腺花素在制药中的应用 【技术领域】
本发明涉及生物技术和医药领域， 具体地讲， 涉及活性物质腺花素 （adenanthin） 在制备预防或治疗多发性硬化症药物中的应用。背景技术
多发性硬化 (Multiple Sclerosis, MS) 是最常见的神经免疫疾病之一， 表现为中 枢神经系统的脱髓鞘， 约 50% 的患者在发病后 15 年后不能独立行走。 MS 是西欧和南美地区 最常见的非外伤所致的神经系统残障的疾病。 在我国， 据不完全统计， 该病患病率也已达约 十万分之五， 并呈逐年上升趋势。因其在中青年人群中多发， 且有较高致残率， 对社会和家 庭造成极为不良的影响。 该病的病变部位在脑部或脊髓， 临床特点是病灶播散广泛， 病程中 常有缓解复发的神经系统损害症状。MS 的症状视其所影响的神经组织而定， 患者可能出现 视力受损 （视神经病变） 、 肢体无力、 平衡失调、 行动不便、 麻木、 感觉异常、 口齿不清、 眩晕、 大小便机能失调等症状， 病情反复性加重， 致残率高。MS 的发病机制迄今不清， 目前尚无有 效地治疗方法。
MS 的治疗主要包括急性发作期的对症治疗和慢性迁延期的预防复发治疗。目前 MS 疾病治疗的手段主要包括 ： ①糖皮质素 ； ②大剂量免疫球蛋白 ； ③干扰素 -b ； ④免疫抑 制剂如环磷酰胺， 米托蒽醌等 ； ⑤格拉默 （Glatiramer acetate GA） ； ⑥神经营养药物 ； ⑦雷 公藤多甙片。临床上多采取联合治疗方法。现有的治疗方法价格昂贵， 副作用大， 功效相当 有限， 开发新的治疗药物具有重要价值。
现有的多发性硬化的治疗药物价格昂贵， 副作用大， 功效相当有限。在这一点上， 有着几千年历史的中国草药具有独特的优势， 如雷公藤自 20 世纪 80 年代以来， 便广泛地应 用于多种免疫性疾病如类风湿性关节炎及某些肾脏系统免疫性疾病等。 但因中药方剂成份 较复杂， 导致作用机制难以明确， 毒副作用难以控制， 药物剂量难以规范化， 极大限制了其 在临床上的推广应用。 从已知的对某些疾病有明确作用而且毒性较低的中草药中提取纯化 其活性单体成分是发展新的抗炎药物的一条可行途径。
腺花素 （Adenanthin） （见图 1 A）后又在文献中改称为腺花甲素 （Adenanthin A） ， 均为同一个化合物， 是从云南产唇形科 （Lamiaceae） 香茶菜属 （Isodon） 植物腺花香茶 菜 （Isodon adenanthus）中分离鉴定的一个对映－贝壳杉烯 （ent-kaurenoid） 1,2 类二 萜化合物， 其分子式为 C26H34O9， 分子量为 490， 熔点为 251-255℃， [a]13 D -760 (c 0.25, CHCl3); UV (EtOH) lmax (log e) 231 (4.07); IR (Nujol) nmax 3475, 1743, 1724, 1645, 1257, 1217, 1030 cm-1; MS m/z ： 490（M+） ， 448， 430， 380， 370， 328， 310， 295， 292， 180， 162， 138。
腺花素是一种植物中天然存在的化合物， 具有较高的安全性。以往的研究中显示 腺花素类化合物如毛萼乙素、 冬凌草甲素在肿瘤、 炎症等方面疾病的防治中具有广阔的前 景。本发明的腺花素安全低毒， 药理作用强， 预示着很好的药用前景， 容易为市场所接受。发明内容 本发明的目的在于提供腺花素在制药中的应用。
本发明的第二个目的在于提供一种 NF-kB 抑制剂。
为实现以上目的， 本发明公开以下技术方案 ： 腺花素在制备预防或治疗多发性硬 化症药物中的应用。
一种 NF-kB 抑制剂， 所述抑制剂是腺花素。
本发明的优点在于 ： 腺 花 素 能 够 通 过 多 个 环 节 抑 制 NF-kB 的 活 性 （直 接 抑 制 NF-kB/p65 的 DNA 结合， 抑制 IKKb 的激酶活性） ， 抑制抗原递呈细胞的活化， 抑制 T 细胞的活 化及巨噬细胞的活化 , 从而表现出显著的多发性硬化症预防和治疗作用。本发明的腺花素 安全低毒， 药理作用强， 预示着很好的药用前景。本发明的腺花素活性物质具有容易吸收、 稳定性好等特点， 更加适合作为新型药物、 食物、 保健品和／或膳食添加剂进行开发。
附图说明
图 1A 为腺花素的化学结构。
图 1B 显 示 NF-kB 荧 光 报 告 基 因 实 验 中，不 同 浓 度 腺 花 素 与 处 理 pGL4.32-NF-kB-RE-THP-1 细胞 1 个小时后加入 10ng/ml TNFa 刺激 5 个小时， 检测荧光素酶 的活性， 结果提示腺花素能剂量依赖性的抑制 TNFa 诱导的 NF-kB 的活化。
图 1C 显示腺花素抑制 TNFa 诱导的 NF-kB 的 DNA 结合能力， 不同浓度腺花素预处 理 THP-1 细胞 1 个小时后加入 10ng/ml TNFa 刺激一个小时， 提取核蛋白， 通过凝胶迁移实 验检测 NF-kB 的 DNA 结合能力， 结果提示腺花素能剂量依赖性的抑制 TNFa 诱导的 NF-kB 的 DNA 结合能力。
图 1D 显示腺花素抑制 TNFa 诱导的 NF-kB p65 的入核， 不同浓度腺花素预处理 THP-1 细胞 1 个小时后加入 10ng/ml TNFa 刺激 30 分钟， 免疫荧光检测 p65 的细胞定位。
图 1E 显示腺花素抑制 TNFa 诱导的 NF-kB p65 的入核， 不同浓度腺花素预处理 THP-1 细胞 1 个小时后加入 10ng/ml TNFa 刺激 30 分钟， 核浆分离后， WESTERN 检测 p65、 p50、 laminB 和 b-actin。
图 2A 显示 4mM、 10mM 的腺花素处理 THP-1 细胞 1 个小时后加入 10ng/ml TNFa 刺激 15 分钟后， WESTERN 检测 pi-IKKa/b、 IKKa、 pi-IkBa、 IkBa、 pi-p65、 p65、p50 和 b-actin。
图 2B 显示 4mM、 10mM 的腺花素处理 THP-1 细胞 1 个小时后加入 10ng/ml TNFa 刺 激 1 个小时后， 收取细胞， 抽提总的 RNA， 反转后 real-time PCR 检测 IL-8、 IKBa 和 TRAF1， 结果提示腺花素能剂量依赖性的抑制 TNFa 诱导的 NF-kB 的靶基因的表达。
图 3A 显 示 NF-kB 荧 光 报 告 基 因 实 验 中，不 同 浓 度 腺 花 素 预 处 理 pGL4.32-NF-kB-RE-RAW264.7 细胞个小时后加入 100ng/ml LPS 刺激 5 个小时， 检测荧光素 酶的活性。结果提示腺花素能剂量依赖性的抑制 LPS 诱导的 NF-kB 的活化。
图 3B 显示腺花素抑制 LPS 诱导的 NF-kB p65 的入核， 不同浓度腺花素预处理 RAW264.7 细胞 1 个小时后加入 100ng/ml LPS 刺激 30 分钟， 免疫荧光检测 p65 的细胞定位。
图 3C 显示 4mM、 10mM 的腺花素处理 RAW264.7 细胞 1 个小时后加入 100ng/ml LPS 刺激 1 个小时后， 收取细胞， 抽提总的 RNA， 反转后 real-time PCR 检测 IL-1a、 IL-6、 IL-23 和 TNFa 水平。图 3D 显示 4mM、 10mM 的腺花素处理 RAW264.7 细胞 1 个小时后加入 100ng/ml LPS 刺激 30 分钟后， WESTERN 检测 pi-IKKa/b、 IKKa、 pi-IKBa、 IKBa、 pi-p65、 p65、 p50 和 b-actin。
图 4A 显示利用化学方法对腺花素的羟基进行修饰， 连接上生物素， 得到生物素标 记的小分子。
图 4B 显 示 生 物 素 标 记 腺 花 素 在 体 外 与 THP-1 细 胞 裂 解 液 孵 育， 通过 streptavidin-Agarose beads 钓取与生物素标记腺花素相互作用的靶蛋白， 未标记的腺花 素作为冷探针竞争， WESTERN 检测 IKKb、 IKKa、 IkBa、 p65 和 p50， 提示 IKKb 和 p65 为腺花素 的靶蛋白。
图 4C 显示 10ng/ml TNFa 刺激 THP-1 细胞 1 个小时， 提取核蛋白， 体外加入 10mM、 100mM 的腺花素室温孵育 30 分钟， 通过凝胶迁移实验检测 NF-kB 的 DNA 结合能力， 腺花素能 体外直接抑制 NF-kB 的 DNA 结合能力。
图 4D 显示纯化的 IKKb 体外激酶试验， 1mM、 10mM 和 100mM 的腺花素体外加入反应 体系中， WESTERN 检测 pi-IkBa(ser32)。腺花素能体外直接抑制 IKKb 的酶活。
图 5A 显示 DMSO 生理盐水对照组和腺花素预防组 EAE 发病情况的比较， 腺花素可 以明显抑制 EAE 的发病。 图 5B 显示 DMSO 生理盐水对照组和腺花素治疗组 EAE 发病情况的比较， 腺花素可 以明显抑制 EAE 的发病。
图 5C 显示取正常小鼠、 免疫小鼠 14 天 DMSO 生理盐水对照组、 腺花素预防组和腺 花素治疗组小鼠脊髓腰膨大 HE 染色 （上方） ， fast blue 染色 （下方） 。DMSO 生理盐水对照组 可见大量的炎症细胞浸润包膜及白质且产生大量空泡， 腺花素预防和治疗组未见大量的炎 症细胞浸润包膜及白质。
图 6A 显示取免疫小鼠 14 天 DMSO 生理盐水对照组和腺花素治疗组 EAE 小鼠淋巴 结， WESTERN 检测 pi-IkBa(ser32)、 IKBa、 pi-p65 和 b-actin， 腺花素治疗组明显降低 EAE 小鼠淋巴结中 NF-kB 的活性。
图 6B 显示取正常小鼠、 免疫小鼠 14 天 DMSO 生理盐水对照组、 腺花素预防组和 腺花素治疗组小鼠脊髓腰膨大冰冻切片， 免疫荧光检测 pi-IkBa(ser32)， 腺花素明显降低 EAE 小鼠中枢神经系统中 NF-kB 的活性。
图 7A 显示取正常小鼠、 免疫小鼠 14 天 DMSO 生理盐水对照组、 腺花素预防组和腺 花素治疗组小鼠脊髓腰膨大冰冻切片， 免疫荧光检测 pi-IkBa(ser32)、 F4/80。腺花素明显 降低 EAE 小鼠中枢神经系统中巨噬细胞的浸润且降低其 NF-kB 的活性。
图 7B 显示取正常小鼠、 免疫小鼠 14 天 DMSO 生理盐水对照组、 腺花素预防组和腺 花素治疗组小鼠脊髓腰膨大冰冻切片， 免疫荧光检测 TNFa、 F4/80 表达情况， 腺花素明显降 低 EAE 小鼠中枢神经系统中巨噬细胞的浸润且减少其分泌 TNFa。
图 8A 显示取免疫小鼠 14 天 DMSO 生理盐水对照组、 腺花素治疗组小鼠淋巴细胞在 体外对 MOG 的反应性， 腺花素明显降低 EAE 小鼠淋巴细胞对 MOG 刺激增殖的反应性。
图 8B 显示取免疫小鼠 14 天 DMSO 生理盐水对照组、 腺花素治疗组小鼠淋巴细胞， 体外用 20mg/ml MOG 刺激 24 小时后， 标记 CD11b、 CD80、 CD86 和 PD-L1， 圈出 CD11b+ 的细胞 群分析 CD80、 CD86 和 PD-L1 等共刺激分子的表达情况， 腺花素明显降低 EAE 小鼠抗原递成
细胞的共刺激分子的表达。 具体实施方式
下面结合附图对本发明做详细说明， 实施例的作用仅是解释而非限定本发明。
实施例 1 ： 腺花素在 THP-1 细胞中抑制 TNFa 诱导的 NF-kB 的活化。
建立了一个体外筛选 NF-kB 抑制剂的平台， 即在人单核细胞白血病细胞系 THP-1 中， 电穿孔转入 pGL4.32[luc2P/NF-kB-RE/Hygro] Vector（Promega） 质粒， 通过 Hygro 筛 选得到稳转 NF-kB 报告基因的细胞系。通过加入 TNFa 活化 NF-kB 的细胞因子证实此系统 是可以很好反应 NF-kB 的活性 （图 1 B） 。不同浓度腺花素与处理 pGL4.32-NF-kB-RE-THP-1 细胞 1 个小时后加入 10ng/ml TNFa 刺激 5 个小时， 检测荧光素酶的活性。结果提示腺花素 能剂量依赖性的抑制 TNFa 诱导的 NF-kB 的活化 （图 1 B） 。
进一步， 不同浓度腺花素预处理 THP-1 细胞 1 个小时后加入 10ng/ml TNFa 刺激 1 个小时， 提取核蛋白， 通过凝胶迁移实验检测 NF-kB 的 DNA 结合能力。结果提示腺花素能剂 量依赖性的抑制 TNFa 诱导的 NF-kB 的 DNA 结合能力 （图 1 C） 。通过免疫荧光实验我们发现 不同浓度腺花素预处理 THP-1 细胞 1 个小时后加入 10ng/ml TNFa 刺激 30 分钟， TNFa 诱导 的 p65 的入核被抑制 （图 1 D） 。为进一步证实免疫荧光的结果， 核浆分离后， WESTERN 检测 p65、 p50、 laminB 和 b-actin。我们发现腺花素能抑制 TNFa 诱导的 p65 和 p50 的入核 （图 1 E） 。
实施例 2 ： 腺花素通过多个步骤抑制 NF-kB 的活性及下游靶基因的表达。
为了研究腺花素抑制 NF-kB 的机制， 观察腺花素作用于 TNFa 诱导 NF-kB 活化的哪 个环节。 用 4mM、 10mM 的腺花素预处理 THP-1 细胞 1 个小时后加入 10ng/ml TNFa 刺激 15 分 钟后， WESTERN 检测 pi-IKKa/b、 IKKa、 pi-IkBa、 IkBa、 pi-p65、 p65、p50 和 b-actin（图 2 A） 。我们发现即低浓度下 （4mM） 不影响 IkBa 的磷酸化及降解， 高浓度 （10mM） 完全抑制 IkBa 的磷酸化及降解。与此相一致， NF-kB 免疫荧光的结果显示低浓度仅部分抑制 NF-kB 核转 位， 而高浓度几乎完全抑制 NF-kB 核转位。4mM、 10mM 的腺花素处理 THP-1 细胞 1 个小时后 加入 10ng/ml TNFa 刺激 1 个小时后， 收取细胞， 抽提总的 RNA， 反转后 real-time PCR 检测 IL-8、 IKBa 和 TRAF1。腺花素抑制 NF-kB 进而抑制其下游靶基因 IL-8、 IKBa 和 TRAF1 的 表达 （图 2 B） 。以上结果提示腺花素通过多个环节抑制 NF-kB 的活性及其下游靶基因的表 达。
实施例 3 ： 腺花素在 RAW264.7 细胞中抑制 LPS 诱导的 NF-kB 的活化。
在小鼠巨噬细胞系 RAW264.7 中， 电穿孔转入 pGL4.32[luc2P/NF-kB-RE/Hygro] Vector （Promega） 质粒， 通过 Hygro 筛选得到稳转 NF-kB 报告基因的细胞系。通过加入 LPS 活化 NF-kB 的细胞因子证实此系统是可以很好反应 NF-kB 的活性 （图 3 A） 。不同浓度腺花 素与处理 pGL4.32-NF-kB-RE- RAW264.7 细胞 1 个小时后加入 100ng/ml LPS 刺激 5 个小时， 检测荧光素酶的活性。结果提示腺花素能剂量依赖性的抑制 LPS 诱导的 NF-kB 的活化 （图 1 B） 。
进 一 步， 通 过 免 疫 荧 光 实 验 我 们 发 现 不 同 浓 度 (4mM、 10mM) 腺 花 素 预 处 理 RAW264.7 细胞 1 个小时后加入 100ng/ml LPS 刺激 30 分钟， LPS 诱导的 p65 的入核被抑制 （图 3 B） 。4mM、 10mM 的腺花素处理 RAW264.7 细胞 1 个小时后加入 100ng/ml LPS 刺激 1 个小时后， 收取细胞， 抽提总的 RNA， 反转后 real-time PCR 检测 IL-1a、 IL-6、 IL23 和 TNFa。 腺花素抑制 NF-kB 进而抑制其下游基因 IL-1a、 IL-6、 IL23 和 TNFa 的表达 （图 3 C） 。4mM、 10mM 的腺花素处理 RAW264.7 细胞 1 个小时后加入 100ng/ml LPS 刺激 30 分钟后， WESTERN 检测 pi-IKKa/b、 IKKa、 pi-IKBa、 IKBa、 pi-p65、 p65、p50 和 b-actin（图 3 D） ， 发现低浓度 （4mM） 不影响 IkBa 的磷酸化及降解， 高浓度 （10mM） 完全抑制 IkBa 的磷酸化及降解。提示 在不同细胞不同刺激的作用下， 腺花素都能抑制 NF-kB 的活性。
实施例 4 ： 腺花素通过直接结合 IKKb 和 p65 蛋白抑制 NF-kB 的活性。
利用一系列的化学反应， 从羟基位连接上生物素， 得到同样具有活性的生物素标 记的腺花素 （图 4 A） 。进而利用生物素标记腺花素在体外与 THP-1 细胞裂解液孵育， 通过 streptavidin-Agarose beads 钓取与生物素标记腺花素相互作用的靶蛋白， 未标记的腺花 素作为冷探针竞争。WESTERN 检测 IKKb、 IKKa、 IkBa、 p65 和 p50。提示 IKKb 和 p65 为腺 花素的靶蛋白 （图 4 B） 。 进一步通过体外实验验证上面的结果， 显示 10ng/ml TNFa 刺激 THP-1 细胞 1 个小时， 提取核蛋白， 体外加入 10mM、 100mM 的腺花素室温孵育 30 分钟， 通过 凝胶迁移实验检测 NF-kB 的 DNA 结合能力。腺花素能体外直接抑制 NF-kB 的 DNA 结合能力 （图 4 C） 。纯化的 IKKb 体外激酶试验， 1mM、 10mM 和 100mM 的腺花素体外加入反应体系中， WESTERN 检测 pi-IkBa(ser32)。腺花素能体外直接抑制 IKKb 的酶活 （图 4 D） 。腺花素能 直接抑制 NF-kB 的 DNA 结合能力， 也能直接抑制 IKKb 的酶活。 实施例 5 ： 腺花素预防组和治疗组均明显改善 EAE 小鼠的病程。
EAE 是由于炎症导致的中枢神经系统脱髓鞘， 所以炎症的发生早于症状的开始。 我 们应用预防和治疗两种方案探索腺花素对 EAE 的疗效， 即腺花素在 MOG 免疫 C57/BL6 小鼠 前 3 天开始进行腹腔注射治疗 （预防组） ， 腺花素在 MOG 免疫 C57/BL6 小鼠后 8 天开始进行 腹腔注射治疗 （治疗组） ， 同时设立空白对照组， 每组 12-15 只小鼠， 观察腺花素对小鼠 EAE 的效果。通过对小鼠 EAE 发病的临床分值， 与空白对照组小鼠相比， 腺花素预防组和治疗组 EAE 小鼠发病程度明显减轻 （见图 5 A B） 。取正常小鼠、 免疫小鼠 14 天 DMSO 生理盐水对照 组、 腺花素预防组和腺花素治疗组小鼠脊髓腰膨大 HE 染色 （上方） ， fast blue 染色 （下方） （图 5 C） ， 发现对照组 EAE 小鼠脊髓髓鞘形态遭到破坏， 周边蓝色部分有空泡状缺失， 为脱髓 鞘现象．并伴有大量的炎性浸润。而腺花素预防和治疗组小鼠脊髓髓鞘形态保持完整， 未 见有明显的脱髓鞘现象， 髓鞘中也未见有明显的炎性细胞浸润。
实施例 6 ： 腺花素体内抑制 NF-kB 的活性。
取免疫小鼠 14 天 DMSO 生理盐水对照组和腺花素治疗组 EAE 小鼠淋巴结， 裂解 后， WESTERN 检测 pi-IkBa(ser32)、 IKBa、 pi-p65 和 b-actin（图 6 A） 。腺花素治疗组明 显降低 EAE 小鼠淋巴结中 NF-kB 的活性。正常小鼠、 免疫小鼠 14 天 DMSO 生理盐水对照组、 腺花素预防组和腺花素治疗组小鼠脊髓腰膨大冰冻切片， 免疫荧光检测 pi-IkBa(ser32) （图 6 B） ， 可见对照组 EAE 小鼠大量 pi-IkBa(ser32) 的活化， 而腺花素预防和治疗组小鼠 pi-IkBa(ser32) 的活化明显降低。腺花素明显降低 EAE 小鼠中枢神经系统中 NF-kB 的活 性。说明腺花素可以在体内抑制 NF-kB 的活性。
实施例 7 ： 腺花素体内抑制 EAE 小鼠脊髓巨噬细胞的浸润及其分泌 TNFa。
正常小鼠、 免疫小鼠 14 天 DMSO 生理盐水对照组、 腺花素预防组和腺花素治疗组小 鼠脊髓腰膨大冰冻切片， 免疫荧光检测 pi-IkBa(ser32)、 F4/80 （见图 7 A） ， TNFa、 F4/80 （见
图 7 B） 。图中可见对照组 EAE 小鼠脊髓髓鞘有大量的炎性巨噬细胞浸润， 炎性巨噬细胞伴 有 pi-IkBa(ser32) 的活化， 且 TNFa 的分泌量大大增加。而腺花素预防和治疗组小鼠脊髓 未见有明显炎性巨噬细胞浸润， 未见有 pi-IkBa(ser32) 的活化及 TNFa 的分泌。
实施例 8 ： 腺花素抑制淋巴细胞在体外对 MOG 的反应性及明显降低 EAE 小鼠抗原 递成细胞的共刺激分子的表达。
取免疫小鼠 14 天 DMSO 生理盐水对照组和腺花素治疗组 EAE 小鼠脾脏， 分离单个 核细胞后， 在体外加入不同浓度的 MOG 刺激， 56 小时加入 3H 继续培养 16 小时后， 检测 3H 的 掺入量， 进而反映细胞的增殖情况。可见腺花素可明显抑制 MOG 刺激的淋巴细胞增殖 （见图 8 A） 。取免疫小鼠 14 天 DMSO 生理盐水对照组、 腺花素治疗组小鼠淋巴细胞， 体外用 20mg/ ml MOG 刺激 24 小时后， 标记 CD11b、 CD80、 CD86 和 PD-L1。圈出 CD11b+ 的细胞群分析 CD80、 CD86 和 PD-L1 等共刺激分子的表达情况 （见图 8 B） 。腺花素明显降低 EAE 小鼠抗原递成细 胞的共刺激分子的表达。
以上所述仅是本发明的优选实施方式， 应当指出， 对于本技术领域的普通技术人 员， 在不脱离本发明原理的前提下， 还可以做出若干改进和润饰， 这些改进和润饰也应视为 本发明的保护范围。