一种可自产氧气的蛋白复合支架及其制备方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 104288834 A (43)申请公布日 2015.01.21 CN 104288834 A (21)申请号 201310476340.7 (22)申请日 2013.10.12 A61L 27/22(2006.01) A61L 27/02(2006.01) (71)申请人 上海市第六人民医院 地址 200233 上海市徐汇区宜山路 600 号 (72)发明人 冯超 李喆 徐月敏 吕向国 (74)专利代理机构 上海精晟知识产权代理有限 公司 31253 代理人 冯子玲 (54) 发明名称 一种可自产氧气的蛋白复合支架及其制备方 法 (57) 摘要 本发明提供了一种可自。

2、产氧气的蛋白复 合支架组成材料包括生物蛋白、 明胶和自产 氧物， 其中， 所述明胶和生物蛋白的质量比为 （0.5-5） :10， 所述自产氧物和生物蛋白的质量比 为 （1-50） :10。本发明提供的可自产氧气的蛋白 复合支架复合了生物蛋白、 明胶和自产氧物， 物理 强度要优于利用单纯蛋白组合溶液所构建的膜结 构材料， 同时明胶成份对自产氧物构成一定的包 裹作用， 使得本发明提供的蛋白复合支架能够恒 速且高水平的释放氧气， 从而可令复合其上的种 子细胞长期存活并促进材料植入后微血管的长 入， 更适合于实际手术操作的需要， 最终提高尿道 修复重建的成功率。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1。

3、 页 说明书 6 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书6页 附图1页 (10)申请公布号 CN 104288834 A CN 104288834 A 1/1 页 2 1. 一种可自产氧气的蛋白复合支架， 其特征在于， 组成材料包括生物蛋白、 明胶和自产 氧物， 其中， 所述明胶和生物蛋白的质量比为 （0.5-5） :10， 所述自产氧物和生物蛋白的质量 比为 （1-50） :10。 2. 根据权利要求 1 所述的蛋白复合支架， 其特征在于， 所述明胶和生物蛋白的质量比 为 （1-3） :10。 3. 根据权利要求 1 所述的蛋白复。

4、合支架， 其特征在于， 所述自产氧物和生物蛋白的质 量比为 （5-25） :10。 4. 根据权利要求 1 所述的蛋白复合支架， 其特征在于， 所述自产氧物为过氧化钙、 过碳 酸钠、 过碳酸钾、 过氧化硫脲中的一种或几种的混合物。 5. 根据权利要求 1 所述的蛋白复合支架， 其特征在于， 所述生物蛋白选自角蛋白和丝 素蛋白中的一种或两种。 6. 根据权利要求 4 所述的蛋白复合支架， 其特征在于， 所述角蛋白为还原型人发角蛋 白。 7. 一种如权利要求 1 所述的用于尿道修复重建的蛋白复合支架的制备方法， 其特征在 于， 包括以下步骤 ： 步骤 1， 制备生物蛋白溶液， 控制生物蛋白溶液中生。

5、物蛋白的浓度为 0.05-0.2g/mL ； 步骤 2， 将明胶加入到生物蛋白溶液中， 待明胶完全溶解后， 加入自产氧物， 溶解完全， 其中， 所述明胶和生物蛋白的质量比为 （0.5-5） :10， 所述自产氧物和生物蛋白的质量比为 （1-50） :10 ； 步骤 3， 将步骤 2 得到的混合溶液密封静置， 直至凝胶化， 敞口自蒸发， 得到蛋白复合支 架。 8. 根据权利要求 7 所述的制备方法， 其特征在于， 所述生物蛋白选自角蛋白和丝素蛋 白中的一种或两种。 9. 根据权利要求 8 所述的制备方法， 其特征在于， 所述角蛋白为还原型人发角蛋白， 制 备方法如下 ： 将人头发置于提取液中， 。

6、50-150下浸泡 10-60min， 过滤， 将滤液透析， 浓缩， 得到还原 型人发角蛋白， 其中， 人头发的质量与提取液的体积的比为 （0.5-4g） : （5-20mL） ， 所述提取 液为尿素、 十二烷基硫酸钠、 Na2S2O5的混合水溶液， 其中， 每 100mL 水中， 含有 30-70g 尿素、 40-80g 十二烷基硫酸钠、 80-120gNa2S2O5。 10. 根据权利要求 8 所述的制备方法， 其特征在于， 所述丝素蛋白的制备方法如下 ： 将脱胶蚕丝溶于 MX 溶液中， 过滤， 将滤液透析， 浓缩， 得到纯化的丝素蛋白， 其中， M 为 碱金属， X 为卤素。 权 利 要。

7、 求 书 CN 104288834 A 2 1/6 页 3 一种可自产氧气的蛋白复合支架及其制备方法 技术领域 0001 本发明涉及一种一种蛋白复合支架， 尤其涉及一种可以用于尿道修复重建的可自 产氧气的蛋白复合支架及其制备方法。 背景技术 0002 由于各种原因所导致的复杂性尿道疾病历来是泌尿外科临床治疗中的一个难题。 虽然多种自体组织作为替代材料已经在尿道修复重建中获得理想的效果， 但相比而言组织 工程技术没有前者 “牺牲正常组织为代价， 以手术创伤修复组织缺损” 的固有缺陷， 因而更 可作为未来尿道重建发展的主要方向。 现有国内外文献报道中对于各种组织工程材料或者 材料 - 种子细胞复合。

8、体在尿道修复重建中的研究已逐渐从实验室向临床拓展。其中不乏有 小范围实际尿道疾病临床治疗的案例， 并且获得另人满意的初步疗效。 0003 但是相对于种子细胞研究的日趋完善， 在尿道组织工程修复重建中选择何种支架 材料最为理想却始终未能达成共识。目前在尿道的组织工程研究中主要采用两大类支架 ： 天然脱细胞胶原基质 （SIS、 BAMG、 脱细胞真皮基质等） 和人工合成材料 （聚乙醇酸、 聚乳酸 / 聚乙醇酸共聚物） 。前者虽然制备方便， 适合商品化的生产， 但由于多取材于异种乃至异体 生物组织， 因而在生物安全性方面一直受到部分学者质疑， 很难被所有患者所接受。 同时其 在空间结构， 生物力学特。

9、性以及促进微血管和细胞渗透方面也同时存在着固有缺陷。后者 虽然将生物安全性方面的风险降到了最低， 但支架在降解过程中的代谢产物对周围的细胞 以及微环境会造成不可避免的负面影响， 另外人工合成类支架因缺乏相应的生长因子， 在 促进种子细胞黏附， 增殖方面也有着先天的不足。 0004 基于上述背景， 目前在该研究领域， 利用蛋白质进行相关生物支架材料的构建正 受到越来越多的研究者的关注。 现有报道中， 利用丝素蛋白、 人发角蛋白进行生物蛋白支架 构建的报道已经有成功的案例。但制备完成的 Keratieine- 丝素蛋白复合支架如同其它合 成的尿道组织工程修复材料一样会拥有一定的厚度， 而支架材料的。

10、厚度势必会对微血管的 长入、 氧气以及营养补给起到限制作用。而这一问题也是导致利用组织工程材料进行尿道 重建术后出现狭窄复发的主要原因之一。 因而在利用制备的材料进行种子细胞复合和个体 回植之前还需要对其进行进一步的修饰加工。 以往的研究报道中多将支架材料与血管源性 生长因子 （VEGF） 或者血管生发相关细胞 （内皮细胞、 内皮祖细胞） 相结合， 以促进支架材料 的血管化， 保证其上的种子细胞的增殖， 乃至复合材料回植体内后的长期存活。 但是该类方 法操作相对复杂， 成本较高， 不适合大面积组织材料的修饰， 因而在距离临床应用方面还有 很长的距离。 发明内容 0005 本发明的目的在于克服上。

11、述不足， 提供一种可自产氧气的蛋白复合支架， 随着支 架材料的降解逐步且接近恒速的从内部向外释放氧气， 从而可令复合其上的种子细胞长期 存活并促进材料植入后微血管的长入。 说 明 书 CN 104288834 A 3 2/6 页 4 0006 本发明的第一个方面是提供一种可自产氧气的蛋白复合支架， 所述蛋白复合支架 的组成材料包括生物蛋白、 明胶和自产氧物。 0007 优选地， 所述明胶和和生物蛋白的质量比为 （0.5-5） :10， 更优选为 （0.7-4.5） :10， 更优选为 （0.85-4） :10， 更优选为 （1-3） :10， 例如 1.5:10、 2:10、 2.2:10 或。

12、 2.5:10。 0008 优选地， 所述自产氧物和生物蛋白的质量比为 （1-50） :10， 更优选为 （2-40） :10， 更优选为 （4-30） :10， 更优选为 （5-25） :10， 例如 5.5:10、 10:10、 12:10、 15:10 或 20:10。 0009 其中， 所述自产氧物优选为过氧化钙、 过碳酸钠、 过碳酸钾、 过氧化硫脲等中的一 种或几种的混合物， 更优选为过氧化钙。 0010 其中， 所述生物蛋白选自角蛋白和丝素蛋白中的一种或两种。 0011 进一步优选地， 所述角蛋白为还原型人发角蛋白。 0012 本发明的第二个方面是提供一种上述可自产氧气的蛋白复合支。

13、架的制备方法， 包 括以下步骤 ： 0013 步骤 1， 制备生物蛋白溶液， 控制生物蛋白溶液中生物蛋白的浓度为 0.05-0.2g/ mL ； 0014 步骤 2， 将明胶加入到生物蛋白溶液中， 待明胶完全溶解后， 加入自产氧物， 溶解完 全， 其中， 所述明胶和生物蛋白的质量比为 （0.5-5） :10， 所述自产氧物和生物蛋白的质量比 为 （1-50） :10 ； 0015 步骤 3， 将步骤 2 得到的混合溶液密封静置， 直至凝胶化， 敞口自蒸发， 得到蛋白复 合支架。 0016 步骤 1 中， 生物蛋白溶液中生物蛋白的浓度优选为 0.06-0.17g/mL， 更优选为 0.07-0.。

14、15g/mL， 更 优 选 为 0.08-0.13g/mL， 更 优 选 为 0.09-0.11g/mL， 例 如 0.1g/mL 或 0.105g/mL。 0017 步骤 1 中， 所述生物蛋白优选地选自角蛋白和丝素蛋白中的一种或两种。 0018 进一步优选地， 所述角蛋白为还原型人发角蛋白， 制备方法如下 ： 将人头发置于 提取液中， 50-150（优选为 70-130， 更优选为 80-120， 更优选为 100-110） 下浸泡 10-60min（优选为 15-50min， 更优选为 25-35min） ， 过滤， 将滤液透析， 浓缩， 得到还原型人 发角蛋白， 其中， 人头发的质量与。

15、提取液的体积的比为 （0.5-4g） :（5-20mL） 。 0019 进一步优选地， 人头发的质量与提取液的体积的比为 （1-3g） :（8-15mL） ， 更优选 为 （1.5-2g） :（10-12mL） 。 0020 优选地， 所述提取液为尿素、 十二烷基硫酸钠、 Na2S2O5的混合水溶液。 0021 进一步优选地， 所述提取液中， 每 100mL 水中， 含有 30-70g （优选为 35-60g， 更优选 为 45-50g） 尿素、 40-80g（优选为 45-70g， 更优选为 50-60g） 十二烷基硫酸钠、 80-120g（优 选为 88-110g， 更优选为 92-100。

16、g） Na2S2O5。 0022 所述丝素蛋白的制备方法如下 ： 将脱胶蚕丝溶于 MX 溶液中， 过滤， 将滤液透析， 浓 缩， 得到纯化的丝素蛋白， 其中， M 为碱金属 （例如 Li、 Na、 K 等） ， X 为卤素 （例如 F、 Cl、 Br、 I 等） 。 0023 步骤 2 中， 所述明胶和和生物蛋白的质量比优选为 （0.7-4.5） :10， 更优选为 （0.85-4） :10， 更优选为 （1-3） :10， 例如 1.5:10、 2:10、 2.2:10 或 2.5:10。 0024 步骤 2 中， 所述自产氧物和生物蛋白的质量比优选为 （1-50） :10， 更优选为 说 。

17、明 书 CN 104288834 A 4 3/6 页 5 （2-40） :10， 更优选为 （4-30） :10， 更优选为 （5-25） :10， 例如 5.5:10、 10:10、 12:10、 15:10 或 20:10。 0025 步骤 2 中， 所述自产氧物优选为过氧化钙、 过碳酸钠、 过碳酸钾、 过氧化硫脲等中 的一种或几种的混合物， 更优选为过氧化钙。 0026 优选地， 步骤3中， 凝胶化后， 敞口自蒸发8-16h （优选为10-14h， 更优选为11-12h） 后， 倒入无水酒精 0.5-2h（优选为 0.8-1.5h， 更优选为 1-1.2h） 后取出得到蛋白复合支架。 0。

18、027 本发明提供的可自产氧气的蛋白复合支架复合了生物蛋白、 明胶和自产氧物， 物 理强度要优于利用单纯蛋白组合溶液所构建的膜结构材料， 同时明胶成份对自产氧物构成 一定的包裹作用， 使得本发明提供的蛋白复合支架能够恒速且高水平的释放氧气， 从而可 令复合其上的种子细胞长期存活并促进材料植入后微血管的长入， 更适合于实际手术操作 的需要， 最终提高尿道修复重建的成功率。 附图说明 0028 图 1 为本发明提供的可自产氧气的蛋白复合支架的 HE 染色图 ； 0029 图 2 为本发明提供的可自产氧气的蛋白复合支架的扫描电镜图 ： 可见明胶包被自 产氧物 ； 0030 图 3 为本发明提供的可自。

19、产氧气的蛋白复合支架的扫描电镜图 ： 可见支架表面呈 现多孔样结构。 具体实施方式 0031 下面参照附图， 结合具体的实施例对本发明作进一步的描述， 以更好地理解本发 明。 0032 实施例 1 0033 1、 自理发店中获取无染色的正常黑发， 常规洗发精清洗 1-2 次， 置放于常规室温 中进行干燥。 0034 2、 将干燥处理后的头发浸泡于乙酸乙酯与甲醇的混合溶液中 24 小时， 其中乙酸 乙酯与甲醇的体积比为 3:1。 0035 3、 头发再次干燥后， 充分剪碎， 将其按 1.5g/10ml 比例加入提取液 （每 1000ml 水 中， 溶解 480.4g 尿素、 57.676g 十二。

20、烷基硫酸钠 SDS、 95.045gNa2S2O5） 中， 浸没后在 100油 浴加热 30min。 0036 4、 真空抽滤， 将黑色提取液置于透析袋中， 透析 5d， 透析袋周围水溶液中含有 0.1wt% 的 Na2S2O5。 0037 5、 完成透析后将透析带置于 20wt%PEG （分子量 10000） 水溶液中， 浓缩 6 小时， 调节 还原型人发角蛋白的的浓度为0.1g/mL后， 行SDS蛋白电泳检测提示蛋白电泳带在45-60kD 左右， 说明得到还原型人发角蛋白。 0038 6、 将得到的还原型人发角蛋白溶液在 4环境下予以保存。 0039 7、 取上述得到的还原型人发角蛋白溶液。

21、 15ml， 将其融合搅拌并加热至 37， 加入 明胶， 控制混合液中明胶的浓度为 0.02g/mL。待明胶完全溶解后， 加入过氧化钙， 控制混合 液中过氧化钙的浓度为 0.2g/mL， 高速搅拌 30s 后置入方型模具中。 说 明 书 CN 104288834 A 5 4/6 页 6 0040 8、 混合溶液在方型模具中， 模具加盖， 室温下放置 12h 小时， 带凝胶化后， 开盖， 自 然蒸发 12h， 倒入酒精 1h 后取出， 得到蛋白复合支架。 0041 最终获取材料大体外观为褐色半透明膜状材料。其 HE 染色提示该材料一肃木素 染色阳性膜状物， 表面富有多孔样结构 （图 1 所示） 。

22、。扫描电镜显示材料表面可见明胶包被 过氧化钙 （图 2 所示） ， 并可见支架材料呈现多孔样结构 （图 3 所示） 。 0042 经释氧能力检测， 该材料可在体外持续释氧时间超过两周， 其中每平方厘米该类 材料能够使 8ml 中性溶液的氧含量在两周内保证在 100mmHg 以上。 0043 实施例 2 0044 1、 自理发店中获取无染色的正常黑发， 常规洗发精清洗 1-2 次， 置放于常规室温 中进行干燥。 0045 2、 将干燥处理后的头发浸泡于乙酸乙酯与甲醇的混合溶液中 24 小时， 其中乙酸 乙酯与甲醇的体积比为 3:1。 0046 3、 头发再次干燥后， 充分剪碎， 将其按 1.5g。

23、/10ml 比例加入提取液 （每 1000ml 水 中， 溶解 480.4g 尿素、 57.676g 十二烷基硫酸钠 SDS、 95.045gNa2S2O5） 中， 浸没后在 100油 浴加热 30min。 0047 4、 真空抽滤， 将黑色提取液置于透析袋中， 透析 5d， 透析袋周围水溶液中含有 0.1wt% 的 Na2S2O5。 0048 5、 完成透析后将透析带置于 20wt%PEG （分子量 10000） 水溶液中， 浓缩 6 小时， 调节 还原型人发角蛋白的的浓度为0.1g/mL后， 行SDS蛋白电泳检测提示蛋白电泳带在45-60kD 左右， 说明得到还原型人发角蛋白。 0049 。

24、6、 将得到的还原型人发角蛋白溶液在 4环境下予以保存。 0050 7、 将 100g 溴化锂溶于 60ml 水中， 配制成溴化锂水溶液， 搅拌溶液同时加热至 60。 0051 8、 将自市场上购置的脱胶蚕丝 10g 溶液溴化锂水溶液中， 5h 后， 多层纱布过滤， 过 滤后溶液置于透析袋中。 0052 9、 透析 5d， 透析袋周围水溶液中含有 0.1wt% 的 Na2S2O5， 每天换水一次。 0053 10、 完成透析后将透析带置于 20wt%PEG（分子量 20000） 水溶液中， 浓缩 6h， 调节 至丝素蛋白的浓度为 0.1g/mL， 行 SDS 蛋白电泳检测提示蛋白电泳带在 25。

25、-30kD 左右， 说明 得到丝素蛋白。 0054 11、 将得到的丝素蛋白溶液在 4环境下予以保存。 0055 12、 将得到的还原型人发角蛋白溶液和丝素蛋白溶液按体积比 4:6 进行混合。 0056 13、 取步骤12得到的混合液15ml， 将其融合搅拌并加热至37， 加入明胶， 控制混 合液中明胶的浓度为0.02g/mL。 待明胶完全溶解后， 加入过氧化钙， 控制混合液中过氧化钙 的浓度为 0.2g/mL， 高速搅拌 30s 后置入方型模具中。 0057 14、 混合溶液在方型模具中， 模具加盖， 室温下放置 12h 小时， 带凝胶化后， 开盖， 自然蒸发 12h， 倒入酒精 1h 后取。

26、出， 得到蛋白复合支架。 0058 最终获取材料大体外观为褐色半透明膜状材料。其 HE 染色提示该材料一肃木素 染色阳性膜状物， 表面富有多孔样结构。 扫描电镜显示材料表面可见明胶包被过氧化钙， 并 可见支架材料呈现多孔样结构。 说 明 书 CN 104288834 A 6 5/6 页 7 0059 经释氧能力检测， 该材料可在体外持续释氧时间超过两周， 其中每平方厘米该类 材料能够使 8ml 中性溶液的氧含量在两周内保证在 100mmHg 以上。 0060 实施例 3 0061 1、 自理发店中获取无染色的正常黑发， 常规洗发精清洗 1-2 次， 置放于常规室温 中进行干燥。 0062 2、。

27、 将干燥处理后的头发浸泡于乙酸乙酯与甲醇的混合溶液中 24 小时， 其中乙酸 乙酯与甲醇的体积比为 3:1。 0063 3、 头发再次干燥后， 充分剪碎， 将其按 1.5g/10ml 比例加入提取液 （每 1000ml 水 中， 溶解 480.4g 尿素、 57.676g 十二烷基硫酸钠 SDS、 95.045gNa2S2O5） 中， 浸没后在 100油 浴加热 30min。 0064 4、 真空抽滤， 将黑色提取液置于透析袋中， 透析 5d， 透析袋周围水溶液中含有 0.1wt% 的 Na2S2O5。 0065 5、 完成透析后将透析带置于 20wt%PEG （分子量 10000） 水溶液中。

28、， 浓缩 6 小时， 调节 还原型人发角蛋白的的浓度为0.1g/mL后， 行SDS蛋白电泳检测提示蛋白电泳带在45-60kD 左右， 说明得到还原型人发角蛋白。 0066 6、 将得到的还原型人发角蛋白溶液在 4环境下予以保存。 0067 7、 将 100g 溴化锂溶于 60ml 水中， 配制成溴化锂水溶液， 搅拌溶液同时加热至 60。 0068 8、 将自市场上购置的脱胶蚕丝 10g 溶液溴化锂水溶液中， 5h 后， 多层纱布过滤， 过 滤后溶液置于透析袋中。 0069 9、 透析 5d， 透析袋周围水溶液中含有 0.1wt% 的 Na2S2O5， 每天换水一次。 0070 10、 完成透析。

29、后将透析带置于 20wt%PEG（分子量 20000） 水溶液中， 浓缩 6h， 调节 至丝素蛋白的浓度为 0.1g/mL， 行 SDS 蛋白电泳检测提示蛋白电泳带在 25-30kD 左右， 说明 得到丝素蛋白。 0071 11、 将得到的丝素蛋白溶液在 4环境下予以保存。 0072 12、 将得到的还原型人发角蛋白溶液和丝素蛋白溶液按体积比 4:6 进行混合。 0073 13、 取步骤12得到的混合液15ml， 将其融合搅拌并加热至37， 加入明胶， 控制混 合液中明胶的浓度为0.02g/mL。 待明胶完全溶解后， 加入过氧化钙， 控制混合液中过氧化钙 的浓度为 0.05g/mL， 高速搅拌。

30、 30s 后置入方型模具中。 0074 14、 混合溶液在方型模具中， 模具加盖， 室温下放置 12h 小时， 带凝胶化后， 开盖， 自然蒸发 12h， 倒入酒精 1h 后取出， 得到蛋白复合支架。 0075 最终获取材料大体外观为褐色半透明膜状材料。其 HE 染色提示该材料一肃木素 染色阳性膜状物， 表面富有多孔样结构。 扫描电镜显示材料表面可见明胶包被过氧化钙， 并 可见支架材料呈现多孔样结构。 0076 经释氧能力检测， 该材料可在体外持续释氧时间维持在一周左右， 其中每平方厘 米该类材料能够使 8ml 中性溶液的氧含量在一周内保证在 100mmHg 以上。 0077 以上对本发明的具体实施例进行了详细描述， 但其只是作为范例， 本发明并不限 制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言， 任何对本发明进行的等同修改和 替代也都在本发明的范畴之中。因此， 在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和 说 明 书 CN 104288834 A 7 6/6 页 8 修改， 都应涵盖在本发明的范围内。 说 明 书 CN 104288834 A 8 1/1 页 9 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 104288834 A 9 。