新型氟代诺斯菌素及其制法和用途 【技术领域】
本发明属于生物技术工程领域， 具体地涉及使用大肠杆菌重组菌株 SL4101， 发酵 制备 3- 甲基 -2- 吲哚酸及其氟取代类似物， 以及通过前体喂养获得氟取代诺斯菌素的方 法。背景技术
硫肽类抗生素是一类富含硫元素， 氨基酸残基被高度修饰的环肽类化合物， 它们 中大部分都是由放线菌产生， 具有良好的抗菌活性。这类化合物都拥有一个三或四取代的 吡啶核心， 多个噻唑、 噁唑或噻唑啉等氮杂环及脱水氨基酸， 有的还带有高度修饰的芳香环 侧链。
研究表明， 硫肽类抗生素大都可以抑制革兰氏阳性菌的生长， 对多种耐药性的条 件致病菌具有较强的杀伤作用。硫肽类抗生素作用机制都是通过与核糖体结合， 从而抑制 蛋白质的合成来实现的。根据它们结合位点的不同， 大体上可分为两类 ： (1) 与 50S 核糖体 亚单元上的 23S rRNA-L11 蛋白复合物结合， 抑制延长因子的 GTPase 活性， 从而抑制蛋白质 的合成 ； (2) 与延长因子 Tu 蛋白复合物结合， 抑制 Ef-Tu·GTP·aa-tRNA 复合物的形成， 从 而抑制蛋白质的合成。
作为硫肽类抗生素家族中较早发现的成员之一， 诺斯菌素 (Nosiheptide)( 也称 为那西肽、 诺西肽或 multithiomycin) 由于其优良的抗菌活性， 很早就在工业上得到广泛 的应用 ( 图 1， 其中 R ＝ H)。在结构上， 诺斯菌素除了具有硫肽类抗生素的特征大环骨架以 外， 还具有一个特殊的吲哚酸侧环， 因此合成途径非常复杂。
为了提高诺斯菌素的抗菌活性， 本领域一直在尝试开发诺斯菌素的各类衍生物， 然而迄今为止尚未成功开发出活性更高的诺斯菌素的衍生物。因此， 本领域迫切需要开发 新型的、 活性更高的诺斯菌素衍生物。 发明内容
本发明的目的就是提供一类活性更高的新型诺斯菌素衍生物 - 氟代诺斯菌素。
本发明的另一目的是提供所述氟代诺斯菌素的制法和用途。
在本发明的第一方面， 提供了一种诺斯菌素衍生物， 其中所述的衍生物是氟代的 诺斯菌素。
在另一优选例中， 所述的衍生物是 5’ - 氟诺斯菌素或 6’ - 氟诺斯菌素。
在另一优选例中， 所述的 5’ - 氟诺斯菌素和 6’ - 氟诺斯菌素的结构式分别如式 I 和 II 所示 ：
在本发明的第二方面， 提供了一种药物组合物， 它含有本发明第一方面所述的诺 斯菌素衍生物以及药学上可接受的载体。
在另一优选例中， 所述的药物组合物是兽用的药物组合物， 它含有本发明第一方 面所述的诺斯菌素衍生物以及兽药学上可接受的载体。
在本发明的第三方面， 提供了本发明第一方面所述的诺斯菌素衍生物的用途， 它 被用于制备抗菌的组合物 ； 或用于制备抑制微生物生长的组合物 ； 或用作动物饲料的添加 剂 ( 尤其是作为起抗菌作用的添加剂 )。
在另一优选例中， 所述的组合物是药物组合物。
在另一优选例中， 所述的微生物包括细菌、 真菌、 衣原体、 支原体。
在另一优选例中， 所述的微生物包括 ： 枯草芽孢杆菌、 金黄色葡萄球菌、 铜绿假单 胞菌、 肺炎链球菌等等。
在本发明的第四方面， 提供了一种体外非治疗性地抑制微生物生长或杀灭微生物 的方法， 包括步骤 ： 在需要处理的场所施用本发明第一方面所述的诺斯菌素衍生物或第二 方面所述的药物组合物。
在本发明的第五方面， 提供一种治疗动物的细菌感染的方法， 其特征在于， 包括步 骤： 给需要治疗的哺乳动物施用本发明第一方面所述的诺斯菌素衍生物或第三方面所述的 药物组合物。
在本发明的第六方面， 提供了本发明所述的诺斯菌素衍生物的制备方法， 包括步 骤：
(a) 在氟代色氨酸存在下， 发酵培养诺斯菌素的生产菌， 从而产生本发明所述的诺 斯菌素衍生物 ；
(b) 从发酵产物中分离出所述的诺斯菌素衍生物。
在另一优选例中， 所述的氟代色氨酸选自下组 ： 5- 氟色氨酸、 6- 氟色氨酸或其组 合。
在另一优选例中， 所述的衍生物是 5’ - 氟诺斯菌素或 6’ - 氟诺斯菌素， 其结构式 分别如式 I 和 II 所示。
在本发明的第七方面， 提供了一种可用于制备本发明所述的诺斯菌素衍生物的中 间体， 其中所述的中间体是 3- 甲基 -5- 氟 -2- 吲哚酸 (5-F-MIA) 或 3- 甲基 -6- 氟 -2- 吲 哚酸 (6-F-MIA)。
在本发明的第八方面， 提供了一种制备本发明第七方面所述中间体的方法， 该方 法包括步骤 ：
(a) 在氟代色氨酸存在下， 发酵培养表达 S- 腺苷甲硫氨酸自由基酶 NosL 的工程 菌， 从而产生中间体 3- 甲基 -5- 氟 -2- 吲哚酸 (5-F-MIA) 或 3- 甲基 -6- 氟 -2- 吲哚酸 (6-F-MIA)， 其中所述的工程菌中携带含有 S- 腺苷甲硫氨酸自由基酶编码序列的质粒或基 因组中整合有表达 S- 腺苷甲硫氨酸自由基酶的编码序列， 从而表达 S- 腺苷甲硫氨酸自由 基酶 ；
(b) 从发酵产物中分离出所述的中间体。
在另一优选例中， 所述的工程菌包括大肠杆菌。
在另一优选例中， 所述的氟代色氨酸选自下组 ： 5- 氟色氨酸、 6- 氟色氨酸或其组 合。
在另一优选例中， 所述的 S- 腺苷甲硫氨酸自由基酶 NosL 来自产生诺斯菌素的活 跃链霉菌 (Streptomyces actuosus)。
在本发明的第九方面， 提供了一种化合物的用途， 其中所述的化合物选自下组 ： 5- 氟色氨酸、 6- 氟色氨酸、 3- 甲基 -5- 氟 -2- 吲哚酸 (5-F-MIA) 或 3- 甲基 -6- 氟 -2- 吲哚 酸 (6-F-MIA) 或其组合， 所述的化合物被用于制备本发明第一方面中所述的诺斯菌素衍生 物。 应理解， 在本发明范围内中， 本发明的上述各技术特征和在下文 ( 如实施例 ) 中具 体描述的各技术特征可以互相组合， 从而构成新的或优选的技术方案。 限于篇幅， 在此不再 一一累述。
附图说明 下列附图用于说明本发明的具体实施方案， 而不用于限定由权利要求书所界定的 本发明范围。
图 1 表示诺斯菌素 (Nosiheptide) 及本发明中 5’ - 氟诺斯菌素和 6’ - 氟诺斯菌 素的化学结构， 方框中强调的是诺斯菌素中甲基吲哚酸单元。
图 2 表示 S- 腺苷自由基酶 NosL 催化色氨酸 ( 或氟代色氨酸 ) 到 3- 甲基 -2- 吲 哚酸 MIA( 或氟代 MIA) 的复杂转化。
图 3 表示通过 E.coli 异源表达 NosL 获得 MIA 的 HPLC 分析。
图 4 表示通过喂养 SL4101 菌株获得氟代 MIA 的 HPLC 分析， i 为用 5- 氟色氨酸喂 养对照菌株 SL4100( 含 pET28a 空质粒的 E.coli BL21(DE3) 菌株 ) ； ii 为 6- 氟色氨酸喂养 SL4100， iii 为 5- 氟色氨酸喂养 SL4101 产生 5- 氟代 MIA ； iv 为 6- 氟色氨酸喂养 SL4101 产生 6- 氟代 MIA。
图 5 表示通过喂养 Streptomyces actuosus 获得氟取代诺斯菌素的 HPLC 分析， i 为不喂养氟代色氨酸的对照， ii 为 5- 氟色氨酸喂养产生 5’ - 氟诺斯菌素， iii 为 6- 氟色 氨酸喂养产生 6’ - 氟诺斯菌素。
图 6 为 5’ - 氟诺斯菌素的结构， LC-MS 及 UV 分析。
图 7 为 6’ - 氟诺斯菌素的结构， LC-MS 及 UV 分析。
图 8 为 5’ - 氟诺斯菌素的串联质谱 (Tandem-ESI-MS) 分析。
图 9 为 5’ - 氟诺斯菌素的 1H NMR(6d-THF， 600M)。 13
图 10 为 5’ - 氟诺斯菌素的 C NMR(6d-THF， 150M)。 1 1
图 11 为 5’ - 氟诺斯菌素的 H- H COSY(600MHz， d8-THF)。
图 12 为 5’ - 氟诺斯菌素的 HSQC(600MHz， d8-THF)。 19
图 13 为 5’ - 氟诺斯菌素的 F NMR(376MHz， d6-DMSO)。
图 14 表示 5’ - 氟诺斯菌素的抗枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis) 活性测定 ： 1， 5’ - 氟诺斯菌素 ； 2， 诺斯菌素。0.8μg(I)， 0.4μg(II)， 0.2μg(III)， or 0.1μg(IV) 化 合物分别溶于 200μl 四氢呋喃后加入牛津杯。结果显示， 5’ - 氟诺斯菌素抗菌活性比诺斯 菌素提高了 1 倍左右。
符号说明
图 1 中， NOS ： 诺斯菌素 ； 5’ - 氟 -NOS ： 5’ - 氟诺斯菌素 ； 6’ - 氟 -NOS ： 6’ - 氟诺斯 菌素。
图 2 中， L-trp ： L- 色 氨 酸 ； (L)-5-F-trp ： (L)-5 氟 色 氨 酸 ； (L)-6-F-trp ： (L)-5 氟色氨酸 ； MIA ： 3- 甲 基 -2- 吲 哚 酸 ； 5-F-MIA ： 3- 甲 基 -5 氟 -2- 吲 哚 酸 ； 6-F-MIA ： 3- 甲 基 -5- 氟 -2- 吲哚酸。
图 3 中， E.coli BL21(DE3) ： NosL 异源表达宿主 ； pET28a ： 大肠杆菌表达型质粒 ； SL4101 ： 导入 NocL 表达质粒的 E.coli BL21(DE3) 异源表达菌株。
图 4 中， MIA ： 3- 甲 基 -2- 吲 哚 酸 ； 5-fluoro-MIA ： 5 氟 代 3- 甲 基 -2- 吲 哚 酸 ； 6-fluoro-MIA ： 6 氟代 3- 甲基 -2- 吲哚酸。
图 5 中， S.actuosus WT ： 诺 斯 菌 素 产 生 菌 活 跃 链 霉 菌 ( 野 生 型 )； 5-fluoro-L-trp ： 5- 氟 色 氨 酸 ； 6-fluoro-L-trp ： 6- 氟 色 氨 酸 ； NOS ：诺 斯 菌 素 ； 5’ - 氟 -NOS ： 5’ - 氟诺斯菌素 ； 6’ - 氟 -NOS ： 6’ - 氟诺斯菌素。
图 15 中， MIC ： 最小抑菌浓度 (Minimum inhibitory concentrations) ； NOS ： 诺斯 菌素 ； 5’ - 氟 -NOS ： 5’ - 氟诺斯菌素。 具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究， 尤其通过对诺斯菌素生物合成基因簇的克隆以 及生物合成机制研究， 利用前体导向喂养等组合生物合成方法， 首次成功制备获得了一类 新型的、 活性更高的诺斯菌素衍生物 ( 图 1， R ＝ F)。在此基础上完成了本发明。
具体地， 本发明提供了一种制备相应诺斯菌素合成中间体 3- 甲基 -2- 吲哚酸 (MIA) 及其氟代类似物的方法 ( 图 2)， 即通过发酵表达 NosL 的表达菌株及前体喂养， 可以 较容易地获得 3- 甲基 -2- 吲哚酸 (MIA) 及其氟代类似物。此外， 对于诺斯菌素产生菌 ( 例 如活跃链霉菌 (Streptomyces actuosus))， 可在发酵培养过程中添加 ( 或喂养 )5- 氟色氨 酸或 6- 氟色氨酸前体， 从而获得对应的氟取代诺斯菌素。
实验表明， 与诺斯菌素相比， 本发明的氟代诺斯菌素对枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis) 抗菌活性比诺斯菌素提高了一倍。
活性成分
如本文所用， 术语 “本发明的活性成分” 、 “本发明化合物” 、 和 “本发明的诺斯菌素 衍生物” 可互换使用， 都指氟代的诺斯菌素， 尤其是如式 I 和 II 所示的 5’ - 氟诺斯菌素或6’ - 氟诺斯菌素。
如本文所用， 术语 “5’ - 氟 -NOS” 表示 5’ - 氟诺斯菌素， 术语 “6’ - 氟 -NOS” 表示 6’ - 氟诺斯菌素。其结构式如式 I 和 II 所示。
在本发明的一个优选例中， 提供了一种制备氟代诺斯菌素的简便方法， 它包括 将氟取代的色氨酸 (5- 氟色氨酸或 6- 氟色氨酸 ) 喂养诺斯菌素 (Nosiheptide) 产生菌 Streptomyces actuosus， 获得了对应的氟取代诺斯菌素 (5’ - 氟诺斯菌素或 6’ - 氟诺斯菌 素 )。
本发明人不仅通过对 5’ - 氟诺斯菌素的大量发酵以及分离纯化， 确证了化合物的 结构。而且通过抗菌活性实验证实了， 本发明的氟代诺斯菌素比诺斯菌素的抗菌活性有显 著提高。
中间体及其用途
如本文所用， 术语 “中间体” 指参与本发明氟代诺斯菌素合成的化合物， 其中所述 的化合物选自下组 ： 5- 氟色氨酸、 6- 氟色氨酸、 3- 甲基 -5- 氟 -2- 吲哚酸 (5-F-MIA) 或 3- 甲 基 -6- 氟 -2- 吲哚酸 (6-F-MIA) 或其组合。这些中间体化合物被用于合成或制备本发明的 诺斯菌素衍生物。
在本发明的一个优选例中， 提供了一种发酵制备中间体 3- 甲基 -2- 吲哚酸及其氟 取代类似物的方法， 其中包括 ：
1) 对诺斯菌素生物合成中编码一个 S- 腺苷甲硫氨酸自由基酶的基因 nosL 进 行 PCR 扩增并将其连入 pET28a 质粒。将获得的质粒导入大肠杆菌 E.coliBL21(DE3) 获得 重组菌株 SL4101。对 SL4101 进行发酵可以获得产量大于 40mg/L 的 3- 甲基 -2- 吲哚酸 (3-methyl-2-indolic acid， MIA)。
2) 将经诱导表达一段时间的 SL4101 菌体重悬于培养基中， 并在培养基中添加 氟取代的色氨酸 (5- 氟色氨酸或 6- 氟色氨酸 )， 可以获得产量约为 10mg/L 的氟取代的 MIA(3- 甲基 -5- 氟 -2- 吲哚酸， 5-F-MIA 或 3- 甲基 -6- 氟 -2- 吲哚酸， 6-F-MIA)。
药物组合物和施用方法
本发明化合物 ( 即氟代的诺斯菌素 ) 具有优异的抑菌 ( 抗菌 ) 活性， 因此可用作 抗菌素 ( 或抗生素 )。
本发明化合物可施用于哺乳动物 ( 如人 )， 可以口服、 直肠、 肠胃外 ( 静脉内、 肌肉
内或皮下 )、 局部等方式给药。所述化合物可以单独给药， 或者与其他药学上可接受的化合 物联合给药。需要指出， 本发明的化合物可以混合给药。
用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、 片剂、 丸剂、 散剂和颗粒剂。在这些固体剂 型中， 活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂 ( 或载体 ) 混合， 如柠檬酸钠或磷酸二钙， 或 与下述成分混合 ： (a) 填料或增容剂， 例如， 淀粉、 乳糖、 蔗糖、 葡萄糖、 甘露醇和硅酸 ； (b) 粘合剂， 例如， 羟甲基纤维素、 藻酸盐、 明胶、 聚乙烯基吡咯烷酮、 蔗糖和阿拉伯胶 ； (c) 保湿 剂， 例如， 甘油 ； (d) 崩解剂， 例如， 琼脂、 碳酸钙、 马铃薯淀粉或木薯淀粉、 藻酸、 某些复合硅 酸盐、 和碳酸钠 ； (e) 缓溶剂， 例如石蜡 ； (f) 吸收加速剂， 例如， 季胺化合物 ； (g) 润湿剂， 例 如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯 ； (h) 吸附剂， 例如， 高岭土 ； 和 (i) 润滑剂， 例如， 滑石、 硬脂酸 钙、 硬脂酸镁、 固体聚乙二醇、 十二烷基硫酸钠， 或其混合物。 胶囊剂、 片剂和丸剂中， 剂型也 可包含缓冲剂。
固体剂型如片剂、 糖丸、 胶囊剂、 丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备， 如肠衣和 其它本领域公知的材料。 它们可包含不透明剂， 并且， 这种组合物中活性化合物或化合物的 释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。 可采用的包埋组分的实例是聚合物质 和蜡类物质。必要时， 活性化合物也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。 用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、 溶液、 悬浮液、 糖浆或酊剂。 除了活性化合物外， 液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂， 如水或其它溶剂， 增 溶剂和乳化剂， 例知， 乙醇、 异丙醇、 碳酸乙酯、 乙酸乙酯、 丙二醇、 1， 3- 丁二醇、 二甲基甲酰 胺以及油， 特别是棉籽油、 花生油、 玉米胚油、 橄榄油、 蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物 等。
除了这些惰性稀释剂外， 组合物也可包含助剂， 如润湿剂、 乳化剂和悬浮剂、 甜味 剂、 娇味剂和香料。
除了活性化合物外， 悬浮液可包含悬浮剂， 例如， 乙氧基化异十八烷醇、 聚氧乙烯 山梨醇和脱水山梨醇酯、 微晶纤维素、 甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。
用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、 分散液、 悬浮液或乳液， 和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和 非水载体、 稀释剂、 溶剂或赋形剂包括水、 乙醇、 多元醇及其适宜的混合物。
用于局部给药的本发明化合物的剂型包括软膏剂、 散剂、 贴剂、 喷射剂和吸入剂。 活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载体及任何防腐剂、 缓冲剂， 或必要时可能需要 的推进剂一起混合。
本发明化合物可以单独给药， 或者与其他药学上可接受的化合物联合给药。
使用药物组合物时， 是将安全有效量的本发明化合物适用于需要治疗的哺乳动物 ( 如人 )， 其中施用时剂量为药学上认为的有效给药剂量， 对于 60kg 体重的人而言， 日给药 剂量通常为 1 ～ 1000mg， 优选 20 ～ 500mg。当然， 具体剂量还应考虑给药途径、 病人健康状 况等因素， 这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明的主要优点包括 ：
(a) 提供一种制备 3- 甲基 -2- 吲哚酸及其氟取代类似物的方法。
(b) 提供一种结构新颖的、 活性更高的诺斯菌素衍生物。
下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。应理解， 这些实施例仅用于说明本
发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照 常规条件， 例如 Sambrook 等人， 分子克隆 ： 实验室手册 (New York ： Cold Spring Harbor Laboratory Press， 1989) 中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条件。
除非另行定义， 文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意 义相同。此外， 任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所 述的较佳实施方法与材料仅作示范之用， 但不能限制本发明的内容。
实施例 1 大肠杆菌重组菌株 SL4101 的获得及 MIA 的制备
在本实施例中， 通过 PCR 扩增 Streptomyces actuosus 中编码 NosL 的基因序列， 将其连入 pET28a 表达载体后， 将构建成功的质粒导入 E.coliBL21(DE3) 中， 得到重组菌 株 SL4101。诱导 SL4101 中 NosL 的表达 5 小时以上， 在发酵液上清及菌体中检测到大量的 MIA( 大于 40mg/l) 生成。
1.NosL 表达菌株 SL4101 的构建
克隆 NosL 的引物序列如下 ：
NosL- 正向 ： 5’ -TTGAATTCATGACGCAGAACTCCCAGG-3’ (SEQ ID NO ： 1)
NosL- 反向 ： 5’ -TTTAAGCTTTCAGACCGCCCGGGACGCCTC-3’ (SEQ ID NO ： 2) 以抽提的活跃链霉菌的总 DNA 为模板， 用上述特异性引物进行 PCR 扩增， 从而获得 包含 NosL 基因的约 1.4Kb 的扩增片段， 将其进行凝胶电泳分离， 切胶回收纯化。加入限制 性内切酶 EcoRI 和 HindIII 消化回收片段， 将其连入用同样酶处理过的 pET28a 质粒 ( 购自 Promega 公司 ) 后将连接体系转化常规的大肠杆菌 E.coli DH5α， 挑取单克隆菌落于 LB 培 养液 ( 含有卡那霉素抗生素 ) 中培养过夜， 至菌液较浓。 提取质粒经酶切验证后送测序进一 步验证。 用验证正确的质粒转化 E.coli BL21(DE3)， 从而获得重组的大肠杆菌菌株 SL4101。
2. 重组菌株 SL4101 的发酵获得 MIA
将 -80℃保存的 SL4101 菌液在 LB( 卡那霉素 50μg/ml) 平板上划线， 培养过夜。 挑取单菌落分别接种于 3ml LB 培养基 ( 卡那霉素 50μg/ml)37℃培养 8 小时以上后接种于 800ml LB 培养基 ( 卡那霉素 50μg/ml)， 37℃培养 2.5 小时 (A600nm0.5-0.7)， 转移至 25℃继 续培养 0.5 小时， 加入 Fe(NH4)SO4 至终浓度 2mg/L， 再加入 IPTG 至终浓度 0.1mM， 25℃培养 6 小时以上 ( 或过夜 )。将菌液离心 (5000rmp， 20 分钟 )， 菌液直接用 HPLC 进行检测 ( 图 3)。
HPLC 分析检测条件 ：
仪器 ： Agilent 1100HPLC 系统
柱子 ： Agilent ZORBAX SB-C18 柱 (4.6x 150mm， 产品批号 993967-902)
检测波长 ： UV ＝ 298nm
流动相条件 ： V ＝ 1ml/min ； A ＝ H2O(1‰ TFA) ； B ＝ CH3CN(1‰ TFA)
Min 0 3 A％ /B％ 85％ A/15％ B 85％ A/15％ B60％ A/40％ B 60％ A/40％ B 45％ A/55％ B 85％ A/15％ B3.MIA 的分离纯化及表征
NosL 表达菌液经离心， 上清用 2M HCl 调 pH ＝ 2.8 后用 0.5 倍体积的萃取液 ( 正 丁醇∶二氯甲烷＝ 1 ∶ 4) 萃取两次。沉淀用 50ml 四氢呋喃浸泡 2 小时后离心弃沉淀， 上 清与萃取液合并后蒸发浓缩至近干。剩余固体用 5ml 四氢呋喃溶解， 过滤除去不溶物后用 半制备 HPLC(Agilent ZORBAX SB-C18 柱 (9.4x 250mm， 产品批号 880975-202)) 进行分离纯 化和表征。 1
H NMR(400MHz， d6-DMSO)δ11.28(s， 1H)， 7.60(d， J ＝ 8.02， 1H)， 7.37(d， J ＝ 8.15， 1H)， 7.20(m， 1H)， 7.02(m， 1H)， 2.50(s， 3H)。 13
C NMR(400MHz， d6-DMSO)δ164.0， 135.9， 127.9， 125.1， 124.2， 120.1， 119.0， 116.9， 112.2， 9.7。
UV 吸收， v max ＝ 230nm 和 298nm ；
HR-ESI-MS m/z[M-H]- 测量值 ： 174.05605(C10H8O2N 的计算值 ： 174.05615)
上述结果证实， S- 腺苷甲硫氨酸自由基酶 NosL 参与了吲哚酸单元的形成。
实施例 2 氟代 MIA 的获得
在本实施例中， 将表达 5 小时的 SL4101 菌体重悬于用常规的 LB 培养基和 M9 培养 基按 1 ∶ 1 混合所形成的混合培养基中， 并且喂养氟取代的色氨酸 (5- 氟色氨酸或 6- 氟色 氨酸 )， 培养 5 小时以上， 可获得 10mg/l 左右的对应氟取代的 MIA， 该化合物通过 LC/MS 检 测 ( 图 4)， 并且经过分离纯化和表征， 结构得到证实。
此外， 还采用与实施例 1 类似的方法， 将 -80℃保存的 SL4101 菌液在 LB( 卡那霉 素 50μg/ml) 平板上划线， 培养过夜。挑取单菌落分别接种于 3ml LB 培养基 ( 卡那霉素 50μg/ml)37℃培养 8 小时以上后接种于 800ml LB 培养基 ( 卡那霉素 50μg/ml)， 37℃培养 2.5 小时 (A600nm0.5-0.7)， 转移至 25℃继续培养 0.5 小时， 加入 Fe(NH4)SO4 至终浓度 2mg/L， 加入对应的 5- 氟或 6- 氟取代的色氨酸至中浓度为 1mM， 再加入 IPTG 至终浓度 0.1mM， 25℃ 培养 5-6 小时。通过与实施例 1 类似的方法对氟取代的 MIA 进行分离纯化和表征。
5- 氟 -MIA ： 1
H NMR(400MHz， d6-DMSO) ： δ11.21(s， 1H)， 7.30(m， 2H)， 6.99(m， 1H)， 2.46(s， 13 3H) ；C NMR(100MHz， d6-DMSO) ： δ156.7， 154.4， 131.1， 127.1， 127.0， 112.2， 112.1， 111.5， 111.1， 103.1， 102.8， 17.4 ； 19
F NMR(376MHz， d6-DMSO) ： δ-119.6 ；
UV/Visλmax227nm， 242nm， 和 302nm ； HR-ESI-MS(m/z) ： [M-H] C10H7FO2N 计算值 ： 192.04663 ； 测量值 ： 192.04637 ； 6- 氟 -MIA ：10CN 102453077 A
1说明书9/12 页H NMR(300MHz， CD3OD)δ7.58(m， 1H)， 7.02(m， 1H)， 6.82(m， 1H)， 2.55(s， 3H) ；
F NMR(282MHz， CD3OD)δ-120.2 ；
UV/Visλmax227nm， 242nm， 和 302nm ；
HR-ESI-MS(m/z) ： [M-H] C10H7FO2N 计算值 ： 192.04663 ； 测量值 ： 192.04624.
上述结果证实， 通过添加 5- 氟色氨酸和 6- 氟色氨酸， 在 S- 腺苷甲硫氨酸自 由基酶 NosL 的催化作用下， 可分别形成 3- 甲基 -5- 氟 -2- 吲哚酸 (5-F-MIA) 或 3- 甲 基 -6- 氟 -2- 吲哚酸 (6-F-MIA)。
实施例 3 氟代诺斯菌素的发酵、 检测、 分离纯化及活性测定
在本实施例中， 将氟取代的色氨酸 (5- 氟色氨酸或 6- 氟色氨酸 ) 喂养诺斯菌素 (Nosiheptide) 产生菌 Streptomyces actuosus， 获得了对应的氟取代诺斯菌素 (5’ - 氟诺 斯菌素或 6’ - 氟诺斯菌素 )。方法如下 ：
将诺斯菌素产生菌 S.actuosus 单菌落接种于 3ml 常规的 TSB 培养基中， 培养 36-48 小时， 将菌液接种于 50ml TSB 培养基至对数生长期。此时将 3-4ml 菌液接种于 50ml 预发酵培养基 ( 葡萄糖 5g， 玉米浆 15ml， 蛋白胨 5g， 酵母提取物 1g， 麦芽提取物 1g， 七水硫 酸镁 0.2g， 硫酸铵 1.5g， 碳酸钙 2.5g， pH ＝ 6.8)， 30℃培养 28-36 小时至菌体长浓。 将 10ml 预发酵菌液接种于 100ml 发酵培养基中 ( 谷氨酸 0.5g， 精氨酸 0.1g， 天冬氨酸 0.1g， 七水磷 酸氢二钾 0.05g， 七水硫酸镁 0.1g， 硫酸钠 0.2g， 七水硫酸锌 0.001g， 七水硫酸亚铁 0.002g， 碳酸钙 0.3g， 葡萄糖 4g， pH ＝ 7.25)， 30℃， 250rpm 培养， 分别于 30， 48 小时加入氟代色氨19酸 (5- 氟色氨酸或 6- 氟色氨酸 ) 至终浓度为 0.2mM。培养 96 小时离心收菌。
离心后上清弃去， 菌体 (20×100ml 培养液 ) 用 500ml 丙酮浸泡过夜， 过滤除去不 溶物， 滤液经 HPLC 分析 ( 结果如图 5 所示 )。
此外， 滤液经减压蒸馏抽干得深褐色膏状物。膏状物第一步先进行粗分， 用 100-200 目粗硅胶拌样膏状物， 油泵抽干， 上 300-400 目硅胶预装的正相柱， 梯度洗脱条件 为：
氟代诺斯菌素出现在 95％二氯甲烷 /5％甲醇的洗脱部分中， 把上述洗脱液减压 抽干溶于 3ml 四氢呋喃， 上 C18 材料的高压反相柱， 洗脱顺序为 ：
11CN 102453077 A
说水∶甲醇明书配比 95％ /5％ 90％ /10％ 85％ /15％ 80％ /20％ 60％ /40％ 50％ /50％ 40％ /60％ 100％10/12 页
目标化合物出现在 60％水 /40％甲醇， 50％水 /50％甲醇这两部分， 收集该段流出 液， 减压抽干， 溶于 3ml 四氢呋喃， 然后 HPLC 半制备。
HPLC 半制备条件 ：
仪器 ： Agilent 1100HPLC 系统
柱子 ： Agilent ZORBAX SB-C18 柱 (9.4x 250mm， 产品批号 880975-202)
检测波长 ： UV ＝ 330nm
流动相条件 ： V ＝ 2.2ml/min ； A ＝ H2O(1‰ TFA) ； B ＝ CH3CN(1‰ TFA)
Min 0 20 A％ /B％ 55％ A/45％ B 85％ A/15％ B
按上述的 HPLC 的洗脱条件， 收集氟代诺斯菌素的流出液， 最终得到目标产物， 结 果如图 6-13 所示， 测量数据如下 ：
5’ - 氟诺斯菌素 ： 1
H NMR(600MHz， d8-THF) ： δ10.76(br， 1H)， 10.19(s， br， 1H)， 9.81(s， 1H)， 8.76(s， 1H)， 8.63(s， br， 1H)， 8.32(s， 1H)， 8.13(s， 1H)， 7.93(s， 1H)， 7.79(m， 1H)， 7.77(s， 1H)， 7.70(s， 1H)， 7.43(d， J ＝ 9.50， 2H)， 7.09(m)， 6.89(br)， 6.52(s)， 6.33(q， J ＝ 7.00)， 5.86(m)， 5.69(t， J ＝ 10.50)， 5.45Z(s)， 5.42(m)， 4.32(m)， 3.89(t， J ＝ 12.0)， 2.09(s)， 1.67(d， J ＝ 6.00)， 0.75(d， J ＝ 6.50) ； 13
C NMR(150MHz， d8-THF) ： δ177.9， 173.9， 171.7， 171.4， 170.7， 168.2， 167.8， 166.4 ， 165.9 ， 161.8 ， 160.7 ， 160.4 ， 159.0 ， 158.1 ， 156.6 ， 155.9 ， 152.9 ， 152.9 ， 152.0 ， 151.7 ， 151.5 ， 149.8 ， 145.5 ， 135.6 ， 135.5 ， 135.4 ， 132.9 ， 131.9 ， 130.5 ， 129.0 ， 128.1 ，127.2， 126.9， 126.8， 125.7， 125.1， 121.5， 120.0， 117.2， 115.6， 68.0， 64.6， 58.4， 58.3， 50.9， 46.8， 35.3， 29.9， 23.2， 21.5， 14.7 ； 19
F NMR(376MHz， d6-DMSO) ： δ-126.5 ；
UV/Vis λmax222nm 和 357nm ；
HR-ESI-MS(m/z) ： [M-H]-C51H41FN13O12 计算值 ： 1238.13114 ； 测量值 ： 1238.12959 ；
串 联 质 谱 Tanderm ESI-MS( 阳 离 子 扫 描 ) ： 1239.9， 1220.0， 1196.0， 1149.4， 1116.0， 1035.1， 956.7， 904.7
6’ - 氟诺斯菌素的测量结果与 5’ - 氟诺斯菌素类似。
实施例 4
通过中间体制备氟代诺斯菌素
重复实施例 3， 不同点在于， 在发酵培养过程时不加入氟代色氨酸， 而改为加入实 施例 2 中制备的氟取代的 3- 甲基 -2- 吲哚酸， 即 3- 甲基 -5- 氟 -2- 吲哚酸 (5-F-MIA) 或 3- 甲基 -6- 氟 -2- 吲哚酸 (6-F-MIA)。
结果， 在添加 3- 甲基 -5- 氟 -2- 吲哚酸 (5-F-MIA) 的情况下， 获得了 5’ - 氟诺斯 菌素。在添加 3- 甲基 -6- 氟 -2- 吲哚酸 (6-F-MIA) 的情况下， 获得了 6’ - 氟诺斯菌素。 这表明， 氟取代 3- 甲基 -2- 吲哚酸是合成氟代诺斯菌素的中间体。
实施例 5
氟代诺斯菌素的抗菌活性
对 5’ - 氟诺斯菌素和诺斯菌素进行抗菌活性的测定， 方法如下 ： 在 96 孔板中， 将 溶于四氢呋喃的 5’ - 氟诺斯菌素加入培养基至 0.256ug/ml 并逐级稀释至 0.00025ug/ml。 将测试菌加入培养基至 107-108cfu/ml( 根据 0.5McFarland 标准 ) 并培养过夜。测试菌不 能生长所对应的最小浓度为 MIC。
最小抑菌浓度 (MIC) 测试结果显示， 5’ - 氟诺斯菌素的 MIC 值为 0.004ug/ml， 而诺 斯菌素的 MIC 值为 0.008ug/ml， 这表明， 5’ - 氟诺斯菌素具有更高的抗菌活性， 其抗革兰氏 阳性菌 Bacillus subtilis 的活性比诺斯菌素的活性提高 1 倍 ( 图 14 和表 1)。
表 1 5’ - 氟诺斯菌素与诺斯菌素对枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度 (MIC)
注： 枯草芽孢杆菌购自上海医学工业研究院。
同样地， 6’ - 氟诺斯菌素对抗革兰氏阳性菌 Bacillus subtilis 的活性也明显高 于诺斯菌素 ( 提高至少约 1 倍 )。
实施例 6
药物组合物
5’ - 氟诺斯菌素 20g
淀粉 140g
微晶纤维素 70g
按常规方法， 将上述物质混合均匀后， 装入普通明胶胶囊， 得到 1000 颗胶囊。
按类似方法， 制得含 6’ - 氟诺斯菌素的胶囊。
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