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药物组合物、 食品饮料以及与它们相关的方法
    【技术领域】
     本发明涉及一种药物组合物、 食品饮料以及关于它们的方法。背景技术 目前， 人们正在进行各种抗肥胖药物的研发。例如， 有报道指出脂肪酸合成酶 (FAS) 的抑制剂通过降低下丘脑的神经肽 Y(NPY) 的产生量， 引起显著的食欲减退， 从而最 终达到减少体重或脂肪量的效果 ( 例如， 参照非专利文献 1)。
     现有技术文献
     非专利文献
     非专利文献 1 ： Loftus， T.M. 等 Science 288 ： 2379-2381(2000)
     发明内容 技术问题
     然而， 对于将作用于脑神经系统的低分子化合物作为有效成分的抗肥胖药物而 言， 会引起不良的副作用 ( 例如， 厌食症 )。
     因此， 人们迫切期望研制出不会伴随这种副作用 ( 例如， 厌食症 ) 的新的抗肥胖药 物。
     本发明是鉴于上述技术问题而提出的， 目的之一在于提供新型药物组合物、 食品 饮料以及与它们相关的方法。
     技术方案
     为了解决上述问题的本发明的一种实施方式所涉及的药物组合物， 特征在于， 作 为有效成分而包含下述的 (I) 或 (II) 的蛋白质 ： (I) 巨噬细胞凋亡抑制因子 ； (II) 由巨噬 细胞凋亡抑制因子的氨基酸序列经过缺失、 取代或添加一个或多个氨基酸的与所述氨基酸 序列具有同源性的氨基酸序列构成， 且具有抑制前脂肪细胞向成熟脂肪细胞的分化的功能 和 / 或在成熟脂肪细胞中诱导脂滴分解的功能的蛋白质。根据本发明， 可以提供新型药物 组合物。
     为了解决上述问题的本发明的一种实施方式所涉及的蛋白质， 特征在于， 是所述 (I) 的蛋白质或者所述 (II) 的蛋白质， 且作为药物组合物的有效成分使用。 根据本发明， 可 以提供用于新的药物用途的蛋白质。
     为了解决上述问题的本发明的一种实施方式所涉及的方法， 特征在于， 制备所述 药物组合物。根据本发明， 可以提供制备新型药物组合物的方法。
     为了解决上述问题的本发明的一种实施方式所涉及的方法， 特征在于， 向生物机 体给予所述药物组合物。根据本发明， 可以提供向生物机体给予新型药物组合物的方法。
     为了解决上述问题的本发明的一种实施方式所涉及的食品饮料， 特征在于， 包含 下述的 (I) 或 (II) 的蛋白质 ： (I) 巨噬细胞凋亡抑制因子 ； (II) 由巨噬细胞凋亡抑制因子 的氨基酸序列经过缺失、 取代或添加一个或多个氨基酸的与所述氨基酸序列具有同源性的
     氨基酸序列构成， 且具有抑制前脂肪细胞向成熟脂肪细胞的分化的功能和 / 或在成熟脂肪 细胞中诱导脂滴分解的功能的蛋白质。根据本发明， 可以提供新型食品饮料。
     为了解决上述问题的本发明的一种实施方式所涉及的方法， 特征在于， 制造所述 食品饮料。根据本发明， 可以提供制造新型食品饮料的方法。 附图说明 图 1 为将人类 AIM 氨基酸序列与 cDNA 碱基序列相对应起来而示出的说明图。
     图 2 为示出属于 SRCR-SF 的分子的一种示例的说明图。
     图 3 为将人类 AIM 氨基酸序列、 小鼠 AIM 氨基酸序列以及它们共有的共有序列相 对应起来而示出的说明图。
     图 4 是示出巨噬细胞浸润到脂肪组织而产生 AIM 的状态的显微镜照的一种示例的 说明图。
     图 5A 是示出对脂肪细胞的 AIM 处理方案的一种示例的说明图。
     图 5B 是示出对根据图 5A 中示出的方案用 AIM 处理的细胞采用油红 O 脂肪染色的 结果的一种示例的说明图。
     图 6A 是示出对脂肪细胞的 AIM 处理方案的一种示例的说明图。
     图 6B 是示出对根据图 6A 中示出的方案用 AIM 处理的细胞采用油红 O 脂肪染色的 结果的一种示例的说明图。
     图 7A 是示出根据图 6A 中示出的方案用 AIM 处理时得到的具有脂滴的细胞的数的 测定结果的一种示例的说明图。
     图 7B 是示出根据图 6A 中示出的方案用 AIM 处理时得到的具有脂滴的细胞的数中 的脂滴直径的测定结果的一种示例的说明图。
     图 8A 是示出根据图 6A 中示出的方案用 AIM 处理时释放到培养上清液中的甘油的 量的测定结果的一种示例的说明图。
     图 8B 是示出根据图 6A 中示出的方案用 AIM 处理时释放到培养上清液中的游离脂 肪酸的量的测定结果的一种示例的说明图。
     图 9 是以模式化示出伴随脂肪细胞分化的主要的基因的表达模式的说明图。
     图 10 是示出根据图 5A 以及图 6A 中示出的方案用 AIM 处理的细胞中的基因表达 的分析结果的一种示例的说明图。
     图 11A 是示出对于脂肪细胞的 AIM 处理方案的一种示例的说明图。
     图 11B 是示出根据图 11A 中示出的方案用 AIM 或 FAS 抑制剂处理的细胞中的 FAS 酶活性的测定结果的一种示例的说明图。
     图 11C 是示出根据图 11A 中示出的方案用 AIM 或 FAS 抑制剂处理的细胞中的 FAS 酶活性的测定结果的另一种示例的说明图。
     图 12A 是示出对根据图 11A 中示出的方案用 AIM 或 FAS 抑制剂处理的细胞采用油 红 O 脂肪染色的结果的一种示例的说明图。
     图 12B 是示出对根据图 11A 中示出的方案用 AIM 或 FAS 抑制剂处理的细胞中的基 因表达的分析结果的一种示例的说明图。
     图 13A 是示出根据图 11A 中示出的方案用 AIM 或 FAS 抑制剂处理时释放到培养上
     清液中的甘油的量的测定结果的一种示例的说明图。
     图 13B 是示出根据图 11A 中示出的方案用 AIM 或 FAS 抑制剂处理时释放到培养上 清液中的游离脂肪酸的量的测定结果的一种示例的说明图。
     图 14 是示出证实添加有 HA 标签的 AIM 和添加有 FLAG 标签的 FAS 的结合的免疫 沉淀的结果的一种示例的说明图。
     图 15A 是示出用 AIM 处理并用抗 AIM 抗体染色的细胞的共焦显微镜照的一种示例 的说明图。
     图 15B 是示出用 AIM 处理并用抗 AIM 抗体染色的细胞的共焦显微镜照的另一种示 例的说明图。
     图 16A 是示出用 AIM 处理的细胞的免疫电子显微镜照的一种示例的说明图。
     图 16B 是示出用 AIM 处理的细胞的免疫电子显微镜照的另一种示例的说明图。
     图 17 是以模式化示出 AIM 内吞进入细胞内的机制的说明图。
     图 18A 是示出将采用 AIM 以及 CD36 双重染色的脂肪细胞通过共焦显微镜以二维 方式分析的结果的一种示例的说明图。
     图 18B 是示出将采用 AIM 以及 CD36 双重染色的脂肪细胞通过共焦显微镜以三维 方式分析的结果的一种示例的说明图。 图 18C 是示出将采用 AIM 以及 CD36 双重染色的脂肪细胞通过共焦显微镜以三维 方式分析的结果的另一种示例的说明图。
     图 18D 是示出将采用 AIM 以及 CD36 双重染色的脂肪细胞通过共焦显微镜以三维 方式分析的结果的又一个另一种示例的说明图。
     图 19A 是示出将不存在 CD36 中和抗体的情况下用 AIM 处理的细胞用抗 AIM 抗体 染色的结果的一种示例的说明图。
     图 19B 是示出将用 CD36 中和抗体的同时用 AIM 处理的细胞用抗 AIM 抗体染色的 结果的一种示例的说明图。
     图 20A 是示出拍摄 AIM-/- Adipo-/- 小鼠的腹腔内脂肪组织的照片的一种示例的说 明图。
     图 20B 是示出拍摄 AIM+/+ Adipo-/- 小鼠的腹腔内脂肪组织的照片的一种示例的说 明图。
     图 21A 是示出 AIM-/- Adipo-/- 小鼠以及 AIM+/+ Adipo-/- 小鼠的体重的测定结果的 一种示例的说明图。
     图 21B 是示出 AIM-/- Adipo-/- 小鼠以及 AIM+/+ Adipo-/- 小鼠的脂肪组织的重量的 测定结果的一种示例的说明图。
     图 22A 是示出给予 BSA 的小鼠的脂肪组织的显微镜观察结果的一种示例的说明 图。
     图 22B 是示出给予 AIM 的小鼠的脂肪组织的显微镜观察结果的一种示例的说明 图。
     图 23A 是示出用 HFD 喂食之前的 AIM-/- Adipo-/- 小鼠以及 AIM+/+ Adipo-/- 小鼠的 体重的测定结果的一种示例的说明图。
     图 23B 是示出用 HFD 喂食之后的 AIM-/- Adipo-/- 小鼠以及 AIM+/+ Adipo-/- 小鼠的
     体重的测定结果的一种示例的说明图。
     图 23C 是示出 AIM-/- Adipo-/- 小鼠以及 AIM+/+ Adipo-/- 小鼠的内脏脂肪的重量的 测定结果的一种示例的说明图。
     图 23D 是示出 AIM-/- Adipo-/- 小鼠以及 AIM+/+ Adipo-/- 小鼠的皮下脂肪的重量的 测定结果的一种示例的说明图。
     图 23E 是示出 AIM-/- Adipo-/- 小鼠以及 AIM+/+ Adipo-/- 小鼠的肝脏的重量的测定 结果的一种示例的说明图。
     图 24A 是示出用 HFD 喂食之前的 AIM-/- 小鼠以及 AIM+/+ 小鼠的体重的测定结果的 一种示例的说明图。
     图 24B 是示出用 HFD 喂食之后的 AIM-/- 小鼠以及 AIM+/+ 小鼠的体重的测定结果的 一种示例的说明图。
     图 24C 是示出 AIM-/- 小鼠以及 AIM+/+ 小鼠的内脏脂肪组织的重量的测定结果的一 种示例的说明图。
     图 24D 是示出 AIM-/- 小鼠以及 AIM+/+ 小鼠的皮下脂肪组织的重量的测定结果的一 种示例的说明图。 图 24E 是示出 AIM-/- 小鼠以及 AIM+/+ 小鼠的肝脏的重量的测定结果的一种示例的 说明图。
     图 25 是示出 AIM-/- 小鼠以及 AIM+/+ 小鼠的饲料摄入量的测定结果的一种示例的说 明图。
     图 26 是示出 AIM+/+ 小鼠以及 AIM-/- 小鼠的脂肪细胞的大小的测定结果的一种示例 的说明图。
     图 27A 是示出从 AIM+/+ 小鼠采集的内脏脂肪组织切片用 HE 染色而在相差显微镜 下观察的结果的一种示例的说明图。
     图 27B 是示出从 AIM-/- 小鼠采集的内脏脂肪组织切片用 HE 染色而在相差显微镜 下观察的结果的一种示例的说明图。
     图 28A 是示出 AIM+/+ 小鼠以及 AIM-/- 小鼠的体重的测定结果的一种示例的说明图。
     图 28B 是示出 AIM+/+ 小鼠以及 AIM-/- 小鼠的内脏脂肪组织的重量的测定结果的一 种示例的说明图。
     图 28C 是示出 AIM+/+ 小鼠以及 AIM-/- 小鼠的皮下脂肪组织的重量的测定结果的一 种示例的说明图。
     图 29A 是示出 AIM+/+ 小鼠以及 AIM-/- 小鼠的体温的测定结果的一种示例的说明图。
     图 29B 是示出 AIM+/+ 小鼠以及 AIM-/- 小鼠的耗氧速率的测定结果的一种示例的说 明图。
     图 29C 是示出 AIM+/+ 小鼠以及 AIM-/- 小鼠的饲料摄入量的测定结果的一种示例的 说明图。
     图 29D 是示出 AIM+/+ 小鼠以及 AIM-/- 小鼠的活动性的评价结果的一种示例的说明 图。
     图 30A 是示出给予 AIM 或者 BSA 的 AIM-/- 小鼠的体重的测定结果的一种示例的说 明图。
     图 30B 是示出给予 AIM 或者 BSA 的 AIM-/- 小鼠的内脏脂肪组织的重量的测定结果 的一种示例的说明图。
     图 30C 是示出给予 AIM 或者 BSA 的 AIM-/- 小鼠的皮下脂肪组织的重量的测定结果 的一种示例的说明图。
     图 31 是示出给予 AIM 或者 BSA 的 AIM-/- 小鼠的 mRNA 水平的评价结果的一种示例 的说明图。
     图 32 是示出确认体内 (in vivo) 的 AIM 和 FAS 结合的结果的一种示例的说明图。
     图 33A 是示出确认体外 (in vitro) 的 AIM 和 FAS 结合的结果的一种示例的说明 图。
     图 33B 是示出确认体外 (in vitro) 的 AIM 和 FAS 结合的结果的另一种示例的说 明图。
     图 34A 是示出二聚化的 FAS 以及各区域的主要功能的说明图。
     图 34B 是示出将 FAS 各区域用 Flag 序列标记， 并通过共沉淀试验研究该各区域与 用 HA 标记的 AIM 的结合的结果的一种示例的说明图。
     图 35A 是示出向野生型 CD36+/+ 小鼠从静脉注射 rAIM， 分析向脂肪组织的 rAIM 的 内吞的结果的一种示例的说明图。
     图 35B 是示出向 CD36-/- 小鼠从静脉注射 rAIM， 分析向脂肪组织的 rAIM 的内吞的 结果的一种示例的说明图。
     图 36A 是示出在相差显微镜下观察分化刺激前的 HMSC 的结果的一种示例的说明 图。
     图 36B 是示出在相差显微镜下观察 rhAIM 不存在下被分化刺激后的 HMSC 的结果 的一种示例的说明图。
     图 36C 是示出在相差显微镜下观察 rhAIM 存在下被分化刺激后的 HMSC 的结果的 一种示例的说明图。
     图 37 是示出 HMSC 中的 Glut-4 的 mRNA 水平的评价结果的一种示例的说明图。
     图 38 是示出采用抗小鼠 AIM 抗体对狗血清以及猫血清进行免疫印迹试验的结果 的一种示例的说明图。 具体实施方式
     以下， 说明本发明的一种实施方式。 需要说明的是， 本发明不受本实施方式的任何 限制。
     首先， 对于作为与本发明相关的蛋白质的巨噬细胞凋亡抑制因子 (Apoptosis Inhibitor of Macrophage， 以下称为 “AIM” 。)， 进行说明。
     AIM 在 其 氨 基 酸 序 列 中 存 在 保 守 的 三 个 SRCR(Scavenger Receptor Cysteine-Rich) 结构域 ( 从 N 末端依次称为 SRCR1、 SRCR2、 SRCR3。)， 是具有由该三个 SRCR 结构域串联的分子结构的分泌蛋白。
     本发明的发明人研究团队通过克隆小鼠基因， 构建基因敲除小鼠， 并基于分析结 果， 首次发表了由巨噬细胞特异性产生的、 作为具有抑制巨噬细胞的凋亡的功能的分泌 蛋 白 的 小 鼠 AIM( 文 献 1 ： Miyazaki， T. 等 Increased susceptibility of thymocytesto apoptosis in mice lacking AIM， a novel murine macrophage-derived soluble factor belonging to the scavenger receptor cysteine-rich domain superfamily. J Exp Med.189 ： 413-422， 1999. ； 文献 2 ： Haruta， I.， Kato， Y.， Hashimoto， E.， Minjares， C.， Kennedy， S.， Uto， H.， Yamauchi， K.， Kobayashi， M.， Yusa， S.， Muller， U.， Hayashi， N.& Miyazaki， T.Association of AIM， a novel apoptosis inhibitory factor， with hepatitis via supporting macrophage survival and enhancing phagocytotic function of macrophages.J.Biol.Chem.276 ： 22910-22914(2001).)。
     另一方面， 其他研究团队发表过人类基因序列的 “Spα” (Secretion proteinα) ( 文献 3 ： Gebe， J.A. 等 Molecular cloning， mapping to human chromosome 1 q21-q23， and cell binding characteristics of Spalpha， a new member of the scavenger receptor cysteine-rich(SRCR)family of proteins.J Biol Chem.272 ： 6151-6158， 1997.)。并且， 此后作为基因组测序工程的一环， 将该基因命名为 “Api6” 。而且， 由于具有三个 SRCR 结构 域的结构与 CD5 的细胞外结构域相似， 因此又将该基因命名为 “CD5L” 。 并且， 最近提出将这 些名称统一为 “CD5L” 。 但是， 从分子名称应当反映其功能的观点考虑， 将这些蛋白质名称均 统一为 “AIM” ， 应该更为恰当。 小鼠 AIM 是由示出在序列表 5 中的氨基酸序列构成的蛋白质。 并且， 人类 AIM 是由 示出在序列表 1 中的氨基酸序列构成的蛋白质。在此， 图 1 是将人类 AIM 氨基酸序列 ( 序 列表 1 中示出的氨基酸序列 ) 与 cDNA 碱基序列 ( 序列表 9 中示出的碱基序列 ) 相对应起 来而示出的。
     接着， 对 AIM 分子的特征进行说明。小鼠 AIM 原本是作为清道夫受体富含半胱氨 酸残基超家族 (Scavenger-Receptor Cysteine-Rich Super-Family， SRCR-SF) 的新组成员 而发现的， 是具有 54kDa 分子量的分子。
     图 2 中示出属于该 SRCR-SF 的分子的一种示例。如图 2 所示， AIM 分子由在属于 SRCR-SF 的组成员分子之间保守的富含半胱氨酸残基的三个 SRCR 结构域串联而成。
     该 AIM 虽然包含相比于作为最为靠近 N 末端侧的 SRCR 结构域的 SRCR1， 更靠近 N 末端侧的信号肽， 但是不包含相当于跨膜结构域或胞内结构域的部分， 在序列上是典型的 分泌蛋白。需要说明的是， 如图 2 所示， CD5 或 CD6 等具有三个相同的 SRCR 结构域的其他 SRCR-SF 的组成员属于跨膜蛋白。
     另外提一下， “SRCR-SF” 的名称是由于富含半胱氨酸残基的结构域在清道夫受体 中最初被记载而被命名的名称， 但并不是所有的包含该结构域的分子都具有清道夫功能。 实际上， 小鼠 AIM 不具有清道夫功能。
     小鼠 AIM 与人类 AIM 的氨基酸序列具有 68％的同源性。并且， 虽然小鼠 AIM 中包 含三个 N- 糖化位点， 但人类 AIM 中没有 N- 糖化位点。
     图 3 是将人类 AIM 氨基酸序列 ( 序列表 1 中示出的氨基酸序列的单字母标记 )、 小 鼠 AIM 氨基酸序列 ( 序列表 5 中示出的氨基酸序列的单字母标记 ) 以及它们共有的共有序 列相对应起来而示出的。在图 3 的六段中， 示出在最上段到第三段的用方框圈起来的部分 是 SRCR1 结构域的氨基酸序列 ( 涉及人类 AIM 的序列表 2 中示出的氨基酸序列以及涉及小 鼠 AIM 的序列表 6 中示出的氨基酸序列 )。 并且， 示出在第三段到第五段的用方框圈起来的 部分是 SRCR2 结构域的氨基酸序列 ( 涉及人类 AIM 的序列表 3 中示出的氨基酸序列以及涉
     及小鼠 AIM 的序列表 7 中示出的氨基酸序列 )。 并且， 示出在第五段到第六段的用方框圈起 来的部分是 SRCR3 结构域的氨基酸序列 ( 涉及人类 AIM 的序列表 4 中示出的氨基酸序列以 及涉及小鼠 AIM 的序列表 8 中示出的氨基酸序列 )。
     进一步地， 对于迄今为止了解到的 AIM 的功能进行说明。 AIM 的一部分功能在最初 分析基因敲除小鼠时即已明确 ( 上述文献 1)。即， 已经了解到虽然 AIM 基因缺失 (AIM-/-) 小鼠基本上没有出现异常， 但腹腔巨噬细胞中， 对于通过各种刺激而诱导的凋亡的抵抗性 -/低下。同样地， 如果用重组 AIM 分子处理 AIM 巨噬细胞， 则会提高凋亡抵抗性。即， 已经 明确 AIM 具有抑制巨噬细胞的凋亡的功能。
     对于 AIM 而言， 能够抑制的凋亡并不是通过限定的刺激而诱导的凋亡， 其能够作 用于通过 Fas/CD95、 放射线、 类固醇、 感染 ( 李斯特菌等 )、 氧化 LDL 等各种刺激而诱导的凋 亡。AIM 究竟通过什么样的机制抑制凋亡， 尚不明了。
     并且， 本发明的发明人对于这种 AIM 反复进行了专心研究， 其结果独立发现 AIM 发 挥以下意外的功能。 即， 抑制前脂肪细胞向成熟脂肪细胞的分化， 并且在成熟的脂肪细胞中 诱导脂滴分解 (lipolysis， 脂解作用 )。由此出发， 最终完成了本发明。
     而且， 令人惊讶的是， 虽然 AIM 已经被明确属于分泌蛋白， 但在细胞膜表面上表达 的 CD36 介导下内吞进入细胞质内， 由此发挥其功能。 该事实表明， AIM 仅特异性地作用于表达有 CD36 的细胞。即， 例如 AIM 对不表达 CD36 的脑神经系统的细胞不起作用。
     并且， 由于 AIM 是一种蛋白， 因此不会通过血脑屏障。从而， AIM 不会引起诸如由 于现有的将低分子物质作为有效成分的抗肥胖药物而引起的副作用 ( 例如， 厌食症 )。
     接着， 对本实施方式所涉及的药物组合物 ( 以下， 称为 “本药物组合物” 。) 进行说 明。本药物组合物作为有效成分而含有包含上述 AIM 的特定蛋白质 ( 以下， 称为 “本蛋白 质” 。)。
     即， 本药物组合物作为有效成分而包含下述的 (I) 或 (II) 的蛋白质， (I) 巨噬细 胞凋亡抑制因子 (AIM) ； (II) 由巨噬细胞凋亡抑制因子 (AIM) 的氨基酸序列经过缺失、 取代 或添加一个或多个氨基酸的与所述氨基酸序列具有同源性的氨基酸序列构成， 且具有抑制 前脂肪细胞向成熟脂肪细胞的分化的功能和 / 或在成熟脂肪细胞中诱导脂滴分解的功能 的蛋白质。在此， 所述 (I) 的蛋白质是天然 AIM， 而所述 (II) 的蛋白质是该天然 AIM 的变异 蛋白。
     本蛋白质是所述 (I) 的蛋白质或所述 (II) 的蛋白质， 是作为药物组合物的有效成 分而使用的蛋白质。 并且， 本蛋白质是例如在后述的任意疾病的诊断、 治疗或预防中所使用 的蛋白质。
     本药物组合物作为有效成分而包含例如人类或人类以外的动物 ( 以下， 仅称为 “动物” 。) 的 AIM。
     本蛋白质例如是由序列表 1 中示出的氨基酸序列构成的蛋白质。即， 此时， 本蛋白 质是人类的 AIM， 是具有抑制巨噬细胞凋亡的功能 ( 以下， 称为 “凋亡抑制功能” ) 的分泌蛋 白。
     并且， 本蛋白质例如是动物的 AIM。对于动物， 只要是人以外的动物， 没有特别限 制， 例如是哺乳动物 ( 例如， 小鼠、 大鼠、 天竺鼠等啮齿类 ； 兔； 狗； 猫； 猪； 牛； 马； 猴 )。 更加
     具体地， 本蛋白质例如是小鼠、 狗或猫的 AIM。
     本蛋白质例如是由序列表 5 中示出的氨基酸序列构成的蛋白质。即， 此时， 本蛋白 质是小鼠的 AIM， 是具有凋亡抑制功能的分泌蛋白。
     这些 AIM 例如可以利用基因重组技术而制备。即， 首先， 将序列表 9 中示出的人类 AIM 的 cDNA( 需要说明的是， 序列表 9 中示出的氨基酸序列中 3′末端的 “tag” 是终止密码 子。) 整合到适当的表达载体 (pCAGGS 等 )。接着， 将该表达载体导入到动物细胞株 (CHO 细胞、 293T 细胞等 )， 使该动物细胞产生人类 AIM。
     由于人类 AIM 属于分泌蛋白， 因此产生的重组人类 AIM 会被释放到培养上清液中。 从而， 例如， 可以通过在该人类 AIM 上添加 HA 等标签多肽 (9 ～ 12 个氨基酸 )， 利用固定有 针对该标签多肽的抗体的纯化柱， 从培养上清液纯化该人类 AIM。并且， 例如， 预先得到抗 AIM 抗体时， 还可以采用该抗 AIM 抗体， 从培养上清液纯化没有添加标签的人类 AIM。
     在此， 对于人以外的动物的 AIM， 也可以采用同样的方法制备 AIM。即， 例如， 对于 小鼠， 可以通过利用序列表 10 中示出的小鼠 AIM 的 cDNA( 需要说明的是， 序列表 10 中示出 的氨基酸序列中 3′末端的 “tga” 是终止密码子。)， 按照与制备上述的人类 AIM 时相同的 顺序， 得到重组小鼠 AIM。 并且， 对于其他的动物种 ( 例如， 狗、 猫 )， 例如， 也可以基于包含保守的 SRCR 结构 域、 具有三个该 SRCR 结构域串联的形态、 是分泌蛋白， 这三个特征， 从该其他动物种的 cDNA 文库中获得 AIM 的 cDNA， 按照与制备上述的人类 AIM 时相同的顺序， 得到重组 AIM。
     并且， 例如， 还可以从公知的数据库 ( 例如， National Center for Biotechnology Information(NCBI， 美国国家生物技术信息中心 ) 提供的数据库 ) 得到 AIM 的氨基酸序列。 具体而言， 例如， 将狗 AIM 的氨基酸序列示出在序列表 11 中， 将黑猩猩 AIM 的氨基酸序列示 出在序列表 12 中， 将大鼠 AIM 的氨基酸序列示出在序列表 13 中。
     进一步地， 对于在这些天然 AIM 的部分氨基酸序列中发生如后述的变异的 AIM 类 似蛋白质， 例如， 只要合成并使用对应的 cDNA， 就可以按照相同的顺序， 作为重组变异 AIM 而获得。
     并且， 对于本蛋白质而言， 在不损坏其抑制前脂肪细胞向成熟脂肪细胞的分化 的功能 ( 以下， 称为 “脂肪分化抑制功能” 。) 和 / 或在成熟脂肪细胞中诱导脂滴分解 (lipolysis， 脂解作用 ) 的功能 ( 以下， 称为 “脂解功能” 。) 的范围内， 可以使用在上述的 天然 AIM 的氨基酸序列中发生变异的蛋白质 (AIM 变异蛋白 )。
     即， 本药物组合物作为有效成分而包含例如人类或动物的 AIM 变异蛋白。
     如上所述， AIM 变异蛋白是由 AIM 氨基酸序列经过缺失、 取代或添加一个或多个氨 基酸的与所述氨基酸序列具有同源性的氨基酸序列构成， 且具有脂肪分化抑制功能和 / 或 脂解功能的蛋白质。
     在此， 对以下说明的 AIM 变异蛋白， 没有明确记载时， 也可以具有如下所述的特 征。即， AIM 变异蛋白也可以是分泌蛋白。并且， AIM 变异蛋白也可以具有凋亡抑制功能。 并且， AIM 变异蛋白也可以是其氨基酸序列所包含的氨基酸数目为 300 ～ 400 个， 优选为 320 ～ 380 个， 更优选为 340 ～ 360 个的蛋白质。
     并且， 当 AIM 变异蛋白的氨基酸序列与天然 AIM 的氨基酸序列具有 80％以上的同 源性时， 以及当 AIM 变异蛋白的结构域的氨基酸序列与天然 AIM 的结构域的氨基酸序列具
     有 80％以上的同源性时， 该同源性优选为 85％以上， 更优选为 90％以上， 尤其优选为 95％。
     并且， AIM 变异蛋白也可以是与 AIM 同样地在 CD36 介导下作用于细胞的蛋白质。 此时， AIM 变异蛋白与 AIM 同样地、 特异性地作用于含有 CD36 的细胞。并且， AIM 变异蛋白 也可以是与 AIM 同样地， 与细胞的脂肪酸合成酶 (FAS) 结合而降低该 FAS 的活性的蛋白质。
     本蛋白质例如是由序列表 1 中示出的氨基酸序列经过缺失、 取代或添加一个或多 个氨基酸的与序列表 1 中示出的氨基酸序列具有 80％以上的同源性的氨基酸序列构成， 且 具有脂肪分化抑制功能和 / 或脂解功能的蛋白质。
     本蛋白质也可以是分泌蛋白。此时， 本蛋白质包含分泌蛋白的特征氨基酸序列。 具体而言， 本蛋白质例如由具有以下分子结构的分泌蛋白形成 ： 在其氨基酸序列的 N 端 ( 最前部分 ) 包含疏水性的短的序列 (leader sequence， 前导序列 )， 但不包含跨膜序列 (transmembrane region， 跨膜区 ( 同样具有疏水性 ))、 细胞内结构域。 实际上， 天然 AIM 是 具有这种分子结构的分泌蛋白。并且， 本蛋白质也可以具有凋亡抑制功能。
     本蛋白质例如是由序列表 1 中示出的氨基酸序列经过缺失、 取代或添加一个或几 个氨基酸的氨基酸序列构成， 且具有脂肪分化抑制功能和 / 或脂解功能的蛋白质。
     此时， 本蛋白质是由与序列表 1 中示出的氨基酸序列具有 80％以上的同源性的氨 基酸序列构成的蛋白质。并且， 本蛋白质也可以是分泌蛋白。并且， 本蛋白质也可以具有凋 亡抑制功能。
     并且， 本蛋白质例如是由序列表 1 中示出的氨基酸序列经过缺失、 取代或添加一 个或多个氨基酸的氨基酸序列构成， 并且由序列表 2 中示出的氨基酸序列或者序列表 2 中 示出的氨基酸序列经过缺失、 取代或添加一个或多个氨基酸的与序列表 2 中示出的氨基酸 序列具有 80％以上的同源性的氨基酸序列构成的第一结构域、 由序列表 3 中示出的氨基酸 序列或者序列表 3 中示出的氨基酸序列经过缺失、 取代或添加一个或多个氨基酸的与序列 表 3 中示出的氨基酸序列具有 80％以上的同源性的氨基酸序列构成的第二结构域、 以及由 序列表 4 中示出的氨基酸序列或者序列表 4 中示出的氨基酸序列经过缺失、 取代或添加一 个或多个氨基酸的与序列表 4 中示出的氨基酸序列具有 80％以上的同源性的氨基酸序列 构成的第三结构域串联而成， 而且具有脂肪分化抑制功能和 / 或脂解功能的蛋白质。
     即， 该本蛋白质具有三个结构域， 即人类 AIM 的 SRCR1 结构域或者在该结构域中发 生变异的结构域、 SRCR2 结构域或者在该结构域中发生变异的结构域、 以及 SRCR3 结构域或 者在该结构域中发生变异的结构域。并且， 此时， 本蛋白质也可以是由与序列表 1 中示出的 氨基酸序列具有 80％以上的同源性的氨基酸序列构成的蛋白质。并且， 本蛋白质也可以是 分泌蛋白。并且， 本蛋白质也可以具有凋亡抑制功能。并且， 本蛋白质也可以是其氨基酸序 列所包含的氨基酸数目为 300 ～ 400 个， 优选为 320 ～ 380 个， 更优选为 340 ～ 360 个的蛋 白质。
     并且， 第一结构域、 第二结构域以及第三结构域中的至少一个结构域也可以是由 与该至少一个结构域对应的序列表中示出的氨基酸序列经过缺失、 取代或添加一个或多个 氨基酸的与该对应的序列表中示出的氨基酸序列具有 80％以上的同源性的氨基酸序列构 成的结构域。并且， 第一结构域、 第二结构域以及第三结构域也可以从 N 末端侧依次连接。
     而且， 本蛋白质例如是由序列表 2 中示出的氨基酸序列或者序列表 2 中示出的氨 基酸序列经过缺失、 取代或添加一个或几个氨基酸的氨基酸序列构成的第一结构域、 由序列表 3 中示出的氨基酸序列或者序列表 3 中示出的氨基酸序列经过缺失、 取代或添加一个 或几个氨基酸的氨基酸序列构成的第二结构域、 以及由序列表 4 中示出的氨基酸序列或者 序列表 4 中示出的氨基酸序列经过缺失、 取代或添加一个或几个氨基酸的氨基酸序列构成 的第三结构域串联而成， 且具有脂肪分化抑制功能和 / 或脂解功能的蛋白质。
     并且， 本蛋白质例如是由序列表 2 中示出的氨基酸序列构成的第一结构域 ( 人类 AIM 的 SRCR1 结构域 )、 由序列表 3 中示出的氨基酸序列构成的第二结构域 ( 人类 AIM 的 SRCR2 结构域 )、 以及由序列表 4 中示出的氨基酸序列构成的第三结构域 ( 人类 AIM 的 SRCR3 结构域 ) 串联而成， 且具有脂肪分化抑制功能和 / 或脂解功能的蛋白质。
     即， 该本蛋白质作为 SRCR 结构域具有三个结构域， 即人类 AIM 的 SRCR1 结构域、 SRCR2 结构域以及 SRCR3 结构域。并且， 此时， 本蛋白质也可以是由与序列表 1 中示出的氨 基酸序列具有 80％以上的同源性的氨基酸序列构成的蛋白质。并且， 本蛋白质也可以是分 泌蛋白。并且， 本蛋白质也可以具有凋亡抑制功能。并且， 本蛋白质也可以是其氨基酸序列 所包含的氨基酸数目为 300 ～ 400 个， 优选为 320 ～ 380 个， 更优选为 340 ～ 360 个的蛋白 质。
     并且， 具有上述的第一结构域、 第二结构域以及第三结构域的任意一种本蛋白质， 也可以是该第一结构域、 第二结构域以及第三结构域直接串联而成， 且具有脂肪分化抑制 功能和 / 或脂解功能的蛋白质。
     即， 此时， 本蛋白质是由第一结构域的氨基酸序列、 第二结构域的氨基酸序列以及 第三结构域的氨基酸序列直接串联而成的氨基酸序列构成的蛋白质。 因此， 此时， 本蛋白质 例如不包含相当于人类 AIM 中构成 SRCR1 结构域与 SRCR2 结构域之间的连接部分的氨基酸 序列、 构成该 SRCR2 结构域与 SRCR3 结构域之间的连接部分的氨基酸序列的、 结构域之间的 连接部分。但是， 包含上述的第一结构域、 第二结构域以及第三结构域的本蛋白质， 不限于 此， 也可以是包含结构域之间的连接部分的蛋白质。
     并且， 本蛋白质例如是由序列表 2 中示出的氨基酸序列或者序列表 2 中示出的氨 基酸序列中共有序列 ( 图 3 中示出的 SRCR1 结构域部分的共有序列 ) 以外的部分经过缺失、 取代或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列构成的第一结构域、 由序列表 3 中示出的氨基 酸序列或者序列表 3 中示出的氨基酸序列中共有序列 ( 图 3 中示出的 SRCR2 结构域部分的 共有序列 ) 以外的部分经过缺失、 取代或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列构成的第二 结构域、 以及由序列表 4 中示出的氨基酸序列或者序列表 4 中示出的氨基酸序列中共有序 列 ( 图 3 中示出的 SRCR3 结构域部分的共有序列 ) 以外的部分经过缺失、 取代或添加一个 或多个氨基酸的氨基酸序列构成的第三结构域串联而成， 且具有脂肪分化抑制功能和 / 或 脂解功能的蛋白质。
     即， 该本蛋白质具有三个结构域， 即人类 AIM 的 SRCR1 结构域或者在人类 AIM 的 SRCR1 结构域的共有序列以外的部分发生变异的结构域、 人类 AIM 的 SRCR2 结构域或者在 SRCR2 结构域的共有序列以外的部分发生变异的结构域、 以及人类 AIM 的 SRCR3 结构域或者 在 SRCR3 结构域的共有序列以外的部分发生变异的结构域。并且， 此时， 本蛋白质是由序列 表 1 中示出的氨基酸序列经过缺失、 取代或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列构成的蛋 白质。即， 本蛋白质也可以是由与序列表 1 中示出的氨基酸序列具有 80％以上的同源性的 氨基酸序列构成的蛋白质。并且， 本蛋白质也可以是分泌蛋白。并且， 本蛋白质也可以具有凋亡抑制功能。并且， 本蛋白质也可以是其氨基酸序列所包含的氨基酸数目为 300 ～ 400 个， 优选为 320 ～ 380 个， 更优选为 340 ～ 360 个的蛋白质。
     并且， 第一结构域、 第二结构域以及第三结构域中的至少一个结构域也可以是由 该至少一个结构域对应的序列表中示出的氨基酸序列中共有序列以外的部分经过缺失、 取 代或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列构成的结构域。 并且， 第一结构域、 第二结构域以 及第三结构域中的至少一个结构域也可以是由与该至少一个结构域对应的序列表中示出 的氨基酸序列具有 80％以上的同源性的氨基酸序列构成的结构域。 即， 第一结构域、 第二结 构域以及第三结构域中的至少一个结构域也可以是由该至少一个结构域对应的序列表中 示出的氨基酸序列中共有序列以外的部分经过缺失、 取代或添加一个或几个氨基酸的氨基 酸序列构成的结构域。并且， 第一结构域、 第二结构域以及第三结构域也可以从 N 末端侧依 次连接。
     并且， 具有上述的在共有序列以外的部分发生变异的第一结构域、 第二结构域以 及第三结构域的任意一种本蛋白质， 也可以是该第一结构域、 第二结构域以及第三结构域 直接串联而成， 且具有脂肪分化抑制功能和 / 或脂解功能的蛋白质。
     即， 此时， 本蛋白质是由第一结构域的氨基酸序列、 第二结构域的氨基酸序列以及 第三结构域的氨基酸序列直接串联而成的氨基酸序列构成的蛋白质。但是， 包含上述的在 共有序列以外的部分发生变异的第一结构域、 第二结构域以及第三结构域的本蛋白质， 不 限于此， 也可以是包含结构域之间的连接部分的蛋白质。 并且， 本蛋白质例如是下述的 (x1)、 (x2) 或 (x3) 蛋白质， 且具有脂肪分化抑制功 能和 / 或脂解功能的蛋白质。 (x1) 由序列表 2 中示出的氨基酸序列构成的第一结构域蛋白 或者多个所述第一结构域蛋白串联而成的蛋白质 ； (x2) 由序列表 3 中示出的氨基酸序列构 成的第二结构域蛋白或者多个所述第二结构域蛋白串联而成的蛋白质 ； (x3) 由序列表 4 中 示出的氨基酸序列构成的第三结构域蛋白或者多个所述第三结构域蛋白串联而成的蛋白 质。
     即， 此时， 本蛋白质例如是由人类 AIM 的 SRCR1 结构域构成的蛋白质 ( 第一结构域 蛋白 )， 或者多个该 SRCR1 结构域串联而成的蛋白质 ( 所述 (x1) 的蛋白质 )。并且， 本蛋白 质例如是由人类 AIM 的 SRCR2 结构域构成的蛋白质 ( 第二结构域蛋白 )， 或者多个该 SRCR2 结构域串联而成的蛋白质 ( 所述 (x2) 的蛋白质 )。并且， 本蛋白质例如是由人类 AIM 的 SRCR3 结构域构成的蛋白质 ( 第三结构域蛋白 )， 或者多个该 SRCR3 结构域串联而成的蛋白 质 ( 所述 (x3) 的蛋白质 )。
     并且， 同样地， 本蛋白质例如也可以是下述的 (y1)、 (y2) 或 (y3) 蛋白质， 且具有脂 肪分化抑制功能和 / 或脂解功能的蛋白质。(y1) 由序列表 2 中示出的氨基酸序列经过缺 失、 取代或添加一个或多个氨基酸的与序列表 2 中示出的氨基酸序列具有 80％以上的同源 性的氨基酸序列构成的第一结构域蛋白或者多个所述第一结构域蛋白串联而成的蛋白质 ； (y2) 由序列表 3 中示出的氨基酸序列经过缺失、 取代或添加一个或多个氨基酸的与序列表 3 中示出的氨基酸序列具有 80％以上的同源性的氨基酸序列构成的第二结构域蛋白或者 多个所述第二结构域蛋白串联而成的蛋白质 ； (y3) 由序列表 4 中示出的氨基酸序列经过缺 失、 取代或添加一个或多个氨基酸的与序列表 4 中示出的氨基酸序列具有 80％以上的同源 性的氨基酸序列构成的第三结构域蛋白或者多个所述第三结构域蛋白串联而成的蛋白质。
     并且， 同样地， 本蛋白质例如也可以是下述的 (z1)、 (z2) 或 (z3) 蛋白质， 且具有脂 肪分化抑制功能和 / 或脂解功能的蛋白质。 (z1) 由在序列表 2 中示出的氨基酸序列中共有 序列以外的部分经过缺失、 取代或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列构成的第一结构域 蛋白或者多个所述第一结构域蛋白串联而成的蛋白质 ； (z2) 由在序列表 3 中示出的氨基酸 序列中共有序列以外的部分经过缺失、 取代或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列构成的 第二结构域蛋白或者多个所述第二结构域蛋白串联而成的蛋白质 ； (z3) 由在序列表 4 中示 出的氨基酸序列中共有序列以外的部分经过缺失、 取代或添加一个或多个氨基酸的氨基酸 序列构成的第三结构域蛋白或者多个所述第三结构域蛋白串联而成的蛋白质。
     并且， 具有上述的第一结构域蛋白、 第二结构域蛋白或第三结构域蛋白的任意一 种本蛋白质， 也可以是多个该第一结构域蛋白、 第二结构域蛋白或第三结构域蛋白直接串 联而成的蛋白质。但是， 本蛋白质不限于此， 也可以是包含结构域之间的连接部分的蛋白 质。
     并且， 本蛋白质例如是由动物的 AIM 的氨基酸序列经过缺失、 取代或添加一个或 多个氨基酸的与该动物的 AIM 的氨基酸序列具有 80％以上的同源性的氨基酸序列构成， 且 具有脂肪分化抑制功能和 / 或脂解功能的蛋白质。 此时， 动物只要是人以外的动物， 没有特别限制， 例如是哺乳动物 ( 例如， 小鼠、 大 鼠、 天竺鼠等啮齿类 ； 兔； 狗； 猫； 猪； 牛； 马； 猴 )。更加具体地， 例如是小鼠、 狗或者猫。
     即， 本蛋白质例如是由序列表 5 中示出的氨基酸序列 ( 小鼠 AIM 的氨基酸序列 ) 经过缺失、 取代或添加一个或多个氨基酸的与序列表 5 中示出的氨基酸序列具有 80％以上 的同源性的氨基酸序列构成， 且具有脂肪分化抑制功能和 / 或脂解功能的蛋白质。
     此时， 本蛋白质也可以是分泌蛋白。并且， 本蛋白质也可以具有凋亡抑制功能。
     并且， 同样地， 本蛋白质例如是由序列表 11 中示出的氨基酸序列 ( 狗 AIM 的氨基 酸序列 )、 序列表 12 中示出的氨基酸序列 ( 黑猩猩 AIM 的氨基酸序列 ) 或者序列表 13 中示 出的氨基酸序列 ( 大鼠 AIM 的氨基酸序列 ) 经过缺失、 取代或添加一个或多个氨基酸的与 序列表 11、 序列表 12 或者序列表 13 中示出的氨基酸序列具有 80％以上的同源性的氨基酸 序列构成， 且具有脂肪分化抑制功能和 / 或脂解功能的蛋白质。
     进一步地， 本蛋白质例如是由动物的 AIM 的氨基酸序列经过缺失、 取代或添加一 个或几个氨基酸的氨基酸序列构成， 且具有脂肪分化抑制功能和 / 或脂解功能的蛋白质。
     此时， 动物只要是人以外的动物， 没有特别限制， 例如是哺乳动物 ( 例如， 小鼠、 大 鼠、 天竺鼠等啮齿类 ； 兔； 狗； 猫； 猪； 牛； 马； 猴 )。更加具体地， 例如是小鼠、 狗或者猫。
     即， 本蛋白质例如是由序列表 5 中示出的氨基酸序列 ( 小鼠 AIM 的氨基酸序列 ) 经过缺失、 取代或添加一个或几个氨基酸的氨基酸序列构成， 且具有脂肪分化抑制功能和 / 或脂解功能的蛋白质。
     此时， 本蛋白质例如是由与序列表 5 中示出的氨基酸序列具有 80％以上的同源性 的氨基酸序列构成的蛋白质。并且， 本蛋白质也可以是分泌蛋白。并且， 本蛋白质也可以具 有凋亡抑制功能。
     并且， 同样地， 本蛋白质例如是由序列表 11 中示出的氨基酸序列 ( 狗 AIM 的氨基 酸序列 )、 序列表 12 中示出的氨基酸序列 ( 黑猩猩 AIM 的氨基酸序列 ) 或者序列表 13 中示 出的氨基酸序列 ( 大鼠 AIM 的氨基酸序列 ) 经过缺失、 取代或添加一个或几个氨基酸的氨
     基酸序列构成， 且具有脂肪分化抑制功能和 / 或脂解功能的蛋白质。
     并且， 本蛋白质例如是由具有 SRCR1 结构域、 SRCR2 结构域以及 SRCR3 结构域的 动物的 AIM 的氨基酸序列经过缺失、 取代或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列构成， 并 且由该 SRCR1 结构域的氨基酸序列或者该 SRCR1 结构域的氨基酸序列经过缺失、 取代或添 加一个或多个氨基酸的与该 SRCR1 结构域的氨基酸序列具有 80％以上的同源性的氨基酸 序列构成的第一结构域、 由该 SRCR2 结构域的氨基酸序列或者该 SRCR2 结构域的氨基酸序 列经过缺失、 取代或添加一个或多个氨基酸的与该 SRCR2 结构域的氨基酸序列具有 80％以 上的同源性的氨基酸序列构成的第二结构域、 以及由该 SRCR3 结构域的氨基酸序列或者该 SRCR3 结构域的氨基酸序列经过缺失、 取代或添加一个或多个氨基酸的与该 SRCR3 结构域 的氨基酸序列具有 80％以上的同源性的氨基酸序列构成的第三结构域串联而成， 而且具有 脂肪分化抑制功能和 / 或脂解功能的蛋白质。
     此时， 本蛋白质也可以是由与动物的 AIM 的氨基酸序列具有 80％以上的同源性的 氨基酸序列构成的蛋白质。并且， 本蛋白质也可以是分泌蛋白。并且， 本蛋白质也可以具有 凋亡抑制功能。并且， 本蛋白质也可以是其氨基酸序列所包含的氨基酸数目为 300 ～ 400 个， 优选为 320 ～ 380 个， 更优选为 340 ～ 360 个的蛋白质。
     并且， 第一结构域、 第二结构域以及第三结构域中的至少一个结构域也可以是由 与该至少一个结构域对应的 SRCR 结构域的氨基酸序列经过缺失、 取代或添加一个或多个 氨基酸的与该对应的 SRCR 结构域的氨基酸序列具有 80％以上的同源性的氨基酸序列构成 的结构域。并且， 第一结构域、 第二结构域以及第三结构域也可以从 N 末端侧依次连接。
     此时， 动物只要是人以外的动物， 没有特别限制， 例如是哺乳动物 ( 例如， 小鼠、 大 鼠、 天竺鼠等啮齿类 ； 兔； 狗； 猫； 猪； 牛； 马； 猴 )。更加具体地， 例如是小鼠、 狗或者猫。
     即， 例如， 动物的 AIM 的氨基酸序列是序列表 5 中示出的氨基酸序列 ( 小鼠 AIM 的 氨基酸序列 )， SRCR1 结构域的氨基酸序列是序列表 6 中示出的氨基酸序列， SRCR2 结构域 的氨基酸序列是序列表 7 中示出的氨基酸序列， SRCR3 结构域的氨基酸序列是序列表 8 中 示出的氨基酸序列。
     并且， 同样地， 动物的 AIM 的氨基酸序列例如也可以是序列表 11 中示出的氨基酸 序列 ( 狗 AIM 的氨基酸序列 )、 序列表 12 中示出的氨基酸序列 ( 黑猩猩 AIM 的氨基酸序列 ) 或序列表 13 中示出的氨基酸序列 ( 大鼠 AIM 的氨基酸序列 )。
     进一步地， 本蛋白质例如是由所述 SRCR1 结构域的氨基酸序列或者该 SRCR1 结构 域的氨基酸序列经过缺失、 取代或添加一个或几个氨基酸的氨基酸序列构成的第一结构 域、 由所述 SRCR2 结构域的氨基酸序列或者该 SRCR2 结构域的氨基酸序列经过缺失、 取代或 添加一个或几个氨基酸的氨基酸序列构成的第二结构域、 以及由所述 SRCR3 结构域的氨基 酸序列或者该 SRCR3 结构域的氨基酸序列经过缺失、 取代或添加一个或几个氨基酸的氨基 酸序列构成的第三结构域串联而成， 且具有脂肪分化抑制功能和 / 或脂解功能的蛋白质。
     此时， 同样地， 动物只要是人以外的动物， 没有特别限制， 例如是哺乳动物 ( 例如， 小鼠、 大鼠、 天竺鼠等啮齿类 ； 兔； 狗； 猫； 猪； 牛； 马； 猴 )。 更加具体地， 例如是小鼠、 狗或者 猫。
     即， 本蛋白质例如是由序列表 6 中示出的氨基酸序列或者序列表 6 中示出的氨基 酸序列经过缺失、 取代或添加一个或几个氨基酸的氨基酸序列构成的第一结构域、 由序列表 7 中示出的氨基酸序列或者序列表 7 中示出的氨基酸序列经过缺失、 取代或添加一个或 几个氨基酸的氨基酸序列构成的第二结构域、 以及由序列表 8 中示出的氨基酸序列或者序 列表 8 中示出的氨基酸序列经过缺失、 取代或添加一个或几个氨基酸的氨基酸序列构成的 第三结构域串联而成， 且具有脂肪分化抑制功能和 / 或脂解功能的蛋白质。
     即， 该本蛋白质具有三个结构域， 即小鼠 AIM 的 SRCR1 结构域或者在该结构域中发 生变异的结构域、 SRCR2 结构域或者在该结构域中发生变异的结构域、 以及 SRCR3 结构域或 者在该结构域中发生变异的结构域。并且， 此时， 本蛋白质是由序列表 5 中示出的氨基酸序 列经过缺失、 取代或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列构成的蛋白质。 即， 本蛋白质也可 以是由与序列表 5 中示出的氨基酸序列具有 80％以上的同源性的氨基酸序列构成的蛋白 质。并且， 本蛋白质也可以是分泌蛋白。并且， 本蛋白质也可以具有凋亡抑制功能。并且， 本蛋白质也可以是其氨基酸序列所包含的氨基酸数目为 300 ～ 400 个， 优选为 320 ～ 380 个， 更优选为 340 ～ 360 个的蛋白质。
     并且， 本蛋白质例如是由所述 SRCR1 结构域的氨基酸序列构成的第一结构域、 由 所述 SRCR2 结构域的氨基酸序列构成的第二结构域、 以及由所述 SRCR3 结构域的氨基酸序 列构成的第三结构域串联而成， 且具有脂肪分化抑制功能和 / 或脂解功能的蛋白质。
     此时， 同样地， 动物只要是人以外的动物， 没有特别限制， 例如是哺乳动物 ( 例如， 小鼠、 大鼠、 天竺鼠等啮齿类 ； 兔； 狗； 猫； 猪； 牛； 马； 猴 )。 更加具体地， 例如是小鼠、 狗或者 猫。
     即， 本蛋白质例如是由序列表 5 中示出的氨基酸序列经过缺失、 取代或添加一个 或多个氨基酸的氨基酸序列构成， 并且由序列表 6 中示出的氨基酸序列构成的第一结构域 ( 小鼠 AIM 的 SRCR1 结构域 )、 由序列表 7 中示出的氨基酸序列构成的第二结构域 ( 小鼠 AIM 的 SRCR2 结构域 )、 以及由序列表 8 中示出的氨基酸序列构成的第三结构域 ( 小鼠 AIM 的 SRCR3 结构域 ) 串联而成， 且具有脂肪分化抑制功能和 / 或脂解功能的蛋白质。
     即， 该本蛋白质作为 SRCR 结构域具有三个， 即小鼠 AIM 的 SRCR1 结构域、 SRCR2 结 构域以及 SRCR3 结构域。并且， 此时， 本蛋白质也可以是由与序列表 5 中示出的氨基酸序列 具有 80％以上的同源性的氨基酸序列构成的蛋白质。即， 本蛋白质例如也可以是由序列表 5 中示出的氨基酸序列经过缺失、 取代或添加一个或几个氨基酸的氨基酸序列构成的蛋白 质。并且， 本蛋白质也可以是分泌蛋白。并且， 本蛋白质也可以具有凋亡抑制功能。并且， 本蛋白质也可以是其氨基酸序列所包含的氨基酸数目为 300 ～ 400 个， 优选为 320 ～ 380 个， 更优选为 340 ～ 360 个的蛋白质。
     并且， 具有上述的第一结构域、 第二结构域以及第三结构域的任意一种本蛋白质， 也可以是该第一结构域、 第二结构域以及第三结构域直接串联而成， 且具有脂肪分化抑制 功能和 / 或脂解功能的蛋白质。
     即， 此时， 本蛋白质是由第一结构域的氨基酸序列、 第二结构域的氨基酸序列以及 第三结构域的氨基酸序列直接串联而成的氨基酸序列构成的蛋白质。但是， 包含上述的第 一结构域、 第二结构域以及第三结构域的本蛋白质， 不限于此， 也可以是包含结构域之间的 连接部分的蛋白质。
     并且， 本蛋白质例如是由具有 SRCR1 结构域、 SRCR2 结构域以及 SRCR3 结构域的 动物的 AIM 的氨基酸序列经过缺失、 取代或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列构成， 并且由该 SRCR1 结构域的氨基酸序列或者在该 SRCR1 结构域的氨基酸序列中除了共有序列 以外的部分经过缺失、 取代或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列构成的第一结构域、 由 该 SRCR2 结构域的氨基酸序列或者在该 SRCR2 结构域的氨基酸序列中除了共有序列以外的 部分经过缺失、 取代或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列构成的第二结构域、 以及由该 SRCR3 结构域的氨基酸序列或者在该 SRCR3 结构域的氨基酸序列中除了共有序列以外的部 分经过缺失、 取代或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列构成的第三结构域串联而成， 而 且具有脂肪分化抑制功能和 / 或脂解功能的蛋白质。
     此时， 本蛋白质也可以是由与动物的 AIM 的氨基酸序列具有 80％以上的同源性的 氨基酸序列构成的蛋白质。并且， 本蛋白质也可以是分泌蛋白。并且， 本蛋白质也可以具有 凋亡抑制功能。并且， 本蛋白质也可以是其氨基酸序列所包含的氨基酸数目为 300 ～ 400 个， 优选为 320 ～ 380 个， 更优选为 340 ～ 360 个的蛋白质。
     并且， 第一结构域、 第二结构域以及第三结构域中的至少一个结构域也可以是由 在该至少一个结构域对应的 SRCR 结构域的氨基酸序列中共有序列以外的部分经过缺失、 取代或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列构成的结构域。 并且， 第一结构域、 第二结构域 以及第三结构域中的至少一个结构域也可以是由与该至少一个结构域所对应的 SRCR 结构 域的氨基酸序列具有 80％以上的同源性的氨基酸序列构成的结构域。 即， 第一结构域、 第二 结构域以及第三结构域中的至少一个结构域也可以是由在该至少一个结构域对应的 SRCR 结构域的氨基酸序列中共有序列以外的部分经过缺失、 取代或添加一个或几个氨基酸的氨 基酸序列构成的结构域。并且， 第一结构域、 第二结构域以及第三结构域也可以从 N 末端侧 依次连接。
     动物只要是人以外的动物， 没有特别限制， 例如是哺乳动物 ( 例如， 小鼠、 大鼠、 天 竺鼠等啮齿类 ； 兔； 狗； 猫； 猪； 牛； 马； 猴 )。更加具体地， 例如是小鼠、 狗或者猫。
     即， 本蛋白质例如是由序列表 6 中示出的氨基酸序列或者序列表 6 中示出的氨基 酸序列中共有序列 ( 图 3 中示出的 SRCR1 结构域部分的共有序列 ) 以外的部分经过缺失、 取代或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列构成的第一结构域、 由序列表 7 中示出的氨基 酸序列或者序列表 7 中示出的氨基酸序列中共有序列 ( 图 3 中示出的 SRCR2 结构域部分的 共有序列 ) 以外的部分经过缺失、 取代或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列构成的第二 结构域、 以及由序列表 8 中示出的氨基酸序列或者序列表 8 中示出的氨基酸序列中共有序 列 ( 图 3 中示出的 SRCR3 结构域部分的共有序列 ) 以外的部分经过缺失、 取代或添加一个 或多个氨基酸的氨基酸序列构成的第三结构域串联而成， 且具有脂肪分化抑制功能和 / 或 脂解功能的蛋白质。
     即， 该本蛋白质作为 SRCR 结构域具有三个， 即小鼠 AIM 的 SRCR1 结构域或者在小 鼠 AIM 的 SRCR1 结构域的共有序列以外的部分发生变异的结构域、 小鼠 AIM 的 SRCR2 结构 域或者在 SRCR2 结构域的共有序列以外的部分发生变异的结构域、 以及小鼠 AIM 的 SRCR3 结构域或者在 SRCR3 结构域的共有序列以外的部分发生变异的结构域。并且， 此时， 本蛋白 质可以是由与序列表 5 中示出的氨基酸序列具有 80％以上的同源性的氨基酸序列构成的 蛋白质。并且， 本蛋白质也可以是分泌蛋白。并且， 本蛋白质也可以具有凋亡抑制功能。并 且， 本蛋白质也可以是其氨基酸序列所包含的氨基酸数目为 300 ～ 400 个， 优选为 320 ～ 380 个， 更优选为 340 ～ 360 个的蛋白质。并且， 同样地， 动物的 AIM 的氨基酸序列例如也可以是序列表 11 中示出的氨基酸 序列 ( 狗 AIM 的氨基酸序列 )、 序列表 12 中示出的氨基酸序列 ( 黑猩猩 AIM 的氨基酸序列 ) 或序列表 13 中示出的氨基酸序列 ( 大鼠 AIM 的氨基酸序列 )。
     并且， 包含上述的在共有序列以外的部分发生变异的第一结构域、 第二结构域以 及第三结构域的任意一种本蛋白质， 也可以是该第一结构域、 第二结构域以及第三结构域 直接串联而成， 且具有脂肪分化抑制功能和 / 或脂解功能的蛋白质。
     即， 此时， 本蛋白质是由第一结构域的氨基酸序列、 第二结构域的氨基酸序列以及 第三结构域的氨基酸序列直接串联而成的氨基酸序列构成的蛋白质。但是， 包含上述的在 共有序列以外的部分发生变异的第一结构域、 第二结构域以及第三结构域的本蛋白质， 不 限于此， 也可以是包含结构域之间的连接部分的蛋白质。
     并且， 本蛋白质例如是下述的 (p1)、 (p2) 或 (p3) 蛋白质， 且具有脂肪分化抑制功 能和 / 或脂解功能的蛋白质。(p1) 由动物的 AIM 的 SRCR1 结构域的氨基酸序列构成的第一 结构域蛋白或者多个所述第一结构域蛋白串联而成的蛋白质 ； (p2) 由动物的 AIM 的 SRCR2 结构域的氨基酸序列构成的第二结构域蛋白或者多个所述第二结构域蛋白串联而成的蛋 白质 ； (p3) 由动物的 AIM 的 SRCR3 结构域的氨基酸序列构成的第三结构域蛋白或者多个所 述第三结构域蛋白串联而成的蛋白质。
     即， 此时， 本蛋白质例如是由动物 AIM 的 SRCR1 结构域构成的蛋白质 ( 第一结构域 蛋白 )， 或者多个该 SRCR1 结构域串联而成的蛋白质 ( 所述 (p1) 的蛋白质 )。并且， 本蛋白 质例如是由动物 AIM 的 SRCR2 结构域构成的蛋白质 ( 第二结构域蛋白 )， 或者多个该 SRCR2 结构域串联而成的蛋白质 ( 所述 (p2) 的蛋白质 )。并且， 本蛋白质例如是由动物 AIM 的 SRCR3 结构域构成的蛋白质 ( 第三结构域蛋白 )， 或者多个该 SRCR3 结构域串联而成的蛋白 质 ( 所述 (p3) 的蛋白质 )。
     并且， 同样地， 本蛋白质例如是下述的 (q1)、 (q2) 或 (q3) 蛋白质， 且具有脂肪分 化抑制功能和 / 或脂解功能的蛋白质。(q1) 由动物的 AIM 的 SRCR1 结构域的氨基酸序列 经过缺失、 取代或添加一个或多个氨基酸的与所述 SRCR1 结构域的氨基酸序列具有 80％以 上的同源性的氨基酸序列构成的第一结构域蛋白或者多个所述第一结构域蛋白直接串联 而成的蛋白质 ； (q2) 由动物的 AIM 的 SRCR2 结构域的氨基酸序列经过缺失、 取代或添加一 个或多个氨基酸的与所述 SRCR2 结构域的氨基酸序列具有 80％以上的同源性的氨基酸序 列构成的第二结构域蛋白或者多个所述第二结构域蛋白直接串联而成的蛋白质 ； (q3) 由 动物的 AIM 的 SRCR3 结构域的氨基酸序列经过缺失、 取代或添加一个或多个氨基酸的与所 述 SRCR3 结构域的氨基酸序列具有 80％以上的同源性的氨基酸序列构成的第三结构域蛋 白或者多个所述第三结构域蛋白直接串联而成的蛋白质。
     并且， 同样地， 本蛋白质例如是下述的 (r1)、 (r2) 或 (r3) 蛋白质， 且具有脂肪分化 抑制功能和 / 或脂解功能的蛋白质。(r1) 由动物的脂肪分化抑制功能和 / 或脂解功能的 SRCR1 结构域的氨基酸序列中共有序列以外的部分经过缺失、 取代或添加一个或多个氨基 酸的氨基酸序列构成的第一结构域蛋白或者多个所述第一结构域蛋白直接串联而成的蛋 白质 ； (r2) 由动物的脂肪分化抑制功能和 / 或脂解功能的 SRCR2 结构域的氨基酸序列中共 有序列以外的部分经过缺失、 取代或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列构成的第二结构 域蛋白或者多个所述第二结构域蛋白直接串联而成的蛋白质 ； (r3) 由动物的脂肪分化抑制功能和 / 或脂解功能的 SRCR3 结构域的氨基酸序列中共有序列以外的部分经过缺失、 取 代或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列构成的第三结构域蛋白或者多个所述第三结构 域蛋白直接串联而成的蛋白质。
     并且， 具有上述的第一结构域蛋白、 第二结构域蛋白或第三结构域蛋白的任意一 种本蛋白质， 也可以是多个该第一结构域蛋白、 第二结构域蛋白或第三结构域蛋白直接串 联而成的蛋白质。但是， 本蛋白质不限于此， 也可以是包含结构域之间的连接部分的蛋白 质。
     此时， 动物只要是人以外的动物， 没有特别限制， 例如是哺乳动物 ( 例如， 小鼠、 大 鼠、 天竺鼠等啮齿类 ； 兔； 狗； 猫； 猪； 牛； 马； 猴 )。更加具体地， 例如是小鼠、 狗或者猫。
     即， 例如， 当动物的 AIM 是小鼠 AIM 时， 所述 SRCR1 结构域的氨基酸序列是序列表 6 中示出的氨基酸序列， 所述 SRCR2 结构域的氨基酸序列是序列表 7 中示出的氨基酸序列， 所述 SRCR3 结构域的氨基酸序列是序列表 8 中示出的氨基酸序列。
     并且， 同样地， 动物的 AIM 的氨基酸序列例如也可以是序列表 11 中示出的氨基酸 序列 ( 狗 AIM 的氨基酸序列 )、 序列表 12 中示出的氨基酸序列 ( 黑猩猩 AIM 的氨基酸序列 ) 或序列表 13 中示出的氨基酸序列 ( 大鼠 AIM 的氨基酸序列 )。
     本药物组合物作为有效成分而包含上述的本蛋白质中的一种或多种。并且， 本药 物组合物可以进一步包含药学上可接受的载体。 对于药学上可接受的载体， 没有特别限制， 例如可以优选使用能够在抗体药学等所谓的蛋白质制剂中使用的载体。具体而言， 例如可 以使用在赋形剂、 溶剂、 稀释剂、 分散剂、 乳化剂、 助溶剂、 悬浮剂、 稳定剂、 等张剂、 缓冲剂、 pH 调节剂、 安抚剂、 防腐剂、 抗氧化剂中的一种或两种以上。
     对于本药物组合物的剂型， 没有特别限制， 例如可以制备成注射剂、 片剂、 丸剂、 胶 囊剂、 散剂、 颗粒剂、 液剂、 糖浆剂。即， 本医药组合物例如可以制备成注射到生物机体组织 内的局部注射剂 ； 注射到血管内的静脉注射剂、 动脉注射剂或者滴剂 ； 腹腔内给药的注射 剂。
     当本药物组合物为局部注射剂时， 本药物组合物例如可以制备成直接注射到脂肪 组织 ( 内脏脂肪组织、 皮下脂肪组织等 ) 的脂肪组织注射剂、 皮下注射剂、 肌肉注射剂。
     并且， 当本药物组合物为注射剂时， 本药物组合物例如可以将含有本蛋白质和上 述的药学上可接受的载体的溶液经过冷冻干燥等方法进行干燥， 制备成粉末状， 并于安瓶 等容器中无菌保存。在此， 本发明的发明人确认出 AIM 的功能不会因这种干燥以及再溶解 而被破坏。
     并且， 给予本药物组合物时， 将其粉末溶解于适当的溶剂 ( 例如， 生理盐水、 林格 氏溶液、 其他注射用溶液 ) 中， 由此配制出由将本蛋白质作为有效成分而包含的液状注射 剂形成的本药物组合物。 并且， 当本药物组合物为注射剂时， 例如还可以将含有本蛋白质和 上述的药学上可接受的载体的溶液直接无菌保存于安瓶等容器中。
     本药物组合物中的本蛋白质的含量， 根据剂型、 剂量等而适当地确定， 例如本药物 组合物可以被制备成包含 0.1 ～ 10 重量％的本蛋白质的液状注射剂。
     本药物组合物用于人或动物的疾病诊断、 治疗或预防中。动物只要是人以外的动 物， 没有特别限制， 但优选表达野生型 AIM， 其脂肪细胞表达 CD36 的动物。具体而言， 动物 例如是哺乳动物 ( 例如， 小鼠、 大鼠、 天竺鼠等啮齿类 ； 兔； 狗； 猫； 猪； 牛； 马； 猴 )， 更加具体地， 例如是小鼠、 狗或者猫。即， 本药物组合物例如用于人或人以外的哺乳动物 ( 例如， 小 鼠、 大鼠、 天竺鼠等啮齿类 ； 兔； 狗； 猫； 猪； 牛； 马； 猴 ) 的疾病诊断、 治疗或预防中， 更加具 体地， 例如用于人、 小鼠、 狗或者猫的疾病诊断、 治疗或预防中。
     即， 本药物组合物例如是给予人的药物组合物 ( 人用药物组合物 )。并且， 本药物 组合物例如是给予动物的药物组合物 ( 动物用药物组合物 )。动物只要是人以外的动物， 没有特别限制， 但优选表达野生型 AIM， 其脂肪细胞表达 CD36 的动物。具体而言， 动物例如 是哺乳动物 ( 例如， 小鼠、 大鼠、 天竺鼠等啮齿类 ； 兔； 狗； 猫； 猪； 牛； 马； 猴 )， 更加具体地， 例如是小鼠、 狗或者猫。即， 本药物组合物例如是给予人或人以外的哺乳动物 ( 例如， 小鼠、 大鼠、 天竺鼠等啮齿类 ； 兔； 狗； 猫； 猪； 牛； 马； 猴 ) 的药物组合物， 更加具体地， 例如是给予 人、 小鼠、 狗或者猫的药物组合物。
     在此， 对于成为本药物组合物适用对象的疾病， 应当广义地解释， 包括在生物机体 的结构或功能上有任意不适感的所有的状态。 即， 本药物组合物例如是为了诊断、 治疗或预 防代谢性疾病 (metabolic disorder， 代谢失调 )、 脂肪瘤 ( 肿瘤 )、 ( 包括神经的 ) 退化性 疾病而向生物机体给予的药物组合物。这些疾病领域中， 例如还包括诸如糖尿病、 肥胖症、 高血压、 动脉硬化等心血管疾病 ； 脂肪瘤。 更加具体地， 本药物组合物例如为了诊断、 治疗或预防与脂肪组织有关的不适感 而使用。 作为与脂肪组织有关的不适感， 例如可以举出肥胖、 脂肪肉瘤 (liposarcoma)。 即， 本药物组合物将消除或预防伴随肥胖而引起的不适感作为目的， 为了适当调节内脏脂肪和 / 或皮下脂肪的量而使用。并且， 本药物组合物为了缩小脂肪肉瘤或者抑制其增大而使用。 并且， 本药物组合物例如还可以将调节外形上能看到的期望的部位的脂肪组织的量作为目 的， 用于美容整形或整形外科上的治疗中。 即， 本药物组合物将减少脂肪组织、 抑制其增加、 降低其增加程度作为目的， 向生物机体给药。
     并且， 本实施方式所涉及的方法 ( 以下， 称为 “本方法” 。) 中的一个， 例如是向生 物机体给予有效量的本蛋白质的方法。即， 本方法是向生物机体给予上述的本药物组合物 的方法。
     在此， 生物机体例如是人。 并且， 生物机体例如是动物。 动物只要是人以外的动物， 没有特别限制， 但优选表达野生型 AIM， 其脂肪细胞表达 CD36 的动物。具体而言， 动物例如 是哺乳动物 ( 例如， 小鼠、 大鼠、 天竺鼠等啮齿类 ； 兔； 狗； 猫； 猪； 牛； 马； 猴 )， 更加具体地， 例如是小鼠、 狗或者猫。
     本方法例如是为了诊断、 治疗或者预防人或人以外的哺乳动物的疾病， 向该人或 人以外的哺乳动物给予对该诊断、 治疗或者预防有效的量的本蛋白质 ( 即， 本药物组合物 ) 的方法。
     对于本蛋白质的给药方法， 没有特别限制， 例如可以举出， 通过局部注射等的局部 给药、 通过静脉注射、 动脉注射、 点滴注射等的血管内给药、 口服给药。
     当将本蛋白质局部给药时， 例如， 将本药物组合物配制成注射剂， 利用注射器等局 部给药器具， 将该注射剂注射到生物机体的组织内。即， 例如以消除或预防肥胖、 美容整形 等作为目的， 将本药物组合物直接注射到内脏脂肪组织或皮下脂肪组织等脂肪组织内。并 且， 例如， 对于患有脂肪肉瘤的患者， 将本药物组合物局部注射到该脂肪肉瘤组织内。
     当将本蛋白质向血管内给药时， 将本药物组合物配制成注射剂， 并利用注射器、 输
     液器具等血管内给药器具， 将该注射剂注射到生物机体的血管内。当将本蛋白质口服给药 时， 将本药物组合物配制成诸如片剂、 丸剂、 胶囊剂、 散剂、 颗粒剂、 液剂、 糖浆剂等口服给药 剂， 并使患者服用该口服给药剂。在此， AIM 在 pH 值 2 ～ 3 左右的酸性条件下， 其分子结构 仍稳定， 不会丧失功能。
     如此， 可以通过将本蛋白质向生物机体内给药， 有效地减少该生物机体内的脂肪 组织的量， 抑制其增加或者降低其增加的程度。其中， 当将本蛋白质通过注射给药时， 尤其 是将本蛋白质向脂肪组织内局部给药时， 可以更加有效地减少该脂肪组织的量， 抑制其增 加或者降低其增加的程度。
     本蛋白质的剂量根据给药对象的症状、 年龄、 体重等因素而适当地确定， 例如一次 剂量可以是每 1kg 体重给予 0.1 ～ 5mg。 当然， 本蛋白质的剂量只要是在对减少作为给药对 象的生物机体的脂肪组织， 抑制其增加或者降低其增加的程度有效的范围内， 则不限于上 述剂量。 即， 例如局部给药时， 由于可以使本蛋白质有效且确实地到达该本蛋白质的作用部 位， 因此与血管内给药等全身给药时相比， 可以减少剂量。
     并且， 本蛋白质的给药方案同样也根据给药对象的症状、 年龄、 体重等因素而适当 地确定， 例如可以以 1 周～几周的间隔， 实施几周～几月多次给药。
     根据这种本蛋白质的给药， 该本蛋白质在到达的生物机体的脂肪组织内， 可以诱 导成熟脂肪细胞中的脂肪的分解， 并且还可以抑制前脂肪细胞向成熟脂肪细胞的分化。 即， 本药物组合物例如还可以称为前脂肪细胞的分化抑制剂或成熟脂肪细胞中的脂肪分解诱 导剂。 并且， 给予本蛋白质的结果， 得到减少生物机体的脂肪组织的量、 抑制其增加、 降低其 增加的程度的效果， 进而能够得到降低体重的效果。
     并且， 本方法只要是与本蛋白质的使用有关的， 不限于上述示例。即， 本方法例如 是将本蛋白质作为药物组合物的有效成分而使用的方法。并且， 本方法例如是将本蛋白质 作为有效成分含有的药物组合物的制备方法。此时， 本方法例如也可以是将本蛋白质与药 学上可接受的载体混合， 制备含有该本蛋白质和该载体的药物组合物的方法。
     并且， 本蛋白质还可以适用于食品饮料。即， 本实施方式所涉及的食品饮料 ( 以 下， 称为 “本食品饮料” 。) 是含有本蛋白质 ( 即， 所述 (I)AIM 或 (II) 由 AIM 的氨基酸序列 经过缺失、 取代或添加一个或多个氨基酸的、 与所述氨基酸序列具有同源性的氨基酸序列 构成， 且具有脂肪分化抑制功能和 / 或脂肪分解功能的蛋白质 ) 的食品饮料。即， 本食品饮 料例如是含有本蛋白质的食品。并且， 本食品饮料例如是含有本蛋白质的饮料。
     并且， 本食品饮料例如是含有本蛋白质的经口摄入组合物。该经口摄入组合物例 如是不制备成药物， 而是使需要者类似于维生素剂等机能增强剂辅助摄取的组合物， 例如 制备成片剂、 胶囊剂、 颗粒、 凝胶等形态。 并且， 本食品饮料例如是含有本蛋白质的食品饮料 用添加剂。 该食品饮料用添加剂例如是在食品饮料制造工艺中作为部分原料而使用或者添 加到原料中的组合物。
     并且， 与本食品饮料相关的本方法例如是将本蛋白质作为食品饮料的部分原料而 使用的方法。并且， 本方法是制造含有本蛋白质的食品饮料的方法。此时， 本方法例如也可 以是将本蛋白质与其他原料混合， 制造含有该本蛋白质和该其他原料的食品饮料的方法。
     在此， 记载本发明的一方面。本发明的一种实施方式所涉及的药物组合物是将作 为有效成分而含有以下的 (a) 至 (l) 中一种或多种蛋白质作为特征的药物组合物。(a) 由序列表 1 中示出的氨基酸序列构成的蛋白质 ； (b) 由序列表 5 中示出的氨基酸序列构成的 蛋白质 ； (c) 由序列表 1 中示出的氨基酸序列经过缺失、 取代或添加一个或几个氨基酸的氨 基酸序列构成， 且具有抑制前脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化的功能和 / 或在成熟脂肪细胞 中诱导脂滴分解的功能的蛋白质 ； (d) 由序列表 5 中示出的氨基酸序列经过缺失、 取代或 添加一个或几个氨基酸的氨基酸序列构成， 且具有抑制前脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化的 功能和 / 或在成熟脂肪细胞中诱导脂滴分解的功能的蛋白质 ； (e) 由序列表 1 中示出的氨 基酸序列经过缺失、 取代或添加一个或多个氨基酸的与该序列表 1 示出的氨基酸序列具有 80％以上的同源性的氨基酸序列构成， 且具有抑制前脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化的功能 和 / 或在成熟脂肪细胞中诱导脂滴分解的功能的蛋白质 ； (f) 由序列表 5 中示出的氨基酸 序列经过缺失、 取代或添加一个或多个氨基酸的与该序列表 5 示出的氨基酸序列具有 80％ 以上的同源性的氨基酸序列构成， 且具有抑制前脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化的功能和 / 或在成熟脂肪细胞中诱导脂滴分解的功能的蛋白质 ； (g) 由序列表 2 中示出的氨基酸序列 构成的第一结构域、 由序列表 3 中示出的氨基酸序列构成的第二结构域以及由序列表 4 中 示出的氨基酸序列构成的第三结构域串联而成， 且具有抑制前脂肪细胞向成熟脂肪细胞分 化的功能和 / 或在成熟脂肪细胞中诱导脂滴分解的功能的蛋白质 ； (h) 由序列表 6 中示出 的氨基酸序列构成的第一结构域、 由序列表 7 中示出的氨基酸序列构成的第二结构域以及 由序列表 8 中示出的氨基酸序列构成的第三结构域串联而成， 且具有抑制前脂肪细胞向成 熟脂肪细胞分化的功能和 / 或在成熟脂肪细胞中诱导脂滴分解的功能的蛋白质 ； (i) 由序 列表 2 中示出的氨基酸序列或者序列表 2 中示出的氨基酸序列经过缺失、 取代或添加一个 或几个氨基酸的氨基酸序列构成的第一结构域、 由序列表 3 中示出的氨基酸序列或者序列 表 3 中示出的氨基酸序列经过缺失、 取代或添加一个或几个氨基酸的氨基酸序列构成的第 二结构域以及由序列表 4 中示出的氨基酸序列或者序列表 4 中示出的氨基酸序列经过缺 失、 取代或添加一个或几个氨基酸的氨基酸序列构成的第三结构域串联而成， 且具有抑制 前脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化的功能和 / 或在成熟脂肪细胞中诱导脂滴分解的功能的 蛋白质 ； (j) 由序列表 6 中示出的氨基酸序列或者序列表 6 中示出的氨基酸序列经过缺失、 取代或添加一个或几个氨基酸的氨基酸序列构成的第一结构域、 由序列表 7 中示出的氨基 酸序列或者序列表 7 中示出的氨基酸序列经过缺失、 取代或添加一个或几个氨基酸的氨基 酸序列构成的第二结构域以及由序列表 8 中示出的氨基酸序列或者序列表 8 中示出的氨 基酸序列经过缺失、 取代或添加一个或几个氨基酸的氨基酸序列构成的第三结构域串联而 成， 且具有抑制前脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化的功能和 / 或在成熟脂肪细胞中诱导脂滴 分解的功能的蛋白质 ； (k) 由序列表 2 中示出的氨基酸序列或者在序列表 2 中示出的氨基 酸序列中共有序列以外的部分经过缺失、 取代或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列构成 的第一结构域、 由序列表 3 中示出的氨基酸序列或者在序列表 3 中示出的氨基酸序列中共 有序列以外的部分经过缺失、 取代或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列构成的第二结构 域以及由序列表 4 中示出的氨基酸序列或者在序列表 4 中示出的氨基酸序列中共有序列以 外的部分经过缺失、 取代或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列构成的第三结构域串联而 成， 且具有抑制前脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化的功能和 / 或在成熟脂肪细胞中诱导脂滴 分解的功能的蛋白质 ； (l) 由序列表 6 中示出的氨基酸序列或者在序列表 6 中示出的氨基 酸序列中共有序列以外的部分经过缺失、 取代或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列构成的第一结构域、 由序列表 7 中示出的氨基酸序列或者在序列表 7 中示出的氨基酸序列中共 有序列以外的部分经过缺失、 取代或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列构成的第二结构 域以及由序列表 8 中示出的氨基酸序列或者在序列表 8 中示出的氨基酸序列中共有序列以 外的部分经过缺失、 取代或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列构成的第三结构域串联而 成， 且具有抑制前脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化的功能和 / 或在成熟脂肪细胞中诱导脂滴 分解的功能的蛋白质。
     本发明的一种实施方式所涉及的方法的特征在于， 向生物机体给予所述药物组合 物。并且， 本发明的一种实施方式所涉及的方法的特征在于， 向生物机体给予所述 (a) 至 (l) 中一种或多种蛋白质的有效量。并且， 本发明的一种实施方式所涉及的方法的特征在 于， 将所述 (a) 至 (l) 中一种或多种蛋白质作为药物组合物的有效成分使用。并且， 本发明 的一种实施方式所涉及的方法的特征在于， 制备作为有效成分而含有所述 (a) 至 (l) 中一 种或多种蛋白质的药物组合物。并且， 本发明的一种实施方式所涉及的食品饮料的特征在 于， 含有所述 (a) 至 (l) 中一种或多种蛋白质。并且， 本发明的一种实施方式所涉及的方法 的特征在于， 制备含有所述 (a) 至 (l) 中一种或多种蛋白质的食品饮料。
     接着， 对本实施方式所涉及的具体实施例进行说明。
     实施例 1
     [ 脂肪组织中的巨噬细胞的 AIM 表达 ]
     对 C57BL/6 小鼠采用高脂饮食 (High Fat Diet ： HFD， 60 ％脂肪热量饲料 ) 喂养 20 周。并且， 同样也对肥胖程度更显著的脂联素 (adiponectin) 基因敲除小鼠 (Adipo-/- 小 鼠 )， 采用 HFD 喂养。然后， 从这些小鼠腹腔内部采集内脏脂肪组织。使用该脂肪组织制作 的石蜡切片用抗巨噬细胞单克隆抗体 (F4/80) 以及抗小鼠 AIM 多克隆抗体 (SA-1) 进行双 重染色。
     图 4 示出将染色的切片通过相差显微镜以及荧光显微镜观察的结果的一种示例。 图 4 中， 对于野生型的 C57BL/6 小鼠 (Wild-type) 以及 Adipo-/- 小鼠 (Adiponectin-/-)， 分 别示出相差显微镜照 (Phase)、 染色了巨噬细胞的荧光显微镜照 (F4/80 macrophage)、 染色 了 AIM 的荧光显微镜照 (AIM) 以及将这些荧光显微镜照合并的照片 (merge)。
     如图 4 所示， 可以确认， 在野生型小鼠以及 Adipo-/- 小鼠中， 均出现巨噬细胞染色 部分与 AIM 染色部分相重叠， 且浸润到脂肪组织的巨噬细胞强烈表达 AIM。
     实施例 2
     [AIM 的对脂肪细胞分化的抑制 ]
     为了研究浸润到脂肪组织的巨噬细胞所产生的 AIM 对周围的脂肪细胞起什么样 的作用， 进行了在 3T3L1 前脂肪细胞 (preadipocyte) 向成熟脂肪细胞分化的培养过程中用 AIM 处理的实验。
     即， 如图 5A 所示， 根据以下的互不相同的 4 种方案 a 至 d， 进行了 3T3L1 细胞的培 养。(a) 没有用 AIM 处理 ； (b) 从分化诱导刺激开始时起用 AIM 处理 10 天 (day2 ～ day12) ； (c) 仅在分化诱导前的增殖 (clonal expansion， 克隆增殖 ) 期间 (day(-2) ～ day2) 用 AIM 处理 ； (d) 仅在分化诱导刺激的初期 (day2 ～ day4) 用 AIM 处理。
     作为 AIM， 使用小鼠重组 AIM 蛋白质或者人类重组 AIM 蛋白质。这些重组 AIM 蛋白 质， 通过培养由小鼠或人类的 AIM 的表达载体转染的来源于人类的 HEK293T 细胞， 从该培养上清分离纯化而配制。其中， 在以下示出的其他实施例中， 作为 AIM 使用同样的重组 AIM 蛋 白质。AIM 处理， 通过在培养液中以 5μg/ml 浓度添加 AIM 而进行。
     并且， 如图 5A 所示， 3T3L1 细胞的分化诱导通过以下步骤进行 ： 首先， 培养 3T3L 1 细胞 4 天 (day(-2) ～ day2)， 使其增殖 (cell proliferation)， 然后在含有胰岛素、 地塞米 松 (DEX)、 3- 异丁基 -1- 甲基黄嘌呤 (IBMX) 的培养液中培养 2 天 (day2 ～ day4)， 由此开始 分化诱导刺激， 进一步地， 在含有胰岛素的培养液中培养 2 天 (day4 ～ day6)。
     分化诱导刺激期间 (day2 ～ day6) 过后， 在不含有这些分化诱导刺激因子的培养 液中继续培养。并且， 用油红 O(oil-red-o) 对从分化诱导刺激开始起第十天 (day12) 的细 胞进行染色， 观察从 3T3L1 细胞向成熟脂肪细胞的分化状况。
     图 5B 中示出， 分别对于四种方案 a ～ d， 用小鼠 AIM( 小鼠 rAIM) 或者人类 AIM( 人 类 rAIM) 处理的实验 ( 但是， 方案 a 是没有用 AIM 处理 ) 中得到的染色后的细胞的显微镜 照。其中， 对使用人类 AIM 的方案 c， 没有拍摄显微镜照 (N.D.)。
     如图 5B 所示， 根据方案 d 仅在分化诱导刺激的初期 (day2-day4) 用 AIM 处理时， 几乎没有观察到包含脂滴的细胞， 3T3L1 细胞的分化几乎完全被抑制住。即， AIM 在存在有 上述的分化诱导因子的情况下， 抑制 3T3L1 细胞的分化。
     在此需要说明的是， 配制包含有分化诱导因子和 AIM 的培养液之后， 利用纯化柱 从该培养液去除 AIM 时， 该分化诱导因子仍然没有丧失分化 3T3L1 细胞的能力 ( 没有示出 数据 )。因此， 认为分化诱导因子与 AIM 之间实质上不存在化学相互作用。
     并且， 根据方案 b 从分化诱导刺激开始时起用 AIM 处理 10 天 (day2-day12) 时， 也 几乎没有观察到包含脂滴的细胞， 3T3L1 细胞的分化几乎完全被抑制住。并且， 还确认出这 种 AIM 的分化抑制效果跟 AIM 浓度有关 ( 没有示出数据 )。即， 如果对 3T3L 1 细胞进行处 理的 AIM 的浓度减少到 1μg/ml、 0.1μg/ml， 则 AIM 的分化抑制效果也会下降。
     并且， 没有发现 AIM 的处理会增加死细胞数。因此， 认为 AIM 不会诱导细胞死亡， 而通过减少向成熟脂肪细胞分化的 3T3L1 细胞的数量来发挥分化抑制作用。
     另一方面， 根据方案 c 仅在分化诱导前 (day(-2)-day2) 用 AIM 处理时， 确认出与 根据方案 a 没有用 AIM 处理时同样地， 几乎所有的细胞包含有脂滴， 几乎所有的 3T3L1 细胞 分化成成熟脂肪细胞。即， 仅在分化诱导前使用 AIM 处理时， 3T3L1 细胞的向成熟脂肪细胞 的分化没有被抑制住。 但是， 从分化诱导前开始经过分化诱导期间且其后 (day(-2)-day12) 也继续用 AIM 处理时， 3T3L1 细胞的向脂肪细胞的分化完全被抑制住 ( 没有示出数据 )。
     在此， 小鼠 AIM 和人类 AIM 的氨基酸序列之间的同源性高达 68％左右。并且， 如 图 3 所示， 在小鼠 AIM 和人类 AIM 中， SRCR 结构域中的共有序列 (CD5、 CD6 等包含 SRCR 结 构域的其他分子中也保守的氨基酸序列 ) 完全一致。并且， 如上所述， 人类 AIM 与小鼠 AIM 同样地， 抑制作为来源于小鼠的细胞的 3T3L1 细胞的分化。即， 人与小鼠之间， 关于 AIM 功 能具有互换性。
     实施例 3
     [AIM 的脂滴分解 (lipolysis， 脂解作用 ) 的诱导 ]
     研究了对于成熟脂肪细胞的 AIM 的效果。 如图 6A 所示， 与上述的实施例 2 同样地， 作为方案 e 进行了以下培养实验。即， 从 3T3L1 细胞分化而在细胞质内形成脂滴开始用小 鼠 AIM 处理 6 天 (day6-day12)。并且， 用油红 O(oil-red-o) 对从分化诱导刺激开始起第十天 (day12) 的细胞进行 染色。 并且， 计算具有脂滴的细胞数。 进一步地， 对于具有脂滴的细胞， 测定脂滴的直径。 其 中， 为了进行比较， 对于通过上述的方案 a 培养的细胞以及通过方案 d 培养的细胞， 也进行 了细胞计数以及脂滴直径的测定。
     并且， 回收根据方案 e 用 AIM 处理而培养后的培养液的上清液， 通过 ELISA 法测定 包含在该上清液中的甘油以及游离脂肪酸 (free fatty acids， FFAs) 的量。并且， 为了进 行比较， 对于上述的方案 a， 同样也测定包含在培养上清液中的甘油以及游离脂肪酸的量。
     在此， 为了防止包含在培养液中的白蛋白吸附游离脂肪酸， 从分化诱导开始起的 第十天 (day 12) 时， 将 10％ FBS( 胎牛血清 ) 添加培养液换成无血清培养液， 将细胞进一步 在该无血清培养液中培养 6 小时， 然后测定包含在该无血清培养液的上清液中的甘油以及 游离脂肪酸。
     图 6B 中示出脂肪被油红 O 染色的细胞的显微镜照。图 7A 以及图 7B 中分别示 出对于方案 a、 d 以及 e(Exp.a， d， e)， 评价具有脂滴的细胞 (Droplet(+)cells) 的数 ( 个 4 2 /10 μm ) 以及脂滴的相对大小 ( 脂滴相对直径 )(％ ) 的结果。其中， 图 7B 中示出的脂滴 的相对大小是将在没有用 AIM 处理的方案 a 中得到的细胞所具有的脂滴的大小视为 100％ 而计算出的。图 8A 以及图 8B 中分别示出对于方案 a 以及 e(Exp.a， e)， 测定培养液中的甘 油浓度 ( 甘油释放量 )(mM) 以及游离脂肪酸浓度 (FFA 释放量 )(×10mM) 的结果。 如图 6B 以及图 7A 所示， 通过方案 e 用 AIM 处理分化后的脂肪细胞而继续培养时得 到的具有脂滴的细胞的数与通过方案 a 没有用 AIM 处理分化后的脂肪细胞而培养时相比， 显著减少。
     并且， 如图 7B 所示， 在方案 e 中得到的包含在脂肪细胞中的脂滴的直径与在方案 a 中得到的细胞中的相比， 缩小至约 25％。
     并且， 如图 8A 以及图 8B 所示， 根据方案 e 用 AIM 处理时， 与根据方案 a 没有用 AIM 处理时相比， 培养上清液中的甘油浓度以及游离脂肪酸浓度均显著增加。
     进一步地， 根据方案 e 用 AIM 处理时， 观察到用 AIM 处理后， 培养液的粘度急剧增 加。该观察结果支持培养液中的甘油以及游离脂肪酸的量显著增加的事实。
     如此， 确认出 AIM 诱导成熟脂肪细胞的脂解 (lipolysis)。从以上结果可以确 认， AIM 不仅抑制前脂肪细胞的分化以及成熟， 而且还作用于成熟的脂肪细胞而诱导脂解 (lipolysis)， 发挥使成熟脂肪细胞 “变瘦的功能” 。
     实施例 4
     [AIM 的对伴随脂肪细胞分化的基因群的表达的抑制 ]
     对于在上述的实施例 2 以及实施例 3 中通过上述的五种方案 a ～ e 培养的细胞， 在从分化诱导刺激开始起的第十天 (day12) 时， 进行回收， 通过定量 RT-PCR(QPCR) 分析伴 随脂肪化而表达的基因的表达量。
     在此， 图 9 中以模式化示出伴随脂肪细胞分化的主要的基因的表达模式。 如图 9 的 左侧的虚线方框内示出的那样， 在分化诱导期， 基于分化诱导刺激， 暂时诱导 C/EBPβ， 据此 C/EBPα， 其次 PPARγ 的表达被上调。 进一步地， 因 PPARγ 而诱导诸如脂肪酸合成酶 (Fatty acid synthase， FAS)、 CD36、 葡萄糖转运蛋白 4(Glucose transporter 4， Glut4) 等对于分 化的脂肪细胞必须的功能性基因的表达。
     此后， 如果 C/EBPα 以下的基因表达一定程度被上调， 则如图 9 的右侧的虚线方框 内示出的那样， 根据 FAS 而产生的脂肪酸 (fatty acids， FAs) 活化 PPARγ 蛋白质， 其使 C/ EBPα 基因的表达维持在一定水平。C/EBPα 进一步诱导 PPARγ 基因的表达。根据这种交 互刺激， 即使 C/EBPβ 的表达水平已下调， 也形成维持 PPARγ 以及 C/EBPα 的表达的机制 ( 参照图 9 的右侧的虚线方框 )。
     图 10 中示出通过五种方案 a ～ e 培养的细胞中的基因表达的分析结果。如图 10 所示， 根据方案 d 仅在分化诱导刺激的初期 (day2-day4) 用 AIM( 小鼠 AIM， 本实施例 4 中以 下相同 ) 处理时以及根据方案 b 从分化诱导刺激开始用 AIM 处理 10 天 (day2-day12) 时， C/EBPα、 PPARγ、 CD36、 Glut4 各基因的表达几乎完全被抑制。其中， 非常有趣的是， 在这些 情况下， 只有 FAS 基因表达反而稍微上调。
     另一方面， 根据方案 c 仅在分化诱导前 (day(-2)-day2) 用 AIM 处理时以及根据方 案 e 仅在细胞分化诱导后 (day6-day12) 用 AIM 处理时， 与根据方案 a 没有用 AIM 处理时比 较， 基因表达模式没有出现变化。如此， 对于 FAS 基因表达以外的基因， 基于 AIM 处理的表 达调控的实验结果与上述实施例 2 中的细胞形态学上的变化结果相匹配。
     实施例 5
     [AIM 的对 FAS 酶活性的抑制 ]
     研究 AIM 是否对 FAS 的酶活性产生影响。即， 如图 11A 所示， 根据上述的方案 d 仅 在 3T3L1 细胞的分化诱导初期 (day2-day4) 用 AIM( 小鼠 AIM， 本实施例 5 中以下相同 ) 处 理， 然后从分化诱导开始经过 2 天后 (day4)， 回收细胞， 配制细胞裂解液 (cell lysate)， 测 定 FAS 的酶活性。
     并且， 作为与上述的方案 e 相似的方案 f， 在 3T3L1 细胞分化之后用 AIM 处理 4 天 (day8-day12)， 然后从分化诱导开始起十天后 (day12)， 回收细胞， 配制细胞裂解液 (cell lysate)， 测定 FAS 的酶活性。其中， FAS 的酶活性基于丙二酸单酰辅酶 A(malonyl-CoA) 消 耗量进行测定。
     并且， 代替 AIM 而使用 FAS 抑制剂 (C75)， 根据方案 d 以及 f 用 25μM 浓度的该 FAS 抑制剂处理， 与上述 AIM 的情形同样地， 从分化诱导开始经过 2 天后 (day4， 方案 d) 以及 10 天后 (day12， 方案 f)， 回收细胞， 测定 FAS 的酶活性。
     进一步地， 为了进行比较， 对于根据上述方案 a 没有用 AIM 处理而培养的细胞， 也 分别在分化诱导开始经过 2 天后 (day4) 以及 10 天后 (day12) 的时间， 同样测定 FAS 的酶 活性。
     图 11B 以及图 11C 中示出 FAS 的酶活性 (Fatty acid synthase activity， 脂肪酸 合成酶活性 )(nmol NADPH/min/mg 蛋白质 ) 的测定结果。图 11B 中分别示出对于根据方案 a 没有用 AIM 处理时 (None)、 根据方案 d 用 AIM 处理时 (AIM(5μg/ml))、 根据方案 d 用 FAS 抑制剂处理时 (C75(25μM))， 从分化诱导开始经过 2 天后 (day4) 得到的结果。图 11C 中 分别示出对于根据方案 a 没有用 AIM 处理时 (None)、 根据方案 f 用 AIM 处理时 (AIM(5μg/ ml))、 根据方案 f 用 FAS 抑制剂处理时 (C75(25μM))， 从分化诱导开始经过 10 天后 (day12) 得到的结果。
     如图 11B 以及图 11C 所示， 任意一种方案中， 用 AIM 处理时与没有用 AIM 处理时相 比， FAS 的酶活性均显著下降。该 AIM 降低 FAS 的酶活性的程度与用作为 FAS 抑制剂的 C75的有效浓度 (25μM) 处理时相同。
     并且， 图 12A 以及图 12B 中分别示出对于根据方案 a 没有用 AIM 处理时 (None)、 根 据方案 d 用 AIM 处理时 (AIM(5μg/ml))、 根据方案 d 用 FAS 抑制剂处理时 (C75(25μM))， 分别从分化诱导开始经过 2 天后 (day4)， 进行细胞的油红 O 染色以及基因表达的 RT-PCR 分 析的结果。
     并且， 图 13A 以及图 13B 中分别示出对于根据方案 a 没有用 AIM 处理时 (None)、 根据方案 f 用 AIM 处理时 (AIM)、 根据方案 f 用 FAS 抑制剂处理时 (C75)， 从分化诱导开始 经过 10 天后 (day12)， 测定培养液中的甘油浓度 ( 甘油释放量 )(mM) 以及游离脂肪酸浓度 (FFA 释放量 )(×10mM) 的结果。
     如这些图 12A、 图 12B、 图 13A 以及图 13B 所示， 用 AIM 处理时和用 FAS 抑制剂 (C75) 处理时， 发现对于细胞的形态、 基因表达、 甘油以及游离脂肪酸的细胞外释放， 具有相同的 效果。即， 在前脂肪细胞的分化以及成熟脂肪细胞中的脂解作用 (lipolysis) 这两个方面， AIM 表现出与 C75 相同的效果。
     在上述的实施例 4 中只有 FAS 基因的表达没有被 AIM 抑制的原因， 认为是根据 AIM 的 FAS 功能抑制， 可能出现了负反馈 (negative feedback)， 根据 PPARγ 以外的表达调控系 统 ( 例如， 基于 LXR-SREBP1 系统的调控等 )， FAS 基因的表达被上调。
     并且， 认为如果对成熟脂肪细胞用 AIM 处理， 以抑制 FAS 功能， 则由于内源性的游 离脂肪酸 (FFAs) 的量会下降， 因此作为对游离脂肪酸 (FFAs) 的量下降的反馈， 诱导脂解作 用 (lipolysis)， 从而调节 FFAs 的量。
     实施例 6
     [ 脂肪细胞内的 AIM 和 FAS 的结合 ]
     细胞中的 FAS 活性调节， 并不是根据磷酸化等蛋白修饰而进行的， 而主要是根据 表达调控和分子结构调节而进行的。 通过 AIM 处理， 即使 FAS 的活性降低， 在 FAS 的表达上， 如上所述， 并没有确认出在 mRNA 水平、 蛋白质的量中的任意一方面的下调。因此， 作为一种 可能性， 认为 AIM 与 FAS 结合， 在结构上抑制其活性。
     为此， 为了证实上述的假设， 首先， 构建均表达添加有 HA 标签的 AIM( 小鼠 AIM) 和 添加有 FLAG 标签的 FAS 的 HEK293T 细胞。并且， 将该 HEK293T 细胞培养预定时间之后， 回 收， 配制细胞裂解液 (cell lysate)， 采用抗 FLAG 抗体进行免疫沉淀。
     其结果， 如图 14 所示， 确认出添加有 HA 标签的 AIM(HA-AIM) 和添加有 FLAG 标签 的 FAS(FL-FAS) 的共沉淀。即， 可以确认存在 AIM 与 FAS 结合的可能性。该结果支持上述 的假设。
     实施例 7
     [AIM 的向脂肪细胞的内吞 ]
     AIM 是由巨噬细胞分泌的可溶性蛋白。 通常， 分泌蛋白分子与存在于靶细胞的膜表 面的受体结合， 引起信号转导， 由此功能性地作用于靶细胞。然而， 如上所述， 要想使 AIM 与 FAS 结合而抑制其活性， AIM 作为分子需要内吞进入到细胞内。
     为了证明上述观点， 与上述的其他实施例同样地， 分化诱导 3T3L1 细胞， 从分化诱 导后的培养第四天 (day4) 起用 AIM( 小鼠 AIM)(5μg/ml) 处理 3 小时。然后， 回收细胞， 用 抗 AIM 抗体对细胞内进行染色。在此， 进一步地对细胞核采用 DAPI 进行染色。图 15A 以及图 15B 示出用 AIM 处理培养 3 小时后染色的细胞在共焦显微镜下观察 的结果的一种示例。图 15A 示出用 200 倍的倍数， 图 15B 示出用 400 倍的倍数拍摄的结果。 如图 15A 以及图 15B 所示， 确认出 AIM 以圆点 (dot) 状 ( 在原图中呈红色 ) 内吞到细胞质 内。
     进一步地， 通过采用胶体金标记的抗 AIM 抗体的免疫电子显微镜法， 确认 AIM 内吞 到脂肪细胞的现象。图 16A 以及图 16B 中分别示出用 AIM 处理后培养 3 小时 (3hr) 以及 12 小时 (overnight， 过夜 ) 的细胞的免疫电子显微镜照。图 16A 示出从用 AIM 处理经过 3 小 时 (3hr) 后回收的细胞， 图 16B 示出从用 AIM 处理经过 12 小时后回收的细胞的结果。
     如图 16A 所示， 在 AIM 的存在下培养 3 小时的细胞的细胞质内， AIM 以圆点状聚集 在被认为是内涵体 (endosome) 的粒子 (particle) 的膜上。这认为是 AIM 与脂肪细胞表面 的某种分子结合， 并以结合的状态与该表面分子一同内吞 (Endocytosis) 到细胞内而出现 的现象。
     并且， 如图 16B 所示， 在 AIM 的存在下培养 12 小时的细胞的细胞质内， 内涵体 (endosome) 变性， 从此处还可以观察到 AIM 进入到细胞质中。其中， AIM 没有聚集在吞噬体 (Phagosome)、 吞噬溶酶体 (Phagolysosome) 或者线粒体 (mitochondria) 上。图 17 以模式 化示出基于这些观点推测的 AIM 内吞进入细胞内的机制。
     实施例 8
     [ 细胞表面的 CD36 分子介导下的 AIM 内吞 (internalization)]
     如上所述， 认为 AIM 在细胞表面分子的介导下内吞到细胞内。因此， 认定了该细胞 表面分子。
     CD36 是二次跨膜分子， 在脂肪细胞或巨噬细胞中表达， 参与包括脂肪酸、 LDL 等的 多种分子的细胞内内吞。因此， 构建超表达 C 端上添加有 FLAG 标签的小鼠 CD36 的 HEK293 细胞， 将该细胞与小鼠 AIM 一同培养 3 小时。然后， 回收细胞， 采用抗 AIM 抗体以及抗 CD36 抗体染色， 通过共焦显微镜观察。
     图 18A 至图 18D 中示出得到的共焦显微镜照。图 18 示出以二维方式分析的结果 (2-dimensional analysis， 二维分析 )， 图 18B 至图 18D 分别示出以三位方式分析的结果 (3-dimensional analysis， 三位分析 )。如图 18A 至图 18D 所示， 如果以二维以及三位方 式进行分析， 则观察到， 在细胞的表达有 CD36 的部位 ( 原图中 FLAG 以红色表示 ) 上结合有 AIM 圆点 (dot)( 原图中以绿色表示 ) 的形态。并且， 在部分细胞上， 还观察到 AIM 内吞到细 胞内的形态。从这些结果认为， AIM 与 CD36 结合， 内吞 (internalize) 到细胞内。
     但是， 本次使用的 HEK293T 细胞中， 主要观察到的是 AIM 存在于细胞表面的形态， 与上述的实施例 7 的脂肪细胞 ( 分化的 3T3-L1 细胞 ) 相比， 几乎没有观察到 AIM 进入到细 胞内的形态。 其原因认为是， HEK293T 细胞与脂肪细胞相比， 内吞 (endocytosis) 能力较弱， 因此与 CD36 结合的 AIM 容易以结合的状态停留在细胞表面上。
     并且， 进一步地， 为了确认 AIM 在 CD36 介导下内吞的事实， 用 AIM 处理通过上述的 分化诱导而分化的 3T3L1 脂肪细胞时， 同时用抑制与 CD36 的配体 (ligand) 结合的中和抗 体处理。然后， 回收培养的 3T3L1 脂肪细胞， 用抗 AIM 抗体染色。并且， 对没有用 CD36 中和 抗体处理而仅用 AIM 进行同样的处理而培养的 3T3L 1 脂肪细胞， 也进行同样的染色。
     图 19A 以及图 19B 分别示出没有用 CD36 中和抗体处理时 (no CD36 antibody， 无CD36 抗体 ) 以及用 CD36 中和抗体处理时 (with CD36 neutralizing antibody， 使用 CD36 中和抗体 ) 的染色结果。如图 19A 所示， 没有用 CD36 中和抗体处理时， 可以观察到 AIM 内 吞到细胞内的现象 ( 原图中 AIM 在细胞内以红色的圆点状被检测出 )。另一方面， 如图 19B 所示， 当用 CD36 中和抗体处理时， 细胞内完全没有被抗 AIM 抗体染色， 没有观察到 AIM 的内 吞。
     即， 由于用 CD36 中和抗体进行处理， 因此向细胞内的 AIM 的内吞被显著地抑制住。 从以上结果可以明确， 负责向脂肪细胞的 AIM 的内吞作用的至少一种分子是 CD36。
     实施例 9
     [AIM 缺失小鼠的体重以及脂肪量的增加 ]
     从上述的实施例中得到的实验结果可以明确， AIM 抑制前脂肪细胞的成熟以及分 化， 并且诱导成熟的脂肪细胞中发生脂解作用 (lipolysis)。因此， 为了研究该作用在生物 -/机体内的效果， 对 AIM 被敲除的 AIM 缺失小鼠 (AIM 小鼠 ) 以及 AIM 没有被敲除的正常的 +/+ 小鼠 (AIM 小鼠 )， 采用高脂饮食 (HFD) 喂养 20 周以上， 测定体重和内脏白色脂肪的重量。 -/+/+ 其结果， AIM 缺失的 AIM 小鼠与 AIM 小鼠相比， 体重以及内脏白色脂肪的重量的增加有 意义地被加剧 ( 没有示出数据 )。
     进 一 步 地， 为 了 增 强 肥 胖 的 发 展 效 果， 将上述的两种小鼠分别与脂联素 -/(adiponectin) 基 因 敲 除 小 鼠 (Adipo 小 鼠 ) 交 配， 构 建 AIM-/- Adipo-/- 小 鼠 和 AIM+/+ Adipo-/- 小鼠。并且， 对这些小鼠同样采用 HFD 处理 20 周以上， 进行分析。 -/-/
     图 20A 以 及 图 20B 分 别 示 出 拍 摄 AIM Adipo 小 鼠 (AIM-/-) 以 及 AIM+/+ Adipo-/- 小鼠 (AIM+/+) 的腹腔内的照片。在图 20A 中， 上侧的箭头表示肠粘膜脂肪组织， 下 +/+ -/侧的箭头表示附睾脂肪组织。图 21A 以及图 21B 分别示出 AIM Adipo 小鼠 (WT) 以及 -/-/AIM Adipo 小鼠 (KO) 的体重 (Body weight(g)) 以及内脏白色脂肪组织的重量 (Total fat tissue(g)， 总脂肪组织 (g)) 的测定结果。
     如图 21A 以及图 21B 所示， 与上述的没有被敲除脂联素基因的小鼠同样地， AIM 缺 -/-/+/+ -/失的 AIM Adipo 小鼠与 AIM Adipo 小鼠相比， 体重以及内脏白色脂肪重量的增加被 加剧。这种体重增加的加剧， 主要是由于脂肪组织重量增加的加剧而引起的。
     这些结果支持以下结论。即， 由浸润到脂肪组织的巨噬细胞分泌的 AIM 在周围的 脂肪细胞中， 通过降低 FAS 活性， 诱导脂解作用 (lipolysis)， 同时抑制新的成熟脂肪细胞 的分化， 由此抑制性地调节脂肪组织的量 (mass)。
     并 且， 有 报 道 指 出， 对 于 小 鼠 给 予 FAS 抑 制 剂 (C75)， 会降低下丘脑的神经肽 Y(NPY) 的产生量， 引起显著的食欲减退以及体重减少。
     与此相比， AIM-/- 小鼠和 AIM+/+ 小鼠之间在摄入量 (Food intake) 上没有出现差 异。因此， 本次的 AIM 给予实验中， 不存在如同全身给予上述的 FAS 抑制剂 (C75) 时出现的 -/对于脑神经系统的作用， 在 AIM 小鼠中出现的脂肪量的增加， 认为是 AIM 的缺失直接对脂 肪细胞引起影响的结果。
     这认为是， 由于 AIM 需要在不包含于下丘脑的细胞中， 而包含于脂肪细胞中的作 为特异性的内吞中介物 (endocytosis mediator) 的 CD36 的存在下， 发挥作用的结果。
     实施例 10
     [ 向肥胖小鼠给予 AIM 而引起的脂解 (Lipolysis) 的诱导 ]构建采用 HFD 处理 20 周以上的肥胖的 AIM-/- 小鼠。另一方面， 准备纯化的小鼠重 组 AIM 蛋白， 将该 AIM 以 0.2mg/m 浓度溶解于 PBS( 磷酸缓冲液， pH7.4) 的 AIM 溶液配置成 注射剂。并且， 将该 AIM 注射剂通过小鼠的尾静脉， 一周两次， 四周给药。
     对于剂量来说， 每 1g 小鼠体重给予 1μg。其中， 决定该剂量时， 基于上述的体外 (in vitro) 实验中的培养液中的 AIM 浓度， 考虑使小鼠血液中的 AIM 浓度达到与该培养液 中的 AIM 浓度相同的程度而决定。
     并且， 作为对照， 同样地对于用 HFD 处理 20 周以上的肥胖的 AIM-/- 小鼠， 根据同样 的方案， 从尾静脉注射相同量的牛血清白蛋白 (BSA)。并且， 对于给药后的小鼠， 测定体重， 同时采集内脏白色脂肪组织而测定重量。
     其结果， 在体重以及脂肪组织的总重量上， 根据 AIM 给予与否而没有确认出有意 义的差异， 但是在采集的脂肪组织中， 在局部 ( 点状 ) 观察到脂肪细胞的缩小以及分解， 为 了处理这个而聚集的巨噬细胞， 而且好像是大致释放出 ( 分解 ) 了脂滴的脂肪细胞的、 脂肪 细胞的前细胞 ( 分化诱导前的 3T3L1 那样的细胞 )。
     图 22A 以及图 22B 中示出用显微镜观察被苏木精 - 伊红 (Hematoxylin-Eosin， HE) 染 色 的 脂 肪 组 织 切 片 的 结 果。 图 22A 示 出 关 于 给 予 白 蛋 白 的 小 鼠 (BSA injected(control)， BSA 注射 ( 对照 )) 的结果， 图 22B 示出关于给予 AIM 的小鼠 (rAIM injected， rAIM 注射 ) 的结果。 如图 22A 以及图 22B 所示， 可以确认出当给予 AIM 时与给予白蛋白时相比， 脂肪组 织的脂肪细胞的大小显著减小的同时， 巨噬细胞显著聚集。 即， 向肥胖小鼠全身 (systemic) 静脉注射纯化 AIM 蛋白时， 在该肥胖小鼠的脂肪组织中诱导脂肪分解 (Lipolysis)。
     本次实验中， 在部分脂肪组织中局部观察到脂解 (Lipolysis) 的原因认为可能 是， 通过静脉注射全身给药时， 脂肪组织中的局部浓度只在局部充分上升 ( 认为局部浓度 根据毛细血管的走行等而被决定 )， 而不能达到在整个脂肪组织中诱导脂解 (lipolysis) 且减少脂肪组织的总重量以及体重的程度的可能性较高。 但是， 如上所述， 可以明确地确认 AIM 在生物机体中也表现出诱导脂解 (lipolysis) 的作用。 在此， 没有确认出根据 AIM 的给 予而导致小鼠的摄入量发生变化。
     如上所述， 为了根据 AIM 而诱导脂解 (lipolysis)， 认为有效的是提高生物机体内 的局部浓度。因此， 认为例如通过局部注射， 将 AIM 局部注射到脂肪组织内， 由此可以更有 效地诱导脂解 (lipolysis)， 并有效地减少脂肪组织的重量以及体重。并且， 认为通过将 AIM 全身给药以及局部给药， 还可以得到抑制生物机体内的前脂肪细胞的分化的效果。
     在此， 说明通过上述的实施例 1 至 10 得到的部分见解。在实施例 1 中， 确认出浸 润到肥胖的小鼠脂肪组织中的巨噬细胞产生 AIM。了解到巨噬细胞也同样地浸润到肥胖的 人类脂肪组织中。因此， 认为浸润到人的脂肪组织中的巨噬细胞也产生 AIM。
     在实施例 2 中， 确认出 AIM 抑制前脂肪细胞的成熟分化。并且， 在小鼠 AIM 以及人 类 AIM 中的任意一个均表现出同样的分化抑制功能。这种小鼠和人之间的分化抑制功能的 互换性， 认为是由于 AIM 氨基酸序列具有高的同源性， 而且参与前脂肪细胞的分化以及 AIM 的功能表达的分子之间也具有高的同源性而导致的。
     在实施例 3 中， 确认出 AIM 作用于成熟的脂肪细胞而诱导脂滴分解 (Lipolysis)。 在实施例 7 以及实施例 8 中， 确认出 AIM 与脂肪细胞的细胞膜表面上的 CD36 分子结合， 通
     过内吞作用 (endocytosis) 而进入到细胞质内。
     在实施例 5 以及实施例 6 中， 确认出内吞到细胞内的 AIM 进入到细胞质内， 与脂肪 酸合成酶 (Fatty acid synthase ； FAS) 结合而抑制其酶活性。因此， 基于 AIM 的前脂肪细 胞的分化抑制以及成熟脂肪细胞中的脂肪分解诱导， 认为是该 AIM 抑制 FAS 而产生的结果。
     在实施例 9 中， 确认出如果采用高脂饮食 (High Fat Diet， HFD) 处理， 则 AIM 缺失 -/+/+ (AIM ) 小鼠与正常 (AIM ) 小鼠相比， 体重以及脂肪组织的重量增加得更快。
     但是， 没有确认出 AIM 缺失 (AIM-/-) 小鼠和正常 (AIM+/+) 小鼠之间的在摄入量上 的差异。即， 认为 AIM 并不像现有的抗肥胖药物那样诱导食欲减退， 而根据完全不同的机制 (AIM 直接特异性地作用于脂肪细胞或脂肪组织的机制 ) 抑制体重以及脂肪组织重量的增 加。
     进一步地， 在实施例 10 中， 确认出如果向肥胖的 AIM-/- 小鼠从尾静脉全身注射纯 化重组 AIM 蛋白 (4 周 )， 则在脂肪组织中局部发生脂解 (lipolysis)。即， 实际在生物机体 也确认出与在体外 (in vitro) 实验中确认出的对于培养细胞的效果相同的效果。
     如上所述， 人类 AIM 以及小鼠 AIM 中含有保守的三个特征性的结构域 (SRCR1 ～ 3)， 氨基酸序列的同源性高达 68％。 而且， 参与 AIM 向脂肪细胞的内吞的 CD36 以及作为 AIM 的一种靶分子的 FAS 也在人与小鼠之间具有较高的同源性。 即， 负责基于 AIM 的前脂肪细胞 的分化以及成熟脂肪细胞中的脂解 (lipolysis) 的分子的任意一个， 均在人与小鼠之间具 有较高的同源性。在此， 对于现有的其他药物而言， 存在虽然在利用小鼠的实验中有效果， 但在人体上没有得到效果的例子， 这主要是因为参与该效果的分子在小鼠和人之间同源性 较低而引起的。 并且， 在体外 (in vitro) 实验中， 人类 AIM 以及小鼠 AIM 中的任意一个在相同的 浓度范围下均对于来源于小鼠的脂肪细胞发挥同样的分化抑制功能以及脂肪分解诱导功 能。并且， 采用与在体外 (in vitro) 实验中获得效果的浓度对应的剂量， 向小鼠机体内给 予 AIM 时， 实际确认出在脂肪组织中发生脂解 (lipolysis)。因此， 认为 AIM 在人的机体内 也同样作用于脂肪细胞， 获得同样的效果的可能性非常之高。
     并且， AIM 为了发挥如上所述的功能， 需要在 CD36 的介导下内吞进入到细胞内。 根 据该作用机制， 向生物机体内给予 AIM 时， 不需要考虑如同现有的 FAS 抑制剂中出现的那种 对脑神经系统引起的副作用。
     实际上， AIM 缺失小鼠的摄入量与正常的小鼠相比， 没有出现差异。因此， 认为向 人机体给予 AIM 时， 至少不会出现如同现有的 FAS 抑制剂中出现的那种对脑神经系统引起 的副作用。
     实施例 11
     [ 给予肥胖小鼠的 AIM 的向脂肪细胞的内吞以及与 FAS 的结合 ]
     对于从肥胖小鼠采集的脂肪组织样品， 采用抗巨噬细胞 F4/80 抗体 ( 红色 ) 以及 抗小鼠 AIM 多克隆抗体 (SA-1)( 绿色 ) 进行共染色， 在荧光显微镜下观察。其结果， 包围巨 噬细胞的若干个脂肪细胞被抗 AIM 抗体染色。另一方面， 与巨噬细胞分开的脂肪细胞没有 被抗 AIM 抗体染色。发明人认为， 这些结果说明来源于巨噬细胞的 AIM 被组织内的脂肪细 胞内吞。
     进一步地， 向肥胖 AIM-/- 小鼠的附睾脂肪组织直接注射小鼠 rAIM， 然后在组织学上分析该脂肪组织。即， 向附睾脂肪组织的若干处直接注射共 100μg 的 rAIM。从注射经过 3 小时后， 从附睾脂肪组织制作组织切片， 将该组织切片用抗 AIM 抗体以及抗巨噬细胞抗体 染色。
     其结果， 在注射了 rAIM 的脂肪组织内， AIM-/- 脂肪细胞被染色成 AIM 阳性。即， 确认出脂肪组织中的外源性的 rAIM 内吞进入脂肪细胞。在更高倍数的荧光显微镜下观察 时， 观察到在脂肪细胞的细胞质内， 内吞 (endocytosed) 的 rAIM 以点状聚集 (dot-forming accumulation)。
     并且， 将 rAIM 通过静脉注射而向 AIM-/- 小鼠全身给药， 然后在组织学上分析脂肪 -/组织。即， 向 AIM 小鼠通过静脉内注射全身给予 200μg 的 rAIM。从注射经过 3 小时后， 从附睾脂肪组织制作组织切片， 将该组织切片用抗 AIM 抗体以及抗巨噬细胞抗体染色。
     其结果， 在脂肪组织的脂肪细胞内， 虽然与上述的向组织内直接注射时相比程度 较低， 但是检测出内吞的 rAIM 信号。非常有趣的是， 脂肪组织的巨噬细胞也被抗 AIM 抗体 染色。该结果给出以下启示， 即外源性 rAIM 同样内吞到巨噬细胞内。
     进一步地， 使用来源于这些脂肪组织的裂解物 (lysate)， 使内吞的 rAIM 沉淀， 研究内源性 FAS 是否发生共沉淀。即， 使用 HA-tagged rAIM 和抗 HA 抗体， 通过免疫印迹 (Western blotting) 分析在沉淀物中是否包含 FAS。
     其结果， rAIM 以及 FAS 两种蛋白发生共沉淀。从该结果确认出， 内吞的 rAIM 和细 胞质内的 FAS 结合。
     从这些所有的结果证实， 在体内 (in vivo) 在生理学上实现了通过脂肪细胞的 AIM 的内吞以及随之发生的该 AIM 与细胞质内的 FAS 的结合。
     实施例 12
     [AIM 缺失导致的肥胖的促进 ]
     为了试验在体内 (in vivo) 中 AIM 对脂肪细胞的效果， 分析了采用 HFD 喂食 40 周 -/-/+/+ -/以上的 AIM Adipo 小鼠以及 AIM Adipo 小鼠的肥胖状态。在此， 采用 Adipo-/- 背 景的小鼠是有用的， 因为在实验 AIM 缺失对于脂肪组织量的影响时， 可以排除脂联素 (Adiponectin) 的参与。
     分析结果示出在图 23A 至图 23E。图 23A 示出用 HFD 喂食之前的体重 (BW(pre)) (g)， 图 23B 示出用 HFD 喂食之后的体重 (BW(HFD))(g)。 图 23C、 图 23D 以及图 23E 分别示出 用 HFD 喂食之后的内脏脂肪 (Visceral Fat) 的重量 (g)、 皮下脂肪 (Subcutaneous Fat) 的 重量 (g) 以及肝脏 (Liver) 的重量 (g)。在图 23A 至图 23E 中， “+/+” 表示 AIM+/+ Adipo-/- 小 鼠的结果， “-/-” 表示 AIM-/- Adipo-/- 小鼠的结果。
     如图 23A 以及图 23B 所示， 在体重增加方面， 与 AIM+/+ Adipo-/- 小鼠相比， 在 AIM-/Adipo-/- 小鼠中被加快。如图 23C 以及图 23D 所示， 这种体重的差异主要是因脂肪组织的重 量增加而导致的。
     并且， 如图 23E 所示， 肝脏组织的重量也同样地与 AIM+/+ Adipo-/- 小鼠相比， 在 -/-/AIM Adipo 小鼠中得到显著地增加。 该结果揭示 AIM 还作用于肝细胞 (hepatocyte)， 并 控制该细胞内的甘油储藏的可能性。其中， 心脏或肾脏等其他脏器的重量在两种小鼠之间 大致相同。
     在用 HFD 喂食 40 周以上的没有敲除脂联素 (Adiponectin) 基因的 AIM-/- 小鼠以及AIM+/+ 小鼠分析中， 也观察到同样的结果。将分析结果示出在图 24A 至图 24E 中。如图 24A 至图 24E 所示， 与 Adipo-/- 背景的小鼠同样地， 与 AIM+/+ 小鼠相比， AIM-/- 小鼠的体重、 脂肪 组织重量以及肝脏重量的增加更显著。
     图 25 中示出对于用 HFD 喂食的 AIM-/- 小鼠以及 AIM+/+ 小鼠评价成为其食欲指标的 饲料摄入量 (Food intake(g/24h)) 的结果。在图 25 中， “+/+” 表示 AIM+/+ 小鼠的结果， “-/-” 表示 AIM-/- 小鼠的结果。
     在此， 如上述的实施例 9 中也记载的那样， 有报道指出给予 FAS 抑制剂 C75 时， 会降低小鼠下丘脑的神经肽 Y(NPY) 的产生， 其结果引起显著的食欲减退， 作为整体， 加 速 体 重 的 减 少 (Loftus， T.M. 等 Reduced food intake and body weight in mice treated with fatty acid synthase inhibitors.Science 288， 2379-2381(2000) ； Kumar， M.V.， Shimokawa， T.， Nagy， T.R.& Lane， M.D.Differential effects of a centrally acting fatty acid synthase inhibitor in lean and obese mice.Proc.Natl.Acad. Sci.U.S.A.99， 1921-1925(2002) ； Shimokawa， T.， Kumar， M.V.& Lane， M.D.Effect of a fatty acid synthase inhibitor on food intake and expression of hypothalamic neuropeptides.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99， 66-71(2002) ； Chakravarthy， M.V. 等 Inactivation of hypothalamic FAS protects mice from diet-induced obesity and inflammation.J.Lipid Res.50， 630-640(2009))。
     与此相比， 本发明所涉及的实验中， 如图 25 所示， AIM-/- 小鼠和 AIM+/+ 小鼠之间在 24 小时的饲料摄入量 (g/24h) 上大致相同。即， 说明 AIM 不具有神经学上的效果。发明人 认为， 其原因在于， AIM 的作用需要由没有报道出在下丘脑的细胞中表达的 CD36 介导的、 特 异性内吞过程 (endocytotic process)。
     在此， 用 HFD 喂食的 AIM-/- 小鼠以及 AIM+/+ 小鼠 ( 无论 Adipo-/- 背景还是 Adipo+/+ 背景 ) 中， 血清中的 TNFα 以及 IL-6 的水平没有显著的差异， 且血液中的葡萄糖水平也大 致相同。
     实施例 13
     [AIM 缺失小鼠的脂肪细胞大小、 脂肪组织量以及体重的增加 ] -/+/+
     给 AIM 小鼠以及 AIM 小鼠用 HFD 喂食 20 周。并且， 从各小鼠采集的附睾脂肪 组织切片用 HE 染色， 在显微镜下观察。并且， 利用安装有图像分析软件的计算机， 评价各组 织切片的显微镜照内的不同区域中的 50 个独立的脂肪细胞的大小。脂肪细胞的大小以平 均值 ± 标准偏差 (SEM)(in pixels) 来表示。
     图 26 中示出分别对于 AIM+/+ 小鼠 (“+/+” ) 以及 AIM-/- 小鼠 (“-/-” ) 测定脂肪细 +/+ 胞的大小 (pixel/cell) 的结果。图 27A 以及图 27B 中示出从 AIM 小鼠 (“+/+” ) 以及 -/-/AIM 小鼠 ( “ ” ) 采集的内脏脂肪组织切片用 HE 染色而在相差显微镜下观察的结果。其 中， 在图 27A 以及图 27B 中示出的比例尺表示 100μm。
     如图 26、 图 27A 以及图 27B 所示， 与上述的体外 (in vitro) 实验中的 3T3-L1 细胞 -/的观察结果相同， 肥胖 AIM 小鼠的内脏脂肪细胞的大小与肥胖 AIM+/+ 小鼠相比， 更大。 -/+/+
     并且， 给 AIM 小鼠以及 AIM 小鼠采用 HFD 喂食 12 周， 测定体重以及脂肪组织 +/+ 的重量。图 28A、 图 28B 以及图 28C 中分别示出对于 AIM 小鼠 (“+/+” ) 以及 AIM-/- 小鼠 (“-/-” ) 分别测定体重 (Body)(g)、 内脏脂肪组织 (Visceral fat) 的重量 (g) 以及皮下脂肪组织 (Subcutaneous fat) 的重量 (g) 的结果。
     如图 28A 至图 28C 所示， 关于上述的脂肪细胞的增大， 在用 HFD 喂食 12 周后的 体重、 内脏脂肪组织的重量以及皮下脂肪组织的重量的增加方面， 与 AIM+/+ 小鼠相比， 在 -/AIM 小鼠中增加得更快。
     在 此， 需 要 说 明 的 是， 用 HFD 喂 食 的 AIM+/+ 小 鼠 和 AIM-/- 小 鼠 中， 代谢速度 +/+ (metabolic rates) 大致相同。 图 29A、 图 29B、 图 29C 中分别示出对于 AIM 小鼠 ( “+/+” )以 -/-/及 AIM 小鼠 ( “ ” )， 作为反映代谢速度的指标分别评价体温 (Body temperature)(℃ )、 耗氧速率 (Oxygen Consumption)(VO2/min/kg) 以及饲料摄入量 (Food Intake)(g/24h) 的 结果。其中， 在图 29C 中表示在用 HFD 喂食时 (HFD) 和用普通饲料喂食时 (normal chow， 普 通食物 )， 每 24 小时摄食的饲料的量。如图 29A 至图 29C 所示， 在体温、 耗氧速率以及饲料 +/+ -/摄入量中的任意一项上， AIM 小鼠和 AIM 小鼠之间不存在较大的差异。
     进一步地， 用 HFD 喂食的 AIM+/+ 小鼠和 AIM-/- 小鼠的活动性 (Locomotor activity) 也大致相同。图 29D 中示出对于 AIM+/+ 小鼠 (“+/+” ) 以及 AIM-/- 小鼠 (“-/-” )， 分别评价活 动性 (Locomotor activity)(count) 的结果。图 29D 中示出黑暗环境下 (Dark)12 小时以 及光照环境下 (light)12 小时的活动性以及共 24 小时的综合活动性 (Total)。
     从这些结果认为， AIM 通过特异性地作用于脂肪细胞， 由此对脂肪组织量产生影 响。
     实施例 14
     [ 基于向 AIM 缺失小鼠给予 AIM 而引起的对脂肪组织量以及体重增加的抑制 ]
     向 AIM-/- 小鼠用 HFD 喂食 15 周期间， 在最后 9 周向该 AIM-/- 小鼠的腹腔内注射小 鼠 rAIM， 研究该 rAIM 的给予是否抑制脂肪组织量的增加。即， 最后的 9 周， 向 AIM-/- 小鼠的 腹腔内每周 3 次注射 rAIM([150μg/ 注射 / 小鼠 ]×[3 次 / 周 ] ＝ [450μg/ 小鼠 / 周 ])， 第 15 周测定体重、 内脏脂肪的重量以及皮下脂肪的重量。其中， 作为对照， 对于按照同样的 -/方案而向腹腔内给予 BSA(Bovine Serum Albumin， 牛血清白蛋白 ) 的 AIM 小鼠， 也测定体 重、 内脏脂肪的重量以及皮下脂肪的重量。
     图 30A、 图 30B 以及图 30C 中示出对于给予 BSA 的 AIM-/- 小鼠 (“BSA” ) 以及给予 -/rAIM 的 AIM 小鼠 (“rAIM” )， 分别测定体重 (Body)(g)、 内脏脂肪组织 (Visceral fat) 的重量 (g) 以及皮下脂肪组织 (Subcutaneous fat) 的重量 (g) 的结果 (n ＝ 3， 即给予 BSA -/-/的 AIM 小鼠以及给予 rAIM 的 AIM 小鼠分别为 3 例 )。
     如图 30A 至图 30C 所示， 对于内脏脂肪的重量以及皮下脂肪的重量这两项指标的 增加来说， 与体重同样地， 相比于作为对照而注射 BSA 的小鼠， 在注射 rAIM 的小鼠中显著减 小。
     进一步地， 对于给予 BSA 的 AIM-/- 小鼠以及给予 rAIM 的 AIM-/- 小鼠， 分别评价 FSP27、 Perilipin( 围脂滴蛋白 ) 以及 Adipophilin( 脂肪分化相关蛋白 ) 的 mRNA 水平。 mRNA 水平使用从附睾脂肪分离的 RNA， 通过 QPCR 测定。
     图 31 中示出对于给予 BSA 的 AIM-/- 小鼠 (“BSA” ) 以及给予 rAIM 的 AIM-/- 小鼠 “rAIM” ( )， 分别进行评价的 FSP27、 Perilipin 以及 Adipophilin 的 mRNA 水平 (n ＝ 3)。其 中， 图 31 中示出的值表示经 GAPDH 归一化 (normalized to GAPDH) 的、 相对于注射 BSA 的 小鼠的结果的相对值 (Relative Expression)。如图 31 所示， 与用 rAIM 处理上述的 3T3-L1 脂肪细胞时观察到的结果同样地， 随 着进行脂解 (lipolysis) 而减少的 FSP27、 Perilipin 以及 Adipophilin 的 mRNA 水平， 也相 比于作为对照而注射 BSA 的小鼠， 注射 rAIM 的小鼠中较低。因此， 认为根据 AIM 的注射， 生 物机体内进行了脂解 (lipolysis)。
     实施例 15
     [AIM 的向 FAS 的结合 ]
     体内 (in vivo) 以及体外 (in vitro) 两种实验中， 均确认出 AIM 与 FAS 的结合。 -/即， 向肥胖 AIM 小鼠的附睾脂肪组织的若干处直接注射共 100μg 的用 HA 标记的小鼠 rAIM。从注射经过 3 小时后， 采集附睾脂肪组织。接着， 使用抗 HA 抗体， 从该脂肪组织的 裂解物沉淀分离内吞的 rAIM。并且， 采用免疫印迹 (WB)， 分析在得到的沉淀物中是否包含 FAS。其结果， 如图 32 所示， 确认出两种蛋白发生共沉淀， 内吞的 rAIM 和内源性的细胞质内 FAS 结合。
     进一步地， 使用表达用 Flag 标记的 FAS 和用 HA 标记的小鼠 AIM 这两种蛋白的 HEK293T 细胞以及抗 Flag 抗体或抗 HA 抗体， 进行共免疫沉淀试验。其结果， 如图 33A 以及 图 33B 所示， 两种蛋白均发生共沉淀。因此， 认为 AIM 具有与 FAS 结合的能力。
     进一步地， 试图绘出 FAS 中的对于 AIM 的结合区域。如图 34A 所示， FAS 由下还的 7 个独立的功能结构域构成。即， 酮脂酰合成酶 (ketoacyl synthase， KS)、 丙二酰转移酶 和乙酰转移酶 (malonyl/acetyl transferase， MAT)、 脱水酶 (dehydrase， DH)、 烯酰还原酶 (enoylreductase， ER)、 酮脂酰还原酶 (ketoreductase， KR)、 酰基载体蛋白 (acyl carrier protein， ACP) 以及硫酯酶 (thioesterase， TE)。在 DH 结构域和 ER 结构域之间包含中央核 心区 (central core， CC)。认为， 该 CC 不具有已知的酶功能， 而起结构上稳定二聚体的作 用。在此， 图 34A 中示出头尾 (head-to-tail) 二聚化的 FAS 以及其各区域的主要功能。
     因此， 通过共沉淀试验， 研究用 Flag 标记的 FAS 的各区域与用 HA 标记的 AIM 的结 合。即， 使 N 末端中添加有 Flag 标签的 FAS 的各结构域， 在表达用 HA 标记的小鼠 AIM 的 HEK293T 细胞中， 稳定表达。 并且， 使用抗 Flag 抗体以及抗 HA 抗体， 通过共免疫沉淀试验， 研 究各区域与 AIM 的结合。其结果， 如图 34B 所示， AIM 特异性地结合于 ER、 DH、 TE 以及 CC 结 构域。但是， AIM 不结合于参与初期的酰基链集合体 (initial asyl chain assembly， 初期 的酰基链装配 )( 即， 伴随二氧化碳的释放的、 乙酰基以及丙二酰基向 3-ketobutyryl-ACP 的缩合 (condensation)) 的、 包含 KS 以及 MAT 的 N 末端区域 ( 参照图 34A)。因此， 认为 AIM 对于脂肪酸链延长 ( 由 ER 以及 DH 参与 ) 以及释放合成的棕榈酸酯 (palmitate)( 依赖于 TE) 产生影响。其中， ER 或 KR 的过度表达会带来多数细胞的死亡。这会引起使用这些细胞 裂解物的 WB 中的信号低下 ( 图 34B 的下侧板， 通道 ： ER 以及 KR)。
     实施例 16
     [ 细胞表面 CD36 介导下的 AIM 的内吞 ]
     对于缺失 CD36 的 CD36-/- 小鼠以及野生型 CD36+/+ 小鼠， 分别从静脉注射小鼠 rAIM， 分析向脂肪组织的 rAIM 的内吞。即， 将在 PSB 中溶解 rAIM 而配制的注射液分别静脉注射 -/+/+ 到 CD36 小鼠以及 CD36 小鼠 (300μg/ 小鼠 )。从注射经过 16 小时后， 处死小鼠， 从其 附睾脂肪组织制作组织切片。并且， 将组织切片用抗 AIM 抗体染色。
     其结果， 如图 35A 以及图 35B 所示， 在 CD36-/- 小鼠 (CD36-/-) 的脂肪组织中检测出的 AIM 的信号水平与 CD36+/+ 小鼠 (CD36+/+) 相比， 显著地低下。即， 向脂肪细胞的 rAIM 内 +/+ +/+ -/-/吞， 相比于 CD36 小鼠 (CD36 )， 在 CD36 小鼠 (CD36 ) 中显著地少。
     实施例 17
     [ 人 rAIM 的对人前脂肪细胞的成熟的抑制 ]
     为了确认 AIM 在人细胞中也作用于脂肪细胞分化 (adipogenesis)， 在重组人 AIM(rhAIM) 的存在以及不存在下， 刺激人间叶干细胞 (human mesenchymal stem cell， HMSC)(Lonza Walkersville Inc.， USA) 的分化。
     即， 将 HMSC， 在间叶干细胞基础培养基 (Mesenchymal Stem Cell Basal Medium， MSCBM)(Lonza Walkersville Inc.) 中 培 养 10 天， 以 达 到 汇 合。 然 后， 将细 胞 在 rhAIM 存 在 (10μg/mL) 或 者 不 存 在 下， 加 入 人 胰 岛 素、 MCGS、 地 塞 米 松 (dexamethasone)、 吲 哚 美 辛 (indomethacin) 以 及 IBMX， 培 养 3 天， 由 此 刺 激 该 细 胞 的 分 化 (adipogenesis) (adipogenesis induction)( 参考文献 ： Janderrova 等， Obes.Res.11 ： 65， 2003)。经过该 刺激后， 将细胞在添加有人胰岛素以及 MCGS 的 MSCBM 中培养 10 天。并且， 回收细胞， 用油 红 O 染色。
     图 36A、 图 36B 以 及 图 36C 中 分 别 示 出 在 相 差 显 微 镜 下 观 察 分 化 刺 激 前 (Pre-stimulation)、 rhAIM 不存在下刺激后 (rhAIM(-)) 以及 10μg/mL 的 rhAIM 存在下刺 激后 (rhAIM(10μg/mL)) 的细胞的结果。 如图 36A 至图 36C 所示， rhAIM 戏剧性地抑制 HMSC 的分化。并且， 通过 RT-PCR 评 价在成熟脂肪细胞中表达的 Glut-4 的 mRNA 水平。并且， 对于 β 肌动蛋白的 mRNA， 也同样 地进行评价。在图 37 中示出其结果。图 37 中示出评价分化刺激前 (Pre)、 rhAIM 不存在下 刺激后 (-rhAIM) 以及 10μg/mL 的 rhAIM 存在下刺激后 (+rhAIM) 的细胞中的 Glut-4 以及 β 肌动蛋白的 mRNA 的水平的结果。如图 37 所示， 与上述的组织学分析结果一致， Glut-4 的 mRNA 水平， 相比于 rhAIM 不存在的状态， 在 rhAIM 存在下显著地减少。
     实施例 18
     [ 狗以及猫中的 AIM 的表达 ]
     为了研究狗以及猫中的 AIM 的表达， 采用抗小鼠 AIM 多克隆抗体 (SA-1)， 对从 3 只 狗以及 3 只猫采集的血清进行免疫印迹试验。并且， 为了进行比较， 对小鼠血清也同样进行 免疫印迹试验。
     图 38 中示出对于狗 3 例 (dog 1、 2、 3)、 猫 3 例 (cat 1、 2、 3) 以及小鼠 (mouse) 分 别进行免疫印迹的结果。如图 38 所示， 在狗血清中检测出明显的条带。另一方面， 在猫血 清中检测出分子量比狗更大、 而与小鼠大致相同的、 较浅的条带。即， 确认出在狗以及猫中 也表达， 与小鼠 AIM 具有能够被抗小鼠 AIM 多克隆抗体检测出的程度的同源性的 AIM。
     在此， 说明通过上述的实施例 11 至 18 得到的部分见解。在实施例 11 中， 在向 -/-/AIM 小鼠的附睾脂肪组织直接注射 rAIM 以及向 AIM 小鼠静脉注射 rAIM 的任意一种情况 下， 均出现给予的外源性 rAIM 内吞进入脂肪细胞， 且内吞的 rAIM 与该脂肪细胞的细胞质内 的内源性 FAS 结合的现象。并且， 在实施例 16 中， 确认出向 CD36-/- 小鼠以及野生型 CD36+/+
     小鼠分别静脉注射 rAIM 时， 向脂肪细胞的 rAIM 的内吞， 相比于 CD36+/+ 小鼠， 在 CD36-/- 小鼠 中显著地少。即， 在上述的实施例 5 至 8 中采用培养细胞进行的体外 (in vitro) 实验中确 认出的现象， 在采用小鼠进行的体内 (in vivo) 实验中也被确认出。其中， 实施例 15 中， 再次确认出在细胞内 AIM 与 FAS 结合， 同时还获得关于 FAS 的与 AIM 结合的区域的见解。
     在实施例 12 以及实施例 13 中， 示出以下现象 ： 用 HFD 喂食的 AIM-/- 小鼠的体重、 脂 肪组织的重量、 肝脏的重量以及脂肪组织中所包含的脂肪细胞的大小的增加， 与同样用 HFD +/+ -/喂食的 AIM 小鼠相比， 被显著地促进 ； 但是该 AIM 小鼠的饲料摄入量、 代谢速率以及活 +/+ 动性方面， 与该 AIM 小鼠大致相同。即， 更加详细地确认出在上述的实施例 9 中被确认出 的现象。
     在实施例 14 中， 示出同时实施摄取 HFD 和腹腔内注射 rAIM 的处理的 AIM-/- 小鼠 的体重、 内脏脂肪的重量以及皮下脂肪的重量的增加， 与同时实施摄取 HFD 和腹腔内注射 -/BSA 的处理的 AIM 小鼠相比， 被显著地抑制的结果。并且， 这种由 AIM 引起的效果还可以 根据以下分析结果证实， 即， 随着脂解 (lipolysis) 的进行而减少的 FSP27、 Perilipin( 围 脂滴蛋白 ) 以及 Adipophilin( 脂肪分化相关蛋白 ) 的 mRNA 水平， 相比于腹腔内注射 BSA -/-/的 AIM 小鼠， 在腹腔内注射 rAIM 的 AIM 小鼠中更低。即， 如在上述的实施例 10 中已经 理解的那样， 通过相比于静脉注射可以提高脂肪组织中的局部浓度的腹腔内注射， 明确地 确认出由于给予 AIM 而抑制体重以及脂肪组织重量的增加的效果。
     在实施例 17 中， 确认出人 AIM 通过作用于人前脂肪细胞， 抑制该人前脂肪细胞向 人脂肪细胞的分化。即， 确认出如同基于上述的实施例 1 至 10 中得到的见解以及与 AIM 分 子结构及其作用机制相关的小鼠和人的同源性而已经理解的那样， 小鼠 AIM 作用于小鼠细 胞， 同样地人 AIM 作用于人细胞。该结果加强了支持下述理解的依据， 即 AIM 在人的机体内 与在小鼠机体内同样地作用于脂肪细胞， 带来前脂肪细胞的分化抑制、 脂肪细胞中的脂解 (lipolysis)、 脂肪组织重量的增加抑制、 体重的增加抑制的效果。
     在实施例 18 中， 确认出在狗以及猫中也表达， 与小鼠 AIM 具有能够被抗小鼠 AIM 多克隆抗体检测出的程度的同源性的 AIM。实际上， 由序列表 11 中示出的氨基酸序列构成 的狗 AIM 与由序列表 1 中示出的人 AIM 具有 66％的同源性， 并与序列表 5 中示出的小鼠 AIM 具有 60％的同源性。
     本发明涉及一种药物组合物、 食品饮料以及关于它们的方法。背景技术 目前， 人们正在进行各种抗肥胖药物的研发。例如， 有报道指出脂肪酸合成酶 (FAS) 的抑制剂通过降低下丘脑的神经肽 Y(NPY) 的产生量， 引起显著的食欲减退， 从而最 终达到减少体重或脂肪量的效果 ( 例如， 参照非专利文献 1)。
     现有技术文献
     非专利文献
     非专利文献 1 ： Loftus， T.M. 等 Science 288 ： 2379-2381(2000)
     现有技术文献
     非专利文献
     非专利文献 1 ： Loftus， T.M. 等 Science 288 ： 2379-2381(2000)
    发明内容 技术问题
     然而， 对于将作用于脑神经系统的低分子化合物作为有效成分的抗肥胖药物而 言， 会引起不良的副作用 ( 例如， 厌食症 )。
     因此， 人们迫切期望研制出不会伴随这种副作用 ( 例如， 厌食症 ) 的新的抗肥胖药 物。
     本发明是鉴于上述技术问题而提出的， 目的之一在于提供新型药物组合物、 食品 饮料以及与它们相关的方法。
     技术方案
     为了解决上述问题的本发明的一种实施方式所涉及的药物组合物， 特征在于， 作 为有效成分而包含下述的 (I) 或 (II) 的蛋白质 ： (I) 巨噬细胞凋亡抑制因子 ； (II) 由巨噬 细胞凋亡抑制因子的氨基酸序列经过缺失、 取代或添加一个或多个氨基酸的与所述氨基酸 序列具有同源性的氨基酸序列构成， 且具有抑制前脂肪细胞向成熟脂肪细胞的分化的功能 和 / 或在成熟脂肪细胞中诱导脂滴分解的功能的蛋白质。根据本发明， 可以提供新型药物 组合物。
     为了解决上述问题的本发明的一种实施方式所涉及的蛋白质， 特征在于， 是所述 (I) 的蛋白质或者所述 (II) 的蛋白质， 且作为药物组合物的有效成分使用。 根据本发明， 可 以提供用于新的药物用途的蛋白质。
     为了解决上述问题的本发明的一种实施方式所涉及的方法， 特征在于， 制备所述 药物组合物。根据本发明， 可以提供制备新型药物组合物的方法。
     为了解决上述问题的本发明的一种实施方式所涉及的方法， 特征在于， 向生物机 体给予所述药物组合物。根据本发明， 可以提供向生物机体给予新型药物组合物的方法。
     为了解决上述问题的本发明的一种实施方式所涉及的食品饮料， 特征在于， 包含 下述的 (I) 或 (II) 的蛋白质 ： (I) 巨噬细胞凋亡抑制因子 ； (II) 由巨噬细胞凋亡抑制因子 的氨基酸序列经过缺失、 取代或添加一个或多个氨基酸的与所述氨基酸序列具有同源性的
     然而， 对于将作用于脑神经系统的低分子化合物作为有效成分的抗肥胖药物而 言， 会引起不良的副作用 ( 例如， 厌食症 )。
     因此， 人们迫切期望研制出不会伴随这种副作用 ( 例如， 厌食症 ) 的新的抗肥胖药 物。
     本发明是鉴于上述技术问题而提出的， 目的之一在于提供新型药物组合物、 食品 饮料以及与它们相关的方法。
     技术方案
     为了解决上述问题的本发明的一种实施方式所涉及的药物组合物， 特征在于， 作 为有效成分而包含下述的 (I) 或 (II) 的蛋白质 ： (I) 巨噬细胞凋亡抑制因子 ； (II) 由巨噬 细胞凋亡抑制因子的氨基酸序列经过缺失、 取代或添加一个或多个氨基酸的与所述氨基酸 序列具有同源性的氨基酸序列构成， 且具有抑制前脂肪细胞向成熟脂肪细胞的分化的功能 和 / 或在成熟脂肪细胞中诱导脂滴分解的功能的蛋白质。根据本发明， 可以提供新型药物 组合物。
     为了解决上述问题的本发明的一种实施方式所涉及的蛋白质， 特征在于， 是所述 (I) 的蛋白质或者所述 (II) 的蛋白质， 且作为药物组合物的有效成分使用。 根据本发明， 可 以提供用于新的药物用途的蛋白质。
     为了解决上述问题的本发明的一种实施方式所涉及的方法， 特征在于， 制备所述 药物组合物。根据本发明， 可以提供制备新型药物组合物的方法。
     为了解决上述问题的本发明的一种实施方式所涉及的方法， 特征在于， 向生物机 体给予所述药物组合物。根据本发明， 可以提供向生物机体给予新型药物组合物的方法。
     为了解决上述问题的本发明的一种实施方式所涉及的食品饮料， 特征在于， 包含 下述的 (I) 或 (II) 的蛋白质 ： (I) 巨噬细胞凋亡抑制因子 ； (II) 由巨噬细胞凋亡抑制因子 的氨基酸序列经过缺失、 取代或添加一个或多个氨基酸的与所述氨基酸序列具有同源性的
     氨基酸序列构成， 且具有抑制前脂肪细胞向成熟脂肪细胞的分化的功能和 / 或在成熟脂肪 细胞中诱导脂滴分解的功能的蛋白质。根据本发明， 可以提供新型食品饮料。
     为了解决上述问题的本发明的一种实施方式所涉及的方法， 特征在于， 制造所述 食品饮料。根据本发明， 可以提供制造新型食品饮料的方法。 附图说明 图 1 为将人类 AIM 氨基酸序列与 cDNA 碱基序列相对应起来而示出的说明图。
     图 2 为示出属于 SRCR-SF 的分子的一种示例的说明图。
     图 3 为将人类 AIM 氨基酸序列、 小鼠 AIM 氨基酸序列以及它们共有的共有序列相 对应起来而示出的说明图。
     图 4 是示出巨噬细胞浸润到脂肪组织而产生 AIM 的状态的显微镜照的一种示例的 说明图。
     图 5A 是示出对脂肪细胞的 AIM 处理方案的一种示例的说明图。
     图 5B 是示出对根据图 5A 中示出的方案用 AIM 处理的细胞采用油红 O 脂肪染色的 结果的一种示例的说明图。
    图 6A 是示出对脂肪细胞的 AIM 处理方案的一种示例的说明图。
     图 6B 是示出对根据图 6A 中示出的方案用 AIM 处理的细胞采用油红 O 脂肪染色的 结果的一种示例的说明图。
     图 7A 是示出根据图 6A 中示出的方案用 AIM 处理时得到的具有脂滴的细胞的数的 测定结果的一种示例的说明图。
     图 7B 是示出根据图 6A 中示出的方案用 AIM 处理时得到的具有脂滴的细胞的数中 的脂滴直径的测定结果的一种示例的说明图。
     图 8A 是示出根据图 6A 中示出的方案用 AIM 处理时释放到培养上清液中的甘油的 量的测定结果的一种示例的说明图。
     图 8B 是示出根据图 6A 中示出的方案用 AIM 处理时释放到培养上清液中的游离脂 肪酸的量的测定结果的一种示例的说明图。
     图 9 是以模式化示出伴随脂肪细胞分化的主要的基因的表达模式的说明图。
     图 10 是示出根据图 5A 以及图 6A 中示出的方案用 AIM 处理的细胞中的基因表达 的分析结果的一种示例的说明图。
     图 11A 是示出对于脂肪细胞的 AIM 处理方案的一种示例的说明图。
     图 11B 是示出根据图 11A 中示出的方案用 AIM 或 FAS 抑制剂处理的细胞中的 FAS 酶活性的测定结果的一种示例的说明图。
     图 11C 是示出根据图 11A 中示出的方案用 AIM 或 FAS 抑制剂处理的细胞中的 FAS 酶活性的测定结果的另一种示例的说明图。
     图 12A 是示出对根据图 11A 中示出的方案用 AIM 或 FAS 抑制剂处理的细胞采用油 红 O 脂肪染色的结果的一种示例的说明图。
     图 12B 是示出对根据图 11A 中示出的方案用 AIM 或 FAS 抑制剂处理的细胞中的基 因表达的分析结果的一种示例的说明图。
     图 13A 是示出根据图 11A 中示出的方案用 AIM 或 FAS 抑制剂处理时释放到培养上
     清液中的甘油的量的测定结果的一种示例的说明图。
     图 13B 是示出根据图 11A 中示出的方案用 AIM 或 FAS 抑制剂处理时释放到培养上 清液中的游离脂肪酸的量的测定结果的一种示例的说明图。
     图 14 是示出证实添加有 HA 标签的 AIM 和添加有 FLAG 标签的 FAS 的结合的免疫 沉淀的结果的一种示例的说明图。
     图 15A 是示出用 AIM 处理并用抗 AIM 抗体染色的细胞的共焦显微镜照的一种示例 的说明图。
     图 15B 是示出用 AIM 处理并用抗 AIM 抗体染色的细胞的共焦显微镜照的另一种示 例的说明图。
     图 16A 是示出用 AIM 处理的细胞的免疫电子显微镜照的一种示例的说明图。
     图 16B 是示出用 AIM 处理的细胞的免疫电子显微镜照的另一种示例的说明图。
     图 17 是以模式化示出 AIM 内吞进入细胞内的机制的说明图。
     图 18A 是示出将采用 AIM 以及 CD36 双重染色的脂肪细胞通过共焦显微镜以二维 方式分析的结果的一种示例的说明图。
     图 18B 是示出将采用 AIM 以及 CD36 双重染色的脂肪细胞通过共焦显微镜以三维 方式分析的结果的一种示例的说明图。 图 18C 是示出将采用 AIM 以及 CD36 双重染色的脂肪细胞通过共焦显微镜以三维 方式分析的结果的另一种示例的说明图。
     图 18D 是示出将采用 AIM 以及 CD36 双重染色的脂肪细胞通过共焦显微镜以三维 方式分析的结果的又一个另一种示例的说明图。
     图 19A 是示出将不存在 CD36 中和抗体的情况下用 AIM 处理的细胞用抗 AIM 抗体 染色的结果的一种示例的说明图。
     图 19B 是示出将用 CD36 中和抗体的同时用 AIM 处理的细胞用抗 AIM 抗体染色的 结果的一种示例的说明图。
     图 20A 是示出拍摄 AIM-/- Adipo-/- 小鼠的腹腔内脂肪组织的照片的一种示例的说 明图。
     图 20B 是示出拍摄 AIM+/+ Adipo-/- 小鼠的腹腔内脂肪组织的照片的一种示例的说 明图。
     图 21A 是示出 AIM-/- Adipo-/- 小鼠以及 AIM+/+ Adipo-/- 小鼠的体重的测定结果的 一种示例的说明图。
     图 21B 是示出 AIM-/- Adipo-/- 小鼠以及 AIM+/+ Adipo-/- 小鼠的脂肪组织的重量的 测定结果的一种示例的说明图。
     图 22A 是示出给予 BSA 的小鼠的脂肪组织的显微镜观察结果的一种示例的说明 图。
     图 22B 是示出给予 AIM 的小鼠的脂肪组织的显微镜观察结果的一种示例的说明 图。
     图 23A 是示出用 HFD 喂食之前的 AIM-/- Adipo-/- 小鼠以及 AIM+/+ Adipo-/- 小鼠的 体重的测定结果的一种示例的说明图。
     图 23B 是示出用 HFD 喂食之后的 AIM-/- Adipo-/- 小鼠以及 AIM+/+ Adipo-/- 小鼠的
     体重的测定结果的一种示例的说明图。
     图 23C 是示出 AIM-/- Adipo-/- 小鼠以及 AIM+/+ Adipo-/- 小鼠的内脏脂肪的重量的 测定结果的一种示例的说明图。
     图 23D 是示出 AIM-/- Adipo-/- 小鼠以及 AIM+/+ Adipo-/- 小鼠的皮下脂肪的重量的 测定结果的一种示例的说明图。
     图 23E 是示出 AIM-/- Adipo-/- 小鼠以及 AIM+/+ Adipo-/- 小鼠的肝脏的重量的测定 结果的一种示例的说明图。
     图 24A 是示出用 HFD 喂食之前的 AIM-/- 小鼠以及 AIM+/+ 小鼠的体重的测定结果的 一种示例的说明图。
     图 24B 是示出用 HFD 喂食之后的 AIM-/- 小鼠以及 AIM+/+ 小鼠的体重的测定结果的 一种示例的说明图。
     图 24C 是示出 AIM-/- 小鼠以及 AIM+/+ 小鼠的内脏脂肪组织的重量的测定结果的一 种示例的说明图。
     图 24D 是示出 AIM-/- 小鼠以及 AIM+/+ 小鼠的皮下脂肪组织的重量的测定结果的一 种示例的说明图。 图 24E 是示出 AIM-/- 小鼠以及 AIM+/+ 小鼠的肝脏的重量的测定结果的一种示例的 说明图。
     图 25 是示出 AIM-/- 小鼠以及 AIM+/+ 小鼠的饲料摄入量的测定结果的一种示例的说 明图。
     图 26 是示出 AIM+/+ 小鼠以及 AIM-/- 小鼠的脂肪细胞的大小的测定结果的一种示例 的说明图。
     图 27A 是示出从 AIM+/+ 小鼠采集的内脏脂肪组织切片用 HE 染色而在相差显微镜 下观察的结果的一种示例的说明图。
     图 27B 是示出从 AIM-/- 小鼠采集的内脏脂肪组织切片用 HE 染色而在相差显微镜 下观察的结果的一种示例的说明图。
     图 28A 是示出 AIM+/+ 小鼠以及 AIM-/- 小鼠的体重的测定结果的一种示例的说明图。
     图 28B 是示出 AIM+/+ 小鼠以及 AIM-/- 小鼠的内脏脂肪组织的重量的测定结果的一 种示例的说明图。
     图 28C 是示出 AIM+/+ 小鼠以及 AIM-/- 小鼠的皮下脂肪组织的重量的测定结果的一 种示例的说明图。
     图 29A 是示出 AIM+/+ 小鼠以及 AIM-/- 小鼠的体温的测定结果的一种示例的说明图。
     图 29B 是示出 AIM+/+ 小鼠以及 AIM-/- 小鼠的耗氧速率的测定结果的一种示例的说 明图。
     图 29C 是示出 AIM+/+ 小鼠以及 AIM-/- 小鼠的饲料摄入量的测定结果的一种示例的 说明图。
     图 29D 是示出 AIM+/+ 小鼠以及 AIM-/- 小鼠的活动性的评价结果的一种示例的说明 图。
     图 30A 是示出给予 AIM 或者 BSA 的 AIM-/- 小鼠的体重的测定结果的一种示例的说 明图。
     图 30B 是示出给予 AIM 或者 BSA 的 AIM-/- 小鼠的内脏脂肪组织的重量的测定结果 的一种示例的说明图。
     图 30C 是示出给予 AIM 或者 BSA 的 AIM-/- 小鼠的皮下脂肪组织的重量的测定结果 的一种示例的说明图。
     图 31 是示出给予 AIM 或者 BSA 的 AIM-/- 小鼠的 mRNA 水平的评价结果的一种示例 的说明图。
     图 32 是示出确认体内 (in vivo) 的 AIM 和 FAS 结合的结果的一种示例的说明图。
     图 33A 是示出确认体外 (in vitro) 的 AIM 和 FAS 结合的结果的一种示例的说明 图。
     图 33B 是示出确认体外 (in vitro) 的 AIM 和 FAS 结合的结果的另一种示例的说 明图。
     图 34A 是示出二聚化的 FAS 以及各区域的主要功能的说明图。
     图 34B 是示出将 FAS 各区域用 Flag 序列标记， 并通过共沉淀试验研究该各区域与 用 HA 标记的 AIM 的结合的结果的一种示例的说明图。
     图 35A 是示出向野生型 CD36+/+ 小鼠从静脉注射 rAIM， 分析向脂肪组织的 rAIM 的 内吞的结果的一种示例的说明图。
     图 35B 是示出向 CD36-/- 小鼠从静脉注射 rAIM， 分析向脂肪组织的 rAIM 的内吞的 结果的一种示例的说明图。
     图 36A 是示出在相差显微镜下观察分化刺激前的 HMSC 的结果的一种示例的说明 图。
     图 36B 是示出在相差显微镜下观察 rhAIM 不存在下被分化刺激后的 HMSC 的结果 的一种示例的说明图。
     图 36C 是示出在相差显微镜下观察 rhAIM 存在下被分化刺激后的 HMSC 的结果的 一种示例的说明图。
     图 37 是示出 HMSC 中的 Glut-4 的 mRNA 水平的评价结果的一种示例的说明图。
     图 38 是示出采用抗小鼠 AIM 抗体对狗血清以及猫血清进行免疫印迹试验的结果 的一种示例的说明图。 具体实施方式
     以下， 说明本发明的一种实施方式。 需要说明的是， 本发明不受本实施方式的任何 限制。
     首先， 对于作为与本发明相关的蛋白质的巨噬细胞凋亡抑制因子 (Apoptosis Inhibitor of Macrophage， 以下称为 “AIM” 。)， 进行说明。
     AIM 在 其 氨 基 酸 序 列 中 存 在 保 守 的 三 个 SRCR(Scavenger Receptor Cysteine-Rich) 结构域 ( 从 N 末端依次称为 SRCR1、 SRCR2、 SRCR3。)， 是具有由该三个 SRCR 结构域串联的分子结构的分泌蛋白。
     本发明的发明人研究团队通过克隆小鼠基因， 构建基因敲除小鼠， 并基于分析结 果， 首次发表了由巨噬细胞特异性产生的、 作为具有抑制巨噬细胞的凋亡的功能的分泌 蛋 白 的 小 鼠 AIM( 文 献 1 ： Miyazaki， T. 等 Increased susceptibility of thymocytesto apoptosis in mice lacking AIM， a novel murine macrophage-derived soluble factor belonging to the scavenger receptor cysteine-rich domain superfamily. J Exp Med.189 ： 413-422， 1999. ； 文献 2 ： Haruta， I.， Kato， Y.， Hashimoto， E.， Minjares， C.， Kennedy， S.， Uto， H.， Yamauchi， K.， Kobayashi， M.， Yusa， S.， Muller， U.， Hayashi， N.& Miyazaki， T.Association of AIM， a novel apoptosis inhibitory factor， with hepatitis via supporting macrophage survival and enhancing phagocytotic function of macrophages.J.Biol.Chem.276 ： 22910-22914(2001).)。
     另一方面， 其他研究团队发表过人类基因序列的 “Spα” (Secretion proteinα) ( 文献 3 ： Gebe， J.A. 等 Molecular cloning， mapping to human chromosome 1 q21-q23， and cell binding characteristics of Spalpha， a new member of the scavenger receptor cysteine-rich(SRCR)family of proteins.J Biol Chem.272 ： 6151-6158， 1997.)。并且， 此后作为基因组测序工程的一环， 将该基因命名为 “Api6” 。而且， 由于具有三个 SRCR 结构 域的结构与 CD5 的细胞外结构域相似， 因此又将该基因命名为 “CD5L” 。 并且， 最近提出将这 些名称统一为 “CD5L” 。 但是， 从分子名称应当反映其功能的观点考虑， 将这些蛋白质名称均 统一为 “AIM” ， 应该更为恰当。 小鼠 AIM 是由示出在序列表 5 中的氨基酸序列构成的蛋白质。 并且， 人类 AIM 是由 示出在序列表 1 中的氨基酸序列构成的蛋白质。在此， 图 1 是将人类 AIM 氨基酸序列 ( 序 列表 1 中示出的氨基酸序列 ) 与 cDNA 碱基序列 ( 序列表 9 中示出的碱基序列 ) 相对应起 来而示出的。
     接着， 对 AIM 分子的特征进行说明。小鼠 AIM 原本是作为清道夫受体富含半胱氨 酸残基超家族 (Scavenger-Receptor Cysteine-Rich Super-Family， SRCR-SF) 的新组成员 而发现的， 是具有 54kDa 分子量的分子。
     图 2 中示出属于该 SRCR-SF 的分子的一种示例。如图 2 所示， AIM 分子由在属于 SRCR-SF 的组成员分子之间保守的富含半胱氨酸残基的三个 SRCR 结构域串联而成。
     该 AIM 虽然包含相比于作为最为靠近 N 末端侧的 SRCR 结构域的 SRCR1， 更靠近 N 末端侧的信号肽， 但是不包含相当于跨膜结构域或胞内结构域的部分， 在序列上是典型的 分泌蛋白。需要说明的是， 如图 2 所示， CD5 或 CD6 等具有三个相同的 SRCR 结构域的其他 SRCR-SF 的组成员属于跨膜蛋白。
     另外提一下， “SRCR-SF” 的名称是由于富含半胱氨酸残基的结构域在清道夫受体 中最初被记载而被命名的名称， 但并不是所有的包含该结构域的分子都具有清道夫功能。 实际上， 小鼠 AIM 不具有清道夫功能。
     小鼠 AIM 与人类 AIM 的氨基酸序列具有 68％的同源性。并且， 虽然小鼠 AIM 中包 含三个 N- 糖化位点， 但人类 AIM 中没有 N- 糖化位点。
     图 3 是将人类 AIM 氨基酸序列 ( 序列表 1 中示出的氨基酸序列的单字母标记 )、 小 鼠 AIM 氨基酸序列 ( 序列表 5 中示出的氨基酸序列的单字母标记 ) 以及它们共有的共有序 列相对应起来而示出的。在图 3 的六段中， 示出在最上段到第三段的用方框圈起来的部分 是 SRCR1 结构域的氨基酸序列 ( 涉及人类 AIM 的序列表 2 中示出的氨基酸序列以及涉及小 鼠 AIM 的序列表 6 中示出的氨基酸序列 )。 并且， 示出在第三段到第五段的用方框圈起来的 部分是 SRCR2 结构域的氨基酸序列 ( 涉及人类 AIM 的序列表 3 中示出的氨基酸序列以及涉
     及小鼠 AIM 的序列表 7 中示出的氨基酸序列 )。 并且， 示出在第五段到第六段的用方框圈起 来的部分是 SRCR3 结构域的氨基酸序列 ( 涉及人类 AIM 的序列表 4 中示出的氨基酸序列以 及涉及小鼠 AIM 的序列表 8 中示出的氨基酸序列 )。
     进一步地， 对于迄今为止了解到的 AIM 的功能进行说明。 AIM 的一部分功能在最初 分析基因敲除小鼠时即已明确 ( 上述文献 1)。即， 已经了解到虽然 AIM 基因缺失 (AIM-/-) 小鼠基本上没有出现异常， 但腹腔巨噬细胞中， 对于通过各种刺激而诱导的凋亡的抵抗性 -/低下。同样地， 如果用重组 AIM 分子处理 AIM 巨噬细胞， 则会提高凋亡抵抗性。即， 已经 明确 AIM 具有抑制巨噬细胞的凋亡的功能。
     对于 AIM 而言， 能够抑制的凋亡并不是通过限定的刺激而诱导的凋亡， 其能够作 用于通过 Fas/CD95、 放射线、 类固醇、 感染 ( 李斯特菌等 )、 氧化 LDL 等各种刺激而诱导的凋 亡。AIM 究竟通过什么样的机制抑制凋亡， 尚不明了。
     并且， 本发明的发明人对于这种 AIM 反复进行了专心研究， 其结果独立发现 AIM 发 挥以下意外的功能。 即， 抑制前脂肪细胞向成熟脂肪细胞的分化， 并且在成熟的脂肪细胞中 诱导脂滴分解 (lipolysis， 脂解作用 )。由此出发， 最终完成了本发明。
     而且， 令人惊讶的是， 虽然 AIM 已经被明确属于分泌蛋白， 但在细胞膜表面上表达 的 CD36 介导下内吞进入细胞质内， 由此发挥其功能。 该事实表明， AIM 仅特异性地作用于表达有 CD36 的细胞。即， 例如 AIM 对不表达 CD36 的脑神经系统的细胞不起作用。
     并且， 由于 AIM 是一种蛋白， 因此不会通过血脑屏障。从而， AIM 不会引起诸如由 于现有的将低分子物质作为有效成分的抗肥胖药物而引起的副作用 ( 例如， 厌食症 )。
     接着， 对本实施方式所涉及的药物组合物 ( 以下， 称为 “本药物组合物” 。) 进行说 明。本药物组合物作为有效成分而含有包含上述 AIM 的特定蛋白质 ( 以下， 称为 “本蛋白 质” 。)。
     即， 本药物组合物作为有效成分而包含下述的 (I) 或 (II) 的蛋白质， (I) 巨噬细 胞凋亡抑制因子 (AIM) ； (II) 由巨噬细胞凋亡抑制因子 (AIM) 的氨基酸序列经过缺失、 取代 或添加一个或多个氨基酸的与所述氨基酸序列具有同源性的氨基酸序列构成， 且具有抑制 前脂肪细胞向成熟脂肪细胞的分化的功能和 / 或在成熟脂肪细胞中诱导脂滴分解的功能 的蛋白质。在此， 所述 (I) 的蛋白质是天然 AIM， 而所述 (II) 的蛋白质是该天然 AIM 的变异 蛋白。
     本蛋白质是所述 (I) 的蛋白质或所述 (II) 的蛋白质， 是作为药物组合物的有效成 分而使用的蛋白质。 并且， 本蛋白质是例如在后述的任意疾病的诊断、 治疗或预防中所使用 的蛋白质。
     本药物组合物作为有效成分而包含例如人类或人类以外的动物 ( 以下， 仅称为 “动物” 。) 的 AIM。
     本蛋白质例如是由序列表 1 中示出的氨基酸序列构成的蛋白质。即， 此时， 本蛋白 质是人类的 AIM， 是具有抑制巨噬细胞凋亡的功能 ( 以下， 称为 “凋亡抑制功能” ) 的分泌蛋 白。
     并且， 本蛋白质例如是动物的 AIM。对于动物， 只要是人以外的动物， 没有特别限 制， 例如是哺乳动物 ( 例如， 小鼠、 大鼠、 天竺鼠等啮齿类 ； 兔； 狗； 猫； 猪； 牛； 马； 猴 )。 更加
     具体地， 本蛋白质例如是小鼠、 狗或猫的 AIM。
     本蛋白质例如是由序列表 5 中示出的氨基酸序列构成的蛋白质。即， 此时， 本蛋白 质是小鼠的 AIM， 是具有凋亡抑制功能的分泌蛋白。
     这些 AIM 例如可以利用基因重组技术而制备。即， 首先， 将序列表 9 中示出的人类 AIM 的 cDNA( 需要说明的是， 序列表 9 中示出的氨基酸序列中 3′末端的 “tag” 是终止密码 子。) 整合到适当的表达载体 (pCAGGS 等 )。接着， 将该表达载体导入到动物细胞株 (CHO 细胞、 293T 细胞等 )， 使该动物细胞产生人类 AIM。
     由于人类 AIM 属于分泌蛋白， 因此产生的重组人类 AIM 会被释放到培养上清液中。 从而， 例如， 可以通过在该人类 AIM 上添加 HA 等标签多肽 (9 ～ 12 个氨基酸 )， 利用固定有 针对该标签多肽的抗体的纯化柱， 从培养上清液纯化该人类 AIM。并且， 例如， 预先得到抗 AIM 抗体时， 还可以采用该抗 AIM 抗体， 从培养上清液纯化没有添加标签的人类 AIM。
     在此， 对于人以外的动物的 AIM， 也可以采用同样的方法制备 AIM。即， 例如， 对于 小鼠， 可以通过利用序列表 10 中示出的小鼠 AIM 的 cDNA( 需要说明的是， 序列表 10 中示出 的氨基酸序列中 3′末端的 “tga” 是终止密码子。)， 按照与制备上述的人类 AIM 时相同的 顺序， 得到重组小鼠 AIM。 并且， 对于其他的动物种 ( 例如， 狗、 猫 )， 例如， 也可以基于包含保守的 SRCR 结构 域、 具有三个该 SRCR 结构域串联的形态、 是分泌蛋白， 这三个特征， 从该其他动物种的 cDNA 文库中获得 AIM 的 cDNA， 按照与制备上述的人类 AIM 时相同的顺序， 得到重组 AIM。
     并且， 例如， 还可以从公知的数据库 ( 例如， National Center for Biotechnology Information(NCBI， 美国国家生物技术信息中心 ) 提供的数据库 ) 得到 AIM 的氨基酸序列。 具体而言， 例如， 将狗 AIM 的氨基酸序列示出在序列表 11 中， 将黑猩猩 AIM 的氨基酸序列示 出在序列表 12 中， 将大鼠 AIM 的氨基酸序列示出在序列表 13 中。
     进一步地， 对于在这些天然 AIM 的部分氨基酸序列中发生如后述的变异的 AIM 类 似蛋白质， 例如， 只要合成并使用对应的 cDNA， 就可以按照相同的顺序， 作为重组变异 AIM 而获得。
     并且， 对于本蛋白质而言， 在不损坏其抑制前脂肪细胞向成熟脂肪细胞的分化 的功能 ( 以下， 称为 “脂肪分化抑制功能” 。) 和 / 或在成熟脂肪细胞中诱导脂滴分解 (lipolysis， 脂解作用 ) 的功能 ( 以下， 称为 “脂解功能” 。) 的范围内， 可以使用在上述的 天然 AIM 的氨基酸序列中发生变异的蛋白质 (AIM 变异蛋白 )。
     即， 本药物组合物作为有效成分而包含例如人类或动物的 AIM 变异蛋白。
     如上所述， AIM 变异蛋白是由 AIM 氨基酸序列经过缺失、 取代或添加一个或多个氨 基酸的与所述氨基酸序列具有同源性的氨基酸序列构成， 且具有脂肪分化抑制功能和 / 或 脂解功能的蛋白质。
     在此， 对以下说明的 AIM 变异蛋白， 没有明确记载时， 也可以具有如下所述的特 征。即， AIM 变异蛋白也可以是分泌蛋白。并且， AIM 变异蛋白也可以具有凋亡抑制功能。 并且， AIM 变异蛋白也可以是其氨基酸序列所包含的氨基酸数目为 300 ～ 400 个， 优选为 320 ～ 380 个， 更优选为 340 ～ 360 个的蛋白质。
     并且， 当 AIM 变异蛋白的氨基酸序列与天然 AIM 的氨基酸序列具有 80％以上的同 源性时， 以及当 AIM 变异蛋白的结构域的氨基酸序列与天然 AIM 的结构域的氨基酸序列具
     有 80％以上的同源性时， 该同源性优选为 85％以上， 更优选为 90％以上， 尤其优选为 95％。
     并且， AIM 变异蛋白也可以是与 AIM 同样地在 CD36 介导下作用于细胞的蛋白质。 此时， AIM 变异蛋白与 AIM 同样地、 特异性地作用于含有 CD36 的细胞。并且， AIM 变异蛋白 也可以是与 AIM 同样地， 与细胞的脂肪酸合成酶 (FAS) 结合而降低该 FAS 的活性的蛋白质。
     本蛋白质例如是由序列表 1 中示出的氨基酸序列经过缺失、 取代或添加一个或多 个氨基酸的与序列表 1 中示出的氨基酸序列具有 80％以上的同源性的氨基酸序列构成， 且 具有脂肪分化抑制功能和 / 或脂解功能的蛋白质。
     本蛋白质也可以是分泌蛋白。此时， 本蛋白质包含分泌蛋白的特征氨基酸序列。 具体而言， 本蛋白质例如由具有以下分子结构的分泌蛋白形成 ： 在其氨基酸序列的 N 端 ( 最前部分 ) 包含疏水性的短的序列 (leader sequence， 前导序列 )， 但不包含跨膜序列 (transmembrane region， 跨膜区 ( 同样具有疏水性 ))、 细胞内结构域。 实际上， 天然 AIM 是 具有这种分子结构的分泌蛋白。并且， 本蛋白质也可以具有凋亡抑制功能。
     本蛋白质例如是由序列表 1 中示出的氨基酸序列经过缺失、 取代或添加一个或几 个氨基酸的氨基酸序列构成， 且具有脂肪分化抑制功能和 / 或脂解功能的蛋白质。
     此时， 本蛋白质是由与序列表 1 中示出的氨基酸序列具有 80％以上的同源性的氨 基酸序列构成的蛋白质。并且， 本蛋白质也可以是分泌蛋白。并且， 本蛋白质也可以具有凋 亡抑制功能。
     并且， 本蛋白质例如是由序列表 1 中示出的氨基酸序列经过缺失、 取代或添加一 个或多个氨基酸的氨基酸序列构成， 并且由序列表 2 中示出的氨基酸序列或者序列表 2 中 示出的氨基酸序列经过缺失、 取代或添加一个或多个氨基酸的与序列表 2 中示出的氨基酸 序列具有 80％以上的同源性的氨基酸序列构成的第一结构域、 由序列表 3 中示出的氨基酸 序列或者序列表 3 中示出的氨基酸序列经过缺失、 取代或添加一个或多个氨基酸的与序列 表 3 中示出的氨基酸序列具有 80％以上的同源性的氨基酸序列构成的第二结构域、 以及由 序列表 4 中示出的氨基酸序列或者序列表 4 中示出的氨基酸序列经过缺失、 取代或添加一 个或多个氨基酸的与序列表 4 中示出的氨基酸序列具有 80％以上的同源性的氨基酸序列 构成的第三结构域串联而成， 而且具有脂肪分化抑制功能和 / 或脂解功能的蛋白质。
     即， 该本蛋白质具有三个结构域， 即人类 AIM 的 SRCR1 结构域或者在该结构域中发 生变异的结构域、 SRCR2 结构域或者在该结构域中发生变异的结构域、 以及 SRCR3 结构域或 者在该结构域中发生变异的结构域。并且， 此时， 本蛋白质也可以是由与序列表 1 中示出的 氨基酸序列具有 80％以上的同源性的氨基酸序列构成的蛋白质。并且， 本蛋白质也可以是 分泌蛋白。并且， 本蛋白质也可以具有凋亡抑制功能。并且， 本蛋白质也可以是其氨基酸序 列所包含的氨基酸数目为 300 ～ 400 个， 优选为 320 ～ 380 个， 更优选为 340 ～ 360 个的蛋 白质。
     并且， 第一结构域、 第二结构域以及第三结构域中的至少一个结构域也可以是由 与该至少一个结构域对应的序列表中示出的氨基酸序列经过缺失、 取代或添加一个或多个 氨基酸的与该对应的序列表中示出的氨基酸序列具有 80％以上的同源性的氨基酸序列构 成的结构域。并且， 第一结构域、 第二结构域以及第三结构域也可以从 N 末端侧依次连接。
     而且， 本蛋白质例如是由序列表 2 中示出的氨基酸序列或者序列表 2 中示出的氨 基酸序列经过缺失、 取代或添加一个或几个氨基酸的氨基酸序列构成的第一结构域、 由序列表 3 中示出的氨基酸序列或者序列表 3 中示出的氨基酸序列经过缺失、 取代或添加一个 或几个氨基酸的氨基酸序列构成的第二结构域、 以及由序列表 4 中示出的氨基酸序列或者 序列表 4 中示出的氨基酸序列经过缺失、 取代或添加一个或几个氨基酸的氨基酸序列构成 的第三结构域串联而成， 且具有脂肪分化抑制功能和 / 或脂解功能的蛋白质。
     并且， 本蛋白质例如是由序列表 2 中示出的氨基酸序列构成的第一结构域 ( 人类 AIM 的 SRCR1 结构域 )、 由序列表 3 中示出的氨基酸序列构成的第二结构域 ( 人类 AIM 的 SRCR2 结构域 )、 以及由序列表 4 中示出的氨基酸序列构成的第三结构域 ( 人类 AIM 的 SRCR3 结构域 ) 串联而成， 且具有脂肪分化抑制功能和 / 或脂解功能的蛋白质。
     即， 该本蛋白质作为 SRCR 结构域具有三个结构域， 即人类 AIM 的 SRCR1 结构域、 SRCR2 结构域以及 SRCR3 结构域。并且， 此时， 本蛋白质也可以是由与序列表 1 中示出的氨 基酸序列具有 80％以上的同源性的氨基酸序列构成的蛋白质。并且， 本蛋白质也可以是分 泌蛋白。并且， 本蛋白质也可以具有凋亡抑制功能。并且， 本蛋白质也可以是其氨基酸序列 所包含的氨基酸数目为 300 ～ 400 个， 优选为 320 ～ 380 个， 更优选为 340 ～ 360 个的蛋白 质。
     并且， 具有上述的第一结构域、 第二结构域以及第三结构域的任意一种本蛋白质， 也可以是该第一结构域、 第二结构域以及第三结构域直接串联而成， 且具有脂肪分化抑制 功能和 / 或脂解功能的蛋白质。
     即， 此时， 本蛋白质是由第一结构域的氨基酸序列、 第二结构域的氨基酸序列以及 第三结构域的氨基酸序列直接串联而成的氨基酸序列构成的蛋白质。 因此， 此时， 本蛋白质 例如不包含相当于人类 AIM 中构成 SRCR1 结构域与 SRCR2 结构域之间的连接部分的氨基酸 序列、 构成该 SRCR2 结构域与 SRCR3 结构域之间的连接部分的氨基酸序列的、 结构域之间的 连接部分。但是， 包含上述的第一结构域、 第二结构域以及第三结构域的本蛋白质， 不限于 此， 也可以是包含结构域之间的连接部分的蛋白质。
     并且， 本蛋白质例如是由序列表 2 中示出的氨基酸序列或者序列表 2 中示出的氨 基酸序列中共有序列 ( 图 3 中示出的 SRCR1 结构域部分的共有序列 ) 以外的部分经过缺失、 取代或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列构成的第一结构域、 由序列表 3 中示出的氨基 酸序列或者序列表 3 中示出的氨基酸序列中共有序列 ( 图 3 中示出的 SRCR2 结构域部分的 共有序列 ) 以外的部分经过缺失、 取代或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列构成的第二 结构域、 以及由序列表 4 中示出的氨基酸序列或者序列表 4 中示出的氨基酸序列中共有序 列 ( 图 3 中示出的 SRCR3 结构域部分的共有序列 ) 以外的部分经过缺失、 取代或添加一个 或多个氨基酸的氨基酸序列构成的第三结构域串联而成， 且具有脂肪分化抑制功能和 / 或 脂解功能的蛋白质。
     即， 该本蛋白质具有三个结构域， 即人类 AIM 的 SRCR1 结构域或者在人类 AIM 的 SRCR1 结构域的共有序列以外的部分发生变异的结构域、 人类 AIM 的 SRCR2 结构域或者在 SRCR2 结构域的共有序列以外的部分发生变异的结构域、 以及人类 AIM 的 SRCR3 结构域或者 在 SRCR3 结构域的共有序列以外的部分发生变异的结构域。并且， 此时， 本蛋白质是由序列 表 1 中示出的氨基酸序列经过缺失、 取代或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列构成的蛋 白质。即， 本蛋白质也可以是由与序列表 1 中示出的氨基酸序列具有 80％以上的同源性的 氨基酸序列构成的蛋白质。并且， 本蛋白质也可以是分泌蛋白。并且， 本蛋白质也可以具有凋亡抑制功能。并且， 本蛋白质也可以是其氨基酸序列所包含的氨基酸数目为 300 ～ 400 个， 优选为 320 ～ 380 个， 更优选为 340 ～ 360 个的蛋白质。
     并且， 第一结构域、 第二结构域以及第三结构域中的至少一个结构域也可以是由 该至少一个结构域对应的序列表中示出的氨基酸序列中共有序列以外的部分经过缺失、 取 代或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列构成的结构域。 并且， 第一结构域、 第二结构域以 及第三结构域中的至少一个结构域也可以是由与该至少一个结构域对应的序列表中示出 的氨基酸序列具有 80％以上的同源性的氨基酸序列构成的结构域。 即， 第一结构域、 第二结 构域以及第三结构域中的至少一个结构域也可以是由该至少一个结构域对应的序列表中 示出的氨基酸序列中共有序列以外的部分经过缺失、 取代或添加一个或几个氨基酸的氨基 酸序列构成的结构域。并且， 第一结构域、 第二结构域以及第三结构域也可以从 N 末端侧依 次连接。
     并且， 具有上述的在共有序列以外的部分发生变异的第一结构域、 第二结构域以 及第三结构域的任意一种本蛋白质， 也可以是该第一结构域、 第二结构域以及第三结构域 直接串联而成， 且具有脂肪分化抑制功能和 / 或脂解功能的蛋白质。
     即， 此时， 本蛋白质是由第一结构域的氨基酸序列、 第二结构域的氨基酸序列以及 第三结构域的氨基酸序列直接串联而成的氨基酸序列构成的蛋白质。但是， 包含上述的在 共有序列以外的部分发生变异的第一结构域、 第二结构域以及第三结构域的本蛋白质， 不 限于此， 也可以是包含结构域之间的连接部分的蛋白质。 并且， 本蛋白质例如是下述的 (x1)、 (x2) 或 (x3) 蛋白质， 且具有脂肪分化抑制功 能和 / 或脂解功能的蛋白质。 (x1) 由序列表 2 中示出的氨基酸序列构成的第一结构域蛋白 或者多个所述第一结构域蛋白串联而成的蛋白质 ； (x2) 由序列表 3 中示出的氨基酸序列构 成的第二结构域蛋白或者多个所述第二结构域蛋白串联而成的蛋白质 ； (x3) 由序列表 4 中 示出的氨基酸序列构成的第三结构域蛋白或者多个所述第三结构域蛋白串联而成的蛋白 质。
     即， 此时， 本蛋白质例如是由人类 AIM 的 SRCR1 结构域构成的蛋白质 ( 第一结构域 蛋白 )， 或者多个该 SRCR1 结构域串联而成的蛋白质 ( 所述 (x1) 的蛋白质 )。并且， 本蛋白 质例如是由人类 AIM 的 SRCR2 结构域构成的蛋白质 ( 第二结构域蛋白 )， 或者多个该 SRCR2 结构域串联而成的蛋白质 ( 所述 (x2) 的蛋白质 )。并且， 本蛋白质例如是由人类 AIM 的 SRCR3 结构域构成的蛋白质 ( 第三结构域蛋白 )， 或者多个该 SRCR3 结构域串联而成的蛋白 质 ( 所述 (x3) 的蛋白质 )。
     并且， 同样地， 本蛋白质例如也可以是下述的 (y1)、 (y2) 或 (y3) 蛋白质， 且具有脂 肪分化抑制功能和 / 或脂解功能的蛋白质。(y1) 由序列表 2 中示出的氨基酸序列经过缺 失、 取代或添加一个或多个氨基酸的与序列表 2 中示出的氨基酸序列具有 80％以上的同源 性的氨基酸序列构成的第一结构域蛋白或者多个所述第一结构域蛋白串联而成的蛋白质 ； (y2) 由序列表 3 中示出的氨基酸序列经过缺失、 取代或添加一个或多个氨基酸的与序列表 3 中示出的氨基酸序列具有 80％以上的同源性的氨基酸序列构成的第二结构域蛋白或者 多个所述第二结构域蛋白串联而成的蛋白质 ； (y3) 由序列表 4 中示出的氨基酸序列经过缺 失、 取代或添加一个或多个氨基酸的与序列表 4 中示出的氨基酸序列具有 80％以上的同源 性的氨基酸序列构成的第三结构域蛋白或者多个所述第三结构域蛋白串联而成的蛋白质。
     并且， 同样地， 本蛋白质例如也可以是下述的 (z1)、 (z2) 或 (z3) 蛋白质， 且具有脂 肪分化抑制功能和 / 或脂解功能的蛋白质。 (z1) 由在序列表 2 中示出的氨基酸序列中共有 序列以外的部分经过缺失、 取代或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列构成的第一结构域 蛋白或者多个所述第一结构域蛋白串联而成的蛋白质 ； (z2) 由在序列表 3 中示出的氨基酸 序列中共有序列以外的部分经过缺失、 取代或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列构成的 第二结构域蛋白或者多个所述第二结构域蛋白串联而成的蛋白质 ； (z3) 由在序列表 4 中示 出的氨基酸序列中共有序列以外的部分经过缺失、 取代或添加一个或多个氨基酸的氨基酸 序列构成的第三结构域蛋白或者多个所述第三结构域蛋白串联而成的蛋白质。
     并且， 具有上述的第一结构域蛋白、 第二结构域蛋白或第三结构域蛋白的任意一 种本蛋白质， 也可以是多个该第一结构域蛋白、 第二结构域蛋白或第三结构域蛋白直接串 联而成的蛋白质。但是， 本蛋白质不限于此， 也可以是包含结构域之间的连接部分的蛋白 质。
     并且， 本蛋白质例如是由动物的 AIM 的氨基酸序列经过缺失、 取代或添加一个或 多个氨基酸的与该动物的 AIM 的氨基酸序列具有 80％以上的同源性的氨基酸序列构成， 且 具有脂肪分化抑制功能和 / 或脂解功能的蛋白质。 此时， 动物只要是人以外的动物， 没有特别限制， 例如是哺乳动物 ( 例如， 小鼠、 大 鼠、 天竺鼠等啮齿类 ； 兔； 狗； 猫； 猪； 牛； 马； 猴 )。更加具体地， 例如是小鼠、 狗或者猫。
     即， 本蛋白质例如是由序列表 5 中示出的氨基酸序列 ( 小鼠 AIM 的氨基酸序列 ) 经过缺失、 取代或添加一个或多个氨基酸的与序列表 5 中示出的氨基酸序列具有 80％以上 的同源性的氨基酸序列构成， 且具有脂肪分化抑制功能和 / 或脂解功能的蛋白质。
     此时， 本蛋白质也可以是分泌蛋白。并且， 本蛋白质也可以具有凋亡抑制功能。
     并且， 同样地， 本蛋白质例如是由序列表 11 中示出的氨基酸序列 ( 狗 AIM 的氨基 酸序列 )、 序列表 12 中示出的氨基酸序列 ( 黑猩猩 AIM 的氨基酸序列 ) 或者序列表 13 中示 出的氨基酸序列 ( 大鼠 AIM 的氨基酸序列 ) 经过缺失、 取代或添加一个或多个氨基酸的与 序列表 11、 序列表 12 或者序列表 13 中示出的氨基酸序列具有 80％以上的同源性的氨基酸 序列构成， 且具有脂肪分化抑制功能和 / 或脂解功能的蛋白质。
     进一步地， 本蛋白质例如是由动物的 AIM 的氨基酸序列经过缺失、 取代或添加一 个或几个氨基酸的氨基酸序列构成， 且具有脂肪分化抑制功能和 / 或脂解功能的蛋白质。
     此时， 动物只要是人以外的动物， 没有特别限制， 例如是哺乳动物 ( 例如， 小鼠、 大 鼠、 天竺鼠等啮齿类 ； 兔； 狗； 猫； 猪； 牛； 马； 猴 )。更加具体地， 例如是小鼠、 狗或者猫。
     即， 本蛋白质例如是由序列表 5 中示出的氨基酸序列 ( 小鼠 AIM 的氨基酸序列 ) 经过缺失、 取代或添加一个或几个氨基酸的氨基酸序列构成， 且具有脂肪分化抑制功能和 / 或脂解功能的蛋白质。
     此时， 本蛋白质例如是由与序列表 5 中示出的氨基酸序列具有 80％以上的同源性 的氨基酸序列构成的蛋白质。并且， 本蛋白质也可以是分泌蛋白。并且， 本蛋白质也可以具 有凋亡抑制功能。
     并且， 同样地， 本蛋白质例如是由序列表 11 中示出的氨基酸序列 ( 狗 AIM 的氨基 酸序列 )、 序列表 12 中示出的氨基酸序列 ( 黑猩猩 AIM 的氨基酸序列 ) 或者序列表 13 中示 出的氨基酸序列 ( 大鼠 AIM 的氨基酸序列 ) 经过缺失、 取代或添加一个或几个氨基酸的氨
     基酸序列构成， 且具有脂肪分化抑制功能和 / 或脂解功能的蛋白质。
     并且， 本蛋白质例如是由具有 SRCR1 结构域、 SRCR2 结构域以及 SRCR3 结构域的 动物的 AIM 的氨基酸序列经过缺失、 取代或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列构成， 并 且由该 SRCR1 结构域的氨基酸序列或者该 SRCR1 结构域的氨基酸序列经过缺失、 取代或添 加一个或多个氨基酸的与该 SRCR1 结构域的氨基酸序列具有 80％以上的同源性的氨基酸 序列构成的第一结构域、 由该 SRCR2 结构域的氨基酸序列或者该 SRCR2 结构域的氨基酸序 列经过缺失、 取代或添加一个或多个氨基酸的与该 SRCR2 结构域的氨基酸序列具有 80％以 上的同源性的氨基酸序列构成的第二结构域、 以及由该 SRCR3 结构域的氨基酸序列或者该 SRCR3 结构域的氨基酸序列经过缺失、 取代或添加一个或多个氨基酸的与该 SRCR3 结构域 的氨基酸序列具有 80％以上的同源性的氨基酸序列构成的第三结构域串联而成， 而且具有 脂肪分化抑制功能和 / 或脂解功能的蛋白质。
     此时， 本蛋白质也可以是由与动物的 AIM 的氨基酸序列具有 80％以上的同源性的 氨基酸序列构成的蛋白质。并且， 本蛋白质也可以是分泌蛋白。并且， 本蛋白质也可以具有 凋亡抑制功能。并且， 本蛋白质也可以是其氨基酸序列所包含的氨基酸数目为 300 ～ 400 个， 优选为 320 ～ 380 个， 更优选为 340 ～ 360 个的蛋白质。
     并且， 第一结构域、 第二结构域以及第三结构域中的至少一个结构域也可以是由 与该至少一个结构域对应的 SRCR 结构域的氨基酸序列经过缺失、 取代或添加一个或多个 氨基酸的与该对应的 SRCR 结构域的氨基酸序列具有 80％以上的同源性的氨基酸序列构成 的结构域。并且， 第一结构域、 第二结构域以及第三结构域也可以从 N 末端侧依次连接。
     此时， 动物只要是人以外的动物， 没有特别限制， 例如是哺乳动物 ( 例如， 小鼠、 大 鼠、 天竺鼠等啮齿类 ； 兔； 狗； 猫； 猪； 牛； 马； 猴 )。更加具体地， 例如是小鼠、 狗或者猫。
     即， 例如， 动物的 AIM 的氨基酸序列是序列表 5 中示出的氨基酸序列 ( 小鼠 AIM 的 氨基酸序列 )， SRCR1 结构域的氨基酸序列是序列表 6 中示出的氨基酸序列， SRCR2 结构域 的氨基酸序列是序列表 7 中示出的氨基酸序列， SRCR3 结构域的氨基酸序列是序列表 8 中 示出的氨基酸序列。
     并且， 同样地， 动物的 AIM 的氨基酸序列例如也可以是序列表 11 中示出的氨基酸 序列 ( 狗 AIM 的氨基酸序列 )、 序列表 12 中示出的氨基酸序列 ( 黑猩猩 AIM 的氨基酸序列 ) 或序列表 13 中示出的氨基酸序列 ( 大鼠 AIM 的氨基酸序列 )。
     进一步地， 本蛋白质例如是由所述 SRCR1 结构域的氨基酸序列或者该 SRCR1 结构 域的氨基酸序列经过缺失、 取代或添加一个或几个氨基酸的氨基酸序列构成的第一结构 域、 由所述 SRCR2 结构域的氨基酸序列或者该 SRCR2 结构域的氨基酸序列经过缺失、 取代或 添加一个或几个氨基酸的氨基酸序列构成的第二结构域、 以及由所述 SRCR3 结构域的氨基 酸序列或者该 SRCR3 结构域的氨基酸序列经过缺失、 取代或添加一个或几个氨基酸的氨基 酸序列构成的第三结构域串联而成， 且具有脂肪分化抑制功能和 / 或脂解功能的蛋白质。
     此时， 同样地， 动物只要是人以外的动物， 没有特别限制， 例如是哺乳动物 ( 例如， 小鼠、 大鼠、 天竺鼠等啮齿类 ； 兔； 狗； 猫； 猪； 牛； 马； 猴 )。 更加具体地， 例如是小鼠、 狗或者 猫。
     即， 本蛋白质例如是由序列表 6 中示出的氨基酸序列或者序列表 6 中示出的氨基 酸序列经过缺失、 取代或添加一个或几个氨基酸的氨基酸序列构成的第一结构域、 由序列表 7 中示出的氨基酸序列或者序列表 7 中示出的氨基酸序列经过缺失、 取代或添加一个或 几个氨基酸的氨基酸序列构成的第二结构域、 以及由序列表 8 中示出的氨基酸序列或者序 列表 8 中示出的氨基酸序列经过缺失、 取代或添加一个或几个氨基酸的氨基酸序列构成的 第三结构域串联而成， 且具有脂肪分化抑制功能和 / 或脂解功能的蛋白质。
     即， 该本蛋白质具有三个结构域， 即小鼠 AIM 的 SRCR1 结构域或者在该结构域中发 生变异的结构域、 SRCR2 结构域或者在该结构域中发生变异的结构域、 以及 SRCR3 结构域或 者在该结构域中发生变异的结构域。并且， 此时， 本蛋白质是由序列表 5 中示出的氨基酸序 列经过缺失、 取代或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列构成的蛋白质。 即， 本蛋白质也可 以是由与序列表 5 中示出的氨基酸序列具有 80％以上的同源性的氨基酸序列构成的蛋白 质。并且， 本蛋白质也可以是分泌蛋白。并且， 本蛋白质也可以具有凋亡抑制功能。并且， 本蛋白质也可以是其氨基酸序列所包含的氨基酸数目为 300 ～ 400 个， 优选为 320 ～ 380 个， 更优选为 340 ～ 360 个的蛋白质。
     并且， 本蛋白质例如是由所述 SRCR1 结构域的氨基酸序列构成的第一结构域、 由 所述 SRCR2 结构域的氨基酸序列构成的第二结构域、 以及由所述 SRCR3 结构域的氨基酸序 列构成的第三结构域串联而成， 且具有脂肪分化抑制功能和 / 或脂解功能的蛋白质。
     此时， 同样地， 动物只要是人以外的动物， 没有特别限制， 例如是哺乳动物 ( 例如， 小鼠、 大鼠、 天竺鼠等啮齿类 ； 兔； 狗； 猫； 猪； 牛； 马； 猴 )。 更加具体地， 例如是小鼠、 狗或者 猫。
     即， 本蛋白质例如是由序列表 5 中示出的氨基酸序列经过缺失、 取代或添加一个 或多个氨基酸的氨基酸序列构成， 并且由序列表 6 中示出的氨基酸序列构成的第一结构域 ( 小鼠 AIM 的 SRCR1 结构域 )、 由序列表 7 中示出的氨基酸序列构成的第二结构域 ( 小鼠 AIM 的 SRCR2 结构域 )、 以及由序列表 8 中示出的氨基酸序列构成的第三结构域 ( 小鼠 AIM 的 SRCR3 结构域 ) 串联而成， 且具有脂肪分化抑制功能和 / 或脂解功能的蛋白质。
     即， 该本蛋白质作为 SRCR 结构域具有三个， 即小鼠 AIM 的 SRCR1 结构域、 SRCR2 结 构域以及 SRCR3 结构域。并且， 此时， 本蛋白质也可以是由与序列表 5 中示出的氨基酸序列 具有 80％以上的同源性的氨基酸序列构成的蛋白质。即， 本蛋白质例如也可以是由序列表 5 中示出的氨基酸序列经过缺失、 取代或添加一个或几个氨基酸的氨基酸序列构成的蛋白 质。并且， 本蛋白质也可以是分泌蛋白。并且， 本蛋白质也可以具有凋亡抑制功能。并且， 本蛋白质也可以是其氨基酸序列所包含的氨基酸数目为 300 ～ 400 个， 优选为 320 ～ 380 个， 更优选为 340 ～ 360 个的蛋白质。
     并且， 具有上述的第一结构域、 第二结构域以及第三结构域的任意一种本蛋白质， 也可以是该第一结构域、 第二结构域以及第三结构域直接串联而成， 且具有脂肪分化抑制 功能和 / 或脂解功能的蛋白质。
     即， 此时， 本蛋白质是由第一结构域的氨基酸序列、 第二结构域的氨基酸序列以及 第三结构域的氨基酸序列直接串联而成的氨基酸序列构成的蛋白质。但是， 包含上述的第 一结构域、 第二结构域以及第三结构域的本蛋白质， 不限于此， 也可以是包含结构域之间的 连接部分的蛋白质。
     并且， 本蛋白质例如是由具有 SRCR1 结构域、 SRCR2 结构域以及 SRCR3 结构域的 动物的 AIM 的氨基酸序列经过缺失、 取代或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列构成， 并且由该 SRCR1 结构域的氨基酸序列或者在该 SRCR1 结构域的氨基酸序列中除了共有序列 以外的部分经过缺失、 取代或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列构成的第一结构域、 由 该 SRCR2 结构域的氨基酸序列或者在该 SRCR2 结构域的氨基酸序列中除了共有序列以外的 部分经过缺失、 取代或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列构成的第二结构域、 以及由该 SRCR3 结构域的氨基酸序列或者在该 SRCR3 结构域的氨基酸序列中除了共有序列以外的部 分经过缺失、 取代或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列构成的第三结构域串联而成， 而 且具有脂肪分化抑制功能和 / 或脂解功能的蛋白质。
     此时， 本蛋白质也可以是由与动物的 AIM 的氨基酸序列具有 80％以上的同源性的 氨基酸序列构成的蛋白质。并且， 本蛋白质也可以是分泌蛋白。并且， 本蛋白质也可以具有 凋亡抑制功能。并且， 本蛋白质也可以是其氨基酸序列所包含的氨基酸数目为 300 ～ 400 个， 优选为 320 ～ 380 个， 更优选为 340 ～ 360 个的蛋白质。
     并且， 第一结构域、 第二结构域以及第三结构域中的至少一个结构域也可以是由 在该至少一个结构域对应的 SRCR 结构域的氨基酸序列中共有序列以外的部分经过缺失、 取代或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列构成的结构域。 并且， 第一结构域、 第二结构域 以及第三结构域中的至少一个结构域也可以是由与该至少一个结构域所对应的 SRCR 结构 域的氨基酸序列具有 80％以上的同源性的氨基酸序列构成的结构域。 即， 第一结构域、 第二 结构域以及第三结构域中的至少一个结构域也可以是由在该至少一个结构域对应的 SRCR 结构域的氨基酸序列中共有序列以外的部分经过缺失、 取代或添加一个或几个氨基酸的氨 基酸序列构成的结构域。并且， 第一结构域、 第二结构域以及第三结构域也可以从 N 末端侧 依次连接。
     动物只要是人以外的动物， 没有特别限制， 例如是哺乳动物 ( 例如， 小鼠、 大鼠、 天 竺鼠等啮齿类 ； 兔； 狗； 猫； 猪； 牛； 马； 猴 )。更加具体地， 例如是小鼠、 狗或者猫。
     即， 本蛋白质例如是由序列表 6 中示出的氨基酸序列或者序列表 6 中示出的氨基 酸序列中共有序列 ( 图 3 中示出的 SRCR1 结构域部分的共有序列 ) 以外的部分经过缺失、 取代或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列构成的第一结构域、 由序列表 7 中示出的氨基 酸序列或者序列表 7 中示出的氨基酸序列中共有序列 ( 图 3 中示出的 SRCR2 结构域部分的 共有序列 ) 以外的部分经过缺失、 取代或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列构成的第二 结构域、 以及由序列表 8 中示出的氨基酸序列或者序列表 8 中示出的氨基酸序列中共有序 列 ( 图 3 中示出的 SRCR3 结构域部分的共有序列 ) 以外的部分经过缺失、 取代或添加一个 或多个氨基酸的氨基酸序列构成的第三结构域串联而成， 且具有脂肪分化抑制功能和 / 或 脂解功能的蛋白质。
     即， 该本蛋白质作为 SRCR 结构域具有三个， 即小鼠 AIM 的 SRCR1 结构域或者在小 鼠 AIM 的 SRCR1 结构域的共有序列以外的部分发生变异的结构域、 小鼠 AIM 的 SRCR2 结构 域或者在 SRCR2 结构域的共有序列以外的部分发生变异的结构域、 以及小鼠 AIM 的 SRCR3 结构域或者在 SRCR3 结构域的共有序列以外的部分发生变异的结构域。并且， 此时， 本蛋白 质可以是由与序列表 5 中示出的氨基酸序列具有 80％以上的同源性的氨基酸序列构成的 蛋白质。并且， 本蛋白质也可以是分泌蛋白。并且， 本蛋白质也可以具有凋亡抑制功能。并 且， 本蛋白质也可以是其氨基酸序列所包含的氨基酸数目为 300 ～ 400 个， 优选为 320 ～ 380 个， 更优选为 340 ～ 360 个的蛋白质。并且， 同样地， 动物的 AIM 的氨基酸序列例如也可以是序列表 11 中示出的氨基酸 序列 ( 狗 AIM 的氨基酸序列 )、 序列表 12 中示出的氨基酸序列 ( 黑猩猩 AIM 的氨基酸序列 ) 或序列表 13 中示出的氨基酸序列 ( 大鼠 AIM 的氨基酸序列 )。
     并且， 包含上述的在共有序列以外的部分发生变异的第一结构域、 第二结构域以 及第三结构域的任意一种本蛋白质， 也可以是该第一结构域、 第二结构域以及第三结构域 直接串联而成， 且具有脂肪分化抑制功能和 / 或脂解功能的蛋白质。
     即， 此时， 本蛋白质是由第一结构域的氨基酸序列、 第二结构域的氨基酸序列以及 第三结构域的氨基酸序列直接串联而成的氨基酸序列构成的蛋白质。但是， 包含上述的在 共有序列以外的部分发生变异的第一结构域、 第二结构域以及第三结构域的本蛋白质， 不 限于此， 也可以是包含结构域之间的连接部分的蛋白质。
     并且， 本蛋白质例如是下述的 (p1)、 (p2) 或 (p3) 蛋白质， 且具有脂肪分化抑制功 能和 / 或脂解功能的蛋白质。(p1) 由动物的 AIM 的 SRCR1 结构域的氨基酸序列构成的第一 结构域蛋白或者多个所述第一结构域蛋白串联而成的蛋白质 ； (p2) 由动物的 AIM 的 SRCR2 结构域的氨基酸序列构成的第二结构域蛋白或者多个所述第二结构域蛋白串联而成的蛋 白质 ； (p3) 由动物的 AIM 的 SRCR3 结构域的氨基酸序列构成的第三结构域蛋白或者多个所 述第三结构域蛋白串联而成的蛋白质。
     即， 此时， 本蛋白质例如是由动物 AIM 的 SRCR1 结构域构成的蛋白质 ( 第一结构域 蛋白 )， 或者多个该 SRCR1 结构域串联而成的蛋白质 ( 所述 (p1) 的蛋白质 )。并且， 本蛋白 质例如是由动物 AIM 的 SRCR2 结构域构成的蛋白质 ( 第二结构域蛋白 )， 或者多个该 SRCR2 结构域串联而成的蛋白质 ( 所述 (p2) 的蛋白质 )。并且， 本蛋白质例如是由动物 AIM 的 SRCR3 结构域构成的蛋白质 ( 第三结构域蛋白 )， 或者多个该 SRCR3 结构域串联而成的蛋白 质 ( 所述 (p3) 的蛋白质 )。
     并且， 同样地， 本蛋白质例如是下述的 (q1)、 (q2) 或 (q3) 蛋白质， 且具有脂肪分 化抑制功能和 / 或脂解功能的蛋白质。(q1) 由动物的 AIM 的 SRCR1 结构域的氨基酸序列 经过缺失、 取代或添加一个或多个氨基酸的与所述 SRCR1 结构域的氨基酸序列具有 80％以 上的同源性的氨基酸序列构成的第一结构域蛋白或者多个所述第一结构域蛋白直接串联 而成的蛋白质 ； (q2) 由动物的 AIM 的 SRCR2 结构域的氨基酸序列经过缺失、 取代或添加一 个或多个氨基酸的与所述 SRCR2 结构域的氨基酸序列具有 80％以上的同源性的氨基酸序 列构成的第二结构域蛋白或者多个所述第二结构域蛋白直接串联而成的蛋白质 ； (q3) 由 动物的 AIM 的 SRCR3 结构域的氨基酸序列经过缺失、 取代或添加一个或多个氨基酸的与所 述 SRCR3 结构域的氨基酸序列具有 80％以上的同源性的氨基酸序列构成的第三结构域蛋 白或者多个所述第三结构域蛋白直接串联而成的蛋白质。
     并且， 同样地， 本蛋白质例如是下述的 (r1)、 (r2) 或 (r3) 蛋白质， 且具有脂肪分化 抑制功能和 / 或脂解功能的蛋白质。(r1) 由动物的脂肪分化抑制功能和 / 或脂解功能的 SRCR1 结构域的氨基酸序列中共有序列以外的部分经过缺失、 取代或添加一个或多个氨基 酸的氨基酸序列构成的第一结构域蛋白或者多个所述第一结构域蛋白直接串联而成的蛋 白质 ； (r2) 由动物的脂肪分化抑制功能和 / 或脂解功能的 SRCR2 结构域的氨基酸序列中共 有序列以外的部分经过缺失、 取代或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列构成的第二结构 域蛋白或者多个所述第二结构域蛋白直接串联而成的蛋白质 ； (r3) 由动物的脂肪分化抑制功能和 / 或脂解功能的 SRCR3 结构域的氨基酸序列中共有序列以外的部分经过缺失、 取 代或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列构成的第三结构域蛋白或者多个所述第三结构 域蛋白直接串联而成的蛋白质。
     并且， 具有上述的第一结构域蛋白、 第二结构域蛋白或第三结构域蛋白的任意一 种本蛋白质， 也可以是多个该第一结构域蛋白、 第二结构域蛋白或第三结构域蛋白直接串 联而成的蛋白质。但是， 本蛋白质不限于此， 也可以是包含结构域之间的连接部分的蛋白 质。
     此时， 动物只要是人以外的动物， 没有特别限制， 例如是哺乳动物 ( 例如， 小鼠、 大 鼠、 天竺鼠等啮齿类 ； 兔； 狗； 猫； 猪； 牛； 马； 猴 )。更加具体地， 例如是小鼠、 狗或者猫。
     即， 例如， 当动物的 AIM 是小鼠 AIM 时， 所述 SRCR1 结构域的氨基酸序列是序列表 6 中示出的氨基酸序列， 所述 SRCR2 结构域的氨基酸序列是序列表 7 中示出的氨基酸序列， 所述 SRCR3 结构域的氨基酸序列是序列表 8 中示出的氨基酸序列。
     并且， 同样地， 动物的 AIM 的氨基酸序列例如也可以是序列表 11 中示出的氨基酸 序列 ( 狗 AIM 的氨基酸序列 )、 序列表 12 中示出的氨基酸序列 ( 黑猩猩 AIM 的氨基酸序列 ) 或序列表 13 中示出的氨基酸序列 ( 大鼠 AIM 的氨基酸序列 )。
     本药物组合物作为有效成分而包含上述的本蛋白质中的一种或多种。并且， 本药 物组合物可以进一步包含药学上可接受的载体。 对于药学上可接受的载体， 没有特别限制， 例如可以优选使用能够在抗体药学等所谓的蛋白质制剂中使用的载体。具体而言， 例如可 以使用在赋形剂、 溶剂、 稀释剂、 分散剂、 乳化剂、 助溶剂、 悬浮剂、 稳定剂、 等张剂、 缓冲剂、 pH 调节剂、 安抚剂、 防腐剂、 抗氧化剂中的一种或两种以上。
     对于本药物组合物的剂型， 没有特别限制， 例如可以制备成注射剂、 片剂、 丸剂、 胶 囊剂、 散剂、 颗粒剂、 液剂、 糖浆剂。即， 本医药组合物例如可以制备成注射到生物机体组织 内的局部注射剂 ； 注射到血管内的静脉注射剂、 动脉注射剂或者滴剂 ； 腹腔内给药的注射 剂。
     当本药物组合物为局部注射剂时， 本药物组合物例如可以制备成直接注射到脂肪 组织 ( 内脏脂肪组织、 皮下脂肪组织等 ) 的脂肪组织注射剂、 皮下注射剂、 肌肉注射剂。
     并且， 当本药物组合物为注射剂时， 本药物组合物例如可以将含有本蛋白质和上 述的药学上可接受的载体的溶液经过冷冻干燥等方法进行干燥， 制备成粉末状， 并于安瓶 等容器中无菌保存。在此， 本发明的发明人确认出 AIM 的功能不会因这种干燥以及再溶解 而被破坏。
     并且， 给予本药物组合物时， 将其粉末溶解于适当的溶剂 ( 例如， 生理盐水、 林格 氏溶液、 其他注射用溶液 ) 中， 由此配制出由将本蛋白质作为有效成分而包含的液状注射 剂形成的本药物组合物。 并且， 当本药物组合物为注射剂时， 例如还可以将含有本蛋白质和 上述的药学上可接受的载体的溶液直接无菌保存于安瓶等容器中。
     本药物组合物中的本蛋白质的含量， 根据剂型、 剂量等而适当地确定， 例如本药物 组合物可以被制备成包含 0.1 ～ 10 重量％的本蛋白质的液状注射剂。
     本药物组合物用于人或动物的疾病诊断、 治疗或预防中。动物只要是人以外的动 物， 没有特别限制， 但优选表达野生型 AIM， 其脂肪细胞表达 CD36 的动物。具体而言， 动物 例如是哺乳动物 ( 例如， 小鼠、 大鼠、 天竺鼠等啮齿类 ； 兔； 狗； 猫； 猪； 牛； 马； 猴 )， 更加具体地， 例如是小鼠、 狗或者猫。即， 本药物组合物例如用于人或人以外的哺乳动物 ( 例如， 小 鼠、 大鼠、 天竺鼠等啮齿类 ； 兔； 狗； 猫； 猪； 牛； 马； 猴 ) 的疾病诊断、 治疗或预防中， 更加具 体地， 例如用于人、 小鼠、 狗或者猫的疾病诊断、 治疗或预防中。
     即， 本药物组合物例如是给予人的药物组合物 ( 人用药物组合物 )。并且， 本药物 组合物例如是给予动物的药物组合物 ( 动物用药物组合物 )。动物只要是人以外的动物， 没有特别限制， 但优选表达野生型 AIM， 其脂肪细胞表达 CD36 的动物。具体而言， 动物例如 是哺乳动物 ( 例如， 小鼠、 大鼠、 天竺鼠等啮齿类 ； 兔； 狗； 猫； 猪； 牛； 马； 猴 )， 更加具体地， 例如是小鼠、 狗或者猫。即， 本药物组合物例如是给予人或人以外的哺乳动物 ( 例如， 小鼠、 大鼠、 天竺鼠等啮齿类 ； 兔； 狗； 猫； 猪； 牛； 马； 猴 ) 的药物组合物， 更加具体地， 例如是给予 人、 小鼠、 狗或者猫的药物组合物。
     在此， 对于成为本药物组合物适用对象的疾病， 应当广义地解释， 包括在生物机体 的结构或功能上有任意不适感的所有的状态。 即， 本药物组合物例如是为了诊断、 治疗或预 防代谢性疾病 (metabolic disorder， 代谢失调 )、 脂肪瘤 ( 肿瘤 )、 ( 包括神经的 ) 退化性 疾病而向生物机体给予的药物组合物。这些疾病领域中， 例如还包括诸如糖尿病、 肥胖症、 高血压、 动脉硬化等心血管疾病 ； 脂肪瘤。 更加具体地， 本药物组合物例如为了诊断、 治疗或预防与脂肪组织有关的不适感 而使用。 作为与脂肪组织有关的不适感， 例如可以举出肥胖、 脂肪肉瘤 (liposarcoma)。 即， 本药物组合物将消除或预防伴随肥胖而引起的不适感作为目的， 为了适当调节内脏脂肪和 / 或皮下脂肪的量而使用。并且， 本药物组合物为了缩小脂肪肉瘤或者抑制其增大而使用。 并且， 本药物组合物例如还可以将调节外形上能看到的期望的部位的脂肪组织的量作为目 的， 用于美容整形或整形外科上的治疗中。 即， 本药物组合物将减少脂肪组织、 抑制其增加、 降低其增加程度作为目的， 向生物机体给药。
     并且， 本实施方式所涉及的方法 ( 以下， 称为 “本方法” 。) 中的一个， 例如是向生 物机体给予有效量的本蛋白质的方法。即， 本方法是向生物机体给予上述的本药物组合物 的方法。
     在此， 生物机体例如是人。 并且， 生物机体例如是动物。 动物只要是人以外的动物， 没有特别限制， 但优选表达野生型 AIM， 其脂肪细胞表达 CD36 的动物。具体而言， 动物例如 是哺乳动物 ( 例如， 小鼠、 大鼠、 天竺鼠等啮齿类 ； 兔； 狗； 猫； 猪； 牛； 马； 猴 )， 更加具体地， 例如是小鼠、 狗或者猫。
     本方法例如是为了诊断、 治疗或者预防人或人以外的哺乳动物的疾病， 向该人或 人以外的哺乳动物给予对该诊断、 治疗或者预防有效的量的本蛋白质 ( 即， 本药物组合物 ) 的方法。
     对于本蛋白质的给药方法， 没有特别限制， 例如可以举出， 通过局部注射等的局部 给药、 通过静脉注射、 动脉注射、 点滴注射等的血管内给药、 口服给药。
     当将本蛋白质局部给药时， 例如， 将本药物组合物配制成注射剂， 利用注射器等局 部给药器具， 将该注射剂注射到生物机体的组织内。即， 例如以消除或预防肥胖、 美容整形 等作为目的， 将本药物组合物直接注射到内脏脂肪组织或皮下脂肪组织等脂肪组织内。并 且， 例如， 对于患有脂肪肉瘤的患者， 将本药物组合物局部注射到该脂肪肉瘤组织内。
     当将本蛋白质向血管内给药时， 将本药物组合物配制成注射剂， 并利用注射器、 输
     液器具等血管内给药器具， 将该注射剂注射到生物机体的血管内。当将本蛋白质口服给药 时， 将本药物组合物配制成诸如片剂、 丸剂、 胶囊剂、 散剂、 颗粒剂、 液剂、 糖浆剂等口服给药 剂， 并使患者服用该口服给药剂。在此， AIM 在 pH 值 2 ～ 3 左右的酸性条件下， 其分子结构 仍稳定， 不会丧失功能。
     如此， 可以通过将本蛋白质向生物机体内给药， 有效地减少该生物机体内的脂肪 组织的量， 抑制其增加或者降低其增加的程度。其中， 当将本蛋白质通过注射给药时， 尤其 是将本蛋白质向脂肪组织内局部给药时， 可以更加有效地减少该脂肪组织的量， 抑制其增 加或者降低其增加的程度。
     本蛋白质的剂量根据给药对象的症状、 年龄、 体重等因素而适当地确定， 例如一次 剂量可以是每 1kg 体重给予 0.1 ～ 5mg。 当然， 本蛋白质的剂量只要是在对减少作为给药对 象的生物机体的脂肪组织， 抑制其增加或者降低其增加的程度有效的范围内， 则不限于上 述剂量。 即， 例如局部给药时， 由于可以使本蛋白质有效且确实地到达该本蛋白质的作用部 位， 因此与血管内给药等全身给药时相比， 可以减少剂量。
     并且， 本蛋白质的给药方案同样也根据给药对象的症状、 年龄、 体重等因素而适当 地确定， 例如可以以 1 周～几周的间隔， 实施几周～几月多次给药。
     根据这种本蛋白质的给药， 该本蛋白质在到达的生物机体的脂肪组织内， 可以诱 导成熟脂肪细胞中的脂肪的分解， 并且还可以抑制前脂肪细胞向成熟脂肪细胞的分化。 即， 本药物组合物例如还可以称为前脂肪细胞的分化抑制剂或成熟脂肪细胞中的脂肪分解诱 导剂。 并且， 给予本蛋白质的结果， 得到减少生物机体的脂肪组织的量、 抑制其增加、 降低其 增加的程度的效果， 进而能够得到降低体重的效果。
     并且， 本方法只要是与本蛋白质的使用有关的， 不限于上述示例。即， 本方法例如 是将本蛋白质作为药物组合物的有效成分而使用的方法。并且， 本方法例如是将本蛋白质 作为有效成分含有的药物组合物的制备方法。此时， 本方法例如也可以是将本蛋白质与药 学上可接受的载体混合， 制备含有该本蛋白质和该载体的药物组合物的方法。
     并且， 本蛋白质还可以适用于食品饮料。即， 本实施方式所涉及的食品饮料 ( 以 下， 称为 “本食品饮料” 。) 是含有本蛋白质 ( 即， 所述 (I)AIM 或 (II) 由 AIM 的氨基酸序列 经过缺失、 取代或添加一个或多个氨基酸的、 与所述氨基酸序列具有同源性的氨基酸序列 构成， 且具有脂肪分化抑制功能和 / 或脂肪分解功能的蛋白质 ) 的食品饮料。即， 本食品饮 料例如是含有本蛋白质的食品。并且， 本食品饮料例如是含有本蛋白质的饮料。
     并且， 本食品饮料例如是含有本蛋白质的经口摄入组合物。该经口摄入组合物例 如是不制备成药物， 而是使需要者类似于维生素剂等机能增强剂辅助摄取的组合物， 例如 制备成片剂、 胶囊剂、 颗粒、 凝胶等形态。 并且， 本食品饮料例如是含有本蛋白质的食品饮料 用添加剂。 该食品饮料用添加剂例如是在食品饮料制造工艺中作为部分原料而使用或者添 加到原料中的组合物。
     并且， 与本食品饮料相关的本方法例如是将本蛋白质作为食品饮料的部分原料而 使用的方法。并且， 本方法是制造含有本蛋白质的食品饮料的方法。此时， 本方法例如也可 以是将本蛋白质与其他原料混合， 制造含有该本蛋白质和该其他原料的食品饮料的方法。
     在此， 记载本发明的一方面。本发明的一种实施方式所涉及的药物组合物是将作 为有效成分而含有以下的 (a) 至 (l) 中一种或多种蛋白质作为特征的药物组合物。(a) 由序列表 1 中示出的氨基酸序列构成的蛋白质 ； (b) 由序列表 5 中示出的氨基酸序列构成的 蛋白质 ； (c) 由序列表 1 中示出的氨基酸序列经过缺失、 取代或添加一个或几个氨基酸的氨 基酸序列构成， 且具有抑制前脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化的功能和 / 或在成熟脂肪细胞 中诱导脂滴分解的功能的蛋白质 ； (d) 由序列表 5 中示出的氨基酸序列经过缺失、 取代或 添加一个或几个氨基酸的氨基酸序列构成， 且具有抑制前脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化的 功能和 / 或在成熟脂肪细胞中诱导脂滴分解的功能的蛋白质 ； (e) 由序列表 1 中示出的氨 基酸序列经过缺失、 取代或添加一个或多个氨基酸的与该序列表 1 示出的氨基酸序列具有 80％以上的同源性的氨基酸序列构成， 且具有抑制前脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化的功能 和 / 或在成熟脂肪细胞中诱导脂滴分解的功能的蛋白质 ； (f) 由序列表 5 中示出的氨基酸 序列经过缺失、 取代或添加一个或多个氨基酸的与该序列表 5 示出的氨基酸序列具有 80％ 以上的同源性的氨基酸序列构成， 且具有抑制前脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化的功能和 / 或在成熟脂肪细胞中诱导脂滴分解的功能的蛋白质 ； (g) 由序列表 2 中示出的氨基酸序列 构成的第一结构域、 由序列表 3 中示出的氨基酸序列构成的第二结构域以及由序列表 4 中 示出的氨基酸序列构成的第三结构域串联而成， 且具有抑制前脂肪细胞向成熟脂肪细胞分 化的功能和 / 或在成熟脂肪细胞中诱导脂滴分解的功能的蛋白质 ； (h) 由序列表 6 中示出 的氨基酸序列构成的第一结构域、 由序列表 7 中示出的氨基酸序列构成的第二结构域以及 由序列表 8 中示出的氨基酸序列构成的第三结构域串联而成， 且具有抑制前脂肪细胞向成 熟脂肪细胞分化的功能和 / 或在成熟脂肪细胞中诱导脂滴分解的功能的蛋白质 ； (i) 由序 列表 2 中示出的氨基酸序列或者序列表 2 中示出的氨基酸序列经过缺失、 取代或添加一个 或几个氨基酸的氨基酸序列构成的第一结构域、 由序列表 3 中示出的氨基酸序列或者序列 表 3 中示出的氨基酸序列经过缺失、 取代或添加一个或几个氨基酸的氨基酸序列构成的第 二结构域以及由序列表 4 中示出的氨基酸序列或者序列表 4 中示出的氨基酸序列经过缺 失、 取代或添加一个或几个氨基酸的氨基酸序列构成的第三结构域串联而成， 且具有抑制 前脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化的功能和 / 或在成熟脂肪细胞中诱导脂滴分解的功能的 蛋白质 ； (j) 由序列表 6 中示出的氨基酸序列或者序列表 6 中示出的氨基酸序列经过缺失、 取代或添加一个或几个氨基酸的氨基酸序列构成的第一结构域、 由序列表 7 中示出的氨基 酸序列或者序列表 7 中示出的氨基酸序列经过缺失、 取代或添加一个或几个氨基酸的氨基 酸序列构成的第二结构域以及由序列表 8 中示出的氨基酸序列或者序列表 8 中示出的氨 基酸序列经过缺失、 取代或添加一个或几个氨基酸的氨基酸序列构成的第三结构域串联而 成， 且具有抑制前脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化的功能和 / 或在成熟脂肪细胞中诱导脂滴 分解的功能的蛋白质 ； (k) 由序列表 2 中示出的氨基酸序列或者在序列表 2 中示出的氨基 酸序列中共有序列以外的部分经过缺失、 取代或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列构成 的第一结构域、 由序列表 3 中示出的氨基酸序列或者在序列表 3 中示出的氨基酸序列中共 有序列以外的部分经过缺失、 取代或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列构成的第二结构 域以及由序列表 4 中示出的氨基酸序列或者在序列表 4 中示出的氨基酸序列中共有序列以 外的部分经过缺失、 取代或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列构成的第三结构域串联而 成， 且具有抑制前脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化的功能和 / 或在成熟脂肪细胞中诱导脂滴 分解的功能的蛋白质 ； (l) 由序列表 6 中示出的氨基酸序列或者在序列表 6 中示出的氨基 酸序列中共有序列以外的部分经过缺失、 取代或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列构成的第一结构域、 由序列表 7 中示出的氨基酸序列或者在序列表 7 中示出的氨基酸序列中共 有序列以外的部分经过缺失、 取代或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列构成的第二结构 域以及由序列表 8 中示出的氨基酸序列或者在序列表 8 中示出的氨基酸序列中共有序列以 外的部分经过缺失、 取代或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列构成的第三结构域串联而 成， 且具有抑制前脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化的功能和 / 或在成熟脂肪细胞中诱导脂滴 分解的功能的蛋白质。
     本发明的一种实施方式所涉及的方法的特征在于， 向生物机体给予所述药物组合 物。并且， 本发明的一种实施方式所涉及的方法的特征在于， 向生物机体给予所述 (a) 至 (l) 中一种或多种蛋白质的有效量。并且， 本发明的一种实施方式所涉及的方法的特征在 于， 将所述 (a) 至 (l) 中一种或多种蛋白质作为药物组合物的有效成分使用。并且， 本发明 的一种实施方式所涉及的方法的特征在于， 制备作为有效成分而含有所述 (a) 至 (l) 中一 种或多种蛋白质的药物组合物。并且， 本发明的一种实施方式所涉及的食品饮料的特征在 于， 含有所述 (a) 至 (l) 中一种或多种蛋白质。并且， 本发明的一种实施方式所涉及的方法 的特征在于， 制备含有所述 (a) 至 (l) 中一种或多种蛋白质的食品饮料。
     接着， 对本实施方式所涉及的具体实施例进行说明。
     实施例 1
     [ 脂肪组织中的巨噬细胞的 AIM 表达 ]
     对 C57BL/6 小鼠采用高脂饮食 (High Fat Diet ： HFD， 60 ％脂肪热量饲料 ) 喂养 20 周。并且， 同样也对肥胖程度更显著的脂联素 (adiponectin) 基因敲除小鼠 (Adipo-/- 小 鼠 )， 采用 HFD 喂养。然后， 从这些小鼠腹腔内部采集内脏脂肪组织。使用该脂肪组织制作 的石蜡切片用抗巨噬细胞单克隆抗体 (F4/80) 以及抗小鼠 AIM 多克隆抗体 (SA-1) 进行双 重染色。
     图 4 示出将染色的切片通过相差显微镜以及荧光显微镜观察的结果的一种示例。 图 4 中， 对于野生型的 C57BL/6 小鼠 (Wild-type) 以及 Adipo-/- 小鼠 (Adiponectin-/-)， 分 别示出相差显微镜照 (Phase)、 染色了巨噬细胞的荧光显微镜照 (F4/80 macrophage)、 染色 了 AIM 的荧光显微镜照 (AIM) 以及将这些荧光显微镜照合并的照片 (merge)。
     如图 4 所示， 可以确认， 在野生型小鼠以及 Adipo-/- 小鼠中， 均出现巨噬细胞染色 部分与 AIM 染色部分相重叠， 且浸润到脂肪组织的巨噬细胞强烈表达 AIM。
     实施例 2
     [AIM 的对脂肪细胞分化的抑制 ]
     为了研究浸润到脂肪组织的巨噬细胞所产生的 AIM 对周围的脂肪细胞起什么样 的作用， 进行了在 3T3L1 前脂肪细胞 (preadipocyte) 向成熟脂肪细胞分化的培养过程中用 AIM 处理的实验。
     即， 如图 5A 所示， 根据以下的互不相同的 4 种方案 a 至 d， 进行了 3T3L1 细胞的培 养。(a) 没有用 AIM 处理 ； (b) 从分化诱导刺激开始时起用 AIM 处理 10 天 (day2 ～ day12) ； (c) 仅在分化诱导前的增殖 (clonal expansion， 克隆增殖 ) 期间 (day(-2) ～ day2) 用 AIM 处理 ； (d) 仅在分化诱导刺激的初期 (day2 ～ day4) 用 AIM 处理。
     作为 AIM， 使用小鼠重组 AIM 蛋白质或者人类重组 AIM 蛋白质。这些重组 AIM 蛋白 质， 通过培养由小鼠或人类的 AIM 的表达载体转染的来源于人类的 HEK293T 细胞， 从该培养上清分离纯化而配制。其中， 在以下示出的其他实施例中， 作为 AIM 使用同样的重组 AIM 蛋 白质。AIM 处理， 通过在培养液中以 5μg/ml 浓度添加 AIM 而进行。
     并且， 如图 5A 所示， 3T3L1 细胞的分化诱导通过以下步骤进行 ： 首先， 培养 3T3L 1 细胞 4 天 (day(-2) ～ day2)， 使其增殖 (cell proliferation)， 然后在含有胰岛素、 地塞米 松 (DEX)、 3- 异丁基 -1- 甲基黄嘌呤 (IBMX) 的培养液中培养 2 天 (day2 ～ day4)， 由此开始 分化诱导刺激， 进一步地， 在含有胰岛素的培养液中培养 2 天 (day4 ～ day6)。
     分化诱导刺激期间 (day2 ～ day6) 过后， 在不含有这些分化诱导刺激因子的培养 液中继续培养。并且， 用油红 O(oil-red-o) 对从分化诱导刺激开始起第十天 (day12) 的细 胞进行染色， 观察从 3T3L1 细胞向成熟脂肪细胞的分化状况。
     图 5B 中示出， 分别对于四种方案 a ～ d， 用小鼠 AIM( 小鼠 rAIM) 或者人类 AIM( 人 类 rAIM) 处理的实验 ( 但是， 方案 a 是没有用 AIM 处理 ) 中得到的染色后的细胞的显微镜 照。其中， 对使用人类 AIM 的方案 c， 没有拍摄显微镜照 (N.D.)。
     如图 5B 所示， 根据方案 d 仅在分化诱导刺激的初期 (day2-day4) 用 AIM 处理时， 几乎没有观察到包含脂滴的细胞， 3T3L1 细胞的分化几乎完全被抑制住。即， AIM 在存在有 上述的分化诱导因子的情况下， 抑制 3T3L1 细胞的分化。
     在此需要说明的是， 配制包含有分化诱导因子和 AIM 的培养液之后， 利用纯化柱 从该培养液去除 AIM 时， 该分化诱导因子仍然没有丧失分化 3T3L1 细胞的能力 ( 没有示出 数据 )。因此， 认为分化诱导因子与 AIM 之间实质上不存在化学相互作用。
     并且， 根据方案 b 从分化诱导刺激开始时起用 AIM 处理 10 天 (day2-day12) 时， 也 几乎没有观察到包含脂滴的细胞， 3T3L1 细胞的分化几乎完全被抑制住。并且， 还确认出这 种 AIM 的分化抑制效果跟 AIM 浓度有关 ( 没有示出数据 )。即， 如果对 3T3L 1 细胞进行处 理的 AIM 的浓度减少到 1μg/ml、 0.1μg/ml， 则 AIM 的分化抑制效果也会下降。
     并且， 没有发现 AIM 的处理会增加死细胞数。因此， 认为 AIM 不会诱导细胞死亡， 而通过减少向成熟脂肪细胞分化的 3T3L1 细胞的数量来发挥分化抑制作用。
     另一方面， 根据方案 c 仅在分化诱导前 (day(-2)-day2) 用 AIM 处理时， 确认出与 根据方案 a 没有用 AIM 处理时同样地， 几乎所有的细胞包含有脂滴， 几乎所有的 3T3L1 细胞 分化成成熟脂肪细胞。即， 仅在分化诱导前使用 AIM 处理时， 3T3L1 细胞的向成熟脂肪细胞 的分化没有被抑制住。 但是， 从分化诱导前开始经过分化诱导期间且其后 (day(-2)-day12) 也继续用 AIM 处理时， 3T3L1 细胞的向脂肪细胞的分化完全被抑制住 ( 没有示出数据 )。
     在此， 小鼠 AIM 和人类 AIM 的氨基酸序列之间的同源性高达 68％左右。并且， 如 图 3 所示， 在小鼠 AIM 和人类 AIM 中， SRCR 结构域中的共有序列 (CD5、 CD6 等包含 SRCR 结 构域的其他分子中也保守的氨基酸序列 ) 完全一致。并且， 如上所述， 人类 AIM 与小鼠 AIM 同样地， 抑制作为来源于小鼠的细胞的 3T3L1 细胞的分化。即， 人与小鼠之间， 关于 AIM 功 能具有互换性。
     实施例 3
     [AIM 的脂滴分解 (lipolysis， 脂解作用 ) 的诱导 ]
     研究了对于成熟脂肪细胞的 AIM 的效果。 如图 6A 所示， 与上述的实施例 2 同样地， 作为方案 e 进行了以下培养实验。即， 从 3T3L1 细胞分化而在细胞质内形成脂滴开始用小 鼠 AIM 处理 6 天 (day6-day12)。并且， 用油红 O(oil-red-o) 对从分化诱导刺激开始起第十天 (day12) 的细胞进行 染色。 并且， 计算具有脂滴的细胞数。 进一步地， 对于具有脂滴的细胞， 测定脂滴的直径。 其 中， 为了进行比较， 对于通过上述的方案 a 培养的细胞以及通过方案 d 培养的细胞， 也进行 了细胞计数以及脂滴直径的测定。
     并且， 回收根据方案 e 用 AIM 处理而培养后的培养液的上清液， 通过 ELISA 法测定 包含在该上清液中的甘油以及游离脂肪酸 (free fatty acids， FFAs) 的量。并且， 为了进 行比较， 对于上述的方案 a， 同样也测定包含在培养上清液中的甘油以及游离脂肪酸的量。
     在此， 为了防止包含在培养液中的白蛋白吸附游离脂肪酸， 从分化诱导开始起的 第十天 (day 12) 时， 将 10％ FBS( 胎牛血清 ) 添加培养液换成无血清培养液， 将细胞进一步 在该无血清培养液中培养 6 小时， 然后测定包含在该无血清培养液的上清液中的甘油以及 游离脂肪酸。
     图 6B 中示出脂肪被油红 O 染色的细胞的显微镜照。图 7A 以及图 7B 中分别示 出对于方案 a、 d 以及 e(Exp.a， d， e)， 评价具有脂滴的细胞 (Droplet(+)cells) 的数 ( 个 4 2 /10 μm ) 以及脂滴的相对大小 ( 脂滴相对直径 )(％ ) 的结果。其中， 图 7B 中示出的脂滴 的相对大小是将在没有用 AIM 处理的方案 a 中得到的细胞所具有的脂滴的大小视为 100％ 而计算出的。图 8A 以及图 8B 中分别示出对于方案 a 以及 e(Exp.a， e)， 测定培养液中的甘 油浓度 ( 甘油释放量 )(mM) 以及游离脂肪酸浓度 (FFA 释放量 )(×10mM) 的结果。 如图 6B 以及图 7A 所示， 通过方案 e 用 AIM 处理分化后的脂肪细胞而继续培养时得 到的具有脂滴的细胞的数与通过方案 a 没有用 AIM 处理分化后的脂肪细胞而培养时相比， 显著减少。
     并且， 如图 7B 所示， 在方案 e 中得到的包含在脂肪细胞中的脂滴的直径与在方案 a 中得到的细胞中的相比， 缩小至约 25％。
     并且， 如图 8A 以及图 8B 所示， 根据方案 e 用 AIM 处理时， 与根据方案 a 没有用 AIM 处理时相比， 培养上清液中的甘油浓度以及游离脂肪酸浓度均显著增加。
     进一步地， 根据方案 e 用 AIM 处理时， 观察到用 AIM 处理后， 培养液的粘度急剧增 加。该观察结果支持培养液中的甘油以及游离脂肪酸的量显著增加的事实。
     如此， 确认出 AIM 诱导成熟脂肪细胞的脂解 (lipolysis)。从以上结果可以确 认， AIM 不仅抑制前脂肪细胞的分化以及成熟， 而且还作用于成熟的脂肪细胞而诱导脂解 (lipolysis)， 发挥使成熟脂肪细胞 “变瘦的功能” 。
     实施例 4
     [AIM 的对伴随脂肪细胞分化的基因群的表达的抑制 ]
     对于在上述的实施例 2 以及实施例 3 中通过上述的五种方案 a ～ e 培养的细胞， 在从分化诱导刺激开始起的第十天 (day12) 时， 进行回收， 通过定量 RT-PCR(QPCR) 分析伴 随脂肪化而表达的基因的表达量。
     在此， 图 9 中以模式化示出伴随脂肪细胞分化的主要的基因的表达模式。 如图 9 的 左侧的虚线方框内示出的那样， 在分化诱导期， 基于分化诱导刺激， 暂时诱导 C/EBPβ， 据此 C/EBPα， 其次 PPARγ 的表达被上调。 进一步地， 因 PPARγ 而诱导诸如脂肪酸合成酶 (Fatty acid synthase， FAS)、 CD36、 葡萄糖转运蛋白 4(Glucose transporter 4， Glut4) 等对于分 化的脂肪细胞必须的功能性基因的表达。
     此后， 如果 C/EBPα 以下的基因表达一定程度被上调， 则如图 9 的右侧的虚线方框 内示出的那样， 根据 FAS 而产生的脂肪酸 (fatty acids， FAs) 活化 PPARγ 蛋白质， 其使 C/ EBPα 基因的表达维持在一定水平。C/EBPα 进一步诱导 PPARγ 基因的表达。根据这种交 互刺激， 即使 C/EBPβ 的表达水平已下调， 也形成维持 PPARγ 以及 C/EBPα 的表达的机制 ( 参照图 9 的右侧的虚线方框 )。
     图 10 中示出通过五种方案 a ～ e 培养的细胞中的基因表达的分析结果。如图 10 所示， 根据方案 d 仅在分化诱导刺激的初期 (day2-day4) 用 AIM( 小鼠 AIM， 本实施例 4 中以 下相同 ) 处理时以及根据方案 b 从分化诱导刺激开始用 AIM 处理 10 天 (day2-day12) 时， C/EBPα、 PPARγ、 CD36、 Glut4 各基因的表达几乎完全被抑制。其中， 非常有趣的是， 在这些 情况下， 只有 FAS 基因表达反而稍微上调。
     另一方面， 根据方案 c 仅在分化诱导前 (day(-2)-day2) 用 AIM 处理时以及根据方 案 e 仅在细胞分化诱导后 (day6-day12) 用 AIM 处理时， 与根据方案 a 没有用 AIM 处理时比 较， 基因表达模式没有出现变化。如此， 对于 FAS 基因表达以外的基因， 基于 AIM 处理的表 达调控的实验结果与上述实施例 2 中的细胞形态学上的变化结果相匹配。
     实施例 5
     [AIM 的对 FAS 酶活性的抑制 ]
     研究 AIM 是否对 FAS 的酶活性产生影响。即， 如图 11A 所示， 根据上述的方案 d 仅 在 3T3L1 细胞的分化诱导初期 (day2-day4) 用 AIM( 小鼠 AIM， 本实施例 5 中以下相同 ) 处 理， 然后从分化诱导开始经过 2 天后 (day4)， 回收细胞， 配制细胞裂解液 (cell lysate)， 测 定 FAS 的酶活性。
     并且， 作为与上述的方案 e 相似的方案 f， 在 3T3L1 细胞分化之后用 AIM 处理 4 天 (day8-day12)， 然后从分化诱导开始起十天后 (day12)， 回收细胞， 配制细胞裂解液 (cell lysate)， 测定 FAS 的酶活性。其中， FAS 的酶活性基于丙二酸单酰辅酶 A(malonyl-CoA) 消 耗量进行测定。
     并且， 代替 AIM 而使用 FAS 抑制剂 (C75)， 根据方案 d 以及 f 用 25μM 浓度的该 FAS 抑制剂处理， 与上述 AIM 的情形同样地， 从分化诱导开始经过 2 天后 (day4， 方案 d) 以及 10 天后 (day12， 方案 f)， 回收细胞， 测定 FAS 的酶活性。
     进一步地， 为了进行比较， 对于根据上述方案 a 没有用 AIM 处理而培养的细胞， 也 分别在分化诱导开始经过 2 天后 (day4) 以及 10 天后 (day12) 的时间， 同样测定 FAS 的酶 活性。
     图 11B 以及图 11C 中示出 FAS 的酶活性 (Fatty acid synthase activity， 脂肪酸 合成酶活性 )(nmol NADPH/min/mg 蛋白质 ) 的测定结果。图 11B 中分别示出对于根据方案 a 没有用 AIM 处理时 (None)、 根据方案 d 用 AIM 处理时 (AIM(5μg/ml))、 根据方案 d 用 FAS 抑制剂处理时 (C75(25μM))， 从分化诱导开始经过 2 天后 (day4) 得到的结果。图 11C 中 分别示出对于根据方案 a 没有用 AIM 处理时 (None)、 根据方案 f 用 AIM 处理时 (AIM(5μg/ ml))、 根据方案 f 用 FAS 抑制剂处理时 (C75(25μM))， 从分化诱导开始经过 10 天后 (day12) 得到的结果。
     如图 11B 以及图 11C 所示， 任意一种方案中， 用 AIM 处理时与没有用 AIM 处理时相 比， FAS 的酶活性均显著下降。该 AIM 降低 FAS 的酶活性的程度与用作为 FAS 抑制剂的 C75的有效浓度 (25μM) 处理时相同。
     并且， 图 12A 以及图 12B 中分别示出对于根据方案 a 没有用 AIM 处理时 (None)、 根 据方案 d 用 AIM 处理时 (AIM(5μg/ml))、 根据方案 d 用 FAS 抑制剂处理时 (C75(25μM))， 分别从分化诱导开始经过 2 天后 (day4)， 进行细胞的油红 O 染色以及基因表达的 RT-PCR 分 析的结果。
     并且， 图 13A 以及图 13B 中分别示出对于根据方案 a 没有用 AIM 处理时 (None)、 根据方案 f 用 AIM 处理时 (AIM)、 根据方案 f 用 FAS 抑制剂处理时 (C75)， 从分化诱导开始 经过 10 天后 (day12)， 测定培养液中的甘油浓度 ( 甘油释放量 )(mM) 以及游离脂肪酸浓度 (FFA 释放量 )(×10mM) 的结果。
     如这些图 12A、 图 12B、 图 13A 以及图 13B 所示， 用 AIM 处理时和用 FAS 抑制剂 (C75) 处理时， 发现对于细胞的形态、 基因表达、 甘油以及游离脂肪酸的细胞外释放， 具有相同的 效果。即， 在前脂肪细胞的分化以及成熟脂肪细胞中的脂解作用 (lipolysis) 这两个方面， AIM 表现出与 C75 相同的效果。
     在上述的实施例 4 中只有 FAS 基因的表达没有被 AIM 抑制的原因， 认为是根据 AIM 的 FAS 功能抑制， 可能出现了负反馈 (negative feedback)， 根据 PPARγ 以外的表达调控系 统 ( 例如， 基于 LXR-SREBP1 系统的调控等 )， FAS 基因的表达被上调。
     并且， 认为如果对成熟脂肪细胞用 AIM 处理， 以抑制 FAS 功能， 则由于内源性的游 离脂肪酸 (FFAs) 的量会下降， 因此作为对游离脂肪酸 (FFAs) 的量下降的反馈， 诱导脂解作 用 (lipolysis)， 从而调节 FFAs 的量。
     实施例 6
     [ 脂肪细胞内的 AIM 和 FAS 的结合 ]
     细胞中的 FAS 活性调节， 并不是根据磷酸化等蛋白修饰而进行的， 而主要是根据 表达调控和分子结构调节而进行的。 通过 AIM 处理， 即使 FAS 的活性降低， 在 FAS 的表达上， 如上所述， 并没有确认出在 mRNA 水平、 蛋白质的量中的任意一方面的下调。因此， 作为一种 可能性， 认为 AIM 与 FAS 结合， 在结构上抑制其活性。
     为此， 为了证实上述的假设， 首先， 构建均表达添加有 HA 标签的 AIM( 小鼠 AIM) 和 添加有 FLAG 标签的 FAS 的 HEK293T 细胞。并且， 将该 HEK293T 细胞培养预定时间之后， 回 收， 配制细胞裂解液 (cell lysate)， 采用抗 FLAG 抗体进行免疫沉淀。
     其结果， 如图 14 所示， 确认出添加有 HA 标签的 AIM(HA-AIM) 和添加有 FLAG 标签 的 FAS(FL-FAS) 的共沉淀。即， 可以确认存在 AIM 与 FAS 结合的可能性。该结果支持上述 的假设。
     实施例 7
     [AIM 的向脂肪细胞的内吞 ]
     AIM 是由巨噬细胞分泌的可溶性蛋白。 通常， 分泌蛋白分子与存在于靶细胞的膜表 面的受体结合， 引起信号转导， 由此功能性地作用于靶细胞。然而， 如上所述， 要想使 AIM 与 FAS 结合而抑制其活性， AIM 作为分子需要内吞进入到细胞内。
     为了证明上述观点， 与上述的其他实施例同样地， 分化诱导 3T3L1 细胞， 从分化诱 导后的培养第四天 (day4) 起用 AIM( 小鼠 AIM)(5μg/ml) 处理 3 小时。然后， 回收细胞， 用 抗 AIM 抗体对细胞内进行染色。在此， 进一步地对细胞核采用 DAPI 进行染色。图 15A 以及图 15B 示出用 AIM 处理培养 3 小时后染色的细胞在共焦显微镜下观察 的结果的一种示例。图 15A 示出用 200 倍的倍数， 图 15B 示出用 400 倍的倍数拍摄的结果。 如图 15A 以及图 15B 所示， 确认出 AIM 以圆点 (dot) 状 ( 在原图中呈红色 ) 内吞到细胞质 内。
     进一步地， 通过采用胶体金标记的抗 AIM 抗体的免疫电子显微镜法， 确认 AIM 内吞 到脂肪细胞的现象。图 16A 以及图 16B 中分别示出用 AIM 处理后培养 3 小时 (3hr) 以及 12 小时 (overnight， 过夜 ) 的细胞的免疫电子显微镜照。图 16A 示出从用 AIM 处理经过 3 小 时 (3hr) 后回收的细胞， 图 16B 示出从用 AIM 处理经过 12 小时后回收的细胞的结果。
     如图 16A 所示， 在 AIM 的存在下培养 3 小时的细胞的细胞质内， AIM 以圆点状聚集 在被认为是内涵体 (endosome) 的粒子 (particle) 的膜上。这认为是 AIM 与脂肪细胞表面 的某种分子结合， 并以结合的状态与该表面分子一同内吞 (Endocytosis) 到细胞内而出现 的现象。
     并且， 如图 16B 所示， 在 AIM 的存在下培养 12 小时的细胞的细胞质内， 内涵体 (endosome) 变性， 从此处还可以观察到 AIM 进入到细胞质中。其中， AIM 没有聚集在吞噬体 (Phagosome)、 吞噬溶酶体 (Phagolysosome) 或者线粒体 (mitochondria) 上。图 17 以模式 化示出基于这些观点推测的 AIM 内吞进入细胞内的机制。
     实施例 8
     [ 细胞表面的 CD36 分子介导下的 AIM 内吞 (internalization)]
     如上所述， 认为 AIM 在细胞表面分子的介导下内吞到细胞内。因此， 认定了该细胞 表面分子。
     CD36 是二次跨膜分子， 在脂肪细胞或巨噬细胞中表达， 参与包括脂肪酸、 LDL 等的 多种分子的细胞内内吞。因此， 构建超表达 C 端上添加有 FLAG 标签的小鼠 CD36 的 HEK293 细胞， 将该细胞与小鼠 AIM 一同培养 3 小时。然后， 回收细胞， 采用抗 AIM 抗体以及抗 CD36 抗体染色， 通过共焦显微镜观察。
     图 18A 至图 18D 中示出得到的共焦显微镜照。图 18 示出以二维方式分析的结果 (2-dimensional analysis， 二维分析 )， 图 18B 至图 18D 分别示出以三位方式分析的结果 (3-dimensional analysis， 三位分析 )。如图 18A 至图 18D 所示， 如果以二维以及三位方 式进行分析， 则观察到， 在细胞的表达有 CD36 的部位 ( 原图中 FLAG 以红色表示 ) 上结合有 AIM 圆点 (dot)( 原图中以绿色表示 ) 的形态。并且， 在部分细胞上， 还观察到 AIM 内吞到细 胞内的形态。从这些结果认为， AIM 与 CD36 结合， 内吞 (internalize) 到细胞内。
     但是， 本次使用的 HEK293T 细胞中， 主要观察到的是 AIM 存在于细胞表面的形态， 与上述的实施例 7 的脂肪细胞 ( 分化的 3T3-L1 细胞 ) 相比， 几乎没有观察到 AIM 进入到细 胞内的形态。 其原因认为是， HEK293T 细胞与脂肪细胞相比， 内吞 (endocytosis) 能力较弱， 因此与 CD36 结合的 AIM 容易以结合的状态停留在细胞表面上。
     并且， 进一步地， 为了确认 AIM 在 CD36 介导下内吞的事实， 用 AIM 处理通过上述的 分化诱导而分化的 3T3L1 脂肪细胞时， 同时用抑制与 CD36 的配体 (ligand) 结合的中和抗 体处理。然后， 回收培养的 3T3L1 脂肪细胞， 用抗 AIM 抗体染色。并且， 对没有用 CD36 中和 抗体处理而仅用 AIM 进行同样的处理而培养的 3T3L 1 脂肪细胞， 也进行同样的染色。
     图 19A 以及图 19B 分别示出没有用 CD36 中和抗体处理时 (no CD36 antibody， 无CD36 抗体 ) 以及用 CD36 中和抗体处理时 (with CD36 neutralizing antibody， 使用 CD36 中和抗体 ) 的染色结果。如图 19A 所示， 没有用 CD36 中和抗体处理时， 可以观察到 AIM 内 吞到细胞内的现象 ( 原图中 AIM 在细胞内以红色的圆点状被检测出 )。另一方面， 如图 19B 所示， 当用 CD36 中和抗体处理时， 细胞内完全没有被抗 AIM 抗体染色， 没有观察到 AIM 的内 吞。
     即， 由于用 CD36 中和抗体进行处理， 因此向细胞内的 AIM 的内吞被显著地抑制住。 从以上结果可以明确， 负责向脂肪细胞的 AIM 的内吞作用的至少一种分子是 CD36。
     实施例 9
     [AIM 缺失小鼠的体重以及脂肪量的增加 ]
     从上述的实施例中得到的实验结果可以明确， AIM 抑制前脂肪细胞的成熟以及分 化， 并且诱导成熟的脂肪细胞中发生脂解作用 (lipolysis)。因此， 为了研究该作用在生物 -/机体内的效果， 对 AIM 被敲除的 AIM 缺失小鼠 (AIM 小鼠 ) 以及 AIM 没有被敲除的正常的 +/+ 小鼠 (AIM 小鼠 )， 采用高脂饮食 (HFD) 喂养 20 周以上， 测定体重和内脏白色脂肪的重量。 -/+/+ 其结果， AIM 缺失的 AIM 小鼠与 AIM 小鼠相比， 体重以及内脏白色脂肪的重量的增加有 意义地被加剧 ( 没有示出数据 )。
     进 一 步 地， 为 了 增 强 肥 胖 的 发 展 效 果， 将上述的两种小鼠分别与脂联素 -/(adiponectin) 基 因 敲 除 小 鼠 (Adipo 小 鼠 ) 交 配， 构 建 AIM-/- Adipo-/- 小 鼠 和 AIM+/+ Adipo-/- 小鼠。并且， 对这些小鼠同样采用 HFD 处理 20 周以上， 进行分析。 -/-/
     图 20A 以 及 图 20B 分 别 示 出 拍 摄 AIM Adipo 小 鼠 (AIM-/-) 以 及 AIM+/+ Adipo-/- 小鼠 (AIM+/+) 的腹腔内的照片。在图 20A 中， 上侧的箭头表示肠粘膜脂肪组织， 下 +/+ -/侧的箭头表示附睾脂肪组织。图 21A 以及图 21B 分别示出 AIM Adipo 小鼠 (WT) 以及 -/-/AIM Adipo 小鼠 (KO) 的体重 (Body weight(g)) 以及内脏白色脂肪组织的重量 (Total fat tissue(g)， 总脂肪组织 (g)) 的测定结果。
     如图 21A 以及图 21B 所示， 与上述的没有被敲除脂联素基因的小鼠同样地， AIM 缺 -/-/+/+ -/失的 AIM Adipo 小鼠与 AIM Adipo 小鼠相比， 体重以及内脏白色脂肪重量的增加被 加剧。这种体重增加的加剧， 主要是由于脂肪组织重量增加的加剧而引起的。
     这些结果支持以下结论。即， 由浸润到脂肪组织的巨噬细胞分泌的 AIM 在周围的 脂肪细胞中， 通过降低 FAS 活性， 诱导脂解作用 (lipolysis)， 同时抑制新的成熟脂肪细胞 的分化， 由此抑制性地调节脂肪组织的量 (mass)。
     并 且， 有 报 道 指 出， 对 于 小 鼠 给 予 FAS 抑 制 剂 (C75)， 会降低下丘脑的神经肽 Y(NPY) 的产生量， 引起显著的食欲减退以及体重减少。
     与此相比， AIM-/- 小鼠和 AIM+/+ 小鼠之间在摄入量 (Food intake) 上没有出现差 异。因此， 本次的 AIM 给予实验中， 不存在如同全身给予上述的 FAS 抑制剂 (C75) 时出现的 -/对于脑神经系统的作用， 在 AIM 小鼠中出现的脂肪量的增加， 认为是 AIM 的缺失直接对脂 肪细胞引起影响的结果。
     这认为是， 由于 AIM 需要在不包含于下丘脑的细胞中， 而包含于脂肪细胞中的作 为特异性的内吞中介物 (endocytosis mediator) 的 CD36 的存在下， 发挥作用的结果。
     实施例 10
     [ 向肥胖小鼠给予 AIM 而引起的脂解 (Lipolysis) 的诱导 ]构建采用 HFD 处理 20 周以上的肥胖的 AIM-/- 小鼠。另一方面， 准备纯化的小鼠重 组 AIM 蛋白， 将该 AIM 以 0.2mg/m 浓度溶解于 PBS( 磷酸缓冲液， pH7.4) 的 AIM 溶液配置成 注射剂。并且， 将该 AIM 注射剂通过小鼠的尾静脉， 一周两次， 四周给药。
     对于剂量来说， 每 1g 小鼠体重给予 1μg。其中， 决定该剂量时， 基于上述的体外 (in vitro) 实验中的培养液中的 AIM 浓度， 考虑使小鼠血液中的 AIM 浓度达到与该培养液 中的 AIM 浓度相同的程度而决定。
     并且， 作为对照， 同样地对于用 HFD 处理 20 周以上的肥胖的 AIM-/- 小鼠， 根据同样 的方案， 从尾静脉注射相同量的牛血清白蛋白 (BSA)。并且， 对于给药后的小鼠， 测定体重， 同时采集内脏白色脂肪组织而测定重量。
     其结果， 在体重以及脂肪组织的总重量上， 根据 AIM 给予与否而没有确认出有意 义的差异， 但是在采集的脂肪组织中， 在局部 ( 点状 ) 观察到脂肪细胞的缩小以及分解， 为 了处理这个而聚集的巨噬细胞， 而且好像是大致释放出 ( 分解 ) 了脂滴的脂肪细胞的、 脂肪 细胞的前细胞 ( 分化诱导前的 3T3L1 那样的细胞 )。
     图 22A 以及图 22B 中示出用显微镜观察被苏木精 - 伊红 (Hematoxylin-Eosin， HE) 染 色 的 脂 肪 组 织 切 片 的 结 果。 图 22A 示 出 关 于 给 予 白 蛋 白 的 小 鼠 (BSA injected(control)， BSA 注射 ( 对照 )) 的结果， 图 22B 示出关于给予 AIM 的小鼠 (rAIM injected， rAIM 注射 ) 的结果。 如图 22A 以及图 22B 所示， 可以确认出当给予 AIM 时与给予白蛋白时相比， 脂肪组 织的脂肪细胞的大小显著减小的同时， 巨噬细胞显著聚集。 即， 向肥胖小鼠全身 (systemic) 静脉注射纯化 AIM 蛋白时， 在该肥胖小鼠的脂肪组织中诱导脂肪分解 (Lipolysis)。
     本次实验中， 在部分脂肪组织中局部观察到脂解 (Lipolysis) 的原因认为可能 是， 通过静脉注射全身给药时， 脂肪组织中的局部浓度只在局部充分上升 ( 认为局部浓度 根据毛细血管的走行等而被决定 )， 而不能达到在整个脂肪组织中诱导脂解 (lipolysis) 且减少脂肪组织的总重量以及体重的程度的可能性较高。 但是， 如上所述， 可以明确地确认 AIM 在生物机体中也表现出诱导脂解 (lipolysis) 的作用。 在此， 没有确认出根据 AIM 的给 予而导致小鼠的摄入量发生变化。
     如上所述， 为了根据 AIM 而诱导脂解 (lipolysis)， 认为有效的是提高生物机体内 的局部浓度。因此， 认为例如通过局部注射， 将 AIM 局部注射到脂肪组织内， 由此可以更有 效地诱导脂解 (lipolysis)， 并有效地减少脂肪组织的重量以及体重。并且， 认为通过将 AIM 全身给药以及局部给药， 还可以得到抑制生物机体内的前脂肪细胞的分化的效果。
     在此， 说明通过上述的实施例 1 至 10 得到的部分见解。在实施例 1 中， 确认出浸 润到肥胖的小鼠脂肪组织中的巨噬细胞产生 AIM。了解到巨噬细胞也同样地浸润到肥胖的 人类脂肪组织中。因此， 认为浸润到人的脂肪组织中的巨噬细胞也产生 AIM。
     在实施例 2 中， 确认出 AIM 抑制前脂肪细胞的成熟分化。并且， 在小鼠 AIM 以及人 类 AIM 中的任意一个均表现出同样的分化抑制功能。这种小鼠和人之间的分化抑制功能的 互换性， 认为是由于 AIM 氨基酸序列具有高的同源性， 而且参与前脂肪细胞的分化以及 AIM 的功能表达的分子之间也具有高的同源性而导致的。
     在实施例 3 中， 确认出 AIM 作用于成熟的脂肪细胞而诱导脂滴分解 (Lipolysis)。 在实施例 7 以及实施例 8 中， 确认出 AIM 与脂肪细胞的细胞膜表面上的 CD36 分子结合， 通
     过内吞作用 (endocytosis) 而进入到细胞质内。
     在实施例 5 以及实施例 6 中， 确认出内吞到细胞内的 AIM 进入到细胞质内， 与脂肪 酸合成酶 (Fatty acid synthase ； FAS) 结合而抑制其酶活性。因此， 基于 AIM 的前脂肪细 胞的分化抑制以及成熟脂肪细胞中的脂肪分解诱导， 认为是该 AIM 抑制 FAS 而产生的结果。
     在实施例 9 中， 确认出如果采用高脂饮食 (High Fat Diet， HFD) 处理， 则 AIM 缺失 -/+/+ (AIM ) 小鼠与正常 (AIM ) 小鼠相比， 体重以及脂肪组织的重量增加得更快。
     但是， 没有确认出 AIM 缺失 (AIM-/-) 小鼠和正常 (AIM+/+) 小鼠之间的在摄入量上 的差异。即， 认为 AIM 并不像现有的抗肥胖药物那样诱导食欲减退， 而根据完全不同的机制 (AIM 直接特异性地作用于脂肪细胞或脂肪组织的机制 ) 抑制体重以及脂肪组织重量的增 加。
     进一步地， 在实施例 10 中， 确认出如果向肥胖的 AIM-/- 小鼠从尾静脉全身注射纯 化重组 AIM 蛋白 (4 周 )， 则在脂肪组织中局部发生脂解 (lipolysis)。即， 实际在生物机体 也确认出与在体外 (in vitro) 实验中确认出的对于培养细胞的效果相同的效果。
     如上所述， 人类 AIM 以及小鼠 AIM 中含有保守的三个特征性的结构域 (SRCR1 ～ 3)， 氨基酸序列的同源性高达 68％。 而且， 参与 AIM 向脂肪细胞的内吞的 CD36 以及作为 AIM 的一种靶分子的 FAS 也在人与小鼠之间具有较高的同源性。 即， 负责基于 AIM 的前脂肪细胞 的分化以及成熟脂肪细胞中的脂解 (lipolysis) 的分子的任意一个， 均在人与小鼠之间具 有较高的同源性。在此， 对于现有的其他药物而言， 存在虽然在利用小鼠的实验中有效果， 但在人体上没有得到效果的例子， 这主要是因为参与该效果的分子在小鼠和人之间同源性 较低而引起的。 并且， 在体外 (in vitro) 实验中， 人类 AIM 以及小鼠 AIM 中的任意一个在相同的 浓度范围下均对于来源于小鼠的脂肪细胞发挥同样的分化抑制功能以及脂肪分解诱导功 能。并且， 采用与在体外 (in vitro) 实验中获得效果的浓度对应的剂量， 向小鼠机体内给 予 AIM 时， 实际确认出在脂肪组织中发生脂解 (lipolysis)。因此， 认为 AIM 在人的机体内 也同样作用于脂肪细胞， 获得同样的效果的可能性非常之高。
     并且， AIM 为了发挥如上所述的功能， 需要在 CD36 的介导下内吞进入到细胞内。 根 据该作用机制， 向生物机体内给予 AIM 时， 不需要考虑如同现有的 FAS 抑制剂中出现的那种 对脑神经系统引起的副作用。
     实际上， AIM 缺失小鼠的摄入量与正常的小鼠相比， 没有出现差异。因此， 认为向 人机体给予 AIM 时， 至少不会出现如同现有的 FAS 抑制剂中出现的那种对脑神经系统引起 的副作用。
     实施例 11
     [ 给予肥胖小鼠的 AIM 的向脂肪细胞的内吞以及与 FAS 的结合 ]
     对于从肥胖小鼠采集的脂肪组织样品， 采用抗巨噬细胞 F4/80 抗体 ( 红色 ) 以及 抗小鼠 AIM 多克隆抗体 (SA-1)( 绿色 ) 进行共染色， 在荧光显微镜下观察。其结果， 包围巨 噬细胞的若干个脂肪细胞被抗 AIM 抗体染色。另一方面， 与巨噬细胞分开的脂肪细胞没有 被抗 AIM 抗体染色。发明人认为， 这些结果说明来源于巨噬细胞的 AIM 被组织内的脂肪细 胞内吞。
    
    进一步地， 向肥胖 AIM-/- 小鼠的附睾脂肪组织直接注射小鼠 rAIM， 然后在组织学上分析该脂肪组织。即， 向附睾脂肪组织的若干处直接注射共 100μg 的 rAIM。从注射经过 3 小时后， 从附睾脂肪组织制作组织切片， 将该组织切片用抗 AIM 抗体以及抗巨噬细胞抗体 染色。
     其结果， 在注射了 rAIM 的脂肪组织内， AIM-/- 脂肪细胞被染色成 AIM 阳性。即， 确认出脂肪组织中的外源性的 rAIM 内吞进入脂肪细胞。在更高倍数的荧光显微镜下观察 时， 观察到在脂肪细胞的细胞质内， 内吞 (endocytosed) 的 rAIM 以点状聚集 (dot-forming accumulation)。
     并且， 将 rAIM 通过静脉注射而向 AIM-/- 小鼠全身给药， 然后在组织学上分析脂肪 -/组织。即， 向 AIM 小鼠通过静脉内注射全身给予 200μg 的 rAIM。从注射经过 3 小时后， 从附睾脂肪组织制作组织切片， 将该组织切片用抗 AIM 抗体以及抗巨噬细胞抗体染色。
     其结果， 在脂肪组织的脂肪细胞内， 虽然与上述的向组织内直接注射时相比程度 较低， 但是检测出内吞的 rAIM 信号。非常有趣的是， 脂肪组织的巨噬细胞也被抗 AIM 抗体 染色。该结果给出以下启示， 即外源性 rAIM 同样内吞到巨噬细胞内。
     进一步地， 使用来源于这些脂肪组织的裂解物 (lysate)， 使内吞的 rAIM 沉淀， 研究内源性 FAS 是否发生共沉淀。即， 使用 HA-tagged rAIM 和抗 HA 抗体， 通过免疫印迹 (Western blotting) 分析在沉淀物中是否包含 FAS。
     其结果， rAIM 以及 FAS 两种蛋白发生共沉淀。从该结果确认出， 内吞的 rAIM 和细 胞质内的 FAS 结合。
     从这些所有的结果证实， 在体内 (in vivo) 在生理学上实现了通过脂肪细胞的 AIM 的内吞以及随之发生的该 AIM 与细胞质内的 FAS 的结合。
     实施例 12
     [AIM 缺失导致的肥胖的促进 ]
     为了试验在体内 (in vivo) 中 AIM 对脂肪细胞的效果， 分析了采用 HFD 喂食 40 周 -/-/+/+ -/以上的 AIM Adipo 小鼠以及 AIM Adipo 小鼠的肥胖状态。在此， 采用 Adipo-/- 背 景的小鼠是有用的， 因为在实验 AIM 缺失对于脂肪组织量的影响时， 可以排除脂联素 (Adiponectin) 的参与。
     分析结果示出在图 23A 至图 23E。图 23A 示出用 HFD 喂食之前的体重 (BW(pre)) (g)， 图 23B 示出用 HFD 喂食之后的体重 (BW(HFD))(g)。 图 23C、 图 23D 以及图 23E 分别示出 用 HFD 喂食之后的内脏脂肪 (Visceral Fat) 的重量 (g)、 皮下脂肪 (Subcutaneous Fat) 的 重量 (g) 以及肝脏 (Liver) 的重量 (g)。在图 23A 至图 23E 中， “+/+” 表示 AIM+/+ Adipo-/- 小 鼠的结果， “-/-” 表示 AIM-/- Adipo-/- 小鼠的结果。
     如图 23A 以及图 23B 所示， 在体重增加方面， 与 AIM+/+ Adipo-/- 小鼠相比， 在 AIM-/Adipo-/- 小鼠中被加快。如图 23C 以及图 23D 所示， 这种体重的差异主要是因脂肪组织的重 量增加而导致的。
     并且， 如图 23E 所示， 肝脏组织的重量也同样地与 AIM+/+ Adipo-/- 小鼠相比， 在 -/-/AIM Adipo 小鼠中得到显著地增加。 该结果揭示 AIM 还作用于肝细胞 (hepatocyte)， 并 控制该细胞内的甘油储藏的可能性。其中， 心脏或肾脏等其他脏器的重量在两种小鼠之间 大致相同。
     在用 HFD 喂食 40 周以上的没有敲除脂联素 (Adiponectin) 基因的 AIM-/- 小鼠以及AIM+/+ 小鼠分析中， 也观察到同样的结果。将分析结果示出在图 24A 至图 24E 中。如图 24A 至图 24E 所示， 与 Adipo-/- 背景的小鼠同样地， 与 AIM+/+ 小鼠相比， AIM-/- 小鼠的体重、 脂肪 组织重量以及肝脏重量的增加更显著。
     图 25 中示出对于用 HFD 喂食的 AIM-/- 小鼠以及 AIM+/+ 小鼠评价成为其食欲指标的 饲料摄入量 (Food intake(g/24h)) 的结果。在图 25 中， “+/+” 表示 AIM+/+ 小鼠的结果， “-/-” 表示 AIM-/- 小鼠的结果。
     在此， 如上述的实施例 9 中也记载的那样， 有报道指出给予 FAS 抑制剂 C75 时， 会降低小鼠下丘脑的神经肽 Y(NPY) 的产生， 其结果引起显著的食欲减退， 作为整体， 加 速 体 重 的 减 少 (Loftus， T.M. 等 Reduced food intake and body weight in mice treated with fatty acid synthase inhibitors.Science 288， 2379-2381(2000) ； Kumar， M.V.， Shimokawa， T.， Nagy， T.R.& Lane， M.D.Differential effects of a centrally acting fatty acid synthase inhibitor in lean and obese mice.Proc.Natl.Acad. Sci.U.S.A.99， 1921-1925(2002) ； Shimokawa， T.， Kumar， M.V.& Lane， M.D.Effect of a fatty acid synthase inhibitor on food intake and expression of hypothalamic neuropeptides.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99， 66-71(2002) ； Chakravarthy， M.V. 等 Inactivation of hypothalamic FAS protects mice from diet-induced obesity and inflammation.J.Lipid Res.50， 630-640(2009))。
     与此相比， 本发明所涉及的实验中， 如图 25 所示， AIM-/- 小鼠和 AIM+/+ 小鼠之间在 24 小时的饲料摄入量 (g/24h) 上大致相同。即， 说明 AIM 不具有神经学上的效果。发明人 认为， 其原因在于， AIM 的作用需要由没有报道出在下丘脑的细胞中表达的 CD36 介导的、 特 异性内吞过程 (endocytotic process)。
     在此， 用 HFD 喂食的 AIM-/- 小鼠以及 AIM+/+ 小鼠 ( 无论 Adipo-/- 背景还是 Adipo+/+ 背景 ) 中， 血清中的 TNFα 以及 IL-6 的水平没有显著的差异， 且血液中的葡萄糖水平也大 致相同。
     实施例 13
     [AIM 缺失小鼠的脂肪细胞大小、 脂肪组织量以及体重的增加 ] -/+/+
     给 AIM 小鼠以及 AIM 小鼠用 HFD 喂食 20 周。并且， 从各小鼠采集的附睾脂肪 组织切片用 HE 染色， 在显微镜下观察。并且， 利用安装有图像分析软件的计算机， 评价各组 织切片的显微镜照内的不同区域中的 50 个独立的脂肪细胞的大小。脂肪细胞的大小以平 均值 ± 标准偏差 (SEM)(in pixels) 来表示。
     图 26 中示出分别对于 AIM+/+ 小鼠 (“+/+” ) 以及 AIM-/- 小鼠 (“-/-” ) 测定脂肪细 +/+ 胞的大小 (pixel/cell) 的结果。图 27A 以及图 27B 中示出从 AIM 小鼠 (“+/+” ) 以及 -/-/AIM 小鼠 ( “ ” ) 采集的内脏脂肪组织切片用 HE 染色而在相差显微镜下观察的结果。其 中， 在图 27A 以及图 27B 中示出的比例尺表示 100μm。
     如图 26、 图 27A 以及图 27B 所示， 与上述的体外 (in vitro) 实验中的 3T3-L1 细胞 -/的观察结果相同， 肥胖 AIM 小鼠的内脏脂肪细胞的大小与肥胖 AIM+/+ 小鼠相比， 更大。 -/+/+
     并且， 给 AIM 小鼠以及 AIM 小鼠采用 HFD 喂食 12 周， 测定体重以及脂肪组织 +/+ 的重量。图 28A、 图 28B 以及图 28C 中分别示出对于 AIM 小鼠 (“+/+” ) 以及 AIM-/- 小鼠 (“-/-” ) 分别测定体重 (Body)(g)、 内脏脂肪组织 (Visceral fat) 的重量 (g) 以及皮下脂肪组织 (Subcutaneous fat) 的重量 (g) 的结果。
     如图 28A 至图 28C 所示， 关于上述的脂肪细胞的增大， 在用 HFD 喂食 12 周后的 体重、 内脏脂肪组织的重量以及皮下脂肪组织的重量的增加方面， 与 AIM+/+ 小鼠相比， 在 -/AIM 小鼠中增加得更快。
     在 此， 需 要 说 明 的 是， 用 HFD 喂 食 的 AIM+/+ 小 鼠 和 AIM-/- 小 鼠 中， 代谢速度 +/+ (metabolic rates) 大致相同。 图 29A、 图 29B、 图 29C 中分别示出对于 AIM 小鼠 ( “+/+” )以 -/-/及 AIM 小鼠 ( “ ” )， 作为反映代谢速度的指标分别评价体温 (Body temperature)(℃ )、 耗氧速率 (Oxygen Consumption)(VO2/min/kg) 以及饲料摄入量 (Food Intake)(g/24h) 的 结果。其中， 在图 29C 中表示在用 HFD 喂食时 (HFD) 和用普通饲料喂食时 (normal chow， 普 通食物 )， 每 24 小时摄食的饲料的量。如图 29A 至图 29C 所示， 在体温、 耗氧速率以及饲料 +/+ -/摄入量中的任意一项上， AIM 小鼠和 AIM 小鼠之间不存在较大的差异。
     进一步地， 用 HFD 喂食的 AIM+/+ 小鼠和 AIM-/- 小鼠的活动性 (Locomotor activity) 也大致相同。图 29D 中示出对于 AIM+/+ 小鼠 (“+/+” ) 以及 AIM-/- 小鼠 (“-/-” )， 分别评价活 动性 (Locomotor activity)(count) 的结果。图 29D 中示出黑暗环境下 (Dark)12 小时以 及光照环境下 (light)12 小时的活动性以及共 24 小时的综合活动性 (Total)。
     从这些结果认为， AIM 通过特异性地作用于脂肪细胞， 由此对脂肪组织量产生影 响。
     实施例 14
     [ 基于向 AIM 缺失小鼠给予 AIM 而引起的对脂肪组织量以及体重增加的抑制 ]
     向 AIM-/- 小鼠用 HFD 喂食 15 周期间， 在最后 9 周向该 AIM-/- 小鼠的腹腔内注射小 鼠 rAIM， 研究该 rAIM 的给予是否抑制脂肪组织量的增加。即， 最后的 9 周， 向 AIM-/- 小鼠的 腹腔内每周 3 次注射 rAIM([150μg/ 注射 / 小鼠 ]×[3 次 / 周 ] ＝ [450μg/ 小鼠 / 周 ])， 第 15 周测定体重、 内脏脂肪的重量以及皮下脂肪的重量。其中， 作为对照， 对于按照同样的 -/方案而向腹腔内给予 BSA(Bovine Serum Albumin， 牛血清白蛋白 ) 的 AIM 小鼠， 也测定体 重、 内脏脂肪的重量以及皮下脂肪的重量。
     图 30A、 图 30B 以及图 30C 中示出对于给予 BSA 的 AIM-/- 小鼠 (“BSA” ) 以及给予 -/rAIM 的 AIM 小鼠 (“rAIM” )， 分别测定体重 (Body)(g)、 内脏脂肪组织 (Visceral fat) 的重量 (g) 以及皮下脂肪组织 (Subcutaneous fat) 的重量 (g) 的结果 (n ＝ 3， 即给予 BSA -/-/的 AIM 小鼠以及给予 rAIM 的 AIM 小鼠分别为 3 例 )。
     如图 30A 至图 30C 所示， 对于内脏脂肪的重量以及皮下脂肪的重量这两项指标的 增加来说， 与体重同样地， 相比于作为对照而注射 BSA 的小鼠， 在注射 rAIM 的小鼠中显著减 小。
     进一步地， 对于给予 BSA 的 AIM-/- 小鼠以及给予 rAIM 的 AIM-/- 小鼠， 分别评价 FSP27、 Perilipin( 围脂滴蛋白 ) 以及 Adipophilin( 脂肪分化相关蛋白 ) 的 mRNA 水平。 mRNA 水平使用从附睾脂肪分离的 RNA， 通过 QPCR 测定。
     图 31 中示出对于给予 BSA 的 AIM-/- 小鼠 (“BSA” ) 以及给予 rAIM 的 AIM-/- 小鼠 “rAIM” ( )， 分别进行评价的 FSP27、 Perilipin 以及 Adipophilin 的 mRNA 水平 (n ＝ 3)。其 中， 图 31 中示出的值表示经 GAPDH 归一化 (normalized to GAPDH) 的、 相对于注射 BSA 的 小鼠的结果的相对值 (Relative Expression)。如图 31 所示， 与用 rAIM 处理上述的 3T3-L1 脂肪细胞时观察到的结果同样地， 随 着进行脂解 (lipolysis) 而减少的 FSP27、 Perilipin 以及 Adipophilin 的 mRNA 水平， 也相 比于作为对照而注射 BSA 的小鼠， 注射 rAIM 的小鼠中较低。因此， 认为根据 AIM 的注射， 生 物机体内进行了脂解 (lipolysis)。
     实施例 15
     [AIM 的向 FAS 的结合 ]
     体内 (in vivo) 以及体外 (in vitro) 两种实验中， 均确认出 AIM 与 FAS 的结合。 -/即， 向肥胖 AIM 小鼠的附睾脂肪组织的若干处直接注射共 100μg 的用 HA 标记的小鼠 rAIM。从注射经过 3 小时后， 采集附睾脂肪组织。接着， 使用抗 HA 抗体， 从该脂肪组织的 裂解物沉淀分离内吞的 rAIM。并且， 采用免疫印迹 (WB)， 分析在得到的沉淀物中是否包含 FAS。其结果， 如图 32 所示， 确认出两种蛋白发生共沉淀， 内吞的 rAIM 和内源性的细胞质内 FAS 结合。
     进一步地， 使用表达用 Flag 标记的 FAS 和用 HA 标记的小鼠 AIM 这两种蛋白的 HEK293T 细胞以及抗 Flag 抗体或抗 HA 抗体， 进行共免疫沉淀试验。其结果， 如图 33A 以及 图 33B 所示， 两种蛋白均发生共沉淀。因此， 认为 AIM 具有与 FAS 结合的能力。
     进一步地， 试图绘出 FAS 中的对于 AIM 的结合区域。如图 34A 所示， FAS 由下还的 7 个独立的功能结构域构成。即， 酮脂酰合成酶 (ketoacyl synthase， KS)、 丙二酰转移酶 和乙酰转移酶 (malonyl/acetyl transferase， MAT)、 脱水酶 (dehydrase， DH)、 烯酰还原酶 (enoylreductase， ER)、 酮脂酰还原酶 (ketoreductase， KR)、 酰基载体蛋白 (acyl carrier protein， ACP) 以及硫酯酶 (thioesterase， TE)。在 DH 结构域和 ER 结构域之间包含中央核 心区 (central core， CC)。认为， 该 CC 不具有已知的酶功能， 而起结构上稳定二聚体的作 用。在此， 图 34A 中示出头尾 (head-to-tail) 二聚化的 FAS 以及其各区域的主要功能。
     因此， 通过共沉淀试验， 研究用 Flag 标记的 FAS 的各区域与用 HA 标记的 AIM 的结 合。即， 使 N 末端中添加有 Flag 标签的 FAS 的各结构域， 在表达用 HA 标记的小鼠 AIM 的 HEK293T 细胞中， 稳定表达。 并且， 使用抗 Flag 抗体以及抗 HA 抗体， 通过共免疫沉淀试验， 研 究各区域与 AIM 的结合。其结果， 如图 34B 所示， AIM 特异性地结合于 ER、 DH、 TE 以及 CC 结 构域。但是， AIM 不结合于参与初期的酰基链集合体 (initial asyl chain assembly， 初期 的酰基链装配 )( 即， 伴随二氧化碳的释放的、 乙酰基以及丙二酰基向 3-ketobutyryl-ACP 的缩合 (condensation)) 的、 包含 KS 以及 MAT 的 N 末端区域 ( 参照图 34A)。因此， 认为 AIM 对于脂肪酸链延长 ( 由 ER 以及 DH 参与 ) 以及释放合成的棕榈酸酯 (palmitate)( 依赖于 TE) 产生影响。其中， ER 或 KR 的过度表达会带来多数细胞的死亡。这会引起使用这些细胞 裂解物的 WB 中的信号低下 ( 图 34B 的下侧板， 通道 ： ER 以及 KR)。
     实施例 16
     [ 细胞表面 CD36 介导下的 AIM 的内吞 ]
     对于缺失 CD36 的 CD36-/- 小鼠以及野生型 CD36+/+ 小鼠， 分别从静脉注射小鼠 rAIM， 分析向脂肪组织的 rAIM 的内吞。即， 将在 PSB 中溶解 rAIM 而配制的注射液分别静脉注射 -/+/+ 到 CD36 小鼠以及 CD36 小鼠 (300μg/ 小鼠 )。从注射经过 16 小时后， 处死小鼠， 从其 附睾脂肪组织制作组织切片。并且， 将组织切片用抗 AIM 抗体染色。
     其结果， 如图 35A 以及图 35B 所示， 在 CD36-/- 小鼠 (CD36-/-) 的脂肪组织中检测出的 AIM 的信号水平与 CD36+/+ 小鼠 (CD36+/+) 相比， 显著地低下。即， 向脂肪细胞的 rAIM 内 +/+ +/+ -/-/吞， 相比于 CD36 小鼠 (CD36 )， 在 CD36 小鼠 (CD36 ) 中显著地少。
     实施例 17
     [ 人 rAIM 的对人前脂肪细胞的成熟的抑制 ]
     为了确认 AIM 在人细胞中也作用于脂肪细胞分化 (adipogenesis)， 在重组人 AIM(rhAIM) 的存在以及不存在下， 刺激人间叶干细胞 (human mesenchymal stem cell， HMSC)(Lonza Walkersville Inc.， USA) 的分化。
     即， 将 HMSC， 在间叶干细胞基础培养基 (Mesenchymal Stem Cell Basal Medium， MSCBM)(Lonza Walkersville Inc.) 中 培 养 10 天， 以 达 到 汇 合。 然 后， 将细 胞 在 rhAIM 存 在 (10μg/mL) 或 者 不 存 在 下， 加 入 人 胰 岛 素、 MCGS、 地 塞 米 松 (dexamethasone)、 吲 哚 美 辛 (indomethacin) 以 及 IBMX， 培 养 3 天， 由 此 刺 激 该 细 胞 的 分 化 (adipogenesis) (adipogenesis induction)( 参考文献 ： Janderrova 等， Obes.Res.11 ： 65， 2003)。经过该 刺激后， 将细胞在添加有人胰岛素以及 MCGS 的 MSCBM 中培养 10 天。并且， 回收细胞， 用油 红 O 染色。
     图 36A、 图 36B 以 及 图 36C 中 分 别 示 出 在 相 差 显 微 镜 下 观 察 分 化 刺 激 前 (Pre-stimulation)、 rhAIM 不存在下刺激后 (rhAIM(-)) 以及 10μg/mL 的 rhAIM 存在下刺 激后 (rhAIM(10μg/mL)) 的细胞的结果。 如图 36A 至图 36C 所示， rhAIM 戏剧性地抑制 HMSC 的分化。并且， 通过 RT-PCR 评 价在成熟脂肪细胞中表达的 Glut-4 的 mRNA 水平。并且， 对于 β 肌动蛋白的 mRNA， 也同样 地进行评价。在图 37 中示出其结果。图 37 中示出评价分化刺激前 (Pre)、 rhAIM 不存在下 刺激后 (-rhAIM) 以及 10μg/mL 的 rhAIM 存在下刺激后 (+rhAIM) 的细胞中的 Glut-4 以及 β 肌动蛋白的 mRNA 的水平的结果。如图 37 所示， 与上述的组织学分析结果一致， Glut-4 的 mRNA 水平， 相比于 rhAIM 不存在的状态， 在 rhAIM 存在下显著地减少。
     实施例 18
     [ 狗以及猫中的 AIM 的表达 ]
     为了研究狗以及猫中的 AIM 的表达， 采用抗小鼠 AIM 多克隆抗体 (SA-1)， 对从 3 只 狗以及 3 只猫采集的血清进行免疫印迹试验。并且， 为了进行比较， 对小鼠血清也同样进行 免疫印迹试验。
     图 38 中示出对于狗 3 例 (dog 1、 2、 3)、 猫 3 例 (cat 1、 2、 3) 以及小鼠 (mouse) 分 别进行免疫印迹的结果。如图 38 所示， 在狗血清中检测出明显的条带。另一方面， 在猫血 清中检测出分子量比狗更大、 而与小鼠大致相同的、 较浅的条带。即， 确认出在狗以及猫中 也表达， 与小鼠 AIM 具有能够被抗小鼠 AIM 多克隆抗体检测出的程度的同源性的 AIM。
     在此， 说明通过上述的实施例 11 至 18 得到的部分见解。在实施例 11 中， 在向 -/-/AIM 小鼠的附睾脂肪组织直接注射 rAIM 以及向 AIM 小鼠静脉注射 rAIM 的任意一种情况 下， 均出现给予的外源性 rAIM 内吞进入脂肪细胞， 且内吞的 rAIM 与该脂肪细胞的细胞质内 的内源性 FAS 结合的现象。并且， 在实施例 16 中， 确认出向 CD36-/- 小鼠以及野生型 CD36+/+
    小鼠分别静脉注射 rAIM 时， 向脂肪细胞的 rAIM 的内吞， 相比于 CD36+/+ 小鼠， 在 CD36-/- 小鼠 中显著地少。即， 在上述的实施例 5 至 8 中采用培养细胞进行的体外 (in vitro) 实验中确 认出的现象， 在采用小鼠进行的体内 (in vivo) 实验中也被确认出。其中， 实施例 15 中， 再次确认出在细胞内 AIM 与 FAS 结合， 同时还获得关于 FAS 的与 AIM 结合的区域的见解。
     在实施例 12 以及实施例 13 中， 示出以下现象 ： 用 HFD 喂食的 AIM-/- 小鼠的体重、 脂 肪组织的重量、 肝脏的重量以及脂肪组织中所包含的脂肪细胞的大小的增加， 与同样用 HFD +/+ -/喂食的 AIM 小鼠相比， 被显著地促进 ； 但是该 AIM 小鼠的饲料摄入量、 代谢速率以及活 +/+ 动性方面， 与该 AIM 小鼠大致相同。即， 更加详细地确认出在上述的实施例 9 中被确认出 的现象。
     在实施例 14 中， 示出同时实施摄取 HFD 和腹腔内注射 rAIM 的处理的 AIM-/- 小鼠 的体重、 内脏脂肪的重量以及皮下脂肪的重量的增加， 与同时实施摄取 HFD 和腹腔内注射 -/BSA 的处理的 AIM 小鼠相比， 被显著地抑制的结果。并且， 这种由 AIM 引起的效果还可以 根据以下分析结果证实， 即， 随着脂解 (lipolysis) 的进行而减少的 FSP27、 Perilipin( 围 脂滴蛋白 ) 以及 Adipophilin( 脂肪分化相关蛋白 ) 的 mRNA 水平， 相比于腹腔内注射 BSA -/-/的 AIM 小鼠， 在腹腔内注射 rAIM 的 AIM 小鼠中更低。即， 如在上述的实施例 10 中已经 理解的那样， 通过相比于静脉注射可以提高脂肪组织中的局部浓度的腹腔内注射， 明确地 确认出由于给予 AIM 而抑制体重以及脂肪组织重量的增加的效果。
     在实施例 17 中， 确认出人 AIM 通过作用于人前脂肪细胞， 抑制该人前脂肪细胞向 人脂肪细胞的分化。即， 确认出如同基于上述的实施例 1 至 10 中得到的见解以及与 AIM 分 子结构及其作用机制相关的小鼠和人的同源性而已经理解的那样， 小鼠 AIM 作用于小鼠细 胞， 同样地人 AIM 作用于人细胞。该结果加强了支持下述理解的依据， 即 AIM 在人的机体内 与在小鼠机体内同样地作用于脂肪细胞， 带来前脂肪细胞的分化抑制、 脂肪细胞中的脂解 (lipolysis)、 脂肪组织重量的增加抑制、 体重的增加抑制的效果。
     在实施例 18 中， 确认出在狗以及猫中也表达， 与小鼠 AIM 具有能够被抗小鼠 AIM 多克隆抗体检测出的程度的同源性的 AIM。实际上， 由序列表 11 中示出的氨基酸序列构成 的狗 AIM 与由序列表 1 中示出的人 AIM 具有 66％的同源性， 并与序列表 5 中示出的小鼠 AIM 具有 60％的同源性。
     如上所述， 得到以下见解， 即 AIM 基于在各种哺乳动物的种间的氨基酸序列的同 源性以及该 AIM 的作用机制的同源性， 通过向生物机体给药， 带来该生物机体的脂肪组织 的量和 / 或体重的减少、 增加的抑制、 增加程度的降低等效果。进一步地， 在作为药物的有 用性以及安全性方面还得到极其令人感兴趣的见解， 即 AIM 基于在 CD36 的介导下内吞进入 细胞内而作用于该细胞的机制， 不会改变生物机体的代谢状态， 而特异性地作用于该生物 机体的脂肪细胞。40CN 102458472 A
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