技术领域
本发明涉及生物医用材料领域，更具体地说，涉及一种具有止血和防粘连 作用的表面富集钙离子的胶原海绵及其制备方法。
背景技术
手术中出血是外科治疗中的常见症候。失血会使血管中液体减少而引起低 血压，会导致机体组织氧供应量减少而损伤机体，大量失血甚至会引起失血性 休克等严重后果，直接危及人的生命安全。因此，手术中必须在第一时间对出 血部位进行止血操作。
术后粘连也是目前临床亟待解决的重要问题之一。有报道称，50％～100％ 的腹腔和盆腔手术可导致不同程度的术后粘连，其可能导致肠梗阻、不育症、 慢性盆腔疼痛等严重并发症；开颅手术后粘连可能引发术后癫痫；甲状腺手术 后粘连可能导致继发性喉返神经损伤等。术后粘连所导致的这些症状需要通过 禁饮食、静脉输液、服用中药等保守方法治疗，甚至通过二次手术来进行医治， 增加了病人痛苦、经济负担和治疗的风险性。
由于在外科手术中，出血和术后粘连的部位比较接近，因此，有必要开发 一种兼具止血和防粘连作用的可吸收植入器械，可以在术中对出血部位进行有 效止血，并防止手术部位的脏器发生术后粘连。同时，该植入器械需可在体内 降解，从而随着手术创伤的恢复后逐渐被人体代谢吸收，在病人康复后不影响 正常组织的结构和生理功能。
胶原(collagen)是人体骨骼、皮肤、肌腱、软骨等许多组织的主要组成 成分，目前，人们已经开发出胶原海绵材料用于术中止血。胶原海绵具有良好 的生物相容性，并可在体内降解吸收，在术中止血的应用中可以发挥一定作用。 然而，现有胶原海绵产品的止血仅仅依靠其多孔结构和亲水性对血液中水分的 吸收作用，只能用于填塞止血，效果十分有限。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于，针对现有胶原海绵产品的止血效果有限的 缺陷，提供一种表面富集钙离子的胶原海绵的制备方法。本发明还提供了该制 备方法制得的表面富集钙离子的胶原海绵。该胶原海绵表面的胶原分子在特定 位点上结合有一定浓度的钙离子，能够有效发挥凝血作用；并与凝血因子I、 II、III等协同作用，促进血液凝固。使用该胶原海绵还具有防术后粘连的效果。
本发明的第一方面，提供了一种表面富集钙离子的胶原海绵的制备方法， 包括：
步骤S1、将胶原溶于醋酸的水溶液中，并进行冷冻干燥得到胶原海绵；
步骤S2、采用戊二醛对所述胶原海绵进行交联；
步骤S3、在所述胶原海绵表面结合钙离子，具体包括：
步骤S3-1、配制0.01～0.1mol/L的氯化钙的水溶液；
步骤S3-2、将步骤S2得到的胶原海绵浸泡于步骤S3-1配制的氯化钙溶 液中1～12小时；
步骤S3-3、将步骤S3-2获得的胶原海绵从所述氯化钙溶液中取出，置于 层析柱中，以流动的纯水洗涤2～4小时，以除去残留的氯化钙溶液；
步骤S3-4、将步骤S3-3获得的胶原海绵进行冷冻干燥，得到表面富集钙 离子的胶原海绵。
在根据本发明所述的表面富集钙离子的胶原海绵的制备方法中，所述步骤 S1具体包括：
步骤S1-1、将胶原溶于醋酸的水溶液中，配制成胶原溶液，其中胶原的 浓度为0.01～0.03g/mL；
步骤S1-2、将步骤S1-1得到的胶原溶液填入模具中，然后进行冷冻干燥， 得到胶原海绵。
在根据本发明所述的表面富集钙离子的胶原海绵的制备方法中，所述步骤 S1-2中所述胶原溶液在模具中装填的厚度不超过2cm，以免溶剂去除不完全， 影响冷冻干燥的效果。
在根据本发明所述的表面富集钙离子的胶原海绵的制备方法中，所述步骤 S2具体包括：
步骤S2-1、配制0.005～0.25wt％的戊二醛的乙醇溶液作为交联剂溶液；
步骤S2-2、将步骤S1获得的胶原海绵浸泡于步骤S2-1配制的交联剂溶 液中24～48小时，进行交联；
步骤S2-3、将步骤S2-2获得的胶原海绵从所述交联剂溶液中取出，置于 层析柱中，洗涤48～72小时，以除去残留的交联剂。
在根据本发明所述的表面富集钙离子的胶原海绵的制备方法中，步骤S2-3 中所述洗涤为水洗，乙醇洗，或者水洗和乙醇洗相结合。
本发明第二方面，还提供了一种表面富集钙离子的胶原海绵，其采用如上 所述的表面富集钙离子的胶原海绵的制备方法制得。
在根据本发明所述的表面富集钙离子的胶原海绵中，所述表面富集钙离子 的胶原海绵表面结合的钙离子的含量为每立方厘米胶原海绵的表面结合1.5× 10-6～3.0×10-6mol钙离子。
在根据本发明所述的表面富集钙离子的胶原海绵中，所述表面富集钙离子 的胶原海绵具有90％～99％的高孔隙率。
实施本发明的表面富集钙离子的胶原海绵及其制备方法，具有以下有益效 果：本发明制得的表面富集钙离子的胶原海绵，具有高孔隙率，除了通过迅速 吸收血液中的水分进行止血，其表面结合的钙离子还能够有效发挥凝血作用， 并与凝血因子I、II、III等协同作用，促进血液凝固；此外该胶原海绵还能够 贴附在组织器官的表面，起到防术后粘连的作用，使得该表面富集钙离子的胶 原海绵兼具良好的术中止血效果和术后防粘连作用。
附图说明
下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：
图1为本发明的表面富集钙离子的胶原海绵的制备方法流程图；
图2为本发明的表面富集钙离子的胶原海绵的傅里叶变换红外图谱；
图3为本发明的表面富集钙离子的胶原海绵扫描电子显微镜照片。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实 施例，对本发明进行进一步详细说明。
本发明提供了一种表面富集钙离子的胶原海绵及其制备方法。钙离子 (Ca2+)本身是人体的第IV类凝血因子，同时也是其它多种凝血因子的辅助 因子，在凝血过程中发挥着十分重要的作用。有研究表明，胶原分子上存在许 多Ca2+的结合位点，如羰基、羧基等，可以通过一定的方法在胶原材料表面富 集Ca2+。因此，如果将Ca2+有效结合在胶原海绵的表面，将在胶原海绵填塞止 血的同时激活人体的相关凝血因子，从而极大提高胶原海绵材料的止血效果。
请参阅图1，为本发明的表面富集钙离子的胶原海绵的制备方法流程图。 如图1所示，本发明提供的表面富集钙离子的胶原海绵的制备方法，主要包括 以下操作步骤：
步骤S1、胶原海绵的制备，具体包括：
步骤S1-1、将胶原溶于醋酸的水溶液中，配制成胶原溶液，其中胶原的 浓度为0.01～0.03g/mL；
步骤S1-2、将步骤S1-1得到的胶原溶液填入一定形状的模具中，然后进 行冷冻干燥，得到胶原海绵。
步骤S2、胶原海绵的交联，具体包括：
步骤S2-1、配制0.005～0.25wt％的戊二醛的乙醇溶液作为交联剂；
步骤S2-2、将步骤S1-2获得的胶原海绵浸泡于步骤S2-1配制的交联剂溶 液中24～48小时，进行交联；
步骤S2-3、将步骤S2-2获得的胶原海绵从交联剂溶液中取出，置于层析 柱中，以流动的纯水洗涤48～72小时，以除去残留的交联剂。
步骤S3、胶原海绵表面结合钙离子，具体包括：
步骤S3-1、配制0.01～0.1mol/L的氯化钙的水溶液；
步骤S3-2、将步骤S2-3洗涤后的胶原海绵浸泡于步骤S3-1配制的氯化钙 溶液中1～12小时；
步骤S3-3、将步骤S3-2获得的胶原海绵从氯化钙溶液中取出，置于层析 柱中，以流动的纯水洗涤2～4小时，以除去残留的氯化钙溶液；
步骤S3-4、将步骤S3-3获得的胶原海绵进行冷冻干燥，得到表面富集钙 离子的胶原海绵。
其中，步骤S1-2中，胶原溶液在模具中装填的厚度不超过2cm，以免溶 剂去除不完全，影响冷冻干燥的效果。
其中，步骤S2-3的交联剂去除过程除了水洗，也可以采用乙醇洗，或者 水洗和乙醇洗相结合的方法。
本发明通过上述方法制得了表面富集钙离子的胶原海绵。该表面富集钙离 子的胶原海绵包括胶原海绵的外表面和孔隙结构的内表面，其具有90％～99％ 的高孔隙率，且孔与孔之间相互贯通。微观上在胶原海绵表面胶原分子的羰基、 羧基等位点结合有Ca2+。该胶原海绵表面结合的Ca2+的含量为每立方厘米胶原 海绵的表面结合1.5×10-6～3.0×10-6molCa2+。并且该表面富集钙离子的胶原 海绵在生产过程中经过了交联处理，具有一定的韧性和抗溃散性。本发明制得 的表面富集钙离子的胶原海绵可自由切割和塑型。
实施例1
步骤S1-1、将1g胶原溶于100mL醋酸的水溶液中，配制成胶原溶液；
步骤S1-2、将步骤S1-1得到的胶原溶液填入底面边长为8cm的正方形模 具中，然后进行冷冻干燥，得到胶原海绵；
步骤S2-1、配制0.01wt％的戊二醛的乙醇溶液作为交联剂；
步骤S2-2、将步骤S1-2获得的胶原海绵浸泡于步骤S2-1配制的交联剂溶 液中24小时，进行交联；
步骤S2-3、将步骤S2-2获得的胶原海绵从交联剂溶液中取出，置于层析 柱中，以流动的纯水洗涤60小时，以除去残留的交联剂；
步骤S3-1、配制0.02mol/L的氯化钙的水溶液；
步骤S3-2、将步骤S2-3洗涤后的胶原海绵浸泡于步骤S3-1配制的氯化钙 溶液中3小时；
步骤S3-3、将步骤S3-2获得的胶原海绵从氯化钙溶液中取出，置于层析 柱中，以流动的纯水洗涤2小时，以除去残留的氯化钙溶液；
步骤S3-4、将步骤S3-3获得的胶原海绵进行冷冻干燥，得到表面富集钙 离子的胶原海绵。
经电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)检测，本实施例的表面富集钙离子 的胶原海绵上Ca2+的含量为每立方厘米胶原海绵的表面结合1.7×10-6mol Ca2+。
实施例2
步骤S1-1、将1.5g胶原溶于100mL醋酸的水溶液中，配制成胶原溶液；
步骤S1-2、将步骤S1-1得到的胶原溶液填入底面边长为8cm的正方形模 具中，然后进行冷冻干燥，得到胶原海绵；
步骤S2-1、配制0.05wt％的戊二醛的乙醇溶液作为交联剂；
步骤S2-2、将步骤S1-2获得的胶原海绵浸泡于步骤S2-1配制的交联剂溶 液中36小时，进行交联；
步骤S2-3、将步骤S2-2获得的胶原海绵从交联剂溶液中取出，置于层析 柱中，以流动的无水乙醇洗涤36小时，再以纯水洗涤24小时，以除去残留的 交联剂。
步骤S3、胶原海绵表面结合钙离子，具体包括：
步骤S3-1、配制0.05mol/L的氯化钙的水溶液；
步骤S3-2、将步骤S2-3洗涤后的胶原海绵浸泡于步骤S3-1配制的氯化钙 溶液中4小时；
步骤S3-3、将步骤S3-2获得的胶原海绵从氯化钙溶液中取出，置于层析 柱中，以流动的纯水洗涤3小时，以除去残留的氯化钙溶液；
步骤S3-4、将步骤S3-3获得的胶原海绵进行冷冻干燥，得到表面富集钙 离子的胶原海绵。
经ICP-MS检测，本实施例的表面富集钙离子的胶原海绵上Ca2+的含量为 每立方厘米胶原海绵的表面结合2.2×10-6molCa2+。
图2所示为本发明的表面富集钙离子的胶原海绵的傅里叶变换红外 (FTIR)图谱。其中，a为未结合Ca2+的纯胶原海绵，b为实施例1制得的胶 原海绵，c为实施例2制得的胶原海绵，I、II、III分别为胶原分子中酰胺I、 酰胺II和酰胺III的红外吸收峰。从FTIR图谱可知，随着Ca2+的结合，胶原 分子中酰胺键吸收峰的强度有所降低，且酰胺I键的红外吸收峰向低波数处发 生偏移。证明在实施例1和2的胶原分子中，在酰胺键的位点上发生了与Ca2+的结合，从而影响了酰胺键的红外吸收特性，导致FTIR图谱上吸收峰的强度 和位置发生改变。
实施例3
步骤S1-1、将2.5g胶原溶于100mL醋酸的水溶液中，配制成胶原溶液；
步骤S1-2、将步骤S1-1得到的胶原溶液填入底面边长为6×9cm的长方 形模具中，然后进行冷冻干燥，得到胶原海绵；
步骤S2-1、配制0.1wt％的戊二醛的乙醇溶液作为交联剂；
步骤S2-2、将步骤S1-2获得的胶原海绵浸泡于步骤S2-1配制的交联剂溶 液中36小时，进行交联；
步骤S2-3、将步骤S2-2获得的胶原海绵从交联剂溶液中取出，置于层析 柱中，以流动的无水乙醇洗涤48小时，再以纯水洗涤24小时，以除去残留的 交联剂；
步骤S3-1、配制0.08mol/L的氯化钙的水溶液；
步骤S3-2、将步骤S2-3洗涤后的胶原海绵浸泡于步骤S3-1配制的氯化钙 溶液中6小时；
步骤S3-3、将步骤S3-2获得的胶原海绵从氯化钙溶液中取出，置于层析 柱中，以流动的纯水洗涤4小时，以除去残留的氯化钙溶液；
步骤S3-4、将步骤S3-3获得的胶原海绵进行冷冻干燥，得到表面富集钙 离子的胶原海绵。
经ICP-MS检测，本实施例的表面富集钙离子的胶原海绵上Ca2+的含量为 每立方厘米胶原海绵的表面结合2.8×10-6molCa2+。
对上述实施例制备的胶原海绵材料进行止血效果评价，另用不含Ca2+的胶 原海绵和普通医用纱布进行止血评价作为对比，具体操作步骤如下：
1.建立兔股动脉失血模型：将兔麻醉、脱毛、消毒、分离股动脉，然后 将股动脉剪断；
2.立即用1～3号胶原海绵、不含Ca2+的胶原海绵和普通医用纱布对股动 脉进行止血，记录止血时间和失血量。
本发明的表面富集钙离子的胶原海绵止血结果见表格1：
表格1
产品编号 止血时间(秒) 失血量(克) 实施例1 117.37±10.29 0.80±0.24 实施例2 104.09±12.28 0.69±0.14 实施例3 120.44±13.50 0.82±0.13 不含Ca2+的胶原海绵 145.37±7.79 1.09±0.27 普通纱布 233.63±21.27 3.90±1.21
根据止血实验数据，可以看到，使用表面富集钙离子的胶原海绵对伤口进 行处理，其止血时间较不含Ca2+的胶原海绵缩短17.15％～28.40％，较普通纱 布处理伤口缩短约50％。失血量方面，使用表面富集钙离子的胶原海绵较不含 Ca2+的胶原海绵减少24.77％～36.70％，较普通纱布处理伤口失血量减少约 80％，具有很好的止血效果。
对上述实施例制备的胶原海绵材料进行防粘连效果评价，另用不含Ca2+的胶原海绵和不用任何防粘连膜的对照组进行止血评价作为对比，具体操作步 骤如下：
1.建立兔跟腱损伤模型：将兔麻醉、脱毛、消毒、分离跟腱，然后用手 术刀在跟腱上进行刮擦建立2cm长的损伤模型；
2.立即用1～3号胶原海绵和不含Ca2+的胶原海绵包裹跟腱损伤，5天后 观察粘连情况并评分。
本发明的表面富集钙离子的胶原海绵的防粘连实验结果见表格2：
表格2
产品编号 肌腱损伤粘连长度 肌腱损伤粘连评分 实施例1 0.5±0.1 1 实施例2 0 0 实施例3 0.6±0.1 1 不含Ca2+的胶原海绵 1.5±0.2 2 空白对照 2.6±0.3 3
根据防粘连实验数据，可以看到，使用表面富集钙离子的胶原海绵对跟腱 损伤进行处理，术后能有效防止跟腱在修复过程中与自体组织发生粘连，具有 很好的防粘连效果。
综上所述，本发明获得了表面富集钙离子的胶原海绵，该胶原海绵具有高 孔隙率，其表面的胶原分子在特定位点上结合有一定浓度的钙离子。当被用于 术中止血时，该胶原海绵除了通过迅速吸收血液中的水分进行止血，其表面结 合的Ca2+还能够有效发挥凝血作用，并与凝血因子I、II、III等协同作用，促 进血液凝固。使用该胶原海绵还能够贴附在组织器官的表面，从而起到防术后 粘连的作用。总而言之，本发明所提供的表面富集钙离子的胶原海绵具备良好 的术中止血效果和术后防粘连作用，具有广阔的应用前景。
本发明是根据特定实施例进行描述的，但本领域的技术人员应明白在不脱 离本发明范围时，可进行各种变化和等同替换。此外，为适应本发明技术的特 定场合，可对本发明进行诸多修改而不脱离其保护范围。因此，本发明并不限 于在此公开的特定实施例，而包括所有落入到权利要求保护范围的实施例。