一类免疫调节剂及其制备方法和用途 技术领域 本发明涉及一类具有免疫调节活性的免疫调节剂， 以及这些化合物的制备方法。 更具体地说， 本发明涉及支链改造的新一代免疫调节剂或其药学上可接受的盐， 以及它们 的制备方法和这些新化合物在免疫调节领域中的应用。
背景技术
免疫调节剂是一类具有免疫调节作用的药物， 可通过影响机体免疫应答反应和免 疫病理反应而调节机体的免疫功能， 目前广泛应用于器官移植抗排斥反应和自身免疫性疾 病的治疗。 免疫调节剂的迅速发展， 为目前临床器官移植所取得的巨大成功奠定了基础。 医 学研究者们对免疫调节药物的不断探索与研究， 新型药物的不断问世， 使免疫调节药物在 临床中的应用占有越来越重要的地位。
免疫调节剂发展至今， 一般可分为四大类， 分别为 ： 类固醇类药物、 抗代谢类药物、 T 淋巴细胞抑制剂和抗体类免疫抑制剂。
类固醇类药物主要有泼尼松、 甲基强的松龙和地塞米松等。该类药物作为免疫调 节剂在临床用药已有很长一段时间， 其抗炎和免疫抑制作用已得到充分证实。此类药物对 免疫反应的多个环节均有抑制作用， 包括防止和抑制细胞中介的免疫反应， 减少 T 淋巴细 胞、 单核细胞、 嗜酸性细胞的数目， 降低免疫球蛋白与细胞表面受体结合的能力， 并抑制白 介素的合成与释放， 从而阻止 T 淋巴细胞向淋巴母细胞转化， 延缓源发免疫反应的扩展。
抗代谢类药物主要有硫唑嘌呤 (AZP) 和霉酚酸酯 (MMF)。AZP 主要作用于 S 期细 胞， 导致 DNA 合成障碍， 并可抑制淋巴细胞增殖， 防止抗原敏感型淋巴细胞转化为淋巴母细 胞， 但长期试用该药物易造成肝损伤、 白细胞和血小板减少等不良反应。MMF 具有较强的免 疫抑制活性， 其通过控制细胞和抗体介导的排斥作用， 抑制抗体的形成来延长移植物的存 活。
T 淋巴细胞抑制剂主要有环孢素 A(CsA)、 他可莫司 (FK506) 等。环孢素 A 是第一 个具有选择性的免疫调节剂， 其无骨髓抑制副作用， 不影响人体免疫系统防御感染的能力。 FK506 是一种强效免疫抑制剂， 通过与 FK 结合蛋白结合， 抑制钙依赖性磷酸酯合成酶， 阻断 活化的 T 细胞核心因子从细胞浆向细胞核转移， 进而抑制 IL-2 的生成。
抗体类免疫抑制剂主要有单克隆 T 淋巴细胞抗体 (OKT3) 和抗淋巴细胞球蛋白 (ALG)。单克隆 T 淋巴细胞抗体能特异性与人 T 淋巴细胞抗原相结合， 直接作用于淋巴细胞 亚群， 阻断 T 细胞的再生及其功能， 从而起到免疫调节作用， 其最常见的不良反应为 “首剂 反应” 。抗淋巴细胞球蛋白进入体内后， 能够与循环系统中的淋巴细胞相结合， 阻断淋巴细 胞正常功能所必须的受体， 在肝脏调理素和补体的协助下， 选择性的耗尽 T 淋巴细胞， 从而 形成以 T 细胞为主的细胞免疫抑制状态， 可以降低迟发型过敏反应提高器官移植物的生存 率。
随着环孢素 A(cyclosporin)、 他克莫司 (tacrolimus， FK506) 等免疫调节药物的 应用， 临床器官移植成功率得到了很大的提高。但目前常规的免疫调节类药物大多治疗窗狭窄、 价格昂贵， 而且多具严重毒副作用， 如长期服用环孢素的病人自身免疫力都有不同程 度的削弱， 感染病原微生物的危险性增加 ； 他克莫司会导致局部皮肤免疫功能下降， 进而引 起继发细菌感染。
FTY720(1)， 是一种新型的免疫调节剂。 它是将冬虫夏草抽提物中具有免疫抑制作 用的成份 ISP-1 进行结构改造而成。
FTY720(1) 为鞘氨醇 -1- 磷酸酯 (S1P) 受体激动剂， 在体内经磷酸化后的 FTY720 就成为 S1P 的类似物， 可促使 T 淋巴细胞和 B 淋巴细胞自外周淋巴器官流出， 也可促使胸腺 细胞自胸腺流入外周血， 从而减少淋巴细胞到达移植物部位的概率， 延长移植器官的存活 时间。FTY720 的体内作用机制独特， 在抑制免疫排斥反应发生的同时不会破坏机体对病毒 的免疫应答及免疫记忆力， 不良反应少， 生物利用度高。
但是， FTY720 在给药后会造成短暂心动过缓反应， 其他的副作用主要常见于贫血、 水肿、 高血钾、 多毛症、 肠胃不适和心动过缓等症状。而且， 导致黄斑变性的发生是 FTY720 所造成的最严重副作用， 并最终使 FTY720 退出器官移植的临床试验。
因此， 发展与常规免疫调节剂具有不同作用机制新型药物将有十分重要的意义。
发明内容 本发明的一个目的是提供一类免疫调节剂或其药学上可接受的盐， 其活性与 FTY720 相当的免疫调节剂。
本发明的另一目的是提供一种所述免疫调节剂或其药学上可接受的盐的制备方 法。
本发明的再一目的是提供所述免疫调节剂或其药学上可接受的盐在制备免疫调 节药物中的应用。
本发明的目的是这样实现的 ：
根据本发明的第一个目的， 本发明提供了一类免疫调节剂或其药学上可接受的 盐。
通过对 FTY720 和其类似物的构效关系研究， 在此基础上设计并合成了一系列新 的免疫调节剂。本发明维持了该类化合物亲水头部结构， 认为氨基丙二醇头部结构对其类 似物的活性也是至关重要的 ； 在亲酯部分中， 由于苯环的存在， 分子活性得以提高而毒副作 用降低， 因此也维持了苯环的结构。为了发展新的免疫调节剂， 通过改变柔性的 C8 支链， 具
体是用更具刚性的六元环支链代替刚性较差的烷基支链， 通过增强支链的强度和立体位阻 来提高此类新化合物的免疫调节活性， 降低毒性及改善该类药物的药代动力学性质。
本发明提供的一类免疫调节剂或其药学上可接受的盐为 FTY720 苯环上侧链取代 改造的化合物， 其结构通式如式 (I) 所示 ：
其中 ：
R 为 H 或 C2 ～ C5 的 直 链 烷 基， 具 体 为 H-、 CH3CH2-、 CH3CH2CH2-、 CH3(CH2)2CH2- 或 CH3(CH2)3CH2- ； 优选地， R 与苯环处于反式， 结构通式 (I) 为反式构型。
根据本发明的第二个目的， 本发明提供了一种上述免疫调节剂或其药学上可接受 的盐的制备方法。
本发明上述的免疫调节剂或其药学上可接受的盐的制备， 通过下列反应制得 ：
其中， R 的定义同上 ； Cbz 表示苄氧羰基。 a、 化合物 ( Ⅱ ) 经酯化反应得化合物 ( Ⅲ ) ； b、 化合物 ( Ⅲ ) 进行还原反应得化合物 ( Ⅳ ) ； c、 化合物 ( Ⅳ ) 经溴代反应得化合物 ( Ⅴ ) ； d、 化合物 ( Ⅴ ) 与三苯基膦反应得化合物 ( Ⅵ ) ； e、 化合物 ( Ⅵ ) 与化合物 (4) 经过 Witting 偶联反应得到化合物 ( Ⅶ )， 化合物 ( Ⅶ ) 为顺反异构体混合物 ；
f、 化合物 ( Ⅶ ) 经氢化还原反应， 同时脱去 Cbz 保护基得化合物 ( Ⅷ ) ；
g、 化合物 ( Ⅷ ) 在稀酸条件下进行水解得化合物 ( Ⅰ )。
本发明上述的免疫调节剂或其药学上可接受的盐的制备方法可以具体描述如下： 化合物 ( Ⅱ ) 与甲醇通过常规的酯化反应， 得到化合物 ( Ⅲ )。
化合物 ( Ⅲ ) 经还原反应得化合物 ( Ⅳ )， 该反应所用的还原剂为铝或硼的复氢化 物及其衍生物， 优选为氢化铝锂、 硼氢化钠、 硼氢化锂或硼氢化钾和氯化锂， 最优选为硼氢 化钾和氯化锂体系 ； 该反应所用溶剂优选四氢呋喃。
化合物 ( Ⅳ ) 经溴代反应制得化合物 ( Ⅴ )， 该反应所用的溴化试剂常为溴化氢或 三溴化磷， 优选三溴化磷。
化合物 ( Ⅴ ) 与三苯基膦反应， 优选无水甲苯为溶剂， 在氮气保护下反应制得化合 物 ( Ⅵ )。
化合物 ( Ⅵ ) 和化合物 (4) 在碱性条件下经 Witting 偶联反应生成烯烃化合物 ( Ⅶ )， 常用的碱如氢化钠、 叔丁醇钾、 碳酸钾等， 其中优选无水碳酸钾 ； 反应溶剂优选四氢 呋喃和 N， N- 二甲基甲酰胺混合溶剂 ； 得到的烯烃化合物 ( Ⅶ ) 为顺反式混合物， 但无需分 离。
化合物 ( Ⅶ ) 再经加氢还原同时脱去 Cbz 保护基生成化合物 ( Ⅷ )， 其中可使用本 领域技术人员已知的催化剂， 如钯碳， 其用量为化合物 ( Ⅶ ) 质量的 6％ -10％， 而氢压可为 2 1-20kg/cm 。
化合物 ( Ⅷ ) 在稀酸条件下水解脱保护得化合物 ( Ⅰ )， 常用的稀酸为稀硫酸、 稀 盐酸或乙酸 (1mol/L-8mol/L)， 优选稀盐酸， 浓度为 6mol/L。
例如， 当 R 为 CH3(CH2)2CH2- 时， (E)-4-(4- 正丁基环己基 ) 苯甲酸 ( Ⅱ -4) 经过常 规的酯化、 还原、 溴代得到溴化物 ( Ⅴ -4)， 然后溴化物 ( Ⅴ -4) 与三苯基膦反应， 生成关键 中间产物 (E)-4-(4- 正丁基环己基 ) 苄磷叶利德 ( Ⅵ -4)， 化合物 ( Ⅵ -4) 和另一关键中间 产物醛 (4) 经过 Witting 偶联反应生成烯烃化合物 ( Ⅶ -4)， 化合物 ( Ⅶ -4) 再经过加氢还 原同时脱去氨基 Cbz 保护基生成烷基氨化合物 ( Ⅷ -4)， 化合物 ( Ⅷ -4) 经过稀酸 ( 例如， 盐酸 ) 脱保护制得目标化合物 ( Ⅰ -4)。反应式如下所示 ：
其中， 上述的化合物 4 是以三 ( 羟甲基 ) 氨基甲烷 (TRIS， 2) 为起始原料制备得到 的， 具体实施方案如下 ：
原料三 ( 羟甲基 ) 氨基甲烷 (TRIS， 2) 先后经过氨基 Cbz 保护、 羟基丙酮叉保护和 Swern 氧化制得产物醛 (4)， 该反应已有论述， 在此不再累述。可以参考文献 Monatshefte für Chemie-Chemical Monthly ： A Convenient Synthesis of Immunosuppressive Agent FTY720。反应式如下 ：
根据本发明的第三个目的， 本发明提供该类免疫调节剂或其药学上可接受的盐在 制备免疫调节药物中的应用。
本发明所涉及的免疫调节剂化合物或其药学上可接受的盐具有良好的体内、 外免 疫调节活性。
附图说明 图1： 腹腔注射给药条件对 DNFB 诱导的迟发型超敏反应的抑制作用。
图2： 口服给药条件对 DNFB 诱导的迟发型超敏反应的抑制作用。
图3： 化合物 I-3 和 I-5 对 OVA 诱导的 T 细胞增殖的抑制活性 (3mg/kg/ 天 )。
图4 ： 无 ConA 存在的条件下， 化合物 I-5 在体外诱导小鼠淋巴细胞凋亡的能力。 右 下象限凋亡早期细胞群 (Annexin V+PI- 细胞群 ) 比例与 FTY720 相比较， 无明显差异。
图5： ConA(2μg/mL) 存在的条件下， 化合物 I-5 在体外诱导小鼠淋巴细胞凋亡的 能力。右下象限凋亡早期细胞群 (Annexin V+PI- 细胞群 ) 比例与 FTY720 相比较， 无明显
差异。
图6： 化合物 I-5 对于 GVHD 的治疗作用 ( 口服 3mg/kg/ 天 )。具体实施方式
以下将通过实施例进一步描述本发明， 但是， 这些实施例仅是用于说明本发明， 而 不是对本发明范围的限制。
制备实施例
制备实施例 1
1)(E)-4-(4- 正丁基环己基 ) 苯甲酸甲酯 ( Ⅲ -4)
将 (E)-4-(4- 正丁基环己基 ) 苯甲酸 ( Ⅱ -4)( 购买自山东烟台芳臣化学材料技术 有限责任公司 )(26.0g， 0.1mol) 溶于 200mL 甲醇中， 滴加入 98％硫酸 (0.9mL， 0.014mol)。 滴加完毕后加热回流反应 8 小时， 反应完全， 冷却后有白色固体析出， 抽滤， 水洗后少量甲 醇洗， 低温烘干， 得白色固体 24.2g， 收率 88％。 1
mp 39-40 ℃ . H NMR(500MHz ， CDCl 3) ： δ 0.90(t ， 3H) ， 1.04-1.08(m ， 2H) ， 1.23-1.25(m， 2H)， 1.30-1.31(m， 5H)， 1.44-1.47(m， 2H)， 1.87-1.90(m， 4H)， 2.50-2.53(m， 1H)， 3.90(s， 3H)， 7.27(d， J ＝ 8Hz， 2H)， 7.95(d， J ＝ 8Hz， 2H). 2)4- 环己基苯甲酸甲酯 ( Ⅲ -1)
方法同上， 投入 20.0g 化合物Ⅱ -1( 购买自山东烟台芳臣化学材料技术有限责任 公司 )， 得到目标物 19.5g， 收率 90％。 1
mp 41-43 ℃ . H NMR(500MHz， CDCl3) ： δ1.24(s， 1H)， 1.34-1.45(m， 4H)， 1.74(d， 1H)， 1.84(m， 4H)， 2.54(d， 1H)， 3.88(s， 3H)， 7.25(d， J ＝ 8Hz， 2H)， 7.94(d， J ＝ 8Hz， 2H).
3)(E)-4-(4- 乙基环己基 ) 苯甲酸甲酯 ( Ⅲ -2)
方法同上， 投入 23.2g 化合物Ⅱ -2( 购买自山东烟台芳臣化学材料技术有限责任 公司 )， 得到目标物 23.4g， 收率 95％。
mp 43-44 ℃ . 1H NMR(500MHz ， CDCl 3) ： δ 0.91(t ， 3H) ， 1.04-1.08(m ， 2H) ， 1.19-1.21(m， 1H)， 1.25-1.90(m， 2H)， 1.43-1.50(m， 2H)， 1.89(d， 4H)， 2.50-2.55(m， 1H)， 3.90(s， 3H)， 7.27(d， J ＝ 9Hz， 2H)， 7.95(d， J ＝ 9Hz， 2H).
4)(E)-4-(4- 正丙基环己基 ) 苯甲酸甲酯 ( Ⅲ -3)
方法同上， 投入 24.6g 化合物Ⅱ -3( 购买自山东烟台芳臣化学材料技术有限责任 公司 )， 得到目标物 21.8g， 收率 84％。
mp 42-43 ℃ . 1H NMR(500MHz ， CDCl 3) ： δ 0.90(t ， 3H) ， 1.06-1.08(m ， 2H) ， 1.21-1.24(m， 2H)， 1.33-1.36(m， 3H)， 1.47-1.48(m， 2H)， 1.87-1.90(m， 4H)， 2.51-2.53(m， 1H)， 3.90(s， 3H)， 7.27(d， J ＝ 9Hz， 2H)， 7.95(d， J ＝ 9Hz， 2H).
5)(E)-4-(4- 正戊基环己基 ) 苯甲酸甲酯 ( Ⅲ -5)
方法同上， 投入 22.0g 化合物Ⅱ -5( 烟台芳臣化学材料技术有限责任公司 )， 得到 目标物 19.9g， 收率 86％。
mp 49-51 ℃ . 1H NMR(500MHz ， CDCl 3) ： δ 0.90(t ， 3H) ， 1.04-1.08(m ， 2H) ， 1.22-1.33(m， 9H)， 1.45-1.47(m， 2H)， 1.88-1.90(m， 4H)， 2.50-2.52(m， 1H)， 3.90(s， 3H)， 7.27(d， J ＝ 7Hz， 2H)， 7.95(d， J ＝ 7Hz， 2H).
制备实施例 2
1)(E)-4-(4- 正丁基环己基 ) 苯甲醇 ( Ⅳ -4)
将 (E)-4-(4- 正 丁 基 环 己 基 ) 苯 甲 酸 甲 酯 ( Ⅲ -4)(27.4g， 0.1mol)、 硼氢化钾 (6.5g， 0.12mol) 和氯化锂 (5g， 0.12mol) 悬溶于 100mL 无水四氢呋喃中， 回流 8 小时后冷却 至室温， 缓慢滴加 200mL 饱和氯化铵溶液， 继续搅拌 2 小时， 减压浓缩除去四氢呋喃， 乙酸乙 酯萃取， 有机相分别用水洗， 饱和氯化钠溶液洗， 无水硫酸镁干燥， 浓缩得 22.2g 白色固体， 收率 ： 90％。
mp 47-48 ℃ . 1H NMR(500MHz ， CDCl 3) ： δ 0.92(t ， 3H) ， 1.07-1.08(m ， 2H) ， 1.24-1.32(m， 7H)， 1.46-1.48(m， 2H)， 1.86-1.90(m， 4H)， 2.48-2.50(m， 1H)， 4.66(s， 2H)， 13 7.21(d， J ＝ 9Hz， 2H)， 7.29(d， J ＝ 9Hz， 2H). C NMR(CDCl3， 100MHz) ： δ23.0， 29.2， 33.6， + 34.4， 37.1， 37.3， 44.4， 65.2， 127.0， 127.1， 138.3， 147.4.MS(EI) ： m/z 246(M ， 68).
2)4- 环己基苯甲醇 ( Ⅳ -1)
方法同上， 投入 19.6g 化合物Ⅲ -1， 得到目标物 15.2g， 收率 89％。 1
mp 35-37 ℃ . H NMR(500MHz， CDCl3) ： δ1.26-1.27(m， 1H)， 1.38-1.43(m， 4H)， 1.76-1.77(m， 1H)， 1.83-1.88(m， 4H)， 2.50-2.52(m， 1H)， 4.64(s， 2H)， 7.20(d， J ＝ 8Hz， 13 2H)， 7.28(d， J ＝ 8Hz， 2H). C NMR(CDCl3， 100MHz) ： δ26.1， 26.8， 34.4， 44.3， 65.2， 127.0， + 127.1， 138.3， 147.6.MS(EI) ： m/z 190(M ， 56).
3)(E)-4-(4- 乙基环己基 ) 苯甲醇 ( Ⅳ -2)
方法同上， 投入 18.5g 化合物Ⅲ -2， 得到目标物 16.1g， 收率 98％。 1
mp 38-39 ℃ . H NMR(500MHz ， CDCl 3) ： δ 0.90(t ， 3H) ， 1.03-1.08(m ， 2H) ， 1.20-1.28(m， 3H)， 1.41-1.46(m， 2H)， 1.57(s， 1H)， 1.87-1.89(m， 4H)， 2.44-2.49(m， 1H)， 13 4.65(s， 2H)， 7.21(d， J ＝ 8Hz， 2H)， 7.29(d， J ＝ 8Hz， 2H). C NMR(CDCl3， 100MHz) ： δ11.5， + 29.9， 33.2， 34.3， 44.4， 65.3， 127.0， 127.1， 138.3， 147.5.MS(EI) ： m/z 218(M ， 68).
4)(E)-4-(4- 正丙基环己基 ) 苯甲醇 ( Ⅳ -3)
方法同上， 投入 19.5g 化合物Ⅲ -3， 得到目标物 16.0g， 收率 92％。 1
mp 48-49 ℃ . H NMR(500MHz ， CDCl 3) ： δ 0.92(t ， 3H) ， 1.07-1.08(m ， 2H) ， 1.22-1.25(m， 2H)， 1.34-1.37(m， 3H)， 1.46-1.48(m， 2H)， 1.89-1.91(m， 4H)， 2.48-2.51(m， 13 1H)， 4.67(s， 2H)， 7.23(d， J ＝ 8Hz， 2H)， 7.31(d， J ＝ 8Hz， 2H). C NMR(CDCl3， 100MHz) ： δ14.4， 20.0， 33.6， 34.4， 37.0， 39.7， 44.4， 65.3， 127.0， 127.1， 138.3， 147.5.MS(EI) ： m/z + 232(M ， 72).
5)(E)-4-(4- 正戊基环己基 ) 苯甲醇 ( Ⅳ -5)
方法同上， 投入 12.0g 化合物Ⅲ -5， 得到目标物 9.3g， 收率 86％。 1
mp 48-50 ℃ . H NMR(500MHz ， CDCl 3) ： δ 0.90(t ， 3H) ， 1.07-1.08(m ， 2H) ， 1.23-1.33(m， 9H)， 1.46-1.48(m， 2H)， 1.87-1.88(m， 4H)， 2.45-2.47(m， 1H)， 4.66(s， 2H)， 13 7.21(d， J ＝ 7Hz， 2H)， 7.29(d， J ＝ 7Hz， 2H). C NMR(CDCl3， 100MHZ) ： δ14.1， 22.7， 26.6， 32.2， 33.6， 34.3， 37.3， 37.4， 44.4， 65.2， 127.0， 127.1， 138.3， 147.5.MS(EI) ： m/z 260(M+， 72).
制备实施例 3
1)(E)-4-(4- 正丁基环己基 ) 苯甲基溴 ( Ⅴ -4)将 (E)-4-(4- 正丁基环己基 ) 苯甲醇 ( Ⅳ -4)(34.5g， 0.14mol) 溶于 200mL 二氯 甲烷中， 冰浴冷却至 -10℃， 20 分钟内滴加 5.3mL 三溴化磷， 室温反应 6 小时， 反应完毕， 加 入碎冰破坏多余的三溴化磷， 有机相分别用水洗， 饱和氯化钠溶液洗， 无水硫酸钠干燥， 旋 蒸得淡黄色固体产物 41.5g， 产率 ： 96％。 1
mp 33-35 ℃ . H NMR(500MHz ， CDCl 3) ： δ 0.92(t ， 3H) ， 1.05-1.08(m ， 2H) ， 1.25-1.34(m， 7H)， 1.44-1.46(m， 2H)， 1.88-1.90(m， 4H)， 2.48-2.49(m， 1H)， 4.51(s， 2H)， 13 7.20(d， J ＝ 9Hz， 2H)， 7.33(d， J ＝ 9Hz， 2H). C NMR(CDCl3， 100MHz) ： δ23.0， 29.2， 33.6， + 33.7， 34.2， 37.1， 37.3， 44.4， 127.3， 129.0， 135.1， 148.3.MS(EI) ： m/z 308(M ， 2).
2)4- 环己基苯甲基溴 ( Ⅴ -1)
方法同上， 投入 13.3g 化合物Ⅳ -1， 得到目标物 17.3g， 收率 98％。 1
H NMR(500MHz， CDCl3) ： δ1.25-1.28(m， 1H)， 1.36-1.46(m， 4H)， 1.75-1.78(m， 1H)， 1.85-1.89(m， 4H)， 2.50-2.53(m， 1H)， 4.51(s， 2H)， 7.20(d， J ＝ 8Hz， 2H)， 7.31(d， J 13 ＝ 8Hz， 2H). C NMR(CDCl3， 100MHz) ： δ26.0， 26.8， 33.7， 44.3， 44.2， 127.2， 128.9， 135.0， + 148.4.MS(EI) ： m/z 252(M ， 3).
3)(E)-4-(4- 乙基环己基 ) 苯甲基溴 ( Ⅴ -2) 方法同上， 投入 13.0g 化合物Ⅳ -2， 得到目标物 12.3g， 收率 74％。 1
H NMR(500MHz， CDCl3) ： δ0.96(t， 3H)， 1.08-1.12(m， 2H)， 1.25-1.33(m， 3H)， 1.44-1.51(m， 2H)， 1.91-1.94(m， 4H)， 2.48-2.53(m， 1H)， 4.52(s， 2H)， 7.22(d， J ＝ 8Hz， 13 2H)， 7.34(d， J ＝ 8Hz， 2H). C NMR(CDCl3， 100MHz) ： δ11.5， 29.9， 33.1， 33.7， 34.2， 39.0， + 44.4， 127.2， 129.0， 148.3.MS(EI) ： m/z 280(M ， 2).
4)(E)-4-(4- 正丙基环己基 ) 苯甲基溴 ( Ⅴ -3)
方法同上， 投入 10.0g 化合物Ⅳ -3， 得到目标物 10.0g， 收率 79％。 1
mp 35-37 ℃ . H NMR(500MHz ， CDCl 3) ： δ 0.88(t ， 3H) ， 1.02-1.04(m ， 2H) ， 1.18-1.22(m， 2H)， 1.31-1.34(m， 3H)， 1.40-1.44(m， 2H)， 1.84-1.86(m， 4H)， 2.44-2.45(m， 13 1H)， 4.47(s， 2H)， 7.16(d， J ＝ 8Hz， 2H)， 7.29(d， J ＝ 8Hz， 2H). C NMR(CDCl3， 100MHz) ： δ14.4， 20.0， 33.5， 33.8， 34.2， 37.0， 39.7， 44.4， 127.3， 129.0， 135.1， 148.3.MS(EI) ： m/z + 294(M ， 2).
5)(E)-4-(4- 正戊基环己基 ) 苯甲基溴 ( Ⅴ -5)
方法同上， 投入 9.0g 化合物Ⅳ -5， 得到目标物 9.0g， 收率 81％。 1
mp 31-32 ℃ . H NMR(500MHz ， CDCl 3) ： δ 0.89(t ， 3H) ， 1.03-1.05(m ， 2H) ， 1.21-1.32(m， 9H)， 1.42-1.45(m， 2H)， 1.85-1.87(m， 4H)， 2.42-2.45(m， 1H)， 4.45(s， 2H)， 13 7.15(d， J ＝ 7Hz， 2H)， 7.28(d， J ＝ 7Hz， 2H). C NMR(CDCl3， 100MHz) ： d 14.1， 22.7， 26.6， + 32.2， 33.5， 34.2， 37.2， 37.3， 44.3， 127.2， 128.9， 135.1， 148.2.MS(EI) ： m/z 322(M ， 2).
制备实施例 4
1)(E)-4-(4- 正丁基环己基 ) 苄磷叶利德 ( Ⅵ -4)
将 (E)-4-(4- 正丁基环己基 ) 苯甲基溴 ( Ⅴ -4)(20.7g， 0.067mol) 和三苯基膦 (17.5g， 0.067mol) 溶于 100mL 无水甲苯中， 氮气保护下回流反应 6 小时， 冰浴冷却， 有大量 白色固体析出， 抽滤并用乙酸乙酯洗， 得白色固体 37.1g， 产率 ： 97％。 1
mp 240-241 ℃ . H NMR(500MHz， CDCl3) ： δ0.88(t， 3H)， 0.98-1.02(m， 2H)，
1.20-1.33(m ， 9H) ， 1.76-1.83(m ， 4H) ， 2.32-2.37(m ， 1H) ， 4.26(d ，J ＝ 11Hz ， 2H) ， 6.93-6.97(m， 4H)， 7.59-7.63(m， 6H)， 7.66-7.77(m， 9H).
2)4- 环己基苄磷叶利德 ( Ⅵ -1)
方法同上， 投入 17.0g 化合物Ⅴ -1 和 17.5g 三苯基膦， 得到目标物 33.5g， 收率 97％。
mp 237-239 ℃ .1H NMR(500MHz， CDCl3) ： δ1.18-1.36(m， 5H)， 1.70-1.81(m， 5H)， 2.35-2.41(m， 1H)， 5.29(d， J ＝ 11Hz， 2H)， 6.94-6.98(m， 4H)， 7.60-7.63(m， 6H)， 7.68-7.77(m， 9H).
3)(E)-4-(4- 乙基环己基 ) 苄磷叶利德 ( Ⅵ -2)
方法同上， 投入 5.6g 化合物Ⅴ -2 和 5.3g 三苯基膦， 得到目标物 10.4g， 收率 96％。 1
mp 243-245 ℃ . H NMR(500MHz， CDCl3) ： δ0.90(t， 3H)， 0.98-1.01(m， 2H)， 1.20-1.26(m， 3H)， 1.32-1.35(m， 2H)， 1.80-1.85(m， 4H)， 2.34-2.39(m， 1H)， 5.31(d， J ＝ 9Hz， 2H)， 6.94-6.97(m， 4H)， 7.60-7.64(m， 6H)， 7.69-7.78(m， 9H).
4)(E)-4-(4- 正丙基环己基 ) 苄磷叶利德 ( Ⅵ -3)
方法同上， 投入 3.0g 化合物Ⅴ -3 和 2.7g 三苯基膦， 得到目标物 5.4g， 收率 96％。 mp 238-239 ℃ .1H NMR(500MHz， CDCl3) ： δ0.89(t， 3H)， 0.99-1.01(m， 2H)， 1.18-1.21(m， 3H)， 1.29-1.35(m， 4H)， 1.77-1.84(m， 4H)， 2.35-2.37(m， 1H)， 5.32(d， J ＝ 9Hz， 2H)， 6.94-6.99(m， 4H)， 7.60-7.64(m， 6H)， 7.69-7.78(m， 9H).
5)(E)-4-(4- 正戊基环己基 ) 苄磷叶利德 ( Ⅵ -5)
方法同上， 投入 4.9g 化合物Ⅴ -5 和 4.0g 三苯基膦， 得到目标物 8.4g， 收率 94％。 1
mp 242-243 ℃ . H NMR(500MHz， CDCl3) ： δ0.89(t， 3H)， 1.00-1.03(m， 2H)， 1.19-1.35(m ， 11H) ， 1.68-1.85(m ， 4H) ， 2.34-2.39(m ， 1H) ， 5.33(d ，J ＝ 9Hz ， 2H) ， 6.95-6.99(m， 4H)， 7.61-7.65(m， 6H)， 7.70-7.78(m， 9H).
制备实施例 5
1)(E)-5-N-Cbz-5-{2-[4-(4- 正丁基环己基 ) 苯基 ] 乙烯基 }-2， 2- 二甲基 -1， 3- 二氧六环 ( Ⅶ -4)
将 (E)-4-(4- 正 丁 基 环 己 基 ) 苄 磷 叶 利 德 ( Ⅵ -4)(3.2g， 0.0056mol)， 5-N-Cbz-5- 羰甲基 -2， 2- 二甲基 -1， 3- 二氧六环 (1.5g， 0.005mol) 和无水碳酸钾 (2g， 0.014mol) 溶于 30mL 无水四氢呋喃和 10mL 无水 N， N- 二甲基甲酰胺混合溶剂中， 回流反应 18 小时， 冷却后减压浓缩除去四氢呋喃， 加入水， 用乙酸乙酯萃取， 有机相分别用水洗， 饱和 食盐水洗， 无水硫酸钠干燥， 减压浓缩得固体。过短柱 (PE ∶ EA ＝ 10 ∶ 1) 得 1.9g 白色固 体， 为顺反式异构体混合物， 无须拆分， 可直接投入下一步， 收率 ： 77％。
2)5-N-Cbz-5-[2-(4- 环己基苯基 ) 乙烯基 ]-2， 2- 二甲基 -1， 3- 二氧六环 ( Ⅶ -1)
方法同上， 投入 5.2g 化合物Ⅵ -1 和 3.0g 化合物醛 (4)， 得到目标物 3.7g， 收率 80％。
3)(E)-5-N-Cbz-5-{2-[4-(4- 乙基环己基 ) 苯基 ] 乙烯基 }-2， 2- 二甲基 -1， 3- 二 氧六环 ( Ⅶ -2)
方法同上， 投入 1.8g 化合物Ⅵ -2 和 0.9g 化合物醛 (4)， 得到目标物 1.1g， 收率 79％。
4)(E)-5-N-Cbz-5-{2-[4-(4- 正丙基环己基 ) 苯基 ] 乙烯基 }-2， 2- 二甲基 -1， 3- 二氧六环 ( Ⅶ -3)
方法同上， 投入 2.0g 化合物Ⅵ -3 和 0.9g 化合物醛 (4)， 得到目标物 1.3g， 收率 76％。
5)(E)-5-N-Cbz-5-{2-[4-(4- 正戊基环己基 ) 苯基 ] 乙烯基 }-2， 2- 二甲基 -1， 3- 二氧六环 ( Ⅶ -5)
方法同上， 投入 2.0g 化合物Ⅵ -5 和 0.9g 化合物醛 (4)， 得到目标物 1.3g， 收率 75％。
制备实施例 6
1)(E)-5- 氨基 -5-{2-[4-(4- 正丁基环己基 ) 苯基 ] 乙基 }-2， 2- 二甲基 -1， 3- 二 氧六环 ( Ⅷ -4)
将 (E)-5-N-Cbz-5-{2-[4-(4- 正丁基环己基 ) 苯基 ] 乙烯基 }-2， 2- 二甲基 -1， 3- 二氧六环 ( Ⅶ -4)(2.0g， 0.0043mol) 和 0.2g 钯碳加入 20mL 无水甲醇中。充入氢气， 室 温反应 2 小时后减压过滤除去钯碳， 直接进入下一步反应。 1
mp 78-80 ℃ . H NMR(500MHz ， CDCl 3) ： δ 0.90(t ， 3H) ， 1.05-1.08(m ， 2H) ， 1.23-1.31(m， 7H)， 1.41-1.44(m， 8H)， 1.60-1.63(m， 2H)， 1.85-1.86(m， 4H)， 2.44-2.45(m， 1H)， 2.61-2.65(m， 2H)， 3.47(d， J ＝ 10Hz， 2H)， 3.79(d， J ＝ 10Hz， 2H)， 7.09-7.13(m， 4H).13C NMR(CDCl3， 100MHz) ： δ23.0， 27.3， 28.3， 29.2， 33.6， 34.4， 37.1， 37.3， 37.6， 44.2， 48.7， + 70.1， 98.2， 126.9， 128.1， 139.2， 145.6.HRMS-FAB m/z 373.2982[M] ( 计 算 值 ： C22H39NO2 373.2981).
2)5- 氨基 -5-[2-(4- 环己基苯基 ) 乙基 ]-2， 2- 二甲基 -1， 3- 二氧六环 ( Ⅷ -1)
方法同上， 投入 1.8g 化合物Ⅶ -1 和 0.2g 钯碳， 得到目标物 1.0g， 收率 91％。 1
mp 60-63 ℃ . H NMR(500MHz， CDCl3) ： δ1.36-1.45(m， 10H)， 1.60-1.63(m， 2H)， 1.72-1.75(m， 1H)， 1.82-1.84(m， 7H)， 2.46(s， 1H)， 2.61-2.65(m， 2H)， 3.48(d， J ＝ 11Hz， 13 2H)， 3.79(d， J ＝ 11Hz， 2H)， 7.10-7.14(m， 4H). C NMR(CDCl3， 100MHz) ： δ26.1， 26.9， 27.4， 28.2， 29.7， 34.5， 37.6， 44.1， 48.7， 70.1， 98.2， 126.9， 128.1， 139.2， 146.8.HRMS-FAB m/z + 317.2355[M] ( 计算值 ： C22H39NO2 317.2355).
3)(E)-5- 氨基 -5-{2-[4-(4- 乙基环己基 ) 苯基 ] 乙基 }-2， 2- 二甲基 -1， 3- 二氧 六环 ( Ⅷ -2)
方法同上， 投入 1.0g 化合物Ⅶ -2 和 0.1g 钯碳， 得到目标物 0.7g， 收率 90％。 1
mp 78-79 ℃ . H NMR(500MHz ， CDCl 3) ： δ 0.90(t ， 3H) ， 1.02-1.05(m ， 2H) ， 1.25-1.28(m， 2H)， 1.42-1.44(m， 8H)， 1.60-1.63(m， 5H)， 1.86-1.88(m， 4H)， 2.48-2.53(m， 1H)， 2.61-2.65(m， 2H)， 3.47(d， J ＝ 10Hz， 2H)， 3.78(d， J ＝ 10Hz， 2H)， 7.01-7.14(m， 4H).13C NMR(CDCl3， 100MHz) ： δ11.5， 19.8， 27.4， 28.2， 30.0， 33.2， 34.3， 37.6， 39.1， 44.2， 48.6， + 70.1， 98.2， 127.0， 128.1， 139.2， 145.6.HRMS-FAB m/z 345.2667[M] ( 计 算 值 ： C22H39NO2 345.2668).
4)(E)-5- 氨基 -5-{2-[4-(4- 正丙基环己基 ) 苯基 ] 乙基 }-2， 2- 二甲基 -1， 3- 二 氧六环 ( Ⅷ -3)
方法同上， 投入 0.7g 化合物Ⅶ -3 和 0.1g 钯碳， 得到目标物 0.5g， 收率 88％。mp 74-76 ℃ . 1H NMR(500MHz ， CDCl 3) ： δ 0.89(t ， 3H) ， 1.02-1.04(m ， 2H) ， 1.19-1.21(m， 2H)， 1.32-1.35(m， 2H)， 1.42-1.44(m， 7H)， 1.60-1.63(m， 2H)， 1.84-1.86(m， 8H)， 2.44-2.45(m， 1H)， 2.61-2.64(m， 2H)， 3.48(d， J ＝ 10Hz， 2H)， 3.79(d， J ＝ 10Hz， 13 2H)， 7.09-7.13(m， 4H). C NMR(CDCl 3， 100MHz) ： δ14.4， 19.9， 27.5， 28.2， 33.6， 34.4， 37.0 ， 37.5 ， 39.7 ， 44.2 ， 48.7 ， 70.0 ， 98.2 ， 127.0 ， 128.1 ， 139.2 ， 145.6.HRMS-FAB m/z + 359.2819[M] ( 计算值 ： C22H39NO2359.2824).
5)(E)-5- 氨基 -5-{2-[4-(4- 正戊基环己基 ) 苯基 ] 乙基 }-2， 2- 二甲基 -1， 3- 二 氧六环 ( Ⅷ -5)
方法同上， 投入 1.4g 化合物Ⅶ -5 和 0.2g 钯碳， 得到目标物 0.9g， 收率 89％。 1
mp 76-77 ℃ . H NMR(500MHz ， CDCl 3) ： δ 0.89(t ， 3H) ， 1.05-1.08(m ， 2H) ， 1.22-1.32(m， 9H)， 1.42-1.44(m， 8H)， 1.60-1.64(m， 2H)， 1.84-1.86(m， 4H)， 2.44-2.45(m， 1H)， 2.61-2.64(m， 2H)， 3.47(d， J ＝ 10Hz， 2H)， 3.78(d， J ＝ 10Hz， 2H)， 7.09-7.13(m， 4H).13C NMR(CDCl3， 100MHz) ： δ14.1， 19.7， 22.7， 26.6， 27.5， 28.2， 32.2， 33.6， 34.4， 37.3， 37.4， 37.6， 44.2， 48.7， 70.0， 98.2， 126.9， 128.1， 139.2， 145.6.HRMS-FAB m/z 387.3139[M]+( 计 算值 ： C22H39NO2387.3137).
制备实施例 7
1)(E)-2- 氨基 -2-{2-[4-(4- 正丁基环己基 ) 苯基 ] 乙基 }-1， 3- 丙二醇盐酸盐 ( Ⅰ -4)
将 (E)-5- 氨基 -5-{2-[4-(4- 正丁基环己基 ) 苯基 ] 乙基 }-2， 2- 二甲基 -1， 3- 二 氧六环 ( Ⅷ -4)(0.8g， 0.0021mol) 加入 2.5mL 1mol/L 的盐酸， 加热 50 ～ 60℃反应 3 小时， 后冷却至室温， 有固体析出， 抽滤得白色鳞片状固体 0.6g， 收率 80％。 1
mp 185-187 ℃ . HNMR(500MHz ， CDCl 3) ： δ 0.87(t ， 3H) ， 1.00-1.04(m ， 2H) ， 1.21-1.22(m， 2H)， 1.27-1.28(m， 5H)， 1.38-1.41(m， 2H)， 1.75-1.81(m， 6H)， 2.48-2.52(m， 1H)， 2.55-2.58(m， 2H)， 3.51-3.54(m， 4H)， 5.39(t， 3H)， 7.09-7.13(m， 4H)， 7.92(s， 3H).13C NMR(CDCl3， 100MHz) ： δ13.9， 22.4， 27.9， 28.6， 33.1， 33.2， 33.9， 36.5， 36.6， 43.4， 60.3， 60.9， 126.5， 127.9， 139.0， 144.7.
2)2- 氨基 -2-[2-(4- 环己基苯基 ) 乙基 ]-1， 3- 丙二醇盐酸盐 ( Ⅰ -1)
方法同上， 投入 1.0g 化合物Ⅷ -1， 得到目标物 0.5g， 收率 81％。 1
mp 191-193 ℃ . H NMR(500MHz， CDCl3) ： δ1.21-1.24(m， 1H)， 1.33-1.38(m， 4H)， 1.68-1.70(m， 1H)， 1.74-1.79(m， 4H)， 2.43-2.45(m， 1H)， 2.55-2.58(m， 4H)， 3.50-3.54(m， 13 4H)， 5.36-5.38(t， 2H)， 7.10-7.14(m， 4H)， 7.90(s， 3H). C NMR(CDCl3， 100MHz) ： δ25.6， 26.4， 27.9， 33.3， 34.1， 43.4， 60.2， 61.0， 126.6， 128.1， 139.0， 145.1.
3)(E)-2- 氨 基 -2-{2-[4-(4- 乙 基 环 己 基 ) 苯 基 ] 乙 基 }-1， 3- 丙 二 醇 盐 酸 盐 ( Ⅰ -2)
方法同上， 投入 0.7g 化合物Ⅷ -2， 得到目标物 0.5g， 收率 78％。 1
mp 184-186 ℃ . H NMR(500MHz， CDCl3) ： δ0.88(t， 3H)， 1.00-1.03(m， 2H)， 1.22-1.25(m， 3H)， 1.38-1.42(m， 2H)， 1.75-1.83(m， 6H)， 2.40-2.43(m， 1H)， 2.54-2.57(m， 13 2H)， 3.32-3.52(m， 4H)， 3.36-3.38(t， 2H)， 7.09-7.14(m， 4H)， 7.83(s， 3H). C NMR(CDCl3， 100MHz) ： δ 11.3 ， 27.9 ， 29.4 ， 32.6 ， 33.2 ， 33.8 ， 38.4 ， 38.9 ， 60.2 ， 60.9 ， 126.5 ， 127.9 ，140.0， 144.8.
4)(E)-2- 氨基 -2-{2-[4-(4- 正丙基基环己基 ) 苯基 ] 乙基 }-1， 3- 丙二醇盐酸盐 ( Ⅰ -3)
方法同上， 投入 0.4g 化合物Ⅷ -3， 得到目标物 0.3g， 收率 76％。 1
mp 186-188 ℃ . H NMR(500MHz， CDCl3) ： δ0.87(t， 3H)， 1.01-1.04(m， 2H)， 1.18-1.19(m， 2H)， 1.30-1.33(m， 3H)， 1.39-1.42(m， 2H)， 1.75-1.81(m， 6H)， 2.49-2.50(m， 1H)， 2.54-2.57(m， 2H)， 3.51-3.52(m， 4H)， 5,37(t， 2H)， 7.09-7.14(m， 4H)， 7.85(s， 3H).13C NMR(CDCl3， 100MHz) ： δ14.2， 19.4， 27.9， 28.4， 33.0， 33.2， 33.8， 36.3， 39.2， 43.4， 60.2， 60.9， 126.5， 127.9， 140.0， 144.8.
5)(E)-2- 氨基 -2-{2-[4-(4- 正戊基基环己基 ) 苯基 ] 乙基 }-1， 3- 丙二醇盐酸盐 ( Ⅰ -5)
方法同上， 投入 0.8g 化合物Ⅷ -5， 得到目标物 0.6g， 收率 75％。 1
mp 180-182 ℃ . H NMR(500MHz， CDCl3) ： δ0.87(t， 3H)， 1.05-1.06(m， 2H)， 1.19-1.30(m， 9H)， 1.41-1.44(m， 2H)， 1.76-1.82(m， 4H)， 2.45-2.47(m， 1H)， 2.53-2.56(m， 13 2H) ， 3.51-3.53(m ， 4H) ， 5.34(t ， 3H) ， 7.09-7.14(m ， 4H) ， 7.87(s ， 3H). C NMR(CDCl 3， 100MHz) ： δ13.9， 22.1， 26.0， 27.9， 31.6， 33.1， 33.3， 33.9， 36.6， 36.9， 44.5， 60.3， 60.9， 126.6， 128.0， 139.1， 144.8.
样品标号及结构式
实验实施例
实验实施例 1
ConA 诱导淋巴细胞增殖实验 ： 无菌取小鼠脾脏， 制成单细胞悬液， 去除红细胞后， 5 用含 10％胎牛血清 (FBS) 的 RPMI-1640 培养液调细胞浓度。5×10 个 / 孔小鼠脾脏细胞加 入 5μg/mL 的 ConA 诱导细胞增殖， 各化合物以适当的浓度加入测试其活性。37℃， 5％ CO2 3 培养箱中培养 48 小时， 在培养结束前 8 小时每孔加入 25μCi 的 H-TdR， 培养结束， 用细胞 3 收集仪收集细胞于玻璃纤维膜上， 加入闪烁液， 用液体闪烁计数仪检测 DNA 中 H-TdR 渗入 量来反映细胞增殖情况。
同种异体抗原诱导淋巴细胞增殖实验 ： C57BL/6 小鼠脾脏淋巴细胞悬液 5×105 个 / 孔接种于 96 孔板， 加入铯 137γ- 射线处理后的 BALB/C 小鼠脾淋巴细胞悬液 5×105 个 / 孔， 同时加入不同浓度待测化合物。37℃， 5％ CO2 培养箱中培养 3-5 天。培养结束前 8 小 3 时， 每孔加入 50μCi H- 胸腺嘧啶核苷酸。培养结束， 用细胞收集仪收集细胞于玻璃纤维膜 3 上， 加入闪烁液， 用液体闪烁计数仪检测 DNA 中 H-TdR 渗入量来反映细胞增殖情况。
活性数据显示 ： 对 ConA 诱导的淋巴细胞增殖和混合淋巴细胞反应 (MLR) 均具有较 好的抑制作用。这些化合物对 ConA 诱导的淋巴细胞增殖和对于 MLR 的增殖抑制作用显示，
该系列化合物在体外有着较好的免疫抑制作用， 并且其活性与 FTY720 基本一致。
表1： 对 ConA 诱导的淋巴细胞增殖的抑制活性
FTY720 IC50(μM)
FTY720 IC50(μM)
0.403 I-1 0.150 I-2 0.185 I-3 0.192 I-4 0.241 I-5 0.265 0.62 I-1 1.15 I-2 0.92 I-3 0.75 I-4 0.43 I-5 0.52表2： 对混合淋巴细胞反应 (MLR) 的抑制活性实验实施例 2
本发明所涉及的化合物显著抑制二硝基氟苯 (DNFB) 诱导的小鼠迟发型超敏反应 (DTH)， 小鼠经过 DNFB 诱导产生迟发型超敏反应， 小鼠会产生耳肿胀反应。通过观察化合物 对小鼠耳肿胀反应程度的影响， 反映化合物对小鼠 DTH 的影响作用， 探讨其对机体细胞免 疫反应的影响作用。 丙酮∶橄榄油 (4 ∶ 1) 作溶剂、 0.5％的 DNFB 溶液 20μl， 涂抹在小鼠的每只后腿 上致敏。致敏后的第 9 天， 用 0.2％ DNFB 溶液涂抹到小鼠左耳两侧进行免疫攻击。右耳单 涂以丙酮∶橄榄油 (4 ∶ 1) 溶剂， 作为对照。DNFB 免疫攻击后 24 小时用游标卡尺分别测量 左、 右耳的厚度， 并以其差值代表耳朵的肿胀程度 ； 用打孔机打下小鼠左、 右耳片称重， 计算 出两耳的重量差。FTY720 和各化合物从致敏第一天开始连续给药直至实验结束。 ** * **
结果如图 1 和图 2( 图 1 中， 表示 P ＜ 0.01 ； 图 2 中， 表示 P ＜ 0.05， 表示 P ＜ 0.01， 与模型对照组比较 )。图 1 为腹腔注射给药条件对 DNFB 诱导的迟发型超敏反应的 抑制作用。 图 2 为口服给药条件对 DNFB 诱导的迟发型超敏反应的抑制作用。 从抑制由二硝 基氟苯 (DNFB) 诱导的迟发性超敏反应 (DTH) 来看， 这些化合物在腹腔给药条件下 (0.3mg/ kg 给药 )， 能明显抑制 DTH 反应， 缓解小鼠耳肿胀， 减轻小鼠两耳重量差。和原药 FTY720 相 比， 化合物 I-3 和 I-5 的活性基本与 FTY720 一致。而这些化合物在口服条件下 (0.3mg/kg 给药 ) 也有一定的效果。总体来看， 化合物 I-3 和 I-5 的活性比较好。
实验实施例 3
在前期活性实验的基础上， 我们着重研究了化合物 I-3 和 I-5 对卵清蛋白 (OVA) 诱导的抗原特异性 T 淋巴细胞反应的影响。将 OVA(2mg/kg) 与等体积的 CFA 充分乳化， 分 三个点给 BALB/c 小鼠背部皮下注射 (200μL/ 只 ) 进行致敏。致敏当日起， 每日口服给化 合物， 连续给药 14 天。在第 14 天， 制备每组小鼠脾脏淋巴细胞， 加入 OVA 后在 37℃， 5％ CO2 培养箱中培养 48 小时， 检测细胞增殖情况。结果如图 3， 口服给药 3mg/kg/ 天条件， 化合物 I-3 和 I-5 对于 OVA 诱导的 T 细胞抗原特异性的增殖均有较好的抑制活性， 且活性与 FTY720 基本一致。
实验实施例 4
因为 FTY720 能够诱导淋巴细胞凋亡， 同样， 我们着重检测了化合物 I-5 在体外诱 导细胞凋亡的能力。取 Balb/c 小鼠脾脏细胞， 制成单细胞悬液， 调成 5×106/mL ； 细胞分别
加入 5μg/mL ConA 或培养液作为对照， 37℃， 5％ CO2 培养箱中培养 24 小时后， 采用 Annexin V/PI 双染， 流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果如图 4 和图 5。图 4 为无 ConA 存在的条件 下， 化合物 I-5 在体外诱导小鼠淋巴细胞凋亡的能力。右下象限凋亡早期细胞群 (Annexin V+PI- 细胞群 ) 比例与 FTY720 相比较， 无明显差异。图 5 为 ConA(2μg/mL) 存在的条件 下， 化合物 I-5 在体外诱导小鼠淋巴细胞凋亡的能力。右下象限凋亡早期细胞群 (Annexin V+PI- 细胞群 ) 比例与 FTY720 相比较， 无明显差异。可以看出， 无论是在 ConA 存在条件还 是无 ConA 存在条件， Annexin V+PI- 细胞群比例与 FTY720 相比较， 无明显差异， 该化合物 诱导细胞凋亡能力， 与 FTY720 相当。
实验实施例 5
研究了化合物 I-5 对动物急性移植物抗宿主病 (aGVHD) 的治疗作用。以 4 周龄 BALB/c 小鼠为供体小鼠， 取小鼠四肢长骨骨髓细胞和脾脏淋巴细胞悬于 PBS 缓冲液中制备 混合细胞悬液。以 7 周龄 C57BL/6 小鼠为受体小鼠， Gammacell 全身照射 8.5Gy， 照射 4-6 小时后， 每只受体小鼠尾静脉注射 0.5mL 供体小鼠的混合细胞悬液作为异源骨髓移植。从 骨髓移植当天开始给药， 3mg/kg/ 天剂量口服给药， 每天一次直至实验结束。在此剂量下， I-5 显示了一定的治疗效果， 无论是生存率还是体重与模型组相比均有明显改善 ( 见图 6)。
本发明提供了一种免疫调节剂， 该类免疫调节剂化合物具有良好的体内、 外免疫 调节活性。