用于具有美容功能的细胞的遗传修饰以提高美容外观的方 法和组合物 发明领域 本发明提供了用于细胞的美容的遗传修饰的具有美容功能的组合物和方法。 还提 供了使用多种动物模型, 用于测定是否皮肤蛋白和其他生物分子 ( 如胶原、 弹性蛋白、 细胞 外基质蛋白、 蛋白多糖、 生长因子等 ) 的表达和 / 或水平对皮肤有美容的回复青春作用, 并 用于评估具有美容功能的基本上完整细胞的美容基因修饰的组合物和方法。
背景技术 皮肤蛋白质的水平和 / 或表达, 以及其他生物分子 ( 如胶原, 弹性蛋白, 细胞外基 质蛋白, 蛋白多糖, 生长因子, 内源性抗氧化酶, DNA 修复酶等 ) 会随着年龄增长显著衰退, 造成外观上非期望的改变。例如, 纤维细胞和角质细胞对生长因子的刺激应答能力会随着 年龄下降。 相反的, 某些蛋白质会增加, 对皮肤和其他具有美容功效的细胞带来不可预计的 影响。基质金属蛋白酶 (MMP-1) 在皮肤细胞中的含量会增加 ; 可是当 MMP-1 加速胶原酶分 解后, MMP-1 的增加对皮肤是有害的。
与年龄相关的变化包括皮肤的松弛, 稀疏, 起皱。 个别指定的组合物用以改善皮肤 外观, 但一般说来, 这种组合物需要频繁和大量的使用 ( 全年中每天一次或两次 )。 另外, 侵 入式治疗 ( 如整形外科手术, 激光换肤, 注射治疗 ) 可能会有助于减少皮肤下垂和起皱。尽 管如此, 许多人并不愿意接受非治疗用 ( 即外形美观 ) 的外科手术。因此, 有必要使化妆品 的组合物和方法提供一个比普通的护肤霜更永久的解决方法, 但又不需要任何外科手术或 侵入式的干预。
基因治疗可以为促进, 治疗和维护有美容功效的细胞提供有针对性的方法。 例如, 某些基因与皮肤组织的维护及修缮有关。许多生长因子, 如表皮生长因子 (EGF), 转化生长 因子 (TGF-β), 成纤维细胞生长因子 (FGF), 胰岛素样生长因子 (IGF-1), 角质细胞生长因 子 (KGF), 血管内皮生长因子 (VEGF) 和 PDGF 可能参与伤口愈合 ( 见例如, Grazul-Bilska 等, Druags of Today , 2003 , 39 : 787-800 ; S.Werner 和 R.Grose ; Physiol.Rev. , 83 : 835-870, 2003)。例如, 血管内皮生长因子 (VEGF), 血小板衍生生长因子 (PDGF), 胰岛素样 生长因子 (IGF-1), 粒细胞 / 巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF), 白细胞介素 (IL-8, IL-6), 肿 瘤坏死因子 (TNF-α), 转化生长因子 (TGB-β) 和基质蛋白的混合物可以被用来改善伤口 愈合 ( 综述于 Jimenez 和 Jimenez, Am.J.Surgery, 2004, 187 : 56S-64S)。此外, 胰岛素样生 长因子 (IGF-1) 可能被用来增加肌肉肥大 (Barton-Davis 等, Acta Physiol.Scand., 1999, 167 : 301-305)。因此, 通过分子靶向涉及美容功效的细胞的基因组改进特定蛋白的产生和 可以提供一种改进这种细胞的寿命和健康的方法。 功能,
发明概述
本发明的某些实施方案解决这些与老化和其他不想要的改变有关的问题, 所述不 想要的改变可发生于皮肤和其他具有美容功能的细胞中。
本发明的某些实施方案提供了用于具有美容功能的细胞的美容基因修饰的方法,
以及用于提供具有美容功能的细胞的美容外观的组合物。
本发明的其他实施方案提供了使用多种动物模型, 用于测定是否皮肤蛋白和其他 生物分子 ( 如胶原、 弹性蛋白、 细胞外基质蛋白、 蛋白多糖、 生长因子等 ) 的表达和 / 或水平 对皮肤有美容的回复青春作用, 并用于评估具有美容功能的基本上完整细胞的美容基因修 饰的组合物和方法。
如此处所公开, 本发明的方法和组合物的实施方案可包含编码为核算和 / 或多肽 的多核苷酸的构建, 所述核酸和 / 或多肽可发挥作用以改善和 / 或保持此类细胞的外观。 或 者或此外, 也可使用包含孤立的多肽或其生物学活性的衍生物的组合物。
因此, 本发明主要致力于皮肤和具有美容功效细胞的外观退化问题, 以及对这种 细胞的基因修饰提供组合物和方法。同时本发明可以以各种方式体现。
在一个实施方案中, 对于具有美容功效的完整细胞的大幅基因修饰, 当前的发明 提供了一些组合物和方法。 其中主要包括对至少可以编码一种核苷酸的多聚核苷酸进行调 控, 或是对美容功效细胞有维持作用的多肽在这种细胞中的表达进行调控。他们所具有的 提高和 / 或维持一个生化和 / 或生理过程的美容功效, 对外观具有积极作用。 其中一个实施 例中, 某种多肽由角质细胞生长因子或一种生物活性衍生物组成。 例如, 在某些实施例的多 聚核苷酸中, 包含了序列 ID 号为 24 的核苷酸 446 到 1030, 或者是一段至少有 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 或 99%和该段核苷酸相似的序列。或者是具有序 列 ID 号为 23 的一种编码蛋白的多聚核苷酸, 亦或是和该段序列 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%相似的序列。 在另一个实施方案中, 当前的发明包含了在个体中, 对具有美容功效的完整细胞 大幅基因修饰的组合物。该组合物包括至少可以编码一种核苷酸的孤立多聚核苷酸, 或是 可以维持细胞美容功效的多肽。或者, 该组合物包括了维持细胞美容功效的多肽。其中一 个实施例中, 某种多肽由角质细胞生长因子或一种生物活性衍生物组成。 例如, 在某些实施 的多聚核苷酸中, 包含了序列 ID 号为 24 的核苷酸 446 到 1030, 或者是一段序列至少 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 或 99%和该段核苷酸相似。 或者是具有序列 ID 号为 23 的一种编码蛋白的多聚核苷酸, 亦或是和该段序列 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%相似的序列。
该组分可能进一步包含某种载体, 这种载体可以调控至少一种具有美容功效宿主 细胞中的多聚核苷酸或多肽。 在一个实施方案中, 确定主体后, 该组分使核酸和多肽在具有 美容功效的细胞中表达, 他们所具有的提高和 / 或维持一个生化和 / 或生理过程的功效, 对 美容外观具有积极作用。
在某些实施例中, 本发明的方法和组合物可能会导致多个蛋白的表达。他们所具 有的提高和 / 或维持一个生化和 / 或生理过程的功效, 对美容外观具有积极作用。例如, 和 外观有关的初级蛋白或氨基酸的表达 ( 例如, 将可以表达角质细胞生长因子的多聚核苷酸 或其他多肽应用于细胞 ) 可以引发次级蛋白质或多肽的内源性表达 ( 如胶原或其他多肽 )。 他们所具有的提高和 / 或维持一个生化和 / 或生理过程的功效, 对美容外观具有积极作用。
因此, 本发明的实施例中包括对具有美容功效细胞的基因修饰的方法和组合物, 在某些实施例中, 本发明还包含对具有美容功效的细胞进行体内转染重组构建的方法。而 在另外一些实施例中, 通过将这种转染细胞注射入皮肤或其他美容相关的细胞中, 可以在
体外进行相同的构建。而在其他一些实施例中, 多肽也可被用于本发明中。
对构建编码的众多生物分子进行重组, 可用来增强美容功效细胞的蛋白质和其他 生物大分子的表达。 在某一实施例中, 组分可能包括一种多肽, 或是构造包括编码多肽或其 他生物分子的重组 DNA 分子, 他们在具有美容功效的细胞中, 可以修饰基因的活性。例如, 在备用实施例中, 多聚核苷酸可以编码胶原多肽, 弹性蛋白多肽, TIMP-1 多肽, 超氧化物歧 化酶多肽, 和 / 或角质细胞生长因子 (KGF) 多肽。
或者, 重组构建可以编码调节核酸分子, 如反义寡核苷酸, 或 RNA 抑制子 (RNAi), 核酶, 三重螺旋形成寡核苷酸 (TFOs) 或肽核酸 (PNA), 它们能在具有美容功效的细胞内影 响基因, 例如通过下调表达胶原和弹性蛋白的降解酶 ( 如基质金属蛋白酶, 胶原酶, 明胶 酶, 弹性蛋白酶, 质溶解素, 丝氨酸蛋白酶和 / 或膜型基质金属蛋白酶 )。例如, 通过抑制胶 原 1 的表达, 来对抗富含半胱氨酸 61(CYR61/CCN1) ; 以及通过加快胶原和弹性蛋白的分解, 使基质金属蛋白酶抑制, 它们都可用于反义技术。
在交替的实施例中, 多聚核苷酸构造可以编码一种生长因子, 以提高美容的外观。 例如, 多聚核苷酸构造可以编码角质细胞生长因子 (KGF)。在其他实施例中, 多聚核苷酸 构造可能编码胰岛素样生长因子 1(IGF-I), 血小板衍生生长因子 (PDGF), 肝细胞生长因子 (HGF), 和 / 或转化生长因子 β(TGF-β)。本发明的方法和组合物, 可能会产生无需侵入式 外科手术就可达到的 “基因脸和 / 或纤体效果” , 这种基因修饰可能会恢复或增强有关于改 善美观的生理和 / 或生化过程 ( 如促进胶原, 弹性蛋白或超氧化物岐化酶的产生 ), 或减少 皮肤细胞的进程, 产生负的美观效果 ( 如通过增加抑制剂的表达, 从而增加对胶原酶的抑 制 )。
其他的实施例, 以及任何和本发明相关的进一步的细节将在如下的叙述和申明中 提出。需要说明的是, 本发明不仅仅是运用于如下所述的细节中, 更可以在其他的实施例 中, 通过各种各样的方式被实施和贯彻。
附图简述
图 1A-1C 描述如下 : 原胶原 DNA 序列 (COL1A1)( 序列 ID 号 : 1)( 图 1A 和 1B) ; 蛋 白质 ( 序列 ID 号 : 2)( 图 .1C) ; 以及将原胶原 cDNA 亚克隆入 Pcdna3.1 zeo 载体的引物 ( 图 .1C) ; 亚克隆引物的 5′端 ( 序列 ID 号 : 3) 包含一个 Nhe Ⅰ限制性内切酶位点 ( 下划 线 ) 和一个 Kozak 序列 ( 下划线粗体 ), 亚克隆引物的 3′端 ( 序列 ID 号 : 4) 包含一个 Hind Ⅲ限制性内切酶位点 ( 下划线 ) 和一个开放的阅读框 (ORF) 停止序列 ( 下划线粗体 ), 这与 本发明的实施例相一致 ; cds 即编码序列。
图 2A-2B 描述如下 : 弹性蛋白 DNA 序列 ( 序列 ID 号 : 5)( 图 2A) ; 蛋白质 ( 序列 ID 号: 6)( 图 .2B) ; 以及将弹性蛋白 cDNA 亚克隆入 Pcdna3.1 zeo 载体的引物 ( 图 .2B) ; 亚 克隆引物的 5′端 ( 序列 ID 号 : 7) 包含一个 Nhe Ⅰ限制性内切酶位点 ( 下划线 ) 和一个 Kozak 序列 ( 粗体 ), 亚克隆引物的 3′端 ( 序列 ID 号 : 8) 包含一个 Bgl Ⅱ限制性内切酶 位点 ( 下划线 ) 和一个开放的阅读框 (ORF) 停止序列 ( 下划线粗体 ), 这与本发明的实施例 相一致。
图 3A-3B 描述如下 : 超氧化物歧化酶 3(SOD3)DNA 序列 ( 序列 ID 号 : 9)( 图 3A) ; 蛋白质 ( 序列 ID 号 : 10)( 图 .3B) ; 以及将 SOD3 cDNA 亚克隆入 Pcdna3.1 zeo 载体的引物 ( 图 .3B) ; 亚克隆引物的 5′端 ( 序列 ID 号 : 11) 包含一个 Nhe Ⅰ限制性内切酶位点 ( 下划线 ) 和一个 Kozak 序列 ( 下划线粗体 ), 亚克隆引物的 3′端 ( 序列 ID 号 : 12) 包含一个 Hind Ⅲ限制性内切酶位点 ( 下划线 ) 和一个开放的阅读框 (ORF) 停止序列 ( 下划线粗体 ), 这与本发明的实施例相一致。
图 4 描述如下 : TIMP-1DNA 序列 ( 序列 ID 号 : 13) ; 蛋白质 ( 序列 ID 号 : 14) : 以及 将 TIMP-1cDNA 亚克隆入 Pcdna3.1 zeo 载体的引物 ; 亚克隆引物的 5′端 ( 序列 ID 号 : 15) 包含一个 Nhe Ⅰ限制性内切酶位点 ( 下划线 ) 和一个 Kozak 序列 ( 下划线粗体 ), 亚克隆 引物的 3′端 ( 序列 ID 号 : 16) 包含一个 Hind Ⅲ限制性内切酶位点 ( 下划线 ) 和一个开 放的阅读框 (ORF) 停止序列 ( 下划线粗体 ), 这与本发明的实施例相一致。
图 5A-5C 描述如下 : COL1A2 DNA 序列 ( 序列 ID 号 : 17)( 图 .A 和 B) ; 蛋白质 ( 序 列 ID 号 : 18)( 图 .B) ; 以及将 COL1A2 cDNA 亚克隆入 Pcdna3.1 zeo 载体的引物 ( 图 .C) ; 亚克隆引物的 5′端 ( 序列 ID 号 : 19) 包含一个 Nhe Ⅰ限制性内切酶位点 ( 下划线 ) 和一 个 Kozak 序列 ( 下划线粗体 ), 亚克隆引物的 3′端 ( 序列 ID 号 : 20) 包含一个 Hind Ⅲ限 制性内切酶位点 ( 下划线 ) 和一个开放的阅读框 (ORF) 停止序列 ( 下划线粗体 ), 这与本发 明的实施例相一致 ;
图 6 描述了一个例子, 即按照本发明的实施例, 处理具有美容功效细胞的方法。 图 7 描述了按照本发明的实施例, 重组 DNA 分子的例子。
图 8 描述了按照本发明交替的实施例, 如何运用 CMV 启动子驱动的真核载体 pcDNA3.1+zeo : intA, 使人体蛋白 COLAlA, COL1A2, 弹性蛋白, 和 TIMP-I 在哺乳动物细胞中 表达的克隆策略。
图 9 描述了按照本发明交替的实施例, 使用 PCR 对来自于正常人体组织 COLAlA, COL1A2, TIMP-I, 以及弹性蛋白的 cDNAs 进行扩增。
图 10 描述了按照本发明的实施例, 对 HEK-293T/17 细胞内的人体 COL1A2 进行瞬 时表达分析。分子量 138.9KDa 的 COL1A2 蛋白如箭头所示。
图 11 描述了按照本发明的实施例, 对 HEK-293T/17 细胞内的人体 TIMP-I 进行瞬 时表达分析。分子量 23.2KDa 的 TIMP-I 蛋白如箭头所示。
图 12 描述了按照本发明的实施例, 对 HEK-293T/17 细胞内的人体弹性蛋白进行瞬 时表达分析。分子量 66.1KDa 的弹性蛋白如箭头所示。
图 13 描述了按照本发明交替的实施例, 如何运用 CMV 启动子驱动的真核载体 pcDNA3.1+zeo : intA, 使人体蛋白 KGF-I 在哺乳动物细胞中表达的克隆策略。
图 14 描述了按照本发明交替的实施例, 使用 PCR 对来自于正常人体肺组织的 KGF-I 的 cDNAs 进行扩增。感兴趣的扩增基因序列如箭头所示, 并指出了相应的大小。KBL, 碱基梯 ; kbp, 碱基对。
图 15A-15B 描述了按照本发明的实施例, 在中期的 PCR-TOPO 载体中克隆人体 KGF-I 的 cDNA(0.58kb 嵌入 )( 图 .15A) 以及随后在哺乳动物细胞中表达 pcDNA3.1+zeo : intA( 图 .15B) 载体的克隆。KGF-I 基因是由 Nhel 和 Hind Ⅲ从 pCR-TOPO 中切割而来, 在 具有相同限制性内切酶的 pcDNA3.1+zeo : intA 中被定向克隆, 感兴趣的扩增基因序列如箭 头所示, 并指出了相应的大小。如图 .15B 所示是 5 个独立的亚克隆 (1-5), 其中泳道 1 和 2 是未切割的, 以及 Nhel 和 HincKR 为克隆会消化小量的 DNAs, 他们是克隆 1( 分别是泳道 1 和 2), 克隆 2( 泳道 3 和 4), 克隆 3( 泳道 5 和 6), 克隆 4( 泳道 7 和 8), 克隆 5( 泳道 9 和
10), 分子大小标记的碱基梯 ( 泳道 11) 以及一个 100 碱基对的碱基梯 ( 泳道 12) ; kbp, 碱 基对。
图 16A-16B 描述了按照本发明的实施例, KGF-I 的氨基酸序列 ( 图 16.A) 和核苷 酸序列 ( 又名 FGF-7 或 KGF-l/FGF-7)( 图 16.B)。
图 .17 描述了对人体细胞提取物中的 KGF-I(a), COLAlA(b) 和 COL1A2(c) 蛋白, 以及运用 pcDNA3.1+ : intA/KGF-I 转染 HEK-293T/17 细胞的上清液, 单独载体 (pcDNA3.1+ : intA), 或非 DNA 调控进行瞬时表达的分析。KGF-I 蛋白如黑箭头所示, M 是标准分子量参照 物, KDa 即道尔顿。
发明详述
定义
尽管本发明中, 数值和参数设定的广泛范围都是近似值, 但是在具体的实施例中 所列的数值是尽可能准确的。 然而, 在本质上包含任何错误的数值, 必然在各自的测试测量 中导致标准偏差。此外, 此处披露的所有范围, 应理解为包括该量程中任何的及所有的子 域。例如, 一个 “1 至 10” 的规定范围, 应视为包括任何以及所有最小值是 1, 最大值是 10 的 子域。即所有以最小值 1 开头的子域, 如 1 至 6.1, 以及以最大值 10 结尾的子域, 如 5.5 至 10。此外, 任何被称为 “纳入本发明” 的参考, 都将被认为是纳入其整体之中。 此处进一步指出, 在本发明中, 单数形式的 “a” “an” 和 “the” 除非是明确和毫不 含糊的指出包含复数参照物, 否则都只限定是单数。术语 “或” “和 / 或” 可以交替使用, 除 非文意明确指出另有其他。
此外, 此处使用的主体是哺乳动物需要的, 用以维持或改善任何具有美容功效细 胞状态的治疗。这些主体可以是动物 ( 如有某种皮肤状况的动物 ), 也可以是人。主体可 能是人, 如绝经的妇女, 或是一个非人的哺乳动物, 如需要治疗皮肤, 指甲, 头发或皮毛的宠 物。
此处使用的具有美容功效的细胞包括 : 皮肤, 脂肪, 肌肉, 结缔组织, 以及在表皮, 真皮和皮下组织层的神经细胞 ; 还包括指甲根部的甲床, 指甲基质和指甲板细胞 ; 头皮, 头 发毛囊和头发细胞 ; 以及皮下脂肪层和舌头下的肌肉细胞 ; 牙齿和牙龈细胞 ; 骨骼细胞, 包 括面部骨骼 ; 眼睛中的细胞 ( 包括虹膜和覆盖虹膜的基质 )。
本发明中所使用的 “表皮组织” 包括外胚层的衍生组织。外胚层是后生动物胚胎 的最外层, 而后发展成表皮和神经组织。这其中表皮组织包括皮肤, 指甲和头发。
本发明中所使用的 “皮肤” 是指表皮和真皮。皮肤的最外层表皮是由具有底层基 底膜的复层鳞状上皮组成。皮肤表层不含任何的血管, 通过真皮扩散获取养分。组成表皮 的主要细胞形式是角质细胞。另外也有黑色素细胞和朗氏细胞。另外, 表皮可以进一步从 外到内细分为几个层 : 角质层, 透明层, 颗粒层, 棘层和基底。 真皮位于表皮下部, 包括血管, 神经, 毛囊, 平滑肌, 腺体和淋巴组织。此外, 成纤维细胞通常也存在于真皮层, 分泌到细胞 外基质, 富含胶原, 弹性蛋白, 透明质酸等大分子物质。 下皮层存在于真皮层的下部, 包含充 满脂肪的脂肪细胞以及较大的血管和神经细胞。肌肉位于皮下脂肪下面。皮肤结构是通过 肌肉的结缔组织附着在一起的。 结缔组织像锚一样, 使皮肤, 脂肪和肌肉与骨组织很好的连 接在一起。而在下皮层的附属区, 过多的脂肪会造成 “橘皮” 状的纹状外观。
本发明中使用的, “基本上完整的细胞” 包括没有因外伤造成的撕裂, 切割和刺破
的细胞。然而, 这些细胞可能已接受过激光治疗, 化学去皮, 祛疤或其他增加美观的治疗。
除非另有界定, 否则此处使用的所有技术和科学术语都具有相同的含义, 即该技 术领域中公知的一种普通技能。 参与者应该详细的根据分子生物学当前的协定来确定技术 的定义和术语。氨基酸残基的缩写, 是标准的 3 个字母或 1 个字母的代码, 用来在技术中指 代 20 种 L- 氨基酸之一。
有关于多聚核苷酸 “重组” 这一术语, 来源于多聚核苷酸的半合成, 合成或是由 cDNA, 基因组 DNA(“gDNA” ) 编码得来, 他们与这些在自然中与自身完全或部分关联的多聚 核苷酸不完全相关联。
此处所使用的″多肽″这一术语, 指的是一种氨基酸的聚合物, 并不是指产品的 特定长度。因此, 多肽的定义中可以包含多肽、 低聚肽、 蛋白质并且最短可至两个氨基酸。 这个术语也指修饰后表达的多肽, 例如, 糖基化、 乙酰化、 磷酸化或类似反应。 例如定义范围 内的多肽包含一个或多个类似氨基酸 ( 例如非天然氨基酸 ), 有替代关联的多肽, 以及在技 术领域中已被公知的发生自然或非自然修饰的多肽。正如在该技术领域中公知的, “蛋白 质” “肽类” “多肽” 和 “寡肽” 是氨基酸链碳 ( 通常为 L- 氨基酸 ), 他们的 α 炭通过缩合反 应形成肽键, 使彼此的氨基酸相连接。通常情况下, 组成蛋白质的氨基酸的编号顺序, 起始 于氨基末端, 向着羧基末端的方向延长。 ″核酸″是指多聚核苷酸, 如脱氧核糖核酸 (DNA) 或核糖核酸 (RNA) 等。这一术 语通常包括单链核酸, 双链核酸, 以及 RNA, DNA 的核苷酸或核苷类似物。此处使用的术语″ 多聚核苷酸″是指一个 DNA 分子、 RNA 分子或其互补链。一个多聚核苷酸分子可以单个或 双链的。
DNA 分子可由其核酸序列鉴别, 通常是由 5′到 3′方向。 其中 5′和 3′是指上一 个核苷酸的 5′端的磷酸基团和下一个核苷酸的 3′端羟基之间的连接。一段 5′到 3′方 向的序列, 他的互补链的序列是按照沃森 - 克里克碱基配对原则形成的。因此互补链的序 列由母链序列决定, 如胸腺嘧啶对腺嘌呤, 鸟嘌呤对胞嘧啶。
此处使用的, 一个小的抑制 RNA 是 20-30 个核苷酸组成的双链 RNA, 与蛋白结合后 形成一个 RNA 干扰诱导的沉默复合体 (RISC), 可以直导 siRNA 到目标 RNA 序列。随后, 双链 siRNA 松开, 通过内切酶和核酸外切酶的作用, 离开反义链, 使 mRNA 序列的信号减弱。为了 获得持久的治疗效果, RNAi 需要长时间表达, 最好是有构建的启动子。为了获得一个载体 的双链 RNA, 它需要被表达成一个短发夹状 RNA(shRNA), 其中有一个正义链, 发夹环区域和 反义链 (Miyagishi 等, J 基因医学 6 : 715-723, 2004)。
此处所指的术语 “上游” , 当是蛋白质分子时, 是靠近第二个残基的 N 端残基 ; 当是 核苷酸分子时, 是靠近第二个残基的 5′端。而术语 “下游” 是指, 当是蛋白质分子时, 指靠 近第二个残基的 C 端残基 ; 当是核苷酸分子时, 指靠近第二个残基的 3′端。此外, “部分” 和 “片段” 交替使用, 指一种多肽, 核酸, 或其他分子构造的部分。
“载体” 一词是指一个核酸分子可以转运另一个核酸分子进出细胞。在某些例子 中, 载体可以允许 DNA 序列复制进自身。同时载体需要包含一个启动子, 这样至少在部分宿 主细胞内, 可以加强或维持核苷酸的表达。 载体可以自主复制, 或被整合到宿主细胞的染色 体上。 有例子表明, 载体中包含一种表达载体, 它可以按照核苷酸的部分序列复制出蛋白质 或核苷酸, 再将其嵌入载体中。
在该技术领域中周知的是, 核酸序列相互杂交的条件, 是严密性从低到高的进化。 通常说来, 高度严密的杂交, 是用高温, 低盐缓冲溶液洗涤。杂交也可以利用科学的杂交方 案标准过滤掉限制性的 DNA, 如 0.5M NaHPO4 和 7%十二烷基硫酸钠 (SDS), 在 65℃, 以及用 0.1 x SSC/0.1% SDS 洗涤后再用 0.25M NaHPO4, 3.5% SDS 洗涤, 温度范围可以从室温到 68℃, 这由探针的长度决定。( 见例如 Ausubel, F.M. 等, Short Protocols in Molecular Biology, 第 4 版, 第 2 章, John Wiley&Sons, N.Y)。例如, 一个高度严密性的洗涤包括 6x SSC/0.05%焦磷酸钠, 在 37℃下洗涤得到的 14 个碱基的寡核苷酸探针 ; 或是 48℃下得到的 17 个碱基的寡核苷酸探针 ; 或是 55℃下得到的 20 个碱基的寡核苷酸探针 ; 或是 6O℃下得 到的 25 个碱基的寡核苷酸探针 ; 或是 65℃下得到的一个约 250 个核苷酸长度的核酸探针。 核酸探针常由放射性核酸标记, 例如在尾部由 [γ-32P]ATP 标记, 或是和 [α-32P]dCTP 通过 随机的初级结合而标记。 此外, 探针通过和生物标记素或被荧光标记的核酸相结合, 而被标 记, 并使用链霉素亲和素或抗荧光抗体来检测探针。
术语 “相似性” 或 “相似百分比” 指的是两个氨基酸序列或核酸序列之间的同源性, 相似百分比用以校准两条核酸序列, 指的是在共同的位置比较相似残基 ( 氨基酸或核酸 ) 的数量。序列的校准和比较是按照目前科学的计算标准, 或是公开在 BLAST 和 FASTA 上的 计算版本来进行。此外, 由美国国立卫生院, Bethesda 医师提供的 ENTPvEZ, 可用于序列比 较。在实施例中, 两个序列的相似百分比可由重量差距为 1 的 GCG 来确定, 把每个氨基酸的 差距加权, 就好像是两个序列间不匹配的单个氨基酸一样。 例如, 某序列和指定的序列有至 少 90%相似, 是指范围从 90 到 99.99%, 并且包含之间所有的范围。即它和指定序列的相 似度可以是 91, 91.5, 92, 92.5, 93, 93.5.94, 94.5, 95, 95.5, 96, 96.5, 97, 97.5, 98, 98.5, 99, 99.5%。同理, 某序列和指定的序列有至少 70%相似, 是指范围从 70 到 99.99%, 并且包含 之间所有的范围。而具体的数值取决于所使用的计算方法。
在此, “同源性” 是指一个序列与另一个序列 ( 蛋白质或核酸序列 ) 的序列相似程 度。通常, 两个同源序列之间的相似程度至少在 50%。在备用实施例中, 同源序列的相似 性不低于 60%或者 75%或者 80%, 甚至有时高达 90%。在另一些实施例中, 两个序列之间 的相似性至少在 95%或 98%, 甚至 99%。与此类似, 此处所提到的 “同源物” 表示与野生 型氨基酸序列具有同源性的多肽。同源性比对可通过肉眼进行, 但更多情况下需要借助于 序列比对程序。这些商业化的程序能够计算出两个甚至更多序列间的同源性百分比 ( 例如 Wilbur, W. J. 和 Lipman, D.J., 1983, Proc.Natl.Acad Sci.USA, 80 : 726-730)。
任何有生物活性的多肽或有功能的衍生物 ( 和 / 或类似物 ) 包括对多肽的其中一 个或多个氨基酸进行修饰、 插入、 缺失或替换而又不显著影响多肽的性质。例如, 具有生物 活性的衍生物或类似物可以通过替换保守氨基酸而实现。当然, 生物活性衍生物也要包含 原始肽段的片段。最好衍生物或类似物与原始肽段相比具有更高的活性或稳定性。
突变蛋白质可以通过传统的技术来获得类似物和衍生物。在某个实例中, 衍生物 与原始多肽相比可能具有更高的活性。 例如, 在某些实例中, 衍生物或类似物的活性至少提 高了 2 倍, 有的至少提高 5-10 倍, 甚至提高 20 倍。
“突变蛋白” 是通过改变多肽一个或者更多氨基酸来得到预期的多肽, 例如用非二 硫键形式的氨基酸代替半胱氨酸残基。
突变蛋白、 类似物和衍生物还可以用另外一些传统技术来获得。例如, PCR 引入的突变可以被利用。 虽然以下讨论都是针对 DNA, 但该技术也可以应用到 RNA 上。 WO 92/22653 中描述了 PCR 技术的实例。获得类似物、 突变蛋白和衍生物的另一种方法是以 Wells 提出 的技术为基础的盒式突变形成 (Gene, (1985)34 : 315)。
目前, 发明中所涉及的术语 “类似物” 或 “衍生物” 是指基因的断裂、 变异、 等位基 因造成并由此产生的衍生物。这些术语只在具有 “成熟” 多肽或功能性多肽生物活性的情 况下适用。因此, 人或非人来源的成熟蛋白质或功能多肽具有至少 60%、 或者 70%、 80%甚 至高达 90%的序列同源性的多肽都涵盖在此定义中。 某种蛋白的类似物还包括与其具有一 处或多处肽段相似性 ( 类肽 ) 并具有蛋白生物活性的多肽。此定义还包括含有一个或多个 类似氨基酸 ( 如非自然界存在的氨基酸 ) 的多肽、 含有替代化学键的多肽以及其他自然存 在或非自然存在的修饰后多肽。多肽一词也不排除表达后进行过化学修饰 ( 诸如糖基化修 饰、 乙酰化修饰和磷酸化修饰之类 ) 的多肽。
因此, 通过调节细胞环境而实现美容功效的多肽类似物和 / 或衍生物可能含有氨 基酸替换、 缺失或插入。氨基酸替换应该是对保守氨基酸进行替换或者消除非必需氨基酸 残基的替换, 例如改变糖基化位点、 乙酰化位点, 或者通过替换或缺失一个或多个对蛋白功 能不必要的半胱氨酸残基来减少多肽的错误折叠。 此处使用的 “保守氨基酸” 一词是指拥有相同结构和 / 或功能的一类蛋白质群体 中完全相同的氨基酸。大多数保守的氨基酸残基对蛋白质的结构和功能是非常重要的。因 此, 鉴定出蛋白质三维结构中存在的连续保守氨基酸区域对该蛋白质的结构和功能非常重 要。 为了找到保守的氨基酸残基或三维结构中的保守区域, 要对不同物种、 或同一物种的不 同个体间相同或相似的蛋白质进行序列比对。对保守氨基酸的替换通常要能够维持多肽 整体的电荷量、 疏水性或亲水性或空间体积, 例如, 有如下氨基酸取代的即为保守氨基酸取 代: 甘氨酸 / 丙氨酸, 缬氨酸 / 异亮氨酸 / 亮氨酸, 天冬氨酸 / 谷氨酸, 赖氨酸 / 精氨酸, 天 冬酰胺 / 谷氨酰胺, 丝氨酸 / 半胱氨酸 / 苏氨酸和苯丙氨酸 / 色氨酸 / 酪氨酸。
“表达载体” 是一种多聚核苷酸, 可以在目的宿主细胞内起作用, 同时可以引起宿 主细胞生成有益的基因。
“调控序列” 指的是一段多聚核苷酸序列, 负责调控与它自身相连接的编码基因的 表达。这种调控序列的本质随宿主的不同而不同。通常包括启动子, 转录终止序列等。 “调 控序列” 还包括一些其他的有益存在, 例如, 分泌多肽的分泌前导序列。
“可行性连接” 指的是, 在允许组件按各自方式发挥功能的基础上, 给他们并置某 些有关联的组分。 在不影响编码序列表达的基础上, 编码序列和控制序列和谐的连接, 这就 是可行性连接。在这两个组分之外, 可行性连接可能会有自己额外的核苷酸 ( 或肽类的氨 基酸 )。
此处使用的 “终止子” 是一种控制序列, 如多聚腺苷酸和转录终止序列, 位于 3′端 或终止密码子编码序列的下游调控序列。
本文所用的 “重组宿主细胞” “宿主细胞” “细胞” “细胞培养” 和其他类似的术语, 表示微生物, 昆虫细胞和哺乳动物细胞, 可以或已被用来作为引进重组载体或以其他方式 转移 DNA 的接受者, 包括已转化细胞的后代。
本文使用的 “转化” 或 “转染” 是指进入宿主细胞的外源性核苷酸的转移, 可以使 用多种转移方法, 例如, 感染, 直接吸收, 传导, F- 交配, 注射, 显微注射或电击。外源性核苷
酸可以作为非集成载体被维持, 例如在某些情况下, 质粒可能会被整合到宿主基因组中。
“纯化的” 和 “分离的” 是指一种多肽或核苷酸序列, 表示该序列的分子在其它相同 品种或类型的生物大分子中实质性的缺乏。在其他的方案中, 术语 “精炼的” 是指重量至少 占相同类型生物大分子质量的 75%, 85%, 95%或 98%。
“药学可接受的载体” 是指任何可以服用进入人体, 而不会产生任何不良副作用的 载体。如抗体产生的发热症状等。
“处理” 或 “治疗” 是指改善或防止恶化状态 ( 如皮肤皱纹 ), 或改进主体的状况。 在某些实施例中, “治疗” 一词是指对美容外观状态的广泛的治疗, 包括减轻某种症状或是 这种状态引起的其他症状。
“有效量” 是指能够产生理想结局的有效量。这个数值会变化, 取决于接收治疗的 人不同的健康或生理状态, 个体对合成抗生素的免疫力, 需要保护的程度, 药物的制剂, 主 治医生对医疗状况的评估, 以及其他的相关因素。
本文使用的, “体内转染” 或 “体内合并” 是指, 有益的生物分子被引入活体细胞的 过程。这个术语包含了对单独多聚核苷酸的转染, 或者是包含一个额外基团或进入细胞的 载体的多聚核苷酸。体内转染的具体方法将在细节中介绍。 “体外转染” 或 “体外合并” 是指, 有益的生物分子被引入活体外细胞的过程。这个 术语包含了对单独多聚核苷酸的转染, 或者是包含一个额外基团或进入细胞的载体的多聚 核苷酸。体外转染的具体方法将在细节中介绍。
本文使用的, 维护具有美容功效细胞的多肽, 可以是如前所述的任何形式的多肽。 它们可以促进生成, 增强这类细胞健康和寿命的生物分子。 正如领域中众所周知的, 这种蛋 白的肽类和基因的序列已经可以从公共数据库中获得。
本文使用的, “血小板衍生生长因子” 或 “PDGF” 包括 PDGF A 链多肽, PDGF B 链多 肽, 以及 AA, BB, AB 型的二聚体, 生物活性片段, 类似物, 衍生物。这些都在如下文献中有 介绍 : 美国专利, 专利号 5,187,263, Waterfield 等 ., Nature 304 : 35-39(1983) ; Wang 等, J.Biol.Chem.259 : 10645-48(1984), Antoniades 等, Biochem.Pharm.33 : 2833-38(1984) ; 和 Westermark 等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83 : 7197-7200(1986) ; 美 国 专 利, 专利号 5,219,759。一种 “具有生物活性的 PDGF” 多肽是指, 一种具有相同或更好的, 能优先刺激 皮肤真皮层细胞生长或增殖能力的多肽。这种多肽可以是一个全长 PDGF, PDGF 片段, 或 是 PDGF 的类似物。他可以承担 PDGF 氨基酸的替换, 删除, 增加或衍生。这些在如下的文 献中有介绍 : 美国专利, 专利号 5,149,792, EP 458959B1 ; 以及美国专利 Nos.4,769,328 ; 4,801,542 ; 4,766,073 ; 4,849,407 ; 4,845,075 ; 4,889,919 ; 5,045,633 ; 和 5,128,321。
本文使用的, “角质细胞生长因子” 或 “KGF” 指的是一群结构不同的蛋白族中的一 种, 这个蛋白族称作 FGFs, 它们显示不同程度的序列同源性。这表明他们是由相同的基因 家族编码的。FGFs 在细胞表面具有相同的结合位点。例如, KGF 能够和 FGFR-3 结合。同时 “角质细胞生长因子” 或 “KGF” 指的是任何一个如前所述的成熟的多肽或生物活性片段, 类 似物或衍生物, 例如 WO 90/08771 和 WO 95/01434。
一种 “具有生物活性的 KGF” 多肽是指, 一种具有相同或更好的, 能优先刺激皮肤 表皮层细胞生长能力的多肽。这种多肽可以是一个全长 KGF, KGF 片段, 或是 KGF 的类似物。 他可以承担 KGF 氨基酸的替换, 删除, 增加或衍生。这些在 WO 90/08771 和 WO 95/01434 中
有介绍。 此处使用的术语 “胰岛素样生长因子” 是指, 在大幅纯化的, 天然的, 重组生产的 以及化学合成的各种形式中, 包含的 IGF-I 和 IGF-II。除此之外还包括生物活性片段, 类 似物, 突变蛋白, C 端缺失的突变蛋白以及衍生物。他们可以保持胰岛素样生长因子的活 性, 或连接胰岛素受体的能力。例如以下文献描述的 : EP 135 094, WO 85/00831, 美国专 利, 专利号 4,738,921, WO 92/04363, 美国专利, 专利号 5,158,875, EP 123 228 和 EP 128 733。同时相同的内容在如下文献中也有描述 : EP 135 094, WO 85/00831, 美国专利, 专利 号 4,738,921, WO 92/04363, 美国专利, 专利号 5,158,875, EP 123 228 和 EP 128 733。一 种 “具有生物活性的 IGF” 多肽是指, 一种具有相同或更好的胰岛素样作用的生长因子。例 如, 在与其连接的受体的胞质区, 对特定的酪氨酸残基进行磷酸化的刺激, 如 WO 93/98826 所述。或是在另一些例子中, 对某种细胞有丝分裂的影响, 如 EP 0128733 所述。这种多肽 可以是一个全长 IGF, IGF 片段, 或是 IGF 的类似物。他可以承担 IGF 氨基酸的替换, 删除, 增加或衍生。
本发明中所使用的 “胰岛素样生长因子结合蛋白 (IGFBP)” , 是指一个绑定了 IGF 结合蛋白的结合蛋白。在如下文献中被鉴别和描述 : Keifer et al, J.Biol.Chem.266 : 9043-9(1991), Camacho-Hubner 等, J.Biol.Chem.267 : 11949-56(1992), McCusker 和 Clemens, THE INSULIN LIKE GROWTH FACTORS : STRUCTURE AND BIOLOGICAL FUNCTIONS, Oxford Univ.Press, N.Y. pp.110-150(1992)。一种 “具有生物活性的 IGFBP” 多肽是指, 具
有相同或更好的胰岛素样生长因子绑定蛋白的活性的多肽, 通过向那些胰岛素样生长因子 可以发挥活性的组织和细胞内绑定及输送胰岛素样生长因子而发挥作用。 正如现在至少有 6 种已知的 IGFBP, 他们中有些与其他的 IGFBP 很不同。一个给定的 IGFBP 的生物活性相关 的特质不必包括整个胰岛素样生长因子整体。一个独立的 IGFBP 的生物活性或许和其他的 IGFBP 有相似之处, 但也有不同。
此处使用的 “全长 PDGF” 或 “成熟 PDGF” 和 “全长 KGF” 或 “成熟 KGF” 和 “全长 IGF” 或 “成熟 IGF” 和 “全长 IGFBP” 或 “成熟 IGFBP” 指的是在人或其他哺乳动物组织中发现的, 各自的母体多肽。
此处使用的 “胶原” 是指一个含有至少 28 个结构相关蛋白 ( 胶原 I-XXVIII) 的大 族群中的一员, 它们显示不同程度的序列同源性。 这表明他们是由相同的基因家族编码的。 胶原是组成细胞外间质的主要纤维多肽, 同时也是皮肤结构的支撑。它包括真皮, 表皮 - 真 皮交界以及其他身体组织。这类蛋白质组成了多种, 结构和功能重要的超分子组件 ( 例如 参见, Pihlajamaa T., New tools for the study of an old collagen characterization of the human COL9A1, COL9A2 and COL9A3 genes and production of human type IX collagen as a recombinant protein.Collagen Research Unit, Biocenter OuIu and Department of Medical Biochemistry, University of OuIu, FIN-90220OuIu, Finland, 2000, OuIu, Finland)。胶原的特点是由三重螺旋其中的三个相同或不同的多肽链组成的, 称为 α 链。而单个胶原则是以结构划分成两个主要群体为其特征, 如纤维状和非纤维状。 纤维状的群体和原纤维中, 胶原包括 I, II, III, V 和 XI 型。
I, II 和 III 型的胶原作为主要的纤维状胶原, 意味着含有大量的组织。大部分的 I 型胶原在结缔组织中表达, 同时也是最丰富的胶原, 是皮肤, 骨骼, 肌腱和韧带的主要结构成分。I 型胶原通常以异三聚体的形式存在, 包括两个 α1(I) 链和一个 α2(I) 链, 分别由 COL1A1 和 COL1A2 基因编码。II 型胶原则是软骨, 玻璃体和椎间盘的主要成分, 也是在其发 展过程中, 在内耳和许多其他组织中瞬时检测到的。它是一个由 COL2A1 基因编码的同三聚 体, 由三个 α1(II) 链组成。 III 型胶原也是同三聚体, 由 α1(III) 链组成。 它在大部分含有 I 型胶原的组织中表达, 除了骨骼和肌腱。在弹性蛋白组织中广泛存在, 包括皮肤, 血管, 内 脏和肺, 可与 I 型胶原组装成异型纤维。除了形成原纤维, 非纤维状胶原还可以提供许多其 他功能。 他们的三重螺旋特质会因为非胶原的干扰而分裂为若干片段。 而非纤维状的胶原, 根据他们的结构和功能不同分为六个亚群。重要的网状胶原包括 IV 型, VI 型和 VII 型。IV 型胶原网络存在于身体大部分位点的所有基底膜中。在大部分位点中, 这种支持和控制的 网络包括 α1(IV) 和 α2(IV) 链, 但是某些基底膜, 如肾小球膜, 也包括 α3(IV), α4(IV), α5(IV) 和 α6(IV) 链。这些 α 链的胶原区, 长度大约是 1400 个氨基酸, 并含有许多短暂 的中断。编码这些多肽的基因, 在一般随机定位的胶原基因之间, 形成了一个有趣的例外, 那就是在三种染色体头对头连接的趋势中, 它们被成对的定位。VI 型胶原是由 α1(VI), α2(VI) 和 α3(VI) 链组成的异三聚体, 它由一个侧面具有大型球状 N 和 C 端的简短三重 螺旋组成。 它是唯一聚合成串珠状微丝的胶原, 存在于细胞表面, 众多结缔组织周围的胶原 纤维中, 并可能作为细胞外基质中的大分子框架与细胞相连的锚定位点。VII 型胶原通过 二聚以及和同三聚体 α1(VII) 三个分子侧面的结合而形成锚固纤维。这些纤维连接上皮 基底膜到皮肤的细胞外基质底部, 角膜以及一些其他的上皮组织。高度中断的 VII 型三重 螺旋, 在所有胶原中是最长的, 并且编码它的 COL7A1 基因具有已知基因中最多数量的外显 子, 如 108 个。因此在替代方案中, 运用在本发明方法和组合物中的胶原肽, 以及表达会使 这些使用增加的胶原肽可以是完整长度的胶原, 胶原片段或其功能类似物。这种胶原可能 包括Ⅰ型 (COL1A1 和 COL1A2 基因, 体内最丰富的胶原 ), Ⅱ型 (COL2A1 基因, 透明软骨 ), Ⅲ 型 (COL3A1 基因, 肉芽组织中发现 ), IV 型 (COL4A1, COL4A2, COL4A3, COL4A4, COL4A5, COL4A6 基因, 基膜和眼球晶状体中发现 ), V 型 (COL5A1, COL5A2, COL5A3 基因, 间质组织中发现 ), VI 型 (COL6A1, COL6A2, COL6A3 基因, 间质组织中发现 ), VII 型 (COL7A1 基因, 真皮与表皮的 交界处发现 ), VIII(COL8A1 和 COL8A2 基因, 内皮细胞中发现 ), EK(COL9A1, COL9A2, COL9A3 基因, 与 II 型和 XI 原纤维结合的 FACIT 胶原 ), X(COL1OA1 基因, 矿化的软骨 ), XI(COL11A1 和 COL11A2 基因, 软骨中发现 ), XII(COL12A1 基因, 与 I 型原纤维结合的 FACIT 胶原 ), XIII(COL13A1 基因, 一种与某种整合蛋白和纤连蛋白相作用的跨膜蛋白 ), XIV(COL14A1 基 因, 一种 FACIT 胶原 ), XV(COL15A1 基因 ), XVI(COL16A1 基因 ), XVII(COL17A1 基因, 一种 跨膜胶原 ), XVIII(COL18A1 基因 ), XIV(COL19A1 基因, 一种 FACIT 胶原 ), XX(COL20A1 基 因 ), XXI(COL21A1 基因, 一种 FACIT 胶原 ), XXII(COL22A1 基因 ), XXIII(COL23A1 基因 ), XX IV(COL24A1 基因 ), XXV(COL25A1 基因 ), XXVI(COL26A1 基因 ), XXVII(COL27A1 基因 ), 以及 XVIII(COL28A1 基因 )。 在本发明的方法和组合物中, 许多类型的胶原对具有美容功效 的细胞的功能至关重要。
此处使用的 “弹力蛋白” 是指原弹性蛋白或成熟的弹性蛋白多肽。它是一种关键 的细胞外基质蛋白, 对脊椎动物组织的弹力和恢复力至关重要, 这些组织包括皮肤大动脉, 肺, 韧带, 肌腱, 皮肤以及弹性软骨 ( 见 Mithieux 和 Weiss, 2005, Elastin, Advances in Protein Chemistry, Vol70, p437)。人基因编码的原弹性蛋白是一种定位于 7q11.2 区域的单拷贝。初级转录大约是 40kb 的长度, 同时包括散落在大量内显子周围的少量外显子, 这 就导致了外显子 / 内显子比率异常偏低。这段约 3.5kb 的 mRNA 序列码, 包含一个约 2.2kb 的编码区以及一个相对大的, 1.3kb 30 的非转译区。人原弹性蛋白包含 34 个外显子。原 弹性蛋白以外显子周期为特征, 具有独特功能的疏水性和交联域在独立的外显子替换中被 编码。所有以三核酸倍数存在的外显子以及内显子 - 外显子的交界都是以相同的方式分裂 的。在 30 交叉点发现密码子的第一个核苷酸, 而第二个和第三个核苷酸存在于 50 外显子 的边界。原弹性蛋白的主要转化产物需要经历广泛的选择性剪切, 因为位于外显子 - 内显 子边界的密码子剪切始终贯彻在整个分子中, 有选择性的剪切与编码序列的维护一起, 常 以卡带式发生。这就在转录中产生了大量不规则的原弹性蛋白的亚型。至少已知的 7 种人 外显子被选择性切割, 它们分别是 22, 23, 24, 26A, 30, 32, 和 33。
可以使用个体外显子的选择性剪切, 来修饰不同组织中的结构性功能蛋白。从 所有被调查的物种中观察到, 它显现发育调控和组织特异性, 同时随着年龄以相同比率变 化。人最常见的同型原弹性蛋白缺乏外显子 26A, 据报道仅在某些疾病蛋白中表达。有三 种人疾病与原弹性蛋白基因的突变或缺失有关, 它们是 : 皮肤松弛症, 上主动脉瓣狭窄以及 Williams-Beuren 综合征。
“TIMP” 指的是一群至少有 4 种结构相关蛋白族 ( 基质金属蛋白酶组织抑制因 子 -1, 2, 3, 4( 即 TIMP-I, TIMP-2, TIMP-3 和 TIMP-4)) 中的一种, 它们显示不同程度的序列 同源性。 这表明他们是由相同的基因家族编码的。 通过抑制胶原酶, 明胶酶或其类似物 ( 基 质金属蛋白酶类 (MMPs)), TIMPs 对限制细胞外基质分解起至关重要的作用。所有的 TIMPs 具有一个主要的特征, 即他们有 12 个保守半胱氨酸残基以及保守的相互间距, 和一个 23 到 29 的氨基酸前导序列, 和生产成熟蛋白有关。TIMPs 和 MMP-TIMP 的复合物晶体结构已被报 道, 如 TIMP-I 和 MMP-3, TIMP-2, MT1-MMP 的复合物。TIMPs 的形状是一个细长连续的楔形, 包括二分之一 N 端和 C 端与彼此相反的多肽链的 (Gomis-Ruth 等 1997)。在 MMPs 复合物 中, TIMPs 通过和它们裂隙边缘的活性位点结合而进入全线 MMPs。
TIMP-1 蛋白是一个分子量 28.5kDa 的 184 个氨基酸的糖蛋白。它包含了两种可 能的 N- 糖基化位点。TIMP-1 启动子除了一个先导结合蛋白 1(LBP1) 转录因子的假定结合 位点外, 还包括 10 个 SpI, 6 个 AP-I, 6 个 PEA3, 12 个 AP-2 位点以及 5 个 CCAAT 框。上游 TIMP-1 元素 -1(UTE-I) 对 TIMP-1 的转录也是必不可少的。启动子含有两种新型的抑制成 分, 和一个身份不明的 ETS 相关因子来抑制转录 (Dean 等 2000)。TIMP-1 蛋白已在人牙本 质和牙骨质中发现。此外, 人成骨细胞可以分泌 TIMP-1。
TIMP-2 蛋白是一个分子量 21 kDa 的 194 个氨基酸的非糖蛋白。它有一个带负电 荷的延伸的 C 端。TIMP-2 启动子由若干调控元件组成, 包括 5 个 SpI, 2 个 AP-2, 1 个 AP-I 以及 3 个 PEA-3 结合位点。TIMP-2 被转录成两种 mRNAs, 分子量分别是 1.2 和 3.8kb。并由 人成骨细胞和软骨细胞分泌。
TIMP-3 的多肽序列与 TIMP-1 和 TIMP-2 的序列分别有 37 %和 42 %的相似度。 TIMP-3 蛋白有 188 个氨基酸。在 C 端有一个保守的糖基化位点。重组人 TEVDP-3 的特征 表明, 它有一个 27kDa 的糖基化成分和一个 24kDa 的非糖基化成分。TIMP-3 可以以它的糖 基化和非糖基化形式定位于 ECM。TIMP-3 基因有 4 个 SpI 位点, 但是在它的启动子中没有 TATA 框。三种 TIMP-3 的 mRNA 组分, 分子量分别是 2.4, 2.8 和 5.5kb, 由该基因转录得来,并由人软骨细胞表达。
TIMP-4 蛋白的分子量是 22kDa, 是由 195 个氨基酸组成的多肽。TIMP-4 多肽与 TIMP-1 具有 37%的相似度, 与 TIMP-2 和 -3 具有 51%的相似度。在生理条件下 (pH 7.4), TIMP-4 是最中性的 TIMP 蛋白, 等电点为 7.34。相比之下, 人体 TEMP-1, TIMP-2 和 TEMP-3 蛋白的等电点分别为 8.00, 6.45 和 9.04。
TIMP-4 基因转录成分子量 1.4kb 的 mRNA。作为钙化组织, TIMP-4 在人软骨中被 检测到。
每个 TIMP 蛋白都与一个目标 MMP 蛋白以不同速率的相互作用和亲和力相结合, 通 常是按 1 ∶ 1 或 2 ∶ 2 的化学计量。 TIMP-1 对 MMP-1, MMP-3 和 MMP-9 的抑制比 TIMP-2 更有 效。TIMP-2 对 proMMP-2 的抑制比 TIMP-1 更有效, 是 10 倍甚至更多。但是 TIMP-2 对 MMP-2 有双向调节作用, 因为 MT-MMP 需要少量 TIMP-2 激活反应, 从而调解 proMMP-2 的活性。但 是大浓度的 TIMP-2 会抑制 MMP-2。TIMP-3 至少对 MMP-2 和 MMP-9 有抑制作用, 而 TIMP-4 是一个没有显着偏好的所有特定类型 MMPs 的良好抑制剂。TIMP-4 通过抑制 MT1-MMP 和抑 制 MMP-2 激活来调节 MMP-2 活性。
虽然 TIMPs 会抑制已激活的 MMP, 但与明胶结合的 MMPs 是一个例外, 因为 TIMP 能可逆的结合 MMP-2 和 MMP-9 的前体形式。随后, TIMP 从复合体中分离, 并允许继续激活 proMMP。例如, TEMP-1 与 proMMP-9 结合, 随后 proMMP-9 被 MMP-3 激活, 直到 TEMP-I 使复 合体失活而被阻止。例如中性粒细胞弹性蛋白酶, 不会破坏 proMMP-9。但是, TEMP-2 也可 能抑制 MMP-9 的活性形式。对于被所有 TIMPs( 除去 TIMP-1) 抑制的 MMP 和 MMP-19, 活性 MMP-13 是个例子。可溶性 MMP-16 的活性被 TIMP-2 和 TIMP-3 抑制, 但是不包括 TIMP-1。
此处使用的 “MMPs” 是指一个由至少 28 个分泌或跨膜酶组成的大家族, 它们都可 以加工或降解 ECM 蛋白。它们中, 至少有 22 种 MMPs 迄今为止被发现在人体组织中表达。 MMPs 具有高度的蛋白序列同源性, 并且已经定义了结构域。因此, 根据其结构特点, MMPs 既 可以按分泌 MMPs 归类, 又可以被分类为膜锚定 MMPs, 进一步可分为 8 个独立的亚群。分泌 MMPs 包括最小域 MMPs, 简单血液结合素域 MMPs, 明胶结合 MMPs, 弗林蛋白酶激活分泌 MMPs 和类体蛋白嵌入 MMPs。 而膜结合 MMPs 包括Ⅰ型跨膜 MMPs, 糖基磷脂酰肌醇 (GPI) 连接 MMPs 和Ⅱ型跨膜 MMPs。
MMPs 的晶体结构进一步揭示了准确的域组织, 多肽折叠以及主要的特异性决定因 素。迄今为止, 除了猪的全长 MMP-I 蛋白和人 proMMP-2 蛋白外, 人 MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MMP-11, MMP-12, MMP-13 和 MMP-14 蛋白刺激域的晶体结构已经解决。
第三个限制 MMPs 蛋白水解活性的层次, 包括内源性 MMPs 组织抑制剂 (TIMPs)。 TIMPs 特异性抑制 MMPs 的活性形式, 以及某些情况下潜在的 MMPs 形式, 同时打乱这种平衡, 导致组织发生病变。 活性 MMPs 可以被 α- 巨球蛋白, 尤其是 α2- 巨球蛋白灭活。 最近的研 究结果表明, 丝氨酸蛋白酶抑制剂和组织因子途径抑制剂 -2(TFPI-2) 抑制 MMP-I, MMP-2, MMP-9 和 MMP-13(Herman 等 2001)。钙结合蛋白多糖 (N-TES, 睾丸素 -1 或睾丸素 -3) 能够 抑制 MT1- 或 MT3-MMP 介导的 proMMP-2 的激活。 此外, 还有许多外源性抑制剂。 例如一些绿 茶中的黄酮醇 ( 如没食子儿茶素 -3- 没食子酸或儿茶素 ), 可以抑制 MMP-2, MMP-9, MMP-12 的活性以及 proMMP-2 的激活。有些合成抑制剂对 MMPs 活性也具有很好的抑制作用。一种 “具有生物活性的 TIMP” 多肽, 是指具有相同或更强的优先抑制 MMPs 能力的多肽。这种多肽可以是一个全长 TIMP, TIMP, 片段, 或是 TDVDP 的类似物。他可以承担 TIMP 氨基酸的替 换, 删除, 增加或衍生。
此处所述 “弹力素” 指一个成熟的弹力素多肽 ( 见如, Francart, 等, 1997, Solution Structure of R-elafin, a Specific Inhibitor of Elastase, J.Mol.Biol.(1997)268, 666-677)。一个 “具有弹力素生物学活性” 的多肽指有相同 / 更强的能倾向于抑制弹性蛋 白酶的物质。 此多肽可以是全长的弹力素, 一段弹力素片段, 具有氨基酸替代物的弹力素类 似物, 缺失, 或增加, 或弹力素衍生物如在美国专利 5734014 中所述。 弹力素通常也称为 “皮 肤衍生抗白细胞蛋白 ; 弹性蛋白酶抑制剂 ; 和 SKALP)。弹力素是一个具有 57 个氨基酸残基 的多肽 (6kDa), 其最初从银屑患者的鳞屑中分离。弹力素是人白细胞弹性蛋白酶 (HLE), 猪 胰弹性蛋白酶抑制剂, 蛋白酶 -3, 三种能切割重要结缔组织蛋白质弹性蛋白的酶的特定抑 制剂。它对其他丝氨酸蛋白酶没有抑制作用, 如纤维蛋白溶酶, 胰蛋白酶, 糜蛋白酶和组织 蛋白酶 G。弹力素与其目标以解离常数紧密结合。弹力素对于保护含有弹性蛋白的组织结 构的完整性, 免遭免遭弹性蛋白酶降解, 有重要作用, 因此是一个潜在的治疗价值的弹性蛋 白酶引起的疾病的化合物。 近日, 弹力素已经被证明, 其以物理方式结合与弹性蛋白纤维可 防止由紫外线引起的弹性蛋白的降解。弹力素基因序列已公开。 此处所述, “超氧化物歧化酶” 或 “SOD” 指至少三类结构相关的酶蛋白 (SOD1-3) 的 成员之一, SOD1-3 显示不同程度的序列同源性, 显示, 他们由相关的基因家族编码。SOD 歧 化催化超氧化物生成氧气和过氧化氢。 因此, 对于所有暴露在氧气的细胞中, 它具重要的抗 氧化防御作用。 在人中, 超氧化物歧化酶的三种形式存在。 SOD1 存在于细胞质中, SOD2 存在 于线粒体和 SOD3 在细胞外。SOD1 是一个二聚体 (2 个亚基 ), 而其他两个是四聚体 (4 个亚 基 )。SOD1 和 SOD3 含有铜和锌, SOD2 在其反应中心含锰。SOD1, 2 和 3 的基因分别 21, 6和 4 号染色体上 (21q22.1, 6q25.3 和 4p15.3-p15.1)。 SOD 已经证明能防止成纤维细胞端粒的 缩短, 转化肌成纤维细胞为成纤维细胞, 并减少皮肤辐射后的纤维化疤痕 (Serra, et.al., 2003.J Biol Chem.Feb 28 ; 278(9) : 6824-30 ; Vozenin-Brotons.et.al., 2001.Free Radic Biol Med.Jan 1 ; 30(1) : 30-42)。SOD1 和 SOD2 基因序列已公开。
此处所述, “热激蛋白”或 “HSPs”指一类结构相关蛋白的成员之一, 该组蛋白 具不同程度的序列同源性, 显示, 他们由相关的基因家族编码。热激蛋白 (HSPs) 是存在 于从细菌到人之间可组成或诱导表达的高度保守蛋白 (S.Lindquist, Ann.Rev.Biochem 55, 1151(1986)。 组 成 型 Hsp 对 许 多 不 同 的 细 胞 功 能 具 有 重 要 作 用。 据 分 子 量, 可将 Hsp 分 成 6 大 类 : (a)20-30kDa ; (b)40-50kDa ; (c)50-60kDa ; (d)70kDa ; (e)90kDa ; 和 (f)100-110kDa(Minowada G 等, J.Clin.Invest., 95, 3(1995) ; Morris SD, Clin.Exper. Dermatol., 27, 220(2001)) 可诱导型 Hsps 可由一系列胁迫诱导, 如升温 (M.Schlesinger 等, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982), 重金属 (M.Schlesinger 等, Alan R.Liss, Inc., 137(1989)), 氨基酸类似物 (P.Kelley 和 M.Schlesinger, Cell 15, 1277(1978) ; L. Hightower, J.Cell.Physiol.102, 407(1980)), 氧自由基 (M.Ashburner, Chromosoma 31, 356(1970) ; J.Compton 和 B.McCarthy, Cell 14, 191(1978)), 局部缺血或有缺氧导致的局 部缺血 (S.Guttman, Cell 22, 299(1980) ; M.Ashburner 和 J.Bonner, Cell 17, 241(1979)), 机械创伤 (L.Hightower 和 F.White, Cold Spring Harbor Laboratory, 369(1982) ; D.Gower 等, J.Cell Biol.103, 291(1986)), 和细胞内异常蛋白的出现 (J.Ananthan 等, Science
232, 522(1986))。热激蛋白的统一功能是在非理想环境中维持细胞正常功能。
Hsps 在正常或休眠的皮肤细胞中均可组成型表达, 对重要的生物过程起重要作 用, 例如分子伴侣作用 (Maytin EV, J.Invest.Dermatol., 104, 448(1995), 和 / 或当环境 胁迫下, 对胁迫蛋白的表达起迅速上调作用 (Welch WJ, Physiol.Rev., 72, 1063(1992)。 一些 Hsps 在皮肤细胞中表达。Hsp72 在角质细胞中组成型表达 ( 例如参见, Trautinger F 等, J.Invest.Dermatol., 101, 334(1993) ; Charveron M 等, Cell Biol.Toxicol., 11, 161(1995) ;和 Laplante A 等, J.Histochem.Cytochem., 46, 1291(1998))。 另 外 Hsps 27, 47, 60, 90, 和 110 可 能 存 在 于 正 常 的 表 皮 中 (Wilson N 等, J.Cutan.Pathol., 27, 176(2000))。任何这些 Hsps 似乎在正常组织中起特定作用。例如, Hsp 27 稳定肌动蛋 白, 而 Hsp 90 可作为分子伴侣, 和 / 或激活特定转录因子 (Charveron M 等, Cell Biol. Toxicol., 11, 161(1995)), 皮肤中 Hsp 27 可控制发育皮肤细胞的分化 (Jantschitsch C 等, Br.J.Dermatol., 139, 247(1998))。
有 证 据 表 明, Hsps 在 细 胞 之 间 能 互 换 (L.Hightower 和 P. Guidon, J.Cell. Physiol.138 , 257(1989) ; M.Tytell 等, Brain Res.363 , 161(1986) ; M.Tytell , Int. J.Hyperthermia, 21, 4450455(2005))。因此, Hsps 起作用的位点可能并不限于产生其的细 胞, 而扩散到相邻细胞。
对具有美容功能的细胞进行基因修饰
因此, 本发明涉及用于基因修饰具美容功能的细胞以提升外貌的组合物和方法。 本发明可以其他多种方法予以实施。
在一个实施例中, 本发明可能包括一种用于受体中具美容功能的基本完整细胞在 美容方面的基因修饰方法, 该方法包括 : 使用一种能编码至少一个用于维持特定细胞具美 容功能的核酸分子或多肽链的多聚核苷酸, 将其应用到至少一部分能发挥美容功效的细胞 中, 从而使上述核酸分子或多肽链在这些细胞中表达以提高或 / 和维持对外貌产生积极效 果的生物化学或 / 和生理过程。
在另一个实施例中, 本发明包括一个分离的多聚核苷酸分子, 其能编码至少一个 用于维持具美容功能的细胞的核酸分子或多肽链。在另一个实施例中, 该分离的多聚核苷 酸分子被应用于细胞, 使具美容功能的细胞能表达上述提及的核酸分子或多肽, 从而提高 或 / 和维持对外貌产生积极效果的生物化学或 / 和生理过程。
在另一个实施例中, 本发明包括一个分离的多肽或一个分离的多聚核苷酸, 其涉 及维持具有美容功能的细胞。 例如, 在具体实施例中, 本发明包括在此描述的一个分离的多 肽或一个分离的多聚核苷酸。 因此, 在关于本发明的方法和组合物的另一些实施例中, 分离 出的多聚核苷酸可能包括 SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 5, SEQ DD NO : 9, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 17, 或者是 SEQ ID NO : 24 中的核苷酸 446-1030, 或者是 SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 17 的互补序列, 或者是 SEQ ID NO : 24, 或者是 与 SEQ ID NO : 1, SEQ BD NO : 5, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 17 至少有 70%, 85%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 或 99%相似的序列, 或者是 SEQ ID NO : 24 中的核 苷酸 446-1030, 或者是与 SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 17 互补序列至少有 70%, 85%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%相似的 序列, 或者或者是 / 和 SEQ ID NO : 24 中的核苷酸 446-1030。在 另 一 个 实 施 例 中, 分 离 的 多 聚 核 苷 酸 可 能 包 括 SEQ ED NO : 2( 原 骨 胶 原 COL1A1), SEQ ID NO : 6( 弹性蛋白 ), SEQ BD NO : 10( 超氧化物歧化酶 3), SEQ ID NO : 14(TIMP-I)SEQ BD NO : 18(COL1A2), SEQ ID NO : 23(KGF-I) 或者至少与 SEQ BD NO : 2, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 18 有 70%, 85%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%相似的多肽, 或者 SEQ BD NO : 23。或者已被使用的含上述序列的 多肽。这些核苷酸和多肽序列见图 1-5 和 16.
在另一实施例中, 本发明可能包括一个组合物用以基因修饰受体中大体完整的具 美容功能的细胞。此组合物可能包括一个多聚核苷酸, 其能编码至少一个用于维持具美容 功能的细胞的核酸分子或多肽链 ; 还包括一个载体, 用于将该多聚核苷酸应用到至少一部 分能发挥美容功效的受体细胞中, 从而使核酸分子或多肽链在这些细胞中表达以提高或 / 和维持对外貌产生积极效果的生物化学或 / 和生理过程。或者, 该组合物可能包括一个多 肽用以维持具美容功能的细胞, 还包括一个载体, 用于将该多肽应用到至少一部分能发挥 美容功效的受体细胞中, 从而使核酸分子或多肽链在这些细胞中表达以提高或 / 和维持对 外貌产生积极效果的生物化学或 / 和生理过程。
多种多肽可能定向提高或 / 和维持对外貌产生积极效果的生物化学或 / 和生理过 程。例如, 在一些具体实施例中, 本发明的方法和组合物中所使用的多聚核苷酸编码了一 种角化细胞生长因子。在一个实施例中, 该多肽包括一种角化细胞生长因子或由它产生的 具生物学活性的衍生物。例如, 在一些具体实施例中, 该多聚核苷酸包括 SEQ ED NO : 24 的 446-1030 核苷酸, 或 SEQ ED NO : 24 的 446-1030 核苷酸互补序列, 或与 SEQ ED NO : 24 或其 互补序列的 446-1030 核苷酸至少 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%相似的序列, 或者一条能编码 SEQ ID NO : 23 蛋白序列或与 SEQ ED NO : 23 至少有 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%相似序列的多聚核苷酸。
在其他实施例中, 该多聚核苷酸编码一个胶原多肽或多肽 ( 如 COL1A1 和 COL1A2)。 或者, 该多聚核苷酸可能编码一个弹性蛋白。 在其他实施例中, 该多聚核苷酸可能编码一个 TIMP-I 多肽。或者, 该多聚核苷酸可能编码 SOD 多肽。在其他实施例中, 该多肽至少包含一 种转化生长因子, 一种血小板源性生长因子, 一种血管内皮生长因子, 一种胰岛素样生长因 子, 一种肝细胞生长因子, 一种血管内皮生长因子, 一种成纤维细胞生长因子, 一种表皮生 长因子, 血小板衍化内皮细胞生长因子, 一种结缔组织生长因子, 一种粒细胞 - 巨噬细胞集 落刺激因子, 一种巨噬细胞集落刺激因子, 一种生长激素, TSP-I, TSP-2, 一种胶原, TIMP-I, 一种超氧化物歧化酶, 一种弹性蛋白, 或一种缺氧诱导因子, 或由其衍生的具生物学活性物 质中的一种。
因此, 在本发明的方法和组合物的另一些实施例中, 多核苷酸可能包括 SEQ ED NO : 1, SEQ ED NO : 5, SEQ ED NO : 9, SEQ ID NO : 13, 或 SEQ ID NO : 17, 或 SEQ ED NO : 1, SEQ ED NO : 5, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 13, SEQ ED NO : 17 的互补序列, 和 / 或 SEQ ID NO : 24 的 446-1030 核苷酸序列, 或与 SEQ ED NO : 1, SEQ ED NO : 5, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 13 至少有 70%, 85%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%相似的序列, 或 SEQ ID NO : 17, 和 / 或 SEQ ID NO : 24 的 446-1030 核苷酸序列, 或 SEQ ED NO : 1, SEQ ID NO : 5, SEQ ED NO : 9, SEQ BD NO : 13, SEQ ID NO : 17 的互补序列和 / 或 SEQ ED NO : 24 的 446-1030 序列。
在其他实施例中, 在本发明的方法和组合物的多聚核苷酸可能编码多肽 SEQ IDNO : 2( 原骨胶原 COL1A1), SEQ ID NO : 6( 弹性蛋白 ), SEQ ID NO : 10( 超氧化物歧化酶 3), SEQ ID NO : 14(TIMP-1) 或 SEQ ID NO : 18(COL1A2), SEQ ID NO : 23(KGF-1) 或与 SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 18, or SEQ ID NO : 23 多肽序 列至少有 70%, 85%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%相似的序列。或者一个被 使用的包含这些序列的多肽。这些核苷酸和多肽的序列见图 1-5 和 16.
在本发明的方法和组合物的具体实施例中, 该多聚核苷酸包括, 或被插入一个质 粒或一个病毒载体。 例如, 在至少一部分转染细胞中, 该多聚核苷酸可稳定地以质粒形式存 在于染色体外。在具体实施例中, 购自于 Gelantis 的 gWIZTM 载体可被使用。或者购自于 InvitrogenpVAX-BEST 可被使用。
本发明的方法和组合物可能包括将单一或多种试剂导入细胞。在一个实施例中, 至少两种多肽或核酸分子被导入细胞。
在本发明的方法和组合物中的多聚核苷酸可能包括一个重组体的构建体, 用于在 具有美容功能的细胞中表达特定多肽。 因此, 在此更详细描述, 能编码一个核酸或多肽以维 持具美容功能的细胞的多聚核苷酸, 被可操作地连接到组成型启动子或可诱导启动子。在 另一个实施例中, 该启动子并不是在所有细胞中表达, 而仅在具美容功能的细胞中表达。 可 再选或单选, 能编码一个核酸或多肽以维持具美容功能的细胞的多聚核苷酸, 被可操作地 连接到一个增强子。另外, 在其他实施例中, 能编码一个核酸或多肽以维持具美容功能的 细胞的多聚核苷酸, 被可操作地连接到至少一段功能 polyA 序列, 一段内含子, 一段终止序 列, 或一个 cap 位点中的一种。
本发明中的方法和组合物被应用于多种具有美容功能的细胞。可选地, 被改造的 具美容功能的细胞至少包含角质细胞, 纤维母细胞, 脂肪细胞, 或肌原纤维中的一种。
本发明采用了多方法来操作所述的核酸 ( 多聚核苷酸 ) 构建体。 在一个实施例中, 所述多聚核苷酸是裸 DNA 引入具美容功能的细胞中。在具体实施例中, 载体包括至少包括 脂质体, 纳米粒子, 一种乳剂, 一种触变凝胶、 或一种感官凝胶中的一种。 因此, 可选地, 被引 入具美容功能细胞的多聚核苷酸其载体至少包括脂质体, 纳米粒子, 一种乳剂, 一种触变凝 胶, 或一种感官凝胶中的一种。 或者, 引入具美容功能细胞的多聚核苷酸其通过一种油包水 乳剂或水包油乳剂被导入。在另一实施例中, 被引入具美容功能细胞的多聚核苷酸是通过 至少颗粒介导转移 ( 如金颗粒、 微球 ), 电压驱动转移, 无线电频率灼烧介导转移, 超声波, 或微针中的一种被导入的。
图 6 显示了本发明示例方法 2 的一个实施例。如, 所述方法可能包括中受体对增 加或维持具有美容功能细胞的需求评估的步骤 4。该评估可能由一个皮肤科医生或另一医 疗保健专业人员执行。或者, 该评估可能被受者执行 ( 即自我评估 )。
接下来, 所述方法可能包括对所要求的疗法的性质做出决定的步骤 6。同样, 该 评估可能由一个皮肤科医生或另一医疗保健专业人员执行。或者, 该评估可能被受者执行 ( 即自我评估 )。
所述方法可进一步包括准备 ( 或选择 ) 一个组合物的步骤 8, 该组合物包括所要求 的用于治疗的基因或它的混合物。在一实施例中, 该步骤可能至少最初由一个皮肤科医生 或其他医疗保健专业人员执行。一旦选出合适的组合物, 受者 ( 即自我评估 ) 执行该评估。 例如, 受者可能要对购买何种可用的皮肤护理基因产品进行评估。所述方法可能额外包括对需治疗的细胞或组织应用所述组合物的步骤 10。 在一个 实施例中, 为增加和 / 或维持具美容功能的细胞, 该组合物需要按要求施用一段时间。在此 更详细地, 该组合物准确的剂量和治疗时间根据受者情况和应用的组合物的性质而变化。
所述方法也可能包括对受体再评估以确定受体具有美容功能的细胞是否得到改 善的步骤 12。如果确定具美容功能的细胞其有提升的外观表现 14-YES, 受者可以选择是否 使用组合物 16。然而, 如果确定具美容功能的细胞其并无提升的外观表现 14-NO, 受者可以 选择重复所述过程, 或许用一种不同的组合物。
因此, 本发明的实施例包括用于对具美容功能的细胞进行基因修饰的方法和组合 物。在具体实施例中, 本发明可能包括用于体内或体外转染重组核酸构建体进入具有美容 功能的细胞的方法和 / 或组合物。所述重组构建体可能以基因组外元件或以直接插入基因 组的形式并入具有美容功能的细胞
在其他实施例中, 所述方法和 / 或组合物可能直接提供多肽或其他生物分子 ( 即 不需通过基因表达 )。例如, 使用了能增加或维持具有美容功能的细胞的生长因子混合物。 例如, 在一个实施例中, 所述多肽可能包括角化细胞生长因子 (KGF), 胰岛素样生长因子 (IGF-I), 和 / 或转化生长因子 β(TGF-β), 和 / 或此处详述的多肽的混合物。或其他被使 用的多肽。
或者, 所述重组构建体可能编码调控多核苷酸, 如反义 RNA 或抑制 RNAs(RNAi) 以 增加或 / 和维持对外貌产生积极效果的生物化学或 / 和生理过程。
所述的本发明方法和 / 或组合物被用于增加和 / 或维持和 / 或改善受体和 / 或受 体组织和 / 或具有美容功能的细胞的外观。多种生物分子和 / 或生理过程可应用本发明所 述方法和组合物进行调整。在具体的实施例中, 本发明所述的方法和组合物可产生至少如 下美容效果中的一项 : 减少皮肤下垂, 减少皱纹长度, 减少皱纹深度 ; 增加皮肤紧致度, 坚 固度, 色调, 或弹性 ; 增加皮肤水合作用和保水能力, 水分流动 ( 即产生水通道蛋白 ) 和渗透 平衡。
调整至少一种在具有美容功能的细胞表达的多种生物分子其结果由本发明的组 合物和 / 或方法的处理决定。例如, 在一些具体实施例中, 用本发明的方法和组合物也可 以增加皮肤蛋白质。或者用本发明的方法和组合物也可以增加皮肤脂类水平, 如膜脂, 板 层体脂, 分泌的细胞间脂。因此, 在具体实施例中, 用本发明的方法和 / 或组合物可能增加 细胞间基质, 和 / 或黏性和通讯多肽, 包括但不限于胶原, 弹性蛋白, 角蛋白 ( 包含角蛋白 中间丝 ), 纤连蛋白, 蛋白聚糖, 层粘连蛋白, 整合蛋白, 核心蛋白聚糖, 基膜聚醣, 纤调蛋白 ( 和其他小分子富亮氨酸蛋白聚糖 (SLRP’ s)), 肌腱蛋白 E, 神经纤维细丝, 巢蛋白, 肌间线 蛋白, 波形蛋白, 外周蛋白, 神经酰胺, 胆固醇, 磷脂, 鞘脂, “天然保湿因子” (NMF), 和粘多糖 (GAGs) 如透明质酸和硫酸皮肤素。
在另一些实施例中, 用本发明的方法和组合物可能会增加皮肤细胞能量的产生, 利用和保存 ; 增加氧气利用, 增加皮肤细胞生命 ( 例如延长成纤维细胞寿命 ) 和 / 或生命周 期 ( 如减少衰老 )。利用本发明的方法和组合物的实施例可额外地或可选地使以下至少一 项水平提高 : 皮肤细胞的免疫防御, 热休克 / 应激反应, 消除自由基的抗氧化防御能力 ( 如 活性氧或羰基化合物 ), 和 / 或有毒防御 ( 如环境污染物 ) ; 能提高对紫外线的保护和恢复 能力。在其他实施例中, 用本发明的方法和 / 或组合物可能会增加皮肤细胞通讯 ( 如神经肽介导的沟通 ) 和皮肤细胞神经支配 ; 改善皮肤细胞的粘附性 / 粘结性 ( 如桥粒完整性 ) ; 改善矿物质钙和其他矿物质代谢, 促进皮肤细胞更替 ( 例如脱皮 ) ; 和 / 或改善皮肤细胞的 生物钟节奏。
在具体实施例中, 利用本发明的方法和组合物的至少可实现以下之一 : 皮肤纹理 改善, 平滑, 容光焕发, 神采奕奕。例如, 在具体实施例中, 利用本发明的方法和 / 或组合物 的至少可实现以下之一 : 减少色斑和肤色不均 ( 包括红斑, 色素沉着 ( 如黄褐斑 ) 和色素不 足。
另一些利用本发明的方法和组合物的实施例可使一下至少一项实现 : 改善血管 健康, 包括改善血管的完整性 ( 即减少变色的血液制品渗漏到皮肤 ), 改善血管张力, 改善 变色的血液副产品分解 ( 如改善血铁黄素分解, 胆红素加工和改善 UGT1a 酶的功能 ) 和减 少 “蜘蛛脉” 和 “静脉曲张” 。在其他实施例中, 本发明的方法和组合物的实施可改善 DNA, RNA, 线粒体, 膜和其他皮肤细胞器健康 ; 改善脂肪生成以增加脂肪总量用以保持皮肤丰满 及脸或其他身体其他部位看上去饱满、 轮廓分明或圆润 ; 改善真皮表皮交界处 (“DEJ)。例 如, 最明显的和可重复的皮肤老化生物学特性之一是真皮表皮交界处的扁平化。这个过程 可能由于真皮乳头状突起减少和 rarification 所致。例如, 30 到 90 岁之间, 这些皮肤层 之间的交错结合可能会减少 50%以上 ( 见, 例如, Kirstin et al, Phytochemistry and Photobiology, 2005, 81 : 581-587)。
在具有美容功能的细胞中, 有些特定的生物大分子能过量表达。 因此, 在其他实施 例中, 利用本发明的方法和 / 或组合物可用来减少这样的有害生物大分子。例如, 本发明的 方法和 / 或组合物的具体实施例可增加脂肪分解, 以减少 “橘皮组织” , “凹陷” 的皮肤 ; 以及 减少腹部和 / 或全身脂肪。或者, 本发明的方法和 / 或组合物的具体实施例可使孔径降低 ; 减少干燥和 / 或剥落 ; 减少油性和粉刺。本发明的方法和 / 或组合物的具体实施例也可能 被用于减少肌肉收缩, 平滑肌细胞和肌原纤维 ( 例如, 以减少表情皱纹 ), 或增加肌肉收缩, 平滑肌细胞和肌原纤维 ( 如减少下垂 ) ; 和增加皮肤细胞的大小 ( 如增大脸部肌肉, 以防止 脸庞 “凹陷” )。此外, 改造维持具有美容功能的细胞 ( 例如皮肤细胞 ) 是以维持其美观为 目的, 不论紫外线光损伤 ( 如增强核酸内切酶, 光解酶, 热休克蛋白, 金属硫蛋白和超氧化 物歧化酶的表达水平, 增加内源性 “遮光剂” 以保护美观 ) 和其他的环境侵害 ( 如污染物和 刺激物 )。
本发明的方法和 / 或组合物的具体实施例也可能被用于增加色素沉着 ( 例如古铜 色肌肤的获得, 其不需通过紫外线照射而获得免晒古铜色 ) 或可选地, 减少色素沉着 ( 如 “美白” )。此外, 皮肤细胞可能被改造, 以永久或临时的颜色和色素变化 ( 如改变头发或虹 膜的颜色 ), 包括荧光, 彩虹色, 磷光, 反射, 折射, 光致发光, 化学发光, 和 / 或生物发光 ( 如 荧光素酶和荧光素反应 )。另外, 应用本发明的方法和 / 或组合物的处理, 美容改善和维持 的好处至少包括以下中的一项 : 减少创伤后疤痕的形成 ; 改善激光后皮肤的重新修复, 提 高人对光敏药物如 ACCUTANE 的防护, 抗抑郁药, RETIN-A MICRO 等类似药物防护 ; 减 少光老化损伤 ; 在激光换肤 / 脉冲光治疗或任何利用光, 激光, 无线电波, 电磁, 超声波的类 似方法对皮肤细胞进行处理后期改善美观和加快愈合, 在磨皮手术, 化学换肤 ( 种类繁多 的化学换肤 ) 后期改善美观和愈合 ; 减少疤痕 ( 前摄和倒摄 ), 后期注射程序, 包括 BOTOX Restylane, Juviderm 和类似物。在一些实施例中, 尽管本方法和 / 或组合物可能应用于皮肤, 然而靶细胞也可以 为其他类型的细胞。例如, 指甲有关的细胞可能会被修饰, 以增加指甲和角质层的生长速 率, 减少开裂和损坏, 提高了长度和厚度, 降低垄起和剥落, 降低粗糙度和钝度, 和更好的着 色。 头发有关的细胞可能会被修饰, 以提高生长速度, 降低生长速度, 减少发梢分叉, 剥落和 断裂, 改善可处理性, 降低钝度, 改善光泽和光彩, 增加密度 ( 更厚 ), 降低密度 ( 更薄 ), 磨 蚀, 增加的长度和厚度, 提高柔软度。 上述任何一个美观改善可能会产生的第二个好处是增 加受者自信和提升受者心情。
因此, 在具体实施例中, 本发明提供了能在具有美容功能的细胞增加表达有提高 或维持功能的核酸或多肽的体内或体外方法。例如, 所述方法可能包括使用一种能编码至 少一个用于维持特定细胞具美容功能的核酸分子或多肽链的多聚核苷酸, 将其应用到至少 一部分能发挥美容功效的细胞中, 从而使上述核酸分子或多肽链在这些细胞中表达以提高 或 / 和维持对外貌产生积极效果的生物化学或 / 和生理过程。
在本发明的方法和组合物可能使用了能编码多种蛋白质的多种基因。 在本发明的 方法和组合物的具体实施例中, 所述多核苷酸构建体可能编码一个反义 RNA 或一个 siRNA, 以作为一种抑制所述蛋白表达的方法。例如, 某些特定生长因子减少表达可能使具有美容 功能的细胞或其周围细胞减少炎症。另外, 特定 MMP 蛋白减少表达可增加细胞的胶原含量。 在具体实施例中, 所述的 siRNA 可使能提高细胞美观的其他基因表达减少。 在一具体实施例中, 由所述转染的重组多核苷酸编码的所述核苷酸或多肽, 可能 包括角化细胞生长因子 ( 如, KFG-1 或 KFG-2), 和 / 或 KGF 受体和辅因子或它的一个片段。 可选地或另外地, 由所述转染的重组多核苷酸编码的所述核酸或多肽, 可能至少包括一种 转化生长因子 (TFG-α, TFG-β1-4, 其他已知的 TGF-β 蛋白 ) 和 / 或 TGF 受体和辅因子或 源自它它的一段片段中的之一。可选地或另外地, 由所述转染的重组多核苷酸编码的所述 核苷酸或多肽, 可能包括一种胰岛素样生长因子 ( 如 IGF-1, IGF-2) 或一段源自它的片段。 可选地或另外地, 由所述转染的重组多核苷酸编码的所述核苷酸或多肽, 可能包括至少一 种血小板源性生长因子 ( 如 DGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PDGF-CC) 或一段源自它的片段。
在其他实施例中, 由所述转染的重组多核苷酸编码的所述核苷酸或多肽, 可能包 括至少一项以下多肽或源自它的片段 : 血管内皮生长因子 ( 如 VEGF-A 或 VEGF-C), 肝细胞 生长因子, 成纤维细胞生长因子 (FGF-1, FGF-2, FGF-3, 或 FGF-22) ; 表皮生长因子 ( 如 EGF ; 肝素结合 EGF), 血小板衍化内皮细胞生长因子 (PD-ECGF) ; 结缔组织生长因子 ( 如 CTGF-1, 粒细胞 - 巨噬细胞集落刺激因子 (GMCSF), 单核细胞集落刺激因子 (MCSF), 粒 CTGF-2) ; 细胞集落刺激因子 (GCSF), 生长激素 (GH) ; 抗血管生成因子 ( 如 Ang-1, 如可溶性血小板 因子 -4, 血小板反应素如 TSP-1 和 TSP-2, 尿激酶型纤溶酶原激活物 / 受体拮抗剂, 如, uPA/uPAR, 血管抑素, 内皮抑素和钙网蛋白 ) ; 一种转录因子 Egr-1 的, 或缺氧诱导因子 (HIF-1-α)。本发明的方法和组合物使用的其他被编码的多肽或核酸包括一些具有合成, 降解, 修复和抗氧化保护的酶功能多肽, 包括一些具有结构功能包括细胞外基质蛋白的多 肽, 包括具有细胞粘附和通信功能的多肽, 所述表达的多肽的因子, 辅助因子, 受体, 和在皮 肤细胞内为非转染的基因组多核苷酸编码活性多肽的启动子。例如, 本发明的组合物和方 法中使用的多肽或核酸可能包括, 或编码 ( 或与编码序列互补 ) 源自以下的多肽或片段 : 神经营养因子 ( 如神经生长因子 (NGFs), 神经营养因子 -3(NT-3), NT-4 和脑源性神经营养
因子 (BDNF), 肿瘤坏死因子 (TNFs), 肝细胞生长因子 (HGFs), 干扰素 (INFs), 白细胞介素 (ILSs- 如 IL-1, IL-2, IL-6, IL-8 和 IL-10), 血管生成素, 分散因子 (SFs), 趋化因子 (CCs), 抑制素 (TGF-β 家族的一部分 ), 脂肪因子 ( 如瘦素, 白细胞介素 6(IL-6), 其他细胞因子, 脂联素, 补体成分, 脂肪酶, 纤溶酶原激活物抑制物 1(PAI-1), 肾素 - 血管紧张素系统 (RAS) 的蛋白质和其他 ), 骨形态发生蛋白 (BMPs)。
在其他一些实施例中, 所述多聚核苷酸 ( 或与编码序列互补 ) 可能编码 CCN 蛋 白家族多肽 ( 如富半胱氨酸的 (CYR61/CNN1), 一种结缔组织生长因子 CNN2, Nov, WISP-1, WISP-2, 和 WISP-3), 整合素 (6)β(1), 细胞表面的硫酸乙酰肝素蛋白多糖 (HSPGs), 粘着斑 激酶, 桩蛋白, 和 / 或 Rac, p42/p44MAPKs, 源自它的片段或生物活性物。或者, 也可使用这 些基因的 siRNA 或反义分子。
在其他实施例中, 多聚核苷酸可能编码 ( 或与编码序列互补 ) 至少以下一中多 肽 ( 或由其衍生具有生物学活性的或其片段 ) : 信号转导和 / 或转录激活物 (STATs), 甲状 腺激素 (TH), 促甲状腺激素 (TSH), 催乳素, 甲状旁腺激素 (PTH), 甲状旁腺激素相关蛋白 (PTHrP), 促甲状腺激素释放激素 (TRH), 神经肽 ( 如内啡肽 ) 他扎罗汀诱导基因 (TIGs), 细 胞维甲酸结合蛋白 (CRABPs), 原骨胶原, 胶原 ( 所有形式 ), 脯氨酸羟化酶和其他参与胶原 合成 ( 如羟赖氨酰半乳糖神经酰转移酶和半乳糖羟赖氨酰葡糖基转移酶 ), 修复 / 维持和降 解的酶, 弹性蛋白原, 弹性蛋白, 赖氨酰氧化酶和其他参与弹性蛋白合成, 修复 / 维持和降 解的酶, 原纤蛋白, fibulins 蛋白, 超氧化物歧化酶 ( 如 SOD 1, 2 和 3), 谷胱甘肽过氧化物 酶 (GSH-Px), 过氧化氢酶 (CAT), 过氧化还原酶 VI, 血红素氧酶 (HO), 巯基蛋白还原酶, 抗氧 化蛋白 2(Aop2) 金属硫蛋白 (MT), 谷胱甘肽 (GSH), 辅酶 ( 辅酶 Q), 钙联蛋白, 与角质细胞脱 屑有关的酶 ( 如组织蛋白酶, 比如组织蛋白酶 -D 和组织蛋白酶 -G 和转谷氨酰胺酶 ), 纤连 蛋白, 层粘连蛋白, 整合蛋白, 钙粘素, 凝集素细胞黏附分子 (LEC-CAMs), 水通道蛋白, 肌动 蛋白, 伞形蛋白, 兜甲蛋白, 聚角蛋白微丝, 角质 / 角蛋白, 桥粒蛋白, 斑蛋白, 旁血小板溶蛋 白, 膜联蛋白, 参与的合成, 修复 / 维持和降解细胞外基质, 细胞粘附和细胞通信 ( 如涉及层 粘连蛋白, 纤维连接蛋白和角蛋白合成酶 ), DNA 的合成, 修复 / 维持和降解酶 ( 如限制性内 切酶, 光解酶, 端粒酶, 和其他 (ERCC3, PCNA, RPA, XPA, p53, 所有这一切都是随着年龄下降 ; Goukassian 等, FASEB J., 2000, 14, 1325-1334 年 ) 和端粒 3-prime 突出序列 ( 寡聚 T), 应 激反应和伴侣蛋白及相关元件 / 激活物 / 因子 ( 如热休克蛋白 27, 热休克蛋白 47, 热休克蛋 白 60, 热休克蛋白 70, alphaB 结晶, Grp78, Grp94, 热休克转录因子和辅助因子 ( 如 HSF1, 2, 4) 产生的热休克元素 (HSE), 半胱氨酸串联蛋白 (csp), BAG-1, Hip, CHIP, Hop 和 Tpr-2), 涉 及合成, 修复 / 维持和降解神经酰胺和酰胺衍生物的酶 ( 如丝氨酸棕榈酰转移酶, B- 半乳糖 脑苷脂酶, 葡糖脑苷酯酶, 酸性 / 中性 / 碱性 SMASE( 鞘磷脂酶 ), 酸性神经鞘氨醇酶, SM 脱 酰酶, GC 脱酰酶, pSAP, 葡糖神经酰胺合酶, 神经酰胺合酶和鞘磷脂合成酶 ), 涉及合成, 修 复 / 维持和降解透明质酸的酶 ( 如透明质酸酶 / 透明质酸合成酶 1-3 和其他 ), 参与胆固醇 的合成, 修复 / 维持和降解的酶, 参与脂肪酸, 三酸甘油酯, 磷脂, 缩醛磷脂, 鞘脂, 类花生酸 ( 包括花生四烯酸级联, 前列腺素和白三烯 ) 的合成, 修复 / 维持和降解的酶, 维甲酸受体, 类固醇受体, 激素受体 ( 如雌激素受体 ), 甲状腺受体, 维生素 D 受体, 过氧化物酶体增殖物 激活受体 (PPARs 的 ), 金合欢醇激活受体 (FXR), 肝激活受体 (LXR), 基质金属蛋白酶 (MMPs 包括胶原酶 (MMP-1), 明胶酶 ( 例如, MMP-2 和 MMP-9), 弹性蛋白酶, 质溶解素, 丝氨酸蛋白酶和膜 - 型 MMPSs), 金属蛋白酶组的织抑制剂 (TIMPs)。
在其他实施例中, 所述多聚核苷酸可能编码 ( 或与编码序列互补 ) 一个多肽或能 编码以下物质至少一个片段的核酸 : 丝氨酸蛋白酶抑制剂 ( 如皮肤衍生抗白细胞蛋白酶 (SKALP), 也称为弹力素 ( 包括 preproelafin 和 proelafin) 和分泌的白细胞蛋白酶抑制 剂 (SLPI)), MSX( 同义词包括 CHOX-8 ; GHOX-8 ; HOMEOBOX PROTEIN MSX-2 ; HOX-8 ; HOX-8.1 ; HOX8 ; MSH HOMEO BOX HOMOLOG 2 ; MSX-1 ; MSX-2 ; MSX1 ; 和 QUOX-7), SMAD 通 路, Smad3, C-ski, 和细胞外信号调节激酶 1/2, 心脏重复蛋白, 雌激素 - 相应 B box 蛋白 (EBBP), 胰岛 素样生长因子结合蛋白 (IGFBPs), 玻联蛋白, 卵泡抑素。RAC1, ADAMTS1 蛋白酶, 神经元突 触前膜蛋白 -1, 转录因子 AP-1, cJun, cFos, β- 淀粉样蛋白前体蛋白 (sAPP), β- 连环蛋 白, CHL1, 促肾上腺皮质激素释放激素 (CRH), DJ-1, 固醇调节元件结合蛋白 ( 如 SREBP-1 和 SREBP-2), 磷脂酰肌醇 3- 激酶 (PI3K), 硬脂酰辅酶 A 脱氢酶 (SCD), 脂肪酸合成酶, 羟甲基 戊二酰 - 辅酶 A 合成酶 (HMGCS), CCAAT/ 增强子结合蛋白 α(C/EBPα), C/EBP δ, FAS, 硬 脂酰辅酶一个去饱和酶 -1(SCD-1), 涉及雌激素的合成 ( 如芳香化酶 ) 的酶, 成纤维细胞生 长因子同源因子 (FHF) 多肽, 核心蛋白聚糖, 基膜聚醣, 纤调蛋白 ( 和其他小富含亮氨酸重 复蛋白聚糖 ), 多功能蛋白聚糖, 双糖链蛋白多糖, 蛋白聚糖, 短缩素, 半乳凝素 ( 如半乳糖 凝集素 -3 与半乳糖凝集素 -7), 硫酸肝素, 串珠素, 多配体聚糖 -1, 硫酸软骨素, JUN-- 调节 因素 ( 如多效蛋白 (PTN) 和基质细胞衍生因子 1(SDF-1)), CXCR4(SDF-1 受体 ), 抗凋亡蛋白 ( 如 Bcl2 和生存素 ), 转录因子核因子 (NF)-κB, 一氧化氮合酶, 参与儿茶酚胺的合成和降 解的酶, 丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK), 转录因子 NF-E2 相关因子 ( 如 Nrf2 和 Nrf3), P21 活化 蛋白激酶 4(PAK4), 参与合成溶血神经鞘氨脂 (SPC) 的酶, 脂酶, 脂质动员肽 ( 如 β- 促脂解 素和 “解脂肽 A 和肽 B” ), 双调蛋白, 酪氨酸酶和其他参与黑色素, 真黑素和褐黑素合成和降 解的酶, 黑素肾上腺皮质激素 ( 垂体肽类激素, 包括促肾上腺皮质激素 (ACTH) 和 α, β和 γ 黑色素细胞刺激激素 (MSH), 激素原, 阿黑皮素原, A- 促黑激素, 促肾上腺皮质激素, 内皮 素 1, 环磷酸腺苷, PKCb, bey1, bey2, bey3, 人黑素肾上腺皮质激素 -1 受体 (MC1R), OCA1( 酪 氨酸酶, TYR), OCA2(OCA2), OCA3( 酪氨酸酶相关蛋白 1, TYRP1), 和 OCA4( 膜相关转运蛋白, MATP), c-Jun N- 末端激酶激酶激酶 (JNKKK 多肽如 MLK4, PAK4, PAK5 和 YSK2), HiF1-α 调控基因 ( 如 BNIP3, 缺氧诱导基因 1, 腺苷酸激酶 4, 半乳糖激酶, 乳糖凝集素 -3, 凝溶胶 蛋白, RhoA, Rho 激酶, 异构核核糖核蛋白 H1 和剪接因子和 REV3), α-SMA, S1-P, GRO-α/ CXCR-1, erbB, 激活肝细胞生长因子 (HGFA), 角质细胞富含脯氨酸的蛋白 (KPRP), 神经递质 和神经递质阻滞剂 ( 如 GABA(γ- 氨基丁酸 )), 乙酰胆碱受体阻滞剂, 蛇毒 Waglerin1 和箭 毒 Curare。
在其他实施例中, 本发明发放和或组合物所述多聚核苷酸可能编码 ( 或与编码序 列互补 ) 至少一个以下多肽 ( 或源自它的片段 ) : α1- 抗胰蛋白酶 ( 一个不可逆转的中性粒 细胞弹性蛋白酶抑制剂, 可改善静脉曲张的静脉强度 ), 在某些实施例中, 其可能与 MMP-2 抑制联合 (MMP-2 在静脉曲张组织中含量高 ), 激素敏感脂肪酶 (HSL), 蛋白激酶 A( 激活 HSL), 甘油三酯脂酶 (ATGL), CGI-58( 最近发现的 ATGL 的辅激活因子, 其促进野生型和 HSL 缺陷型 WAT 的 TG 水解酶活性, 但在 ATGL- 缺陷型 WAT 中并不如此, 表明 ATGL 是的 CGI-58 介 导的激活脂肪分解的唯一目标 ; 同时, 目前在小鼠 WAT 中, ATGL 和 HSL 负责超过 95%的 TG 水解酶的活性 )。此外已知的脂肪酶, 心房利钠肽, 胰蛋白酶, α- 糜蛋白酶, 抗感染和痤疮皮肤抗菌肽 ( 如 SLPI, 溶菌酶和防御素 ), 上游转录因子 -1(USF-1), δNp63α, Sirt1, 血管 紧张素 (ANG) Ⅱ 1 型 (AT1) 和 2 型 (AT2) 受体, 血管紧张素Ⅱ, SHP-1(Src 同源 2 含蛋白质 酪氨酸磷酸酶 -1), 和 / 或前列环素合酶 (PGIS) 可能由本发明的反义构建体所编码或为目 标。
另外, 本发明中的基因构建体可能包括一个多核苷酸 ( 或它的片段 ), 其能编码 ( 或与编码序列互补 ) 至少一个以下参与美化或维持容貌的多肽 ( 或它的片段 ) : 肌动 蛋白, 原骨胶原, 或胶原片段 ( 如 KTTKS, 多聚赖氨酸多肽 ), 弹性蛋白原或弹性蛋白片段, TM 层粘连蛋白片段, 纤维连接蛋白片段, Matrixyl (Pal-KTTKS), Matrixyl 3000TM(Pal-GHK 和 Pal-GQPR), RonaCare ASCIIITM, CPC PeptideTM, CollaxylTM, Peptide Vinci 01TM, ALDENINETM, AmelioxTM( 肌肽二胎 ), ANTARCTICINETM, BIOPEPTIDE CLTM, BioPeptide-ELTM, Kappa ElastinTM, SYN -COLL, 血 小 板 反 应 蛋 白 T SP-1 片 段, MYOXINOLTM, DERMAXYLTM, copper peptides(GHK-Cu), CYTOKINOL LS 9028, Peptamide 6TM, RIGINTM, KOLLAREN ( 肝细胞生长因子 (HGF) 活性片段 ), EyelissTM, HaloxylTM, Dipeptide 2, Dermican(TSH 片 段 ), 和众多大豆衍生的多肽和如 CFTA 的化妆品成分 INCI 数据库中所列的。 另外, 可以放松 TM 肌肉的局部应用的多肽包括 SYN -AKE(Waglerin 1 模仿物 ), VIALOX (Curare 模仿物 ), TM TM TM ARGIRELINE ( 乙酰基六肽 -3), Leuphasyl , 和 SNAP-8 ( 同 SNAP-25)。另外, 皮肤中的活 性多肽详见美国专利 6586185。
在其他实施例中, 所述多聚核苷酸可能编码用以降低, 减慢和 / 或延迟具有美容 功能细胞衰老的核酸和 / 或多肽, 例如美国专利 No.6,953,664, 以提高或 / 和维持对外貌产 生积极效果的生物化学或 / 和生理过程。
在其他实施例中, 所述多聚核苷酸可能编码一个对应于具美容功能的细胞中某蛋 白的抗体, 以提高或 / 和维持对外貌产生积极效果的生物化学或 / 和生理过程。
多肽的组合
另外, 在一些具体实施例中, 由本发明的构建体提供的多聚核苷酸包括一个编 码两个或更多的多肽或核酸组合的多聚核苷酸。例如, 在伤口愈合中, 相对于个别地应 用生长因子, 特定的生长因子组合可显示协同的改善作用 ( 见如, Lynch, 1999 ; J.Clin. Invest., 84 : 640-646 ; Jeschke 等, 2004, Gene Therapy 11 : 847-855 ; Sprugel 等, Wound Repair Regen., 2004, 12 : 67-79 ; Endocrine Reviews, 2002 ; 24 : 737-767 ; Nabarro, J.D., 1987, Clin.Endocrinol., 26 : 481-512 ; Ristow 等, 1988, J.Cell Physiol., 137 : 277-284 ; O’ Keefe 等, 1988 , J.Invest.Dermatol. , 90 : 2-7 ; Cook 等, J.Cell Physiol. , 146 : 277-189)。 可选地, 构建体可被操作以使所述多肽以 1 ∶ 1 比例表达。 或对于所述各种多肽 可用其他比例 ( 如 2 ∶ 1, 3 ∶ 1, 4 ∶ 1, 5 ∶ 1, 10 ∶ 1, 20 ∶ 1, 50 ∶ 1, 100 ∶ 1, 500 ∶ 1, 或 1000 ∶ 1)。
例如, 在一个具体实施例中, 一个组合包含 PGDF 和 IGF。 PGDF 可能包括已知的 PDGF 亚型中的任何一个。同样, IGF 可包括其任何一个已知的亚型。构建体可能被操作, 以使 所述多肽以 1 ∶ 1 的比例表达。或者, 可对于所述各蛋白使用其他比例 ( 如 2 ∶ 1, 3 ∶ 1, 4 ∶ 1, 5 ∶ 1, 10 ∶ 1, 20 ∶ 1, 50 ∶ 1, 100 ∶ 1, 500 ∶ 1 或 1000 ∶ 1)。在一个实施例中, 构建体被操作, 结果 PDGF-BB 和 IGF-1 以 2 ∶ 1( 重量比 ) 表达。或其他 PDGF 和 / 或 IGF 和 / 或其他比例组合也可使用。同样, 可使用一个 PDGF 和 TGF-α 组合。或者, 可使用 HGF和 IGF 组合。在其他实施例中, 可使用 PDGF 和一个碱性 FGF 组合, 或可使用 HGF 和碱性 FGF 组合。在又一实施例中个, 可使用 GH 和 IGF-1 或 IGF-II 组合。
在一些特定实施例中, 所述构建体或多种构建体可能编码两个以上蛋白。 例如, 在 一些实施例中, PDGF 和其他一些生长因子的组合可被使用。在一个实施例中, PDGF 与 KGF, IGF 和 IGFBP 的组合可被使用。或者, 这些生长因子的次级组合可被使用。
清除降解的胶原和 / 或其他碎片
在其他一些实施例中, 本发明的多核苷酸构建体可编码能帮助清除降解的生物大 分子以维持和 / 或提高完整生物大分子合成的蛋白质, 这些生物大分子对提高或 / 和维持 对外貌产生积极效果的生物化学或 / 和生理过程有重要作用。例如, 在一个实施例中, 所述 构建体编码 MMP-2 和 / 或 MMP-9 以清除来自 MMP-1 的胶原碎片。所述构建体使用完后, 可 使用能形成新胶原的构建体。在一些特定实施例中, 这些构建体可编码生长因子, 胶原和 / 或 TIMP-1。
受体
另外地, 在一些特定实施例中, 本发明的构建体所提供的多核苷酸可能包括一个 编码一个受体或受体组合 ( 如 KGF 受体, TGF 受体, FGF 受体如 FGFRiiib, 等 ) 的多核苷酸, 其作用物为具美容功能细胞中的多肽, 生长因子和其他能提高或 / 和维持对外貌产生积极 效果的生物化学或 / 和生理过程的生物大分子 ( 如如必须的辅因子或转录因子 )。
表达的性质
本发明中的构建体可被导入一个或多个类型的具美容功能的哺乳动物细胞中, 例 如, 转染未分化的 “干” 或 “基础” 的皮肤细胞, 于不同阶段的正在分化的皮肤细胞, 最后已分 化的皮肤细胞。 在一个实施例中, 此技术可以将核酸稳定转移进细胞基因组, 因此所述核酸 或多肽可被细胞长期表达。 所述能编码至少一个核酸或多肽多核苷酸以维持具有美容功能 的细胞, 从而能提高或 / 和维持对外貌产生积极效果的生物化学或 / 和生理过程的多核苷 酸, 一旦被纳入一个干细胞的基因组, 它便可遗传和在细胞后代中表达, 如来源于未分化的 “干” 或 “基础” 细胞的角质细胞或纤维母细胞。例如, 可能会使用一个综合载体 ( 如如逆转 录病毒, AAV, “睡美人” 转座子, 或细菌噬菌体整合酶, 如 ΦC31, 或类似物, 因此, 靶细胞可以 是任何具美容功能的细胞。
在其他实施例中, 所述技术可使核酸瞬时转化到具有美容功能的细胞的, 使核酸 或多肽可由细胞瞬时表达。 可选地, 这样的表达可能持续数秒, 数分钟, 数小时, 数天, 数周, 数月或数年。
在其他实施例中, 表达瞬态是由于所述细胞的生物学特性。 以皮肤细胞为例, 据终 端分化, 细胞更新可能会导致被改造细胞的减少, 例如正在分化的角化细胞向上移向表皮 的外围以形成鳞状细胞并最终因脱皮而消失。或者, 干细胞可能被修饰, 但能提高或 / 和维 持对外貌产生积极效果的生物化学或 / 和生理过程的多核苷酸可能直到细胞分化阶段才 表达。 因此, 虽然干细胞系中存在基因修饰, 核酸或多肽的表达可能取决于子代细胞的发育 阶段, 从而使修饰的瞬态取决于分化阶段 ( 即, 要么局限于干细胞阶段, 要么是分化的细胞 阶段 )。
在某些实施例中, 表达的核酸和 / 或多肽可能在具美容功能的干细胞, 分化细胞 和已分化细胞任意组合之间发挥旁分泌和 / 或自分泌的作用。例如, 转染的表皮成纤维细胞干细胞可能表达和分泌生长因子 ( 如角质细胞生长因子 (KGF)), 其对正在分化的表皮角 质细胞具有自分泌的效果。另一例, 所表达的核酸和 / 或多肽被用于将通常的旁分泌功能 转变为自分泌功能。例如, 皮肤成纤维细胞通常表达和分泌角质细胞生长因子 (KGF), 随后 扩散到表皮角质细胞发挥旁分泌的效果。然而, 能编码 KGF 的构建体转染表皮角质细胞后, 随后的表达和分泌的 KGF 改变为自分泌功能而不是 KGF 的旁分泌功能。
给予的位点
所述构建体被导入受者一个或多个部位, 从而能提高或 / 和维持对外貌产生积极 效果的生物化学或 / 和生理过程。被实施的部可能包括前额, 头皮, 毛囊, 上眼睑, 下眼睑, 眉毛, 睫毛, 眼眶下和眼周区 ( 包括典型的 “鱼尾纹” 区 ), 鬓角, 鼻, 鼻梁, 面颊, 舌, 鼻唇沟, 嘴唇和 periobicular 包括 “下颌” 区, 下颌线, 耳朵, 颈部, 胸部, 三头肌下, 手背, 背部, 腹 部, 两侧, 臀部, 大腿前和背部, 膝盖和其他受者具美容功能的细胞。在一个实施例中, 所述 构建体被注射进血液, 例如通过受体介导输送系统或组织特异性调控序列 ( 如启动子和 / 或信号序列 ), 表达的目的多肽作用于特定的具有美容功能的细胞受体。
名人基因
在某些实施例中, 本发明的构建体序列, 可以从 “名人” 和公众人物如著名的男演 员, 女演员, 音乐家, 画家, 作家, 政治家, 皇室成员, 运动员, 商界领袖, 部长, 社会活动家, 科 学家, 英雄人物, 及其他类似人物, 无论生者或死者任何可用的 DNA 来源, 或来自于上述 “名 人” 的家族直系血亲 ( 例如, 著名歌手的女儿 )。在其他实施例中, 本发明所述构建体的序 列可来自普遍多态性 : 来自总哺乳动物种群, 来自一个没有接受该美容修饰 ( 如将妻子的 构建体拷贝应用于丈夫, 反之亦然 ) 的哺乳动物, 从相同皮肤区域或更优的皮肤区域自体 移植到修饰区域, 被转染哺乳动物的直系血亲 ( 如将孩子的构建体拷贝应用于父母 ), 被转 染哺乳动物的配偶或同伴 ; 其他国民或 “种族” (如; 来自法国人男性的构建体拷贝转染的 美国人男性 ) ; 异性 ( 妇女可能希望得到来自于著名男演员的构建体 ) ; 或任何非哺乳动物 来源 ( 如藻类, 酵母, 真菌, 病毒, 植物, 鱼类和昆虫 ) 构造的序列 ) 的构建体序列
分子构建体
在某些实施例中, 本发明的构建体可通过本领域公知的技术提高导入和随后表 达, 包括利用基因构建体改造包括修饰内核苷酸 (internucleotides), 目标表达载体 ( 如 角质形成细胞和成纤维细胞的干细胞 ), 核靶, 使用细胞特定的, 或改良的调控启动子和其 他元件 ( 如增强子 ). 本发明的构建体可能包含其他的元件以提高参与增加或 / 和维持具 有美容功能细胞的多核苷酸和多肽的表达和 / 或适当的功能。
因此, 在一些实施例中, 所述构建体可能包括组成型的或可诱导的启动子, 其可操 作地连接到能表达多核苷酸或多肽的特定核酸上, 而所述多核苷酸或多肽能维持具有美容 功能的细胞, 从而提高或 / 和维持对外貌产生积极效果的生物化学或 / 和生理过程。
在其他实施例中, 所述构建体可能包括增强子, 其可操作地连接到多核苷酸或多 肽上, 而所述多核苷酸或多肽能维持具有美容功能的细胞, 从而提高或 / 和维持对外貌产 生积极效果的生物化学或 / 和生理过程。
另外地或可选地, 所述构建体可能包括切割位点序列, 内含子序列, 帽位点, 或功 能 polyA 元件, 其可操作地连接到多核苷酸或多肽上, 而所述多核苷酸或多肽能维持具有 美容功能的细胞, 从而提高或 / 和维持对外貌产生积极效果的生物化学或 / 和生理过程。给予方法
本发明采用本领域公知的技术, 将构建体应用于具有美容功能的细胞。在受体细 胞的必须的发育和生理功能未被破坏的前提下, 多种已知最先进的基因导入细胞技术被相 应地应用于本发明中。
基因转化具有美容功能的细胞的方法可能包括脂质递送系统, 如脂质体或双相囊 泡。此外, 还使用乳剂渗透具有美容功能的细胞, 如阳离子纳米粒子, 醇 / 碳氟微乳液, 或油 / 水和水 / 油型纳米乳液。
或者, 可用多联体。多联体, 在体外试验中, 用 T4 连接酶处理成熟 DNA 能够增强转 染效率, 如同一次转染实验并不能转入一个以上的分子一样, 转染通常只能转入较小的分 子, 这可能是因为转染分子的尾部结构起了重要作用。
在其他实施例中, 可使用粒子介导的转化。 在具体实施例中, 可用电磁辐射提高构 建体进入具有美容功能的细胞的能力。所述方法可能包含利用无线电频率形成微通道, 电 穿孔, 离子电渗, 或使用电整合 (electroincorporation)。 该操作可能还应用了物理导入方 法例如显微注射无修饰的 DNA。所述技术使参与维持或修复皮肤的多核苷酸或多肽瞬态表 达。
或, 可使用长时效基因表达技术。 例如, 可使用含目的核酸序列的病毒或噬菌体转 染的分子技术。同时, 其他技术如如细胞融合, 染色体介导的基因转移, 微细胞介导的基因 转移, 原生质球融合, 或转座子都包含在本发明的方法和组合物中。按已知的最先进技术, 化学和物理的渗透促进剂 ( 如, 加热, 前处理微晶换肤, 吸留 ) 及任何包含于本发明的方法 和组合物可被使用。
因此, 本发明的实施例承认了基因修饰具美容功能的细胞的潜力, 其可作为改善 受体美观的方法。基因修饰具美容功能的细胞提供了瞬态或长效改造细胞的方法。
可用于调整皮肤维持和 / 或美容外观的基因
令人不悦的容貌改变, 如皮肤下垂, 变薄, 起皱通常是由于皮肤蛋白如胶原, 弹性 蛋白, 或其他细胞外基质蛋白和蛋白聚糖的表达大量且稳定减少所致。 因此, 取代这些蛋白 质或阻止这些蛋白质的减少, 成为一个潜在的有效的策略, 以维持或改善皮肤的外观和健 康。本文所述的例子描述了五个重组载体构建体的设计, 所述构建体编码的蛋白旨在提高 细胞外基质的稳定和支持改善的皮肤外观。这些蛋白质为胶原, 弹性蛋白, EC-SOD, TIMP-1 和角质细胞生长因子 ( 例如, KGF-1)。以下详细讨论这些蛋白质对皮肤生理的作用。
其他蛋白质和 / 或多肽也可以使用本发明的方法和组合物。例如, 皮肤细胞表达 各种可能对组织的修复和维护有重要作用的不同的蛋白质和其他因子。因此, 角质细胞产 生白细胞介素 (IL-1-α, IL-1-β, IL-1ra 的, IL-3, IL-6, IL-8, IL-10 和 IL-18), 粒细胞 集落刺激因子 (G-CSF), 单核细胞集落刺激因子 (M-CSF 的 ), 粒 / 单核细胞集落刺激因子 (GM-CSF), 转化生长因子 (TGF-α 和 TGF-β), 血小板衍生生长因子 (PDGF), 肝细胞生长因 子 (HGF), 血管内皮生长因子 (VEGF), 肿瘤坏死因子 (TNF-α), 干扰素 ( 例如, INF-α, β和 γ), 胰岛素样生长因子 (IGF-1), 和成纤维细胞生长因子 ( 碱性 FGF, FGF-22)。 此外, 成纤维 细胞产生角质细胞生长因子 (KGF-1, KGF-2), TGF-β-1, TGF-β-2 和 TGF-β-3, 结缔组织生 长因子 (CTGF), FGF-2( 碱性 ), PDGF-A, IGF-1, 血管内皮生长因子, 肝细胞生长因子 (HGF), IL-6, IL-8, TNF-α 和 GM-CSF, G-CSF, FGF-22, 和 IGF-1。在另一个实施例中, 目的核苷酸是HIF-1-α 转录因子。此外, EGR-1 转录因子多肽, 或其一个生物活性片段, 或核苷酸编码的 类似多肽, 已有报道可用于治疗伤口 ( 美国专利号 6689758)。因此, 这些多肽, 或其衍生的 功能物, 在本发明的方法和 / 或组合物的实施例中可用单独或组合使用。
胶原
在一个实施例中, 所述参与保养具有美容功能的细胞而提高或 / 和维持对外貌产 生积极效果的生物化学或 / 和生理过程的多肽, 可能是一个胶原多肽或其功能衍生物。胶 原是构成人体的组织细胞外基质的主要纤维蛋白。I 型胶原是人体皮肤的主要细胞外基质 (ECM) 组分, 是由两个 α-1 和 1 个 α-2 链组成的三股螺旋结构 (Myllyharju 和 Kivirikko, 2001, Ann.Med., 33 : 7-21)。 这种原骨胶原链是由皮肤的成纤维细胞和身体其他组织的合成 的。一旦合成, 原骨胶原链裂解, 以便聚集和形成较大的胶原纤维以组成 ECM 的关键组分。 骨原胶原纤维退化或产量不足可导致减少 EMC 结构完整性和导致如皮肤等上覆组织的物 理变化。
胶原的丧失或退化是正常老化的一部分, 但它也是光损伤皮肤中观察到的主 要 变 化 之 一 (Lavker, 1995, Cutaneous Aging : chronologic versus photoaging, In Photoaging, Ed., Gilchrest, B.A., Cambridge MA, Blackwell Science, pp.123-135 ; Fligiel 等, 2003, J.Invest.Dermatol., 120 : 842-848 ; Varani 等, 2001, Am.J.Pathol., 158 : 931-942).。 据报道, 变老的, 防晒的皮肤 (Varani 等, 2000, J.Invest.Dermatol., 114 : 480-486) 和光损伤皮肤 (Griffiths 等, 1993, N.Engl.J.Med., 329 : 530-535) 其原蛋白的 合成持续下调。 一些机制表明, 正常年龄的胶原损失和由光损伤引起的胶原损失, 与基质金 属蛋白酶 (MMPs) 的增加和皮肤成纤维细胞数量的减少有关 ( 如 Fisher 等, 1996, Nature, 379 : 335-338 ; Fisher 等, 1997, N.Eng.J.Med., 337 : 1419-1428 ; Millis 等, 1992, Exp.Cell Res., 201 : 373-379 ; Burke 等, 1994, Exp.Gerontol., 29 : 37-53 ; Varani 等, 2000)。另一种 与胶原减少至少部分相关的机制是, 与年龄有关的皮肤成纤维细胞的胶原合成减少。 因此, 已证明, 老化皮肤的 I 型胶原的数量比年轻的成纤维细胞所合成的 I 型胶原数量低 (Varani 等, 2006)。在这项研究中, 在 I 型胶原的合成和含量的减少是与胶原束空间较大及成纤维 细胞和胶原纤丝之间的接触较少有关, 这表明纤维母细胞机械张力减少。 此前的研究表明, 机械张力降低时, 胶原的生产可能会下降, 基质 MMPs 的生产可能会增加 (Lambert 等, 1992, Lab.Invest.66 : 444-451 ; Delvoye 等, 1991, J.Invest.Dermatol., 97 : 898-902)。因此, 与 年龄有关的成纤维细胞胶原的合成减少可能会导致在 ECM 减少机械张力, 从而进一步降低 胶原的生产 (Varani 等, 2006)。通过对皮肤补充 I 型原骨胶原基因拷贝, 胶原产量可能会 提高, 可提供增加在 ECM 机械张力的潜力, 从而随后可使现有的成纤维细胞提高胶原产量。
弹性蛋白
在一个实施例中, 所述参与保养具有美容功能的细胞而提高或 / 和维持对外貌产 生积极效果的生物化学或 / 和生理过程的多肽, 可能是一个弹性蛋白多肽或其功能衍生 物。弹性蛋白是 ECM 另一个极为重要的组成部分, 提供皮肤弹力和恢复力 ( 综述 : Mithieux 和 Weiss, 2005, Adv.Protein Chem., 70 : 437-461)。弹性蛋白合成需通过其前体分子弹性 蛋白原的合成和赖氨酰氧化酶介导的交联。弹性蛋白是一个持久的分子, 其构成 90%的弹 性纤维和构成皮肤干重的 2-5%。弹性蛋白和弹性纤维的形成主要发生在胎儿发育和出生 后不久。除了损伤反应, 成年期弹性蛋白基本不合成。虽然弹性蛋白的主要功能是提供组织弹性, 但弹性蛋白 - 层粘连蛋白受体 (ELR) 已报道参与的皮肤成纤维细胞增殖 (Groult 等, 1991, Cell Biochem.Funct., 9: 171-182)。 正常老化一直伴随着弹性纤维的退化和丧失 (Braverman 等, 1982, J.Invest.Dermatol., 78 : 434-443 ; Ashcroft 等, 1997a, J.Pathol., 183 : 80-89)。据报道之间的 30 个人 -50 岁, 形成囊肿和陷窝是主要的异常 (Braverman 等, 1982)。在 50-70 岁个体中能观察到多孔纤维的形成, 但在 70 岁以上的人则更加频繁。同 样, 有研究表明, 年长者的防晒部位皮肤下表皮部区域有破碎的弹性蛋白纤维, , 在下表皮 层以下也有破碎的弹性纤维片段 (Ashcroft 等, 1997a)。更多最近的研究已经证实, 随着年 龄的增长皮肤弹性蛋白含量减少。据报道, 防晒皮肤的弹性蛋白染色密度从生命的第十年 的 49 %下降到第九十年的 30 % (El-Domyati 等, 2002, Exp.Dermatol., 11 : 398-405)。同 样, 据报道, 臀部皮肤 ( 防晒的 ) 弹性蛋白的含量在 20 岁至 80 岁间减少 51% (Seite 等, 2006, J.Eur.Acad.Dermatol.Venereol., 20 : 980-987)。有趣的是, 这些作者还报道, 虽然 面部皮肤 ( 严重太阳暴露 ) 的弹性蛋白的含量在 50 至 70 岁之间减少 44%, 但在前臂皮肤 ( 中等强度太阳暴露 ) 却没有观察到弹性蛋白含量的变化。这种随着年龄而增加的皮肤弹 性蛋白损失是与皮肤的弹性和恢复力降低相关的主要因素之一, 会导致皱纹和下垂。提供 弹性蛋白基因的外源性拷贝可能会增加新的弹性蛋白的生产, 并有助于抵消正常的随年龄 减少的弹性蛋白损失。这反过来又可以帮助改善皮肤的外观。
金属蛋白酶 -1 组织抑制剂 (TIMP-1)
在一个实施例中, 所述参与保养具有美容功能的细胞而提高或 / 和维持对外貌产 生积极效果的生物化学或 / 和生理过程的多肽, 可能是金属蛋白酶 -1 组织抑制剂 (TIMP-1) 或其功能衍生物。基质金属蛋白酶 (MMPs) 是一组酶 ( 胶原酶, 明胶酶和质溶解素 ), 参与 消化和重组的 ECM(Woessner, 1994, Ann.NY Acad.Sci., 732 : 11-30), 且在皮肤中大量存在 ( 综述 Kahari 和 Saarialho-Kere, 1997, Exp.Dermatol., 6: 199-214)。 MMP 活性由金属蛋白 酶组织抑制剂 (TIMPs) 调节 (Birkedal 等, 1993, Crit.Rev.Oral Biol.Med., 4: 197-250)。 ECM 的整体更新率是由组织中 MMP 和 TIMP 的比例起作用。
在正常的慢性老化期间, MMP 水平, 尤其是 MMP-1 水平, 在皮肤中增多 (Ashcroft 等, 1997b, Cell Tissue Res., 290 : 581-591 ; Varani 等, 2000)。光老化过程也能观察到皮 肤 MMP 相类似的增多。使用紫外线 (UV) 诱导的皮肤光老化模型证明, MMP-1 可能是主要负 责在皮肤胶原降解的酶 (Brennnan 等, 2003, Photochem.Photobiol., 78 : 43-48)。 与增加的 MMP 含量相比, 随着正常年龄增长, 皮肤 TIMP-1 水平可能会降低。随年龄增长, 这种 MMP 水 平不断提高和 TIMP-1 水平的下降的组合, 可导致皮肤的胶原含量的整体下降。随着胶原的 减少和随后支持它的 ECM 的减少, 皮肤显示出典型的外在老化特征包括细纹和皱纹的出现 和坚固度的降低。最近的研究报告, 各种 MMP 抑制剂可减少面部皮肤皱纹和支持胶原的生 产 (McDaniel 等, 2005, J.Cosmetic Derm., 4: 167-173 ; Moon 等, 2006, Phytomedicine 13 : 707-711 ; Park 等, 2006, Photochem Photobiol., 82 : 574-578)。 作为以上数据的结论, 如可 抑制皮肤 MMP 的活性的 EquiStat(Engelhard) 和 ECM-Protect(Atrium Biotechnologies) 化妆品成分已成功在市场推广。
本发明的实施例可提高 TIMP-1 合成。通过提高 TIMP-1 产量, 皮肤能够减少内源 性 MMPs 对皮肤的影响在本发明的方法和或组合物的实施例中, 。当如上所述的胶原基因构 建体和 TIMP-1 基因构建体同时转染, 可以生成一个双管齐下的措施以改善皮肤的外观。一方面, 胶原基因构建体可加强胶原的生产以对皮肤的 ECM 提供额外支持, 而 MMP-1 构建体的 使用将能保护新的和现有的胶原免受因 MMP 活性而导致的降解。
细胞外超氧化物歧化酶 (SOD-3)
在一个实施例中, 所述参与保养具有美容功能的细胞而提高或 / 和维持对外 貌产生积极效果的生物化学或 / 和生理过程的多肽, 可能是一个细胞外超氧化物歧化 酶 (SOD-3) 或其功能衍生物。皮肤以及许多其他组织含有内源性抗氧化酶系统, 其包 含三个强有力的酶超氧化物歧化酶 (SOD), 谷胱甘肽过氧化物酶 (GPX) 和过氧化氢酶 (Steenvoorden 等, 1997, J.Photochem Photobiol B : Biology 41 : 1-10 ; Afaq 和 Mukhtar, 2001, J.Photochem Photobiol B : Biology, 63 : 61-69)。超氧化物歧化酶催化过氧化物转 化为低毒性的过氧化氢, 其随后被谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶催化为水和氧。
这些酶的变化已经在衰老和光老化中被报导。已经证实表皮中 SOD 和过氧化氢酶 的含量比真皮高, 而在年轻和衰老皮肤真皮中 GPX 的含量均比表皮高 (Rhie et al, 2001, J.Invest.Dermatol., 117 : 1212-1217)。 在天然的和光老化的皮肤中 SOD 或 GPX 的含量均没 有明显变化, 但是过氧化氢酶的含量在表皮中增加了、 在真皮中减少了 (Rhie 等, 2001)。与 此相反, 有报导称光老化会导致角质层中这三种抗氧化酶的大量减少以及表皮中 CuZn-SOD 的减少 (Sander 等, 2002, J.Invest.Dermatol., 118 : 618-625)。这种抗氧化酶活性的丧失 与光老化皮肤上层真皮中氧化蛋白的增加是一致的。
超氧化物歧化酶在皮肤中有三种存在形式 (Cu/Zn-SOD, Mn-SOD 和 EC-SOD)。最 近的研究表明 EC-SOD 可能在抗氧化和抗衰老方面有重要作用。细胞外 SOD mRNA 在真皮 和表皮中都存在, 尽管真皮中的含量要更高, 而 EC-SOD 蛋白在表皮和真皮中都高水平表达 (Choung 等, 2004, Exp.Dermatol, 13 : 691-699)。有研究表明暴露于 UVA 和 UVB 下 EC-SOD 的 mRNA 的表达会增加 (Choung 等, 2004)。其他人则检测了在正常和超氧情况下成纤维细 胞中抗氧化基因的表达 (Serra 等, 2003, J.Biol.Chem., 278 : 6824-6830)。在这些研究中, 超氧引起 EC-SOD 基因的表达, 特别在具有高抗氧化活性的成纤维细胞中。而且, EC-SOD 的表达与端粒酶的缩短成反比, 因此 EC-SOD 表达的增加可以减慢端粒酶的缩短, 使成纤维 细胞的复制生命周期延长 (Serra 等, 2003)。也有研究表明胞外 SOD 对 I 型胶原有直接的 保护作用。EC-SOD 可以通过 C 端的肝素结合区与 I 型胶原直接结合 (Petersen 等, 2004, J.Biol.Chem., 279 : 13705-13710)。另外, 这些科学家报导结合的 EC-SOD 可以阻止氧化造 成的 I 型胶原的断裂。除了潜在的皮肤保护作用, EC-SOD 也有抗炎症功效 (Ha 等, 2006, Biochem.Biophys.Res.Comm., 348 : 450-458), 可以减少化学因素诱导的肿瘤形成的可能性 (Kim 等, 2005, Oncol.Res., 15 : 333-341), 可以减缓胶原引起的关节炎的一些症状 (Iyama et al, 2001, Arthritis Rheum., 44 : 2160-2167 ; Ross 等, 2004, Arthritis Rheum., 50 : 3702-3711)。
外在局部给予 EC-SOD 基因可能与内源 EC-SOD mRNA 的过表达有相同效果, 如增 加 EC-SOD 的表达量、 增强细胞的抗氧化能力、 延长细胞寿命等。通过延长皮肤成纤维细胞 的寿命和增强其抗氧化活性, 这些细胞产生和维持对健康皮肤所必须的 ECM 的能力就会增 强。而且, EC-SOD 对胶原的直接保护作用可以保护皮肤的胶原免受与皮肤衰老和光老化有 关的氧化损伤。
KGF在一个实施例中, 维持具有美容功能的细胞从而增强和 / 或维持对皮肤外观有益 的生化或生理过程的多肽是角质化细胞生长因子 (KGF)。KGF-1( 或 FGF-7) 是一个肝素结 合生长因子, 可以促进上皮细胞的增殖、 迁移和形态发生 ( 例如参见, au dem Keller, Eur. J.Cell Biol., 2004, 11-12, 607-612)。KGF 也可以刺激胶原和 / 或弹性蛋白的产生, 这两 种蛋白对维持皮肤和其他有外在功能的组织的健康有重要作用。这个 26-28kDa 的蛋白 C 端的三分之二与 FGF 家族的 8 个蛋白的同源性是 30-45% (Rubin et al, Cell Biol.Int., 1995, 19, 399-411)。KGF 是由一系列的间叶细胞产生的, 上皮细胞不产生 KGF。上皮细胞会 表达高亲和力的 KGF 受体, FGFR1- Ⅲ b, 它是 KGF 结合的唯一的 FGF 受体 (Grazu-Bilska et al, 2003 ; Werner et al, Cytokin Growth Factor Rev., 1998, 9, 153-65)。KGF 可以与其他 生长因子共同作用。因此, KGF cDNA 的非病毒脂质体转移到伤口可以使 VEGF 和 IGF-1 的 表达增加 (Grazu-Bilska et al, 2003)。在一案例中, 可通过大量给予 KGF 来增加 IGF-1、 VEGF 和 PDGF 的表达。
KGF-2( 也叫 FGF-12) 与 KGF 有 57%的同源性, 与 KGF-1 有相似的伤口治愈功能。 另外, 已有报道指出 KGF 的切短突变——KGFdes1-23 可增强细胞的有丝分裂活性 (U.S.Patent No.5,677,278)。Repifermin 是 一 个 用 于 治 疗 慢 性 静 脉 郁 血 性 溃 疡 的 切 短 的 重 组 人 KGF-2(Robson et ah, Wound Repair Regen., 2001, 9, 347-52 ; Fricker, MoI.Med.Today, 1998, 4, 229)。另外, 最近的研究表明树突状 γ-δ 上皮 T 细胞 (DETCs) 可产生 FGF-7 和 FGF-12, 在伤口治愈中可促进角化细胞的增殖 (Baum 和 Arpey, Dematol.Surg., 2005, 31, 674-686 ; Born et ah, Nat.Med, 2002, 8, 560-1 ; Jaeson, Science, 2002, 296 : 747-9)。
例 如, 包 括 KGF-I、 KGF-2 及 其 类 似 物 的 多 核 苷 酸 载 体 已 经 在 美 国 专 利 (Nos.5,731, 170 ; 5,677,278 ; 5,814,605, ; 6,228,839 以 及 6,916,786) 中 被 描 述。 这 些 序列也许能够被应用于本发明的多核苷酸构建体, 还有被缩短了的序列比如 Kepivance (palifermin), 它不同于内源性的人 KGF, 因为它起始序列 N 端的 23 个氨基酸被删除了以增 强其稳定性。
IGF
在一个实施例中, 维持具有美容功能的细胞从而增强和 / 或维持对皮肤外观有益 的生化或生理过程的多肽是胰岛素样生长因子 (IGF)。 胰岛素样生长因子主要在肝脏产生, 但是通过自分泌机制也有可能在所有细胞中产生。IGF-I 和 IGF-2 可能参与了组织生长调 节、 发育和再生 ( 参考 Grazul-Bilska et ah, 2003)。IGF-I 和 PDGF 可能一起作用增强皮 肤伤口的愈合、 骨骼再生以及牙周伤口痊愈。例如, 通过脂质体转移非常少量的 IGF-1cDNA 能够提高具有烧伤伤口的大鼠的再上皮化速度 (Pierre et ah, J.Burn Care Rehab., 1997, 18, 287-91 ; Jeschke et ah, Gene Therapy, 1999, 6, 1015-1020)。IGF-I 能够和生长激素通 过协同方式相互作用 (Meyer et ah, J.Trauma, 1996, 41, 1008-12)。 在某些实施例中, IGF-I 也可能升高细胞的脂浓度。这将可能有利于增强组织的丰满度, 例如面部肌肤或者嘴唇。
TGF-β
在一个实施例中, 维持具有美容功能的细胞从而增强和 / 或维持对皮肤外观有益 的生化或生理过程的多肽是转化生长因子 (TGF-β)。TGF-β 由几种类型的细胞合成, 包括 血小板、 巨噬细胞、 淋巴细胞、 成纤维细胞、 骨细胞以及角质细胞。 TGF-β 在成纤维细胞中可 能刺激纤连蛋白和胶原的产生, 以及促进这些蛋白多聚体进入胞外基质中 (Servoid, Clin.Pod.Med.Surg., 1991, 8, 937-53)。TGF-β 的应用有利于伤口愈合 (Graham et al, J.Wound Care, 1998, 7, 536-40)。因此, TGF-β 可能参与了增强和调节皮肤组织的作用。
HBF-1
在一个实施例中, 维持具有美容功能的细胞从而增强和 / 或维持对皮肤外观有益 的生化或生理过程的多肽是一种缺氧诱导因子 (HIF-1)。HIF-1 是一种 DNA 结合蛋白, 它能 够激活具有 HIF-1 结合位点的基因的表达。能够被 HIF-1 激活的基因包括 VEGF、 红细胞生 成素以及糖酵解基因。HIF-1 由两个亚基组成, HIF-1-α 和 HIF-1-β。已经发现每一个亚 基的变体都可以被用来灭活 HIF-1, 即通过形成没有功能的 HIF-1 二聚体。因此, 在另一种 实施方案中, 参与维持细胞美容功能的核苷酸或者多肽就是能够编码 HIF-1-α、 HIF-1-β 以及它们的变体的多肽, 或者是包括 HIF-1 结合位点的核苷酸。这样的序列能够在美国专 利 (No.5,882,914) 中找到。
其他与皮肤功能相关的多肽
在一个实施例中, 维持具有美容功能的细胞从而增强和 / 或维持对皮肤外观有益 的生化或生理过程的多肽是表皮生长因子 (EGF)。 EGF 是一个 6KD 的分子, 与 TGF-α 有 30% 的氨基酸同源性。EGF 由血小板产生, 在伤口愈合过程中浓度很高。EGF 可以提高伤口上皮 化速率, 也可以通过阻止伤口过度收缩而减少伤疤的形成。EGF 可能与 KFG、 PDGF 以及其他 生长因子共同维持和 / 或修复皮肤组织。 在另外一个实施例中, 维持具有美容功能的细胞从而增强和 / 或维持对皮肤外观 有益的生化或生理过程的多肽可能是成纤维细胞生长因子家族成员 (FGF))。FGF 由几个相 关联的多肽组成, 包括酸性 FGF(aFGF 或者 FGF-I)、 碱性 FGF(bFGF 或 FGF-2)、 几个癌基因 (int-2, hst/K-FGF, FGF-5) 以及 KGF( 见上面讨论 )。在皮肤中 FGF-1、 FGF-2 以及 KGF 被认 为是最重要的成纤维生长因子。在其他实施例中, 也有可能用到 FGF-IO 和 / 或 FGF-22( 参 考 au dem Keller, Eur.J.Cell Biol., 2004, 11-12, 607-612)。FGFs 能够刺激血管生成, 以及与伤口愈合相关的许多细胞的增殖和 / 或迁移, 包括毛细血管内皮细胞、 血管内皮细 胞、 成纤维细胞、 角质细胞、 上皮细胞以及一些特别的细胞种类, 比如软骨细胞和成肌细 胞。FGF-2 还可以刺激胶原的合成, 上皮形成, 纤连蛋白以及蛋白多糖的合成 ( 参考例如, Grazu-Bilska, 2003)。
在另一个实施例中, 维持具有美容功能的细胞从而增强和 / 或维持对皮肤外观有 益的生化或生理过程的多肽是血小板源生长因子 ( 例如, PDGF AA, AB, BB, CC 及其他 )。 PDGF 是间充质来源细胞的强有力的有丝分裂原, 并且能够促进伤口愈合。PDGF 促进成纤维细胞 中胶原的产生, 从而有利于成纤维细胞的迁移以及改变伤口基质。 例如, 发现体内调节角质 细胞过表达血小板源生长因子 (PDGF) 能够促进伤口愈合 (Eming et al, Hum.Gene Ther., 1998, 9, 529-539)。
在另一个实施例中, 维持具有美容功能的细胞从而增强和 / 或维持对皮肤外观有 益的生化或生理过程的多肽是血管内皮生长因子 (VEGF)。VEGF 高度保守且与 PDGF 具有高 度的结构同源性。VEGF 是一种内皮细胞特异性的有丝分裂原和化学引诱物, 具有强有力的 体内血管生成活性 ( 参考 Grazu-Bilska, 2003), 这对于皮肤细胞维持和修复非常重要。
在 另 一 个 实 施 例 中, 维持具有美容功能的细胞从而增强和 / 或维持对皮 肤 外 观 有 益 的 生 化 或 生 理 过 程 的 多 肽 是 肝 细 胞 生 长 因 子 (HGF)( 参 考 Ono et al, J
SurgRes.2004Jul ; 120(1) : 47-55)。 HGF 具有许多生物学活性, 例如促有丝分裂、 单性生殖、 抗凋亡、 抗成纤维化以及形态发生。对内皮细胞而言它还具有血管生成和血管保护活性。
在另一个实施例中, 维持具有美容功能的细胞从而增强和 / 或维持对皮肤外观有 益的生化或生理过程的多肽至少包括结缔组织生长因子 (CTFG-I, CTFG-2)、 粒细胞巨噬细 胞集落刺激因子 (GMCSF)( 参考美国专利 No.6,689,351, 描述了用 GMCSF 治疗创伤 )、 巨噬 细胞集落刺激因子 (MCSF)、 生长激素 (GH) 中的一种。同时, 维持细胞的美容功能从而增 强和 / 或维持对皮肤外观有益的生化或生理过程的多肽可能包括抗血管生成多肽, 例如 TSP-I 或 TSP-2( 参考美国专利 No.6,712,617)。其他活跃在具有美容功能细胞中的多肽 和因子比如上面描述的, 可以查阅以引用全文的方式并入本文中的第 6,586,185 号美国专 利。
分子构建体及其制备方法
在各种实施例中, 目标基因通过重组 DNA 技术产生。一个重组 DNA 分子包括一个 多核苷酸序列, 这段多核苷酸序列编码至少一种维持具有美容功能的细胞从而增强和 / 或 维持对皮肤外观有益的生化或生理过程核苷酸或者多肽, 它能够利用本领域公知的常规基 因表达技术来操作和表达。通过这种方式, 能够大量产生具有合适的侧翼序列的目标多肽 或者多核苷酸。
本文中提到的这些方法和化合物中的每一种多核苷酸或者多肽包括生物活性衍 生物、 类似物和 / 或保留了全长多核苷酸或多肽具有的生物活性的片段。这些衍生物或者 类似物可能包括翻译后修饰的多肽或者磷酸化的多肽。或者, 通过化学合成具有修饰残基 的核苷酸分子而形成的多核苷酸类似物。 多肽类似物也可能利用常规的氨基酸替换、 删除、 添加或者位点突变的方式而产生。在一个实施例中, 可以通过删除参与了皮肤维持和 / 或 治疗的核苷酸的一段序列或者多肽的氨基酸残基就能得到一个目标基因片段, 正如本领域 技术人员所知。
一个多核苷酸序列编码至少一种维持具有美容功能的细胞从而增强和 / 或维持 对皮肤外观有益的生化或生理过程核苷酸或者多肽, 它能够在原核或者真核表达系统中进 行增殖和表达。 在另一个实施方案中细菌、 哺乳动物、 酵母以及昆虫细胞系均可以被用于重 组载体的增殖。
在一个实施例中, 一个多核苷酸序列编码至少一种维持具有美容功能的细胞从而 增强和 / 或维持对皮肤外观有益的生化或生理过程核苷酸或者多肽, 它能够进行融合蛋白 的表达, 即与另外一种维持具有美容功能的细胞的编码序列以正确的框架和方向联合。这 些融合蛋白用于增强维持具有美容功能的细胞的核苷酸和多肽的稳定性或者保证其正确 加工。或者, 维持具有美容功能的细胞从而增强和 / 或维持对皮肤外观有益的生化或生理 过程的核苷酸或者多肽能够与其他合适的意向用途的分子相连接。例如, 维持具有美容功 能的细胞从而增强和 / 或维持对皮肤外观有益的生化或生理过程的核苷酸或者多肽能够 与一种结合组分相连接从而变成一种被目标细胞认识的受体。
除非另有说明外, 本发明的实践应用中将会利用分子生物学、 微生物学、 重组 DNA 以及免疫学中的常规技术, 这些技术都被包括在本技术领域内。这些技术在文献中有详 细的解释, 包括 Sambrook, 等, Molecular Cloning : ALaboratory Manual 2nd ed.(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) ; DNA Cloning, Vol.I 和 II, D.N Glover ed.(IRLPress, 1985) ; B.Perbal, A Practical Guide To Molecular T/US2010/04205 ; Cloning, Wiley(1984) ; ; Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, J.H.Miller 和 M.P. Calos eds.(Cold Spring Harbor Laboratory, 1987) ; Methods In Enzymology, Vol.154 和 155, Wu 和 Grossman, eds., 和 Wu, ed., respectively(Academic Press, 1987).
重组构建体由维持具有美容功能的细胞从而增强和 / 或维持对皮肤外观有益的 生化或生理过程的核苷酸或者多肽组成, 能够利用公知的重组技术得到。 就此而言, 目标序 列通过正确的阅读框和方向可以可操纵地连接到一个或者多个合适载体的调节序列上。 因 此, 目标序列可以被插入, 例如, 插入到一个哺乳动物载体上在哺乳动物细胞中进行表达。
图 7 显示了本发明编号 20 的重组构建体。这个重组构建体由一个 DNA 分子组成, 它编码一个维持具有美容功能的细胞从而增强和 / 或维持对皮肤外观有益的生化或生理 过程蛋白或多肽 22。或者, 这个载体由一段多核苷酸组成 ( 例如反义 RNA 或者 siRNA), 它 能够用来调节维持具有美容功能的细胞从而增强和 / 或维持对皮肤外观有益的生化或生 理过程的多肽的表达。
在一个实施例中, 维持具有美容功能的细胞从而增强和 / 或维持对皮肤外观有 益的生化或生理过程的多肽的编码序列来源于一种互补 DNA(cDNA), 它由宿主细胞的胞内 RNA 逆转录而成, 能够用本文举例中描述的方式或者本领域中其他已知的方式表达目标基 因。
如图 7 所示, 在某些实施例中, 重组载体可能包含一段调节序列比如启动子 24( 或 ) 增强子 26。因此, 一段包含了在目标细胞中强有力的启动子 24 的常规序列可能通 过分子技术被连接到 cDNA 序列上。也可能用到其他的调节序列, 比如一个或者多个增强子 序列 26, 一个核糖体结合位点 28, 一个具有功能性剪接供体和受体位点序列的内含子, 一 段指导重组多肽 30 分泌的信号序列, 一段终止序列 32, 一个多腺苷酸化信号和 / 或多腺苷 酸化序列 34, 其他转录终止序列以及一段宿主基因组同源序列。 其他序列, 比如复制起始位 点能够被插入到载体中从而优化目标产品的表达。同时, 一个选择标记也有可能被包括在 载体上以便用来对转化的宿主细胞进行选择。
调节序列具有多种来源。例如, 它们中一个或者多个可能能够正常地与编码序列 相连结, 或者来源于宿主细胞的调节系统, 或者与宿主细胞的调节系统同源 ( 例如角质细 胞 )。同样地, 启动子可能来源于一个基因, 这个基因能够启动应答使具有美容功能的细胞 退化的化合物或者条件, 比如紫外线或者一些化学试剂。表达载体的各种组分能够直接连 结到一起, 或者由通过本领域中已知的限制性酶识别位点组成的连结体来连结。
任何能够使维持具有美容功能的细胞从而增强和 / 或维持对皮肤外观有益的生 化或生理过程的多肽编码序列表达的启动子都能够被用于本发明。例如, 能够应用于此的 哺乳动物启动子序列是一些哺乳动物病毒, 它们能够进行高表达且具有广泛的宿主范围。
启动子可以是那些能够在大部分哺乳动物中进行持续表达的启动子, 比如 PKG 启 动子。举例来说, 能够在真核细胞中持续表达的合适的调节元件是一些能够被 RNA 聚合酶 III 识别的启动子或者病毒启动子、 CMV 增强子、 CMV 启动子、 SV40 启动子或者 LTR 启动子, 如来自 MMTV( 小鼠乳腺瘤病毒, Lee et al, 1981, Nature, 214, 228-232) 和其他病毒的启 动子和激活序列, 例如来自 HBV, HCV, HSV, HPV, EBV, HTLV 或者 HIV。举例来说, 能够在真核 细胞中进行表达调节的调节元件是由四聚体组成的操纵子及其相应的阻遏物 (Gossen M.,等, 1994, Curr.Opin.Biotechnol., 5, 516-20)。
在一个实施例中, 目标基因的表达在组织特异性启动子控制下才发生。在另一个 实施例中, 组织特异性启动子可能包括皮肤特异性启动子, 比如人 K10 启动子 (Bailleul et al, 1990, Cell, 62, 697-708 ; Sawamura 等, J.Invest.Dermatol, 1999, 112 : 828-830), 人 K14 启动子 (Vassar et al, 1989, Proc.Natl.Acad.ScL USA, 86, 1563-67), 人套膜蛋白启动子 (Carroll 等, 1993, Proc.Natl, Acad.ScL, 90 : 10270-10274), 牛细胞角蛋白 IV 启动子, 或者 其他人角蛋白启动子 ( 例如, K1 和 K5)(Bryne 等, 1994, Development, 120 : 2369-2383)。
另一种方案中, 启动子可能是在细胞周期或者发育过程中特定时间启动的启动 子。 例如, 重组载体可能包括能够在真核细胞中进行组织特异性表达的调节元件, 例如启动 子或者来自启动子的激活序列, 或者一些只在某些细胞类型中表达蛋白的编码基因的增强 子。举例来说, 这些在真核生物细胞周期中特异性表达的调节元件是以下基因的启动子 : cdc25A, cdc25B, cdc25C, cyclin A, cyclin E, cdc2, E2F-1to E2F-5, B-myb or DHFR( 参 考美国专利 No.6,856,185 ; No.6,903,078 ; 以及 Zwicker J. 和 Muller R.5 1997, Trends Genet., 13, 3-6)。根据本发明, 细胞周期调节启动子仅限于增殖细胞中多肽或者核苷酸 的表达。在一个实施方案中, 一种叫做 FiRE 的元件能够使角质细胞在皮肤中特异性表达 (Jaakkola et al, 2000, Gen.Ther., 7, 1640-1647)。这种 FiRE 元件是一种 AP-1 驱动分子, FGF 诱导的 Syndecan-1 基因应答元件 (Jaakkola et al, 1998, FASEB J., 12, 959-9)。同样 的, 那些能够实现真核细胞中代谢特异性表达的元件是一些被低氧 ( 如 HIF-α)、 葡萄糖缺 乏、 磷酸浓度或者热休克调节的启动子。
在另一个实施例中, 一个增强子元件能够与启动子序列相连接 . 这样的增强子不 仅仅可以扩增基因, 还可以调节目标基因的表达。 在一个实施方案中, 增强子可以来源于通 常位于多肽编码基因 ( 例如胶原 ) 附近的一段序列, 这种多肽参与了维持或者作用于与美 容相关的细胞。 被应用于哺乳动物表达系统中合适的增强子元件是, 例如, 来源于具有广泛 宿主范围的病毒增强子, 如 SV4 早期基因增强子, 来源于劳斯氏肉瘤病毒 LTR 以及人巨细胞 病毒的增强子 / 启动子。
此外, 还有那些能够包含在启动子序列里面合适的增强子, 这些增强子只有在诱 导物存在时才能够被激活, 比如本领域已知的激素、 金属离子或者酶的底物。
在本发明的另一个实施例中, 一段转录终止序列被放在目标基因编码序列翻译终 止密码子的 3’ 端 . 因此, 这段终止序列和启动子分别位于编码基因的两侧。
表达载体可能还包括一个复制起始位点从而使其作为一个复制子, 进行大量的复 制且在宿主中稳定存在。 这样的复制起始位点包括那些能够使表达载体在胞内合适蛋白存 在的条件下进行大量复制的序列, 例如 2μ 和自主复制序列能在酵母中发挥作用, SV40 中 重要 T- 抗原的复制起始位点能在 COS-7 中发挥作用。哺乳动物复制系统可能包括一些来 源于动物病毒的序列, 需要反式作用因子才能进行复制。 例如, 乳头多瘤空泡病毒的复制系 统如 SV40, 在适量的重要 T- 抗原存在的条件下能够大量复制乳头多瘤空泡病毒, 或者也利 用那些来源于牛乳头瘤病毒和巴尔病毒的序列。
在某些情况下, 表达载体可能不止一个复制系统, 从而使其能够在哺乳动物中表 达以及在原核宿主中克隆和扩增 ( 参考美国专利 No.5,677,278)。
在一个实施例中, 表达载体能够作为整合载体被整合到宿主基因组上。此处的整合载体至少包含了一段多聚核苷酸序列, 这段序列与宿主基因组同源从而使得载体能够整 合。例如, 在一个实施例中, 利用了噬菌体或者转座子插入序列。本技术的最佳实施方式 如文献中描述 ( 例如, Branski 等, 2006, Gene Therapy, 2006, 1-10 ; 和 Hengge, 2006, Gene Therapy, 13 : 155-1563)。
在本发明的某些实施方案中, 表达载体还可能包含一个或者多个选择标记, 从而 能够选择转化成功的宿主细胞。能够在宿主细胞中表达的选择标记包括一些能够使宿主 细胞具有耐药性的基因, 例如衣霉素、 G418、 氨苄青霉素、 氯霉素、 红霉素、 卡那霉素 ( 新霉 素 )、 四环素。 选择标记还可以是一些生物合成基因, 比如那些参与组氨酸、 色氨酸以及亮氨 酸生物合成途径的基因, 如 ade2、 his4、 Ieu2、 trpl, 或者是一些能够使得宿主细胞在毒性化 合物中 ( 如金属 ) 生长的基因。
因此, 在一个实施方案中, 本发明包括了一种产生多聚核苷酸的方法, 这种多聚核 苷酸编码至少一种维持细胞具有美容功能的核酸或者多肽, 使得这种核酸或多肽能够在具 有美容功能的细胞中表达从而增强和 / 或维持对美容有积极作用的生理和 / 或生化过程。 这种方法还包括在表达重组载体中插入一段多聚核苷酸。 因此, 在某些实施方案中, 本发明 包括了一种由多聚核苷酸组成的表达载体, 这段多聚核苷酸编码至少一种维持细胞具有美 容功能的核酸或者多肽。 同样地, 在某些实施方案中, 本发明包括了转染了这种载体的宿主 细胞。
例如, 这种方法还包括将 DNA 构建体整合到表达载体上。这种方法可能进一步包 括将本发明的表达载体转染到细胞中。因此, 在一个实施方案中, 本发明包括转染了本发 明表达载体的细胞。例如, 可以构建表达参与维持细胞具有美容功能的多肽的质粒。表达 盒式序列可以被插入到表达载体如 pcDNA3.1 上或者利用标准重组技术构建的表达载体 (Invitrogen, CA)。
如本技术领域所知, 这样的核酸构建体可以通过突变进行修饰, 例如, 通过包含了 突变位点的引物来 PCR 扩增核酸模板。通过这种方式, 可以设计包含了不同水平生物活性 的多肽。在另一个实施方案中, 突变序列可能与原始 DNA 具有 70%、 75%、 80%、 85%、 90% 或者更高的同源性。这样的话, 突变体可能包括了能在严格条件下杂交的核酸序列 ( 例如 在 1mol 盐浓度, 低于 DNA 双链的溶解温度 (Tm 值 )20-27℃的条件下。
同样地, 这种方法还包括将表达载体转染到宿主细胞中。 在某些实施方案中, 本发 明的多肽能够在哺乳动物表达系统中表达, 包括将表达构建体利用病毒如逆转录病毒或者 腺病毒转入到哺乳动物细胞中的系统。 适合作为表达宿主的哺乳动物细胞系是本技术领域 公知的, 包括很多合适的来自美国典型培养物中心 (ATCC) 的永生细胞系。特别包括了中国 仓鼠卵巢细胞系 (CHO)、 NSO、 SP2 细胞、 HeLa 细胞、 幼地鼠肾细胞 (BHK)、 猴肾细胞 (COS)、 人 肝癌细胞 (Hep G2)、 A549 细胞以及许多其他细胞系。细胞系的选择取决于在哪一种细胞系 中多肽能够高水平表达。也可能利用到昆虫细胞系, 如 SF9 细胞。还有可能利用到植物宿 主细胞, 如烟草、 拟南芥、 浮萍、 玉米、 小麦、 马铃薯等等。 微生物宿主细胞包括大肠杆菌和链 霉菌属。酵母宿主细胞包括粟酒裂殖酵母、 酿酒酵母和毕氏酵母。
当编码目的基因的重组表达载体被导入到哺乳宿主动物细胞中, 通过培养宿主细 胞足够的时间本发明涉及的多肽就能在宿主细胞内表达, 或者分泌到细胞培养液上清中。 表达的多肽可以通过标准的蛋白纯化方法从培养液中回收。编码本发明涉及的多肽的核酸分子和含有这些核酸分子的表达载体可以用于在 合适的哺乳动物细胞、 植物细胞、 细菌和酵母细胞中转染。
可以通过已知的任何一种转化方法将多聚核苷酸导入到宿主细胞中。 在本技术领 域将异源多核苷酸导入到哺乳动物细胞中的方法是已知的, 包括葡聚糖介导的转染、 磷酸 钙沉淀、 聚凝胺介导的转染、 原生质体融合、 电穿孔、 脂质体包裹以及将 DNA 直接微注射到 核里。另外, 也可以通过病毒载体把核酸分子导入到哺乳动物细胞中。在本技术领域, 转化 植物细胞的方法也是已知的, 包括土壤杆菌介导的转化、 基因枪转化、 直接注射、 电穿孔和 病毒转化。转化细菌和酵母细胞的方法也是已知的。
表达载体也可以通过 DNA 基因枪的方法导入到表达系统里, 在该方法中将质粒沉 淀到微颗粒上, 最好是金颗粒, 然后微颗粒被推进目的细胞或表达系统中。DNA 基因枪技术 和手段已经得到广泛应用, 如一种 “基因枪” 已经被商业应用于将微颗粒导入到细胞 ( 例 如, Helios Gene Gun, Bio-Rad Labs., Hercules, CA) 和皮肤中 (PMED Device, PowderMed Ltd., Oxford, UK)。
本发明涉及的多肽在生产细胞系中的表达量可以通过一些已知技术得到提高。 例 如, 谷氨酰胺合成酶基因表达系统 (GS 系统 ) 和抗新霉素细胞质表达系统是在一定条件下 提高表达量的常用方法。 当本发明涉及的多肽用不同细胞系表达时, 它们会有不同的糖基化方式。 然而, 这 里所描述的核酸分子编码的多肽, 或组成的氨基酸序列, 都是立即产物, 不考虑其糖基化
在一种实施方案中, 重组 DNA 载体可以转染到中国仓鼠卵细胞中, 得到最优表达。 在另一种实施方案中, 细胞可产生的蛋白浓度为 0.1-20 克每升, 或 0,5-10 克每升、 1-5 克 每升, 或 1-2 克每升。例如, 重组载体可以稳定转染到中国仓鼠卵细胞 (CHO) 中, 其中表达 有维持美容功效的多肽的细胞被筛选和克隆出来。在一种实施方案中, 可通过加入抗生素 G418 筛选有新霉素抗性的表达重组质粒的细胞。通过 Western Blot 检测细胞上清液得到 的高表达重组蛋白的单克隆可被挑选出来和扩增, 基因产物可通过蛋白 A 亲和层析纯化。
把编码与皮肤维持和 / 或治疗有关的多核苷酸或多肽的重组载体转移到有美容 功能效的细胞中
很多方法都可以用于转移编码有美容功效的多肽的多聚核苷酸, 从而增强或维持 对皮肤有益的生化或生理过程。因此, 本发明的配方含有帮助蛋白进入细胞的特殊成分。
为了通过转染、 转化或感染等手段使核酸进入到真核或原核细胞中, 核酸可以被 整合到质粒中, 作为病毒载体或非病毒载体的一部分。 合适的病毒载体包括杆状病毒、 牛痘 腺依赖 病毒、 慢病毒 ( 参考 Siprashvili 和 Khavari, MoI Ther., 2004, 9, 93-100)、 腺病毒、 病毒和疱疹病毒。 有基因治疗功效的载体是病毒载体, 例如腺病毒载体和逆转录病毒载体。 真核表达载体也适用于单独的基因治疗, 因为裸 DNA 可以在局部敷用中穿透进入有美容功 效的细胞中 (Hengge et al, 1996, J.Clin.Invest., 97, 2911-6 ; Yu et al, 1999, J.Invest. Dermatol, 112, 370-5)。 另一种基因治疗载体可通过把上述核酸做成金颗粒得到, 然后用所
谓的基因枪注射到组织中 (Wang et ah, 1999, J.Invest.Dermatol, 112, 775-81, 以用到的基因转染方法会在下文更详细地说明。
裸 DNA39vaget al, 1998, J.Invest.Dermatol, 111, 183-8), 最好使皮肤中, 或者细胞中。一些本发明可CN 102471769 A
说明书37/71 页在一个实施方案中, 编码至少一个参与维持具有美容功能的细胞从而增强和 / 或 维持对美容有积极作用的生化和 / 或生理过程的核酸或多肽的多核苷酸重组体被直接注 射入具有美容功能的细胞中, 称之为裸 DNA。且在局部施用后, 寡核苷酸 ( 例如, 编码 RNAi) 能被有效的转入表皮的各个细胞层。
在某些的实施方案中, 这些 DNA 和水或者缓冲液一起使用。或者, 也可以利用在 此被详细描述过的脂质体。并且, 在某些的实施方案中, 皮肤可能被磨损了, 通过移除一部 分毛发 ( 如剥离 ), 或者刷掉, 或者利用本技术领域已知的其他方法。(Choi et al, Skin Pharmacol.Appl Skin Physiol., 2003, 16 : 271-282 ; Choi 等, Current Drug Delivery, 2006, 3: 37-45).
在其他实施方案中, 可能用到包含了与 DNA 连接的多肽的基因载运系统。在另一 个实施方案中, 载体 ( 称之为 “裸” 表达载体 ) 会被传入到生物相容的基质中, 如胶原基质 (Goldstein 和 Banadio, U.S.Pat.No.5,962,427)。
一 些 研 究 报 道 说, 裸 质 粒 DNA 能 够 成 功 地 经 皮 肤 传 送 (Fan 等, 1999, Nature Biotech., 17 : 870-872 ; Yu 等, 1999, J.Invest.Dermatol., 112 : 370-375 ; Kang 等, 2004, J.Gene Med., 6: 1238-1246)。例如, 据报道, 磷酸盐缓冲液 (PBS) 中的 DNA 局部施用后, 产 生了抗细菌 β- 半乳糖苷酶的抗体, 表明了裸质粒 DNA 可以经皮肤传送 (Fan 等 (1999)。利 用具有毛囊和不具有毛囊的小鼠进行传送对比, Fan 等人 (1999) 发现这种传送是通过毛囊 的。但是, 也有其他报道称, 裸质粒 DNA 的转运导致了报告基因不仅在毛囊中表达也在上 皮细胞中的角质细胞内表达 (Yu 等, 1999)。也有论证表明, 300μg 质粒 DNA 局部施用 2 小 时后, 导致每克组织转运了大约 1,000ng 的质粒 DNA, 施用 24 小时后每克组织转运了大约 100ng 的质粒 DNA, 局部施用的一天后 mRNA 就开始表达 (Kang 等, 2004)。
早期的研究表明, 质粒 DNA 可能会通过缺损的系统 ( 这些缺损是在适当条件下暂 时形成的孔道 ) 渗透进入角质层 (Menon 和 Elias, 1997, Skin Pharmacol, 10 : 235-246)。 也有论证表明, 被极性脂类环绕的水合区域构成的孔道也可能促进了细胞间极性物质的转 移 (Sznitowska 等, 1998, J.Pharm.ScL, 87 : 1109-1114)。 并 且, 近 期 研 究 表 明, 质 粒 DNA 在胞内主要由角质细胞通过吞噬作用摄取, 还涉及到与 DNA 连接的埃兹蛋白和膜突蛋白 (Basner-Tschakarjan 等, 2004, Gene Therapy 11 : 765-774)。
裸质粒 DNA 的安全性和扩散性已得到广泛的评价 ( 如, Hengge UR, Vol-Platzer B(eds), The Skin and Gene Therapy.Springer-Verlag : Berlin, 2001, pp.67-80)。与病 毒载体转运 DNA 不同, 裸质粒 cDNA 不会引起不良的免疫应答, 也不会导致插入突变, 且能保 持启动子的功能。潜在的担忧在于质粒 DN 会 A 从靶点向其他组织和器官迁移, 然而, 报道 称在任何时间点都不能检测到质粒 DNA 整合进入了宿主 DNA, 并且质粒 cDNA 的表达时间很 短暂, 以至于处理 11 天之后, 表达的 RNA 只在被处理过的皮肤中发现, 除此之外的任何其他 组织中都未发现 (Hengge 等, 1995, Nat.Genet, 10 : 161-166)。据猜测, 质粒 DNA 的遗失是由 于组织核酸酶的降解以及表皮再生引起的。由于质粒 DNA 表达的短暂性以及质粒 DNA 的快 速降解, 因此皮肤的基因疗法被认为是安全的。
脂质体和微囊体介导的转移
例如, 在其他的实施方案中, 脂质体和 / 或微囊体被用于促进多聚核苷酸的转 移, 多聚核苷酸编码参与维持具有美容功能的细胞具有从而增强和 / 或维持对美容有积极作用的生化和 / 或生理过程的多肽, 脂质体是由人工构建的、 含有双层磷脂的小囊泡 (Jeschke, M.G. et al, Gene Ther., 12, 1718-24(2005) ; 美国专利 No.6,576,618)。微囊体 是非常小的脂质体, 但是其制作方法本质上与脂质体相同。
核酸、 蛋白质和其他生物物质能够被包含在脂质体和 / 或微囊体中, 通过质膜融 合的方式被运输进入哺乳细胞中。脂质体和 / 微囊体是引人注目的运载系统, 因为它们是 无病毒的、 稳定的, 并且能够与细胞膜相互作用。利用脂质体和 / 或微囊体直接施用到皮肤 上, 可以把脂质双分子层中包含的物质通过质膜融合的方式导入具有美容功能的细胞中。 传送的方式可以是内吞作用也可以是膜泡运输途径。例如, 脂质体和 / 或微囊体能够皮下 注射转染真皮中的细胞, 导致皮肤注射位点的蛋白表达。也可以先用空脂质体和 / 或空微 囊体对皮肤进行预处理, 然后再用含裸 DNA 的脂质体处理。
脂 质 体 和 / 或 微 囊 体 由 阳 离 子、 阴 离 子、 中 性 脂 质 和 混 合 物 构 成 (Luo, D.& Saltzman, W.M., Nat.Biotech., 18, 33-37(1999)。为了转移 DNA, 脂质分子可以通过化学修 饰使其包含化学基团从而促进 DNA 的压缩或释放。阳离子脂质, 例如季铵盐洗涤剂、 胆固 醇和甘油二酯阳离子衍生物、 聚胺类脂质衍生物, 更有利于细胞转染, 因为它们降低了 DNA 的净负电荷并且增强了其同细胞膜的相互作用 (Nishikawa, M.&Huang, L., 2001, Hum.Gene Ther., 12, 861-70 ; Badea J.Biol.Gene Medi 2005, 7: 1200-1214)。也可以使用包括 1, 2, 3- 三甲基丙烷磷脂酰乙醇胺在内的其他脂质体。
中性脂质, 例如磷脂酰乙醇胺 (DOPE)、 甘油月桂酸、 聚氧乙烯 -10- 硬脂 (POE-10)、 胆固醇, 可以作为辅助性脂类加入到阳离子脂质 DNA 复合物中, 从而在细胞通过内吞作用 摄取复合物后, 促进 DNA 从内吞体中释放出来。也应该充分利用能促进 DNA 转移的辅助 物, 例如可以连接到 DNA 上的聚合物、 蛋白质或者促进 DNA 更有效地转入细胞核中的合成 肽 -DNA 分子 ( 参考 Niidome, T.& Huang, L., Gene Ther., 9, 1647-52(2002))。这样, 由于 阳离子聚合物 ( 例如聚赖氨酸或鱼精蛋白 ) 能够引起 DNA 紧密压缩, 从而防止复合物聚合 以及核酸酶的降解作用, 所以阳离子聚合物可以被应用于脂质 -DNA 复合物中。例如在混合 质粒 DNA 之前, 先将 1, 2, 3- 三甲基丙烷磷脂酰乙醇胺 (DOTAP) 与带有硫酸鱼精蛋白的脂质 体混合, 然后产生稳定的 135nm 的小颗粒, 可以导致基因在各个组织中高水平的表达 ( 如, lung., liver, heart)(Li, S.et al, Gene Ther., 5, 930-37(1998))。 加入作为辅助性脂质的 胆固醇, 可以增强脂质 - 肽 -DNA 复合物的转染效率。并且, 在添加阳离子脂质 ( 脂质体 RPR 115335 或 RPR 120535) 或者聚合物 ( 聚乙烯亚胺 ) 之前, 预先将荧光素酶基因或 β- 半乳 糖苷酶基因与来源于人组蛋白或鱼精蛋白的短肽紧密连接, 即使在血清存在的情况下, 也 可以增强转染效率。
正如本技术领域所知, 脂质体可以通过加热脂质从而形成脂质相的方式来制作 (Wu, H.et al, Int.J.Pharmaceut, 221, 23-24(2001))。随后, 在冷却条件下, 通过注射器来 回推动, 将包含有水、 盐、 缓冲液的水相与脂质相混合。 其后, 通过声波降解法直至最终形成 直径在 100-140nm 的脂质体。然后通过倒置混合, DNA 或蛋白质 ( 溶液 ) 可以被加入到脂 质体中。这样制备的脂质体可以直接应用或注射到皮肤内。制作脂质体所要用到的脂质种 类和比例、 DNA 的浓度、 以及加到皮肤上的脂质体的量, 需要根据经验来判断最终实现最优 化。促进 DNA 转移的辅助物, 例如多肽, 可以在加入脂质体混合物之前, 与 DNA 混合 ; 但是, DNA 辅助物必须维持高度的水溶性, 从而被密封在脂质体脂质相的外部。另外, 通过对包含有阳离子脂质以及 DOTMA 或磷脂酰乙醇胺 (DPOE) 的悬浮脂质体 进行超声处理可以制备小的单层囊泡, 例如细胞转染剂 GS2888。倒置混匀之后, DNA 或蛋白 质将通过离子键连接到脂质体的表面, 按照可以维持复合物表面净正电荷的比率, 此时 DNA 将 100%混入脂质体中。 而且, 阳离子巯基洗涤剂也可以被用于制备转运 DNA 的脂质体 ( 例 如参见, Dauty, E.et al, J.Am.Chem.Soc, 123, 9227-34(2001))。一旦被氧化, 脂质中的巯 基就会转变成二硫化物, 促进 DNA- 脂质复合物形成稳定的纳米级小颗粒, 这些小颗粒会以 静电的形式连接到细胞表面, 阴离子肝素硫酸蛋白多糖会促使细胞对其的摄取。小尺寸的 纳米粒子和脂双层结构均会促进 DNA 转入具有美容功能的细胞中。一旦进入细胞, 细胞内 谷胱甘肽所提供的还原性环境会将二硫化物转化为硫醇并释放 DNA。
油包水和水包油的纳米乳剂介导的转移
在另一个实施例中, 油包水和 / 或水包油的纳米乳剂可以被用来转移多核苷酸或 多肽, 这些多核苷酸或多肽可以用来维持具有美容功能的细胞, 进而增强和 / 或维持对细 胞美容功能具有积极作用的生理生化过程。水包油和 / 或油包水的纳米乳剂是由水、 油和 表面活性剂构成的热力学稳定的液态均质分散体系, 构成了将 DNA 或蛋白质 ( 或其它生物 分子 ) 转入细胞中的技术 (Wu, H.et al, Int.J.Pharmaceut, 221, 23-24(2001) ; 同时参考美 国专利 Nos.5,753,241, 6,274,150, 6,335,022, 6,464,990, 6,541, 018, 以及 6,689,371)。
利用具有生物学安全的成分, 例如聚氧乙烯 - 失水山梨醇单油酸酯 ( 吐温 80)、 失水山梨醇单油酸酯和橄榄油, 可以使人体试验中对人体刺激的风险降到最低。在这些成 分精确的化学计量比率下, 缓慢加热以及轻轻混匀, 纳米粒子会开始自发形成。 这样就不需 要高剪切力的作用, 从而消除了对被转运的生物分子明显的物理损伤。这项技术已经实现 了规模化, 可以封装大量的水相物质。 纳米乳剂可以直接应用于皮肤, 从而实现将生物分子 导入具有美容功能的细胞中。例如, 氯霉素乙酰转移酶和人干扰素 -α2 的 cDNA 已成功实 现了对离体小鼠表皮的转染, 其中, DNA 沉积物主要进入了滤泡角质细胞 (Wu et al, 2001)。 单次施用以后, 转基因表达量在 24h 达到最大, 且多次施用后, 转基因表达水平显著提高。 也可以用相似的方式使用包含有乙醇 - 氟碳的微乳状液。
颗粒介导的转移
在 另 一 实 施 方 案 中, 转 运 方 法 包 括 颗 粒 介 导 的 转 移 ( 例 如 参 见, Nishikawa, M.&Huang, L., Hum.Gene Ther., 12, 861-70(2001) ; Luo, D.&Saltzman, W.M., Nat.Biotech, 18, 33-37(1999))。例如, 由金粒子或钨粒子等金属粒子包被的 DNA 颗粒 (1-5μm), 能够 被 “基因枪” 加速到极高的速度, 从而穿透细胞膜 (Williams, R.S.et al, Proc.Nat.Acad. Sci.U.S.A., 88, 2726-30(1991))。通过将微粒子在溶液中与 DNA 溶液、 氯化钙和亚精胺自 由基循环混匀, 微粒子表面可被包被上 DNA。将经由酒精淋洗后的颗粒涂抹到基因枪的涂 药器上, 待颗粒干燥、 酒精挥发后, 基因枪就可以将颗粒射入具有美容功能的细胞中, 从而 增强和维持对细胞美容功能有积极影响的生理生化过程。 这项技术可以将一种生物分子同 时导入多个细胞中, 并且将生物分子经由细胞膜直接导入细胞质甚至细胞核中, 因此可以 避免体内潜在的酶解反应。另外, 在一个实施方案中, 这项技术只能实现颗粒对细胞层较 浅部位的渗透作用, 因此可有效地用于被运输进入表皮的 DNA 的局部表达。基因枪的颗粒 轰击会造成轻微的细胞损伤以及炎症。例如, Oshikawa 等人使用氦脉冲 PowderJect XR 基 因传送装置, 将内部包被着白细胞杀菌素的 12 个基因 DNA 的金颗粒射入小鼠表皮中, 或者覆盖在肿瘤位点上, 或者与肿瘤位点有较远距离 (Oshikawa, K.et al, Hum.Gene Ther., 12, 149-60(2001))。结果发现, 覆盖在肿瘤位点上的转染细胞可以有效地抑制肿瘤的生长, 但 是如果不考虑转染位点的话, 这种疗法具有抗癌细胞转移效果 (Oshikawa 等, 2001)。类似 的方法也得到了成功的应用, 在人 β- 肌动蛋白启动子的控制下, 编码荧光素酶的基因 DNA 可以有效转染小鼠表皮, 基因枪轰击区域 10-20 %细胞会表达转入的基因 (Williams 等, 1991)。
电压驱动的转移
还可以使用其他的转移方法, 例如电穿孔法、 离子电渗法等 ( 参考 Banga, A.K.et al, Int.J.PharmaceuL, 179, 1-19(1999) ; Banga AJ.&Prausnitz, M.R., TIBTech, 16, 408, 12(1998) ; Andre, F.&Mir, L.M., Gene Ther., 11, S33-42(2004))。在这些方法中, 当 DNA 已 被注射进入表皮或者敷在表皮上时, 电流可以促进 DNA 转入细胞中, 在高离子强度的介质 中效果更好。由于皮肤易于处理, 所以是应用这些技术的最佳组织。使用这些技术时必须 充分考虑 DNA 的剂量、 电极形状 ( 如针状、 钳状 ) 和数量、 电场强度和持续时间。处理后的 细胞的渗透性逐渐降低, 这表明这些技术对细胞所造成的损伤均是可逆的。 另外, 由于受到 电流的作用, 这些技术可以实现在低刺激的条件下达到 DNA 高水平转移的目的。
电穿孔
电穿孔涉及到使用非常短促的高电压 ( 通常应大于 100V), 电脉冲会使细胞膜 暂时通透, 促使细胞对大分子的摄取 ( 参考 Nishikawa, M.&Huang, L., Hum.Gene Ther., 12, 861-70(2001))。电流会使细胞膜形成通透孔, DNA 和蛋白质会通过该孔顺浓度梯度进 入细胞内, 从而, 促进或维持在注射和 / 或施用后对生物分子的摄取。这项技术已被用于 活体表皮转染 : 通过皮内注射, 将编码报告基因的质粒注射进入猪或小鼠的表皮, 然后用 PulseAgile 电穿孔设备和软件给予电脉冲。 (CytoPulse Sciences, Hanover, MD)(Drabick, JJ et al, Molec.Ther., 3, 249-55(2000)). 转染细胞主要位于真皮中, 包括脂肪细胞、 成纤 维细胞和内皮细胞及其他细胞中。
离子导入
离子导入涉及到低压电脉冲的使用 ( 通常为 10V 或更小 ), 这种电脉冲通常是 高频脉冲或持续的恒定脉冲 ( 通常 0.5mA/cm3 或更小 ), 进而促进带电分子进入表皮 (Nishikawa, M.&Huang, L., Hum.Gem Ther., 12, 861-70(2001))。具有与极性分子相同的 电荷的电极可以驱动带电分子进入皮肤。例如, 带有负电荷的阳极可用来驱动带负电荷的 DNA 分子。电极通常非常小, 可以被纳入到基质中, 基质可以应用于施用过 DNA 溶液的表皮 (Mikszta, J.A.et al, Nat.Med., 8, 415-19(2002))。 除了使用包括汗腺在内的原有路径外, 该技术与电穿孔类似, 在表皮上形成了新的孔道来实现转移。 与电穿孔相比, 该技术更适用 于人体。被转运的 DNA 与施用于表皮上的电流和基质大小成正比。因此, 用量易于调节, 并且可以根据病人的需要进行优化。另外, 由于离子导入法是一种驱动型的转移, 所以与 其他药物驱动系统相比, 它对其他生物变量的依赖较小, 例如膜渗透活细胞内组件 (Banga, A.K.et al, Int.J.Pharmaceut., 179, 1-19(1999))。在一个实施方案中, micorenhancer 芯 片可以利用裸露的荧光素酶基因 DNA, 对 BALB/c 小鼠的具有美容功能的细胞进行转染, 与 局部施用相比, 该过程具有更显著的转基因活性 ( 增强了 2800 倍 )(Mikszta, J.A.et al, 2002)。电整合
电整合是对离子电渗法和电泳的一种改进, 使用这种方法, 电脉冲会造成皮肤 上层细胞的破裂, 从而使包装在囊泡或颗粒 ( 例如微球体和金颗粒 ) 中的分子被转移进 入表皮。电极可直接设置在目标位置, 且颗粒直接施用于皮肤上。表皮上层细胞的破裂 后, 双向电泳和 / 或压力驱动粒子进入表皮 (zhang 等 Bioelectrochem.Bioenerg., 42, 283-92(1997))。此外, 也可使用压力介导的电整合技术。
射频消融介导的转移
此外, 在一个实施方案中, DNA 和 / 或蛋白质的转移方法还包括射频消融介导的转 移。通过射频消融技术能在具有美容功能的细胞上形成微通道或瞬间微通道 (Birchall, J.et al, Int.J.Pharmaceut, 312, 15-23(2006))。 这些通路足够大, 具有足够的形态和深度 来转运直径达到 100nm 的纳米粒子。在另一个实施方案中, DNA 和 / 或蛋白质的转移方法 TM 还包括超声介导的转移, 或称为超声渗透法。ViaDerm 是一种可以通过射频消融形成微通 道来实现 DNA 的转移仪器。该仪器在总面积为 1.4cm2、 电极密度为 100/cm2 的范围内, 具有 一个电极控制单元和一个可支配的不锈钢电极阵列。通过施加 290V 或 330V 以及 1-5 次射 频频率为 100kHz、 持续时间为 700μs 的电压, 微通道就会形成。在将 DNA 施加到表皮上以 前, 以及施加过以后, 对表皮作如是处理, 可以增强转移的效果。例如, 具有 β- 半乳糖苷酶 TM 基因或绿色荧光蛋白报告基因的质粒 DNA, 可以经由 ViaDerm 这种仪器来转染离体的人皮 肤 (Birchall et al, 2006)。
超声波
超 声 波 可 以 增 加 细 胞 膜 对 大 分 子 比 如 DNA 的 通 透 性 ( 参 考, Newman, CM., et al, Echocardiography, 18, 339-47(2001) ; Niidome, T.&Huang, L., Gene Ther., 9, 1647-52(2002))。例如, 将 DNA 注射进入皮肤后, 超声波照射可以促进 DNA 进入细胞。由于 这项技术具有灵活性和安全性的特征, 通常可用于人体, 尤其是肌肉组织。 与微泡或超声造 影剂结合的超声技术, 例如充满全氟丙烷的白蛋白微泡, 可以通过超声能量降低细胞空心 化的极限值 (Teupe, C.et al, Circulation, 105, 1104-09(2002))。例如, 利用超声介导的 对运载质粒的白蛋白微泡进行破坏的方法, 将编码激活型一氧化氮合酶 (eNOS) 的 DNA 转染 猪的冠状动脉, 导致蛋白的表达量显著提高, 增强的一氧化二氮导致被缓激肽刺激的动脉 舒缓 (Teupe 等, 2002)。
促进基因的长期表达的组织特异性、 自我复制和整合质粒表达系统
在一个实施方案中, 使用的 DNA 转移方法可能包括自我复制和整合型质粒表达系 统 ( 参考 Newman, CM., et al, Echocardiography, 18, 339-47(2001) ; Niidome, T.&Huang, L., Gene Ther., 9, 1647-52(2002))。 并且, 在某些实施方案中, 整合还可能具有组织或细胞 类型特异性。 因此, 至少这里探讨的某些技术是暂时的, 并且不是针对生物学上某些特定类 型的细胞。
在一个实施方案中, 可以通过如下方式来实现组织特异性转运 : 将蛋白质或肽配 体合并到 DNA 复合物中, 从而促进受体介导的靶细胞表面表达特定的受体。另外, DNA 元 件可以被包含在被转入细胞的 DNA 中, 以至于编码基因只能在含有相应的蛋白因子的细胞 中表达。例如, 可以将组织特异性的转录因子结合位点或启动子包含在被转移的 DNA 分子 中。这项技术已被成功用于将质粒 DNA 转染活体小鼠肝脏, 该质粒 DNA 具有人因子 EX 微基因序列, 该序列包含第一个内含子和 3’ 非翻译区的一部分, 在肝脏载脂蛋白 E 位点控制区 和 α- 抗胰蛋白酶启动子的控制之下, 且利用了牛生长激素 polyA 信号 (Miao, CH. 等, MoI. Ther., 1, 522-32(2000))。 除了基因序列自身以外, 这些遗传元件使得基因在持续十个月的 治疗范围内其表达水平的提高。
在其他的实施方案中, 可以通过将能自我复制的 DNA 分子转入靶细胞中的方 式 来 实 现 被 转 入 基 因 长 时 间 的 持 续 表 达 (Shirakata M.&Hirai, K., J.Biochem., 123, 175-81(1998))。 例如, DNA 质粒可通过巴尔病毒提供的系统来维持自身的游离状态, 并随着 细胞代代遗传下去 (Shirakata M.&Hirai, K., J.Biochem., 123, 175-81(1998))。该系统需 要被转移的 DNA 含有巴尔病毒核心抗原 1(EBNA1) 编码序列和 oriP DNA 元件, 这样在被转入 细胞中后, EBNA1 蛋白的表达可以促使被转入的 DNA 的复制以及与基因组 DNA 结合。 为了使 目标蛋白在皮肤中长期持续表达, 被转入的 DNA 需要被引入基底细胞中。例如, 该系统在体 外用于自杀基因疗法, 在体内用编码 EBV 病毒元件的质粒和 1 型单纯性疱疹病毒基因来增 加细胞对化学疗法药物 ganciclovir 的敏感性 (Maruyama-Tabata, H.et ah, Gene Ther., 7, 53-60(2000))。并且, 将可编码 β2- 肾上腺素受体和携带有 EBV 元件的质粒 DNA 导入仓 鼠心室肌中, 可以实现 β2- 肾上腺素受体的长期表达 (Tomiyasu, K.et a Gene Ther., 7, 2087-93(2000))。
如果被转入的质粒 DNA 被整合进了皮肤基底细胞或其他具有美容功能的细胞染 色体 DNA 中, 它就可以在细胞分裂时被传递给子细胞, 这样就可以使相应的蛋白进行持续 表达。将转入的 DNA 整合到染色体 DNA 中需要使用到一种酶, 这种酶可以切割染色体 DNA, 从而使被转入 DNA 插进去。一种有效的将 DNA 插入到具有美容功能的细胞基因组中的方法 是使用转座子, 例如 “睡美人” (SB) 转座系统。因此, 在一个实施方案中, 转座子可以实现 特定构建体从供体质粒向哺乳动物基因组的精确转移 ( 参考 Hackett, P.B., et ah, Adv.in Genet, 54, 189-232(2005), 同时参考美国专利 No.6,489,458))。 以转座子为基础的方法中, 除了携带可以编码维持具有美容功能的细胞的核酸或多肽的 DNA 外, 被转入的 DNA 还包含 有转座酶编码序列或者转座酶 mRNA。例如, SB 转座系统是由约有 340 个碱基对的两个终端 重复序列组成的, 它可以介导外源性核苷酸序列近乎随机地插入基因组的 TA 碱基对中 ( 虽 然两侧的 DNA 序列可能会影响特定位点整合的几率 )。SB 转座子系统已经被用于模拟人体 疾病的小鼠疾病的研究中, 并且使得激活体细胞癌基因的 NARS 基因被整合到小鼠肝细胞 DNA 中 (Carelson et al, Proc.Nat.Acad.ScL U.S.A., 102, 17059-64(2005))。
在另一个实施方案中, 可通过噬菌体整合酶实现基因组的整合 (reviewed in Groth, A.C.&Calos, M.P., J.Biol.Chem., 335(3), 667-678(2004))。例如, 噬菌体整合酶 可用于介导两个不同的、 相对较短序列的高效特异性重组。因此, 发现丝氨酸催化家族的 ΦC31 整合酶在人细胞中可以高效地调节识别位点的整合, 以及调节与这些位点具有部分 同源性的宿主染色体序列的整合。
制剂
在某些实施例中, 多聚核苷酸编码至少一个维持细胞美容功能以而增强和 / 或 维持对美容具有积极效果的生理生化反应的核酸或多肽, 该多聚核苷酸可与药物相容的 载体相混合, 从而产生治疗用的化合物, 该化合物可用于具有美容功能的细胞的治疗。对 于用到本发明的各种方法和成分的大量阐述都在美国专利出版号为 No.2006/0058256 和No.2006/0025363 中被描述过, 这两篇专利的全文均被包含在本文的参考文献中。
在一个实施方案中, 本发明的组成包括一个局部给药制剂。该制剂由溶解或悬浮 在媒介中的物质组成, 如凝胶、 洗涤剂、 乳液, 悬浮物或载体还可能包括矿物油、 石油、 酒精 或者药物处方的其他基础成分。任何其他合适的配方均可用于转运这些化合物, 这些化合 物可能包括本技术领域中公知的药物佐剂, 就如 Remington′ s 的医药科学所描述的那样 (16 版, 1980)。 在某些实施方案中, 在化合物中加入其他成分, 例如可可油和芦荟, 也是可行 的。
制剂可能包括那些适合于口腔, 直肠, 局部, 鼻, 眼或注射 ( 包括皮下, 肌肉注射和 静脉注射 ) 治疗的药物制剂, 所有的这些都可能作为本发明的给药途径。
制剂可以以剂量方便的形式呈现, 也可以通过药剂技术领域公知的方法制备。制 剂可能通过由一个或多个助剂构成的载体来使活性化合物激活而进入相应组织。 在一般情 况下, 配方是由液体载体或精细分开的固体载体或两者结合将活性化合物带入组织的, 然 后, 如有必要, 将产品包装成所需的制剂。
适合用于注射给药的制剂, 可方便地制成无菌水制备的活性化合物, 最好与受体 的血液等渗。
喷鼻剂制剂可能是包含防腐剂和等渗剂的活性化合物的水溶液。 这种制剂最好调 整其 pH 和等渗状态, 使之与鼻腔粘膜兼容。
直肠给药制剂可能通过一个合适的载体制成栓剂的形式, 如可可脂, 氢化脂肪或 氢化脂肪羧酸。
眼科制剂可通过与喷鼻剂类似的方法来制备, 除了将 pH 和等渗因素调整到最适 用于眼的状态。
本发明的制剂适用于口服给药, 制剂可能是制成为独立单元, 如胶囊, 扁囊, 片或 含片, 每种都包含等同于粉末或颗粒或脂质体或悬浮在水溶液中或非水液体中的预定量, 如糖浆, 酏剂, 乳液或顿服水剂。例如, 药片可任意与一个或多个助剂压缩成型。
压缩药片可在一个合适的机器中压缩形成。 活性化合物以粉末或颗粒等自由流动 的形式通过粘合剂, 崩解剂, 润滑剂, 惰性稀释剂, 表面活性剂或分散剂以任意比例进行混 合。 合适的粉末状活性化合物的混合物及其载体组成的模压片可能会在一个合适的机器成 型。或者, 糖浆可能通过将活性化合物加入到浓缩的糖水溶液, 例如蔗糖, 也可以添加任何 助剂。这种助剂可能包括调味剂, 合适的防腐剂, 延缓糖结晶剂, 增加其他成分溶解度的试 剂, 如多元醇, 甘油或山梨醇。
在实施例中, 参与维持细胞美容功能的编码至少一个核酸或多肽的药剂可能是局 部的。 局部给药制剂可能包含溶解或悬浮在一种或多种媒介的活性化合物, 如矿物油, 凡士 林, 多羟基醇或外用药物制剂中使用的其他基质, 可能还需添加其他助剂。例如, 本发明的 制备形式可能是护肤霜, 面霜, 乳液, 软膏, 或任何其他适于皮肤局部使用的形式 ( 美国专 利 4760096 全部纳入参照 )。 根据其预期用途, 可添加其他成分使其具有适于皮肤的流变性 能。
因此, 在实施例中, 本发明的制剂可能是溶液的形式, 如水溶液, 胶体溶液, 乳化乳 液, 水包油型的霜 ( 亲水膏 ) 或水凝胶, 其中水相是连续相。 另外, 制剂也可能是油性混合物 的形式, 如软膏, 油包水型的面霜, 凝胶质地, 吸收基质或亲水性软膏中, 油相是连续相。此外, 可能会添加非水的水溶性基质, 如聚乙二醇的混合物, 此外, 在具体实施中, 也可以制成 添加了固体分散剂的悬浮基质, 如震动乳液。 可以使用油性成分, 乳化剂, 分散剂, 凝胶剂和 固体材料来制备这些制剂, 它们都是众所周知的化妆品和外用产品中常用的成分。
本技术领域公知的可使用的油性成分可能包括碳氢化合物如液体石蜡, 凡士林, 固体石蜡, 微晶蜡等。此外, 高级脂肪醇, 如十六醇, 十六烷醇, 硬脂醇, 油醇, 酸酯的高脂肪 低醇, 如十四酸异丙酯或十六酸异丙酯, 植物油, 改性植物油, 无水羊毛脂及其衍生物, 角鲨 烯或角鲨烷, 更高级脂肪酸, 如棕榈酸、 硬脂酸。
在一个实施例中, 药剂可使用物理层 ( 如擦皮术和包藏 ), 和 / 或化学渗透 / 渗透 促进剂 ( 二甲基亚砜, 氮酮, 醇, 脂肪酸和萜烯 ), 已经证明渗透增强剂能扰乱或液化角质层 的脂质结构以增加通透性 )。 此外, 本发明的药剂可使用其他增强通透性的方法, 例如, 电整 合, 超声, 改变细胞的同渗容摩, 纳米粒子和任何其他合适的能有效地加强本发明的药剂的 渗透性的技术或方法, 例如, 局部用药。
在一个实施例中, L- 丝氨酸, L- 羟脯氨酸, 或其他可能增强和 / 或有助于增强生长 因子作用的氨基酸, 都可能包括在本发明的药剂中。
在另一个实施例中, 本发明的局部给药制剂可能包含有用的乳化剂和阴离子、 阳 离子、 非离子表面活性剂等分散剂。 非离子表面活性剂可能是首选, 因为它们对皮肤的刺激 性较小。典型的非离子表面活性剂可能包括, 如单硬脂酸甘油酯等单甘酯, 山梨醇等脂肪 醇, 蔗糖脂肪酯, 聚氧乙烯硬脂酸酯等聚氧乙烯脂肪, 十六烷基聚氧乙烯醚等聚乙二醇高等 醚醇, 聚乙二醇醚, 聚乙二醇脂肪酸之类的 ( 美国专利 4760096)。此外, 还可以使用如羧甲 基纤维素, 纤维素胶, 聚乙烯醇, 聚乙二醇和各种树胶等凝胶剂。这些油性成分, 乳化剂, 分 散剂和凝胶剂可单独使用或相互结合使用。此外, 还可使用纳米乳液。
除上述成分外, 本发明的制剂可能还包括一种或多种助剂, 如稀释剂, 缓冲剂, 调 味剂, 粘合剂, 崩解剂, 表面活性剂, 增稠剂, 润滑剂, 防腐剂 ( 包括抗氧化剂 ) 等之类的物 质。
剂量
服用多核苷酸药物, 相当于提供一定量的用于维持和 / 或改进具有美容功能的细 胞的多肽或多核苷酸。对于多肽的局部给药, 在不同的实施例中, 用药的剂量从 1ng/cm2 到 1mg/cm2 组织面积, 或从 10ng/cm2 到 100μg/cm2 组织面积, 或从 100ng/cm2 到 10μg/cm2 组 织面积, 或从 500ng/cm2 到 10μg/cm2 组织面积, 或从 1μg/cm2 到 5μg/cm2 组织面积, 或从 2 2 1μg/cm 到 2μg/cm 组织面积。
或者, 对于全身用药 ( 如腹腔 ) 的剂量范围可能从约 1ng/kg/d 至 100mg/kg/d, 或 从 1mg/kg/d 至 10mg/kg/d, 或从 100ng/kg/d 到 5mg/kg/d, 或从 1μg/kg/d 至 1mg/kg/d, 或 从 100μg/kg/d 到 500μg/kg/d, 或从 10μg/kg/d 到 100μg/kg/d。或者, 在这些范围内都 可以使用。
在不同的给药方案中, 提供的多核苷酸相当于多肽的剂量, 范围从 1ng/cm2 到 1mg/ cm2 组织面积, 或从 10ng/cm2 到 100μg/cm2 组织面积, 或从 100ng/cm2 到 10μg/cm2 组织 面积, 或从 500ng/cm2 到 10μg/cm2 组织面积, 或从约 1μg/cm2 到 5μg/cm2 组织面积, 或从 2 2 10μg/cm 到 2μg/cm 组织面积。或者, 在这些范围内都可以使用。
例如, 载体构造可应用裸 DNA 剂量, 范围从 1ng/cm2 到 1mg/cm2 组织面积, 或从10ng/cm2 到 10mg/cm2 组织面积, 或从 100ng/cm2 到 100μg/cm2 组织面积, 或从 500ng/cm2 到 10μg/cm2 组织面积, 或从 1μg/cm2 到 5μg/cm2 组织面积, 或从 10μg/cm2 到 2μg/cm2 组织 面积。或者, 在这些范围内都可以使用。
这些剂量范围通过在体外和动物中, 在感兴趣的美容细胞中研究得到精确的基因 转染效率来确定。同样地, 可使用本技术领域公知的其他特定的方法来确定其他载体如脂 质体, 超微粒子, 纳米乳液, 颗粒介导传递, 电压驱动传递的剂量范围。
在评估有美容功能的细胞的基因改造的研究时, 质粒可在任何剂量范围给药, 在 具有美容功能的细胞中产生了预期的效果。 例如, 质粒可以合适的制剂通过局部途径给药, 个人剂量范围约从 5 到 2000 微克 / 毫升 (μg/ml), 较好的个人剂量范围是从 50 至 1000 微 克 / 毫升 ; 更好的个人剂量范围约从 100 至 500 微克 / 毫升。有研究表明, 亚治疗的微磨 皮术可用于是提高 KGF-1pDNA 到猪皮的传递速度, 剂量约为 100 到 500μg/ml KGF-1pDNA。 根据一个给药方案, 质粒传递的浓度为 100, 250, 500, 750, 1000, 1500 和 2000 微克 / 毫升 (μg/ml 的 )。
因此, 本发明的实施例考虑到有美容功能的细胞的基因修饰能提高和 / 或维持基 因表达, 这可能会刺激皮肤蛋白的生长, 所以看起来更年轻。在一些实施例中, 本发明的方 法和成分对于目前可用的化妆品增强剂可能有明显的优势, 包括整形外科, 肉毒杆菌 ( 注 射用肉毒毒素 ), 激光换肤, 微磨皮术, 脉冲光治疗, 注射填充剂 / 结缔组织替代, 自体成纤 维细胞注射, 局部皮肤护理产品等其他方法。
比起组织的局部给药, 本发明有一个优势, 本发明的方法和成分能更好的将治疗 性分子定量输送到有美容功能的细胞。
此外, 在某些情况下, 局部使用的复合物, 包括生长因子, 可能会被蛋白酶快速的 消化从而限制了其功效的持续时间, 或刺激免疫原性反应。本发明的实施例可能会刺激有 美容功能的细胞生成, 进而增加细胞本身的蛋白生成, 因此, 有可能会减少蛋白酶激活或免 疫原性反应。
与建议每日两次局部用药以达到改善美观的生长因子蛋白产品不同, 本发明的给 药方案, 可提供每周一次或每月一次剂量 ( 即全面的美容效益不需要每天或每天两次的标 准应用程序 ), 或在干细胞转染时, 一次剂量就可改善外观。恒昼夜化妆品都在提高多肽的 表达。例如质粒编码的角质细胞生长因子 (KGF), 在 7 天内, 比起有表达高峰和低谷期的每 日两次局部用药的 KGF 多肽, 有明显的优势。实际上, 这种方法将皮肤变成一个能持续生产 具有美容功效的多肽的生物反应器。此外, 由于本发明的方法和成分的用药频率比局部治 疗量常常要低一些, 本发明的方法和成分可以消除或降低创伤性, 有时复杂的手术、 注射和 激光 / 光疗法会对皮肤产生损害。本发明通过减少用药频率来改善。
亚治疗的微磨皮术
为确定皮肤蛋白和其他生物分子, 如胶原, 弹性蛋白, 细胞外基质蛋白, 蛋白多糖, 生长因子的表达和 / 或水平是否在皮肤上有整容修复的效果, 并大幅评价完整的细胞的美 容遗传改造后是否有美容功能, 首选使用亚治疗的微磨皮术。
质粒 DNA(pDNA) 的传递通过完整的皮肤利用各种渗透增强术已深入研究, 包括屏 障破坏 ( 如微磨皮术和胶带剥离 ), 脂质体输送系统 ( 如脂质体 ), 和不稳定膜技术, 如电 击 (Choi MJ 和 Maibach HI.Topical Vaccination of DNA Antigens : Topical Deliveryof DNA Antigens.Skin Pharmacol.Appl.Skin Physiol.2003 ; 16 : 271-282)。高分子量质 粒 DNA, 需要渗透到最上面的角质层以达到可行的角质细胞。用胶带剥离和创面电灼术物 理击穿角质层以提高大分子及质粒 DNA 穿过动物皮肤的传递速度 (Yu WH, Kashani-Sabet M, Liggitt D, Moore D, Heath TD, Debs RJ.Topical gene delivery to murine skin.J Invest Dermatol 1999 ; 112 : 370-375)。
Lee 等人 (Microdermabrasion as a novel tool to enhance drug delivery via the skin : an animal study.Dermatol Surg.2006Aug ; 32(8) : 1013-22) 发现亚治疗的微磨 皮术 ( 即, 使用低吸入压力和短期治疗持续时间 [15cmHg 10 秒= 20 千帕 ]) 将小鼠和猪的 药物传递速度增加了 8-24 倍。亚治疗的微磨皮术的治疗参数的强度低于用于治疗目的微 磨皮术 ( 即减少皱纹 ), 而且不引起皮肤炎症反应。使用亚治疗的微磨皮术, 微观分析已经 证明整个皮肤没有明显的破坏, 只是角质层 (SC) 轻微稀疏。SC 层出现集中和压实。表皮和 真皮层没有变化, 亚治疗的微磨皮术得到的结果是可控和可重复的。
增加的高分子的传递也可在灵长类动物和人的微磨皮术中看到 (Prausnitz MR, 等 Transdermal drug delivery.Nat Biotechnol.2008Nov ; 26(11) : 1261-8 ; Gill HS, 等 Selective removal of stratum corneum by microdermabrasion to increase skin permeability.Eur J Pharm Sci.2009)。吉尔等人 (2009) 发现, 可通过控制经过猴子和人 的头部的微磨皮术中的皮肤来控制去除角质层的程度。然而, 变压 (25kPa vs 50 kPa) 并 没有表现出差异。
如本示例所述, 可以在不同哺乳动物物种中可靠地使用亚治疗的微磨皮术, 例如, 在小鼠或猪。应该理解, 本文所述的实验研究 ( 例如, 如前所示的例子 ) 包括用亚治疗的微 磨皮术的研究, 也可以在其他哺乳动物物种中进行, 例如, 为确定其他生长因子是否表达, 如, 对皮肤有美容修复功效的 PDGF( 血小板衍生生长因子 )。 亚治疗的微磨皮术也可以用来 评估完整的细胞被遗传修饰后是否有美容功效。
此外, 除了亚治疗的微磨皮术以外的技术, 也可以用来评估其他生长因子是否表 达, 如对皮肤有美容修复功效的 PDGF( 血小板衍生生长因子 )。
组织学和其他分析方法
在动物研究中, 为确定皮肤蛋白和其他生物分子, 如胶原, 弹性蛋白, 细胞外基质 蛋白, 蛋白多糖, 生长因子的表达和 / 或水平在皮肤上是否有美容修复的功效, 并评价完 整的细胞通过美容遗传改造后其美容功能, 其结果可通过标准且著名的组织学程序进行分 析。组织学程序也可以用来分析在光或电子显微镜下有很小差别的物体, 因为着色使两个 组织形成对比, 同时使感兴趣的特定的特征更显著。
例如, 在涉及 KGF-1 质粒 DNA 传递到动物的皮肤的研究时, 并要确定 KGF-1 的表达 在皮肤上是否有美容修复的效果, 可以利用标准和知名的组织学程序。类似的组织学程序 也可以用来评价一个或多个其他生物大分子的表达是否对皮肤有美容修复的功效。
使用组织学程序的例子包括使用光显微镜的污迹, 如苏木精和曙红 (H&E) 的污 渍。其他知名的及建立在组织学和组织病理学上的程序, 也可用于评估一个或多个其他生 物大分子的表达在皮肤上是否有美容修复的效果。
也可以采用其他典型的染色技术, 包括马森三色染色法, 这是组织学经常使用的 典型的三色染色法, 还有冯·吉布森染色染色的。使用 H&E 进行染色, 梅森三色和冯·吉布森染色法, 可用于各种组织学测量, 包括皮肤厚度的分析, 胶原和弹力纤维成分分析。
在另一种典型的实施例中, H&E 染色剂, 可用于评估表皮的厚度, 角质细胞的数量, 胶原厚度和真皮的密度的变化, KGF-1 质粒 DNA 传递到动物皮肤前后的变化。
染色是使这两个组织形成对比, 以及突出感兴趣的特定特征。苏木, 一种碱性染 料, 由于对细胞核中的核酸的亲和力比较强, 所以将核染成蓝色 ; 曙红, 一种酸性染料, 将细 胞质染成粉红色。 醋酸铀和柠檬酸铅常用来使组织在电子显微镜下形成对比。 此外, 还有各 种其他技术可用于选择性染色细胞和细胞组分。其他化合物, 可用于组织切片染色, 例如, 番红, 刚果红, 固绿 FCF, 银盐, 以及许多自然和人工染料。
组织样品也可以通过其他程序分析来确定皮肤蛋白和其他生物分子, 如胶原, 弹 性蛋白, 细胞外基质蛋白, 蛋白多糖, 生长因子的表达和 / 或水平对皮肤是否有美容修复的 功效, 并评价完整的细胞通过美容遗传改造后其美容功能。 例如, 抗体可以用来使特定的生 物分子可视化, 例如, 用免疫组化, 或利用免疫荧光进行荧光染色。 其他技术, 如非放射性原 位杂交, 可与免疫组化结合起来, 用于鉴定与免疫荧光和酶联荧光扩增的荧光探针或标签 结合的特定的 DNA 或 RNA 分子。不同的成像技术可用于研究组织学样本, 例如, 染色后的组 织样本, 或用荧光染色后的免疫荧光。 在某些实施例中, 荧光显微镜和共聚焦显微镜可用于 检测细胞内的具体的荧光信号。数码相机也可以用来捕捉组织学和病理学图像。
动物模型
根据此处所述的实施例, 任何合适的动物模型都可用于确定皮肤蛋白和其他生物 分子, 如胶原, 弹性蛋白, 细胞外基质蛋白, 蛋白多糖, 生长因子的表达和 / 或水平是否对皮 肤有美容修复的功效, 并大幅评价完整的细胞的美容遗传改造后是否有美容功能。 “动物” 一词旨在包括但不仅限于任何哺乳动物的物种。 这些哺乳动物的例子包括但不仅限于不同 品种的猪 ( 猪 ) 和鼠科动物 ( 小鼠 )。熟悉这些领域的技术的人都知道, 考虑到猪和和人的 皮肤在生理和形态上已知的相似之处, 猪的动物模型存在一定的优势。 动物模型的选择, 需 要对许多不同的因素进行评估。在选择一个合适的动物模型时, 考虑的因素包括皮肤层的 厚度及药物通过皮肤的渗透能力。
角质层 (SC), 这是表皮外的保护层, 是疏水性的, 带负电荷的 PDNA 难以穿透这层 (Branski LK, 等, Gene Ther.2007Jan ; 14(1) : 1-10)。 小鼠背侧皮肤角质层的细胞只有 1-2 层, 兔子有 1-2 背部 SC 细胞层。 相比之下, 猪和人的角质层的厚度和皮肤比较相似 (Meyer, W., 等, 1978, Curr.Prob.Dermatol.7 : 39-52 ; Bronaugh, R., 等, 1982, Toxicol.Appl. Pharmacol.62 : 481-488 ; Kiritsy CP, 等 Crit Rev OralBiol Med.1993 ; 4(5) : 729-60)。 人 面部皮肤有 9±2 层 ; 毛囊很少 ; 非面部有 14-17 细胞层。小鼠有更薄的真皮层和较少的角 化角质层 (Hengge, U.R., 等 J.Clin.Invest., (1996)97, 2911-2916)。皮肤的渗透性 ( 通 常比人体皮肤的渗透性高 10-100 倍 ) 是选择动物模型的一个考虑因素, 如无毛小鼠和大鼠 (Paasonen L, 等 Int.J.Pharm.2006Jan 13 ; 307(2) : 188-93)。
正常治愈的猪模型已广泛应用于诱导性部分皮层伤口的研究, 因为他们的皮肤外 层与人及其相对无毛时很相似。此外, 猪同人一样, 被认为是紧皮肤的动物, 与兔子和豚鼠 等皮肤宽松的啮齿类动物形成对比。 松散皮肤的动物包含一层纤肌膜, 那就是肌肉层下方、 附着在皮肤上的肉膜。Hengge 等人 (J.Clin.Invest., (1996)97, 2911-2916) 报道, 当裸 pDNA 通过皮内注射入小鼠皮肤后, 在表皮、 真皮和底层的脂肪及肌肉中表达。而在猪和人的皮肤中, 只在表皮中表达。 同样的, Glasspool-Malone(Mol.Ther.2000 ; 2: 140-146) 等人 报道 pDNA 注射入猪和猕猴后, 转基因的表达很大程度上只局限于表皮。小型猪对于皮肤测 试是一个很有吸引力的模型, 因为它们的体型更小, 与人的皮肤更相似 (Mortensen JT, 等 Scand.J.Lab.Anim.Sci.Suppl.1.1998.Vol.25)。 两个物种的表皮都比较厚, 猪大约 70-140 毫米, 人大约 20-120 毫米, 不同地方有很大的区别。 猪表皮类似于有网状真皮 - 表皮结合点 的人。各种动物模型的皮肤渗透性排名大致如下 : 家兔>大鼠>豚鼠>猪>猕猴>人。小 型猪的皮肤对刺激物不如兔皮肤敏感。基于诸多因素的评价, 猪是一个适于局部实施 pDNA 测试的动物模型。正如此处其他所述, 本文所有引用参考全部纳入在此披露。
应该理解, 此处所描述的典型实施例只是在描述意义上进行考虑, 不是限制使用 目的。 据本技术领域公认, 在这些实施例中可能会有一些变化, 但没有违背该发明的原则和 精神, 其范围在要求及其等价物中有限制。 实施例 此处描述的实施例描述四个编码设计为改进细胞外基质的稳定性和支持皮肤的 改进的外观的重组载体构建体的合成。这些都是胶原, 弹性蛋白, EC-SOD 和 TIMP-1。此处 详细讨论了这些蛋白在皮肤生理学中的作用。每个构建的质粒由以下组成 : 一个有用的基 因和有人巨细胞病毒立早启动子的设计为提供高水平稳定性和瞬时表达该有用的基因的 质粒 cDNA。整合到该质粒 cDNA 载体的基因包括胶原 1, 弹性蛋白, 金属蛋白酶 -1 组织抑制 剂 (TIMP-1), 和细胞外超氧化物歧化酶 (EC-SOD)。包含有用的基因的 cDNA 质粒构建体可 被制成局部使用的护肤霜。
实施例 2 描述了扩增, 克隆和表达来自人肺组织的 cDNA 的人角质细胞生长因 子 -1(KGF-1, FGF-7)。
此外, 此处描述的实施例也描述了给小鼠局部施用的 KGF 质粒评估的研究 ( 实施 例 3)。在小鼠中也进行了亚治疗的微磨皮术的效度研究 ( 实施例 4 中描述 ) ; 并且在小鼠 中进行剂量增加研究 ( 实施例 5 中描述 )。
猪体内也进行了一独立组的试验性研究。通过实例, 实施例 6 描述了在猪体内进 行的亚治疗的微磨皮术的效度研究 ; 实施例 7 描述了在猪体内进行的剂量范围研究。
实施例 1- 扩增、 克隆和表达来自正常组织 cDNA 的 1 型人胶原 α1, 1 型胶原 α2, TIMP-1 及弹力蛋白
从 正 常 的 人 组 织 产 生 的 第 一 链 cDNA 购 自 BioChain 研 究 所 (Hayward, CA)。 1 型 胶 原 α1(COLA1A), 1 型 胶 原 α2(COL1A2) 和 弹 性 蛋 白 从 正 常 人 皮 肤 ( 目 录 号 : C1234218-10) 的 cDNA 扩增, 而 TIMP-1 从正常的人肺 ( 目录号 : C1234152-10) 和脑 ( 目录 号: C1244035-10) 的 cDNA 扩增。使用高保真的铂 Pfx 聚合酶 (Invitrogen Invitrogen, Carlsbad, CA) 进行基因扩增, 参照说明书, 使用基因的特定寡核苷酸。
表 1 概述了用于每种基因扩增的寡核苷酸序列, 以及聚合酶链反应 (PCR) 的条件。
表 1 也显示了自正常人组织 cDNA 扩增 COLA1A, COL1A2, 弹性蛋白及 TIMP-1 所用 的寡核苷酸序列和 PCR 参数。
表1
从正常组织克隆 COLA1A, COL1A2, 弹性蛋白及 TIMP-1cDNA 的引物及 PCR 参数
在 5′寡核苷酸设计有 NheI 限制性内切酶 (REN) 位点用于克隆至哺乳动物表达载 体质粒 pcDNA3.1+zeo : intA 紧邻的 PCMV 启动子的下游。最佳翻译起始的 Kozak 序列设计 为紧随每个 NheI 位点 (GCCGCCACCATG)( 即序列 ID 号 : 3 的 11-22 核苷酸 )。对于 COLA1A, COL1A2 及 TIMP-1 的 3′寡核苷酸设计有 HindIII 限制性内切酶位点 (REN sites), 对于弹 性蛋白有 BglII REN 用于克隆到同样的载体, 位于牛生长激素聚腺苷酸化 (BGHpA) 信号序 列的紧邻前方。REN 以下划线标注, 翻译起始密码子 (ATG) 以双下划线标注。每个基因本身 的终止密码子 ( 例如, 5′ -TAA-3′, 或 5′ -TGA-3′ ) 位于 3′寡核苷酸序列 REN 的紧邻 前方, 以粗体标注。
PCR 反应在冰上配制, 包含每种成分的终浓度如下 : 1X Pfx 扩增缓冲液, dATP, dCTP, dGTP 均为 0.3mM, 硫酸镁为 1mM, 每种寡核苷酸 0.3μM, 第一链 cDNA 模板为 dTTP, 1μL, 1.0-2.5 单位铂 PfxDNA 聚合酶, 添加无核酸酶的蒸馏水至终体积 50μL。每个反应均 为三步 PCR 循环, 使用以下参数 : 94℃, 15s ; 56℃, 30s ; 68℃, 对于每种基因的时间量如上表 1 所述。 每个扩增反应均进行 35 个循环, 之后为最终循环在 72℃持续 7min, 4℃冷藏直至分 析。 每次试验 PCR 反应使用同样的第一链 cDNA 模板和一组人 β 肌动蛋白 (BioChain) 特异 引物进行阳性对照。 PCR 后每个反应进行 Tris- 醋酸 EDTA(TAE) 琼脂糖凝胶电泳分析, 以确 定扩增的 cDNA 的延伸和完整性。对于每次分析取 10μL 每种反应物与蓝色 Juice 上样缓 冲液 (Invitrogen) 混合, 在每个 1% TAE 琼脂糖凝胶的泳道上样。以 TriDye 1kb 的 DNA 梯
形 (ladder)(New England Biolabs, Ipswich, MA) 用于评估扩增的 cDNAs 的大小。确定每 种 cDNA 的 PCR 扩增后, 按照使用说明, 每种反应物被立即克隆到 Zero Blunt TOPO PCR 克隆 系统 (Invitrogen)。菌落被筛选, 通过 PCR 或 REN 分析纯化的来自过夜的细菌培养的 DNA, 或两者同时。将含有预期大小的片段的 pCR-Blunt II-TOPO 克隆随后用合适的 REN 酶切, 分离并将全长基因克隆到哺乳动物表达载体 pcDNA3.1+zeo : intA。这个表达载体构建自 pcDNA3.1+zeo(Invitrogen), 通过将人 CMV 内含子 A 序列加至最小启动子的 3′端进行。 CMV 内含子 A 序列已被广泛地表征, 与无内含子的 CMV 启动子相比, 能大大提高重组基因在哺乳 动物细胞中的表达。内含子 A 序列从载体 pWRG7077 通过 PCR 扩增得到 ( 由 Dr.Jay Hooper 友好提供, 美国陆军医学传染病研究所 [USAMRIID]), 然后将其克隆到 pcDNA3.1+zeo 载体, 作为 NdeI-NheI 位点。pcDNA3.1+zeo : intA 是有图 8 中列出的表达元件的大小为 6.5kb 的 质粒。TIMP-1 从脑和肺组织 cDNAs 扩增得到, 本研究中, 从脑 cDNA 得到的 TIMP-1 用于所有 后续的克隆和表达试验。
克隆反应如 Maniatis 及 Sambrook 所述 (1998 年 ), 然后转化为亚克隆效率大肠 杆菌 (E.coli)DH5α 株, 用于克隆的 DNA 增殖。菌落被筛选, 通过 PCR 或 REN 分析纯化的 来自过夜的细菌培养的 DNA, 或两者同时。随后将含有预期大小的片段的 pcDNA3.1+zeo : intA 克隆用特异的 REN 进行酶切, 确认基因同一性。对于每种构建体从在选择性培养基 中过夜生长的 50mL 大肠杆菌培养物中分离高纯度 midiprep 的质粒 DNA。通过 A280 和 A260 来分析 DNAs 的纯度和浓度。每种基因的表达通过人内皮肾细胞系 HEK-293T/17 的 脂质体介导的转染确认, 然后分析细胞提取物和上清液。对每种要分析的构建体, 转染前 晚, 将 1x106HEK-293T/17 细胞接种至每孔含有 2mL 生长培养基, 多聚 -D- 赖氨酸包被的 6 孔板中, (DMEM, 高葡萄糖 ; 2mM L- 谷氨酰胺 ; 1X 非必需氨基酸 [NEAA] ; 10%热灭活胎牛血 清 [FBS]), 于 37℃, 5% CO2, 90%相对湿度 (Rh) 培养。第二天, 在转染前, 将培养物用 2mL 新鲜生长培养基填入。将每 4μg 每种质粒 DNA 构建体在 250μL Opti-MEM 减少的血清 培养基 (Invitrogen) 中柔和混合, 并与额外的 250μL 加有 10μL 脂质体 2000 转染试剂 (Invitrogen) 的同样的培养基合并。该反应物在室温下孵育 20 分钟, 使得形成 DNA : 脂质 体复合物。然后用移液器将全部反应液轻轻地吸至相应的含有 HEK-293T/17 细胞的孔中, 轻轻涡旋以均匀分散该转染混合液。然后将板放回孵育器孵育 72 小时, 然后收获并分析。 每种基因构建体的表达用转染的 HEK-293T/17 细胞提取物及上清液进行。
转染 72 小时后, 离心收集并澄清上清液。每种上清液转移 1mL 至聚丙烯离心管 中, 冰上放置直至分析。将细胞从孔中刮下, 在聚丙烯微量离心管中短暂离心形成沉淀。轻 轻倒出上清液, 让沉淀重新悬浮在 pH 为 7.4 的 1X 磷酸盐缓冲液 (PBS) 中, 短暂离心形成沉 淀。根据说明书, 倒掉 PBS, 将每种细胞沉淀重新悬浮在 100μL 哺乳动物细胞裂解缓冲液 中 (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO)。裂解缓冲液用 TRIS 缓冲液, 氯化钠, 十二烷基硫酸钠 (SDS), 表面活性剂, 脱氧胆酸和蛋白酶抑制剂制成。裂解反应在室温孵育 10 分钟, 然后在 室温下 14,000xg 离心 10 分钟。上清液转移到新的聚丙烯离心管中, 冰上放置至分析。将 每组转染的 HEK-293T/17 细胞提取物和上清液进行 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 和免疫印迹分析。每十万细胞当量 ( ~ 10μL) 与 NuPage LDS 样品缓冲液、 NuPAGE 还原 剂及去离子水混合, 90℃加热 5 分钟, 在 10% NuPage Novex Bis-Tris 凝胶每个泳道中上 样, 同样, 准备 30μL 相应的上清液, 在细胞提取物旁上样。SeeBlue Plus-2 蛋白分子量标记 (Invitrogen) 用于估计蛋白大小。凝胶在 200V 电压, 1X SDS NuPAGE MES 电泳缓冲 液中电泳 45 分钟。然后根据说明书 (Invitrogen), 利用 X-Cell II 印迹设备将电泳蛋 白转移至 0.45μm 的硝酸纤维素膜上。参照说明书, 利用蛋白检测 TMB 免疫印迹试剂盒 (KPL, Gaithersburg, MD) 进行蛋白质印迹, 利用第一抗血清及第二检测试剂, 如表 2 所述。 COLA1A, COL1A2, TIMP-1 和弹性蛋白的兔抗血清, 均购自 Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA)。 辣根过氧化物酶 (HRP) 标记的山羊抗兔 IgG(H+L)(Santa Cruz Biotechnology) 用来作为第二检测试剂。免疫复合物通过 TMB 膜底物检测 2-5 分钟, 将印迹浸泡在蒸馏水 中终止反应。通过高分辨扫描得到永久记录。HEK-293T/17 细胞中瞬时表达的 COLA1A, COL1A2, TIMP-1 及弹性蛋白的蛋白质印迹分析在所用检测试剂如表 2 所示。
表2
用于蛋白质印迹检测表达的重组蛋白的血清
图 8 显示使用 CMV 启动子启动的真核生物载体 pcDNA3.1+zeo : intA 在哺乳动物细 胞中表达人蛋白 COLA1A, COL1A2, 弹力蛋白, TIMP-1 的克隆方法。从正常的人组织的 cDNAs 通过 PCR 扩增的基因, 如材料和方法中所述克隆。COLA1A, COL1A2, 和 TIMP-1 直接克隆到 哺乳动物载体 NheI-HindIII REN 位点, 而弹性蛋白克隆到 NheI-BamHI 位点。弹性蛋白 3’ 端的 BglII 位点直接克隆到独特的同切点酶 BamHI 处。相关的表达元件是细菌的复制起 点 (ori), β- 内酰胺酶基因 (bla), CMV 早期启动子 (PCMV), 牛生长激素聚腺苷酸化信号 (BGHpA), 单链丝状噬菌体起点 (f1), 猿猴病毒 40 的复制起点 (SV40 ori), 猿猴病毒 40 多
聚腺苷酸信号 (SV40 pA), 博来霉素 (zeocin) 抗生素抗性基因 (zeocin)。
图 9 描述了从正常的人体组织的 cDNAs PCR 扩增 COLA1A, COL1A2, TIMP-1 和弹性 蛋白。使用基因特异的寡核苷酸引物扩增每种基因, 如材料与方法中所述。感兴趣的扩增 的基因用箭头标注, 其相应的大小被指示。(a)COLA1A ; (b)COL1A2 ; (c)TIMP-1 ; (d) 弹性蛋 白。KBL, 千碱基梯度 ; kbp, 千碱基对。
显示克隆蛋白 (COL1A2, TIMP-1 和弹力素 ) 的结果如图 10-12 所示。图 10 描述 了人 COL1A2 在 HEK-293T/17 细胞中的瞬时表达分析。COL1A2 蛋白大小为 138.9KDa, 如箭 头所示。COL1A2 特异性抗血清检测到的小碎片可能是不完整的翻译产物和降解的蛋白质。 图 11 描述了人 TIMP-1 在 HEK-293T/17 细胞的瞬间表达。TIMP-1 蛋白大小为 23.2Kda, 如 箭头所示。 TIMP-1 分子量高于其预测蛋白质分子量 23KDa 的可能原因是该蛋白在哺乳动物 细胞中 N- 连接和 Asn-Xaa-Ser/Thr 糖基化了。图 12 描述了人弹力蛋白在 HEK-293T/17 细 胞中的瞬时表达分析。 弹性蛋白大小为 66.1Kda, 如箭头所示。 弹性蛋白特异的抗血清检测 到的小碎片可能是不完整的翻译产物及降解蛋白质。表达结果表明, 在 HEK-293T/17 细胞 中, 弹力蛋白是不分泌的, 只是在胞内表达。
实 施 例 2- 扩 增、 克 隆 和 表 达 来 自 正 常 肺 组 织 cDNA 的 人 角 化 细 胞 生 长 因 子 -1(KGF-1, FGF-7)
材料与方法
正常人体组织的第一链 cDNAs 从 BioChain 研究所购买 (Hayward, CA)。角化细胞 生长因子 -1 从正常人体肺部 cDNAs( 目录号为 C1234152-10) 扩增。参照说明书, 用基因特 异性的寡核苷酸, 用高保真铂 Pfx 聚合酶 (Invitrogen, Carlsbad, CA) 进行基因扩增。表 3 概述用于扩增 KGF-1 基因的寡核苷酸序列, 以及聚合酶链反应 (PCR) 条件。
表3
用于来自正常的人肺组织 cDNAs 的 KGF-1 扩增的寡核苷酸序列和 PCR 参数
在 5′寡核苷酸设计有 NheI 限制性内切酶 (REN) 位点, 用于克隆至哺乳动物表达载体 pcDNA3.1+zeo : intA 紧邻 PCMV 启动子的下游。用于最佳翻译起始的 Kozak 序列设计 为紧邻每个 NheI 位点 (GCCGCCACCATG)。3′寡核苷酸被设计具有 HindIII REN( 下划线标 注 ), 用于克隆至同一载体紧邻牛生长素多聚腺苷酸化 (BGHpA) 信号序列之前。REN 位点用 下划线标出, 翻译起始密码子 (ATG) 用双下划线标出。 终止密码子天然存在于 3′寡核苷酸 序列中紧邻 REN 位点之前的基因, 并用黑体标出。
PCR 反应体系在冰上配制, 所含每种成分的终浓度如下 : 1X Pfx 扩增缓冲液, dAP, dTTP, dCTP, dGTP 为 0.3mM, MgSO4 为 1mM, 寡核苷酸为 0.3μM, 第一链 cDNA 模板为 1μL, 铂 Pfx DNA 聚合酶为 1.0-2.5 个单位, 最后用无核酸酶的蒸馏水补充至 50μL 终体积。每 个反应经过了三步 PCR 循环, 使用下列参数 : 94 ℃, 15S ; 56 ℃, 30S ; 68 ℃, 延伸时间如上表 1 所述。每个扩增反应都经过 35 个循环, 接着于 72℃终延伸循环 7 分钟, 4℃保存至分析。 每一次试验 PCR 反应旁边都使用相同的第一链 cDNA 和一组人 β- 肌动蛋白的特异性定 引物 (BioChain) 做阳性对照。PCR 每次反应后进行 Tris- 醋酸 EDTA(TAE) 琼脂糖凝胶电 泳分析, 以测定扩增的 cDNA 的延伸和完整性。对于每次分析每种反应物取 10μL 与蓝色 Juice 上样缓冲液 (Invitrogen) 混合, 在 1% TAE 琼脂糖凝胶的每个泳道上样。以 TriDye 1 kb 的 DNA 梯度 (New England Biolabs, Ipswich, MA) 来评估扩增的 cDNAs 的大小。确 认每种 cDNA 的 PCR 扩增后, 按照说明书, 将每种反应物立即克隆到 Zero Blunt TOPO PCR 克隆系统 (Invitrogen)。将转化子过夜培养, 通过 PCR 或 REN 分析来自过夜培养的细菌 培养物的纯化的 DNAs, 或将两种方法结合, 来筛选菌落。将含有预期大小的片段的克隆 pCR-Blunt II-TOPO 用合适的 REN 进行酶切用于分离, 并将全长基因克隆到哺乳动物表达 载体 pcDNA3.1+zeo : intA。
这个表达载体是在 pcDNA3.1+zeo(Invitrogen) 的 3′端的最小启动子增加了人 CMV 内含子 A。CMV 内含子 A 很独特, 与无内含子的 CMV 启动子相比, 能大大提高重组基因在 哺乳动物细胞的表达效率。内含子 A 序列从载体 pWRG7077 通过 PCR 扩增得到 ( 由 Dr.Jay Hooper 提供, 美国陆军医学传染病研究所 [USAMRIID]), 然后克隆到 pcDNA3.1+zeo 载体, 作为 NdeI-NheI 位点。pcDNA3.1+zeo : intA 是具有表达元件的 6.5kb 大小的质粒, 如图 13 所示。克隆反应如 Maniatis 及 Sambrook 所述 (1998 年 ), 然后转化至大肠杆菌 (E.coli) DH5α, 在体内扩增克隆的 DNAs。将转化子过夜培养, 通过 PCR 或酶切分析纯化的 DNAs, 或 将两种方法结合, 筛选出正确的克隆。
图 13 描述了使用 CMV 启动子启动的真核生物载体 pcDNA3.1+zeo : intA 在哺乳动 物细胞表达人蛋白 KGF-1 的克隆方法。 从正常的人体组织的 cDNAs 通过 PCR 扩增克隆基因, 如材料和方法中所述。KGF-1 直接克隆到哺乳动物载体 NheI-HindIII 酶切位点间, 相关的 表达元件是细菌的复制起点 (ori), β- 内酰胺酶基因 (bla), CMV 早期启动子 (PCMV), 牛生 长激素聚腺苷酸化信号 (BGHpA), 单链丝状噬菌体起点 (f1), 猿猴病毒 40 的复制起点 (SV40 ori), 猿猴病毒 40 多聚腺苷酸信号 (SV40pA), 博来霉素抗性基因 (zeocin)。
将含有大小正确的片段的克隆 pcDNA3.1+zeo : intA 用特异的限制性内切酶酶进 行酶切, 确保基因的特异性。从在选择性培养基中过夜培养的 50mL 大肠杆菌菌液中提取高 纯度的质粒, 通过测量 A280 和 A260 来分析 DNAs 的纯度和浓度。每个基因的表达通过脂质 体介导的转染至人内皮肾细胞系 HEK-293T/17, 然后分析细胞提取物和上清液。对每一个 要分析的构建的载体, 转染前晚, 将 1x106HEK-293T/17 细胞接种至含 2mL 生长培养基, 多聚 -D- 赖氨酸覆盖的 6 孔平板中, (DMEM 培养液, 高糖 ; 2mM L- 谷氨酰胺 ; 1X 非必需氨基酸 [NEAA] ; 10%热灭活小牛血清 [FBS])。于 37℃, 5% CO2, 90%相对湿度 (RH) 条件下培养。 第二天, 在转染前, 将培养物用 2mL 新鲜生长培养基培养。将每 4μg 质粒 DNA 加入 250μL 低血清培养基 (Invitrogen) 及 250μL 加有脂质体 2000 转染试剂 (Invitrogen) 的同样的 培养基, 在室温下孵育 20 分钟, 形成 DNA : 脂质体复合物。然后用移液器将全部反应液轻轻 地吸至相应的含有 HEK-293T/17 细胞的容器中, 轻轻搅拌, 混匀转染混合液。然后将平板放 回孵育器孵育 72 小时。基因在转染的 HEK-293T/17 细胞提取物及上清液中表达。转染 72 小时后, 离心收集上清液。每种上清液转移 1mL 至聚丙烯离心管中, 冰上放置。将细胞从容 器中刮下, 在离心管中简单的离心分离。轻轻倒出上清液, 让沉淀重新悬浮在 pH 为 7.4 的 1X 磷酸缓冲液 (PBS) 中, 离心, 弃 PBS 上清液, 根据说明书, 将沉淀重新悬浮在 100μL 哺乳 动物细胞裂解液中 (Sigma-Aldrich, 圣路易斯, 密苏里州 )。 裂解液由 TRIS 缓冲液, 氯化钠, 十二烷基硫酸钠 (SDS), 表面活性剂, 脱氧胆酸和蛋白酶抑制剂制成。裂解反应在室温孵育 10 分钟, 然后在室温下 14,000xg 离心 10 分钟。 上清液转移到新的聚丙烯离心管中, 冰上放 置。
为测定和定量表达的蛋白, 将每组转染的 HEK-293T/17 细胞提取物和上清进行 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 和 Western 杂交分析。每十万细胞当量 ( ~ 10μL) 与 NuPage LDS 样品缓冲液、 NuPAGE 还原剂及去离子水混合, 90oC 加热 5 分钟, 在 10 % NuPage Novex Bis-Tris 凝胶中上样, 同样, 准备 30μL 相应的上清液, 在细胞提取物旁上 样。SeeBlue Plus-2 蛋白分子量标准 (Invitrogen) 用于估计蛋白大小。在 200V 电压, 1X SDS NuPAGE MES 下电泳 45 分钟。 然后根据说明书, 利用 X-Cell II 印迹模板将电泳蛋白转 移至 0.45μm 的硝酸纤维素膜上。根据说明书, 利用蛋白检测 TMB 蛋白印迹试剂盒 (KPL, Gaithersburg, MD) 进行蛋白质印迹, 利用抗血清及辅助检测试剂, 如表 4 所述。 兔子的抗血 清, COLA1A, COL1A2, TIMP-1 和弹性蛋白均购自 Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA)。辣根过氧化物酶 (HRP) 标记的山羊抗兔 IgG(H+L)(Santa Cruz Biotechnology) 用来 作为辅助检测试剂。免疫复合物通过 TMB 膜底物检测 2-5 分钟, 将印迹浸泡在蒸馏水中终 止反应。通过高分辨扫描得到永久记录。
表4
蛋白印迹检测 COLA1A, COL1A2 和 KGF-1 在 HEK-293T/17 细胞中的短暂表达
所用的检测试剂
结果
图 14 表明从正常的人肺组织 cDNAs 中 PCR 扩增出来的 KGF-1 与本发明一致。用 基因特异引物扩增该基因, 如材料与方法所示。 箭头标注的是感兴趣的扩增的基因序列, 相 应的大小也予以标注。KBL, 千碱基梯度 ; KBP, 千碱基对。
图 15 是人 KGF-1cDNA 在 pCR-TOPO 载体中的克隆 ( 图 15A), 然后克隆至哺乳类表 达载体 pcDNA3.1+zeo : intA( 图 15B)。通过 NheI 和 HindIII 对重组载体 pCR TOPO 双酶 切, 得到 KGF-1 基因, 将其直接克隆至通过同样的内切酶酶切的 pcDNA3.1+zeo : intA 载体。 箭头标注的是感兴趣的扩增的 KGF-1 基因序列, 相应的大小也予以标注。KBL, 千碱基梯度 ; KBP, 千碱基对。
图 16 所示的是 KGF-1 的蛋白序列 ( 图 16A) 和 KGF-1/FGF-7 的核苷酸序列 ( 图 16B)。图 16B 中 KGF-1 的 DNA 序列对应于序列号 24 中的第 446 到 1030 位序列 ( 粗体 ), 其 他序列 ( 非粗体 ) 是基因组 DNA 序列, 只克隆了序列号 24 中的第 446 到 1030 位序列。
蛋白免疫印迹结果表明 KGF-1 蛋白在 293T 细胞中表达。例如, 图 17 是对转染 pcDNA3.1+ : intA/KGF-1、 空载 (pcDNA3.1+ : intA)、 没有 DNA 对照的细胞提取物 (C) 及上清 液 (S) 中 KGF-1 蛋白 (a), COLA1A 蛋白 (b) 和 COL1A2 蛋白 (c) 的短暂表达分析, 与本发 明的实施例一致。可以看出, 表达的 KGF-1 基因只存在于转染 pcDNA3.1+ : intA/KGF-1 的 293T/17 细胞的提取物和上清中。KGF-1 用黑色箭头标注。(M =分子量标准 ; KDa =千道尔 顿 ) 可以看出, 细胞转染 KGF 基因后在高分子量区域染色会加强, 而 COL1A1 和 COL1A2 蛋白 的染色则表明细胞转染后, KGF 的表达可能增加胶原的表达。
实施例 3-KGF 质粒局部应用于小鼠的评估 本实验研究于 BALB/C 小鼠中进行, 以判断 KGF 质粒的局部应用是否有美容修复的 实验设计如下 : 在试验组, 用尼龙刷刷 100 次去除 BALB/C 小鼠皮肤的角质层, 类似58功效。
CN 102471769 A说明书56/71 页于亚治疗的微磨皮术。对照组 BALB/C 小鼠只剪毛, 不刷毛。
两种不同的组合试剂进行测试 :
组合试剂 A : 94% TE 缓冲液 (10mM Tris) ; 5%甘油 ; 1%羟丙甲纤维素
组合试剂 B : 88% TE 缓冲液 (10mM Tris) ; 5%甘油 ; 5%丙二醇 ; 1%羟丙甲纤维素
两种不同的质粒进行测试 : gWiz-KGF1 质粒和 NTX-KGF1 质粒分别在单一浓度为 2000 微克 /mL 下进行测试。每只小鼠每次注射 4 微升。
使用 KGF1 质粒的试验组 :
空白对照包括 : - 没有处理 ;- 载体 A 单独处理 ;
- 载体 B 单独处理 ;
- 仅 gWiz-KGF1 质粒, 没有载体
- 仅 NTX-KGF1 质粒, 没有载体
对照组没有使用任何质粒 : 用载体 A 或 B 处理的同一小鼠都有 2 个斑点 ; 同一小鼠 除毛后刷过但没有用载体处理的皮肤区域被认为是 “非载体” 。
载体 A 刷 不刷
刷 gWiz-KGF1 NTX-KGF 1
n=1 n=1 不刷 n=0 n=0 n=1 n=1 载体 B n=1 n=1 没有载体 n=1 n=1对照组没有使用载体 : 仅质粒 ( 无载体 ) 在皮肤上使用所有试验组的详细情况 :
材料和方法 质粒 质粒及载体来自于 Aaron Tabor, Gene Facelift, LLC。 动物 20 只 BALB/C 氏小鼠来自于 Jackson 实验室并在实验之前被驯化。质粒给予
小鼠用氯胺酮及二甲苯胺噻嗪 (1/10) 的混合物麻醉。剃掉它们的背毛, 但是并 不使其脱落。治疗区域要用力地用尼龙刷清洗 (3 排 4cm×1cm 的尼龙纤维 )。通行 100 次 (2 个垂直方向分别 50 次 ) 得到红斑而不出血即可, 以此来破坏皮肤屏障。此 2 个垂直方 向通行产生一个重叠的约 1 平方厘米的治疗区域。那些治疗混合物 ( 如 : gWiz-KGF 质粒或 NTX-KGF1 质粒 ) 就可应用于此拉绒区域, 通过一种 P10 微量吸管 (GILSON, 法国 ) 轻柔将混 合物散布于此区域, 在动物返回到笼内之前, 不要摩擦, 并让其干燥。实验动物都将单独饲 养。
质粒转染后的组织学评估
每只动物的数据结果都在实验 0 天开始记录, 直到实验动物死亡。皮肤活检样本 用 12mm 的打孔器获得, 包括了治疗区域及其上下 1mm 的皮肤细胞。此样本取得后, 平放于 暗盒中, 并予以 10%的福尔马林处理。之后用 H&E, Mason Trichrome 和 Von Gieson 染色, 分析皮肤厚度, 胶原及弹性纤维成分。
结果简介
根据组织学分析, 在被拉绒了皮肤并转染了 gWiz-KGF1 质粒 ( 没有载体 ) 的动物 中, 没有美容的皮肤回复青春的效果。 gWiz-KGF1 质粒被证实是有发挥作用的, 比如, 有一些 正结果显示有美容的皮肤回复青春效果, 只有载体 B 显示有一些祛疤效果。结果显示, 具有 增强穿透性的丙二醇, 能够使 gWiz-KGF1 产生美容的皮肤回复青春的正结果。
NTX-KGF1 质粒则显示有美容的皮肤回复青春作用, 不论使用载体 A, 载体 B, 还是 不用载体 ( 生理盐溶液 ), 不过只适用于祛疤。
不管是 gWiz-KGF1 质粒还是 NTX-KGF1 质粒, 除了祛疤或恢复拉伤皮肤的功能之 外, 不具有其他美容的皮肤回复青春功效。
前文使用过的词句 “美容的皮肤回复青春阳性效果” , 包括一系列使用 KGF1 质粒 治疗之后令人满意的改变, 如本文所述, 是用组织学评估的得到, 此改变包括 :
1. 增加角质层细胞数量从而增强表皮厚度 (H&E 染色 ) ;
2. 增加真皮层胶原的厚度和密度 (Masson′ s Trichome 染色 ) ;
3. 增加真皮层及表皮层连接处垂直方向的弹性纤维 (Luna 染色 ) ;
4. 增加基底细胞增殖 (Ki-67 染色 ) ;
实施例 4- 小鼠亚治疗微磨皮验证研究
本研究的目的是为了验证小鼠中的亚治疗磨皮实验有效。本实验中, 用到 SV129 型小鼠。磨皮手术也基于该小鼠。每只小鼠活检完毕后, 实验者在其相应位置做上标记, 活 检是在磨皮手术之后立即执行的。
在磨皮手术中, 用到了两种尼龙刷, 用于拉绒小鼠皮肤的两种尼龙刷, 有着不同的 鬃毛。
此二种尼龙刷如下所述 :
本尼龙刷, 具有柔软 ( 不硬 ) 的鬃毛, 标记绿色的尖部 (G) ;
本尼龙刷, 具有硬的鬃毛, 标记黄色尖部 (Y)。
下文是用于标记的代码 :
第一个字母 : 代表尖部的颜色 (G 代表绿色, Y 代表黄色 )- 接下来的字母 : 代表压力用 “in Hg” 表示 (10, 15 或者 20) - 接着的数字 : 代表样品号码 (1 到 4) 病理学样品编码
基于上述研究结果, 黄尖 ( 具有硬鬃毛, 黄尖部的尼龙刷 ), 20/Hg 被选作微磨皮器材。 实施例 5- 小鼠给药剂量上升实验
本实验的目的是为了评估不同剂量的 NTX-KGF1pDNA 质粒在小鼠中的效果。
本实验是基于实施例 4 中的微磨皮装置。根据实施例 4 中的结果, 黄尖 ( 具有硬 鬃毛, 黄尖部的尼龙刷 ) 在 20in Hg 被选作微磨皮器材。
总共有 26 只 “SV 129 小鼠” 参与该实验, 该小鼠被称作 “GFP 小鼠” 或者绿色荧光 蛋白小鼠 ( 因为该小鼠在其细胞质中表达 GFP)。
本实验, 只对 NTX 质粒 ( 特别是 NTX-KGF1pDNA) 进行了评估。gWiz-KGF1 质粒没有 用于本实验。NTX-KGF1 质粒是 NTC8385-KGF1lot#NTC-Ol 1007( 由 Nature Technology 于 2009 年 10 月 27 日生产 )。该质粒是 3.18mg/ml 的冻干粉。
本实验检测了 6 种不同剂量的 NTX-KGF1pDNA 质粒, 分别是 50, 100, 250, 500, 750, 和 1000 毫克 / 毫升 (μg/ml)。
本实验唯一用的载体是载体 A, 成分描述如下 : 94% TE 缓冲液 (10mM Tris) ; 5%甘 油; 和 1%羟丙基甲基纤维素。
一只小鼠在麻醉之后便死去。
本实验对照组有以下小鼠组成 :
- 只做磨皮手术 (2 只 ) ;
- 磨皮手术 + 载体 A(2 只 ) ;
- 只有载体 A( 无质粒, 无磨皮手术 )(2 只 ) ;
- 载体 A+6 种不同浓度 NTX 质粒 (50, 100, 250, 500, 750, 和 1000 毫克 / 毫升 ) 但 是不做磨皮手术 ( 每个浓度一只小鼠 )。
为了检测不同给药剂量, 设置了两组实验组 :
- 一些小鼠接受全部实验处理 ( 磨皮手术, 于载体 A 中的不同浓度的质粒 ) ;
- 另一些小鼠仅有于载体 A 中的不同浓度的质粒, 没做磨皮手术。
本实验小鼠用克他命及甲苯胺噻嗪 (9/1) 腹部麻醉。剃掉其的背毛, 但是并不使 其脱发。
本替代治疗磨皮手术用真皮标记。微铺平装置 (Dermasweep Inc.Rocklin, CA, USA) 用的是黄尖尼龙刷, 20in Hg 真空压力。
Dermasweep 迷你微磨皮装置
该 Dermasweep 迷你微磨皮装置 (Dermasweep Mini), 其特征是, 有一个密闭可调 真空压力系统, 可以将皮肤轻轻拉起, 利用尼龙刷, 以准确可控的方式轻柔地去除上层皮 肤。
该尼龙毛刷的尖部以传统的晶体系统去掉杂质和危害物质。 该 Dermasweep Mini) 装置经过了 FDA 认证的。
小鼠中 NTX-KGF1pDNA 质粒的应用
在亚治疗微磨皮之后 ( 大约 5 分钟 ) 立即用微量管加入不同浓度的 NTX-KGF1 pDNA 质粒, 并在实验动物回笼前让其干燥。麻醉剂的用量足够多直到观察小鼠背部复合物 干燥。
未用质粒的对照组
处置说明 进磨皮手术 磨皮手术 + 载体 A 仅载体 A
剂量 (μg/ml) 50 100 250 磨皮手术 164, 165 828, 159 162, 900 无磨皮手术 163, 833( 额外的小鼠 ) 155 156 小鼠标签号码 831, 830 160, 161( 背部有深的抓痕 ) 829, 166接受不同剂量的 NTX-KGF1pDNA 质粒的测试组64CN 102471769 A 500 750 1000
说826, 170 827, 158 167, 157明书169 832 17162/71 页实验 5 结果概要
本实验结束后, 应用组织学来分析不同处置组的效果。所有剂量的 NTX-KGF1pDNA 质粒, 特别是 100, 250, 和 500 微克 / 毫升 (μg/ml), 其组织学评价如下 :
1. 增加角质层细胞数量从而增强表皮厚度 (H&E 染色 ) ;
2. 增加真皮层胶原的厚度和密度 (Masson′ s Trichome 染色 ) ;
3.500 微克 / 毫升的剂量引起一定的炎症 / 毒力。
实施例 6- 猪的微磨皮验证
本实验的目的是为了评估和验证用于增强 KGF-1pDNA 递送至猪皮肤的亚治疗微 磨皮设置。
用于本实验的种类和品系是 Yorkshire 猪 ; 该猪被检测是健康的, 并且初始体重 为约 200lbs。 本实验假定如下 : 1) 亚治疗微磨皮能以可控, 可重复的方式进行 ; 2) 亚治疗微磨 皮加上 KGF-1pDNA 将产生美容的皮肤回复青春的功效 ; 3) 亚治疗微磨皮单独或者加 / 减载 体不产生美容的皮肤回复青春。
研究目的 :
1. 确定最佳的微磨皮设置 ( 尖部级别, 穿过数量, 真空压力 ) 来有效地去除 ( 或几 乎去除 ) 角质层而不破坏或引起基本的有活力的表皮炎症。
2. 证明亚治疗的微磨皮程序可控且可重复。
3. 确定局部应用 KGF-1pDNA 与优化的亚治疗的微磨皮程序联合给予的剂量—— 药效。
实验 #1
优化亚治疗的微磨皮的程序
处理和组织收集 : 用到了一只 Yorkshire 猪。该 Dermasweep 迷你微磨皮装置 ( 本文别处所述 ) 用于确认以确定角质层去除的程度和再生性。当电力剪下并轻柔清洗 Yorkshire 猪的治疗区域后, 改变真空压力和通行次数, 产生不同的治疗排列。
进行皮肤打孔活检和 H&E 染色来检测角质层的移除百分比。
本实验中, 评估了 Dermasweep 迷你微磨皮装置的不同的设备设置, 来测定哪种设 备产生亚治疗的去除角质层而不破坏或者使基本的有活力的表皮发炎。治疗区域大约有 2×2 厘米= 4 平方厘米。去皮后组织立马收集。当最后的实验手术结束后, 实验动物被安 乐死。
最低的 Dermasweep 微真空设置在 3/Hg 分析, 最高的为 27/Hg。多数情况下, 用该 设备治疗人时, 真空设置设为 15-20/Hg 范围, 在 1 垂直和 1 水平通行期间, 用中等的 ( 绿 色 ) 或中等粗糙 ( 黄色 ) 处理尖部。相对于中等的 ( 绿色 ) 处理尖部, 中等粗糙的 ( 黄色 ) 处理尖部具有更硬的尼龙鬃毛。尖部在皮肤上移动速率评估为 10cm 每秒。对照皮肤区域
不进行磨皮手术处理, 其被收集用于分析。
材料和方法
Dermasweep 迷你微磨皮装置
正如本文其他位置所述, Dermasweep 迷你微磨皮装置 ( 即 “Dermasweep Mini” ), 其特征是, 有变量水平真空泵的密闭系统, 在鬃毛以精确和控制的方式 “扫走” 皮肤的死
层时将皮肤轻轻拉起。该鬃毛尖部完全去掉与传统的晶体系统相关的杂质和危害物质。 Dermasweep Mini 为 FDA 认证的医疗设备。
微磨皮程序
将 Yorkshire 猪麻醉, 治疗区域用电剪剃毛并清洗, 但并不脱毛, 然后如以上指定 的以多种设备设置进行程序。
组织收集
所有组织从试验 0 天在单一时间收集, 皮肤活检组织在微磨皮之后立即收集, 利 用的是 12mm 活检打孔器。在最终的手术之后, 实验动物处以安乐死。
活检样品名称 : 侧面活检
两个对照样品用 C1 和 C2 表示 活检样品名称 : 下腹活检5/Hg 绿尖 黄尖 G5-B Y5-B 10/Hg G10-B Y10-B 15/Hg G15-B Y15-B 20/Hg G20-B Y20-B 25/Hg G25-B Y25-B其中 B 表示腹部
评价
本实验组织样本平放于暗盒中, 并置于 10 %的福尔马林中用于组织学。之后用 H&E 染色, 分析角质层 / 表皮 / 真皮厚度, 以及任何炎症指示物的存在。
实验 #1 结果概述
1. 该绿尖组 (G) 在 25/Hg x 2 次通行, 产生了最平滑地移除角质层。在任何压力 设置下, 用绿 (G) 尖没有观察到上皮损伤。黄尖 (Y) 产生了更多粗糙的表面, 并在 20/Hg 时 上皮开始显著损伤。
2. 该猪的侧腹被确定为最佳治疗区域。 其下腹部是皮肤中具有大的峰和谷的高度 凹凸不平的皮肤。腹部皮肤的 “谷” 没有显现出具有任何角质层被移除。
侧腹则为更平滑的皮肤。
3. 为猪刺字则是为了确定样品是来自与精确的微磨皮治疗区域。
实验 #2
局部应用 KGF-1pDNA 之后亚治疗磨皮手术
处理和组织收集 : 用到了 1 只 Yorkshire 猪。在实验 0 天, 测试之前, 利用电剪剃 掉毛并轻轻清理干净, 接着进行温柔的微磨皮程序 ( 如前文所述测定 ) 以去掉角质层。该 治疗区域约为 2×2 厘米= 4 平方厘米。组织在实验 4 天后单独收集 ( 处理后 96 小时 )。 实验动物在第 4 天的实验后处以安乐死。
载体 :
载体 A : 94% TE 缓冲液 (10mM Tris) ; 5%甘油 ; 和 1%羟丙基甲基纤维素。
质粒 :
NTX-KGF1pDNA 质粒被配制成不同浓度 100, 250, 500, 750, 1000, 1500, 和 2000 微克 / 毫升。因为在小鼠中 NTX-KGF1 表现出强烈的肉眼可见的效果, 所以实验确定了一个大范 围 ( 超过 20 倍 ), 每平方厘米用 4 微升体积 ( 比如 : 4 平方厘米的区域用 16 微升 )。
对照组由以下组成 : 1) 无微磨皮或者 pDNA 治疗 ( 收集相邻的治疗区域 ) ; 2) 只有 微磨皮 ; 3) 微磨皮之后只有载体。处置表如下 :
质粒
质粒和载体来自于 Aaron Tabor, Gene Facelift, LLC.
动物
一只 Yorkshire 猪在实验之前被使之适应。
微磨皮程序及质粒应用
本实验猪被麻醉, 在应用亚治疗微磨皮程序之前, 其背部用电剪剃掉毛发并清理, 但是不会使其脱毛, 正如实验 #1 所述。
本实验治疗区域用微磨皮技术去除其角质层, 该区域大约 2x 2 = 4 平方厘米大 小。
本实验微量管涂布于该治疗区域, 并用一次性血清刷 ( 或小铲 ) 涂布均匀, 不要摩 擦, 在动物回笼之前, 令其干燥。
本实验动物单独饲养
组织收集
所有组织在第 3 天某一时间收集, 在实验第 3 天, 该动物被麻醉。用 12mm 活检打 孔器取样, 之后该动物被处以安乐死。
评价
评价在实验 0 天, 微磨皮之前和之后, 每日进行直到实验动物牺牲。
组 织 样 本 取 得 后, 平 放 于 暗 盒 中, 并 置 于 10 % 的 福 尔 马 林 用 于 组 织 学。 用
H&E±Selective Ki67 染色, 胶原及弹性纤维成分被用于另外的组织学分析。
示例性实验总结 : 猪的亚治疗的微磨皮和基因治疗——剂量递增研究
动物模型 : 使用一只 8 月龄的大 Yorkshire 母猪 (275 磅 ), 全身麻醉使之镇静。
治疗区域绘图 : 治疗点用笔标记在背部和侧面。
治疗区域绘图 : 治疗编码编号直接写在皮肤上。
该猪皮肤模型的相关性 : 其背部和侧腹部皮肤与人皮肤相似。
样品收集方法 : 在计划的治疗区域周围 ( 黑点标记的 ) 用 12mm 打孔器标记一 个黑圈, 在其垂直方向上 24mm 处 (2 倍于打孔的距离 ), 做上刺字标记 ( 红色标记 )。该 刺字标记用的是斯波尔丁特电器纹身标记, 型号为 SSEMK, Spaulding&Rogers MFG., Inc. Voorheesville, NY USA。电压设定为 17 到 21 之间。在刺字标记之后, 洗去墨迹, 微磨皮则 用 25/Hg 压力, 绿尖尼龙刷, 载体 A 或者不用质粒。
治疗说明
治疗区域命名 执行治疗的范围 ( 从左到右, 从上到下 )顺序 1 治疗说明 无70CN 102471769 A 2 3 4 5 6 7 8
9 10 11 12
说单独磨皮 单独载体明书68/71 页磨皮 + 载体, 无质粒 50 微克 / 毫升 NTX 100 微克 / 毫升 NTX 250 微克 / 毫升 NTX 500 微克 / 毫升 NTX750 微克 / 毫升 NTX 1000 微克 / 毫升 NTX 1500 微克 / 毫升 NTX 2000 微克 / 毫升 NTX这些顺序在每个身体区域 ( 背部和侧腹部 ) 上重复除了对照组只有 NTX 无磨皮手 术的。该 3 组重复治疗方案动物分别标记 A, B, C。身体背部区域标记 D, 侧腹部区域标记 F。
对于只用 NTX 治疗, 不做磨皮手术的, 其编码是 :
第一个字母是其剂量, 第二个字母是样品编号 (A 或 B)
例如 :
50-A : 50 微克 / 毫升质粒, 没有进行磨皮手术, 第一个样品。
100-B : 100 微克 / 毫升质粒, 没有进行磨皮手术, 第二个样品。
病理切片命名 ( 样品 ID)
石蜡切样 本实验皮肤样品, 从中间切样。接着放入石蜡模具, 面朝下, 放置垂直直到石蜡凝集。 结果摘要 ( 病理分析 )
在 50 微克 / 毫升 NTX-KGF1pDNA 治疗下, 与对照组并无明显差异。
1) 在 100 到 250 微克 / 毫升 NTX-KGF1pDNA 治疗下, 表皮和真皮增殖良好, 在表皮 和真皮的连接处, 有浓密的胶原质将其连接。这是皮肤产生主要结构 ( 胶原质 IV/VII 和胶 原质 I/III) 来对抗皱纹的证据。其表皮同样以增加网钉 ( 交错连接 ) 的形式增厚, 使表皮 及真皮区域增加。基底干细胞 ( 真皮右上面 ) 染色更深 ( 扩散更大 )。
2) 在 500 微克 / 毫升 NTX-KGF1pDNA 治疗下, 出现一定的皮肤角化过度 ( 表明有炎 症反应 )。
3) 在 750 到 2000 微克 / 毫升 NTX-KGF1pDNA 治疗下, 皮肤角化过度, 不存
在浓密的胶原层。
4) 在单一剂量 250 微克 / 毫升 NTX-KGF1 pDNA 治疗下, 真皮层以增加角蛋白
细胞的形式增厚。厚厚的纤维胶原直接堆积在真皮 - 上皮交联处。
对于美容的皮肤回复青春的显著影响
本文描述的研究结果, 如在实施例中进一步详述, 表明利用质粒 DNA 进行表面皮 肤层细胞的基因治疗, 可以得到令人惊奇且意想不到的美容的皮肤回复青春效果。该结果 证实, 应用 KGF1 pDNA, 通过递送路径, 和本文描述方法, 在美容的皮肤回复青春方面很大益 处。 因此, 此种在人中的给予可类似地有益于改正皮肤老化的标记, 去除美容外观的不良变 化, 例如 : 起皱, 下垂, 变薄, 干燥, 暗淡, 粗糙, 和紫外线照射引起的皮肤变色和老化。 此处所 述的实施例只为举例说明, 而不是为了限制本发明的范围。一个或多个其他生物分子的表 达, 如: PDGF 或者其他生长因子, 结构生物分子 ( 如胶原 1, 胶原 3), 抗氧化分子 ( 如过氧化 物歧化酶 ), 同样在本发明范围内, 并且也可以评价对于消除美容外观的不良变化的影响, 例如 : 起皱, 下垂, 变薄, 干燥, 暗淡, 粗糙, 变色的皮肤, 这些往往是紫外线照射和老化的结 果。
这些结果进一步表明, 外用抗皱基因治疗可大为发展, 比如 : 整形外科, 皮肤科, 医 疗水疗市场。 事实上, 生长因子恶化的基因往往被新的生长因子基因取代, 以重新启动胶原 质和弹性蛋白的生产, 恢复皮肤的厚度。
本文所述的组合物和方法, 可用于纠正皮肤老化的根本原因, 即, 促进正确的断裂 或基因突变。 在一般情况下, 此处所述的组成和方法可以用来增加皮肤厚度, 增加胶原和弹 性蛋白, 因此此处所描述的基因治疗能够可靠和有效地用于恢复美容特性。一定的生长因 子, 如 KGF, 能被用来在其他哺乳动物, 甚至人中, 以产生抗皱的理想的美容效果。
本发明其他令人惊讶和意想不到的优势, 包括但不仅限于 : 1) 相比 Botox 治疗 ( 往往肌肉瘫痪 ) 和 Juv é derm( 暂时的皮肤扩张 ) 治疗, 具在不刺激下, 增加皮肤质量的优 势; 2) 与多肽短暂治疗相比, 能持续达到预期效果, 因为基因治疗有更强有力的美容效果 ; 3) 与其它化妆药品相比, 本发明的组成和方法是具有更多的使用途径, 比如 : 治疗皱纹, 下 眼圈, 手背, 颈部下垂。
本文引用的所有专利、 出版物、 摘要和其他参考文献通过参考以其全文结合至此。
背景技术 皮肤蛋白质的水平和 / 或表达, 以及其他生物分子 ( 如胶原, 弹性蛋白, 细胞外基 质蛋白, 蛋白多糖, 生长因子, 内源性抗氧化酶, DNA 修复酶等 ) 会随着年龄增长显著衰退, 造成外观上非期望的改变。例如, 纤维细胞和角质细胞对生长因子的刺激应答能力会随着 年龄下降。 相反的, 某些蛋白质会增加, 对皮肤和其他具有美容功效的细胞带来不可预计的 影响。基质金属蛋白酶 (MMP-1) 在皮肤细胞中的含量会增加 ; 可是当 MMP-1 加速胶原酶分 解后, MMP-1 的增加对皮肤是有害的。
与年龄相关的变化包括皮肤的松弛, 稀疏, 起皱。 个别指定的组合物用以改善皮肤 外观, 但一般说来, 这种组合物需要频繁和大量的使用 ( 全年中每天一次或两次 )。 另外, 侵 入式治疗 ( 如整形外科手术, 激光换肤, 注射治疗 ) 可能会有助于减少皮肤下垂和起皱。尽 管如此, 许多人并不愿意接受非治疗用 ( 即外形美观 ) 的外科手术。因此, 有必要使化妆品 的组合物和方法提供一个比普通的护肤霜更永久的解决方法, 但又不需要任何外科手术或 侵入式的干预。
基因治疗可以为促进, 治疗和维护有美容功效的细胞提供有针对性的方法。 例如, 某些基因与皮肤组织的维护及修缮有关。许多生长因子, 如表皮生长因子 (EGF), 转化生长 因子 (TGF-β), 成纤维细胞生长因子 (FGF), 胰岛素样生长因子 (IGF-1), 角质细胞生长因 子 (KGF), 血管内皮生长因子 (VEGF) 和 PDGF 可能参与伤口愈合 ( 见例如, Grazul-Bilska 等, Druags of Today , 2003 , 39 : 787-800 ; S.Werner 和 R.Grose ; Physiol.Rev. , 83 : 835-870, 2003)。例如, 血管内皮生长因子 (VEGF), 血小板衍生生长因子 (PDGF), 胰岛素样 生长因子 (IGF-1), 粒细胞 / 巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF), 白细胞介素 (IL-8, IL-6), 肿 瘤坏死因子 (TNF-α), 转化生长因子 (TGB-β) 和基质蛋白的混合物可以被用来改善伤口 愈合 ( 综述于 Jimenez 和 Jimenez, Am.J.Surgery, 2004, 187 : 56S-64S)。此外, 胰岛素样生 长因子 (IGF-1) 可能被用来增加肌肉肥大 (Barton-Davis 等, Acta Physiol.Scand., 1999, 167 : 301-305)。因此, 通过分子靶向涉及美容功效的细胞的基因组改进特定蛋白的产生和 可以提供一种改进这种细胞的寿命和健康的方法。 功能,
发明概述
本发明的某些实施方案解决这些与老化和其他不想要的改变有关的问题, 所述不 想要的改变可发生于皮肤和其他具有美容功能的细胞中。
本发明的某些实施方案提供了用于具有美容功能的细胞的美容基因修饰的方法,
与年龄相关的变化包括皮肤的松弛, 稀疏, 起皱。 个别指定的组合物用以改善皮肤 外观, 但一般说来, 这种组合物需要频繁和大量的使用 ( 全年中每天一次或两次 )。 另外, 侵 入式治疗 ( 如整形外科手术, 激光换肤, 注射治疗 ) 可能会有助于减少皮肤下垂和起皱。尽 管如此, 许多人并不愿意接受非治疗用 ( 即外形美观 ) 的外科手术。因此, 有必要使化妆品 的组合物和方法提供一个比普通的护肤霜更永久的解决方法, 但又不需要任何外科手术或 侵入式的干预。
基因治疗可以为促进, 治疗和维护有美容功效的细胞提供有针对性的方法。 例如, 某些基因与皮肤组织的维护及修缮有关。许多生长因子, 如表皮生长因子 (EGF), 转化生长 因子 (TGF-β), 成纤维细胞生长因子 (FGF), 胰岛素样生长因子 (IGF-1), 角质细胞生长因 子 (KGF), 血管内皮生长因子 (VEGF) 和 PDGF 可能参与伤口愈合 ( 见例如, Grazul-Bilska 等, Druags of Today , 2003 , 39 : 787-800 ; S.Werner 和 R.Grose ; Physiol.Rev. , 83 : 835-870, 2003)。例如, 血管内皮生长因子 (VEGF), 血小板衍生生长因子 (PDGF), 胰岛素样 生长因子 (IGF-1), 粒细胞 / 巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF), 白细胞介素 (IL-8, IL-6), 肿 瘤坏死因子 (TNF-α), 转化生长因子 (TGB-β) 和基质蛋白的混合物可以被用来改善伤口 愈合 ( 综述于 Jimenez 和 Jimenez, Am.J.Surgery, 2004, 187 : 56S-64S)。此外, 胰岛素样生 长因子 (IGF-1) 可能被用来增加肌肉肥大 (Barton-Davis 等, Acta Physiol.Scand., 1999, 167 : 301-305)。因此, 通过分子靶向涉及美容功效的细胞的基因组改进特定蛋白的产生和 可以提供一种改进这种细胞的寿命和健康的方法。 功能,
发明概述
本发明的某些实施方案解决这些与老化和其他不想要的改变有关的问题, 所述不 想要的改变可发生于皮肤和其他具有美容功能的细胞中。
本发明的某些实施方案提供了用于具有美容功能的细胞的美容基因修饰的方法,
以及用于提供具有美容功能的细胞的美容外观的组合物。
本发明的其他实施方案提供了使用多种动物模型, 用于测定是否皮肤蛋白和其他 生物分子 ( 如胶原、 弹性蛋白、 细胞外基质蛋白、 蛋白多糖、 生长因子等 ) 的表达和 / 或水平 对皮肤有美容的回复青春作用, 并用于评估具有美容功能的基本上完整细胞的美容基因修 饰的组合物和方法。
如此处所公开, 本发明的方法和组合物的实施方案可包含编码为核算和 / 或多肽 的多核苷酸的构建, 所述核酸和 / 或多肽可发挥作用以改善和 / 或保持此类细胞的外观。 或 者或此外, 也可使用包含孤立的多肽或其生物学活性的衍生物的组合物。
因此, 本发明主要致力于皮肤和具有美容功效细胞的外观退化问题, 以及对这种 细胞的基因修饰提供组合物和方法。同时本发明可以以各种方式体现。
在一个实施方案中, 对于具有美容功效的完整细胞的大幅基因修饰, 当前的发明 提供了一些组合物和方法。 其中主要包括对至少可以编码一种核苷酸的多聚核苷酸进行调 控, 或是对美容功效细胞有维持作用的多肽在这种细胞中的表达进行调控。他们所具有的 提高和 / 或维持一个生化和 / 或生理过程的美容功效, 对外观具有积极作用。 其中一个实施 例中, 某种多肽由角质细胞生长因子或一种生物活性衍生物组成。 例如, 在某些实施例的多 聚核苷酸中, 包含了序列 ID 号为 24 的核苷酸 446 到 1030, 或者是一段至少有 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 或 99%和该段核苷酸相似的序列。或者是具有序 列 ID 号为 23 的一种编码蛋白的多聚核苷酸, 亦或是和该段序列 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%相似的序列。 在另一个实施方案中, 当前的发明包含了在个体中, 对具有美容功效的完整细胞 大幅基因修饰的组合物。该组合物包括至少可以编码一种核苷酸的孤立多聚核苷酸, 或是 可以维持细胞美容功效的多肽。或者, 该组合物包括了维持细胞美容功效的多肽。其中一 个实施例中, 某种多肽由角质细胞生长因子或一种生物活性衍生物组成。 例如, 在某些实施 的多聚核苷酸中, 包含了序列 ID 号为 24 的核苷酸 446 到 1030, 或者是一段序列至少 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 或 99%和该段核苷酸相似。 或者是具有序列 ID 号为 23 的一种编码蛋白的多聚核苷酸, 亦或是和该段序列 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%相似的序列。
该组分可能进一步包含某种载体, 这种载体可以调控至少一种具有美容功效宿主 细胞中的多聚核苷酸或多肽。 在一个实施方案中, 确定主体后, 该组分使核酸和多肽在具有 美容功效的细胞中表达, 他们所具有的提高和 / 或维持一个生化和 / 或生理过程的功效, 对 美容外观具有积极作用。
在某些实施例中, 本发明的方法和组合物可能会导致多个蛋白的表达。他们所具 有的提高和 / 或维持一个生化和 / 或生理过程的功效, 对美容外观具有积极作用。例如, 和 外观有关的初级蛋白或氨基酸的表达 ( 例如, 将可以表达角质细胞生长因子的多聚核苷酸 或其他多肽应用于细胞 ) 可以引发次级蛋白质或多肽的内源性表达 ( 如胶原或其他多肽 )。 他们所具有的提高和 / 或维持一个生化和 / 或生理过程的功效, 对美容外观具有积极作用。
因此, 本发明的实施例中包括对具有美容功效细胞的基因修饰的方法和组合物, 在某些实施例中, 本发明还包含对具有美容功效的细胞进行体内转染重组构建的方法。而 在另外一些实施例中, 通过将这种转染细胞注射入皮肤或其他美容相关的细胞中, 可以在
该组分可能进一步包含某种载体, 这种载体可以调控至少一种具有美容功效宿主 细胞中的多聚核苷酸或多肽。 在一个实施方案中, 确定主体后, 该组分使核酸和多肽在具有 美容功效的细胞中表达, 他们所具有的提高和 / 或维持一个生化和 / 或生理过程的功效, 对 美容外观具有积极作用。
在某些实施例中, 本发明的方法和组合物可能会导致多个蛋白的表达。他们所具 有的提高和 / 或维持一个生化和 / 或生理过程的功效, 对美容外观具有积极作用。例如, 和 外观有关的初级蛋白或氨基酸的表达 ( 例如, 将可以表达角质细胞生长因子的多聚核苷酸 或其他多肽应用于细胞 ) 可以引发次级蛋白质或多肽的内源性表达 ( 如胶原或其他多肽 )。 他们所具有的提高和 / 或维持一个生化和 / 或生理过程的功效, 对美容外观具有积极作用。
因此, 本发明的实施例中包括对具有美容功效细胞的基因修饰的方法和组合物, 在某些实施例中, 本发明还包含对具有美容功效的细胞进行体内转染重组构建的方法。而 在另外一些实施例中, 通过将这种转染细胞注射入皮肤或其他美容相关的细胞中, 可以在
体外进行相同的构建。而在其他一些实施例中, 多肽也可被用于本发明中。
对构建编码的众多生物分子进行重组, 可用来增强美容功效细胞的蛋白质和其他 生物大分子的表达。 在某一实施例中, 组分可能包括一种多肽, 或是构造包括编码多肽或其 他生物分子的重组 DNA 分子, 他们在具有美容功效的细胞中, 可以修饰基因的活性。例如, 在备用实施例中, 多聚核苷酸可以编码胶原多肽, 弹性蛋白多肽, TIMP-1 多肽, 超氧化物歧 化酶多肽, 和 / 或角质细胞生长因子 (KGF) 多肽。
或者, 重组构建可以编码调节核酸分子, 如反义寡核苷酸, 或 RNA 抑制子 (RNAi), 核酶, 三重螺旋形成寡核苷酸 (TFOs) 或肽核酸 (PNA), 它们能在具有美容功效的细胞内影 响基因, 例如通过下调表达胶原和弹性蛋白的降解酶 ( 如基质金属蛋白酶, 胶原酶, 明胶 酶, 弹性蛋白酶, 质溶解素, 丝氨酸蛋白酶和 / 或膜型基质金属蛋白酶 )。例如, 通过抑制胶 原 1 的表达, 来对抗富含半胱氨酸 61(CYR61/CCN1) ; 以及通过加快胶原和弹性蛋白的分解, 使基质金属蛋白酶抑制, 它们都可用于反义技术。
在交替的实施例中, 多聚核苷酸构造可以编码一种生长因子, 以提高美容的外观。 例如, 多聚核苷酸构造可以编码角质细胞生长因子 (KGF)。在其他实施例中, 多聚核苷酸 构造可能编码胰岛素样生长因子 1(IGF-I), 血小板衍生生长因子 (PDGF), 肝细胞生长因子 (HGF), 和 / 或转化生长因子 β(TGF-β)。本发明的方法和组合物, 可能会产生无需侵入式 外科手术就可达到的 “基因脸和 / 或纤体效果” , 这种基因修饰可能会恢复或增强有关于改 善美观的生理和 / 或生化过程 ( 如促进胶原, 弹性蛋白或超氧化物岐化酶的产生 ), 或减少 皮肤细胞的进程, 产生负的美观效果 ( 如通过增加抑制剂的表达, 从而增加对胶原酶的抑 制 )。
其他的实施例, 以及任何和本发明相关的进一步的细节将在如下的叙述和申明中 提出。需要说明的是, 本发明不仅仅是运用于如下所述的细节中, 更可以在其他的实施例 中, 通过各种各样的方式被实施和贯彻。
附图简述
图 1A-1C 描述如下 : 原胶原 DNA 序列 (COL1A1)( 序列 ID 号 : 1)( 图 1A 和 1B) ; 蛋 白质 ( 序列 ID 号 : 2)( 图 .1C) ; 以及将原胶原 cDNA 亚克隆入 Pcdna3.1 zeo 载体的引物 ( 图 .1C) ; 亚克隆引物的 5′端 ( 序列 ID 号 : 3) 包含一个 Nhe Ⅰ限制性内切酶位点 ( 下划 线 ) 和一个 Kozak 序列 ( 下划线粗体 ), 亚克隆引物的 3′端 ( 序列 ID 号 : 4) 包含一个 Hind Ⅲ限制性内切酶位点 ( 下划线 ) 和一个开放的阅读框 (ORF) 停止序列 ( 下划线粗体 ), 这与 本发明的实施例相一致 ; cds 即编码序列。
图 2A-2B 描述如下 : 弹性蛋白 DNA 序列 ( 序列 ID 号 : 5)( 图 2A) ; 蛋白质 ( 序列 ID 号: 6)( 图 .2B) ; 以及将弹性蛋白 cDNA 亚克隆入 Pcdna3.1 zeo 载体的引物 ( 图 .2B) ; 亚 克隆引物的 5′端 ( 序列 ID 号 : 7) 包含一个 Nhe Ⅰ限制性内切酶位点 ( 下划线 ) 和一个 Kozak 序列 ( 粗体 ), 亚克隆引物的 3′端 ( 序列 ID 号 : 8) 包含一个 Bgl Ⅱ限制性内切酶 位点 ( 下划线 ) 和一个开放的阅读框 (ORF) 停止序列 ( 下划线粗体 ), 这与本发明的实施例 相一致。
图 3A-3B 描述如下 : 超氧化物歧化酶 3(SOD3)DNA 序列 ( 序列 ID 号 : 9)( 图 3A) ; 蛋白质 ( 序列 ID 号 : 10)( 图 .3B) ; 以及将 SOD3 cDNA 亚克隆入 Pcdna3.1 zeo 载体的引物 ( 图 .3B) ; 亚克隆引物的 5′端 ( 序列 ID 号 : 11) 包含一个 Nhe Ⅰ限制性内切酶位点 ( 下划线 ) 和一个 Kozak 序列 ( 下划线粗体 ), 亚克隆引物的 3′端 ( 序列 ID 号 : 12) 包含一个 Hind Ⅲ限制性内切酶位点 ( 下划线 ) 和一个开放的阅读框 (ORF) 停止序列 ( 下划线粗体 ), 这与本发明的实施例相一致。
图 4 描述如下 : TIMP-1DNA 序列 ( 序列 ID 号 : 13) ; 蛋白质 ( 序列 ID 号 : 14) : 以及 将 TIMP-1cDNA 亚克隆入 Pcdna3.1 zeo 载体的引物 ; 亚克隆引物的 5′端 ( 序列 ID 号 : 15) 包含一个 Nhe Ⅰ限制性内切酶位点 ( 下划线 ) 和一个 Kozak 序列 ( 下划线粗体 ), 亚克隆 引物的 3′端 ( 序列 ID 号 : 16) 包含一个 Hind Ⅲ限制性内切酶位点 ( 下划线 ) 和一个开 放的阅读框 (ORF) 停止序列 ( 下划线粗体 ), 这与本发明的实施例相一致。
图 5A-5C 描述如下 : COL1A2 DNA 序列 ( 序列 ID 号 : 17)( 图 .A 和 B) ; 蛋白质 ( 序 列 ID 号 : 18)( 图 .B) ; 以及将 COL1A2 cDNA 亚克隆入 Pcdna3.1 zeo 载体的引物 ( 图 .C) ; 亚克隆引物的 5′端 ( 序列 ID 号 : 19) 包含一个 Nhe Ⅰ限制性内切酶位点 ( 下划线 ) 和一 个 Kozak 序列 ( 下划线粗体 ), 亚克隆引物的 3′端 ( 序列 ID 号 : 20) 包含一个 Hind Ⅲ限 制性内切酶位点 ( 下划线 ) 和一个开放的阅读框 (ORF) 停止序列 ( 下划线粗体 ), 这与本发 明的实施例相一致 ;
图 6 描述了一个例子, 即按照本发明的实施例, 处理具有美容功效细胞的方法。 图 7 描述了按照本发明的实施例, 重组 DNA 分子的例子。
图 8 描述了按照本发明交替的实施例, 如何运用 CMV 启动子驱动的真核载体 pcDNA3.1+zeo : intA, 使人体蛋白 COLAlA, COL1A2, 弹性蛋白, 和 TIMP-I 在哺乳动物细胞中 表达的克隆策略。
图 9 描述了按照本发明交替的实施例, 使用 PCR 对来自于正常人体组织 COLAlA, COL1A2, TIMP-I, 以及弹性蛋白的 cDNAs 进行扩增。
图 10 描述了按照本发明的实施例, 对 HEK-293T/17 细胞内的人体 COL1A2 进行瞬 时表达分析。分子量 138.9KDa 的 COL1A2 蛋白如箭头所示。
图 11 描述了按照本发明的实施例, 对 HEK-293T/17 细胞内的人体 TIMP-I 进行瞬 时表达分析。分子量 23.2KDa 的 TIMP-I 蛋白如箭头所示。
图 12 描述了按照本发明的实施例, 对 HEK-293T/17 细胞内的人体弹性蛋白进行瞬 时表达分析。分子量 66.1KDa 的弹性蛋白如箭头所示。
图 13 描述了按照本发明交替的实施例, 如何运用 CMV 启动子驱动的真核载体 pcDNA3.1+zeo : intA, 使人体蛋白 KGF-I 在哺乳动物细胞中表达的克隆策略。
图 14 描述了按照本发明交替的实施例, 使用 PCR 对来自于正常人体肺组织的 KGF-I 的 cDNAs 进行扩增。感兴趣的扩增基因序列如箭头所示, 并指出了相应的大小。KBL, 碱基梯 ; kbp, 碱基对。
图 15A-15B 描述了按照本发明的实施例, 在中期的 PCR-TOPO 载体中克隆人体 KGF-I 的 cDNA(0.58kb 嵌入 )( 图 .15A) 以及随后在哺乳动物细胞中表达 pcDNA3.1+zeo : intA( 图 .15B) 载体的克隆。KGF-I 基因是由 Nhel 和 Hind Ⅲ从 pCR-TOPO 中切割而来, 在 具有相同限制性内切酶的 pcDNA3.1+zeo : intA 中被定向克隆, 感兴趣的扩增基因序列如箭 头所示, 并指出了相应的大小。如图 .15B 所示是 5 个独立的亚克隆 (1-5), 其中泳道 1 和 2 是未切割的, 以及 Nhel 和 HincKR 为克隆会消化小量的 DNAs, 他们是克隆 1( 分别是泳道 1 和 2), 克隆 2( 泳道 3 和 4), 克隆 3( 泳道 5 和 6), 克隆 4( 泳道 7 和 8), 克隆 5( 泳道 9 和
图 8 描述了按照本发明交替的实施例, 如何运用 CMV 启动子驱动的真核载体 pcDNA3.1+zeo : intA, 使人体蛋白 COLAlA, COL1A2, 弹性蛋白, 和 TIMP-I 在哺乳动物细胞中 表达的克隆策略。
图 9 描述了按照本发明交替的实施例, 使用 PCR 对来自于正常人体组织 COLAlA, COL1A2, TIMP-I, 以及弹性蛋白的 cDNAs 进行扩增。
图 10 描述了按照本发明的实施例, 对 HEK-293T/17 细胞内的人体 COL1A2 进行瞬 时表达分析。分子量 138.9KDa 的 COL1A2 蛋白如箭头所示。
图 11 描述了按照本发明的实施例, 对 HEK-293T/17 细胞内的人体 TIMP-I 进行瞬 时表达分析。分子量 23.2KDa 的 TIMP-I 蛋白如箭头所示。
图 12 描述了按照本发明的实施例, 对 HEK-293T/17 细胞内的人体弹性蛋白进行瞬 时表达分析。分子量 66.1KDa 的弹性蛋白如箭头所示。
图 13 描述了按照本发明交替的实施例, 如何运用 CMV 启动子驱动的真核载体 pcDNA3.1+zeo : intA, 使人体蛋白 KGF-I 在哺乳动物细胞中表达的克隆策略。
图 14 描述了按照本发明交替的实施例, 使用 PCR 对来自于正常人体肺组织的 KGF-I 的 cDNAs 进行扩增。感兴趣的扩增基因序列如箭头所示, 并指出了相应的大小。KBL, 碱基梯 ; kbp, 碱基对。
图 15A-15B 描述了按照本发明的实施例, 在中期的 PCR-TOPO 载体中克隆人体 KGF-I 的 cDNA(0.58kb 嵌入 )( 图 .15A) 以及随后在哺乳动物细胞中表达 pcDNA3.1+zeo : intA( 图 .15B) 载体的克隆。KGF-I 基因是由 Nhel 和 Hind Ⅲ从 pCR-TOPO 中切割而来, 在 具有相同限制性内切酶的 pcDNA3.1+zeo : intA 中被定向克隆, 感兴趣的扩增基因序列如箭 头所示, 并指出了相应的大小。如图 .15B 所示是 5 个独立的亚克隆 (1-5), 其中泳道 1 和 2 是未切割的, 以及 Nhel 和 HincKR 为克隆会消化小量的 DNAs, 他们是克隆 1( 分别是泳道 1 和 2), 克隆 2( 泳道 3 和 4), 克隆 3( 泳道 5 和 6), 克隆 4( 泳道 7 和 8), 克隆 5( 泳道 9 和
10), 分子大小标记的碱基梯 ( 泳道 11) 以及一个 100 碱基对的碱基梯 ( 泳道 12) ; kbp, 碱 基对。
图 16A-16B 描述了按照本发明的实施例, KGF-I 的氨基酸序列 ( 图 16.A) 和核苷 酸序列 ( 又名 FGF-7 或 KGF-l/FGF-7)( 图 16.B)。
图 .17 描述了对人体细胞提取物中的 KGF-I(a), COLAlA(b) 和 COL1A2(c) 蛋白, 以及运用 pcDNA3.1+ : intA/KGF-I 转染 HEK-293T/17 细胞的上清液, 单独载体 (pcDNA3.1+ : intA), 或非 DNA 调控进行瞬时表达的分析。KGF-I 蛋白如黑箭头所示, M 是标准分子量参照 物, KDa 即道尔顿。
发明详述
定义
尽管本发明中, 数值和参数设定的广泛范围都是近似值, 但是在具体的实施例中 所列的数值是尽可能准确的。 然而, 在本质上包含任何错误的数值, 必然在各自的测试测量 中导致标准偏差。此外, 此处披露的所有范围, 应理解为包括该量程中任何的及所有的子 域。例如, 一个 “1 至 10” 的规定范围, 应视为包括任何以及所有最小值是 1, 最大值是 10 的 子域。即所有以最小值 1 开头的子域, 如 1 至 6.1, 以及以最大值 10 结尾的子域, 如 5.5 至 10。此外, 任何被称为 “纳入本发明” 的参考, 都将被认为是纳入其整体之中。 此处进一步指出, 在本发明中, 单数形式的 “a” “an” 和 “the” 除非是明确和毫不 含糊的指出包含复数参照物, 否则都只限定是单数。术语 “或” “和 / 或” 可以交替使用, 除 非文意明确指出另有其他。
此外, 此处使用的主体是哺乳动物需要的, 用以维持或改善任何具有美容功效细 胞状态的治疗。这些主体可以是动物 ( 如有某种皮肤状况的动物 ), 也可以是人。主体可 能是人, 如绝经的妇女, 或是一个非人的哺乳动物, 如需要治疗皮肤, 指甲, 头发或皮毛的宠 物。
此处使用的具有美容功效的细胞包括 : 皮肤, 脂肪, 肌肉, 结缔组织, 以及在表皮, 真皮和皮下组织层的神经细胞 ; 还包括指甲根部的甲床, 指甲基质和指甲板细胞 ; 头皮, 头 发毛囊和头发细胞 ; 以及皮下脂肪层和舌头下的肌肉细胞 ; 牙齿和牙龈细胞 ; 骨骼细胞, 包 括面部骨骼 ; 眼睛中的细胞 ( 包括虹膜和覆盖虹膜的基质 )。
本发明中所使用的 “表皮组织” 包括外胚层的衍生组织。外胚层是后生动物胚胎 的最外层, 而后发展成表皮和神经组织。这其中表皮组织包括皮肤, 指甲和头发。
本发明中所使用的 “皮肤” 是指表皮和真皮。皮肤的最外层表皮是由具有底层基 底膜的复层鳞状上皮组成。皮肤表层不含任何的血管, 通过真皮扩散获取养分。组成表皮 的主要细胞形式是角质细胞。另外也有黑色素细胞和朗氏细胞。另外, 表皮可以进一步从 外到内细分为几个层 : 角质层, 透明层, 颗粒层, 棘层和基底。 真皮位于表皮下部, 包括血管, 神经, 毛囊, 平滑肌, 腺体和淋巴组织。此外, 成纤维细胞通常也存在于真皮层, 分泌到细胞 外基质, 富含胶原, 弹性蛋白, 透明质酸等大分子物质。 下皮层存在于真皮层的下部, 包含充 满脂肪的脂肪细胞以及较大的血管和神经细胞。肌肉位于皮下脂肪下面。皮肤结构是通过 肌肉的结缔组织附着在一起的。 结缔组织像锚一样, 使皮肤, 脂肪和肌肉与骨组织很好的连 接在一起。而在下皮层的附属区, 过多的脂肪会造成 “橘皮” 状的纹状外观。
本发明中使用的, “基本上完整的细胞” 包括没有因外伤造成的撕裂, 切割和刺破
此外, 此处使用的主体是哺乳动物需要的, 用以维持或改善任何具有美容功效细 胞状态的治疗。这些主体可以是动物 ( 如有某种皮肤状况的动物 ), 也可以是人。主体可 能是人, 如绝经的妇女, 或是一个非人的哺乳动物, 如需要治疗皮肤, 指甲, 头发或皮毛的宠 物。
此处使用的具有美容功效的细胞包括 : 皮肤, 脂肪, 肌肉, 结缔组织, 以及在表皮, 真皮和皮下组织层的神经细胞 ; 还包括指甲根部的甲床, 指甲基质和指甲板细胞 ; 头皮, 头 发毛囊和头发细胞 ; 以及皮下脂肪层和舌头下的肌肉细胞 ; 牙齿和牙龈细胞 ; 骨骼细胞, 包 括面部骨骼 ; 眼睛中的细胞 ( 包括虹膜和覆盖虹膜的基质 )。
本发明中所使用的 “表皮组织” 包括外胚层的衍生组织。外胚层是后生动物胚胎 的最外层, 而后发展成表皮和神经组织。这其中表皮组织包括皮肤, 指甲和头发。
本发明中所使用的 “皮肤” 是指表皮和真皮。皮肤的最外层表皮是由具有底层基 底膜的复层鳞状上皮组成。皮肤表层不含任何的血管, 通过真皮扩散获取养分。组成表皮 的主要细胞形式是角质细胞。另外也有黑色素细胞和朗氏细胞。另外, 表皮可以进一步从 外到内细分为几个层 : 角质层, 透明层, 颗粒层, 棘层和基底。 真皮位于表皮下部, 包括血管, 神经, 毛囊, 平滑肌, 腺体和淋巴组织。此外, 成纤维细胞通常也存在于真皮层, 分泌到细胞 外基质, 富含胶原, 弹性蛋白, 透明质酸等大分子物质。 下皮层存在于真皮层的下部, 包含充 满脂肪的脂肪细胞以及较大的血管和神经细胞。肌肉位于皮下脂肪下面。皮肤结构是通过 肌肉的结缔组织附着在一起的。 结缔组织像锚一样, 使皮肤, 脂肪和肌肉与骨组织很好的连 接在一起。而在下皮层的附属区, 过多的脂肪会造成 “橘皮” 状的纹状外观。
本发明中使用的, “基本上完整的细胞” 包括没有因外伤造成的撕裂, 切割和刺破
的细胞。然而, 这些细胞可能已接受过激光治疗, 化学去皮, 祛疤或其他增加美观的治疗。
除非另有界定, 否则此处使用的所有技术和科学术语都具有相同的含义, 即该技 术领域中公知的一种普通技能。 参与者应该详细的根据分子生物学当前的协定来确定技术 的定义和术语。氨基酸残基的缩写, 是标准的 3 个字母或 1 个字母的代码, 用来在技术中指 代 20 种 L- 氨基酸之一。
有关于多聚核苷酸 “重组” 这一术语, 来源于多聚核苷酸的半合成, 合成或是由 cDNA, 基因组 DNA(“gDNA” ) 编码得来, 他们与这些在自然中与自身完全或部分关联的多聚 核苷酸不完全相关联。
此处所使用的″多肽″这一术语, 指的是一种氨基酸的聚合物, 并不是指产品的 特定长度。因此, 多肽的定义中可以包含多肽、 低聚肽、 蛋白质并且最短可至两个氨基酸。 这个术语也指修饰后表达的多肽, 例如, 糖基化、 乙酰化、 磷酸化或类似反应。 例如定义范围 内的多肽包含一个或多个类似氨基酸 ( 例如非天然氨基酸 ), 有替代关联的多肽, 以及在技 术领域中已被公知的发生自然或非自然修饰的多肽。正如在该技术领域中公知的, “蛋白 质” “肽类” “多肽” 和 “寡肽” 是氨基酸链碳 ( 通常为 L- 氨基酸 ), 他们的 α 炭通过缩合反 应形成肽键, 使彼此的氨基酸相连接。通常情况下, 组成蛋白质的氨基酸的编号顺序, 起始 于氨基末端, 向着羧基末端的方向延长。 ″核酸″是指多聚核苷酸, 如脱氧核糖核酸 (DNA) 或核糖核酸 (RNA) 等。这一术 语通常包括单链核酸, 双链核酸, 以及 RNA, DNA 的核苷酸或核苷类似物。此处使用的术语″ 多聚核苷酸″是指一个 DNA 分子、 RNA 分子或其互补链。一个多聚核苷酸分子可以单个或 双链的。
DNA 分子可由其核酸序列鉴别, 通常是由 5′到 3′方向。 其中 5′和 3′是指上一 个核苷酸的 5′端的磷酸基团和下一个核苷酸的 3′端羟基之间的连接。一段 5′到 3′方 向的序列, 他的互补链的序列是按照沃森 - 克里克碱基配对原则形成的。因此互补链的序 列由母链序列决定, 如胸腺嘧啶对腺嘌呤, 鸟嘌呤对胞嘧啶。
此处使用的, 一个小的抑制 RNA 是 20-30 个核苷酸组成的双链 RNA, 与蛋白结合后 形成一个 RNA 干扰诱导的沉默复合体 (RISC), 可以直导 siRNA 到目标 RNA 序列。随后, 双链 siRNA 松开, 通过内切酶和核酸外切酶的作用, 离开反义链, 使 mRNA 序列的信号减弱。为了 获得持久的治疗效果, RNAi 需要长时间表达, 最好是有构建的启动子。为了获得一个载体 的双链 RNA, 它需要被表达成一个短发夹状 RNA(shRNA), 其中有一个正义链, 发夹环区域和 反义链 (Miyagishi 等, J 基因医学 6 : 715-723, 2004)。
此处所指的术语 “上游” , 当是蛋白质分子时, 是靠近第二个残基的 N 端残基 ; 当是 核苷酸分子时, 是靠近第二个残基的 5′端。而术语 “下游” 是指, 当是蛋白质分子时, 指靠 近第二个残基的 C 端残基 ; 当是核苷酸分子时, 指靠近第二个残基的 3′端。此外, “部分” 和 “片段” 交替使用, 指一种多肽, 核酸, 或其他分子构造的部分。
“载体” 一词是指一个核酸分子可以转运另一个核酸分子进出细胞。在某些例子 中, 载体可以允许 DNA 序列复制进自身。同时载体需要包含一个启动子, 这样至少在部分宿 主细胞内, 可以加强或维持核苷酸的表达。 载体可以自主复制, 或被整合到宿主细胞的染色 体上。 有例子表明, 载体中包含一种表达载体, 它可以按照核苷酸的部分序列复制出蛋白质 或核苷酸, 再将其嵌入载体中。
DNA 分子可由其核酸序列鉴别, 通常是由 5′到 3′方向。 其中 5′和 3′是指上一 个核苷酸的 5′端的磷酸基团和下一个核苷酸的 3′端羟基之间的连接。一段 5′到 3′方 向的序列, 他的互补链的序列是按照沃森 - 克里克碱基配对原则形成的。因此互补链的序 列由母链序列决定, 如胸腺嘧啶对腺嘌呤, 鸟嘌呤对胞嘧啶。
此处使用的, 一个小的抑制 RNA 是 20-30 个核苷酸组成的双链 RNA, 与蛋白结合后 形成一个 RNA 干扰诱导的沉默复合体 (RISC), 可以直导 siRNA 到目标 RNA 序列。随后, 双链 siRNA 松开, 通过内切酶和核酸外切酶的作用, 离开反义链, 使 mRNA 序列的信号减弱。为了 获得持久的治疗效果, RNAi 需要长时间表达, 最好是有构建的启动子。为了获得一个载体 的双链 RNA, 它需要被表达成一个短发夹状 RNA(shRNA), 其中有一个正义链, 发夹环区域和 反义链 (Miyagishi 等, J 基因医学 6 : 715-723, 2004)。
此处所指的术语 “上游” , 当是蛋白质分子时, 是靠近第二个残基的 N 端残基 ; 当是 核苷酸分子时, 是靠近第二个残基的 5′端。而术语 “下游” 是指, 当是蛋白质分子时, 指靠 近第二个残基的 C 端残基 ; 当是核苷酸分子时, 指靠近第二个残基的 3′端。此外, “部分” 和 “片段” 交替使用, 指一种多肽, 核酸, 或其他分子构造的部分。
“载体” 一词是指一个核酸分子可以转运另一个核酸分子进出细胞。在某些例子 中, 载体可以允许 DNA 序列复制进自身。同时载体需要包含一个启动子, 这样至少在部分宿 主细胞内, 可以加强或维持核苷酸的表达。 载体可以自主复制, 或被整合到宿主细胞的染色 体上。 有例子表明, 载体中包含一种表达载体, 它可以按照核苷酸的部分序列复制出蛋白质 或核苷酸, 再将其嵌入载体中。
在该技术领域中周知的是, 核酸序列相互杂交的条件, 是严密性从低到高的进化。 通常说来, 高度严密的杂交, 是用高温, 低盐缓冲溶液洗涤。杂交也可以利用科学的杂交方 案标准过滤掉限制性的 DNA, 如 0.5M NaHPO4 和 7%十二烷基硫酸钠 (SDS), 在 65℃, 以及用 0.1 x SSC/0.1% SDS 洗涤后再用 0.25M NaHPO4, 3.5% SDS 洗涤, 温度范围可以从室温到 68℃, 这由探针的长度决定。( 见例如 Ausubel, F.M. 等, Short Protocols in Molecular Biology, 第 4 版, 第 2 章, John Wiley&Sons, N.Y)。例如, 一个高度严密性的洗涤包括 6x SSC/0.05%焦磷酸钠, 在 37℃下洗涤得到的 14 个碱基的寡核苷酸探针 ; 或是 48℃下得到的 17 个碱基的寡核苷酸探针 ; 或是 55℃下得到的 20 个碱基的寡核苷酸探针 ; 或是 6O℃下得 到的 25 个碱基的寡核苷酸探针 ; 或是 65℃下得到的一个约 250 个核苷酸长度的核酸探针。 核酸探针常由放射性核酸标记, 例如在尾部由 [γ-32P]ATP 标记, 或是和 [α-32P]dCTP 通过 随机的初级结合而标记。 此外, 探针通过和生物标记素或被荧光标记的核酸相结合, 而被标 记, 并使用链霉素亲和素或抗荧光抗体来检测探针。
术语 “相似性” 或 “相似百分比” 指的是两个氨基酸序列或核酸序列之间的同源性, 相似百分比用以校准两条核酸序列, 指的是在共同的位置比较相似残基 ( 氨基酸或核酸 ) 的数量。序列的校准和比较是按照目前科学的计算标准, 或是公开在 BLAST 和 FASTA 上的 计算版本来进行。此外, 由美国国立卫生院, Bethesda 医师提供的 ENTPvEZ, 可用于序列比 较。在实施例中, 两个序列的相似百分比可由重量差距为 1 的 GCG 来确定, 把每个氨基酸的 差距加权, 就好像是两个序列间不匹配的单个氨基酸一样。 例如, 某序列和指定的序列有至 少 90%相似, 是指范围从 90 到 99.99%, 并且包含之间所有的范围。即它和指定序列的相 似度可以是 91, 91.5, 92, 92.5, 93, 93.5.94, 94.5, 95, 95.5, 96, 96.5, 97, 97.5, 98, 98.5, 99, 99.5%。同理, 某序列和指定的序列有至少 70%相似, 是指范围从 70 到 99.99%, 并且包含 之间所有的范围。而具体的数值取决于所使用的计算方法。
在此, “同源性” 是指一个序列与另一个序列 ( 蛋白质或核酸序列 ) 的序列相似程 度。通常, 两个同源序列之间的相似程度至少在 50%。在备用实施例中, 同源序列的相似 性不低于 60%或者 75%或者 80%, 甚至有时高达 90%。在另一些实施例中, 两个序列之间 的相似性至少在 95%或 98%, 甚至 99%。与此类似, 此处所提到的 “同源物” 表示与野生 型氨基酸序列具有同源性的多肽。同源性比对可通过肉眼进行, 但更多情况下需要借助于 序列比对程序。这些商业化的程序能够计算出两个甚至更多序列间的同源性百分比 ( 例如 Wilbur, W. J. 和 Lipman, D.J., 1983, Proc.Natl.Acad Sci.USA, 80 : 726-730)。
任何有生物活性的多肽或有功能的衍生物 ( 和 / 或类似物 ) 包括对多肽的其中一 个或多个氨基酸进行修饰、 插入、 缺失或替换而又不显著影响多肽的性质。例如, 具有生物 活性的衍生物或类似物可以通过替换保守氨基酸而实现。当然, 生物活性衍生物也要包含 原始肽段的片段。最好衍生物或类似物与原始肽段相比具有更高的活性或稳定性。
突变蛋白质可以通过传统的技术来获得类似物和衍生物。在某个实例中, 衍生物 与原始多肽相比可能具有更高的活性。 例如, 在某些实例中, 衍生物或类似物的活性至少提 高了 2 倍, 有的至少提高 5-10 倍, 甚至提高 20 倍。
“突变蛋白” 是通过改变多肽一个或者更多氨基酸来得到预期的多肽, 例如用非二 硫键形式的氨基酸代替半胱氨酸残基。
突变蛋白、 类似物和衍生物还可以用另外一些传统技术来获得。例如, PCR 引入的突变可以被利用。 虽然以下讨论都是针对 DNA, 但该技术也可以应用到 RNA 上。 WO 92/22653 中描述了 PCR 技术的实例。获得类似物、 突变蛋白和衍生物的另一种方法是以 Wells 提出 的技术为基础的盒式突变形成 (Gene, (1985)34 : 315)。
目前, 发明中所涉及的术语 “类似物” 或 “衍生物” 是指基因的断裂、 变异、 等位基 因造成并由此产生的衍生物。这些术语只在具有 “成熟” 多肽或功能性多肽生物活性的情 况下适用。因此, 人或非人来源的成熟蛋白质或功能多肽具有至少 60%、 或者 70%、 80%甚 至高达 90%的序列同源性的多肽都涵盖在此定义中。 某种蛋白的类似物还包括与其具有一 处或多处肽段相似性 ( 类肽 ) 并具有蛋白生物活性的多肽。此定义还包括含有一个或多个 类似氨基酸 ( 如非自然界存在的氨基酸 ) 的多肽、 含有替代化学键的多肽以及其他自然存 在或非自然存在的修饰后多肽。多肽一词也不排除表达后进行过化学修饰 ( 诸如糖基化修 饰、 乙酰化修饰和磷酸化修饰之类 ) 的多肽。
因此, 通过调节细胞环境而实现美容功效的多肽类似物和 / 或衍生物可能含有氨 基酸替换、 缺失或插入。氨基酸替换应该是对保守氨基酸进行替换或者消除非必需氨基酸 残基的替换, 例如改变糖基化位点、 乙酰化位点, 或者通过替换或缺失一个或多个对蛋白功 能不必要的半胱氨酸残基来减少多肽的错误折叠。 此处使用的 “保守氨基酸” 一词是指拥有相同结构和 / 或功能的一类蛋白质群体 中完全相同的氨基酸。大多数保守的氨基酸残基对蛋白质的结构和功能是非常重要的。因 此, 鉴定出蛋白质三维结构中存在的连续保守氨基酸区域对该蛋白质的结构和功能非常重 要。 为了找到保守的氨基酸残基或三维结构中的保守区域, 要对不同物种、 或同一物种的不 同个体间相同或相似的蛋白质进行序列比对。对保守氨基酸的替换通常要能够维持多肽 整体的电荷量、 疏水性或亲水性或空间体积, 例如, 有如下氨基酸取代的即为保守氨基酸取 代: 甘氨酸 / 丙氨酸, 缬氨酸 / 异亮氨酸 / 亮氨酸, 天冬氨酸 / 谷氨酸, 赖氨酸 / 精氨酸, 天 冬酰胺 / 谷氨酰胺, 丝氨酸 / 半胱氨酸 / 苏氨酸和苯丙氨酸 / 色氨酸 / 酪氨酸。
“表达载体” 是一种多聚核苷酸, 可以在目的宿主细胞内起作用, 同时可以引起宿 主细胞生成有益的基因。
“调控序列” 指的是一段多聚核苷酸序列, 负责调控与它自身相连接的编码基因的 表达。这种调控序列的本质随宿主的不同而不同。通常包括启动子, 转录终止序列等。 “调 控序列” 还包括一些其他的有益存在, 例如, 分泌多肽的分泌前导序列。
“可行性连接” 指的是, 在允许组件按各自方式发挥功能的基础上, 给他们并置某 些有关联的组分。 在不影响编码序列表达的基础上, 编码序列和控制序列和谐的连接, 这就 是可行性连接。在这两个组分之外, 可行性连接可能会有自己额外的核苷酸 ( 或肽类的氨 基酸 )。
此处使用的 “终止子” 是一种控制序列, 如多聚腺苷酸和转录终止序列, 位于 3′端 或终止密码子编码序列的下游调控序列。
本文所用的 “重组宿主细胞” “宿主细胞” “细胞” “细胞培养” 和其他类似的术语, 表示微生物, 昆虫细胞和哺乳动物细胞, 可以或已被用来作为引进重组载体或以其他方式 转移 DNA 的接受者, 包括已转化细胞的后代。
本文使用的 “转化” 或 “转染” 是指进入宿主细胞的外源性核苷酸的转移, 可以使 用多种转移方法, 例如, 感染, 直接吸收, 传导, F- 交配, 注射, 显微注射或电击。外源性核苷
酸可以作为非集成载体被维持, 例如在某些情况下, 质粒可能会被整合到宿主基因组中。
“纯化的” 和 “分离的” 是指一种多肽或核苷酸序列, 表示该序列的分子在其它相同 品种或类型的生物大分子中实质性的缺乏。在其他的方案中, 术语 “精炼的” 是指重量至少 占相同类型生物大分子质量的 75%, 85%, 95%或 98%。
“药学可接受的载体” 是指任何可以服用进入人体, 而不会产生任何不良副作用的 载体。如抗体产生的发热症状等。
“处理” 或 “治疗” 是指改善或防止恶化状态 ( 如皮肤皱纹 ), 或改进主体的状况。 在某些实施例中, “治疗” 一词是指对美容外观状态的广泛的治疗, 包括减轻某种症状或是 这种状态引起的其他症状。
“有效量” 是指能够产生理想结局的有效量。这个数值会变化, 取决于接收治疗的 人不同的健康或生理状态, 个体对合成抗生素的免疫力, 需要保护的程度, 药物的制剂, 主 治医生对医疗状况的评估, 以及其他的相关因素。
本文使用的, “体内转染” 或 “体内合并” 是指, 有益的生物分子被引入活体细胞的 过程。这个术语包含了对单独多聚核苷酸的转染, 或者是包含一个额外基团或进入细胞的 载体的多聚核苷酸。体内转染的具体方法将在细节中介绍。 “体外转染” 或 “体外合并” 是指, 有益的生物分子被引入活体外细胞的过程。这个 术语包含了对单独多聚核苷酸的转染, 或者是包含一个额外基团或进入细胞的载体的多聚 核苷酸。体外转染的具体方法将在细节中介绍。
本文使用的, 维护具有美容功效细胞的多肽, 可以是如前所述的任何形式的多肽。 它们可以促进生成, 增强这类细胞健康和寿命的生物分子。 正如领域中众所周知的, 这种蛋 白的肽类和基因的序列已经可以从公共数据库中获得。
本文使用的, “血小板衍生生长因子” 或 “PDGF” 包括 PDGF A 链多肽, PDGF B 链多 肽, 以及 AA, BB, AB 型的二聚体, 生物活性片段, 类似物, 衍生物。这些都在如下文献中有 介绍 : 美国专利, 专利号 5,187,263, Waterfield 等 ., Nature 304 : 35-39(1983) ; Wang 等, J.Biol.Chem.259 : 10645-48(1984), Antoniades 等, Biochem.Pharm.33 : 2833-38(1984) ; 和 Westermark 等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83 : 7197-7200(1986) ; 美 国 专 利, 专利号 5,219,759。一种 “具有生物活性的 PDGF” 多肽是指, 一种具有相同或更好的, 能优先刺激 皮肤真皮层细胞生长或增殖能力的多肽。这种多肽可以是一个全长 PDGF, PDGF 片段, 或 是 PDGF 的类似物。他可以承担 PDGF 氨基酸的替换, 删除, 增加或衍生。这些在如下的文 献中有介绍 : 美国专利, 专利号 5,149,792, EP 458959B1 ; 以及美国专利 Nos.4,769,328 ; 4,801,542 ; 4,766,073 ; 4,849,407 ; 4,845,075 ; 4,889,919 ; 5,045,633 ; 和 5,128,321。
本文使用的, “角质细胞生长因子” 或 “KGF” 指的是一群结构不同的蛋白族中的一 种, 这个蛋白族称作 FGFs, 它们显示不同程度的序列同源性。这表明他们是由相同的基因 家族编码的。FGFs 在细胞表面具有相同的结合位点。例如, KGF 能够和 FGFR-3 结合。同时 “角质细胞生长因子” 或 “KGF” 指的是任何一个如前所述的成熟的多肽或生物活性片段, 类 似物或衍生物, 例如 WO 90/08771 和 WO 95/01434。
一种 “具有生物活性的 KGF” 多肽是指, 一种具有相同或更好的, 能优先刺激皮肤 表皮层细胞生长能力的多肽。这种多肽可以是一个全长 KGF, KGF 片段, 或是 KGF 的类似物。 他可以承担 KGF 氨基酸的替换, 删除, 增加或衍生。这些在 WO 90/08771 和 WO 95/01434 中
有介绍。 此处使用的术语 “胰岛素样生长因子” 是指, 在大幅纯化的, 天然的, 重组生产的 以及化学合成的各种形式中, 包含的 IGF-I 和 IGF-II。除此之外还包括生物活性片段, 类 似物, 突变蛋白, C 端缺失的突变蛋白以及衍生物。他们可以保持胰岛素样生长因子的活 性, 或连接胰岛素受体的能力。例如以下文献描述的 : EP 135 094, WO 85/00831, 美国专 利, 专利号 4,738,921, WO 92/04363, 美国专利, 专利号 5,158,875, EP 123 228 和 EP 128 733。同时相同的内容在如下文献中也有描述 : EP 135 094, WO 85/00831, 美国专利, 专利 号 4,738,921, WO 92/04363, 美国专利, 专利号 5,158,875, EP 123 228 和 EP 128 733。一 种 “具有生物活性的 IGF” 多肽是指, 一种具有相同或更好的胰岛素样作用的生长因子。例 如, 在与其连接的受体的胞质区, 对特定的酪氨酸残基进行磷酸化的刺激, 如 WO 93/98826 所述。或是在另一些例子中, 对某种细胞有丝分裂的影响, 如 EP 0128733 所述。这种多肽 可以是一个全长 IGF, IGF 片段, 或是 IGF 的类似物。他可以承担 IGF 氨基酸的替换, 删除, 增加或衍生。
本发明中所使用的 “胰岛素样生长因子结合蛋白 (IGFBP)” , 是指一个绑定了 IGF 结合蛋白的结合蛋白。在如下文献中被鉴别和描述 : Keifer et al, J.Biol.Chem.266 : 9043-9(1991), Camacho-Hubner 等, J.Biol.Chem.267 : 11949-56(1992), McCusker 和 Clemens, THE INSULIN LIKE GROWTH FACTORS : STRUCTURE AND BIOLOGICAL FUNCTIONS, Oxford Univ.Press, N.Y. pp.110-150(1992)。一种 “具有生物活性的 IGFBP” 多肽是指, 具
有相同或更好的胰岛素样生长因子绑定蛋白的活性的多肽, 通过向那些胰岛素样生长因子 可以发挥活性的组织和细胞内绑定及输送胰岛素样生长因子而发挥作用。 正如现在至少有 6 种已知的 IGFBP, 他们中有些与其他的 IGFBP 很不同。一个给定的 IGFBP 的生物活性相关 的特质不必包括整个胰岛素样生长因子整体。一个独立的 IGFBP 的生物活性或许和其他的 IGFBP 有相似之处, 但也有不同。
此处使用的 “全长 PDGF” 或 “成熟 PDGF” 和 “全长 KGF” 或 “成熟 KGF” 和 “全长 IGF” 或 “成熟 IGF” 和 “全长 IGFBP” 或 “成熟 IGFBP” 指的是在人或其他哺乳动物组织中发现的, 各自的母体多肽。
此处使用的 “胶原” 是指一个含有至少 28 个结构相关蛋白 ( 胶原 I-XXVIII) 的大 族群中的一员, 它们显示不同程度的序列同源性。 这表明他们是由相同的基因家族编码的。 胶原是组成细胞外间质的主要纤维多肽, 同时也是皮肤结构的支撑。它包括真皮, 表皮 - 真 皮交界以及其他身体组织。这类蛋白质组成了多种, 结构和功能重要的超分子组件 ( 例如 参见, Pihlajamaa T., New tools for the study of an old collagen characterization of the human COL9A1, COL9A2 and COL9A3 genes and production of human type IX collagen as a recombinant protein.Collagen Research Unit, Biocenter OuIu and Department of Medical Biochemistry, University of OuIu, FIN-90220OuIu, Finland, 2000, OuIu, Finland)。胶原的特点是由三重螺旋其中的三个相同或不同的多肽链组成的, 称为 α 链。而单个胶原则是以结构划分成两个主要群体为其特征, 如纤维状和非纤维状。 纤维状的群体和原纤维中, 胶原包括 I, II, III, V 和 XI 型。
I, II 和 III 型的胶原作为主要的纤维状胶原, 意味着含有大量的组织。大部分的 I 型胶原在结缔组织中表达, 同时也是最丰富的胶原, 是皮肤, 骨骼, 肌腱和韧带的主要结构成分。I 型胶原通常以异三聚体的形式存在, 包括两个 α1(I) 链和一个 α2(I) 链, 分别由 COL1A1 和 COL1A2 基因编码。II 型胶原则是软骨, 玻璃体和椎间盘的主要成分, 也是在其发 展过程中, 在内耳和许多其他组织中瞬时检测到的。它是一个由 COL2A1 基因编码的同三聚 体, 由三个 α1(II) 链组成。 III 型胶原也是同三聚体, 由 α1(III) 链组成。 它在大部分含有 I 型胶原的组织中表达, 除了骨骼和肌腱。在弹性蛋白组织中广泛存在, 包括皮肤, 血管, 内 脏和肺, 可与 I 型胶原组装成异型纤维。除了形成原纤维, 非纤维状胶原还可以提供许多其 他功能。 他们的三重螺旋特质会因为非胶原的干扰而分裂为若干片段。 而非纤维状的胶原, 根据他们的结构和功能不同分为六个亚群。重要的网状胶原包括 IV 型, VI 型和 VII 型。IV 型胶原网络存在于身体大部分位点的所有基底膜中。在大部分位点中, 这种支持和控制的 网络包括 α1(IV) 和 α2(IV) 链, 但是某些基底膜, 如肾小球膜, 也包括 α3(IV), α4(IV), α5(IV) 和 α6(IV) 链。这些 α 链的胶原区, 长度大约是 1400 个氨基酸, 并含有许多短暂 的中断。编码这些多肽的基因, 在一般随机定位的胶原基因之间, 形成了一个有趣的例外, 那就是在三种染色体头对头连接的趋势中, 它们被成对的定位。VI 型胶原是由 α1(VI), α2(VI) 和 α3(VI) 链组成的异三聚体, 它由一个侧面具有大型球状 N 和 C 端的简短三重 螺旋组成。 它是唯一聚合成串珠状微丝的胶原, 存在于细胞表面, 众多结缔组织周围的胶原 纤维中, 并可能作为细胞外基质中的大分子框架与细胞相连的锚定位点。VII 型胶原通过 二聚以及和同三聚体 α1(VII) 三个分子侧面的结合而形成锚固纤维。这些纤维连接上皮 基底膜到皮肤的细胞外基质底部, 角膜以及一些其他的上皮组织。高度中断的 VII 型三重 螺旋, 在所有胶原中是最长的, 并且编码它的 COL7A1 基因具有已知基因中最多数量的外显 子, 如 108 个。因此在替代方案中, 运用在本发明方法和组合物中的胶原肽, 以及表达会使 这些使用增加的胶原肽可以是完整长度的胶原, 胶原片段或其功能类似物。这种胶原可能 包括Ⅰ型 (COL1A1 和 COL1A2 基因, 体内最丰富的胶原 ), Ⅱ型 (COL2A1 基因, 透明软骨 ), Ⅲ 型 (COL3A1 基因, 肉芽组织中发现 ), IV 型 (COL4A1, COL4A2, COL4A3, COL4A4, COL4A5, COL4A6 基因, 基膜和眼球晶状体中发现 ), V 型 (COL5A1, COL5A2, COL5A3 基因, 间质组织中发现 ), VI 型 (COL6A1, COL6A2, COL6A3 基因, 间质组织中发现 ), VII 型 (COL7A1 基因, 真皮与表皮的 交界处发现 ), VIII(COL8A1 和 COL8A2 基因, 内皮细胞中发现 ), EK(COL9A1, COL9A2, COL9A3 基因, 与 II 型和 XI 原纤维结合的 FACIT 胶原 ), X(COL1OA1 基因, 矿化的软骨 ), XI(COL11A1 和 COL11A2 基因, 软骨中发现 ), XII(COL12A1 基因, 与 I 型原纤维结合的 FACIT 胶原 ), XIII(COL13A1 基因, 一种与某种整合蛋白和纤连蛋白相作用的跨膜蛋白 ), XIV(COL14A1 基 因, 一种 FACIT 胶原 ), XV(COL15A1 基因 ), XVI(COL16A1 基因 ), XVII(COL17A1 基因, 一种 跨膜胶原 ), XVIII(COL18A1 基因 ), XIV(COL19A1 基因, 一种 FACIT 胶原 ), XX(COL20A1 基 因 ), XXI(COL21A1 基因, 一种 FACIT 胶原 ), XXII(COL22A1 基因 ), XXIII(COL23A1 基因 ), XX IV(COL24A1 基因 ), XXV(COL25A1 基因 ), XXVI(COL26A1 基因 ), XXVII(COL27A1 基因 ), 以及 XVIII(COL28A1 基因 )。 在本发明的方法和组合物中, 许多类型的胶原对具有美容功效 的细胞的功能至关重要。
此处使用的 “弹力蛋白” 是指原弹性蛋白或成熟的弹性蛋白多肽。它是一种关键 的细胞外基质蛋白, 对脊椎动物组织的弹力和恢复力至关重要, 这些组织包括皮肤大动脉, 肺, 韧带, 肌腱, 皮肤以及弹性软骨 ( 见 Mithieux 和 Weiss, 2005, Elastin, Advances in Protein Chemistry, Vol70, p437)。人基因编码的原弹性蛋白是一种定位于 7q11.2 区域的单拷贝。初级转录大约是 40kb 的长度, 同时包括散落在大量内显子周围的少量外显子, 这 就导致了外显子 / 内显子比率异常偏低。这段约 3.5kb 的 mRNA 序列码, 包含一个约 2.2kb 的编码区以及一个相对大的, 1.3kb 30 的非转译区。人原弹性蛋白包含 34 个外显子。原 弹性蛋白以外显子周期为特征, 具有独特功能的疏水性和交联域在独立的外显子替换中被 编码。所有以三核酸倍数存在的外显子以及内显子 - 外显子的交界都是以相同的方式分裂 的。在 30 交叉点发现密码子的第一个核苷酸, 而第二个和第三个核苷酸存在于 50 外显子 的边界。原弹性蛋白的主要转化产物需要经历广泛的选择性剪切, 因为位于外显子 - 内显 子边界的密码子剪切始终贯彻在整个分子中, 有选择性的剪切与编码序列的维护一起, 常 以卡带式发生。这就在转录中产生了大量不规则的原弹性蛋白的亚型。至少已知的 7 种人 外显子被选择性切割, 它们分别是 22, 23, 24, 26A, 30, 32, 和 33。
可以使用个体外显子的选择性剪切, 来修饰不同组织中的结构性功能蛋白。从 所有被调查的物种中观察到, 它显现发育调控和组织特异性, 同时随着年龄以相同比率变 化。人最常见的同型原弹性蛋白缺乏外显子 26A, 据报道仅在某些疾病蛋白中表达。有三 种人疾病与原弹性蛋白基因的突变或缺失有关, 它们是 : 皮肤松弛症, 上主动脉瓣狭窄以及 Williams-Beuren 综合征。
“TIMP” 指的是一群至少有 4 种结构相关蛋白族 ( 基质金属蛋白酶组织抑制因 子 -1, 2, 3, 4( 即 TIMP-I, TIMP-2, TIMP-3 和 TIMP-4)) 中的一种, 它们显示不同程度的序列 同源性。 这表明他们是由相同的基因家族编码的。 通过抑制胶原酶, 明胶酶或其类似物 ( 基 质金属蛋白酶类 (MMPs)), TIMPs 对限制细胞外基质分解起至关重要的作用。所有的 TIMPs 具有一个主要的特征, 即他们有 12 个保守半胱氨酸残基以及保守的相互间距, 和一个 23 到 29 的氨基酸前导序列, 和生产成熟蛋白有关。TIMPs 和 MMP-TIMP 的复合物晶体结构已被报 道, 如 TIMP-I 和 MMP-3, TIMP-2, MT1-MMP 的复合物。TIMPs 的形状是一个细长连续的楔形, 包括二分之一 N 端和 C 端与彼此相反的多肽链的 (Gomis-Ruth 等 1997)。在 MMPs 复合物 中, TIMPs 通过和它们裂隙边缘的活性位点结合而进入全线 MMPs。
TIMP-1 蛋白是一个分子量 28.5kDa 的 184 个氨基酸的糖蛋白。它包含了两种可 能的 N- 糖基化位点。TIMP-1 启动子除了一个先导结合蛋白 1(LBP1) 转录因子的假定结合 位点外, 还包括 10 个 SpI, 6 个 AP-I, 6 个 PEA3, 12 个 AP-2 位点以及 5 个 CCAAT 框。上游 TIMP-1 元素 -1(UTE-I) 对 TIMP-1 的转录也是必不可少的。启动子含有两种新型的抑制成 分, 和一个身份不明的 ETS 相关因子来抑制转录 (Dean 等 2000)。TIMP-1 蛋白已在人牙本 质和牙骨质中发现。此外, 人成骨细胞可以分泌 TIMP-1。
TIMP-2 蛋白是一个分子量 21 kDa 的 194 个氨基酸的非糖蛋白。它有一个带负电 荷的延伸的 C 端。TIMP-2 启动子由若干调控元件组成, 包括 5 个 SpI, 2 个 AP-2, 1 个 AP-I 以及 3 个 PEA-3 结合位点。TIMP-2 被转录成两种 mRNAs, 分子量分别是 1.2 和 3.8kb。并由 人成骨细胞和软骨细胞分泌。
TIMP-3 的多肽序列与 TIMP-1 和 TIMP-2 的序列分别有 37 %和 42 %的相似度。 TIMP-3 蛋白有 188 个氨基酸。在 C 端有一个保守的糖基化位点。重组人 TEVDP-3 的特征 表明, 它有一个 27kDa 的糖基化成分和一个 24kDa 的非糖基化成分。TIMP-3 可以以它的糖 基化和非糖基化形式定位于 ECM。TIMP-3 基因有 4 个 SpI 位点, 但是在它的启动子中没有 TATA 框。三种 TIMP-3 的 mRNA 组分, 分子量分别是 2.4, 2.8 和 5.5kb, 由该基因转录得来,并由人软骨细胞表达。
TIMP-4 蛋白的分子量是 22kDa, 是由 195 个氨基酸组成的多肽。TIMP-4 多肽与 TIMP-1 具有 37%的相似度, 与 TIMP-2 和 -3 具有 51%的相似度。在生理条件下 (pH 7.4), TIMP-4 是最中性的 TIMP 蛋白, 等电点为 7.34。相比之下, 人体 TEMP-1, TIMP-2 和 TEMP-3 蛋白的等电点分别为 8.00, 6.45 和 9.04。
TIMP-4 基因转录成分子量 1.4kb 的 mRNA。作为钙化组织, TIMP-4 在人软骨中被 检测到。
每个 TIMP 蛋白都与一个目标 MMP 蛋白以不同速率的相互作用和亲和力相结合, 通 常是按 1 ∶ 1 或 2 ∶ 2 的化学计量。 TIMP-1 对 MMP-1, MMP-3 和 MMP-9 的抑制比 TIMP-2 更有 效。TIMP-2 对 proMMP-2 的抑制比 TIMP-1 更有效, 是 10 倍甚至更多。但是 TIMP-2 对 MMP-2 有双向调节作用, 因为 MT-MMP 需要少量 TIMP-2 激活反应, 从而调解 proMMP-2 的活性。但 是大浓度的 TIMP-2 会抑制 MMP-2。TIMP-3 至少对 MMP-2 和 MMP-9 有抑制作用, 而 TIMP-4 是一个没有显着偏好的所有特定类型 MMPs 的良好抑制剂。TIMP-4 通过抑制 MT1-MMP 和抑 制 MMP-2 激活来调节 MMP-2 活性。
虽然 TIMPs 会抑制已激活的 MMP, 但与明胶结合的 MMPs 是一个例外, 因为 TIMP 能可逆的结合 MMP-2 和 MMP-9 的前体形式。随后, TIMP 从复合体中分离, 并允许继续激活 proMMP。例如, TEMP-1 与 proMMP-9 结合, 随后 proMMP-9 被 MMP-3 激活, 直到 TEMP-I 使复 合体失活而被阻止。例如中性粒细胞弹性蛋白酶, 不会破坏 proMMP-9。但是, TEMP-2 也可 能抑制 MMP-9 的活性形式。对于被所有 TIMPs( 除去 TIMP-1) 抑制的 MMP 和 MMP-19, 活性 MMP-13 是个例子。可溶性 MMP-16 的活性被 TIMP-2 和 TIMP-3 抑制, 但是不包括 TIMP-1。
此处使用的 “MMPs” 是指一个由至少 28 个分泌或跨膜酶组成的大家族, 它们都可 以加工或降解 ECM 蛋白。它们中, 至少有 22 种 MMPs 迄今为止被发现在人体组织中表达。 MMPs 具有高度的蛋白序列同源性, 并且已经定义了结构域。因此, 根据其结构特点, MMPs 既 可以按分泌 MMPs 归类, 又可以被分类为膜锚定 MMPs, 进一步可分为 8 个独立的亚群。分泌 MMPs 包括最小域 MMPs, 简单血液结合素域 MMPs, 明胶结合 MMPs, 弗林蛋白酶激活分泌 MMPs 和类体蛋白嵌入 MMPs。 而膜结合 MMPs 包括Ⅰ型跨膜 MMPs, 糖基磷脂酰肌醇 (GPI) 连接 MMPs 和Ⅱ型跨膜 MMPs。
MMPs 的晶体结构进一步揭示了准确的域组织, 多肽折叠以及主要的特异性决定因 素。迄今为止, 除了猪的全长 MMP-I 蛋白和人 proMMP-2 蛋白外, 人 MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MMP-11, MMP-12, MMP-13 和 MMP-14 蛋白刺激域的晶体结构已经解决。
第三个限制 MMPs 蛋白水解活性的层次, 包括内源性 MMPs 组织抑制剂 (TIMPs)。 TIMPs 特异性抑制 MMPs 的活性形式, 以及某些情况下潜在的 MMPs 形式, 同时打乱这种平衡, 导致组织发生病变。 活性 MMPs 可以被 α- 巨球蛋白, 尤其是 α2- 巨球蛋白灭活。 最近的研 究结果表明, 丝氨酸蛋白酶抑制剂和组织因子途径抑制剂 -2(TFPI-2) 抑制 MMP-I, MMP-2, MMP-9 和 MMP-13(Herman 等 2001)。钙结合蛋白多糖 (N-TES, 睾丸素 -1 或睾丸素 -3) 能够 抑制 MT1- 或 MT3-MMP 介导的 proMMP-2 的激活。 此外, 还有许多外源性抑制剂。 例如一些绿 茶中的黄酮醇 ( 如没食子儿茶素 -3- 没食子酸或儿茶素 ), 可以抑制 MMP-2, MMP-9, MMP-12 的活性以及 proMMP-2 的激活。有些合成抑制剂对 MMPs 活性也具有很好的抑制作用。一种 “具有生物活性的 TIMP” 多肽, 是指具有相同或更强的优先抑制 MMPs 能力的多肽。这种多肽可以是一个全长 TIMP, TIMP, 片段, 或是 TDVDP 的类似物。他可以承担 TIMP 氨基酸的替 换, 删除, 增加或衍生。
此处所述 “弹力素” 指一个成熟的弹力素多肽 ( 见如, Francart, 等, 1997, Solution Structure of R-elafin, a Specific Inhibitor of Elastase, J.Mol.Biol.(1997)268, 666-677)。一个 “具有弹力素生物学活性” 的多肽指有相同 / 更强的能倾向于抑制弹性蛋 白酶的物质。 此多肽可以是全长的弹力素, 一段弹力素片段, 具有氨基酸替代物的弹力素类 似物, 缺失, 或增加, 或弹力素衍生物如在美国专利 5734014 中所述。 弹力素通常也称为 “皮 肤衍生抗白细胞蛋白 ; 弹性蛋白酶抑制剂 ; 和 SKALP)。弹力素是一个具有 57 个氨基酸残基 的多肽 (6kDa), 其最初从银屑患者的鳞屑中分离。弹力素是人白细胞弹性蛋白酶 (HLE), 猪 胰弹性蛋白酶抑制剂, 蛋白酶 -3, 三种能切割重要结缔组织蛋白质弹性蛋白的酶的特定抑 制剂。它对其他丝氨酸蛋白酶没有抑制作用, 如纤维蛋白溶酶, 胰蛋白酶, 糜蛋白酶和组织 蛋白酶 G。弹力素与其目标以解离常数紧密结合。弹力素对于保护含有弹性蛋白的组织结 构的完整性, 免遭免遭弹性蛋白酶降解, 有重要作用, 因此是一个潜在的治疗价值的弹性蛋 白酶引起的疾病的化合物。 近日, 弹力素已经被证明, 其以物理方式结合与弹性蛋白纤维可 防止由紫外线引起的弹性蛋白的降解。弹力素基因序列已公开。 此处所述, “超氧化物歧化酶” 或 “SOD” 指至少三类结构相关的酶蛋白 (SOD1-3) 的 成员之一, SOD1-3 显示不同程度的序列同源性, 显示, 他们由相关的基因家族编码。SOD 歧 化催化超氧化物生成氧气和过氧化氢。 因此, 对于所有暴露在氧气的细胞中, 它具重要的抗 氧化防御作用。 在人中, 超氧化物歧化酶的三种形式存在。 SOD1 存在于细胞质中, SOD2 存在 于线粒体和 SOD3 在细胞外。SOD1 是一个二聚体 (2 个亚基 ), 而其他两个是四聚体 (4 个亚 基 )。SOD1 和 SOD3 含有铜和锌, SOD2 在其反应中心含锰。SOD1, 2 和 3 的基因分别 21, 6和 4 号染色体上 (21q22.1, 6q25.3 和 4p15.3-p15.1)。 SOD 已经证明能防止成纤维细胞端粒的 缩短, 转化肌成纤维细胞为成纤维细胞, 并减少皮肤辐射后的纤维化疤痕 (Serra, et.al., 2003.J Biol Chem.Feb 28 ; 278(9) : 6824-30 ; Vozenin-Brotons.et.al., 2001.Free Radic Biol Med.Jan 1 ; 30(1) : 30-42)。SOD1 和 SOD2 基因序列已公开。
此处所述, “热激蛋白”或 “HSPs”指一类结构相关蛋白的成员之一, 该组蛋白 具不同程度的序列同源性, 显示, 他们由相关的基因家族编码。热激蛋白 (HSPs) 是存在 于从细菌到人之间可组成或诱导表达的高度保守蛋白 (S.Lindquist, Ann.Rev.Biochem 55, 1151(1986)。 组 成 型 Hsp 对 许 多 不 同 的 细 胞 功 能 具 有 重 要 作 用。 据 分 子 量, 可将 Hsp 分 成 6 大 类 : (a)20-30kDa ; (b)40-50kDa ; (c)50-60kDa ; (d)70kDa ; (e)90kDa ; 和 (f)100-110kDa(Minowada G 等, J.Clin.Invest., 95, 3(1995) ; Morris SD, Clin.Exper. Dermatol., 27, 220(2001)) 可诱导型 Hsps 可由一系列胁迫诱导, 如升温 (M.Schlesinger 等, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982), 重金属 (M.Schlesinger 等, Alan R.Liss, Inc., 137(1989)), 氨基酸类似物 (P.Kelley 和 M.Schlesinger, Cell 15, 1277(1978) ; L. Hightower, J.Cell.Physiol.102, 407(1980)), 氧自由基 (M.Ashburner, Chromosoma 31, 356(1970) ; J.Compton 和 B.McCarthy, Cell 14, 191(1978)), 局部缺血或有缺氧导致的局 部缺血 (S.Guttman, Cell 22, 299(1980) ; M.Ashburner 和 J.Bonner, Cell 17, 241(1979)), 机械创伤 (L.Hightower 和 F.White, Cold Spring Harbor Laboratory, 369(1982) ; D.Gower 等, J.Cell Biol.103, 291(1986)), 和细胞内异常蛋白的出现 (J.Ananthan 等, Science
232, 522(1986))。热激蛋白的统一功能是在非理想环境中维持细胞正常功能。
Hsps 在正常或休眠的皮肤细胞中均可组成型表达, 对重要的生物过程起重要作 用, 例如分子伴侣作用 (Maytin EV, J.Invest.Dermatol., 104, 448(1995), 和 / 或当环境 胁迫下, 对胁迫蛋白的表达起迅速上调作用 (Welch WJ, Physiol.Rev., 72, 1063(1992)。 一些 Hsps 在皮肤细胞中表达。Hsp72 在角质细胞中组成型表达 ( 例如参见, Trautinger F 等, J.Invest.Dermatol., 101, 334(1993) ; Charveron M 等, Cell Biol.Toxicol., 11, 161(1995) ;和 Laplante A 等, J.Histochem.Cytochem., 46, 1291(1998))。 另 外 Hsps 27, 47, 60, 90, 和 110 可 能 存 在 于 正 常 的 表 皮 中 (Wilson N 等, J.Cutan.Pathol., 27, 176(2000))。任何这些 Hsps 似乎在正常组织中起特定作用。例如, Hsp 27 稳定肌动蛋 白, 而 Hsp 90 可作为分子伴侣, 和 / 或激活特定转录因子 (Charveron M 等, Cell Biol. Toxicol., 11, 161(1995)), 皮肤中 Hsp 27 可控制发育皮肤细胞的分化 (Jantschitsch C 等, Br.J.Dermatol., 139, 247(1998))。
有 证 据 表 明, Hsps 在 细 胞 之 间 能 互 换 (L.Hightower 和 P. Guidon, J.Cell. Physiol.138 , 257(1989) ; M.Tytell 等, Brain Res.363 , 161(1986) ; M.Tytell , Int. J.Hyperthermia, 21, 4450455(2005))。因此, Hsps 起作用的位点可能并不限于产生其的细 胞, 而扩散到相邻细胞。
对具有美容功能的细胞进行基因修饰
因此, 本发明涉及用于基因修饰具美容功能的细胞以提升外貌的组合物和方法。 本发明可以其他多种方法予以实施。
在一个实施例中, 本发明可能包括一种用于受体中具美容功能的基本完整细胞在 美容方面的基因修饰方法, 该方法包括 : 使用一种能编码至少一个用于维持特定细胞具美 容功能的核酸分子或多肽链的多聚核苷酸, 将其应用到至少一部分能发挥美容功效的细胞 中, 从而使上述核酸分子或多肽链在这些细胞中表达以提高或 / 和维持对外貌产生积极效 果的生物化学或 / 和生理过程。
在另一个实施例中, 本发明包括一个分离的多聚核苷酸分子, 其能编码至少一个 用于维持具美容功能的细胞的核酸分子或多肽链。在另一个实施例中, 该分离的多聚核苷 酸分子被应用于细胞, 使具美容功能的细胞能表达上述提及的核酸分子或多肽, 从而提高 或 / 和维持对外貌产生积极效果的生物化学或 / 和生理过程。
在另一个实施例中, 本发明包括一个分离的多肽或一个分离的多聚核苷酸, 其涉 及维持具有美容功能的细胞。 例如, 在具体实施例中, 本发明包括在此描述的一个分离的多 肽或一个分离的多聚核苷酸。 因此, 在关于本发明的方法和组合物的另一些实施例中, 分离 出的多聚核苷酸可能包括 SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 5, SEQ DD NO : 9, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 17, 或者是 SEQ ID NO : 24 中的核苷酸 446-1030, 或者是 SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 17 的互补序列, 或者是 SEQ ID NO : 24, 或者是 与 SEQ ID NO : 1, SEQ BD NO : 5, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 17 至少有 70%, 85%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 或 99%相似的序列, 或者是 SEQ ID NO : 24 中的核 苷酸 446-1030, 或者是与 SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 17 互补序列至少有 70%, 85%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%相似的 序列, 或者或者是 / 和 SEQ ID NO : 24 中的核苷酸 446-1030。在 另 一 个 实 施 例 中, 分 离 的 多 聚 核 苷 酸 可 能 包 括 SEQ ED NO : 2( 原 骨 胶 原 COL1A1), SEQ ID NO : 6( 弹性蛋白 ), SEQ BD NO : 10( 超氧化物歧化酶 3), SEQ ID NO : 14(TIMP-I)SEQ BD NO : 18(COL1A2), SEQ ID NO : 23(KGF-I) 或者至少与 SEQ BD NO : 2, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 18 有 70%, 85%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%相似的多肽, 或者 SEQ BD NO : 23。或者已被使用的含上述序列的 多肽。这些核苷酸和多肽序列见图 1-5 和 16.
在另一实施例中, 本发明可能包括一个组合物用以基因修饰受体中大体完整的具 美容功能的细胞。此组合物可能包括一个多聚核苷酸, 其能编码至少一个用于维持具美容 功能的细胞的核酸分子或多肽链 ; 还包括一个载体, 用于将该多聚核苷酸应用到至少一部 分能发挥美容功效的受体细胞中, 从而使核酸分子或多肽链在这些细胞中表达以提高或 / 和维持对外貌产生积极效果的生物化学或 / 和生理过程。或者, 该组合物可能包括一个多 肽用以维持具美容功能的细胞, 还包括一个载体, 用于将该多肽应用到至少一部分能发挥 美容功效的受体细胞中, 从而使核酸分子或多肽链在这些细胞中表达以提高或 / 和维持对 外貌产生积极效果的生物化学或 / 和生理过程。
多种多肽可能定向提高或 / 和维持对外貌产生积极效果的生物化学或 / 和生理过 程。例如, 在一些具体实施例中, 本发明的方法和组合物中所使用的多聚核苷酸编码了一 种角化细胞生长因子。在一个实施例中, 该多肽包括一种角化细胞生长因子或由它产生的 具生物学活性的衍生物。例如, 在一些具体实施例中, 该多聚核苷酸包括 SEQ ED NO : 24 的 446-1030 核苷酸, 或 SEQ ED NO : 24 的 446-1030 核苷酸互补序列, 或与 SEQ ED NO : 24 或其 互补序列的 446-1030 核苷酸至少 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%相似的序列, 或者一条能编码 SEQ ID NO : 23 蛋白序列或与 SEQ ED NO : 23 至少有 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%相似序列的多聚核苷酸。
在其他实施例中, 该多聚核苷酸编码一个胶原多肽或多肽 ( 如 COL1A1 和 COL1A2)。 或者, 该多聚核苷酸可能编码一个弹性蛋白。 在其他实施例中, 该多聚核苷酸可能编码一个 TIMP-I 多肽。或者, 该多聚核苷酸可能编码 SOD 多肽。在其他实施例中, 该多肽至少包含一 种转化生长因子, 一种血小板源性生长因子, 一种血管内皮生长因子, 一种胰岛素样生长因 子, 一种肝细胞生长因子, 一种血管内皮生长因子, 一种成纤维细胞生长因子, 一种表皮生 长因子, 血小板衍化内皮细胞生长因子, 一种结缔组织生长因子, 一种粒细胞 - 巨噬细胞集 落刺激因子, 一种巨噬细胞集落刺激因子, 一种生长激素, TSP-I, TSP-2, 一种胶原, TIMP-I, 一种超氧化物歧化酶, 一种弹性蛋白, 或一种缺氧诱导因子, 或由其衍生的具生物学活性物 质中的一种。
因此, 在本发明的方法和组合物的另一些实施例中, 多核苷酸可能包括 SEQ ED NO : 1, SEQ ED NO : 5, SEQ ED NO : 9, SEQ ID NO : 13, 或 SEQ ID NO : 17, 或 SEQ ED NO : 1, SEQ ED NO : 5, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 13, SEQ ED NO : 17 的互补序列, 和 / 或 SEQ ID NO : 24 的 446-1030 核苷酸序列, 或与 SEQ ED NO : 1, SEQ ED NO : 5, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 13 至少有 70%, 85%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%相似的序列, 或 SEQ ID NO : 17, 和 / 或 SEQ ID NO : 24 的 446-1030 核苷酸序列, 或 SEQ ED NO : 1, SEQ ID NO : 5, SEQ ED NO : 9, SEQ BD NO : 13, SEQ ID NO : 17 的互补序列和 / 或 SEQ ED NO : 24 的 446-1030 序列。
在其他实施例中, 在本发明的方法和组合物的多聚核苷酸可能编码多肽 SEQ IDNO : 2( 原骨胶原 COL1A1), SEQ ID NO : 6( 弹性蛋白 ), SEQ ID NO : 10( 超氧化物歧化酶 3), SEQ ID NO : 14(TIMP-1) 或 SEQ ID NO : 18(COL1A2), SEQ ID NO : 23(KGF-1) 或与 SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 18, or SEQ ID NO : 23 多肽序 列至少有 70%, 85%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%相似的序列。或者一个被 使用的包含这些序列的多肽。这些核苷酸和多肽的序列见图 1-5 和 16.
在本发明的方法和组合物的具体实施例中, 该多聚核苷酸包括, 或被插入一个质 粒或一个病毒载体。 例如, 在至少一部分转染细胞中, 该多聚核苷酸可稳定地以质粒形式存 在于染色体外。在具体实施例中, 购自于 Gelantis 的 gWIZTM 载体可被使用。或者购自于 InvitrogenpVAX-BEST 可被使用。
本发明的方法和组合物可能包括将单一或多种试剂导入细胞。在一个实施例中, 至少两种多肽或核酸分子被导入细胞。
在本发明的方法和组合物中的多聚核苷酸可能包括一个重组体的构建体, 用于在 具有美容功能的细胞中表达特定多肽。 因此, 在此更详细描述, 能编码一个核酸或多肽以维 持具美容功能的细胞的多聚核苷酸, 被可操作地连接到组成型启动子或可诱导启动子。在 另一个实施例中, 该启动子并不是在所有细胞中表达, 而仅在具美容功能的细胞中表达。 可 再选或单选, 能编码一个核酸或多肽以维持具美容功能的细胞的多聚核苷酸, 被可操作地 连接到一个增强子。另外, 在其他实施例中, 能编码一个核酸或多肽以维持具美容功能的 细胞的多聚核苷酸, 被可操作地连接到至少一段功能 polyA 序列, 一段内含子, 一段终止序 列, 或一个 cap 位点中的一种。
本发明中的方法和组合物被应用于多种具有美容功能的细胞。可选地, 被改造的 具美容功能的细胞至少包含角质细胞, 纤维母细胞, 脂肪细胞, 或肌原纤维中的一种。
本发明采用了多方法来操作所述的核酸 ( 多聚核苷酸 ) 构建体。 在一个实施例中, 所述多聚核苷酸是裸 DNA 引入具美容功能的细胞中。在具体实施例中, 载体包括至少包括 脂质体, 纳米粒子, 一种乳剂, 一种触变凝胶、 或一种感官凝胶中的一种。 因此, 可选地, 被引 入具美容功能细胞的多聚核苷酸其载体至少包括脂质体, 纳米粒子, 一种乳剂, 一种触变凝 胶, 或一种感官凝胶中的一种。 或者, 引入具美容功能细胞的多聚核苷酸其通过一种油包水 乳剂或水包油乳剂被导入。在另一实施例中, 被引入具美容功能细胞的多聚核苷酸是通过 至少颗粒介导转移 ( 如金颗粒、 微球 ), 电压驱动转移, 无线电频率灼烧介导转移, 超声波, 或微针中的一种被导入的。
图 6 显示了本发明示例方法 2 的一个实施例。如, 所述方法可能包括中受体对增 加或维持具有美容功能细胞的需求评估的步骤 4。该评估可能由一个皮肤科医生或另一医 疗保健专业人员执行。或者, 该评估可能被受者执行 ( 即自我评估 )。
接下来, 所述方法可能包括对所要求的疗法的性质做出决定的步骤 6。同样, 该 评估可能由一个皮肤科医生或另一医疗保健专业人员执行。或者, 该评估可能被受者执行 ( 即自我评估 )。
所述方法可进一步包括准备 ( 或选择 ) 一个组合物的步骤 8, 该组合物包括所要求 的用于治疗的基因或它的混合物。在一实施例中, 该步骤可能至少最初由一个皮肤科医生 或其他医疗保健专业人员执行。一旦选出合适的组合物, 受者 ( 即自我评估 ) 执行该评估。 例如, 受者可能要对购买何种可用的皮肤护理基因产品进行评估。所述方法可能额外包括对需治疗的细胞或组织应用所述组合物的步骤 10。 在一个 实施例中, 为增加和 / 或维持具美容功能的细胞, 该组合物需要按要求施用一段时间。在此 更详细地, 该组合物准确的剂量和治疗时间根据受者情况和应用的组合物的性质而变化。
所述方法也可能包括对受体再评估以确定受体具有美容功能的细胞是否得到改 善的步骤 12。如果确定具美容功能的细胞其有提升的外观表现 14-YES, 受者可以选择是否 使用组合物 16。然而, 如果确定具美容功能的细胞其并无提升的外观表现 14-NO, 受者可以 选择重复所述过程, 或许用一种不同的组合物。
因此, 本发明的实施例包括用于对具美容功能的细胞进行基因修饰的方法和组合 物。在具体实施例中, 本发明可能包括用于体内或体外转染重组核酸构建体进入具有美容 功能的细胞的方法和 / 或组合物。所述重组构建体可能以基因组外元件或以直接插入基因 组的形式并入具有美容功能的细胞
在其他实施例中, 所述方法和 / 或组合物可能直接提供多肽或其他生物分子 ( 即 不需通过基因表达 )。例如, 使用了能增加或维持具有美容功能的细胞的生长因子混合物。 例如, 在一个实施例中, 所述多肽可能包括角化细胞生长因子 (KGF), 胰岛素样生长因子 (IGF-I), 和 / 或转化生长因子 β(TGF-β), 和 / 或此处详述的多肽的混合物。或其他被使 用的多肽。
或者, 所述重组构建体可能编码调控多核苷酸, 如反义 RNA 或抑制 RNAs(RNAi) 以 增加或 / 和维持对外貌产生积极效果的生物化学或 / 和生理过程。
所述的本发明方法和 / 或组合物被用于增加和 / 或维持和 / 或改善受体和 / 或受 体组织和 / 或具有美容功能的细胞的外观。多种生物分子和 / 或生理过程可应用本发明所 述方法和组合物进行调整。在具体的实施例中, 本发明所述的方法和组合物可产生至少如 下美容效果中的一项 : 减少皮肤下垂, 减少皱纹长度, 减少皱纹深度 ; 增加皮肤紧致度, 坚 固度, 色调, 或弹性 ; 增加皮肤水合作用和保水能力, 水分流动 ( 即产生水通道蛋白 ) 和渗透 平衡。
调整至少一种在具有美容功能的细胞表达的多种生物分子其结果由本发明的组 合物和 / 或方法的处理决定。例如, 在一些具体实施例中, 用本发明的方法和组合物也可 以增加皮肤蛋白质。或者用本发明的方法和组合物也可以增加皮肤脂类水平, 如膜脂, 板 层体脂, 分泌的细胞间脂。因此, 在具体实施例中, 用本发明的方法和 / 或组合物可能增加 细胞间基质, 和 / 或黏性和通讯多肽, 包括但不限于胶原, 弹性蛋白, 角蛋白 ( 包含角蛋白 中间丝 ), 纤连蛋白, 蛋白聚糖, 层粘连蛋白, 整合蛋白, 核心蛋白聚糖, 基膜聚醣, 纤调蛋白 ( 和其他小分子富亮氨酸蛋白聚糖 (SLRP’ s)), 肌腱蛋白 E, 神经纤维细丝, 巢蛋白, 肌间线 蛋白, 波形蛋白, 外周蛋白, 神经酰胺, 胆固醇, 磷脂, 鞘脂, “天然保湿因子” (NMF), 和粘多糖 (GAGs) 如透明质酸和硫酸皮肤素。
在另一些实施例中, 用本发明的方法和组合物可能会增加皮肤细胞能量的产生, 利用和保存 ; 增加氧气利用, 增加皮肤细胞生命 ( 例如延长成纤维细胞寿命 ) 和 / 或生命周 期 ( 如减少衰老 )。利用本发明的方法和组合物的实施例可额外地或可选地使以下至少一 项水平提高 : 皮肤细胞的免疫防御, 热休克 / 应激反应, 消除自由基的抗氧化防御能力 ( 如 活性氧或羰基化合物 ), 和 / 或有毒防御 ( 如环境污染物 ) ; 能提高对紫外线的保护和恢复 能力。在其他实施例中, 用本发明的方法和 / 或组合物可能会增加皮肤细胞通讯 ( 如神经肽介导的沟通 ) 和皮肤细胞神经支配 ; 改善皮肤细胞的粘附性 / 粘结性 ( 如桥粒完整性 ) ; 改善矿物质钙和其他矿物质代谢, 促进皮肤细胞更替 ( 例如脱皮 ) ; 和 / 或改善皮肤细胞的 生物钟节奏。
在具体实施例中, 利用本发明的方法和组合物的至少可实现以下之一 : 皮肤纹理 改善, 平滑, 容光焕发, 神采奕奕。例如, 在具体实施例中, 利用本发明的方法和 / 或组合物 的至少可实现以下之一 : 减少色斑和肤色不均 ( 包括红斑, 色素沉着 ( 如黄褐斑 ) 和色素不 足。
另一些利用本发明的方法和组合物的实施例可使一下至少一项实现 : 改善血管 健康, 包括改善血管的完整性 ( 即减少变色的血液制品渗漏到皮肤 ), 改善血管张力, 改善 变色的血液副产品分解 ( 如改善血铁黄素分解, 胆红素加工和改善 UGT1a 酶的功能 ) 和减 少 “蜘蛛脉” 和 “静脉曲张” 。在其他实施例中, 本发明的方法和组合物的实施可改善 DNA, RNA, 线粒体, 膜和其他皮肤细胞器健康 ; 改善脂肪生成以增加脂肪总量用以保持皮肤丰满 及脸或其他身体其他部位看上去饱满、 轮廓分明或圆润 ; 改善真皮表皮交界处 (“DEJ)。例 如, 最明显的和可重复的皮肤老化生物学特性之一是真皮表皮交界处的扁平化。这个过程 可能由于真皮乳头状突起减少和 rarification 所致。例如, 30 到 90 岁之间, 这些皮肤层 之间的交错结合可能会减少 50%以上 ( 见, 例如, Kirstin et al, Phytochemistry and Photobiology, 2005, 81 : 581-587)。
在具有美容功能的细胞中, 有些特定的生物大分子能过量表达。 因此, 在其他实施 例中, 利用本发明的方法和 / 或组合物可用来减少这样的有害生物大分子。例如, 本发明的 方法和 / 或组合物的具体实施例可增加脂肪分解, 以减少 “橘皮组织” , “凹陷” 的皮肤 ; 以及 减少腹部和 / 或全身脂肪。或者, 本发明的方法和 / 或组合物的具体实施例可使孔径降低 ; 减少干燥和 / 或剥落 ; 减少油性和粉刺。本发明的方法和 / 或组合物的具体实施例也可能 被用于减少肌肉收缩, 平滑肌细胞和肌原纤维 ( 例如, 以减少表情皱纹 ), 或增加肌肉收缩, 平滑肌细胞和肌原纤维 ( 如减少下垂 ) ; 和增加皮肤细胞的大小 ( 如增大脸部肌肉, 以防止 脸庞 “凹陷” )。此外, 改造维持具有美容功能的细胞 ( 例如皮肤细胞 ) 是以维持其美观为 目的, 不论紫外线光损伤 ( 如增强核酸内切酶, 光解酶, 热休克蛋白, 金属硫蛋白和超氧化 物歧化酶的表达水平, 增加内源性 “遮光剂” 以保护美观 ) 和其他的环境侵害 ( 如污染物和 刺激物 )。
本发明的方法和 / 或组合物的具体实施例也可能被用于增加色素沉着 ( 例如古铜 色肌肤的获得, 其不需通过紫外线照射而获得免晒古铜色 ) 或可选地, 减少色素沉着 ( 如 “美白” )。此外, 皮肤细胞可能被改造, 以永久或临时的颜色和色素变化 ( 如改变头发或虹 膜的颜色 ), 包括荧光, 彩虹色, 磷光, 反射, 折射, 光致发光, 化学发光, 和 / 或生物发光 ( 如 荧光素酶和荧光素反应 )。另外, 应用本发明的方法和 / 或组合物的处理, 美容改善和维持 的好处至少包括以下中的一项 : 减少创伤后疤痕的形成 ; 改善激光后皮肤的重新修复, 提 高人对光敏药物如 ACCUTANE 的防护, 抗抑郁药, RETIN-A MICRO 等类似药物防护 ; 减 少光老化损伤 ; 在激光换肤 / 脉冲光治疗或任何利用光, 激光, 无线电波, 电磁, 超声波的类 似方法对皮肤细胞进行处理后期改善美观和加快愈合, 在磨皮手术, 化学换肤 ( 种类繁多 的化学换肤 ) 后期改善美观和愈合 ; 减少疤痕 ( 前摄和倒摄 ), 后期注射程序, 包括 BOTOX Restylane, Juviderm 和类似物。在一些实施例中, 尽管本方法和 / 或组合物可能应用于皮肤, 然而靶细胞也可以 为其他类型的细胞。例如, 指甲有关的细胞可能会被修饰, 以增加指甲和角质层的生长速 率, 减少开裂和损坏, 提高了长度和厚度, 降低垄起和剥落, 降低粗糙度和钝度, 和更好的着 色。 头发有关的细胞可能会被修饰, 以提高生长速度, 降低生长速度, 减少发梢分叉, 剥落和 断裂, 改善可处理性, 降低钝度, 改善光泽和光彩, 增加密度 ( 更厚 ), 降低密度 ( 更薄 ), 磨 蚀, 增加的长度和厚度, 提高柔软度。 上述任何一个美观改善可能会产生的第二个好处是增 加受者自信和提升受者心情。
因此, 在具体实施例中, 本发明提供了能在具有美容功能的细胞增加表达有提高 或维持功能的核酸或多肽的体内或体外方法。例如, 所述方法可能包括使用一种能编码至 少一个用于维持特定细胞具美容功能的核酸分子或多肽链的多聚核苷酸, 将其应用到至少 一部分能发挥美容功效的细胞中, 从而使上述核酸分子或多肽链在这些细胞中表达以提高 或 / 和维持对外貌产生积极效果的生物化学或 / 和生理过程。
在本发明的方法和组合物可能使用了能编码多种蛋白质的多种基因。 在本发明的 方法和组合物的具体实施例中, 所述多核苷酸构建体可能编码一个反义 RNA 或一个 siRNA, 以作为一种抑制所述蛋白表达的方法。例如, 某些特定生长因子减少表达可能使具有美容 功能的细胞或其周围细胞减少炎症。另外, 特定 MMP 蛋白减少表达可增加细胞的胶原含量。 在具体实施例中, 所述的 siRNA 可使能提高细胞美观的其他基因表达减少。 在一具体实施例中, 由所述转染的重组多核苷酸编码的所述核苷酸或多肽, 可能 包括角化细胞生长因子 ( 如, KFG-1 或 KFG-2), 和 / 或 KGF 受体和辅因子或它的一个片段。 可选地或另外地, 由所述转染的重组多核苷酸编码的所述核酸或多肽, 可能至少包括一种 转化生长因子 (TFG-α, TFG-β1-4, 其他已知的 TGF-β 蛋白 ) 和 / 或 TGF 受体和辅因子或 源自它它的一段片段中的之一。可选地或另外地, 由所述转染的重组多核苷酸编码的所述 核苷酸或多肽, 可能包括一种胰岛素样生长因子 ( 如 IGF-1, IGF-2) 或一段源自它的片段。 可选地或另外地, 由所述转染的重组多核苷酸编码的所述核苷酸或多肽, 可能包括至少一 种血小板源性生长因子 ( 如 DGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PDGF-CC) 或一段源自它的片段。
在其他实施例中, 由所述转染的重组多核苷酸编码的所述核苷酸或多肽, 可能包 括至少一项以下多肽或源自它的片段 : 血管内皮生长因子 ( 如 VEGF-A 或 VEGF-C), 肝细胞 生长因子, 成纤维细胞生长因子 (FGF-1, FGF-2, FGF-3, 或 FGF-22) ; 表皮生长因子 ( 如 EGF ; 肝素结合 EGF), 血小板衍化内皮细胞生长因子 (PD-ECGF) ; 结缔组织生长因子 ( 如 CTGF-1, 粒细胞 - 巨噬细胞集落刺激因子 (GMCSF), 单核细胞集落刺激因子 (MCSF), 粒 CTGF-2) ; 细胞集落刺激因子 (GCSF), 生长激素 (GH) ; 抗血管生成因子 ( 如 Ang-1, 如可溶性血小板 因子 -4, 血小板反应素如 TSP-1 和 TSP-2, 尿激酶型纤溶酶原激活物 / 受体拮抗剂, 如, uPA/uPAR, 血管抑素, 内皮抑素和钙网蛋白 ) ; 一种转录因子 Egr-1 的, 或缺氧诱导因子 (HIF-1-α)。本发明的方法和组合物使用的其他被编码的多肽或核酸包括一些具有合成, 降解, 修复和抗氧化保护的酶功能多肽, 包括一些具有结构功能包括细胞外基质蛋白的多 肽, 包括具有细胞粘附和通信功能的多肽, 所述表达的多肽的因子, 辅助因子, 受体, 和在皮 肤细胞内为非转染的基因组多核苷酸编码活性多肽的启动子。例如, 本发明的组合物和方 法中使用的多肽或核酸可能包括, 或编码 ( 或与编码序列互补 ) 源自以下的多肽或片段 : 神经营养因子 ( 如神经生长因子 (NGFs), 神经营养因子 -3(NT-3), NT-4 和脑源性神经营养
因子 (BDNF), 肿瘤坏死因子 (TNFs), 肝细胞生长因子 (HGFs), 干扰素 (INFs), 白细胞介素 (ILSs- 如 IL-1, IL-2, IL-6, IL-8 和 IL-10), 血管生成素, 分散因子 (SFs), 趋化因子 (CCs), 抑制素 (TGF-β 家族的一部分 ), 脂肪因子 ( 如瘦素, 白细胞介素 6(IL-6), 其他细胞因子, 脂联素, 补体成分, 脂肪酶, 纤溶酶原激活物抑制物 1(PAI-1), 肾素 - 血管紧张素系统 (RAS) 的蛋白质和其他 ), 骨形态发生蛋白 (BMPs)。
在其他一些实施例中, 所述多聚核苷酸 ( 或与编码序列互补 ) 可能编码 CCN 蛋 白家族多肽 ( 如富半胱氨酸的 (CYR61/CNN1), 一种结缔组织生长因子 CNN2, Nov, WISP-1, WISP-2, 和 WISP-3), 整合素 (6)β(1), 细胞表面的硫酸乙酰肝素蛋白多糖 (HSPGs), 粘着斑 激酶, 桩蛋白, 和 / 或 Rac, p42/p44MAPKs, 源自它的片段或生物活性物。或者, 也可使用这 些基因的 siRNA 或反义分子。
在其他实施例中, 多聚核苷酸可能编码 ( 或与编码序列互补 ) 至少以下一中多 肽 ( 或由其衍生具有生物学活性的或其片段 ) : 信号转导和 / 或转录激活物 (STATs), 甲状 腺激素 (TH), 促甲状腺激素 (TSH), 催乳素, 甲状旁腺激素 (PTH), 甲状旁腺激素相关蛋白 (PTHrP), 促甲状腺激素释放激素 (TRH), 神经肽 ( 如内啡肽 ) 他扎罗汀诱导基因 (TIGs), 细 胞维甲酸结合蛋白 (CRABPs), 原骨胶原, 胶原 ( 所有形式 ), 脯氨酸羟化酶和其他参与胶原 合成 ( 如羟赖氨酰半乳糖神经酰转移酶和半乳糖羟赖氨酰葡糖基转移酶 ), 修复 / 维持和降 解的酶, 弹性蛋白原, 弹性蛋白, 赖氨酰氧化酶和其他参与弹性蛋白合成, 修复 / 维持和降 解的酶, 原纤蛋白, fibulins 蛋白, 超氧化物歧化酶 ( 如 SOD 1, 2 和 3), 谷胱甘肽过氧化物 酶 (GSH-Px), 过氧化氢酶 (CAT), 过氧化还原酶 VI, 血红素氧酶 (HO), 巯基蛋白还原酶, 抗氧 化蛋白 2(Aop2) 金属硫蛋白 (MT), 谷胱甘肽 (GSH), 辅酶 ( 辅酶 Q), 钙联蛋白, 与角质细胞脱 屑有关的酶 ( 如组织蛋白酶, 比如组织蛋白酶 -D 和组织蛋白酶 -G 和转谷氨酰胺酶 ), 纤连 蛋白, 层粘连蛋白, 整合蛋白, 钙粘素, 凝集素细胞黏附分子 (LEC-CAMs), 水通道蛋白, 肌动 蛋白, 伞形蛋白, 兜甲蛋白, 聚角蛋白微丝, 角质 / 角蛋白, 桥粒蛋白, 斑蛋白, 旁血小板溶蛋 白, 膜联蛋白, 参与的合成, 修复 / 维持和降解细胞外基质, 细胞粘附和细胞通信 ( 如涉及层 粘连蛋白, 纤维连接蛋白和角蛋白合成酶 ), DNA 的合成, 修复 / 维持和降解酶 ( 如限制性内 切酶, 光解酶, 端粒酶, 和其他 (ERCC3, PCNA, RPA, XPA, p53, 所有这一切都是随着年龄下降 ; Goukassian 等, FASEB J., 2000, 14, 1325-1334 年 ) 和端粒 3-prime 突出序列 ( 寡聚 T), 应 激反应和伴侣蛋白及相关元件 / 激活物 / 因子 ( 如热休克蛋白 27, 热休克蛋白 47, 热休克蛋 白 60, 热休克蛋白 70, alphaB 结晶, Grp78, Grp94, 热休克转录因子和辅助因子 ( 如 HSF1, 2, 4) 产生的热休克元素 (HSE), 半胱氨酸串联蛋白 (csp), BAG-1, Hip, CHIP, Hop 和 Tpr-2), 涉 及合成, 修复 / 维持和降解神经酰胺和酰胺衍生物的酶 ( 如丝氨酸棕榈酰转移酶, B- 半乳糖 脑苷脂酶, 葡糖脑苷酯酶, 酸性 / 中性 / 碱性 SMASE( 鞘磷脂酶 ), 酸性神经鞘氨醇酶, SM 脱 酰酶, GC 脱酰酶, pSAP, 葡糖神经酰胺合酶, 神经酰胺合酶和鞘磷脂合成酶 ), 涉及合成, 修 复 / 维持和降解透明质酸的酶 ( 如透明质酸酶 / 透明质酸合成酶 1-3 和其他 ), 参与胆固醇 的合成, 修复 / 维持和降解的酶, 参与脂肪酸, 三酸甘油酯, 磷脂, 缩醛磷脂, 鞘脂, 类花生酸 ( 包括花生四烯酸级联, 前列腺素和白三烯 ) 的合成, 修复 / 维持和降解的酶, 维甲酸受体, 类固醇受体, 激素受体 ( 如雌激素受体 ), 甲状腺受体, 维生素 D 受体, 过氧化物酶体增殖物 激活受体 (PPARs 的 ), 金合欢醇激活受体 (FXR), 肝激活受体 (LXR), 基质金属蛋白酶 (MMPs 包括胶原酶 (MMP-1), 明胶酶 ( 例如, MMP-2 和 MMP-9), 弹性蛋白酶, 质溶解素, 丝氨酸蛋白酶和膜 - 型 MMPSs), 金属蛋白酶组的织抑制剂 (TIMPs)。
在其他实施例中, 所述多聚核苷酸可能编码 ( 或与编码序列互补 ) 一个多肽或能 编码以下物质至少一个片段的核酸 : 丝氨酸蛋白酶抑制剂 ( 如皮肤衍生抗白细胞蛋白酶 (SKALP), 也称为弹力素 ( 包括 preproelafin 和 proelafin) 和分泌的白细胞蛋白酶抑制 剂 (SLPI)), MSX( 同义词包括 CHOX-8 ; GHOX-8 ; HOMEOBOX PROTEIN MSX-2 ; HOX-8 ; HOX-8.1 ; HOX8 ; MSH HOMEO BOX HOMOLOG 2 ; MSX-1 ; MSX-2 ; MSX1 ; 和 QUOX-7), SMAD 通 路, Smad3, C-ski, 和细胞外信号调节激酶 1/2, 心脏重复蛋白, 雌激素 - 相应 B box 蛋白 (EBBP), 胰岛 素样生长因子结合蛋白 (IGFBPs), 玻联蛋白, 卵泡抑素。RAC1, ADAMTS1 蛋白酶, 神经元突 触前膜蛋白 -1, 转录因子 AP-1, cJun, cFos, β- 淀粉样蛋白前体蛋白 (sAPP), β- 连环蛋 白, CHL1, 促肾上腺皮质激素释放激素 (CRH), DJ-1, 固醇调节元件结合蛋白 ( 如 SREBP-1 和 SREBP-2), 磷脂酰肌醇 3- 激酶 (PI3K), 硬脂酰辅酶 A 脱氢酶 (SCD), 脂肪酸合成酶, 羟甲基 戊二酰 - 辅酶 A 合成酶 (HMGCS), CCAAT/ 增强子结合蛋白 α(C/EBPα), C/EBP δ, FAS, 硬 脂酰辅酶一个去饱和酶 -1(SCD-1), 涉及雌激素的合成 ( 如芳香化酶 ) 的酶, 成纤维细胞生 长因子同源因子 (FHF) 多肽, 核心蛋白聚糖, 基膜聚醣, 纤调蛋白 ( 和其他小富含亮氨酸重 复蛋白聚糖 ), 多功能蛋白聚糖, 双糖链蛋白多糖, 蛋白聚糖, 短缩素, 半乳凝素 ( 如半乳糖 凝集素 -3 与半乳糖凝集素 -7), 硫酸肝素, 串珠素, 多配体聚糖 -1, 硫酸软骨素, JUN-- 调节 因素 ( 如多效蛋白 (PTN) 和基质细胞衍生因子 1(SDF-1)), CXCR4(SDF-1 受体 ), 抗凋亡蛋白 ( 如 Bcl2 和生存素 ), 转录因子核因子 (NF)-κB, 一氧化氮合酶, 参与儿茶酚胺的合成和降 解的酶, 丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK), 转录因子 NF-E2 相关因子 ( 如 Nrf2 和 Nrf3), P21 活化 蛋白激酶 4(PAK4), 参与合成溶血神经鞘氨脂 (SPC) 的酶, 脂酶, 脂质动员肽 ( 如 β- 促脂解 素和 “解脂肽 A 和肽 B” ), 双调蛋白, 酪氨酸酶和其他参与黑色素, 真黑素和褐黑素合成和降 解的酶, 黑素肾上腺皮质激素 ( 垂体肽类激素, 包括促肾上腺皮质激素 (ACTH) 和 α, β和 γ 黑色素细胞刺激激素 (MSH), 激素原, 阿黑皮素原, A- 促黑激素, 促肾上腺皮质激素, 内皮 素 1, 环磷酸腺苷, PKCb, bey1, bey2, bey3, 人黑素肾上腺皮质激素 -1 受体 (MC1R), OCA1( 酪 氨酸酶, TYR), OCA2(OCA2), OCA3( 酪氨酸酶相关蛋白 1, TYRP1), 和 OCA4( 膜相关转运蛋白, MATP), c-Jun N- 末端激酶激酶激酶 (JNKKK 多肽如 MLK4, PAK4, PAK5 和 YSK2), HiF1-α 调控基因 ( 如 BNIP3, 缺氧诱导基因 1, 腺苷酸激酶 4, 半乳糖激酶, 乳糖凝集素 -3, 凝溶胶 蛋白, RhoA, Rho 激酶, 异构核核糖核蛋白 H1 和剪接因子和 REV3), α-SMA, S1-P, GRO-α/ CXCR-1, erbB, 激活肝细胞生长因子 (HGFA), 角质细胞富含脯氨酸的蛋白 (KPRP), 神经递质 和神经递质阻滞剂 ( 如 GABA(γ- 氨基丁酸 )), 乙酰胆碱受体阻滞剂, 蛇毒 Waglerin1 和箭 毒 Curare。
在其他实施例中, 本发明发放和或组合物所述多聚核苷酸可能编码 ( 或与编码序 列互补 ) 至少一个以下多肽 ( 或源自它的片段 ) : α1- 抗胰蛋白酶 ( 一个不可逆转的中性粒 细胞弹性蛋白酶抑制剂, 可改善静脉曲张的静脉强度 ), 在某些实施例中, 其可能与 MMP-2 抑制联合 (MMP-2 在静脉曲张组织中含量高 ), 激素敏感脂肪酶 (HSL), 蛋白激酶 A( 激活 HSL), 甘油三酯脂酶 (ATGL), CGI-58( 最近发现的 ATGL 的辅激活因子, 其促进野生型和 HSL 缺陷型 WAT 的 TG 水解酶活性, 但在 ATGL- 缺陷型 WAT 中并不如此, 表明 ATGL 是的 CGI-58 介 导的激活脂肪分解的唯一目标 ; 同时, 目前在小鼠 WAT 中, ATGL 和 HSL 负责超过 95%的 TG 水解酶的活性 )。此外已知的脂肪酶, 心房利钠肽, 胰蛋白酶, α- 糜蛋白酶, 抗感染和痤疮皮肤抗菌肽 ( 如 SLPI, 溶菌酶和防御素 ), 上游转录因子 -1(USF-1), δNp63α, Sirt1, 血管 紧张素 (ANG) Ⅱ 1 型 (AT1) 和 2 型 (AT2) 受体, 血管紧张素Ⅱ, SHP-1(Src 同源 2 含蛋白质 酪氨酸磷酸酶 -1), 和 / 或前列环素合酶 (PGIS) 可能由本发明的反义构建体所编码或为目 标。
另外, 本发明中的基因构建体可能包括一个多核苷酸 ( 或它的片段 ), 其能编码 ( 或与编码序列互补 ) 至少一个以下参与美化或维持容貌的多肽 ( 或它的片段 ) : 肌动 蛋白, 原骨胶原, 或胶原片段 ( 如 KTTKS, 多聚赖氨酸多肽 ), 弹性蛋白原或弹性蛋白片段, TM 层粘连蛋白片段, 纤维连接蛋白片段, Matrixyl (Pal-KTTKS), Matrixyl 3000TM(Pal-GHK 和 Pal-GQPR), RonaCare ASCIIITM, CPC PeptideTM, CollaxylTM, Peptide Vinci 01TM, ALDENINETM, AmelioxTM( 肌肽二胎 ), ANTARCTICINETM, BIOPEPTIDE CLTM, BioPeptide-ELTM, Kappa ElastinTM, SYN -COLL, 血 小 板 反 应 蛋 白 T SP-1 片 段, MYOXINOLTM, DERMAXYLTM, copper peptides(GHK-Cu), CYTOKINOL LS 9028, Peptamide 6TM, RIGINTM, KOLLAREN ( 肝细胞生长因子 (HGF) 活性片段 ), EyelissTM, HaloxylTM, Dipeptide 2, Dermican(TSH 片 段 ), 和众多大豆衍生的多肽和如 CFTA 的化妆品成分 INCI 数据库中所列的。 另外, 可以放松 TM 肌肉的局部应用的多肽包括 SYN -AKE(Waglerin 1 模仿物 ), VIALOX (Curare 模仿物 ), TM TM TM ARGIRELINE ( 乙酰基六肽 -3), Leuphasyl , 和 SNAP-8 ( 同 SNAP-25)。另外, 皮肤中的活 性多肽详见美国专利 6586185。
在其他实施例中, 所述多聚核苷酸可能编码用以降低, 减慢和 / 或延迟具有美容 功能细胞衰老的核酸和 / 或多肽, 例如美国专利 No.6,953,664, 以提高或 / 和维持对外貌产 生积极效果的生物化学或 / 和生理过程。
在其他实施例中, 所述多聚核苷酸可能编码一个对应于具美容功能的细胞中某蛋 白的抗体, 以提高或 / 和维持对外貌产生积极效果的生物化学或 / 和生理过程。
多肽的组合
另外, 在一些具体实施例中, 由本发明的构建体提供的多聚核苷酸包括一个编 码两个或更多的多肽或核酸组合的多聚核苷酸。例如, 在伤口愈合中, 相对于个别地应 用生长因子, 特定的生长因子组合可显示协同的改善作用 ( 见如, Lynch, 1999 ; J.Clin. Invest., 84 : 640-646 ; Jeschke 等, 2004, Gene Therapy 11 : 847-855 ; Sprugel 等, Wound Repair Regen., 2004, 12 : 67-79 ; Endocrine Reviews, 2002 ; 24 : 737-767 ; Nabarro, J.D., 1987, Clin.Endocrinol., 26 : 481-512 ; Ristow 等, 1988, J.Cell Physiol., 137 : 277-284 ; O’ Keefe 等, 1988 , J.Invest.Dermatol. , 90 : 2-7 ; Cook 等, J.Cell Physiol. , 146 : 277-189)。 可选地, 构建体可被操作以使所述多肽以 1 ∶ 1 比例表达。 或对于所述各种多肽 可用其他比例 ( 如 2 ∶ 1, 3 ∶ 1, 4 ∶ 1, 5 ∶ 1, 10 ∶ 1, 20 ∶ 1, 50 ∶ 1, 100 ∶ 1, 500 ∶ 1, 或 1000 ∶ 1)。
例如, 在一个具体实施例中, 一个组合包含 PGDF 和 IGF。 PGDF 可能包括已知的 PDGF 亚型中的任何一个。同样, IGF 可包括其任何一个已知的亚型。构建体可能被操作, 以使 所述多肽以 1 ∶ 1 的比例表达。或者, 可对于所述各蛋白使用其他比例 ( 如 2 ∶ 1, 3 ∶ 1, 4 ∶ 1, 5 ∶ 1, 10 ∶ 1, 20 ∶ 1, 50 ∶ 1, 100 ∶ 1, 500 ∶ 1 或 1000 ∶ 1)。在一个实施例中, 构建体被操作, 结果 PDGF-BB 和 IGF-1 以 2 ∶ 1( 重量比 ) 表达。或其他 PDGF 和 / 或 IGF 和 / 或其他比例组合也可使用。同样, 可使用一个 PDGF 和 TGF-α 组合。或者, 可使用 HGF和 IGF 组合。在其他实施例中, 可使用 PDGF 和一个碱性 FGF 组合, 或可使用 HGF 和碱性 FGF 组合。在又一实施例中个, 可使用 GH 和 IGF-1 或 IGF-II 组合。
在一些特定实施例中, 所述构建体或多种构建体可能编码两个以上蛋白。 例如, 在 一些实施例中, PDGF 和其他一些生长因子的组合可被使用。在一个实施例中, PDGF 与 KGF, IGF 和 IGFBP 的组合可被使用。或者, 这些生长因子的次级组合可被使用。
清除降解的胶原和 / 或其他碎片
在其他一些实施例中, 本发明的多核苷酸构建体可编码能帮助清除降解的生物大 分子以维持和 / 或提高完整生物大分子合成的蛋白质, 这些生物大分子对提高或 / 和维持 对外貌产生积极效果的生物化学或 / 和生理过程有重要作用。例如, 在一个实施例中, 所述 构建体编码 MMP-2 和 / 或 MMP-9 以清除来自 MMP-1 的胶原碎片。所述构建体使用完后, 可 使用能形成新胶原的构建体。在一些特定实施例中, 这些构建体可编码生长因子, 胶原和 / 或 TIMP-1。
受体
另外地, 在一些特定实施例中, 本发明的构建体所提供的多核苷酸可能包括一个 编码一个受体或受体组合 ( 如 KGF 受体, TGF 受体, FGF 受体如 FGFRiiib, 等 ) 的多核苷酸, 其作用物为具美容功能细胞中的多肽, 生长因子和其他能提高或 / 和维持对外貌产生积极 效果的生物化学或 / 和生理过程的生物大分子 ( 如如必须的辅因子或转录因子 )。
表达的性质
本发明中的构建体可被导入一个或多个类型的具美容功能的哺乳动物细胞中, 例 如, 转染未分化的 “干” 或 “基础” 的皮肤细胞, 于不同阶段的正在分化的皮肤细胞, 最后已分 化的皮肤细胞。 在一个实施例中, 此技术可以将核酸稳定转移进细胞基因组, 因此所述核酸 或多肽可被细胞长期表达。 所述能编码至少一个核酸或多肽多核苷酸以维持具有美容功能 的细胞, 从而能提高或 / 和维持对外貌产生积极效果的生物化学或 / 和生理过程的多核苷 酸, 一旦被纳入一个干细胞的基因组, 它便可遗传和在细胞后代中表达, 如来源于未分化的 “干” 或 “基础” 细胞的角质细胞或纤维母细胞。例如, 可能会使用一个综合载体 ( 如如逆转 录病毒, AAV, “睡美人” 转座子, 或细菌噬菌体整合酶, 如 ΦC31, 或类似物, 因此, 靶细胞可以 是任何具美容功能的细胞。
在其他实施例中, 所述技术可使核酸瞬时转化到具有美容功能的细胞的, 使核酸 或多肽可由细胞瞬时表达。 可选地, 这样的表达可能持续数秒, 数分钟, 数小时, 数天, 数周, 数月或数年。
在其他实施例中, 表达瞬态是由于所述细胞的生物学特性。 以皮肤细胞为例, 据终 端分化, 细胞更新可能会导致被改造细胞的减少, 例如正在分化的角化细胞向上移向表皮 的外围以形成鳞状细胞并最终因脱皮而消失。或者, 干细胞可能被修饰, 但能提高或 / 和维 持对外貌产生积极效果的生物化学或 / 和生理过程的多核苷酸可能直到细胞分化阶段才 表达。 因此, 虽然干细胞系中存在基因修饰, 核酸或多肽的表达可能取决于子代细胞的发育 阶段, 从而使修饰的瞬态取决于分化阶段 ( 即, 要么局限于干细胞阶段, 要么是分化的细胞 阶段 )。
在某些实施例中, 表达的核酸和 / 或多肽可能在具美容功能的干细胞, 分化细胞 和已分化细胞任意组合之间发挥旁分泌和 / 或自分泌的作用。例如, 转染的表皮成纤维细胞干细胞可能表达和分泌生长因子 ( 如角质细胞生长因子 (KGF)), 其对正在分化的表皮角 质细胞具有自分泌的效果。另一例, 所表达的核酸和 / 或多肽被用于将通常的旁分泌功能 转变为自分泌功能。例如, 皮肤成纤维细胞通常表达和分泌角质细胞生长因子 (KGF), 随后 扩散到表皮角质细胞发挥旁分泌的效果。然而, 能编码 KGF 的构建体转染表皮角质细胞后, 随后的表达和分泌的 KGF 改变为自分泌功能而不是 KGF 的旁分泌功能。
给予的位点
所述构建体被导入受者一个或多个部位, 从而能提高或 / 和维持对外貌产生积极 效果的生物化学或 / 和生理过程。被实施的部可能包括前额, 头皮, 毛囊, 上眼睑, 下眼睑, 眉毛, 睫毛, 眼眶下和眼周区 ( 包括典型的 “鱼尾纹” 区 ), 鬓角, 鼻, 鼻梁, 面颊, 舌, 鼻唇沟, 嘴唇和 periobicular 包括 “下颌” 区, 下颌线, 耳朵, 颈部, 胸部, 三头肌下, 手背, 背部, 腹 部, 两侧, 臀部, 大腿前和背部, 膝盖和其他受者具美容功能的细胞。在一个实施例中, 所述 构建体被注射进血液, 例如通过受体介导输送系统或组织特异性调控序列 ( 如启动子和 / 或信号序列 ), 表达的目的多肽作用于特定的具有美容功能的细胞受体。
名人基因
在某些实施例中, 本发明的构建体序列, 可以从 “名人” 和公众人物如著名的男演 员, 女演员, 音乐家, 画家, 作家, 政治家, 皇室成员, 运动员, 商界领袖, 部长, 社会活动家, 科 学家, 英雄人物, 及其他类似人物, 无论生者或死者任何可用的 DNA 来源, 或来自于上述 “名 人” 的家族直系血亲 ( 例如, 著名歌手的女儿 )。在其他实施例中, 本发明所述构建体的序 列可来自普遍多态性 : 来自总哺乳动物种群, 来自一个没有接受该美容修饰 ( 如将妻子的 构建体拷贝应用于丈夫, 反之亦然 ) 的哺乳动物, 从相同皮肤区域或更优的皮肤区域自体 移植到修饰区域, 被转染哺乳动物的直系血亲 ( 如将孩子的构建体拷贝应用于父母 ), 被转 染哺乳动物的配偶或同伴 ; 其他国民或 “种族” (如; 来自法国人男性的构建体拷贝转染的 美国人男性 ) ; 异性 ( 妇女可能希望得到来自于著名男演员的构建体 ) ; 或任何非哺乳动物 来源 ( 如藻类, 酵母, 真菌, 病毒, 植物, 鱼类和昆虫 ) 构造的序列 ) 的构建体序列
分子构建体
在某些实施例中, 本发明的构建体可通过本领域公知的技术提高导入和随后表 达, 包括利用基因构建体改造包括修饰内核苷酸 (internucleotides), 目标表达载体 ( 如 角质形成细胞和成纤维细胞的干细胞 ), 核靶, 使用细胞特定的, 或改良的调控启动子和其 他元件 ( 如增强子 ). 本发明的构建体可能包含其他的元件以提高参与增加或 / 和维持具 有美容功能细胞的多核苷酸和多肽的表达和 / 或适当的功能。
因此, 在一些实施例中, 所述构建体可能包括组成型的或可诱导的启动子, 其可操 作地连接到能表达多核苷酸或多肽的特定核酸上, 而所述多核苷酸或多肽能维持具有美容 功能的细胞, 从而提高或 / 和维持对外貌产生积极效果的生物化学或 / 和生理过程。
在其他实施例中, 所述构建体可能包括增强子, 其可操作地连接到多核苷酸或多 肽上, 而所述多核苷酸或多肽能维持具有美容功能的细胞, 从而提高或 / 和维持对外貌产 生积极效果的生物化学或 / 和生理过程。
另外地或可选地, 所述构建体可能包括切割位点序列, 内含子序列, 帽位点, 或功 能 polyA 元件, 其可操作地连接到多核苷酸或多肽上, 而所述多核苷酸或多肽能维持具有 美容功能的细胞, 从而提高或 / 和维持对外貌产生积极效果的生物化学或 / 和生理过程。给予方法
本发明采用本领域公知的技术, 将构建体应用于具有美容功能的细胞。在受体细 胞的必须的发育和生理功能未被破坏的前提下, 多种已知最先进的基因导入细胞技术被相 应地应用于本发明中。
基因转化具有美容功能的细胞的方法可能包括脂质递送系统, 如脂质体或双相囊 泡。此外, 还使用乳剂渗透具有美容功能的细胞, 如阳离子纳米粒子, 醇 / 碳氟微乳液, 或油 / 水和水 / 油型纳米乳液。
或者, 可用多联体。多联体, 在体外试验中, 用 T4 连接酶处理成熟 DNA 能够增强转 染效率, 如同一次转染实验并不能转入一个以上的分子一样, 转染通常只能转入较小的分 子, 这可能是因为转染分子的尾部结构起了重要作用。
在其他实施例中, 可使用粒子介导的转化。 在具体实施例中, 可用电磁辐射提高构 建体进入具有美容功能的细胞的能力。所述方法可能包含利用无线电频率形成微通道, 电 穿孔, 离子电渗, 或使用电整合 (electroincorporation)。 该操作可能还应用了物理导入方 法例如显微注射无修饰的 DNA。所述技术使参与维持或修复皮肤的多核苷酸或多肽瞬态表 达。
或, 可使用长时效基因表达技术。 例如, 可使用含目的核酸序列的病毒或噬菌体转 染的分子技术。同时, 其他技术如如细胞融合, 染色体介导的基因转移, 微细胞介导的基因 转移, 原生质球融合, 或转座子都包含在本发明的方法和组合物中。按已知的最先进技术, 化学和物理的渗透促进剂 ( 如, 加热, 前处理微晶换肤, 吸留 ) 及任何包含于本发明的方法 和组合物可被使用。
因此, 本发明的实施例承认了基因修饰具美容功能的细胞的潜力, 其可作为改善 受体美观的方法。基因修饰具美容功能的细胞提供了瞬态或长效改造细胞的方法。
可用于调整皮肤维持和 / 或美容外观的基因
令人不悦的容貌改变, 如皮肤下垂, 变薄, 起皱通常是由于皮肤蛋白如胶原, 弹性 蛋白, 或其他细胞外基质蛋白和蛋白聚糖的表达大量且稳定减少所致。 因此, 取代这些蛋白 质或阻止这些蛋白质的减少, 成为一个潜在的有效的策略, 以维持或改善皮肤的外观和健 康。本文所述的例子描述了五个重组载体构建体的设计, 所述构建体编码的蛋白旨在提高 细胞外基质的稳定和支持改善的皮肤外观。这些蛋白质为胶原, 弹性蛋白, EC-SOD, TIMP-1 和角质细胞生长因子 ( 例如, KGF-1)。以下详细讨论这些蛋白质对皮肤生理的作用。
其他蛋白质和 / 或多肽也可以使用本发明的方法和组合物。例如, 皮肤细胞表达 各种可能对组织的修复和维护有重要作用的不同的蛋白质和其他因子。因此, 角质细胞产 生白细胞介素 (IL-1-α, IL-1-β, IL-1ra 的, IL-3, IL-6, IL-8, IL-10 和 IL-18), 粒细胞 集落刺激因子 (G-CSF), 单核细胞集落刺激因子 (M-CSF 的 ), 粒 / 单核细胞集落刺激因子 (GM-CSF), 转化生长因子 (TGF-α 和 TGF-β), 血小板衍生生长因子 (PDGF), 肝细胞生长因 子 (HGF), 血管内皮生长因子 (VEGF), 肿瘤坏死因子 (TNF-α), 干扰素 ( 例如, INF-α, β和 γ), 胰岛素样生长因子 (IGF-1), 和成纤维细胞生长因子 ( 碱性 FGF, FGF-22)。 此外, 成纤维 细胞产生角质细胞生长因子 (KGF-1, KGF-2), TGF-β-1, TGF-β-2 和 TGF-β-3, 结缔组织生 长因子 (CTGF), FGF-2( 碱性 ), PDGF-A, IGF-1, 血管内皮生长因子, 肝细胞生长因子 (HGF), IL-6, IL-8, TNF-α 和 GM-CSF, G-CSF, FGF-22, 和 IGF-1。在另一个实施例中, 目的核苷酸是HIF-1-α 转录因子。此外, EGR-1 转录因子多肽, 或其一个生物活性片段, 或核苷酸编码的 类似多肽, 已有报道可用于治疗伤口 ( 美国专利号 6689758)。因此, 这些多肽, 或其衍生的 功能物, 在本发明的方法和 / 或组合物的实施例中可用单独或组合使用。
胶原
在一个实施例中, 所述参与保养具有美容功能的细胞而提高或 / 和维持对外貌产 生积极效果的生物化学或 / 和生理过程的多肽, 可能是一个胶原多肽或其功能衍生物。胶 原是构成人体的组织细胞外基质的主要纤维蛋白。I 型胶原是人体皮肤的主要细胞外基质 (ECM) 组分, 是由两个 α-1 和 1 个 α-2 链组成的三股螺旋结构 (Myllyharju 和 Kivirikko, 2001, Ann.Med., 33 : 7-21)。 这种原骨胶原链是由皮肤的成纤维细胞和身体其他组织的合成 的。一旦合成, 原骨胶原链裂解, 以便聚集和形成较大的胶原纤维以组成 ECM 的关键组分。 骨原胶原纤维退化或产量不足可导致减少 EMC 结构完整性和导致如皮肤等上覆组织的物 理变化。
胶原的丧失或退化是正常老化的一部分, 但它也是光损伤皮肤中观察到的主 要 变 化 之 一 (Lavker, 1995, Cutaneous Aging : chronologic versus photoaging, In Photoaging, Ed., Gilchrest, B.A., Cambridge MA, Blackwell Science, pp.123-135 ; Fligiel 等, 2003, J.Invest.Dermatol., 120 : 842-848 ; Varani 等, 2001, Am.J.Pathol., 158 : 931-942).。 据报道, 变老的, 防晒的皮肤 (Varani 等, 2000, J.Invest.Dermatol., 114 : 480-486) 和光损伤皮肤 (Griffiths 等, 1993, N.Engl.J.Med., 329 : 530-535) 其原蛋白的 合成持续下调。 一些机制表明, 正常年龄的胶原损失和由光损伤引起的胶原损失, 与基质金 属蛋白酶 (MMPs) 的增加和皮肤成纤维细胞数量的减少有关 ( 如 Fisher 等, 1996, Nature, 379 : 335-338 ; Fisher 等, 1997, N.Eng.J.Med., 337 : 1419-1428 ; Millis 等, 1992, Exp.Cell Res., 201 : 373-379 ; Burke 等, 1994, Exp.Gerontol., 29 : 37-53 ; Varani 等, 2000)。另一种 与胶原减少至少部分相关的机制是, 与年龄有关的皮肤成纤维细胞的胶原合成减少。 因此, 已证明, 老化皮肤的 I 型胶原的数量比年轻的成纤维细胞所合成的 I 型胶原数量低 (Varani 等, 2006)。在这项研究中, 在 I 型胶原的合成和含量的减少是与胶原束空间较大及成纤维 细胞和胶原纤丝之间的接触较少有关, 这表明纤维母细胞机械张力减少。 此前的研究表明, 机械张力降低时, 胶原的生产可能会下降, 基质 MMPs 的生产可能会增加 (Lambert 等, 1992, Lab.Invest.66 : 444-451 ; Delvoye 等, 1991, J.Invest.Dermatol., 97 : 898-902)。因此, 与 年龄有关的成纤维细胞胶原的合成减少可能会导致在 ECM 减少机械张力, 从而进一步降低 胶原的生产 (Varani 等, 2006)。通过对皮肤补充 I 型原骨胶原基因拷贝, 胶原产量可能会 提高, 可提供增加在 ECM 机械张力的潜力, 从而随后可使现有的成纤维细胞提高胶原产量。
弹性蛋白
在一个实施例中, 所述参与保养具有美容功能的细胞而提高或 / 和维持对外貌产 生积极效果的生物化学或 / 和生理过程的多肽, 可能是一个弹性蛋白多肽或其功能衍生 物。弹性蛋白是 ECM 另一个极为重要的组成部分, 提供皮肤弹力和恢复力 ( 综述 : Mithieux 和 Weiss, 2005, Adv.Protein Chem., 70 : 437-461)。弹性蛋白合成需通过其前体分子弹性 蛋白原的合成和赖氨酰氧化酶介导的交联。弹性蛋白是一个持久的分子, 其构成 90%的弹 性纤维和构成皮肤干重的 2-5%。弹性蛋白和弹性纤维的形成主要发生在胎儿发育和出生 后不久。除了损伤反应, 成年期弹性蛋白基本不合成。虽然弹性蛋白的主要功能是提供组织弹性, 但弹性蛋白 - 层粘连蛋白受体 (ELR) 已报道参与的皮肤成纤维细胞增殖 (Groult 等, 1991, Cell Biochem.Funct., 9: 171-182)。 正常老化一直伴随着弹性纤维的退化和丧失 (Braverman 等, 1982, J.Invest.Dermatol., 78 : 434-443 ; Ashcroft 等, 1997a, J.Pathol., 183 : 80-89)。据报道之间的 30 个人 -50 岁, 形成囊肿和陷窝是主要的异常 (Braverman 等, 1982)。在 50-70 岁个体中能观察到多孔纤维的形成, 但在 70 岁以上的人则更加频繁。同 样, 有研究表明, 年长者的防晒部位皮肤下表皮部区域有破碎的弹性蛋白纤维, , 在下表皮 层以下也有破碎的弹性纤维片段 (Ashcroft 等, 1997a)。更多最近的研究已经证实, 随着年 龄的增长皮肤弹性蛋白含量减少。据报道, 防晒皮肤的弹性蛋白染色密度从生命的第十年 的 49 %下降到第九十年的 30 % (El-Domyati 等, 2002, Exp.Dermatol., 11 : 398-405)。同 样, 据报道, 臀部皮肤 ( 防晒的 ) 弹性蛋白的含量在 20 岁至 80 岁间减少 51% (Seite 等, 2006, J.Eur.Acad.Dermatol.Venereol., 20 : 980-987)。有趣的是, 这些作者还报道, 虽然 面部皮肤 ( 严重太阳暴露 ) 的弹性蛋白的含量在 50 至 70 岁之间减少 44%, 但在前臂皮肤 ( 中等强度太阳暴露 ) 却没有观察到弹性蛋白含量的变化。这种随着年龄而增加的皮肤弹 性蛋白损失是与皮肤的弹性和恢复力降低相关的主要因素之一, 会导致皱纹和下垂。提供 弹性蛋白基因的外源性拷贝可能会增加新的弹性蛋白的生产, 并有助于抵消正常的随年龄 减少的弹性蛋白损失。这反过来又可以帮助改善皮肤的外观。
金属蛋白酶 -1 组织抑制剂 (TIMP-1)
在一个实施例中, 所述参与保养具有美容功能的细胞而提高或 / 和维持对外貌产 生积极效果的生物化学或 / 和生理过程的多肽, 可能是金属蛋白酶 -1 组织抑制剂 (TIMP-1) 或其功能衍生物。基质金属蛋白酶 (MMPs) 是一组酶 ( 胶原酶, 明胶酶和质溶解素 ), 参与 消化和重组的 ECM(Woessner, 1994, Ann.NY Acad.Sci., 732 : 11-30), 且在皮肤中大量存在 ( 综述 Kahari 和 Saarialho-Kere, 1997, Exp.Dermatol., 6: 199-214)。 MMP 活性由金属蛋白 酶组织抑制剂 (TIMPs) 调节 (Birkedal 等, 1993, Crit.Rev.Oral Biol.Med., 4: 197-250)。 ECM 的整体更新率是由组织中 MMP 和 TIMP 的比例起作用。
在正常的慢性老化期间, MMP 水平, 尤其是 MMP-1 水平, 在皮肤中增多 (Ashcroft 等, 1997b, Cell Tissue Res., 290 : 581-591 ; Varani 等, 2000)。光老化过程也能观察到皮 肤 MMP 相类似的增多。使用紫外线 (UV) 诱导的皮肤光老化模型证明, MMP-1 可能是主要负 责在皮肤胶原降解的酶 (Brennnan 等, 2003, Photochem.Photobiol., 78 : 43-48)。 与增加的 MMP 含量相比, 随着正常年龄增长, 皮肤 TIMP-1 水平可能会降低。随年龄增长, 这种 MMP 水 平不断提高和 TIMP-1 水平的下降的组合, 可导致皮肤的胶原含量的整体下降。随着胶原的 减少和随后支持它的 ECM 的减少, 皮肤显示出典型的外在老化特征包括细纹和皱纹的出现 和坚固度的降低。最近的研究报告, 各种 MMP 抑制剂可减少面部皮肤皱纹和支持胶原的生 产 (McDaniel 等, 2005, J.Cosmetic Derm., 4: 167-173 ; Moon 等, 2006, Phytomedicine 13 : 707-711 ; Park 等, 2006, Photochem Photobiol., 82 : 574-578)。 作为以上数据的结论, 如可 抑制皮肤 MMP 的活性的 EquiStat(Engelhard) 和 ECM-Protect(Atrium Biotechnologies) 化妆品成分已成功在市场推广。
本发明的实施例可提高 TIMP-1 合成。通过提高 TIMP-1 产量, 皮肤能够减少内源 性 MMPs 对皮肤的影响在本发明的方法和或组合物的实施例中, 。当如上所述的胶原基因构 建体和 TIMP-1 基因构建体同时转染, 可以生成一个双管齐下的措施以改善皮肤的外观。一方面, 胶原基因构建体可加强胶原的生产以对皮肤的 ECM 提供额外支持, 而 MMP-1 构建体的 使用将能保护新的和现有的胶原免受因 MMP 活性而导致的降解。
细胞外超氧化物歧化酶 (SOD-3)
在一个实施例中, 所述参与保养具有美容功能的细胞而提高或 / 和维持对外 貌产生积极效果的生物化学或 / 和生理过程的多肽, 可能是一个细胞外超氧化物歧化 酶 (SOD-3) 或其功能衍生物。皮肤以及许多其他组织含有内源性抗氧化酶系统, 其包 含三个强有力的酶超氧化物歧化酶 (SOD), 谷胱甘肽过氧化物酶 (GPX) 和过氧化氢酶 (Steenvoorden 等, 1997, J.Photochem Photobiol B : Biology 41 : 1-10 ; Afaq 和 Mukhtar, 2001, J.Photochem Photobiol B : Biology, 63 : 61-69)。超氧化物歧化酶催化过氧化物转 化为低毒性的过氧化氢, 其随后被谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶催化为水和氧。
这些酶的变化已经在衰老和光老化中被报导。已经证实表皮中 SOD 和过氧化氢酶 的含量比真皮高, 而在年轻和衰老皮肤真皮中 GPX 的含量均比表皮高 (Rhie et al, 2001, J.Invest.Dermatol., 117 : 1212-1217)。 在天然的和光老化的皮肤中 SOD 或 GPX 的含量均没 有明显变化, 但是过氧化氢酶的含量在表皮中增加了、 在真皮中减少了 (Rhie 等, 2001)。与 此相反, 有报导称光老化会导致角质层中这三种抗氧化酶的大量减少以及表皮中 CuZn-SOD 的减少 (Sander 等, 2002, J.Invest.Dermatol., 118 : 618-625)。这种抗氧化酶活性的丧失 与光老化皮肤上层真皮中氧化蛋白的增加是一致的。
超氧化物歧化酶在皮肤中有三种存在形式 (Cu/Zn-SOD, Mn-SOD 和 EC-SOD)。最 近的研究表明 EC-SOD 可能在抗氧化和抗衰老方面有重要作用。细胞外 SOD mRNA 在真皮 和表皮中都存在, 尽管真皮中的含量要更高, 而 EC-SOD 蛋白在表皮和真皮中都高水平表达 (Choung 等, 2004, Exp.Dermatol, 13 : 691-699)。有研究表明暴露于 UVA 和 UVB 下 EC-SOD 的 mRNA 的表达会增加 (Choung 等, 2004)。其他人则检测了在正常和超氧情况下成纤维细 胞中抗氧化基因的表达 (Serra 等, 2003, J.Biol.Chem., 278 : 6824-6830)。在这些研究中, 超氧引起 EC-SOD 基因的表达, 特别在具有高抗氧化活性的成纤维细胞中。而且, EC-SOD 的表达与端粒酶的缩短成反比, 因此 EC-SOD 表达的增加可以减慢端粒酶的缩短, 使成纤维 细胞的复制生命周期延长 (Serra 等, 2003)。也有研究表明胞外 SOD 对 I 型胶原有直接的 保护作用。EC-SOD 可以通过 C 端的肝素结合区与 I 型胶原直接结合 (Petersen 等, 2004, J.Biol.Chem., 279 : 13705-13710)。另外, 这些科学家报导结合的 EC-SOD 可以阻止氧化造 成的 I 型胶原的断裂。除了潜在的皮肤保护作用, EC-SOD 也有抗炎症功效 (Ha 等, 2006, Biochem.Biophys.Res.Comm., 348 : 450-458), 可以减少化学因素诱导的肿瘤形成的可能性 (Kim 等, 2005, Oncol.Res., 15 : 333-341), 可以减缓胶原引起的关节炎的一些症状 (Iyama et al, 2001, Arthritis Rheum., 44 : 2160-2167 ; Ross 等, 2004, Arthritis Rheum., 50 : 3702-3711)。
外在局部给予 EC-SOD 基因可能与内源 EC-SOD mRNA 的过表达有相同效果, 如增 加 EC-SOD 的表达量、 增强细胞的抗氧化能力、 延长细胞寿命等。通过延长皮肤成纤维细胞 的寿命和增强其抗氧化活性, 这些细胞产生和维持对健康皮肤所必须的 ECM 的能力就会增 强。而且, EC-SOD 对胶原的直接保护作用可以保护皮肤的胶原免受与皮肤衰老和光老化有 关的氧化损伤。
KGF在一个实施例中, 维持具有美容功能的细胞从而增强和 / 或维持对皮肤外观有益 的生化或生理过程的多肽是角质化细胞生长因子 (KGF)。KGF-1( 或 FGF-7) 是一个肝素结 合生长因子, 可以促进上皮细胞的增殖、 迁移和形态发生 ( 例如参见, au dem Keller, Eur. J.Cell Biol., 2004, 11-12, 607-612)。KGF 也可以刺激胶原和 / 或弹性蛋白的产生, 这两 种蛋白对维持皮肤和其他有外在功能的组织的健康有重要作用。这个 26-28kDa 的蛋白 C 端的三分之二与 FGF 家族的 8 个蛋白的同源性是 30-45% (Rubin et al, Cell Biol.Int., 1995, 19, 399-411)。KGF 是由一系列的间叶细胞产生的, 上皮细胞不产生 KGF。上皮细胞会 表达高亲和力的 KGF 受体, FGFR1- Ⅲ b, 它是 KGF 结合的唯一的 FGF 受体 (Grazu-Bilska et al, 2003 ; Werner et al, Cytokin Growth Factor Rev., 1998, 9, 153-65)。KGF 可以与其他 生长因子共同作用。因此, KGF cDNA 的非病毒脂质体转移到伤口可以使 VEGF 和 IGF-1 的 表达增加 (Grazu-Bilska et al, 2003)。在一案例中, 可通过大量给予 KGF 来增加 IGF-1、 VEGF 和 PDGF 的表达。
KGF-2( 也叫 FGF-12) 与 KGF 有 57%的同源性, 与 KGF-1 有相似的伤口治愈功能。 另外, 已有报道指出 KGF 的切短突变——KGFdes1-23 可增强细胞的有丝分裂活性 (U.S.Patent No.5,677,278)。Repifermin 是 一 个 用 于 治 疗 慢 性 静 脉 郁 血 性 溃 疡 的 切 短 的 重 组 人 KGF-2(Robson et ah, Wound Repair Regen., 2001, 9, 347-52 ; Fricker, MoI.Med.Today, 1998, 4, 229)。另外, 最近的研究表明树突状 γ-δ 上皮 T 细胞 (DETCs) 可产生 FGF-7 和 FGF-12, 在伤口治愈中可促进角化细胞的增殖 (Baum 和 Arpey, Dematol.Surg., 2005, 31, 674-686 ; Born et ah, Nat.Med, 2002, 8, 560-1 ; Jaeson, Science, 2002, 296 : 747-9)。
例 如, 包 括 KGF-I、 KGF-2 及 其 类 似 物 的 多 核 苷 酸 载 体 已 经 在 美 国 专 利 (Nos.5,731, 170 ; 5,677,278 ; 5,814,605, ; 6,228,839 以 及 6,916,786) 中 被 描 述。 这 些 序列也许能够被应用于本发明的多核苷酸构建体, 还有被缩短了的序列比如 Kepivance (palifermin), 它不同于内源性的人 KGF, 因为它起始序列 N 端的 23 个氨基酸被删除了以增 强其稳定性。
IGF
在一个实施例中, 维持具有美容功能的细胞从而增强和 / 或维持对皮肤外观有益 的生化或生理过程的多肽是胰岛素样生长因子 (IGF)。 胰岛素样生长因子主要在肝脏产生, 但是通过自分泌机制也有可能在所有细胞中产生。IGF-I 和 IGF-2 可能参与了组织生长调 节、 发育和再生 ( 参考 Grazul-Bilska et ah, 2003)。IGF-I 和 PDGF 可能一起作用增强皮 肤伤口的愈合、 骨骼再生以及牙周伤口痊愈。例如, 通过脂质体转移非常少量的 IGF-1cDNA 能够提高具有烧伤伤口的大鼠的再上皮化速度 (Pierre et ah, J.Burn Care Rehab., 1997, 18, 287-91 ; Jeschke et ah, Gene Therapy, 1999, 6, 1015-1020)。IGF-I 能够和生长激素通 过协同方式相互作用 (Meyer et ah, J.Trauma, 1996, 41, 1008-12)。 在某些实施例中, IGF-I 也可能升高细胞的脂浓度。这将可能有利于增强组织的丰满度, 例如面部肌肤或者嘴唇。
TGF-β
在一个实施例中, 维持具有美容功能的细胞从而增强和 / 或维持对皮肤外观有益 的生化或生理过程的多肽是转化生长因子 (TGF-β)。TGF-β 由几种类型的细胞合成, 包括 血小板、 巨噬细胞、 淋巴细胞、 成纤维细胞、 骨细胞以及角质细胞。 TGF-β 在成纤维细胞中可 能刺激纤连蛋白和胶原的产生, 以及促进这些蛋白多聚体进入胞外基质中 (Servoid, Clin.Pod.Med.Surg., 1991, 8, 937-53)。TGF-β 的应用有利于伤口愈合 (Graham et al, J.Wound Care, 1998, 7, 536-40)。因此, TGF-β 可能参与了增强和调节皮肤组织的作用。
HBF-1
在一个实施例中, 维持具有美容功能的细胞从而增强和 / 或维持对皮肤外观有益 的生化或生理过程的多肽是一种缺氧诱导因子 (HIF-1)。HIF-1 是一种 DNA 结合蛋白, 它能 够激活具有 HIF-1 结合位点的基因的表达。能够被 HIF-1 激活的基因包括 VEGF、 红细胞生 成素以及糖酵解基因。HIF-1 由两个亚基组成, HIF-1-α 和 HIF-1-β。已经发现每一个亚 基的变体都可以被用来灭活 HIF-1, 即通过形成没有功能的 HIF-1 二聚体。因此, 在另一种 实施方案中, 参与维持细胞美容功能的核苷酸或者多肽就是能够编码 HIF-1-α、 HIF-1-β 以及它们的变体的多肽, 或者是包括 HIF-1 结合位点的核苷酸。这样的序列能够在美国专 利 (No.5,882,914) 中找到。
其他与皮肤功能相关的多肽
在一个实施例中, 维持具有美容功能的细胞从而增强和 / 或维持对皮肤外观有益 的生化或生理过程的多肽是表皮生长因子 (EGF)。 EGF 是一个 6KD 的分子, 与 TGF-α 有 30% 的氨基酸同源性。EGF 由血小板产生, 在伤口愈合过程中浓度很高。EGF 可以提高伤口上皮 化速率, 也可以通过阻止伤口过度收缩而减少伤疤的形成。EGF 可能与 KFG、 PDGF 以及其他 生长因子共同维持和 / 或修复皮肤组织。 在另外一个实施例中, 维持具有美容功能的细胞从而增强和 / 或维持对皮肤外观 有益的生化或生理过程的多肽可能是成纤维细胞生长因子家族成员 (FGF))。FGF 由几个相 关联的多肽组成, 包括酸性 FGF(aFGF 或者 FGF-I)、 碱性 FGF(bFGF 或 FGF-2)、 几个癌基因 (int-2, hst/K-FGF, FGF-5) 以及 KGF( 见上面讨论 )。在皮肤中 FGF-1、 FGF-2 以及 KGF 被认 为是最重要的成纤维生长因子。在其他实施例中, 也有可能用到 FGF-IO 和 / 或 FGF-22( 参 考 au dem Keller, Eur.J.Cell Biol., 2004, 11-12, 607-612)。FGFs 能够刺激血管生成, 以及与伤口愈合相关的许多细胞的增殖和 / 或迁移, 包括毛细血管内皮细胞、 血管内皮细 胞、 成纤维细胞、 角质细胞、 上皮细胞以及一些特别的细胞种类, 比如软骨细胞和成肌细 胞。FGF-2 还可以刺激胶原的合成, 上皮形成, 纤连蛋白以及蛋白多糖的合成 ( 参考例如, Grazu-Bilska, 2003)。
在另一个实施例中, 维持具有美容功能的细胞从而增强和 / 或维持对皮肤外观有 益的生化或生理过程的多肽是血小板源生长因子 ( 例如, PDGF AA, AB, BB, CC 及其他 )。 PDGF 是间充质来源细胞的强有力的有丝分裂原, 并且能够促进伤口愈合。PDGF 促进成纤维细胞 中胶原的产生, 从而有利于成纤维细胞的迁移以及改变伤口基质。 例如, 发现体内调节角质 细胞过表达血小板源生长因子 (PDGF) 能够促进伤口愈合 (Eming et al, Hum.Gene Ther., 1998, 9, 529-539)。
在另一个实施例中, 维持具有美容功能的细胞从而增强和 / 或维持对皮肤外观有 益的生化或生理过程的多肽是血管内皮生长因子 (VEGF)。VEGF 高度保守且与 PDGF 具有高 度的结构同源性。VEGF 是一种内皮细胞特异性的有丝分裂原和化学引诱物, 具有强有力的 体内血管生成活性 ( 参考 Grazu-Bilska, 2003), 这对于皮肤细胞维持和修复非常重要。
在 另 一 个 实 施 例 中, 维持具有美容功能的细胞从而增强和 / 或维持对皮 肤 外 观 有 益 的 生 化 或 生 理 过 程 的 多 肽 是 肝 细 胞 生 长 因 子 (HGF)( 参 考 Ono et al, J
SurgRes.2004Jul ; 120(1) : 47-55)。 HGF 具有许多生物学活性, 例如促有丝分裂、 单性生殖、 抗凋亡、 抗成纤维化以及形态发生。对内皮细胞而言它还具有血管生成和血管保护活性。
在另一个实施例中, 维持具有美容功能的细胞从而增强和 / 或维持对皮肤外观有 益的生化或生理过程的多肽至少包括结缔组织生长因子 (CTFG-I, CTFG-2)、 粒细胞巨噬细 胞集落刺激因子 (GMCSF)( 参考美国专利 No.6,689,351, 描述了用 GMCSF 治疗创伤 )、 巨噬 细胞集落刺激因子 (MCSF)、 生长激素 (GH) 中的一种。同时, 维持细胞的美容功能从而增 强和 / 或维持对皮肤外观有益的生化或生理过程的多肽可能包括抗血管生成多肽, 例如 TSP-I 或 TSP-2( 参考美国专利 No.6,712,617)。其他活跃在具有美容功能细胞中的多肽 和因子比如上面描述的, 可以查阅以引用全文的方式并入本文中的第 6,586,185 号美国专 利。
分子构建体及其制备方法
在各种实施例中, 目标基因通过重组 DNA 技术产生。一个重组 DNA 分子包括一个 多核苷酸序列, 这段多核苷酸序列编码至少一种维持具有美容功能的细胞从而增强和 / 或 维持对皮肤外观有益的生化或生理过程核苷酸或者多肽, 它能够利用本领域公知的常规基 因表达技术来操作和表达。通过这种方式, 能够大量产生具有合适的侧翼序列的目标多肽 或者多核苷酸。
本文中提到的这些方法和化合物中的每一种多核苷酸或者多肽包括生物活性衍 生物、 类似物和 / 或保留了全长多核苷酸或多肽具有的生物活性的片段。这些衍生物或者 类似物可能包括翻译后修饰的多肽或者磷酸化的多肽。或者, 通过化学合成具有修饰残基 的核苷酸分子而形成的多核苷酸类似物。 多肽类似物也可能利用常规的氨基酸替换、 删除、 添加或者位点突变的方式而产生。在一个实施例中, 可以通过删除参与了皮肤维持和 / 或 治疗的核苷酸的一段序列或者多肽的氨基酸残基就能得到一个目标基因片段, 正如本领域 技术人员所知。
一个多核苷酸序列编码至少一种维持具有美容功能的细胞从而增强和 / 或维持 对皮肤外观有益的生化或生理过程核苷酸或者多肽, 它能够在原核或者真核表达系统中进 行增殖和表达。 在另一个实施方案中细菌、 哺乳动物、 酵母以及昆虫细胞系均可以被用于重 组载体的增殖。
在一个实施例中, 一个多核苷酸序列编码至少一种维持具有美容功能的细胞从而 增强和 / 或维持对皮肤外观有益的生化或生理过程核苷酸或者多肽, 它能够进行融合蛋白 的表达, 即与另外一种维持具有美容功能的细胞的编码序列以正确的框架和方向联合。这 些融合蛋白用于增强维持具有美容功能的细胞的核苷酸和多肽的稳定性或者保证其正确 加工。或者, 维持具有美容功能的细胞从而增强和 / 或维持对皮肤外观有益的生化或生理 过程的核苷酸或者多肽能够与其他合适的意向用途的分子相连接。例如, 维持具有美容功 能的细胞从而增强和 / 或维持对皮肤外观有益的生化或生理过程的核苷酸或者多肽能够 与一种结合组分相连接从而变成一种被目标细胞认识的受体。
除非另有说明外, 本发明的实践应用中将会利用分子生物学、 微生物学、 重组 DNA 以及免疫学中的常规技术, 这些技术都被包括在本技术领域内。这些技术在文献中有详 细的解释, 包括 Sambrook, 等, Molecular Cloning : ALaboratory Manual 2nd ed.(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) ; DNA Cloning, Vol.I 和 II, D.N Glover ed.(IRLPress, 1985) ; B.Perbal, A Practical Guide To Molecular T/US2010/04205 ; Cloning, Wiley(1984) ; ; Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, J.H.Miller 和 M.P. Calos eds.(Cold Spring Harbor Laboratory, 1987) ; Methods In Enzymology, Vol.154 和 155, Wu 和 Grossman, eds., 和 Wu, ed., respectively(Academic Press, 1987).
重组构建体由维持具有美容功能的细胞从而增强和 / 或维持对皮肤外观有益的 生化或生理过程的核苷酸或者多肽组成, 能够利用公知的重组技术得到。 就此而言, 目标序 列通过正确的阅读框和方向可以可操纵地连接到一个或者多个合适载体的调节序列上。 因 此, 目标序列可以被插入, 例如, 插入到一个哺乳动物载体上在哺乳动物细胞中进行表达。
图 7 显示了本发明编号 20 的重组构建体。这个重组构建体由一个 DNA 分子组成, 它编码一个维持具有美容功能的细胞从而增强和 / 或维持对皮肤外观有益的生化或生理 过程蛋白或多肽 22。或者, 这个载体由一段多核苷酸组成 ( 例如反义 RNA 或者 siRNA), 它 能够用来调节维持具有美容功能的细胞从而增强和 / 或维持对皮肤外观有益的生化或生 理过程的多肽的表达。
在一个实施例中, 维持具有美容功能的细胞从而增强和 / 或维持对皮肤外观有 益的生化或生理过程的多肽的编码序列来源于一种互补 DNA(cDNA), 它由宿主细胞的胞内 RNA 逆转录而成, 能够用本文举例中描述的方式或者本领域中其他已知的方式表达目标基 因。
如图 7 所示, 在某些实施例中, 重组载体可能包含一段调节序列比如启动子 24( 或 ) 增强子 26。因此, 一段包含了在目标细胞中强有力的启动子 24 的常规序列可能通 过分子技术被连接到 cDNA 序列上。也可能用到其他的调节序列, 比如一个或者多个增强子 序列 26, 一个核糖体结合位点 28, 一个具有功能性剪接供体和受体位点序列的内含子, 一 段指导重组多肽 30 分泌的信号序列, 一段终止序列 32, 一个多腺苷酸化信号和 / 或多腺苷 酸化序列 34, 其他转录终止序列以及一段宿主基因组同源序列。 其他序列, 比如复制起始位 点能够被插入到载体中从而优化目标产品的表达。同时, 一个选择标记也有可能被包括在 载体上以便用来对转化的宿主细胞进行选择。
调节序列具有多种来源。例如, 它们中一个或者多个可能能够正常地与编码序列 相连结, 或者来源于宿主细胞的调节系统, 或者与宿主细胞的调节系统同源 ( 例如角质细 胞 )。同样地, 启动子可能来源于一个基因, 这个基因能够启动应答使具有美容功能的细胞 退化的化合物或者条件, 比如紫外线或者一些化学试剂。表达载体的各种组分能够直接连 结到一起, 或者由通过本领域中已知的限制性酶识别位点组成的连结体来连结。
任何能够使维持具有美容功能的细胞从而增强和 / 或维持对皮肤外观有益的生 化或生理过程的多肽编码序列表达的启动子都能够被用于本发明。例如, 能够应用于此的 哺乳动物启动子序列是一些哺乳动物病毒, 它们能够进行高表达且具有广泛的宿主范围。
启动子可以是那些能够在大部分哺乳动物中进行持续表达的启动子, 比如 PKG 启 动子。举例来说, 能够在真核细胞中持续表达的合适的调节元件是一些能够被 RNA 聚合酶 III 识别的启动子或者病毒启动子、 CMV 增强子、 CMV 启动子、 SV40 启动子或者 LTR 启动子, 如来自 MMTV( 小鼠乳腺瘤病毒, Lee et al, 1981, Nature, 214, 228-232) 和其他病毒的启 动子和激活序列, 例如来自 HBV, HCV, HSV, HPV, EBV, HTLV 或者 HIV。举例来说, 能够在真核 细胞中进行表达调节的调节元件是由四聚体组成的操纵子及其相应的阻遏物 (Gossen M.,等, 1994, Curr.Opin.Biotechnol., 5, 516-20)。
在一个实施例中, 目标基因的表达在组织特异性启动子控制下才发生。在另一个 实施例中, 组织特异性启动子可能包括皮肤特异性启动子, 比如人 K10 启动子 (Bailleul et al, 1990, Cell, 62, 697-708 ; Sawamura 等, J.Invest.Dermatol, 1999, 112 : 828-830), 人 K14 启动子 (Vassar et al, 1989, Proc.Natl.Acad.ScL USA, 86, 1563-67), 人套膜蛋白启动子 (Carroll 等, 1993, Proc.Natl, Acad.ScL, 90 : 10270-10274), 牛细胞角蛋白 IV 启动子, 或者 其他人角蛋白启动子 ( 例如, K1 和 K5)(Bryne 等, 1994, Development, 120 : 2369-2383)。
另一种方案中, 启动子可能是在细胞周期或者发育过程中特定时间启动的启动 子。 例如, 重组载体可能包括能够在真核细胞中进行组织特异性表达的调节元件, 例如启动 子或者来自启动子的激活序列, 或者一些只在某些细胞类型中表达蛋白的编码基因的增强 子。举例来说, 这些在真核生物细胞周期中特异性表达的调节元件是以下基因的启动子 : cdc25A, cdc25B, cdc25C, cyclin A, cyclin E, cdc2, E2F-1to E2F-5, B-myb or DHFR( 参 考美国专利 No.6,856,185 ; No.6,903,078 ; 以及 Zwicker J. 和 Muller R.5 1997, Trends Genet., 13, 3-6)。根据本发明, 细胞周期调节启动子仅限于增殖细胞中多肽或者核苷酸 的表达。在一个实施方案中, 一种叫做 FiRE 的元件能够使角质细胞在皮肤中特异性表达 (Jaakkola et al, 2000, Gen.Ther., 7, 1640-1647)。这种 FiRE 元件是一种 AP-1 驱动分子, FGF 诱导的 Syndecan-1 基因应答元件 (Jaakkola et al, 1998, FASEB J., 12, 959-9)。同样 的, 那些能够实现真核细胞中代谢特异性表达的元件是一些被低氧 ( 如 HIF-α)、 葡萄糖缺 乏、 磷酸浓度或者热休克调节的启动子。
在另一个实施例中, 一个增强子元件能够与启动子序列相连接 . 这样的增强子不 仅仅可以扩增基因, 还可以调节目标基因的表达。 在一个实施方案中, 增强子可以来源于通 常位于多肽编码基因 ( 例如胶原 ) 附近的一段序列, 这种多肽参与了维持或者作用于与美 容相关的细胞。 被应用于哺乳动物表达系统中合适的增强子元件是, 例如, 来源于具有广泛 宿主范围的病毒增强子, 如 SV4 早期基因增强子, 来源于劳斯氏肉瘤病毒 LTR 以及人巨细胞 病毒的增强子 / 启动子。
此外, 还有那些能够包含在启动子序列里面合适的增强子, 这些增强子只有在诱 导物存在时才能够被激活, 比如本领域已知的激素、 金属离子或者酶的底物。
在本发明的另一个实施例中, 一段转录终止序列被放在目标基因编码序列翻译终 止密码子的 3’ 端 . 因此, 这段终止序列和启动子分别位于编码基因的两侧。
表达载体可能还包括一个复制起始位点从而使其作为一个复制子, 进行大量的复 制且在宿主中稳定存在。 这样的复制起始位点包括那些能够使表达载体在胞内合适蛋白存 在的条件下进行大量复制的序列, 例如 2μ 和自主复制序列能在酵母中发挥作用, SV40 中 重要 T- 抗原的复制起始位点能在 COS-7 中发挥作用。哺乳动物复制系统可能包括一些来 源于动物病毒的序列, 需要反式作用因子才能进行复制。 例如, 乳头多瘤空泡病毒的复制系 统如 SV40, 在适量的重要 T- 抗原存在的条件下能够大量复制乳头多瘤空泡病毒, 或者也利 用那些来源于牛乳头瘤病毒和巴尔病毒的序列。
在某些情况下, 表达载体可能不止一个复制系统, 从而使其能够在哺乳动物中表 达以及在原核宿主中克隆和扩增 ( 参考美国专利 No.5,677,278)。
在一个实施例中, 表达载体能够作为整合载体被整合到宿主基因组上。此处的整合载体至少包含了一段多聚核苷酸序列, 这段序列与宿主基因组同源从而使得载体能够整 合。例如, 在一个实施例中, 利用了噬菌体或者转座子插入序列。本技术的最佳实施方式 如文献中描述 ( 例如, Branski 等, 2006, Gene Therapy, 2006, 1-10 ; 和 Hengge, 2006, Gene Therapy, 13 : 155-1563)。
在本发明的某些实施方案中, 表达载体还可能包含一个或者多个选择标记, 从而 能够选择转化成功的宿主细胞。能够在宿主细胞中表达的选择标记包括一些能够使宿主 细胞具有耐药性的基因, 例如衣霉素、 G418、 氨苄青霉素、 氯霉素、 红霉素、 卡那霉素 ( 新霉 素 )、 四环素。 选择标记还可以是一些生物合成基因, 比如那些参与组氨酸、 色氨酸以及亮氨 酸生物合成途径的基因, 如 ade2、 his4、 Ieu2、 trpl, 或者是一些能够使得宿主细胞在毒性化 合物中 ( 如金属 ) 生长的基因。
因此, 在一个实施方案中, 本发明包括了一种产生多聚核苷酸的方法, 这种多聚核 苷酸编码至少一种维持细胞具有美容功能的核酸或者多肽, 使得这种核酸或多肽能够在具 有美容功能的细胞中表达从而增强和 / 或维持对美容有积极作用的生理和 / 或生化过程。 这种方法还包括在表达重组载体中插入一段多聚核苷酸。 因此, 在某些实施方案中, 本发明 包括了一种由多聚核苷酸组成的表达载体, 这段多聚核苷酸编码至少一种维持细胞具有美 容功能的核酸或者多肽。 同样地, 在某些实施方案中, 本发明包括了转染了这种载体的宿主 细胞。
例如, 这种方法还包括将 DNA 构建体整合到表达载体上。这种方法可能进一步包 括将本发明的表达载体转染到细胞中。因此, 在一个实施方案中, 本发明包括转染了本发 明表达载体的细胞。例如, 可以构建表达参与维持细胞具有美容功能的多肽的质粒。表达 盒式序列可以被插入到表达载体如 pcDNA3.1 上或者利用标准重组技术构建的表达载体 (Invitrogen, CA)。
如本技术领域所知, 这样的核酸构建体可以通过突变进行修饰, 例如, 通过包含了 突变位点的引物来 PCR 扩增核酸模板。通过这种方式, 可以设计包含了不同水平生物活性 的多肽。在另一个实施方案中, 突变序列可能与原始 DNA 具有 70%、 75%、 80%、 85%、 90% 或者更高的同源性。这样的话, 突变体可能包括了能在严格条件下杂交的核酸序列 ( 例如 在 1mol 盐浓度, 低于 DNA 双链的溶解温度 (Tm 值 )20-27℃的条件下。
同样地, 这种方法还包括将表达载体转染到宿主细胞中。 在某些实施方案中, 本发 明的多肽能够在哺乳动物表达系统中表达, 包括将表达构建体利用病毒如逆转录病毒或者 腺病毒转入到哺乳动物细胞中的系统。 适合作为表达宿主的哺乳动物细胞系是本技术领域 公知的, 包括很多合适的来自美国典型培养物中心 (ATCC) 的永生细胞系。特别包括了中国 仓鼠卵巢细胞系 (CHO)、 NSO、 SP2 细胞、 HeLa 细胞、 幼地鼠肾细胞 (BHK)、 猴肾细胞 (COS)、 人 肝癌细胞 (Hep G2)、 A549 细胞以及许多其他细胞系。细胞系的选择取决于在哪一种细胞系 中多肽能够高水平表达。也可能利用到昆虫细胞系, 如 SF9 细胞。还有可能利用到植物宿 主细胞, 如烟草、 拟南芥、 浮萍、 玉米、 小麦、 马铃薯等等。 微生物宿主细胞包括大肠杆菌和链 霉菌属。酵母宿主细胞包括粟酒裂殖酵母、 酿酒酵母和毕氏酵母。
当编码目的基因的重组表达载体被导入到哺乳宿主动物细胞中, 通过培养宿主细 胞足够的时间本发明涉及的多肽就能在宿主细胞内表达, 或者分泌到细胞培养液上清中。 表达的多肽可以通过标准的蛋白纯化方法从培养液中回收。编码本发明涉及的多肽的核酸分子和含有这些核酸分子的表达载体可以用于在 合适的哺乳动物细胞、 植物细胞、 细菌和酵母细胞中转染。
可以通过已知的任何一种转化方法将多聚核苷酸导入到宿主细胞中。 在本技术领 域将异源多核苷酸导入到哺乳动物细胞中的方法是已知的, 包括葡聚糖介导的转染、 磷酸 钙沉淀、 聚凝胺介导的转染、 原生质体融合、 电穿孔、 脂质体包裹以及将 DNA 直接微注射到 核里。另外, 也可以通过病毒载体把核酸分子导入到哺乳动物细胞中。在本技术领域, 转化 植物细胞的方法也是已知的, 包括土壤杆菌介导的转化、 基因枪转化、 直接注射、 电穿孔和 病毒转化。转化细菌和酵母细胞的方法也是已知的。
表达载体也可以通过 DNA 基因枪的方法导入到表达系统里, 在该方法中将质粒沉 淀到微颗粒上, 最好是金颗粒, 然后微颗粒被推进目的细胞或表达系统中。DNA 基因枪技术 和手段已经得到广泛应用, 如一种 “基因枪” 已经被商业应用于将微颗粒导入到细胞 ( 例 如, Helios Gene Gun, Bio-Rad Labs., Hercules, CA) 和皮肤中 (PMED Device, PowderMed Ltd., Oxford, UK)。
本发明涉及的多肽在生产细胞系中的表达量可以通过一些已知技术得到提高。 例 如, 谷氨酰胺合成酶基因表达系统 (GS 系统 ) 和抗新霉素细胞质表达系统是在一定条件下 提高表达量的常用方法。 当本发明涉及的多肽用不同细胞系表达时, 它们会有不同的糖基化方式。 然而, 这 里所描述的核酸分子编码的多肽, 或组成的氨基酸序列, 都是立即产物, 不考虑其糖基化
在一种实施方案中, 重组 DNA 载体可以转染到中国仓鼠卵细胞中, 得到最优表达。 在另一种实施方案中, 细胞可产生的蛋白浓度为 0.1-20 克每升, 或 0,5-10 克每升、 1-5 克 每升, 或 1-2 克每升。例如, 重组载体可以稳定转染到中国仓鼠卵细胞 (CHO) 中, 其中表达 有维持美容功效的多肽的细胞被筛选和克隆出来。在一种实施方案中, 可通过加入抗生素 G418 筛选有新霉素抗性的表达重组质粒的细胞。通过 Western Blot 检测细胞上清液得到 的高表达重组蛋白的单克隆可被挑选出来和扩增, 基因产物可通过蛋白 A 亲和层析纯化。
把编码与皮肤维持和 / 或治疗有关的多核苷酸或多肽的重组载体转移到有美容 功能效的细胞中
很多方法都可以用于转移编码有美容功效的多肽的多聚核苷酸, 从而增强或维持 对皮肤有益的生化或生理过程。因此, 本发明的配方含有帮助蛋白进入细胞的特殊成分。
为了通过转染、 转化或感染等手段使核酸进入到真核或原核细胞中, 核酸可以被 整合到质粒中, 作为病毒载体或非病毒载体的一部分。 合适的病毒载体包括杆状病毒、 牛痘 腺依赖 病毒、 慢病毒 ( 参考 Siprashvili 和 Khavari, MoI Ther., 2004, 9, 93-100)、 腺病毒、 病毒和疱疹病毒。 有基因治疗功效的载体是病毒载体, 例如腺病毒载体和逆转录病毒载体。 真核表达载体也适用于单独的基因治疗, 因为裸 DNA 可以在局部敷用中穿透进入有美容功 效的细胞中 (Hengge et al, 1996, J.Clin.Invest., 97, 2911-6 ; Yu et al, 1999, J.Invest. Dermatol, 112, 370-5)。 另一种基因治疗载体可通过把上述核酸做成金颗粒得到, 然后用所
谓的基因枪注射到组织中 (Wang et ah, 1999, J.Invest.Dermatol, 112, 775-81, 以用到的基因转染方法会在下文更详细地说明。
裸 DNA39vaget al, 1998, J.Invest.Dermatol, 111, 183-8), 最好使皮肤中, 或者细胞中。一些本发明可CN 102471769 A
说明书37/71 页在一个实施方案中, 编码至少一个参与维持具有美容功能的细胞从而增强和 / 或 维持对美容有积极作用的生化和 / 或生理过程的核酸或多肽的多核苷酸重组体被直接注 射入具有美容功能的细胞中, 称之为裸 DNA。且在局部施用后, 寡核苷酸 ( 例如, 编码 RNAi) 能被有效的转入表皮的各个细胞层。
在某些的实施方案中, 这些 DNA 和水或者缓冲液一起使用。或者, 也可以利用在 此被详细描述过的脂质体。并且, 在某些的实施方案中, 皮肤可能被磨损了, 通过移除一部 分毛发 ( 如剥离 ), 或者刷掉, 或者利用本技术领域已知的其他方法。(Choi et al, Skin Pharmacol.Appl Skin Physiol., 2003, 16 : 271-282 ; Choi 等, Current Drug Delivery, 2006, 3: 37-45).
在其他实施方案中, 可能用到包含了与 DNA 连接的多肽的基因载运系统。在另一 个实施方案中, 载体 ( 称之为 “裸” 表达载体 ) 会被传入到生物相容的基质中, 如胶原基质 (Goldstein 和 Banadio, U.S.Pat.No.5,962,427)。
一 些 研 究 报 道 说, 裸 质 粒 DNA 能 够 成 功 地 经 皮 肤 传 送 (Fan 等, 1999, Nature Biotech., 17 : 870-872 ; Yu 等, 1999, J.Invest.Dermatol., 112 : 370-375 ; Kang 等, 2004, J.Gene Med., 6: 1238-1246)。例如, 据报道, 磷酸盐缓冲液 (PBS) 中的 DNA 局部施用后, 产 生了抗细菌 β- 半乳糖苷酶的抗体, 表明了裸质粒 DNA 可以经皮肤传送 (Fan 等 (1999)。利 用具有毛囊和不具有毛囊的小鼠进行传送对比, Fan 等人 (1999) 发现这种传送是通过毛囊 的。但是, 也有其他报道称, 裸质粒 DNA 的转运导致了报告基因不仅在毛囊中表达也在上 皮细胞中的角质细胞内表达 (Yu 等, 1999)。也有论证表明, 300μg 质粒 DNA 局部施用 2 小 时后, 导致每克组织转运了大约 1,000ng 的质粒 DNA, 施用 24 小时后每克组织转运了大约 100ng 的质粒 DNA, 局部施用的一天后 mRNA 就开始表达 (Kang 等, 2004)。
早期的研究表明, 质粒 DNA 可能会通过缺损的系统 ( 这些缺损是在适当条件下暂 时形成的孔道 ) 渗透进入角质层 (Menon 和 Elias, 1997, Skin Pharmacol, 10 : 235-246)。 也有论证表明, 被极性脂类环绕的水合区域构成的孔道也可能促进了细胞间极性物质的转 移 (Sznitowska 等, 1998, J.Pharm.ScL, 87 : 1109-1114)。 并 且, 近 期 研 究 表 明, 质 粒 DNA 在胞内主要由角质细胞通过吞噬作用摄取, 还涉及到与 DNA 连接的埃兹蛋白和膜突蛋白 (Basner-Tschakarjan 等, 2004, Gene Therapy 11 : 765-774)。
裸质粒 DNA 的安全性和扩散性已得到广泛的评价 ( 如, Hengge UR, Vol-Platzer B(eds), The Skin and Gene Therapy.Springer-Verlag : Berlin, 2001, pp.67-80)。与病 毒载体转运 DNA 不同, 裸质粒 cDNA 不会引起不良的免疫应答, 也不会导致插入突变, 且能保 持启动子的功能。潜在的担忧在于质粒 DN 会 A 从靶点向其他组织和器官迁移, 然而, 报道 称在任何时间点都不能检测到质粒 DNA 整合进入了宿主 DNA, 并且质粒 cDNA 的表达时间很 短暂, 以至于处理 11 天之后, 表达的 RNA 只在被处理过的皮肤中发现, 除此之外的任何其他 组织中都未发现 (Hengge 等, 1995, Nat.Genet, 10 : 161-166)。据猜测, 质粒 DNA 的遗失是由 于组织核酸酶的降解以及表皮再生引起的。由于质粒 DNA 表达的短暂性以及质粒 DNA 的快 速降解, 因此皮肤的基因疗法被认为是安全的。
脂质体和微囊体介导的转移
例如, 在其他的实施方案中, 脂质体和 / 或微囊体被用于促进多聚核苷酸的转 移, 多聚核苷酸编码参与维持具有美容功能的细胞具有从而增强和 / 或维持对美容有积极作用的生化和 / 或生理过程的多肽, 脂质体是由人工构建的、 含有双层磷脂的小囊泡 (Jeschke, M.G. et al, Gene Ther., 12, 1718-24(2005) ; 美国专利 No.6,576,618)。微囊体 是非常小的脂质体, 但是其制作方法本质上与脂质体相同。
核酸、 蛋白质和其他生物物质能够被包含在脂质体和 / 或微囊体中, 通过质膜融 合的方式被运输进入哺乳细胞中。脂质体和 / 微囊体是引人注目的运载系统, 因为它们是 无病毒的、 稳定的, 并且能够与细胞膜相互作用。利用脂质体和 / 或微囊体直接施用到皮肤 上, 可以把脂质双分子层中包含的物质通过质膜融合的方式导入具有美容功能的细胞中。 传送的方式可以是内吞作用也可以是膜泡运输途径。例如, 脂质体和 / 或微囊体能够皮下 注射转染真皮中的细胞, 导致皮肤注射位点的蛋白表达。也可以先用空脂质体和 / 或空微 囊体对皮肤进行预处理, 然后再用含裸 DNA 的脂质体处理。
脂 质 体 和 / 或 微 囊 体 由 阳 离 子、 阴 离 子、 中 性 脂 质 和 混 合 物 构 成 (Luo, D.& Saltzman, W.M., Nat.Biotech., 18, 33-37(1999)。为了转移 DNA, 脂质分子可以通过化学修 饰使其包含化学基团从而促进 DNA 的压缩或释放。阳离子脂质, 例如季铵盐洗涤剂、 胆固 醇和甘油二酯阳离子衍生物、 聚胺类脂质衍生物, 更有利于细胞转染, 因为它们降低了 DNA 的净负电荷并且增强了其同细胞膜的相互作用 (Nishikawa, M.&Huang, L., 2001, Hum.Gene Ther., 12, 861-70 ; Badea J.Biol.Gene Medi 2005, 7: 1200-1214)。也可以使用包括 1, 2, 3- 三甲基丙烷磷脂酰乙醇胺在内的其他脂质体。
中性脂质, 例如磷脂酰乙醇胺 (DOPE)、 甘油月桂酸、 聚氧乙烯 -10- 硬脂 (POE-10)、 胆固醇, 可以作为辅助性脂类加入到阳离子脂质 DNA 复合物中, 从而在细胞通过内吞作用 摄取复合物后, 促进 DNA 从内吞体中释放出来。也应该充分利用能促进 DNA 转移的辅助 物, 例如可以连接到 DNA 上的聚合物、 蛋白质或者促进 DNA 更有效地转入细胞核中的合成 肽 -DNA 分子 ( 参考 Niidome, T.& Huang, L., Gene Ther., 9, 1647-52(2002))。这样, 由于 阳离子聚合物 ( 例如聚赖氨酸或鱼精蛋白 ) 能够引起 DNA 紧密压缩, 从而防止复合物聚合 以及核酸酶的降解作用, 所以阳离子聚合物可以被应用于脂质 -DNA 复合物中。例如在混合 质粒 DNA 之前, 先将 1, 2, 3- 三甲基丙烷磷脂酰乙醇胺 (DOTAP) 与带有硫酸鱼精蛋白的脂质 体混合, 然后产生稳定的 135nm 的小颗粒, 可以导致基因在各个组织中高水平的表达 ( 如, lung., liver, heart)(Li, S.et al, Gene Ther., 5, 930-37(1998))。 加入作为辅助性脂质的 胆固醇, 可以增强脂质 - 肽 -DNA 复合物的转染效率。并且, 在添加阳离子脂质 ( 脂质体 RPR 115335 或 RPR 120535) 或者聚合物 ( 聚乙烯亚胺 ) 之前, 预先将荧光素酶基因或 β- 半乳 糖苷酶基因与来源于人组蛋白或鱼精蛋白的短肽紧密连接, 即使在血清存在的情况下, 也 可以增强转染效率。
正如本技术领域所知, 脂质体可以通过加热脂质从而形成脂质相的方式来制作 (Wu, H.et al, Int.J.Pharmaceut, 221, 23-24(2001))。随后, 在冷却条件下, 通过注射器来 回推动, 将包含有水、 盐、 缓冲液的水相与脂质相混合。 其后, 通过声波降解法直至最终形成 直径在 100-140nm 的脂质体。然后通过倒置混合, DNA 或蛋白质 ( 溶液 ) 可以被加入到脂 质体中。这样制备的脂质体可以直接应用或注射到皮肤内。制作脂质体所要用到的脂质种 类和比例、 DNA 的浓度、 以及加到皮肤上的脂质体的量, 需要根据经验来判断最终实现最优 化。促进 DNA 转移的辅助物, 例如多肽, 可以在加入脂质体混合物之前, 与 DNA 混合 ; 但是, DNA 辅助物必须维持高度的水溶性, 从而被密封在脂质体脂质相的外部。另外, 通过对包含有阳离子脂质以及 DOTMA 或磷脂酰乙醇胺 (DPOE) 的悬浮脂质体 进行超声处理可以制备小的单层囊泡, 例如细胞转染剂 GS2888。倒置混匀之后, DNA 或蛋白 质将通过离子键连接到脂质体的表面, 按照可以维持复合物表面净正电荷的比率, 此时 DNA 将 100%混入脂质体中。 而且, 阳离子巯基洗涤剂也可以被用于制备转运 DNA 的脂质体 ( 例 如参见, Dauty, E.et al, J.Am.Chem.Soc, 123, 9227-34(2001))。一旦被氧化, 脂质中的巯 基就会转变成二硫化物, 促进 DNA- 脂质复合物形成稳定的纳米级小颗粒, 这些小颗粒会以 静电的形式连接到细胞表面, 阴离子肝素硫酸蛋白多糖会促使细胞对其的摄取。小尺寸的 纳米粒子和脂双层结构均会促进 DNA 转入具有美容功能的细胞中。一旦进入细胞, 细胞内 谷胱甘肽所提供的还原性环境会将二硫化物转化为硫醇并释放 DNA。
油包水和水包油的纳米乳剂介导的转移
在另一个实施例中, 油包水和 / 或水包油的纳米乳剂可以被用来转移多核苷酸或 多肽, 这些多核苷酸或多肽可以用来维持具有美容功能的细胞, 进而增强和 / 或维持对细 胞美容功能具有积极作用的生理生化过程。水包油和 / 或油包水的纳米乳剂是由水、 油和 表面活性剂构成的热力学稳定的液态均质分散体系, 构成了将 DNA 或蛋白质 ( 或其它生物 分子 ) 转入细胞中的技术 (Wu, H.et al, Int.J.Pharmaceut, 221, 23-24(2001) ; 同时参考美 国专利 Nos.5,753,241, 6,274,150, 6,335,022, 6,464,990, 6,541, 018, 以及 6,689,371)。
利用具有生物学安全的成分, 例如聚氧乙烯 - 失水山梨醇单油酸酯 ( 吐温 80)、 失水山梨醇单油酸酯和橄榄油, 可以使人体试验中对人体刺激的风险降到最低。在这些成 分精确的化学计量比率下, 缓慢加热以及轻轻混匀, 纳米粒子会开始自发形成。 这样就不需 要高剪切力的作用, 从而消除了对被转运的生物分子明显的物理损伤。这项技术已经实现 了规模化, 可以封装大量的水相物质。 纳米乳剂可以直接应用于皮肤, 从而实现将生物分子 导入具有美容功能的细胞中。例如, 氯霉素乙酰转移酶和人干扰素 -α2 的 cDNA 已成功实 现了对离体小鼠表皮的转染, 其中, DNA 沉积物主要进入了滤泡角质细胞 (Wu et al, 2001)。 单次施用以后, 转基因表达量在 24h 达到最大, 且多次施用后, 转基因表达水平显著提高。 也可以用相似的方式使用包含有乙醇 - 氟碳的微乳状液。
颗粒介导的转移
在 另 一 实 施 方 案 中, 转 运 方 法 包 括 颗 粒 介 导 的 转 移 ( 例 如 参 见, Nishikawa, M.&Huang, L., Hum.Gene Ther., 12, 861-70(2001) ; Luo, D.&Saltzman, W.M., Nat.Biotech, 18, 33-37(1999))。例如, 由金粒子或钨粒子等金属粒子包被的 DNA 颗粒 (1-5μm), 能够 被 “基因枪” 加速到极高的速度, 从而穿透细胞膜 (Williams, R.S.et al, Proc.Nat.Acad. Sci.U.S.A., 88, 2726-30(1991))。通过将微粒子在溶液中与 DNA 溶液、 氯化钙和亚精胺自 由基循环混匀, 微粒子表面可被包被上 DNA。将经由酒精淋洗后的颗粒涂抹到基因枪的涂 药器上, 待颗粒干燥、 酒精挥发后, 基因枪就可以将颗粒射入具有美容功能的细胞中, 从而 增强和维持对细胞美容功能有积极影响的生理生化过程。 这项技术可以将一种生物分子同 时导入多个细胞中, 并且将生物分子经由细胞膜直接导入细胞质甚至细胞核中, 因此可以 避免体内潜在的酶解反应。另外, 在一个实施方案中, 这项技术只能实现颗粒对细胞层较 浅部位的渗透作用, 因此可有效地用于被运输进入表皮的 DNA 的局部表达。基因枪的颗粒 轰击会造成轻微的细胞损伤以及炎症。例如, Oshikawa 等人使用氦脉冲 PowderJect XR 基 因传送装置, 将内部包被着白细胞杀菌素的 12 个基因 DNA 的金颗粒射入小鼠表皮中, 或者覆盖在肿瘤位点上, 或者与肿瘤位点有较远距离 (Oshikawa, K.et al, Hum.Gene Ther., 12, 149-60(2001))。结果发现, 覆盖在肿瘤位点上的转染细胞可以有效地抑制肿瘤的生长, 但 是如果不考虑转染位点的话, 这种疗法具有抗癌细胞转移效果 (Oshikawa 等, 2001)。类似 的方法也得到了成功的应用, 在人 β- 肌动蛋白启动子的控制下, 编码荧光素酶的基因 DNA 可以有效转染小鼠表皮, 基因枪轰击区域 10-20 %细胞会表达转入的基因 (Williams 等, 1991)。
电压驱动的转移
还可以使用其他的转移方法, 例如电穿孔法、 离子电渗法等 ( 参考 Banga, A.K.et al, Int.J.PharmaceuL, 179, 1-19(1999) ; Banga AJ.&Prausnitz, M.R., TIBTech, 16, 408, 12(1998) ; Andre, F.&Mir, L.M., Gene Ther., 11, S33-42(2004))。在这些方法中, 当 DNA 已 被注射进入表皮或者敷在表皮上时, 电流可以促进 DNA 转入细胞中, 在高离子强度的介质 中效果更好。由于皮肤易于处理, 所以是应用这些技术的最佳组织。使用这些技术时必须 充分考虑 DNA 的剂量、 电极形状 ( 如针状、 钳状 ) 和数量、 电场强度和持续时间。处理后的 细胞的渗透性逐渐降低, 这表明这些技术对细胞所造成的损伤均是可逆的。 另外, 由于受到 电流的作用, 这些技术可以实现在低刺激的条件下达到 DNA 高水平转移的目的。
电穿孔
电穿孔涉及到使用非常短促的高电压 ( 通常应大于 100V), 电脉冲会使细胞膜 暂时通透, 促使细胞对大分子的摄取 ( 参考 Nishikawa, M.&Huang, L., Hum.Gene Ther., 12, 861-70(2001))。电流会使细胞膜形成通透孔, DNA 和蛋白质会通过该孔顺浓度梯度进 入细胞内, 从而, 促进或维持在注射和 / 或施用后对生物分子的摄取。这项技术已被用于 活体表皮转染 : 通过皮内注射, 将编码报告基因的质粒注射进入猪或小鼠的表皮, 然后用 PulseAgile 电穿孔设备和软件给予电脉冲。 (CytoPulse Sciences, Hanover, MD)(Drabick, JJ et al, Molec.Ther., 3, 249-55(2000)). 转染细胞主要位于真皮中, 包括脂肪细胞、 成纤 维细胞和内皮细胞及其他细胞中。
离子导入
离子导入涉及到低压电脉冲的使用 ( 通常为 10V 或更小 ), 这种电脉冲通常是 高频脉冲或持续的恒定脉冲 ( 通常 0.5mA/cm3 或更小 ), 进而促进带电分子进入表皮 (Nishikawa, M.&Huang, L., Hum.Gem Ther., 12, 861-70(2001))。具有与极性分子相同的 电荷的电极可以驱动带电分子进入皮肤。例如, 带有负电荷的阳极可用来驱动带负电荷的 DNA 分子。电极通常非常小, 可以被纳入到基质中, 基质可以应用于施用过 DNA 溶液的表皮 (Mikszta, J.A.et al, Nat.Med., 8, 415-19(2002))。 除了使用包括汗腺在内的原有路径外, 该技术与电穿孔类似, 在表皮上形成了新的孔道来实现转移。 与电穿孔相比, 该技术更适用 于人体。被转运的 DNA 与施用于表皮上的电流和基质大小成正比。因此, 用量易于调节, 并且可以根据病人的需要进行优化。另外, 由于离子导入法是一种驱动型的转移, 所以与 其他药物驱动系统相比, 它对其他生物变量的依赖较小, 例如膜渗透活细胞内组件 (Banga, A.K.et al, Int.J.Pharmaceut., 179, 1-19(1999))。在一个实施方案中, micorenhancer 芯 片可以利用裸露的荧光素酶基因 DNA, 对 BALB/c 小鼠的具有美容功能的细胞进行转染, 与 局部施用相比, 该过程具有更显著的转基因活性 ( 增强了 2800 倍 )(Mikszta, J.A.et al, 2002)。电整合
电整合是对离子电渗法和电泳的一种改进, 使用这种方法, 电脉冲会造成皮肤 上层细胞的破裂, 从而使包装在囊泡或颗粒 ( 例如微球体和金颗粒 ) 中的分子被转移进 入表皮。电极可直接设置在目标位置, 且颗粒直接施用于皮肤上。表皮上层细胞的破裂 后, 双向电泳和 / 或压力驱动粒子进入表皮 (zhang 等 Bioelectrochem.Bioenerg., 42, 283-92(1997))。此外, 也可使用压力介导的电整合技术。
射频消融介导的转移
此外, 在一个实施方案中, DNA 和 / 或蛋白质的转移方法还包括射频消融介导的转 移。通过射频消融技术能在具有美容功能的细胞上形成微通道或瞬间微通道 (Birchall, J.et al, Int.J.Pharmaceut, 312, 15-23(2006))。 这些通路足够大, 具有足够的形态和深度 来转运直径达到 100nm 的纳米粒子。在另一个实施方案中, DNA 和 / 或蛋白质的转移方法 TM 还包括超声介导的转移, 或称为超声渗透法。ViaDerm 是一种可以通过射频消融形成微通 道来实现 DNA 的转移仪器。该仪器在总面积为 1.4cm2、 电极密度为 100/cm2 的范围内, 具有 一个电极控制单元和一个可支配的不锈钢电极阵列。通过施加 290V 或 330V 以及 1-5 次射 频频率为 100kHz、 持续时间为 700μs 的电压, 微通道就会形成。在将 DNA 施加到表皮上以 前, 以及施加过以后, 对表皮作如是处理, 可以增强转移的效果。例如, 具有 β- 半乳糖苷酶 TM 基因或绿色荧光蛋白报告基因的质粒 DNA, 可以经由 ViaDerm 这种仪器来转染离体的人皮 肤 (Birchall et al, 2006)。
超声波
超 声 波 可 以 增 加 细 胞 膜 对 大 分 子 比 如 DNA 的 通 透 性 ( 参 考, Newman, CM., et al, Echocardiography, 18, 339-47(2001) ; Niidome, T.&Huang, L., Gene Ther., 9, 1647-52(2002))。例如, 将 DNA 注射进入皮肤后, 超声波照射可以促进 DNA 进入细胞。由于 这项技术具有灵活性和安全性的特征, 通常可用于人体, 尤其是肌肉组织。 与微泡或超声造 影剂结合的超声技术, 例如充满全氟丙烷的白蛋白微泡, 可以通过超声能量降低细胞空心 化的极限值 (Teupe, C.et al, Circulation, 105, 1104-09(2002))。例如, 利用超声介导的 对运载质粒的白蛋白微泡进行破坏的方法, 将编码激活型一氧化氮合酶 (eNOS) 的 DNA 转染 猪的冠状动脉, 导致蛋白的表达量显著提高, 增强的一氧化二氮导致被缓激肽刺激的动脉 舒缓 (Teupe 等, 2002)。
促进基因的长期表达的组织特异性、 自我复制和整合质粒表达系统
在一个实施方案中, 使用的 DNA 转移方法可能包括自我复制和整合型质粒表达系 统 ( 参考 Newman, CM., et al, Echocardiography, 18, 339-47(2001) ; Niidome, T.&Huang, L., Gene Ther., 9, 1647-52(2002))。 并且, 在某些实施方案中, 整合还可能具有组织或细胞 类型特异性。 因此, 至少这里探讨的某些技术是暂时的, 并且不是针对生物学上某些特定类 型的细胞。
在一个实施方案中, 可以通过如下方式来实现组织特异性转运 : 将蛋白质或肽配 体合并到 DNA 复合物中, 从而促进受体介导的靶细胞表面表达特定的受体。另外, DNA 元 件可以被包含在被转入细胞的 DNA 中, 以至于编码基因只能在含有相应的蛋白因子的细胞 中表达。例如, 可以将组织特异性的转录因子结合位点或启动子包含在被转移的 DNA 分子 中。这项技术已被成功用于将质粒 DNA 转染活体小鼠肝脏, 该质粒 DNA 具有人因子 EX 微基因序列, 该序列包含第一个内含子和 3’ 非翻译区的一部分, 在肝脏载脂蛋白 E 位点控制区 和 α- 抗胰蛋白酶启动子的控制之下, 且利用了牛生长激素 polyA 信号 (Miao, CH. 等, MoI. Ther., 1, 522-32(2000))。 除了基因序列自身以外, 这些遗传元件使得基因在持续十个月的 治疗范围内其表达水平的提高。
在其他的实施方案中, 可以通过将能自我复制的 DNA 分子转入靶细胞中的方 式 来 实 现 被 转 入 基 因 长 时 间 的 持 续 表 达 (Shirakata M.&Hirai, K., J.Biochem., 123, 175-81(1998))。 例如, DNA 质粒可通过巴尔病毒提供的系统来维持自身的游离状态, 并随着 细胞代代遗传下去 (Shirakata M.&Hirai, K., J.Biochem., 123, 175-81(1998))。该系统需 要被转移的 DNA 含有巴尔病毒核心抗原 1(EBNA1) 编码序列和 oriP DNA 元件, 这样在被转入 细胞中后, EBNA1 蛋白的表达可以促使被转入的 DNA 的复制以及与基因组 DNA 结合。 为了使 目标蛋白在皮肤中长期持续表达, 被转入的 DNA 需要被引入基底细胞中。例如, 该系统在体 外用于自杀基因疗法, 在体内用编码 EBV 病毒元件的质粒和 1 型单纯性疱疹病毒基因来增 加细胞对化学疗法药物 ganciclovir 的敏感性 (Maruyama-Tabata, H.et ah, Gene Ther., 7, 53-60(2000))。并且, 将可编码 β2- 肾上腺素受体和携带有 EBV 元件的质粒 DNA 导入仓 鼠心室肌中, 可以实现 β2- 肾上腺素受体的长期表达 (Tomiyasu, K.et a Gene Ther., 7, 2087-93(2000))。
如果被转入的质粒 DNA 被整合进了皮肤基底细胞或其他具有美容功能的细胞染 色体 DNA 中, 它就可以在细胞分裂时被传递给子细胞, 这样就可以使相应的蛋白进行持续 表达。将转入的 DNA 整合到染色体 DNA 中需要使用到一种酶, 这种酶可以切割染色体 DNA, 从而使被转入 DNA 插进去。一种有效的将 DNA 插入到具有美容功能的细胞基因组中的方法 是使用转座子, 例如 “睡美人” (SB) 转座系统。因此, 在一个实施方案中, 转座子可以实现 特定构建体从供体质粒向哺乳动物基因组的精确转移 ( 参考 Hackett, P.B., et ah, Adv.in Genet, 54, 189-232(2005), 同时参考美国专利 No.6,489,458))。 以转座子为基础的方法中, 除了携带可以编码维持具有美容功能的细胞的核酸或多肽的 DNA 外, 被转入的 DNA 还包含 有转座酶编码序列或者转座酶 mRNA。例如, SB 转座系统是由约有 340 个碱基对的两个终端 重复序列组成的, 它可以介导外源性核苷酸序列近乎随机地插入基因组的 TA 碱基对中 ( 虽 然两侧的 DNA 序列可能会影响特定位点整合的几率 )。SB 转座子系统已经被用于模拟人体 疾病的小鼠疾病的研究中, 并且使得激活体细胞癌基因的 NARS 基因被整合到小鼠肝细胞 DNA 中 (Carelson et al, Proc.Nat.Acad.ScL U.S.A., 102, 17059-64(2005))。
在另一个实施方案中, 可通过噬菌体整合酶实现基因组的整合 (reviewed in Groth, A.C.&Calos, M.P., J.Biol.Chem., 335(3), 667-678(2004))。例如, 噬菌体整合酶 可用于介导两个不同的、 相对较短序列的高效特异性重组。因此, 发现丝氨酸催化家族的 ΦC31 整合酶在人细胞中可以高效地调节识别位点的整合, 以及调节与这些位点具有部分 同源性的宿主染色体序列的整合。
制剂
在某些实施例中, 多聚核苷酸编码至少一个维持细胞美容功能以而增强和 / 或 维持对美容具有积极效果的生理生化反应的核酸或多肽, 该多聚核苷酸可与药物相容的 载体相混合, 从而产生治疗用的化合物, 该化合物可用于具有美容功能的细胞的治疗。对 于用到本发明的各种方法和成分的大量阐述都在美国专利出版号为 No.2006/0058256 和No.2006/0025363 中被描述过, 这两篇专利的全文均被包含在本文的参考文献中。
在一个实施方案中, 本发明的组成包括一个局部给药制剂。该制剂由溶解或悬浮 在媒介中的物质组成, 如凝胶、 洗涤剂、 乳液, 悬浮物或载体还可能包括矿物油、 石油、 酒精 或者药物处方的其他基础成分。任何其他合适的配方均可用于转运这些化合物, 这些化合 物可能包括本技术领域中公知的药物佐剂, 就如 Remington′ s 的医药科学所描述的那样 (16 版, 1980)。 在某些实施方案中, 在化合物中加入其他成分, 例如可可油和芦荟, 也是可行 的。
制剂可能包括那些适合于口腔, 直肠, 局部, 鼻, 眼或注射 ( 包括皮下, 肌肉注射和 静脉注射 ) 治疗的药物制剂, 所有的这些都可能作为本发明的给药途径。
制剂可以以剂量方便的形式呈现, 也可以通过药剂技术领域公知的方法制备。制 剂可能通过由一个或多个助剂构成的载体来使活性化合物激活而进入相应组织。 在一般情 况下, 配方是由液体载体或精细分开的固体载体或两者结合将活性化合物带入组织的, 然 后, 如有必要, 将产品包装成所需的制剂。
适合用于注射给药的制剂, 可方便地制成无菌水制备的活性化合物, 最好与受体 的血液等渗。
喷鼻剂制剂可能是包含防腐剂和等渗剂的活性化合物的水溶液。 这种制剂最好调 整其 pH 和等渗状态, 使之与鼻腔粘膜兼容。
直肠给药制剂可能通过一个合适的载体制成栓剂的形式, 如可可脂, 氢化脂肪或 氢化脂肪羧酸。
眼科制剂可通过与喷鼻剂类似的方法来制备, 除了将 pH 和等渗因素调整到最适 用于眼的状态。
本发明的制剂适用于口服给药, 制剂可能是制成为独立单元, 如胶囊, 扁囊, 片或 含片, 每种都包含等同于粉末或颗粒或脂质体或悬浮在水溶液中或非水液体中的预定量, 如糖浆, 酏剂, 乳液或顿服水剂。例如, 药片可任意与一个或多个助剂压缩成型。
压缩药片可在一个合适的机器中压缩形成。 活性化合物以粉末或颗粒等自由流动 的形式通过粘合剂, 崩解剂, 润滑剂, 惰性稀释剂, 表面活性剂或分散剂以任意比例进行混 合。 合适的粉末状活性化合物的混合物及其载体组成的模压片可能会在一个合适的机器成 型。或者, 糖浆可能通过将活性化合物加入到浓缩的糖水溶液, 例如蔗糖, 也可以添加任何 助剂。这种助剂可能包括调味剂, 合适的防腐剂, 延缓糖结晶剂, 增加其他成分溶解度的试 剂, 如多元醇, 甘油或山梨醇。
在实施例中, 参与维持细胞美容功能的编码至少一个核酸或多肽的药剂可能是局 部的。 局部给药制剂可能包含溶解或悬浮在一种或多种媒介的活性化合物, 如矿物油, 凡士 林, 多羟基醇或外用药物制剂中使用的其他基质, 可能还需添加其他助剂。例如, 本发明的 制备形式可能是护肤霜, 面霜, 乳液, 软膏, 或任何其他适于皮肤局部使用的形式 ( 美国专 利 4760096 全部纳入参照 )。 根据其预期用途, 可添加其他成分使其具有适于皮肤的流变性 能。
因此, 在实施例中, 本发明的制剂可能是溶液的形式, 如水溶液, 胶体溶液, 乳化乳 液, 水包油型的霜 ( 亲水膏 ) 或水凝胶, 其中水相是连续相。 另外, 制剂也可能是油性混合物 的形式, 如软膏, 油包水型的面霜, 凝胶质地, 吸收基质或亲水性软膏中, 油相是连续相。此外, 可能会添加非水的水溶性基质, 如聚乙二醇的混合物, 此外, 在具体实施中, 也可以制成 添加了固体分散剂的悬浮基质, 如震动乳液。 可以使用油性成分, 乳化剂, 分散剂, 凝胶剂和 固体材料来制备这些制剂, 它们都是众所周知的化妆品和外用产品中常用的成分。
本技术领域公知的可使用的油性成分可能包括碳氢化合物如液体石蜡, 凡士林, 固体石蜡, 微晶蜡等。此外, 高级脂肪醇, 如十六醇, 十六烷醇, 硬脂醇, 油醇, 酸酯的高脂肪 低醇, 如十四酸异丙酯或十六酸异丙酯, 植物油, 改性植物油, 无水羊毛脂及其衍生物, 角鲨 烯或角鲨烷, 更高级脂肪酸, 如棕榈酸、 硬脂酸。
在一个实施例中, 药剂可使用物理层 ( 如擦皮术和包藏 ), 和 / 或化学渗透 / 渗透 促进剂 ( 二甲基亚砜, 氮酮, 醇, 脂肪酸和萜烯 ), 已经证明渗透增强剂能扰乱或液化角质层 的脂质结构以增加通透性 )。 此外, 本发明的药剂可使用其他增强通透性的方法, 例如, 电整 合, 超声, 改变细胞的同渗容摩, 纳米粒子和任何其他合适的能有效地加强本发明的药剂的 渗透性的技术或方法, 例如, 局部用药。
在一个实施例中, L- 丝氨酸, L- 羟脯氨酸, 或其他可能增强和 / 或有助于增强生长 因子作用的氨基酸, 都可能包括在本发明的药剂中。
在另一个实施例中, 本发明的局部给药制剂可能包含有用的乳化剂和阴离子、 阳 离子、 非离子表面活性剂等分散剂。 非离子表面活性剂可能是首选, 因为它们对皮肤的刺激 性较小。典型的非离子表面活性剂可能包括, 如单硬脂酸甘油酯等单甘酯, 山梨醇等脂肪 醇, 蔗糖脂肪酯, 聚氧乙烯硬脂酸酯等聚氧乙烯脂肪, 十六烷基聚氧乙烯醚等聚乙二醇高等 醚醇, 聚乙二醇醚, 聚乙二醇脂肪酸之类的 ( 美国专利 4760096)。此外, 还可以使用如羧甲 基纤维素, 纤维素胶, 聚乙烯醇, 聚乙二醇和各种树胶等凝胶剂。这些油性成分, 乳化剂, 分 散剂和凝胶剂可单独使用或相互结合使用。此外, 还可使用纳米乳液。
除上述成分外, 本发明的制剂可能还包括一种或多种助剂, 如稀释剂, 缓冲剂, 调 味剂, 粘合剂, 崩解剂, 表面活性剂, 增稠剂, 润滑剂, 防腐剂 ( 包括抗氧化剂 ) 等之类的物 质。
剂量
服用多核苷酸药物, 相当于提供一定量的用于维持和 / 或改进具有美容功能的细 胞的多肽或多核苷酸。对于多肽的局部给药, 在不同的实施例中, 用药的剂量从 1ng/cm2 到 1mg/cm2 组织面积, 或从 10ng/cm2 到 100μg/cm2 组织面积, 或从 100ng/cm2 到 10μg/cm2 组 织面积, 或从 500ng/cm2 到 10μg/cm2 组织面积, 或从 1μg/cm2 到 5μg/cm2 组织面积, 或从 2 2 1μg/cm 到 2μg/cm 组织面积。
或者, 对于全身用药 ( 如腹腔 ) 的剂量范围可能从约 1ng/kg/d 至 100mg/kg/d, 或 从 1mg/kg/d 至 10mg/kg/d, 或从 100ng/kg/d 到 5mg/kg/d, 或从 1μg/kg/d 至 1mg/kg/d, 或 从 100μg/kg/d 到 500μg/kg/d, 或从 10μg/kg/d 到 100μg/kg/d。或者, 在这些范围内都 可以使用。
在不同的给药方案中, 提供的多核苷酸相当于多肽的剂量, 范围从 1ng/cm2 到 1mg/ cm2 组织面积, 或从 10ng/cm2 到 100μg/cm2 组织面积, 或从 100ng/cm2 到 10μg/cm2 组织 面积, 或从 500ng/cm2 到 10μg/cm2 组织面积, 或从约 1μg/cm2 到 5μg/cm2 组织面积, 或从 2 2 10μg/cm 到 2μg/cm 组织面积。或者, 在这些范围内都可以使用。
例如, 载体构造可应用裸 DNA 剂量, 范围从 1ng/cm2 到 1mg/cm2 组织面积, 或从10ng/cm2 到 10mg/cm2 组织面积, 或从 100ng/cm2 到 100μg/cm2 组织面积, 或从 500ng/cm2 到 10μg/cm2 组织面积, 或从 1μg/cm2 到 5μg/cm2 组织面积, 或从 10μg/cm2 到 2μg/cm2 组织 面积。或者, 在这些范围内都可以使用。
这些剂量范围通过在体外和动物中, 在感兴趣的美容细胞中研究得到精确的基因 转染效率来确定。同样地, 可使用本技术领域公知的其他特定的方法来确定其他载体如脂 质体, 超微粒子, 纳米乳液, 颗粒介导传递, 电压驱动传递的剂量范围。
在评估有美容功能的细胞的基因改造的研究时, 质粒可在任何剂量范围给药, 在 具有美容功能的细胞中产生了预期的效果。 例如, 质粒可以合适的制剂通过局部途径给药, 个人剂量范围约从 5 到 2000 微克 / 毫升 (μg/ml), 较好的个人剂量范围是从 50 至 1000 微 克 / 毫升 ; 更好的个人剂量范围约从 100 至 500 微克 / 毫升。有研究表明, 亚治疗的微磨 皮术可用于是提高 KGF-1pDNA 到猪皮的传递速度, 剂量约为 100 到 500μg/ml KGF-1pDNA。 根据一个给药方案, 质粒传递的浓度为 100, 250, 500, 750, 1000, 1500 和 2000 微克 / 毫升 (μg/ml 的 )。
因此, 本发明的实施例考虑到有美容功能的细胞的基因修饰能提高和 / 或维持基 因表达, 这可能会刺激皮肤蛋白的生长, 所以看起来更年轻。在一些实施例中, 本发明的方 法和成分对于目前可用的化妆品增强剂可能有明显的优势, 包括整形外科, 肉毒杆菌 ( 注 射用肉毒毒素 ), 激光换肤, 微磨皮术, 脉冲光治疗, 注射填充剂 / 结缔组织替代, 自体成纤 维细胞注射, 局部皮肤护理产品等其他方法。
比起组织的局部给药, 本发明有一个优势, 本发明的方法和成分能更好的将治疗 性分子定量输送到有美容功能的细胞。
此外, 在某些情况下, 局部使用的复合物, 包括生长因子, 可能会被蛋白酶快速的 消化从而限制了其功效的持续时间, 或刺激免疫原性反应。本发明的实施例可能会刺激有 美容功能的细胞生成, 进而增加细胞本身的蛋白生成, 因此, 有可能会减少蛋白酶激活或免 疫原性反应。
与建议每日两次局部用药以达到改善美观的生长因子蛋白产品不同, 本发明的给 药方案, 可提供每周一次或每月一次剂量 ( 即全面的美容效益不需要每天或每天两次的标 准应用程序 ), 或在干细胞转染时, 一次剂量就可改善外观。恒昼夜化妆品都在提高多肽的 表达。例如质粒编码的角质细胞生长因子 (KGF), 在 7 天内, 比起有表达高峰和低谷期的每 日两次局部用药的 KGF 多肽, 有明显的优势。实际上, 这种方法将皮肤变成一个能持续生产 具有美容功效的多肽的生物反应器。此外, 由于本发明的方法和成分的用药频率比局部治 疗量常常要低一些, 本发明的方法和成分可以消除或降低创伤性, 有时复杂的手术、 注射和 激光 / 光疗法会对皮肤产生损害。本发明通过减少用药频率来改善。
亚治疗的微磨皮术
为确定皮肤蛋白和其他生物分子, 如胶原, 弹性蛋白, 细胞外基质蛋白, 蛋白多糖, 生长因子的表达和 / 或水平是否在皮肤上有整容修复的效果, 并大幅评价完整的细胞的美 容遗传改造后是否有美容功能, 首选使用亚治疗的微磨皮术。
质粒 DNA(pDNA) 的传递通过完整的皮肤利用各种渗透增强术已深入研究, 包括屏 障破坏 ( 如微磨皮术和胶带剥离 ), 脂质体输送系统 ( 如脂质体 ), 和不稳定膜技术, 如电 击 (Choi MJ 和 Maibach HI.Topical Vaccination of DNA Antigens : Topical Deliveryof DNA Antigens.Skin Pharmacol.Appl.Skin Physiol.2003 ; 16 : 271-282)。高分子量质 粒 DNA, 需要渗透到最上面的角质层以达到可行的角质细胞。用胶带剥离和创面电灼术物 理击穿角质层以提高大分子及质粒 DNA 穿过动物皮肤的传递速度 (Yu WH, Kashani-Sabet M, Liggitt D, Moore D, Heath TD, Debs RJ.Topical gene delivery to murine skin.J Invest Dermatol 1999 ; 112 : 370-375)。
Lee 等人 (Microdermabrasion as a novel tool to enhance drug delivery via the skin : an animal study.Dermatol Surg.2006Aug ; 32(8) : 1013-22) 发现亚治疗的微磨 皮术 ( 即, 使用低吸入压力和短期治疗持续时间 [15cmHg 10 秒= 20 千帕 ]) 将小鼠和猪的 药物传递速度增加了 8-24 倍。亚治疗的微磨皮术的治疗参数的强度低于用于治疗目的微 磨皮术 ( 即减少皱纹 ), 而且不引起皮肤炎症反应。使用亚治疗的微磨皮术, 微观分析已经 证明整个皮肤没有明显的破坏, 只是角质层 (SC) 轻微稀疏。SC 层出现集中和压实。表皮和 真皮层没有变化, 亚治疗的微磨皮术得到的结果是可控和可重复的。
增加的高分子的传递也可在灵长类动物和人的微磨皮术中看到 (Prausnitz MR, 等 Transdermal drug delivery.Nat Biotechnol.2008Nov ; 26(11) : 1261-8 ; Gill HS, 等 Selective removal of stratum corneum by microdermabrasion to increase skin permeability.Eur J Pharm Sci.2009)。吉尔等人 (2009) 发现, 可通过控制经过猴子和人 的头部的微磨皮术中的皮肤来控制去除角质层的程度。然而, 变压 (25kPa vs 50 kPa) 并 没有表现出差异。
如本示例所述, 可以在不同哺乳动物物种中可靠地使用亚治疗的微磨皮术, 例如, 在小鼠或猪。应该理解, 本文所述的实验研究 ( 例如, 如前所示的例子 ) 包括用亚治疗的微 磨皮术的研究, 也可以在其他哺乳动物物种中进行, 例如, 为确定其他生长因子是否表达, 如, 对皮肤有美容修复功效的 PDGF( 血小板衍生生长因子 )。 亚治疗的微磨皮术也可以用来 评估完整的细胞被遗传修饰后是否有美容功效。
此外, 除了亚治疗的微磨皮术以外的技术, 也可以用来评估其他生长因子是否表 达, 如对皮肤有美容修复功效的 PDGF( 血小板衍生生长因子 )。
组织学和其他分析方法
在动物研究中, 为确定皮肤蛋白和其他生物分子, 如胶原, 弹性蛋白, 细胞外基质 蛋白, 蛋白多糖, 生长因子的表达和 / 或水平在皮肤上是否有美容修复的功效, 并评价完 整的细胞通过美容遗传改造后其美容功能, 其结果可通过标准且著名的组织学程序进行分 析。组织学程序也可以用来分析在光或电子显微镜下有很小差别的物体, 因为着色使两个 组织形成对比, 同时使感兴趣的特定的特征更显著。
例如, 在涉及 KGF-1 质粒 DNA 传递到动物的皮肤的研究时, 并要确定 KGF-1 的表达 在皮肤上是否有美容修复的效果, 可以利用标准和知名的组织学程序。类似的组织学程序 也可以用来评价一个或多个其他生物大分子的表达是否对皮肤有美容修复的功效。
使用组织学程序的例子包括使用光显微镜的污迹, 如苏木精和曙红 (H&E) 的污 渍。其他知名的及建立在组织学和组织病理学上的程序, 也可用于评估一个或多个其他生 物大分子的表达在皮肤上是否有美容修复的效果。
也可以采用其他典型的染色技术, 包括马森三色染色法, 这是组织学经常使用的 典型的三色染色法, 还有冯·吉布森染色染色的。使用 H&E 进行染色, 梅森三色和冯·吉布森染色法, 可用于各种组织学测量, 包括皮肤厚度的分析, 胶原和弹力纤维成分分析。
在另一种典型的实施例中, H&E 染色剂, 可用于评估表皮的厚度, 角质细胞的数量, 胶原厚度和真皮的密度的变化, KGF-1 质粒 DNA 传递到动物皮肤前后的变化。
染色是使这两个组织形成对比, 以及突出感兴趣的特定特征。苏木, 一种碱性染 料, 由于对细胞核中的核酸的亲和力比较强, 所以将核染成蓝色 ; 曙红, 一种酸性染料, 将细 胞质染成粉红色。 醋酸铀和柠檬酸铅常用来使组织在电子显微镜下形成对比。 此外, 还有各 种其他技术可用于选择性染色细胞和细胞组分。其他化合物, 可用于组织切片染色, 例如, 番红, 刚果红, 固绿 FCF, 银盐, 以及许多自然和人工染料。
组织样品也可以通过其他程序分析来确定皮肤蛋白和其他生物分子, 如胶原, 弹 性蛋白, 细胞外基质蛋白, 蛋白多糖, 生长因子的表达和 / 或水平对皮肤是否有美容修复的 功效, 并评价完整的细胞通过美容遗传改造后其美容功能。 例如, 抗体可以用来使特定的生 物分子可视化, 例如, 用免疫组化, 或利用免疫荧光进行荧光染色。 其他技术, 如非放射性原 位杂交, 可与免疫组化结合起来, 用于鉴定与免疫荧光和酶联荧光扩增的荧光探针或标签 结合的特定的 DNA 或 RNA 分子。不同的成像技术可用于研究组织学样本, 例如, 染色后的组 织样本, 或用荧光染色后的免疫荧光。 在某些实施例中, 荧光显微镜和共聚焦显微镜可用于 检测细胞内的具体的荧光信号。数码相机也可以用来捕捉组织学和病理学图像。
动物模型
根据此处所述的实施例, 任何合适的动物模型都可用于确定皮肤蛋白和其他生物 分子, 如胶原, 弹性蛋白, 细胞外基质蛋白, 蛋白多糖, 生长因子的表达和 / 或水平是否对皮 肤有美容修复的功效, 并大幅评价完整的细胞的美容遗传改造后是否有美容功能。 “动物” 一词旨在包括但不仅限于任何哺乳动物的物种。 这些哺乳动物的例子包括但不仅限于不同 品种的猪 ( 猪 ) 和鼠科动物 ( 小鼠 )。熟悉这些领域的技术的人都知道, 考虑到猪和和人的 皮肤在生理和形态上已知的相似之处, 猪的动物模型存在一定的优势。 动物模型的选择, 需 要对许多不同的因素进行评估。在选择一个合适的动物模型时, 考虑的因素包括皮肤层的 厚度及药物通过皮肤的渗透能力。
角质层 (SC), 这是表皮外的保护层, 是疏水性的, 带负电荷的 PDNA 难以穿透这层 (Branski LK, 等, Gene Ther.2007Jan ; 14(1) : 1-10)。 小鼠背侧皮肤角质层的细胞只有 1-2 层, 兔子有 1-2 背部 SC 细胞层。 相比之下, 猪和人的角质层的厚度和皮肤比较相似 (Meyer, W., 等, 1978, Curr.Prob.Dermatol.7 : 39-52 ; Bronaugh, R., 等, 1982, Toxicol.Appl. Pharmacol.62 : 481-488 ; Kiritsy CP, 等 Crit Rev OralBiol Med.1993 ; 4(5) : 729-60)。 人 面部皮肤有 9±2 层 ; 毛囊很少 ; 非面部有 14-17 细胞层。小鼠有更薄的真皮层和较少的角 化角质层 (Hengge, U.R., 等 J.Clin.Invest., (1996)97, 2911-2916)。皮肤的渗透性 ( 通 常比人体皮肤的渗透性高 10-100 倍 ) 是选择动物模型的一个考虑因素, 如无毛小鼠和大鼠 (Paasonen L, 等 Int.J.Pharm.2006Jan 13 ; 307(2) : 188-93)。
正常治愈的猪模型已广泛应用于诱导性部分皮层伤口的研究, 因为他们的皮肤外 层与人及其相对无毛时很相似。此外, 猪同人一样, 被认为是紧皮肤的动物, 与兔子和豚鼠 等皮肤宽松的啮齿类动物形成对比。 松散皮肤的动物包含一层纤肌膜, 那就是肌肉层下方、 附着在皮肤上的肉膜。Hengge 等人 (J.Clin.Invest., (1996)97, 2911-2916) 报道, 当裸 pDNA 通过皮内注射入小鼠皮肤后, 在表皮、 真皮和底层的脂肪及肌肉中表达。而在猪和人的皮肤中, 只在表皮中表达。 同样的, Glasspool-Malone(Mol.Ther.2000 ; 2: 140-146) 等人 报道 pDNA 注射入猪和猕猴后, 转基因的表达很大程度上只局限于表皮。小型猪对于皮肤测 试是一个很有吸引力的模型, 因为它们的体型更小, 与人的皮肤更相似 (Mortensen JT, 等 Scand.J.Lab.Anim.Sci.Suppl.1.1998.Vol.25)。 两个物种的表皮都比较厚, 猪大约 70-140 毫米, 人大约 20-120 毫米, 不同地方有很大的区别。 猪表皮类似于有网状真皮 - 表皮结合点 的人。各种动物模型的皮肤渗透性排名大致如下 : 家兔>大鼠>豚鼠>猪>猕猴>人。小 型猪的皮肤对刺激物不如兔皮肤敏感。基于诸多因素的评价, 猪是一个适于局部实施 pDNA 测试的动物模型。正如此处其他所述, 本文所有引用参考全部纳入在此披露。
应该理解, 此处所描述的典型实施例只是在描述意义上进行考虑, 不是限制使用 目的。 据本技术领域公认, 在这些实施例中可能会有一些变化, 但没有违背该发明的原则和 精神, 其范围在要求及其等价物中有限制。 实施例 此处描述的实施例描述四个编码设计为改进细胞外基质的稳定性和支持皮肤的 改进的外观的重组载体构建体的合成。这些都是胶原, 弹性蛋白, EC-SOD 和 TIMP-1。此处 详细讨论了这些蛋白在皮肤生理学中的作用。每个构建的质粒由以下组成 : 一个有用的基 因和有人巨细胞病毒立早启动子的设计为提供高水平稳定性和瞬时表达该有用的基因的 质粒 cDNA。整合到该质粒 cDNA 载体的基因包括胶原 1, 弹性蛋白, 金属蛋白酶 -1 组织抑制 剂 (TIMP-1), 和细胞外超氧化物歧化酶 (EC-SOD)。包含有用的基因的 cDNA 质粒构建体可 被制成局部使用的护肤霜。
实施例 2 描述了扩增, 克隆和表达来自人肺组织的 cDNA 的人角质细胞生长因 子 -1(KGF-1, FGF-7)。
此外, 此处描述的实施例也描述了给小鼠局部施用的 KGF 质粒评估的研究 ( 实施 例 3)。在小鼠中也进行了亚治疗的微磨皮术的效度研究 ( 实施例 4 中描述 ) ; 并且在小鼠 中进行剂量增加研究 ( 实施例 5 中描述 )。
猪体内也进行了一独立组的试验性研究。通过实例, 实施例 6 描述了在猪体内进 行的亚治疗的微磨皮术的效度研究 ; 实施例 7 描述了在猪体内进行的剂量范围研究。
实施例 1- 扩增、 克隆和表达来自正常组织 cDNA 的 1 型人胶原 α1, 1 型胶原 α2, TIMP-1 及弹力蛋白
从 正 常 的 人 组 织 产 生 的 第 一 链 cDNA 购 自 BioChain 研 究 所 (Hayward, CA)。 1 型 胶 原 α1(COLA1A), 1 型 胶 原 α2(COL1A2) 和 弹 性 蛋 白 从 正 常 人 皮 肤 ( 目 录 号 : C1234218-10) 的 cDNA 扩增, 而 TIMP-1 从正常的人肺 ( 目录号 : C1234152-10) 和脑 ( 目录 号: C1244035-10) 的 cDNA 扩增。使用高保真的铂 Pfx 聚合酶 (Invitrogen Invitrogen, Carlsbad, CA) 进行基因扩增, 参照说明书, 使用基因的特定寡核苷酸。
表 1 概述了用于每种基因扩增的寡核苷酸序列, 以及聚合酶链反应 (PCR) 的条件。
表 1 也显示了自正常人组织 cDNA 扩增 COLA1A, COL1A2, 弹性蛋白及 TIMP-1 所用 的寡核苷酸序列和 PCR 参数。
表1
从正常组织克隆 COLA1A, COL1A2, 弹性蛋白及 TIMP-1cDNA 的引物及 PCR 参数
在 5′寡核苷酸设计有 NheI 限制性内切酶 (REN) 位点用于克隆至哺乳动物表达载 体质粒 pcDNA3.1+zeo : intA 紧邻的 PCMV 启动子的下游。最佳翻译起始的 Kozak 序列设计 为紧随每个 NheI 位点 (GCCGCCACCATG)( 即序列 ID 号 : 3 的 11-22 核苷酸 )。对于 COLA1A, COL1A2 及 TIMP-1 的 3′寡核苷酸设计有 HindIII 限制性内切酶位点 (REN sites), 对于弹 性蛋白有 BglII REN 用于克隆到同样的载体, 位于牛生长激素聚腺苷酸化 (BGHpA) 信号序 列的紧邻前方。REN 以下划线标注, 翻译起始密码子 (ATG) 以双下划线标注。每个基因本身 的终止密码子 ( 例如, 5′ -TAA-3′, 或 5′ -TGA-3′ ) 位于 3′寡核苷酸序列 REN 的紧邻 前方, 以粗体标注。
PCR 反应在冰上配制, 包含每种成分的终浓度如下 : 1X Pfx 扩增缓冲液, dATP, dCTP, dGTP 均为 0.3mM, 硫酸镁为 1mM, 每种寡核苷酸 0.3μM, 第一链 cDNA 模板为 dTTP, 1μL, 1.0-2.5 单位铂 PfxDNA 聚合酶, 添加无核酸酶的蒸馏水至终体积 50μL。每个反应均 为三步 PCR 循环, 使用以下参数 : 94℃, 15s ; 56℃, 30s ; 68℃, 对于每种基因的时间量如上表 1 所述。 每个扩增反应均进行 35 个循环, 之后为最终循环在 72℃持续 7min, 4℃冷藏直至分 析。 每次试验 PCR 反应使用同样的第一链 cDNA 模板和一组人 β 肌动蛋白 (BioChain) 特异 引物进行阳性对照。 PCR 后每个反应进行 Tris- 醋酸 EDTA(TAE) 琼脂糖凝胶电泳分析, 以确 定扩增的 cDNA 的延伸和完整性。对于每次分析取 10μL 每种反应物与蓝色 Juice 上样缓 冲液 (Invitrogen) 混合, 在每个 1% TAE 琼脂糖凝胶的泳道上样。以 TriDye 1kb 的 DNA 梯
形 (ladder)(New England Biolabs, Ipswich, MA) 用于评估扩增的 cDNAs 的大小。确定每 种 cDNA 的 PCR 扩增后, 按照使用说明, 每种反应物被立即克隆到 Zero Blunt TOPO PCR 克隆 系统 (Invitrogen)。菌落被筛选, 通过 PCR 或 REN 分析纯化的来自过夜的细菌培养的 DNA, 或两者同时。将含有预期大小的片段的 pCR-Blunt II-TOPO 克隆随后用合适的 REN 酶切, 分离并将全长基因克隆到哺乳动物表达载体 pcDNA3.1+zeo : intA。这个表达载体构建自 pcDNA3.1+zeo(Invitrogen), 通过将人 CMV 内含子 A 序列加至最小启动子的 3′端进行。 CMV 内含子 A 序列已被广泛地表征, 与无内含子的 CMV 启动子相比, 能大大提高重组基因在哺乳 动物细胞中的表达。内含子 A 序列从载体 pWRG7077 通过 PCR 扩增得到 ( 由 Dr.Jay Hooper 友好提供, 美国陆军医学传染病研究所 [USAMRIID]), 然后将其克隆到 pcDNA3.1+zeo 载体, 作为 NdeI-NheI 位点。pcDNA3.1+zeo : intA 是有图 8 中列出的表达元件的大小为 6.5kb 的 质粒。TIMP-1 从脑和肺组织 cDNAs 扩增得到, 本研究中, 从脑 cDNA 得到的 TIMP-1 用于所有 后续的克隆和表达试验。
克隆反应如 Maniatis 及 Sambrook 所述 (1998 年 ), 然后转化为亚克隆效率大肠 杆菌 (E.coli)DH5α 株, 用于克隆的 DNA 增殖。菌落被筛选, 通过 PCR 或 REN 分析纯化的 来自过夜的细菌培养的 DNA, 或两者同时。随后将含有预期大小的片段的 pcDNA3.1+zeo : intA 克隆用特异的 REN 进行酶切, 确认基因同一性。对于每种构建体从在选择性培养基 中过夜生长的 50mL 大肠杆菌培养物中分离高纯度 midiprep 的质粒 DNA。通过 A280 和 A260 来分析 DNAs 的纯度和浓度。每种基因的表达通过人内皮肾细胞系 HEK-293T/17 的 脂质体介导的转染确认, 然后分析细胞提取物和上清液。对每种要分析的构建体, 转染前 晚, 将 1x106HEK-293T/17 细胞接种至每孔含有 2mL 生长培养基, 多聚 -D- 赖氨酸包被的 6 孔板中, (DMEM, 高葡萄糖 ; 2mM L- 谷氨酰胺 ; 1X 非必需氨基酸 [NEAA] ; 10%热灭活胎牛血 清 [FBS]), 于 37℃, 5% CO2, 90%相对湿度 (Rh) 培养。第二天, 在转染前, 将培养物用 2mL 新鲜生长培养基填入。将每 4μg 每种质粒 DNA 构建体在 250μL Opti-MEM 减少的血清 培养基 (Invitrogen) 中柔和混合, 并与额外的 250μL 加有 10μL 脂质体 2000 转染试剂 (Invitrogen) 的同样的培养基合并。该反应物在室温下孵育 20 分钟, 使得形成 DNA : 脂质 体复合物。然后用移液器将全部反应液轻轻地吸至相应的含有 HEK-293T/17 细胞的孔中, 轻轻涡旋以均匀分散该转染混合液。然后将板放回孵育器孵育 72 小时, 然后收获并分析。 每种基因构建体的表达用转染的 HEK-293T/17 细胞提取物及上清液进行。
转染 72 小时后, 离心收集并澄清上清液。每种上清液转移 1mL 至聚丙烯离心管 中, 冰上放置直至分析。将细胞从孔中刮下, 在聚丙烯微量离心管中短暂离心形成沉淀。轻 轻倒出上清液, 让沉淀重新悬浮在 pH 为 7.4 的 1X 磷酸盐缓冲液 (PBS) 中, 短暂离心形成沉 淀。根据说明书, 倒掉 PBS, 将每种细胞沉淀重新悬浮在 100μL 哺乳动物细胞裂解缓冲液 中 (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO)。裂解缓冲液用 TRIS 缓冲液, 氯化钠, 十二烷基硫酸钠 (SDS), 表面活性剂, 脱氧胆酸和蛋白酶抑制剂制成。裂解反应在室温孵育 10 分钟, 然后在 室温下 14,000xg 离心 10 分钟。上清液转移到新的聚丙烯离心管中, 冰上放置至分析。将 每组转染的 HEK-293T/17 细胞提取物和上清液进行 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 和免疫印迹分析。每十万细胞当量 ( ~ 10μL) 与 NuPage LDS 样品缓冲液、 NuPAGE 还原 剂及去离子水混合, 90℃加热 5 分钟, 在 10% NuPage Novex Bis-Tris 凝胶每个泳道中上 样, 同样, 准备 30μL 相应的上清液, 在细胞提取物旁上样。SeeBlue Plus-2 蛋白分子量标记 (Invitrogen) 用于估计蛋白大小。凝胶在 200V 电压, 1X SDS NuPAGE MES 电泳缓冲 液中电泳 45 分钟。然后根据说明书 (Invitrogen), 利用 X-Cell II 印迹设备将电泳蛋 白转移至 0.45μm 的硝酸纤维素膜上。参照说明书, 利用蛋白检测 TMB 免疫印迹试剂盒 (KPL, Gaithersburg, MD) 进行蛋白质印迹, 利用第一抗血清及第二检测试剂, 如表 2 所述。 COLA1A, COL1A2, TIMP-1 和弹性蛋白的兔抗血清, 均购自 Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA)。 辣根过氧化物酶 (HRP) 标记的山羊抗兔 IgG(H+L)(Santa Cruz Biotechnology) 用来作为第二检测试剂。免疫复合物通过 TMB 膜底物检测 2-5 分钟, 将印迹浸泡在蒸馏水 中终止反应。通过高分辨扫描得到永久记录。HEK-293T/17 细胞中瞬时表达的 COLA1A, COL1A2, TIMP-1 及弹性蛋白的蛋白质印迹分析在所用检测试剂如表 2 所示。
表2
用于蛋白质印迹检测表达的重组蛋白的血清
图 8 显示使用 CMV 启动子启动的真核生物载体 pcDNA3.1+zeo : intA 在哺乳动物细 胞中表达人蛋白 COLA1A, COL1A2, 弹力蛋白, TIMP-1 的克隆方法。从正常的人组织的 cDNAs 通过 PCR 扩增的基因, 如材料和方法中所述克隆。COLA1A, COL1A2, 和 TIMP-1 直接克隆到 哺乳动物载体 NheI-HindIII REN 位点, 而弹性蛋白克隆到 NheI-BamHI 位点。弹性蛋白 3’ 端的 BglII 位点直接克隆到独特的同切点酶 BamHI 处。相关的表达元件是细菌的复制起 点 (ori), β- 内酰胺酶基因 (bla), CMV 早期启动子 (PCMV), 牛生长激素聚腺苷酸化信号 (BGHpA), 单链丝状噬菌体起点 (f1), 猿猴病毒 40 的复制起点 (SV40 ori), 猿猴病毒 40 多
聚腺苷酸信号 (SV40 pA), 博来霉素 (zeocin) 抗生素抗性基因 (zeocin)。
图 9 描述了从正常的人体组织的 cDNAs PCR 扩增 COLA1A, COL1A2, TIMP-1 和弹性 蛋白。使用基因特异的寡核苷酸引物扩增每种基因, 如材料与方法中所述。感兴趣的扩增 的基因用箭头标注, 其相应的大小被指示。(a)COLA1A ; (b)COL1A2 ; (c)TIMP-1 ; (d) 弹性蛋 白。KBL, 千碱基梯度 ; kbp, 千碱基对。
显示克隆蛋白 (COL1A2, TIMP-1 和弹力素 ) 的结果如图 10-12 所示。图 10 描述 了人 COL1A2 在 HEK-293T/17 细胞中的瞬时表达分析。COL1A2 蛋白大小为 138.9KDa, 如箭 头所示。COL1A2 特异性抗血清检测到的小碎片可能是不完整的翻译产物和降解的蛋白质。 图 11 描述了人 TIMP-1 在 HEK-293T/17 细胞的瞬间表达。TIMP-1 蛋白大小为 23.2Kda, 如 箭头所示。 TIMP-1 分子量高于其预测蛋白质分子量 23KDa 的可能原因是该蛋白在哺乳动物 细胞中 N- 连接和 Asn-Xaa-Ser/Thr 糖基化了。图 12 描述了人弹力蛋白在 HEK-293T/17 细 胞中的瞬时表达分析。 弹性蛋白大小为 66.1Kda, 如箭头所示。 弹性蛋白特异的抗血清检测 到的小碎片可能是不完整的翻译产物及降解蛋白质。表达结果表明, 在 HEK-293T/17 细胞 中, 弹力蛋白是不分泌的, 只是在胞内表达。
实 施 例 2- 扩 增、 克 隆 和 表 达 来 自 正 常 肺 组 织 cDNA 的 人 角 化 细 胞 生 长 因 子 -1(KGF-1, FGF-7)
材料与方法
正常人体组织的第一链 cDNAs 从 BioChain 研究所购买 (Hayward, CA)。角化细胞 生长因子 -1 从正常人体肺部 cDNAs( 目录号为 C1234152-10) 扩增。参照说明书, 用基因特 异性的寡核苷酸, 用高保真铂 Pfx 聚合酶 (Invitrogen, Carlsbad, CA) 进行基因扩增。表 3 概述用于扩增 KGF-1 基因的寡核苷酸序列, 以及聚合酶链反应 (PCR) 条件。
表3
用于来自正常的人肺组织 cDNAs 的 KGF-1 扩增的寡核苷酸序列和 PCR 参数
在 5′寡核苷酸设计有 NheI 限制性内切酶 (REN) 位点, 用于克隆至哺乳动物表达载体 pcDNA3.1+zeo : intA 紧邻 PCMV 启动子的下游。用于最佳翻译起始的 Kozak 序列设计 为紧邻每个 NheI 位点 (GCCGCCACCATG)。3′寡核苷酸被设计具有 HindIII REN( 下划线标 注 ), 用于克隆至同一载体紧邻牛生长素多聚腺苷酸化 (BGHpA) 信号序列之前。REN 位点用 下划线标出, 翻译起始密码子 (ATG) 用双下划线标出。 终止密码子天然存在于 3′寡核苷酸 序列中紧邻 REN 位点之前的基因, 并用黑体标出。
PCR 反应体系在冰上配制, 所含每种成分的终浓度如下 : 1X Pfx 扩增缓冲液, dAP, dTTP, dCTP, dGTP 为 0.3mM, MgSO4 为 1mM, 寡核苷酸为 0.3μM, 第一链 cDNA 模板为 1μL, 铂 Pfx DNA 聚合酶为 1.0-2.5 个单位, 最后用无核酸酶的蒸馏水补充至 50μL 终体积。每 个反应经过了三步 PCR 循环, 使用下列参数 : 94 ℃, 15S ; 56 ℃, 30S ; 68 ℃, 延伸时间如上表 1 所述。每个扩增反应都经过 35 个循环, 接着于 72℃终延伸循环 7 分钟, 4℃保存至分析。 每一次试验 PCR 反应旁边都使用相同的第一链 cDNA 和一组人 β- 肌动蛋白的特异性定 引物 (BioChain) 做阳性对照。PCR 每次反应后进行 Tris- 醋酸 EDTA(TAE) 琼脂糖凝胶电 泳分析, 以测定扩增的 cDNA 的延伸和完整性。对于每次分析每种反应物取 10μL 与蓝色 Juice 上样缓冲液 (Invitrogen) 混合, 在 1% TAE 琼脂糖凝胶的每个泳道上样。以 TriDye 1 kb 的 DNA 梯度 (New England Biolabs, Ipswich, MA) 来评估扩增的 cDNAs 的大小。确 认每种 cDNA 的 PCR 扩增后, 按照说明书, 将每种反应物立即克隆到 Zero Blunt TOPO PCR 克隆系统 (Invitrogen)。将转化子过夜培养, 通过 PCR 或 REN 分析来自过夜培养的细菌 培养物的纯化的 DNAs, 或将两种方法结合, 来筛选菌落。将含有预期大小的片段的克隆 pCR-Blunt II-TOPO 用合适的 REN 进行酶切用于分离, 并将全长基因克隆到哺乳动物表达 载体 pcDNA3.1+zeo : intA。
这个表达载体是在 pcDNA3.1+zeo(Invitrogen) 的 3′端的最小启动子增加了人 CMV 内含子 A。CMV 内含子 A 很独特, 与无内含子的 CMV 启动子相比, 能大大提高重组基因在 哺乳动物细胞的表达效率。内含子 A 序列从载体 pWRG7077 通过 PCR 扩增得到 ( 由 Dr.Jay Hooper 提供, 美国陆军医学传染病研究所 [USAMRIID]), 然后克隆到 pcDNA3.1+zeo 载体, 作为 NdeI-NheI 位点。pcDNA3.1+zeo : intA 是具有表达元件的 6.5kb 大小的质粒, 如图 13 所示。克隆反应如 Maniatis 及 Sambrook 所述 (1998 年 ), 然后转化至大肠杆菌 (E.coli) DH5α, 在体内扩增克隆的 DNAs。将转化子过夜培养, 通过 PCR 或酶切分析纯化的 DNAs, 或 将两种方法结合, 筛选出正确的克隆。
图 13 描述了使用 CMV 启动子启动的真核生物载体 pcDNA3.1+zeo : intA 在哺乳动 物细胞表达人蛋白 KGF-1 的克隆方法。 从正常的人体组织的 cDNAs 通过 PCR 扩增克隆基因, 如材料和方法中所述。KGF-1 直接克隆到哺乳动物载体 NheI-HindIII 酶切位点间, 相关的 表达元件是细菌的复制起点 (ori), β- 内酰胺酶基因 (bla), CMV 早期启动子 (PCMV), 牛生 长激素聚腺苷酸化信号 (BGHpA), 单链丝状噬菌体起点 (f1), 猿猴病毒 40 的复制起点 (SV40 ori), 猿猴病毒 40 多聚腺苷酸信号 (SV40pA), 博来霉素抗性基因 (zeocin)。
将含有大小正确的片段的克隆 pcDNA3.1+zeo : intA 用特异的限制性内切酶酶进 行酶切, 确保基因的特异性。从在选择性培养基中过夜培养的 50mL 大肠杆菌菌液中提取高 纯度的质粒, 通过测量 A280 和 A260 来分析 DNAs 的纯度和浓度。每个基因的表达通过脂质 体介导的转染至人内皮肾细胞系 HEK-293T/17, 然后分析细胞提取物和上清液。对每一个 要分析的构建的载体, 转染前晚, 将 1x106HEK-293T/17 细胞接种至含 2mL 生长培养基, 多聚 -D- 赖氨酸覆盖的 6 孔平板中, (DMEM 培养液, 高糖 ; 2mM L- 谷氨酰胺 ; 1X 非必需氨基酸 [NEAA] ; 10%热灭活小牛血清 [FBS])。于 37℃, 5% CO2, 90%相对湿度 (RH) 条件下培养。 第二天, 在转染前, 将培养物用 2mL 新鲜生长培养基培养。将每 4μg 质粒 DNA 加入 250μL 低血清培养基 (Invitrogen) 及 250μL 加有脂质体 2000 转染试剂 (Invitrogen) 的同样的 培养基, 在室温下孵育 20 分钟, 形成 DNA : 脂质体复合物。然后用移液器将全部反应液轻轻 地吸至相应的含有 HEK-293T/17 细胞的容器中, 轻轻搅拌, 混匀转染混合液。然后将平板放 回孵育器孵育 72 小时。基因在转染的 HEK-293T/17 细胞提取物及上清液中表达。转染 72 小时后, 离心收集上清液。每种上清液转移 1mL 至聚丙烯离心管中, 冰上放置。将细胞从容 器中刮下, 在离心管中简单的离心分离。轻轻倒出上清液, 让沉淀重新悬浮在 pH 为 7.4 的 1X 磷酸缓冲液 (PBS) 中, 离心, 弃 PBS 上清液, 根据说明书, 将沉淀重新悬浮在 100μL 哺乳 动物细胞裂解液中 (Sigma-Aldrich, 圣路易斯, 密苏里州 )。 裂解液由 TRIS 缓冲液, 氯化钠, 十二烷基硫酸钠 (SDS), 表面活性剂, 脱氧胆酸和蛋白酶抑制剂制成。裂解反应在室温孵育 10 分钟, 然后在室温下 14,000xg 离心 10 分钟。 上清液转移到新的聚丙烯离心管中, 冰上放 置。
为测定和定量表达的蛋白, 将每组转染的 HEK-293T/17 细胞提取物和上清进行 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 和 Western 杂交分析。每十万细胞当量 ( ~ 10μL) 与 NuPage LDS 样品缓冲液、 NuPAGE 还原剂及去离子水混合, 90oC 加热 5 分钟, 在 10 % NuPage Novex Bis-Tris 凝胶中上样, 同样, 准备 30μL 相应的上清液, 在细胞提取物旁上 样。SeeBlue Plus-2 蛋白分子量标准 (Invitrogen) 用于估计蛋白大小。在 200V 电压, 1X SDS NuPAGE MES 下电泳 45 分钟。 然后根据说明书, 利用 X-Cell II 印迹模板将电泳蛋白转 移至 0.45μm 的硝酸纤维素膜上。根据说明书, 利用蛋白检测 TMB 蛋白印迹试剂盒 (KPL, Gaithersburg, MD) 进行蛋白质印迹, 利用抗血清及辅助检测试剂, 如表 4 所述。 兔子的抗血 清, COLA1A, COL1A2, TIMP-1 和弹性蛋白均购自 Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA)。辣根过氧化物酶 (HRP) 标记的山羊抗兔 IgG(H+L)(Santa Cruz Biotechnology) 用来 作为辅助检测试剂。免疫复合物通过 TMB 膜底物检测 2-5 分钟, 将印迹浸泡在蒸馏水中终 止反应。通过高分辨扫描得到永久记录。
表4
蛋白印迹检测 COLA1A, COL1A2 和 KGF-1 在 HEK-293T/17 细胞中的短暂表达
所用的检测试剂
结果
图 14 表明从正常的人肺组织 cDNAs 中 PCR 扩增出来的 KGF-1 与本发明一致。用 基因特异引物扩增该基因, 如材料与方法所示。 箭头标注的是感兴趣的扩增的基因序列, 相 应的大小也予以标注。KBL, 千碱基梯度 ; KBP, 千碱基对。
图 15 是人 KGF-1cDNA 在 pCR-TOPO 载体中的克隆 ( 图 15A), 然后克隆至哺乳类表 达载体 pcDNA3.1+zeo : intA( 图 15B)。通过 NheI 和 HindIII 对重组载体 pCR TOPO 双酶 切, 得到 KGF-1 基因, 将其直接克隆至通过同样的内切酶酶切的 pcDNA3.1+zeo : intA 载体。 箭头标注的是感兴趣的扩增的 KGF-1 基因序列, 相应的大小也予以标注。KBL, 千碱基梯度 ; KBP, 千碱基对。
图 16 所示的是 KGF-1 的蛋白序列 ( 图 16A) 和 KGF-1/FGF-7 的核苷酸序列 ( 图 16B)。图 16B 中 KGF-1 的 DNA 序列对应于序列号 24 中的第 446 到 1030 位序列 ( 粗体 ), 其 他序列 ( 非粗体 ) 是基因组 DNA 序列, 只克隆了序列号 24 中的第 446 到 1030 位序列。
蛋白免疫印迹结果表明 KGF-1 蛋白在 293T 细胞中表达。例如, 图 17 是对转染 pcDNA3.1+ : intA/KGF-1、 空载 (pcDNA3.1+ : intA)、 没有 DNA 对照的细胞提取物 (C) 及上清 液 (S) 中 KGF-1 蛋白 (a), COLA1A 蛋白 (b) 和 COL1A2 蛋白 (c) 的短暂表达分析, 与本发 明的实施例一致。可以看出, 表达的 KGF-1 基因只存在于转染 pcDNA3.1+ : intA/KGF-1 的 293T/17 细胞的提取物和上清中。KGF-1 用黑色箭头标注。(M =分子量标准 ; KDa =千道尔 顿 ) 可以看出, 细胞转染 KGF 基因后在高分子量区域染色会加强, 而 COL1A1 和 COL1A2 蛋白 的染色则表明细胞转染后, KGF 的表达可能增加胶原的表达。
实施例 3-KGF 质粒局部应用于小鼠的评估 本实验研究于 BALB/C 小鼠中进行, 以判断 KGF 质粒的局部应用是否有美容修复的 实验设计如下 : 在试验组, 用尼龙刷刷 100 次去除 BALB/C 小鼠皮肤的角质层, 类似58功效。
CN 102471769 A说明书56/71 页于亚治疗的微磨皮术。对照组 BALB/C 小鼠只剪毛, 不刷毛。
两种不同的组合试剂进行测试 :
组合试剂 A : 94% TE 缓冲液 (10mM Tris) ; 5%甘油 ; 1%羟丙甲纤维素
组合试剂 B : 88% TE 缓冲液 (10mM Tris) ; 5%甘油 ; 5%丙二醇 ; 1%羟丙甲纤维素
两种不同的质粒进行测试 : gWiz-KGF1 质粒和 NTX-KGF1 质粒分别在单一浓度为 2000 微克 /mL 下进行测试。每只小鼠每次注射 4 微升。
使用 KGF1 质粒的试验组 :
空白对照包括 : - 没有处理 ;- 载体 A 单独处理 ;
- 载体 B 单独处理 ;
- 仅 gWiz-KGF1 质粒, 没有载体
- 仅 NTX-KGF1 质粒, 没有载体
对照组没有使用任何质粒 : 用载体 A 或 B 处理的同一小鼠都有 2 个斑点 ; 同一小鼠 除毛后刷过但没有用载体处理的皮肤区域被认为是 “非载体” 。
载体 A 刷 不刷
刷 gWiz-KGF1 NTX-KGF 1
n=1 n=1 不刷 n=0 n=0 n=1 n=1 载体 B n=1 n=1 没有载体 n=1 n=1对照组没有使用载体 : 仅质粒 ( 无载体 ) 在皮肤上使用所有试验组的详细情况 :
材料和方法 质粒 质粒及载体来自于 Aaron Tabor, Gene Facelift, LLC。 动物 20 只 BALB/C 氏小鼠来自于 Jackson 实验室并在实验之前被驯化。质粒给予
小鼠用氯胺酮及二甲苯胺噻嗪 (1/10) 的混合物麻醉。剃掉它们的背毛, 但是并 不使其脱落。治疗区域要用力地用尼龙刷清洗 (3 排 4cm×1cm 的尼龙纤维 )。通行 100 次 (2 个垂直方向分别 50 次 ) 得到红斑而不出血即可, 以此来破坏皮肤屏障。此 2 个垂直方 向通行产生一个重叠的约 1 平方厘米的治疗区域。那些治疗混合物 ( 如 : gWiz-KGF 质粒或 NTX-KGF1 质粒 ) 就可应用于此拉绒区域, 通过一种 P10 微量吸管 (GILSON, 法国 ) 轻柔将混 合物散布于此区域, 在动物返回到笼内之前, 不要摩擦, 并让其干燥。实验动物都将单独饲 养。
质粒转染后的组织学评估
每只动物的数据结果都在实验 0 天开始记录, 直到实验动物死亡。皮肤活检样本 用 12mm 的打孔器获得, 包括了治疗区域及其上下 1mm 的皮肤细胞。此样本取得后, 平放于 暗盒中, 并予以 10%的福尔马林处理。之后用 H&E, Mason Trichrome 和 Von Gieson 染色, 分析皮肤厚度, 胶原及弹性纤维成分。
结果简介
根据组织学分析, 在被拉绒了皮肤并转染了 gWiz-KGF1 质粒 ( 没有载体 ) 的动物 中, 没有美容的皮肤回复青春的效果。 gWiz-KGF1 质粒被证实是有发挥作用的, 比如, 有一些 正结果显示有美容的皮肤回复青春效果, 只有载体 B 显示有一些祛疤效果。结果显示, 具有 增强穿透性的丙二醇, 能够使 gWiz-KGF1 产生美容的皮肤回复青春的正结果。
NTX-KGF1 质粒则显示有美容的皮肤回复青春作用, 不论使用载体 A, 载体 B, 还是 不用载体 ( 生理盐溶液 ), 不过只适用于祛疤。
不管是 gWiz-KGF1 质粒还是 NTX-KGF1 质粒, 除了祛疤或恢复拉伤皮肤的功能之 外, 不具有其他美容的皮肤回复青春功效。
前文使用过的词句 “美容的皮肤回复青春阳性效果” , 包括一系列使用 KGF1 质粒 治疗之后令人满意的改变, 如本文所述, 是用组织学评估的得到, 此改变包括 :
1. 增加角质层细胞数量从而增强表皮厚度 (H&E 染色 ) ;
2. 增加真皮层胶原的厚度和密度 (Masson′ s Trichome 染色 ) ;
3. 增加真皮层及表皮层连接处垂直方向的弹性纤维 (Luna 染色 ) ;
4. 增加基底细胞增殖 (Ki-67 染色 ) ;
实施例 4- 小鼠亚治疗微磨皮验证研究
本研究的目的是为了验证小鼠中的亚治疗磨皮实验有效。本实验中, 用到 SV129 型小鼠。磨皮手术也基于该小鼠。每只小鼠活检完毕后, 实验者在其相应位置做上标记, 活 检是在磨皮手术之后立即执行的。
在磨皮手术中, 用到了两种尼龙刷, 用于拉绒小鼠皮肤的两种尼龙刷, 有着不同的 鬃毛。
此二种尼龙刷如下所述 :
本尼龙刷, 具有柔软 ( 不硬 ) 的鬃毛, 标记绿色的尖部 (G) ;
本尼龙刷, 具有硬的鬃毛, 标记黄色尖部 (Y)。
下文是用于标记的代码 :
第一个字母 : 代表尖部的颜色 (G 代表绿色, Y 代表黄色 )- 接下来的字母 : 代表压力用 “in Hg” 表示 (10, 15 或者 20) - 接着的数字 : 代表样品号码 (1 到 4) 病理学样品编码
基于上述研究结果, 黄尖 ( 具有硬鬃毛, 黄尖部的尼龙刷 ), 20/Hg 被选作微磨皮器材。 实施例 5- 小鼠给药剂量上升实验
本实验的目的是为了评估不同剂量的 NTX-KGF1pDNA 质粒在小鼠中的效果。
本实验是基于实施例 4 中的微磨皮装置。根据实施例 4 中的结果, 黄尖 ( 具有硬 鬃毛, 黄尖部的尼龙刷 ) 在 20in Hg 被选作微磨皮器材。
总共有 26 只 “SV 129 小鼠” 参与该实验, 该小鼠被称作 “GFP 小鼠” 或者绿色荧光 蛋白小鼠 ( 因为该小鼠在其细胞质中表达 GFP)。
本实验, 只对 NTX 质粒 ( 特别是 NTX-KGF1pDNA) 进行了评估。gWiz-KGF1 质粒没有 用于本实验。NTX-KGF1 质粒是 NTC8385-KGF1lot#NTC-Ol 1007( 由 Nature Technology 于 2009 年 10 月 27 日生产 )。该质粒是 3.18mg/ml 的冻干粉。
本实验检测了 6 种不同剂量的 NTX-KGF1pDNA 质粒, 分别是 50, 100, 250, 500, 750, 和 1000 毫克 / 毫升 (μg/ml)。
本实验唯一用的载体是载体 A, 成分描述如下 : 94% TE 缓冲液 (10mM Tris) ; 5%甘 油; 和 1%羟丙基甲基纤维素。
一只小鼠在麻醉之后便死去。
本实验对照组有以下小鼠组成 :
- 只做磨皮手术 (2 只 ) ;
- 磨皮手术 + 载体 A(2 只 ) ;
- 只有载体 A( 无质粒, 无磨皮手术 )(2 只 ) ;
- 载体 A+6 种不同浓度 NTX 质粒 (50, 100, 250, 500, 750, 和 1000 毫克 / 毫升 ) 但 是不做磨皮手术 ( 每个浓度一只小鼠 )。
为了检测不同给药剂量, 设置了两组实验组 :
- 一些小鼠接受全部实验处理 ( 磨皮手术, 于载体 A 中的不同浓度的质粒 ) ;
- 另一些小鼠仅有于载体 A 中的不同浓度的质粒, 没做磨皮手术。
本实验小鼠用克他命及甲苯胺噻嗪 (9/1) 腹部麻醉。剃掉其的背毛, 但是并不使 其脱发。
本替代治疗磨皮手术用真皮标记。微铺平装置 (Dermasweep Inc.Rocklin, CA, USA) 用的是黄尖尼龙刷, 20in Hg 真空压力。
Dermasweep 迷你微磨皮装置
该 Dermasweep 迷你微磨皮装置 (Dermasweep Mini), 其特征是, 有一个密闭可调 真空压力系统, 可以将皮肤轻轻拉起, 利用尼龙刷, 以准确可控的方式轻柔地去除上层皮 肤。
该尼龙毛刷的尖部以传统的晶体系统去掉杂质和危害物质。 该 Dermasweep Mini) 装置经过了 FDA 认证的。
小鼠中 NTX-KGF1pDNA 质粒的应用
在亚治疗微磨皮之后 ( 大约 5 分钟 ) 立即用微量管加入不同浓度的 NTX-KGF1 pDNA 质粒, 并在实验动物回笼前让其干燥。麻醉剂的用量足够多直到观察小鼠背部复合物 干燥。
未用质粒的对照组
处置说明 进磨皮手术 磨皮手术 + 载体 A 仅载体 A
剂量 (μg/ml) 50 100 250 磨皮手术 164, 165 828, 159 162, 900 无磨皮手术 163, 833( 额外的小鼠 ) 155 156 小鼠标签号码 831, 830 160, 161( 背部有深的抓痕 ) 829, 166接受不同剂量的 NTX-KGF1pDNA 质粒的测试组64CN 102471769 A 500 750 1000
说826, 170 827, 158 167, 157明书169 832 17162/71 页实验 5 结果概要
本实验结束后, 应用组织学来分析不同处置组的效果。所有剂量的 NTX-KGF1pDNA 质粒, 特别是 100, 250, 和 500 微克 / 毫升 (μg/ml), 其组织学评价如下 :
1. 增加角质层细胞数量从而增强表皮厚度 (H&E 染色 ) ;
2. 增加真皮层胶原的厚度和密度 (Masson′ s Trichome 染色 ) ;
3.500 微克 / 毫升的剂量引起一定的炎症 / 毒力。
实施例 6- 猪的微磨皮验证
本实验的目的是为了评估和验证用于增强 KGF-1pDNA 递送至猪皮肤的亚治疗微 磨皮设置。
用于本实验的种类和品系是 Yorkshire 猪 ; 该猪被检测是健康的, 并且初始体重 为约 200lbs。 本实验假定如下 : 1) 亚治疗微磨皮能以可控, 可重复的方式进行 ; 2) 亚治疗微磨 皮加上 KGF-1pDNA 将产生美容的皮肤回复青春的功效 ; 3) 亚治疗微磨皮单独或者加 / 减载 体不产生美容的皮肤回复青春。
研究目的 :
1. 确定最佳的微磨皮设置 ( 尖部级别, 穿过数量, 真空压力 ) 来有效地去除 ( 或几 乎去除 ) 角质层而不破坏或引起基本的有活力的表皮炎症。
2. 证明亚治疗的微磨皮程序可控且可重复。
3. 确定局部应用 KGF-1pDNA 与优化的亚治疗的微磨皮程序联合给予的剂量—— 药效。
实验 #1
优化亚治疗的微磨皮的程序
处理和组织收集 : 用到了一只 Yorkshire 猪。该 Dermasweep 迷你微磨皮装置 ( 本文别处所述 ) 用于确认以确定角质层去除的程度和再生性。当电力剪下并轻柔清洗 Yorkshire 猪的治疗区域后, 改变真空压力和通行次数, 产生不同的治疗排列。
进行皮肤打孔活检和 H&E 染色来检测角质层的移除百分比。
本实验中, 评估了 Dermasweep 迷你微磨皮装置的不同的设备设置, 来测定哪种设 备产生亚治疗的去除角质层而不破坏或者使基本的有活力的表皮发炎。治疗区域大约有 2×2 厘米= 4 平方厘米。去皮后组织立马收集。当最后的实验手术结束后, 实验动物被安 乐死。
最低的 Dermasweep 微真空设置在 3/Hg 分析, 最高的为 27/Hg。多数情况下, 用该 设备治疗人时, 真空设置设为 15-20/Hg 范围, 在 1 垂直和 1 水平通行期间, 用中等的 ( 绿 色 ) 或中等粗糙 ( 黄色 ) 处理尖部。相对于中等的 ( 绿色 ) 处理尖部, 中等粗糙的 ( 黄色 ) 处理尖部具有更硬的尼龙鬃毛。尖部在皮肤上移动速率评估为 10cm 每秒。对照皮肤区域
不进行磨皮手术处理, 其被收集用于分析。
材料和方法
Dermasweep 迷你微磨皮装置
正如本文其他位置所述, Dermasweep 迷你微磨皮装置 ( 即 “Dermasweep Mini” ), 其特征是, 有变量水平真空泵的密闭系统, 在鬃毛以精确和控制的方式 “扫走” 皮肤的死
层时将皮肤轻轻拉起。该鬃毛尖部完全去掉与传统的晶体系统相关的杂质和危害物质。 Dermasweep Mini 为 FDA 认证的医疗设备。
微磨皮程序
将 Yorkshire 猪麻醉, 治疗区域用电剪剃毛并清洗, 但并不脱毛, 然后如以上指定 的以多种设备设置进行程序。
组织收集
所有组织从试验 0 天在单一时间收集, 皮肤活检组织在微磨皮之后立即收集, 利 用的是 12mm 活检打孔器。在最终的手术之后, 实验动物处以安乐死。
活检样品名称 : 侧面活检
两个对照样品用 C1 和 C2 表示 活检样品名称 : 下腹活检5/Hg 绿尖 黄尖 G5-B Y5-B 10/Hg G10-B Y10-B 15/Hg G15-B Y15-B 20/Hg G20-B Y20-B 25/Hg G25-B Y25-B其中 B 表示腹部
评价
本实验组织样本平放于暗盒中, 并置于 10 %的福尔马林中用于组织学。之后用 H&E 染色, 分析角质层 / 表皮 / 真皮厚度, 以及任何炎症指示物的存在。
实验 #1 结果概述
1. 该绿尖组 (G) 在 25/Hg x 2 次通行, 产生了最平滑地移除角质层。在任何压力 设置下, 用绿 (G) 尖没有观察到上皮损伤。黄尖 (Y) 产生了更多粗糙的表面, 并在 20/Hg 时 上皮开始显著损伤。
2. 该猪的侧腹被确定为最佳治疗区域。 其下腹部是皮肤中具有大的峰和谷的高度 凹凸不平的皮肤。腹部皮肤的 “谷” 没有显现出具有任何角质层被移除。
侧腹则为更平滑的皮肤。
3. 为猪刺字则是为了确定样品是来自与精确的微磨皮治疗区域。
实验 #2
局部应用 KGF-1pDNA 之后亚治疗磨皮手术
处理和组织收集 : 用到了 1 只 Yorkshire 猪。在实验 0 天, 测试之前, 利用电剪剃 掉毛并轻轻清理干净, 接着进行温柔的微磨皮程序 ( 如前文所述测定 ) 以去掉角质层。该 治疗区域约为 2×2 厘米= 4 平方厘米。组织在实验 4 天后单独收集 ( 处理后 96 小时 )。 实验动物在第 4 天的实验后处以安乐死。
载体 :
载体 A : 94% TE 缓冲液 (10mM Tris) ; 5%甘油 ; 和 1%羟丙基甲基纤维素。
质粒 :
NTX-KGF1pDNA 质粒被配制成不同浓度 100, 250, 500, 750, 1000, 1500, 和 2000 微克 / 毫升。因为在小鼠中 NTX-KGF1 表现出强烈的肉眼可见的效果, 所以实验确定了一个大范 围 ( 超过 20 倍 ), 每平方厘米用 4 微升体积 ( 比如 : 4 平方厘米的区域用 16 微升 )。
对照组由以下组成 : 1) 无微磨皮或者 pDNA 治疗 ( 收集相邻的治疗区域 ) ; 2) 只有 微磨皮 ; 3) 微磨皮之后只有载体。处置表如下 :
质粒
质粒和载体来自于 Aaron Tabor, Gene Facelift, LLC.
动物
一只 Yorkshire 猪在实验之前被使之适应。
微磨皮程序及质粒应用
本实验猪被麻醉, 在应用亚治疗微磨皮程序之前, 其背部用电剪剃掉毛发并清理, 但是不会使其脱毛, 正如实验 #1 所述。
本实验治疗区域用微磨皮技术去除其角质层, 该区域大约 2x 2 = 4 平方厘米大 小。
本实验微量管涂布于该治疗区域, 并用一次性血清刷 ( 或小铲 ) 涂布均匀, 不要摩 擦, 在动物回笼之前, 令其干燥。
本实验动物单独饲养
组织收集
所有组织在第 3 天某一时间收集, 在实验第 3 天, 该动物被麻醉。用 12mm 活检打 孔器取样, 之后该动物被处以安乐死。
评价
评价在实验 0 天, 微磨皮之前和之后, 每日进行直到实验动物牺牲。
组 织 样 本 取 得 后, 平 放 于 暗 盒 中, 并 置 于 10 % 的 福 尔 马 林 用 于 组 织 学。 用
H&E±Selective Ki67 染色, 胶原及弹性纤维成分被用于另外的组织学分析。
示例性实验总结 : 猪的亚治疗的微磨皮和基因治疗——剂量递增研究
动物模型 : 使用一只 8 月龄的大 Yorkshire 母猪 (275 磅 ), 全身麻醉使之镇静。
治疗区域绘图 : 治疗点用笔标记在背部和侧面。
治疗区域绘图 : 治疗编码编号直接写在皮肤上。
该猪皮肤模型的相关性 : 其背部和侧腹部皮肤与人皮肤相似。
样品收集方法 : 在计划的治疗区域周围 ( 黑点标记的 ) 用 12mm 打孔器标记一 个黑圈, 在其垂直方向上 24mm 处 (2 倍于打孔的距离 ), 做上刺字标记 ( 红色标记 )。该 刺字标记用的是斯波尔丁特电器纹身标记, 型号为 SSEMK, Spaulding&Rogers MFG., Inc. Voorheesville, NY USA。电压设定为 17 到 21 之间。在刺字标记之后, 洗去墨迹, 微磨皮则 用 25/Hg 压力, 绿尖尼龙刷, 载体 A 或者不用质粒。
治疗说明
治疗区域命名 执行治疗的范围 ( 从左到右, 从上到下 )顺序 1 治疗说明 无70CN 102471769 A 2 3 4 5 6 7 8
9 10 11 12
说单独磨皮 单独载体明书68/71 页磨皮 + 载体, 无质粒 50 微克 / 毫升 NTX 100 微克 / 毫升 NTX 250 微克 / 毫升 NTX 500 微克 / 毫升 NTX750 微克 / 毫升 NTX 1000 微克 / 毫升 NTX 1500 微克 / 毫升 NTX 2000 微克 / 毫升 NTX这些顺序在每个身体区域 ( 背部和侧腹部 ) 上重复除了对照组只有 NTX 无磨皮手 术的。该 3 组重复治疗方案动物分别标记 A, B, C。身体背部区域标记 D, 侧腹部区域标记 F。
对于只用 NTX 治疗, 不做磨皮手术的, 其编码是 :
第一个字母是其剂量, 第二个字母是样品编号 (A 或 B)
例如 :
50-A : 50 微克 / 毫升质粒, 没有进行磨皮手术, 第一个样品。
100-B : 100 微克 / 毫升质粒, 没有进行磨皮手术, 第二个样品。
病理切片命名 ( 样品 ID)
石蜡切样 本实验皮肤样品, 从中间切样。接着放入石蜡模具, 面朝下, 放置垂直直到石蜡凝集。 结果摘要 ( 病理分析 )
在 50 微克 / 毫升 NTX-KGF1pDNA 治疗下, 与对照组并无明显差异。
1) 在 100 到 250 微克 / 毫升 NTX-KGF1pDNA 治疗下, 表皮和真皮增殖良好, 在表皮 和真皮的连接处, 有浓密的胶原质将其连接。这是皮肤产生主要结构 ( 胶原质 IV/VII 和胶 原质 I/III) 来对抗皱纹的证据。其表皮同样以增加网钉 ( 交错连接 ) 的形式增厚, 使表皮 及真皮区域增加。基底干细胞 ( 真皮右上面 ) 染色更深 ( 扩散更大 )。
2) 在 500 微克 / 毫升 NTX-KGF1pDNA 治疗下, 出现一定的皮肤角化过度 ( 表明有炎 症反应 )。
3) 在 750 到 2000 微克 / 毫升 NTX-KGF1pDNA 治疗下, 皮肤角化过度, 不存
在浓密的胶原层。
4) 在单一剂量 250 微克 / 毫升 NTX-KGF1 pDNA 治疗下, 真皮层以增加角蛋白
细胞的形式增厚。厚厚的纤维胶原直接堆积在真皮 - 上皮交联处。
对于美容的皮肤回复青春的显著影响
本文描述的研究结果, 如在实施例中进一步详述, 表明利用质粒 DNA 进行表面皮 肤层细胞的基因治疗, 可以得到令人惊奇且意想不到的美容的皮肤回复青春效果。该结果 证实, 应用 KGF1 pDNA, 通过递送路径, 和本文描述方法, 在美容的皮肤回复青春方面很大益 处。 因此, 此种在人中的给予可类似地有益于改正皮肤老化的标记, 去除美容外观的不良变 化, 例如 : 起皱, 下垂, 变薄, 干燥, 暗淡, 粗糙, 和紫外线照射引起的皮肤变色和老化。 此处所 述的实施例只为举例说明, 而不是为了限制本发明的范围。一个或多个其他生物分子的表 达, 如: PDGF 或者其他生长因子, 结构生物分子 ( 如胶原 1, 胶原 3), 抗氧化分子 ( 如过氧化 物歧化酶 ), 同样在本发明范围内, 并且也可以评价对于消除美容外观的不良变化的影响, 例如 : 起皱, 下垂, 变薄, 干燥, 暗淡, 粗糙, 变色的皮肤, 这些往往是紫外线照射和老化的结 果。
这些结果进一步表明, 外用抗皱基因治疗可大为发展, 比如 : 整形外科, 皮肤科, 医 疗水疗市场。 事实上, 生长因子恶化的基因往往被新的生长因子基因取代, 以重新启动胶原 质和弹性蛋白的生产, 恢复皮肤的厚度。
本文所述的组合物和方法, 可用于纠正皮肤老化的根本原因, 即, 促进正确的断裂 或基因突变。 在一般情况下, 此处所述的组成和方法可以用来增加皮肤厚度, 增加胶原和弹 性蛋白, 因此此处所描述的基因治疗能够可靠和有效地用于恢复美容特性。一定的生长因 子, 如 KGF, 能被用来在其他哺乳动物, 甚至人中, 以产生抗皱的理想的美容效果。
本发明其他令人惊讶和意想不到的优势, 包括但不仅限于 : 1) 相比 Botox 治疗 ( 往往肌肉瘫痪 ) 和 Juv é derm( 暂时的皮肤扩张 ) 治疗, 具在不刺激下, 增加皮肤质量的优 势; 2) 与多肽短暂治疗相比, 能持续达到预期效果, 因为基因治疗有更强有力的美容效果 ; 3) 与其它化妆药品相比, 本发明的组成和方法是具有更多的使用途径, 比如 : 治疗皱纹, 下 眼圈, 手背, 颈部下垂。
本文引用的所有专利、 出版物、 摘要和其他参考文献通过参考以其全文结合至此。
应理解, 前述仅涉及本发明的某些实施方案和多种修饰或改变可在此进行而不脱离本发明 的精神和范围, 如所附权利要求书中限定的。74CN 102471769 A
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术语 “相似性” 或 “相似百分比” 指的是两个氨基酸序列或核酸序列之间的同源性, 相似百分比用以校准两条核酸序列, 指的是在共同的位置比较相似残基 ( 氨基酸或核酸 ) 的数量。序列的校准和比较是按照目前科学的计算标准, 或是公开在 BLAST 和 FASTA 上的 计算版本来进行。此外, 由美国国立卫生院, Bethesda 医师提供的 ENTPvEZ, 可用于序列比 较。在实施例中, 两个序列的相似百分比可由重量差距为 1 的 GCG 来确定, 把每个氨基酸的 差距加权, 就好像是两个序列间不匹配的单个氨基酸一样。 例如, 某序列和指定的序列有至 少 90%相似, 是指范围从 90 到 99.99%, 并且包含之间所有的范围。即它和指定序列的相 似度可以是 91, 91.5, 92, 92.5, 93, 93.5.94, 94.5, 95, 95.5, 96, 96.5, 97, 97.5, 98, 98.5, 99, 99.5%。同理, 某序列和指定的序列有至少 70%相似, 是指范围从 70 到 99.99%, 并且包含 之间所有的范围。而具体的数值取决于所使用的计算方法。
在此, “同源性” 是指一个序列与另一个序列 ( 蛋白质或核酸序列 ) 的序列相似程 度。通常, 两个同源序列之间的相似程度至少在 50%。在备用实施例中, 同源序列的相似 性不低于 60%或者 75%或者 80%, 甚至有时高达 90%。在另一些实施例中, 两个序列之间 的相似性至少在 95%或 98%, 甚至 99%。与此类似, 此处所提到的 “同源物” 表示与野生 型氨基酸序列具有同源性的多肽。同源性比对可通过肉眼进行, 但更多情况下需要借助于 序列比对程序。这些商业化的程序能够计算出两个甚至更多序列间的同源性百分比 ( 例如 Wilbur, W. J. 和 Lipman, D.J., 1983, Proc.Natl.Acad Sci.USA, 80 : 726-730)。
任何有生物活性的多肽或有功能的衍生物 ( 和 / 或类似物 ) 包括对多肽的其中一 个或多个氨基酸进行修饰、 插入、 缺失或替换而又不显著影响多肽的性质。例如, 具有生物 活性的衍生物或类似物可以通过替换保守氨基酸而实现。当然, 生物活性衍生物也要包含 原始肽段的片段。最好衍生物或类似物与原始肽段相比具有更高的活性或稳定性。
突变蛋白质可以通过传统的技术来获得类似物和衍生物。在某个实例中, 衍生物 与原始多肽相比可能具有更高的活性。 例如, 在某些实例中, 衍生物或类似物的活性至少提 高了 2 倍, 有的至少提高 5-10 倍, 甚至提高 20 倍。
“突变蛋白” 是通过改变多肽一个或者更多氨基酸来得到预期的多肽, 例如用非二 硫键形式的氨基酸代替半胱氨酸残基。
突变蛋白、 类似物和衍生物还可以用另外一些传统技术来获得。例如, PCR 引入的突变可以被利用。 虽然以下讨论都是针对 DNA, 但该技术也可以应用到 RNA 上。 WO 92/22653 中描述了 PCR 技术的实例。获得类似物、 突变蛋白和衍生物的另一种方法是以 Wells 提出 的技术为基础的盒式突变形成 (Gene, (1985)34 : 315)。
目前, 发明中所涉及的术语 “类似物” 或 “衍生物” 是指基因的断裂、 变异、 等位基 因造成并由此产生的衍生物。这些术语只在具有 “成熟” 多肽或功能性多肽生物活性的情 况下适用。因此, 人或非人来源的成熟蛋白质或功能多肽具有至少 60%、 或者 70%、 80%甚 至高达 90%的序列同源性的多肽都涵盖在此定义中。 某种蛋白的类似物还包括与其具有一 处或多处肽段相似性 ( 类肽 ) 并具有蛋白生物活性的多肽。此定义还包括含有一个或多个 类似氨基酸 ( 如非自然界存在的氨基酸 ) 的多肽、 含有替代化学键的多肽以及其他自然存 在或非自然存在的修饰后多肽。多肽一词也不排除表达后进行过化学修饰 ( 诸如糖基化修 饰、 乙酰化修饰和磷酸化修饰之类 ) 的多肽。
因此, 通过调节细胞环境而实现美容功效的多肽类似物和 / 或衍生物可能含有氨 基酸替换、 缺失或插入。氨基酸替换应该是对保守氨基酸进行替换或者消除非必需氨基酸 残基的替换, 例如改变糖基化位点、 乙酰化位点, 或者通过替换或缺失一个或多个对蛋白功 能不必要的半胱氨酸残基来减少多肽的错误折叠。 此处使用的 “保守氨基酸” 一词是指拥有相同结构和 / 或功能的一类蛋白质群体 中完全相同的氨基酸。大多数保守的氨基酸残基对蛋白质的结构和功能是非常重要的。因 此, 鉴定出蛋白质三维结构中存在的连续保守氨基酸区域对该蛋白质的结构和功能非常重 要。 为了找到保守的氨基酸残基或三维结构中的保守区域, 要对不同物种、 或同一物种的不 同个体间相同或相似的蛋白质进行序列比对。对保守氨基酸的替换通常要能够维持多肽 整体的电荷量、 疏水性或亲水性或空间体积, 例如, 有如下氨基酸取代的即为保守氨基酸取 代: 甘氨酸 / 丙氨酸, 缬氨酸 / 异亮氨酸 / 亮氨酸, 天冬氨酸 / 谷氨酸, 赖氨酸 / 精氨酸, 天 冬酰胺 / 谷氨酰胺, 丝氨酸 / 半胱氨酸 / 苏氨酸和苯丙氨酸 / 色氨酸 / 酪氨酸。
“表达载体” 是一种多聚核苷酸, 可以在目的宿主细胞内起作用, 同时可以引起宿 主细胞生成有益的基因。
“调控序列” 指的是一段多聚核苷酸序列, 负责调控与它自身相连接的编码基因的 表达。这种调控序列的本质随宿主的不同而不同。通常包括启动子, 转录终止序列等。 “调 控序列” 还包括一些其他的有益存在, 例如, 分泌多肽的分泌前导序列。
“可行性连接” 指的是, 在允许组件按各自方式发挥功能的基础上, 给他们并置某 些有关联的组分。 在不影响编码序列表达的基础上, 编码序列和控制序列和谐的连接, 这就 是可行性连接。在这两个组分之外, 可行性连接可能会有自己额外的核苷酸 ( 或肽类的氨 基酸 )。
此处使用的 “终止子” 是一种控制序列, 如多聚腺苷酸和转录终止序列, 位于 3′端 或终止密码子编码序列的下游调控序列。
本文所用的 “重组宿主细胞” “宿主细胞” “细胞” “细胞培养” 和其他类似的术语, 表示微生物, 昆虫细胞和哺乳动物细胞, 可以或已被用来作为引进重组载体或以其他方式 转移 DNA 的接受者, 包括已转化细胞的后代。
本文使用的 “转化” 或 “转染” 是指进入宿主细胞的外源性核苷酸的转移, 可以使 用多种转移方法, 例如, 感染, 直接吸收, 传导, F- 交配, 注射, 显微注射或电击。外源性核苷
酸可以作为非集成载体被维持, 例如在某些情况下, 质粒可能会被整合到宿主基因组中。
“纯化的” 和 “分离的” 是指一种多肽或核苷酸序列, 表示该序列的分子在其它相同 品种或类型的生物大分子中实质性的缺乏。在其他的方案中, 术语 “精炼的” 是指重量至少 占相同类型生物大分子质量的 75%, 85%, 95%或 98%。
“药学可接受的载体” 是指任何可以服用进入人体, 而不会产生任何不良副作用的 载体。如抗体产生的发热症状等。
“处理” 或 “治疗” 是指改善或防止恶化状态 ( 如皮肤皱纹 ), 或改进主体的状况。 在某些实施例中, “治疗” 一词是指对美容外观状态的广泛的治疗, 包括减轻某种症状或是 这种状态引起的其他症状。
“有效量” 是指能够产生理想结局的有效量。这个数值会变化, 取决于接收治疗的 人不同的健康或生理状态, 个体对合成抗生素的免疫力, 需要保护的程度, 药物的制剂, 主 治医生对医疗状况的评估, 以及其他的相关因素。
本文使用的, “体内转染” 或 “体内合并” 是指, 有益的生物分子被引入活体细胞的 过程。这个术语包含了对单独多聚核苷酸的转染, 或者是包含一个额外基团或进入细胞的 载体的多聚核苷酸。体内转染的具体方法将在细节中介绍。 “体外转染” 或 “体外合并” 是指, 有益的生物分子被引入活体外细胞的过程。这个 术语包含了对单独多聚核苷酸的转染, 或者是包含一个额外基团或进入细胞的载体的多聚 核苷酸。体外转染的具体方法将在细节中介绍。
本文使用的, 维护具有美容功效细胞的多肽, 可以是如前所述的任何形式的多肽。 它们可以促进生成, 增强这类细胞健康和寿命的生物分子。 正如领域中众所周知的, 这种蛋 白的肽类和基因的序列已经可以从公共数据库中获得。
本文使用的, “血小板衍生生长因子” 或 “PDGF” 包括 PDGF A 链多肽, PDGF B 链多 肽, 以及 AA, BB, AB 型的二聚体, 生物活性片段, 类似物, 衍生物。这些都在如下文献中有 介绍 : 美国专利, 专利号 5,187,263, Waterfield 等 ., Nature 304 : 35-39(1983) ; Wang 等, J.Biol.Chem.259 : 10645-48(1984), Antoniades 等, Biochem.Pharm.33 : 2833-38(1984) ; 和 Westermark 等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83 : 7197-7200(1986) ; 美 国 专 利, 专利号 5,219,759。一种 “具有生物活性的 PDGF” 多肽是指, 一种具有相同或更好的, 能优先刺激 皮肤真皮层细胞生长或增殖能力的多肽。这种多肽可以是一个全长 PDGF, PDGF 片段, 或 是 PDGF 的类似物。他可以承担 PDGF 氨基酸的替换, 删除, 增加或衍生。这些在如下的文 献中有介绍 : 美国专利, 专利号 5,149,792, EP 458959B1 ; 以及美国专利 Nos.4,769,328 ; 4,801,542 ; 4,766,073 ; 4,849,407 ; 4,845,075 ; 4,889,919 ; 5,045,633 ; 和 5,128,321。
本文使用的, “角质细胞生长因子” 或 “KGF” 指的是一群结构不同的蛋白族中的一 种, 这个蛋白族称作 FGFs, 它们显示不同程度的序列同源性。这表明他们是由相同的基因 家族编码的。FGFs 在细胞表面具有相同的结合位点。例如, KGF 能够和 FGFR-3 结合。同时 “角质细胞生长因子” 或 “KGF” 指的是任何一个如前所述的成熟的多肽或生物活性片段, 类 似物或衍生物, 例如 WO 90/08771 和 WO 95/01434。
一种 “具有生物活性的 KGF” 多肽是指, 一种具有相同或更好的, 能优先刺激皮肤 表皮层细胞生长能力的多肽。这种多肽可以是一个全长 KGF, KGF 片段, 或是 KGF 的类似物。 他可以承担 KGF 氨基酸的替换, 删除, 增加或衍生。这些在 WO 90/08771 和 WO 95/01434 中
有介绍。 此处使用的术语 “胰岛素样生长因子” 是指, 在大幅纯化的, 天然的, 重组生产的 以及化学合成的各种形式中, 包含的 IGF-I 和 IGF-II。除此之外还包括生物活性片段, 类 似物, 突变蛋白, C 端缺失的突变蛋白以及衍生物。他们可以保持胰岛素样生长因子的活 性, 或连接胰岛素受体的能力。例如以下文献描述的 : EP 135 094, WO 85/00831, 美国专 利, 专利号 4,738,921, WO 92/04363, 美国专利, 专利号 5,158,875, EP 123 228 和 EP 128 733。同时相同的内容在如下文献中也有描述 : EP 135 094, WO 85/00831, 美国专利, 专利 号 4,738,921, WO 92/04363, 美国专利, 专利号 5,158,875, EP 123 228 和 EP 128 733。一 种 “具有生物活性的 IGF” 多肽是指, 一种具有相同或更好的胰岛素样作用的生长因子。例 如, 在与其连接的受体的胞质区, 对特定的酪氨酸残基进行磷酸化的刺激, 如 WO 93/98826 所述。或是在另一些例子中, 对某种细胞有丝分裂的影响, 如 EP 0128733 所述。这种多肽 可以是一个全长 IGF, IGF 片段, 或是 IGF 的类似物。他可以承担 IGF 氨基酸的替换, 删除, 增加或衍生。
本发明中所使用的 “胰岛素样生长因子结合蛋白 (IGFBP)” , 是指一个绑定了 IGF 结合蛋白的结合蛋白。在如下文献中被鉴别和描述 : Keifer et al, J.Biol.Chem.266 : 9043-9(1991), Camacho-Hubner 等, J.Biol.Chem.267 : 11949-56(1992), McCusker 和 Clemens, THE INSULIN LIKE GROWTH FACTORS : STRUCTURE AND BIOLOGICAL FUNCTIONS, Oxford Univ.Press, N.Y. pp.110-150(1992)。一种 “具有生物活性的 IGFBP” 多肽是指, 具
有相同或更好的胰岛素样生长因子绑定蛋白的活性的多肽, 通过向那些胰岛素样生长因子 可以发挥活性的组织和细胞内绑定及输送胰岛素样生长因子而发挥作用。 正如现在至少有 6 种已知的 IGFBP, 他们中有些与其他的 IGFBP 很不同。一个给定的 IGFBP 的生物活性相关 的特质不必包括整个胰岛素样生长因子整体。一个独立的 IGFBP 的生物活性或许和其他的 IGFBP 有相似之处, 但也有不同。
此处使用的 “全长 PDGF” 或 “成熟 PDGF” 和 “全长 KGF” 或 “成熟 KGF” 和 “全长 IGF” 或 “成熟 IGF” 和 “全长 IGFBP” 或 “成熟 IGFBP” 指的是在人或其他哺乳动物组织中发现的, 各自的母体多肽。
此处使用的 “胶原” 是指一个含有至少 28 个结构相关蛋白 ( 胶原 I-XXVIII) 的大 族群中的一员, 它们显示不同程度的序列同源性。 这表明他们是由相同的基因家族编码的。 胶原是组成细胞外间质的主要纤维多肽, 同时也是皮肤结构的支撑。它包括真皮, 表皮 - 真 皮交界以及其他身体组织。这类蛋白质组成了多种, 结构和功能重要的超分子组件 ( 例如 参见, Pihlajamaa T., New tools for the study of an old collagen characterization of the human COL9A1, COL9A2 and COL9A3 genes and production of human type IX collagen as a recombinant protein.Collagen Research Unit, Biocenter OuIu and Department of Medical Biochemistry, University of OuIu, FIN-90220OuIu, Finland, 2000, OuIu, Finland)。胶原的特点是由三重螺旋其中的三个相同或不同的多肽链组成的, 称为 α 链。而单个胶原则是以结构划分成两个主要群体为其特征, 如纤维状和非纤维状。 纤维状的群体和原纤维中, 胶原包括 I, II, III, V 和 XI 型。
I, II 和 III 型的胶原作为主要的纤维状胶原, 意味着含有大量的组织。大部分的 I 型胶原在结缔组织中表达, 同时也是最丰富的胶原, 是皮肤, 骨骼, 肌腱和韧带的主要结构成分。I 型胶原通常以异三聚体的形式存在, 包括两个 α1(I) 链和一个 α2(I) 链, 分别由 COL1A1 和 COL1A2 基因编码。II 型胶原则是软骨, 玻璃体和椎间盘的主要成分, 也是在其发 展过程中, 在内耳和许多其他组织中瞬时检测到的。它是一个由 COL2A1 基因编码的同三聚 体, 由三个 α1(II) 链组成。 III 型胶原也是同三聚体, 由 α1(III) 链组成。 它在大部分含有 I 型胶原的组织中表达, 除了骨骼和肌腱。在弹性蛋白组织中广泛存在, 包括皮肤, 血管, 内 脏和肺, 可与 I 型胶原组装成异型纤维。除了形成原纤维, 非纤维状胶原还可以提供许多其 他功能。 他们的三重螺旋特质会因为非胶原的干扰而分裂为若干片段。 而非纤维状的胶原, 根据他们的结构和功能不同分为六个亚群。重要的网状胶原包括 IV 型, VI 型和 VII 型。IV 型胶原网络存在于身体大部分位点的所有基底膜中。在大部分位点中, 这种支持和控制的 网络包括 α1(IV) 和 α2(IV) 链, 但是某些基底膜, 如肾小球膜, 也包括 α3(IV), α4(IV), α5(IV) 和 α6(IV) 链。这些 α 链的胶原区, 长度大约是 1400 个氨基酸, 并含有许多短暂 的中断。编码这些多肽的基因, 在一般随机定位的胶原基因之间, 形成了一个有趣的例外, 那就是在三种染色体头对头连接的趋势中, 它们被成对的定位。VI 型胶原是由 α1(VI), α2(VI) 和 α3(VI) 链组成的异三聚体, 它由一个侧面具有大型球状 N 和 C 端的简短三重 螺旋组成。 它是唯一聚合成串珠状微丝的胶原, 存在于细胞表面, 众多结缔组织周围的胶原 纤维中, 并可能作为细胞外基质中的大分子框架与细胞相连的锚定位点。VII 型胶原通过 二聚以及和同三聚体 α1(VII) 三个分子侧面的结合而形成锚固纤维。这些纤维连接上皮 基底膜到皮肤的细胞外基质底部, 角膜以及一些其他的上皮组织。高度中断的 VII 型三重 螺旋, 在所有胶原中是最长的, 并且编码它的 COL7A1 基因具有已知基因中最多数量的外显 子, 如 108 个。因此在替代方案中, 运用在本发明方法和组合物中的胶原肽, 以及表达会使 这些使用增加的胶原肽可以是完整长度的胶原, 胶原片段或其功能类似物。这种胶原可能 包括Ⅰ型 (COL1A1 和 COL1A2 基因, 体内最丰富的胶原 ), Ⅱ型 (COL2A1 基因, 透明软骨 ), Ⅲ 型 (COL3A1 基因, 肉芽组织中发现 ), IV 型 (COL4A1, COL4A2, COL4A3, COL4A4, COL4A5, COL4A6 基因, 基膜和眼球晶状体中发现 ), V 型 (COL5A1, COL5A2, COL5A3 基因, 间质组织中发现 ), VI 型 (COL6A1, COL6A2, COL6A3 基因, 间质组织中发现 ), VII 型 (COL7A1 基因, 真皮与表皮的 交界处发现 ), VIII(COL8A1 和 COL8A2 基因, 内皮细胞中发现 ), EK(COL9A1, COL9A2, COL9A3 基因, 与 II 型和 XI 原纤维结合的 FACIT 胶原 ), X(COL1OA1 基因, 矿化的软骨 ), XI(COL11A1 和 COL11A2 基因, 软骨中发现 ), XII(COL12A1 基因, 与 I 型原纤维结合的 FACIT 胶原 ), XIII(COL13A1 基因, 一种与某种整合蛋白和纤连蛋白相作用的跨膜蛋白 ), XIV(COL14A1 基 因, 一种 FACIT 胶原 ), XV(COL15A1 基因 ), XVI(COL16A1 基因 ), XVII(COL17A1 基因, 一种 跨膜胶原 ), XVIII(COL18A1 基因 ), XIV(COL19A1 基因, 一种 FACIT 胶原 ), XX(COL20A1 基 因 ), XXI(COL21A1 基因, 一种 FACIT 胶原 ), XXII(COL22A1 基因 ), XXIII(COL23A1 基因 ), XX IV(COL24A1 基因 ), XXV(COL25A1 基因 ), XXVI(COL26A1 基因 ), XXVII(COL27A1 基因 ), 以及 XVIII(COL28A1 基因 )。 在本发明的方法和组合物中, 许多类型的胶原对具有美容功效 的细胞的功能至关重要。
此处使用的 “弹力蛋白” 是指原弹性蛋白或成熟的弹性蛋白多肽。它是一种关键 的细胞外基质蛋白, 对脊椎动物组织的弹力和恢复力至关重要, 这些组织包括皮肤大动脉, 肺, 韧带, 肌腱, 皮肤以及弹性软骨 ( 见 Mithieux 和 Weiss, 2005, Elastin, Advances in Protein Chemistry, Vol70, p437)。人基因编码的原弹性蛋白是一种定位于 7q11.2 区域的单拷贝。初级转录大约是 40kb 的长度, 同时包括散落在大量内显子周围的少量外显子, 这 就导致了外显子 / 内显子比率异常偏低。这段约 3.5kb 的 mRNA 序列码, 包含一个约 2.2kb 的编码区以及一个相对大的, 1.3kb 30 的非转译区。人原弹性蛋白包含 34 个外显子。原 弹性蛋白以外显子周期为特征, 具有独特功能的疏水性和交联域在独立的外显子替换中被 编码。所有以三核酸倍数存在的外显子以及内显子 - 外显子的交界都是以相同的方式分裂 的。在 30 交叉点发现密码子的第一个核苷酸, 而第二个和第三个核苷酸存在于 50 外显子 的边界。原弹性蛋白的主要转化产物需要经历广泛的选择性剪切, 因为位于外显子 - 内显 子边界的密码子剪切始终贯彻在整个分子中, 有选择性的剪切与编码序列的维护一起, 常 以卡带式发生。这就在转录中产生了大量不规则的原弹性蛋白的亚型。至少已知的 7 种人 外显子被选择性切割, 它们分别是 22, 23, 24, 26A, 30, 32, 和 33。
可以使用个体外显子的选择性剪切, 来修饰不同组织中的结构性功能蛋白。从 所有被调查的物种中观察到, 它显现发育调控和组织特异性, 同时随着年龄以相同比率变 化。人最常见的同型原弹性蛋白缺乏外显子 26A, 据报道仅在某些疾病蛋白中表达。有三 种人疾病与原弹性蛋白基因的突变或缺失有关, 它们是 : 皮肤松弛症, 上主动脉瓣狭窄以及 Williams-Beuren 综合征。
“TIMP” 指的是一群至少有 4 种结构相关蛋白族 ( 基质金属蛋白酶组织抑制因 子 -1, 2, 3, 4( 即 TIMP-I, TIMP-2, TIMP-3 和 TIMP-4)) 中的一种, 它们显示不同程度的序列 同源性。 这表明他们是由相同的基因家族编码的。 通过抑制胶原酶, 明胶酶或其类似物 ( 基 质金属蛋白酶类 (MMPs)), TIMPs 对限制细胞外基质分解起至关重要的作用。所有的 TIMPs 具有一个主要的特征, 即他们有 12 个保守半胱氨酸残基以及保守的相互间距, 和一个 23 到 29 的氨基酸前导序列, 和生产成熟蛋白有关。TIMPs 和 MMP-TIMP 的复合物晶体结构已被报 道, 如 TIMP-I 和 MMP-3, TIMP-2, MT1-MMP 的复合物。TIMPs 的形状是一个细长连续的楔形, 包括二分之一 N 端和 C 端与彼此相反的多肽链的 (Gomis-Ruth 等 1997)。在 MMPs 复合物 中, TIMPs 通过和它们裂隙边缘的活性位点结合而进入全线 MMPs。
TIMP-1 蛋白是一个分子量 28.5kDa 的 184 个氨基酸的糖蛋白。它包含了两种可 能的 N- 糖基化位点。TIMP-1 启动子除了一个先导结合蛋白 1(LBP1) 转录因子的假定结合 位点外, 还包括 10 个 SpI, 6 个 AP-I, 6 个 PEA3, 12 个 AP-2 位点以及 5 个 CCAAT 框。上游 TIMP-1 元素 -1(UTE-I) 对 TIMP-1 的转录也是必不可少的。启动子含有两种新型的抑制成 分, 和一个身份不明的 ETS 相关因子来抑制转录 (Dean 等 2000)。TIMP-1 蛋白已在人牙本 质和牙骨质中发现。此外, 人成骨细胞可以分泌 TIMP-1。
TIMP-2 蛋白是一个分子量 21 kDa 的 194 个氨基酸的非糖蛋白。它有一个带负电 荷的延伸的 C 端。TIMP-2 启动子由若干调控元件组成, 包括 5 个 SpI, 2 个 AP-2, 1 个 AP-I 以及 3 个 PEA-3 结合位点。TIMP-2 被转录成两种 mRNAs, 分子量分别是 1.2 和 3.8kb。并由 人成骨细胞和软骨细胞分泌。
TIMP-3 的多肽序列与 TIMP-1 和 TIMP-2 的序列分别有 37 %和 42 %的相似度。 TIMP-3 蛋白有 188 个氨基酸。在 C 端有一个保守的糖基化位点。重组人 TEVDP-3 的特征 表明, 它有一个 27kDa 的糖基化成分和一个 24kDa 的非糖基化成分。TIMP-3 可以以它的糖 基化和非糖基化形式定位于 ECM。TIMP-3 基因有 4 个 SpI 位点, 但是在它的启动子中没有 TATA 框。三种 TIMP-3 的 mRNA 组分, 分子量分别是 2.4, 2.8 和 5.5kb, 由该基因转录得来,并由人软骨细胞表达。
TIMP-4 蛋白的分子量是 22kDa, 是由 195 个氨基酸组成的多肽。TIMP-4 多肽与 TIMP-1 具有 37%的相似度, 与 TIMP-2 和 -3 具有 51%的相似度。在生理条件下 (pH 7.4), TIMP-4 是最中性的 TIMP 蛋白, 等电点为 7.34。相比之下, 人体 TEMP-1, TIMP-2 和 TEMP-3 蛋白的等电点分别为 8.00, 6.45 和 9.04。
TIMP-4 基因转录成分子量 1.4kb 的 mRNA。作为钙化组织, TIMP-4 在人软骨中被 检测到。
每个 TIMP 蛋白都与一个目标 MMP 蛋白以不同速率的相互作用和亲和力相结合, 通 常是按 1 ∶ 1 或 2 ∶ 2 的化学计量。 TIMP-1 对 MMP-1, MMP-3 和 MMP-9 的抑制比 TIMP-2 更有 效。TIMP-2 对 proMMP-2 的抑制比 TIMP-1 更有效, 是 10 倍甚至更多。但是 TIMP-2 对 MMP-2 有双向调节作用, 因为 MT-MMP 需要少量 TIMP-2 激活反应, 从而调解 proMMP-2 的活性。但 是大浓度的 TIMP-2 会抑制 MMP-2。TIMP-3 至少对 MMP-2 和 MMP-9 有抑制作用, 而 TIMP-4 是一个没有显着偏好的所有特定类型 MMPs 的良好抑制剂。TIMP-4 通过抑制 MT1-MMP 和抑 制 MMP-2 激活来调节 MMP-2 活性。
虽然 TIMPs 会抑制已激活的 MMP, 但与明胶结合的 MMPs 是一个例外, 因为 TIMP 能可逆的结合 MMP-2 和 MMP-9 的前体形式。随后, TIMP 从复合体中分离, 并允许继续激活 proMMP。例如, TEMP-1 与 proMMP-9 结合, 随后 proMMP-9 被 MMP-3 激活, 直到 TEMP-I 使复 合体失活而被阻止。例如中性粒细胞弹性蛋白酶, 不会破坏 proMMP-9。但是, TEMP-2 也可 能抑制 MMP-9 的活性形式。对于被所有 TIMPs( 除去 TIMP-1) 抑制的 MMP 和 MMP-19, 活性 MMP-13 是个例子。可溶性 MMP-16 的活性被 TIMP-2 和 TIMP-3 抑制, 但是不包括 TIMP-1。
此处使用的 “MMPs” 是指一个由至少 28 个分泌或跨膜酶组成的大家族, 它们都可 以加工或降解 ECM 蛋白。它们中, 至少有 22 种 MMPs 迄今为止被发现在人体组织中表达。 MMPs 具有高度的蛋白序列同源性, 并且已经定义了结构域。因此, 根据其结构特点, MMPs 既 可以按分泌 MMPs 归类, 又可以被分类为膜锚定 MMPs, 进一步可分为 8 个独立的亚群。分泌 MMPs 包括最小域 MMPs, 简单血液结合素域 MMPs, 明胶结合 MMPs, 弗林蛋白酶激活分泌 MMPs 和类体蛋白嵌入 MMPs。 而膜结合 MMPs 包括Ⅰ型跨膜 MMPs, 糖基磷脂酰肌醇 (GPI) 连接 MMPs 和Ⅱ型跨膜 MMPs。
MMPs 的晶体结构进一步揭示了准确的域组织, 多肽折叠以及主要的特异性决定因 素。迄今为止, 除了猪的全长 MMP-I 蛋白和人 proMMP-2 蛋白外, 人 MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MMP-11, MMP-12, MMP-13 和 MMP-14 蛋白刺激域的晶体结构已经解决。
第三个限制 MMPs 蛋白水解活性的层次, 包括内源性 MMPs 组织抑制剂 (TIMPs)。 TIMPs 特异性抑制 MMPs 的活性形式, 以及某些情况下潜在的 MMPs 形式, 同时打乱这种平衡, 导致组织发生病变。 活性 MMPs 可以被 α- 巨球蛋白, 尤其是 α2- 巨球蛋白灭活。 最近的研 究结果表明, 丝氨酸蛋白酶抑制剂和组织因子途径抑制剂 -2(TFPI-2) 抑制 MMP-I, MMP-2, MMP-9 和 MMP-13(Herman 等 2001)。钙结合蛋白多糖 (N-TES, 睾丸素 -1 或睾丸素 -3) 能够 抑制 MT1- 或 MT3-MMP 介导的 proMMP-2 的激活。 此外, 还有许多外源性抑制剂。 例如一些绿 茶中的黄酮醇 ( 如没食子儿茶素 -3- 没食子酸或儿茶素 ), 可以抑制 MMP-2, MMP-9, MMP-12 的活性以及 proMMP-2 的激活。有些合成抑制剂对 MMPs 活性也具有很好的抑制作用。一种 “具有生物活性的 TIMP” 多肽, 是指具有相同或更强的优先抑制 MMPs 能力的多肽。这种多肽可以是一个全长 TIMP, TIMP, 片段, 或是 TDVDP 的类似物。他可以承担 TIMP 氨基酸的替 换, 删除, 增加或衍生。
此处所述 “弹力素” 指一个成熟的弹力素多肽 ( 见如, Francart, 等, 1997, Solution Structure of R-elafin, a Specific Inhibitor of Elastase, J.Mol.Biol.(1997)268, 666-677)。一个 “具有弹力素生物学活性” 的多肽指有相同 / 更强的能倾向于抑制弹性蛋 白酶的物质。 此多肽可以是全长的弹力素, 一段弹力素片段, 具有氨基酸替代物的弹力素类 似物, 缺失, 或增加, 或弹力素衍生物如在美国专利 5734014 中所述。 弹力素通常也称为 “皮 肤衍生抗白细胞蛋白 ; 弹性蛋白酶抑制剂 ; 和 SKALP)。弹力素是一个具有 57 个氨基酸残基 的多肽 (6kDa), 其最初从银屑患者的鳞屑中分离。弹力素是人白细胞弹性蛋白酶 (HLE), 猪 胰弹性蛋白酶抑制剂, 蛋白酶 -3, 三种能切割重要结缔组织蛋白质弹性蛋白的酶的特定抑 制剂。它对其他丝氨酸蛋白酶没有抑制作用, 如纤维蛋白溶酶, 胰蛋白酶, 糜蛋白酶和组织 蛋白酶 G。弹力素与其目标以解离常数紧密结合。弹力素对于保护含有弹性蛋白的组织结 构的完整性, 免遭免遭弹性蛋白酶降解, 有重要作用, 因此是一个潜在的治疗价值的弹性蛋 白酶引起的疾病的化合物。 近日, 弹力素已经被证明, 其以物理方式结合与弹性蛋白纤维可 防止由紫外线引起的弹性蛋白的降解。弹力素基因序列已公开。 此处所述, “超氧化物歧化酶” 或 “SOD” 指至少三类结构相关的酶蛋白 (SOD1-3) 的 成员之一, SOD1-3 显示不同程度的序列同源性, 显示, 他们由相关的基因家族编码。SOD 歧 化催化超氧化物生成氧气和过氧化氢。 因此, 对于所有暴露在氧气的细胞中, 它具重要的抗 氧化防御作用。 在人中, 超氧化物歧化酶的三种形式存在。 SOD1 存在于细胞质中, SOD2 存在 于线粒体和 SOD3 在细胞外。SOD1 是一个二聚体 (2 个亚基 ), 而其他两个是四聚体 (4 个亚 基 )。SOD1 和 SOD3 含有铜和锌, SOD2 在其反应中心含锰。SOD1, 2 和 3 的基因分别 21, 6和 4 号染色体上 (21q22.1, 6q25.3 和 4p15.3-p15.1)。 SOD 已经证明能防止成纤维细胞端粒的 缩短, 转化肌成纤维细胞为成纤维细胞, 并减少皮肤辐射后的纤维化疤痕 (Serra, et.al., 2003.J Biol Chem.Feb 28 ; 278(9) : 6824-30 ; Vozenin-Brotons.et.al., 2001.Free Radic Biol Med.Jan 1 ; 30(1) : 30-42)。SOD1 和 SOD2 基因序列已公开。
此处所述, “热激蛋白”或 “HSPs”指一类结构相关蛋白的成员之一, 该组蛋白 具不同程度的序列同源性, 显示, 他们由相关的基因家族编码。热激蛋白 (HSPs) 是存在 于从细菌到人之间可组成或诱导表达的高度保守蛋白 (S.Lindquist, Ann.Rev.Biochem 55, 1151(1986)。 组 成 型 Hsp 对 许 多 不 同 的 细 胞 功 能 具 有 重 要 作 用。 据 分 子 量, 可将 Hsp 分 成 6 大 类 : (a)20-30kDa ; (b)40-50kDa ; (c)50-60kDa ; (d)70kDa ; (e)90kDa ; 和 (f)100-110kDa(Minowada G 等, J.Clin.Invest., 95, 3(1995) ; Morris SD, Clin.Exper. Dermatol., 27, 220(2001)) 可诱导型 Hsps 可由一系列胁迫诱导, 如升温 (M.Schlesinger 等, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982), 重金属 (M.Schlesinger 等, Alan R.Liss, Inc., 137(1989)), 氨基酸类似物 (P.Kelley 和 M.Schlesinger, Cell 15, 1277(1978) ; L. Hightower, J.Cell.Physiol.102, 407(1980)), 氧自由基 (M.Ashburner, Chromosoma 31, 356(1970) ; J.Compton 和 B.McCarthy, Cell 14, 191(1978)), 局部缺血或有缺氧导致的局 部缺血 (S.Guttman, Cell 22, 299(1980) ; M.Ashburner 和 J.Bonner, Cell 17, 241(1979)), 机械创伤 (L.Hightower 和 F.White, Cold Spring Harbor Laboratory, 369(1982) ; D.Gower 等, J.Cell Biol.103, 291(1986)), 和细胞内异常蛋白的出现 (J.Ananthan 等, Science
232, 522(1986))。热激蛋白的统一功能是在非理想环境中维持细胞正常功能。
Hsps 在正常或休眠的皮肤细胞中均可组成型表达, 对重要的生物过程起重要作 用, 例如分子伴侣作用 (Maytin EV, J.Invest.Dermatol., 104, 448(1995), 和 / 或当环境 胁迫下, 对胁迫蛋白的表达起迅速上调作用 (Welch WJ, Physiol.Rev., 72, 1063(1992)。 一些 Hsps 在皮肤细胞中表达。Hsp72 在角质细胞中组成型表达 ( 例如参见, Trautinger F 等, J.Invest.Dermatol., 101, 334(1993) ; Charveron M 等, Cell Biol.Toxicol., 11, 161(1995) ;和 Laplante A 等, J.Histochem.Cytochem., 46, 1291(1998))。 另 外 Hsps 27, 47, 60, 90, 和 110 可 能 存 在 于 正 常 的 表 皮 中 (Wilson N 等, J.Cutan.Pathol., 27, 176(2000))。任何这些 Hsps 似乎在正常组织中起特定作用。例如, Hsp 27 稳定肌动蛋 白, 而 Hsp 90 可作为分子伴侣, 和 / 或激活特定转录因子 (Charveron M 等, Cell Biol. Toxicol., 11, 161(1995)), 皮肤中 Hsp 27 可控制发育皮肤细胞的分化 (Jantschitsch C 等, Br.J.Dermatol., 139, 247(1998))。
有 证 据 表 明, Hsps 在 细 胞 之 间 能 互 换 (L.Hightower 和 P. Guidon, J.Cell. Physiol.138 , 257(1989) ; M.Tytell 等, Brain Res.363 , 161(1986) ; M.Tytell , Int. J.Hyperthermia, 21, 4450455(2005))。因此, Hsps 起作用的位点可能并不限于产生其的细 胞, 而扩散到相邻细胞。
对具有美容功能的细胞进行基因修饰
因此, 本发明涉及用于基因修饰具美容功能的细胞以提升外貌的组合物和方法。 本发明可以其他多种方法予以实施。
在一个实施例中, 本发明可能包括一种用于受体中具美容功能的基本完整细胞在 美容方面的基因修饰方法, 该方法包括 : 使用一种能编码至少一个用于维持特定细胞具美 容功能的核酸分子或多肽链的多聚核苷酸, 将其应用到至少一部分能发挥美容功效的细胞 中, 从而使上述核酸分子或多肽链在这些细胞中表达以提高或 / 和维持对外貌产生积极效 果的生物化学或 / 和生理过程。
在另一个实施例中, 本发明包括一个分离的多聚核苷酸分子, 其能编码至少一个 用于维持具美容功能的细胞的核酸分子或多肽链。在另一个实施例中, 该分离的多聚核苷 酸分子被应用于细胞, 使具美容功能的细胞能表达上述提及的核酸分子或多肽, 从而提高 或 / 和维持对外貌产生积极效果的生物化学或 / 和生理过程。
在另一个实施例中, 本发明包括一个分离的多肽或一个分离的多聚核苷酸, 其涉 及维持具有美容功能的细胞。 例如, 在具体实施例中, 本发明包括在此描述的一个分离的多 肽或一个分离的多聚核苷酸。 因此, 在关于本发明的方法和组合物的另一些实施例中, 分离 出的多聚核苷酸可能包括 SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 5, SEQ DD NO : 9, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 17, 或者是 SEQ ID NO : 24 中的核苷酸 446-1030, 或者是 SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 17 的互补序列, 或者是 SEQ ID NO : 24, 或者是 与 SEQ ID NO : 1, SEQ BD NO : 5, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 17 至少有 70%, 85%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 或 99%相似的序列, 或者是 SEQ ID NO : 24 中的核 苷酸 446-1030, 或者是与 SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 17 互补序列至少有 70%, 85%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%相似的 序列, 或者或者是 / 和 SEQ ID NO : 24 中的核苷酸 446-1030。在 另 一 个 实 施 例 中, 分 离 的 多 聚 核 苷 酸 可 能 包 括 SEQ ED NO : 2( 原 骨 胶 原 COL1A1), SEQ ID NO : 6( 弹性蛋白 ), SEQ BD NO : 10( 超氧化物歧化酶 3), SEQ ID NO : 14(TIMP-I)SEQ BD NO : 18(COL1A2), SEQ ID NO : 23(KGF-I) 或者至少与 SEQ BD NO : 2, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 18 有 70%, 85%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%相似的多肽, 或者 SEQ BD NO : 23。或者已被使用的含上述序列的 多肽。这些核苷酸和多肽序列见图 1-5 和 16.
在另一实施例中, 本发明可能包括一个组合物用以基因修饰受体中大体完整的具 美容功能的细胞。此组合物可能包括一个多聚核苷酸, 其能编码至少一个用于维持具美容 功能的细胞的核酸分子或多肽链 ; 还包括一个载体, 用于将该多聚核苷酸应用到至少一部 分能发挥美容功效的受体细胞中, 从而使核酸分子或多肽链在这些细胞中表达以提高或 / 和维持对外貌产生积极效果的生物化学或 / 和生理过程。或者, 该组合物可能包括一个多 肽用以维持具美容功能的细胞, 还包括一个载体, 用于将该多肽应用到至少一部分能发挥 美容功效的受体细胞中, 从而使核酸分子或多肽链在这些细胞中表达以提高或 / 和维持对 外貌产生积极效果的生物化学或 / 和生理过程。
多种多肽可能定向提高或 / 和维持对外貌产生积极效果的生物化学或 / 和生理过 程。例如, 在一些具体实施例中, 本发明的方法和组合物中所使用的多聚核苷酸编码了一 种角化细胞生长因子。在一个实施例中, 该多肽包括一种角化细胞生长因子或由它产生的 具生物学活性的衍生物。例如, 在一些具体实施例中, 该多聚核苷酸包括 SEQ ED NO : 24 的 446-1030 核苷酸, 或 SEQ ED NO : 24 的 446-1030 核苷酸互补序列, 或与 SEQ ED NO : 24 或其 互补序列的 446-1030 核苷酸至少 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%相似的序列, 或者一条能编码 SEQ ID NO : 23 蛋白序列或与 SEQ ED NO : 23 至少有 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%相似序列的多聚核苷酸。
在其他实施例中, 该多聚核苷酸编码一个胶原多肽或多肽 ( 如 COL1A1 和 COL1A2)。 或者, 该多聚核苷酸可能编码一个弹性蛋白。 在其他实施例中, 该多聚核苷酸可能编码一个 TIMP-I 多肽。或者, 该多聚核苷酸可能编码 SOD 多肽。在其他实施例中, 该多肽至少包含一 种转化生长因子, 一种血小板源性生长因子, 一种血管内皮生长因子, 一种胰岛素样生长因 子, 一种肝细胞生长因子, 一种血管内皮生长因子, 一种成纤维细胞生长因子, 一种表皮生 长因子, 血小板衍化内皮细胞生长因子, 一种结缔组织生长因子, 一种粒细胞 - 巨噬细胞集 落刺激因子, 一种巨噬细胞集落刺激因子, 一种生长激素, TSP-I, TSP-2, 一种胶原, TIMP-I, 一种超氧化物歧化酶, 一种弹性蛋白, 或一种缺氧诱导因子, 或由其衍生的具生物学活性物 质中的一种。
因此, 在本发明的方法和组合物的另一些实施例中, 多核苷酸可能包括 SEQ ED NO : 1, SEQ ED NO : 5, SEQ ED NO : 9, SEQ ID NO : 13, 或 SEQ ID NO : 17, 或 SEQ ED NO : 1, SEQ ED NO : 5, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 13, SEQ ED NO : 17 的互补序列, 和 / 或 SEQ ID NO : 24 的 446-1030 核苷酸序列, 或与 SEQ ED NO : 1, SEQ ED NO : 5, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 13 至少有 70%, 85%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%相似的序列, 或 SEQ ID NO : 17, 和 / 或 SEQ ID NO : 24 的 446-1030 核苷酸序列, 或 SEQ ED NO : 1, SEQ ID NO : 5, SEQ ED NO : 9, SEQ BD NO : 13, SEQ ID NO : 17 的互补序列和 / 或 SEQ ED NO : 24 的 446-1030 序列。
在其他实施例中, 在本发明的方法和组合物的多聚核苷酸可能编码多肽 SEQ IDNO : 2( 原骨胶原 COL1A1), SEQ ID NO : 6( 弹性蛋白 ), SEQ ID NO : 10( 超氧化物歧化酶 3), SEQ ID NO : 14(TIMP-1) 或 SEQ ID NO : 18(COL1A2), SEQ ID NO : 23(KGF-1) 或与 SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 18, or SEQ ID NO : 23 多肽序 列至少有 70%, 85%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%相似的序列。或者一个被 使用的包含这些序列的多肽。这些核苷酸和多肽的序列见图 1-5 和 16.
在本发明的方法和组合物的具体实施例中, 该多聚核苷酸包括, 或被插入一个质 粒或一个病毒载体。 例如, 在至少一部分转染细胞中, 该多聚核苷酸可稳定地以质粒形式存 在于染色体外。在具体实施例中, 购自于 Gelantis 的 gWIZTM 载体可被使用。或者购自于 InvitrogenpVAX-BEST 可被使用。
本发明的方法和组合物可能包括将单一或多种试剂导入细胞。在一个实施例中, 至少两种多肽或核酸分子被导入细胞。
在本发明的方法和组合物中的多聚核苷酸可能包括一个重组体的构建体, 用于在 具有美容功能的细胞中表达特定多肽。 因此, 在此更详细描述, 能编码一个核酸或多肽以维 持具美容功能的细胞的多聚核苷酸, 被可操作地连接到组成型启动子或可诱导启动子。在 另一个实施例中, 该启动子并不是在所有细胞中表达, 而仅在具美容功能的细胞中表达。 可 再选或单选, 能编码一个核酸或多肽以维持具美容功能的细胞的多聚核苷酸, 被可操作地 连接到一个增强子。另外, 在其他实施例中, 能编码一个核酸或多肽以维持具美容功能的 细胞的多聚核苷酸, 被可操作地连接到至少一段功能 polyA 序列, 一段内含子, 一段终止序 列, 或一个 cap 位点中的一种。
本发明中的方法和组合物被应用于多种具有美容功能的细胞。可选地, 被改造的 具美容功能的细胞至少包含角质细胞, 纤维母细胞, 脂肪细胞, 或肌原纤维中的一种。
本发明采用了多方法来操作所述的核酸 ( 多聚核苷酸 ) 构建体。 在一个实施例中, 所述多聚核苷酸是裸 DNA 引入具美容功能的细胞中。在具体实施例中, 载体包括至少包括 脂质体, 纳米粒子, 一种乳剂, 一种触变凝胶、 或一种感官凝胶中的一种。 因此, 可选地, 被引 入具美容功能细胞的多聚核苷酸其载体至少包括脂质体, 纳米粒子, 一种乳剂, 一种触变凝 胶, 或一种感官凝胶中的一种。 或者, 引入具美容功能细胞的多聚核苷酸其通过一种油包水 乳剂或水包油乳剂被导入。在另一实施例中, 被引入具美容功能细胞的多聚核苷酸是通过 至少颗粒介导转移 ( 如金颗粒、 微球 ), 电压驱动转移, 无线电频率灼烧介导转移, 超声波, 或微针中的一种被导入的。
图 6 显示了本发明示例方法 2 的一个实施例。如, 所述方法可能包括中受体对增 加或维持具有美容功能细胞的需求评估的步骤 4。该评估可能由一个皮肤科医生或另一医 疗保健专业人员执行。或者, 该评估可能被受者执行 ( 即自我评估 )。
接下来, 所述方法可能包括对所要求的疗法的性质做出决定的步骤 6。同样, 该 评估可能由一个皮肤科医生或另一医疗保健专业人员执行。或者, 该评估可能被受者执行 ( 即自我评估 )。
所述方法可进一步包括准备 ( 或选择 ) 一个组合物的步骤 8, 该组合物包括所要求 的用于治疗的基因或它的混合物。在一实施例中, 该步骤可能至少最初由一个皮肤科医生 或其他医疗保健专业人员执行。一旦选出合适的组合物, 受者 ( 即自我评估 ) 执行该评估。 例如, 受者可能要对购买何种可用的皮肤护理基因产品进行评估。所述方法可能额外包括对需治疗的细胞或组织应用所述组合物的步骤 10。 在一个 实施例中, 为增加和 / 或维持具美容功能的细胞, 该组合物需要按要求施用一段时间。在此 更详细地, 该组合物准确的剂量和治疗时间根据受者情况和应用的组合物的性质而变化。
所述方法也可能包括对受体再评估以确定受体具有美容功能的细胞是否得到改 善的步骤 12。如果确定具美容功能的细胞其有提升的外观表现 14-YES, 受者可以选择是否 使用组合物 16。然而, 如果确定具美容功能的细胞其并无提升的外观表现 14-NO, 受者可以 选择重复所述过程, 或许用一种不同的组合物。
因此, 本发明的实施例包括用于对具美容功能的细胞进行基因修饰的方法和组合 物。在具体实施例中, 本发明可能包括用于体内或体外转染重组核酸构建体进入具有美容 功能的细胞的方法和 / 或组合物。所述重组构建体可能以基因组外元件或以直接插入基因 组的形式并入具有美容功能的细胞
在其他实施例中, 所述方法和 / 或组合物可能直接提供多肽或其他生物分子 ( 即 不需通过基因表达 )。例如, 使用了能增加或维持具有美容功能的细胞的生长因子混合物。 例如, 在一个实施例中, 所述多肽可能包括角化细胞生长因子 (KGF), 胰岛素样生长因子 (IGF-I), 和 / 或转化生长因子 β(TGF-β), 和 / 或此处详述的多肽的混合物。或其他被使 用的多肽。
或者, 所述重组构建体可能编码调控多核苷酸, 如反义 RNA 或抑制 RNAs(RNAi) 以 增加或 / 和维持对外貌产生积极效果的生物化学或 / 和生理过程。
所述的本发明方法和 / 或组合物被用于增加和 / 或维持和 / 或改善受体和 / 或受 体组织和 / 或具有美容功能的细胞的外观。多种生物分子和 / 或生理过程可应用本发明所 述方法和组合物进行调整。在具体的实施例中, 本发明所述的方法和组合物可产生至少如 下美容效果中的一项 : 减少皮肤下垂, 减少皱纹长度, 减少皱纹深度 ; 增加皮肤紧致度, 坚 固度, 色调, 或弹性 ; 增加皮肤水合作用和保水能力, 水分流动 ( 即产生水通道蛋白 ) 和渗透 平衡。
调整至少一种在具有美容功能的细胞表达的多种生物分子其结果由本发明的组 合物和 / 或方法的处理决定。例如, 在一些具体实施例中, 用本发明的方法和组合物也可 以增加皮肤蛋白质。或者用本发明的方法和组合物也可以增加皮肤脂类水平, 如膜脂, 板 层体脂, 分泌的细胞间脂。因此, 在具体实施例中, 用本发明的方法和 / 或组合物可能增加 细胞间基质, 和 / 或黏性和通讯多肽, 包括但不限于胶原, 弹性蛋白, 角蛋白 ( 包含角蛋白 中间丝 ), 纤连蛋白, 蛋白聚糖, 层粘连蛋白, 整合蛋白, 核心蛋白聚糖, 基膜聚醣, 纤调蛋白 ( 和其他小分子富亮氨酸蛋白聚糖 (SLRP’ s)), 肌腱蛋白 E, 神经纤维细丝, 巢蛋白, 肌间线 蛋白, 波形蛋白, 外周蛋白, 神经酰胺, 胆固醇, 磷脂, 鞘脂, “天然保湿因子” (NMF), 和粘多糖 (GAGs) 如透明质酸和硫酸皮肤素。
在另一些实施例中, 用本发明的方法和组合物可能会增加皮肤细胞能量的产生, 利用和保存 ; 增加氧气利用, 增加皮肤细胞生命 ( 例如延长成纤维细胞寿命 ) 和 / 或生命周 期 ( 如减少衰老 )。利用本发明的方法和组合物的实施例可额外地或可选地使以下至少一 项水平提高 : 皮肤细胞的免疫防御, 热休克 / 应激反应, 消除自由基的抗氧化防御能力 ( 如 活性氧或羰基化合物 ), 和 / 或有毒防御 ( 如环境污染物 ) ; 能提高对紫外线的保护和恢复 能力。在其他实施例中, 用本发明的方法和 / 或组合物可能会增加皮肤细胞通讯 ( 如神经肽介导的沟通 ) 和皮肤细胞神经支配 ; 改善皮肤细胞的粘附性 / 粘结性 ( 如桥粒完整性 ) ; 改善矿物质钙和其他矿物质代谢, 促进皮肤细胞更替 ( 例如脱皮 ) ; 和 / 或改善皮肤细胞的 生物钟节奏。
在具体实施例中, 利用本发明的方法和组合物的至少可实现以下之一 : 皮肤纹理 改善, 平滑, 容光焕发, 神采奕奕。例如, 在具体实施例中, 利用本发明的方法和 / 或组合物 的至少可实现以下之一 : 减少色斑和肤色不均 ( 包括红斑, 色素沉着 ( 如黄褐斑 ) 和色素不 足。
另一些利用本发明的方法和组合物的实施例可使一下至少一项实现 : 改善血管 健康, 包括改善血管的完整性 ( 即减少变色的血液制品渗漏到皮肤 ), 改善血管张力, 改善 变色的血液副产品分解 ( 如改善血铁黄素分解, 胆红素加工和改善 UGT1a 酶的功能 ) 和减 少 “蜘蛛脉” 和 “静脉曲张” 。在其他实施例中, 本发明的方法和组合物的实施可改善 DNA, RNA, 线粒体, 膜和其他皮肤细胞器健康 ; 改善脂肪生成以增加脂肪总量用以保持皮肤丰满 及脸或其他身体其他部位看上去饱满、 轮廓分明或圆润 ; 改善真皮表皮交界处 (“DEJ)。例 如, 最明显的和可重复的皮肤老化生物学特性之一是真皮表皮交界处的扁平化。这个过程 可能由于真皮乳头状突起减少和 rarification 所致。例如, 30 到 90 岁之间, 这些皮肤层 之间的交错结合可能会减少 50%以上 ( 见, 例如, Kirstin et al, Phytochemistry and Photobiology, 2005, 81 : 581-587)。
在具有美容功能的细胞中, 有些特定的生物大分子能过量表达。 因此, 在其他实施 例中, 利用本发明的方法和 / 或组合物可用来减少这样的有害生物大分子。例如, 本发明的 方法和 / 或组合物的具体实施例可增加脂肪分解, 以减少 “橘皮组织” , “凹陷” 的皮肤 ; 以及 减少腹部和 / 或全身脂肪。或者, 本发明的方法和 / 或组合物的具体实施例可使孔径降低 ; 减少干燥和 / 或剥落 ; 减少油性和粉刺。本发明的方法和 / 或组合物的具体实施例也可能 被用于减少肌肉收缩, 平滑肌细胞和肌原纤维 ( 例如, 以减少表情皱纹 ), 或增加肌肉收缩, 平滑肌细胞和肌原纤维 ( 如减少下垂 ) ; 和增加皮肤细胞的大小 ( 如增大脸部肌肉, 以防止 脸庞 “凹陷” )。此外, 改造维持具有美容功能的细胞 ( 例如皮肤细胞 ) 是以维持其美观为 目的, 不论紫外线光损伤 ( 如增强核酸内切酶, 光解酶, 热休克蛋白, 金属硫蛋白和超氧化 物歧化酶的表达水平, 增加内源性 “遮光剂” 以保护美观 ) 和其他的环境侵害 ( 如污染物和 刺激物 )。
本发明的方法和 / 或组合物的具体实施例也可能被用于增加色素沉着 ( 例如古铜 色肌肤的获得, 其不需通过紫外线照射而获得免晒古铜色 ) 或可选地, 减少色素沉着 ( 如 “美白” )。此外, 皮肤细胞可能被改造, 以永久或临时的颜色和色素变化 ( 如改变头发或虹 膜的颜色 ), 包括荧光, 彩虹色, 磷光, 反射, 折射, 光致发光, 化学发光, 和 / 或生物发光 ( 如 荧光素酶和荧光素反应 )。另外, 应用本发明的方法和 / 或组合物的处理, 美容改善和维持 的好处至少包括以下中的一项 : 减少创伤后疤痕的形成 ; 改善激光后皮肤的重新修复, 提 高人对光敏药物如 ACCUTANE 的防护, 抗抑郁药, RETIN-A MICRO 等类似药物防护 ; 减 少光老化损伤 ; 在激光换肤 / 脉冲光治疗或任何利用光, 激光, 无线电波, 电磁, 超声波的类 似方法对皮肤细胞进行处理后期改善美观和加快愈合, 在磨皮手术, 化学换肤 ( 种类繁多 的化学换肤 ) 后期改善美观和愈合 ; 减少疤痕 ( 前摄和倒摄 ), 后期注射程序, 包括 BOTOX Restylane, Juviderm 和类似物。在一些实施例中, 尽管本方法和 / 或组合物可能应用于皮肤, 然而靶细胞也可以 为其他类型的细胞。例如, 指甲有关的细胞可能会被修饰, 以增加指甲和角质层的生长速 率, 减少开裂和损坏, 提高了长度和厚度, 降低垄起和剥落, 降低粗糙度和钝度, 和更好的着 色。 头发有关的细胞可能会被修饰, 以提高生长速度, 降低生长速度, 减少发梢分叉, 剥落和 断裂, 改善可处理性, 降低钝度, 改善光泽和光彩, 增加密度 ( 更厚 ), 降低密度 ( 更薄 ), 磨 蚀, 增加的长度和厚度, 提高柔软度。 上述任何一个美观改善可能会产生的第二个好处是增 加受者自信和提升受者心情。
因此, 在具体实施例中, 本发明提供了能在具有美容功能的细胞增加表达有提高 或维持功能的核酸或多肽的体内或体外方法。例如, 所述方法可能包括使用一种能编码至 少一个用于维持特定细胞具美容功能的核酸分子或多肽链的多聚核苷酸, 将其应用到至少 一部分能发挥美容功效的细胞中, 从而使上述核酸分子或多肽链在这些细胞中表达以提高 或 / 和维持对外貌产生积极效果的生物化学或 / 和生理过程。
在本发明的方法和组合物可能使用了能编码多种蛋白质的多种基因。 在本发明的 方法和组合物的具体实施例中, 所述多核苷酸构建体可能编码一个反义 RNA 或一个 siRNA, 以作为一种抑制所述蛋白表达的方法。例如, 某些特定生长因子减少表达可能使具有美容 功能的细胞或其周围细胞减少炎症。另外, 特定 MMP 蛋白减少表达可增加细胞的胶原含量。 在具体实施例中, 所述的 siRNA 可使能提高细胞美观的其他基因表达减少。 在一具体实施例中, 由所述转染的重组多核苷酸编码的所述核苷酸或多肽, 可能 包括角化细胞生长因子 ( 如, KFG-1 或 KFG-2), 和 / 或 KGF 受体和辅因子或它的一个片段。 可选地或另外地, 由所述转染的重组多核苷酸编码的所述核酸或多肽, 可能至少包括一种 转化生长因子 (TFG-α, TFG-β1-4, 其他已知的 TGF-β 蛋白 ) 和 / 或 TGF 受体和辅因子或 源自它它的一段片段中的之一。可选地或另外地, 由所述转染的重组多核苷酸编码的所述 核苷酸或多肽, 可能包括一种胰岛素样生长因子 ( 如 IGF-1, IGF-2) 或一段源自它的片段。 可选地或另外地, 由所述转染的重组多核苷酸编码的所述核苷酸或多肽, 可能包括至少一 种血小板源性生长因子 ( 如 DGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PDGF-CC) 或一段源自它的片段。
在其他实施例中, 由所述转染的重组多核苷酸编码的所述核苷酸或多肽, 可能包 括至少一项以下多肽或源自它的片段 : 血管内皮生长因子 ( 如 VEGF-A 或 VEGF-C), 肝细胞 生长因子, 成纤维细胞生长因子 (FGF-1, FGF-2, FGF-3, 或 FGF-22) ; 表皮生长因子 ( 如 EGF ; 肝素结合 EGF), 血小板衍化内皮细胞生长因子 (PD-ECGF) ; 结缔组织生长因子 ( 如 CTGF-1, 粒细胞 - 巨噬细胞集落刺激因子 (GMCSF), 单核细胞集落刺激因子 (MCSF), 粒 CTGF-2) ; 细胞集落刺激因子 (GCSF), 生长激素 (GH) ; 抗血管生成因子 ( 如 Ang-1, 如可溶性血小板 因子 -4, 血小板反应素如 TSP-1 和 TSP-2, 尿激酶型纤溶酶原激活物 / 受体拮抗剂, 如, uPA/uPAR, 血管抑素, 内皮抑素和钙网蛋白 ) ; 一种转录因子 Egr-1 的, 或缺氧诱导因子 (HIF-1-α)。本发明的方法和组合物使用的其他被编码的多肽或核酸包括一些具有合成, 降解, 修复和抗氧化保护的酶功能多肽, 包括一些具有结构功能包括细胞外基质蛋白的多 肽, 包括具有细胞粘附和通信功能的多肽, 所述表达的多肽的因子, 辅助因子, 受体, 和在皮 肤细胞内为非转染的基因组多核苷酸编码活性多肽的启动子。例如, 本发明的组合物和方 法中使用的多肽或核酸可能包括, 或编码 ( 或与编码序列互补 ) 源自以下的多肽或片段 : 神经营养因子 ( 如神经生长因子 (NGFs), 神经营养因子 -3(NT-3), NT-4 和脑源性神经营养
因子 (BDNF), 肿瘤坏死因子 (TNFs), 肝细胞生长因子 (HGFs), 干扰素 (INFs), 白细胞介素 (ILSs- 如 IL-1, IL-2, IL-6, IL-8 和 IL-10), 血管生成素, 分散因子 (SFs), 趋化因子 (CCs), 抑制素 (TGF-β 家族的一部分 ), 脂肪因子 ( 如瘦素, 白细胞介素 6(IL-6), 其他细胞因子, 脂联素, 补体成分, 脂肪酶, 纤溶酶原激活物抑制物 1(PAI-1), 肾素 - 血管紧张素系统 (RAS) 的蛋白质和其他 ), 骨形态发生蛋白 (BMPs)。
在其他一些实施例中, 所述多聚核苷酸 ( 或与编码序列互补 ) 可能编码 CCN 蛋 白家族多肽 ( 如富半胱氨酸的 (CYR61/CNN1), 一种结缔组织生长因子 CNN2, Nov, WISP-1, WISP-2, 和 WISP-3), 整合素 (6)β(1), 细胞表面的硫酸乙酰肝素蛋白多糖 (HSPGs), 粘着斑 激酶, 桩蛋白, 和 / 或 Rac, p42/p44MAPKs, 源自它的片段或生物活性物。或者, 也可使用这 些基因的 siRNA 或反义分子。
在其他实施例中, 多聚核苷酸可能编码 ( 或与编码序列互补 ) 至少以下一中多 肽 ( 或由其衍生具有生物学活性的或其片段 ) : 信号转导和 / 或转录激活物 (STATs), 甲状 腺激素 (TH), 促甲状腺激素 (TSH), 催乳素, 甲状旁腺激素 (PTH), 甲状旁腺激素相关蛋白 (PTHrP), 促甲状腺激素释放激素 (TRH), 神经肽 ( 如内啡肽 ) 他扎罗汀诱导基因 (TIGs), 细 胞维甲酸结合蛋白 (CRABPs), 原骨胶原, 胶原 ( 所有形式 ), 脯氨酸羟化酶和其他参与胶原 合成 ( 如羟赖氨酰半乳糖神经酰转移酶和半乳糖羟赖氨酰葡糖基转移酶 ), 修复 / 维持和降 解的酶, 弹性蛋白原, 弹性蛋白, 赖氨酰氧化酶和其他参与弹性蛋白合成, 修复 / 维持和降 解的酶, 原纤蛋白, fibulins 蛋白, 超氧化物歧化酶 ( 如 SOD 1, 2 和 3), 谷胱甘肽过氧化物 酶 (GSH-Px), 过氧化氢酶 (CAT), 过氧化还原酶 VI, 血红素氧酶 (HO), 巯基蛋白还原酶, 抗氧 化蛋白 2(Aop2) 金属硫蛋白 (MT), 谷胱甘肽 (GSH), 辅酶 ( 辅酶 Q), 钙联蛋白, 与角质细胞脱 屑有关的酶 ( 如组织蛋白酶, 比如组织蛋白酶 -D 和组织蛋白酶 -G 和转谷氨酰胺酶 ), 纤连 蛋白, 层粘连蛋白, 整合蛋白, 钙粘素, 凝集素细胞黏附分子 (LEC-CAMs), 水通道蛋白, 肌动 蛋白, 伞形蛋白, 兜甲蛋白, 聚角蛋白微丝, 角质 / 角蛋白, 桥粒蛋白, 斑蛋白, 旁血小板溶蛋 白, 膜联蛋白, 参与的合成, 修复 / 维持和降解细胞外基质, 细胞粘附和细胞通信 ( 如涉及层 粘连蛋白, 纤维连接蛋白和角蛋白合成酶 ), DNA 的合成, 修复 / 维持和降解酶 ( 如限制性内 切酶, 光解酶, 端粒酶, 和其他 (ERCC3, PCNA, RPA, XPA, p53, 所有这一切都是随着年龄下降 ; Goukassian 等, FASEB J., 2000, 14, 1325-1334 年 ) 和端粒 3-prime 突出序列 ( 寡聚 T), 应 激反应和伴侣蛋白及相关元件 / 激活物 / 因子 ( 如热休克蛋白 27, 热休克蛋白 47, 热休克蛋 白 60, 热休克蛋白 70, alphaB 结晶, Grp78, Grp94, 热休克转录因子和辅助因子 ( 如 HSF1, 2, 4) 产生的热休克元素 (HSE), 半胱氨酸串联蛋白 (csp), BAG-1, Hip, CHIP, Hop 和 Tpr-2), 涉 及合成, 修复 / 维持和降解神经酰胺和酰胺衍生物的酶 ( 如丝氨酸棕榈酰转移酶, B- 半乳糖 脑苷脂酶, 葡糖脑苷酯酶, 酸性 / 中性 / 碱性 SMASE( 鞘磷脂酶 ), 酸性神经鞘氨醇酶, SM 脱 酰酶, GC 脱酰酶, pSAP, 葡糖神经酰胺合酶, 神经酰胺合酶和鞘磷脂合成酶 ), 涉及合成, 修 复 / 维持和降解透明质酸的酶 ( 如透明质酸酶 / 透明质酸合成酶 1-3 和其他 ), 参与胆固醇 的合成, 修复 / 维持和降解的酶, 参与脂肪酸, 三酸甘油酯, 磷脂, 缩醛磷脂, 鞘脂, 类花生酸 ( 包括花生四烯酸级联, 前列腺素和白三烯 ) 的合成, 修复 / 维持和降解的酶, 维甲酸受体, 类固醇受体, 激素受体 ( 如雌激素受体 ), 甲状腺受体, 维生素 D 受体, 过氧化物酶体增殖物 激活受体 (PPARs 的 ), 金合欢醇激活受体 (FXR), 肝激活受体 (LXR), 基质金属蛋白酶 (MMPs 包括胶原酶 (MMP-1), 明胶酶 ( 例如, MMP-2 和 MMP-9), 弹性蛋白酶, 质溶解素, 丝氨酸蛋白酶和膜 - 型 MMPSs), 金属蛋白酶组的织抑制剂 (TIMPs)。
在其他实施例中, 所述多聚核苷酸可能编码 ( 或与编码序列互补 ) 一个多肽或能 编码以下物质至少一个片段的核酸 : 丝氨酸蛋白酶抑制剂 ( 如皮肤衍生抗白细胞蛋白酶 (SKALP), 也称为弹力素 ( 包括 preproelafin 和 proelafin) 和分泌的白细胞蛋白酶抑制 剂 (SLPI)), MSX( 同义词包括 CHOX-8 ; GHOX-8 ; HOMEOBOX PROTEIN MSX-2 ; HOX-8 ; HOX-8.1 ; HOX8 ; MSH HOMEO BOX HOMOLOG 2 ; MSX-1 ; MSX-2 ; MSX1 ; 和 QUOX-7), SMAD 通 路, Smad3, C-ski, 和细胞外信号调节激酶 1/2, 心脏重复蛋白, 雌激素 - 相应 B box 蛋白 (EBBP), 胰岛 素样生长因子结合蛋白 (IGFBPs), 玻联蛋白, 卵泡抑素。RAC1, ADAMTS1 蛋白酶, 神经元突 触前膜蛋白 -1, 转录因子 AP-1, cJun, cFos, β- 淀粉样蛋白前体蛋白 (sAPP), β- 连环蛋 白, CHL1, 促肾上腺皮质激素释放激素 (CRH), DJ-1, 固醇调节元件结合蛋白 ( 如 SREBP-1 和 SREBP-2), 磷脂酰肌醇 3- 激酶 (PI3K), 硬脂酰辅酶 A 脱氢酶 (SCD), 脂肪酸合成酶, 羟甲基 戊二酰 - 辅酶 A 合成酶 (HMGCS), CCAAT/ 增强子结合蛋白 α(C/EBPα), C/EBP δ, FAS, 硬 脂酰辅酶一个去饱和酶 -1(SCD-1), 涉及雌激素的合成 ( 如芳香化酶 ) 的酶, 成纤维细胞生 长因子同源因子 (FHF) 多肽, 核心蛋白聚糖, 基膜聚醣, 纤调蛋白 ( 和其他小富含亮氨酸重 复蛋白聚糖 ), 多功能蛋白聚糖, 双糖链蛋白多糖, 蛋白聚糖, 短缩素, 半乳凝素 ( 如半乳糖 凝集素 -3 与半乳糖凝集素 -7), 硫酸肝素, 串珠素, 多配体聚糖 -1, 硫酸软骨素, JUN-- 调节 因素 ( 如多效蛋白 (PTN) 和基质细胞衍生因子 1(SDF-1)), CXCR4(SDF-1 受体 ), 抗凋亡蛋白 ( 如 Bcl2 和生存素 ), 转录因子核因子 (NF)-κB, 一氧化氮合酶, 参与儿茶酚胺的合成和降 解的酶, 丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK), 转录因子 NF-E2 相关因子 ( 如 Nrf2 和 Nrf3), P21 活化 蛋白激酶 4(PAK4), 参与合成溶血神经鞘氨脂 (SPC) 的酶, 脂酶, 脂质动员肽 ( 如 β- 促脂解 素和 “解脂肽 A 和肽 B” ), 双调蛋白, 酪氨酸酶和其他参与黑色素, 真黑素和褐黑素合成和降 解的酶, 黑素肾上腺皮质激素 ( 垂体肽类激素, 包括促肾上腺皮质激素 (ACTH) 和 α, β和 γ 黑色素细胞刺激激素 (MSH), 激素原, 阿黑皮素原, A- 促黑激素, 促肾上腺皮质激素, 内皮 素 1, 环磷酸腺苷, PKCb, bey1, bey2, bey3, 人黑素肾上腺皮质激素 -1 受体 (MC1R), OCA1( 酪 氨酸酶, TYR), OCA2(OCA2), OCA3( 酪氨酸酶相关蛋白 1, TYRP1), 和 OCA4( 膜相关转运蛋白, MATP), c-Jun N- 末端激酶激酶激酶 (JNKKK 多肽如 MLK4, PAK4, PAK5 和 YSK2), HiF1-α 调控基因 ( 如 BNIP3, 缺氧诱导基因 1, 腺苷酸激酶 4, 半乳糖激酶, 乳糖凝集素 -3, 凝溶胶 蛋白, RhoA, Rho 激酶, 异构核核糖核蛋白 H1 和剪接因子和 REV3), α-SMA, S1-P, GRO-α/ CXCR-1, erbB, 激活肝细胞生长因子 (HGFA), 角质细胞富含脯氨酸的蛋白 (KPRP), 神经递质 和神经递质阻滞剂 ( 如 GABA(γ- 氨基丁酸 )), 乙酰胆碱受体阻滞剂, 蛇毒 Waglerin1 和箭 毒 Curare。
在其他实施例中, 本发明发放和或组合物所述多聚核苷酸可能编码 ( 或与编码序 列互补 ) 至少一个以下多肽 ( 或源自它的片段 ) : α1- 抗胰蛋白酶 ( 一个不可逆转的中性粒 细胞弹性蛋白酶抑制剂, 可改善静脉曲张的静脉强度 ), 在某些实施例中, 其可能与 MMP-2 抑制联合 (MMP-2 在静脉曲张组织中含量高 ), 激素敏感脂肪酶 (HSL), 蛋白激酶 A( 激活 HSL), 甘油三酯脂酶 (ATGL), CGI-58( 最近发现的 ATGL 的辅激活因子, 其促进野生型和 HSL 缺陷型 WAT 的 TG 水解酶活性, 但在 ATGL- 缺陷型 WAT 中并不如此, 表明 ATGL 是的 CGI-58 介 导的激活脂肪分解的唯一目标 ; 同时, 目前在小鼠 WAT 中, ATGL 和 HSL 负责超过 95%的 TG 水解酶的活性 )。此外已知的脂肪酶, 心房利钠肽, 胰蛋白酶, α- 糜蛋白酶, 抗感染和痤疮皮肤抗菌肽 ( 如 SLPI, 溶菌酶和防御素 ), 上游转录因子 -1(USF-1), δNp63α, Sirt1, 血管 紧张素 (ANG) Ⅱ 1 型 (AT1) 和 2 型 (AT2) 受体, 血管紧张素Ⅱ, SHP-1(Src 同源 2 含蛋白质 酪氨酸磷酸酶 -1), 和 / 或前列环素合酶 (PGIS) 可能由本发明的反义构建体所编码或为目 标。
另外, 本发明中的基因构建体可能包括一个多核苷酸 ( 或它的片段 ), 其能编码 ( 或与编码序列互补 ) 至少一个以下参与美化或维持容貌的多肽 ( 或它的片段 ) : 肌动 蛋白, 原骨胶原, 或胶原片段 ( 如 KTTKS, 多聚赖氨酸多肽 ), 弹性蛋白原或弹性蛋白片段, TM 层粘连蛋白片段, 纤维连接蛋白片段, Matrixyl (Pal-KTTKS), Matrixyl 3000TM(Pal-GHK 和 Pal-GQPR), RonaCare ASCIIITM, CPC PeptideTM, CollaxylTM, Peptide Vinci 01TM, ALDENINETM, AmelioxTM( 肌肽二胎 ), ANTARCTICINETM, BIOPEPTIDE CLTM, BioPeptide-ELTM, Kappa ElastinTM, SYN -COLL, 血 小 板 反 应 蛋 白 T SP-1 片 段, MYOXINOLTM, DERMAXYLTM, copper peptides(GHK-Cu), CYTOKINOL LS 9028, Peptamide 6TM, RIGINTM, KOLLAREN ( 肝细胞生长因子 (HGF) 活性片段 ), EyelissTM, HaloxylTM, Dipeptide 2, Dermican(TSH 片 段 ), 和众多大豆衍生的多肽和如 CFTA 的化妆品成分 INCI 数据库中所列的。 另外, 可以放松 TM 肌肉的局部应用的多肽包括 SYN -AKE(Waglerin 1 模仿物 ), VIALOX (Curare 模仿物 ), TM TM TM ARGIRELINE ( 乙酰基六肽 -3), Leuphasyl , 和 SNAP-8 ( 同 SNAP-25)。另外, 皮肤中的活 性多肽详见美国专利 6586185。
在其他实施例中, 所述多聚核苷酸可能编码用以降低, 减慢和 / 或延迟具有美容 功能细胞衰老的核酸和 / 或多肽, 例如美国专利 No.6,953,664, 以提高或 / 和维持对外貌产 生积极效果的生物化学或 / 和生理过程。
在其他实施例中, 所述多聚核苷酸可能编码一个对应于具美容功能的细胞中某蛋 白的抗体, 以提高或 / 和维持对外貌产生积极效果的生物化学或 / 和生理过程。
多肽的组合
另外, 在一些具体实施例中, 由本发明的构建体提供的多聚核苷酸包括一个编 码两个或更多的多肽或核酸组合的多聚核苷酸。例如, 在伤口愈合中, 相对于个别地应 用生长因子, 特定的生长因子组合可显示协同的改善作用 ( 见如, Lynch, 1999 ; J.Clin. Invest., 84 : 640-646 ; Jeschke 等, 2004, Gene Therapy 11 : 847-855 ; Sprugel 等, Wound Repair Regen., 2004, 12 : 67-79 ; Endocrine Reviews, 2002 ; 24 : 737-767 ; Nabarro, J.D., 1987, Clin.Endocrinol., 26 : 481-512 ; Ristow 等, 1988, J.Cell Physiol., 137 : 277-284 ; O’ Keefe 等, 1988 , J.Invest.Dermatol. , 90 : 2-7 ; Cook 等, J.Cell Physiol. , 146 : 277-189)。 可选地, 构建体可被操作以使所述多肽以 1 ∶ 1 比例表达。 或对于所述各种多肽 可用其他比例 ( 如 2 ∶ 1, 3 ∶ 1, 4 ∶ 1, 5 ∶ 1, 10 ∶ 1, 20 ∶ 1, 50 ∶ 1, 100 ∶ 1, 500 ∶ 1, 或 1000 ∶ 1)。
例如, 在一个具体实施例中, 一个组合包含 PGDF 和 IGF。 PGDF 可能包括已知的 PDGF 亚型中的任何一个。同样, IGF 可包括其任何一个已知的亚型。构建体可能被操作, 以使 所述多肽以 1 ∶ 1 的比例表达。或者, 可对于所述各蛋白使用其他比例 ( 如 2 ∶ 1, 3 ∶ 1, 4 ∶ 1, 5 ∶ 1, 10 ∶ 1, 20 ∶ 1, 50 ∶ 1, 100 ∶ 1, 500 ∶ 1 或 1000 ∶ 1)。在一个实施例中, 构建体被操作, 结果 PDGF-BB 和 IGF-1 以 2 ∶ 1( 重量比 ) 表达。或其他 PDGF 和 / 或 IGF 和 / 或其他比例组合也可使用。同样, 可使用一个 PDGF 和 TGF-α 组合。或者, 可使用 HGF和 IGF 组合。在其他实施例中, 可使用 PDGF 和一个碱性 FGF 组合, 或可使用 HGF 和碱性 FGF 组合。在又一实施例中个, 可使用 GH 和 IGF-1 或 IGF-II 组合。
在一些特定实施例中, 所述构建体或多种构建体可能编码两个以上蛋白。 例如, 在 一些实施例中, PDGF 和其他一些生长因子的组合可被使用。在一个实施例中, PDGF 与 KGF, IGF 和 IGFBP 的组合可被使用。或者, 这些生长因子的次级组合可被使用。
清除降解的胶原和 / 或其他碎片
在其他一些实施例中, 本发明的多核苷酸构建体可编码能帮助清除降解的生物大 分子以维持和 / 或提高完整生物大分子合成的蛋白质, 这些生物大分子对提高或 / 和维持 对外貌产生积极效果的生物化学或 / 和生理过程有重要作用。例如, 在一个实施例中, 所述 构建体编码 MMP-2 和 / 或 MMP-9 以清除来自 MMP-1 的胶原碎片。所述构建体使用完后, 可 使用能形成新胶原的构建体。在一些特定实施例中, 这些构建体可编码生长因子, 胶原和 / 或 TIMP-1。
受体
另外地, 在一些特定实施例中, 本发明的构建体所提供的多核苷酸可能包括一个 编码一个受体或受体组合 ( 如 KGF 受体, TGF 受体, FGF 受体如 FGFRiiib, 等 ) 的多核苷酸, 其作用物为具美容功能细胞中的多肽, 生长因子和其他能提高或 / 和维持对外貌产生积极 效果的生物化学或 / 和生理过程的生物大分子 ( 如如必须的辅因子或转录因子 )。
表达的性质
本发明中的构建体可被导入一个或多个类型的具美容功能的哺乳动物细胞中, 例 如, 转染未分化的 “干” 或 “基础” 的皮肤细胞, 于不同阶段的正在分化的皮肤细胞, 最后已分 化的皮肤细胞。 在一个实施例中, 此技术可以将核酸稳定转移进细胞基因组, 因此所述核酸 或多肽可被细胞长期表达。 所述能编码至少一个核酸或多肽多核苷酸以维持具有美容功能 的细胞, 从而能提高或 / 和维持对外貌产生积极效果的生物化学或 / 和生理过程的多核苷 酸, 一旦被纳入一个干细胞的基因组, 它便可遗传和在细胞后代中表达, 如来源于未分化的 “干” 或 “基础” 细胞的角质细胞或纤维母细胞。例如, 可能会使用一个综合载体 ( 如如逆转 录病毒, AAV, “睡美人” 转座子, 或细菌噬菌体整合酶, 如 ΦC31, 或类似物, 因此, 靶细胞可以 是任何具美容功能的细胞。
在其他实施例中, 所述技术可使核酸瞬时转化到具有美容功能的细胞的, 使核酸 或多肽可由细胞瞬时表达。 可选地, 这样的表达可能持续数秒, 数分钟, 数小时, 数天, 数周, 数月或数年。
在其他实施例中, 表达瞬态是由于所述细胞的生物学特性。 以皮肤细胞为例, 据终 端分化, 细胞更新可能会导致被改造细胞的减少, 例如正在分化的角化细胞向上移向表皮 的外围以形成鳞状细胞并最终因脱皮而消失。或者, 干细胞可能被修饰, 但能提高或 / 和维 持对外貌产生积极效果的生物化学或 / 和生理过程的多核苷酸可能直到细胞分化阶段才 表达。 因此, 虽然干细胞系中存在基因修饰, 核酸或多肽的表达可能取决于子代细胞的发育 阶段, 从而使修饰的瞬态取决于分化阶段 ( 即, 要么局限于干细胞阶段, 要么是分化的细胞 阶段 )。
在某些实施例中, 表达的核酸和 / 或多肽可能在具美容功能的干细胞, 分化细胞 和已分化细胞任意组合之间发挥旁分泌和 / 或自分泌的作用。例如, 转染的表皮成纤维细胞干细胞可能表达和分泌生长因子 ( 如角质细胞生长因子 (KGF)), 其对正在分化的表皮角 质细胞具有自分泌的效果。另一例, 所表达的核酸和 / 或多肽被用于将通常的旁分泌功能 转变为自分泌功能。例如, 皮肤成纤维细胞通常表达和分泌角质细胞生长因子 (KGF), 随后 扩散到表皮角质细胞发挥旁分泌的效果。然而, 能编码 KGF 的构建体转染表皮角质细胞后, 随后的表达和分泌的 KGF 改变为自分泌功能而不是 KGF 的旁分泌功能。
给予的位点
所述构建体被导入受者一个或多个部位, 从而能提高或 / 和维持对外貌产生积极 效果的生物化学或 / 和生理过程。被实施的部可能包括前额, 头皮, 毛囊, 上眼睑, 下眼睑, 眉毛, 睫毛, 眼眶下和眼周区 ( 包括典型的 “鱼尾纹” 区 ), 鬓角, 鼻, 鼻梁, 面颊, 舌, 鼻唇沟, 嘴唇和 periobicular 包括 “下颌” 区, 下颌线, 耳朵, 颈部, 胸部, 三头肌下, 手背, 背部, 腹 部, 两侧, 臀部, 大腿前和背部, 膝盖和其他受者具美容功能的细胞。在一个实施例中, 所述 构建体被注射进血液, 例如通过受体介导输送系统或组织特异性调控序列 ( 如启动子和 / 或信号序列 ), 表达的目的多肽作用于特定的具有美容功能的细胞受体。
名人基因
在某些实施例中, 本发明的构建体序列, 可以从 “名人” 和公众人物如著名的男演 员, 女演员, 音乐家, 画家, 作家, 政治家, 皇室成员, 运动员, 商界领袖, 部长, 社会活动家, 科 学家, 英雄人物, 及其他类似人物, 无论生者或死者任何可用的 DNA 来源, 或来自于上述 “名 人” 的家族直系血亲 ( 例如, 著名歌手的女儿 )。在其他实施例中, 本发明所述构建体的序 列可来自普遍多态性 : 来自总哺乳动物种群, 来自一个没有接受该美容修饰 ( 如将妻子的 构建体拷贝应用于丈夫, 反之亦然 ) 的哺乳动物, 从相同皮肤区域或更优的皮肤区域自体 移植到修饰区域, 被转染哺乳动物的直系血亲 ( 如将孩子的构建体拷贝应用于父母 ), 被转 染哺乳动物的配偶或同伴 ; 其他国民或 “种族” (如; 来自法国人男性的构建体拷贝转染的 美国人男性 ) ; 异性 ( 妇女可能希望得到来自于著名男演员的构建体 ) ; 或任何非哺乳动物 来源 ( 如藻类, 酵母, 真菌, 病毒, 植物, 鱼类和昆虫 ) 构造的序列 ) 的构建体序列
分子构建体
在某些实施例中, 本发明的构建体可通过本领域公知的技术提高导入和随后表 达, 包括利用基因构建体改造包括修饰内核苷酸 (internucleotides), 目标表达载体 ( 如 角质形成细胞和成纤维细胞的干细胞 ), 核靶, 使用细胞特定的, 或改良的调控启动子和其 他元件 ( 如增强子 ). 本发明的构建体可能包含其他的元件以提高参与增加或 / 和维持具 有美容功能细胞的多核苷酸和多肽的表达和 / 或适当的功能。
因此, 在一些实施例中, 所述构建体可能包括组成型的或可诱导的启动子, 其可操 作地连接到能表达多核苷酸或多肽的特定核酸上, 而所述多核苷酸或多肽能维持具有美容 功能的细胞, 从而提高或 / 和维持对外貌产生积极效果的生物化学或 / 和生理过程。
在其他实施例中, 所述构建体可能包括增强子, 其可操作地连接到多核苷酸或多 肽上, 而所述多核苷酸或多肽能维持具有美容功能的细胞, 从而提高或 / 和维持对外貌产 生积极效果的生物化学或 / 和生理过程。
另外地或可选地, 所述构建体可能包括切割位点序列, 内含子序列, 帽位点, 或功 能 polyA 元件, 其可操作地连接到多核苷酸或多肽上, 而所述多核苷酸或多肽能维持具有 美容功能的细胞, 从而提高或 / 和维持对外貌产生积极效果的生物化学或 / 和生理过程。给予方法
本发明采用本领域公知的技术, 将构建体应用于具有美容功能的细胞。在受体细 胞的必须的发育和生理功能未被破坏的前提下, 多种已知最先进的基因导入细胞技术被相 应地应用于本发明中。
基因转化具有美容功能的细胞的方法可能包括脂质递送系统, 如脂质体或双相囊 泡。此外, 还使用乳剂渗透具有美容功能的细胞, 如阳离子纳米粒子, 醇 / 碳氟微乳液, 或油 / 水和水 / 油型纳米乳液。
或者, 可用多联体。多联体, 在体外试验中, 用 T4 连接酶处理成熟 DNA 能够增强转 染效率, 如同一次转染实验并不能转入一个以上的分子一样, 转染通常只能转入较小的分 子, 这可能是因为转染分子的尾部结构起了重要作用。
在其他实施例中, 可使用粒子介导的转化。 在具体实施例中, 可用电磁辐射提高构 建体进入具有美容功能的细胞的能力。所述方法可能包含利用无线电频率形成微通道, 电 穿孔, 离子电渗, 或使用电整合 (electroincorporation)。 该操作可能还应用了物理导入方 法例如显微注射无修饰的 DNA。所述技术使参与维持或修复皮肤的多核苷酸或多肽瞬态表 达。
或, 可使用长时效基因表达技术。 例如, 可使用含目的核酸序列的病毒或噬菌体转 染的分子技术。同时, 其他技术如如细胞融合, 染色体介导的基因转移, 微细胞介导的基因 转移, 原生质球融合, 或转座子都包含在本发明的方法和组合物中。按已知的最先进技术, 化学和物理的渗透促进剂 ( 如, 加热, 前处理微晶换肤, 吸留 ) 及任何包含于本发明的方法 和组合物可被使用。
因此, 本发明的实施例承认了基因修饰具美容功能的细胞的潜力, 其可作为改善 受体美观的方法。基因修饰具美容功能的细胞提供了瞬态或长效改造细胞的方法。
可用于调整皮肤维持和 / 或美容外观的基因
令人不悦的容貌改变, 如皮肤下垂, 变薄, 起皱通常是由于皮肤蛋白如胶原, 弹性 蛋白, 或其他细胞外基质蛋白和蛋白聚糖的表达大量且稳定减少所致。 因此, 取代这些蛋白 质或阻止这些蛋白质的减少, 成为一个潜在的有效的策略, 以维持或改善皮肤的外观和健 康。本文所述的例子描述了五个重组载体构建体的设计, 所述构建体编码的蛋白旨在提高 细胞外基质的稳定和支持改善的皮肤外观。这些蛋白质为胶原, 弹性蛋白, EC-SOD, TIMP-1 和角质细胞生长因子 ( 例如, KGF-1)。以下详细讨论这些蛋白质对皮肤生理的作用。
其他蛋白质和 / 或多肽也可以使用本发明的方法和组合物。例如, 皮肤细胞表达 各种可能对组织的修复和维护有重要作用的不同的蛋白质和其他因子。因此, 角质细胞产 生白细胞介素 (IL-1-α, IL-1-β, IL-1ra 的, IL-3, IL-6, IL-8, IL-10 和 IL-18), 粒细胞 集落刺激因子 (G-CSF), 单核细胞集落刺激因子 (M-CSF 的 ), 粒 / 单核细胞集落刺激因子 (GM-CSF), 转化生长因子 (TGF-α 和 TGF-β), 血小板衍生生长因子 (PDGF), 肝细胞生长因 子 (HGF), 血管内皮生长因子 (VEGF), 肿瘤坏死因子 (TNF-α), 干扰素 ( 例如, INF-α, β和 γ), 胰岛素样生长因子 (IGF-1), 和成纤维细胞生长因子 ( 碱性 FGF, FGF-22)。 此外, 成纤维 细胞产生角质细胞生长因子 (KGF-1, KGF-2), TGF-β-1, TGF-β-2 和 TGF-β-3, 结缔组织生 长因子 (CTGF), FGF-2( 碱性 ), PDGF-A, IGF-1, 血管内皮生长因子, 肝细胞生长因子 (HGF), IL-6, IL-8, TNF-α 和 GM-CSF, G-CSF, FGF-22, 和 IGF-1。在另一个实施例中, 目的核苷酸是HIF-1-α 转录因子。此外, EGR-1 转录因子多肽, 或其一个生物活性片段, 或核苷酸编码的 类似多肽, 已有报道可用于治疗伤口 ( 美国专利号 6689758)。因此, 这些多肽, 或其衍生的 功能物, 在本发明的方法和 / 或组合物的实施例中可用单独或组合使用。
胶原
在一个实施例中, 所述参与保养具有美容功能的细胞而提高或 / 和维持对外貌产 生积极效果的生物化学或 / 和生理过程的多肽, 可能是一个胶原多肽或其功能衍生物。胶 原是构成人体的组织细胞外基质的主要纤维蛋白。I 型胶原是人体皮肤的主要细胞外基质 (ECM) 组分, 是由两个 α-1 和 1 个 α-2 链组成的三股螺旋结构 (Myllyharju 和 Kivirikko, 2001, Ann.Med., 33 : 7-21)。 这种原骨胶原链是由皮肤的成纤维细胞和身体其他组织的合成 的。一旦合成, 原骨胶原链裂解, 以便聚集和形成较大的胶原纤维以组成 ECM 的关键组分。 骨原胶原纤维退化或产量不足可导致减少 EMC 结构完整性和导致如皮肤等上覆组织的物 理变化。
胶原的丧失或退化是正常老化的一部分, 但它也是光损伤皮肤中观察到的主 要 变 化 之 一 (Lavker, 1995, Cutaneous Aging : chronologic versus photoaging, In Photoaging, Ed., Gilchrest, B.A., Cambridge MA, Blackwell Science, pp.123-135 ; Fligiel 等, 2003, J.Invest.Dermatol., 120 : 842-848 ; Varani 等, 2001, Am.J.Pathol., 158 : 931-942).。 据报道, 变老的, 防晒的皮肤 (Varani 等, 2000, J.Invest.Dermatol., 114 : 480-486) 和光损伤皮肤 (Griffiths 等, 1993, N.Engl.J.Med., 329 : 530-535) 其原蛋白的 合成持续下调。 一些机制表明, 正常年龄的胶原损失和由光损伤引起的胶原损失, 与基质金 属蛋白酶 (MMPs) 的增加和皮肤成纤维细胞数量的减少有关 ( 如 Fisher 等, 1996, Nature, 379 : 335-338 ; Fisher 等, 1997, N.Eng.J.Med., 337 : 1419-1428 ; Millis 等, 1992, Exp.Cell Res., 201 : 373-379 ; Burke 等, 1994, Exp.Gerontol., 29 : 37-53 ; Varani 等, 2000)。另一种 与胶原减少至少部分相关的机制是, 与年龄有关的皮肤成纤维细胞的胶原合成减少。 因此, 已证明, 老化皮肤的 I 型胶原的数量比年轻的成纤维细胞所合成的 I 型胶原数量低 (Varani 等, 2006)。在这项研究中, 在 I 型胶原的合成和含量的减少是与胶原束空间较大及成纤维 细胞和胶原纤丝之间的接触较少有关, 这表明纤维母细胞机械张力减少。 此前的研究表明, 机械张力降低时, 胶原的生产可能会下降, 基质 MMPs 的生产可能会增加 (Lambert 等, 1992, Lab.Invest.66 : 444-451 ; Delvoye 等, 1991, J.Invest.Dermatol., 97 : 898-902)。因此, 与 年龄有关的成纤维细胞胶原的合成减少可能会导致在 ECM 减少机械张力, 从而进一步降低 胶原的生产 (Varani 等, 2006)。通过对皮肤补充 I 型原骨胶原基因拷贝, 胶原产量可能会 提高, 可提供增加在 ECM 机械张力的潜力, 从而随后可使现有的成纤维细胞提高胶原产量。
弹性蛋白
在一个实施例中, 所述参与保养具有美容功能的细胞而提高或 / 和维持对外貌产 生积极效果的生物化学或 / 和生理过程的多肽, 可能是一个弹性蛋白多肽或其功能衍生 物。弹性蛋白是 ECM 另一个极为重要的组成部分, 提供皮肤弹力和恢复力 ( 综述 : Mithieux 和 Weiss, 2005, Adv.Protein Chem., 70 : 437-461)。弹性蛋白合成需通过其前体分子弹性 蛋白原的合成和赖氨酰氧化酶介导的交联。弹性蛋白是一个持久的分子, 其构成 90%的弹 性纤维和构成皮肤干重的 2-5%。弹性蛋白和弹性纤维的形成主要发生在胎儿发育和出生 后不久。除了损伤反应, 成年期弹性蛋白基本不合成。虽然弹性蛋白的主要功能是提供组织弹性, 但弹性蛋白 - 层粘连蛋白受体 (ELR) 已报道参与的皮肤成纤维细胞增殖 (Groult 等, 1991, Cell Biochem.Funct., 9: 171-182)。 正常老化一直伴随着弹性纤维的退化和丧失 (Braverman 等, 1982, J.Invest.Dermatol., 78 : 434-443 ; Ashcroft 等, 1997a, J.Pathol., 183 : 80-89)。据报道之间的 30 个人 -50 岁, 形成囊肿和陷窝是主要的异常 (Braverman 等, 1982)。在 50-70 岁个体中能观察到多孔纤维的形成, 但在 70 岁以上的人则更加频繁。同 样, 有研究表明, 年长者的防晒部位皮肤下表皮部区域有破碎的弹性蛋白纤维, , 在下表皮 层以下也有破碎的弹性纤维片段 (Ashcroft 等, 1997a)。更多最近的研究已经证实, 随着年 龄的增长皮肤弹性蛋白含量减少。据报道, 防晒皮肤的弹性蛋白染色密度从生命的第十年 的 49 %下降到第九十年的 30 % (El-Domyati 等, 2002, Exp.Dermatol., 11 : 398-405)。同 样, 据报道, 臀部皮肤 ( 防晒的 ) 弹性蛋白的含量在 20 岁至 80 岁间减少 51% (Seite 等, 2006, J.Eur.Acad.Dermatol.Venereol., 20 : 980-987)。有趣的是, 这些作者还报道, 虽然 面部皮肤 ( 严重太阳暴露 ) 的弹性蛋白的含量在 50 至 70 岁之间减少 44%, 但在前臂皮肤 ( 中等强度太阳暴露 ) 却没有观察到弹性蛋白含量的变化。这种随着年龄而增加的皮肤弹 性蛋白损失是与皮肤的弹性和恢复力降低相关的主要因素之一, 会导致皱纹和下垂。提供 弹性蛋白基因的外源性拷贝可能会增加新的弹性蛋白的生产, 并有助于抵消正常的随年龄 减少的弹性蛋白损失。这反过来又可以帮助改善皮肤的外观。
金属蛋白酶 -1 组织抑制剂 (TIMP-1)
在一个实施例中, 所述参与保养具有美容功能的细胞而提高或 / 和维持对外貌产 生积极效果的生物化学或 / 和生理过程的多肽, 可能是金属蛋白酶 -1 组织抑制剂 (TIMP-1) 或其功能衍生物。基质金属蛋白酶 (MMPs) 是一组酶 ( 胶原酶, 明胶酶和质溶解素 ), 参与 消化和重组的 ECM(Woessner, 1994, Ann.NY Acad.Sci., 732 : 11-30), 且在皮肤中大量存在 ( 综述 Kahari 和 Saarialho-Kere, 1997, Exp.Dermatol., 6: 199-214)。 MMP 活性由金属蛋白 酶组织抑制剂 (TIMPs) 调节 (Birkedal 等, 1993, Crit.Rev.Oral Biol.Med., 4: 197-250)。 ECM 的整体更新率是由组织中 MMP 和 TIMP 的比例起作用。
在正常的慢性老化期间, MMP 水平, 尤其是 MMP-1 水平, 在皮肤中增多 (Ashcroft 等, 1997b, Cell Tissue Res., 290 : 581-591 ; Varani 等, 2000)。光老化过程也能观察到皮 肤 MMP 相类似的增多。使用紫外线 (UV) 诱导的皮肤光老化模型证明, MMP-1 可能是主要负 责在皮肤胶原降解的酶 (Brennnan 等, 2003, Photochem.Photobiol., 78 : 43-48)。 与增加的 MMP 含量相比, 随着正常年龄增长, 皮肤 TIMP-1 水平可能会降低。随年龄增长, 这种 MMP 水 平不断提高和 TIMP-1 水平的下降的组合, 可导致皮肤的胶原含量的整体下降。随着胶原的 减少和随后支持它的 ECM 的减少, 皮肤显示出典型的外在老化特征包括细纹和皱纹的出现 和坚固度的降低。最近的研究报告, 各种 MMP 抑制剂可减少面部皮肤皱纹和支持胶原的生 产 (McDaniel 等, 2005, J.Cosmetic Derm., 4: 167-173 ; Moon 等, 2006, Phytomedicine 13 : 707-711 ; Park 等, 2006, Photochem Photobiol., 82 : 574-578)。 作为以上数据的结论, 如可 抑制皮肤 MMP 的活性的 EquiStat(Engelhard) 和 ECM-Protect(Atrium Biotechnologies) 化妆品成分已成功在市场推广。
本发明的实施例可提高 TIMP-1 合成。通过提高 TIMP-1 产量, 皮肤能够减少内源 性 MMPs 对皮肤的影响在本发明的方法和或组合物的实施例中, 。当如上所述的胶原基因构 建体和 TIMP-1 基因构建体同时转染, 可以生成一个双管齐下的措施以改善皮肤的外观。一方面, 胶原基因构建体可加强胶原的生产以对皮肤的 ECM 提供额外支持, 而 MMP-1 构建体的 使用将能保护新的和现有的胶原免受因 MMP 活性而导致的降解。
细胞外超氧化物歧化酶 (SOD-3)
在一个实施例中, 所述参与保养具有美容功能的细胞而提高或 / 和维持对外 貌产生积极效果的生物化学或 / 和生理过程的多肽, 可能是一个细胞外超氧化物歧化 酶 (SOD-3) 或其功能衍生物。皮肤以及许多其他组织含有内源性抗氧化酶系统, 其包 含三个强有力的酶超氧化物歧化酶 (SOD), 谷胱甘肽过氧化物酶 (GPX) 和过氧化氢酶 (Steenvoorden 等, 1997, J.Photochem Photobiol B : Biology 41 : 1-10 ; Afaq 和 Mukhtar, 2001, J.Photochem Photobiol B : Biology, 63 : 61-69)。超氧化物歧化酶催化过氧化物转 化为低毒性的过氧化氢, 其随后被谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶催化为水和氧。
这些酶的变化已经在衰老和光老化中被报导。已经证实表皮中 SOD 和过氧化氢酶 的含量比真皮高, 而在年轻和衰老皮肤真皮中 GPX 的含量均比表皮高 (Rhie et al, 2001, J.Invest.Dermatol., 117 : 1212-1217)。 在天然的和光老化的皮肤中 SOD 或 GPX 的含量均没 有明显变化, 但是过氧化氢酶的含量在表皮中增加了、 在真皮中减少了 (Rhie 等, 2001)。与 此相反, 有报导称光老化会导致角质层中这三种抗氧化酶的大量减少以及表皮中 CuZn-SOD 的减少 (Sander 等, 2002, J.Invest.Dermatol., 118 : 618-625)。这种抗氧化酶活性的丧失 与光老化皮肤上层真皮中氧化蛋白的增加是一致的。
超氧化物歧化酶在皮肤中有三种存在形式 (Cu/Zn-SOD, Mn-SOD 和 EC-SOD)。最 近的研究表明 EC-SOD 可能在抗氧化和抗衰老方面有重要作用。细胞外 SOD mRNA 在真皮 和表皮中都存在, 尽管真皮中的含量要更高, 而 EC-SOD 蛋白在表皮和真皮中都高水平表达 (Choung 等, 2004, Exp.Dermatol, 13 : 691-699)。有研究表明暴露于 UVA 和 UVB 下 EC-SOD 的 mRNA 的表达会增加 (Choung 等, 2004)。其他人则检测了在正常和超氧情况下成纤维细 胞中抗氧化基因的表达 (Serra 等, 2003, J.Biol.Chem., 278 : 6824-6830)。在这些研究中, 超氧引起 EC-SOD 基因的表达, 特别在具有高抗氧化活性的成纤维细胞中。而且, EC-SOD 的表达与端粒酶的缩短成反比, 因此 EC-SOD 表达的增加可以减慢端粒酶的缩短, 使成纤维 细胞的复制生命周期延长 (Serra 等, 2003)。也有研究表明胞外 SOD 对 I 型胶原有直接的 保护作用。EC-SOD 可以通过 C 端的肝素结合区与 I 型胶原直接结合 (Petersen 等, 2004, J.Biol.Chem., 279 : 13705-13710)。另外, 这些科学家报导结合的 EC-SOD 可以阻止氧化造 成的 I 型胶原的断裂。除了潜在的皮肤保护作用, EC-SOD 也有抗炎症功效 (Ha 等, 2006, Biochem.Biophys.Res.Comm., 348 : 450-458), 可以减少化学因素诱导的肿瘤形成的可能性 (Kim 等, 2005, Oncol.Res., 15 : 333-341), 可以减缓胶原引起的关节炎的一些症状 (Iyama et al, 2001, Arthritis Rheum., 44 : 2160-2167 ; Ross 等, 2004, Arthritis Rheum., 50 : 3702-3711)。
外在局部给予 EC-SOD 基因可能与内源 EC-SOD mRNA 的过表达有相同效果, 如增 加 EC-SOD 的表达量、 增强细胞的抗氧化能力、 延长细胞寿命等。通过延长皮肤成纤维细胞 的寿命和增强其抗氧化活性, 这些细胞产生和维持对健康皮肤所必须的 ECM 的能力就会增 强。而且, EC-SOD 对胶原的直接保护作用可以保护皮肤的胶原免受与皮肤衰老和光老化有 关的氧化损伤。
KGF在一个实施例中, 维持具有美容功能的细胞从而增强和 / 或维持对皮肤外观有益 的生化或生理过程的多肽是角质化细胞生长因子 (KGF)。KGF-1( 或 FGF-7) 是一个肝素结 合生长因子, 可以促进上皮细胞的增殖、 迁移和形态发生 ( 例如参见, au dem Keller, Eur. J.Cell Biol., 2004, 11-12, 607-612)。KGF 也可以刺激胶原和 / 或弹性蛋白的产生, 这两 种蛋白对维持皮肤和其他有外在功能的组织的健康有重要作用。这个 26-28kDa 的蛋白 C 端的三分之二与 FGF 家族的 8 个蛋白的同源性是 30-45% (Rubin et al, Cell Biol.Int., 1995, 19, 399-411)。KGF 是由一系列的间叶细胞产生的, 上皮细胞不产生 KGF。上皮细胞会 表达高亲和力的 KGF 受体, FGFR1- Ⅲ b, 它是 KGF 结合的唯一的 FGF 受体 (Grazu-Bilska et al, 2003 ; Werner et al, Cytokin Growth Factor Rev., 1998, 9, 153-65)。KGF 可以与其他 生长因子共同作用。因此, KGF cDNA 的非病毒脂质体转移到伤口可以使 VEGF 和 IGF-1 的 表达增加 (Grazu-Bilska et al, 2003)。在一案例中, 可通过大量给予 KGF 来增加 IGF-1、 VEGF 和 PDGF 的表达。
KGF-2( 也叫 FGF-12) 与 KGF 有 57%的同源性, 与 KGF-1 有相似的伤口治愈功能。 另外, 已有报道指出 KGF 的切短突变——KGFdes1-23 可增强细胞的有丝分裂活性 (U.S.Patent No.5,677,278)。Repifermin 是 一 个 用 于 治 疗 慢 性 静 脉 郁 血 性 溃 疡 的 切 短 的 重 组 人 KGF-2(Robson et ah, Wound Repair Regen., 2001, 9, 347-52 ; Fricker, MoI.Med.Today, 1998, 4, 229)。另外, 最近的研究表明树突状 γ-δ 上皮 T 细胞 (DETCs) 可产生 FGF-7 和 FGF-12, 在伤口治愈中可促进角化细胞的增殖 (Baum 和 Arpey, Dematol.Surg., 2005, 31, 674-686 ; Born et ah, Nat.Med, 2002, 8, 560-1 ; Jaeson, Science, 2002, 296 : 747-9)。
例 如, 包 括 KGF-I、 KGF-2 及 其 类 似 物 的 多 核 苷 酸 载 体 已 经 在 美 国 专 利 (Nos.5,731, 170 ; 5,677,278 ; 5,814,605, ; 6,228,839 以 及 6,916,786) 中 被 描 述。 这 些 序列也许能够被应用于本发明的多核苷酸构建体, 还有被缩短了的序列比如 Kepivance (palifermin), 它不同于内源性的人 KGF, 因为它起始序列 N 端的 23 个氨基酸被删除了以增 强其稳定性。
IGF
在一个实施例中, 维持具有美容功能的细胞从而增强和 / 或维持对皮肤外观有益 的生化或生理过程的多肽是胰岛素样生长因子 (IGF)。 胰岛素样生长因子主要在肝脏产生, 但是通过自分泌机制也有可能在所有细胞中产生。IGF-I 和 IGF-2 可能参与了组织生长调 节、 发育和再生 ( 参考 Grazul-Bilska et ah, 2003)。IGF-I 和 PDGF 可能一起作用增强皮 肤伤口的愈合、 骨骼再生以及牙周伤口痊愈。例如, 通过脂质体转移非常少量的 IGF-1cDNA 能够提高具有烧伤伤口的大鼠的再上皮化速度 (Pierre et ah, J.Burn Care Rehab., 1997, 18, 287-91 ; Jeschke et ah, Gene Therapy, 1999, 6, 1015-1020)。IGF-I 能够和生长激素通 过协同方式相互作用 (Meyer et ah, J.Trauma, 1996, 41, 1008-12)。 在某些实施例中, IGF-I 也可能升高细胞的脂浓度。这将可能有利于增强组织的丰满度, 例如面部肌肤或者嘴唇。
TGF-β
在一个实施例中, 维持具有美容功能的细胞从而增强和 / 或维持对皮肤外观有益 的生化或生理过程的多肽是转化生长因子 (TGF-β)。TGF-β 由几种类型的细胞合成, 包括 血小板、 巨噬细胞、 淋巴细胞、 成纤维细胞、 骨细胞以及角质细胞。 TGF-β 在成纤维细胞中可 能刺激纤连蛋白和胶原的产生, 以及促进这些蛋白多聚体进入胞外基质中 (Servoid, Clin.Pod.Med.Surg., 1991, 8, 937-53)。TGF-β 的应用有利于伤口愈合 (Graham et al, J.Wound Care, 1998, 7, 536-40)。因此, TGF-β 可能参与了增强和调节皮肤组织的作用。
HBF-1
在一个实施例中, 维持具有美容功能的细胞从而增强和 / 或维持对皮肤外观有益 的生化或生理过程的多肽是一种缺氧诱导因子 (HIF-1)。HIF-1 是一种 DNA 结合蛋白, 它能 够激活具有 HIF-1 结合位点的基因的表达。能够被 HIF-1 激活的基因包括 VEGF、 红细胞生 成素以及糖酵解基因。HIF-1 由两个亚基组成, HIF-1-α 和 HIF-1-β。已经发现每一个亚 基的变体都可以被用来灭活 HIF-1, 即通过形成没有功能的 HIF-1 二聚体。因此, 在另一种 实施方案中, 参与维持细胞美容功能的核苷酸或者多肽就是能够编码 HIF-1-α、 HIF-1-β 以及它们的变体的多肽, 或者是包括 HIF-1 结合位点的核苷酸。这样的序列能够在美国专 利 (No.5,882,914) 中找到。
其他与皮肤功能相关的多肽
在一个实施例中, 维持具有美容功能的细胞从而增强和 / 或维持对皮肤外观有益 的生化或生理过程的多肽是表皮生长因子 (EGF)。 EGF 是一个 6KD 的分子, 与 TGF-α 有 30% 的氨基酸同源性。EGF 由血小板产生, 在伤口愈合过程中浓度很高。EGF 可以提高伤口上皮 化速率, 也可以通过阻止伤口过度收缩而减少伤疤的形成。EGF 可能与 KFG、 PDGF 以及其他 生长因子共同维持和 / 或修复皮肤组织。 在另外一个实施例中, 维持具有美容功能的细胞从而增强和 / 或维持对皮肤外观 有益的生化或生理过程的多肽可能是成纤维细胞生长因子家族成员 (FGF))。FGF 由几个相 关联的多肽组成, 包括酸性 FGF(aFGF 或者 FGF-I)、 碱性 FGF(bFGF 或 FGF-2)、 几个癌基因 (int-2, hst/K-FGF, FGF-5) 以及 KGF( 见上面讨论 )。在皮肤中 FGF-1、 FGF-2 以及 KGF 被认 为是最重要的成纤维生长因子。在其他实施例中, 也有可能用到 FGF-IO 和 / 或 FGF-22( 参 考 au dem Keller, Eur.J.Cell Biol., 2004, 11-12, 607-612)。FGFs 能够刺激血管生成, 以及与伤口愈合相关的许多细胞的增殖和 / 或迁移, 包括毛细血管内皮细胞、 血管内皮细 胞、 成纤维细胞、 角质细胞、 上皮细胞以及一些特别的细胞种类, 比如软骨细胞和成肌细 胞。FGF-2 还可以刺激胶原的合成, 上皮形成, 纤连蛋白以及蛋白多糖的合成 ( 参考例如, Grazu-Bilska, 2003)。
在另一个实施例中, 维持具有美容功能的细胞从而增强和 / 或维持对皮肤外观有 益的生化或生理过程的多肽是血小板源生长因子 ( 例如, PDGF AA, AB, BB, CC 及其他 )。 PDGF 是间充质来源细胞的强有力的有丝分裂原, 并且能够促进伤口愈合。PDGF 促进成纤维细胞 中胶原的产生, 从而有利于成纤维细胞的迁移以及改变伤口基质。 例如, 发现体内调节角质 细胞过表达血小板源生长因子 (PDGF) 能够促进伤口愈合 (Eming et al, Hum.Gene Ther., 1998, 9, 529-539)。
在另一个实施例中, 维持具有美容功能的细胞从而增强和 / 或维持对皮肤外观有 益的生化或生理过程的多肽是血管内皮生长因子 (VEGF)。VEGF 高度保守且与 PDGF 具有高 度的结构同源性。VEGF 是一种内皮细胞特异性的有丝分裂原和化学引诱物, 具有强有力的 体内血管生成活性 ( 参考 Grazu-Bilska, 2003), 这对于皮肤细胞维持和修复非常重要。
在 另 一 个 实 施 例 中, 维持具有美容功能的细胞从而增强和 / 或维持对皮 肤 外 观 有 益 的 生 化 或 生 理 过 程 的 多 肽 是 肝 细 胞 生 长 因 子 (HGF)( 参 考 Ono et al, J
SurgRes.2004Jul ; 120(1) : 47-55)。 HGF 具有许多生物学活性, 例如促有丝分裂、 单性生殖、 抗凋亡、 抗成纤维化以及形态发生。对内皮细胞而言它还具有血管生成和血管保护活性。
在另一个实施例中, 维持具有美容功能的细胞从而增强和 / 或维持对皮肤外观有 益的生化或生理过程的多肽至少包括结缔组织生长因子 (CTFG-I, CTFG-2)、 粒细胞巨噬细 胞集落刺激因子 (GMCSF)( 参考美国专利 No.6,689,351, 描述了用 GMCSF 治疗创伤 )、 巨噬 细胞集落刺激因子 (MCSF)、 生长激素 (GH) 中的一种。同时, 维持细胞的美容功能从而增 强和 / 或维持对皮肤外观有益的生化或生理过程的多肽可能包括抗血管生成多肽, 例如 TSP-I 或 TSP-2( 参考美国专利 No.6,712,617)。其他活跃在具有美容功能细胞中的多肽 和因子比如上面描述的, 可以查阅以引用全文的方式并入本文中的第 6,586,185 号美国专 利。
分子构建体及其制备方法
在各种实施例中, 目标基因通过重组 DNA 技术产生。一个重组 DNA 分子包括一个 多核苷酸序列, 这段多核苷酸序列编码至少一种维持具有美容功能的细胞从而增强和 / 或 维持对皮肤外观有益的生化或生理过程核苷酸或者多肽, 它能够利用本领域公知的常规基 因表达技术来操作和表达。通过这种方式, 能够大量产生具有合适的侧翼序列的目标多肽 或者多核苷酸。
本文中提到的这些方法和化合物中的每一种多核苷酸或者多肽包括生物活性衍 生物、 类似物和 / 或保留了全长多核苷酸或多肽具有的生物活性的片段。这些衍生物或者 类似物可能包括翻译后修饰的多肽或者磷酸化的多肽。或者, 通过化学合成具有修饰残基 的核苷酸分子而形成的多核苷酸类似物。 多肽类似物也可能利用常规的氨基酸替换、 删除、 添加或者位点突变的方式而产生。在一个实施例中, 可以通过删除参与了皮肤维持和 / 或 治疗的核苷酸的一段序列或者多肽的氨基酸残基就能得到一个目标基因片段, 正如本领域 技术人员所知。
一个多核苷酸序列编码至少一种维持具有美容功能的细胞从而增强和 / 或维持 对皮肤外观有益的生化或生理过程核苷酸或者多肽, 它能够在原核或者真核表达系统中进 行增殖和表达。 在另一个实施方案中细菌、 哺乳动物、 酵母以及昆虫细胞系均可以被用于重 组载体的增殖。
在一个实施例中, 一个多核苷酸序列编码至少一种维持具有美容功能的细胞从而 增强和 / 或维持对皮肤外观有益的生化或生理过程核苷酸或者多肽, 它能够进行融合蛋白 的表达, 即与另外一种维持具有美容功能的细胞的编码序列以正确的框架和方向联合。这 些融合蛋白用于增强维持具有美容功能的细胞的核苷酸和多肽的稳定性或者保证其正确 加工。或者, 维持具有美容功能的细胞从而增强和 / 或维持对皮肤外观有益的生化或生理 过程的核苷酸或者多肽能够与其他合适的意向用途的分子相连接。例如, 维持具有美容功 能的细胞从而增强和 / 或维持对皮肤外观有益的生化或生理过程的核苷酸或者多肽能够 与一种结合组分相连接从而变成一种被目标细胞认识的受体。
除非另有说明外, 本发明的实践应用中将会利用分子生物学、 微生物学、 重组 DNA 以及免疫学中的常规技术, 这些技术都被包括在本技术领域内。这些技术在文献中有详 细的解释, 包括 Sambrook, 等, Molecular Cloning : ALaboratory Manual 2nd ed.(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) ; DNA Cloning, Vol.I 和 II, D.N Glover ed.(IRLPress, 1985) ; B.Perbal, A Practical Guide To Molecular T/US2010/04205 ; Cloning, Wiley(1984) ; ; Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, J.H.Miller 和 M.P. Calos eds.(Cold Spring Harbor Laboratory, 1987) ; Methods In Enzymology, Vol.154 和 155, Wu 和 Grossman, eds., 和 Wu, ed., respectively(Academic Press, 1987).
重组构建体由维持具有美容功能的细胞从而增强和 / 或维持对皮肤外观有益的 生化或生理过程的核苷酸或者多肽组成, 能够利用公知的重组技术得到。 就此而言, 目标序 列通过正确的阅读框和方向可以可操纵地连接到一个或者多个合适载体的调节序列上。 因 此, 目标序列可以被插入, 例如, 插入到一个哺乳动物载体上在哺乳动物细胞中进行表达。
图 7 显示了本发明编号 20 的重组构建体。这个重组构建体由一个 DNA 分子组成, 它编码一个维持具有美容功能的细胞从而增强和 / 或维持对皮肤外观有益的生化或生理 过程蛋白或多肽 22。或者, 这个载体由一段多核苷酸组成 ( 例如反义 RNA 或者 siRNA), 它 能够用来调节维持具有美容功能的细胞从而增强和 / 或维持对皮肤外观有益的生化或生 理过程的多肽的表达。
在一个实施例中, 维持具有美容功能的细胞从而增强和 / 或维持对皮肤外观有 益的生化或生理过程的多肽的编码序列来源于一种互补 DNA(cDNA), 它由宿主细胞的胞内 RNA 逆转录而成, 能够用本文举例中描述的方式或者本领域中其他已知的方式表达目标基 因。
如图 7 所示, 在某些实施例中, 重组载体可能包含一段调节序列比如启动子 24( 或 ) 增强子 26。因此, 一段包含了在目标细胞中强有力的启动子 24 的常规序列可能通 过分子技术被连接到 cDNA 序列上。也可能用到其他的调节序列, 比如一个或者多个增强子 序列 26, 一个核糖体结合位点 28, 一个具有功能性剪接供体和受体位点序列的内含子, 一 段指导重组多肽 30 分泌的信号序列, 一段终止序列 32, 一个多腺苷酸化信号和 / 或多腺苷 酸化序列 34, 其他转录终止序列以及一段宿主基因组同源序列。 其他序列, 比如复制起始位 点能够被插入到载体中从而优化目标产品的表达。同时, 一个选择标记也有可能被包括在 载体上以便用来对转化的宿主细胞进行选择。
调节序列具有多种来源。例如, 它们中一个或者多个可能能够正常地与编码序列 相连结, 或者来源于宿主细胞的调节系统, 或者与宿主细胞的调节系统同源 ( 例如角质细 胞 )。同样地, 启动子可能来源于一个基因, 这个基因能够启动应答使具有美容功能的细胞 退化的化合物或者条件, 比如紫外线或者一些化学试剂。表达载体的各种组分能够直接连 结到一起, 或者由通过本领域中已知的限制性酶识别位点组成的连结体来连结。
任何能够使维持具有美容功能的细胞从而增强和 / 或维持对皮肤外观有益的生 化或生理过程的多肽编码序列表达的启动子都能够被用于本发明。例如, 能够应用于此的 哺乳动物启动子序列是一些哺乳动物病毒, 它们能够进行高表达且具有广泛的宿主范围。
启动子可以是那些能够在大部分哺乳动物中进行持续表达的启动子, 比如 PKG 启 动子。举例来说, 能够在真核细胞中持续表达的合适的调节元件是一些能够被 RNA 聚合酶 III 识别的启动子或者病毒启动子、 CMV 增强子、 CMV 启动子、 SV40 启动子或者 LTR 启动子, 如来自 MMTV( 小鼠乳腺瘤病毒, Lee et al, 1981, Nature, 214, 228-232) 和其他病毒的启 动子和激活序列, 例如来自 HBV, HCV, HSV, HPV, EBV, HTLV 或者 HIV。举例来说, 能够在真核 细胞中进行表达调节的调节元件是由四聚体组成的操纵子及其相应的阻遏物 (Gossen M.,等, 1994, Curr.Opin.Biotechnol., 5, 516-20)。
在一个实施例中, 目标基因的表达在组织特异性启动子控制下才发生。在另一个 实施例中, 组织特异性启动子可能包括皮肤特异性启动子, 比如人 K10 启动子 (Bailleul et al, 1990, Cell, 62, 697-708 ; Sawamura 等, J.Invest.Dermatol, 1999, 112 : 828-830), 人 K14 启动子 (Vassar et al, 1989, Proc.Natl.Acad.ScL USA, 86, 1563-67), 人套膜蛋白启动子 (Carroll 等, 1993, Proc.Natl, Acad.ScL, 90 : 10270-10274), 牛细胞角蛋白 IV 启动子, 或者 其他人角蛋白启动子 ( 例如, K1 和 K5)(Bryne 等, 1994, Development, 120 : 2369-2383)。
另一种方案中, 启动子可能是在细胞周期或者发育过程中特定时间启动的启动 子。 例如, 重组载体可能包括能够在真核细胞中进行组织特异性表达的调节元件, 例如启动 子或者来自启动子的激活序列, 或者一些只在某些细胞类型中表达蛋白的编码基因的增强 子。举例来说, 这些在真核生物细胞周期中特异性表达的调节元件是以下基因的启动子 : cdc25A, cdc25B, cdc25C, cyclin A, cyclin E, cdc2, E2F-1to E2F-5, B-myb or DHFR( 参 考美国专利 No.6,856,185 ; No.6,903,078 ; 以及 Zwicker J. 和 Muller R.5 1997, Trends Genet., 13, 3-6)。根据本发明, 细胞周期调节启动子仅限于增殖细胞中多肽或者核苷酸 的表达。在一个实施方案中, 一种叫做 FiRE 的元件能够使角质细胞在皮肤中特异性表达 (Jaakkola et al, 2000, Gen.Ther., 7, 1640-1647)。这种 FiRE 元件是一种 AP-1 驱动分子, FGF 诱导的 Syndecan-1 基因应答元件 (Jaakkola et al, 1998, FASEB J., 12, 959-9)。同样 的, 那些能够实现真核细胞中代谢特异性表达的元件是一些被低氧 ( 如 HIF-α)、 葡萄糖缺 乏、 磷酸浓度或者热休克调节的启动子。
在另一个实施例中, 一个增强子元件能够与启动子序列相连接 . 这样的增强子不 仅仅可以扩增基因, 还可以调节目标基因的表达。 在一个实施方案中, 增强子可以来源于通 常位于多肽编码基因 ( 例如胶原 ) 附近的一段序列, 这种多肽参与了维持或者作用于与美 容相关的细胞。 被应用于哺乳动物表达系统中合适的增强子元件是, 例如, 来源于具有广泛 宿主范围的病毒增强子, 如 SV4 早期基因增强子, 来源于劳斯氏肉瘤病毒 LTR 以及人巨细胞 病毒的增强子 / 启动子。
此外, 还有那些能够包含在启动子序列里面合适的增强子, 这些增强子只有在诱 导物存在时才能够被激活, 比如本领域已知的激素、 金属离子或者酶的底物。
在本发明的另一个实施例中, 一段转录终止序列被放在目标基因编码序列翻译终 止密码子的 3’ 端 . 因此, 这段终止序列和启动子分别位于编码基因的两侧。
表达载体可能还包括一个复制起始位点从而使其作为一个复制子, 进行大量的复 制且在宿主中稳定存在。 这样的复制起始位点包括那些能够使表达载体在胞内合适蛋白存 在的条件下进行大量复制的序列, 例如 2μ 和自主复制序列能在酵母中发挥作用, SV40 中 重要 T- 抗原的复制起始位点能在 COS-7 中发挥作用。哺乳动物复制系统可能包括一些来 源于动物病毒的序列, 需要反式作用因子才能进行复制。 例如, 乳头多瘤空泡病毒的复制系 统如 SV40, 在适量的重要 T- 抗原存在的条件下能够大量复制乳头多瘤空泡病毒, 或者也利 用那些来源于牛乳头瘤病毒和巴尔病毒的序列。
在某些情况下, 表达载体可能不止一个复制系统, 从而使其能够在哺乳动物中表 达以及在原核宿主中克隆和扩增 ( 参考美国专利 No.5,677,278)。
在一个实施例中, 表达载体能够作为整合载体被整合到宿主基因组上。此处的整合载体至少包含了一段多聚核苷酸序列, 这段序列与宿主基因组同源从而使得载体能够整 合。例如, 在一个实施例中, 利用了噬菌体或者转座子插入序列。本技术的最佳实施方式 如文献中描述 ( 例如, Branski 等, 2006, Gene Therapy, 2006, 1-10 ; 和 Hengge, 2006, Gene Therapy, 13 : 155-1563)。
在本发明的某些实施方案中, 表达载体还可能包含一个或者多个选择标记, 从而 能够选择转化成功的宿主细胞。能够在宿主细胞中表达的选择标记包括一些能够使宿主 细胞具有耐药性的基因, 例如衣霉素、 G418、 氨苄青霉素、 氯霉素、 红霉素、 卡那霉素 ( 新霉 素 )、 四环素。 选择标记还可以是一些生物合成基因, 比如那些参与组氨酸、 色氨酸以及亮氨 酸生物合成途径的基因, 如 ade2、 his4、 Ieu2、 trpl, 或者是一些能够使得宿主细胞在毒性化 合物中 ( 如金属 ) 生长的基因。
因此, 在一个实施方案中, 本发明包括了一种产生多聚核苷酸的方法, 这种多聚核 苷酸编码至少一种维持细胞具有美容功能的核酸或者多肽, 使得这种核酸或多肽能够在具 有美容功能的细胞中表达从而增强和 / 或维持对美容有积极作用的生理和 / 或生化过程。 这种方法还包括在表达重组载体中插入一段多聚核苷酸。 因此, 在某些实施方案中, 本发明 包括了一种由多聚核苷酸组成的表达载体, 这段多聚核苷酸编码至少一种维持细胞具有美 容功能的核酸或者多肽。 同样地, 在某些实施方案中, 本发明包括了转染了这种载体的宿主 细胞。
例如, 这种方法还包括将 DNA 构建体整合到表达载体上。这种方法可能进一步包 括将本发明的表达载体转染到细胞中。因此, 在一个实施方案中, 本发明包括转染了本发 明表达载体的细胞。例如, 可以构建表达参与维持细胞具有美容功能的多肽的质粒。表达 盒式序列可以被插入到表达载体如 pcDNA3.1 上或者利用标准重组技术构建的表达载体 (Invitrogen, CA)。
如本技术领域所知, 这样的核酸构建体可以通过突变进行修饰, 例如, 通过包含了 突变位点的引物来 PCR 扩增核酸模板。通过这种方式, 可以设计包含了不同水平生物活性 的多肽。在另一个实施方案中, 突变序列可能与原始 DNA 具有 70%、 75%、 80%、 85%、 90% 或者更高的同源性。这样的话, 突变体可能包括了能在严格条件下杂交的核酸序列 ( 例如 在 1mol 盐浓度, 低于 DNA 双链的溶解温度 (Tm 值 )20-27℃的条件下。
同样地, 这种方法还包括将表达载体转染到宿主细胞中。 在某些实施方案中, 本发 明的多肽能够在哺乳动物表达系统中表达, 包括将表达构建体利用病毒如逆转录病毒或者 腺病毒转入到哺乳动物细胞中的系统。 适合作为表达宿主的哺乳动物细胞系是本技术领域 公知的, 包括很多合适的来自美国典型培养物中心 (ATCC) 的永生细胞系。特别包括了中国 仓鼠卵巢细胞系 (CHO)、 NSO、 SP2 细胞、 HeLa 细胞、 幼地鼠肾细胞 (BHK)、 猴肾细胞 (COS)、 人 肝癌细胞 (Hep G2)、 A549 细胞以及许多其他细胞系。细胞系的选择取决于在哪一种细胞系 中多肽能够高水平表达。也可能利用到昆虫细胞系, 如 SF9 细胞。还有可能利用到植物宿 主细胞, 如烟草、 拟南芥、 浮萍、 玉米、 小麦、 马铃薯等等。 微生物宿主细胞包括大肠杆菌和链 霉菌属。酵母宿主细胞包括粟酒裂殖酵母、 酿酒酵母和毕氏酵母。
当编码目的基因的重组表达载体被导入到哺乳宿主动物细胞中, 通过培养宿主细 胞足够的时间本发明涉及的多肽就能在宿主细胞内表达, 或者分泌到细胞培养液上清中。 表达的多肽可以通过标准的蛋白纯化方法从培养液中回收。编码本发明涉及的多肽的核酸分子和含有这些核酸分子的表达载体可以用于在 合适的哺乳动物细胞、 植物细胞、 细菌和酵母细胞中转染。
可以通过已知的任何一种转化方法将多聚核苷酸导入到宿主细胞中。 在本技术领 域将异源多核苷酸导入到哺乳动物细胞中的方法是已知的, 包括葡聚糖介导的转染、 磷酸 钙沉淀、 聚凝胺介导的转染、 原生质体融合、 电穿孔、 脂质体包裹以及将 DNA 直接微注射到 核里。另外, 也可以通过病毒载体把核酸分子导入到哺乳动物细胞中。在本技术领域, 转化 植物细胞的方法也是已知的, 包括土壤杆菌介导的转化、 基因枪转化、 直接注射、 电穿孔和 病毒转化。转化细菌和酵母细胞的方法也是已知的。
表达载体也可以通过 DNA 基因枪的方法导入到表达系统里, 在该方法中将质粒沉 淀到微颗粒上, 最好是金颗粒, 然后微颗粒被推进目的细胞或表达系统中。DNA 基因枪技术 和手段已经得到广泛应用, 如一种 “基因枪” 已经被商业应用于将微颗粒导入到细胞 ( 例 如, Helios Gene Gun, Bio-Rad Labs., Hercules, CA) 和皮肤中 (PMED Device, PowderMed Ltd., Oxford, UK)。
本发明涉及的多肽在生产细胞系中的表达量可以通过一些已知技术得到提高。 例 如, 谷氨酰胺合成酶基因表达系统 (GS 系统 ) 和抗新霉素细胞质表达系统是在一定条件下 提高表达量的常用方法。 当本发明涉及的多肽用不同细胞系表达时, 它们会有不同的糖基化方式。 然而, 这 里所描述的核酸分子编码的多肽, 或组成的氨基酸序列, 都是立即产物, 不考虑其糖基化
在一种实施方案中, 重组 DNA 载体可以转染到中国仓鼠卵细胞中, 得到最优表达。 在另一种实施方案中, 细胞可产生的蛋白浓度为 0.1-20 克每升, 或 0,5-10 克每升、 1-5 克 每升, 或 1-2 克每升。例如, 重组载体可以稳定转染到中国仓鼠卵细胞 (CHO) 中, 其中表达 有维持美容功效的多肽的细胞被筛选和克隆出来。在一种实施方案中, 可通过加入抗生素 G418 筛选有新霉素抗性的表达重组质粒的细胞。通过 Western Blot 检测细胞上清液得到 的高表达重组蛋白的单克隆可被挑选出来和扩增, 基因产物可通过蛋白 A 亲和层析纯化。
把编码与皮肤维持和 / 或治疗有关的多核苷酸或多肽的重组载体转移到有美容 功能效的细胞中
很多方法都可以用于转移编码有美容功效的多肽的多聚核苷酸, 从而增强或维持 对皮肤有益的生化或生理过程。因此, 本发明的配方含有帮助蛋白进入细胞的特殊成分。
为了通过转染、 转化或感染等手段使核酸进入到真核或原核细胞中, 核酸可以被 整合到质粒中, 作为病毒载体或非病毒载体的一部分。 合适的病毒载体包括杆状病毒、 牛痘 腺依赖 病毒、 慢病毒 ( 参考 Siprashvili 和 Khavari, MoI Ther., 2004, 9, 93-100)、 腺病毒、 病毒和疱疹病毒。 有基因治疗功效的载体是病毒载体, 例如腺病毒载体和逆转录病毒载体。 真核表达载体也适用于单独的基因治疗, 因为裸 DNA 可以在局部敷用中穿透进入有美容功 效的细胞中 (Hengge et al, 1996, J.Clin.Invest., 97, 2911-6 ; Yu et al, 1999, J.Invest. Dermatol, 112, 370-5)。 另一种基因治疗载体可通过把上述核酸做成金颗粒得到, 然后用所
谓的基因枪注射到组织中 (Wang et ah, 1999, J.Invest.Dermatol, 112, 775-81, 以用到的基因转染方法会在下文更详细地说明。
裸 DNA39vaget al, 1998, J.Invest.Dermatol, 111, 183-8), 最好使皮肤中, 或者细胞中。一些本发明可CN 102471769 A
说明书37/71 页在一个实施方案中, 编码至少一个参与维持具有美容功能的细胞从而增强和 / 或 维持对美容有积极作用的生化和 / 或生理过程的核酸或多肽的多核苷酸重组体被直接注 射入具有美容功能的细胞中, 称之为裸 DNA。且在局部施用后, 寡核苷酸 ( 例如, 编码 RNAi) 能被有效的转入表皮的各个细胞层。
在某些的实施方案中, 这些 DNA 和水或者缓冲液一起使用。或者, 也可以利用在 此被详细描述过的脂质体。并且, 在某些的实施方案中, 皮肤可能被磨损了, 通过移除一部 分毛发 ( 如剥离 ), 或者刷掉, 或者利用本技术领域已知的其他方法。(Choi et al, Skin Pharmacol.Appl Skin Physiol., 2003, 16 : 271-282 ; Choi 等, Current Drug Delivery, 2006, 3: 37-45).
在其他实施方案中, 可能用到包含了与 DNA 连接的多肽的基因载运系统。在另一 个实施方案中, 载体 ( 称之为 “裸” 表达载体 ) 会被传入到生物相容的基质中, 如胶原基质 (Goldstein 和 Banadio, U.S.Pat.No.5,962,427)。
一 些 研 究 报 道 说, 裸 质 粒 DNA 能 够 成 功 地 经 皮 肤 传 送 (Fan 等, 1999, Nature Biotech., 17 : 870-872 ; Yu 等, 1999, J.Invest.Dermatol., 112 : 370-375 ; Kang 等, 2004, J.Gene Med., 6: 1238-1246)。例如, 据报道, 磷酸盐缓冲液 (PBS) 中的 DNA 局部施用后, 产 生了抗细菌 β- 半乳糖苷酶的抗体, 表明了裸质粒 DNA 可以经皮肤传送 (Fan 等 (1999)。利 用具有毛囊和不具有毛囊的小鼠进行传送对比, Fan 等人 (1999) 发现这种传送是通过毛囊 的。但是, 也有其他报道称, 裸质粒 DNA 的转运导致了报告基因不仅在毛囊中表达也在上 皮细胞中的角质细胞内表达 (Yu 等, 1999)。也有论证表明, 300μg 质粒 DNA 局部施用 2 小 时后, 导致每克组织转运了大约 1,000ng 的质粒 DNA, 施用 24 小时后每克组织转运了大约 100ng 的质粒 DNA, 局部施用的一天后 mRNA 就开始表达 (Kang 等, 2004)。
早期的研究表明, 质粒 DNA 可能会通过缺损的系统 ( 这些缺损是在适当条件下暂 时形成的孔道 ) 渗透进入角质层 (Menon 和 Elias, 1997, Skin Pharmacol, 10 : 235-246)。 也有论证表明, 被极性脂类环绕的水合区域构成的孔道也可能促进了细胞间极性物质的转 移 (Sznitowska 等, 1998, J.Pharm.ScL, 87 : 1109-1114)。 并 且, 近 期 研 究 表 明, 质 粒 DNA 在胞内主要由角质细胞通过吞噬作用摄取, 还涉及到与 DNA 连接的埃兹蛋白和膜突蛋白 (Basner-Tschakarjan 等, 2004, Gene Therapy 11 : 765-774)。
裸质粒 DNA 的安全性和扩散性已得到广泛的评价 ( 如, Hengge UR, Vol-Platzer B(eds), The Skin and Gene Therapy.Springer-Verlag : Berlin, 2001, pp.67-80)。与病 毒载体转运 DNA 不同, 裸质粒 cDNA 不会引起不良的免疫应答, 也不会导致插入突变, 且能保 持启动子的功能。潜在的担忧在于质粒 DN 会 A 从靶点向其他组织和器官迁移, 然而, 报道 称在任何时间点都不能检测到质粒 DNA 整合进入了宿主 DNA, 并且质粒 cDNA 的表达时间很 短暂, 以至于处理 11 天之后, 表达的 RNA 只在被处理过的皮肤中发现, 除此之外的任何其他 组织中都未发现 (Hengge 等, 1995, Nat.Genet, 10 : 161-166)。据猜测, 质粒 DNA 的遗失是由 于组织核酸酶的降解以及表皮再生引起的。由于质粒 DNA 表达的短暂性以及质粒 DNA 的快 速降解, 因此皮肤的基因疗法被认为是安全的。
脂质体和微囊体介导的转移
例如, 在其他的实施方案中, 脂质体和 / 或微囊体被用于促进多聚核苷酸的转 移, 多聚核苷酸编码参与维持具有美容功能的细胞具有从而增强和 / 或维持对美容有积极作用的生化和 / 或生理过程的多肽, 脂质体是由人工构建的、 含有双层磷脂的小囊泡 (Jeschke, M.G. et al, Gene Ther., 12, 1718-24(2005) ; 美国专利 No.6,576,618)。微囊体 是非常小的脂质体, 但是其制作方法本质上与脂质体相同。
核酸、 蛋白质和其他生物物质能够被包含在脂质体和 / 或微囊体中, 通过质膜融 合的方式被运输进入哺乳细胞中。脂质体和 / 微囊体是引人注目的运载系统, 因为它们是 无病毒的、 稳定的, 并且能够与细胞膜相互作用。利用脂质体和 / 或微囊体直接施用到皮肤 上, 可以把脂质双分子层中包含的物质通过质膜融合的方式导入具有美容功能的细胞中。 传送的方式可以是内吞作用也可以是膜泡运输途径。例如, 脂质体和 / 或微囊体能够皮下 注射转染真皮中的细胞, 导致皮肤注射位点的蛋白表达。也可以先用空脂质体和 / 或空微 囊体对皮肤进行预处理, 然后再用含裸 DNA 的脂质体处理。
脂 质 体 和 / 或 微 囊 体 由 阳 离 子、 阴 离 子、 中 性 脂 质 和 混 合 物 构 成 (Luo, D.& Saltzman, W.M., Nat.Biotech., 18, 33-37(1999)。为了转移 DNA, 脂质分子可以通过化学修 饰使其包含化学基团从而促进 DNA 的压缩或释放。阳离子脂质, 例如季铵盐洗涤剂、 胆固 醇和甘油二酯阳离子衍生物、 聚胺类脂质衍生物, 更有利于细胞转染, 因为它们降低了 DNA 的净负电荷并且增强了其同细胞膜的相互作用 (Nishikawa, M.&Huang, L., 2001, Hum.Gene Ther., 12, 861-70 ; Badea J.Biol.Gene Medi 2005, 7: 1200-1214)。也可以使用包括 1, 2, 3- 三甲基丙烷磷脂酰乙醇胺在内的其他脂质体。
中性脂质, 例如磷脂酰乙醇胺 (DOPE)、 甘油月桂酸、 聚氧乙烯 -10- 硬脂 (POE-10)、 胆固醇, 可以作为辅助性脂类加入到阳离子脂质 DNA 复合物中, 从而在细胞通过内吞作用 摄取复合物后, 促进 DNA 从内吞体中释放出来。也应该充分利用能促进 DNA 转移的辅助 物, 例如可以连接到 DNA 上的聚合物、 蛋白质或者促进 DNA 更有效地转入细胞核中的合成 肽 -DNA 分子 ( 参考 Niidome, T.& Huang, L., Gene Ther., 9, 1647-52(2002))。这样, 由于 阳离子聚合物 ( 例如聚赖氨酸或鱼精蛋白 ) 能够引起 DNA 紧密压缩, 从而防止复合物聚合 以及核酸酶的降解作用, 所以阳离子聚合物可以被应用于脂质 -DNA 复合物中。例如在混合 质粒 DNA 之前, 先将 1, 2, 3- 三甲基丙烷磷脂酰乙醇胺 (DOTAP) 与带有硫酸鱼精蛋白的脂质 体混合, 然后产生稳定的 135nm 的小颗粒, 可以导致基因在各个组织中高水平的表达 ( 如, lung., liver, heart)(Li, S.et al, Gene Ther., 5, 930-37(1998))。 加入作为辅助性脂质的 胆固醇, 可以增强脂质 - 肽 -DNA 复合物的转染效率。并且, 在添加阳离子脂质 ( 脂质体 RPR 115335 或 RPR 120535) 或者聚合物 ( 聚乙烯亚胺 ) 之前, 预先将荧光素酶基因或 β- 半乳 糖苷酶基因与来源于人组蛋白或鱼精蛋白的短肽紧密连接, 即使在血清存在的情况下, 也 可以增强转染效率。
正如本技术领域所知, 脂质体可以通过加热脂质从而形成脂质相的方式来制作 (Wu, H.et al, Int.J.Pharmaceut, 221, 23-24(2001))。随后, 在冷却条件下, 通过注射器来 回推动, 将包含有水、 盐、 缓冲液的水相与脂质相混合。 其后, 通过声波降解法直至最终形成 直径在 100-140nm 的脂质体。然后通过倒置混合, DNA 或蛋白质 ( 溶液 ) 可以被加入到脂 质体中。这样制备的脂质体可以直接应用或注射到皮肤内。制作脂质体所要用到的脂质种 类和比例、 DNA 的浓度、 以及加到皮肤上的脂质体的量, 需要根据经验来判断最终实现最优 化。促进 DNA 转移的辅助物, 例如多肽, 可以在加入脂质体混合物之前, 与 DNA 混合 ; 但是, DNA 辅助物必须维持高度的水溶性, 从而被密封在脂质体脂质相的外部。另外, 通过对包含有阳离子脂质以及 DOTMA 或磷脂酰乙醇胺 (DPOE) 的悬浮脂质体 进行超声处理可以制备小的单层囊泡, 例如细胞转染剂 GS2888。倒置混匀之后, DNA 或蛋白 质将通过离子键连接到脂质体的表面, 按照可以维持复合物表面净正电荷的比率, 此时 DNA 将 100%混入脂质体中。 而且, 阳离子巯基洗涤剂也可以被用于制备转运 DNA 的脂质体 ( 例 如参见, Dauty, E.et al, J.Am.Chem.Soc, 123, 9227-34(2001))。一旦被氧化, 脂质中的巯 基就会转变成二硫化物, 促进 DNA- 脂质复合物形成稳定的纳米级小颗粒, 这些小颗粒会以 静电的形式连接到细胞表面, 阴离子肝素硫酸蛋白多糖会促使细胞对其的摄取。小尺寸的 纳米粒子和脂双层结构均会促进 DNA 转入具有美容功能的细胞中。一旦进入细胞, 细胞内 谷胱甘肽所提供的还原性环境会将二硫化物转化为硫醇并释放 DNA。
油包水和水包油的纳米乳剂介导的转移
在另一个实施例中, 油包水和 / 或水包油的纳米乳剂可以被用来转移多核苷酸或 多肽, 这些多核苷酸或多肽可以用来维持具有美容功能的细胞, 进而增强和 / 或维持对细 胞美容功能具有积极作用的生理生化过程。水包油和 / 或油包水的纳米乳剂是由水、 油和 表面活性剂构成的热力学稳定的液态均质分散体系, 构成了将 DNA 或蛋白质 ( 或其它生物 分子 ) 转入细胞中的技术 (Wu, H.et al, Int.J.Pharmaceut, 221, 23-24(2001) ; 同时参考美 国专利 Nos.5,753,241, 6,274,150, 6,335,022, 6,464,990, 6,541, 018, 以及 6,689,371)。
利用具有生物学安全的成分, 例如聚氧乙烯 - 失水山梨醇单油酸酯 ( 吐温 80)、 失水山梨醇单油酸酯和橄榄油, 可以使人体试验中对人体刺激的风险降到最低。在这些成 分精确的化学计量比率下, 缓慢加热以及轻轻混匀, 纳米粒子会开始自发形成。 这样就不需 要高剪切力的作用, 从而消除了对被转运的生物分子明显的物理损伤。这项技术已经实现 了规模化, 可以封装大量的水相物质。 纳米乳剂可以直接应用于皮肤, 从而实现将生物分子 导入具有美容功能的细胞中。例如, 氯霉素乙酰转移酶和人干扰素 -α2 的 cDNA 已成功实 现了对离体小鼠表皮的转染, 其中, DNA 沉积物主要进入了滤泡角质细胞 (Wu et al, 2001)。 单次施用以后, 转基因表达量在 24h 达到最大, 且多次施用后, 转基因表达水平显著提高。 也可以用相似的方式使用包含有乙醇 - 氟碳的微乳状液。
颗粒介导的转移
在 另 一 实 施 方 案 中, 转 运 方 法 包 括 颗 粒 介 导 的 转 移 ( 例 如 参 见, Nishikawa, M.&Huang, L., Hum.Gene Ther., 12, 861-70(2001) ; Luo, D.&Saltzman, W.M., Nat.Biotech, 18, 33-37(1999))。例如, 由金粒子或钨粒子等金属粒子包被的 DNA 颗粒 (1-5μm), 能够 被 “基因枪” 加速到极高的速度, 从而穿透细胞膜 (Williams, R.S.et al, Proc.Nat.Acad. Sci.U.S.A., 88, 2726-30(1991))。通过将微粒子在溶液中与 DNA 溶液、 氯化钙和亚精胺自 由基循环混匀, 微粒子表面可被包被上 DNA。将经由酒精淋洗后的颗粒涂抹到基因枪的涂 药器上, 待颗粒干燥、 酒精挥发后, 基因枪就可以将颗粒射入具有美容功能的细胞中, 从而 增强和维持对细胞美容功能有积极影响的生理生化过程。 这项技术可以将一种生物分子同 时导入多个细胞中, 并且将生物分子经由细胞膜直接导入细胞质甚至细胞核中, 因此可以 避免体内潜在的酶解反应。另外, 在一个实施方案中, 这项技术只能实现颗粒对细胞层较 浅部位的渗透作用, 因此可有效地用于被运输进入表皮的 DNA 的局部表达。基因枪的颗粒 轰击会造成轻微的细胞损伤以及炎症。例如, Oshikawa 等人使用氦脉冲 PowderJect XR 基 因传送装置, 将内部包被着白细胞杀菌素的 12 个基因 DNA 的金颗粒射入小鼠表皮中, 或者覆盖在肿瘤位点上, 或者与肿瘤位点有较远距离 (Oshikawa, K.et al, Hum.Gene Ther., 12, 149-60(2001))。结果发现, 覆盖在肿瘤位点上的转染细胞可以有效地抑制肿瘤的生长, 但 是如果不考虑转染位点的话, 这种疗法具有抗癌细胞转移效果 (Oshikawa 等, 2001)。类似 的方法也得到了成功的应用, 在人 β- 肌动蛋白启动子的控制下, 编码荧光素酶的基因 DNA 可以有效转染小鼠表皮, 基因枪轰击区域 10-20 %细胞会表达转入的基因 (Williams 等, 1991)。
电压驱动的转移
还可以使用其他的转移方法, 例如电穿孔法、 离子电渗法等 ( 参考 Banga, A.K.et al, Int.J.PharmaceuL, 179, 1-19(1999) ; Banga AJ.&Prausnitz, M.R., TIBTech, 16, 408, 12(1998) ; Andre, F.&Mir, L.M., Gene Ther., 11, S33-42(2004))。在这些方法中, 当 DNA 已 被注射进入表皮或者敷在表皮上时, 电流可以促进 DNA 转入细胞中, 在高离子强度的介质 中效果更好。由于皮肤易于处理, 所以是应用这些技术的最佳组织。使用这些技术时必须 充分考虑 DNA 的剂量、 电极形状 ( 如针状、 钳状 ) 和数量、 电场强度和持续时间。处理后的 细胞的渗透性逐渐降低, 这表明这些技术对细胞所造成的损伤均是可逆的。 另外, 由于受到 电流的作用, 这些技术可以实现在低刺激的条件下达到 DNA 高水平转移的目的。
电穿孔
电穿孔涉及到使用非常短促的高电压 ( 通常应大于 100V), 电脉冲会使细胞膜 暂时通透, 促使细胞对大分子的摄取 ( 参考 Nishikawa, M.&Huang, L., Hum.Gene Ther., 12, 861-70(2001))。电流会使细胞膜形成通透孔, DNA 和蛋白质会通过该孔顺浓度梯度进 入细胞内, 从而, 促进或维持在注射和 / 或施用后对生物分子的摄取。这项技术已被用于 活体表皮转染 : 通过皮内注射, 将编码报告基因的质粒注射进入猪或小鼠的表皮, 然后用 PulseAgile 电穿孔设备和软件给予电脉冲。 (CytoPulse Sciences, Hanover, MD)(Drabick, JJ et al, Molec.Ther., 3, 249-55(2000)). 转染细胞主要位于真皮中, 包括脂肪细胞、 成纤 维细胞和内皮细胞及其他细胞中。
离子导入
离子导入涉及到低压电脉冲的使用 ( 通常为 10V 或更小 ), 这种电脉冲通常是 高频脉冲或持续的恒定脉冲 ( 通常 0.5mA/cm3 或更小 ), 进而促进带电分子进入表皮 (Nishikawa, M.&Huang, L., Hum.Gem Ther., 12, 861-70(2001))。具有与极性分子相同的 电荷的电极可以驱动带电分子进入皮肤。例如, 带有负电荷的阳极可用来驱动带负电荷的 DNA 分子。电极通常非常小, 可以被纳入到基质中, 基质可以应用于施用过 DNA 溶液的表皮 (Mikszta, J.A.et al, Nat.Med., 8, 415-19(2002))。 除了使用包括汗腺在内的原有路径外, 该技术与电穿孔类似, 在表皮上形成了新的孔道来实现转移。 与电穿孔相比, 该技术更适用 于人体。被转运的 DNA 与施用于表皮上的电流和基质大小成正比。因此, 用量易于调节, 并且可以根据病人的需要进行优化。另外, 由于离子导入法是一种驱动型的转移, 所以与 其他药物驱动系统相比, 它对其他生物变量的依赖较小, 例如膜渗透活细胞内组件 (Banga, A.K.et al, Int.J.Pharmaceut., 179, 1-19(1999))。在一个实施方案中, micorenhancer 芯 片可以利用裸露的荧光素酶基因 DNA, 对 BALB/c 小鼠的具有美容功能的细胞进行转染, 与 局部施用相比, 该过程具有更显著的转基因活性 ( 增强了 2800 倍 )(Mikszta, J.A.et al, 2002)。电整合
电整合是对离子电渗法和电泳的一种改进, 使用这种方法, 电脉冲会造成皮肤 上层细胞的破裂, 从而使包装在囊泡或颗粒 ( 例如微球体和金颗粒 ) 中的分子被转移进 入表皮。电极可直接设置在目标位置, 且颗粒直接施用于皮肤上。表皮上层细胞的破裂 后, 双向电泳和 / 或压力驱动粒子进入表皮 (zhang 等 Bioelectrochem.Bioenerg., 42, 283-92(1997))。此外, 也可使用压力介导的电整合技术。
射频消融介导的转移
此外, 在一个实施方案中, DNA 和 / 或蛋白质的转移方法还包括射频消融介导的转 移。通过射频消融技术能在具有美容功能的细胞上形成微通道或瞬间微通道 (Birchall, J.et al, Int.J.Pharmaceut, 312, 15-23(2006))。 这些通路足够大, 具有足够的形态和深度 来转运直径达到 100nm 的纳米粒子。在另一个实施方案中, DNA 和 / 或蛋白质的转移方法 TM 还包括超声介导的转移, 或称为超声渗透法。ViaDerm 是一种可以通过射频消融形成微通 道来实现 DNA 的转移仪器。该仪器在总面积为 1.4cm2、 电极密度为 100/cm2 的范围内, 具有 一个电极控制单元和一个可支配的不锈钢电极阵列。通过施加 290V 或 330V 以及 1-5 次射 频频率为 100kHz、 持续时间为 700μs 的电压, 微通道就会形成。在将 DNA 施加到表皮上以 前, 以及施加过以后, 对表皮作如是处理, 可以增强转移的效果。例如, 具有 β- 半乳糖苷酶 TM 基因或绿色荧光蛋白报告基因的质粒 DNA, 可以经由 ViaDerm 这种仪器来转染离体的人皮 肤 (Birchall et al, 2006)。
超声波
超 声 波 可 以 增 加 细 胞 膜 对 大 分 子 比 如 DNA 的 通 透 性 ( 参 考, Newman, CM., et al, Echocardiography, 18, 339-47(2001) ; Niidome, T.&Huang, L., Gene Ther., 9, 1647-52(2002))。例如, 将 DNA 注射进入皮肤后, 超声波照射可以促进 DNA 进入细胞。由于 这项技术具有灵活性和安全性的特征, 通常可用于人体, 尤其是肌肉组织。 与微泡或超声造 影剂结合的超声技术, 例如充满全氟丙烷的白蛋白微泡, 可以通过超声能量降低细胞空心 化的极限值 (Teupe, C.et al, Circulation, 105, 1104-09(2002))。例如, 利用超声介导的 对运载质粒的白蛋白微泡进行破坏的方法, 将编码激活型一氧化氮合酶 (eNOS) 的 DNA 转染 猪的冠状动脉, 导致蛋白的表达量显著提高, 增强的一氧化二氮导致被缓激肽刺激的动脉 舒缓 (Teupe 等, 2002)。
促进基因的长期表达的组织特异性、 自我复制和整合质粒表达系统
在一个实施方案中, 使用的 DNA 转移方法可能包括自我复制和整合型质粒表达系 统 ( 参考 Newman, CM., et al, Echocardiography, 18, 339-47(2001) ; Niidome, T.&Huang, L., Gene Ther., 9, 1647-52(2002))。 并且, 在某些实施方案中, 整合还可能具有组织或细胞 类型特异性。 因此, 至少这里探讨的某些技术是暂时的, 并且不是针对生物学上某些特定类 型的细胞。
在一个实施方案中, 可以通过如下方式来实现组织特异性转运 : 将蛋白质或肽配 体合并到 DNA 复合物中, 从而促进受体介导的靶细胞表面表达特定的受体。另外, DNA 元 件可以被包含在被转入细胞的 DNA 中, 以至于编码基因只能在含有相应的蛋白因子的细胞 中表达。例如, 可以将组织特异性的转录因子结合位点或启动子包含在被转移的 DNA 分子 中。这项技术已被成功用于将质粒 DNA 转染活体小鼠肝脏, 该质粒 DNA 具有人因子 EX 微基因序列, 该序列包含第一个内含子和 3’ 非翻译区的一部分, 在肝脏载脂蛋白 E 位点控制区 和 α- 抗胰蛋白酶启动子的控制之下, 且利用了牛生长激素 polyA 信号 (Miao, CH. 等, MoI. Ther., 1, 522-32(2000))。 除了基因序列自身以外, 这些遗传元件使得基因在持续十个月的 治疗范围内其表达水平的提高。
在其他的实施方案中, 可以通过将能自我复制的 DNA 分子转入靶细胞中的方 式 来 实 现 被 转 入 基 因 长 时 间 的 持 续 表 达 (Shirakata M.&Hirai, K., J.Biochem., 123, 175-81(1998))。 例如, DNA 质粒可通过巴尔病毒提供的系统来维持自身的游离状态, 并随着 细胞代代遗传下去 (Shirakata M.&Hirai, K., J.Biochem., 123, 175-81(1998))。该系统需 要被转移的 DNA 含有巴尔病毒核心抗原 1(EBNA1) 编码序列和 oriP DNA 元件, 这样在被转入 细胞中后, EBNA1 蛋白的表达可以促使被转入的 DNA 的复制以及与基因组 DNA 结合。 为了使 目标蛋白在皮肤中长期持续表达, 被转入的 DNA 需要被引入基底细胞中。例如, 该系统在体 外用于自杀基因疗法, 在体内用编码 EBV 病毒元件的质粒和 1 型单纯性疱疹病毒基因来增 加细胞对化学疗法药物 ganciclovir 的敏感性 (Maruyama-Tabata, H.et ah, Gene Ther., 7, 53-60(2000))。并且, 将可编码 β2- 肾上腺素受体和携带有 EBV 元件的质粒 DNA 导入仓 鼠心室肌中, 可以实现 β2- 肾上腺素受体的长期表达 (Tomiyasu, K.et a Gene Ther., 7, 2087-93(2000))。
如果被转入的质粒 DNA 被整合进了皮肤基底细胞或其他具有美容功能的细胞染 色体 DNA 中, 它就可以在细胞分裂时被传递给子细胞, 这样就可以使相应的蛋白进行持续 表达。将转入的 DNA 整合到染色体 DNA 中需要使用到一种酶, 这种酶可以切割染色体 DNA, 从而使被转入 DNA 插进去。一种有效的将 DNA 插入到具有美容功能的细胞基因组中的方法 是使用转座子, 例如 “睡美人” (SB) 转座系统。因此, 在一个实施方案中, 转座子可以实现 特定构建体从供体质粒向哺乳动物基因组的精确转移 ( 参考 Hackett, P.B., et ah, Adv.in Genet, 54, 189-232(2005), 同时参考美国专利 No.6,489,458))。 以转座子为基础的方法中, 除了携带可以编码维持具有美容功能的细胞的核酸或多肽的 DNA 外, 被转入的 DNA 还包含 有转座酶编码序列或者转座酶 mRNA。例如, SB 转座系统是由约有 340 个碱基对的两个终端 重复序列组成的, 它可以介导外源性核苷酸序列近乎随机地插入基因组的 TA 碱基对中 ( 虽 然两侧的 DNA 序列可能会影响特定位点整合的几率 )。SB 转座子系统已经被用于模拟人体 疾病的小鼠疾病的研究中, 并且使得激活体细胞癌基因的 NARS 基因被整合到小鼠肝细胞 DNA 中 (Carelson et al, Proc.Nat.Acad.ScL U.S.A., 102, 17059-64(2005))。
在另一个实施方案中, 可通过噬菌体整合酶实现基因组的整合 (reviewed in Groth, A.C.&Calos, M.P., J.Biol.Chem., 335(3), 667-678(2004))。例如, 噬菌体整合酶 可用于介导两个不同的、 相对较短序列的高效特异性重组。因此, 发现丝氨酸催化家族的 ΦC31 整合酶在人细胞中可以高效地调节识别位点的整合, 以及调节与这些位点具有部分 同源性的宿主染色体序列的整合。
制剂
在某些实施例中, 多聚核苷酸编码至少一个维持细胞美容功能以而增强和 / 或 维持对美容具有积极效果的生理生化反应的核酸或多肽, 该多聚核苷酸可与药物相容的 载体相混合, 从而产生治疗用的化合物, 该化合物可用于具有美容功能的细胞的治疗。对 于用到本发明的各种方法和成分的大量阐述都在美国专利出版号为 No.2006/0058256 和No.2006/0025363 中被描述过, 这两篇专利的全文均被包含在本文的参考文献中。
在一个实施方案中, 本发明的组成包括一个局部给药制剂。该制剂由溶解或悬浮 在媒介中的物质组成, 如凝胶、 洗涤剂、 乳液, 悬浮物或载体还可能包括矿物油、 石油、 酒精 或者药物处方的其他基础成分。任何其他合适的配方均可用于转运这些化合物, 这些化合 物可能包括本技术领域中公知的药物佐剂, 就如 Remington′ s 的医药科学所描述的那样 (16 版, 1980)。 在某些实施方案中, 在化合物中加入其他成分, 例如可可油和芦荟, 也是可行 的。
制剂可能包括那些适合于口腔, 直肠, 局部, 鼻, 眼或注射 ( 包括皮下, 肌肉注射和 静脉注射 ) 治疗的药物制剂, 所有的这些都可能作为本发明的给药途径。
制剂可以以剂量方便的形式呈现, 也可以通过药剂技术领域公知的方法制备。制 剂可能通过由一个或多个助剂构成的载体来使活性化合物激活而进入相应组织。 在一般情 况下, 配方是由液体载体或精细分开的固体载体或两者结合将活性化合物带入组织的, 然 后, 如有必要, 将产品包装成所需的制剂。
适合用于注射给药的制剂, 可方便地制成无菌水制备的活性化合物, 最好与受体 的血液等渗。
喷鼻剂制剂可能是包含防腐剂和等渗剂的活性化合物的水溶液。 这种制剂最好调 整其 pH 和等渗状态, 使之与鼻腔粘膜兼容。
直肠给药制剂可能通过一个合适的载体制成栓剂的形式, 如可可脂, 氢化脂肪或 氢化脂肪羧酸。
眼科制剂可通过与喷鼻剂类似的方法来制备, 除了将 pH 和等渗因素调整到最适 用于眼的状态。
本发明的制剂适用于口服给药, 制剂可能是制成为独立单元, 如胶囊, 扁囊, 片或 含片, 每种都包含等同于粉末或颗粒或脂质体或悬浮在水溶液中或非水液体中的预定量, 如糖浆, 酏剂, 乳液或顿服水剂。例如, 药片可任意与一个或多个助剂压缩成型。
压缩药片可在一个合适的机器中压缩形成。 活性化合物以粉末或颗粒等自由流动 的形式通过粘合剂, 崩解剂, 润滑剂, 惰性稀释剂, 表面活性剂或分散剂以任意比例进行混 合。 合适的粉末状活性化合物的混合物及其载体组成的模压片可能会在一个合适的机器成 型。或者, 糖浆可能通过将活性化合物加入到浓缩的糖水溶液, 例如蔗糖, 也可以添加任何 助剂。这种助剂可能包括调味剂, 合适的防腐剂, 延缓糖结晶剂, 增加其他成分溶解度的试 剂, 如多元醇, 甘油或山梨醇。
在实施例中, 参与维持细胞美容功能的编码至少一个核酸或多肽的药剂可能是局 部的。 局部给药制剂可能包含溶解或悬浮在一种或多种媒介的活性化合物, 如矿物油, 凡士 林, 多羟基醇或外用药物制剂中使用的其他基质, 可能还需添加其他助剂。例如, 本发明的 制备形式可能是护肤霜, 面霜, 乳液, 软膏, 或任何其他适于皮肤局部使用的形式 ( 美国专 利 4760096 全部纳入参照 )。 根据其预期用途, 可添加其他成分使其具有适于皮肤的流变性 能。
因此, 在实施例中, 本发明的制剂可能是溶液的形式, 如水溶液, 胶体溶液, 乳化乳 液, 水包油型的霜 ( 亲水膏 ) 或水凝胶, 其中水相是连续相。 另外, 制剂也可能是油性混合物 的形式, 如软膏, 油包水型的面霜, 凝胶质地, 吸收基质或亲水性软膏中, 油相是连续相。此外, 可能会添加非水的水溶性基质, 如聚乙二醇的混合物, 此外, 在具体实施中, 也可以制成 添加了固体分散剂的悬浮基质, 如震动乳液。 可以使用油性成分, 乳化剂, 分散剂, 凝胶剂和 固体材料来制备这些制剂, 它们都是众所周知的化妆品和外用产品中常用的成分。
本技术领域公知的可使用的油性成分可能包括碳氢化合物如液体石蜡, 凡士林, 固体石蜡, 微晶蜡等。此外, 高级脂肪醇, 如十六醇, 十六烷醇, 硬脂醇, 油醇, 酸酯的高脂肪 低醇, 如十四酸异丙酯或十六酸异丙酯, 植物油, 改性植物油, 无水羊毛脂及其衍生物, 角鲨 烯或角鲨烷, 更高级脂肪酸, 如棕榈酸、 硬脂酸。
在一个实施例中, 药剂可使用物理层 ( 如擦皮术和包藏 ), 和 / 或化学渗透 / 渗透 促进剂 ( 二甲基亚砜, 氮酮, 醇, 脂肪酸和萜烯 ), 已经证明渗透增强剂能扰乱或液化角质层 的脂质结构以增加通透性 )。 此外, 本发明的药剂可使用其他增强通透性的方法, 例如, 电整 合, 超声, 改变细胞的同渗容摩, 纳米粒子和任何其他合适的能有效地加强本发明的药剂的 渗透性的技术或方法, 例如, 局部用药。
在一个实施例中, L- 丝氨酸, L- 羟脯氨酸, 或其他可能增强和 / 或有助于增强生长 因子作用的氨基酸, 都可能包括在本发明的药剂中。
在另一个实施例中, 本发明的局部给药制剂可能包含有用的乳化剂和阴离子、 阳 离子、 非离子表面活性剂等分散剂。 非离子表面活性剂可能是首选, 因为它们对皮肤的刺激 性较小。典型的非离子表面活性剂可能包括, 如单硬脂酸甘油酯等单甘酯, 山梨醇等脂肪 醇, 蔗糖脂肪酯, 聚氧乙烯硬脂酸酯等聚氧乙烯脂肪, 十六烷基聚氧乙烯醚等聚乙二醇高等 醚醇, 聚乙二醇醚, 聚乙二醇脂肪酸之类的 ( 美国专利 4760096)。此外, 还可以使用如羧甲 基纤维素, 纤维素胶, 聚乙烯醇, 聚乙二醇和各种树胶等凝胶剂。这些油性成分, 乳化剂, 分 散剂和凝胶剂可单独使用或相互结合使用。此外, 还可使用纳米乳液。
除上述成分外, 本发明的制剂可能还包括一种或多种助剂, 如稀释剂, 缓冲剂, 调 味剂, 粘合剂, 崩解剂, 表面活性剂, 增稠剂, 润滑剂, 防腐剂 ( 包括抗氧化剂 ) 等之类的物 质。
剂量
服用多核苷酸药物, 相当于提供一定量的用于维持和 / 或改进具有美容功能的细 胞的多肽或多核苷酸。对于多肽的局部给药, 在不同的实施例中, 用药的剂量从 1ng/cm2 到 1mg/cm2 组织面积, 或从 10ng/cm2 到 100μg/cm2 组织面积, 或从 100ng/cm2 到 10μg/cm2 组 织面积, 或从 500ng/cm2 到 10μg/cm2 组织面积, 或从 1μg/cm2 到 5μg/cm2 组织面积, 或从 2 2 1μg/cm 到 2μg/cm 组织面积。
或者, 对于全身用药 ( 如腹腔 ) 的剂量范围可能从约 1ng/kg/d 至 100mg/kg/d, 或 从 1mg/kg/d 至 10mg/kg/d, 或从 100ng/kg/d 到 5mg/kg/d, 或从 1μg/kg/d 至 1mg/kg/d, 或 从 100μg/kg/d 到 500μg/kg/d, 或从 10μg/kg/d 到 100μg/kg/d。或者, 在这些范围内都 可以使用。
在不同的给药方案中, 提供的多核苷酸相当于多肽的剂量, 范围从 1ng/cm2 到 1mg/ cm2 组织面积, 或从 10ng/cm2 到 100μg/cm2 组织面积, 或从 100ng/cm2 到 10μg/cm2 组织 面积, 或从 500ng/cm2 到 10μg/cm2 组织面积, 或从约 1μg/cm2 到 5μg/cm2 组织面积, 或从 2 2 10μg/cm 到 2μg/cm 组织面积。或者, 在这些范围内都可以使用。
例如, 载体构造可应用裸 DNA 剂量, 范围从 1ng/cm2 到 1mg/cm2 组织面积, 或从10ng/cm2 到 10mg/cm2 组织面积, 或从 100ng/cm2 到 100μg/cm2 组织面积, 或从 500ng/cm2 到 10μg/cm2 组织面积, 或从 1μg/cm2 到 5μg/cm2 组织面积, 或从 10μg/cm2 到 2μg/cm2 组织 面积。或者, 在这些范围内都可以使用。
这些剂量范围通过在体外和动物中, 在感兴趣的美容细胞中研究得到精确的基因 转染效率来确定。同样地, 可使用本技术领域公知的其他特定的方法来确定其他载体如脂 质体, 超微粒子, 纳米乳液, 颗粒介导传递, 电压驱动传递的剂量范围。
在评估有美容功能的细胞的基因改造的研究时, 质粒可在任何剂量范围给药, 在 具有美容功能的细胞中产生了预期的效果。 例如, 质粒可以合适的制剂通过局部途径给药, 个人剂量范围约从 5 到 2000 微克 / 毫升 (μg/ml), 较好的个人剂量范围是从 50 至 1000 微 克 / 毫升 ; 更好的个人剂量范围约从 100 至 500 微克 / 毫升。有研究表明, 亚治疗的微磨 皮术可用于是提高 KGF-1pDNA 到猪皮的传递速度, 剂量约为 100 到 500μg/ml KGF-1pDNA。 根据一个给药方案, 质粒传递的浓度为 100, 250, 500, 750, 1000, 1500 和 2000 微克 / 毫升 (μg/ml 的 )。
因此, 本发明的实施例考虑到有美容功能的细胞的基因修饰能提高和 / 或维持基 因表达, 这可能会刺激皮肤蛋白的生长, 所以看起来更年轻。在一些实施例中, 本发明的方 法和成分对于目前可用的化妆品增强剂可能有明显的优势, 包括整形外科, 肉毒杆菌 ( 注 射用肉毒毒素 ), 激光换肤, 微磨皮术, 脉冲光治疗, 注射填充剂 / 结缔组织替代, 自体成纤 维细胞注射, 局部皮肤护理产品等其他方法。
比起组织的局部给药, 本发明有一个优势, 本发明的方法和成分能更好的将治疗 性分子定量输送到有美容功能的细胞。
此外, 在某些情况下, 局部使用的复合物, 包括生长因子, 可能会被蛋白酶快速的 消化从而限制了其功效的持续时间, 或刺激免疫原性反应。本发明的实施例可能会刺激有 美容功能的细胞生成, 进而增加细胞本身的蛋白生成, 因此, 有可能会减少蛋白酶激活或免 疫原性反应。
与建议每日两次局部用药以达到改善美观的生长因子蛋白产品不同, 本发明的给 药方案, 可提供每周一次或每月一次剂量 ( 即全面的美容效益不需要每天或每天两次的标 准应用程序 ), 或在干细胞转染时, 一次剂量就可改善外观。恒昼夜化妆品都在提高多肽的 表达。例如质粒编码的角质细胞生长因子 (KGF), 在 7 天内, 比起有表达高峰和低谷期的每 日两次局部用药的 KGF 多肽, 有明显的优势。实际上, 这种方法将皮肤变成一个能持续生产 具有美容功效的多肽的生物反应器。此外, 由于本发明的方法和成分的用药频率比局部治 疗量常常要低一些, 本发明的方法和成分可以消除或降低创伤性, 有时复杂的手术、 注射和 激光 / 光疗法会对皮肤产生损害。本发明通过减少用药频率来改善。
亚治疗的微磨皮术
为确定皮肤蛋白和其他生物分子, 如胶原, 弹性蛋白, 细胞外基质蛋白, 蛋白多糖, 生长因子的表达和 / 或水平是否在皮肤上有整容修复的效果, 并大幅评价完整的细胞的美 容遗传改造后是否有美容功能, 首选使用亚治疗的微磨皮术。
质粒 DNA(pDNA) 的传递通过完整的皮肤利用各种渗透增强术已深入研究, 包括屏 障破坏 ( 如微磨皮术和胶带剥离 ), 脂质体输送系统 ( 如脂质体 ), 和不稳定膜技术, 如电 击 (Choi MJ 和 Maibach HI.Topical Vaccination of DNA Antigens : Topical Deliveryof DNA Antigens.Skin Pharmacol.Appl.Skin Physiol.2003 ; 16 : 271-282)。高分子量质 粒 DNA, 需要渗透到最上面的角质层以达到可行的角质细胞。用胶带剥离和创面电灼术物 理击穿角质层以提高大分子及质粒 DNA 穿过动物皮肤的传递速度 (Yu WH, Kashani-Sabet M, Liggitt D, Moore D, Heath TD, Debs RJ.Topical gene delivery to murine skin.J Invest Dermatol 1999 ; 112 : 370-375)。
Lee 等人 (Microdermabrasion as a novel tool to enhance drug delivery via the skin : an animal study.Dermatol Surg.2006Aug ; 32(8) : 1013-22) 发现亚治疗的微磨 皮术 ( 即, 使用低吸入压力和短期治疗持续时间 [15cmHg 10 秒= 20 千帕 ]) 将小鼠和猪的 药物传递速度增加了 8-24 倍。亚治疗的微磨皮术的治疗参数的强度低于用于治疗目的微 磨皮术 ( 即减少皱纹 ), 而且不引起皮肤炎症反应。使用亚治疗的微磨皮术, 微观分析已经 证明整个皮肤没有明显的破坏, 只是角质层 (SC) 轻微稀疏。SC 层出现集中和压实。表皮和 真皮层没有变化, 亚治疗的微磨皮术得到的结果是可控和可重复的。
增加的高分子的传递也可在灵长类动物和人的微磨皮术中看到 (Prausnitz MR, 等 Transdermal drug delivery.Nat Biotechnol.2008Nov ; 26(11) : 1261-8 ; Gill HS, 等 Selective removal of stratum corneum by microdermabrasion to increase skin permeability.Eur J Pharm Sci.2009)。吉尔等人 (2009) 发现, 可通过控制经过猴子和人 的头部的微磨皮术中的皮肤来控制去除角质层的程度。然而, 变压 (25kPa vs 50 kPa) 并 没有表现出差异。
如本示例所述, 可以在不同哺乳动物物种中可靠地使用亚治疗的微磨皮术, 例如, 在小鼠或猪。应该理解, 本文所述的实验研究 ( 例如, 如前所示的例子 ) 包括用亚治疗的微 磨皮术的研究, 也可以在其他哺乳动物物种中进行, 例如, 为确定其他生长因子是否表达, 如, 对皮肤有美容修复功效的 PDGF( 血小板衍生生长因子 )。 亚治疗的微磨皮术也可以用来 评估完整的细胞被遗传修饰后是否有美容功效。
此外, 除了亚治疗的微磨皮术以外的技术, 也可以用来评估其他生长因子是否表 达, 如对皮肤有美容修复功效的 PDGF( 血小板衍生生长因子 )。
组织学和其他分析方法
在动物研究中, 为确定皮肤蛋白和其他生物分子, 如胶原, 弹性蛋白, 细胞外基质 蛋白, 蛋白多糖, 生长因子的表达和 / 或水平在皮肤上是否有美容修复的功效, 并评价完 整的细胞通过美容遗传改造后其美容功能, 其结果可通过标准且著名的组织学程序进行分 析。组织学程序也可以用来分析在光或电子显微镜下有很小差别的物体, 因为着色使两个 组织形成对比, 同时使感兴趣的特定的特征更显著。
例如, 在涉及 KGF-1 质粒 DNA 传递到动物的皮肤的研究时, 并要确定 KGF-1 的表达 在皮肤上是否有美容修复的效果, 可以利用标准和知名的组织学程序。类似的组织学程序 也可以用来评价一个或多个其他生物大分子的表达是否对皮肤有美容修复的功效。
使用组织学程序的例子包括使用光显微镜的污迹, 如苏木精和曙红 (H&E) 的污 渍。其他知名的及建立在组织学和组织病理学上的程序, 也可用于评估一个或多个其他生 物大分子的表达在皮肤上是否有美容修复的效果。
也可以采用其他典型的染色技术, 包括马森三色染色法, 这是组织学经常使用的 典型的三色染色法, 还有冯·吉布森染色染色的。使用 H&E 进行染色, 梅森三色和冯·吉布森染色法, 可用于各种组织学测量, 包括皮肤厚度的分析, 胶原和弹力纤维成分分析。
在另一种典型的实施例中, H&E 染色剂, 可用于评估表皮的厚度, 角质细胞的数量, 胶原厚度和真皮的密度的变化, KGF-1 质粒 DNA 传递到动物皮肤前后的变化。
染色是使这两个组织形成对比, 以及突出感兴趣的特定特征。苏木, 一种碱性染 料, 由于对细胞核中的核酸的亲和力比较强, 所以将核染成蓝色 ; 曙红, 一种酸性染料, 将细 胞质染成粉红色。 醋酸铀和柠檬酸铅常用来使组织在电子显微镜下形成对比。 此外, 还有各 种其他技术可用于选择性染色细胞和细胞组分。其他化合物, 可用于组织切片染色, 例如, 番红, 刚果红, 固绿 FCF, 银盐, 以及许多自然和人工染料。
组织样品也可以通过其他程序分析来确定皮肤蛋白和其他生物分子, 如胶原, 弹 性蛋白, 细胞外基质蛋白, 蛋白多糖, 生长因子的表达和 / 或水平对皮肤是否有美容修复的 功效, 并评价完整的细胞通过美容遗传改造后其美容功能。 例如, 抗体可以用来使特定的生 物分子可视化, 例如, 用免疫组化, 或利用免疫荧光进行荧光染色。 其他技术, 如非放射性原 位杂交, 可与免疫组化结合起来, 用于鉴定与免疫荧光和酶联荧光扩增的荧光探针或标签 结合的特定的 DNA 或 RNA 分子。不同的成像技术可用于研究组织学样本, 例如, 染色后的组 织样本, 或用荧光染色后的免疫荧光。 在某些实施例中, 荧光显微镜和共聚焦显微镜可用于 检测细胞内的具体的荧光信号。数码相机也可以用来捕捉组织学和病理学图像。
动物模型
根据此处所述的实施例, 任何合适的动物模型都可用于确定皮肤蛋白和其他生物 分子, 如胶原, 弹性蛋白, 细胞外基质蛋白, 蛋白多糖, 生长因子的表达和 / 或水平是否对皮 肤有美容修复的功效, 并大幅评价完整的细胞的美容遗传改造后是否有美容功能。 “动物” 一词旨在包括但不仅限于任何哺乳动物的物种。 这些哺乳动物的例子包括但不仅限于不同 品种的猪 ( 猪 ) 和鼠科动物 ( 小鼠 )。熟悉这些领域的技术的人都知道, 考虑到猪和和人的 皮肤在生理和形态上已知的相似之处, 猪的动物模型存在一定的优势。 动物模型的选择, 需 要对许多不同的因素进行评估。在选择一个合适的动物模型时, 考虑的因素包括皮肤层的 厚度及药物通过皮肤的渗透能力。
角质层 (SC), 这是表皮外的保护层, 是疏水性的, 带负电荷的 PDNA 难以穿透这层 (Branski LK, 等, Gene Ther.2007Jan ; 14(1) : 1-10)。 小鼠背侧皮肤角质层的细胞只有 1-2 层, 兔子有 1-2 背部 SC 细胞层。 相比之下, 猪和人的角质层的厚度和皮肤比较相似 (Meyer, W., 等, 1978, Curr.Prob.Dermatol.7 : 39-52 ; Bronaugh, R., 等, 1982, Toxicol.Appl. Pharmacol.62 : 481-488 ; Kiritsy CP, 等 Crit Rev OralBiol Med.1993 ; 4(5) : 729-60)。 人 面部皮肤有 9±2 层 ; 毛囊很少 ; 非面部有 14-17 细胞层。小鼠有更薄的真皮层和较少的角 化角质层 (Hengge, U.R., 等 J.Clin.Invest., (1996)97, 2911-2916)。皮肤的渗透性 ( 通 常比人体皮肤的渗透性高 10-100 倍 ) 是选择动物模型的一个考虑因素, 如无毛小鼠和大鼠 (Paasonen L, 等 Int.J.Pharm.2006Jan 13 ; 307(2) : 188-93)。
正常治愈的猪模型已广泛应用于诱导性部分皮层伤口的研究, 因为他们的皮肤外 层与人及其相对无毛时很相似。此外, 猪同人一样, 被认为是紧皮肤的动物, 与兔子和豚鼠 等皮肤宽松的啮齿类动物形成对比。 松散皮肤的动物包含一层纤肌膜, 那就是肌肉层下方、 附着在皮肤上的肉膜。Hengge 等人 (J.Clin.Invest., (1996)97, 2911-2916) 报道, 当裸 pDNA 通过皮内注射入小鼠皮肤后, 在表皮、 真皮和底层的脂肪及肌肉中表达。而在猪和人的皮肤中, 只在表皮中表达。 同样的, Glasspool-Malone(Mol.Ther.2000 ; 2: 140-146) 等人 报道 pDNA 注射入猪和猕猴后, 转基因的表达很大程度上只局限于表皮。小型猪对于皮肤测 试是一个很有吸引力的模型, 因为它们的体型更小, 与人的皮肤更相似 (Mortensen JT, 等 Scand.J.Lab.Anim.Sci.Suppl.1.1998.Vol.25)。 两个物种的表皮都比较厚, 猪大约 70-140 毫米, 人大约 20-120 毫米, 不同地方有很大的区别。 猪表皮类似于有网状真皮 - 表皮结合点 的人。各种动物模型的皮肤渗透性排名大致如下 : 家兔>大鼠>豚鼠>猪>猕猴>人。小 型猪的皮肤对刺激物不如兔皮肤敏感。基于诸多因素的评价, 猪是一个适于局部实施 pDNA 测试的动物模型。正如此处其他所述, 本文所有引用参考全部纳入在此披露。
应该理解, 此处所描述的典型实施例只是在描述意义上进行考虑, 不是限制使用 目的。 据本技术领域公认, 在这些实施例中可能会有一些变化, 但没有违背该发明的原则和 精神, 其范围在要求及其等价物中有限制。 实施例 此处描述的实施例描述四个编码设计为改进细胞外基质的稳定性和支持皮肤的 改进的外观的重组载体构建体的合成。这些都是胶原, 弹性蛋白, EC-SOD 和 TIMP-1。此处 详细讨论了这些蛋白在皮肤生理学中的作用。每个构建的质粒由以下组成 : 一个有用的基 因和有人巨细胞病毒立早启动子的设计为提供高水平稳定性和瞬时表达该有用的基因的 质粒 cDNA。整合到该质粒 cDNA 载体的基因包括胶原 1, 弹性蛋白, 金属蛋白酶 -1 组织抑制 剂 (TIMP-1), 和细胞外超氧化物歧化酶 (EC-SOD)。包含有用的基因的 cDNA 质粒构建体可 被制成局部使用的护肤霜。
实施例 2 描述了扩增, 克隆和表达来自人肺组织的 cDNA 的人角质细胞生长因 子 -1(KGF-1, FGF-7)。
此外, 此处描述的实施例也描述了给小鼠局部施用的 KGF 质粒评估的研究 ( 实施 例 3)。在小鼠中也进行了亚治疗的微磨皮术的效度研究 ( 实施例 4 中描述 ) ; 并且在小鼠 中进行剂量增加研究 ( 实施例 5 中描述 )。
猪体内也进行了一独立组的试验性研究。通过实例, 实施例 6 描述了在猪体内进 行的亚治疗的微磨皮术的效度研究 ; 实施例 7 描述了在猪体内进行的剂量范围研究。
实施例 1- 扩增、 克隆和表达来自正常组织 cDNA 的 1 型人胶原 α1, 1 型胶原 α2, TIMP-1 及弹力蛋白
从 正 常 的 人 组 织 产 生 的 第 一 链 cDNA 购 自 BioChain 研 究 所 (Hayward, CA)。 1 型 胶 原 α1(COLA1A), 1 型 胶 原 α2(COL1A2) 和 弹 性 蛋 白 从 正 常 人 皮 肤 ( 目 录 号 : C1234218-10) 的 cDNA 扩增, 而 TIMP-1 从正常的人肺 ( 目录号 : C1234152-10) 和脑 ( 目录 号: C1244035-10) 的 cDNA 扩增。使用高保真的铂 Pfx 聚合酶 (Invitrogen Invitrogen, Carlsbad, CA) 进行基因扩增, 参照说明书, 使用基因的特定寡核苷酸。
表 1 概述了用于每种基因扩增的寡核苷酸序列, 以及聚合酶链反应 (PCR) 的条件。
表 1 也显示了自正常人组织 cDNA 扩增 COLA1A, COL1A2, 弹性蛋白及 TIMP-1 所用 的寡核苷酸序列和 PCR 参数。
表1
从正常组织克隆 COLA1A, COL1A2, 弹性蛋白及 TIMP-1cDNA 的引物及 PCR 参数
在 5′寡核苷酸设计有 NheI 限制性内切酶 (REN) 位点用于克隆至哺乳动物表达载 体质粒 pcDNA3.1+zeo : intA 紧邻的 PCMV 启动子的下游。最佳翻译起始的 Kozak 序列设计 为紧随每个 NheI 位点 (GCCGCCACCATG)( 即序列 ID 号 : 3 的 11-22 核苷酸 )。对于 COLA1A, COL1A2 及 TIMP-1 的 3′寡核苷酸设计有 HindIII 限制性内切酶位点 (REN sites), 对于弹 性蛋白有 BglII REN 用于克隆到同样的载体, 位于牛生长激素聚腺苷酸化 (BGHpA) 信号序 列的紧邻前方。REN 以下划线标注, 翻译起始密码子 (ATG) 以双下划线标注。每个基因本身 的终止密码子 ( 例如, 5′ -TAA-3′, 或 5′ -TGA-3′ ) 位于 3′寡核苷酸序列 REN 的紧邻 前方, 以粗体标注。
PCR 反应在冰上配制, 包含每种成分的终浓度如下 : 1X Pfx 扩增缓冲液, dATP, dCTP, dGTP 均为 0.3mM, 硫酸镁为 1mM, 每种寡核苷酸 0.3μM, 第一链 cDNA 模板为 dTTP, 1μL, 1.0-2.5 单位铂 PfxDNA 聚合酶, 添加无核酸酶的蒸馏水至终体积 50μL。每个反应均 为三步 PCR 循环, 使用以下参数 : 94℃, 15s ; 56℃, 30s ; 68℃, 对于每种基因的时间量如上表 1 所述。 每个扩增反应均进行 35 个循环, 之后为最终循环在 72℃持续 7min, 4℃冷藏直至分 析。 每次试验 PCR 反应使用同样的第一链 cDNA 模板和一组人 β 肌动蛋白 (BioChain) 特异 引物进行阳性对照。 PCR 后每个反应进行 Tris- 醋酸 EDTA(TAE) 琼脂糖凝胶电泳分析, 以确 定扩增的 cDNA 的延伸和完整性。对于每次分析取 10μL 每种反应物与蓝色 Juice 上样缓 冲液 (Invitrogen) 混合, 在每个 1% TAE 琼脂糖凝胶的泳道上样。以 TriDye 1kb 的 DNA 梯
形 (ladder)(New England Biolabs, Ipswich, MA) 用于评估扩增的 cDNAs 的大小。确定每 种 cDNA 的 PCR 扩增后, 按照使用说明, 每种反应物被立即克隆到 Zero Blunt TOPO PCR 克隆 系统 (Invitrogen)。菌落被筛选, 通过 PCR 或 REN 分析纯化的来自过夜的细菌培养的 DNA, 或两者同时。将含有预期大小的片段的 pCR-Blunt II-TOPO 克隆随后用合适的 REN 酶切, 分离并将全长基因克隆到哺乳动物表达载体 pcDNA3.1+zeo : intA。这个表达载体构建自 pcDNA3.1+zeo(Invitrogen), 通过将人 CMV 内含子 A 序列加至最小启动子的 3′端进行。 CMV 内含子 A 序列已被广泛地表征, 与无内含子的 CMV 启动子相比, 能大大提高重组基因在哺乳 动物细胞中的表达。内含子 A 序列从载体 pWRG7077 通过 PCR 扩增得到 ( 由 Dr.Jay Hooper 友好提供, 美国陆军医学传染病研究所 [USAMRIID]), 然后将其克隆到 pcDNA3.1+zeo 载体, 作为 NdeI-NheI 位点。pcDNA3.1+zeo : intA 是有图 8 中列出的表达元件的大小为 6.5kb 的 质粒。TIMP-1 从脑和肺组织 cDNAs 扩增得到, 本研究中, 从脑 cDNA 得到的 TIMP-1 用于所有 后续的克隆和表达试验。
克隆反应如 Maniatis 及 Sambrook 所述 (1998 年 ), 然后转化为亚克隆效率大肠 杆菌 (E.coli)DH5α 株, 用于克隆的 DNA 增殖。菌落被筛选, 通过 PCR 或 REN 分析纯化的 来自过夜的细菌培养的 DNA, 或两者同时。随后将含有预期大小的片段的 pcDNA3.1+zeo : intA 克隆用特异的 REN 进行酶切, 确认基因同一性。对于每种构建体从在选择性培养基 中过夜生长的 50mL 大肠杆菌培养物中分离高纯度 midiprep 的质粒 DNA。通过 A280 和 A260 来分析 DNAs 的纯度和浓度。每种基因的表达通过人内皮肾细胞系 HEK-293T/17 的 脂质体介导的转染确认, 然后分析细胞提取物和上清液。对每种要分析的构建体, 转染前 晚, 将 1x106HEK-293T/17 细胞接种至每孔含有 2mL 生长培养基, 多聚 -D- 赖氨酸包被的 6 孔板中, (DMEM, 高葡萄糖 ; 2mM L- 谷氨酰胺 ; 1X 非必需氨基酸 [NEAA] ; 10%热灭活胎牛血 清 [FBS]), 于 37℃, 5% CO2, 90%相对湿度 (Rh) 培养。第二天, 在转染前, 将培养物用 2mL 新鲜生长培养基填入。将每 4μg 每种质粒 DNA 构建体在 250μL Opti-MEM 减少的血清 培养基 (Invitrogen) 中柔和混合, 并与额外的 250μL 加有 10μL 脂质体 2000 转染试剂 (Invitrogen) 的同样的培养基合并。该反应物在室温下孵育 20 分钟, 使得形成 DNA : 脂质 体复合物。然后用移液器将全部反应液轻轻地吸至相应的含有 HEK-293T/17 细胞的孔中, 轻轻涡旋以均匀分散该转染混合液。然后将板放回孵育器孵育 72 小时, 然后收获并分析。 每种基因构建体的表达用转染的 HEK-293T/17 细胞提取物及上清液进行。
转染 72 小时后, 离心收集并澄清上清液。每种上清液转移 1mL 至聚丙烯离心管 中, 冰上放置直至分析。将细胞从孔中刮下, 在聚丙烯微量离心管中短暂离心形成沉淀。轻 轻倒出上清液, 让沉淀重新悬浮在 pH 为 7.4 的 1X 磷酸盐缓冲液 (PBS) 中, 短暂离心形成沉 淀。根据说明书, 倒掉 PBS, 将每种细胞沉淀重新悬浮在 100μL 哺乳动物细胞裂解缓冲液 中 (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO)。裂解缓冲液用 TRIS 缓冲液, 氯化钠, 十二烷基硫酸钠 (SDS), 表面活性剂, 脱氧胆酸和蛋白酶抑制剂制成。裂解反应在室温孵育 10 分钟, 然后在 室温下 14,000xg 离心 10 分钟。上清液转移到新的聚丙烯离心管中, 冰上放置至分析。将 每组转染的 HEK-293T/17 细胞提取物和上清液进行 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 和免疫印迹分析。每十万细胞当量 ( ~ 10μL) 与 NuPage LDS 样品缓冲液、 NuPAGE 还原 剂及去离子水混合, 90℃加热 5 分钟, 在 10% NuPage Novex Bis-Tris 凝胶每个泳道中上 样, 同样, 准备 30μL 相应的上清液, 在细胞提取物旁上样。SeeBlue Plus-2 蛋白分子量标记 (Invitrogen) 用于估计蛋白大小。凝胶在 200V 电压, 1X SDS NuPAGE MES 电泳缓冲 液中电泳 45 分钟。然后根据说明书 (Invitrogen), 利用 X-Cell II 印迹设备将电泳蛋 白转移至 0.45μm 的硝酸纤维素膜上。参照说明书, 利用蛋白检测 TMB 免疫印迹试剂盒 (KPL, Gaithersburg, MD) 进行蛋白质印迹, 利用第一抗血清及第二检测试剂, 如表 2 所述。 COLA1A, COL1A2, TIMP-1 和弹性蛋白的兔抗血清, 均购自 Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA)。 辣根过氧化物酶 (HRP) 标记的山羊抗兔 IgG(H+L)(Santa Cruz Biotechnology) 用来作为第二检测试剂。免疫复合物通过 TMB 膜底物检测 2-5 分钟, 将印迹浸泡在蒸馏水 中终止反应。通过高分辨扫描得到永久记录。HEK-293T/17 细胞中瞬时表达的 COLA1A, COL1A2, TIMP-1 及弹性蛋白的蛋白质印迹分析在所用检测试剂如表 2 所示。
表2
用于蛋白质印迹检测表达的重组蛋白的血清
图 8 显示使用 CMV 启动子启动的真核生物载体 pcDNA3.1+zeo : intA 在哺乳动物细 胞中表达人蛋白 COLA1A, COL1A2, 弹力蛋白, TIMP-1 的克隆方法。从正常的人组织的 cDNAs 通过 PCR 扩增的基因, 如材料和方法中所述克隆。COLA1A, COL1A2, 和 TIMP-1 直接克隆到 哺乳动物载体 NheI-HindIII REN 位点, 而弹性蛋白克隆到 NheI-BamHI 位点。弹性蛋白 3’ 端的 BglII 位点直接克隆到独特的同切点酶 BamHI 处。相关的表达元件是细菌的复制起 点 (ori), β- 内酰胺酶基因 (bla), CMV 早期启动子 (PCMV), 牛生长激素聚腺苷酸化信号 (BGHpA), 单链丝状噬菌体起点 (f1), 猿猴病毒 40 的复制起点 (SV40 ori), 猿猴病毒 40 多
聚腺苷酸信号 (SV40 pA), 博来霉素 (zeocin) 抗生素抗性基因 (zeocin)。
图 9 描述了从正常的人体组织的 cDNAs PCR 扩增 COLA1A, COL1A2, TIMP-1 和弹性 蛋白。使用基因特异的寡核苷酸引物扩增每种基因, 如材料与方法中所述。感兴趣的扩增 的基因用箭头标注, 其相应的大小被指示。(a)COLA1A ; (b)COL1A2 ; (c)TIMP-1 ; (d) 弹性蛋 白。KBL, 千碱基梯度 ; kbp, 千碱基对。
显示克隆蛋白 (COL1A2, TIMP-1 和弹力素 ) 的结果如图 10-12 所示。图 10 描述 了人 COL1A2 在 HEK-293T/17 细胞中的瞬时表达分析。COL1A2 蛋白大小为 138.9KDa, 如箭 头所示。COL1A2 特异性抗血清检测到的小碎片可能是不完整的翻译产物和降解的蛋白质。 图 11 描述了人 TIMP-1 在 HEK-293T/17 细胞的瞬间表达。TIMP-1 蛋白大小为 23.2Kda, 如 箭头所示。 TIMP-1 分子量高于其预测蛋白质分子量 23KDa 的可能原因是该蛋白在哺乳动物 细胞中 N- 连接和 Asn-Xaa-Ser/Thr 糖基化了。图 12 描述了人弹力蛋白在 HEK-293T/17 细 胞中的瞬时表达分析。 弹性蛋白大小为 66.1Kda, 如箭头所示。 弹性蛋白特异的抗血清检测 到的小碎片可能是不完整的翻译产物及降解蛋白质。表达结果表明, 在 HEK-293T/17 细胞 中, 弹力蛋白是不分泌的, 只是在胞内表达。
实 施 例 2- 扩 增、 克 隆 和 表 达 来 自 正 常 肺 组 织 cDNA 的 人 角 化 细 胞 生 长 因 子 -1(KGF-1, FGF-7)
材料与方法
正常人体组织的第一链 cDNAs 从 BioChain 研究所购买 (Hayward, CA)。角化细胞 生长因子 -1 从正常人体肺部 cDNAs( 目录号为 C1234152-10) 扩增。参照说明书, 用基因特 异性的寡核苷酸, 用高保真铂 Pfx 聚合酶 (Invitrogen, Carlsbad, CA) 进行基因扩增。表 3 概述用于扩增 KGF-1 基因的寡核苷酸序列, 以及聚合酶链反应 (PCR) 条件。
表3
用于来自正常的人肺组织 cDNAs 的 KGF-1 扩增的寡核苷酸序列和 PCR 参数
在 5′寡核苷酸设计有 NheI 限制性内切酶 (REN) 位点, 用于克隆至哺乳动物表达载体 pcDNA3.1+zeo : intA 紧邻 PCMV 启动子的下游。用于最佳翻译起始的 Kozak 序列设计 为紧邻每个 NheI 位点 (GCCGCCACCATG)。3′寡核苷酸被设计具有 HindIII REN( 下划线标 注 ), 用于克隆至同一载体紧邻牛生长素多聚腺苷酸化 (BGHpA) 信号序列之前。REN 位点用 下划线标出, 翻译起始密码子 (ATG) 用双下划线标出。 终止密码子天然存在于 3′寡核苷酸 序列中紧邻 REN 位点之前的基因, 并用黑体标出。
PCR 反应体系在冰上配制, 所含每种成分的终浓度如下 : 1X Pfx 扩增缓冲液, dAP, dTTP, dCTP, dGTP 为 0.3mM, MgSO4 为 1mM, 寡核苷酸为 0.3μM, 第一链 cDNA 模板为 1μL, 铂 Pfx DNA 聚合酶为 1.0-2.5 个单位, 最后用无核酸酶的蒸馏水补充至 50μL 终体积。每 个反应经过了三步 PCR 循环, 使用下列参数 : 94 ℃, 15S ; 56 ℃, 30S ; 68 ℃, 延伸时间如上表 1 所述。每个扩增反应都经过 35 个循环, 接着于 72℃终延伸循环 7 分钟, 4℃保存至分析。 每一次试验 PCR 反应旁边都使用相同的第一链 cDNA 和一组人 β- 肌动蛋白的特异性定 引物 (BioChain) 做阳性对照。PCR 每次反应后进行 Tris- 醋酸 EDTA(TAE) 琼脂糖凝胶电 泳分析, 以测定扩增的 cDNA 的延伸和完整性。对于每次分析每种反应物取 10μL 与蓝色 Juice 上样缓冲液 (Invitrogen) 混合, 在 1% TAE 琼脂糖凝胶的每个泳道上样。以 TriDye 1 kb 的 DNA 梯度 (New England Biolabs, Ipswich, MA) 来评估扩增的 cDNAs 的大小。确 认每种 cDNA 的 PCR 扩增后, 按照说明书, 将每种反应物立即克隆到 Zero Blunt TOPO PCR 克隆系统 (Invitrogen)。将转化子过夜培养, 通过 PCR 或 REN 分析来自过夜培养的细菌 培养物的纯化的 DNAs, 或将两种方法结合, 来筛选菌落。将含有预期大小的片段的克隆 pCR-Blunt II-TOPO 用合适的 REN 进行酶切用于分离, 并将全长基因克隆到哺乳动物表达 载体 pcDNA3.1+zeo : intA。
这个表达载体是在 pcDNA3.1+zeo(Invitrogen) 的 3′端的最小启动子增加了人 CMV 内含子 A。CMV 内含子 A 很独特, 与无内含子的 CMV 启动子相比, 能大大提高重组基因在 哺乳动物细胞的表达效率。内含子 A 序列从载体 pWRG7077 通过 PCR 扩增得到 ( 由 Dr.Jay Hooper 提供, 美国陆军医学传染病研究所 [USAMRIID]), 然后克隆到 pcDNA3.1+zeo 载体, 作为 NdeI-NheI 位点。pcDNA3.1+zeo : intA 是具有表达元件的 6.5kb 大小的质粒, 如图 13 所示。克隆反应如 Maniatis 及 Sambrook 所述 (1998 年 ), 然后转化至大肠杆菌 (E.coli) DH5α, 在体内扩增克隆的 DNAs。将转化子过夜培养, 通过 PCR 或酶切分析纯化的 DNAs, 或 将两种方法结合, 筛选出正确的克隆。
图 13 描述了使用 CMV 启动子启动的真核生物载体 pcDNA3.1+zeo : intA 在哺乳动 物细胞表达人蛋白 KGF-1 的克隆方法。 从正常的人体组织的 cDNAs 通过 PCR 扩增克隆基因, 如材料和方法中所述。KGF-1 直接克隆到哺乳动物载体 NheI-HindIII 酶切位点间, 相关的 表达元件是细菌的复制起点 (ori), β- 内酰胺酶基因 (bla), CMV 早期启动子 (PCMV), 牛生 长激素聚腺苷酸化信号 (BGHpA), 单链丝状噬菌体起点 (f1), 猿猴病毒 40 的复制起点 (SV40 ori), 猿猴病毒 40 多聚腺苷酸信号 (SV40pA), 博来霉素抗性基因 (zeocin)。
将含有大小正确的片段的克隆 pcDNA3.1+zeo : intA 用特异的限制性内切酶酶进 行酶切, 确保基因的特异性。从在选择性培养基中过夜培养的 50mL 大肠杆菌菌液中提取高 纯度的质粒, 通过测量 A280 和 A260 来分析 DNAs 的纯度和浓度。每个基因的表达通过脂质 体介导的转染至人内皮肾细胞系 HEK-293T/17, 然后分析细胞提取物和上清液。对每一个 要分析的构建的载体, 转染前晚, 将 1x106HEK-293T/17 细胞接种至含 2mL 生长培养基, 多聚 -D- 赖氨酸覆盖的 6 孔平板中, (DMEM 培养液, 高糖 ; 2mM L- 谷氨酰胺 ; 1X 非必需氨基酸 [NEAA] ; 10%热灭活小牛血清 [FBS])。于 37℃, 5% CO2, 90%相对湿度 (RH) 条件下培养。 第二天, 在转染前, 将培养物用 2mL 新鲜生长培养基培养。将每 4μg 质粒 DNA 加入 250μL 低血清培养基 (Invitrogen) 及 250μL 加有脂质体 2000 转染试剂 (Invitrogen) 的同样的 培养基, 在室温下孵育 20 分钟, 形成 DNA : 脂质体复合物。然后用移液器将全部反应液轻轻 地吸至相应的含有 HEK-293T/17 细胞的容器中, 轻轻搅拌, 混匀转染混合液。然后将平板放 回孵育器孵育 72 小时。基因在转染的 HEK-293T/17 细胞提取物及上清液中表达。转染 72 小时后, 离心收集上清液。每种上清液转移 1mL 至聚丙烯离心管中, 冰上放置。将细胞从容 器中刮下, 在离心管中简单的离心分离。轻轻倒出上清液, 让沉淀重新悬浮在 pH 为 7.4 的 1X 磷酸缓冲液 (PBS) 中, 离心, 弃 PBS 上清液, 根据说明书, 将沉淀重新悬浮在 100μL 哺乳 动物细胞裂解液中 (Sigma-Aldrich, 圣路易斯, 密苏里州 )。 裂解液由 TRIS 缓冲液, 氯化钠, 十二烷基硫酸钠 (SDS), 表面活性剂, 脱氧胆酸和蛋白酶抑制剂制成。裂解反应在室温孵育 10 分钟, 然后在室温下 14,000xg 离心 10 分钟。 上清液转移到新的聚丙烯离心管中, 冰上放 置。
为测定和定量表达的蛋白, 将每组转染的 HEK-293T/17 细胞提取物和上清进行 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 和 Western 杂交分析。每十万细胞当量 ( ~ 10μL) 与 NuPage LDS 样品缓冲液、 NuPAGE 还原剂及去离子水混合, 90oC 加热 5 分钟, 在 10 % NuPage Novex Bis-Tris 凝胶中上样, 同样, 准备 30μL 相应的上清液, 在细胞提取物旁上 样。SeeBlue Plus-2 蛋白分子量标准 (Invitrogen) 用于估计蛋白大小。在 200V 电压, 1X SDS NuPAGE MES 下电泳 45 分钟。 然后根据说明书, 利用 X-Cell II 印迹模板将电泳蛋白转 移至 0.45μm 的硝酸纤维素膜上。根据说明书, 利用蛋白检测 TMB 蛋白印迹试剂盒 (KPL, Gaithersburg, MD) 进行蛋白质印迹, 利用抗血清及辅助检测试剂, 如表 4 所述。 兔子的抗血 清, COLA1A, COL1A2, TIMP-1 和弹性蛋白均购自 Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA)。辣根过氧化物酶 (HRP) 标记的山羊抗兔 IgG(H+L)(Santa Cruz Biotechnology) 用来 作为辅助检测试剂。免疫复合物通过 TMB 膜底物检测 2-5 分钟, 将印迹浸泡在蒸馏水中终 止反应。通过高分辨扫描得到永久记录。
表4
蛋白印迹检测 COLA1A, COL1A2 和 KGF-1 在 HEK-293T/17 细胞中的短暂表达
所用的检测试剂
结果
图 14 表明从正常的人肺组织 cDNAs 中 PCR 扩增出来的 KGF-1 与本发明一致。用 基因特异引物扩增该基因, 如材料与方法所示。 箭头标注的是感兴趣的扩增的基因序列, 相 应的大小也予以标注。KBL, 千碱基梯度 ; KBP, 千碱基对。
图 15 是人 KGF-1cDNA 在 pCR-TOPO 载体中的克隆 ( 图 15A), 然后克隆至哺乳类表 达载体 pcDNA3.1+zeo : intA( 图 15B)。通过 NheI 和 HindIII 对重组载体 pCR TOPO 双酶 切, 得到 KGF-1 基因, 将其直接克隆至通过同样的内切酶酶切的 pcDNA3.1+zeo : intA 载体。 箭头标注的是感兴趣的扩增的 KGF-1 基因序列, 相应的大小也予以标注。KBL, 千碱基梯度 ; KBP, 千碱基对。
图 16 所示的是 KGF-1 的蛋白序列 ( 图 16A) 和 KGF-1/FGF-7 的核苷酸序列 ( 图 16B)。图 16B 中 KGF-1 的 DNA 序列对应于序列号 24 中的第 446 到 1030 位序列 ( 粗体 ), 其 他序列 ( 非粗体 ) 是基因组 DNA 序列, 只克隆了序列号 24 中的第 446 到 1030 位序列。
蛋白免疫印迹结果表明 KGF-1 蛋白在 293T 细胞中表达。例如, 图 17 是对转染 pcDNA3.1+ : intA/KGF-1、 空载 (pcDNA3.1+ : intA)、 没有 DNA 对照的细胞提取物 (C) 及上清 液 (S) 中 KGF-1 蛋白 (a), COLA1A 蛋白 (b) 和 COL1A2 蛋白 (c) 的短暂表达分析, 与本发 明的实施例一致。可以看出, 表达的 KGF-1 基因只存在于转染 pcDNA3.1+ : intA/KGF-1 的 293T/17 细胞的提取物和上清中。KGF-1 用黑色箭头标注。(M =分子量标准 ; KDa =千道尔 顿 ) 可以看出, 细胞转染 KGF 基因后在高分子量区域染色会加强, 而 COL1A1 和 COL1A2 蛋白 的染色则表明细胞转染后, KGF 的表达可能增加胶原的表达。
实施例 3-KGF 质粒局部应用于小鼠的评估 本实验研究于 BALB/C 小鼠中进行, 以判断 KGF 质粒的局部应用是否有美容修复的 实验设计如下 : 在试验组, 用尼龙刷刷 100 次去除 BALB/C 小鼠皮肤的角质层, 类似58功效。
CN 102471769 A说明书56/71 页于亚治疗的微磨皮术。对照组 BALB/C 小鼠只剪毛, 不刷毛。
两种不同的组合试剂进行测试 :
组合试剂 A : 94% TE 缓冲液 (10mM Tris) ; 5%甘油 ; 1%羟丙甲纤维素
组合试剂 B : 88% TE 缓冲液 (10mM Tris) ; 5%甘油 ; 5%丙二醇 ; 1%羟丙甲纤维素
两种不同的质粒进行测试 : gWiz-KGF1 质粒和 NTX-KGF1 质粒分别在单一浓度为 2000 微克 /mL 下进行测试。每只小鼠每次注射 4 微升。
使用 KGF1 质粒的试验组 :
空白对照包括 : - 没有处理 ;- 载体 A 单独处理 ;
- 载体 B 单独处理 ;
- 仅 gWiz-KGF1 质粒, 没有载体
- 仅 NTX-KGF1 质粒, 没有载体
对照组没有使用任何质粒 : 用载体 A 或 B 处理的同一小鼠都有 2 个斑点 ; 同一小鼠 除毛后刷过但没有用载体处理的皮肤区域被认为是 “非载体” 。
载体 A 刷 不刷
刷 gWiz-KGF1 NTX-KGF 1
n=1 n=1 不刷 n=0 n=0 n=1 n=1 载体 B n=1 n=1 没有载体 n=1 n=1对照组没有使用载体 : 仅质粒 ( 无载体 ) 在皮肤上使用所有试验组的详细情况 :
材料和方法 质粒 质粒及载体来自于 Aaron Tabor, Gene Facelift, LLC。 动物 20 只 BALB/C 氏小鼠来自于 Jackson 实验室并在实验之前被驯化。质粒给予
小鼠用氯胺酮及二甲苯胺噻嗪 (1/10) 的混合物麻醉。剃掉它们的背毛, 但是并 不使其脱落。治疗区域要用力地用尼龙刷清洗 (3 排 4cm×1cm 的尼龙纤维 )。通行 100 次 (2 个垂直方向分别 50 次 ) 得到红斑而不出血即可, 以此来破坏皮肤屏障。此 2 个垂直方 向通行产生一个重叠的约 1 平方厘米的治疗区域。那些治疗混合物 ( 如 : gWiz-KGF 质粒或 NTX-KGF1 质粒 ) 就可应用于此拉绒区域, 通过一种 P10 微量吸管 (GILSON, 法国 ) 轻柔将混 合物散布于此区域, 在动物返回到笼内之前, 不要摩擦, 并让其干燥。实验动物都将单独饲 养。
质粒转染后的组织学评估
每只动物的数据结果都在实验 0 天开始记录, 直到实验动物死亡。皮肤活检样本 用 12mm 的打孔器获得, 包括了治疗区域及其上下 1mm 的皮肤细胞。此样本取得后, 平放于 暗盒中, 并予以 10%的福尔马林处理。之后用 H&E, Mason Trichrome 和 Von Gieson 染色, 分析皮肤厚度, 胶原及弹性纤维成分。
结果简介
根据组织学分析, 在被拉绒了皮肤并转染了 gWiz-KGF1 质粒 ( 没有载体 ) 的动物 中, 没有美容的皮肤回复青春的效果。 gWiz-KGF1 质粒被证实是有发挥作用的, 比如, 有一些 正结果显示有美容的皮肤回复青春效果, 只有载体 B 显示有一些祛疤效果。结果显示, 具有 增强穿透性的丙二醇, 能够使 gWiz-KGF1 产生美容的皮肤回复青春的正结果。
NTX-KGF1 质粒则显示有美容的皮肤回复青春作用, 不论使用载体 A, 载体 B, 还是 不用载体 ( 生理盐溶液 ), 不过只适用于祛疤。
不管是 gWiz-KGF1 质粒还是 NTX-KGF1 质粒, 除了祛疤或恢复拉伤皮肤的功能之 外, 不具有其他美容的皮肤回复青春功效。
前文使用过的词句 “美容的皮肤回复青春阳性效果” , 包括一系列使用 KGF1 质粒 治疗之后令人满意的改变, 如本文所述, 是用组织学评估的得到, 此改变包括 :
1. 增加角质层细胞数量从而增强表皮厚度 (H&E 染色 ) ;
2. 增加真皮层胶原的厚度和密度 (Masson′ s Trichome 染色 ) ;
3. 增加真皮层及表皮层连接处垂直方向的弹性纤维 (Luna 染色 ) ;
4. 增加基底细胞增殖 (Ki-67 染色 ) ;
实施例 4- 小鼠亚治疗微磨皮验证研究
本研究的目的是为了验证小鼠中的亚治疗磨皮实验有效。本实验中, 用到 SV129 型小鼠。磨皮手术也基于该小鼠。每只小鼠活检完毕后, 实验者在其相应位置做上标记, 活 检是在磨皮手术之后立即执行的。
在磨皮手术中, 用到了两种尼龙刷, 用于拉绒小鼠皮肤的两种尼龙刷, 有着不同的 鬃毛。
此二种尼龙刷如下所述 :
本尼龙刷, 具有柔软 ( 不硬 ) 的鬃毛, 标记绿色的尖部 (G) ;
本尼龙刷, 具有硬的鬃毛, 标记黄色尖部 (Y)。
下文是用于标记的代码 :
第一个字母 : 代表尖部的颜色 (G 代表绿色, Y 代表黄色 )- 接下来的字母 : 代表压力用 “in Hg” 表示 (10, 15 或者 20) - 接着的数字 : 代表样品号码 (1 到 4) 病理学样品编码
基于上述研究结果, 黄尖 ( 具有硬鬃毛, 黄尖部的尼龙刷 ), 20/Hg 被选作微磨皮器材。 实施例 5- 小鼠给药剂量上升实验
本实验的目的是为了评估不同剂量的 NTX-KGF1pDNA 质粒在小鼠中的效果。
本实验是基于实施例 4 中的微磨皮装置。根据实施例 4 中的结果, 黄尖 ( 具有硬 鬃毛, 黄尖部的尼龙刷 ) 在 20in Hg 被选作微磨皮器材。
总共有 26 只 “SV 129 小鼠” 参与该实验, 该小鼠被称作 “GFP 小鼠” 或者绿色荧光 蛋白小鼠 ( 因为该小鼠在其细胞质中表达 GFP)。
本实验, 只对 NTX 质粒 ( 特别是 NTX-KGF1pDNA) 进行了评估。gWiz-KGF1 质粒没有 用于本实验。NTX-KGF1 质粒是 NTC8385-KGF1lot#NTC-Ol 1007( 由 Nature Technology 于 2009 年 10 月 27 日生产 )。该质粒是 3.18mg/ml 的冻干粉。
本实验检测了 6 种不同剂量的 NTX-KGF1pDNA 质粒, 分别是 50, 100, 250, 500, 750, 和 1000 毫克 / 毫升 (μg/ml)。
本实验唯一用的载体是载体 A, 成分描述如下 : 94% TE 缓冲液 (10mM Tris) ; 5%甘 油; 和 1%羟丙基甲基纤维素。
一只小鼠在麻醉之后便死去。
本实验对照组有以下小鼠组成 :
- 只做磨皮手术 (2 只 ) ;
- 磨皮手术 + 载体 A(2 只 ) ;
- 只有载体 A( 无质粒, 无磨皮手术 )(2 只 ) ;
- 载体 A+6 种不同浓度 NTX 质粒 (50, 100, 250, 500, 750, 和 1000 毫克 / 毫升 ) 但 是不做磨皮手术 ( 每个浓度一只小鼠 )。
为了检测不同给药剂量, 设置了两组实验组 :
- 一些小鼠接受全部实验处理 ( 磨皮手术, 于载体 A 中的不同浓度的质粒 ) ;
- 另一些小鼠仅有于载体 A 中的不同浓度的质粒, 没做磨皮手术。
本实验小鼠用克他命及甲苯胺噻嗪 (9/1) 腹部麻醉。剃掉其的背毛, 但是并不使 其脱发。
本替代治疗磨皮手术用真皮标记。微铺平装置 (Dermasweep Inc.Rocklin, CA, USA) 用的是黄尖尼龙刷, 20in Hg 真空压力。
Dermasweep 迷你微磨皮装置
该 Dermasweep 迷你微磨皮装置 (Dermasweep Mini), 其特征是, 有一个密闭可调 真空压力系统, 可以将皮肤轻轻拉起, 利用尼龙刷, 以准确可控的方式轻柔地去除上层皮 肤。
该尼龙毛刷的尖部以传统的晶体系统去掉杂质和危害物质。 该 Dermasweep Mini) 装置经过了 FDA 认证的。
小鼠中 NTX-KGF1pDNA 质粒的应用
在亚治疗微磨皮之后 ( 大约 5 分钟 ) 立即用微量管加入不同浓度的 NTX-KGF1 pDNA 质粒, 并在实验动物回笼前让其干燥。麻醉剂的用量足够多直到观察小鼠背部复合物 干燥。
未用质粒的对照组
处置说明 进磨皮手术 磨皮手术 + 载体 A 仅载体 A
剂量 (μg/ml) 50 100 250 磨皮手术 164, 165 828, 159 162, 900 无磨皮手术 163, 833( 额外的小鼠 ) 155 156 小鼠标签号码 831, 830 160, 161( 背部有深的抓痕 ) 829, 166接受不同剂量的 NTX-KGF1pDNA 质粒的测试组64CN 102471769 A 500 750 1000
说826, 170 827, 158 167, 157明书169 832 17162/71 页实验 5 结果概要
本实验结束后, 应用组织学来分析不同处置组的效果。所有剂量的 NTX-KGF1pDNA 质粒, 特别是 100, 250, 和 500 微克 / 毫升 (μg/ml), 其组织学评价如下 :
1. 增加角质层细胞数量从而增强表皮厚度 (H&E 染色 ) ;
2. 增加真皮层胶原的厚度和密度 (Masson′ s Trichome 染色 ) ;
3.500 微克 / 毫升的剂量引起一定的炎症 / 毒力。
实施例 6- 猪的微磨皮验证
本实验的目的是为了评估和验证用于增强 KGF-1pDNA 递送至猪皮肤的亚治疗微 磨皮设置。
用于本实验的种类和品系是 Yorkshire 猪 ; 该猪被检测是健康的, 并且初始体重 为约 200lbs。 本实验假定如下 : 1) 亚治疗微磨皮能以可控, 可重复的方式进行 ; 2) 亚治疗微磨 皮加上 KGF-1pDNA 将产生美容的皮肤回复青春的功效 ; 3) 亚治疗微磨皮单独或者加 / 减载 体不产生美容的皮肤回复青春。
研究目的 :
1. 确定最佳的微磨皮设置 ( 尖部级别, 穿过数量, 真空压力 ) 来有效地去除 ( 或几 乎去除 ) 角质层而不破坏或引起基本的有活力的表皮炎症。
2. 证明亚治疗的微磨皮程序可控且可重复。
3. 确定局部应用 KGF-1pDNA 与优化的亚治疗的微磨皮程序联合给予的剂量—— 药效。
实验 #1
优化亚治疗的微磨皮的程序
处理和组织收集 : 用到了一只 Yorkshire 猪。该 Dermasweep 迷你微磨皮装置 ( 本文别处所述 ) 用于确认以确定角质层去除的程度和再生性。当电力剪下并轻柔清洗 Yorkshire 猪的治疗区域后, 改变真空压力和通行次数, 产生不同的治疗排列。
进行皮肤打孔活检和 H&E 染色来检测角质层的移除百分比。
本实验中, 评估了 Dermasweep 迷你微磨皮装置的不同的设备设置, 来测定哪种设 备产生亚治疗的去除角质层而不破坏或者使基本的有活力的表皮发炎。治疗区域大约有 2×2 厘米= 4 平方厘米。去皮后组织立马收集。当最后的实验手术结束后, 实验动物被安 乐死。
最低的 Dermasweep 微真空设置在 3/Hg 分析, 最高的为 27/Hg。多数情况下, 用该 设备治疗人时, 真空设置设为 15-20/Hg 范围, 在 1 垂直和 1 水平通行期间, 用中等的 ( 绿 色 ) 或中等粗糙 ( 黄色 ) 处理尖部。相对于中等的 ( 绿色 ) 处理尖部, 中等粗糙的 ( 黄色 ) 处理尖部具有更硬的尼龙鬃毛。尖部在皮肤上移动速率评估为 10cm 每秒。对照皮肤区域
不进行磨皮手术处理, 其被收集用于分析。
材料和方法
Dermasweep 迷你微磨皮装置
正如本文其他位置所述, Dermasweep 迷你微磨皮装置 ( 即 “Dermasweep Mini” ), 其特征是, 有变量水平真空泵的密闭系统, 在鬃毛以精确和控制的方式 “扫走” 皮肤的死
层时将皮肤轻轻拉起。该鬃毛尖部完全去掉与传统的晶体系统相关的杂质和危害物质。 Dermasweep Mini 为 FDA 认证的医疗设备。
微磨皮程序
将 Yorkshire 猪麻醉, 治疗区域用电剪剃毛并清洗, 但并不脱毛, 然后如以上指定 的以多种设备设置进行程序。
组织收集
所有组织从试验 0 天在单一时间收集, 皮肤活检组织在微磨皮之后立即收集, 利 用的是 12mm 活检打孔器。在最终的手术之后, 实验动物处以安乐死。
活检样品名称 : 侧面活检
两个对照样品用 C1 和 C2 表示 活检样品名称 : 下腹活检5/Hg 绿尖 黄尖 G5-B Y5-B 10/Hg G10-B Y10-B 15/Hg G15-B Y15-B 20/Hg G20-B Y20-B 25/Hg G25-B Y25-B其中 B 表示腹部
评价
本实验组织样本平放于暗盒中, 并置于 10 %的福尔马林中用于组织学。之后用 H&E 染色, 分析角质层 / 表皮 / 真皮厚度, 以及任何炎症指示物的存在。
实验 #1 结果概述
1. 该绿尖组 (G) 在 25/Hg x 2 次通行, 产生了最平滑地移除角质层。在任何压力 设置下, 用绿 (G) 尖没有观察到上皮损伤。黄尖 (Y) 产生了更多粗糙的表面, 并在 20/Hg 时 上皮开始显著损伤。
2. 该猪的侧腹被确定为最佳治疗区域。 其下腹部是皮肤中具有大的峰和谷的高度 凹凸不平的皮肤。腹部皮肤的 “谷” 没有显现出具有任何角质层被移除。
侧腹则为更平滑的皮肤。
3. 为猪刺字则是为了确定样品是来自与精确的微磨皮治疗区域。
实验 #2
局部应用 KGF-1pDNA 之后亚治疗磨皮手术
处理和组织收集 : 用到了 1 只 Yorkshire 猪。在实验 0 天, 测试之前, 利用电剪剃 掉毛并轻轻清理干净, 接着进行温柔的微磨皮程序 ( 如前文所述测定 ) 以去掉角质层。该 治疗区域约为 2×2 厘米= 4 平方厘米。组织在实验 4 天后单独收集 ( 处理后 96 小时 )。 实验动物在第 4 天的实验后处以安乐死。
载体 :
载体 A : 94% TE 缓冲液 (10mM Tris) ; 5%甘油 ; 和 1%羟丙基甲基纤维素。
质粒 :
NTX-KGF1pDNA 质粒被配制成不同浓度 100, 250, 500, 750, 1000, 1500, 和 2000 微克 / 毫升。因为在小鼠中 NTX-KGF1 表现出强烈的肉眼可见的效果, 所以实验确定了一个大范 围 ( 超过 20 倍 ), 每平方厘米用 4 微升体积 ( 比如 : 4 平方厘米的区域用 16 微升 )。
对照组由以下组成 : 1) 无微磨皮或者 pDNA 治疗 ( 收集相邻的治疗区域 ) ; 2) 只有 微磨皮 ; 3) 微磨皮之后只有载体。处置表如下 :
质粒
质粒和载体来自于 Aaron Tabor, Gene Facelift, LLC.
动物
一只 Yorkshire 猪在实验之前被使之适应。
微磨皮程序及质粒应用
本实验猪被麻醉, 在应用亚治疗微磨皮程序之前, 其背部用电剪剃掉毛发并清理, 但是不会使其脱毛, 正如实验 #1 所述。
本实验治疗区域用微磨皮技术去除其角质层, 该区域大约 2x 2 = 4 平方厘米大 小。
本实验微量管涂布于该治疗区域, 并用一次性血清刷 ( 或小铲 ) 涂布均匀, 不要摩 擦, 在动物回笼之前, 令其干燥。
本实验动物单独饲养
组织收集
所有组织在第 3 天某一时间收集, 在实验第 3 天, 该动物被麻醉。用 12mm 活检打 孔器取样, 之后该动物被处以安乐死。
评价
评价在实验 0 天, 微磨皮之前和之后, 每日进行直到实验动物牺牲。
组 织 样 本 取 得 后, 平 放 于 暗 盒 中, 并 置 于 10 % 的 福 尔 马 林 用 于 组 织 学。 用
H&E±Selective Ki67 染色, 胶原及弹性纤维成分被用于另外的组织学分析。
示例性实验总结 : 猪的亚治疗的微磨皮和基因治疗——剂量递增研究
动物模型 : 使用一只 8 月龄的大 Yorkshire 母猪 (275 磅 ), 全身麻醉使之镇静。
治疗区域绘图 : 治疗点用笔标记在背部和侧面。
治疗区域绘图 : 治疗编码编号直接写在皮肤上。
该猪皮肤模型的相关性 : 其背部和侧腹部皮肤与人皮肤相似。
样品收集方法 : 在计划的治疗区域周围 ( 黑点标记的 ) 用 12mm 打孔器标记一 个黑圈, 在其垂直方向上 24mm 处 (2 倍于打孔的距离 ), 做上刺字标记 ( 红色标记 )。该 刺字标记用的是斯波尔丁特电器纹身标记, 型号为 SSEMK, Spaulding&Rogers MFG., Inc. Voorheesville, NY USA。电压设定为 17 到 21 之间。在刺字标记之后, 洗去墨迹, 微磨皮则 用 25/Hg 压力, 绿尖尼龙刷, 载体 A 或者不用质粒。
治疗说明
治疗区域命名 执行治疗的范围 ( 从左到右, 从上到下 )顺序 1 治疗说明 无70CN 102471769 A 2 3 4 5 6 7 8
9 10 11 12
说单独磨皮 单独载体明书68/71 页磨皮 + 载体, 无质粒 50 微克 / 毫升 NTX 100 微克 / 毫升 NTX 250 微克 / 毫升 NTX 500 微克 / 毫升 NTX750 微克 / 毫升 NTX 1000 微克 / 毫升 NTX 1500 微克 / 毫升 NTX 2000 微克 / 毫升 NTX这些顺序在每个身体区域 ( 背部和侧腹部 ) 上重复除了对照组只有 NTX 无磨皮手 术的。该 3 组重复治疗方案动物分别标记 A, B, C。身体背部区域标记 D, 侧腹部区域标记 F。
对于只用 NTX 治疗, 不做磨皮手术的, 其编码是 :
第一个字母是其剂量, 第二个字母是样品编号 (A 或 B)
例如 :
50-A : 50 微克 / 毫升质粒, 没有进行磨皮手术, 第一个样品。
100-B : 100 微克 / 毫升质粒, 没有进行磨皮手术, 第二个样品。
病理切片命名 ( 样品 ID)
石蜡切样 本实验皮肤样品, 从中间切样。接着放入石蜡模具, 面朝下, 放置垂直直到石蜡凝集。 结果摘要 ( 病理分析 )
在 50 微克 / 毫升 NTX-KGF1pDNA 治疗下, 与对照组并无明显差异。
1) 在 100 到 250 微克 / 毫升 NTX-KGF1pDNA 治疗下, 表皮和真皮增殖良好, 在表皮 和真皮的连接处, 有浓密的胶原质将其连接。这是皮肤产生主要结构 ( 胶原质 IV/VII 和胶 原质 I/III) 来对抗皱纹的证据。其表皮同样以增加网钉 ( 交错连接 ) 的形式增厚, 使表皮 及真皮区域增加。基底干细胞 ( 真皮右上面 ) 染色更深 ( 扩散更大 )。
2) 在 500 微克 / 毫升 NTX-KGF1pDNA 治疗下, 出现一定的皮肤角化过度 ( 表明有炎 症反应 )。
3) 在 750 到 2000 微克 / 毫升 NTX-KGF1pDNA 治疗下, 皮肤角化过度, 不存
在浓密的胶原层。
4) 在单一剂量 250 微克 / 毫升 NTX-KGF1 pDNA 治疗下, 真皮层以增加角蛋白
细胞的形式增厚。厚厚的纤维胶原直接堆积在真皮 - 上皮交联处。
对于美容的皮肤回复青春的显著影响
本文描述的研究结果, 如在实施例中进一步详述, 表明利用质粒 DNA 进行表面皮 肤层细胞的基因治疗, 可以得到令人惊奇且意想不到的美容的皮肤回复青春效果。该结果 证实, 应用 KGF1 pDNA, 通过递送路径, 和本文描述方法, 在美容的皮肤回复青春方面很大益 处。 因此, 此种在人中的给予可类似地有益于改正皮肤老化的标记, 去除美容外观的不良变 化, 例如 : 起皱, 下垂, 变薄, 干燥, 暗淡, 粗糙, 和紫外线照射引起的皮肤变色和老化。 此处所 述的实施例只为举例说明, 而不是为了限制本发明的范围。一个或多个其他生物分子的表 达, 如: PDGF 或者其他生长因子, 结构生物分子 ( 如胶原 1, 胶原 3), 抗氧化分子 ( 如过氧化 物歧化酶 ), 同样在本发明范围内, 并且也可以评价对于消除美容外观的不良变化的影响, 例如 : 起皱, 下垂, 变薄, 干燥, 暗淡, 粗糙, 变色的皮肤, 这些往往是紫外线照射和老化的结 果。
这些结果进一步表明, 外用抗皱基因治疗可大为发展, 比如 : 整形外科, 皮肤科, 医 疗水疗市场。 事实上, 生长因子恶化的基因往往被新的生长因子基因取代, 以重新启动胶原 质和弹性蛋白的生产, 恢复皮肤的厚度。
本文所述的组合物和方法, 可用于纠正皮肤老化的根本原因, 即, 促进正确的断裂 或基因突变。 在一般情况下, 此处所述的组成和方法可以用来增加皮肤厚度, 增加胶原和弹 性蛋白, 因此此处所描述的基因治疗能够可靠和有效地用于恢复美容特性。一定的生长因 子, 如 KGF, 能被用来在其他哺乳动物, 甚至人中, 以产生抗皱的理想的美容效果。
本发明其他令人惊讶和意想不到的优势, 包括但不仅限于 : 1) 相比 Botox 治疗 ( 往往肌肉瘫痪 ) 和 Juv é derm( 暂时的皮肤扩张 ) 治疗, 具在不刺激下, 增加皮肤质量的优 势; 2) 与多肽短暂治疗相比, 能持续达到预期效果, 因为基因治疗有更强有力的美容效果 ; 3) 与其它化妆药品相比, 本发明的组成和方法是具有更多的使用途径, 比如 : 治疗皱纹, 下 眼圈, 手背, 颈部下垂。
本文引用的所有专利、 出版物、 摘要和其他参考文献通过参考以其全文结合至此。
应理解, 前述仅涉及本发明的某些实施方案和多种修饰或改变可在此进行而不脱离本发明 的精神和范围, 如所附权利要求书中限定的。74CN 102471769 A
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