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1、(10)授权公告号 CN 102727947 B (45)授权公告日 2014.05.14 CN 102727947 B (21)申请号 201210152322.9 (22)申请日 2012.05.16 A61L 31/12(2006.01) A61L 31/16(2006.01) C12Q 1/02(2006.01) (73)专利权人 清华大学 地址 100084 北京市海淀区清华园 1 号清华 大学 (72)发明人 于晓龙 须苏菊 崔福斋 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人 关畅 CN 1512181 A,2004.07.14, 说明书第 5 页， 。
2、第 11 页实施例 1. CN 1352388 A,2002.06.05, 全文 . US 7662751 B2,2010.02.16, 全文 . WO 02/086162 A1,2002.10.31, 全文 . Jaegeun Noh 等 .Structure and Electrochemical Behavior.Bull. Korean Chem. Soc .2006, 第 27 卷 ( 第 3 期 ), 第 403 页 实验部分， 第 406 页结论部分 . 应佩青等 . 利用自组装单分子层 (SAM ) 研 究细胞和表面的相互作用 .生物医学工程学杂 志 .2001, 第 18 卷。
3、 ( 第 2 期 ), 期刊第 276 页 1 引言、 2 自组装单分子层 (SAM ). (54) 发明名称 一种用于抑制癌细胞增殖的苯基修饰材料 (57) 摘要 本发明公开了一种苯基修饰材料及其制备方 法与应用。该苯基修饰材料是按照包括下述步骤 的方法制备得到的 ： 1） 以含苯基的硫醇为溶质、 无水乙醇为溶剂， 制备质量浓度为 0.8 1.5% 的 硫醇溶液， 并于 3 8静置 12 24h ； 所述含苯 基的硫醇， 其分子式为 C6H6(CH2)nSH， n 为正整数 ； 2） 在单晶硅片表面生长钛 （Ti） 过渡层， 再在所述 钛过渡层上生长金层， 得到镀金硅片 ； 3） 在避光 条。
4、件下， 将步骤2)所述镀金硅片放入步骤1） 制备 的硫醇溶液中， 静置1224h， 即得所述苯基修饰 材料。本发明提供的苯基修饰材料可以抑制乳腺 癌细胞的黏附、 迁移和增殖。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 潘艺茗 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书3页 附图3页 (10)授权公告号 CN 102727947 B CN 102727947 B 1/1 页 2 1. 苯基修饰材料在下述 1） 或 2） 中的应用 ： 1） 在制备促进乳腺癌细胞内雌激素受体 2 基因表达的产品中的应用 ；。
5、 2） 在制备抑制乳腺癌细胞内迁移、 增殖相关基因表达的产品中 的应用 ； 所述苯基修饰材料的制备方法， 包括下述步骤 ： 1） 以含苯基的硫醇为溶质、 无水乙醇为溶剂， 制备质量浓度为0.81.5%的硫醇溶液， 并于38静置424h ； 其中， 所述含苯基的硫醇， 其分子式为C6H5(CH2)nSH， n为正整数 ； 在制备硫醇溶液的过程中需要避光溶解 ； 2） 在单晶硅片表面生长钛过渡层， 再在所述钛过渡层上生长金层， 得到镀金硅片 ； 所述 单晶硅片的厚度为 0.5 1mm ； 所述钛过渡层的厚度为 8 12nm ； 所述金层的厚度为 30 50nm ； 所述单晶硅片为单晶硅 ； 所述金。
6、层为金 ； 所述生长钛过渡层的方法以及 生长金层的方法选自下述任意一种 ： 等离子溅射法、 磁控溅射法和分子束外延生长法 ； 所 述单晶硅片在使用前还需进行下述清洁处理 ： 将所述单晶硅片在浓硫酸和双氧水体积比为 3:1 的混合液中清洗 2 次， 再用三蒸水清洗 3 次， 氮气环境下烘干 ； 所述浓硫酸的质量浓度 为 98%， 所述双氧水的质量浓度为 50% ； 3） 对步骤 2） 得到的镀金硅片进行下述处理的步骤 ： 将所述镀金硅片在浓硫酸和双氧 水体积比为 3:1 的混合液中清洗 2 次， 再用三蒸水清洗 3 次， 氮气环境下烘干 ； 所述浓硫酸 的质量浓度为 98%， 所述双氧水的质量浓。
7、度为 50% ； 然后， 在避光条件下， 将所述镀金硅片放 入步骤 1） 制备的硫醇溶液中， 静置 4 24h， 即得所述苯基修饰材料。 2. 根据权利要求 1 所述的应用， 其特征在于 ： 所述苯基修饰材料与水的接触角为 101 105 ； 所述苯基修饰材料中的硫醇分子在金表面排列的间距为 5 6nm。 权 利 要 求 书 CN 102727947 B 2 1/3 页 3 一种用于抑制癌细胞增殖的苯基修饰材料 技术领域 0001 本发明涉及一种用于抑制癌细胞增殖的苯基修饰材料。 背景技术 0002 乳腺癌是女性发病率第一的常见恶性肿瘤， 占女性新发恶性肿瘤的30%。 近年来乳 腺癌的发病率居。
8、高不下， 治疗手段包括手术治疗、 放射治疗、 化学治疗、 内分泌治疗和分子 靶向治疗。目前乳腺癌的疗效更多的取决于病期， 人们对乳腺癌的治疗更多的寄希望于预 防和提高早诊率。 对于临床发现的中晚期患者， 治疗总体治疗效果还不尽如人意， 且术后并 发症、 复发、 转移较多。因此寻找更多预防和治疗乳腺癌、 以及预防乳腺癌术后复发的新思 路和新方法仍然十分必要。 发明内容 0003 本发明的目的是提供一种可抑制癌细胞增殖的苯基修饰材料及其制备方法。 0004 本发明所提供的苯基修饰材料是按照包括下述步骤的方法制备得到的 ： 0005 1） 以含苯基的硫醇为溶质、 无水乙醇为溶剂， 制备质量浓度为0.。
9、8%1.5%的硫醇 溶液， 并于 3 8静置 4 24h， 使硫醇分子在溶液中均匀分布 ； 0006 所述含苯基的硫醇， 其分子式为 C6H6(CH2)nSH， n 为正整数 ； 0007 2） 先在单晶硅片表面生长钛 （Ti） 过渡层， 再在所述钛过渡层上生长金层， 得到镀 金硅片 ； 0008 3） 在避光条件下， 将步骤 2) 所述镀金硅片放入步骤 1） 制备的硫醇溶液中， 静置 4 24h， 即得所述苯基修饰材料。 0009 上述方法， 步骤 1） 在制备硫醇溶液的过程中要求避光溶解。 0010 上述方法， 步骤2） 中所述单晶硅片的厚度可为0.51mm， 所述单晶硅片具体可为 单晶硅。
10、 。 0011 所述钛 （Ti） 过渡层的厚度可为 8 12nm。 0012 所述金层的厚度可为 30 50nm， 所述金层具体可为金 （Au,111） 层。 0013 步骤 2） 中在单晶硅片表面生长钛 （Ti） 过渡层以及在钛过渡层上生长金层的方法 可按照现有的方法进行制备。如等离子溅射法、 磁控溅射法或者分子束外延生长法等。 0014 步骤 2） 中所述单晶硅片在使用前还需进行下述清洁处理 ： 将所述单晶硅片在浓 硫酸和双氧水体积比为31的混合液中清洗2次， 再用三蒸水清洗3次， 氮气环境下烘干 ； 所述浓硫酸的质量浓度为 98%， 所述双氧水的质量浓度为 50%。 0015 同样地， 。
11、步骤 2） 得到的镀金硅片也需进行上述清洁处理。 0016 本发明方法制备得到的苯基修饰材料与水的接触角为 101 105， 硫醇分子 在金表面排列的间距为 5 6nm。 0017 本发明的再一个目的是提供上述苯基修饰材料的应用。 0018 本发明所提供的苯基修饰材料的应用包括下述几方面 ： 1） 在制备抑制癌细胞的增 说 明 书 CN 102727947 B 3 2/3 页 4 殖和 / 或黏附和 / 或迁移的产品中的应用 ； 2） 在制备促进乳腺癌细胞内雌激素受体 2 基因 （ESR2） 的表达的产品中的应用 ； 3） 在制备抑制乳腺癌细胞内迁移、 增殖相关基因 （Snaill， Cycl。
12、ln） 的表达的产品中的应用 ； 4） 在制备抗癌产品中的应用 ； 5） 在预防和 / 或治疗癌症 相关研究中的应用。 0019 所述癌细胞具体可为乳腺癌细胞， 如乳腺癌上皮细胞 MCF-7。 0020 细胞微环境是控制细胞命运的关键因素， 而常见的表面改性材料又引入复杂的物 理、 化学及生物因素。单一化学官能团修饰的材料提供物理、 化学特性单一的细胞微环境， 对癌细胞的黏附、 迁移和增殖有针对性作用， 有效控制了癌细胞增殖。以乳腺癌为例， 本发 明通过在材料金表面修饰强疏水性的苯基， 抑制了乳腺癌细胞的粘附、 迁移和增殖， 进而造 成乳腺癌细胞的死亡， 显著提高了乳腺癌预防治疗效果。 附图说。
13、明 0021 图 1 为本发明所制备的苯基修饰材料表面的 X 射线光电子能谱。 0022 图 2 为苯基修饰材料表面对乳腺癌细胞黏附的影响。 0023 图 3 为苯基修饰材料表面对乳腺癌细胞增殖的影响。 0024 图4为苯基修饰材料表面对乳腺癌细胞内雌激素受体2基因 （ESR2） ， 迁移、 增殖相 关基因 （Snaill， Cyclln） 表达的影响。 具体实施方式 0025 下面通过具体实施例对本发明进行说明， 但本发明并不局限于此。 0026 下述实施例中所述实验方法， 如无特殊说明， 均为常规方法 ； 所述试剂和生物材 料， 如无特殊说明， 均可从商业途径获得。 0027 实施例 1、。
14、 制备苯基修饰材料 0028 1） 以含苯基的硫醇 分子式为 C6H6(CH2)8SH 为溶质， 无水乙醇为溶剂， 密封摇匀， 制备质量浓度为1.0%的硫醇溶液， 全程避光。 4静置24h， 使硫醇分子在溶液中均匀分布。 0029 2） 将单晶硅 （Si,100） 片在浓硫酸 （质量浓度 98%） 和双氧水 （质量浓度 50%） 体积比 为 3 1 的混合液中清洗 2 次， 再用三蒸水清洗 3 次， 氮气环境下烘干密封保存。将清洗后 的单晶硅片放入等离子溅射设备的真空腔中， 开启钛源， 生长钛 （Ti） 过渡层 （厚度为 10nm） ； 最后关闭钛源， 开启金源， 在钛过渡层上生长金 （Au,。
15、111） 层 （厚度约为 35nm） ， 制成的镀金 硅片在浓硫酸 （质量浓度 98%） 和双氧水 （质量浓度 50%） 体积比为 3 1 的混合液中清洗 2 次， 再用三蒸水清洗 3 次， 氮气环境下烘干。 0030 3） 在避光条件下， 将上述制成的镀金硅片放入步骤 1） 配置的硫醇溶液中， 静置 24h， 即得到苯基修饰材料。 0031 采用Axis Ultra的X射线光电子能谱系统对上述制成的苯基修饰材料进行检测， 结果见图 1。由图 1 中 84eV 和 88eV 的金峰可知， 金膜已成功生长 ； 由 163eV 和 168eV 的硫 峰可知， 硫醇已成功接枝。 0032 该苯基修饰。
16、材料与水的接触角为 101 105， 硫醇分子在金表面排列的间距 为 5 6nm。根据经典的自组装单分子膜理论， 硫醇分子在金 111 面上是均匀等距排列的， 通过 xps 中金元素和硫元素的峰面积之比可得金硫元素的含量之比， 因为金 111 面上金原 说 明 书 CN 102727947 B 4 3/3 页 5 子的面密度是已知的， 所以可由金硫元素含量之比计算出硫原子的面密度， 即可得到硫原 子的排列的间距。 0033 实施例 2、 苯基修饰材料与癌细胞作用的体外细胞试验 0034 1） 将 1.0cm1.0cm 的苯基修饰材料 （实施例 1 制备的） 灭菌后预先放入 24 孔板， 加入乳。
17、腺癌细胞， 104个细胞 / 孔， 置 37 C 培养箱至细胞贴壁。 0035 2） 定性观察 ： 电镜检测， 记录乳腺癌细胞黏附和增殖情况。 0036 3） 定量检测 ： 荧光定量 PCR， 检测乳腺癌细胞内雌激素受体 2 基因 （ESR2） 、 迁移和 增殖相关基因 （Snaill， Cyclln） 的表达量。 0037 研究对象 ： 人乳腺癌上皮细胞 （MCF-7） 。该癌细胞系的 Wnt7h 基因呈阳性。 0038 结果如下 ： 0039 1、 黏附结果 0040 将接枝好苯基化学官能团的金片切割为边长 1.0cm 的片， 放入 24 孔板中。然后加 入含有 10% 胎牛血清的 DEM。
18、E 培养基， 加入乳腺癌细胞 MCF-7， 104个细胞 / 孔， 在 37下置 于 CO2培养箱中存放。1 天后， 取出后做光镜观察， 结果见图 2。由图 2 可知， 对比对照组 （即 无化学官能团修饰） 和苯基修饰的材料表面上的乳腺癌细胞， 后者的贴附密度较小， 说明苯 基抑制了乳腺癌细胞的黏附。 0041 2、 增殖结果 0042 将接枝好苯基化学官能团的金片切割为边长 1.0cm 的片， 放入 24 孔板中。然后加 入含有 10% 胎牛血清的 DEME 培养基， 加入乳腺癌细胞 MCF-7， 104个细胞 / 孔， 在 37下置 于 CO2培养箱中存放。分别在 1 天和 2 天后， 取。
19、出固定， 染色， 然后采用共聚焦显微镜观察， 结果见图 3。由图 3 可知， 乳腺癌细胞黏附后增殖 1 天和 2 天的结果差别不明显， 说明苯基 抑制了乳腺癌细胞的增殖。 0043 3、 荧光定量 PCR 0044 将接枝好苯基化学官能团的金片切割为边长 1.0cm 的片， 放入 24 孔板中。然后 加入含有 10% 胎牛血清的 DEME 培养基， 加入乳腺癌细胞 MCF-7， 104个细胞 / 孔， 在 37下 置于 CO2培养箱中存放。2 天后， 取出收集细胞， 提取总 RNA， 采用荧光定量 PCR 检测检测苯 基修饰材料表面对乳腺癌细胞内雌激素受体 2 基因 （ESR2） ， 迁移、 。
20、增殖相关基因 （Snaill， Cyclln） 表达的影响， 结果见图 4。有研究报道当乳腺细胞发生癌变后， 细胞内 ESR 表达 水平上升， ESR 表达下降， 而 ESR2 是 ESR 的一种。Snaill 基因的表达与乳腺癌细胞的 迁移有关。Cyclln 基因调控乳腺癌细胞的的增殖。由图 4 可知， 苯基抑制了乳腺癌细胞的 增殖和迁移， 同时可以促进乳腺癌细胞内雌激素受体 2 的分泌。 0045 由上述结果可知， 本发明制备的苯基修饰材料， 可以抑制大部分乳腺癌细胞的黏 附和增殖。同时， 可以促进乳腺癌细胞内雌激素受体 2 基因 （ESR2） 的表达， 抑制迁移、 增殖 相关基因 （Snaill， Cyclln） 的表达， 其可以用于预防和治疗癌症 （尤其是乳腺癌） 的相关研 究。 说 明 书 CN 102727947 B 5 1/3 页 6 图 1 说 明 书 附 图 CN 102727947 B 6 2/3 页 7 图 2 说 明 书 附 图 CN 102727947 B 7 3/3 页 8 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102727947 B 8 。