技术领域
本发明涉及一种神经导管，其包含由可吸收材料形成的成形体。
背景技术
之前描述的技术中的神经导管用于神经系统的损伤，以连接损伤 神经的末端并且在两端之间的空隙上搭桥。神经导管向神经纤维(轴 突)提供空间以使其生长，并且另一方面，在形成伤疤的结缔组织细 胞(成纤维细胞)入侵之前，神经导管完美地提供保护。
在此，神经导管的两端与由损伤形成的神经残余连接，并且在其 间存在的空隙上搭桥。神经残余之间的神经导管内腔向自发再生的轴 突提供方向并且防止其错误的生长，以此形成方向明确的再生。
因此，相对不可吸收的神经导管，优选生物易分解或可吸收的神 经导管，因为在神经纤维恢复之后或在神经纤维恢复过程中，神经导 管分解，因此，与不可吸收的神经导管相比，其避免了不必要的进一 步手术以取出神经导管，该手术自身再次带来损伤神经纤维的风险。 当然，相对吸收机制，可吸收的神经导管的稳定性必须是可调节的， 这是一项挑战。
通过神经导管再生神经的目的是恢复运动功能和感官功能以及阻 止错误的神经生长和疼痛的神经瘤的形成。
到目前为止，对于神经系统的神经纤维损伤，再生药物仅提供不 充分的治疗。尽管理论上大部分成年神经细胞都具有再生轴突的能力， 但是在没有帮助的情况下，在末梢神经系统中仅发生有限的功能性再 生，并且在中央神经系统中几乎完全不发生功能性再生。
所述限制的原因之一是原有神经通路的接触损失以及抑制性伤疤 的形成。
原则上，在损伤/抑制区域手术搭桥是一种成功的治疗手段，到目 前为止，在实践中将该方法单独应用于几乎所有自体同源的神经移植 (通常是小腿的小腿肚神经)。
因此而带来的缺点(例如供体范围内的病状和受限的可用性)基 本刺激了合成神经引导纤维的发展。早期，研发了由不同的惰性和可 吸收的纯净合成聚合物以及生物组分例如多糖、胶原或特殊交联的明 胶材料形成的作为空心管的神经引导纤维。
发明内容
本发明的任务是，进一步改善之前描述的神经导管，以使得在再 生过程中轴突可以尽可能不受阻碍的生长。
通过本发明可以如下地解决该任务，上述神经导管包含由交联的、 可吸收的、基于明胶的材料形成的成形体，其中，成形体是管状空心 管，并具有带有外表面和内表面的壁，该壁限定内腔，以及其中，神 经导管包含围绕内腔的半渗透性的层。
从基于明胶的材料可以形成良好杀菌的神经导管作为植入物，其 在长时间内，特别是在室温下，是可储存的。该神经导管的长度还符 合手术室以及其它的需求。
可以限定地，并且以组成和吸收性能可重复生产地制备基于明胶 的材料。另外，该材料的(病理)生理反应是可估算的。另外，该材 料通常具有所需的生物相容性，并且其既不是有毒的、传染性的也不 是易发炎的。
此外，基于明胶的材料也适用于制备满足植入物机械需求的神经 导管。同时，在外科手术处理及手术后处理时，该材料作为使用的植 入物具有足够的弹性，使得可以避免压迫神经，并且可以适应被处理 的病人身体部位的活动。
另一方面，通过用于成形体的本发明的基于明胶的材料可确保足 够的形状稳定性，该形状稳定性可避免插入的植入物的损毁。
另外，制备具有足够断裂强度的神经导管，使得可以将植入物缝 合在由损伤形成的神经残余上。
根据本发明，神经导管的某层(其可以是成形体的一部分)是半 渗透性的。这意味着，在内腔和神经导管周围之间营养成分的扩散和 气体的扩散在半径方向上尽可能不受阻碍地进行，然而另一方面可以 阻止不希望物质的扩散，特别是来自周围组织的细胞(例如成纤维细 胞)的入侵。
为了实现半渗透性层的该保护功能，有各种可能性，其可以部分 相互结合。
因此，神经导管的半渗透性层可以是例如有孔的，该孔平均小于 约0.5μm。细胞不可以通过这种所谓的毫微孔，然而另一方面，营养物 质扩散和气体扩散可以几乎不受阻碍地通过这种孔。
可选的，在此使用凝胶结构，该凝胶结构一方面允许如上所述的 营养物质扩散和气体扩散，另一方面可作为细胞屏障。
在另一个实施方案中，该神经导管具有作为半渗透性层的阻挡层， 其使得带正电荷的物质，特别是细胞，更特别是成纤维细胞，基本不 能通过，因为细胞在其表面通常带正电荷并且因此较差地粘着在带正 电荷的表面上。
另一个实施方案具有半渗透性的层，其具有极高的亲水性，并且 在此观察到，细胞通过这种层的扩散被强烈阻止。
通过疏水层也可获得相似的效果。在此细胞迁移也明显降低。
疏水层可以由例如包含脂肪酸酯改性的明胶的材料形成。其实例 为十二烯基-琥珀酸明胶。
对于该材料，优选使用脂肪酸酯对明胶的赖氨酸基团的氨基，特 别是对赖氨酸基团的10％至80％，进行改性。
最后作为进一步的变体需要满足，神经导管或其成形体在外表面 上具有作为半渗透性层的可以阻止细胞迁移的固定排斥蛋白，例如轴 突导向因子(Semaphorine)。
在应用(即用作植入物)时，本发明的神经导管的上述机械强度 必须可允许缝合。特别通过使用强化材料(特别地，该强化材料嵌入 基于明胶的材料中)获得因此所需的强度，特别与使用的缝合材料相 对的断裂强度。强化材料应该是生理相容的并最好也是可吸收的。
根据强化材料类型，其除了影响机械性能之外还在一定范围内影 响相对于吸收机制的稳定性。特别地，强化材料的吸收稳定性不取决 于神经导管的其它成分(例如，基于明胶的材料)而选择。
当强化材料含量为5重量％(相对于干质量)时，显示出对神经 导管的机械性能的显著改善。
当含量大于60重量％时，通常不再产生显著改善，和/或难以获 得神经导管的期望的吸收性能或所需的弹性。
强化材料选自颗粒强化材料和分子强化材料及其混合物。
对于颗粒强化材料，特别推荐使用强化纤维。在此特别推荐多糖 纤维和蛋白质纤维，例如胶原纤维，蚕丝或棉纤维，以及聚丙交酯纤 维(Polylactidfaser)，或其混合物。
另一方面，分子强化材料同样适合于改善神经导管的机械性能以 及(如果希望的话)改善吸收性能。
优选的分子强化材料特别是聚丙交酯聚合物及其衍生物、纤维素 衍生物和壳聚糖及其衍生物。也可以使用分子强化材料作为混合物。
优选地，神经导管的成形体至少包含部分强化材料。在此，强化 材料嵌入由基于明胶的材料形成的基体中，或者存在于具有基于明胶 的材料的分子混合物中。
神经导管的优选实施方案具有多层成形体，由此使得每一层都具 有特殊的功能，见下文进一步解释。例如，其中一层可以作为半渗透 性的层起作用。
令人惊讶地表明，基于明胶的材料，特别是高分子明胶，具有促 进血管生成的效果，使得在植入本发明的神经导管的同时，除了导管 对于神经生长所提供的原有基础功能之外，还促进了血管毛细血管的 形成，使得加强对神经导管的周围，即自发新生长的轴突的营养物质 供应。
对于本发明的神经导管，基于明胶的材料优选包含明胶作为主要 成分，这意味着，与可能的其它进一步的成分(例如其它可吸收生物 聚合物例如多糖或透明质酸)相比，明胶占据材料的大部分含量。对 于这种量度规则以及下文所给的特殊推荐，可以不考虑强化材料的含 量。
进一步优选地，基于明胶的材料大部分由明胶形成。
进一步优选地，基于明胶的材料基本全部由明胶形成。
在基于明胶的材料中优选使用的高分子明胶具有优选约160g至 300g范围的勃鲁姆值(Bloomwert)。
对于低分子明胶的研究表明，其促进血管生成的效果显著低于高 分子明胶的效果。
在基于明胶的材料中的高分子明胶还具有进一步的优点，该优点 将在下文对于调整交联度的问题上更进一步讨论。
进一步优选使用缺乏内毒素的明胶，在此猪皮明胶是特别适合的。 根据鲎试剂(LAL)-检测(参见欧洲药剂图书Arzneibuches)第四版(Ph.Eur.4))测得，该明胶具有优选1200国际 单位/克(I.E./g)或更低，特别是200 I.E./g或更低的内毒素含量。通 过特别精细的加工可以获得甚至例如140I.E./g或甚至达50I.E./g的内 毒素含量。
其它来源的明胶或用其它方法制备的明胶可具有高于20000I.E./g 的内毒素值。
根据本发明，仔细选择获批准的原材料，特别仅是新鲜分离和供 应的猪皮，并且结合使用冷却物品(其不需要长时间的运输或储存便 可立即用于原材料)，在特定装料的生产开始之前，额外清洗整个过程 装置，如果可能的话包括使用离子交换器和过滤体系，使得内毒素的 值显著降低。
本发明的神经导管通常具有从0.5至50cm范围的长度。在神经导 管具有单个空心管作为成形体的情况下，其具有约1至30mm的外径。 取决于成形体是一层的或多层的，壁厚为例如0.02至5mm。
当神经导管具有多个空心管/成形体时，外径优选分别在100至 800μm的范围内。在普通神经中，在所谓的神经束中存在小的轴突基 团。具有上述优选直径的多个成形体的神经导管近似构成该结构。
制备由基于明胶的材料形成的管状空心体是一项特别的挑战。特 别是制备用于在末梢神经系统中再生神经的神经导管需要相对小的尺 寸。同时，该尺寸应该是可再现的，并且制备方法是不昂贵的。
优选的方法是浸入法，其中一次或多次将钉子(Dorn)浸入基于 明胶的材料的溶液中，并且期间至少进行部分干燥。
然而，由于小的直径和壁厚，对于本发明的神经导管，将因此形 成的作为成形体的空心管脱去是困难的。
因此，优选在首先的步骤中制备具有较大直径和壁厚的空心体， 然后将该空心体在其纵向上拉伸成具有期望外径和目标壁厚的空心 管。
目前在文献中尚未描述在可观的范围拉伸基于明胶的材料。同时 也表明，在不经过改性的情况下，基于明胶的材料，特别是明胶本身， 是无法被成功拉伸的。
因此根据本发明，使用优选具有增塑剂含量的基于明胶的材料， 该增塑剂的含量在12至40重量％，特别是从16至25重量％的范围 内。
同时，正如期望，使用增塑剂可导致神经导管的较大的弹性，这 使得其作为植入物使用时的处理更为简单。
令人惊讶地，可以以相对大的拉伸比例拉伸包含该增塑剂含量的 明胶，拉伸比例在实践中为1.4至8。
对于基于明胶的材料，本发明优选的增塑剂特别选自甘油、低聚 甘油、低聚乙二醇和山梨醇。这些增塑剂可保留在基于明胶的材料中， 并且和神经导管或成形体的基于明胶的材料一样，这些增塑剂也可被 病人的身体吸收。
令人惊讶地，在拉伸基于明胶的材料时，通过使用增塑剂可以获 得在神经导管纵向上断裂强度的增加，并且特别地，增加到30％的值 或更多，特别是增加到50％或更多。
由于其是相对不敏感的植入物，对于外科来说在神经再生时使用 本发明的神经导管作为植入物是非常有利的。同样，通过拉伸交联材 料获得在纵向上为40N/mm2或更高，特别是60N/mm2或更高的断裂强 度。
优选使用至少部分交联状态的基于明胶的材料。通过交联度可调 整神经导管或成形体的吸收稳定性。
交联优选涉及基于明胶的材料所包含的明胶。
对于制备空心体的推荐的浸入法，将基于明胶的材料在溶液中进 行预交联。这导致了整个基于明胶的材料中的均匀的交联度。
进一步优选地，完成的、通常拉伸的成形体在第二个步骤中进一 步交联，以保证期望的吸收稳定性。该二级交联与一级交联相比允许 较高的交联度。在此也可能实现梯度交联度。
例如，在成形体接近外表面的壁中的基于明胶的材料的交联度高 于在接近内腔的壁的范围中的交联度。
由于选择一方面在成形体外表面而另一方面在接近成形体内腔的 不同的交联度，使得在神经纤维再生时(即轴突生长时)，首先以内腔 的形式提供一个保护体积，在神经生长的过程中，由于上述基于明胶 的材料的产生的吸收而增大了该保护体积。尽管如此，神经导管的保 护功能仍然存在，因为成形体的壁的外部范围吸收较缓慢，并且因此 长时间提供保护以防止成纤维细胞的迁移。
这使得自发再生的轴突形成增厚的作为隔离的髓层 (Myelinschichten)，而不在神经导管中形成压力，该压力可损坏自发 再生的轴突。
溶液中的至少部分交联与第二次交联步骤一样，可以是化学交联 或酶交联。
对于化学交联，可以使用特别是醛、二醛、异氰酸酯、二异氰酸 酯、碳化二亚胺和烷基卤化物作为交联剂。
特别优选使用甲醛进行交联，因为在每个交联步骤中同时对基于 明胶的材料或成形体进行消毒。
对于酶交联优选使用谷氨酰胺转移酶(Transglutaminase)。
对于神经导管的使用目的，这样选择交联度，使得在生理标准条 件(磷酸盐缓冲溶液(PBS)-缓冲剂，pH 7.2，37℃)下，在4周内， 神经导管，特别是其成形体，显示出最高约20重量％的干燥重量的减 少。
与天然生成的单个神经纤维的尺寸相比，成形体的内腔非常大。 轴突仅为约1μm厚，然而神经导管提供的内腔可具有达10mm的直径。 即使当在神经导管中使用多个空心管时，其各自内腔提供超过轴突厚 度约两个数量级或更多的净宽度(lichte Weite)。
为了在再生过程中进一步促进轴突方向明确的生长，并且尽可能 短的保持再生时间，优选在成形体的内腔中布置平行于其纵向的引导 元。在此，引导元优选基本在内腔整个长度上延伸。
在此，引导元可被促进轴突生长的辅细胞特别是雪旺细胞 (Schwannzelle)殖长。
在天然神经中发现雪旺细胞，其在标准反馈回路上提供生长因子， 并且促进血管形成和轴突的再生。该细胞可以例如从病人损伤的神经 中分离，并且在体外培养之后通过本发明的神经导管再植入体内。为 了在神经导管的内腔中尽可能均匀地分布雪旺细胞，优选将雪旺细胞 布置于明胶凝胶基体中，该基体在提高的温度(例如40℃)下液化并 且当体温冷却后再次凝成胶状并固定较高温度下添加的细胞。以这种 方式，可将雪旺细胞均匀分布于引导元上，并且在冷却至室温之后， 以该状态保持直到给病人使用植入物。
为了不阻碍轴突的生长和神经组织的分化，引导元应优选最高占 内腔约30体积％。
根据内腔中所需的净宽度，平均厚度为约10至100μm的微丝特 别适合作为引导元。
为了可以在内腔中均匀分布多个微丝，优选在基体中或通过定距 片使其以一定间距互相固定。
对于具有引导槽的引导元，注意到一种特别突出的引导功能。因 此而获得定向性(stereotropisch)效果，并且正如在所谓的联合带 (Bündnerschen )中，可以以极好的纵向对齐安置任选使用的 辅细胞。因此，获得同样完全纵向指向的轴突生长。几何尺寸并不特 别严格，并且可以具有例如0.5至50μm的深度。重要的是存在由引导 槽界定的边缘。
使用基体以相互固定微丝，该基体材料应该优选由阻挡轴突生长 的材料形成，使得轴突的生长沿着微丝对齐。阻挡轴突生长的材料为 例如透明质酸或疏水明胶凝胶。
或者可以从卷绕的平面材料制备引导元，在其卷绕处 (Wickellagen)之间提供微通道，与上述微丝的引导槽相似。可以通 过在模板中浇铸或通过附加的挤压、冲孔或相似的方法获得平面材料 所需的结构。对于平面材料，卷绕轴线平行与神经导管的纵向。
对于平面材料的相应设计方案，平面材料可同时形成神经导管的 成形体。
如上所述，神经导管可包含多个优选通过基体材料互相连接的成 形体。该基体材料优选包含促进血管生成的成分，使得可以允许轴突 之间的血管发芽(Einsprossen)，正如在非神经细胞基体中的天然肌束 中所出现的。该基体材料优选是基于明胶的材料并且特别优选具有开 孔结构。
该基体材料具有例如占神经导管30至60体积％的体积含量。该 基体材料进一步优选是可吸收的。
在本发明的进一步优选的实施方案中，神经导管具有围绕成形体 的外壳或外壳基体，其同样也是由可吸收材料形成的。对于外壳基体， 特别推荐多孔的、特别是开孔结构。平均孔径优选为100至300μm的 范围。
通过例如发泡成形体制备外壳基体。
或者可以冲孔或借助核壳钻机(Kern-Hülsenbohrer)从预先制备 的坚固的材料块，特别是海绵体，获得该外壳基体。可简单地通过镗孔工具形成用于引入成形体的通过开口(在使用核壳钻机工作时优选 同时进行外壳基体的制备)，在可能的情况下该成形体事先具有半渗透 性的层。
在形成的外壳基体中插入成形体。在外壳基体和成形体之间的轻 微压配合足够在各种情况下安全处理神经导管。
优选地，外壳基体材料包含促进血管生成的成分，以使得在神经 导管周围并特别是靠近成形体之处促进血管的生成。优选如下实现该 促进效果，轴突在成形体的内腔中构建之前或至少是构建过程中，发 生血管的发芽。在此，合适的材料再次是基于明胶的材料，特别是基 于如上文所描述的高分子明胶。外壳或外壳基体的厚度优选为1至 2mm。
当在神经导管中使用多个成形体时，外壳基体可在成形体中横穿 相互连接的基体。可从相同的、特别是促进血管生成的材料形成该两 种基体。
因此在这种情况下，需要保证半渗透性的层是每个成形体的一部 分，使得在保留轴突生长的内腔中不发生细胞的迁移，该迁移阻拦或 完全阻止轴突的生长。
因此，外壳基体比成形体具有更高的吸收速率。
在两个神经残余之间的空隙上搭桥的植入物越长，成形体的基于 明胶的材料的吸收时间也应该越长。也就是说，植入物特别是成形体 和更特别是半渗透性的层的吸收性能，应该符合神经损伤空隙的长度。
对于在末梢神经系统作为植入物使用的神经导管，可以如下选择 神经导管的吸收性能，使得相应于并优选符合轴突的生长，吸收从植 入物的一个末端开始，并向另一末端进行。在轴突生长开始的植入物 的一个末端，同样开始神经纤维的髓鞘化(Myelinisierung)和由此的 加厚。通过植入物的符合时间的吸收可以提供必需的场所，使得可以 避免神经纤维的擦伤。
可以通过沿着神经导管的纵向上基于明胶材料的变化的交联度成 功获得期望的性能，也就是说，交联度在神经导管的一个末端小于另 一末端，其中交联度可以是多级式地变化或基本连续增长。
当将植入物相反地应用于中央神经系统时，优选考虑实情，即轴 突从两个神经残余起进行生长。在此，推荐梯度吸收行为，其中在植 入物的两个末端大约同时开始吸收，并且植入物两个末端之间的中间 区域随着时间的推移才进行吸收。
这也可以通过沿神经导管的纵向的交联度相应的梯度而完成。在 此也可以选择多级式变化的交联度或基本连续的交联度。
当内腔净宽度在神经导管的两个末端大于其余区域时，以此可简 单地将损伤的神经残余引入神经导管中，因此出于实践考虑这是有利 的。
附图说明
通过附图和下文的实施例更详细地解释本发明。其中：
图1示出在第一个实施方案中的本发明的神经导管的示意性示 图；
图2示出在第二个实施方案中的本发明的神经导管的示意性示 图；
图3和4示出关于根据本发明改性的明胶对于基底的细胞殖长的 效果的图表。
图5示出用于测试根据本发明的半渗透性的层的扩散性能的实验 设计的示意性示图；
图6和7示出用于测试根据本发明的半渗透性的层的扩散性能的 实验结果的图表；
图8a和8b示出用于借助绒毛尿囊(Choriollantois)膜研究血管 生成的实验布置的示图；
图9示出用于说明在促进血管生成的材料中血管生长的图表；和
图10示出在惰性合成材料膜上培养的雪旺细胞和轴突的光显微 照片。
具体实施方式
图1显示整体使用附图标记10表示的神经导管，其具有由交联的、 基于明胶的材料形成的成形体12。该成形体12具有带有壁14的管状 空心体，该壁具有外表面16并通过内表面18限定被称作内腔的空心 空间20。
该神经导管进一步具有半渗透性的层，其(在图1中未单独图示 出)与成形体12一体化地构成。半渗透性的层的位置位于壁14内部， 优选邻近外表面16。
成形体12的外表面由外壳22围绕，其开孔式地构成并且包含促 进血管生成的成分，特别是具有海绵结构的高分子交联明胶。
可由由交联明胶构成的海绵材料制备外壳22，如下文实施例3中 单独描述的。首先制备一块具有足够厚度(相应于成品的神经导管的 长度)的这种海绵材料。通过例如冲孔或借助核壳钻机从该海绵体材 料块出发将外壳22制成空心圆柱体。然后可将成形体12插入此空心 圆柱体的通过开口内，在外壳22中该成形体优选保持轻微压配合。
图2显示了另一个具有作为成形体42的管状空心体的本发明的神 经导管40。该成形体42具有由基于明胶的材料形成的壁44，该壁具 有外表面46和限定了内腔50的内表面48。
在与成形体42的外表面46邻接处布置单独的半渗透性的层，其 可以渗出营养物质和气体，然而阻止细胞、特别是成纤维细胞的入侵。
接着，具有半渗透性的层52的成形体42向外由外壳54围绕，该 外壳与图1的实施方案中所描述的相似地构成。可结合图1描述的实 施方案制备外壳54，并将外壳54安置于成形体42之上。
图2图示表明了血管56已经进行发芽到外壳中，通过外壳54的 促进血管生成的成分促进。
实施例
实施例1：本发明的神经导管的制备
管状空心体的制备
在下文中首先描述管状空心体的制备，该管状空心体是本发明的 神经导管的基本组成部分。不同的制备类型具有约2000μm、1100μm 和150μm的内径，并且借助本发明优选的浸入法制备并随后拉伸。
在此，首先将100g猪皮明胶(勃鲁姆强度()300g) 在由260g水和40g作为增塑剂的甘油组成的混合物中在60℃下溶解， 并通过超声波对溶液进行脱气。这相当于增塑剂在材料中约29重量％ 的含量，相对于明胶和甘油的重量。
添加4g的2.0重量％的甲醛水溶液(相对于明胶的800ppm的交 联剂)之后，使溶液均匀，再次脱气并为表面去除泡沫。之后将具有 2mm直径的不锈钢钉(之前使用隔离蜡对其进行喷射)作为成形元件 以约3cm的长度短地浸入如此制备的溶液中。将钉从溶液中取出之后 使其旋转，使得附着的溶液形成尽可能均匀的层。
在25℃和30％的相对空气湿度下干燥约1天之后，可以将形成 的空心管从钉上脱去。
以这种方式制备的空心管具有与钉直径相应的2mm的内径和 300μm的平均壁厚，其通过光显微测定。
为了使空心管达到较小的内径，需要在23℃和45％的相对空气 湿度下将其储存5天并随后拉伸。
为了进行拉伸，夹紧管子的两个末端并且在热的水蒸气的作用下 使其软化。在该热塑状态下，使其以约1.4的拉伸比例延长，在该状态 下固定并在23℃和45％的相对空气湿度下干燥16小时。
因此获得的空心管具有约1100μm的内径和约200μm的壁厚。光 显微测试可看到管子在其周围和长度上的非常规则构成的横截面形状 和非常统一的壁厚。
通过较大的拉伸比例可得到具有直至150μm内径的空心管。
为了延长管子的生理分解时间，将对其中包含的明胶进行进一步 的交联步骤。对此，在干燥器中，在室温下，将该管子暴露于17重量 ％的甲醛水溶液的平衡蒸汽压中17小时。
在此可封闭管子的一个末端，使得仅从外表面进行交联。在此， 发现，与限定管子的内腔的内表面上的交联度相比，外表面上的交联 度较高，并且相应的外表面上的吸收稳定性也升高。
可以通过例如仅使甲醛蒸汽通过空心管的内腔，以获得在接近内 腔的壁区域中具有较高交联度的空心管。
或者可选的，可以通过将钉依次浸入具有不同交联剂浓度的溶液 中以实现不同的交联度。由此在空心管的壁厚上形成相应的梯度交联 度。
应理解，可以通过多种方式修改此处描述的空心管的性能，特别 是通过钉的尺寸和形状，明胶、增塑剂和交联剂在溶液中的含量，浸 入过程的次数，以及后交联的强度应符合各个相应的要求。
半渗透性的层的制备
可以例如化学改性上述空心管的外表面，以与空心管一体化地制 备围绕内腔的、半渗透性的层。
因此，例如可以借助琥珀酸酐将赖氨酸残基的氨基转化为琥珀酸 形式，由此将明胶材料的pKs值从8至9(如未改性明胶的pKs值)降 低到约4。
改性明胶的进一步的可能在于，将赖氨酸残基的氨基转化为十二 烯基-琥珀酰-基团。在此，pKs值降低到约5，并且同时发生明胶的轻 微疏水。
在两种情况下，相对于如此处理的外表面，成纤维细胞的细胞附 着力明显下降，这将在下文的实验中并结合图3和图4有更进一步的 解释。
首先再次提到完整性，对于如上述制备的空心管，除了改性外表 面明胶之外，还可以使其具有单独的半渗透性的层。为了保持事先选 择的实施例，可以通过涂抹琥珀酸明胶或十二烯基-琥珀酸明胶或其与 其它生物聚合物的混合物，特别是未改性明胶的水溶液，获得该层。 在此，正如上文对于制备空心管所描述的，可以使用浸入法的方式。
改性明胶的赖氨酸基团的转化率优选为30％或更多。
在十二烯基-琥珀酸明胶的情况下，通常40至50％的转化率是足 够好的，然而对于琥珀酸明胶，赖氨酸转化80％至几乎全部转化时才 提供最好的效果。
图3和4显示对于出于试验目的在玻璃表面涂抹的由明胶材料形 成的实验面的细胞附着力结果，该明胶材料是从猪皮明胶(MW 119kDa)和约95％赖氨酸基团的琥珀酸明胶(图3)或约45％的十二 烯基-琥珀酸明胶(图4)相同类型制得。分别测试比例为100∶0、80∶20、 50∶50、0∶100的未改性明胶和改性明胶的混合物。
在该试验中，在37℃下分别将20000个猪软骨细胞在实验面上培 养4小时。除去上清液，清洗表面并固定停留在表面上的细胞，以随 后对其进行光显微分析。通过人类软骨细胞获得可对比结果。
图表中的百分比代表，进行上述步骤之后，与培养所使用的数量 相比在薄膜实验面上发现的细胞的含量。
对于两个改性的明胶种类，在仅使用改性明胶时，其殖长效果几 乎为零。
因此可以得出改性空心管表面的情况，通过接近外表面的赖氨酸 基团的相应的高转化率可获得可比较的效果。
当然相应地适用于将由改性明胶形成的单独的层涂抹于空心管的 外表面。
由于在空心管的壁中细胞的迁移首先需要其在外表面上的附着 力，因此非常好地满足了如根据本发明半渗透性的层所期望的阻止细 胞的条件。
实施例2：根据平面材料试验的明胶薄膜半渗透性能/隔离层功能
为了测试上述试验薄膜的渗出性能，在图5所示的两室-试验装置 60中，在两个块62和64之间夹紧该试验薄膜，其中在试验薄膜66的 两侧空心空间68、70到达块62或64内，其在试验阶段使用不同的介 质灌注。
使用酚红溶液作为培养液替代品灌注上室68，在下室70中使用 纯净磷酸盐缓冲溶液(PBS溶液)。每2小时测量酚红溶液和PBS溶液 的吸收。在对于由未改性明胶形成的薄膜的图6的曲线中显示了测量 值。
使用首先以10000个细胞/cm2殖长并粘着2小时的薄膜重复该试 验。在培养中使粘着的细胞在薄膜上繁殖一周，之后进行与上述相同 的测量。测量值被描述于图7中。
在结果中发现上室68中的酚红浓度减少，并且相应的，下室70 中的酚红浓度增加，相应于通过薄膜的营养物质扩散。在细胞殖长的 薄膜的情况中，产生了酚红加速扩散的趋势。
与此平行，使用碳粒悬浮液(75重量％的小于45μm的颗粒尺寸)， 没有发现任何通过薄膜的运输。这意味着，细胞殖长的薄膜对于细胞 和细胞尺寸的颗粒的入侵仍然提供阻挡层的作用，并且达不到细胞蛋 白酶外部作用。
在持续2和3周的培养试验中也证实上述结果。
实施例3：血管生成效果
基于交联明胶的具有胞状结构的成形体的制备和性能
通过在60℃下在水中溶解明胶制备五份猪皮明胶(勃鲁姆强度 300g，平均分子质量140kDa)12重量％的溶液配料，使用超声波脱气， 并分别掺入相应量的甲醛水溶液(1.0重量％，室温)，以获得1500ppm 的甲醛(相对于明胶)。在第六份配料中不添加甲醛。
将均匀的混合物加热至45℃，并且在10分钟的反应时间之后， 用空气使其机械发泡。对于第六份配料，使用不同的空气比明胶溶液 比例进行约30分钟的发泡过程，由此获得具有表1所示的不同湿密度 和孔径的胞状结构。
把具有26.5℃温度的发泡的明胶溶液浇铸成40×20×6cm的尺寸 并在26℃和10％的相对空气湿度下干燥约4天。
所有六份配料的干燥成形体具有海绵状胞状结构(下文中称作海 绵体)。将其切割成2mm厚的层，并在干燥器中，在室温下，将其暴 露于17重量％甲醛水溶液的平衡蒸汽压中17小时以进行第二个交联 步骤。对于第六份配料进行第一个(并且也是唯一的)交联步骤。为 了达到成形体整个体积的均匀充气，分别将干燥器抽空2至3次并再 次通风。
光显微测定海绵体的小孔结构，并通过扫描电子显微镜确认。
表1：
配料 湿密度(mg/cm3) 干密度(mg/cm3) 平均孔径(μm) 1-1 100 20 250 1-2 175 27 200 1-3 300 50 125 1-4 530 70 100 1-5 600 100 75 1-6 78 12 300
为了测定海绵体的稳定性，称量30×30×2mm大小的块，放置于 75ml的PBS缓冲剂中并储存于37℃下。储存时间之后该块在水中清 洗30分钟，干燥并称重。
海绵体1-6在三天后已经完全溶解，然而所有二级交联的海绵体 在14天之后仍然保留80％。这表明进一步的分解行为中的巨大差别， 这归因于材料不同的发泡密度。因此，海绵体1-1在21天之后完全溶 解，海绵体1-2在28天之后完全溶解，然而海绵体1-4和1-5在35天 之后仍有相当的保留。由此使得不取决于其它参数而有针对性地影响 该海绵体或胞状结构材料的分解行为进一步成为可能。
也可以通过改变起始溶液中的明胶浓度显著改变胞状结构材料的 性能。
较高的明胶浓度导致较宽(厚)的胞壁或单个小孔之间的隔壁， 这导致相应海绵体的升高的断裂强度。
通过交联度，也就是说通过交联剂浓度的选择，可相反地影响成 形体的稳定性，特别是考虑到蛋白水解分解。
促进血管生成的效果的证明
从与上述方式所得到的相似的二级交联成形体(干密度22mg/ml， 平均孔径约250μm)制备尺寸为15×15×2mm的样本，下文中称为植入 物。
通过受精鸡蛋的试验(在图8a和8b中示意性地描述)研究该植 入物促进血管生成的性能。
图8a以横截面示意性地图示鸡蛋的结构。在钙质外壳80下面是 绒毛尿囊膜82(下文缩写为CAM)。从位于蛋黄84边缘的胚胎86开 始形成胚外血管88，该血管沿着CAM展开。为了通过注射插管取出 部分蛋白，可以随后在不损伤CAM 82的情况下在钙质壳80上切开一 个小窗口90(如图8b中所描述)。现在可以将植入物92放置在CAM82 上并研究其对于血管生成的效果(参看例如J.Borges等人(2004)Der Chirurg 75，284-290)。
在3天、5天和7天后的光显微照片中，注意到血管的再定位和 再生。
作为参考实施例，除了测试本发明的基底之外，还测试由胶原(复 性的牛胶原，密度5.6mg/cm3，购自Innocoll公司)和聚-DL-乳酸(生 产商，邓肯多夫ITV)形成的相似的海绵状材料。
将所有的植入物放置于CAM上，并且在3、4、5、6和7天后确 定直接在植入物周围生长的血管的数目。在几天之内，血管非常明显 的指向促进血管生成的基底或由海绵状胶原与聚-DL-乳酸形成的参考 样本。
这表明，与零值(不放置植入物的CAM)相比，对于所有三个样 本存在显著升高的血管数量，其中特别是针对零值，通过所有三个样 本获得相似的效果。
也就是说，所有测试的材料在其周围环境下其血管生成效果约升 高相同水平。在一定距离上造成该观察到的效果，并且因此该效果可 能取决于所谓的扩散因子。
CAM是描述空气和蛋液之间的分界面的组织。可以仅通过机械刺 激(Reiz)通过将基底放置于CAM上导致受体的活性，其可以导致每 个血管生成因子(例如细胞的血管内皮生长因子(VEGF))的分布。 由此可诱导内皮细胞并随后导致指向植入物的血管生成。
另一种解释可能性是，由于放置植入物，阻止了空气氧气进入上 皮组织。因为上皮组织中存在较少的氧气，使得在植入物的区域内形 成所谓的缺氧。在缺氧情况下细胞通常与VEGF分布反应，由此诱发 血管改造或血管再生。这意味着，细胞供应不足的部分自发组织了供 应线路。这种生物现象可能发生在严重供应不足的(变形的)组织表 面上。
这解释了为什么在仅将狭窄橡胶环放置于CAM(极小的放置表 面)上的试验中不能观察到血管生成的效果。
图9是使用3天、5天和7天后基底或对比材料的植入物和本发 明的促进血管生成的基底的内部的血管表面(μm2)。描述的柱状图的 次序是明胶样本、胶原样本、聚-DL-乳酸样本。
如在图9中显而易见的，3天后仅本发明的促进血管生成的基底 显示出在植入物中可测量的血管含量，然而在胶原海绵体和聚-DL-乳 酸海绵体中不存在可测量的血管含量。
对于本发明的促进血管生成的基底，5天之后显示可测量血管的 急剧升高，然而对于聚-DL-乳酸样本和胶原海绵仍然几乎观察不到效 果。
对于本发明的促进血管生成的基底，7天后植入物中血管含量显 著降低，然而效果仍然是3天后的约两倍之高。在该时间点，对于胶 原海绵仍然没有发现可测量的结果，然而此刻聚-DL-乳酸海绵具有正 如3天后对于本发明的明胶海绵植入物样本所确定的效果。
为了分析样本并确定植入物中的血管数目，将各个样本制成冷冻 切片并使用DAPI染色，以分析植入物内部的血管表面。对此，从切片 中心区域制作照片并随后通过图像处理法定量评估。对于胶原海绵， 在中间区域不能观察到血管生成。对于聚-DL-乳酸海绵，结合进行结 缔组织细胞殖长，仅在7天后确定血管生成。而且对于该对比样本， 细胞殖长的进行比本发明的植入物缓慢得多。
对于本发明的植入物，7天后血管的退化导致测量表面的减少。 其原因可能在于，由于例如仍然有相对少量的必需供应的其它细胞类 型的迁移，血管网络再次退化至植入物区域实际所需。这符合在传染 时发现的过程，其中一旦发炎减轻，血管网络便再次退化。
实施例4：明胶管的半渗透性能允许封入的细胞的存活
研究细胞是否能在封闭的由明胶(根据实施例1制备，1100μm内 径，壁厚200μm，二级交联)形成的管状成形体中存活。为此将成形 体在PBS中储存一个星期以进行清洗。随后将雪旺细胞散布在0.9mm 宽的透明惰性合成材料带(folex imaging公司的厚度为0.1mm的未涂 层的复印膜(Kopierfolie)X-70)上。事先使用乳状清洁剂清洗合成材 料带，使用聚-赖氨酸和昆布氨酸(33μg/ml，37℃下1小时)进行涂 层。首先将从老鼠坐骨神经分离出来的雪旺细胞(25000个细胞/cm2) 散布在膜上，并在培养基中保持24小时。之后从末梢神经系统的背根 神经节(Hinterwurzelganglien)制备单个神经细胞标本，并以1000个 细胞/cm2的密度在合成材料带上散布雪旺细胞。神经细胞可附着4小 时，随后将其上具有细胞的合成材料带引入由明胶形成的成形体中。 并非直接地，而是通过在透明合成材料带上将细胞引入成形体，具有 极大的优点，即随后可以没有问题地再次将合成材料带取出，以显微 确定细胞活力。之后，通过由牙科蜡(Rosa Dura，Kem-Dent，英国) 形成的塞子封闭管状成形体的末端，并放在培养基中5天。在该条件 下，营养物质和氧气仅可以通过成形体的壁达到细胞。5天的培养时间 之后，将合成材料带从管子中取出并使用抗体SMI31(Sternberger Monoclonals，美国)标记以检测轴突并使用DAPI标记以检测细胞核。 作为用于对照的细胞殖长的合成材料带，其经过完全相同的处理，但 是并不封闭，而是在相同的培养基(DMEM，10％FCS，谷氨酰胺，庆 大霉素)中开放培养5天。如在图10中的光显微图片所示，细胞/神经 细胞在成形体内部和外部的存活一样的好(图A和C)。其以亮点可识 别。同样，在两种情况下形成同样好的轴突(图B和D中的亮线)。图 A和B描述了封闭的同样培养基的雪旺细胞和背根神经节轴突。图C 和D涉及非封闭的培养基。因此表明，明胶管的渗透性足够允许封入 的细胞存活。