲氧基甲氧基 -2- 甲基 - 吡啶
    将 1000mg(6.53mmol)5- 甲 氧 基 甲 氧 基 -2- 甲 基 - 吡 啶 (J.-P.Behr 等 人， Bioorg.Med.Chem.Lett.2003， 13(10)， 1713) 在 10ml THF 中的溶液冷却至 -78 ℃， 其中加 入 4.03mL(6.85mmol)t-BuLi(1.7M 的戊烷溶液 )。将所得混合物在氩气下搅拌 1h， 然后加 入 2.126g(6.53mmol)1， 2- 二溴四氯乙烷 ( 于 5ml THF 中 )。在 -78 ℃继续搅拌 1h， 将反 应混合物升温至室温。加入饱和 NH4Cl 溶液， 将含水混合物用 EtOAc 萃取 (2X)。将合并的 有机层用 H2O 和盐水洗涤， 干燥 (MgSO4)， 过滤。将滤液真空浓缩， 得到残余物， 其通过硅胶 (EtOAc/ 己烷＝ 1 ∶ 1) 纯化， 提供 920mg 为油状物的标题化合物。LCMS ： tR ＝ 0.29min， M+H 79 81 ＝ 232( Br)， 234( Br)( 方法 J)。
     实施例 41 ： (2S， 3S)-3- 吗啉 -4- 基甲基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(7- 叔 丁基 -4， 5- 二氢 - 苯并 [1， 2-d ； 3， 4-d′ ] 双噻唑 -2- 基 )- 酰胺 ]
    
    
    使用 (2S， 3S)-3- 吗啉 -4- 基甲基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺 ( 阶段 37.1) 替代中间 体 D， 利用如实施例 34 所述的方法合成标题化合物。LCMS ： tR ＝ 0.68min， M+H ＝ 505.3.0， M-H ＝ 503.2( 方 法 J)。1H-NMR(d6-DMSO， 600.13MHz) ： 10.65(s， b， 1H)， 7.4(s， b， 1H)， 7.05(s， b， 1H)， 4.3(s， b， 1H)， 3.7(m， 1H)， 3.6(m ， 4H) ， 3.3(m ， 1H) ， 3.1(t ， 2H) ， 2.9(t ， 2H) ， 2.6(m ， 1H) ， 2.4(m ， 1H) ， 2.35(m ， 4H) ， 2.15(m， 1H)， 2.0(m， 1H)， 1.75(m， 1H)， 1.35(s， 9H)。
     实施例 42 ： (2S， 3R)-3- 甲氧基甲基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 叔丁 基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
    在室温、 将三乙胺 (0.525mmol) 加至咪唑 -1- 甲酸 (8- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 噻唑 并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ( 中间体 A)(0.175mmol) 和 (2S， 3R)-3- 甲氧基甲基 - 吡 咯烷 -2- 甲酸酰胺 ( 阶段 42.1)(0.192mmol) 在 DMF(0.7ml) 中的溶液。搅拌 3h 后， 浓缩 反应混合物。将残余物通过硅胶柱层析法纯化， 提供为白色固体的标题化合物。HPLC ： tR ＝ 2.84min( 方 法 G) ； LCMS ： tR ＝ 1.71min， [M+H]+445( 方 法 I) ； TLC ： Rf ＝ 0.41(19 ∶ 1 1 CH2Cl2/MeOH) ； H-NMR(d6-DMSO， 600MHz) ： 11.15(br s， 1H)， 8.40(s， 1H)， 7.42(br s， 1H)， 7.05(br s， 1H)， 4.27(m， 1H)， 3.74(m， 1H)， 3.46(m， 1H)， 3.42(m， 1H)， 3.24(s， 3H)， 3.16(m， 1H)， 2.98(m， 2H)， 2.91(m， 2H)， 2.54(m， 1H)， 2.03(m， 1H)， 1.77(m， 1H)， 1.32(s， 9H)。
     阶段 42.1 ： (2S， 3R)-3- 甲氧基甲基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺
    
    类似于在阶段 37.1 中所述的程序制备标题化合物， 但使用 (2S， 3R)-3- 甲氧基甲 基 -1-((S)-1- 苯基 - 乙基 )- 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺 ( 阶段 42.2) 替代 (2S， 3S)-3- 吗啉 -4- 基 甲基 -1-((S)-1- 苯基 - 乙基 )- 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺。
     获得为白色固体的标题化合物。ESI-MS ： [M+H]+ 159。
     阶段 42.2 ： (2S， 3R)-3- 甲氧基甲基 -1-((S)-1- 苯基 - 乙基 )- 吡咯烷 -2- 甲酸酰 胺
    
    类似于阶段 37.2 中所述的程序制备标题化合物， 但使用 (2S， 3R)-3- 甲氧基甲 基 -1-((S)-1- 苯基 - 乙基 )- 吡咯烷 -2- 甲酸甲酯 ( 阶段 42.3) 替代 (2S， 3S)-3- 吗啉 -4- 基 甲基 -1-((S)-1- 苯基 - 乙基 )- 吡咯烷 -2- 甲酸甲酯。
     获 得 为黄 色油状物 的标题 化合物。HPLC ： tR ＝ 2.35min( 方法 G) ； LC-MS ： tR ＝ + 0.47min， [M+H] 263( 方法 K) ； TLC ： Rf ＝ 0.05(1 ∶ 1 庚烷 /EtOAc)。
     阶段 42.3 ： (2S， 3R)-3- 甲氧基甲基 -1-((S)-1- 苯基 - 乙基 )- 吡咯烷 -2- 甲酸甲 酯
    
    将 (3aR， 6aS)-1-((S)-1- 苯 基 - 乙 基 )- 六 氢 - 呋 喃 并 [3， 4-b] 吡 咯 -6- 酮 [805246-48-4](17.05mmol)、 KOH(71.60mmol) 和碘甲烷 (68.20mmol) 在甲苯 (79ml) 中的混 合物在 80℃搅拌 1.5h。将反应混合物冷却至室温， 在水与 MTBE 之间分配。将水层用 MTBE 萃取 (3X)。 将合并的有机层干燥 (Na2SO4)， 过滤， 浓缩。 将残余物通过硅胶柱层析法纯化， 提 供为黄色油状物的标题化合物。 HPLC ： tR ＝ 2.98min( 方法 G) ； LC-MS ： tR ＝ 0.69min， [M+H]+ 278( 方法 K) ； TLC ： Rf ＝ 0.25(1 ∶ 3 庚烷 /EtOAc)。
     实施例 43 ： (2S， 3S)-3- 二甲基氨基甲基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 叔 丁基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
    
    在室温、 将三乙胺 (0.305mmol) 加至咪唑 -1- 甲酸 (8- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 噻 唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ( 中间体 A)(0.102mmol) 和 (2S， 3S)-3- 二甲基氨基 甲 基 - 吡 咯 烷 -2- 甲 酸 酰 胺 ( 阶 段 43.1)(0.102mmol) 在 DMF(0.3ml) 中 的 溶 液。 搅 拌 0.5h 后， 浓缩反应混合物， 在真空下于 50℃过夜干燥。将残余物悬浮于 EtOAc(1ml) 中， 过 滤， 在真空下干燥， 提供为白色固体的标题化合物。HPLC ： tR ＝ 4.01min( 方法 H) ； LCMS ： + 1 tR ＝ 1.33min， [M+H] 458( 方 法 I) ； TLC ： Rf ＝ 0.08(4 ∶ 1CH2Cl2/MeOH) ； H-NMR(d6-DMSO， 600MHz) ： 11.14(br s， 1H)， 8.40(s， 1H)， 7.42(br s， 1H)， 7.06(br s， 1H)， 4.27(m， 1H)， 3.71(m， 1H)， 3.42(m， 1H)， 2.98(m， 2H)， 2.90(m， 2H)， 2.52(m， 1H)， 2.33(m， 1H)， 2.18(m， 1H)， 2.18(s， 6H)， 2.01(m， 1H)， 1.72(m， 1H)， 1.32(s， 9H)。
     阶段 43.1 ： (2S， 3S)-3- 二甲基氨基甲基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺
    
    类似于阶段 37.1 中所述的程序制备标题化合物， 但使用 (2S， 3S)-3- 二甲基氨基 甲基 -1-((S)-1- 苯基 - 乙基 )- 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺 ( 阶段 43.2) 替代 (2S， 3S)-3- 吗 啉 -4- 基甲基 -1-((S)-1- 苯基 - 乙基 )- 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺。并且， 在 4bar 压力下进行 氢化。
     获得为黄色油状物的标题化合物。ESI-MS ： [M+H]+ 172。
     阶段 43.2 ： (2S， 3S)-3- 二甲基氨基甲基 -1-((S)-1- 苯基 - 乙基 )- 吡咯烷 -2- 甲 酸酰胺
     将 (2S， 3S)-3- 氨基甲基 -1-((S)-1- 苯基 - 乙基 )- 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺 ( 阶 段 43.3)(0.418mmol)、 氰 基 硼 氢 化 钠 (2.86mmol) 和 37 ％ 甲 醛 水 溶 液 (2.14mmol) 在 MeOH(3.3ml) 中的混合物在 55℃搅拌 16h。将反应混合物冷却至室温， 浓缩。将残余物使 用 RediSep 硅胶柱纯化， 提供为白色泡沫状物的标题化合物。HPLC ： tR 3.59min( 方法 H) ；
    LC-MS ： tR ＝ 0.86min， [M+H]+ 276( 方法 I) ； TLC ： Rf ＝ 0.13(9 ∶ 1CH2Cl2/MeOH)。
     阶段 43.3 ： (2S， 3S)-3- 氨基甲基 -1-((S)-1- 苯基 - 乙基 )- 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺
    将 (2S， 3S)-3- 叠氮基甲基 -1-((S)-1- 苯基 - 乙基 )- 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺 ( 阶 段 36.3)(0.723mmol) 和三苯基膦 (0.867mmol) 在 THF(3ml) 中的混合物在室温搅拌 25h。 浓缩反应混合物， 提供为浅褐色固体的粗标题化合物。 HPLC ： tR 3.53min( 方法 H) ； ESI-MS ： + [M+H] 248。
     实 施 例 44 ： (2S， 3R)-3- 甲 基 - 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-{[8-(2， 2， 2- 三 氟 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )-4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 ]- 酰胺 }
    
    在室温、 将三乙胺 (1.714mmol) 加至咪唑 -1- 甲酸 [8-(2， 2， 2- 三氟 -1， 1- 二甲 基 - 乙基 )-4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 ]- 酰胺 ( 阶段 44.1)(0.490mmol) 和 (2S， 3R)-3- 甲基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺 ( 中间体 P)(0.979mmol) 在 DMF(1.5ml) 中的溶液。 搅拌 1.5h 后， 浓缩反应混合物。 将残余物用 NaHCO3 饱和溶液稀释， 用 EtOAc 萃取 (2X)。 将合 并的有机层连续用水和盐水洗涤， 干燥 (Na2SO4)， 过滤， 浓缩。将残余物使用 RediSep 硅胶 柱纯化， 提供为米色固体的标题化合物。 HPLC ： tR ＝ 5.77min( 方法 H) ； LCMS ： tR ＝ 2.18min， + 1 [M+H] 469( 方 法 I) ； TLC ： Rf ＝ 0.16(19 ∶ 1 CH2Cl2/MeOH) ； H-NMR(d6-DMSO， 600MHz) ： 11.19(br s， 1H)， 8.50(s， 1H)， 7.43(br s， 1H)， 7.01(br s， 1H)， 4.18(m， 1H)， 3.72(m， 1H)， 3.40(m， 1H)， 3.03(m， 2H)， 2.94(m， 2H)， 2.38(m， 1H)， 1.97(m， 1H)， 1.70(m， 1H)， 1.58(s， 6H)， 0.99(d， 3H)。
     阶段 44.1 ： 咪唑 -1- 甲酸 [8-(2， 2， 2- 三氟 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )-4， 5- 二氢 - 噻
     唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 ]- 酰胺
    类似于对于中间体 A 所述的程序制备标题化合物， 但在阶段 A.3 中使用 3， 3， 3- 三 氟 -2， 2- 二甲基 - 丙脒盐酸盐 ( 阶段 44.2) 替代叔丁基脒盐酸盐。
     获得为米色固体的标题化合物。 HPLC ： tR ＝ 6.73min( 方法 H) ； LCMS ： tR ＝ 1.11min， + [M+H] 373( 方法 J)。注意 ： 出于鉴定的目的， 将标题化合物溶解于 MeOH-- ＞氨基甲酸甲酯 衍生物。
     阶段 44.2 ： 3， 3， 3- 三氟 -2， 2- 二甲基 - 丙脒盐酸盐
    
    在室温、 将 3， 3， 3- 三氟 -2， 2- 二甲基 - 丙腈 ( 阶段 44.3)(12.40mmol) 加至甲醇钠 ( 由 48.40mmol 金属钠和 102ml MeOH 新鲜制备 ) 溶液。4h 后， 缓慢加入乙酸 (48.40mmol) 和 NH4Cl(14.88mmol)， 然后将反应混合物加热至 70 ℃达 40h。浓缩 (40 ℃， 100mbar) 反应 混合物后， 将残余物悬浮于丙酮中， 过滤， 在真空下干燥， 提供为白色固体的标题化合物。 + ESI-MS ： [M+H] 155。
     阶段 44.3 ： 3， 3， 3- 三氟 -2， 2- 二甲基 - 丙腈
    
    将 3， 3， 3- 三氟 -2， 2- 二甲基 - 丙酰胺 ( 阶段 44.4)(121.2mmol) 和五氧化二磷 (121.2mmol) 的混合物缓慢加热至 200℃， 收集所得的馏出液。获得为无色液体的标题化合 物。
     阶段 44.4 ： 3， 3， 3- 三氟 -2， 2- 二甲基 - 丙酰胺
    
    在 0 ℃、将 草 酰 氯 (140.8mmol) 滴 加 至 3， 3， 3- 三 氟 -2， 2- 二 甲 基 - 丙 酸 [889940-13-0](128mmol) 在 CH2Cl2(128ml) 中的溶液。 加入几滴 DMF 直至观察到气体放出，
     然后继续搅拌 30min。升温至室温并且搅拌过夜后， 浓缩反应混合物 (40℃， 00mbar)。将残 余物溶解于 THF(128ml) 中， 冷却至 0℃， 然后缓慢用浓氨水溶液 (64ml) 处理。在 0℃搅拌 30min 后， 然后在室温搅拌 4h， 将反应混合物浓缩至其一半体积， 得到粘稠的白色悬液。过 + 滤和干燥后， 获得为白色固体的标题化合物。ESI-MS ： [M+H] 156。
     实施例 45 ： (2S， 3R)-3- 甲氧基甲基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-{[8-(2， 2， 2- 三氟 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )-4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 ]- 酰胺 }
    在室温、 将三乙胺 (1.714mmol) 加至咪唑 -1- 甲酸 [8-(2， 2， 2- 三氟 -1， 1- 二甲 基 - 乙基 )-4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 ]- 酰胺 ( 阶段 44.1)(0.490mmol) 和 (2S， 3R)-3- 甲氧基甲基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺 ( 阶段 42.1)(0.0.979mmol) 在 DMF(1.5ml) 中的溶液。搅拌 2h 后， 浓缩反应混合物。将残余物用 NaHCO3 饱和溶液稀释， 用 EtOAc 萃
    取 (2X)。将合并的有机层连续用水和盐水洗涤， 干燥 (Na2SO4)， 过滤， 浓缩。将残余物使用 RediSep 硅胶柱纯化， 提供为米色固体的标题化合物。 HPLC ： tR ＝ 5.71min( 方法 H) ； LCMS ： + 1 tR ＝ 2.15min， [M+H] 499( 方法 I) ； TLC ： Rf ＝ 0.40(19 ∶ 1CH2Cl2/MeOH) ； H-NMR(d6-DMSO， 600MHz) ： 11.23(br s， 1H)， 8.50(s， 1H)， 7.42(br s， 1H)， 7.06(br s， 1H)， 4.27(m， 1H)， 3.74(m， 1H)， 3.46(m， 1H)， 3.42(m， 1H)， 3.24(s， 3H)， 3.16(m， 1H)， 3.03(m， 2H)， 2.94(m， 2H)， 2.55(m， 1H)， 2.03(m， 1H)， 1.77(m， 1H)， 1.58(s， 6H)。
     实 施 例 46 ： (2S， 3R)-3- 甲 基 - 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-[(8- 叔 丁 基 -4H-5- 氧杂 -1- 硫杂 -3， 7- 二氮杂 - 环戊二烯并 [a] 萘 -2- 基 )- 酰胺 ]
    LCMS ： tR ＝ 0.50min， M+H ＝ 416， M-H ＝ 414( 方法 L)。1H-NMR(d6-DMSO， 400MHz) ： 8.05(s， 1H)， 7.37(bs， 1H)， 7.09(s， 1H)， 6.97(bs， 1H)， 5.31(s， 2H)， 4.18(m， 1H)， 3.69(dd， 1H)， 3.39(m， 1H)， 2.35(m， 1H)， 1.95(m， 1H)， 1.71(m， 1H)， 1.27(s， 9H)， 0.975(d， 3H)。
     利用在制备实施例 40 中所述的合成方法， 从 2- 叔丁基 -5- 甲氧基甲氧基 - 吡啶 制备标题化合物。如下所述由 2- 溴 -5- 甲氧基甲氧基 - 吡啶制备原料 2- 叔丁基 -5- 甲氧 基甲氧基 - 吡啶 ：
     2- 叔丁基 -5- 甲氧基甲氧基 - 吡啶 ：
    
    将在 15ml 干燥 THF 中的 6.69g(74.7mmol) 氰化铜 (I) 冷却至 -75 ℃， 其中滴加 149mL(149mmol)1M 叔丁基氯化镁溶液。继续搅拌 40min。之后， 滴加溶解于 30ml 干燥 THF 中的 4.07g(18.67mmol)2- 溴 -5- 甲氧基甲氧基 - 吡啶 (Zhong， W. 等人， WO2008147547)。 将反应混合物在 -75℃搅拌 1h， 然后升温至室温， 再继续搅拌 6h。然后将 30ml 25％氨水 溶液加至反应混合物。过滤混合物， 用 CH2Cl2 萃取两次。将合并的有机层用水洗涤， 干燥 (MgSO4)， 过滤， 真空浓缩。将残余物通过硅胶层析法 (EtOAc， 庚烷 ) 纯化， 得到 2.64g 为油 状物的纯标题化合物。LCMS ： tR ＝ 0.55min， M+H ＝ 196( 方法 K)。
     实施例 47 ： (2S， 3S)-3- 二甲基氨基甲基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 叔 丁基 -4H-5- 氧杂 -1- 硫杂 -3， 7- 二氮杂 - 环戊二烯并 [a] 萘 -2- 基 )- 酰胺 ]
    利用对于制备实施例 46 所述的合成方法， 并且在合成的最后一步中使用 (2S， 3S)-3- 二甲基氨基甲基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺 ( 阶段 43.1) 替代 (2S， 3R)-3- 甲基 - 吡咯 烷 -2- 甲酸酰胺， 制备标题化合物。LC-MS ： tR ＝ 0.24min， M-H ＝ 457( 方法 L)。1H-NMR(d6-DMSO， 400MHz) ： 11.15(bs， 1H)， 8.03(s， 1H)， 7.35(s， 1H)， 7.07(s， 1H)， 7.0(s， 1H)， 5.28(s， 2H)， 4.23(m， 1H)， 3.65(m， 1H) ， 3.40(m ， 1H) ， 2.6-2.45(m ， 2H) ， 2.30(m ， 1H) ， 2.17(s ， 6H) ， 2.15(m ， 1H)1.70(m ， 1H) ， 1.27(s， 9H)。
     实 施 例 48 ： (2S， 3R)-3- 甲 基 - 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-{[8-(2， 2， 2- 三 氟 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )-4H-5- 氧杂 -1- 硫杂 -3， 7- 二氮杂 - 环戊二烯并 [a] 萘 -2- 基 ]- 酰 胺}
    
    LC-MS ： tR ＝ 1.59min， M+H ＝ 470( 方法 F)。1H-NMR(d6-DMSO， 400MHz) ： 11.25(bs， 1H)， 8.15(s， 1H)， 7.42(s， 1H)， 7.34(s， 1H)， 7.00(s， 1H)， 5.40(s， 2H)， 4.19(s， 1H)， 3.71(m， 1H)， ca.3.4(m， 1H)， 2.5-2.35(m， 1H)， 1.99(m， 1H)， 1.68(m， 1H)， 1.56(s， 6H)， 0.99(d， 3H)。
     利用在制备实施例 40 和 42 中所述的合成方法， 由 4- 溴 -5- 甲氧基甲氧基 -2-(2， 2， 2- 三氟 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )- 吡啶制备标题化合物。
     如下制备 4- 溴 -5- 甲氧基甲氧基 -2-(2， 2， 2- 三氟 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )- 吡啶 ：
    
    
    a)4- 溴 -5- 甲氧基甲氧基 -2-(2， 2， 2- 三氟 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )- 吡啶 ：利用在制备实施例 40 阶段 40.5 中所述的合成方法， 获得为油状物的标题化合物。 79 81 LCMS( 方法 L) ： tR ＝ 1.26min， M+H ＝ 328( Br)， 330( Br).
     b)5- 甲氧基甲氧基 -2-(2， 2， 2- 三氟 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )- 吡啶
    
    将 1.7g(4.13mmol) 甲磺酸 2， 2， 2- 三氟 -1-(5- 甲氧基甲氧基 - 吡啶 -2- 基 )-1- 甲 基 - 乙 酯 溶 解 于 20ml 二 氯 甲 烷 中。 将 反 应 混 合 物 冷 却 至 0 ℃， 其中缓慢加入 2.065mL(4.13mmol) 三甲基铝。将反应混合物在室温搅拌 20h。之后， 缓慢加入水， 将混合 物用 EtOAc 萃取 2 次。将合并的有机层用水和盐水洗涤， 干燥 (MgSO4)， 过滤， 真空浓缩。将 残余物通过硅胶层析法 (EtOAc， 庚烷 ) 纯化， 得到 0.55g 纯标题化合物。LCMS( 方法 L) ： tR ＝ 1.09min， M+H ＝ 250。
     c) 甲磺酸 2， 2， 2- 三氟 -1-(5- 甲氧基甲氧基 - 吡啶 -2- 基 )-1- 甲基 - 乙酯
    
    在 0 ℃、 向 搅 拌 的 0.213g(8.44mmol) 氢 化 钠 在 6ml 干 燥 THF 中 的 混 合 物 滴 加 1.06g(4.22mmol)1， 1， 1- 三氟 -2-(5- 甲氧基甲氧基 - 吡啶 -2- 基 )- 丙 -2- 醇 ( 溶解于 4.9ml 干燥 THF 中 )。添加结束后， 在室温继续搅拌 3h。在室温加入甲烷磺酰氯 ( 溶解于 7.3ml 干燥 THF 中 )， 再继续搅拌 2h。然后加入水和 NaHCO3 饱和溶液。将混合物用 EtOAc 萃取 2 次。将合并的有机层用水和盐水洗涤， 干燥 (MgSO4)， 过滤， 真空浓缩， 提供 1.7g 标题 化合物， 其直接用于下一步骤。LCMS( 方法 L) ： tR ＝ 0.96min， M+H ＝ 330。
     d)1， 1， 1- 三氟 -2-(5- 甲氧基甲氧基 - 吡啶 -2- 基 )- 丙 -2- 醇
    
    将 1.48g(4.58mmol)5- 甲氧基甲氧基 -2-(2， 2， 2- 三氟 -1- 甲基 -1- 三甲基甲硅烷 基氧基 - 乙基 )- 吡啶和 5ml(10mmol) 2N HCl 在 15ml THF 中的混合物在室温搅拌 2h。之 后， 将反应混合物倒入水中， 通过添加 2N HCl 将 pH 调节至 1-2。 将反应混合物用 EtOAc 萃取 2 次。 将合并的有机层用水和盐水洗涤， 干燥 (MgSO4)， 过滤， 真空浓缩， 提供 1.06g 为油状物 的标题化合物 (88％纯度 )， 其不需纯化即可用于下一步骤。LCMS( 方法 L) ： tR ＝ 0.88min， M+H ＝ 252。
     e)5- 甲 氧 基 甲 氧 基 -2-(2， 2， 2- 三 氟 -1- 甲 基 -1- 三 甲 基 甲 硅 烷 基 氧 基 - 乙 基 )- 吡啶
    
    将 1.12g(6.18mmol)1-(5- 甲氧基甲氧基 - 吡啶 -2- 基 )- 乙酮、 1.055g(7.42mmol) 三甲基 ( 三氟甲基 ) 甲硅烷和 0.025g(0.309mmol) 乙酸钠在 9mlDMF 中的混合物在 0℃搅拌 1h， 在室温搅拌 1h。之后， 将反应混合物倒入水中， 通过添加 2N HCl 将 pH 调节至 1-2。将 反应混合物用 EtOAc 萃取 2 次。将合并的有机层用水和盐水洗涤， 干燥 (MgSO4)， 过滤， 真空 浓缩。将残余物通过硅胶层析法 (EtOAc， 庚烷 ) 纯化， 得到 1.87g 为油状物的纯标题化合 物。LCMS( 方法 L) ： tR ＝ 1.38min， M+H ＝ 324。
    
    
    f)1-(5- 甲氧基甲氧基 - 吡啶 -2- 基 )- 乙酮 ：在 0℃、 将 NaH 加至 1g(7.29mmol)1-(5- 羟基 - 吡啶 -2- 基 )- 乙酮 (Anichem) 在 15ml DMF 中的溶液。将该混合物搅拌 1h 后， 在 0℃加入 0.78mL(8.75mmol)MOMCl。然后在 室温将反应混合物搅拌 2h。将反应混合物倒入水中， 用 EtOAc 萃取 2 次。将合并的有机层
     用水和盐水洗涤， 干燥 (MgSO4)， 过滤， 真空浓缩。将残余物通过硅胶层析法 (EtOAc， 庚烷 ) 纯化， 得到 1.12g 为油状物的纯标题化合物。LCMS( 方法 L) ： tR ＝ 0.66min， M+H ＝ 182。
     实 施 例 49 ： (2S， 3R)-3- 甲 基 - 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-{[7-(2， 2， 2- 三 氟 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )-4， 5- 二氢 - 苯并 [1， 2-d ； 3， 4-d′ ] 双噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
    LCMS ： tR ＝ 0.97min， M+H ＝ 474， M-H ＝ 414( 方法 L)。1H-NMR(d6-DMSO， 400MHz) ： 10.7(bs， 1H)， 7.37(s， 1H)， 6.97(s， 1H)， 4.18(m， 1H)， 3.69(dd， 1H)， 3.39(m， 1H)， 3.14(t， 2H)， 2.95(t， 2H)， 2.34(m， 1H)， 1.94(m， 1H)， 1.68(m， 1H)， 1.62(s， 6H)， 0.965(d， 3H)。
     利用在制备实施例 39 中所述的合成方法， 由 2， 2- 二甲基 - 硫代丙酰胺制备标题 化合物。如下所述制备原料 3， 3， 3- 三氟 -2， 2- 二甲基 - 硫代丙酰胺 ：
     3， 3， 3- 三氟 -2， 2- 二甲基 - 硫代丙酰胺的制备 ：
    
    
    a)3， 3， 3- 三氟 -2， 2- 二甲基 - 丙酰胺将 2g(12.81mmol)3， 3， 3- 三氟 -2， 2- 二甲基丙酸 (Aldrich)、 2.077g(12.81mmol) 羰基 - 二咪唑和 5.55mL(64.1mmol) 氨水溶液在 50ml CH2Cl2 中的混合物在室温搅拌 20h。 之后， 加入乙醚， 将所得混合物用 0.1N HCL、 0.1N NaOH、 水和盐水洗涤。将有机层干燥 (MgSO4)， 过滤， 真空浓缩， 提供 1.15g 为白色晶体的标题化合物， 其不需进一步纯化即可用 于下一步骤。MS ： M+H ＝ 156。
     b)3， 3， 3- 三氟 -2， 2- 二甲基 - 硫代丙酰胺
    
    将 1.05g(6.77mmol)3， 3， 3- 三 氟 -2， 2- 二 甲 基 - 丙 酰 胺 和 1.48g(3.66mmol) Lawesson 试剂在 32ml 干燥 THF 中的混合物在回流温度搅拌 20h。之后， 将反应混合物冷却 至室温， 真空浓缩。将残余物通过硅胶层析法 ( 庚烷， EtOAc) 纯化， 提供 0.81g 为纯白色晶 体的标题化合物。MS ： M+H ＝ 172。
     在合成的最后一步中使用 (2S， 3R)-3- 甲氧基甲基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺 ( 阶段 42.1)， 以相同的方法制备以下实施例 ：
     实施例 50 ： (2S， 3R)-3- 甲氧基甲基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-{[7-(2， 2， 2- 三氟 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )-4， 5- 二氢 - 苯并 [1， 2-d ； 3， 4-d′ ] 双噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
    
    LC-MS ： tR ＝ 0.96min， M+H ＝ 504， M-H ＝ 502( 方法 L)。1H-NMR(d6-DMSO， 400MHz) ： 10.76(bs， 1H)， 7.34(bs， 1H)， 7.02(bs， 1H)， 4.29(m， 1H)， 3.45(m， 1H)， 3.42(m， 2H)， 3.22(s， 3H)， 3.14(m， 3H)， 2.97(m， 2H)， 2.48(m， 1H)， 1.97(m， 1H)， 1.75(m， 1H)， 1.62(s， 6H)。
     实施例 51 ： (2S， 3S)-3- 二甲基氨基甲基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(7- 叔 丁基 -4， 5- 二氢 - 苯并 [1， 2-d ； 3， 4-d′ ] 双噻唑 -2- 基 )- 酰胺 ]
    
    利 用 对 于 制 备 实 施 例 39 所 述 的 合 成 方 法， 在 合 成 的 最 后 一 步 中 使 用 (2S， 3S)-3- 二甲基氨基甲基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺 ( 阶段 43.1) 替代 (2S， 3R)-3- 甲基 - 吡咯 烷 -2- 甲酸酰胺， 制备标题化合物。
     LC-MS ： tR ＝ 0.91min， M+H ＝ 463， M-H ＝ 461( 方法 L)。1H-NMR(d6-DMSO， 400MHz) ： 10.7(bs， 1H)， 7.36(s， 1H)， 7.01(bs， 1H)， 4.28(m， 1H)， 3.67(dd， 1H)， 3.39(m， 1H)， 3.07(m， 2H)， 2.92(m， 2H)， 2.5-2.44(m， 2H)， 2.30(m， 1H)， 2.14(s， 6H)， 1.95(m， 1H)， 1.40(m， 1H)， 1.36(s， 9H)。
     作为 PI3 激酶抑制剂的效力
     PI3K 激酶 Glo 测定 ： 将 50nL 化合物稀释液分配至黑 384- 孔小体积非结合苯乙烯 (NBS) 板 (Costar 目录号为 NBS#3676)。将以 10mg/ml 甲醇溶液形式提供的 L-a- 磷脂酰肌 醇 (PI) 转移至玻璃管中， 并在氮束中干燥。随后通过涡旋将其再悬浮于 3％辛基糖苷 (OG) 中并储存于 4℃。激酶 Glo 发光激酶测定 (Promega， Madison/WI， USA) 是通过定量激酶反 应后溶液中剩余 ATP 的量来测量激酶活性的均一 HTS 方法。
     添加 5μL PI/OG 与 PI3K 亚型的混合物 ( 表 1)。 通过添加含有 10mM TRIS-HCl pH 7.5、 3mM MgCl2、 50mM NaCl、 0.05％ CHAPS、 1mM DTT 和 1μm ATP 的 5μl ATP- 混合物 ( 最 终体积为 10μL) 开始激酶反应， 且在室温发生。使用 10μl 激酶 Glo 终止反应， 并在 10 分 钟后在 Synergy2 读数仪中使用每孔 0.1 秒的积分时间读板。将 2.5μM 泛 1 类 PI3 激酶抑 制剂 ( 标准物 ) 加至测定板中以产生对激酶反应的 100％抑制， 且使用溶剂媒介物 ( 水中的 90％ DMSO) 得到 0％抑制。使用标准物作为参考化合物， 且以 16 个稀释点形式一式两份地 包括于所有分析板中。
     表 1 藉由激酶 Glo 测定 PI3K ： 测定条件和试剂方案
    
    PI3K 的克隆
     PI3Kα、 PI3Kβ 和 PI3Kδ 构建体是 p85αiSH2 结构域与各自 p110 同种型的融 合物。p85α 片段和 p110 同种型基因是通过 PCR 从第一链 cDNA 制备， 该第一链 cDNA 是如 下文所述通过 RT-PCR 从来自胎盘、 睾丸和脑的市售 RNA 产生。PI3Kγ 构建体购自 Roger Williams 实验室， MRC Laboratory of Molecular Biology， Cambridge， UK(2003 年 11 月 )， 且已有描述 (Pacold， Michael E. ； Suire， Sabine ； Perisic， Olga ； Lara-Gonzalez， Samuel ； Davis， Colin T. ； Walker， Edward H. ； Hawkins， Phillip T. ； Stephens， Len ； Eccleston， John F. ； Williams， Roger L.Crystal structure and functional analysis of Ras
    binding to its effector phosphoinositide 3-kinase gamma( 结合其效应子磷酸肌醇 3- 激酶 γ 的 Ras 的晶体结构和功能分析 ).Cell(2000)， 103(6)， 931-943)。
     PI3Kα 构建体和蛋白
     PI3Kαwt
     BV1075 p85iSH2(461-568)-GGGGGGGGGGGG-p110α(21-1068)-HisBV1075 ： 杆状病毒 BV-1075 的构建体是通过包含克隆至载体 pBlueBac4.5 中的 p110α 片段和 p85 片段的三部分片段连接来制备。p85 片段衍生自使用 Nhe/Spe 消化的 质粒 p1661-2。通过测序来验证衍生自克隆的 p110α 片段， 且其在 LR410 中用作 SpeI/ HindIII 片段。为了产生杆状病毒表达载体 LR410， 利用 Gateway LR 反应将插入物转移 至 Gateway 修 饰 的 pBlueBac4.5(Invitrogen) 载 体 中。 用 Nhe/HindIII 消 化 克 隆 载 体 pBlueBac4.5(Invitrogen)。这产生构建体 PED 153.8。p85 组件 (iSH2) 是通过 PCR、 使用 ORF 318( 上文所述 ) 作为模板且使用一种正向引物 KAC1028(5’ -GCTAGCATGCGAGAATATGAT AGAT-TATATGAAG-AATATACC)(SEQ ID No.1) 和两种反向引物 KAC1029(5’ -GCCTCCACCAC-CT CCGCCTG-GTTTAATGCTGTTCATACGTTTGTC)(SEQ ID No.2) 和 KAC1039(5’ -TACTAGTC-CGCCTCC AC-CACCTCCGCCTCCACCACCTCCGCC)(SEQ ID No.3) 来产生。该两种反向引物重叠， 并将 12x Gly 接头和 p110α 基因的 N- 末端序列引入 SpeI 位点。该 12x Gly 接头替换 BV1052 构建 体中的单一 Gly 接头。将 PCR 片段克隆至 pCR2.1TOPO(Invitrogen) 中。所得克隆中， 通过 测序测定 p1661-2 是正确的。用 Nhe 和 SpeI 消化该质粒， 将所得片段进行凝胶分离及纯化 以用于亚克隆。
     p110α 克隆片段是通过使用 Spe I 和 HindIII 对克隆 LR410 进行酶促消化 ( 见上文 ) 来制备。SpeI 位点位于 p110α 基因的编码区中。对所得片段进行凝胶分离及纯化以 用于亚克隆。克隆载体 pBlueBac4.5(Invitrogen) 是通过使用 Nhe 和 HindIII 进行酶促消 化来制备。 使用 Qiagen 柱来纯化切割载体， 然后使用牛小肠碱性磷酸酶 (CIP)(BioLabs) 去 磷酸化。CIP 反应结束后， 再次对切割载体进行柱纯化以产生最终载体。使用 Roche Rapid 连接酶和供应商说明书来实施三部分连接。通过测序来验证最终的质粒。
     激酶结构域。
     BV1075 的蛋白序列 ：
    
    PI3Kβ 构建体和蛋白BV949 p85iSH2(461-N58K-568)-GGGGGG-p110β(2-1070)-HisPI3Kβ
    BV949 ： 产生 p85 PI3Kα、 PI3Kβ 和 PI3Kδ 亚单元的中间 SH2 结构域 (iSH2) 和全 长 p110β 亚单元的 PCR 产物， 并通过重叠 PCR 融合。 iSH2PCR 产物获自第一链 cDNA， 该第一 链是通过 RT-PCR 从来自胎盘、 睾丸和脑的市售人 RNA(Clontech) 制备， 最初使用引物 gwG13 0-p01(5’ -CGAGAATATGATAGATTATATGAAGAAT-3’ )(SEQ ID No.5) 和 gwG130-p02(5’ -TGGTTT-A ATGCTGTTCATACGTTTGTCAAT-3’ )(SEQ ID No.6)。 随后， 在二级 PCR 反应中， 使用引物 gwG130 -p03(5’ -GGGACAAGTT-TGTACAAAAAAGCAGGCTACGAAGGAGATATACATATGCGAGAATATGATAGATTATAT GAAGAAT-3’ )(SEQ ID No.7) 和 gwG130-p05(5’ -ACTGAAGCATCCTCCTC-CTCCTCCT-CCTGGTTTAATGCTGTTCATACGTTTGTC-3’ )(SEQ ID No.8) 分别在 p85iSH2 片段的 5’ 端和 3’ 端添加 Gateway 重组 AttB1 位点和接头序列。p110β 片段通过 PCR、 使用 p110β 克隆 ( 来自经序列验证的 未知来源 ) 作为模板并且使用含有接头序列和 p110β5’ 端的引物 gwG130-p04(5’ -ATTAAAC CAGGAGGAGGAGGAGGAGGATGCTT-CAGTTTCATAATGCCTCCTGCT-3’ )(SEQ ID No.9) 和含有融合至 组氨酸标签的 p110-β3’ 端序列的引物 gwG130-p06(5’ -AGCTCCGTGATGGTGATGGTGATGTGCTC CAGATC-TGTAGTCTTTCCGAA-CTGTGTG-3’ )(SEQ ID No.10) 来获得。p85-iSH2/p110β 融合蛋 白是通过重叠 PCR 来组装， 其为 iSH2 片段的 3’ 端及 p110β 片段的 5’ 端处接头的反应， 其 使用上文提到的 gwG130-p03 引物及含有重叠组氨酸标签和 AttB2 重组序列的引物 (5’ -GG GACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTAAGCTCCGTGATGGTGATGGTGATGTGCTCC-3’ )(SEQ ID No.11)。 以 Gateway(Invitrogen)OR 反应将该最终产物重组至供体载体 pDONR201(Invitrogen) 以 产生 ORF253 入门克隆。通过测序来验证该克隆并用于 Gateway LR 反应 (Invitrogen) 中 以将插入物转移至 Gateway 修饰的 pBlueBac4.5(Invitrogen) 载体中， 以产生杆状病毒表 达载体 LR280。该 LR280 在 p85 序列中具有氨基酸突变。
     激酶结构域 .
     BV949 的蛋白序列 ：
    
    激酶结构域 . PI3Kγ 构建体和蛋白p110γ(Δ143-[Met144-1102])-His构建体获自 Roger Williams 实验室， MRC Laboratory of Molecular Biology， Cambridge， UK(2003 年 11 月 )。对构建体的描述见 (Pacold， Michael E. ； Suire， Sabine ； Perisic， Olga ； Lara-Gonzalez， Samuel ； Davis， Colin T. ； Walker， Edward H. ； Hawkins， Phillip T. ； Stephens， Len ； Eccleston， John F. ； Williams， Roger L.Crystal structure and functional analysis of Ras binding to its effector phosphoinositide 3-kinase gamma( 结 合 其 效 应 子 磷 酸 肌 醇 3- 激 酶 γ 的 Ras 的 晶 体 结 构 和 功 能 分 析 ).Cell(2000)， 103(6)， 931-943)。构建体缺少 N- 末端 144aa。
     BV950 的蛋白序列 ：
    
    PI3Kδ 构建体和蛋白PI3Kδ BV1060 p85iSH2(461-568)-GGGGGG-p110δ(2-1044)-HisBV1060 ： 产生 p85 亚单元的中间 SH2 结构域 (iSH2) 和 p110δ 亚单元的全长 PCR 产 物， 并通过重叠 PCR 融合。 该 iSH2PCR 产物是通过使用 ORF318( 见上文 ) 作为模板及使用引 物 gwG130-p03(5’ -GGGACAAG-TTTGTACAAAAAAGCAGGCTACGAAGGAGATATACATATGC-GAGAATATGA TAGATTATATGAAGAAT-3’ )(SEQ ID No.7) 和 gwG154-p04(5’ -TCCTCCTCCT-CCTCCTCCTGGTTTAAT GCTGTTCATACGTTTGTC-3’ )(SEQ ID No.14) 来产生。 该 p110δ 片段获自第一链 cDNA， 该第一 链是通过 RT-PCR 从来自胎盘、 睾丸和脑的市售人 RNA(Clontech) 产生， 最初使用引物 gwG15 4-p01(5’ -ATGCCCCCTGGGGTGGACTGCCCCAT-3’ )(SEQ ID No.15) 和 gwG154-p02(5’ -CTACTGCC
     TGT-TGTCTTTGGACACGT-3’ )(SEQ ID No.16)。 在随后 PCR 反应中， 使用引物 gw154-p03(5’ -A TTAAACCAGGAGGAGGAGGAGGAGGACCCCCTGGGGTGGAC-TGCCCCATGGA-3’ )(SEQ ID No.17) 和 gwG15 4-p06(5’ -AGCTCCGTGATGGTGATGGTGAT-GTGCT-CCCTGCCTGTTGTCTTTGGACACGTTGT-3’ )(SEQ ID No.18) 分别在 p110δ 片段的 5’ 端和 3’ 端添加接头序列和组氨酸标签。p85-iSH2/p110δ 融合蛋白是在第三 PCR 反应中、 通过位于 iSH2 片段的 3’ 端和 p110δ 片段的 5’ 端的重叠 接头、 使用上文提到的 gwG130-p03 引物和含有重叠组氨酸标签和 Gateway(Invitrogen) AttB2 重组序列的引物 (5’ -GGG-ACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTAA-GCTCCGTGATGGTGATGGT GAGTGCTCC-3’ )(SEQ ID No.19) 来组装。 以 Gateway OR 反应将该最终产物重组至供体载体 pDONR201(Invitrogen) 以产生 ORF319 入口克隆。通过测序来验证该克隆并用于 Gateway LR 反应 (Invitrogen) 中以将插入物转移至 Gateway 修饰的 pBlueBac4.5(Invitrogen) 载 体中， 以产生杆状病毒表达载体 LR415。
     BV1060 的蛋白质序列 ：
    PI3Kα、 PI3Kβ 和 PI3Kγ 构建体的纯化
     PI3Kα、 PI3Kβ 和 PI3Kγ 在 两 个 层 析 步 骤 中 纯 化 ： Ni 琼 脂 糖 树 脂 (GE Healthcare) 上 的 固 定 金 属 亲 和 层 析 (IMAC) 及 使 用 Superdex 200 26/60 柱 (GE Healthcare) 的凝胶过滤。将所有缓冲液均冷冻至 4℃， 且在冰上冷冻下进行裂解。在室 温进行柱分级分离。用于纯化 PI3Kβ 的所有缓冲液除含有下文所述之外还含有 0.05 ％ Triton X100。
     通常， 将来自 10L Tn5 细胞培养液的冷冻细胞以 1 ∶ 6v/v 沉淀物对裂解缓冲液
     的比率再悬浮于 “裂解缓冲液” 20mM Tris-Cl pH 7.5、 500mM NaCl、 5％甘油、 5mM 咪唑、 1mM NaF、 0.1ug/mL 软海绵酸 (okadaic acid)(OAA)、 5mM BME、 1x 完全蛋白酶抑制剂合剂 - 不 含 EDTA(20 片剂 /1L 缓冲液， Roche Applied Sciences)、 核酸酶 (Benzonase)(25U/mL 缓 冲液， EMD Biosciences)， 并通过使用装配紧密的研棒匀化 20 次来机械裂解。将裂解液在 45,000g 下离心 30 分钟， 将上清液装载到预平衡的 IMAC 柱 (3ml 树脂 /100ml 裂解液 )。使 用 3-5 柱体积的裂解缓冲液洗涤柱， 随后使用 3-5 柱体积的 20mM Tris-Cl pH 7.5、 500mM NaCl、 5％甘油、 45mM 咪唑、 1mM NaF、 0.1μg/mL OAA、 5mM BME、 1x 完全蛋白酶抑制剂合剂 - 不 含 EDTA 进行第二次洗涤。 使用 20mM Tris-Cl pH 7.5、 0.5M NaCl、 5％甘油、 250mM 咪唑、 1mM NaF、 0.1μg/mL OAA、 5mM BME、 1x 完全蛋白酶抑制剂合剂 - 不含 EDTA 来洗脱蛋白质。通过 SDS-PAGE 来分析相关馏分， 相应地汇集。 通过在 Superdex 200 26/60 柱上凝胶过滤对蛋白 质进行进一步纯化， 该柱在 20mM Tris-Cl pH 7.5、 0.5M NaCl、 5％甘油、 1mM NaF、 5mM DTT、 1x 完全蛋白酶抑制剂合剂 - 不含 EDTA 中平衡。通过 SDS-PAGE 来分析相关馏分， 相应地汇 集。将等体积的透析缓冲液 (20mM Tris-Cl pH 7.5、 500mM NaCl、 50％甘油、 5mM NaF、 5mM DTT) 加至汇集物， 随后在透析缓冲液中透析来进行两次交换 ( 一次交换持续过夜 )。将蛋 白质储存于 -20℃。
     PI3Kδ 的纯化
     PI3Kδ 在三个层析步骤中纯化 ： Ni 琼脂糖树脂 (GE Healthcare) 上的固定金属亲 和层析， 使用 Superdex 200 26/60 柱 (GE Healthcare) 的凝胶过滤及最后的在 Q-HP 柱 (GE Healthcare) 上的离子交换步骤。所有缓冲液均冷冻至 4℃， 且在冰上冷冻下进行裂解。在 室温进行柱分级分离。
     通常， 将来自 10L Tn5 细胞培养液的冷冻细胞以 1 ∶ 10v/v 沉淀物对裂解缓冲液 的比率再悬浮于 “裂解缓冲液” 20mM Tris-Cl pH 7.5、 500mM NaCl、 5％甘油、 5mM 咪唑、 1mM NaF、 0.1μg/mL 软海绵酸 (OAA)、 5mM BME、 1x 完全蛋白酶抑制剂合剂 - 不含 EDTA(20 片剂 /1L 缓冲液， Roche Applied Sciences)、 核酸酶 (25U/mL 缓冲液， EMD Biosciences)， 并通 过使用装配紧密的研棒匀化 20 次来机械裂解。将裂解液在 45,000g 下离心 30 分钟， 将上 清液装载到预平衡的 IMAC 柱 (5ml 树脂 /100ml 裂解液 )。使用 3-5 柱体积的裂解缓冲液洗 涤柱， 随后使用 3-5 柱体积的 20mM Tris-Cl pH 7.5、 500mM NaCl、 5％甘油、 40mM 咪唑、 1mM NaF、 0.1μg/mL OAA、 5mM BME、 1x 完全蛋白酶抑制剂合剂 - 不含 EDTA 进行第二次洗涤。使 用 20mM Tris-Cl pH 7.5、 500mM NaCl、 5％甘油、 250mM 咪唑、 1mM NaF、 0.1μg/mL OAA、 5mM BME、 1x 完全蛋白酶抑制剂合剂 - 不含 EDTA 来洗脱蛋白质。通过 SDS-PAGE 分析相关馏分， 相应地汇集。通过在 Superdex 200 上凝胶过滤对蛋白质进一步纯化， 该 Superdex 200 在 20mM Tris-Cl pH 7.5、 500mM NaCl、 5％甘油、 1mM NaF、 0.1μg/mL OAA、 5mM DTT、 1x 完全蛋 白酶抑制剂合剂 - 不含 EDTA 中平衡。 通过 SDS-PAGE 分析相关馏分， 相应地汇集。 这些馏分 以 1 ∶ 10v/v 汇集体积对缓冲液的比率、 使用 “缓冲液 A” 20mM Tris-Cl pH 8.2、 5％甘油、 1mM NaF、 0.1μg/mL OAA、 5mM DTT 稀释， 并装载到制备好的 Q-HP 柱。 在试样装载完成后， 使 用缓冲液 A 和 5％“缓冲液 B” 20mM Tris-Cl pH 8.2、 1M NaCl、 5％甘油、 1mM NaF、 0.1μg/ mL OAA、 5mM DTT 洗涤 3-5 柱体积。使用 5％ -30％梯度的缓冲液 B 洗脱蛋白质。通常蛋白 质在～ 200mM NaCl 下洗脱。通过 SDS-PAGE 分析相关馏分， 相应地汇集。将等体积的透析 缓冲液 (20mM Tris-Cl pH 7.5、 500mM NaCl、 50％甘油、 1mM NaF、 0.1μg/mL OAA、 5mM DTT)加至汇集物， 随后在透析缓冲液中透析进行两次交换 ( 一次交换持续过夜 )。 将蛋白质储存 于 -20℃。
     使用上述测定法获得以下结果 ：
    
    n.d. ＝未测定。87CN 102471351 A
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     可参照以下说明书、 包括下文术语表和最后的实例更全面地理解本发明。如本文 所用， 术语 “包括” 、 “含有” 和 “包含” 在本文中是以其开放且非限制性意义使用。
     本文给出的任何通式意欲代表具有由结构式所绘示的结构的化合物以及某些变 体或形式。 具体来说， 本文给出的任何通式的化合物可具有不对称中心， 因此可以以不同立 体异构形式例如不同对映异构形式存在。如果至少一个不对称碳原子存在于式 I 化合物 中， 那么该化合物可以以旋光形式或以旋光异构体混合物的形式、 例如以外消旋混合物形 式存在。 因此， 不对称碳原子可以以 (R)-、 (S)- 或 (R， S)- 构型存在， 优选以 (R)- 或 (S)- 构 型存在。所有旋光异构体和其混合物、 包括外消旋混合物均是本发明的一部分。因此， 本文 给出的任何通式意欲代表外消旋物、 一种或多种对映异构形式、 一种或多种非对映异构形 式、 一种或多种阻转异构形式及其混合物。此外， 某些结构可以以几何异构体 ( 例如顺式及 反式异构体 )、 以互变异构体或以阻转异构体形式存在。例如， 在双键或环上的取代基可以 以顺式 ( ＝ Z-) 或反式 ( ＝ E-) 形式存在。因此， 本发明化合物可以以异构体混合物、 或优 选以纯异构体、 优选以对映异构体 - 纯非对映异构体或纯对映异构体形式存在。
     本文给出的任何通式意欲代表此类化合物的水合物、 溶剂合物和多晶型物、 及其混合物。 本文给出的任何通式也意欲代表此类化合物的未标记形式和同位素标记形式。 同 位素标记化合物具有本文所给出的各通式所绘示的结构， 只是一个或多个原子被具有所选 原子质量或质量数的原子替换。 可纳入本发明化合物中的同位素的实例包括氢、 碳、 氮、 氧、 2 3 11 13 14 15 31 32 18 35 36 125 磷、 氟和氯的同位素， 例如 H、 H、 C、 C、 C、 N、 P、 P、 F、 S、 Cl、 I。各种同位素标记的 13 本发明化合物是例如纳入放射性同位素例如 3H、 C 和 14C 的那些。此类同位素标记化合物 可用于代谢研究 ( 优选使用 14C)、 反应动力学研究 ( 使用例如 2H 或 3H)、 检测或成像技术， 例 如正电子发射断层摄影术 (PET) 或单光子发射计算机断层摄影术 (SPECT)， 包括药物或底 18 物组织分布分析， 或用于患者的放射性治疗。具体来说， F 或标记化合物对于 PET 或 SPECT 研究可能尤其优选。此外， 用例如更重的同位素如氘 ( 即 2H) 取代可因较强的代谢稳定性 而提供某些治疗优势， 例如体内半衰期延长或所需剂量减低。同位素标记的本发明化合物 及其前药通常可经由实施流程中或下文所述实例和制备中所公开的程序、 通过用易于获得 的同位素标记的试剂取代未经同位素标记的试剂来制备。
     此外， 用较重同位素、 尤其是氘 ( 即 2H 或 D) 取代可因较强的代谢稳定性而提供某 些治疗优势， 例如体内半衰期延长或所需剂量降低或治疗指数提高。 应理解， 在此情况下氘 被视为式 (I) 化合物中的取代基。该较重同位素、 具体而言是氘的浓度可通过同位素富集 因子来界定。 本文所用的术语 “同位素富集因子” 是指特定同位素的同位素丰度与天然丰度 的比值。 如果本发明化合物中的取代基以氘表示， 则对于各指定氘原子， 该化合物具有至少 3500( 在各指定氘原子处具有 52.5％氘纳入 )、 至少 4000(60％氘纳入 )、 至少 4500(67.5％ 氘纳入 )、 至少 5000(75％氘纳入 )、 至少 5500(82.5％氘纳入 )、 至少 6000(90％氘纳入 )、 至少 6333.3(95 ％氘纳入 )、 至少 6466.7(97 ％氘纳入 )、 至少 6600(99 ％氘纳入 ) 或至少 6633.3(99.5％氘纳入 ) 的同位素富集因子。在本发明化合物中， 未特别指定为特定同位素 的任一原子意指代表该原子的任一稳定同位素。除非另有指出， 否则当将一位置特别指定
     此外， 用较重同位素、 尤其是氘 ( 即 2H 或 D) 取代可因较强的代谢稳定性而提供某 些治疗优势， 例如体内半衰期延长或所需剂量降低或治疗指数提高。 应理解， 在此情况下氘 被视为式 (I) 化合物中的取代基。该较重同位素、 具体而言是氘的浓度可通过同位素富集 因子来界定。 本文所用的术语 “同位素富集因子” 是指特定同位素的同位素丰度与天然丰度 的比值。 如果本发明化合物中的取代基以氘表示， 则对于各指定氘原子， 该化合物具有至少 3500( 在各指定氘原子处具有 52.5％氘纳入 )、 至少 4000(60％氘纳入 )、 至少 4500(67.5％ 氘纳入 )、 至少 5000(75％氘纳入 )、 至少 5500(82.5％氘纳入 )、 至少 6000(90％氘纳入 )、 至少 6333.3(95 ％氘纳入 )、 至少 6466.7(97 ％氘纳入 )、 至少 6600(99 ％氘纳入 ) 或至少 6633.3(99.5％氘纳入 ) 的同位素富集因子。在本发明化合物中， 未特别指定为特定同位素 的任一原子意指代表该原子的任一稳定同位素。除非另有指出， 否则当将一位置特别指定
     为 “H” 或 “氢” 时， 该位置应理解为以其天然丰度同位素组成具有氢。因此， 在本发明化合 物中， 特别指定为氘 (D) 的任一原子意指代表氘， 例如在上文给出的范围内。
     当提及本文给出的任何通式时， 从具体变量的可能种类列表选择特定部分并不意 欲界定在其它地方出现的该变量的部分。 换言之， 在变量出现一次以上时， 从特定列表的种 类选择独立于通式中其它地方的相同变量的种类选择 ( 其中上文和下文中表征为优选的 实施方案中的一个或多个直至全部更多通用表述可分别用更具体定义替换， 因此得到本发 明的更优选的实施方案 )。
     在使用复数形式 ( 例如化合物、 盐、 药物制品、 疾病等 ) 的情况下， 这包括单数 ( 例 如单一化合物、 单一盐、 单一药物制剂、 单一疾病等 )。 “一种化合物” 不排除 ( 例如在药物 制剂中 ) 存在一种以上的式 (I) 化合物 ( 或其盐 )。
     如果式 (I) 化合物携带成盐基团， 那么盐优选为式 (I) 化合物的可药用盐。形成 盐所需的酸 / 碱通常为本领域已知。
     除非另有说明， 否则以下通用定义将应用于本说明书中 ：
     卤素 ( 或卤代 ) 表示氟、 溴、 氯或碘， 特别氟、 氯。被卤素取代的基团和部分如被卤 素取代的烷基 ( 卤烷基 ) 可被单 -、 多 - 或全 - 卤化。
     杂原子是除碳和氢之外的原子， 优选氮 (N)、 氧 (O) 或硫 (S)， 特别氮。
     “烷基” 是指直链或支链烷基， 且包括 C1-7 烷基且更优选 C1-4 烷基。 此类烷基包括例 如甲基、 乙基、 正丙基或异丙基、 正丁基、 异丁基、 仲丁基或叔丁基、 正戊基、 正己基、 正庚基， 特别优选甲基、 乙基、 正丙基、 异丙基、 正丁基和异丁基。烷基可未被取代或被取代。示例性 取代基包括但不限于羟基、 烷氧基、 卤素 ( 尤其是氟 )、 氨基和二取代的氨基、 单 - 或二 - 烷 基取代的氨基、 乙酰基氨基、 吗啉基、 芳基。取代的烷基的实例是三氟甲基。环烷基也可以 是烷基的取代基。此类情况的一个实例是部分 ( 烷基 )- 环烷基， 例如 ( 烷基 )- 环丙基或 ( 烷基 )- 环丁基， 例如甲基 - 环丙基或甲基 - 环丁基。( 烷基 )- 环烷基部分的更具体实例 包括偕型的取代模式， 例如 1- 烷基环烷基、 例如 1- 甲基环丙基。环烷基作为烷基的取代基 的另一实例是烷二基 - 环烷基， 例如烷二基 - 环丙基、 例如 -CH2- 环丙基。C1-C7- 烷基是具 有从 1 个 ( 且包括 1 个 ) 直至 7 个 ( 且包括 7 个 ) 碳原子的烷基， 优选具有从 1 个 ( 且包 括 1 个 ) 直至 4 个 ( 且包括 4 个 ) 碳原子 (C1-C4- 烷基 )， 且为直链或支链 ； 优选地， 低级烷 基是丁基， 例如正丁基、 仲丁基、 异丁基、 叔丁基、 丙基， 例如正丙基或异丙基、 乙基或优选甲 基。
     其它基团的各烷基部分如 “烷氧基” “烷氧基烷基” 、 “烷氧基羰基” 、 “烷氧基 - 羰基 、 烷基” 、 “烷基磺酰基” 、 “烷基砜 (alkylsulfoxyl)” 、 “烷基氨基” 、 “卤烷基” 应具有与 “烷基” 的上述定义中所述相同的含义。
     “C3-7- 环烷基” 是指饱和或部分饱和、 单环、 稠合多环或螺多环状碳环， 每一碳环具 有 3 个至 7 个环原子。环烷基的示例性实例包括以下部分 ： 环丙基、 环丁基、 环戊基和环己 基。C3-C7- 环烷基可未被取代或被取代 ； 示例性取代基提供于对烷基的定义中。C3-C7- 环 烷基也可为其它基团例如烷基上的取代基。
     “芳基” 是指优选具有不多于 16 个碳原子、 尤其不多于 10 个碳原子、 例如具有 6 个 至 16 个、 优选 6 个至 10 个环碳原子的环系统的未饱和碳环芳族环系统， 优选为单环或二 环， 且未被取代或取代。例如， 芳基是未取代的或取代的苯基。
     “杂环基” 是指杂环基团， 其在键合环中是不饱和 ( 特别最大程度不饱和， 例如环中携带最高可能数的共轭双键例如杂芳基 )、 饱和或部分饱和且优选为单环或在本发明更 广泛方面为二环状环 ； 其具有 3-16 个环原子， 更优选 4-10 个环原子， 其中至少在键合至式 (I) 分子的基团的环中一个或多个、 优选 1-4 个环原子、 尤其一个或两个环原子是选自氮、 氧和硫的杂原子 ； 该键合环优选具有 4-12 个环原子、 尤其 4-7 个环原子、 例如 6-10 个环原 子、 尤其对于杂芳基， 例如 5、 6、 9 或 10 个环原子。杂环基可被未取代或被一个或多个、 尤其 1 个至 3 个取代基取代， 所述取代基独立地选自烷基或上文对于取代的烷基所定义的取代 基和 / 或选自一个或多个以下取代基 ： 氧代 ( ＝ O)、 硫代羰基 ( ＝ S)、 亚氨基 ( ＝ NH)、 亚 氨基 - 低级烷基， 且对于含氮杂芳基， 包括其 N- 氧化物。
     “治疗” 包括预防性和治疗性治疗以及延长疾病或病症的进展。
     “PI3 激酶介导的疾病” ( 尤其是 PI3Kα 介导的疾病 ) 具体而言是以有益方式 ( 例 如一个或多个症状改善、 疾病发作延迟、 直至疾病暂时或完全治愈 ) 响应 PI3 激酶的抑制、 尤其 PI3Kα 的抑制的病症 ( 其中待治疗的疾病可包括显示 PIK3CA 体细胞突变或种系突变 或 PTEN 体细胞突变的那些 )。 待治疗的疾病尤其包括增殖性疾病， 例如肿瘤疾病， 可提及的 包括实体肿瘤、 白血病、 胶质母细胞瘤、 乳癌和前列腺癌。 “盐” (以 “其盐” 表示 ) 可单独或以与游离式 I 化合物的混合物存在， 且优选为可药 用盐。式 (I) 化合物中的成盐基团是具有碱性或酸性特性的基团或原子团。具有至少一个 碱性基团或至少一个碱性原子团例如氨基、 不形成肽键的仲氨基或吡啶基的化合物可形成 酸加成盐， 例如与盐酸、 硫酸或磷酸等无机酸 ； 或与适宜的有机羧酸或磺酸例如脂族单 - 或 二 - 羧酸， 例如三氟乙酸、 乙酸、 丙酸、 羟基乙酸、 琥珀酸、 马来酸、 富马酸、 羟基马来酸、 苹果 酸、 酒石酸、 柠檬酸或草酸 ； 或氨基酸， 例如精氨酸或赖氨酸 ； 芳族羧酸， 例如苯甲酸 ； 2- 苯 氧基 - 苯甲酸 ； 2- 乙酰氧基 - 苯甲酸 ； 水杨酸 ； 4- 氨基水杨酸 ； 芳族 - 脂族羧酸， 例如扁桃 酸或肉桂酸 ； 杂芳族羧酸， 例如烟酸或异烟酸 ； 脂族磺酸， 例如甲烷 -、 乙烷 - 或 2- 羟基乙 磺酸 ； 或芳族磺酸， 例如苯 -、 对甲苯 - 或萘 -2- 磺酸。存在若干碱性基团时， 可形成单 - 或 多 - 酸加成盐。
     具有酸性基团羧基或酚羟基的式 (I) 化合物可形成金属盐或铵盐， 例如碱金属或 碱土金属盐， 例如钠盐、 钾盐、 镁盐或钙盐 ； 或与氨或适宜有机胺形成的铵盐， 例如叔单胺， 例如三乙胺或三 (2- 羟基乙基 )- 胺， 或杂环碱， 例如 N- 乙基 - 哌啶或 N， N′ - 二甲基哌嗪。 盐的混合物是可能的。
     具有酸性和碱性基团的式 (I) 化合物可形成内盐。
     出于分离或纯化目的， 亦可使用药学上不可接受的盐， 例如苦味酸盐或高氯酸盐。 对于治疗用途， 仅使用可药用盐或游离化合物 ( 酌情为药物制剂形式 )， 且因此这些是优选 的。鉴于游离形式的新型化合物与其盐形式的化合物、 包括在例如新化合物的纯化或鉴定 中可用作中间体的那些盐之间的密切关系， 上下文中关于游离化合物的任何相关内容均应 该视需要及方便被理解为也指对应盐。
     本发明化合物也可形成溶剂合物和水合物， 且因此任何提及式 (I) 化合物均应该 视需要及方便被理解为也提及式 (I) 化合物的对应的溶剂合物和 / 或水合物。
     本发明还涉及在体内转化为式 (I) 化合物本身的式 (I) 化合物的前药。因此， 任 何提及式 (I) 化合物均应该视需要及方便被理解为也提及式 (I) 化合物的对应的前药。
     组合是指一种剂量单元形式中的固定组合或用于组合施用的药盒， 其中式 I 化合 物与组合伴侣 ( 例如如下文所示的其它药物， 也称为 “治疗剂” 或 “辅助药剂” ) 可独立地 同时或单独地在一定时间间隔内施用， 尤其当这些时间间隔使得组合伴侣显示合作、 例如 协同效应时。本文所用的术语 “共施用” 或 “组合施用” 等意欲包括向有需要的单个受试者 ( 例如患者 ) 施用所选组合伴侣， 且意欲包括其中无需以相同施用路径或在相同时间施用 药剂的治疗方案。本文所用的术语 “药物组合” 意指由混合或组合一种以上活性成分而获 得的产物， 且包括活性成分的固定和非固定组合。术语 “固定组合” 意指将活性成分例如式 I 化合物与组合伴侣二者以单一实体或剂量的形式同时施用至患者。术语 “非固定组合” 意 指活性成分例如式 I 化合物与组合伴侣二者作为分开的实体同时、 并行或相继且无具体时 间限制地施用至患者， 其中此施用可在患者体内提供两种化合物的治疗有效量。后者亦适 用于鸡尾酒疗法， 例如施用三种或更多种活性成分。
     在优选的实施方案中 ( 该实施方案独立地、 共同地或以任一组合或亚组合优选 )， 本发明涉及游离碱形式或盐形式的式 I 化合物， 其中取代基如本文所定义。
     如式 I 所示， α- 酰胺取代基是在吡咯烷环的 2 位上， 且该位置的立体化学如图所 绘示。 环 A 优选是含有 1 个或 2 个选自 N、 S 或 O 的杂原子、 其中至少一个杂原子是 N 的 未取代的或取代的 5- 或 6- 元杂环状环 ( 优选杂芳基 )。
     更优选地， 环 A 选自未取代的或取代的吡啶环、 未取代的或取代的嘧啶环、 未取代 的或取代的噻唑环、 未取代的或取代的吡唑环或未取代的或取代的噁唑环。更优选的是未 取代的或取代的吡啶环、 未取代的或取代的嘧啶环或未取代的或取代的噻唑环。
     优选地， 环 A 通过环 A 的碳原子稠合至式 I 分子的其它部分。
     环 A 优选被一个、 两个或三个 R2 基团、 优选两个 R2 基团、 最优选一个 R2 基团取代， 该 R2 基团在每次出现时独立地选自 ：
     未取代的或取代的 C1-C7- 烷基 ；
     未取代的或取代的氨基 ；
     未取代的或取代的 C3-C7- 环烷基。
     优选地， R2 选自
     未取代的 C1-C7- 烷基 ；
     二 (C1-C7- 烷基 ) 氨基 ；
     C1-C7- 烷基， 其被 C3-C7- 环烷基或卤代 ( 优选氟 ) 取代一次或多次 ；
     未取代的 C3-C7- 环烷基 ；
     C3-C7- 环烷基， 其被卤代 ( 优选氟 )、 ( 卤代 -C1-C7- 烷基 ) 或 C1-C7- 烷基取代一次 或多次 ；
     更优选地， R2 选自甲基、 叔丁基、 二乙基氨基、 环丙基甲基、 2- 氟 -1， 1- 二甲基乙基 或 2， 2， 2- 三氟 -1， 1- 二甲基 - 乙基。
     在另一实施方案中， R2 选自甲基、 叔丁基、 二乙基氨基、 环丙基甲基或 2- 氟 -1， 1- 二甲基乙基。
     环 A 更优选选自 A1 或 A2 或 A3 或 A4 或 A5 或 A6 ：
    
     其中 Z 是 N 或 CH 且 R2 如上所定义。
     优选地， 环 A 选自 A1 或 A2。
     X-Y 优选表示 (CH2)r 或 O(CH2)t， 其中 r 是 1、 2或3； t是1或2；
     X-Y 更优选表示 (CH2)r 或 O(CH2)t， 其中 r 是 2 且 t 是 1。为避免产生疑问， 即 X-Y 优选为 -CH2-CH2- 或 -O-CH2-， 如此在后一种情况下， X-Y 中的 X 是 -O-CH2- 中的 O。 1
     R 优选在每次出现时独立地表示
     卤素 ；
     羟基 ；
     未取代的或取代的苯基 ；
     二 (C1-C7- 烷基 ) 氨基 ；
     未取代的 C1-C7- 烷基 ；
     C1-C7- 烷基， 其被下列基团取代一次或多次 ：
     羟基、 C1-C7- 烷氧基、 二 (C1-C7- 烷基 ) 氨基、 二 -( 全氘代 C1-C7- 烷基 ) 氨基、 苯 基、 吗啉基、 乙酰基氨基、 或 N-(C1-C7- 烷基 )-N-( 苯基 C1-C7- 烷基 ) 氨基， 且其中各苯基可 独立地被卤代单取代或多取代。
     R1 更优选在每次出现时独立地表示
    氟；
     羟基 ；
     未取代的苯基 ；
     二甲基氨基 ；
     甲基 ；
     甲基， 其被以下基团取代一次或多次 ( 优选取代一次 )
     羟基、 甲氧基、 二甲基氨基、 二 -( 全氘代甲基 ) 氨基、 苯基、 吗啉基、 乙酰基氨基、 或 N-( 甲基 )-N-( 苯基甲基 ) 氨基， 且其中各苯基可独立地被氟单取代或多取代。 1
     R 最优选在每次出现时独立地表示
     氟；
     羟基 ；
     未取代的苯基 ；
     二甲基氨基 ；
     甲基 ；
     羟基甲基 ；
     甲氧基甲基 ；
     二甲基氨基甲基 ；
     二 -( 全氘代甲基 ) 氨基甲基 ；
     苄基 ；
     吗啉 -4- 基甲基 ；
     N- 乙酰基氨基甲基 ；
     N-( 甲基 )-N-(3- 氟 - 苯基甲基 ) 氨基甲基。
     本发明的一实施方案包括式 I 的化合物， 其中 n 是 0 或 1。优选地， n 是 1。
     本发明的另一实施方案包括式 I 的化合物， 其中 q 是 0， 即其中含氮杂环仅在 2 位 被酰胺取代。在该实施方案中， 优选 n 是 0 或 1， 更优选 1。
     本发明的另一实施方案包括式 I 化合物， 其中 q 是 1， 即其中含氮杂环仅被酰胺在 1 2 位和单一 R 基团取代。在该实施方案中， 优选 n 是 0 或 1， 更优选 1。在该实施方案中， R1 基团可在含氮杂环的 2 位 ( 即在与被酰胺基团取代的碳相同的碳上 ) 或 3 位或 4 位或 5 位 取代。
     优选地， 在该实施方案中， R1 基团在含氮杂环的 3 位被取代， 即式 IA 的化合物 ：
    其中取代基如对于式 (I) 化合物所定义。
     优选地在式 IA 化合物中， n 是 1， 因此提供其中含氮杂环是吡咯烷环、 在 2 位被具 1 有所绘示的立体化学的酰胺取代、 且在 3 位被 R 基团取代的化合物。 1
     优选地， R 基团具有相对于 2 位的酰胺为顺式的立体化学， 即根据式 (IA’ ) 的化 合物 ：
    
    其中取代基如对于式 (I) 化合物所定义。
     优选在式 IA′化合物中， n 是 1， 因此提供其中含氮杂环是吡咯烷环、 在 2 位被具 1 有所绘示的立体化学的酰胺取代、 且在 3 位被具有所绘示的立体化学的 R 基团取代的化合 物， 因此酰胺和 R1 基团相对于彼此呈顺式的化合物。
     本发明的又一实施方案包括其中 q 是 2 或 3、 因此存在至少两个 R1 取代基的式 I 化合物， 各 R1 独立地选自如本文对于式 I 所定义的基团。在该实施方案中， 优选两个 R1 中 的至少每一个键合于吡咯烷环的 3 位， 且任选的第三 R1 基团 ( 若存在 ) 键合在含氮杂环的 其它地方。进一步优选， n 是 1 且第三 R1 基团 ( 若存在 ) 键合在所得吡咯烷环的 4 位或 5 位， 即提供式 IB 化合物 ：
    
    其中取代基如对于式 (I) 化合物所定义。
     在根据式 IB 的化合物中， 优选第三 R1 键合在吡咯烷环的 4 位上。
     本发明的又一实施方案包括如下式 I 化合物 ： 其中 n 是 1、 且其中两个 R1 基团键合 在吡咯烷环的 3 位， 并且一起形成烷二基， 优选 C3-C8- 环烷基， 特别是环丙基， 即提供式 IC 化合物 ：
    
    其中取代基如对于式 (I) 化合物所定义， 且第三 R1 基团是任选的， 且如果存在， 优 选键合在吡咯烷环的 4 位。
     在式 (IA)、 (IA’ )、 (IB) 或 (IC) 的任一个中， 若无另外说明， 则对于环 A、 X-Y、 R1 和 n 的优选定义亦可适用。
     本发明另外涉及式 (I)、 (IA)、 (IA’ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物的可药用前药。 本发明另外涉及式 (I)、 (IA)、 (IA’ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物的可药用代谢产物。 本发明尤其涉及实施例以及本文所述制备方法中给出的式 (I)、 (IA)、 (IA’ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物。
     本发明还涉及用于制备式 (I)、 (IA)、 (IA’ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物的方法。原 则上， 将两种不同胺转化为相应脲衍生物的所有已知方法均适宜， 且可通过使用各自原料 来实施。
     因此， 本发明特别涉及一种方法， 其包括将式 II 化合物
    
    
    其中取代基如上所定义， 与式 IIIA 化合物
    其中取代基如上所定义， 在活化剂存在下反应 ( “方法 A” )， 或与式 IIIB 化合物反应
    其中 R1 如上所定义 ； RG 代表反应基团 ( 例如咪唑基羰基 )(“方法 B” )， 在每种情 况下， 任选在稀释剂存在下和任选在反应助剂存在下， 以及回收游离形式或盐形式的所得 式 I 化合物， 以及
     任选地将根据方法 A 或方法 B 可获得的式 I 化合物转化成不同的式 I 化合物， 和/ 或将可获得的式 I 化合物的盐转化成其不同的盐， 和 / 或将可获得的游离式 I 化合物转化 成其盐， 和 / 或从一种或多种不同的可获得的式 I 异构体分离可获得的式 I 化合物的异构 体。
     反应条件
     该方法可根据本领域已知方法或如下文实施例中所公开来实施。例如， 可将式 II
     化合物与式 IIIA 或 IIIB 化合物于溶剂例如二甲基甲酰胺中、 在碱例如有机胺例如三乙胺 存在下反应。
     在上文或下文中给出温度时， 应添加 “约” ， 因为来自所给出数值的微小偏差 ( 例 如 ±10％的差异 ) 通常可以接受。
     所有反应均可在一种或多种稀释剂和 / 或溶剂存在下进行。可使用等摩尔量的原 料； 可选地， 可使用过量化合物， 以例如用作溶剂或使平衡偏移或通常加快反应速率。
     如本领域已知， 根据反应所需且符合通常已知程序， 可添加适宜量的反应助剂例 如酸、 碱或催化剂。
     保护基
     若一种或多种其他官能团、 例如羧基、 羟基、 氨基、 巯基等在本文中所述的原料或 任何其他前体物中已经加以保护或需要保护， 因为其不应参与反应或者干扰反应， 则这些 基团是常用于合成肽化合物、 合成头孢菌素和青霉素、 以及合成核酸衍生物和糖类的基团。 保护基团是一旦被转移就不再存在于最终化合物中的基团， 而仍然作为取代基的基团在本 文所用意义上并不是保护基团， 保护基团是在原料或中间体阶段添加且被移除以获得最终 化合物的基团。而且， 在将式 (I)、 (IA)、 (IA’ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 的化合物转化成不同的 式 (I)、 (IA)、 (IA’ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物的情况下， 如果有用或需要， 可引入保护基团 并予以移除。 保护基团可能已经存在于前体中且应保护所涉及的官能团以避免不期望的副反 应， 例如酰化、 醚化、 酯化、 氧化、 溶剂分解及类似反应。保护基团的特征在于其适于容易地 即无不期望的副反应、 例如在类似于生理条件的条件下通过乙酰解作用、 质子分解、 溶剂分 解、 还原、 光解或者也可借助酶活性而移除， 而其不存在于终产物中。专业人员都知道或者 可容易确定哪些保护基团适用于上下文所提及的反应。
     此类保护基团对该官能团的保护、 保护基团本身及其移除反应都阐述于 ( 例如 ) 标 准 参 考 著 作 中， 例 如 J.F.W.McOmie， “Protective Groups in Organic Chemistry” ， Plenum Press ， London and New York 1973 ； T.W.Greene ， “Protective Groups in Organic Synthesis” ， 第 3 版， Wiley， New York 1999 ； “The Peptides” ； 第 3 卷 ( 编者 ： E.Gross 和 J.Meienhofer)， Academic Press， London and New York 1981 ； “Methoden der organischen Chemie ″ (Methods of organic chemistry)， Houben Weyl， 第 4 版， 第 15/I 卷， Georg Thieme Verlag， Stuttgart 1974， in H.-D.Jakubke 及 H.Jescheit，
    “Peptide， Proteine” (Amino acids， peptides， proteins)， VerlagChemie， Weinheim， Deerfield Beach and Basel 1982 ； 及 Jochen Lehmann， “Chemie der Kohlenhydrate ： Monosaccharide und Derivate” (Chemistry of carbohydrates ： monosaccharides and derivatives)， Georg Thieme Verlag， Stuttgart 1974。
     任选的反应及转化
     可将式 (I)、 (IA)、 (IA’ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 的化合物转化成不同的式 (I)、 (IA)、 (IA’ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 的化合物。
     在取代基带有氨基或氨基 -C1-C7- 烷基取代基的式 (I)、 (IA)、 (IA’ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 的化合物中， 可通过在叔胺碱如三乙胺或吡啶存在下、 在不存在或存在合适溶剂如二 氯甲烷下、 在例如在 -20℃至 50℃范围的温度、 例如在约室温与对应的 C1-C7- 烷酰卤、 例如对应氯化物反应， 将氨基转化成酰基氨基， 例如 C1-C7- 烷酰基氨基。
     具有成盐基团的式 (I)、 (IA)、 (IA’ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 的化合物的盐可以用众人 皆知的方式制备。因此， 式 (I)、 (IA)、 (IA’ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 的化合物的酸加成盐可通 过用酸或用适宜的阴离子交换试剂处理而获得。具有两个酸分子的盐 ( 例如式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物的二卤化物 ) 也可以转化成每一化合物具有一个酸分子 的盐 ( 例如单卤化物 ) ； 这可通过加热成熔体或例如通过在高温、 例如 130℃至 170℃和高 真空下作为固体加热而进行， 每分子式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 的化合物释放 一个酸分子。盐通常可例如通过用适宜碱性化合物处理而转化成游离化合物， 例如用碱金 属碳酸盐、 碱金属碳酸氢盐或碱金属氢氧化物、 通常为碳酸钾或氢氧化钠。
     立体异构混合物、 例如非对映异构体的混合物可通过适宜分离方法、 以众人皆知 的方式分离成其对应的异构体。例如， 非对映异构体混合物可通过分级结晶、 层析、 溶剂分 布和类似程序分离成其单独非对映异构体。该分离可在起始化合物层面发生或在式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物本身发生。对映异构体可通过以下方式分离 ： 形成 非对映异构体盐， 例如， 通过与对映体纯的手性酸形成盐 ； 或通过层析， 例如通过 HPLC， 使 用带手性配体的层析底物。
     应强调的是， 与本文所提及转化类似的反应也可以在适宜中间体层面进行 ( 且因 此可用于制备对应原料 )。
     原料 ：
     式 II 和 III 的原料以及本文、 例如下文所提及的其他原料可按照或类似于本领域 已知方法制备、 已经为本领域所熟知和 / 或市售可得。尽管没有具体阐述原料的制备， 但该 化合物是已知的或可类似于本领域已知的方法、 例如在 WO 05/021519 或 WO04/096797 中所 述或如下文所公开来制备。新原料及其制备方法同样是本发明的实施方案。在优选的实施 方案中， 使用该原料且选择所选反应以便能够获得优选的化合物。
     在需要和方便时也可以以盐使用和 / 或获得的原料 ( 包括中间体 ) 中， 取代基优 选如对式 (I)、 (IA)、 (IA’ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物所定义。
     药物组合物、 用途及治疗方法
     本发明还涉及本文所公开的式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物作为 药物的用途。在一个实施方案中， 本发明包括包含式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物的组合物， 例如用于人类或兽医使用， 例如在需要抑制 PI3K 的情况下。
     在一个实施方案中， 本发明涉及治疗细胞增殖性疾病， 如肿瘤 ( 良性或恶性 ) 和 / 或癌细胞生长， 例如通过 PI3K 介导的。疾病可包括显示 PIK3CA 体细胞突变或种系突变 或 PTEN 体细胞突变的那些。具体来说， 该化合物可用于治疗人或动物 ( 例如鼠科动物 ) 癌 症， 包括例如肉瘤 ； 肺癌 ； 支气管癌 ； 前列腺癌 ； 乳癌 ( 包括散发性乳癌和 Cowden 病患者 ) ； 胰腺癌 ； 胃肠癌 ； 结肠癌 (colon cancer) ； 直肠癌 ； 结肠癌 (colon carcinoma) ； 结肠直肠 腺瘤 ； 甲状腺癌 ； 肝癌 ； 肝内胆管癌 ； 肝细胞癌 ； 肾上腺癌 ； 胃癌 (stomach cacer 或 gastric cacer) ； 神经胶质瘤 ； 胶质母细胞瘤 ； 子宫内膜癌 ； 黑素瘤 ； 肾癌 ； 肾盂癌 ； 膀胱癌 ； 子宫体 (uterine corpus) 癌 ； 子宫颈癌 ； 阴道癌 ； 卵巢癌 ； 多发性骨髓瘤 ； 食道癌 ； 白血病 ； 急性骨 髓性白血病 ； 慢性骨髓性白血病 ； 淋巴细胞性白血病 ； 髓性白血病 ； 脑癌 ； 脑癌瘤 ； 口腔癌 及咽癌 ； 喉癌 ； 小肠癌 ； 非霍奇金淋巴瘤 ； 黑素瘤 ； 绒毛状结肠腺瘤 ； 瘤形成 (neoplasia) ；上皮性瘤形成 ； 淋巴瘤 ； 乳腺癌 (mammary carcinoma) ； 基底细胞癌 ； 鳞状细胞癌 ； 光化性角 化病 ； 肿瘤疾病， 包括实体肿瘤 ； 颈部或头部肿瘤 ； 真性红细胞增多症 ； 原发性血小板增多 症和骨髓纤维化伴骨髓外化生。
     在其它实施方案中， 疾患或病症 ( 例如 PI3K 介导的 ) 选自 ： 表皮增殖过度、 前列腺 增生、 瘤形成、 上皮性瘤形成、 Cowden 综合征、 莱尔米特 - 杜克洛病 (Lhermitte-Dudos 病 ) 或 Bannayan-Zonana 综合征、 哮喘、 COPD、 ARDS、 吕弗勒综合征 (Loffler′ s syndrome)、 嗜 酸性粒细胞性肺炎、 寄生虫 ( 尤其后生动物 ) 侵染 ( 包括热带肺嗜酸性粒细胞增多症 )、 支 气管肺曲霉病、 结节性多动脉炎 ( 包括 Churg-Strauss 综合征 )、 嗜酸细胞肉芽肿、 由药物反 应引起的侵袭气道的嗜酸性粒细胞相关病症、 银屑病、 接触性皮炎、 特应性皮炎、 斑秃、 多形 性红斑、 疱疹样皮炎、 硬皮病、 白癜风、 变应性血管炎、 荨麻疹、 大疱性类天疱疮、 红斑狼疮、 天疱疮、 获得性大疱性表皮松解、 自身免疫性血液学病症 ( 例如溶血性贫血、 再生障碍性贫 血、 纯红细胞贫血和特发性血小板减少 )、 系统性红斑狼疮、 多发性软骨炎、 硬皮病、 韦格纳 肉芽肿病 (Wegener granulomatosis)、 皮肌炎、 慢性活动性肝炎、 重症肌无力、 斯 - 琼氏综 合征 (Steven-Johnson syndrome)、 特发性口炎性腹泻、 自身免疫性炎性肠病 ( 例如溃疡性 结肠炎及局限性回肠炎 )、 内分泌性眼病、 格雷夫斯氏病 (Grave’ s 病 )、 结节病、 牙槽炎 / 肺 泡炎、 慢性过敏性肺炎、 多发性硬化、 原发性胆汁性肝硬化、 ( 前及后 ) 葡萄膜炎、 间质性肺 纤维化、 银屑病性关节炎、 肾小球肾炎、 心血管疾病、 动脉粥样硬化、 高血压、 深部静脉血栓 形成、 中风、 心肌梗塞、 不稳定型心绞痛、 血栓栓塞、 肺栓塞、 血栓溶解疾病、 急性动脉缺血、 外周血栓性闭塞和冠状动脉疾病、 再灌注损伤、 视网膜病变如糖尿病性视网膜病变或高压 氧诱导的视网膜病变、 和以眼内压升高或分泌眼房水为特征的疾患， 例如青光眼。
     对于上述用途， 所需剂量当然会根据施用方式、 拟治疗的特定疾患及所期望的治 疗效果而变化。通常， 将满意结果指定为通过全身性施用日剂量约 0.03-10.0mg/kg 体重获 得。 较大哺乳动物例如人类的指定日剂量是在约 0.5mg 至约 1g 的范围内， 其可方便地施用， 例如， 多达一天四次地分剂量施用或以延迟形式施用。适用于口服施用的单位剂型包含约 0.1-500mg 活性成分。
     式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物可通过任意一种常规途径施用， 尤 其经肠， 例如经口， 例如以片剂或胶囊剂的形式 ； 或胃肠外， 例如以可注射溶液或混悬液的 形式 ； 局部， 例如以洗剂、 凝胶、 软膏或乳膏形式 ； 通过吸入、 鼻内 ； 或以栓剂形式。
     式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物可以以游离形式或以如上文所述 可药用盐的形式施用。该盐可以采用常规方式制备并显示与游离化合物相同级别的活性。
     因此， 本发明还提供 ：
     ●预防和治疗需要该治疗的受试者中的如上文所述的由 PI3、 例如 PI3 激酶 α 酶激活而介导的疾患、 病症或疾病的方法， 该方法包含向所述受试者给予有效量的式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物或其可药用盐。
     ●游离形式或可药用盐形式的式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物作 为药物、 例如在本文所述的任一方法中的用途。
     ●游离形式或可药用盐形式的式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物， 用 作药物， 例如用于本文所述任一方法中， 特别用于一种或多种磷脂酰肌醇 3- 激酶介导的疾 病。●游离形式或可药用盐形式的式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物在 本文所述任一方法中的用途， 特别用于治疗一种或多种磷脂酰肌醇 3- 激酶介导的疾病。
     ●游离形式或可药用盐形式的式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物在 本文所述任一方法中的用途， 特别用于制备治疗一种或多种磷脂酰肌醇 3- 激酶介导的疾 病的药物。
     PI3K 可用作整合平行的信号传导路径的第二信使节点， 陆续有证据显示 PI3K 抑 制剂与其它路径抑制剂的联合可用于治疗人类癌症及增殖性疾病。约 20-30％的人类乳癌 过度表达 Her-2/neu-ErbB2， 即药物曲妥珠单抗 (trastuzumab) 的靶点。 尽管曲妥珠单抗已 经在一些表达 Her-2/neu-ErbB2 的受试者中显示持久响应， 但仅这些受试者中的亚群有反 应。最近的成果已经显示， 曲妥珠单抗与 PI3K 或 PI3K/AKT 路径的抑制剂的联合可显著改 善该有限的响应率 (Chan 等人， Breast Can.Res.Treat.91 ： 187(2005) ； Woods Ignatoski 等人， Brit.J.Cancer 82 ： 666(2000) ； Nagata 等人， Cancer Cell 6 ： 117(2004))。
     多种人类恶性肿瘤表达 Her1/EGFR 激活突变或 Her1/EGFR 含量增加， 且已经研发 出多种抗体和小分子抑制剂来对抗此受体酪氨酸激酶， 包括塔西法 (tarceva)、 吉非替尼 (gefitinib) 及艾比特思 (erbitux)。 然而， 尽管 EGFR 抑制剂对某些人类肿瘤 ( 例如 NSCLC) 显示抗肿瘤活性， 但其不能提高所有表达 EGFR 肿瘤患者中的总体患者存活率。这可通过以 下事实合理解释 ： 多种恶性肿瘤中， Her1/EGFR 的许多下游靶点以高频率突变或失调， 包括 PI3K/Akt 路径。例如， 在体外测定中， 吉非替尼抑制腺癌细胞系的生长。尽管如此， 仍可选 择对吉非替尼具有抗性、 证实 PI3/Ak 路径激活增加的该类细胞系的亚克隆。该路径的下调 或抑制使抗性亚克隆对吉非替尼敏感 (Kokubo 等人， Brit.J.Cancer 92 ： 1711(2005))。此 外， 在荷有 PTEN 突变且过度表达 EGFR 的细胞系的体外乳癌模型中， 抑制 PI3K/Akt 路径和 EGFR 二者产生协同效应 (She 等人， Cancer Cell 8 ： 287-297(2005))。这些结果显示， 吉非 替尼与 PI3K/Akt 路径抑制剂的联合将是有吸引力的癌症治疗策略。
     AEE778(Her-2/neu/ErbB2、 VEGFR 和 EGFR 的抑制剂 ) 与 RAD001(Akt 的下游靶点 mTOR 的抑制剂 ) 的联合在胶质母细胞瘤异种移植物模型中产生较单独任一药剂更强的联 合功效 (Goudar 等人， Mol.Cancer.Ther.4 ： 101-112(2005))。
     抗雌激素药例如他莫昔芬 (tamoxifen) 通过诱导细胞周期停滞来抑制乳癌生长， 这需要细胞周期抑制剂 p27Kip 的作用。近年， 已经证实， Ras-Raf-MAP 激酶路径的激活会 改变 p27Kip 的磷酸化状态， 由此消弱其遏阻细胞周期的抑制活性， 从而造成抗雌激素抗性 (Donovan 等人， J.Biol.Chem.276 ： 40888， (2001))。如 Donovan 等人报道， 通过使用 MEK 抑 制剂治疗来抑制 MAPK 信号传导逆转了激素难治性乳癌细胞系中 p27 的异常磷酸化状态， 从而恢复激素敏感性。类似地， Akt 对 p27Kip 的磷酸化也消除了其使细胞周期停滞的作用 (Viglietto 等人， Nat Med.8 ： 1145(2002))。
     因此， 另一方面， 本发明还提供式 (I)、 (IA)、 (IA’ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物， 用 于治疗激素依赖性癌症如乳癌及前列腺癌。 该用途旨在逆转使用常规抗癌剂时这类癌症中 常见的激素抗性。
     在血液学癌症如慢性髓性白血病 (CML) 中， 染色体易位是组成型激活 BCR-Abl 酪 氨酸激酶的原因。患病患者由于 Abl 激酶活性受到抑制而对小分子酪氨酸激酶抑制剂伊 马替尼 (imatinib) 产生反应。然而， 许多患有晚期疾病的患者开始对伊马替尼反应， 但是后来由于 Abl 激酶结构域中产生赋予抗性的突变而复发。体外研究已显示 BCR-Abl 采用 Ras-Raf 激酶路径来引发其效应。 此外， 抑制相同路径中的一种以上的激酶可提供对抗赋予 抗性突变的额外保护。
     因此， 另一方面， 本发明还提供式 (I)、 (IA)、 (IA’ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物， 用于 联合至少一种选自激酶抑制剂的其他药剂， 例如格列卫 (Gleevec ) 以治疗血液学癌症， 例如慢性髓性白血病 (CML)。该用途旨在逆转或预防对所述至少一种其他药剂的抗性。 由于 PI3K/Akt 路径的激活会驱动细胞存活， 因此， 抑制该路径并联合促使癌细 胞凋亡的疗法、 包括放射疗法及化学疗法， 会带来改良的反应 (Ghobrial 等人， CA Cancer J.Clin 55 ： 178-194(2005))。作为一个实例， PI3K 激酶抑制剂与卡铂联合在体外细胞增 殖和细胞凋亡测定中和在异种移植物卵巢癌模型的体内肿瘤功效中均显示了协同效应 (Westfall 和 Skinner， Mol.Cancer Ther.4 ： 1764-1771(2005))。
     除癌症和增殖性疾病外， 越来越多的证据显示 1A 类及 1B 类 P13 激酶抑制剂在其 他疾病领域中具有治疗用途。已经显示 p110β(PIK3CB 基因的 P13K 同种型产物 ) 的抑制 牵涉于剪切力诱导的血小板激活 (Jackson 等人， Nature Medicine 11 ： 507-514(2005))。 因此， 抑制 p110β 的 PI3K 抑制剂可在抗血栓疗法中作为单一药剂使用或联合使用。同 种型 p110δ 即 PIK3CD 基因的产物， 在细胞功能和分化 (Clayton 等人， J.Exp.Med.196 ： 753-763(2002))、 T- 细 胞 依 赖 性 及 非 依 赖 性 抗 原 反 应 (Jou 等 人， Mol.Cell.Biol.22 ： 8580-8590(2002) 和肥大细胞分化 (Ali 等人， Nature 431 ： 1007-1011(2004)) 中非常重 要。因此， 预期 p110δ- 抑制剂可用于治疗 B- 细胞驱动的自身免疫疾病和哮喘。最后，
    p110γPI3KC基因的同种型产的抑制会导致降低的 T 细但非 B 细反应 .(Reif等人， J.Immunol.173 ： 2236-2240(2004)， 且其抑制在自身免疫疾病的动物模型中显示了功 效 (Camps 等人， Nature Medicine 11 ： 936-943(2005) ； Barber 等人， Nature Medicine 11 ： 933-935(2005)。
     本发明进一步提供药物组合物， 包含至少一种式 (I)、 (IA)、 (IA’ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物与适于给人或动物受试者施用的药用赋形剂， 其单独或与另一治疗剂、 例如另 一抗癌剂联合。
     本发明进一步提供治疗患有细胞增殖性疾病如癌症的人或动物受试者的方法。 因 此， 本发明提供需要该治疗的人和动物的治疗方法， 其包括向该受试者施用单独或与一种 或多种其他治疗剂如其他抗癌剂组合的治疗有效量的式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物。 具体而言， 组合物或者以联合治疗剂共同配制或单独施用。 适宜与式 I 化合物 一起使用的抗癌剂包括但不限于一种或多种选自下列的化合物 ： 激酶抑制剂、 抗雌激素药、 抗雄激素药、 其他抑制剂、 癌症化疗药物、 烷化剂、 螯合剂、 生物反应调节剂、 癌症疫苗、 用于 反义疗法的药物， 如下所述 ：
     A. 激酶抑制剂 ： 作为抗癌剂与式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物联 合使用的激酶抑制剂包括表皮生长因子受体 (EGFR) 激酶抑制剂， 例如小分子喹唑啉类， 例如吉非替尼 (US 5457105、 US 5616582 和 US 5770599)、 ZD-6474(WO 01/32651)、 厄洛 替尼 (erlotinib)( 塔西法 ， US 5,747,498 和 WO 96/30347) 及拉帕替尼 (lapatinib)(US 6,727,256 和 WO 02/02552) ； 血 管 内 皮 生 长 因 子 受 体 (VEGFR) 激 酶 抑 制 剂， 包括SU-11248(WO 01/60814)、 SU 5416(US 5,883,113 和 WO 99/61422)、 SU 6668(US 5,883,113 和 WO 99/61422)、 CHIR-258(US 6,605,617 和 US 6,774,237)、 瓦他拉尼 (vatalanib) 或 PTK-787(US 6,258,812)、 VEGF-Trap(WO 02/57423)、 B43- 染料木黄酮 (WO-09606116)、 芬 维 a 胺 (fenretinide)( 视黄酸对羟基苯基胺 )(US 4,323,581)、 IM-862(WO 02/62826)、 贝 伐珠单抗 (bevacizumab) 或 Avastin (WO 94/10202)、 KRN-951、 3-[5-( 甲基磺酰基哌啶甲 基 )- 吲哚基 ]- 喹诺酮、 AG-13736 和 AG-13925、 吡咯并 [2， 1-f][1， 2， 4] 三嗪类、 ZK-304709、 Veglin 、 VMDA-3601、 EG-004、 CEP-701(US 5,621,100)、 Cand5(WO 04/09769) ； Erb2 酪氨 酸激酶抑制剂， 例如帕妥珠单抗 (pertuzumab)(WO 01/00245)、 曲妥珠单抗及利妥昔单抗 (rituximab) ； Akt 蛋白激酶抑制剂， 如 RX-0201 ； 蛋白激酶 C(PKC) 抑制剂， 如 LY-317615(WO 95/17182) 及哌立福辛 (perifosine)(US 2003171303) ； Raf/Map/MEK/Ras 激酶抑制剂包 括索拉非尼 (sorafenib)(BAY 43-9006)、 ARQ-350RP、 LErafAON、 BMS-354825AMG-548 和 WO 03/82272 中公开的其他抑制剂 ； 纤维母细胞生长因子受体 (FGFR) 激酶抑制剂 ； 细胞依赖 血小 性激酶 (CDK) 抑制剂， 包括 CYC-202 或 roscovitine(WO 97/20842 和 WO 99/02162) ； 板衍生性生长因子受体 (PDGFR) 激酶抑制剂如 CHIR-258、 3G3mAb、 AG-13736、 SU-11248 和 SU6668 ； 及 Bcr-Abl 激酶抑制剂和融合蛋白如 STI-571 或格列卫 (Gleevec )( 伊马替尼 )。
    B. 抗雌激素药 ： 用于与式 (I)、 (IA)、 (IA’ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物联合用 于抗癌疗法中的雌激素靶向剂包括选择性雌激素受体调节剂 (SERMs)， 包括他莫西芬、 托 瑞米芬 (toremifene)、 雷洛昔芬 (raloxifene) ； 芳香酶抑制剂， 包括瑞宁得 (Arimidex 或氟维司群) 或阿那曲唑 (anastrozole) ； 雌激素受体下调剂 (ERDs)， 包括 Faslodex(fulvestrant)。
     C. 抗雄激素药 ： 用于与式 (I)、 (IA)、 (IA’ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物联合用于 抗癌疗法中的雄激素靶向剂包括氟他胺 (flutamide)、 比卡鲁胺 (bicalutamide)、 非那雄 胺 (finasteride)、 氨鲁米特 (aminoglutethamide)、 酮康唑 (ketoconazole) 及皮质类固醇 (corticosteroid)。
     D. 其他抑制剂 ： 作为抗癌剂与式 (I)、 (IA)、 (IA ′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物 联合使用的其他抑制剂包括蛋白法尼基转移酶抑制剂， 包括替比伐尼 (tipifarnib) 或 R-115777(US 2003134846 和 WO 97/21701)、 BMS-214662、 AZD-3409 及 FTI-277 ； 拓扑异构 酶抑制剂， 包括美巴龙 (merbarone) 和双氟莫替康 (diflomotecan)(BN-80915) ； 有丝分裂 驱动蛋白纺锤体蛋白 (KSP) 抑制剂， 包括 SB-743921 和 MKI-833 ； 蛋白酶体调节剂， 例如硼 替佐米 (bortezomib) 或 Velcade (US 5,780,454)、 XL-784 ； 和环加氧酶 (COX-2) 抑制剂， 包括非甾类抗炎药物 I(NSAID)。
     E. 癌症化疗药物 ： 作为抗癌剂与式 (I)、 (IA)、 (IA ′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合 物联合使用的特定癌症化疗剂包括阿那曲唑 (Arimidex )、 比卡鲁胺 (Casodex )、 硫 酸博来霉素 (bleomycin sulfate)(Blenoxane 安注射液 (Busulfex )、 白消安 (busulfan)(Myleran )、 白消)、 卡培他滨 (capecitabine)(Xeloda )、 卡莫司汀 (BiCNU)、 N4- 戊氧基羰基 -5- 去氧 -5- 氟胞苷、 卡铂 (Paraplatin (Leukeran)、 苯丁酸氮芥 (chlorambucil))、 顺 铂 (cisplatin)(Platinol22)、 克 拉 屈 滨 (cladribine)(LeustatinCN 102471351 A说明书或 Neosar17/81 页)、 环 磷 酰 胺 (cyclophosphamide)(Cytoxan)、 阿 糖 胞 苷 (cytarabine)、 )、 阿糖胞苷脂质体注射液胞 嘧 啶 阿 糖 胞 苷 (cytosine arabinoside)(Cytosar-U (DepoCyt )、 达 卡 巴 嗪 (dacarbazine)(DTIC-Dome)、 更 生 霉 素 (dactinomycin)( 放 )、 柔红霉素柠檬线 菌 素 D(Actinomycin D)、 Cosmegan)、 盐 酸 柔 红 霉 素 (Cerubidine 酸盐脂质体注射液 (DaunoXome (Taxotere)、 地塞米松 (dexamethasone)、 多西他赛 (docetaxel) 、 Rubex )、， US 2004073044)、 盐酸多柔比星 (doxorubicin)(Adriamycin )、 磷酸氟达拉滨 (Fludara依托泊苷 (etoposide)(Vepesid 、 Efudex )、 氟他胺 (Eulexin)、 5- 氟尿嘧啶 (Adrucil)、 替扎他滨 (tezacitibine)、 吉西他滨 (Gemcitabine) )、 伊达比星 (Idarubicin)(Idamycin )、 L- 天( 二氟去氧胞苷 )、 羟基脲 (hydroxyurea)(Hydrea )、 异 环 磷 酰 胺 (ifosfamide)(IFEX 冬 酰 胺 酶 (ELSPAR (Alkeran)、 伊 立 替 康 (irinotecan)(Camptosar)、 甲 酰 四 氢 叶 酸 钙 (leucovorin calcium)、 美 法 仑 (melphalan) )、 氨甲喋呤 (methotrexate)(Folex )、 米托)、 6- 巯基嘌呤 (Purinethol蒽醌 (mitoxantrone)(Novantrone)、 麦罗塔 (mylotarg)、 紫杉醇 (Taxol)、 菲尼克斯(phoenix)(Yttrium90/MX-DTPA)、 喷 司 他 丁 (pentostatin)、 聚 苯 丙 生 20(polifeprosan 20) 与 卡 莫 司 汀 植 入 物 (Gliadel )、 柠 檬 酸 他 莫 西 芬 (Nolvadex )、 替尼泊苷 (teniposide)(Vumon (Tirazone )、 6- 硫 鸟 嘌 呤、 噻 替 哌 (thiotepa)、 替 拉 扎 明 (tirapazamine) )、 长春碱 (vinblastine)(Velban )。)、 注射用托泊替康盐酸盐 (Hycamptin)、 长春新碱 (vincristine)(Oncovin
    ) 和长春瑞滨 (vinorelbine)(NavelbineF. 烷 化 剂 ： 用 于 与 式 (I)、 (IA)、 (IA ′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化 合 物 联 合 使 用 的 烷 基 化 剂 包 括 VNP-40101M 或 克 瑞 替 嗪 (cloretizine)、 奥 沙 利 铂 (oxaliplatin) (US 4,169,846、 WO 03/24978 和 WO 03/04505)、 葡 磷 酰 胺 (glufosfamide)、 马磷酰胺 (mafosfamide)、 凡 毕 复 (etopophos)(US 5,041,424)、 泼 尼 莫 司 汀 (prednimustine)、 曲 奥舒凡 (treosulfan) ； 白消安 ； 伊罗夫文 (irofluven)( 酰基富烯 (acylfulvene)) ； 本可 麦 定 (penclomedine) ； 吡 唑 啉 吖 啶 (pyrazoloacridine)(PD-115934) ； O6- 苄 基 鸟 嘌 呤 ； 地西他滨 (decitabine)(5- 氮杂 -2- 去氧胞苷 ) ； 伯斯坦尼辛 (brostallicin) ； 丝裂霉素 C(mitomycin C)(MitoExtra) ； TLK-286(Telcyta ) ； 替莫唑胺 (temozolomide) ； 曲贝替定 (trabectedin)(US 5,478,932) ； AP-5280( 顺铂的铂酸盐制剂 ) ； 泊非霉素 (porfiromycin) 和克拉兹德 (clearazide)( 氮芥 (meclorethamine))。
     G. 螯 合 剂 ： 用 于 与 式 (I)、 (IA)、 (IA ′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化 合 物 联 合 使 用 的 螯 合 剂 包 括 四 硫 钼 酸 盐 (tetrathiomolybdate)(WO 01/60814) ； RP-697 ； 嵌合 T84.66(cT84.66) ； 钆膦维司 (gadofosveset)(Vasovist ) ； 去铁敏 (deferoxamine) 及任 选与电穿孔 (EPT) 联合的博来霉素。
     H. 生物反应调节剂 ： 用于与式 (I)、 (IA)、 (IA ′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物联 合使用的生物反应调节剂如免疫调节剂包括星形孢霉素 (staurosprine) 和其大环类似 物， 包括 UCN-01、 CEP-701 和米哚妥林 (midostaurin)( 参见 WO 02/30941、 WO 97/07081、WO 89/07105、 US 5,621,100、 WO 93/07153、 WO 01/04125、 WO 02/30941、 WO 93/08809、 WO 94/06799、 WO 00/27422、 WO 96/13506 和 WO 88/07045) ； 角 鲨 胺 (squalamine)(WO 01/79255) ； DA-9601(WO 98/04541 和 US 6,025,387) ； 阿 仑 珠 单 抗 (alemtuzumab) ； 干扰 素 ( 例如 IFN-a、 IFN-b 等 ) ； 白介素、 尤其 IL-2 或阿地白介素 (aldesleukin) 以及 IL-1、 IL-3、 IL-4、 IL-5、 IL-6、 IL-7、 IL-8、 IL-9、 IL-10、 IL-11、 IL-12 及其具有大于天然人类序 列的 70％的氨基酸序列的活性生物变异体 ； 六甲蜜胺 (altretamine)(Hexalen ) ； SU 101 或来氟米特 (leflunomide)(WO 04/06834 和 US 6,331,555) ； 咪唑并喹啉类， 如瑞喹莫德 (resiquimod) 和咪喹莫德 (imiquimod)(US 4,689,338、 5,389,640、 5,268,376、 4,929,624、 5,266,575 、 5,352,784 、 5,494,916 、 5,482,936 、 5,346,905 、 5,395,937 、 5,238,944 和 5,525,612) ； 和 SMIP， 包括苯并吡咯类、 蒽醌类、 缩胺基硫脲类 (thiosemicarbazones) 及色 胺酮 (tryptanthrin)(WO 04/87153、 WO 04/64759 和 WO 04/60308)。
     I. 癌 症 疫 苗 ： 用 于 与 式 (I)、 (IA)、 (IA ′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化 合 物 联 合 使 用 的 抗 癌 疫 苗 包 括 Avicine (Tetrahedron Lett.26 ： 2269-70(1974)) ； 奥戈伏单 抗 (oregovomab)(OvaRex )； Theratope (STn-KLH) ； 黑色素瘤疫苗； GI-4000 系 列(GI-4014、 GI-4015 和 GI-4016)， 其 针 对 Ras 蛋 白 的 五 种 突 变 ； GlioVax-1 ； MelaVax ； Advexin 或 INGN-201(WO 95/12660) ； Sig/E7/LAMP-1， 其编码 HPV-16 E7 ； MAGE-3 疫苗或 M3TK(WO 94/05304) ； HER-2VAX ； ACTIVE， 其刺激对肿瘤具有特异性的 T- 细胞 ； GM-CSF 癌症 疫苗 ； 及基于单核细胞增多性李斯特菌 (Listeria monocytogenes) 的疫苗。
     J. 反义疗法 ： 用于与式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物联合使用的 抗癌剂也包括反义组分， 例如 AEG-35156(GEM-640) ； AP-12009 和 AP-11014(TGF-β2- 特异 性反义寡核苷酸 ) ； AVI-4126 ； AVI-4557 ； AVI-4472 ； 奥利莫森 (oblimersen)(Genasense )； JFS2 ； 安普利森 (aprinocarsen)(WO 97/29780) ； GTI-2040(R2 核糖核酸还原酶 mRNA 反 义寡聚物 )(WO 98/05769) ； GTI-2501(WO 98/05769) ； 脂质体包封的 c-Raf 反义寡去氧核苷 酸 (LErafAON)(WO 98/43095) ； 和 Sirna-027( 基于 RNAi 的靶向 VEGFR-1 mRNA 的治疗剂 )。
     式 (I)、 (IA)、 (IA ′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物也可以与支气管扩张药物或抗 组胺药物物质联合在药物组合物中。该类支气管扩张药物包括抗胆碱能药物或抗毒蕈 碱剂， 尤其格隆溴铵 (glycopyrrolate)、 异丙托溴铵 (ipratropium bromide)、 氧托溴铵 (oxitropium bromide) 和噻托溴铵 (tiotropium bromide)、 OrM3、 阿地溴铵 (aclidinium)、 CHF5407、 GSK233705 和 β-2- 肾 上 腺 素 能 受 体 激 动 剂， 例 如 舒 喘 灵 (salbutamol)、 特 普 他 林 (terbutaline)、 沙 美 特 罗 (salmeterol)、 卡 莫 特 罗 (carmoterol)、 米维特罗 (milveterol) 及尤其是茚达特罗 (indacaterol) 和福莫特罗 (formoterol)。共同治疗 性抗组胺药物物质包括盐酸西替利嗪 (cetirizine hydrochloride)、 富马酸氯马斯汀 (clemastine fumarate)、 异丙嗪 (promethazine)、 氯雷他定 (loratadine)、 地氯雷他定 (desloratadine)、 苯海拉明 (diphenhydramine) 和盐酸非索非那定。
     本发明在另一方面提供包含式 (I)、 (IA)、 (IA ′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物和 一种或多种可用于治疗血栓溶解疾病、 心脏病、 中风等的化合物的组合。该类组合物包括 阿司匹林、 链激酶、 纤维蛋白溶酶原 (plasminogen) 激活剂、 尿激酶、 抗凝血剂、 抗血小板药 ( 例如 PLAVIX ； 硫酸氢氯吡格雷 (clopidogrel bisulfate)、 他汀类药物 (statin)( 例如LIPITOR 或阿伐他汀钙 (Atorvastatin calcium)、 ZOCOR( 辛伐他汀 )、 CRESTOR( 瑞舒伐他 汀 (Rosuvastatin)) 等 )、 β 阻断剂 ( 例如阿替洛尔 (Atenolol))、 NORVASC( 苯磺酸氨氯地 平 (amlodipine besylate)) 和 ACE 抑制剂 ( 例如赖诺普利 (lisinopril))。
     本发明在另一方面提供包含式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物和一 种或多种可用于抗高血压治疗的化合物的组合。该类化合物包括 ACE 抑制剂 ； 降脂剂如他 汀类药物、 LIPITOR( 阿托伐他汀钙 ) ； 钙通道阻断剂， 例如 NORVASC( 苯磺酸氨氯地平 )。
     本发明在另一方面提供包含式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物和一 种或多种选自下列的化合物的组合 ： 贝特类药物 (fibrates)、 β 阻断剂、 NEPI 抑制剂、 血管 紧张素 -2 受体抗结剂和血小板聚集抑制剂。
     本发明在另一方面提供包含式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物和适于 治疗炎症疾病、 包括类风湿性关节炎的化合物的组合。该类化合物可选自 ： TNF-α 抑制剂， 如抗 -TNF-α 单克隆抗体 ( 如 REMICADE、 CDP-870) 和 D2E7(HUMIRA) 及 TNF 受体免疫球蛋白 融合分子 ( 例如 ENBREL)、 IL-1 抑制剂、 受体拮抗剂或可溶性 IL-1Rα( 例如 KINERET 或 ICE 抑制剂 )、 非甾体抗炎药 (NSAIDS)、 吡罗昔康 (piroxicam)、 双氯芬酸 (diclofenac)、 萘普 生 (naproxen)、 氟比洛芬 (flurbiprofen)、 非诺洛芬 (fenoprofen)、 酮洛芬 (ketoprofen)、 布 洛 芬 (ibuprofen)、 灭 酸 类 (fenamates)、 甲 芬 那 酸 (mefenamic acid)、 吲哚美辛 (indomethacin)、 舒林酸 (sulindac)、 阿扎丙宗 (apazone)、 吡唑啉酮类 (pyrazolones)、 保 泰松 (phenylbutazone)、 阿司匹林 (aspirin)、 COX-2 抑制剂 ( 例如 CELEBREX( 塞来昔布 (celecoxib))、 PREXIGE( 鲁米考昔 (lumiracoxib)))、 金属蛋白酶抑制剂 ( 优选 MMP-13 选 择性抑制剂 )、 p2x7 抑制剂、 α2α 抑制剂、 NEUROTIN、 普瑞巴林 (pregabalin)、 低剂量氨甲 喋呤、 来氟米特、 羟氯喹、 d- 青霉胺、 金诺芬 (auranofin) 或胃肠外或口服金。
     本发明在另一方面提供包含式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物和适于 治疗骨关节炎的化合物的组合。 该类化合物可选自 ： 标准非甾体抗炎药 ( 下文称为 NSAID)， 例如吡罗昔康、 双氯芬酸 ； 丙酸类， 例如萘普生、 氟比洛芬、 非诺洛芬、 酮洛芬和布洛芬 ； 灭 酸类 (fenamates)， 例如甲芬那酸、 吲哚美辛、 舒林酸、 阿扎丙宗 ； 吡唑啉酮类， 例如保泰松 ； 水杨酸类， 例如阿司匹林 ； COX-2 抑制剂， 例如塞来昔布、 伐地考昔 (valdecoxib)、 鲁米考昔 和伊诺考昔 (etoricoxib) ； 镇痛药及关节内疗法， 例如皮质类固醇及透明质酸， 例如海尔 根 (hyalgan) 和欣维可 (synvisc)。
     本发明在另一方面提供包含式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物和抗 病毒药和 / 或防腐化合物的组合。该类抗病毒药可选自泛罗赛 (Viracept)、 AZT、 阿昔洛韦 (acyclovir) 和泛昔洛韦 (famciclovir)。该防腐化合物可选自 Valant。
     本发明在另一方面提供包含式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物和一 种或多种选自下列的药剂的组合 ： CNS 药剂， 例如抗抑郁药 ( 舍曲林 (sertraline))、 抗-帕 金森药物 ( 如盐酸司立吉林 (deprenyl)、 左旋多巴 (L-dopa)、 雷奎普 (Requip)、 Mirapex ； MAOB 抑 制 剂 ( 例 如 司 来 吉 兰 (selegine) 和 雷 沙 吉 兰 (rasagiline) ； comP 抑 制 剂 ( 如 Tasmar) ； A-2 抑制剂 ； 多巴胺再摄取抑制剂 ； NMDA 拮抗剂 ； 尼古丁激动剂 ； 多巴胺激动剂 ； 及神经元型一氧化氮合酶抑制剂。
     本发明在另一方面提供包含式 (I)、 (IA)、 (IA ′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物和 一种或多种抗阿尔茨海默病药物的组合。该类抗阿尔茨海默病药物可选自 ： 多奈哌齐(donepezil)、 他克林 (tacrine)、 α2δ 抑制剂、 NEUROTIN、 普瑞巴林 (pregabalin)、 COX-2 抑制剂、 丙戊茶碱 (propentofylline) 或美曲膦酯 (metryfonate)。
     本发明在另一方面提供包含式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物和抗 骨质疏松药和 / 或免疫抑制剂的组合。该类骨质疏松药可选自 ： EVISTA( 盐酸雷洛昔芬 )、 屈洛昔芬 (droloxifene)、 拉索昔芬 (lasofoxifene) 或福善美 (fosomax)。该类免疫抑制 剂可选自 FK-506 和雷帕霉素。
     在优选的实施方案的一方面， 提供了包括一种或多种式 (I)、 (IA)、 (IA’ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物和本文所公开组合伴侣的药盒。代表性药盒包括 PI3K 抑制剂化合物 ( 例 如式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物 ) 和包括通过施用 PI3K 抑制量的化合物 来治疗细胞增殖性疾病的指导的包装说明书或其它标识。
     通常， 式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物可通过用于具有类似效用的 药剂的任一种公认的施用方式以治疗有效量施用。式 (I)、 (IA)、 (IA’ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物即活性成分的实际量应视多种因素而定， 如待治疗疾病的严重度、 患者的年龄及相 对健康状况、 所用化合物的效能、 施用途径和形式、 及其他因素。药物的施用可以每天 1 次 以上， 优选每天 1 次或 2 次。所有这些因素均为主治医师所熟知。式 I 化合物的治疗有效 量可在约 0.05 至约 50mg/ 公斤接受者体重 / 天的范围内 ； 优选为约 0.1 至 25mg/kg/ 天， 更 优选为 0.5 至 10mg/kg/ 天。因此， 对于给 70kg 患者施用， 该剂量范围最优选为约 35-70mg/ 天。
     通常， 式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物可作为药物组合物通过任一 以下途径施用 ： 经口、 全身 ( 例如经皮、 鼻内或通过栓剂 )、 或胃肠外 ( 例如肌内、 静脉内或 皮下 ) 施用。优选的施用方式是使用可根据痛苦程度调节的方便日剂量方案经口施用。组 合物可采取如下形式 ： 片剂、 丸剂、 胶囊、 半固体剂、 粉剂、 缓释制剂、 溶液、 混悬液、 酏剂、 气 溶胶或任何其他合适组合物。用于施用式 I 化合物的另一优选方式是吸入。其是将治疗剂 直接递送至呼吸道的有效方法。
     制剂的选择取决于各种因素， 例如药物施用方式和药物物质的生物利用度。对于 经由吸入传递而言， 可将化合物配制成液体溶液、 混悬液、 气溶胶推进剂或干粉剂并装填至 用于施用的适宜分配器中。 有几种类型的药物吸入装置 - 喷雾器吸入器、 定量吸入器 (MDI) 及干粉吸入器 (DPI)。 喷雾器装置产生高速气流， 使治疗剂 ( 其以液体形式配制 ) 以雾形式 喷出， 被载入患者的呼吸道中。MDI 通常是用压缩气体封装的制剂。在启动后， 该装置由压 缩气体释放出定量的治疗剂， 由此提供一种施用定量药剂的可靠方法。 DPI 以自由流动粉剂 形式分配治疗剂， 该自由流动粉剂在呼吸期间可通过该装置分散于患者的吸入气流中。为 了获得自由流动粉剂， 可用赋形剂例如乳糖配制该治疗剂。测定量的治疗剂以胶囊形式储 存并在每次启动时进行分配。
     本发明还涉及式 I 化合物的粒径介于 10-1000nm、 优选 10-400nm 之间的制剂。 已经 根据增加表面积即缩小粒径可提高生物利用度的原理， 研发出特别适用于那些低生物利用 度药物的这类药物制剂。 例如， U.S.4,107,288 描述了一种具有 10nm 至 1000nm 的粒径范围 的颗粒的药物制剂， 其中活性成分载于大分子交联基质上。 U.S.5,145,684 描述了一种药物 制剂的制备， 其中将药物物质在表面活性剂存在下粉碎成纳米颗粒 ( 平均粒径为 400nm)， 然后将这些纳米颗粒分散于液体介质中， 得到具有相当高生物利用度的药物制剂。两个文件均通过引用并入。
     另一方面， 本发明提供包含 ( 治疗有效量的 ) 式 (I)、 (IA)、 (IA’ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物和至少一种可药用赋形剂的组合物。 可接受的赋形剂无毒性， 有助于施用， 且不 会对式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物的治疗效果造成不利影响。此赋形剂 可以是任何固体、 液体、 半固体或在气溶胶组合物的情况下为气体赋形剂， 其通常可由本领 域技术人员获得。 ，
     固体药物赋形剂包括淀粉、 纤维素、 滑石、 葡萄糖、 乳糖、 蔗糖、 明胶、 麦芽、 稻米、 面 粉、 白垩、 硅胶、 硬脂酸镁、 硬脂酸钠、 甘油单硬脂酸酯、 氯化钠、 脱脂奶粉等。
     液体和半固体赋形剂可选自甘油、 丙二醇、 水、 乙醇及各种油， 包括源于石油、 动 物、 植物或合成来源的油， 例如花生油、 大豆油、 矿物油、 芝麻油等。 优选的液体载体、 尤其是 用于可注射溶液包括水、 盐水、 含水右旋糖和二醇类。
     压缩气体可用于将式 I 化合物以气溶胶形式分散。适用于此目的的惰性气体 有 氮 气、 二 氧化碳 等。 其他适合的 药 用赋 形剂 及其 制剂 记载 于由 E.W.Martin 编 辑的 Remington′ s Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Company， 第 18 版， 1990)。
     制剂中化合物的量可在本领域技术人员采用的整个范围内变化。通常， 以重量百 分比 ( 重量％ ) 计， 该制剂可含有总制剂的约 0.01-99.99 重量％的式 I 化合物， 其余部分 为一种或多种适合的药用赋形剂。优选地， 该化合物是以约 1-80％重量％的水平存在。
     本发明另外涉及包含 ( 即含有或由…组成 ) 至少一种式 (I)、 (IA)、 (IA’ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物和至少一种可药用赋形剂的药物组合物。
     包含游离形式或可药用盐形式的式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物 与至少一种可药用赋形剂 ( 例如载体和 / 或稀释剂 ) 的药物组合物可以以常规方式通过混 合此类组分来制备。
     包含游离形式或可药用盐形式的式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物 且另外包含组合伴侣 ( 在一个剂量单元形式中或作为药盒 ) 与至少一种可药用载体和 / 或 稀释剂的组合药物组合物可以以常规方式、 通过将可药用载体和 / 或稀释剂与所述活性成 分混合来制备。
     因此， 本发明在其它方面提供
     ■组合药物组合物， 例如用于任一本文所述的方法， 其包含游离形式或可药用盐 形式的式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物与可药用稀释剂和 / 或载体。
     ■组合药物组合物， 包含游离形式或可药用盐形式的式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物作为活性成分 ； 一种或多种可药用载体物质和 / 或稀释剂和任选的一种 或多种其它药物物质。此类组合药物组合物可呈一种剂量单位形式或作为药盒。
     ■组合药物组合物， 其包含治疗有效量的游离形式或可药用盐形式的式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物和第二药物物质， 同时或相继施用。
     ■如上文所定义的方法， 包括共施用、 例如伴随或顺次施用治疗有效且无毒量的 式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物或其可药用盐， 和至少第二药物物质， 例如 如上文所述。
     ■药物组合物， 例如药盒， 其包含 a) 第一药剂， 其为游离形式或可药用盐形式的 如本文所公开的式 (I)、 (IA)、 (IA′ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 化合物， 和 b) 至少一种辅助药剂，例如如上文所述 ； 由此该药盒可包含其施用说明书。
     化合物式 (I)、 (IA)、 (IA’ )、 (IB) 和 / 或 (IC) 的下列实施例阐明本发明， 但并不 限制其范围。描述了用于制备此类化合物的方法。
     以摄氏度测量温度。除非另有说明， 否则反应是在室温发生且使用 ESI 获得 MS。 在中间体和实施例的制备和分析中使用下列 HPLC/MS 方法 ：
     方法 A1 至 A3(LCMS ： 分析型 HPLC/MS) ：
     系统 ： Agilent 1100 系列， 其装备有 Waters Micromass ZQ 2000 ESI+ 和 / 或 ESI
     柱： XBridge C18， 3x 30mm， 2.5 微米
     温度 ： 50℃
     洗脱剂 A ： H2O， 其含有 5％ CH3CN 和 0.8％ HCOOH
     洗脱剂 B ： CH3CN， 其含有 0.6％ HCOOH
     流速 ： 1.2-2.4mL/min
     方法 A1 ： 方法 Polar4a_p_100-900 和方法 Polar4a_pn_100-900 ：
     梯度 ： 0-2.9min ： 1％至 95％的 B
     方法 A2 ： 方法 Fast4_p_100-900 和方法 Fast4a_pn_100-900 ： 梯度 ： 0-2.4min ： 10％至 95％的 B
     方法 A3 ： 方法 Slow4a_pn_100-900 ：
     梯度 ： 0-4.4min ： 5％至 95％的 B
     方法 B( 制备型 HPLC) 仪器 ： Waters 制备型 HPLC 系统， 柱： SunfireTM Prep C18OBDTM 5 微米 30X 100mm， 温度 ： 25℃， 洗脱剂 ： 于 0.05％ TFA 水溶液中的 5-100％ CH3CN 梯度， 洗脱 20 分钟， 流速 ： 30mL/ 分钟， 检测 ： UV 254nm。
     方法 C( 制备型 HPLC) 仪器 ： Waters 制备型 HPLC 系统， 柱： SunfireTM Prep C18 OBDTM 5 微米 30X 100mm， 温度 ： 25℃， 洗脱剂 ： 于 0.05％ TFA 水溶液中的 5-50％ CH3CN 梯度， 洗脱 20 分钟， 流速 ： 30mL/ 分钟， 检测 ： UV 254nm。
     方法 D( 分析型 HPLC) ： 线性梯度 2-100％ CH3CN(0.1％ TFA) 和 H2O(0.1％ TFA) 进 行 5min+100％ CH3CN(0.1％ TFA) 进行 1.5min ； 在 215nm 检测， 在 30℃流速为 1mL/min。柱 ： Nucleosil 100-3C18(70x 4mm)
     方法 E( 制备型 HPLC/MS) 仪器 ： Gilson 制备型 HPLC 系统， 柱： SunfireTM Prep C18 OBDTM 5 微米 30X 100mm， 温度 ： 25℃， 洗脱剂 ： 于 0.05％ TFA 水溶液中的 5-100％ CH3CN 梯 度， 进行 20 分钟， 流速 ： 30mL/ 分钟， 检测 ： UV 254nm。
     方 法 F( 分 析 型 HPLC) 仪 器 ： Shimadzu SIL-10A， 方法： 线 性 梯 度 2-100 ％ CH3CN(0.1 ％ TFA) 和 H2O(0.1 ％ TFA) 进 行 4min+100 ％ CH3CN(0.1 ％ TFA) 进 行 2min ； 3min 回 到 -100 ％ CH3CN(0.1 ％ TFA) ； 在 215nm 检 测， RT 流 速 2mL/min. 柱 ： Nucleosil OD-5-100C18(150x 4.6mm)
     方法 G( 分析型 HPLC) 仪器 ：
     系统 ： Agilent 1100 系列，
     柱： HPHypersil BDS C18， 4x 125mm， 5 微米
     温度 ： 25℃
     洗脱剂 A ： H2O， 其含有 0.1％ v/v TFA
     洗脱剂 B ： CH3CN， 其含有 0.1％ v/v TFA
     梯度 ： 在 5min 内 10％→ 100％ B， 100％ B 进行 2.5min， 然后 1min → 10％ B
     流速 ： 1.5mL/min
     检测 ： UV 215nm
     方法 H( 分析型 HPLC) 仪器 ：
     系统 ： Agilent 1100 系列
     柱： Macherey-Nagel Nucleosil 100-3 C18HD， 4x 125mm， 3 微米
     温度 ： 30℃
     洗脱剂 A ： H2O， 其含有 0.1％ v/v TFA
     洗脱剂 B ： CH3CN， 其含有 0.1％ v/v TFA
     梯度 ： 在 7min 内 2％→ 100％ B， 100％ B 进行 2min， 然后 1min → 2％ B
     流速 ： 1.0mL/min
     检测 ： UV 215nm
     方法 I(LCMS ： 分析型 HPLC/MS) ：
     系统 ： Waters Acquity UPLC， 其装备有 Waters Micromass ZQ 2000 ESI+/
     柱： Acquity HSS T3 C18， 2.1x 50mm， 1.8 微米
     温度 ： 50℃
     洗脱剂 A ： H2O， 其含有 0.05％ v/v HCOOH 和 3.75mM 乙酸铵
     洗脱剂 B ： CH3CN， 其含有 0.04％ HCOOH
     梯度 ： 在 4.3min 内 2％→ 98％ B， 98％ B 进行 0.7min， 然后 0.1min → 2％ B 以及 用 2％ B 进行 0.9min
     流速 ： 1.0mL/min
     方法 J(LCMS ： 分析型 HPLC/MS) ：
     系统 ： Agilent 1100 系列 ； MS ： G1946D
     柱： Symmetry C8， 2.1x 50mm， 3.5 微米
     洗脱剂 A ： H2O， 其含有 0.1％ v/v HCOOH
     洗脱剂 B ： CH3CN， 其含有 0.1％ v/v HCOOH
     梯度 ： 0-3.3min ： 5％至 95％的 B
     流速 ： 1.0mL/min
     方法 K(LCMS ： 分析型 HPLC/MS) ：
     系统 ： Waters Acquity UPLC
     柱： Acquity HSS T3 C18， 2.1x 50mm， 1.8 微米
     洗脱剂 A ： H2O， 其含有 0.05％ v/v HCOOH 和 0.05％乙酸铵
     洗脱剂 B ： 乙腈， 其含有 0.04％ HCOOH
     梯度 ： 在 1.7min 内 2％→ 98％ B， 用 98％ B 进行 0.45min， 然后 0.04min → 2％ B
     流速 ： 1.2mL/min
     方法 L(LCMS ： 分析型 HPLC/MS) ：
     系统 ： Waters Aquity UPLC ； MS ： Waters AQ Detector
     柱： Aquity HSS， 1.8m 2.1x 50mm， 3/pk洗脱剂 A ： H2O， 其含有 0.1％ v/v HCOOH 洗脱剂 B ： CH3CN， 其含有 0.1％ v/v HCOOH 梯度 ： 0-1.5min ： 10％至 95％的 B， 然后 1min ： 95％ B 流速 ： 1.2mL/min ESI-MS ： 仪器 ： Micromass Platform II 洗脱剂 ： 含有 0.2％ v/v 的 25％氢氧化铵溶液的 H2O 中的 15％ v/v MeOH 流速 ： 0.05mL/min 在以下实例中， 使用下文所给出的缩写 ：
    中间体 A： 咪 唑 -1- 甲 酸 (8- 叔 丁 基 -4， 5- 二 氢 - 噻 唑 并 [4， 5-h] 喹 唑 啉 -2- 基 )- 酰胺
    
    在氩气气氛下将 8- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基胺 ( 阶段 A.1， 0.319g， 1.225mmol) 和 CDI(278mg， 1.715mmol) 加 至 DCM(5ml) 和 DMF(0.25ml)。18h 后， 将残余物冷却至 4℃， 过滤收集沉淀。将固体在 50℃高真空干燥， 得到为淡黄色固体的 标题化合物。(8- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 氨基甲酸甲酯的 LCMS ： tR 0.95min 和 M+H319.0( 方法 A2) ； 其为在制备 MeOH 溶液样品的过程中标题化合物 与 MeOH 的反应产物。
     阶段 A.1 ： 8- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基胺
    
    中间体 A.1 通过两条不同的路径获得。两条路径从 2- 氨基 -5， 6- 二氢 -4H- 苯并 噻唑 -7- 酮开始并且如下所述 ：
     路径 1 ：
     向 N ′ -{6-[1- 二甲基氨基 - 甲 -(E)- 亚基 ]-7- 氧代 -4， 5， 6， 7- 四氢 - 苯并噻 唑 -2- 基 }-N， N- 二甲基 - 甲脒 ( 阶段 A.2， 2.2g， 7.90mmol) 在 2- 甲氧基乙醇 (20ml) 中 的混合物在室温加入氢氧化钠 (1.185g， 29.6mmol) 和 2， 2- 二甲基 - 丙脒盐酸盐 (1.620g， 11.85mmol)。将 RM 在 125℃搅拌 3h。冷却至室温后， 用 MeOH 稀释 RM， 吸附到硅胶上， 通过 快速层析法纯化 (CombiFlash Companion 系统 使用 RediSep 硅胶柱， 洗脱剂 ： DCM/ MeOH/ 氨 95 ∶ 5 ∶ 0.5)。LC ： tR 3.64min( 方 法 D)。MS ： M+H ＝ 261.1H-NMR( 在 DMSO-d6 中)： 8.24(s， 1H) ； 7.70(s， 2H) ； 2.89-2.84(m， 2H) ； 2.76-2.71(m， 2H) ； 1.28(s， 9H)。
     阶段 A.2 ： N′ -{6-[1- 二甲基氨基 - 甲 -(E)- 亚基 ]-7- 氧代 -4， 5， 6， 7- 四氢 - 苯 并噻唑 -2- 基 }-N， N- 二甲基 - 甲脒
    
    在搅拌下、 将 2- 氨基 -5， 6- 二氢 -4H- 苯并噻唑 -7- 酮 (3.5g， 20.81mmol) 在二甲 氧基甲基二甲胺 (12mL， 90mmol) 中的悬液在 100℃加热 65h。然后将 RM 真空蒸发至干， 将
     残余物悬浮于 EtOAc 中。在 4℃ 1 小时后， 滤掉固体， 用 EtOAc 洗涤， 然后在 60℃高真空干 燥， 得到为褐色晶体的纯标题产物。LC ： tR 3.25min( 方法 D)。MS ： M+H ＝ 279.1H-NMR( 在 DMSO-d6 中 ) ： 8.40(s， 1H) ； 7.23(s， 1H) ； 3.15(s， 3H) ； 3.05(s， 6H) ； 2.97(s， 3H) ； 2.91(t， 2H) ； 2.67(t， 2H)。
     路径 2 ：
    将碳酸钾 (0.434g， 3.14mmol) 加至 N-(8- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹 唑啉 -2- 基 )- 乙酰胺 ( 阶段 A.3， 0.38g， 1.257mmol) 在 MeOH 中的混合物。将 RM 在 50 ℃ 搅拌 52h， 然后冷却至室温， 真空蒸发， 得到红色物质。加入水 (20ml)， 将混合物在室温另外 搅拌 3h。然后将红色悬液冷却至 4℃， 过滤， 在高真空下干燥后得到为米色固体的标题化合 物。LCMS ： tR 0.99min 且 M+H ＝ 261( 方法 A3)。1H-NMR( 在 DMSO-d6 中 )， 400MHz ： 8.24(s， 1H) ； 7.70(s， 2H) ； 2.89-2.84(m， 2H) ； 2.76-2.71(m， 2H) ； 1.28(s， 9H)。
     阶段 A.3 ： N-(8- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 乙酰胺
    
    将吡啶 (13ml) 加至 N-(6- 甲酰基 -7- 氧代 -4， 5， 6， 7- 四氢 - 苯并噻唑 -2- 基 )- 乙 酰胺 ( 阶段 A.4， 3.05g， 12.8mmol) 和叔丁基脒盐酸盐 (1.788g， 12.8mmol)， 将混合物在密封 容器中于 160℃加热 6.5h。冷却后， 将反应混合物过滤， 得到固体。蒸发过滤母液， 得到更 多的固体物质。使用热 CH3CN 反复研磨合并的固体， 蒸发 CH3CN 母液， 得到固体， 显示该固体 主要为标题产物。将粗产物溶解于约 10ml 在 MeOH 中的 10％ DMSO， 得到略微混浊的橙色溶 液， 过滤并在室温边搅拌边滴加至水 (100ml) 中。过滤收集沉淀固体， 得到为橙色固体的标 1 题化合物。LCMS ： tR 1.37min 且 M+H ＝ 303.0( 方法 A3)。 H-NMR( 在 DMSO-d6 中 )， 400MHz ： 12.40(s， 1H) ； 8.44(s， 1H) ； 2.88-3.00(m， 4H) ； 2.17(s， 3H) ； 1.32(s， 9H)。
     阶段 A.4 ： N-(6- 甲酰基 -7- 氧代 -4， 5， 6， 7- 四氢 - 苯并噻唑 -2- 基 )- 乙酰胺
     在 氩 气 气 氛 下、 将 LiHMDS 溶 液 (1M， 27.7ml) 经 10min 添 加 至 在 -78 ℃ 冷 却 的 N-(7- 氧代 -4， 5， 6， 7- 四氢 - 苯并噻唑 -2- 基 )- 乙酰胺 ( 阶段 A.5， 2.0g， 9.23mmol) 在干 燥 THF(20ml) 中的悬液。然后将 RM 在 -78℃搅拌 2.5h， 经 30min 滴加甲酸甲酯 (2.308mL， 36.9mmol)。然后将 RM 逐渐升温至室温， 然后在室温搅拌 18h。将 RM 浸没于 1M HCl 水 溶液 (70ml) 中， 用 DCM 萃取 3X， 经 Na2SO4 干燥， 蒸发， 得到为固体的标题化合物。HPLC ： 1 tR3.65min( 方法 D)。MS ： M-H ＝ 237。 H-NMR( 在 DMSO-d6 中 )(400MHz) ： 12.50(s， br， 1H) ； 7.55(s， 1H) ； 2.90-2.60(m， 4H) ； 2.15(s， 3H)。
     阶段 A.5 ： N-(7- 氧代 -4， 5， 6， 7- 四氢 - 苯并噻唑 -2- 基 )- 乙酰胺
    
    在室温向乙酸酐 (80ml) 中添加 2- 氨基 -5， 6- 二氢 -4H- 苯并噻唑 -7- 酮 (10g， 59.4mmol)， 将所得悬液加热回流。 回流搅拌 1.75h 后， 边搅拌边冷却 RM， 在室温搅拌 18h， 随 后使用冰 /NaCl 浴进一步冷却， 过滤收集固体。 使用回流丙酮 (10ml， 然后 15ml) 将固体研磨 两次， 随后过滤， 在真空下于 40℃干燥， 得到为米色固体的标题产物。HPLC ： tR 3.47min( 方 1 法 D)。MS ： M-H ＝ 211.1. H-NMR( 于 DMSO-d6 中 )(600MHz) ： 12.55(s， br， 1H) ； 2.84(t， 2H) ； 2.48(t， 2H) ； 2.17(s， 3H) ； 2.065(qt， 2H)。
     中间体 B ： (2S， 4R)-4- 二甲基氨基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺
    
    将 (2S， 4R)-4- 二甲基氨基 - 吡咯烷 -2- 甲酸甲酯 ( 阶段 B.1， 225mg) 和含 7M 氨 的 MeOH(7ml) 在密封容器中于室温静置 18h。蒸发， 用 Et2O 研磨， 得到为白色固体的标题化 合物。
     阶段 B.1(2S， 4R)-4- 二甲基氨基 - 吡咯烷 -2- 甲酸甲酯
    
    在氢气气氛下、 将 (2S， 4R)-4- 二甲基氨基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 1- 苄基酯 2- 甲酯 ( 阶段 B.2， 420mg)、 10％披钯碳 (80mg) 和 MeOH(10ml) 的混合物搅拌 16h。过滤， 蒸发， 得到标题化合物， 其未经纯化即用于以下步骤中。
     阶段 B.2(2S， 4R)-4- 二甲基氨基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 1- 苄基酯 2- 甲酯
    将氰基硼氢化钠 (200mg) 加至 (2S， 4R)-4- 氨基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 1- 苄基酯 2- 甲酯 (400mg)、 福尔马林 (0.68ml)、 乙酸 (0.72ml)、 三乙胺 (0.2ml) 和 MeOH(2ml) 的混合 物中， 将混合物在室温搅拌 2h。然后将 RM 在 DCM 与 NaHCO3 水溶液之间分配， 蒸发 DCM 层， 通过正相层析法 ( 洗脱液 ； 梯度自 EtOAc 至的 20％ EtOH/EtOAc) 纯化， 得到大部分 UV 活性 组分。将层析的物质吸收于 1M HCl 中， 用 Et2O 洗涤 2X， 水层用 NaHCO3 碱化， 用 Et2O 萃取 3X， 经 Na2SO4 干燥， 蒸发， 得到为浅黄色油状物的标题化合物。
    
    
    中间体 C ： 咪 唑 -1- 甲 酸 (8- 二 乙 基 氨 基 -4， 5- 二 氢 - 噻 唑 并 [4， 5-h] 喹 唑 啉 -2- 基 )- 酰胺向 2- 氨基 -8-N， N- 二乙基氨基 -4， 5- 二氢噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 ( 阶段 C.1， 1g， 3.63mmol) 在 DCM(35ml) 中的混合物加入 CDI(1.178g， 7.26mmol)。将 RM 在 40 ℃搅拌 90h。冷却至室温后， 过滤收集固体， 得到标题化合物。HPLC ： tR 4.11min( 方法 D)。MS ： M+H ＝ 334， 标题化合物与 MeOH 的反应产物 (8- 二乙基氨基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑 啉 -2- 基 )- 氨基甲酸甲酯。
     阶段 C.1 ： 2- 氨基 -8- 二乙基氨基 -4， 5- 二氢噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉
    
    在氩气下、 于室温向 N′ -{6-[1- 二甲基氨基 - 甲 -(E)- 亚基 ]-7- 氧代 -4， 5， 6， 7- 四氢 - 苯并噻唑 -2- 基 }-N， N- 二甲基 - 甲脒 ( 阶段 A.2， 1g， 3.59mmol) 在 2- 甲氧基乙 醇 (10ml) 中的溶液加入 NaOH(0.539g， 13.47mmol) 和 N， N- 二乙基胍 (0.454g， 3.94mmol)。 将 RM 在 125℃搅拌 3.5h， 然后冷却至室温。真空蒸发后， 将残余物溶解于 0.1M HCl(50ml)中， 用 EtOAc 洗涤。然后将水层用 6N NaOH 碱化， 用 EtOAc 萃取 3X。将有机层经 Na2SO4 干 燥， 蒸发， 于 60℃高真空下干燥， 得到为橙色晶体的标题化合物。LC ： tR 3.60min( 方法 D)。 MS ： M+H ＝ 276.1H-NMR( 于 DMSO-d6 中 ) ： 7.91(s， 1H) ； 7.59(s， 2H) ； 3.50(q， 4H) ； 2.69(dd， 4H) ； 1.07(t， 6H)。
     中间体 D ： (2S， 3S)-3- 甲基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺
    在室温、 将在 1， 4- 二噁烷中的 4M HCl 溶液 (1.5ml) 加至 (2S， 3S)-3- 甲基吡咯 烷 -2- 甲酸 (0.5g) 在 EtOH(5ml) 中的悬液， 将混合物在回流下加热 20h。蒸发 RM， 加入在 MeOH 中的 7M 氨溶液 (5.6ml)。 将 RM 在室温静置 6 天， 然后蒸发， 将残余物用 MeOH(0.5ml) 研 磨， 过滤， 用冷 MeOH(2ml) 洗涤， 得到为白色固体的标题化合物。1H-NMR(d6-DMSO， 400MHz) ： 8.06(s， 1H)， 7.67(s， 1H)， 3.60(d， 1H)， 3.25-3.14(m， 2H)， 2.24-2.15(m， 1H)， 2.09-1.98(m， 1H)， 1.57-1.45(m， 1H)， 1.13(d， 3H)。
     中间体 E ： (R)-2- 苄基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺
    
    将 (3R， 7aR)-7a- 苄基 -3- 三氯甲基 - 四氢 - 吡咯并 [1， 2-c] 噁唑 -1- 酮 (1.40g， 如 Wang 和 Germanas Synlett 1999， 33-36 所述制备 ) 和在 MeOH 中的 7M 氨 (15ml) 的混合 物在密封容器中于 50℃加热 3 天。然后将冷却的 RM 蒸发， 用氯仿研磨， 得到为白色固体的 标题化合物。
     中间体 F(S)-2- 甲基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺
    
    将 (S)-2- 甲基 - 吡咯烷 -2- 甲酸丁酯 ( 阶段 F.1， 2.3g) 在 7M 氨的 MeOH 溶液 (22.2ml) 中的溶液在高压气体贮罐中于 70 ℃加热 10 天。蒸发 RM， 用己烷 (20ml) 研磨， 1 得 到 为 灰 白 色 固 体 的 标 题 化 合 物。 H-NMR(d6-DMSO， 400MHz) ： 7.40(s， 1H)， 6.89(s， 1H)， 2.95-2.84(m， 1H)， 2.72-2.60(m， 1H)， 2.06-1.95(m， 1H)， 1.66-1.44(m， 2H)， 1.42-1.30(m， 1H)， 1.22(s， 3H)。
     阶段 F.1 ： (S)-2- 甲基 - 吡咯烷 -2- 甲酸丁酯
    
     将浓 HCl(2ml) 加至 (S)-2- 甲基 - 吡咯烷 -2- 甲酸 (2g) 在丁 -1- 醇 (50ml) 中的 悬液， 在 60℃加热 18h， 然后回流 4 天。蒸发 RM， 在饱和 NaHCO3 水溶液和 DCM 之间分配， 用 DCM 萃取 3X， 经 Na2SO4 干燥， 蒸发。然后将分离的油状物在 10mbar 下 kugelrohr 蒸馏， 在 100-120℃的烘箱温度将馏分蒸馏， 得到为澄清无色油状物的标题化合物。
     中间体 G ： (R)-2- 甲氧基甲基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺
    
    将 (3R， 7aR)-7a- 甲氧基甲基 -3- 三氯甲基 - 四氢 - 吡咯并 [1， 2-c] 噁唑 -1- 酮 ( 阶段 G.1， 0.6g) 和含 7M 氨的 MeOH(6ml) 的混合物在密封容器中于室温静置 2 天。然后蒸 发 RM， 得到为浅黄色油状物的标题化合物， 其不需进一步纯化即可使用。
     阶段 G.1 ： (3R， 7aR)-7a- 甲氧基甲基 -3- 三氯甲基 - 四氢 - 吡咯并 [1， 2-c] 噁 唑 -1- 酮
    
    在 -78℃、 将二异丙基氨基锂在己烷 /THF 的 3 ∶ 5 混合物中的 1M 溶液 (8.25ml) 滴加至含 (3R， 7aS)-3- 三氯甲基 - 四氢 - 吡咯并 [1， 2-c] 噁唑 -1- 酮 (1.51g， 如 Wang 和 Germanas Synlett 1999， 33-36. 所述制备 ) 的 THF(5ml) 中。在 -78℃搅拌 30 分钟后， 加 入甲基氯甲醚 (1.14ml)。然后经 3h 将 RM 升温至 -30℃， 加入水。将水层用 DCM 萃取， 将合 并的有机层蒸发， 然后将残余物通过用 DCM 洗脱的正相层析法纯化， 得到为浅黄色油状物 的标题化合物。
     中间体 H ： (R)-2- 二甲基氨基甲基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺
    
    将 (3R， 7aR)-7a- 二 甲 基 氨 基 甲 基 -3- 三 氯 甲 基 - 四 氢 - 吡 咯 并 [1， 2-c] 噁 唑 -1- 酮 ( 阶段 H.1， 0.26g) 和在 MeOH(4ml) 中的 7M 氨的混合物在密封容器中于 50℃加 热 3 天。然后将冷却的 RM 蒸发， 得到为褐色油状物的标题化合物， 其不需进一步纯化即可 使用。MS ： M+H ＝ 172.1。
     阶段 H.1 ： (3R， 7aR)-7a- 二甲基氨基甲基 -3- 三氯甲基 - 四氢 - 吡咯并 [1， 2-c] 噁唑 -1- 酮
    在 -78℃， 将二异丙基氨基锂在己烷 /THF 的 3 ∶ 5 混合物中的 1M 溶液 (8.25ml) 滴 加至在 THF(5ml) 中的 (3R， 7aS)-3- 三氯甲基 - 四氢 - 吡咯并 [1， 2-c] 噁唑 -1- 酮 (1.51g， 如 Wang 和 Germanas Synlett 1999， 33-36 所述制备 .)。在 -78 ℃搅拌 30 分钟后， 加入 Eschenmoser 盐 (2.78g)。然后经 1h 将 RM 在剧烈搅拌下升温至 -40℃， 在 -40℃维持 2h。 然后加入水， 将水层用 DCM 萃取， 将合并的有机层经 Na2SO4 干燥， 蒸发。然后将残余物通过
    正相层析法纯化， 用 DCM 至 DCM 中的 20％ EtOAc 的梯度洗脱， 得到为浅黄色油状物的标题化 合物 (M+H ＝ 301/303/3053 ∶ 3 ∶ 1)。
     中间体 I ： d6-(R)-2- 二甲基氨基甲基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺
    将 d6-(3R， 7aR)-7a- 二甲基氨基甲基 -3- 三氯甲基 - 四氢 - 吡咯并 [1， 2-c] 噁 唑 -1- 酮 ( 阶 段 I.1， 440mg， 1.430mmol) 在 密 封 容 器 中 溶 解 于 氨 的 MeOH 溶 液 (10.2mL， 71.4mmol)， 在 75℃加热 5 天。蒸发反应混合物， 用 CHCl3 研磨 2X， 得到为淡褐色固体的标 题产物。
    阶段 I.1 ： d6-(3R， 7aR)-7a- 二甲基氨基甲基 -3- 三氯甲基 - 四氢 - 吡咯并 [1， 2-c] 噁唑 -1- 酮
    
    在氩气下将 (3R， 7aR)-1- 氧代 -3- 三氯甲基 - 二氢 - 吡咯并 [1， 2-c] 噁唑 -7a- 甲醛 ( 如 J.Org.Chem.2006， 71(1)， 97-102 所 述 获 得， 1g， 3.67mmol)、在 THF 中 的 二 甲 胺 -d7(1.0mL， 14.09mmol)、 乙酸 (0.525mL， 9.17mmol) 和 DCE(4ml) 合并， 分批加入三乙酰氧 基硼氢化钠 (1.089g， 5.14mmol)。在室温搅拌 3h 后， 将 RM 溶于 DCM 中， 用 1M NaOH 分配， 再 用 DCM 萃取 1 次。然后将有机层合并， 用水洗涤两次， 然后经 Na2SO4 干燥。蒸发溶液至其体 积一半， 加入 1M HCl H2O 溶液， 分离各层， 将水层用 DCM 洗涤两次。用饱和 Na2CO3 溶液将水 层的 pH 调节至～ 8， 用 DCM 萃取三次。将有机层经 Na2SO4 干燥， 蒸发， 得到为浅黄色油状物 的所需标题产物。
     中间体 J ： (R)-2- 羟基甲基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺
    在氩气下、 将 (3R， 7aR)-7a- 羟基甲基 -3- 三氯甲基 - 四氢 - 吡咯并 [1， 2-c] 噁 唑 -1- 酮 ( 阶段 J.1， 308mg， 1.122mmol) 加至在 MeOH 中的 7M 氨溶液 (8.014mL， 56.1mmol)， 在密封容器中于 75℃加热 72h， 然后蒸发， 得到为粘稠的淡褐色油状物的标题化合物， 其不 需进一步纯化即可使用。 阶 段 J.1 ： (3R， 7aR)-7a- 羟 基 甲 基 -3- 三 氯 甲 基 - 四 氢 - 吡 咯 并 [1， 2-c] 噁
    唑 -1- 酮
    将三乙酰氧基硼氢化钠 (544mg， 2.57mmol) 加至在 DCE(4ml) 中的 (3R， 7aR)-1- 氧 代 -3- 三氯甲基 - 二氢 - 吡咯并 [1， 2-c] 噁唑 -7a- 甲醛 ( 如 J.Org.Chem.2006， 71(1)， 97-102 中所述获得， 500mg， 1.835mmol)。将 RM 在室温搅拌 18h， 然后溶解于 DCM 中， 将有机 层用水洗涤， 经 Na2SO4 干燥， 蒸发。使用 20g RediSep 硅胶柱 ( 洗脱剂 ： DCM 至在 DCM 中 的 10％ MeOH) 纯化粗产物， 得到为澄清淡黄色油状物的标题化合物。
     中间体 K ： (R)-2-{[(3- 氟 - 苄基 )- 甲基 - 氨基 ]- 甲基 }- 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺
    
    在氩气下、 将 (3R， 7aR)-7a-{[(3- 氟 - 苄基 )- 甲基 - 氨基 ]- 甲基 }-3- 三氯甲 基 - 四氢 - 吡咯并 [1， 2-c] 噁唑 -1- 酮 ( 阶段 K.1， 385mg， 0.973mmol) 加至在 MeOH 中的 7M 氨 (6.950mL， 48.7mmol)， 在密封容器中于 50℃加热 6 天， 然后在 75℃加热 5 天。然后蒸发 RM， 将残余物通过使用 12g RediSep 硅胶柱 ( 洗脱剂 ： 于 DCM 中的 5％ MeOH) 的快速层析
     法纯化， 得到为黄色油状物的标题化合物。
     阶段 K.1 ： (3R， 7aR)-7a-{[(3- 氟 - 苄基 - 甲基 - 氨基 ]- 甲基 }-3- 三氯甲基 - 四 氢 - 吡咯并 [1， 2-c] 噁唑 -1- 酮
    在 氩 气 气 氛 下、将 三 乙 酰 氧 基 硼 氢 化 钠 (889mg， 4.19mmol) 加 至 (3R， 7aR)-7a-[(3- 氟 - 苄基氨基 )- 甲基 ]-3- 三氯甲基 - 四氢 - 吡咯并 [1， 2-c] 噁唑 -1- 酮 ( 阶段 K.2， 400mg， 1.048mmol)、 甲醛 (37％于 H2O 中， 0.102mL， 1.36mmol) 和乙酸 (0.150mL， 2.62mmol) 在 DCE(4ml) 中的混合物。在室温搅拌 2h 后， 将 RM 在 DCM 与水之间分配。将合 并的有机层经 Na2SO4 干燥， 蒸发， 得到为淡褐色油状物的标题化合物， 其不需进一步纯化即 可使用。
     阶段 K.2 ： (3R， 7aR)-7a-[(3- 氟 - 苄基氨基 )- 甲基 ]-3- 三氯甲基 - 四氢 - 吡咯 并 [1， 2-c] 噁唑 -1- 酮
    
    在氩气气氛下、 将三乙酰氧基硼氢化钠 (544mg， 2.57mmol) 加至 (3R， 7aR)-1- 氧 代 -3- 三氯甲基 - 二氢 - 吡咯并 [1， 2-c] 噁唑 -7a- 甲醛 ( 如 J.Org.Chem.2006， 71(1)， 97-102 中 所 述 获 得， 500mg， 1.835mmol)、 3- 氟 苄 基 胺 (0.251mL， 2.20mmol) 和 乙 酸 (0.263mL， 4.59mmol) 和 DCE(4ml) 中。将 RM 在室温搅拌 3h， 然后在水与 DCM 之间分配， 将 合并的有机物经 Na2SO4 干燥， 蒸发， 得到为浅黄色油状物的标题化合物， 其不需进一步纯化 即可使用。
     中间体 L ： (S)- 氮杂环丁烷 -2- 甲酸酰胺
    
    在氢气气氛下、 将 (S)-2- 氨基甲酰基 - 氮杂环丁烷 -1- 甲酸苄酯 ( 阶段 L.1， 1.8g) 和 10％披钯碳 (0.2g) 在 MeOH(25ml) 中的混合物在室温搅拌 5h。过滤和蒸发得到标题化 合物， 其不需进一步纯化即可使用。
     阶段 L.1 ： (S)-2- 氨基甲酰基 - 氮杂环丁烷 -1- 甲酸苄酯
    
    将 (S)- 氮杂环丁烷 -1， 2- 二甲酸 1- 苄基酯 2- 甲酯 (2.5g) 和于 MeOH 中的 7M 氨 溶液 (10ml) 的混合物在密封容器中于室温静置 18h。然后蒸发 RM， 得到为白色固体的标题 化合物， 其不需进一步纯化即可使用。MS ： M+H235.1 和 M-H 233.1。
     中间体 M ： (2S， 4R)-4- 氟 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺
    
    在 室 温、 将 HCl 于 EtOH 中 的 1.25M 溶 液 (2.3ml) 加 至 (2S， 4R)-4- 氟 - 吡 咯 烷 -2- 甲酸 (0.25g) 在 EtOH(2ml) 中的溶液， 将混合物于 55℃加热 62h。蒸发 RM， 加入氨 在 MeOH 中的 7M 溶液 (5.6ml)。将 RM 在室温静置 36h， 然后蒸发， 将残余物用 MeOH(0.5ml) 1 研磨， 过滤， 得到为白色固体的标题化合物。H-NMR(d6-DMSO， 400MHz) ： 7.68(s， 1H)， 7.37(s，
    1H)， 5.30(d， 1H)， 3.96(t， 1H)， 3.40-3.12(m， 2H)， 2.48-2.31(m， 1H)， 2.02-1.81(m， 1H)。
     中间体 N ： (2S， 4S)-4- 氟 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺
    将 (2S， 4S)-2- 氨基甲酰基 -4- 氟 - 吡咯烷 -1- 甲酸叔丁酯 (1.0g)、 浓 HCl(0.6ml) 和 1- 丁醇 (10ml) 的混合物在 50℃加热 48h。蒸发 RM， 在 DCM 与 NaHCO3 水溶液之间分配， 将 DCM 层经 Na2SO4 干燥， 蒸发。将在甲醇中的 7M 氨溶液 (10ml) 加至残余物， 将混合物在密 封容器中于室温静置 60h。蒸发， 用 EtOH 研磨， 得到为白色固体的标题化合物。
     中间体 O ： (1S， 5R)-2- 氮杂 - 二环 [3.1.0] 己烷 -1- 甲酸酰胺
    
    将 (1S， 5R)-2- 氮 杂 - 二 环 [3.1.0] 己 烷 -1- 甲 酸 乙 酯 (2.5g， 通 过 Hercouet Tetrahedron Asymmetry 1996， 7， 1267-1268 的程序制备 ) 和在 MeOH 中的 7M 氨溶液 (20ml) 的混合物在密封容器中于 80℃加热 5 天。蒸发冷却的 RM， 用己烷 /DCM 研磨， 得到为米色固
     体的标题化合物。1H-NMR(DMSO-d6， 400MHz) ： 7.15(s， 1H)， ， 7.04(s， 1H)， 3.00-2.91(m， 1H)， 2.67(q， 1H)， 1.94-1.83(m， 1H)， 1.74-1.67(m， 1H)， 1.64-1.55(m， 1H)， 1.38-1.31(m， 1H)， 0.90(t， 1H))。
     中间体 P ： (2S， 3R)-3- 甲基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺
    在 H2 气氛下、 在室温将在 MeOH(20ml) 中的 (2S， 3R)-3- 甲基 -1-((S)-1- 苯基 - 乙 基 )- 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺 ( 阶段 P.1， 1.1g， 4.76mmol) 和披钯炭 10％ (0.101g， 0.947mmol) 振荡 46h。 然后将 RM 滤过 Fluoropore 滤膜 (0.2μm FG)， 蒸发。 将残余物溶解于 DCM 中， 蒸发 1 至干， 得到为白色晶体的标题化合物。MS ： M+H ＝ 129.0. H-NMR(d6-DMSO， 600MHz) ： 7.34(s， br， 1H)， 7.10(s， br， 1H)， 3.48(d， 1H)， 3.0.2-2.97(m， 1H)， 2.80-2.75(m， 1H)， 2.35-2.28(m， 1H)， 1.88-1.81(m， 1H)， 1.39-1.32(m， 1H)， 0.83(d， 3H)。
     阶段 P.1 ： (2S， 3R)-3- 甲基 -1-((S)-1- 苯基 - 乙基 )- 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺
    
    在 氩 气 气 氛 下、 于 0 ℃ 将 在 甲 苯 中 的 三 甲 基 铝 (2M， 3.23ml) 滴 加 至 氯 化 铵 (0.346g， 6.47mmol) 在甲苯 (3.2ml) 中的混合物， 形成甲烷气体。 然后将 RM 升温至室温， 在 室温再搅拌 15min。 然后缓慢加入 (2S， 3R)-3- 甲基 -1-((S)-1- 苯基 - 乙基 )- 吡咯烷 -2- 甲 酸甲酯 ( 如 Tetr.Lett.1997， 38(1)， 85-88 中所述制备 ； 1.6g， 6.47mmol)。将 RM 在室温搅 拌 56h， 然后在冷却下加入 1M HCl， 将 RM 用 DCM 洗涤 3X。将水相用 Na2CO3 碱化， 用 DCM 萃
    取 3X， 将合并的有机层经 Na2SO4 干燥。蒸发， 得到为黄色油状物的标题化合物。MS ： M+H ＝ 1 233.2.HPLC ： tR 3.17min( 方 法 D)。 H-NMR(d6-DMSO， 600MHz) ： 7.37-7.33(m， 2H)， 7.30(t， 2H) ， 7.25(s ， br ， 1H) ， 7.21(t ， 1H) ， 7.12(s ， br ， 1H) ， 3.55(q ， 1H) ， 3.40(d ， 1H) ， 2.71(t ， 1H)， 2.28-2.22(m， 1H)， 2.21-2.16(m， 1H)， 1.71(qt， 1H)， 1.38-1.31(m， 1H)， 1.21(d， 3H)， 0.90(d， 3H)。
    
    中间体 Q ： (2S， 4S)-4- 二甲基氨基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺将 (2S， 4S)-4- 二甲基氨基 - 吡咯烷 -2- 甲酸丁酯 ( 阶段 Q.1， 326mg) 和 7M 氨 / MeOH 的溶液 (8ml) 在密封容器中于室温静置 18h。过滤， 蒸发， 用 Et2O/MeOH 研磨， 得到为
     米色固体的标题化合物。
     阶段 Q.1 ： (2S， 4S)-4- 二甲基氨基 - 吡咯烷 -2- 甲酸丁酯
    将浓 HCl(0.3ml) 加至 (2S， 4S)-4- 二甲基氨基 - 吡咯烷 -2- 甲酸甲酯二盐酸盐 (400mg) 和 1- 丁醇 (4ml) 的混合物， 在 115 ℃加热 18h。冷却后， 蒸发 RM， 然后在 DCM 与 NaHCO3 水溶液之间分配， 干燥 DCM 层， 蒸发， 得到为褐色油状物的标题化合物， 其不需进一步 纯化即可使用。
     中间体 R ： (2S， 4S)-4- 羟基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺
    
    将 (2S， 4S)-4- 羟基 - 吡咯烷 -2- 甲酸甲酯盐酸盐 (1g) 在 7M 氨 MeOH 溶液中的溶 液 (10ml) 搅拌 18h， 然后蒸发， 用 Et2O 研磨。将残余物溶解于最小体积的热 MeOH 中， 在 4℃ 静置 4h。过滤分离标题化合物， 为白色固体。
    
    
    中间体 S ： (2S， 4R)-4- 羟基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺将 (2S， 4R)-4- 羟基 - 吡咯烷 -2- 甲酸苄酯 (1g) 在 880 氨 (5ml) 中的溶液搅拌 18h， 然后蒸发， 用 Et2O 研磨， 得到为白色固体的标题化合物。1H-NMR(d6-DMSO， 400MHz) ： 9.15(s， br， 1H)， 8.04(s， 1H)， 7.63(s， 1H)， 5.56(s， 1H)， 4.40(s， 1H)， 4.27-4.16(m， 1H)， 3.27(d， 1H)， 3.02(d， 1H)， 2.33-2.19(m， 1H)， 1.89-1.76(m， 1H)。
     中间体 T ： 咪唑 -1- 甲酸 (7- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 苯并 [1， 2-d ； 3， 4-d ′ ] 双噻 唑 -2- 基 )- 酰胺
    
    将 7- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 苯并 [1， 2-d ； 3， 4-d ′ ] 双噻唑 -2- 基胺 ( 阶段 T.1， 175mg， 0.659mmol) 溶解于 DCM(10ml) 中， 然后加入 CDI(297mg， 1.648mmol)， 将 RM 在室温搅 拌 2h。过滤分离标题化合物， 用 DCM 洗涤， 在 HV 下干燥。
     阶段 T.1 ： 7- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 苯并 [1， 2-d ； 3， 4-d′ ] 双噻唑 -2- 基胺
    
    将 N-(7- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 苯并 [1， 2-d ； 3， 4-d′ ] 双噻唑 -2- 基 )- 乙酰胺 ( 阶 段 T.2， 225mg， 0.732mmol) 溶解于 EtOH(10ml) 中， 然后加入 HCl 36％ (1.48g， 14.64mmol)， 将 RM 加热至回流。回流 18 小时后， 将 RM 冷却至室温， 通过加入 5％碳酸氢钠水溶液调节至 pH 8-9， 用 EtOAc 萃取， 用 H2O 洗涤两次。将有机层经 Na2SO4 干燥， 蒸发， 得到标题产物 (tR 4.408min( 方法 F))。
     阶段 T.2 ： N-(7- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 苯并 [1， 2-d ； 3， 4-d′ ] 双噻唑 -2- 基 )- 乙 酰胺
    
    将 N-(6- 溴 -7- 氧 代 -4， 5， 6， 7- 四 氢 - 苯 并 噻 唑 -2- 基 )- 乙 酰 胺 ( 阶 段 T.3， 473mg， 1.635mmol) 溶 解 于 MeOH(10ml) 中， 加 入 2， 2- 二 甲 基 硫 代 丙 酰 胺 (230mg， 1.962mmol) 和钼磷酸铵 (307mg， 0.164mmol)， 将 RM 在 25℃搅拌 20h。然后将 RM 静置 2 天， 蒸发。用 30g 之后在 50℃搅拌 24h。将混合物用 EtOAc/H2O 萃取。将有机层经 Na2SO4 干燥， 硅胶对粗物质进行层析， 洗脱剂为 DCM/MeOH ＝ 99 ∶ 1。蒸发含有产物的馏分， 从二噁烷冻 干， 得到 225mg 为白色固体的标题化合物 (M+H ＝ 308 ； M-H ＝ 306 ； tR 5.525min( 方法 F))。
     阶段 T.3 ： N-(6- 溴 -7- 氧代 -4， 5， 6， 7- 四氢 - 苯并噻唑 -2- 基 )- 乙酰胺
    
    将 N-(7- 氧代 -4， 5， 6， 7- 四氢 - 苯并噻唑 -2- 基 )- 乙酰胺 ( 阶段 T.4， 2.286g， 10.87mmol) 溶 解 于 AcOH(60ml) 中， 然 后 缓 慢 加 入 溶 解 于 AcOH(10ml) 中 的 溴 (1.74g， 10.87mmol)， 将 RM 加热至 75℃达 20h。颜色由红色变为米色。蒸发混合物， 将残余物溶解 于 MeOH(10ml) 中， 用 H2O 沉淀。过滤混合物， 在 HV 上干燥。用 MPLC C18H2O 0.1 ％ TFA/ CH3CN 0.1 ％ TFA( 梯度 0-50 ％ ) 对粗物质进行层析。将含有产物的馏分用 NaHCO3 中和， 用 EtOAc 萃取， 从二噁烷冻干， 得到为白色固体的标题化合物 (M+H ＝ 291 ； M-H ＝ 289 ； tR 1 4.29( 方 法 F))。 H-NMR(d6-DMSO， 600.13MHz)12.75(s， 1H)4.95(t， 1H)， 2.95-2.84(m， 2H)， 2.62-2.52(m， 1H)， 2.40-2.30(m， 1H)， 2.20(s， 3H)。
     阶段 T.4 ： N-(7- 氧代 -4， 5， 6， 7- 四氢 - 苯并噻唑 -2- 基 )- 乙酰胺
    在室温、 向乙酸酐 (80ml) 加入 2- 氨基 -5， 6- 二氢 -4H- 苯并噻唑 -7- 酮 (10g， 59.4mmol)， 将黄色悬液加热回流。 在此温度搅拌 1.75h 后， 在搅拌下冷却 RM， 在室温搅拌过 夜。用冰 /NaCl 浴进一步冷却， 过滤悬液。然后将固体用丙酮回流两次 (10ml， 然后 15ml)， 过滤。于 40 ℃、 将所得固体在真空下干燥过夜， 提供为米色固体的标题化合物 (HPLC ： tR 1 3.47min( 方 法 A3)， M-H ＝ 211.1)， H-NMR( 于 DMSO-d6 中 )(600MHz) ： 12.55(s， br， 1H) ； 2.84(t， 2H) ； 2.48(t， 2H) ； 2.17(s， 3H) ； 2.065(qt， 2H))。
     中间体 U ： 咪唑 -1- 甲酸 [7-(2- 氟 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )-4， 5- 二氢 - 苯并 [1， 2-d ； 3， 4-d′ ] 双噻唑 -2- 基 ]- 酰胺
    
    将 7-(2- 氟 -1， 1- 二 甲 基 - 乙 基 )-4， 5- 二 氢 - 苯 并 [1， 2-d ； 3， 4-d ′ ] 双 噻 唑 -2- 基 胺 ( 阶 段 U.161.6mg， 0.217mmol) 溶 解 于 DCM(2ml) 中，加 入 CDI(297mg， 1.648mmol)， 得到澄清无色溶液。将 RM 在室温静置过夜， 得到白色悬液。将混合物在 4℃冷 却 1h， 然后过滤， 用 DCM 洗涤， 在真空下干燥， 得到为白色固体的标题化合物 ( 对在 MeOH 中 的样品进行分析 ； M+H ＝ 342.0 显示氨基甲酸甲酯产物的 MS ； tR 2.14min( 方法 A3))。
     阶段 U.17-(2- 氟 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )-4， 5- 二氢 - 苯并 [1， 2-d ； 3， 4-d ′ ] 双 噻唑 -2- 基胺
    
    将 3- 氟 -2， 2- 二甲基 - 硫代丙酰胺 ( 阶段 U.2， 394mg， 2.331mmol) 溶解于 EtOH中， 然后加入 N-(6- 溴 -7- 氧代 -4， 5， 6， 7- 四氢 - 苯并噻唑 -2- 基 )- 乙酰胺 ( 阶段 T.3， 473mg， 1.635mmol) 和钼磷酸铵 (80mg， 0.042mmol)， 得到黄色悬液。将 RM 加热至回流， 得到 暗蓝绿色悬液。将反应混合物在 65℃搅拌 3 天。过滤 RM， 将滤液蒸发。将残余物溶解于 DMF 中， 通过制备型 HPLC( 方法 E) 纯化。将含有产物的馏分合并， 蒸发， 得到为白色固体的 标题化合物 (M+H ＝ 284.1 ； tR 1.30min( 方法 A3))。
     阶段 U.23- 氟 -2， 2- 二甲基 - 硫代丙酰胺
    通过 Boys， M.L. ； Downs， V.L.Synth.Commun.2006， 36， 295 的程序制备标题化合 物。在室温、 将硫氢化钠水合物 (3.89g， 69.4mmol， 吸湿 ) 加至 3- 氟 -2， 2- 二甲基 - 丙腈 ( 阶段 U.3， 1.17g， 11.57mmol) 和二乙基胺盐酸盐 (7.61g， 69.4mmol) 在 1， 4- 二噁烷 (7ml) 和 H2O(7ml) 中的溶液。将 RM 加热至 55 ℃， 然后在此温度搅拌 3 天。将反应混合物用水 (50ml) 稀释， 用 EtOAc(50ml) 萃取 5X。 将有机层经 Na2SO4 干燥， 蒸发得到橙色油状物。 然后 加入 DCM(5ml)， 得到白色悬液。过滤悬液， 将滤液通过用 DCM 洗脱的硅胶快速层析法纯化。 将含产物的馏分蒸发， 得到为浅黄色油状物的标题化合物。(M+H ＝ 136.1， M-H ＝ 134.1 ； tR
    0.69min( 方法 A3))。19F-NMR(d6-DMSO， 400MHz 218ppm(t， 1F))。
     阶段 U.33- 氟 -2， 2- 二甲基 - 丙腈
    将 3- 氟 -2， 2- 二 甲 基 - 丙 酰 胺 ( 阶 段 U.4， 1.82g， 15.28mmol) 和 五 氧 化 二 磷 (2.168g， 15.28mmol) 合并， 得到自由流动的白色粉末， 其在氩气气氛下经 50 分钟用油浴加 热至 180℃的浴温。 然后缓慢应用 300mbar 真空对流动的澄清无色油状物进行蒸馏， 静置标 19 题化合物后形成低熔点蜡状固体。 F-NMR(d6-DMSO， 400MHz 219.5ppm(t， 1F))。
     阶段 U.43- 氟 -2， 2- 二甲基 - 丙酰胺
    
    将 3- 氟 -2， 2- 二 甲 基 - 丙 酰 氟 (DE3326874 和 DE3611195， 2.5g， 20.47mmol) 在 0℃加至氨水 (10ml) 和 THF(20ml) 的混合物。然后将 RM 升温至室温， 在室温静置过夜。在 真空下将体积减少 50％， 得到粘稠的白色悬液。 将悬液用 DCM/H2O 萃取。 将有机层经 Na2SO4 干燥， 蒸发， 得到为白色结晶固体的标题化合物。
     中间体 V ： 咪唑 -1- 甲酸 (7- 环丙基甲基 -4， 5- 二氢 - 苯并 [1， 2- ； 3， 4-d′ ] 双噻 唑 -2- 基 )- 酰胺
    
     将 7- 环丙基甲基 -4， 5- 二氢 - 苯并 [1， 2-d ； 3， 4-d ′ ] 双噻唑 -2- 基胺 ( 阶段 V.1， 72mg， 0.273mmol) 溶解于 5ml DCM 中， 加入 CDI(73.9mg， 0.410mmol)， 将 RM 在室温搅拌 20h。加入另外的 CDI(37mg， 0.205mmol)， 将 RM 在室温再搅拌 2 小时。过滤混合物， 用 DCM 洗涤， 蒸发滤液， 得到标题化合物 (M+H ＝ 322.1 ； M-H ＝ 320.2MS-ES( 于 MeOH 中 ) 显示氨基 甲酸甲酯产物 )。
     阶段 V.17- 环丙基甲基 -4， 5- 二氢 - 苯并 [1， 2-d ； 3， 4-d′ ] 双噻唑 -2- 基胺
    
    将 N-(7- 环丙基甲基 -4， 5- 二氢 - 苯并 [1， 2-d ； 3， 4-d′ ] 双噻唑 -2- 基 )- 乙酰胺 ( 阶段 V.2， 180mg， 0.589mmol) 溶解于 EtOH(10ml) 中， 加入 36％ HCl(1.193g， 11.79mmol)。 将 RM 加热至 90℃达 16h， 然后冷却， 用 EtOAc/H2O 萃取。将有机层经 Na2SO4 干燥， 蒸发。用 MPLC C18H2O 0.1％ TFA/CH3CN0.1％ TFA( 梯度 0-50％ ) 对粗物质进行层析。将含产物的 馏分用 NaHCO3 中和， 用 EtOAc 萃取， 从二噁烷冻干， 得到标题化合物 (M+H ＝ 264.2 ； M-H ＝ 262.1 ； tR 4.183min( 方法 F))。
     阶 段 V.2N-(7- 环 丙 基 甲 基 -4， 5- 二 氢 - 苯 并 [1， 2-d ； 3， 4-d ′ ] 双 噻 唑 -2- 基 )- 乙酰胺
    
    将 N-(6- 溴 -7- 氧代 -4， 5， 6， 7- 四氢 - 苯并噻唑 -2- 基 )- 乙酰胺 ( 阶段 T.3， 347mg， 1.200mmol) 溶解于 MeOH(10ml) 中， 加入 2- 环丙基 - 硫代乙酰胺 (Can.J.Chem 1995 Vol.73 1468-1477， 166mg， 1.440mmol) 和钼磷酸铵 (225mg， 0.120mmol)。将 RM 在室温搅拌 20h， 然后在 50℃加热 3h， 在 60℃加热 2h， 然后回流 24h。将 RM 在 EtOAc/H2O 之间分配。将 有机层经 Na2SO4 干燥， 蒸发。 用 MPLC C18H2O 0.1％ TFA/CH3CN 0.1％ TFA( 梯度 0-50％ ) 对 原料进行层析。将含产物的馏分用 NaHCO3 中和， 用 EtOAc 萃取， 从二噁烷冻干， 得到为白色 固体的标题化合物 (M+H ＝ 306.2 ； M-H ＝ 304.2 ； tR 5.12min( 方法 F))。
     实施例 1 ： (2S， 4R)-4- 二甲基氨基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 叔丁 基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
     向咪唑 -1- 甲酸 (8- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ( 中间体 A， 45.1mg， 0.127mmol) 在 DMF(1ml) 中的溶液加入 (2S， 4R)-4- 二甲基氨基 - 吡咯 烷 -2- 甲酸酰胺 ( 中间体 B， 22mg， 0.140mmol) 和三乙胺 (0.053mL， 0.382mmol)。 然后将 RM 在 室温搅拌 17h， 通过制备型 HPLC( 方法 B) 纯化。 将含产物的馏分合并， 通过 Bond Elut-SCX， 300mg 柱洗脱。然后将柱用在 MeOH 中的 7M 氨溶液洗涤， 蒸发， 得到标题化合物。MS ： M+H ＝ 444.HPLC ： tR 3.17min( 方法 D)。
     实施例 2 ： (2S， 3S)-3- 甲基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 二乙基氨基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
    
    将 (2S， 3S)-3- 甲基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺 ( 中间体 D， 6.24mg， 0.049mmol)、 咪 唑 -1- 甲酸 (8- 二乙基氨基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ( 中间体 C， 18mg， 0.049mmol) 和三乙胺 (0.020mL， 0.146mmol) 在 DMF(0.4ml) 中的混合物在室温搅拌 6h。然后将 RM 通过制备型 HPLC( 方法 B) 直接纯化。然后将含产物的馏分滤过 300mgBond Elut-SCX 柱。 然后将柱用在 MeOH 中的 7M 氨溶液洗脱， 蒸发洗脱剂， 得到为黄色固体的标题 1 化合物。MS ： M+H ＝ 430.1.HPLC ： tR 3.72min( 方法 D)。 H-NMR(DMSO-d6， 600MHz) ： 11.05(s， 1H) ； 8.04(s， 1H) ； 7.44(s， br， 1H) ； 6.95(s， br， 1H) ； 3.78(s， br， 1H) ； 3.60-3.50(m， 6H) ； 2.82(s， br， 4H) ； 2.18(s， br， 1H) ； 2.03(s， br， 1H) ； 1.55(s， br， 1H) ； 1.10(t， 6H) ； 1.05(d， 3H)。
     实施例 3 ： (R)-2- 苄基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 二乙基氨基 -4， 5- 二 氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
    
    向咪唑 -1- 甲酸 (8- 二乙基氨基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰 胺 ( 中间体 C， 50mg， 0.135mmol) 在 DMF(1ml) 中混合物加入 (R)-2- 苄基 - 吡咯烷 -2- 甲酸 酰胺 ( 中间体 E， 33.2mg， 0.162mmol) 和三乙胺 (0.057mL， 0.406mmol)。将 RM 在 40℃搅拌 21h， 然后用制备型 HPLC( 方法 B) 直接纯化。 将含产物的馏分通过 300mg Bond Elut-SCX 柱
     洗脱。然后将柱用在 MeOH 中的 7M 氨溶液洗脱， 蒸发， 得到为黄色固体的标题化合物。MS ： M+H ＝ 506.1.HPLC ： tR 4.38min( 方法 D)。
     实施例 4 ： (S)-2- 甲基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 二乙基氨基 -4， 5- 二 氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
    向咪唑 -1- 甲酸 (8- 二乙基氨基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰 胺 ( 中间体 C， 75mg， 0.203mmol) 在 DMF(2ml) 中的混合物加入 (S)-2- 甲基 - 吡咯烷 -2- 甲 酸酰胺 ( 中间体 F， 39mg， 0.305mmol) 和三乙胺 (0.085mL， 0.609mmol)。将 RM 在 40℃搅拌 17h， 然后用制备型 HPLC( 方法 B) 直接纯化。将含产物的馏分滤过 300mg Bond Elut-SCX 柱。然后将柱用在 MeOH 中的 7M 氨溶液洗脱， 蒸发， 得到为黄色固体的标题化合物。MS ： M+H ＝ 430.2.HPLC ： tR 3.80min( 方法 D)。
    
    
    实施例 5 ： (R)-2- 甲氧基甲基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 二乙基氨 基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
    将咪唑 -1- 甲酸 (8- 二乙基氨基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰 胺 ( 中间体 C， 75mg， 0.203mmol)、 (R)-2- 甲氧基甲基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺 ( 中间体 G， 35.3mg， 0.223mmol) 和三乙胺 (0.085mL， 0.609mmol) 在 DMF(2ml) 中的混合物在 40℃搅拌 6h。冷却至室温后， 将 RM 溶解于 MeOH(1ml) 中， 通过制备型 HPLC( 方法 B) 直接纯化。将含 产物的馏分通过 300mg Bond Elut-SCX 柱洗脱。然后将柱用在 MeOH 中的 7M 氨溶液洗脱， 蒸发， 得到为黄色固体的标题产物。MS ： M+H ＝ 460.1.HPLC ： tR 3.94min( 方法 D)。 实施例 6 ： (R)-2- 二甲基氨基甲基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 叔丁 基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
    
    在 室 温、 将 咪 唑 -1- 甲 酸 (8- 叔 丁 基 -4， 5- 二 氢 - 噻 唑 并 [4， 5-h] 喹 唑 啉 -2- 基 )- 酰 胺 ( 中 间 体 A， 132mg， 0.372mmol) 加 至 (R)-2- 二 甲 基 氨 基 甲 基 - 吡 咯
     烷 -2- 甲酸酰胺 ( 中间体 H， 70mg， 0.409mmol) 和三乙胺 (0.155mL， 1.115mmol) 在 DMF(1ml) 中的混合物。18 小时后， 加入 MeOH(0.5ml)。将 RM 滤过 PTFE 滤膜， 通过制备型 HPLC( 方法 B) 纯化。 将含产物的馏分合并， 蒸发以去除 CH3CN， 然后通过加入固体 NaHCO3 碱化， 得到黄白 色沉淀。冷却至 4℃后， 过滤重新收集固体， 然后通过制备型 HPLC( 方法 C) 进一步纯化。将 含产物的馏分通过 300mg Bond Elut-SCX 柱洗脱。 然后将柱用在 MeOH 中的 7M 氨溶液洗脱， 蒸发， 得到为黄色无定形玻璃状物的标题产物。 LCMS ： tR 0.98min 且 M+H ＝ 458.1( 方法 A3)。 1 H-NMR(CD3OD， 400MHz) ： 8.28(s， 1H) ； 3.92-3.82(m， 1H) ； 3.67-3.44(m， 2H) ； 3.04-2.88(m， 4H) ； 2.85-2.71(m， 1H) ； 2.56(s， br， 6H) ； 2.29-2.19(m， 1H) ； 2.08-1.87(m， 3H) ； 1.37(s， 9H)。
     实施例 7 ： d6-(R)-2- 二甲基氨基甲基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 叔丁 基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
    在氩气气氛下、 将咪唑 -1- 甲酸 (8- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑 啉 -2- 基 )- 酰 胺 ( 中 间 体 A， 91mg， 0.256mmol) 和 三 乙 胺 (0.036mL， 0.256mmol) 加 至 悬 浮于 DMF(2ml) 中的 d6-(R)-2- 二甲基氨基甲基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺 ( 中间体 I， 50mg， 0.282mmol)。然后将 RM 在 40℃搅拌 2.75h， 然后通过制备型 HPLC 直接纯化两次 ( 方法 B， 然后方法 C)。每次， 将含产物的馏分合并， 通过 300mg Bond Elut-SCX 柱洗脱。然后将柱用 在 MeOH 中的 7M 氨溶液洗脱， 蒸发， 得到黄色固体。将固体悬浮于 DCM 中， 过滤， 真空干燥， 得到为黄色固体的标题化合物。LCMS ： tR 1.21min 且 M+H ＝ 464.0( 方法 A1)。
     实施例 8 ： (R)-2- 羟基甲基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 二乙基氨基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
    
    在 室 温、 将 咪 唑 -1- 甲 酸 (8- 二 乙 基 氨 基 -4， 5- 二 氢 - 噻 唑 并 [4， 5-h] 喹 唑 啉 -2- 基 )- 酰胺 ( 中间体 C， 50mg， 0.135mmol) 加至 (R)-2- 羟基甲基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰 胺 ( 中间体 J， 25.4mg， 0.176mmol) 和三乙胺 (0.047mL， 0.338mmol) 在 DMF(1ml) 中的混合 物。在室温 18h 后， 将 RM 通过 PTFE 膜过滤， 通过制备型 HPLC( 方法 B) 纯化。将含产物的
     馏分合并， 滤过 Bond Elut-SCX 柱。将柱用在 MeOH 中的 7M 氨溶液洗脱， 蒸发， 得到橙色玻 璃状物， 其从 MeOH/ 水重结晶， 提供为黄色固体的标题化合物。LCMS ： tR 1.09min 且 M+H ＝ 446.0( 方法 A3)。
     实施例 9 ： (R)-2- 羟基甲基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 叔丁基 -4， 5- 二 氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
    将咪唑 -1- 甲酸 (8- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ( 中间体 A， 124mg， 0.350mmol) 加至 (R)-2- 羟基甲基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺 ( 中间体 J， 63mg， 0.350mmol) 和三乙胺 (0.049mL， 0.350mmol) 在 DMF(2ml) 中的混合物。将 RM 在 40℃ 搅拌 2h， 然后在室温静置 18h， 然后通过制备型 HPLC( 方法 B) 直接纯化。将含产物的馏分 通过 300mg Bond Elut-SCX 柱洗脱。然后将柱用在 MeOH 中的 7M 氨溶液洗脱， 蒸发， 得到黄 色固体。然后将分离的固体悬浮于 DCM 中， 过滤， 干燥， 得到为淡黄色 / 白色固体的标题化 合物。LCMS ： tR 1.31min 且 M+H ＝ 430.9( 方法 A1)。 实施例 10 ： (R)-2-{[(3- 氟 - 苄基 )- 甲基 - 氨基 ]- 甲基 }- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
    
    在氩气下、 于室温将咪唑 -1- 甲酸 (8- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑 啉 -2- 基 )- 酰胺 ( 中间体 A， 40.1mg， 0.113mmol) 和三乙胺 (0.047mL， 0.339mmol) 加至悬 浮于 DMF(1ml) 中的 (R)-2-{[(3- 氟 - 苄基 )- 甲基 - 氨基 ]- 甲基 }- 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺 ( 中间体 K， 30mg， 0.113mmol)。将 RM 在 40℃搅拌 2.5h， 然后通过制备型 HPLC( 方法 C) 直 接纯化。将含产物的馏分通过 Bond Elut-SCX， 300mg 柱洗脱。然后将柱用在 MeOH 中的 7M 氨溶液洗脱， 蒸发， 得到黄色固体。将固体用 DCM 研磨， 过滤， 干燥， 得到为淡黄色固体的标 题化合物。LCMS ： tR 0.81min 且 M+H ＝ 552.3( 方法 A2)。
     实施例 11 ： (S)-2- 甲基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 叔丁基 -4， 5- 二 氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
    
    在氩气下、 于室温将 (S)-2- 甲基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺 ( 中间体 F， 22.14mg， 0.169mmol) 和三乙胺 (0.035mL， 0.254mmol) 加至在 DMF(1ml) 中的咪唑 -1- 甲酸 (8- 叔丁 基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ( 中间体 A， 30mg， 0.085mmol)。在 室温搅拌 16h 后， 将 RM 通过制备型 HPLC( 方法 B) 直接纯化。将含产物的馏分通过 300mg Bond Elut-SCX 柱洗脱。然后将柱用在 MeOH 中的 7M 氨溶液洗脱， 蒸发， 得到为黄色结晶固 体的标题化合物。MS ： M+H ＝ 415.1.HPLC ： tR 3.73min( 方法 D)。
     实施例 12 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 二乙基氨基 -4， 5- 二氢 - 噻 唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
    
    在 氩 气 下、 于 室 温 将 (S)- 吡 咯 烷 -2- 甲 酸 酰 胺 (148mg， 1.299mmol) 和 三 乙 胺 (0.272mL， 1.949mmol) 加至在 DMF(1ml) 中的咪唑 -1- 甲酸 (8- 二乙基氨基 -4， 5- 二氢 - 噻 唑 并 [4， 5-h] 喹 唑 啉 -2- 基 )- 酰 胺 ( 中 间 体 C， 240mg， 0.65mmol)。 将 RM 在 室 温 搅 拌 15.5h， 然后用制备型 HPLC( 方法 C) 纯化。将含产物的馏分合并， 滤过 Bond Elut-SCX 柱。 然后将柱用在 MeOH 中的 7M 氨溶液洗脱， 蒸发， 得到为橙色晶体的标题化合物。MS ： M+H ＝ 416.1.HPLC ： tR 3.56min( 方法 D)。
     实施例 13 ： (S)- 氮杂环丁烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 二乙基氨基 -4， 5- 二 氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
    
    将 (S)- 氮杂环丁烷 -2- 甲酸酰胺 ( 中间体 L， 26.4mg， 0.264mmol)、 咪唑 -1- 甲 酸 (8- 二乙基氨基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ( 中间体 C， 75mg， 0.203mmol) 和三乙胺 (0.085mL， 0.609mmol) 在 DMF(2ml) 中的混合物在 40℃搅拌 2h。然后 将 RM 通过制备型 HPLC( 方法 B) 直接纯化。将含产物的馏分通过 300mg Bond Elut-SCX 柱 洗脱。然后将柱用在 MeOH 中的 7M 氨溶液洗脱， 蒸发， 得到为白色结晶固体的标题化合物。 MS ： M+H ＝ 402.1.HPLC ： tR 3.56min( 方法 D)。
     实施例 14 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并
     [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
    于室温、 将 (S)- 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺 (16mg， 0.14mmol) 加至咪唑 -1- 甲酸 (8- 叔 丁基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ( 中间体 A， 45mg， 0.127mmol) 和三 乙胺 (0.053mL， 0.381mmol) 在 DMF(1ml) 中的混合物。将 RM 在室温静置过夜， 然后蒸发， 将 1 残余物从 MeOH 和水结晶。 过滤收集标题化合物。 MS ： M+H ＝ 401.1(MS-ESI)。 H-NMR(CD3OD， 400MHz) ： 8.31(s， 1H)， 4.46(d， 1H)， 3.77-3.54(m， 2H)， 3.08-2.90(m， 4H)， 2.33-2.23(m， 1H)， 2.13-2.00(m， 3H)， 1.38(s， 9H))。
     实施例 15 ： 5- 甲基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 二乙基氨基 -4， 5- 二 氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
    
    向咪唑 -1- 甲酸 (8- 二乙基氨基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰 胺 ( 中间体 C， 75mg， 0.203mmol) 在 DMF(2ml) 中的悬液加入 5- 甲基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰 胺 ( 如 Arch.Pharm.， 1936， 274， 40 中 所 述 制 备 ； 39mg， 0.305mmol) 和 三 乙 胺 (0.085mL， 0.609mmol)。将 RM 在 40℃搅拌 2.5h， 然后通过制备型 HPLC( 方法 B) 直接纯化。将含产物 的馏分通过 Bond Elut-SCX 柱洗脱。然后将柱用在 MeOH 中的 7M 氨溶液洗脱， 蒸发， 将残 余物用 DCM 研磨， 得到为黄色固体的标题化合物。LCMS ： tR 0.77min 且 M+H ＝ 430.0( 方法 A2)。
     实施例 16 ： (2S， 4R)-4- 氟 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 二乙基氨基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
    
    向在 DCM(2ml) 中的咪唑 -1- 甲酸 (8- 二乙基氨基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ( 中间体 C， 75mg， 0.203mmol) 加入 (2S， 4R)-4- 氟 - 吡咯烷 -2- 甲酸 酰胺 ( 中间体 M， 40.2mg， 0.305mmol) 和三乙胺 (0.085mL， 0.609mmol)。将 RM 在 40℃搅拌 17.5h， 然后通过制备型 HPLC( 方法 B) 直接纯化。 将含产物的馏分通过 Bond Elut-SCX 柱洗 脱。然后将柱用在 MeOH 中的 7M 氨溶液洗脱， 蒸发， 得到为黄色固体的标题化合物。HPLC ：
     tR 3.66min( 方法 D)。MS ： M+H ＝ 434.1。
     实施例 17 ： (2S， 4S)-4- 氟 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 二乙基氨基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
    向在 DMF(0.4ml) 中的咪唑 -1- 甲酸 (8- 二乙基氨基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ( 中间体 C， 17mg， 0.046mmol) 加入 (2S， 4S)-4- 氟 - 吡咯烷 -2- 甲酸 酰胺 ( 中间体 N， 6.08mg， 0.046mmol) 和三乙胺 (0.019mL， 0.138mmol)。将 RM 在 40℃搅拌 17h， 然后通过制备型 HPLC( 方法 B) 直接纯化。将含产物的馏分通过 Bond Elut-SCX 柱洗 脱。然后将柱用在 MeOH 中的 7M 氨溶液洗脱， 蒸发， 得到为黄色固体的标题化合物。HPLC ： tR3.55min( 方法 D)。MS ： M+H ＝ 434.1。
     实施例 18 ： (1S， 5R)-2- 氮杂 - 二环 [3.1.0] 己烷 -1， 2- 二甲酸 1- 酰胺 2-[(8- 叔 丁基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
    
    在 室 温、 将 (1S， 5R)-2- 氮 杂 - 二 环 [3.1.0] 己 烷 -1- 甲 酸 酰 胺 ( 中 间 体 O， 208mg， 1.65mmol) 加至搅拌的咪唑 -1- 甲酸 (8- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑 啉 -2- 基 )- 酰胺 ( 中间体 A， 532mg， 1.5mmol) 和三乙胺 (0.627mL， 4.50mmol) 在 DMF(4ml) 中的混合物。 56 和 80 小时后， 加入 (1S， 5R)-2- 氮杂 - 二环 [3.1.0] 己烷 -1- 甲酸酰胺 ( 中 间体 O， 104mg， 0.825mmol) 的另外部分， 将 RM 在室温静置 18h。然后将 RM 通过 PTFE 膜过 滤， 通过制备型 HPLC( 方法 B) 纯化。将含产物的馏分通过 Bond Elut-SCX 柱洗脱。然后将 柱用在 MeOH 中的 7M 氨溶液洗脱， 蒸发。 通过制备型 HPLC( 方法 B) 再次纯化残余物， 以相同 方法分离。然后将粗产物从水 /MeOH 的 1 ∶ 1 混合物重结晶， 得到为黄色结晶固体的标题 1 化合物。LCMS ： tR 1.22min 且 M+H ＝ 413.1( 方法 A3)。 H-NMR(d6-DMSO， 400MHz) ： 11.22(s，
    1H)， 8.40(s， 1H) ； 7.33(s， br， 1H) ； 7.05(s， br， 1H) ； 3.97-3.84(m， 1H) ； 3.64-3.52(m， 1H) ； 3.01-2.83(m， 4H) ； 2.28-2.13(m， 1H) ； 1.95-1.74(m， 3H) ； 1.33(s， 9H) ； 1.04-0.97(m， 1H))。
     实施例 19 ： (1S， 5R)-2- 氮杂 - 二环 [3.1.0] 己烷 -1， 2- 二甲酸 1- 酰胺 2-[(8- 二 乙基氨基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
    向在 DCM(2ml) 中的咪唑 -1- 甲酸 (8- 二乙基氨基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ( 中间体 C， 75mg， 0.203mmol) 加入 (1S， 5R)-2- 氮杂 - 二环 [3.1.0] 己烷 -1- 甲酸酰胺 ( 中间体 O， 38.4mg， 0.305mmol) 和三乙胺 (0.085mL， 0.609mmol)。将 RM 在 40℃搅拌 17.5h， 然后通过制备型 HPLC( 方法 B) 直接纯化。将含产物的馏分通过 Bond Elut-SCX 柱洗脱。 然后将柱用在 MeOH 中的 7M 氨溶液洗脱， 蒸发， 得到为黄色固体的标题化 合物。HPLC ： tR 3.73min( 方法 D)。MS ： M+H ＝ 428.1。
     实施例 20 ： (2S， 3R)-3- 甲基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
    
    向在 DMF(1ml) 中的咪唑 -1- 甲酸 (8- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑 啉 -2- 基 )- 酰胺 ( 中间体 A， 60mg， 0.169mmol) 加入 (2S， 3R)-3- 甲基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰 胺 ( 中间体 P， 32.5mg， 0.254mmol) 和三乙胺 (0.071mL， 0.508mmol)。在氩气下将 RM 于室温 搅拌 2h， 然后通过制备型 HPLC( 方法 B) 直接纯化。 将 CH3CN 从含产物的馏分蒸发， 然后将剩 余的液体通过 Bond Elut-SCX 柱洗脱。 然后将柱用在 MeOH 中的 7M 氨溶液洗脱， 蒸发。 将残 余物在甲醇中研磨， 过滤和干燥后， 收集为白色晶体的标题化合物。 HPLC ： tR 3.66( 方法 D)。 1 MS ： M+H ＝ 415.1. H-NMR(CD3OD， 600MHz) ： 7.96(s， 1H)， 4.04(d， 1H)， 3.47(t， 1H)， 3.18(q， 1H)， 2.71-2.67(m， 2H)， 2.64-2.58(m， 2H)， 2.24-2.15(m， 1H)， 1.76(s， br， 1H)， 1.53(s， br， 1H)， 1.03(s， 9H)， 0.78(d， 3H)。
     实施例 21 ： (2S， 3R)-3- 甲基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 二乙基氨基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
    
    在氩气下、 向在 DMF(1.5ml) 中的咪唑 -1- 甲酸 (8- 二乙基氨基 -4， 5- 二氢 - 噻唑 并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ( 中间体 C， 82mg， 0.222mmol) 加入 (2S， 3R)-3- 甲基 - 吡 咯烷 -2- 甲酸酰胺 ( 中间体 P， 42.7mg， 0.333mmol) 和三乙胺 (0.093mL， 0.666mmol)。将 RM 在室温搅拌 2h， 然后通过制备型 HPLC( 方法 B) 直接纯化。将 CH3CN 在真空下从含产物的馏 分除去， 然后将剩余的溶液通过 Bond Elut-SCX 柱洗脱。然后将柱用在 MeOH 中的 7M 氨溶
     液洗脱， 蒸发， 将残余物用甲醇研磨， 得到为白色结晶固体的标题化合物。 HPLC ： tR 3.74( 方 1 法 D)。MS ： M+H ＝ 430.1. H-NMR(CD3OD， 600MHz) ： 7.62(s， 1H)， 4.03(d， 1H)， 3.46(t， 1H)， 3.26(q， 4H)， 3.17(q， 1H)， 2.54(s， 4H)， 2.24-2.15(m， 1H)， 1.80-1.72(m， 1H)， 1.58-1.47(m， 1H)， 0.83(t， 6H)， 0.77(d， 3H)。
     实施例 22 ： (2S， 4S)-4- 二甲基氨基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 二乙基 氨基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
    向 在 DMF(1.5ml) 中 的 咪 唑 -1- 甲 酸 (8- 二 乙 基 氨 基 -4， 5- 二 氢 - 噻 唑 并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ( 中间体 C， 60mg， 0.162mmol) 加入 (2S， 4S)-4- 二甲基氨基 - 吡 咯烷 -2- 甲酸酰胺 ( 中间体 Q， 28.1mg， 0.179mmol) 和三乙胺 (0.068mL， 0.487mmol)。将 RM 在 40℃搅拌 17h， 然后通过制备型 HPLC( 方法 B) 直接纯化。将含产物的馏分通过 Bond Elut-SCX 柱。 然后将柱用在 MeOH 中的 7M 氨溶液洗脱。 将溶液蒸发， 得到标题化合物。 HPLC ： M+H ＝ 459.1。 tR3.23min( 方法 D)。MS ：
     实施例 23 ： 5- 苯基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 二乙基氨基 -4， 5- 二 氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
    
    向咪唑 -1- 甲酸 (8- 二乙基氨基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰 胺 ( 中间体 C， 65mg， 0.176mmol) 在 DMF(2ml) 中的悬液加入 5- 苯基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰 胺 ( 如 US 专 利 3164597 实 施 例 42 所 述 制 备， 50.2mg， 0.264mmol) 和 三 乙 胺 (0.074mL， 0.528mmol)。将 RM 在 40℃搅拌 2h， 然后通过制备型 HPLC( 方法 B) 直接纯化。将含产物的 馏分通过 Bond Elut-SCX 柱。然后将柱用在 MeOH 中的 7M 氨溶液洗脱。将溶液蒸发， 将残 余物在 DCM 中研磨， 得到为黄色固体的标题化合物。LCMS ： tR 0.99min 且 M+H ＝ 492.0( 方
    法 A2)。
    
    实施例 24 ： 氮杂环丁烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]向咪唑 -1- 甲酸 (8- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ( 中 间体 A， 100mg， 0.282mmol) 在 DMF(2ml) 中的溶液加入氮杂环丁烷 -2- 甲酸酰胺 (56.5mg， 0.564mmol) 和三乙胺 (0.118mL， 0.846mmol)。将 RM 在氩气气氛下于室温搅拌 16h， 然后通 过制备型 HPLC( 方法 B) 直接纯化。将含产物的馏分通过 Bond Elut-SCX 柱。然后将柱用 在 MeOH 中的 7M 氨溶液洗脱。将溶液蒸发， 将残余物通过硅胶快速层析法纯化， 用含 0.5％ 880 HN3 的 DCM/MeOH 95 ∶ 5 洗脱， 得到为黄色固体的标题化合物。HPLC ： tR 3.55min( 方法 D)。MS ： M+H ＝ 387.1。
     实施例 25 ： (S)- 氮杂环丁烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 噻 唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
    
    在室温、 将 (S)- 氮杂环丁烷 -2- 甲酸酰胺 ( 中间体 L， 68.1mg， 0.680mmol) 加至 搅拌的咪唑 -1- 甲酸 (8- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ( 中 间体 A， 241mg， 0.680mmol) 和三乙胺 (0.284mL， 2.040mmol) 在 DMF(3ml) 中的混合物。将 RM 在室温静置 66h， 然后通过制备型 HPLC( 方法 B) 直接纯化。将含产物的馏分蒸发， 除去 CH3CN， 然后用 NaHCO3 碱化。然后将水相用 10％ MeOH 的 DCM 溶液萃取 4X， 将合并的有机层 经 Na2SO4 干燥， 蒸发得到固体， 将该固体用 MeOH/ 水研磨， 得到为灰白色结晶固体的标题化 合物。LCMS ： tR 1.08min 且 M+H ＝ 386.9( 方法 A3)。
     实施例 26 ： (2S， 4S)-4- 羟基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 二乙基氨基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
    
    向咪唑 -1- 甲酸 (8- 二乙基氨基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰 胺 ( 中间体 C， 75mg， 0.203mmol) 在 DMF(2ml) 中的悬液加入 (2S， 4S)-4- 羟基 - 吡咯烷 -2- 甲 酸酰胺 ( 中间体 R， 39.6mg， 0.305mmol) 和三乙胺 (0.113mL， 0.812mmol)。将 RM 在 40℃搅 拌 2.5h， 然后通过制备型 HPLC( 方法 B) 直接纯化。将含产物的馏分通过 Bond Elut-SCX 柱。然后将柱用在 MeOH 中的 7M 氨溶液洗脱。将溶液蒸发， 得到为黄色固体的标题化合物。HPLC ： tR 3.44min( 方法 D)。MS ： M+H ＝ 432.1。
     实施例 27 ： (2S， 4R)-4- 羟基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 二乙基氨基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
    向咪唑 -1- 甲酸 (8- 二乙基氨基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰 胺 ( 中间体 C， 75mg， 0.203mmol) 在 DMF(2ml) 中的悬液加入 (2S， 4R)-4- 羟基 - 吡咯烷 -2- 甲 酸酰胺 ( 中间体 S， 39.6mg， 0.305mmol) 和三乙胺 (0.113mL， 0.812mmol)。 将 RM 在 40℃搅拌 4.5h， 然后通过制备型 HPLC( 方法 B) 直接纯化。将含产物的馏分通过 Bond Elut-SCX 柱。 然后将柱用在 MeOH 中的 7M 氨溶液洗脱。将溶液蒸发， 将残余物从 DCM 重结晶， 得到为黄色 固体的标题化合物。HPLC ： tR 3.31min( 方法 D)。MS ： M+H ＝ 432.1。
     实施例 28 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(7- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 苯并 [1， 2-d ； 3， 4-d′ ] 双噻唑 -2- 基 )- 酰胺 ]
    
    将 L- 脯 氨 酰 胺 (59.4mg， 0.521mmol) 和 TEA(0.121mL， 0.868mmol) 加 至 在 DMF(1ml) 中 的 咪 唑 -1- 甲 酸 (7- 叔 丁 基 -4， 5- 二 氢 - 苯 并 [1， 2-d ； 3， 4-d ′ ] 双 噻 唑 -2- 基 )- 酰胺 ( 中间体 T， 156mg， 0.434mmol)。将 RM 在室温搅拌 10min。将混合物用 EtOAc/H2O 萃取。将有机层经 Na2SO4 干燥， 蒸发。用 MPLCC18H2O 0.1 ％ TFA/CH3CN 0.1 ％ TFA( 梯度 0-50 ％ ) 对粗物质层析。将含产物的馏分用 NaHCO3 中和， 用 EtOAc 萃取， 从 二 噁 烷 冻 干， 得 到 为 白 色 固 体 的 标 题 化 合 物 (M+H ＝ 406 ； M-H ＝ 404 ； tR 4.75min( 方 1 法 F) 。 H-NMR(d 6-DMSO ， 600.13MHz)10.80(s ， 1H)7.40(s ， 1H) ， 6.98(s ， 1H) ， 4.30(s ， 1H)3.65-3.55(m 1H)， 3.48-3.38(m， 1H)， 3.10(t， 2H)， 2.94(t， 2H)， 2.14-2.05(m， 1H)， 1.95-1.78(m， 3H)， 1.40(s， 9H))。
     实施例 29 ： (S)-2- 甲基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(7- 叔丁基 -4， 5- 二 氢 - 苯并 [1， 2-d ； 3， 4-d′ ] 双噻唑 -2- 基 )- 酰胺 ]
    
    将 (S)-2- 甲 基 - 吡 咯 烷 -2- 甲 酸 酰 胺 ( 中 间 体 F， 7.7mg， 0.060mmol) 和 TEA(0.014mL， 0.100mmol) 加至在 DMF(3ml) 中的咪唑 -1- 甲酸 (7- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 苯并 [1， 2-d ； 3， 4-d′ ] 双噻唑 -2- 基 )- 酰胺 ( 中间体 T， 18mg， 0.050mmol)。将 RM 在室温搅拌 10min。 然后用 EtOAc/H2O 萃取。 将有机层经 Na2SO4 干燥， 蒸发。 用 MPLC C18H2O 0.1％ TFA/ CH3CN 0.1％ TFA( 梯度 0-50％ ) 对粗物质层析。 将含产物的馏分用 NaHCO3 中和， 用 EtOAc 萃 取， 从二噁烷冻干， 得到为白色固体的标题化合物 (M+H ＝ 420 ； M-H ＝ 418 ； tR 4.875min( 方 1 法 F)。 H-NMR(d6-DMSO， 600.13MHz)10.60(s， br， 1H)7.68(s， 1H)， 6.86(s， 1H)， 3.68-3.60(m 1H)， 3.60-3.50(m 1H)， 3.08(t， 2H)， 2.90(t， 2H)， 2.10-1.98(m， 1H)， 1.90-1.68(m， 3H)， 1.48(s， 3H)， 1.37(s， 9H))。
     实施例 30 ： (S)- 氮杂环丁烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(7- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 苯 并 [1， 2-d ； 3， 4-d′ ] 双噻唑 -2- 基 )- 酰胺 ]
    将 (S)- 氮杂环丁烷 -2- 甲酸酰胺 ( 中间体 L， 37.1mg， 0.370mmol) 和 TEA(0.14mL， 1.010mmol) 加至在 DMF(2ml) 中的咪唑 -1- 甲酸 (7- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 苯并 [1， 2-d ； 3， 4-d′ ] 双噻唑 -2- 基 )- 酰胺 ( 中间体 T， 121mg， 0.337mmol)。将 RM 搅拌 5min， 然后在室 温静置 2 天。过滤 RM， 通过制备型 HPLC( 方法 E) 直接纯化。将含产物的馏分合并， 滤过 BondElute-SCX， 300mg 柱。 然后将柱用在 MeOH 中的 7M 氨溶液 (2ml) 洗涤。 蒸发滤液， 得到为 1 白色固体的标题化合物 (M+H ＝ 391.8 ； M-H ＝ 389.8 ； tR1.84min( 方法 A3)。H-NMR(d6-DMSO， 400MHz)11.12(s， 1H)7.52(s， 1H)， 7.30(s， 1H)， 4.74-4.62(m， 1H)， 3.92(t， 2H)， 3.08(t， 2H)， 2.90(t， 2H)， 2.46-2.36(m， 1H)， 2.18-2.02(m， 1H)， 1.39(s， 9H))。
     实施例 31 ： (2S， 4R)-4- 二甲基氨基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(7- 叔丁 基 -4， 5- 二氢 - 苯并 [1， 2-d ； 3， 4-d′ ] 双噻唑 -2- 基 )- 酰胺 ]
    
    将 (2S， 4R)-4- 二甲基氨基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺 ( 中间体 B， 9.33mg， 0.059mmol) 和 TEA(0.019mL， 0.135mmol) 加 至 在 DMF(1ml) 中 的 咪 唑 -1- 甲 酸 (7- 叔 丁 基 -4， 5- 二 氢 - 苯并 [1， 2-d ； 3， 4-d′ ] 双噻唑 -2- 基 )- 酰胺 ( 中间体 T， 19.4mg， 0.054mmol)。将 RM 搅拌 5min， 然后在室温静置过夜。将 RM 过滤， 通过制备型 HPLC( 方法 E) 直接纯化。将含 产物的馏分合并， 滤过 Bond Elute-SCX， 300mg 柱。然后将柱用在 MeOH 中的 7M 氨溶液洗 涤。蒸发滤液， 得到为白色固体的标题化合物 (M+H ＝ 449.1 ； M-H ＝ 447.3 ； tR1.47min( 方
     法 A3)。1H-NMR(d6-DMSO， 400MHz)7.40(s， 1H)， 7.00(s， 1H)， 4.44-4.25(m， 1H)， 3.86-3.76(m 1H) ， 3.35-3.25(m 1H) ， 3.08(t ， 2H) ， 2.92(t ， 2H) ， 2.96-2.78(m ， 1H) ， 1.18(s ， br ， 6H) ， 2.08-1.85(m， 2H)， 1.38(s， 9H))。
     实施例 32 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-{[7-(2- 氟 -1， 1- 二甲基 - 乙 基 )-4， 5- 二氢 - 苯并 [1， 2-d ； 3， 4-d′ ] 双噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
    将 L- 脯 氨 酰 胺 (23.98mg， 0.210mmol) 和 TEA(0.080mL， 0.573mmol) 加 至 在 DMF(1ml) 中 的 咪 唑 -1- 甲 酸 [7-(2- 氟 -1， 1- 二 甲 基 - 乙 基 )-4， 5- 二 氢 - 苯 并 [1， 2-d ； 3， 4-d ′ ] 双噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 ( 中间体 U， 72.1mg， 0.191mmol)。将 RM 搅拌 5min， 然后在室温静置过夜。蒸发 RM， 然后用 MeOH(2ml) 和 H2O(1ml) 研磨。将混合物冷却至 将固体于 40 ℃在 HV 下干燥， 得到为白色 4 ℃。过滤悬液， 用冷 MeOH/H2O ＝ 2 ∶ 1 洗涤， 1 固体的标题化合物 (M+H ＝ 424.0 ； M-H ＝ 422.1 ； tR 1.7min( 方法 A3)。 H-NMR(d6-DMSO， 400MHz)7.19(s， 1H)， 6.96(s， 1H)， 4.58(s， 1H)4.44(s， 1H)， 4.28(s， br， 1H)3.64-3.50(m 1H)， 3.48-3.38(m 1H)， 3.10(t， 2H)， 2.92(t， 2H)， 2.18-1.98(m， 1H)， 1.94-1.78(m， 3H)， 19 1.38(s， 6H) F-NMR(d6-DMSO， 600.13MHz)219ppm(t， 1F))。
     实施例 33 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(7- 环丙基甲基 -4， 5- 二氢 - 苯 并 [1， 2-d ； 3， 4-d′ ] 双噻唑 -2- 基 )- 酰胺 ]
    
    将 L- 脯 氨 酰 胺 (16.7mg， 0.147mmol) 和 TEA(0.027mL， 0.196mmol) 加 至 在 DMF(1.5ml) 中的咪唑 -1- 甲酸 (7- 环丙基甲基 -4， 5- 二氢 - 苯并 [1， 2- ； 3， 4-d ′ ] 双噻 唑 -2- 基 )- 酰胺 ( 中间体 V， 35mg， 0.098mmol)。 将 RM 在室温搅拌 15min， 然后用 EtOAc/H2O 萃取。将有机层经 Na2SO4 干燥， 蒸发。用 MPLC C18H2O 0.1％ TFA/CH3CN 0.1％ TFA( 梯度 0-50％ ) 对粗物质层析。 将含产物的馏分用 NaHCO3 中和， 用 EtOAc 萃取， 从二噁烷冻干， 得到 1 为白色固体的标题化合物 (M+H ＝ 404 ； M-H ＝ 402 ； tR 4.49min( 方法 F)。 H-NMR(d6-DMSO， 600.13MHz)10.78(s ， 1H)7.40(s ， 1H) ， 6.98(s ， 1H) ， 4.28(s ， br ， 1H)3.65-3.55(m ， 1H) ， 3.48-3.38(m， 1H)， 3.08(t， 2H)， 2.97(t， 2H)， 2.84(d， 2H)， 2.14-2.04(m， 1H)， 1.93-1.72(m， 3H)， 1.10(q， 1H)， 0.60-0.50(m， 2H)， 0.40-0.38(m， 2H))。
     实施例 34 ： (2S， 3S)-3- 甲基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(7- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 苯并 [1， 2-d ； 3， 4-d′ ] 双噻唑 -2- 基 )- 酰胺 ]
     将 (2S， 3S)-3- 甲基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺 ( 中间体 D， 13.37mg， 0.104mmol) 和 TEA(0.039mL， 0.278mmol) 加至在 DMF(2ml) 中的咪唑 -1- 甲酸 (7- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 苯 并 [1， 2-d ； 3， 4-d ′ ] 双 噻 唑 -2- 基 )- 酰 胺 ( 中 间 体 T， 25mg， 0.070mmol)。 将 RM 在 室 温搅拌 10min， 然后用 EtOAc/H2O 萃取。将有机层经 Na2SO4 干燥， 蒸发。将粗物质不经进 一步纯化从二噁烷冻干， 得到为白色固体的标题化合物 (M+H ＝ 420.1 ； M-H ＝ 418.1 ； tR 1 4.85min( 方 法 F)。 H-NMR(d6-DMSO， 600.13MHz)10.78(s， br， 1H)7.44(s， br， 1H)， 6.97(s， br， 1H)， 3.90-3.70(m， 1H)3.62-3.42(m， 2H)， 3.08(t， 2H)， 2.94(t， 2H)， 2.22-2.12(m， 1H)， 2.06-1.94(m， 1H)， 1.58-1.48(m， 1H)， 1.39(s， 9H)， 1.04(d， 3H))。
     实施例 35 ： (1S， 5R)-2- 氮杂 - 二环 [3.1.0] 己烷 -1， 2- 二甲酸 1- 酰胺 2-[(7- 叔 丁基 -4， 5- 二氢 - 苯并 [1， 2-d ； 3， 4-d′ ] 双噻唑 -2- 基 )- 酰胺 ]
    
    使用中间体 O 替代中间体 D， 以与实施例 34 所述类似的方法合成标题化合物。
     (M+H ＝ 418.0 ； M-H ＝ 416.1 ； t R 4.90min( 方 法 F) 。 1H-NMR(d 6-DMSO ， 600.13MHz)10.78(s ，br ， 1H)7.40(s ，br ， 1H) ， 7.06(s ，br ， 1H) ， 3.92-3.82(m ， 1H)3.62-3.52(m ， 1H) ， 3.08(t ， 2H) ， 2.94(t ， 2H) ， 2.26-2.14(m ， 1H) ， 1.92-1.72(m ， 3H) ， 1.39(s， 9H)， 1.05-0.95(m， 1H))。
     实 施 例 36 ： (2S， 3S)-3-( 乙 酰 基 氨 基 - 甲 基 )- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-[(8- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
    
    在室温、 将三乙胺 (0.339mmol) 加至咪唑 -1- 甲酸 (8- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 噻唑 并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ( 中间体 A)(0.113mmol) 和 (2S， 3S)-3-( 乙酰基氨基 - 甲 基 )- 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺 ( 阶段 36.1)(0.135mmol) 的溶液。搅拌 85min 后， 将反应混 合物浓缩。将残余物通过硅胶柱层析法纯化， 然后用 Et2O 研磨， 提供为黄色固体的标题化 合物。HPLC ： tR ＝ 4.20min( 方法 H) ； LCMS ： tR ＝ 1.48min， [M+H]+472( 方法 I) ； TLC ： Rf ＝1 0.14(9 ∶ 1CH2Cl2/MeOH) ； H-NMR(d6-DMSO， 600MHz) ： 11.15(br s， 1H)， 8.41(s， 1H)， 7.81(br s， 1H)， 7.53(br s， 1H)， 7.13(br s， 1H)， 4.28(m， 1H)， 3.74(m， 1H)， 3.40(m， 1H)， 3.25(m， 1H)， 2.98(m， 2H)， 2.93(m， 3H)， 2.42(m， 1H)， 2.02(m， 1H)， 1.82(s， 3H)， 1.74(m， 1H)， 1.33(s， 9H)。
     阶段 36.1 ： (2S， 3S)-3-( 乙酰基氨基 - 甲基 )- 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺
    将 (2S， 3S)-3-( 乙 酰 基 氨 基 - 甲 基 )-1-((S)-1- 苯 基 - 乙 基 )- 吡 咯 烷 -2- 甲 酸 酰 胺 ( 阶 段 36.2)(0.48mmol) 和 10 ％ 披 钯 炭 ( 用 50 ％ H2O 润 湿 )(Aldrich330108) (0.096mmol) 在 MeOH(5ml) 中 的 混 合 物 在 室 温 氢 化 6.5h。 然 后 将 反 应 混 合 物 滤 过 Fluoropore 滤膜 (0.2μm FG)， 蒸发。将残余物溶解于 CH2Cl2 中， 蒸发至干， 提供为灰白色 + 固体的标题化合物。ESI-MS ： [M+H] 186 ； TLC ： Rf ＝ 0.08(200 ∶ 20 ∶ 1CH2Cl2/MeOH/ 浓 NH4OH)。
     阶 段 36.2 ： (2S， 3S)-3-( 乙 酰 基 氨 基 - 甲 基 )-1-((S)-1- 苯 基 - 乙 基 )- 吡 咯 烷 -2- 甲酸酰胺
    
    在室温、 将硫代乙酸 (2.312mmol) 加至 (2S， 3S)-3- 叠氮基甲基 -1-((S)-1- 苯 基 - 乙基 )- 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺 ( 阶段 36.3)(0.578mmol)， 形成氮气。搅拌 16h 后， 将反 应混合物用 Et2O 稀释， 过滤除去固体， 浓缩滤液。将残余物通过硅胶柱层析法纯化， 提供 为浅黄色油状物的标题化合物 ( 硫醇气味 )。HPLC ： tR ＝ 3.71min( 方法 H) ； LC-MS ： tR ＝ + 0.64min， [M+H] 290( 方法 I) ； TLC ： Rf ＝ 0.38(200 ∶ 20 ∶ 1CH2Cl2/MeOH/ 浓 NH4OH)。
     阶段 36.3 ： (2S， 3S)-3- 叠氮基甲基 -1-((S)-1- 苯基 - 乙基 )- 吡咯烷 -2- 甲酸酰 胺
    
    在 0 ℃、 将在甲苯中三甲基铝 (2M， 15.95mmol) 滴加至 NH4Cl(15.95mmol) 在甲苯 (2ml) 中的混合物， 形成甲烷气体。将反应混合物升至室温， 另外搅拌 15min， 然后缓慢地 用 (2S， 3S)-3- 叠氮基甲基 -1-((S)-1- 苯基 - 乙基 )- 吡咯烷 -2- 甲酸甲酯 ( 阶段 36.4) (7.98mmol) 在甲苯 (8ml) 中的溶液处理。 18h 后加入由在甲苯 (2ml) 中的 NH4Cl(15.95mmol) 和在甲苯中的三甲基铝 (2M， 15.95mmol) 在 0 ℃制备的另外的试剂。搅拌 44h 后， 将混合
     物冷却至 0℃， 用 1M HCl 淬灭， 然后用 CH2Cl2(3X) 洗涤。将水相用 1 ∶ 1 的 NaHCO3 饱和溶 液 /Rochelle 盐饱和溶液碱化， 用 THF(10X) 萃取。将合并的有机层干燥 (Na2SO4)， 干燥， 浓缩。将残余物使用 RediSep 硅胶柱纯化， 提供为黄色油状物的标题化合物。HPLC ： tR ＝ 2.50min( 方法 G) ； ESI-MS ： [M+H]+ 274 ； TLC ： Rf ＝ 0.26(3 ∶ 1Hex/EtOAc)。
     阶段 36.4 ： (2S， 3S)-3- 叠氮基甲基 -1-((S)-1- 苯基 - 乙基 )- 吡咯烷 -2- 甲酸甲 酯
    在室温、 将叠氮化钠 (5.34mmol) 加至 (2S， 3R)-3- 碘甲基 -1-((S)-1- 苯基 - 乙 基 )- 吡咯烷 -2- 甲酸甲酯 ( 阶段 36.5)(3.56mmol) 在 DMF(30ml) 中的溶液。18h 后， 将反 应混合物倒入水中， 用 TBE(2X) 萃取。将合并的有机相用盐水洗涤， 干燥 (Na2SO4)， 过滤， 浓缩。将残余物使用 RediSep 硅胶柱纯化， 提供为褐色油状物的标题化合物。HPLC ： tR ＝
    3.26min( 方法 G) ； ESI-MS ： [M+H]+289。
     阶段 36.5 ： (2S， 3R)-3- 碘甲基 -1-((S)-1- 苯基 - 乙基 )- 吡咯烷 -2- 甲酸甲酯
    在 -78 ℃、将 [ 丁 -3- 烯 基 -((S)-1- 苯 基 - 乙 基 )- 氨 基 ]- 乙 酸 甲 酯 [432555-77-6](20.22mmol) 在 THF(10ml) 中的溶液缓慢加至二异丙基氨基锂 (24.26mmol) 在 1 ∶ 2 己烷 /THF(30ml) 中的溶液。将反应混合物升温至 0 ℃， 搅拌 1h， 然后再冷却 至 -78 ℃。加入溴化锌 (50.5mmol) 在 Et2O(40ml) 中的溶液， 然后将反应混合物升温至室 温。搅拌 1h 后， 将混合物冷却至 0℃， 分批加入碘 (22.24mmol)。将反应混合物在 0℃搅拌 2h， 在室温再搅拌 2h， 用 Et2O 稀释， 然后用 Na2S2O3 饱和溶液和 NH4Cl 饱和溶液连续洗涤。将 水层各自用 Et2O 反萃取。将合并的有机相干燥 (Na2SO4)， 过滤， 浓缩。将残余物通过硅胶 柱层析法纯化， 提供为红色油状物的标题化合物。HPLC ： tR ＝ 3.46min( 方法 G) ； ESI-MS ：
    [M+H]+374。
     实施例 37 ： (2S， 3S)-3- 吗啉 -4- 基甲基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 叔 丁基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
    在室温、 将三乙胺 (0.423mmol) 加至咪唑 -1- 甲酸 (8- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 噻 唑 并 [4， 5-h] 喹 唑 啉 -2- 基 )- 酰 胺 ( 中 间 体 A)(0.141mmol) 和 (2S， 3S)-3-( 乙 酰 基 氨 基 - 甲基 )- 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺 ( 阶段 37.1)(0.155mmol) 在 DMF(0.5ml) 中的溶液。搅 拌 3h 后， 浓缩反应混合物。将残余物通过硅胶柱层析法纯化， 提供为白色固体的标题化 合 物。HPLC ： tR ＝ 4.04min( 方 法 H) ； LCMS ： tR ＝ 1.36min， [M+H]+ 500( 方 法 I) ； TLC ： Rf 1 ＝ 0.09(19 ∶ 1CH2Cl2/MeOH) ； H-NMR(d6-DMSO， 600MHz) ： 11.15(br s， 1H)， 8.39(m， 1H)， 7.37(br s， 1H)， 7.05(s， 1H)， 4.27(m， 1H)， 3.70(m， 1H)， 3.59(m， 4H)， 3.42(m， 1H)， 2.97(m， 2H)， 2.90(m， 2H)， 2.58(m， 1H)， 2.38(m， 4H)， 2.35(m， 1H)， 2.17(m， 1H)， 2.02(m， 1H)， 1.75(m， 1H)， 1.32(s， 9H)。
     阶段 37.1 ： (2S， 3S)-3- 吗啉 -4- 基甲基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺
    将 (2S， 3S)-3- 吗 啉 -4- 基 甲 基 -1-((S)-1- 苯 基 - 乙 基 )- 吡 咯 烷 -2- 甲 酸 酰 胺 ( 阶 段 37.2)(1.046mmol) 和 10 ％ 披 钯 炭 ( 用 50 ％ H2O 润 湿 )(Aldrich 330108) (0.105mmol) 在 MeOH(5ml) 中 的 混 合 物 在 室 温 氢 化 6.5h。 然 后 将 反 应 混 合 物 滤 过 Fluoropore 滤膜 (0.2μm FG)， 蒸发。 将残余物溶解于 CH2Cl2， 蒸发至干， 提供为无色油状物 + 的标题化合物。ESI-MS ： [M+H] 214 ； TLC ： Rf ＝ 0.14(200 ∶ 20 ∶ 1CH2Cl2/MeOH/ 浓 NH4OH)。
     阶段 37.2 ： (2S， 3S)-3- 吗啉 -4- 基甲基 -1-((S)-1- 苯基 - 乙基 )- 吡咯烷 -2- 甲 酸酰胺
    
    在 0 ℃、 将在甲苯中的三甲基铝 (2M， 2.89mmol) 滴加至 NH4Cl(2.89mmol) 在甲苯 (3ml) 中的混合物， 形成甲烷气体。将反应混合物升温至室温， 再搅拌 15min， 然后缓慢地用 (2S， 3S)-3- 吗啉 -4- 基甲基 -1-((S)-1- 苯基 - 乙基 )- 吡咯烷 -2- 甲酸甲酯 ( 阶段 37.3) (1.444mmol) 在甲苯 (9ml) 中的溶液处理。 18h 后加入由在甲苯 (2ml) 中的 NH4Cl(2.89mmol) 和在甲苯中的三甲基铝 (2M， 2.89mmol) 在 0℃制备的另外的试剂。 搅拌 60h 后， 将混合物冷 却至 0℃， 用 1M HCl 淬灭， 然后用 CH2Cl2(3X) 洗涤。将水相用 1 ∶ 1 的 NaHCO3 饱和溶液 / Rochelle 盐饱和溶液碱化， 用 THF(10X) 萃取。 将合并的有机层干燥 (Na2SO4)， 过滤， 浓缩。 将 残余物通过硅胶柱层析法纯化， 提供为黄色油状物的标题化合物。HPLC ： tR ＝ 2.18min( 方 + 法 G) ； ESI-MS ： [M+H] 318。
     阶段 37.3 ： (2S， 3S)-3- 吗啉 -4- 基甲基 -1-((S)-1- 苯基 - 乙基 )- 吡咯烷 -2- 甲 酸甲酯
    
    
    将 (2S， 3R)-3- 碘甲基 -1-((S)-1- 苯基 - 乙基 )- 吡咯烷 -2- 甲酸甲酯 ( 阶段 36.5) (7.07mmol)、 K2CO3(21.22mmol) 和吗啉 (10.61mmol) 在 CH3CN(24ml) 中的混合物在 50℃搅 拌 62h。将反应混合物倒入冰水中， 用 EtOAc 萃取 (3X)。将合并的有机层连续用水和盐水 洗涤， 干燥 (Na2SO4)， 过滤， 浓缩。将残余物使用 RediSep 硅胶柱纯化， 提供为黄色油状物的标题化合物。HPLC ： tR ＝ 2.56min( 方法 G) ； ESI-MS ： [M+H]+ 333。
     实施例 38 ： (2S， 3R)-3- 羟基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
    使用 (2S， 3R)-3- 羟基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺 (H.Fukushima 等人， Bioorg.Med. Chem.2004， 12， 6053 ； H.Ji 等人， J.Med.Chem.2006， 49(21)， 6254) 替代中间体 P， 使用如实 施例 20 所述的方法合成标题化合物。
     LCMS ： tR ＝ 1.45min， M+H ＝ 417.0， M-H ＝ 415( 方 法 J)。1H-NMR(d6-DMSO， 600.13MHz) ： 12-11(s， br， 1H)8.4(s， 1H)， 7.2-6.9(m， 2H)， 5.2(s， 1H)， 4.4(s， 1H)， 4.25(s， br， 1H)， 3.6(m， 1H) ； 3.45(m， 1H)， 2.95(m， 2H)， 2.9(m， 2H)， 2.0(m， 1H)， 1.9(m， 1H)， 1.3(s， 9H)。
     实施例 39 ： (2S， 3R)-3- 甲基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(7- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 苯并 [1， 2-d ； 3， 4-d′ ] 双噻唑 -2- 基 )- 酰胺 ]
    
    使用 (2S， 3R)-3- 甲基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺 ( 中间体 P) 替代中间体 D， 使用如实 施例 34 所述的方法合成标题化合物。
     LCMS ： tR ＝ 1.32min， M+H ＝ 420.0， M-H ＝ 418.1( 方 法 J)。1H-NMR(d6-DMSO， 400MHz) ： 10.65(s， br， 1H)7.39(s， br， 1H)， 6.99(s， br， 1H)， 4.2(m， 1H)， 3.67(t， 1H)， 3.3(m， 1H)， 3.08(t， 2H)， 2.93(t， 2H)， 2.38(m， 1H)， 1.95(m， 1H)， 1.7(m， 1H)， 1.39(s， 9H)， 0.97(d 3H)。
     合成流程 ：实施例 40 ： (2S， 3R)-3- 甲基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 甲基 -4H-5- 氧 杂 -1- 硫杂 -3， 7- 二氮杂 - 环戊二烯并 [a] 萘 -2- 基 )- 酰胺 ]
    
    利用在制备实施例 20 中所述的合成方法， 从咪唑 -1- 甲酸 (8- 甲基 -4H-5- 氧 杂 -1- 硫杂 -3， 7- 二氮杂 - 环戊二烯并 [a] 萘 -2- 基 )- 酰胺 ( 阶段 40.1) 开始制备标题 化合物。
     LCMS ： tR ＝ 0.29min， M+H ＝ 374.0， M-H ＝ 372( 方法 J)。1H-NMR 1H-NMR(CD3OD， 400MHz) ： 7.9(s， 1H)， 7.0(s， 1H)， 5.27(s， 2H)， 4.38(d， 1H)， 3.8(dd， 1H)， 3.5(m， 1H)， 2.5(m， 1H)， 2.4(s， 1H)， 2.08(m， 1H)， 1.95(m， 1H)， 1.12(d， 3H)。
     阶段 40.1 ： 咪唑 -1- 甲酸 (8- 甲基 -4H-5- 氧杂 -1- 硫杂 -3， 7- 二氯杂 - 环戊二 烯并 [a] 萘 -2- 基 )- 酰胺
    
    利用在制备中间体 A 中所述的合成方法， 从 N-(8- 甲基 -4H-5- 氧杂 -1- 硫杂 -3， 7- 二氮杂 - 环戊二烯并 [a] 萘 -2- 基 )- 乙酰胺 ( 阶段 40.2) 制备咪唑 -1- 甲酸 (8- 甲 基 -4H-5- 氧杂 -1- 硫杂 -3， 7- 二氮杂 - 环戊二烯并 [a] 萘 -2- 基 )- 酰胺。
     阶 段 40.2 ： N-(8- 甲 基 -4H-5- 氧 杂 -1- 硫 杂 -3， 7- 二 氮 杂 - 环 戊 二 烯 并 [a] 萘 -2- 基 )- 乙酰胺
    
    在氩气下、 将 463mg(1.53mmol)N-[4-(4- 溴 -6- 甲基 - 吡啶 -3- 基氧基甲基 )- 噻 唑 -2- 基 ]- 乙酰胺 ( 阶段 40.3)、 900mg(2.71mmol) 碳酸铯、 30.4mg(0.135mmol) 醋酸钯和 81mg(0.271mmol) 三丁基膦四氟硼酸盐在 3mlDMF 中的混合物在 115℃搅拌 7h。 然后将反应 混合物倒入水中， 加入 EtOAc， 经 Hyflo Super Gel 介质 (Fluka 56678) 层过滤后， 用 EtOAc 萃取滤液 (2X)。将合并的有机层用水和盐水洗涤， 干燥 (MgSO4)， 过滤。将滤液真空浓缩， 得到残余物， 其通过硅胶 ( ＝ -100％ EtOAc 的庚烷溶液 ) 纯化， 提供 93mg 为固体的标题化 合物。LCMS ： tR ＝ 0.27min， M+H ＝ 262， M-H260( 方法 J)。
     阶段 40.3 ： N-[4-(4- 溴 -6- 甲基 - 吡啶 -3- 基氧基甲基 )- 噻唑 -2- 基 ]- 乙酰胺
    
    向 270mg(1.44mmol)4- 溴 -6- 甲基 - 吡啶 -3- 醇 ( 阶段 40.4) 在 DMF(5ml) 中的 溶液加入 44.8mg NaH(1.87mmol)， 将该混合物在室温搅拌 1h。加入 301mg(1.58mmol)2- 乙 酰胺基 -4-( 氯甲基 )-1， 3- 噻唑 (Apollo OR15549)， 在室温再继续搅拌 17h。将反应混合 物倒入水中， 用 EtOAc 萃取 (2X)。将合并的有机层用水和盐水洗涤， 干燥 (MgSO4)， 过滤。将 滤液真空浓缩， 得到 350mg 标题化合物 ( 白色固体 )， 其被认为足够纯而不需进一步纯化。 79 81 LCMS ： tR ＝ 1.36min， M+H ＝ 342( Br)， 344( Br)( 方法 J)。
     阶段 40.4 ： 4- 溴 -6- 甲基 - 吡啶 -3- 醇
    
    将 920mg(3.05mmol)4- 溴 -5- 甲氧基甲氧基 -2- 甲基 - 吡啶 ( 阶段 40.5) 溶解 于 5ml MeOH 中， 加入浓 HCl(1mL， 12mmol)， 将反应混合物在室温搅拌 2h。在真空浓缩混合 物时， 标题化合物 ( 以盐酸盐形式 ) 结晶。过滤提供 570mg 白色晶体。1H-NMR(d6-DMSO， 400MHz) ： 8.19(s， 1H)， 8.04(s， 1H)， 2.53(s， 3H)。
     阶段 40.5 ： 4- 溴 -5- 甲氧基甲氧基 -2- 甲基 - 吡啶
    将 1000mg(6.53mmol)5- 甲 氧 基 甲 氧 基 -2- 甲 基 - 吡 啶 (J.-P.Behr 等 人， Bioorg.Med.Chem.Lett.2003， 13(10)， 1713) 在 10ml THF 中的溶液冷却至 -78 ℃， 其中加 入 4.03mL(6.85mmol)t-BuLi(1.7M 的戊烷溶液 )。将所得混合物在氩气下搅拌 1h， 然后加 入 2.126g(6.53mmol)1， 2- 二溴四氯乙烷 ( 于 5ml THF 中 )。在 -78 ℃继续搅拌 1h， 将反 应混合物升温至室温。加入饱和 NH4Cl 溶液， 将含水混合物用 EtOAc 萃取 (2X)。将合并的 有机层用 H2O 和盐水洗涤， 干燥 (MgSO4)， 过滤。将滤液真空浓缩， 得到残余物， 其通过硅胶 (EtOAc/ 己烷＝ 1 ∶ 1) 纯化， 提供 920mg 为油状物的标题化合物。LCMS ： tR ＝ 0.29min， M+H 79 81 ＝ 232( Br)， 234( Br)( 方法 J)。
     实施例 41 ： (2S， 3S)-3- 吗啉 -4- 基甲基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(7- 叔 丁基 -4， 5- 二氢 - 苯并 [1， 2-d ； 3， 4-d′ ] 双噻唑 -2- 基 )- 酰胺 ]
    
    
    使用 (2S， 3S)-3- 吗啉 -4- 基甲基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺 ( 阶段 37.1) 替代中间 体 D， 利用如实施例 34 所述的方法合成标题化合物。LCMS ： tR ＝ 0.68min， M+H ＝ 505.3.0， M-H ＝ 503.2( 方 法 J)。1H-NMR(d6-DMSO， 600.13MHz) ： 10.65(s， b， 1H)， 7.4(s， b， 1H)， 7.05(s， b， 1H)， 4.3(s， b， 1H)， 3.7(m， 1H)， 3.6(m ， 4H) ， 3.3(m ， 1H) ， 3.1(t ， 2H) ， 2.9(t ， 2H) ， 2.6(m ， 1H) ， 2.4(m ， 1H) ， 2.35(m ， 4H) ， 2.15(m， 1H)， 2.0(m， 1H)， 1.75(m， 1H)， 1.35(s， 9H)。
     实施例 42 ： (2S， 3R)-3- 甲氧基甲基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 叔丁 基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
    在室温、 将三乙胺 (0.525mmol) 加至咪唑 -1- 甲酸 (8- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 噻唑 并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ( 中间体 A)(0.175mmol) 和 (2S， 3R)-3- 甲氧基甲基 - 吡 咯烷 -2- 甲酸酰胺 ( 阶段 42.1)(0.192mmol) 在 DMF(0.7ml) 中的溶液。搅拌 3h 后， 浓缩 反应混合物。将残余物通过硅胶柱层析法纯化， 提供为白色固体的标题化合物。HPLC ： tR ＝ 2.84min( 方 法 G) ； LCMS ： tR ＝ 1.71min， [M+H]+445( 方 法 I) ； TLC ： Rf ＝ 0.41(19 ∶ 1 1 CH2Cl2/MeOH) ； H-NMR(d6-DMSO， 600MHz) ： 11.15(br s， 1H)， 8.40(s， 1H)， 7.42(br s， 1H)， 7.05(br s， 1H)， 4.27(m， 1H)， 3.74(m， 1H)， 3.46(m， 1H)， 3.42(m， 1H)， 3.24(s， 3H)， 3.16(m， 1H)， 2.98(m， 2H)， 2.91(m， 2H)， 2.54(m， 1H)， 2.03(m， 1H)， 1.77(m， 1H)， 1.32(s， 9H)。
     阶段 42.1 ： (2S， 3R)-3- 甲氧基甲基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺
    
    类似于在阶段 37.1 中所述的程序制备标题化合物， 但使用 (2S， 3R)-3- 甲氧基甲 基 -1-((S)-1- 苯基 - 乙基 )- 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺 ( 阶段 42.2) 替代 (2S， 3S)-3- 吗啉 -4- 基 甲基 -1-((S)-1- 苯基 - 乙基 )- 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺。
     获得为白色固体的标题化合物。ESI-MS ： [M+H]+ 159。
     阶段 42.2 ： (2S， 3R)-3- 甲氧基甲基 -1-((S)-1- 苯基 - 乙基 )- 吡咯烷 -2- 甲酸酰 胺
    
    类似于阶段 37.2 中所述的程序制备标题化合物， 但使用 (2S， 3R)-3- 甲氧基甲 基 -1-((S)-1- 苯基 - 乙基 )- 吡咯烷 -2- 甲酸甲酯 ( 阶段 42.3) 替代 (2S， 3S)-3- 吗啉 -4- 基 甲基 -1-((S)-1- 苯基 - 乙基 )- 吡咯烷 -2- 甲酸甲酯。
     获 得 为黄 色油状物 的标题 化合物。HPLC ： tR ＝ 2.35min( 方法 G) ； LC-MS ： tR ＝ + 0.47min， [M+H] 263( 方法 K) ； TLC ： Rf ＝ 0.05(1 ∶ 1 庚烷 /EtOAc)。
     阶段 42.3 ： (2S， 3R)-3- 甲氧基甲基 -1-((S)-1- 苯基 - 乙基 )- 吡咯烷 -2- 甲酸甲 酯
    
    将 (3aR， 6aS)-1-((S)-1- 苯 基 - 乙 基 )- 六 氢 - 呋 喃 并 [3， 4-b] 吡 咯 -6- 酮 [805246-48-4](17.05mmol)、 KOH(71.60mmol) 和碘甲烷 (68.20mmol) 在甲苯 (79ml) 中的混 合物在 80℃搅拌 1.5h。将反应混合物冷却至室温， 在水与 MTBE 之间分配。将水层用 MTBE 萃取 (3X)。 将合并的有机层干燥 (Na2SO4)， 过滤， 浓缩。 将残余物通过硅胶柱层析法纯化， 提 供为黄色油状物的标题化合物。 HPLC ： tR ＝ 2.98min( 方法 G) ； LC-MS ： tR ＝ 0.69min， [M+H]+ 278( 方法 K) ； TLC ： Rf ＝ 0.25(1 ∶ 3 庚烷 /EtOAc)。
     实施例 43 ： (2S， 3S)-3- 二甲基氨基甲基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 叔 丁基 -4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ]
    
    在室温、 将三乙胺 (0.305mmol) 加至咪唑 -1- 甲酸 (8- 叔丁基 -4， 5- 二氢 - 噻 唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 )- 酰胺 ( 中间体 A)(0.102mmol) 和 (2S， 3S)-3- 二甲基氨基 甲 基 - 吡 咯 烷 -2- 甲 酸 酰 胺 ( 阶 段 43.1)(0.102mmol) 在 DMF(0.3ml) 中 的 溶 液。 搅 拌 0.5h 后， 浓缩反应混合物， 在真空下于 50℃过夜干燥。将残余物悬浮于 EtOAc(1ml) 中， 过 滤， 在真空下干燥， 提供为白色固体的标题化合物。HPLC ： tR ＝ 4.01min( 方法 H) ； LCMS ： + 1 tR ＝ 1.33min， [M+H] 458( 方 法 I) ； TLC ： Rf ＝ 0.08(4 ∶ 1CH2Cl2/MeOH) ； H-NMR(d6-DMSO， 600MHz) ： 11.14(br s， 1H)， 8.40(s， 1H)， 7.42(br s， 1H)， 7.06(br s， 1H)， 4.27(m， 1H)， 3.71(m， 1H)， 3.42(m， 1H)， 2.98(m， 2H)， 2.90(m， 2H)， 2.52(m， 1H)， 2.33(m， 1H)， 2.18(m， 1H)， 2.18(s， 6H)， 2.01(m， 1H)， 1.72(m， 1H)， 1.32(s， 9H)。
     阶段 43.1 ： (2S， 3S)-3- 二甲基氨基甲基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺
    
    类似于阶段 37.1 中所述的程序制备标题化合物， 但使用 (2S， 3S)-3- 二甲基氨基 甲基 -1-((S)-1- 苯基 - 乙基 )- 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺 ( 阶段 43.2) 替代 (2S， 3S)-3- 吗 啉 -4- 基甲基 -1-((S)-1- 苯基 - 乙基 )- 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺。并且， 在 4bar 压力下进行 氢化。
     获得为黄色油状物的标题化合物。ESI-MS ： [M+H]+ 172。
     阶段 43.2 ： (2S， 3S)-3- 二甲基氨基甲基 -1-((S)-1- 苯基 - 乙基 )- 吡咯烷 -2- 甲 酸酰胺
     将 (2S， 3S)-3- 氨基甲基 -1-((S)-1- 苯基 - 乙基 )- 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺 ( 阶 段 43.3)(0.418mmol)、 氰 基 硼 氢 化 钠 (2.86mmol) 和 37 ％ 甲 醛 水 溶 液 (2.14mmol) 在 MeOH(3.3ml) 中的混合物在 55℃搅拌 16h。将反应混合物冷却至室温， 浓缩。将残余物使 用 RediSep 硅胶柱纯化， 提供为白色泡沫状物的标题化合物。HPLC ： tR 3.59min( 方法 H) ；
    LC-MS ： tR ＝ 0.86min， [M+H]+ 276( 方法 I) ； TLC ： Rf ＝ 0.13(9 ∶ 1CH2Cl2/MeOH)。
     阶段 43.3 ： (2S， 3S)-3- 氨基甲基 -1-((S)-1- 苯基 - 乙基 )- 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺
    将 (2S， 3S)-3- 叠氮基甲基 -1-((S)-1- 苯基 - 乙基 )- 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺 ( 阶 段 36.3)(0.723mmol) 和三苯基膦 (0.867mmol) 在 THF(3ml) 中的混合物在室温搅拌 25h。 浓缩反应混合物， 提供为浅褐色固体的粗标题化合物。 HPLC ： tR 3.53min( 方法 H) ； ESI-MS ： + [M+H] 248。
     实 施 例 44 ： (2S， 3R)-3- 甲 基 - 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-{[8-(2， 2， 2- 三 氟 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )-4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 ]- 酰胺 }
    
    在室温、 将三乙胺 (1.714mmol) 加至咪唑 -1- 甲酸 [8-(2， 2， 2- 三氟 -1， 1- 二甲 基 - 乙基 )-4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 ]- 酰胺 ( 阶段 44.1)(0.490mmol) 和 (2S， 3R)-3- 甲基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺 ( 中间体 P)(0.979mmol) 在 DMF(1.5ml) 中的溶液。 搅拌 1.5h 后， 浓缩反应混合物。 将残余物用 NaHCO3 饱和溶液稀释， 用 EtOAc 萃取 (2X)。 将合 并的有机层连续用水和盐水洗涤， 干燥 (Na2SO4)， 过滤， 浓缩。将残余物使用 RediSep 硅胶 柱纯化， 提供为米色固体的标题化合物。 HPLC ： tR ＝ 5.77min( 方法 H) ； LCMS ： tR ＝ 2.18min， + 1 [M+H] 469( 方 法 I) ； TLC ： Rf ＝ 0.16(19 ∶ 1 CH2Cl2/MeOH) ； H-NMR(d6-DMSO， 600MHz) ： 11.19(br s， 1H)， 8.50(s， 1H)， 7.43(br s， 1H)， 7.01(br s， 1H)， 4.18(m， 1H)， 3.72(m， 1H)， 3.40(m， 1H)， 3.03(m， 2H)， 2.94(m， 2H)， 2.38(m， 1H)， 1.97(m， 1H)， 1.70(m， 1H)， 1.58(s， 6H)， 0.99(d， 3H)。
     阶段 44.1 ： 咪唑 -1- 甲酸 [8-(2， 2， 2- 三氟 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )-4， 5- 二氢 - 噻
     唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 ]- 酰胺
    类似于对于中间体 A 所述的程序制备标题化合物， 但在阶段 A.3 中使用 3， 3， 3- 三 氟 -2， 2- 二甲基 - 丙脒盐酸盐 ( 阶段 44.2) 替代叔丁基脒盐酸盐。
     获得为米色固体的标题化合物。 HPLC ： tR ＝ 6.73min( 方法 H) ； LCMS ： tR ＝ 1.11min， + [M+H] 373( 方法 J)。注意 ： 出于鉴定的目的， 将标题化合物溶解于 MeOH-- ＞氨基甲酸甲酯 衍生物。
     阶段 44.2 ： 3， 3， 3- 三氟 -2， 2- 二甲基 - 丙脒盐酸盐
    
    在室温、 将 3， 3， 3- 三氟 -2， 2- 二甲基 - 丙腈 ( 阶段 44.3)(12.40mmol) 加至甲醇钠 ( 由 48.40mmol 金属钠和 102ml MeOH 新鲜制备 ) 溶液。4h 后， 缓慢加入乙酸 (48.40mmol) 和 NH4Cl(14.88mmol)， 然后将反应混合物加热至 70 ℃达 40h。浓缩 (40 ℃， 100mbar) 反应 混合物后， 将残余物悬浮于丙酮中， 过滤， 在真空下干燥， 提供为白色固体的标题化合物。 + ESI-MS ： [M+H] 155。
     阶段 44.3 ： 3， 3， 3- 三氟 -2， 2- 二甲基 - 丙腈
    
    将 3， 3， 3- 三氟 -2， 2- 二甲基 - 丙酰胺 ( 阶段 44.4)(121.2mmol) 和五氧化二磷 (121.2mmol) 的混合物缓慢加热至 200℃， 收集所得的馏出液。获得为无色液体的标题化合 物。
     阶段 44.4 ： 3， 3， 3- 三氟 -2， 2- 二甲基 - 丙酰胺
    
    在 0 ℃、将 草 酰 氯 (140.8mmol) 滴 加 至 3， 3， 3- 三 氟 -2， 2- 二 甲 基 - 丙 酸 [889940-13-0](128mmol) 在 CH2Cl2(128ml) 中的溶液。 加入几滴 DMF 直至观察到气体放出，
     然后继续搅拌 30min。升温至室温并且搅拌过夜后， 浓缩反应混合物 (40℃， 00mbar)。将残 余物溶解于 THF(128ml) 中， 冷却至 0℃， 然后缓慢用浓氨水溶液 (64ml) 处理。在 0℃搅拌 30min 后， 然后在室温搅拌 4h， 将反应混合物浓缩至其一半体积， 得到粘稠的白色悬液。过 + 滤和干燥后， 获得为白色固体的标题化合物。ESI-MS ： [M+H] 156。
     实施例 45 ： (2S， 3R)-3- 甲氧基甲基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-{[8-(2， 2， 2- 三氟 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )-4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 ]- 酰胺 }
    在室温、 将三乙胺 (1.714mmol) 加至咪唑 -1- 甲酸 [8-(2， 2， 2- 三氟 -1， 1- 二甲 基 - 乙基 )-4， 5- 二氢 - 噻唑并 [4， 5-h] 喹唑啉 -2- 基 ]- 酰胺 ( 阶段 44.1)(0.490mmol) 和 (2S， 3R)-3- 甲氧基甲基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺 ( 阶段 42.1)(0.0.979mmol) 在 DMF(1.5ml) 中的溶液。搅拌 2h 后， 浓缩反应混合物。将残余物用 NaHCO3 饱和溶液稀释， 用 EtOAc 萃
    取 (2X)。将合并的有机层连续用水和盐水洗涤， 干燥 (Na2SO4)， 过滤， 浓缩。将残余物使用 RediSep 硅胶柱纯化， 提供为米色固体的标题化合物。 HPLC ： tR ＝ 5.71min( 方法 H) ； LCMS ： + 1 tR ＝ 2.15min， [M+H] 499( 方法 I) ； TLC ： Rf ＝ 0.40(19 ∶ 1CH2Cl2/MeOH) ； H-NMR(d6-DMSO， 600MHz) ： 11.23(br s， 1H)， 8.50(s， 1H)， 7.42(br s， 1H)， 7.06(br s， 1H)， 4.27(m， 1H)， 3.74(m， 1H)， 3.46(m， 1H)， 3.42(m， 1H)， 3.24(s， 3H)， 3.16(m， 1H)， 3.03(m， 2H)， 2.94(m， 2H)， 2.55(m， 1H)， 2.03(m， 1H)， 1.77(m， 1H)， 1.58(s， 6H)。
     实 施 例 46 ： (2S， 3R)-3- 甲 基 - 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-[(8- 叔 丁 基 -4H-5- 氧杂 -1- 硫杂 -3， 7- 二氮杂 - 环戊二烯并 [a] 萘 -2- 基 )- 酰胺 ]
    LCMS ： tR ＝ 0.50min， M+H ＝ 416， M-H ＝ 414( 方法 L)。1H-NMR(d6-DMSO， 400MHz) ： 8.05(s， 1H)， 7.37(bs， 1H)， 7.09(s， 1H)， 6.97(bs， 1H)， 5.31(s， 2H)， 4.18(m， 1H)， 3.69(dd， 1H)， 3.39(m， 1H)， 2.35(m， 1H)， 1.95(m， 1H)， 1.71(m， 1H)， 1.27(s， 9H)， 0.975(d， 3H)。
     利用在制备实施例 40 中所述的合成方法， 从 2- 叔丁基 -5- 甲氧基甲氧基 - 吡啶 制备标题化合物。如下所述由 2- 溴 -5- 甲氧基甲氧基 - 吡啶制备原料 2- 叔丁基 -5- 甲氧 基甲氧基 - 吡啶 ：
     2- 叔丁基 -5- 甲氧基甲氧基 - 吡啶 ：
    
    将在 15ml 干燥 THF 中的 6.69g(74.7mmol) 氰化铜 (I) 冷却至 -75 ℃， 其中滴加 149mL(149mmol)1M 叔丁基氯化镁溶液。继续搅拌 40min。之后， 滴加溶解于 30ml 干燥 THF 中的 4.07g(18.67mmol)2- 溴 -5- 甲氧基甲氧基 - 吡啶 (Zhong， W. 等人， WO2008147547)。 将反应混合物在 -75℃搅拌 1h， 然后升温至室温， 再继续搅拌 6h。然后将 30ml 25％氨水 溶液加至反应混合物。过滤混合物， 用 CH2Cl2 萃取两次。将合并的有机层用水洗涤， 干燥 (MgSO4)， 过滤， 真空浓缩。将残余物通过硅胶层析法 (EtOAc， 庚烷 ) 纯化， 得到 2.64g 为油 状物的纯标题化合物。LCMS ： tR ＝ 0.55min， M+H ＝ 196( 方法 K)。
     实施例 47 ： (2S， 3S)-3- 二甲基氨基甲基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(8- 叔 丁基 -4H-5- 氧杂 -1- 硫杂 -3， 7- 二氮杂 - 环戊二烯并 [a] 萘 -2- 基 )- 酰胺 ]
    利用对于制备实施例 46 所述的合成方法， 并且在合成的最后一步中使用 (2S， 3S)-3- 二甲基氨基甲基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺 ( 阶段 43.1) 替代 (2S， 3R)-3- 甲基 - 吡咯 烷 -2- 甲酸酰胺， 制备标题化合物。LC-MS ： tR ＝ 0.24min， M-H ＝ 457( 方法 L)。1H-NMR(d6-DMSO， 400MHz) ： 11.15(bs， 1H)， 8.03(s， 1H)， 7.35(s， 1H)， 7.07(s， 1H)， 7.0(s， 1H)， 5.28(s， 2H)， 4.23(m， 1H)， 3.65(m， 1H) ， 3.40(m ， 1H) ， 2.6-2.45(m ， 2H) ， 2.30(m ， 1H) ， 2.17(s ， 6H) ， 2.15(m ， 1H)1.70(m ， 1H) ， 1.27(s， 9H)。
     实 施 例 48 ： (2S， 3R)-3- 甲 基 - 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-{[8-(2， 2， 2- 三 氟 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )-4H-5- 氧杂 -1- 硫杂 -3， 7- 二氮杂 - 环戊二烯并 [a] 萘 -2- 基 ]- 酰 胺}
    
    LC-MS ： tR ＝ 1.59min， M+H ＝ 470( 方法 F)。1H-NMR(d6-DMSO， 400MHz) ： 11.25(bs， 1H)， 8.15(s， 1H)， 7.42(s， 1H)， 7.34(s， 1H)， 7.00(s， 1H)， 5.40(s， 2H)， 4.19(s， 1H)， 3.71(m， 1H)， ca.3.4(m， 1H)， 2.5-2.35(m， 1H)， 1.99(m， 1H)， 1.68(m， 1H)， 1.56(s， 6H)， 0.99(d， 3H)。
     利用在制备实施例 40 和 42 中所述的合成方法， 由 4- 溴 -5- 甲氧基甲氧基 -2-(2， 2， 2- 三氟 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )- 吡啶制备标题化合物。
     如下制备 4- 溴 -5- 甲氧基甲氧基 -2-(2， 2， 2- 三氟 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )- 吡啶 ：
    
    
    a)4- 溴 -5- 甲氧基甲氧基 -2-(2， 2， 2- 三氟 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )- 吡啶 ：利用在制备实施例 40 阶段 40.5 中所述的合成方法， 获得为油状物的标题化合物。 79 81 LCMS( 方法 L) ： tR ＝ 1.26min， M+H ＝ 328( Br)， 330( Br).
     b)5- 甲氧基甲氧基 -2-(2， 2， 2- 三氟 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )- 吡啶
    
    将 1.7g(4.13mmol) 甲磺酸 2， 2， 2- 三氟 -1-(5- 甲氧基甲氧基 - 吡啶 -2- 基 )-1- 甲 基 - 乙 酯 溶 解 于 20ml 二 氯 甲 烷 中。 将 反 应 混 合 物 冷 却 至 0 ℃， 其中缓慢加入 2.065mL(4.13mmol) 三甲基铝。将反应混合物在室温搅拌 20h。之后， 缓慢加入水， 将混合 物用 EtOAc 萃取 2 次。将合并的有机层用水和盐水洗涤， 干燥 (MgSO4)， 过滤， 真空浓缩。将 残余物通过硅胶层析法 (EtOAc， 庚烷 ) 纯化， 得到 0.55g 纯标题化合物。LCMS( 方法 L) ： tR ＝ 1.09min， M+H ＝ 250。
     c) 甲磺酸 2， 2， 2- 三氟 -1-(5- 甲氧基甲氧基 - 吡啶 -2- 基 )-1- 甲基 - 乙酯
    
    在 0 ℃、 向 搅 拌 的 0.213g(8.44mmol) 氢 化 钠 在 6ml 干 燥 THF 中 的 混 合 物 滴 加 1.06g(4.22mmol)1， 1， 1- 三氟 -2-(5- 甲氧基甲氧基 - 吡啶 -2- 基 )- 丙 -2- 醇 ( 溶解于 4.9ml 干燥 THF 中 )。添加结束后， 在室温继续搅拌 3h。在室温加入甲烷磺酰氯 ( 溶解于 7.3ml 干燥 THF 中 )， 再继续搅拌 2h。然后加入水和 NaHCO3 饱和溶液。将混合物用 EtOAc 萃取 2 次。将合并的有机层用水和盐水洗涤， 干燥 (MgSO4)， 过滤， 真空浓缩， 提供 1.7g 标题 化合物， 其直接用于下一步骤。LCMS( 方法 L) ： tR ＝ 0.96min， M+H ＝ 330。
     d)1， 1， 1- 三氟 -2-(5- 甲氧基甲氧基 - 吡啶 -2- 基 )- 丙 -2- 醇
    
    将 1.48g(4.58mmol)5- 甲氧基甲氧基 -2-(2， 2， 2- 三氟 -1- 甲基 -1- 三甲基甲硅烷 基氧基 - 乙基 )- 吡啶和 5ml(10mmol) 2N HCl 在 15ml THF 中的混合物在室温搅拌 2h。之 后， 将反应混合物倒入水中， 通过添加 2N HCl 将 pH 调节至 1-2。 将反应混合物用 EtOAc 萃取 2 次。 将合并的有机层用水和盐水洗涤， 干燥 (MgSO4)， 过滤， 真空浓缩， 提供 1.06g 为油状物 的标题化合物 (88％纯度 )， 其不需纯化即可用于下一步骤。LCMS( 方法 L) ： tR ＝ 0.88min， M+H ＝ 252。
     e)5- 甲 氧 基 甲 氧 基 -2-(2， 2， 2- 三 氟 -1- 甲 基 -1- 三 甲 基 甲 硅 烷 基 氧 基 - 乙 基 )- 吡啶
    
    将 1.12g(6.18mmol)1-(5- 甲氧基甲氧基 - 吡啶 -2- 基 )- 乙酮、 1.055g(7.42mmol) 三甲基 ( 三氟甲基 ) 甲硅烷和 0.025g(0.309mmol) 乙酸钠在 9mlDMF 中的混合物在 0℃搅拌 1h， 在室温搅拌 1h。之后， 将反应混合物倒入水中， 通过添加 2N HCl 将 pH 调节至 1-2。将 反应混合物用 EtOAc 萃取 2 次。将合并的有机层用水和盐水洗涤， 干燥 (MgSO4)， 过滤， 真空 浓缩。将残余物通过硅胶层析法 (EtOAc， 庚烷 ) 纯化， 得到 1.87g 为油状物的纯标题化合 物。LCMS( 方法 L) ： tR ＝ 1.38min， M+H ＝ 324。
    
    
    f)1-(5- 甲氧基甲氧基 - 吡啶 -2- 基 )- 乙酮 ：在 0℃、 将 NaH 加至 1g(7.29mmol)1-(5- 羟基 - 吡啶 -2- 基 )- 乙酮 (Anichem) 在 15ml DMF 中的溶液。将该混合物搅拌 1h 后， 在 0℃加入 0.78mL(8.75mmol)MOMCl。然后在 室温将反应混合物搅拌 2h。将反应混合物倒入水中， 用 EtOAc 萃取 2 次。将合并的有机层
     用水和盐水洗涤， 干燥 (MgSO4)， 过滤， 真空浓缩。将残余物通过硅胶层析法 (EtOAc， 庚烷 ) 纯化， 得到 1.12g 为油状物的纯标题化合物。LCMS( 方法 L) ： tR ＝ 0.66min， M+H ＝ 182。
     实 施 例 49 ： (2S， 3R)-3- 甲 基 - 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-{[7-(2， 2， 2- 三 氟 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )-4， 5- 二氢 - 苯并 [1， 2-d ； 3， 4-d′ ] 双噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
    LCMS ： tR ＝ 0.97min， M+H ＝ 474， M-H ＝ 414( 方法 L)。1H-NMR(d6-DMSO， 400MHz) ： 10.7(bs， 1H)， 7.37(s， 1H)， 6.97(s， 1H)， 4.18(m， 1H)， 3.69(dd， 1H)， 3.39(m， 1H)， 3.14(t， 2H)， 2.95(t， 2H)， 2.34(m， 1H)， 1.94(m， 1H)， 1.68(m， 1H)， 1.62(s， 6H)， 0.965(d， 3H)。
     利用在制备实施例 39 中所述的合成方法， 由 2， 2- 二甲基 - 硫代丙酰胺制备标题 化合物。如下所述制备原料 3， 3， 3- 三氟 -2， 2- 二甲基 - 硫代丙酰胺 ：
     3， 3， 3- 三氟 -2， 2- 二甲基 - 硫代丙酰胺的制备 ：
    
    
    a)3， 3， 3- 三氟 -2， 2- 二甲基 - 丙酰胺将 2g(12.81mmol)3， 3， 3- 三氟 -2， 2- 二甲基丙酸 (Aldrich)、 2.077g(12.81mmol) 羰基 - 二咪唑和 5.55mL(64.1mmol) 氨水溶液在 50ml CH2Cl2 中的混合物在室温搅拌 20h。 之后， 加入乙醚， 将所得混合物用 0.1N HCL、 0.1N NaOH、 水和盐水洗涤。将有机层干燥 (MgSO4)， 过滤， 真空浓缩， 提供 1.15g 为白色晶体的标题化合物， 其不需进一步纯化即可用 于下一步骤。MS ： M+H ＝ 156。
     b)3， 3， 3- 三氟 -2， 2- 二甲基 - 硫代丙酰胺
    
    将 1.05g(6.77mmol)3， 3， 3- 三 氟 -2， 2- 二 甲 基 - 丙 酰 胺 和 1.48g(3.66mmol) Lawesson 试剂在 32ml 干燥 THF 中的混合物在回流温度搅拌 20h。之后， 将反应混合物冷却 至室温， 真空浓缩。将残余物通过硅胶层析法 ( 庚烷， EtOAc) 纯化， 提供 0.81g 为纯白色晶 体的标题化合物。MS ： M+H ＝ 172。
     在合成的最后一步中使用 (2S， 3R)-3- 甲氧基甲基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺 ( 阶段 42.1)， 以相同的方法制备以下实施例 ：
     实施例 50 ： (2S， 3R)-3- 甲氧基甲基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-{[7-(2， 2， 2- 三氟 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )-4， 5- 二氢 - 苯并 [1， 2-d ； 3， 4-d′ ] 双噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
    
    LC-MS ： tR ＝ 0.96min， M+H ＝ 504， M-H ＝ 502( 方法 L)。1H-NMR(d6-DMSO， 400MHz) ： 10.76(bs， 1H)， 7.34(bs， 1H)， 7.02(bs， 1H)， 4.29(m， 1H)， 3.45(m， 1H)， 3.42(m， 2H)， 3.22(s， 3H)， 3.14(m， 3H)， 2.97(m， 2H)， 2.48(m， 1H)， 1.97(m， 1H)， 1.75(m， 1H)， 1.62(s， 6H)。
     实施例 51 ： (2S， 3S)-3- 二甲基氨基甲基 - 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(7- 叔 丁基 -4， 5- 二氢 - 苯并 [1， 2-d ； 3， 4-d′ ] 双噻唑 -2- 基 )- 酰胺 ]
    
    利 用 对 于 制 备 实 施 例 39 所 述 的 合 成 方 法， 在 合 成 的 最 后 一 步 中 使 用 (2S， 3S)-3- 二甲基氨基甲基 - 吡咯烷 -2- 甲酸酰胺 ( 阶段 43.1) 替代 (2S， 3R)-3- 甲基 - 吡咯 烷 -2- 甲酸酰胺， 制备标题化合物。
     LC-MS ： tR ＝ 0.91min， M+H ＝ 463， M-H ＝ 461( 方法 L)。1H-NMR(d6-DMSO， 400MHz) ： 10.7(bs， 1H)， 7.36(s， 1H)， 7.01(bs， 1H)， 4.28(m， 1H)， 3.67(dd， 1H)， 3.39(m， 1H)， 3.07(m， 2H)， 2.92(m， 2H)， 2.5-2.44(m， 2H)， 2.30(m， 1H)， 2.14(s， 6H)， 1.95(m， 1H)， 1.40(m， 1H)， 1.36(s， 9H)。
     作为 PI3 激酶抑制剂的效力
     PI3K 激酶 Glo 测定 ： 将 50nL 化合物稀释液分配至黑 384- 孔小体积非结合苯乙烯 (NBS) 板 (Costar 目录号为 NBS#3676)。将以 10mg/ml 甲醇溶液形式提供的 L-a- 磷脂酰肌 醇 (PI) 转移至玻璃管中， 并在氮束中干燥。随后通过涡旋将其再悬浮于 3％辛基糖苷 (OG) 中并储存于 4℃。激酶 Glo 发光激酶测定 (Promega， Madison/WI， USA) 是通过定量激酶反 应后溶液中剩余 ATP 的量来测量激酶活性的均一 HTS 方法。
     添加 5μL PI/OG 与 PI3K 亚型的混合物 ( 表 1)。 通过添加含有 10mM TRIS-HCl pH 7.5、 3mM MgCl2、 50mM NaCl、 0.05％ CHAPS、 1mM DTT 和 1μm ATP 的 5μl ATP- 混合物 ( 最 终体积为 10μL) 开始激酶反应， 且在室温发生。使用 10μl 激酶 Glo 终止反应， 并在 10 分 钟后在 Synergy2 读数仪中使用每孔 0.1 秒的积分时间读板。将 2.5μM 泛 1 类 PI3 激酶抑 制剂 ( 标准物 ) 加至测定板中以产生对激酶反应的 100％抑制， 且使用溶剂媒介物 ( 水中的 90％ DMSO) 得到 0％抑制。使用标准物作为参考化合物， 且以 16 个稀释点形式一式两份地 包括于所有分析板中。
     表 1 藉由激酶 Glo 测定 PI3K ： 测定条件和试剂方案
    
    PI3K 的克隆
     PI3Kα、 PI3Kβ 和 PI3Kδ 构建体是 p85αiSH2 结构域与各自 p110 同种型的融 合物。p85α 片段和 p110 同种型基因是通过 PCR 从第一链 cDNA 制备， 该第一链 cDNA 是如 下文所述通过 RT-PCR 从来自胎盘、 睾丸和脑的市售 RNA 产生。PI3Kγ 构建体购自 Roger Williams 实验室， MRC Laboratory of Molecular Biology， Cambridge， UK(2003 年 11 月 )， 且已有描述 (Pacold， Michael E. ； Suire， Sabine ； Perisic， Olga ； Lara-Gonzalez， Samuel ； Davis， Colin T. ； Walker， Edward H. ； Hawkins， Phillip T. ； Stephens， Len ； Eccleston， John F. ； Williams， Roger L.Crystal structure and functional analysis of Ras
    binding to its effector phosphoinositide 3-kinase gamma( 结合其效应子磷酸肌醇 3- 激酶 γ 的 Ras 的晶体结构和功能分析 ).Cell(2000)， 103(6)， 931-943)。
     PI3Kα 构建体和蛋白
     PI3Kαwt
     BV1075 p85iSH2(461-568)-GGGGGGGGGGGG-p110α(21-1068)-HisBV1075 ： 杆状病毒 BV-1075 的构建体是通过包含克隆至载体 pBlueBac4.5 中的 p110α 片段和 p85 片段的三部分片段连接来制备。p85 片段衍生自使用 Nhe/Spe 消化的 质粒 p1661-2。通过测序来验证衍生自克隆的 p110α 片段， 且其在 LR410 中用作 SpeI/ HindIII 片段。为了产生杆状病毒表达载体 LR410， 利用 Gateway LR 反应将插入物转移 至 Gateway 修 饰 的 pBlueBac4.5(Invitrogen) 载 体 中。 用 Nhe/HindIII 消 化 克 隆 载 体 pBlueBac4.5(Invitrogen)。这产生构建体 PED 153.8。p85 组件 (iSH2) 是通过 PCR、 使用 ORF 318( 上文所述 ) 作为模板且使用一种正向引物 KAC1028(5’ -GCTAGCATGCGAGAATATGAT AGAT-TATATGAAG-AATATACC)(SEQ ID No.1) 和两种反向引物 KAC1029(5’ -GCCTCCACCAC-CT CCGCCTG-GTTTAATGCTGTTCATACGTTTGTC)(SEQ ID No.2) 和 KAC1039(5’ -TACTAGTC-CGCCTCC AC-CACCTCCGCCTCCACCACCTCCGCC)(SEQ ID No.3) 来产生。该两种反向引物重叠， 并将 12x Gly 接头和 p110α 基因的 N- 末端序列引入 SpeI 位点。该 12x Gly 接头替换 BV1052 构建 体中的单一 Gly 接头。将 PCR 片段克隆至 pCR2.1TOPO(Invitrogen) 中。所得克隆中， 通过 测序测定 p1661-2 是正确的。用 Nhe 和 SpeI 消化该质粒， 将所得片段进行凝胶分离及纯化 以用于亚克隆。
     p110α 克隆片段是通过使用 Spe I 和 HindIII 对克隆 LR410 进行酶促消化 ( 见上文 ) 来制备。SpeI 位点位于 p110α 基因的编码区中。对所得片段进行凝胶分离及纯化以 用于亚克隆。克隆载体 pBlueBac4.5(Invitrogen) 是通过使用 Nhe 和 HindIII 进行酶促消 化来制备。 使用 Qiagen 柱来纯化切割载体， 然后使用牛小肠碱性磷酸酶 (CIP)(BioLabs) 去 磷酸化。CIP 反应结束后， 再次对切割载体进行柱纯化以产生最终载体。使用 Roche Rapid 连接酶和供应商说明书来实施三部分连接。通过测序来验证最终的质粒。
     激酶结构域。
     BV1075 的蛋白序列 ：
    
    PI3Kβ 构建体和蛋白BV949 p85iSH2(461-N58K-568)-GGGGGG-p110β(2-1070)-HisPI3Kβ
    BV949 ： 产生 p85 PI3Kα、 PI3Kβ 和 PI3Kδ 亚单元的中间 SH2 结构域 (iSH2) 和全 长 p110β 亚单元的 PCR 产物， 并通过重叠 PCR 融合。 iSH2PCR 产物获自第一链 cDNA， 该第一 链是通过 RT-PCR 从来自胎盘、 睾丸和脑的市售人 RNA(Clontech) 制备， 最初使用引物 gwG13 0-p01(5’ -CGAGAATATGATAGATTATATGAAGAAT-3’ )(SEQ ID No.5) 和 gwG130-p02(5’ -TGGTTT-A ATGCTGTTCATACGTTTGTCAAT-3’ )(SEQ ID No.6)。 随后， 在二级 PCR 反应中， 使用引物 gwG130 -p03(5’ -GGGACAAGTT-TGTACAAAAAAGCAGGCTACGAAGGAGATATACATATGCGAGAATATGATAGATTATAT GAAGAAT-3’ )(SEQ ID No.7) 和 gwG130-p05(5’ -ACTGAAGCATCCTCCTC-CTCCTCCT-CCTGGTTTAATGCTGTTCATACGTTTGTC-3’ )(SEQ ID No.8) 分别在 p85iSH2 片段的 5’ 端和 3’ 端添加 Gateway 重组 AttB1 位点和接头序列。p110β 片段通过 PCR、 使用 p110β 克隆 ( 来自经序列验证的 未知来源 ) 作为模板并且使用含有接头序列和 p110β5’ 端的引物 gwG130-p04(5’ -ATTAAAC CAGGAGGAGGAGGAGGAGGATGCTT-CAGTTTCATAATGCCTCCTGCT-3’ )(SEQ ID No.9) 和含有融合至 组氨酸标签的 p110-β3’ 端序列的引物 gwG130-p06(5’ -AGCTCCGTGATGGTGATGGTGATGTGCTC CAGATC-TGTAGTCTTTCCGAA-CTGTGTG-3’ )(SEQ ID No.10) 来获得。p85-iSH2/p110β 融合蛋 白是通过重叠 PCR 来组装， 其为 iSH2 片段的 3’ 端及 p110β 片段的 5’ 端处接头的反应， 其 使用上文提到的 gwG130-p03 引物及含有重叠组氨酸标签和 AttB2 重组序列的引物 (5’ -GG GACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTAAGCTCCGTGATGGTGATGGTGATGTGCTCC-3’ )(SEQ ID No.11)。 以 Gateway(Invitrogen)OR 反应将该最终产物重组至供体载体 pDONR201(Invitrogen) 以 产生 ORF253 入门克隆。通过测序来验证该克隆并用于 Gateway LR 反应 (Invitrogen) 中 以将插入物转移至 Gateway 修饰的 pBlueBac4.5(Invitrogen) 载体中， 以产生杆状病毒表 达载体 LR280。该 LR280 在 p85 序列中具有氨基酸突变。
     激酶结构域 .
     BV949 的蛋白序列 ：
    
    激酶结构域 . PI3Kγ 构建体和蛋白p110γ(Δ143-[Met144-1102])-His构建体获自 Roger Williams 实验室， MRC Laboratory of Molecular Biology， Cambridge， UK(2003 年 11 月 )。对构建体的描述见 (Pacold， Michael E. ； Suire， Sabine ； Perisic， Olga ； Lara-Gonzalez， Samuel ； Davis， Colin T. ； Walker， Edward H. ； Hawkins， Phillip T. ； Stephens， Len ； Eccleston， John F. ； Williams， Roger L.Crystal structure and functional analysis of Ras binding to its effector phosphoinositide 3-kinase gamma( 结 合 其 效 应 子 磷 酸 肌 醇 3- 激 酶 γ 的 Ras 的 晶 体 结 构 和 功 能 分 析 ).Cell(2000)， 103(6)， 931-943)。构建体缺少 N- 末端 144aa。
     BV950 的蛋白序列 ：
    
    PI3Kδ 构建体和蛋白PI3Kδ BV1060 p85iSH2(461-568)-GGGGGG-p110δ(2-1044)-HisBV1060 ： 产生 p85 亚单元的中间 SH2 结构域 (iSH2) 和 p110δ 亚单元的全长 PCR 产 物， 并通过重叠 PCR 融合。 该 iSH2PCR 产物是通过使用 ORF318( 见上文 ) 作为模板及使用引 物 gwG130-p03(5’ -GGGACAAG-TTTGTACAAAAAAGCAGGCTACGAAGGAGATATACATATGC-GAGAATATGA TAGATTATATGAAGAAT-3’ )(SEQ ID No.7) 和 gwG154-p04(5’ -TCCTCCTCCT-CCTCCTCCTGGTTTAAT GCTGTTCATACGTTTGTC-3’ )(SEQ ID No.14) 来产生。 该 p110δ 片段获自第一链 cDNA， 该第一 链是通过 RT-PCR 从来自胎盘、 睾丸和脑的市售人 RNA(Clontech) 产生， 最初使用引物 gwG15 4-p01(5’ -ATGCCCCCTGGGGTGGACTGCCCCAT-3’ )(SEQ ID No.15) 和 gwG154-p02(5’ -CTACTGCC
     TGT-TGTCTTTGGACACGT-3’ )(SEQ ID No.16)。 在随后 PCR 反应中， 使用引物 gw154-p03(5’ -A TTAAACCAGGAGGAGGAGGAGGAGGACCCCCTGGGGTGGAC-TGCCCCATGGA-3’ )(SEQ ID No.17) 和 gwG15 4-p06(5’ -AGCTCCGTGATGGTGATGGTGAT-GTGCT-CCCTGCCTGTTGTCTTTGGACACGTTGT-3’ )(SEQ ID No.18) 分别在 p110δ 片段的 5’ 端和 3’ 端添加接头序列和组氨酸标签。p85-iSH2/p110δ 融合蛋白是在第三 PCR 反应中、 通过位于 iSH2 片段的 3’ 端和 p110δ 片段的 5’ 端的重叠 接头、 使用上文提到的 gwG130-p03 引物和含有重叠组氨酸标签和 Gateway(Invitrogen) AttB2 重组序列的引物 (5’ -GGG-ACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTAA-GCTCCGTGATGGTGATGGT GAGTGCTCC-3’ )(SEQ ID No.19) 来组装。 以 Gateway OR 反应将该最终产物重组至供体载体 pDONR201(Invitrogen) 以产生 ORF319 入口克隆。通过测序来验证该克隆并用于 Gateway LR 反应 (Invitrogen) 中以将插入物转移至 Gateway 修饰的 pBlueBac4.5(Invitrogen) 载 体中， 以产生杆状病毒表达载体 LR415。
     BV1060 的蛋白质序列 ：
    PI3Kα、 PI3Kβ 和 PI3Kγ 构建体的纯化
     PI3Kα、 PI3Kβ 和 PI3Kγ 在 两 个 层 析 步 骤 中 纯 化 ： Ni 琼 脂 糖 树 脂 (GE Healthcare) 上 的 固 定 金 属 亲 和 层 析 (IMAC) 及 使 用 Superdex 200 26/60 柱 (GE Healthcare) 的凝胶过滤。将所有缓冲液均冷冻至 4℃， 且在冰上冷冻下进行裂解。在室 温进行柱分级分离。用于纯化 PI3Kβ 的所有缓冲液除含有下文所述之外还含有 0.05 ％ Triton X100。
     通常， 将来自 10L Tn5 细胞培养液的冷冻细胞以 1 ∶ 6v/v 沉淀物对裂解缓冲液
     的比率再悬浮于 “裂解缓冲液” 20mM Tris-Cl pH 7.5、 500mM NaCl、 5％甘油、 5mM 咪唑、 1mM NaF、 0.1ug/mL 软海绵酸 (okadaic acid)(OAA)、 5mM BME、 1x 完全蛋白酶抑制剂合剂 - 不 含 EDTA(20 片剂 /1L 缓冲液， Roche Applied Sciences)、 核酸酶 (Benzonase)(25U/mL 缓 冲液， EMD Biosciences)， 并通过使用装配紧密的研棒匀化 20 次来机械裂解。将裂解液在 45,000g 下离心 30 分钟， 将上清液装载到预平衡的 IMAC 柱 (3ml 树脂 /100ml 裂解液 )。使 用 3-5 柱体积的裂解缓冲液洗涤柱， 随后使用 3-5 柱体积的 20mM Tris-Cl pH 7.5、 500mM NaCl、 5％甘油、 45mM 咪唑、 1mM NaF、 0.1μg/mL OAA、 5mM BME、 1x 完全蛋白酶抑制剂合剂 - 不 含 EDTA 进行第二次洗涤。 使用 20mM Tris-Cl pH 7.5、 0.5M NaCl、 5％甘油、 250mM 咪唑、 1mM NaF、 0.1μg/mL OAA、 5mM BME、 1x 完全蛋白酶抑制剂合剂 - 不含 EDTA 来洗脱蛋白质。通过 SDS-PAGE 来分析相关馏分， 相应地汇集。 通过在 Superdex 200 26/60 柱上凝胶过滤对蛋白 质进行进一步纯化， 该柱在 20mM Tris-Cl pH 7.5、 0.5M NaCl、 5％甘油、 1mM NaF、 5mM DTT、 1x 完全蛋白酶抑制剂合剂 - 不含 EDTA 中平衡。通过 SDS-PAGE 来分析相关馏分， 相应地汇 集。将等体积的透析缓冲液 (20mM Tris-Cl pH 7.5、 500mM NaCl、 50％甘油、 5mM NaF、 5mM DTT) 加至汇集物， 随后在透析缓冲液中透析来进行两次交换 ( 一次交换持续过夜 )。将蛋 白质储存于 -20℃。
     PI3Kδ 的纯化
     PI3Kδ 在三个层析步骤中纯化 ： Ni 琼脂糖树脂 (GE Healthcare) 上的固定金属亲 和层析， 使用 Superdex 200 26/60 柱 (GE Healthcare) 的凝胶过滤及最后的在 Q-HP 柱 (GE Healthcare) 上的离子交换步骤。所有缓冲液均冷冻至 4℃， 且在冰上冷冻下进行裂解。在 室温进行柱分级分离。
     通常， 将来自 10L Tn5 细胞培养液的冷冻细胞以 1 ∶ 10v/v 沉淀物对裂解缓冲液 的比率再悬浮于 “裂解缓冲液” 20mM Tris-Cl pH 7.5、 500mM NaCl、 5％甘油、 5mM 咪唑、 1mM NaF、 0.1μg/mL 软海绵酸 (OAA)、 5mM BME、 1x 完全蛋白酶抑制剂合剂 - 不含 EDTA(20 片剂 /1L 缓冲液， Roche Applied Sciences)、 核酸酶 (25U/mL 缓冲液， EMD Biosciences)， 并通 过使用装配紧密的研棒匀化 20 次来机械裂解。将裂解液在 45,000g 下离心 30 分钟， 将上 清液装载到预平衡的 IMAC 柱 (5ml 树脂 /100ml 裂解液 )。使用 3-5 柱体积的裂解缓冲液洗 涤柱， 随后使用 3-5 柱体积的 20mM Tris-Cl pH 7.5、 500mM NaCl、 5％甘油、 40mM 咪唑、 1mM NaF、 0.1μg/mL OAA、 5mM BME、 1x 完全蛋白酶抑制剂合剂 - 不含 EDTA 进行第二次洗涤。使 用 20mM Tris-Cl pH 7.5、 500mM NaCl、 5％甘油、 250mM 咪唑、 1mM NaF、 0.1μg/mL OAA、 5mM BME、 1x 完全蛋白酶抑制剂合剂 - 不含 EDTA 来洗脱蛋白质。通过 SDS-PAGE 分析相关馏分， 相应地汇集。通过在 Superdex 200 上凝胶过滤对蛋白质进一步纯化， 该 Superdex 200 在 20mM Tris-Cl pH 7.5、 500mM NaCl、 5％甘油、 1mM NaF、 0.1μg/mL OAA、 5mM DTT、 1x 完全蛋 白酶抑制剂合剂 - 不含 EDTA 中平衡。 通过 SDS-PAGE 分析相关馏分， 相应地汇集。 这些馏分 以 1 ∶ 10v/v 汇集体积对缓冲液的比率、 使用 “缓冲液 A” 20mM Tris-Cl pH 8.2、 5％甘油、 1mM NaF、 0.1μg/mL OAA、 5mM DTT 稀释， 并装载到制备好的 Q-HP 柱。 在试样装载完成后， 使 用缓冲液 A 和 5％“缓冲液 B” 20mM Tris-Cl pH 8.2、 1M NaCl、 5％甘油、 1mM NaF、 0.1μg/ mL OAA、 5mM DTT 洗涤 3-5 柱体积。使用 5％ -30％梯度的缓冲液 B 洗脱蛋白质。通常蛋白 质在～ 200mM NaCl 下洗脱。通过 SDS-PAGE 分析相关馏分， 相应地汇集。将等体积的透析 缓冲液 (20mM Tris-Cl pH 7.5、 500mM NaCl、 50％甘油、 1mM NaF、 0.1μg/mL OAA、 5mM DTT)加至汇集物， 随后在透析缓冲液中透析进行两次交换 ( 一次交换持续过夜 )。 将蛋白质储存 于 -20℃。
     使用上述测定法获得以下结果 ：
    
    n.d. ＝未测定。87CN 102471351 A
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     88CN 102471351 A序列表2/32 页
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