淫羊藿多糖及其组分和它们用于疫苗佐剂的用途 技术领域 本发明涉及淫羊藿的多糖提取物， 具体地， 涉及从中药材淫羊藿叶提取的淫羊藿 总多糖及其其中的酸性糖组分和非糖组分， 本发明还涉及所述的淫羊藿总多糖及其其中的 酸性糖组分和非糖组分用于疫苗佐剂、 疫苗组合物和抗体制备的用途。
背景技术 淫羊藿 (Epimedium) 为小檗硷科 (Berberidaceae) 植物， 常用于补肾壮阳、 祛风除 湿和益气。现代药理研究表明淫羊藿具有镇咳、 去痰、 平喘、 抑菌等活性。淫羊藿中主要化 学成分有黄酮、 木质素、 生物碱以及多糖等。 近年来有以下文献报道有关淫羊藿多糖对动物 免疫功能的影响， 具体内容如下 ：
徐颖等 ( 沈阳药科大学学报， 2000， 17(6) ： 434-437) 采用淫羊藿水煎、 醇沉、 洗涤 和透析获得淫羊藿多糖。 该多糖腹腔注射给予环磷酰胺所致的免疫低下小鼠及荷瘤 (S180) 小鼠， 观察对免疫功能的影响。结果表明该多糖 50、 25mg/kg×7d， 可使脾重量指数上升， 使 下降的溶血素值及空斑形成细胞的溶血能力回升， 使下降的白细胞总数上升。小鼠荷瘤后 免疫功能低下， 皮下注射该多糖 50mg/kg×8d 可对抗荷瘤引起的胸腺指数下降， ， 使荷瘤小 鼠的血清溶血素、 空斑形成细胞的溶血能力及迟发性超敏反应能力有所提高 .
王刚等 ( 武警医学院学报， 2003， 12(3) ： 194-196) 由水煎煮提取、 结晶、 透析 48h 方法获得淫羊藿多糖。该多糖 12.5、 25.0 和 50.0mg/kg 连续给予荷瘤小鼠皮下注射 8d。结 果表明淫羊藿多糖可显著提高小鼠因荷瘤所导致的胸腺指数下降， 溶血素形成减少， 溶血 空斑值降低以及迟发性超敏反应低下。
靳录洋等 ( 甘肃畜牧兽医， 2004， 28(3) ： 7-10) 观察不同浓度的淫羊藿多糖 (EPS， 多糖含量为 32.30％ ) 对正常罗曼雏鸡免疫功能的影响。试验结果表明 EPS 可使外周血淋 巴细胞转化率和 ND-HI 抗体效价明显升高。罗艳等采用相同的淫羊藿多糖， 探讨淫羊藿多 糖 (EPS) 对雏鸡免疫功能和禽流感 - 新城疫重组二联苗免疫效果的影响。结果表明不同浓 度 EPS 均能显著提高淋巴细胞转化率、 中性粒细胞吞噬力、 AI-HI 和 ND-HI 抗体效价、 红细 胞 -C3b 花环率， 降低红细胞 -IC 花环率， 且中剂量效果较好
张述斌等 ( 甘肃畜牧兽医， 2004， 28(4) ： 24-25) 采用 Ca(OH)2 水提取工艺制备淫羊 藿多糖， 苯酚 - 硫酸法测定糖含量为 73.68％。 实验结果表明该多糖鸡新城疫疫苗有明显的 免疫增强作用， 用该多糖免疫后鸡血清中 HI 抗体效价比对照鸡明显提高， 而且维持时间延 长。此外， T 淋巴细胞 ANAE 阳性率与 HI 抗体效价有相应的消长趋势。
孔祥峰等 ( 畜牧兽医学报， 2004， 35(4)， 468-472) 用新城疫 IV 系疫苗免疫雏鸡， 在 均能不同程度地提高抗体 免疫前、 后分别注射高、 低剂量淫羊藿多糖 ( 糖含量为 66.38％ )， 效价， 且与给药时间、 剂量和免疫接种次数有一定关系。
尚川川等 ( 动物医学进展， 2009， 30(4) ： 23-26) 将 50、 100、 150g/L 等不同浓度的 淫羊藿多糖与灭活的鸡新城疫病毒乳化制备疫苗免疫雏鸡， 探讨淫羊藿多糖作为免疫佐剂 对鸡免疫功能的影响。结果表明 100g/L 和 150g/L 的淫羊藿多糖作为免疫佐剂均可促进抗
体的产生， 提高脾脏指数， 但对法氏囊指数的促进作用不明显。
孙艳等 ( 中国专利， 专利号 CN1360894) 从淫羊藿中提取一种淫羊藿多糖， 该多糖 是由 A 部分和 B 部分组成， 包括鼠李糖、 岩藻糖、 阿拉伯糖、 木糖、 甘露糖、 葡萄糖、 半乳糖七 种单糖， 具有明显的促免疫作用， 是一种很有发展前途的生物调节剂。适用于乳腺癌、 小细 胞肺癌、 非何杰金淋巴病、 非腺癌、 胃癌等癌症患者化疗、 放疗需要辅助治疗者。
Yang LS 等 (Vaccine， 2008， 26 ： 4451-4455) 研究黄芪多糖、 淫羊藿多糖 ( 糖含量 为 71.23％ ) 和蜂胶黄酮组成的复方对兔出血病疫苗的佐剂作用。结果表明该复方体外能 显著促进 T 淋巴细胞的增殖， 提高 T 细胞分泌 IFN-γ 和 IL-10 的 mRNA 表达水平， 其佐剂作 用略强于铝佐剂， 对兔出血病有保护作用。
Wang DW 等 (Vaccine， 2006， 24 ： 7109-7114) 将淫羊藿多糖 ( 糖含量为 71.23％ ) 与蜂胶黄酮混和， 研究与 IL-2 免疫协同作用， 以及对鸡外周淋巴细胞 IL-2 和 IFN-γmRNA 表达水平的影响。结果表明该混合物能提高抗体滴度和 IFN-γmRNA 表达水平， 但与 IL-2 的协同作用不明显。
Sun JL 等 (Vaccine， 2006， 24 ： 2343-2348) 把淫羊藿多糖 ( 糖含量 88.96％ ) 和蜂 胶黄酮混和作为佐剂， 研究对兔出血疫苗的免疫激活作用 ； 同时研究了该混合物对鸡新城 疫疫苗佐剂效应和免疫功能的影响。结果显示淫羊藿多糖和蜂胶黄酮混和作为佐剂， 能显 著提高抗体滴度， 促进淋巴细胞增殖， 其作用效果与油佐剂相近。 发明内容 发明人意外地发现， 本发明制备的淫羊藿多糖以及其多糖和非糖组分， 具有良好 的疫苗佐剂作用。具体地， 本发明包括以下几个方面 ：
本发明的第一方面涉及淫羊藿多糖 ( 也称为淫羊藿总多糖 )， 其是通过如下方法 获得的 ：
1) 取淫羊藿叶， 加入水浸泡， 得到水提液 ；
加水浸提的时间为 1 ～ 72 小时， 视浸提温度而定。在室温条件下， 优选为 24 ～ 48 小时， 在本发明的一个实施方案中， 为 48 小时 ；
2) 将步骤 1) 得到的水提液进行乙醇沉淀， 取沉淀部分加入水中溶解， 离心， 取上 清液进行透析 ；
3) 取透析所得的透析液进行冷冻干燥， 得到淫羊藿多糖。
根据本发明第一方面的淫羊藿多糖， 其特征在于如下的 (1)-(12) 项中的任意一 项或多项 ：
(1) 步骤 1) 中所述的淫羊藿叶， 为未经提取的淫羊藿叶， 或者经过有机溶剂例如 石油醚、 乙酸乙酯、 氯仿、 乙醚、 正己烷、 环己烷、 正丁醇、 乙醇或甲醇萃取后得到的残渣叶 ；
通过有机溶剂浸提可以去除叶绿素等杂质以及脂溶性小分子成分。
有机溶剂浸提的温度通常为室温 ； 浸提的时间为 4 ～ 72 小时， 优选为 12 ～ 48 小 时， 在本发明的一个实施方案中， 为 24 小时 ；
(2) 步骤 1) 中所用水为蒸馏水或去离子水 ；
(3) 步骤 1) 中， 加入水浸提的温度为 4 ～ 60℃， 优选为 20 ～ 60℃， 更优选为 20 ～ 50℃。在此温度范围内， 不会破坏糖的性质， 且随温度升高， 糖的得率增加。
(4) 步骤 1) 中， 将浸提后得到的淫羊藿叶按照相同条件进行一次或多次浸提， 合 并水提液 ；
在本发明的一个实施方案中， 进行两次浸提。
(5) 步骤 1) 中水的用量为淫羊藿叶的 5-20 倍量 (L/Kg) ；
(6) 步骤 1) 中， 浸提期间进行搅拌 ；
(7) 步骤 1) 中， 将得到的水提液在 50℃ -55℃下进行减压浓缩， 得到浓缩的水提 液；
(8) 步 骤 2) 中， 乙醇沉淀的条件是 ： 醇 沉 后 乙 醇 的 终 浓 度 为 60-80 ％， 例如 70-75％ ； 优选地， 醇沉的时间大于 12 小时， 例如为 48-72 小时 ；
(9) 步骤 2) 中， 将乙醇沉淀后离心得到的沉淀再进行一次或多次乙醇沉淀 ；
(10) 步骤 2) 中， 透析所用的透析袋的截留分子量大于 1000 ；
(11) 步骤 2) 中， 用自来水和 / 或蒸馏水进行透析 ；
(12) 步骤 2) 中， 透析时间为 24 ～ 72 小时， 透析进行一次或多次 ；
(13) 步骤 3) 中， 在冷冻干燥之前， 将得到的透析液在 50℃ -55℃下进行减压浓缩。
在本发明的一个实施方案中， 所述的淫羊藿多糖是通过以下方法制备的 ：
取淫羊藿叶， 向其中加入蒸馏水浸泡， 期间不时搅拌 ； 过滤， 滤液离心 ； 浸提后的 淫羊藿叶在同样条件下进行第二次提取 ； 合并两次提取的水提液， 减压浓缩， 然后加入 3 ～ 4 倍体积的乙醇进行醇沉 ； 醇沉液离心， 将沉淀部分加入水中搅拌溶解， 离心， 沉淀再同样 操作二次 ； 合并溶解的上清液， 装入透析袋， 截留分子量＞ 1000， 用水透析 ； 将所得透析液 减压浓缩后， 装入小瓶进行冷冻干燥， 获得所述淫羊藿多糖。
在另一个实施方案中， 本发明所述的淫羊藿多糖是通过如下方法获得的 ：
取淫羊藿叶， 向其中加入石油醚浸没浸泡 ； 过滤， 将滤液减压回收浸膏 ； 浸提后的 淫羊藿叶自然挥干后， 向其中加入蒸馏水浸泡， 期间不时搅拌 ； 然后过滤， 滤液离心， 浸提后 的淫羊藿叶在同样条件下进行第二次提取 ； 合并两次提取的水提液， 减压浓缩， 然后加入 3 ～ 4 倍体积的乙醇进行醇沉 ； 醇沉液离心， 向沉淀部分中加入水搅拌溶解， 离心， 再将沉淀 同样操作二次 ； 合并溶解的上清液， 装入透析袋， 截留分子量＞ 1000， 用水透析 ； 将得到的 透析液减压浓缩后， 装入小瓶进行冷冻干燥， 获得所述淫羊藿多糖。
本发明的第二方面涉及一种淫羊藿多糖， 或者根据本发明第一方面任一项所述的 淫羊藿多糖， 其特征在于
(1) 含糖量为 25-45％ ( 以葡萄糖计算 )， 糖醛酸含量为 5-20％ ( 以半乳糖醛酸计 算)； 和/或
(2) 其具有附图 1 和附图 2 所示的特征。
在本发明的一个实施方案中， 含糖量为 35.60％ ( 以葡萄糖计算 )， 糖醛酸含量为 7.53％ ( 以半乳糖醛酸计算 )。
本发明的第三方面涉及一种淫羊藿酸性多糖组分， 其为根据本发明第一方面或 第二方面任一项所述的淫羊藿多糖经 DEAE- 纤维素柱层析， 得到的具有硫酸 - 苯酚显色、 490nm 波长吸收的 0.25mol/L NaHCO3 洗脱部分。
本发明的第四方面涉及一种淫羊藿酸性多糖组分， 或者根据本发明第三方面所述 的淫羊藿酸性多糖组分， 其特征在于 ：包含鼠李糖、 岩藻糖、 阿拉伯糖、 木糖、 甘露糖、 葡萄糖、 半乳糖以及半乳糖醛酸 ； 以 及， 其分子量为 6000 ～ 20000。
根据本发明第四方面的淫羊藿酸性多糖组分， 其特征在于，
(1) 含糖量为 45-65％ ( 以葡萄糖计算 )， 糖醛酸含量为 5-15％ ( 以半乳糖醛酸计 算)； 和/或
(2) 鼠李糖、 岩藻糖、 阿拉伯糖、 木糖、 甘露糖、 葡萄糖、 半乳糖的摩尔比为鼠李糖∶ 岩藻糖∶阿拉伯糖∶木糖∶甘露糖∶葡萄糖∶半乳糖＝ 1.00 ∶ 0.33 ∶ 4.44 ∶ 0.38 ∶ 0.64 ∶ 0.87 ∶ 5.26。
在本发明的一个实施方案中， 含糖量为 58.93％ ( 以葡萄糖计算 )， 糖醛酸含量为 8.40％ ( 以半乳糖醛酸计算 )。
在本发明的实施方案中， 含糖量 ( 以葡萄糖计 ) 的测定方法为硫酸 - 苯酚法 ； 糖醛 酸含量 ( 以半乳糖醛酸计 ) 的测定方法为间羟联苯法。
本发明的第五方面涉及一种淫羊藿非糖组分， 其为本发明第一方面或第二方面 任一项所述的淫羊藿多糖经 DEAE- 纤维素柱层析， 得到的具有 280nm 吸收的 0.25mol/L NaHCO3 洗脱部分。 本发明的第六方面涉及一种淫羊藿非糖组分， 或者根据本发明第五方面所述的淫 羊藿非糖组分， 其为淫羊藿多糖的非糖组分， 其分子量为 2000 ～ 10000。
本发明的第七方面涉及一种药物组合物， 其包含本发明第一方面至第六方面任一 项的淫羊藿多糖和 / 或淫羊藿酸性多糖组分和 / 或淫羊藿非糖组分， 以及药学上可接受的 辅料。
本发明的第八方面涉及一种疫苗佐剂， 其包含本发明第一方面至第六方面任一项 的淫羊藿多糖和 / 或淫羊藿酸性多糖组分和 / 或淫羊藿非糖组分。
本发明的第九方面涉及一种疫苗制剂或疫苗组合物， 其包含本发明第一方面至第 六方面任一项的淫羊藿多糖和 / 或淫羊藿酸性多糖组分和 / 或淫羊藿非糖组分。
本发明的第十方面涉及本发明第一方面至第六方面任一项的淫羊藿多糖和 / 或 淫羊藿酸性多糖组分和 / 或淫羊藿非糖组分用于制备疫苗佐剂、 疫苗制剂、 疫苗组合物或 抗体的用途。
本发明还涉及一种制备抗体的方法， 其包括使用有效量的本发明第一方面至第六 方面任一项的淫羊藿多糖和 / 或淫羊藿酸性多糖组分和 / 或淫羊藿非糖组分的步骤。
本发明还涉及一种免疫方法或者接种方法， 包括给予哺乳动物有效量的疫苗制剂 或疫苗组合物的步骤。
在本发明中， 所述淫羊藿多糖组分是指从淫羊藿总多糖中分离得到的不同组分。 在本发明的一个实施方案中， 为其中的酸性糖组分， 例如为 YYH-G1。 在本发明的另一个实施 方案中， 为其中的非糖组分， 例如为 YYH-G4。
在本发明中， 所述疫苗包括减毒疫苗、 灭活疫苗、 蛋白质疫苗、 DNA 疫苗或多肽疫 苗。
在本发明中， 所述有效量是指给予哺乳动物实现能够免疫效果的疫苗制剂或疫苗 组合物的剂量。
发明的有益效果
本发明从淫羊藿叶中通过水浸提的方式提取得到淫羊藿总多糖， 进而分离得到其 中的多糖组分和非糖组分， 并对其进行了鉴定， 进一步明确了其组成成分。 实验证明得到的 淫羊藿总多糖及其多糖和非糖组分均能够增强免疫应答， 具有良好的佐剂作用， 为疫苗和 抗体的制备提供了新途径。同时， 分离得到了淫羊藿总多糖中具有佐剂作用的多糖组分和 非糖组分， 为淫羊藿总多糖的佐剂作用机制研究奠定了基础， 为找到具有更好佐剂效果的 多糖或非糖制剂提供了可能。 附图说明
图 1 为总多糖 YYH-G 的 DEAE- 纤维素柱层析洗脱曲线， 苯酚 - 硫酸法检测， 490nm 波长检测糖吸收峰
图 2 为总多糖 YYH-G 的 DEAE- 纤维素柱层析洗脱曲线， 280nm 波长检测非糖成分
图 3 为 OVA 抗原配伍多糖 YYH-G 免疫 1 次后小鼠血清抗体滴度， mean±SD， n＝5
图 4 为 OVA 抗原配伍多糖 YYH-G 免疫 2 次后小鼠血清抗体滴度， mean±SD， n＝5
图 5 为 OVA 抗原配伍多糖 YYH-G 免疫 3 次后小鼠血清抗体滴度， mean±SD， n＝5
图 6 为 OVA 抗 原 配 伍 多 糖 YYH-G1 或 YYH-G4 免 疫 1 次 后 小 鼠 的 抗 体 滴 度， mean±SD， n＝5 图 7 为 OVA 抗 原 配 伍 多 糖 YYH-G1 或 YYH-G4 免 疫 2 次 后 小 鼠 的 抗 体 滴 度， mean±SD， n＝5
图 8 为 H1N1 病毒抗原配伍多糖 YYH-G1 免疫 1 次后小鼠血清抗体滴度， mean±SD， n＝5
图 9 为 H1N1 病毒抗原配伍多糖 YYH-G4 免疫 1 次后小鼠血清抗体滴度， mean±SD， n＝5
图 10 为 H1N1 病毒抗原配伍多糖 YYH-G1 免疫 2 次后小鼠血清抗体滴度， mean±SD， n＝5
图 11 为 H1N1 病毒抗原配伍多糖 YYH-G4 免疫 2 次后小鼠血清抗体滴度， mean±SD， n＝5
图 12 为 H1N1 病毒抗原配伍多糖 YYH-G1 或 YYH-G4 免疫 1 次后小鼠血清抗体滴度， mean±SD， n＝5
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述， 但是本领域技术人员将会 理解， 下列实施例仅用于说明本发明， 而不应视为限定本发明的范围。 实施例中未注明具体 条件者， 按照常规条件或制造商建议的条件进行。 所用试剂或仪器未注明生产厂商者， 均为 可以通过市购获得的常规产品。
实施例 1 ： 淫羊藿总多糖的制备
淫羊藿叶 1kg， 室温下加入石油醚浸没浸泡 24 小时， 过滤， 滤液 30 ～ 35℃减压回 收浸膏。经过石油醚浸提后的淫羊藿叶自然挥干后， 加入 15L 蒸馏水， 室温下 (20 ～ 30℃ ) 浸泡 48 小时， 期间不时搅拌 ； 然后过滤， 滤液离心 10min( 转速 3000r/min)， 浸提后的淫羊 藿叶在同样条件下进行二次提取。合并二次提取的水提液， 50 ～ 55℃减压浓缩至 1000ml，然后加入 3 倍体积 (3000ml)95 ％的乙醇进行 48 小时的醇沉。醇沉液离心 10min( 转速 3000r/min)， 沉淀部分加入 1000ml 水搅拌溶解， 离心， 沉淀再同样操作二次。合并溶解的上 清液， 装入透析袋 ( 截留分子量＞ 1000)， 自来水透析 48 小时后换蒸馏水再透析 24 小时。 该透析液 50 ～ 55℃减压浓缩至 200ml 左右， 装入小瓶进行冷冻干燥， 获得棕色粉末， 即总多 糖 ( 得率为 0.74％ )。
实施例 2 ： 淫羊藿总多糖的制备
淫羊藿叶 1kg， 室温下加入 15L 蒸馏水， 室温下 (20 ～ 30 ℃ ) 浸泡 48 小时， 期间 不时搅拌 ； 然后过滤， 滤液离心 10min( 转速 3000r/min)， 浸提后的淫羊藿叶在同样条件下 进行二次提取。合并二次提取的水提液， 50 ～ 55℃减压浓缩至 1000ml， 然后加入 3 倍体积 (3000ml)95％的乙醇进行 48 ～ 72 小时的醇沉。醇沉液离心 10min( 转速 3000r/min)， 沉 淀部分加入 1000ml 水搅拌溶解， 离心， 沉淀再同样操作二次。合并溶解的上清液， 装入透析 袋 ( 截留分子量＞ 1000)， 自来水透析 48 小时后换蒸馏水再透析 24 小时。该透析液 50 ～ 55 ℃减压浓缩至 200ml 左右， 装入小瓶进行冷冻干燥， 获得棕色粉末， 即总多糖 ( 得率为 0.81％ )。
实施例 3 ： 淫羊藿总多糖的制备 淫羊藿叶 1kg， 在 55 ～ 60 ℃温度下加入 15L 蒸馏水， 浸泡 48 小时， 期间不时搅 拌； 然后过滤， 滤液离心 10min( 转速 3000r/min)， 浸提后的淫羊藿叶在同样条件下进行 二次提取。合并二次提取的水提液， 50 ～ 55 ℃减压浓缩至 1000ml， 然后加入 3 倍体积 (3000ml)95％的乙醇进行 48 ～ 72 小时的醇沉。醇沉液离心 10min( 转速 3000r/min)， 沉 淀部分加入 1000ml 水搅拌溶解， 离心， 沉淀再同样操作二次。合并溶解的上清液， 装入透析 袋 ( 截留分子量＞ 1000)， 自来水透析 48 小时后换蒸馏水再透析 24 小时。该透析液 50 ～ 55 ℃减压浓缩至 200ml 左右， 装入小瓶进行冷冻干燥， 获得棕色粉末， 即总多糖 ( 得率为 1.9％ )。
实施例 4 ： 淫羊藿多糖组分的制备
室温浸提的淫羊藿总多糖 YYH-G( 实施例 1 制备 )1g， 加入蒸馏水 50ml 溶解， 溶解 液上样 DEAE- 纤维素柱 (Φ8cm×35cm)， 分别采用水、 0.25mol/L NaHCO3、 0.5mol/L NaHCO3 和 0.1mol/L NaOH 进行连续洗脱， 流速 1ml/min， 10ml/ 管， 相应获得多糖组分 YYH-G0(490nm 吸 收， H2O)、 YYH-G1(490nm 吸 收， 0.25mol/L NaHCO3)、 YYH-G2(490nm 吸 收， 0.5mol/L NaHCO3)、 YYH-G3(490nm 吸收， 0.1mol/LNaOH) 以及非糖组分 YYH-G4(280nm 吸收， 0.25mol/L NaHCO3)、 YYH-G5(280nm 吸收， 0.5mol/L NaHCO3)、 YYH-G6(280nm 吸收， 0.1mol/L NaOH)。
总多糖 YYH-G 在 DEAE- 纤维素柱层析的色谱图如图 1 和图 2 所示。
实施例 5 ： 淫羊藿总多糖、 酸性多糖组分和非糖组分的理化性质
淫羊藿总多糖 YYH-G 由实施例 4 制备， 酸性多糖组分 YYH-G1 和非糖组分 YYH-G4 由实施例 4 制备。
1. 淫羊藿总多糖和酸性多糖组分的含糖量 ( 以葡萄糖计 ) 的测定
1) 实验方法
采用硫酸 - 苯酚法测定糖含量 ( 参考文献 ： Dubois M.， et al.Colorimetric method for detemination of sugars and related substances.Anal.Chem.1956 ； 28 ： 350-56)。
2) 实验结果
总多糖 YYH-G 为棕色粉末， 含糖量为 35.60％ ( 以葡萄糖计算 ) ；
酸性多糖组分 YYH-G1 为淡黄色粉末， 含糖量为 58.93％ ( 以葡萄糖计算 ) ；
非糖组分 YYH-G4 为浅黄色粉末。
2. 淫羊藿总多糖和酸性多糖组分的的糖醛酸含量 ( 以半乳糖醛酸计 ) 的测定
1) 实验方法
采用间羟联苯法测定糖醛酸含量 ( 参考文献 ： Blumenkrantz N， et al.New method for quantitative determiation of uronic acid.Anal Biochem 1973 ； 54 ： 484-89)。
2) 实验结果
总多糖 YYH-G 的糖醛酸含量为 7.53％ ( 以半乳糖醛酸计算 ) ；
酸性多糖组分 YYH-G1 的糖醛酸含量为 8.40％ ( 以半乳糖醛酸计算 )。
3. 淫羊藿总多糖中酸性多糖组分和非糖组分的分子量测定
1) 实验方法
仪器 ： HPLC， Waters 公司 ； 色谱柱 ： TSKsw4000 ； 流动相 ： 0.1M Na2SO4 ； 流速 ： 0.6ml/ min ； 检测器 ： 示差。
2) 实验结果
酸性多糖组分 YYH-G1 的分子量为 6000 ～ 20000 ；
非糖组分 YYH-G4 的分子量为 2000 ～ 10000。
4. 淫羊藿总多糖中酸性多糖组分的单糖组成
酸性多糖组分 YYH-G1 的单糖组成是鼠李糖、 岩藻糖、 阿拉伯糖、 木糖、 甘露糖、 葡 萄糖、 半乳糖以及半乳糖醛酸， 摩尔比分别为 1.00 ∶ 0.33 ∶ 4.44 ∶ 0.38 ∶ 0.64 ∶ 0.87 ∶ 5.2 6。
由于药材产地、 批次不同， 其中的糖含量和糖醛酸含量不可能完全相同， 而是在本 实施例数值周围波动。例如总多糖 YYH-G 的含糖量为 25-45％， 酸性多糖组分 YYH-G1 的含 糖量为 45-65％， 总多糖 YYH-G 的糖醛酸含量为 5-20％， 酸性多糖组分 YYH-G1 的糖醛酸含 量为 5-15％
实施例 6 ： 淫羊藿总多糖的生物学试验
将室温下提取的淫羊藿总多糖 YYH-G( 实施例 1 制备 ) 作为佐剂， 以卵清蛋白 (OVA) 为抗原， 二者联用肌肉注射小鼠， 测定产生的抗体滴度。具体实验方法如下 ：
实验动物 ： Balb/C， 6-8 周， 5 只 / 组， 雌性。
药物浓度 ： 总多糖 YYH-G ： 20mg/ml ； OVA ： 1.2mg/ml ； 铝佐剂 ： 2mg/ml ；
对照溶剂 ： 生理盐水
给药剂量 ： OVA-60μg/50μl/ 鼠 ； 铝佐剂 -100μg/50μl/ 鼠 ； YYH-G ： 1mg/50μl/ 鼠；
分组 ： (1)P 组 ： PBS+OVA ； (2) 铝 佐 剂 组 ： 铝 佐 剂 +OVA ； (3)YYH-G 组 ： YYH-G+OVA ； (4) 溶剂对照组 ： 生理盐水。注射前等体积混合， 100μl/ 鼠， 右后肢肌肉注射。
免疫方案 ： 动物按照免疫分组首次免疫注射后 3 周， 尾静脉取血， 测定血清中抗体 滴度。首次免疫注射后第 3 周检测抗体滴度， 第 4 周加强免疫， 二次免疫注射后 2 周， 尾静 脉取血， 测定血清中抗体滴度， 视滴度情况， 测定后 2 周进行第 3 次免疫。 ELISA 测定血清中抗体滴度。
ELISA 法所用试剂配制 ：
1. 抗原包被液 ： 50mmol/L 碳酸盐缓冲液 pH9.6。称取无水 Na2CO3 1.696g， NaHCO3 2.856g 加水溶解到 1000ml， 调节 pH 至 9.6。
2. 洗涤液 (10×PBST， pH7.4) ： 称取 NaCl 80g， KCl 2g， Na2HPO429g， KH2PO4 2g， Tween-20 10ml， 双蒸水至 1000ml， 调节 pH7.4， 10 倍稀释使用。
3. 封闭液 ： 1％ BSA， 用 50mmol/L PBS pH7.4 溶解。
4. 底物液 (TMB-H2O2) ： 使用时将底物液 A 和 B 等体积混合， 加入 30％ H2O2， 终浓度 0.5％。
5. 底物液 A(TMB)， 称取 TMB 200mg， 无水乙醇 100ml， 加双蒸水至 1000ml。
6. 底物液 B(0.1mol/L 柠檬酸 -0.2mol/L Na2HPO4 缓冲液 )， Na2HPO4 24.8g， 柠檬 酸 19.33g， 加双蒸水至 1000ml， 调节 pH5.0 ～ 5.4。
7.2N H2SO4
8.OVA 溶解于抗原包被液， 浓度为 4μg/ml， 包被 96 孔板 (Costa)100μl/ 孔， 4℃ 过夜。 PBST 洗 3 遍， 1％ BSA-PBS 37℃封闭 1h。 PBST 洗 3 遍后加入以 PBST 稀释的小鼠血清样 品， 100μl/ 孔， 37℃孵温 1h。 PBST 洗 3 遍， 加入 HRP- 羊抗小鼠 IgG(1 ∶ 1000， PBST)100μl/ 孔， 37℃孵温 1， PBST 洗 6 遍， 加入 100μl 底物液显色后， 加入 50μl2NH2SO4 终止反应测定 A450。 实验结果 ：
淫 羊 藿 总 多 糖 YYH-G、 生 理 盐 水、 Al(OH)3 分 别 与 OVA 等 体 积 混 合， 免 疫 小 鼠， 100μl/ 鼠， 免疫 3 周尾静脉取血， 取血清自 1 ∶ 200 始至 1 ∶ 12800 等比稀释， ELISA 方法 检测血清抗体滴度。实验结果表明第一次免疫所有测试组抗体滴度均比较低 ( 图 3)， 而经 过第二、 三次免疫后 YYH-G 注射组动物血清滴度明显升高 ( 见图 4 和图 5)， 表明 YYH-G 具有 显著促进抗体产生作用。
实施例 7 ： 淫羊藿多糖组分的生物学试验
室温下提取的淫羊藿总多糖 YYH-G( 实施例 1 制备 ) 经 DEAE- 纤维素柱层析， 获得 酸性多糖组分 YYH-G1 和非糖组分 YYH-G4。YYH-G1 和 YYH-G4 分别作为佐剂， 以卵清蛋白 (OVA) 为抗原， 二者联用肌肉注射小鼠， 测定产生的抗体滴度。具体实验同实施例 6。
药物浓度 ： YYH-G1 ： 10mg/ml ； YYH-G4 ： 10mg/ml ； OVA ： 1.2mg/ml ； 铝佐剂 ： 2mg/ml ； 对照溶剂 ： 生理盐水
给 药 剂 量： YYH-60μg/50μl/ 鼠 ；铝 佐 剂 -100μg/50μl/ 鼠 ； YYH-G1 ： 0.5mg/50μl/ 鼠 ； YYH-G4 ： 0.5mg/50μl/ 鼠 ；
分组 ： (1)P 组 ： PBS+OVA ； (2) 铝佐剂组 ： 铝佐剂 +OVA ； (3)YYH-G1 组 ： YYH-G1+OVA ； (4)YYH-G4 组 ： YYH-G4+OVA ；
注射前等体积混合， 100μl/ 鼠， 右后肢肌肉注射。
实验结果 ：
淫羊藿总多糖 YYH-G 经 DEAE- 纤维素柱层析分离， 得到酸性多糖组分 YYH-G1 和 非糖组分 YYH-G4， 按照免疫方案进行进一步的佐剂活性功能测定， 经第二次免疫后检测， YYH-G1 和 YYH-G4 组分具有显著的免疫佐剂活性， 能够促进抗体的产生 ( 图 6 和图 7)。
实施例 8 淫羊藿多糖组分的生物学试验
55 ～ 60℃下提取淫羊藿总多糖 YYH-G( 实施例 3 制备 ) 经 DEAE- 纤维素柱层析， 获得酸性多糖组分 YYH-G1 和非糖组分 YYH-G4。 采用 H1N1 病毒裂解液为抗原测定两种糖组 分的活性。
YYH-G1 和 YYH-G4 分别作为佐剂， 以 H1N1 病毒裂解液为抗原， YYH-G1 和 YYH-G4 按 照不同的剂量分别与甲型流感疫苗 H1N1 病毒裂解液配伍肌肉注射小鼠， 测定产生的抗体 滴度。具体实验同实施例 6。
混 合 后 药 物 浓 度： YYH-G1 ： 10， 5， 2.5， 1.25mg/ml ； YYH-G4 ： 5， 2.5， 1.25mg/ml ； H1N1 ： 30μg/ml ； 铝佐剂 ： 1mg/ml ； 对照溶剂 ： 生理盐水
给药剂量： H1N1 ： 3μg/100μl/ 鼠 ； 铝 佐 剂 -100μg/100μl/ 鼠 ； YYH-G1 ： 1.0， 0.5， 0.25， 0.125mg/100μl/ 鼠 ； YYH-G4 ： 0.5， 0.25， 0.125， 0mg/100μl/ 鼠 ；
分组 ： (1)P 组 ： H1N1(YYH-G1 or YYH-G4 ： 0mg/100μl/ 鼠 ) ； (2) 铝佐剂组 ： 铝佐剂 +H1N1 ； (3)YYH-G1 组 ： YYH-G1+H1N1 ； (4)YYH-G4 组 ： YYH-G4+H1N1 ；
注射前等体积混合， 100μl/ 鼠， 右后肢肌肉注射。
实验结果 ： 淫羊藿总多糖 YYH-G 经 DEAE- 纤维素柱层析分离， 得到酸性多糖组分 YYH-G1 和非 糖组分 YYH-G4， 与甲型流感疫苗 H1N1 病毒裂解液配伍免疫， 结果显示初次免疫后 18 天小鼠 血清中具有较高 H1N1 病毒抗体滴度， YYH-G1 免疫剂量每只小鼠为 0.125-1mg、 YYH-G4 免疫 剂量每只小鼠为 0.125-0.5mg， 均具有较高的佐剂活性， 剂量组之间没有明显的差异， 说明 低剂量有效 ( 图 8-11)。
实施例 9 淫羊藿多糖组分的生物学试验
室温下提取淫羊藿总多糖 YYH-G( 实施例 2 制备 ) 经 DEAE- 纤维素柱层析， 获得酸 性多糖组分 YYH-G1 和非糖组分 YYH-G4。 采用 H1N1 病毒裂解液为抗原测定两种糖组分的活 性。具体方法如实施例 8。结果显示室温提取的 YYH-G1 和 YYH-G4 配伍 H1N1 抗原初次免疫 即可产生较高滴度的抗体 ( 图 12)。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述， 本领域技术人员将会理解。根 据已经公开的所有教导， 可以对那些细节进行各种修改和替换， 这些改变均在本发明的保 护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。