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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201380079610.9 (22)申请日 2013.07.16 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 105611952 A (43)申请公布日 2016.05.25 (85)PCT国际申请进入国家阶段日 2016.03.15 (86)PCT国际申请的申请数据 PCT/KR2013/006355 2013.07.16 (87)PCT国际申请的公布数据 WO2015/008877 KO 2015.01.22 (73)专利权人 岭南大学校产学协力团 地址 韩国庆尚北道 。
2、(72)发明人 韩星洙 崔顺模 迪普蒂辛格 (74)专利代理机构 北京信慧永光知识产权代理 有限责任公司 11290 代理人 洪俊梅 张淑珍 (51)Int.Cl. A61L 27/56(2006.01) A61L 27/14(2006.01) A61L 27/20(2006.01) A61F 2/28(2006.01) (56)对比文件 CN 101249275 A,2008.08.27, CN 101254313 A,2008.09.03, CN 101874751 A,2010.11.03, WO 2010084481 A1,2010.07.29, WO 2012134024 A1,20。
3、12.10.04, CN 101668554 A,2010.03.10, 关嫚等.新型双层皮肤组织工程支架的构 建. 厦门大学学报(自然科学版) .2006,第45卷 (第3期), 审查员 郭翔 (54)发明名称 通过单步过程制备双层支架的方法以及利 用由该制备方法获得的双层支架进行组织再生 的方法 (57)摘要 本发明涉及通过单步过程制备双层支架的 方法以及利用由该制备方法获得的双层支架进 行组织再生的方法。 所述制备双层支架的方法可 在没有单独的粘合过程的情况下通过单步过程 产生完全粘合型的双层支架， 这与传统技术中借 助分别制备各聚合物支架随后彼此粘合的两步 过程的双层支架制备方法不同。。
4、 进而， 可通过在 制备的双层支架中培养细胞， 并将获得的双层支 架施用至进行组织再生或创伤愈合的皮肤缺陷 位点； 或者在制备的双层支架中对软骨细胞和骨 细胞进行共培养， 并将获得的双层支架施用至组 织(例如骨或软骨)彼此接触的位点， 促进由于创 伤、 烧伤、 肿瘤等损失的皮肤组织的再生。 权利要求书2页 说明书7页 序列表3页 附图8页 CN 105611952 B 2018.05.29 CN 105611952 B 1.一种通过单步过程制备双层支架的方法， 所述方法包含： 制备第一聚合物水性溶液； 将第二聚合物加入至所述第一聚合物水性溶液中， 并对反应物进行搅拌； 将表面活性剂加入至经搅拌。
5、的反应物中， 并对所述反应物进行高温高速搅拌， 所述高 温高速搅拌在80-120的温度下以800-2000rpm进行； 对经搅拌的反应物进行冷冻干燥， 从而获得海绵状物； 将所述海绵状物浸渍于交联剂中， 使其交联； 以及 对经交联的反应物进行冷冻干燥。 2.根据权利要求1所述的制备双层支架的方法， 其中， 所述第一聚合物和所述第二聚合 物彼此不同， 并且所述第一聚合物和所述第二聚合物选自于由如下聚合物所组成的组： 明胶、 壳聚糖、 弹性蛋白、 透明质酸、 羟基磷灰石、 藻酸盐、 胶原、 纤维素、 聚乙二醇 (PEG)、 聚环氧乙烷(PEO)、 聚己内酯(PCL)、 聚乳酸(PLA)、 聚乙醇酸。
6、(PGA)、 聚(乳酸-共-乙醇 酸)(PLGA)、 聚(3-羟基丁酸酯)-共-(3-羟基戊酸酯)(PHBV)、 聚二噁烷酮(PDO)、 聚(L-丙 交酯)-共-(己内酯)、 聚酯型聚氨酯(PEUU)、 聚(L-丙交酯)-共-(D-丙交酯)、 聚(乙烯- 共-乙烯醇)(PVOH)、 聚丙烯酸(PAA)、 聚乙烯醇(PVA)、 聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、 聚苯乙烯(PS) 和聚苯胺(PAN)。 3.根据权利要求1所述的制备双层支架的方法， 其中， 所述第一聚合物是明胶， 所述第 二聚合物是聚乙烯醇(PVA)。 4.根据权利要求1所述的制备双层支架的方法， 其中， 所述表面活性剂选自于由如下表 面。
7、活性剂所组成的组： 十二烷基硫酸钠(SDS)、 月桂基硫酸铵(ALS)、 月桂基乙烯硫酸钠(SLES)、 直链烷基苯磺 酸盐(LAS)、 -烯烃磺酸盐(AOS)、 烷基硫酸盐(AS)、 烷基醚硫酸盐(AES)和链烷磺酸钠 (SAS)。 5.根据权利要求1所述的制备双层支架的方法， 其中， 所述交联剂选自于由如下交联剂 所组成的组： 戊二醛、 乙基二乙基氨基丙基碳化二亚胺(EDC)、 京尼平和转谷氨酰胺酶(TG)。 6.根据权利要求1所述的制备双层支架的方法， 其中， 所述方法包含： 通过在60-70的温度下以100-300rpm的速度对水中的明胶进行搅拌以使其完全溶 解， 制备明胶水性溶液； 。
8、将聚乙烯醇(PVA)加入至所述明胶水性溶液中， 并对溶液进行搅拌； 将十二烷基硫酸钠加入至经搅拌的溶液中， 并在80-120的温度下以800-2000rpm进 行搅拌； 对经搅拌的溶液进行冷冻干燥， 从而获得海绵状物； 将所述海绵状物浸渍于交联剂中， 使其交联， 所述交联剂选自于由戊二醛或乙基二乙 基氨基丙基碳化二亚胺(EDC)所组成的组； 以及 对经交联的反应物进行冷冻干燥。 7.在根据权利要求1-6中任一项所述的方法制备的双层支架中培养细胞的方法。 8.根据权利要求7所述的培养细胞的方法， 其中， 所述细胞为选自于由如下细胞所组成 的组中的任意一种或两种以上： 权 利 要 求 书 1/2 。
9、页 2 CN 105611952 B 2 软骨细胞、 骨细胞、 皮肤细胞。 9.根据权利要求7所述的培养细胞的方法， 其中， 通过在所述双层支架的上层和下层分 别培养不同的细胞， 对所述细胞进行共培养。 10.一种用于组织再生和创伤愈合的组合物， 所述组合物包含根据权利要求1-6中任一 项所述的方法制备的双层支架。 权 利 要 求 书 2/2 页 3 CN 105611952 B 3 通过单步过程制备双层支架的方法以及利用由该制备方法获 得的双层支架进行组织再生的方法 技术领域 0001 本发明涉及通过单步过程制备双层支架的方法以及利用由该制备方法获得的双 层支架进行组织再生的方法。 背景技术。
10、 0002 支架是为了对组织细胞进行体外培养和移植而制备的物理支撑和贴附基底； 支架 用于为人组织再生进行的细胞移植； 并且， 支架对于细胞的大量培养和增殖十分重要。 其原 因在于上皮细胞的细胞贴附以及相伴的迁移和增殖发生在细胞和基底之间的接触部分。 0003 在体内或体外与物质相接触时， 大部分具有生物活性的细胞首先通过细胞贴附而 存活。 特别地， 在成纤维细胞和组织细胞的存活中， 细胞优先贴附至基底， 随后细胞质中的 细胞器代谢变得活跃， 并移向新的位点， 从而促进增殖和营养供应。 0004 因此， 用于使细胞有效堆积的表面对于细胞的增殖而言是最基本的手段。 可借助 基底的组分对细胞基底的。
11、贴附性能进行人为控制。 支架是细胞再生和生长的支撑载体(即， 人工基底中作为基础的材料)， 近来被用作大量培养和增殖的容器或烧瓶的涂层。 0005 另一方面， 韩国专利公开号2004-0016984公开了用于培养细胞和组织的载体及其 培养方法， 其中， 成纤维细胞的过度生长可被阻抑， 并且靶组织或器官可有效再生。 然而， 上 述支架存在诸多问题： 其贴附性并不足以对细胞进行大量培养， 其物理性质并不出众， 制备 方法也并不简便和符合期望。 0006 此外， 传统的双层支架是通过在分别制造各聚合物支架后将其彼此附着来制备 的， 然而， 所述双层支架不能完全附着， 存在很大的分离可能， 并且， 由。
12、于聚合物支架的制备 为两步法， 工艺很复杂。 0007 因此， 本发明的发明人通过将阴离子表面活性剂加入至两种聚合物共混的溶液 中， 在高温高速下搅拌反应以诱导相分离， 并确认了由此产生的支架是结构和化学上特异 的双层支架， 从而完成了本发明。 发明内容 0008 技术问题 0009 本发明的一个目的在于提供通过简单的单步过程制备结构和化学上特异的、 不会 分离的双层支架的方法。 0010 此外， 本发明的另一目的在于提供利用所述双层支架进行组织再生的方法。 0011 技术方案 0012 为了实现本发明的目的， 本发明提供了通过简单的单步过程制备双层支架的方 法， 所述方法包含： 制备第一聚合。
13、物水性溶液； 将第二聚合物加入至所述第一聚合物水性溶 液中， 并对反应物进行搅拌； 将表面活性剂加入至经搅拌的反应物中， 并对所述反应物进行 高温高速搅拌； 对经搅拌的反应物进行冷冻干燥， 从而获得海绵状物(sponge)； 将所述海绵 说 明 书 1/7 页 4 CN 105611952 B 4 状物浸渍于交联剂中， 使其交联； 以及对经交联的反应物进行冷冻干燥。 0013 本发明提供了制备双层支架的方法， 所述方法包含： 通过在60-70的温度下以 100-300rpm的速度对水中的明胶进行搅拌以使其完全溶解， 制备明胶水性溶液； 将聚乙烯 醇(PVA)加入至所述明胶水性溶液中， 并对溶液。
14、进行搅拌； 将十二烷基硫酸钠加入至经搅拌 的溶液中， 并在80-120的温度下以800-2000rpm进行搅拌； 对经搅拌的溶液进行冷冻干 燥， 从而获得海绵状物； 将所述海绵状物浸渍于交联剂中， 使其交联， 所述交联剂选自于由 戊二醛或乙基二乙基氨基丙基碳化二亚胺(EDC)所组成的组； 以及对经交联的反应物进行 冷冻干燥。 0014 本发明提供了通过在由上述制备方法制备的双层支架中培养细胞进行组织再生 的方法。 0015 此外， 本发明提供了用于组织再生和创伤愈合的组合物， 所述组合物包含上述双 层支架。 0016 有益效果 0017 与通过分别制造各聚合物支架后将其粘合的两步过程而制备的传。
15、统双层支架不 同， 根据本发明的制备方法， 可通过单步过程制备完全附着的双层支架， 并且， 可通过在制 备的双层支架中培养细胞， 并将其施用至进行组织再生或创伤愈合的皮肤缺陷位点； 或者 在制备的双层支架中对软骨细胞和骨细胞进行共培养， 并将其施用至组织(例如骨和软骨) 彼此接触的位点， 促进由于创伤、 烧伤、 肿瘤等损失的皮肤组织的再生。 附图说明 0018 图1描绘了根据本发明的双层支架制备过程的示意流程图。 0019 图2为根据本发明的双层支架的扫描电子显微图像。 0020 图3为根据本发明的双层支架的数字图像(A： 含水的双层支架； B： 干燥的双层支 架； C： 交联前的干燥的双层支。
16、架)。 0021 图4为根据本发明的双层支架的FT-IR显微图像和曲线图(明胶层)。 0022 图5为根据本发明的双层支架的FT-IR显微图像和曲线图(PVA层)。 0023 图6为根据本发明的双层支架的显微CT图像(A： 双层支架； B： 明胶层)。 0024 图7为在根据本发明的双层支架中培养1天的细胞的扫描电子显微图像。 0025 图8为在根据本发明的双层支架中培养5天的细胞的扫描电子显微图像。 0026 图9和10展示了利用根据本发明的双层支架处理的创伤组织中的组织再生效果。 0027 图11为利用双层支架处理创伤组织后将其切下进行的RT-PCR分析。 具体实施方式 0028 本发明提。
17、供了通过单步过程制备双层支架的方法， 所述方法包含： 制备第一聚合 物水性溶液； 将第二聚合物加入至所述第一聚合物水性溶液中， 并对反应物进行搅拌； 将表 面活性剂加入至经搅拌的反应物中， 并对所述反应物进行高温高速搅拌； 对经搅拌的反应 物进行冷冻干燥， 从而获得海绵状物； 将所述海绵状物浸渍于交联剂中， 使其交联； 以及对 经交联的反应物进行冷冻干燥。 0029 所述第一聚合物和所述第二聚合物可彼此不同， 并可选自于由如下聚合物所组成 说 明 书 2/7 页 5 CN 105611952 B 5 的组： 明胶、 壳聚糖(chitosan)、 弹性蛋白、 透明质酸、 羟基磷灰石、 藻酸盐、 。
18、胶原、 纤维素、 聚 乙二醇(PEG)、 聚环氧乙烷(PEO)、 聚己内酯(PCL)、 聚乳酸(PLA)、 聚乙醇酸(PGA)、 聚(乳酸- 共-乙醇酸)(PLGA)、 聚(3-羟基丁酸酯)-共-(3-羟基戊酸酯)(PHBV)、 聚二噁烷酮(PDO)、 聚(L-丙交酯)-共-(己内酯)、 聚酯型聚氨酯(poly(esterurethane)， PEUU)、 聚(L-丙交 酯)-共-(D-丙交酯)、 聚(乙烯-共-乙烯醇)(PVOH)、 聚丙烯酸(PAA)、 聚乙烯醇(PVA)、 聚乙 烯吡咯烷酮(PVP)、 聚苯乙烯(PS)和聚苯胺(PAN)。 优选地， 所述第一聚合物可以是明胶， 所 述第二。
19、聚合物可以是聚乙烯醇(PVA)。 0030 所述表面活性剂可以是阴离子表面活性剂， 例如可选自于由如下表面活性剂所组 成的组： 十二烷基硫酸钠(SDS)、 月桂基硫酸铵(ALS)、 月桂基乙烯硫酸钠(Sodium Lauryl Ethylene Sulfate， SLES)、 直链烷基苯磺酸盐(LAS)、 -烯烃磺酸盐(AOS)、 烷基硫酸盐 (AS)、 烷基醚硫酸盐(AES)和链烷磺酸钠(Sodium Alkane Sulfonate， SAS)； 优选地， 所述表 面活性剂为十二烷基硫酸钠(SDS)。 0031 高温高速搅拌优选在80-120的温度下以800-2000rpm进行。 0032。
20、 所述交联剂可选自于由如下交联剂所组成的组： 戊二醛、 乙基二乙基氨基丙基碳 化二亚胺(EDC)、 京尼平(genepin)和转谷氨酰胺酶(TG)。 0033 此外， 本发明提供了制备上述双层支架的方法， 其中， 所述方法包含： 通过在60-70 的温度下以100-300rpm的速度对水中的明胶进行搅拌以使其完全溶解， 制备明胶水性溶 液； 将聚乙烯醇(PVA)加入至所述明胶水性溶液中， 并对溶液进行搅拌； 将十二烷基硫酸钠 加入至经搅拌的溶液中， 并在80-120的温度下以800-2000rpm进行搅拌； 对经搅拌的溶液 进行冷冻干燥， 从而获得海绵状物； 将所述海绵状物浸渍于交联剂中， 使。
21、其交联， 所述交联 剂选自于由戊二醛或乙基二乙基氨基丙基碳化二亚胺(EDC)所组成的组； 以及对经交联的 反应物进行冷冻干燥。 0034 进而， 本发明提供了通过在由上述方法制备的双层支架中培养细胞进行组织再生 的方法。 0035 所述细胞可为选自于由如下细胞所组成的组中的任意一种或两种以上： 软骨细 胞、 骨细胞、 皮肤细胞。 可通过在双层支架的上层和下层分别培养不同的细胞， 对所述细胞 进行共培养。 0036 此外， 本发明提供了用于组织再生和创伤愈合的组合物， 所述组合物包含由上述 方法制备的双层支架。 0037 将具体描述根据本发明的双层支架制备方法的一个实施方式， 其中， 所述第一聚。
22、 合物为明胶， 所述第二聚合物为聚乙烯醇(PVA)， 所述表面活性剂为十二烷基硫酸钠(SDS)， 并且所述交联剂为戊二醛或乙基二乙基氨基丙基碳化二亚胺(EDC)。 0038 根据本发明的一个实施方式， 双层支架可通过如下方式制备： 通过在60-70的温 度下以100-300rpm的速度对水中的明胶进行搅拌以使其完全溶解， 制备明胶水性溶液； 将 聚乙烯醇(PVA)加入至所述明胶水性溶液中， 并对溶液进行搅拌； 将十二烷基硫酸钠加入至 经搅拌的溶液中， 并在80-120的温度下以800-2000rpm进行搅拌； 在-80下对经搅拌的 反应物进行冷冻干燥24-48h， 从而获得海绵状物； 将所述海。
23、绵状物浸渍于交联剂中， 使其交 联， 所述交联剂选自于由戊二醛或乙基二乙基氨基丙基碳化二亚胺(EDC)所组成的组； 以及 在-80下对经交联的反应物进行冷冻干燥。 说 明 书 3/7 页 6 CN 105611952 B 6 0039 首先， 通过将天然聚合物明胶加入至水中， 并在60-70的温度下以100-300rpm进 行搅拌以使其完全溶解， 制备明胶水性溶液。 所述明胶水性溶液可为1-99wt、 优选 2.5wt。 如果明胶水性溶液中的明胶含量落在上述范围之外， 可能会发生无法在视觉上确 认分层的问题。 0040 如果未在该条件下进行搅拌， 明胶水性溶液不能均匀溶解， 或者分层可能出现问。
24、 题。 0041 通过将聚乙烯醇(PVA)加入至明胶水性溶液中并搅拌， 从而制备含有1-99wt、 优 选12.5wt的PVA的聚合物共混溶液。 如果PVA含量落在上述范围之外， 可能会发生无法在 视觉上确认分层的问题。 0042 将作为阴离子表面活性剂的十二烷基硫酸钠(SDS)加入至经搅拌的聚合物共混溶 液中， 并在80-120的高温下以800-2000rpm的高速进行搅拌。 SDS的加入使得基于聚合物 共混溶液的总量含有0.01-2wt的SDS。 如果SDS含量落在上述范围之外， 不能对分层反应 进行控制， 并且可能发生难以操控的问题。 0043 此外， 如果未在所述高温高速的条件下进行搅。
25、拌， 不会发生均匀的分层， 并且不能 对分层反应进行控制。 0044 在-80下将经搅拌的反应物进行冷冻干燥24-48h， 从而获得海绵状物； 并将所述 海绵状物浸渍于交联剂中， 使其交联， 所述交联剂选自于戊二醛或EDC(乙基二乙基氨基丙 基碳化二亚胺)。 此时， 使用含有0.1-1wt的交联剂的水性溶液进行3-24h来产生交联， 所 述交联剂例如为戊二醛或EDC(乙基二乙基氨基丙基碳化二亚胺)。 如果交联剂含量落在上 述范围之外， 不发生交联反应， 导致溶液降解； 或者， 由于未反应的交联剂残留， 可能导致细 胞培养有问题。 0045 在-80下对经交联的反应物再次进行冷冻干燥， 从而制备。
26、双层支架。 0046 根据所述实施方式， 可简单地通过单步过程制备如图2和图3中示出的未出现层脱 离的双层支架， 这与通过分别制造各聚合物支架后将其粘合的传统双层支架工艺过程不 同。 特别地， 图2证实了双层支架具有位于左侧的多孔明胶层和位于右侧的高密度PVA层。 0047 进而， 图4和图5分别展示了根据本发明的双层支架的FT-IR显微图像中的明胶层 和PVA层， 并将它们与分别制备的明胶支架对照和PVA支架对照进行了比较。 0048 此外， 图6为根据本发明的双层支架的显微CT图像(A： 双层支架； B： 明胶层)， 其中， 红色部分和灰色部分代表多孔明胶层和高密度PVA层。 0049 并。
27、且， 作为利用双层支架培养细胞的结果， 如图7所示， 在细胞接种后1天细胞开始 贴附至支架并增殖； 如图8所示， 证实了在细胞接种后5天细胞分泌的细胞外基质(ECM)堆积 至支架中。 0050 此外， 如反映了使用双层支架在创伤组织中的组织再生效果的图9和图10所示的， 在利用根据本发明的双层支架处理1天后， 组织开始从皮下鼓泡； 5天后， 组织整合至双层支 架中； 10天后， 组织再生， 同时， 明胶层借助自发降解(然而不完全降解)开始脱离。 15天后， 双层支架的明胶层几乎完全降解并自发脱离， 创伤周围的组织几乎完全再生。 另一方面， 即 使在5天后， 对照也维持了80的创伤区域。 005。
28、1 特别地， 本发明在不使得创伤收缩的情况下使组织再生， 创伤收缩与组织再生和 愈合的概念不同， 其通过创伤收缩而使创伤区域变硬且密度变高， 从而成为通常的疤痕组 说 明 书 4/7 页 7 CN 105611952 B 7 织。 0052 此外， 图11示出了利用根据本发明的双层支架对损伤区域处理后1天， 对具有双层 支架的部位的组织进行的RT-PCR分析， 结果： 第1天表达ITGA3， ITGA3为在与ECM(细胞外基 质)蛋白反应的整合蛋白的形成过程中表达的； 未显示ITGA3在第5天的表达， IL-8在第5天 不表达， 证实根据本发明的双层支架不引起免疫应答， 并且， CD55的表达。
29、升高， 其抑制与形 成ECM的主要成分胶原的原纤维(fibril)的COL16A1、 血管内皮生长因子VEGF和血液凝固相 关的炎性物质C5a的形成。 0053 因此， 根据本发明的双层支架在组织工程学、 医学、 药学和材料科学领域中广泛地 用作药物、 细胞、 蛋白和生长因子的递送材料或人工皮肤等， 特别是有利地用作用于组织再 生和创伤愈合的组合物。 0054 也就是说， 通过在由上述制备方法制备的双层支架中培养细胞， 可将所述双层支 架用于组织再生和创伤愈合。 所述细胞可为选自于由如下细胞所组成的组中的任意一种或 两种以上： 软骨细胞、 骨细胞、 皮肤细胞； 并且， 可通过在双层支架的上层和。
30、下层分别培养不 同的细胞， 对所述细胞进行共培养。 0055 特别地， 可将根据本发明的双层支架施用于皮肤缺陷。 换句话说， 在由天然聚合物 制得的下层支架中对细胞进行培养， 将其用作组织再生层； 并将药物加载至由合成聚合物 制得的上层支架， 从而在组织再生中阻断细菌感染。 所述天然聚合物支架在组织再生过程 中通过生物降解而被去除， 所述合成聚合物支架则在组织再生完成时去除。 0056 此外， 根据本发明的双层支架可通过对两种细胞进行共培养并将其施用至组织 (例如骨和软骨)彼此接触的位点来帮助再生。 也就是说， 在由天然聚合物制得的下层支架 中培养软骨细胞， 并在由合成聚合物制得的上层支架中培。
31、养骨细胞， 将该双层支架施用至 组织彼此接触的位点， 从而帮助组织再生。 0057 下文将根据以下实施例对本发明进行更为详细的说明。 然而， 这些实施例对本发 明并不是限制性的。 0058 实施例 0059 制备双层支架 0060 1)制备双层支架 0061 制备2.5wt的明胶水性溶液， 在80下以300rpm进行搅拌。 明胶完全溶解后， 加 入聚乙烯醇(PVA)以使其为10wt， 并搅拌。 加入十二烷基硫酸钠以使其为0.2wt， 并在95 的高温下以900rpm的高速进行搅拌。 将经搅拌的溶液倾倒入培养皿， 并在-80冷冻干燥 至少24小时， 获得海绵状物。 将该海绵状物浸渍于含有戊二醛(。
32、0.5wt)的水性溶液中至少 12小时， 使其交联。 在-80再次冷冻干燥， 产生双层支架。 0062 2)双层支架的SEM和数字图像 0063 借助场致发射型扫描电子显微镜(FE-SEM)(S-4100， HITACHI， LTD)对如上制备的 双层支架进行观测， 获得的SEM图像示于图2中； 借助场致发射型扫描电子显微镜(FE-SEM) (S-4100， HITACHI， LTD)获得的数字图像示于图3中。 换句话说， 证实了该双层支架以一体化 的形式完全附着， 成为没有脱离可能的安全的双层结构支架。 0064 3)双层支架的FT-IR图像分析 0065 借助显微FTIR分光光度计(Spe。
33、ctrum 100， PerkinElmer， USA)/成像系统 说 明 书 5/7 页 8 CN 105611952 B 8 (Spotlight 200， PerkinElmer， USA)， 在含有液氮的区室内通过扫描对如上制备的双层支 架进行分析， 并使用分别制备的Latin支架或PVA支架作为对照。 0066 作为结果， 如图4和图5所示， 证实了根据本发明的双层支架中的明胶层和PVA层。 0067 4)双层支架的显微CT图像分析 0068 借助SKYSCAN1172(Skyscan， German)对如上制备的双层支架的显微CT图像进行分 析， 其中， 单色光束为40kV， 样品。
34、和检测器之间的距离为45.14mm， 曝光时间为147ms， 像素大 小固定为4.84362 m。 0069 作为结果， 图6示出了根据本发明的双层支架的显微CT图像(A： 双层支架； B： 明胶 层)， 其中， 红色部分和灰色部分分别表示多孔明胶层和高密度PVA层。 0070 双层支架的体外性能 0071 将实施例中制备的双层支架制为直径1cm后， 将2104个CRL-2310(ATCC编号； 角 化细胞， 经人乳头瘤病毒16(HPV-16)E6/E7转化)分配在该双层支架上。 细胞分配后， 作为 SEM观测的结果， 如图7所示， 细胞分配1天后细胞开始贴附至支架并再生； 如图8所示， 证实。
35、 了细胞分配5天后细胞分泌的细胞外基质(ECM)堆积至支架中。 0072 双层支架的体内创伤再生效果 0073 使用活检穿孔器制造7mm的创伤， 并使具有与创伤(7mm)相同尺寸的双层支架弯 曲， 从而明胶层与创伤位点相接触。 在此情况下， 分别将支架浸没在20、 40、 60、 80 和100的乙醇中1小时以用于灭菌， 最后在70的乙醇中浸没24小时， 并在室温下浸没在 PBS缓冲液中3小时以供实验使用。 在对照组中保持创伤开放； 而在测试组中用根据本发明 的支架将所制造的创伤覆盖。 0074 作为结果， 如图9和图10所示， 从利用双层支架处理后1天的照片看来， 组织开始从 皮下鼓泡， 而。
36、在对照中至少维持90的创伤， 测试组创伤的大小减小至80。 从其后5天的 照片看来， 组织整合入根据本发明的双层支架中， 对照组创伤的大小减小至80， 而测试组 创伤的大小减小至最初大小的40以下。 从其后10天的照片看来， 组织已经再生， 即便组织 再生仍不完全， 组织鼓泡的程度足以完全覆盖创伤， 同时明胶层降解， 支架自动脱离， 然而 该脱离不完全。 从其后15天的照片看来， 双层支架的明胶层几乎完全降解并自发脱离， 创伤 周围的组织几乎完全再生。 0075 RT-PCR分析 0076 以与实验实施例2相同的方式利用根据本发明的双层支架对创伤进行处理并在其 后1天将双层支架周围的组织切下以。
37、进行RT-PCR分析。 RT-PCR的条件如下： 945min(预变 性)； 进行30个循环的9430秒(变性)、 根据引物的熔点在55-6030秒(退火)和721分钟 (延伸)； 最后7210分钟(最后延伸)。 通过凝胶电泳对由此获得的PCR产物进行分析。 在此 情况之下， 使用的引物组如下所示。 0077 表1 说 明 书 6/7 页 9 CN 105611952 B 9 0078 0079 作为结果， 如图11所示， 第1天表达了ITGA3， ITGA3为在与ECM(细胞外基质)蛋白反 应的整合蛋白的形成过程中表达的； 未显示ITGA3在第5天的表达， IL-8在第5天不表达， 证 实根。
38、据本发明的双层支架不引起免疫应答。 此外， CD55的表达升高， 其抑制与形成ECM的主 要成分胶原的原纤维的COL16A1、 血管内皮生长因子VEGF和血液凝固相关的炎性物质C5a的 形成。 0080 虽然已参考具体特征对本发明进行了详细说明， 本领域的普通技术人员将理解的 是， 所进行的说明仅是为了描述优选的实施方式， 而并不旨在限制本发明的范围。 本领域技 术人员能够在所附权利要求书中记载的本发明的精神和范围的等同范围内作出各种修改 及变化。 说 明 书 7/7 页 10 CN 105611952 B 10 0001 序 列 表 1/3 页 11 CN 105611952 B 11 00。
39、02 序 列 表 2/3 页 12 CN 105611952 B 12 0003 序 列 表 3/3 页 13 CN 105611952 B 13 图1 说 明 书 附 图 1/8 页 14 CN 105611952 B 14 图2 图3 说 明 书 附 图 2/8 页 15 CN 105611952 B 15 图4 说 明 书 附 图 3/8 页 16 CN 105611952 B 16 图5 图6 说 明 书 附 图 4/8 页 17 CN 105611952 B 17 图7 说 明 书 附 图 5/8 页 18 CN 105611952 B 18 图8 说 明 书 附 图 6/8 页 19 CN 105611952 B 19 图9 图10 说 明 书 附 图 7/8 页 20 CN 105611952 B 20 图11 说 明 书 附 图 8/8 页 21 CN 105611952 B 21 。