甘蔗木质素生物合成基因的分离和靶向抑制 与相关申请的交叉引用
本申请要求享有在 2009 年 6 月 5 日提交的美国临时申请序列号 61/217,950 的权 益， 在此以其整体引入作为参考， 包括任意图、 表、 核酸序列、 氨基酸序列和附图。
政府支持
此申请的主题得到 USDA-CSRRES 研究基金 (grant) 的支持， 基金号 00075788。因 此， 政府在此发明中具有一定权利。
发明背景
甘蔗是出产生物质最高的生产者。通常， 农民通过露天燃烧减少甘蔗采割期后的 叶残留物， 这对空气质量具有负面影响。在经酸水解预处理以去除作为酶水解的物理屏障 的木质素后， 可从甘蔗叶残留物中制造燃料级乙醇。因此， 下调木质素生物合成途径的酶 是提高从半纤维素甘蔗残留物中生产生物乙醇的效率的有前景的策略。在木质素途径中， 4- 香豆酸 -CoA 连接酶 (4CL) 是一种关键酶， 其催化 4- 香豆酸和其他羟基肉桂酸的 CoA 硫 酯的形成。然而， 甘蔗具有复杂的多倍体基因组， 且这些基因属于一个大基因家族。其广泛 的底物特异性使鉴定特异性参与木质素生物合成的直向同源物很困难。因此， 在本领域中 存在这样的需要， 即抑制甘蔗中木质素生物合成的手段。
发明概述
本发明涉及调节甘蔗植物中木质素生物合成的材料和方法。在一个方面， 下调了 木质素生物合成。可被靶向从而实现在甘蔗中木质素的下调的基因及其编码的蛋白质包 括， 例如 4- 香豆酸 -CoA 连接酶 (4CL)。在特定的实施方案中， 4CL 基因是 4CL-M， 4CL-N， 或 4CL-L。在另一个实施方案中， 在甘蔗植物的茎组织中减少或下调木质素生物合成。使用本 领域已知的标准技术， 可抑制或下调一种或多种靶基因的表达。 在特定的实施方案中， 抑制 或下调 4CL-L 基因的表达。
本发明也涉及木质素生物合成已被下调的甘蔗植物、 植物组织和植物细胞。在特 定的实施方案中， 在甘蔗植物中抑制或下调一种或多种 4CL 基因的表达。
本发明也涉及产生具有减少的或下调的木质素生物合成的甘蔗植物的方法。 在一 个实施方案中， 在甘蔗植物的叶组织中减少或下调木质素生物合成。 在另一个实施方案中， 在甘蔗植物的茎组织中减少或下调木质素生物合成。在一个实施方案中， 本发明的方法包 括抑制或遏制一种或多种 4CL 基因的表达。在一个实施方案中， 使用反义核酸或 RNA 干扰 抑制所述基因。
序列简述
SEQ ID NO ： 1 是本发明的 4CL-L 基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO ： 2 是本发明的 4CL-M 基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO ： 3 是本发明的 4CL-N 基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO ： 4 是本发明的 Sc4CL-Li RNAi 构建体的核苷酸序列。
SEQ ID NO ： 5 是本发明的 Sc4CL-Mi RNAi 构建体的核苷酸序列。
SEQ ID NO ： 6 是 SEQ ID NO ： 1 编码的氨基酸序列。
SEQ SEQ SEQ SEQ SEQ SEQ SEQ SEQ SEQ SEQ SEQ SEQ SEQ SEQ SEQID ID ID ID ID ID ID ID ID ID ID ID ID ID IDNO ： 7 是 SEQ ID NO ： 2 编码的氨基酸序列。 NO ： 8 是 SEQ ID NO ： 3 编码的氨基酸序列。 NO ： 9 是拟南芥 (Arabidopsis thaliana)4CL1 的氨基酸序列。 NO ： 10 是拟南芥 4CL2 的氨基酸序列。 NO ： 11 是拟南芥 4CL3 的氨基酸序列。 NO ： 12 是拟南芥 4CL4 的氨基酸序列。 NO ： 13 是白杨 (Poplar)4CL1 的氨基酸序列。 NO ： 14 是白杨 4CL2 的氨基酸序列。 NO ： 15 是白杨 4CL3 的氨基酸序列。 NO ： 16 是白杨 4CL4 的氨基酸序列。 NO ： 17 是基于 4CL-L 的部分基因组 DNA 序列的基因特异性引物。 NO ： 18 是基于 4CL-L 的部分基因组 DNA 序列的基因特异性引物。 NO ： 19 是用于 4CL-N 的正向引物。 NO ： 20 是用于 4CL-N 的反向引物。 NO ： 21 是用于 4CL-M 和 4CL-L RNAi 构建体的正向引物。SEQ ID NO ： 22 是用于 4CL-M 和 4CL-L RNAi 构建体的反向引物。
SEQ ID NO ： 23 是甜高粱 (Sorghum bicolor)04g005210(XP_002451647) 的 4CL 多 肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO ： 24 是甜高粱 10g026130(XP_002438783) 的 4CL 多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO ： 25 是甜高粱 04g031010(XP_002452704) 的 4CL 多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO ： 26 是玉蜀黍 (Zea mays)LOC542166(NP_001105258) 的 4CL 多肽的氨 基酸序列。
SEQ ID NO ： 27 是黑麦草 (Lolium perenne)4CL3(AAF37734) 的 4CL 多肽的氨基酸 序列。
SEQ ID NO ： 28 是黑麦草 4CL2(AAF37733) 的 4CL 多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO ： 29 是黑麦草 4CL1(AAF37732) 的 4CL 多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO ： 30 是稻 (Oryza sativa)4CL3(NP_001046069) 的 4CL 多肽的氨基酸序 列。
SEQ ID NO ： 31 是稻 4CL4(NP_001058252) 的 4CL 多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO ： 32 是稻 4CL1(NP_001061353) 的 4CL 多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO ： 33 是稻 4CL2(NP_001047819) 的 4CL 多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO ： 34 显示了拟南芥 4CL1 的保守的 AMP 结合基序。
SEQ ID NO ： 35 显示了拟南芥 4CL2 的保守的 AMP 结合基序。
SEQ ID NO ： 36 显示了拟南芥 4CL3 的保守的 AMP 结合基序。
SEQ ID NO ： 37 显示了拟南芥 4CL4 的保守的 AMP 结合基序。
SEQ ID NO ： 38 显示了白杨 4CL1 的保守的 AMP 结合基序。
SEQ ID NO ： 39 显示了白杨 4CL2 的保守的 AMP 结合基序。
SEQ ID NO ： 40 显示了白杨 4CL3 的保守的 AMP 结合基序。
SEQ ID NO ： 41 显示了白杨 4CL4 的保守的 AMP 结合基序。SEQ ID NO ： 42 显示了甘蔗 4CL1 的保守的 AMP 结合基序。
SEQ ID NO ： 43 显示了甘蔗 4CLM 的保守的 AMP 结合基序。
SEQ ID NO ： 44 显示了拟南芥 4CL1 的特征基序。
SEQ ID NO ： 45 显示了拟南芥 4CL2 的特征基序。
SEQ ID NO ： 46 显示了拟南芥 4CL3 的特征基序。
SEQ ID NO ： 47 显示了拟南芥 4CL4 的特征基序。
SEQ ID NO ： 48 显示了白杨 4CL1 的特征基序。
SEQ ID NO ： 49 显示了白杨 4CL2 的特征基序。
SEQ ID NO ： 50 显示了白杨 4CL3 的特征基序。
SEQ ID NO ： 51 显示了白杨 4CL4 的特征基序。
SEQ ID NO ： 52 显示了甘蔗 4CL1 的特征基序。
SEQ ID NO ： 53 显示了甘蔗 4CLM 的特征基序。
SEQ ID NO ： 54 显示了 4CL 基因的共同的特征基序。
发明详述
本发明涉及调节植物 ( 特别是甘蔗植物 ) 中木质素生物合成的材料和方法。在一 个实施方案中， 在植物中下调了木质素生物合成。本发明设想使用可用于抑制或降低基因 表达 ( 包括在转录、 转录后和翻译水平上 ) 和 / 或基因编码的蛋白质的功能或活性的任何 方法。可被靶向从而实现甘蔗中木质素生物合成的下调的基因及其编码的蛋白质包括， 但 不限于， 4- 香豆酸 -CoA 连接酶 (4CL)。在一个实施方案中， 4CL 基因编码包含 AMP 结合基 序序列 ( 例如 SEQ ID NO ： 34) 和 / 或 SEQ ID NO ： 54 的特征基序序列的 4CL 多肽。在一个 实施方案中， 4CL 基因是 4CL-M， 4CL-L， 或 4CL-N。在一个实施方案中， 4CL-L 基因编码具有 SEQ ID NO ： 6 中所示的氨基酸序列的多肽， 或其片段或变体。在另一个实施方案中， 4CL-M 基因编码具有 SEQ IDNO ： 7 中所示的氨基酸序列的多肽， 或其片段或变体。在另一个实施 方案中， 4CL-N 基因编码具有 SEQ ID NO ： 8 中所示的氨基酸序列的多肽， 或其片段或变体。 在特定的实施方案中， 4CL-L 基因包含 SEQ ID NO ： 1 中所示的核苷酸序列的全部或部分， 和 4CL-M 基因包含 SEQ ID NO ： 2 中所示的核苷酸序列的全部或部分。在特定的实施方案中， 4CL-N 基因包含 SEQ ID NO ： 3 中所示的核苷酸序列的全部或部分。
使用本领域已知的标准技术， 可抑制或下调甘蔗植物中一种或多种靶基因的表 达。在一个实施方案中， 在叶细胞和 / 或组织中选择性下调木质素生物合成。在特定的实 施方案中， 抑制或下调一种或多种 4CL 基因的表达和 / 或 4CL 基因编码的蛋白质的翻译或 功能。在一个实施方案中， 4CL 基因编码包含 AMP 结合基序序列 ( 例如 SEQ ID NO ： 34) 和 / 或 SEQ ID NO ： 54 的特征基序序列的 4CL 多肽。 在更特定的实施方案中， 抑制或下调 4CL-M， 4CL-L， 和 / 或 4CL-N 基因的表达。 在一个实施方案中， 使用反义技术下调靶基因的表达。 在 另一个实施方案中， 可使用共抑制技术抑制或下调靶基因的表达。 在另一个实施方案中， 使 用 RNA 干扰 (RNAi) 技术下调靶基因的表达， 包括例如使用短干扰 RNA(siRNA)。 在另一个实 施方案中， 可在本发明的甘蔗植物中提供靶基因的突变， 例如 “敲除” 突变。也可抑制靶基 因编码的蛋白质的表达和 / 或活性 ( 例如酶活性 )， 例如通过使蛋白质接触结合蛋白质并阻 碍其功能活性的抗体或适体。
可使用反义技术抑制参与甘蔗中木质素生物合成的靶基因的表达。在反义方法中， 在植物细胞中提供与靶基因的 mRNA 的核苷酸序列杂交的核酸。可在甘蔗植物的基因组 中掺入 ( 例如稳定地 ) 在表达时提供与 mRNA 杂交的核酸的核酸构建体。反义核酸可与靶 序列的整条编码链、 或其部分、 或靶序列的非编码部分、 或靶序列的编码和非编码两部分杂 交。反义构建体可与同反义核酸杂交的 mRNA 的部分具有例如至少约 70％、 至少约 75％、 至少约 80％、 至少约 85％、 至少约 90％、 至少约 95％、 至少约 96％、 97％、 98％或 99％的序 列同一性， 或高达 100％的序列同一性。反义核酸可包含任意合适的核苷酸数。例如， 本发 明的反义核酸构建体可包含至少 5， 6， 7， 8， 9， 10， 11， 12， 13， 14， 15， 16， 17， 18， 19， 20， 21， 22， 23， 24， 25， 26， 27， 28， 29， 30， 31， 32， 33， 34， 35， 36， 37， 38， 39， 40 或更多个核苷酸。在一个实 施方案中， 反义核酸包含至少约 40、 或至少约 50、 或至少约 60、 或至少约 70、 或至少约 80、 或 至少约 90、 或至少约 100、 或至少约 150、 或至少约 200、 或至少约 250、 或至少约 300、 或至少 约 350、 或至少约 400、 或至少约 450、 或至少约 500、 或至少约 550、 或至少约 600 或更多个核 苷酸。在一个实施方案中， 反义构建体在植物的叶细胞和 / 或组织中选择性表达， 例如通过 使用叶特异性启动子。下调或抑制靶基因表达的反义方法是本领域已知的。可从用核酸构 建体转化的和 / 或掺入核酸构建体的细胞培养包含和表达反义核酸构建体的植物。
也可使用共抑制或转录后基因沉默 (PTGS) 技术抑制参与甘蔗中木质素生物合成 的靶基因的表达。大体上， 在植物细胞中以正向和在适于核酸表达的构建体中 ( 例如， 包 含与能够在植物细胞中驱动转录的启动子序列有效连接的核酸的构建体 ) 提供对应靶基 因序列且与其具有序列同源性的核酸序列。核酸可与靶基因序列具有例如至少约 70％、 至 少约 75％、 至少约 80％、 至少约 85％、 至少约 90％、 至少约 95％、 至少约 96％、 97％、 98％或 99％的序列同一性， 或高达 100％的序列同一性。在一个实施方案中， 核酸构建体在植物的 叶细胞和 / 或组织中选择性表达， 例如通过使用叶特异性启动子。可从用核酸构建体转化 的和 / 或掺入核酸构建体的细胞培养包含和表达核酸构建体的植物。
也可使用 RNA 干扰 (RNAi) 技术抑制参与甘蔗中木质素生物合成的靶基因的表达。 在 RNAi 中， 在植物细胞中提供与靶基因表达的 mRNA 的全部或部分互补的双链 RNA 分子。 双 链 RNA 分子被加工为较小的 RNA 分子， 其然后被加工进沉默复合物， 所述沉默复合物导致靶 基因表达的抑制， 例如通过切割靶基因 mRNA。大体上， RNAi 分子具有 100 或更多个核苷酸， 更典型地具有 200 或更多个核苷酸。 可通过在细胞中引入和表达导致 RNAi 分子转录和产生 的核酸构建体提供 RNAi 分子。在一个实施方案中， 通过表达提供微 RNA(miRNA) 的核酸的 RNA 干扰视为包含在本发明的范围内。 miRNA 一般是已经从包含发夹结构的较长的前体 RNA 上被加工的 19-23 个核苷酸的 RNA。 在另一个实施方案中， 通过表达提供短干扰 RNA(siRNA) 的核酸的 RNA 干扰视为包含在本发明的范围内。 siRNA 一般是已经从较长的前体双链 RNA 上 被加工的具有 3’ 突出端的 20-25 个核苷酸的 RNA。 可从用提供 RNAi 分子的多核苷酸分子转 化的和 / 或掺入上述多核苷酸分子的细胞培养包含和表达 RNAi 分子 ( 包括 miRNA 和 siRNA) 的植物。在例如美国专利号 7,056,704 ； 7,078,196 ； 7,365,058 ； 7,232,086 ； 6,506,559 ； 7,282,564 ； 和 7,538,095 中已描述了用于 RNA 干扰的方法和材料， 并在 Milhavet 等人 (2003) ； Agrawal 等人 (2003) ； Kusaba(2004) ； 以及 Doran 和 Helliwell(2009) 中综述。在 一个实施方案中， 本发明的用于抑制植物中的 4CL 基因表达的 RNAi 构建体包含 SEQ ID NO ： 4 或 SEQ ID NO ： 5 的核苷酸序列的全部或部分。在特定的实施方案中， 在植物的叶细胞和 / 或组织中选择性表达 RNAi 分子， 例如通过使用叶特异性启动子。也可使用核酶技术抑制参与甘蔗中木质素生物合成的靶基因的表达。 核酶是一类 RNA， 其可被设计为以特异性的序列依赖性方式酶促切割和失活其他 RNA 靶。通过切割靶 RNA， 核酶抑制翻译， 因此阻止靶基因的表达。使用本领域已知的方法可在实验室化学合成 核酶并在结构上改造以提高其稳定性和催化活性。通过本领域已知的基因递送机制， 可将 编码核酶的核苷酸序列引入植物细胞并掺入植物基因组。可从用核酶编码序列转化的和 / 或掺入核酶编码序列的细胞培养包含和表达核酶编码序列的植物。具有对 4CL 的特异性的 核酶可包括与一种或多种 4CL mRNA 的至少一部分的核苷酸序列互补的一种或多种序列， 和 具有已知的负责 mRNA 切割的催化序列的序列 ( 见美国专利号 5,093,246 或 Haselhoff 等 人 1988)。例如， 可构建四膜虫 (Tetrahymena)L-19 IVS RNA 的衍生物， 其中活性位点的核 苷酸序列与将要在 4CL mRNA 中切割的核苷酸序列互补 ( 见例如美国专利号 4,987,071 ； 和 美国专利号 5,116,742)。可选地， 可使用编码 4CL 蛋白质的 4CL mRNA 从 RNA 分子库中选择 具有特定核糖核酸酶活性的催化 RNA( 见例如 Bartel 等人 1993)。 在一个实施方案中， 在植 物的叶细胞和 / 或组织中选择性表达核酶， 例如通过使用叶特异性启动子。
除了抑制参与甘蔗中的木质素生物合成的靶基因以外， 本发明还设想在靶基因中 的突变， 或其中可对植物细胞提供突变的基因， 在所述植物细胞中靶基因表达或基因产物 水平或活性被降低或抑制。在一个实施方案中， 将突变的 4CL 基因掺入甘蔗植物的基因组， 其中突变的 4CL 基因展示基因转录物或其翻译的减少的或无表达。在一个实施方案中， 在 植物的 4CL 基因中引入突变， 所述突变导致 4CL 基因的转录减少， 或 mRNA 的翻译减少， 和/ 或导致展示降低的酶活性的蛋白质。在特定的实施方案中， 在 4CL 基因的蛋白质编码区引 入一种或多种突变。在另一个实施方案中， 在 4CL 基因转录起始位点的上游和 / 或转录起 始位点的下游引入突变。在一个实施方案中， 在 4CL 基因调控序列中或附近， 例如在启动子 序列中引入突变。突变可阻碍或抑制 4CL 基因序列的转录， 例如通过阻碍或抑制转录因子 或聚合酶结合 4CL 核酸序列。在一个实施方案中， 在植物的叶细胞和 / 或叶组织中选择性 引入 4CL 基因中的突变。突变也可包括抑制或降低 4CL 多肽的功能活性 ( 例如酶活性 ) 的 一种或多种核苷酸或氨基酸插入、 缺失和 / 或取代。创造和引入突变的方法是本领域已知 的。在一个实施方案中， 在植物中的一个或多个野生型 4CL 基因中引入突变。在另一个实 施方案中， 突变的 4CL 基因替换植物中的一个或多个野生型 4CL 基因。在一个实施方案中， 在植物的叶细胞和 / 或组织中选择性表达突变的 4CL 基因。
除了抑制或遏制参与木质素生物合成的靶基因以外， 也可抑制由本发明的靶基因 编码的蛋白质的活性 ( 例如酶活性 )。 在一个实施方案中， 可在甘蔗植物的细胞中掺入和表 达编码与蛋白质结合并抑制其活性 ( 例如酶活性 ) 的抗体或其抗原结合片段的核酸。可从 用所述核酸转化的和 / 或掺入所述核酸的细胞培养包含和表达编码抗体或其抗原结合片 段的核酸的植物。 制备结合和抑制特定靶蛋白的抗体的方法和获得编码抗体的核酸的方法 是本领域熟知的。在一个实施方案中， 抗体是单克隆抗体， 或其抗原结合片段。抗原结合片 段包括， 但不限于 F(ab′ )2， Fab′， Fab， 和 Fv， 并可使用本领域已知的标准方法制备。抗体 可来源于能够产生针对靶蛋白表位的抗体的任意动物， 并包括例如人、 灵长类、 小鼠、 大鼠、 山羊、 绵羊、 猪和牛。在特定的实施方案中， 抗体结合 4CL 蛋白。在一个实施方案中， 4CL 基 因编码包含 AMP 结合基序序列 ( 例如 SEQ ID NO ： 34) 和 / 或 SEQ IDNO ： 54 的特征基序序列 的 4CL 多肽。在更特定的实施方案中， 4CL 蛋白由 4CL-M 基因、 4CL-L 基因或 4CL-N 基因编码。在特定的实施方案中， 4CL-L 基因包含 SEQ ID NO ： 1 中所示的核苷酸序列的全部或部 分， 4CL-M 基因包含 SEQ ID NO ： 2 中所示的核苷酸序列的全部或部分， 4CL-N 基因包含 SEQ IDNO ： 3 中所示的核苷酸序列的全部或部分。在一个实施方案中， 4CL-M， 4CL-L 和 4CL-N 基 因分别编码具有 SEQ ID NO ： 6、 7 和 8 中所示的氨基酸序列的多肽， 或其片段或变体。在一 个实施方案中， 抗体与包含 SEQ ID NO ： 6、 7 和 8 中的氨基酸序列的 4CL 蛋白， 或其片段或表 位结合。 在特定的实施方案中， 在植物的叶组织中选择性表达编码抗体的核酸， 例如通过使 用叶特异性启动子。
也可通过表达和 / 或使靶蛋白接触结合特定靶蛋白的适体抑制参与木质素生物 合成的靶基因编码的蛋白质的活性 ( 例如酶活性 )。适体是可被选择用于结合靶分子的 寡核苷酸或肽 ( 见， 例如， Ellington 和 Szostak(1990) 以及 Hoppe-Seyler 和 Butz(2000) 和 美 国 专 利 号 5,582,981 ； 5,270,163 ； 5,595,877 ； 5,817,785 ； 6,344,318 ； 6,933,116 ； 7,368,236 ； 和 7,700,759)。在一个实施方案中， 在植物细胞中掺入和表达编码与参与木 质素生物合成的蛋白结合的适体的核酸。可从用所述核酸转化的和 / 或掺入所述核酸的 细胞培养包含和表达编码适体的核酸的植物。在一个实施方案中， 适体结合并抑制 4CL 蛋 白。在一个实施方案中， 4CL 基因编码包含 AMP 结合基序序列 ( 例如 SEQ ID NO ： 34) 和 / 或 SEQ ID NO ： 54 的特征基序序列的 4CL 多肽。在特定的实施方案中， 4CL 蛋白由本发明的 4CL-L、 4CL-M 或 4CL-N 基因编码。在特定的实施方案中， 4CL-L 基因包含 SEQ IDNO ： 1 中所 示的核苷酸序列的全部或部分， 4CL-M 基因包含 SEQ ID NO ： 2 中所示的核苷酸序列的全部 或部分， 4CL-N 基因包含 SEQ ID NO ： 3 中所示的核苷酸序列的全部或部分。在一个实施方 案中， 4CL-M， 4CL-L 和 4CL-N 基因分别编码具有 SEQ ID NO ： 6、 7 和 8 中所示的氨基酸序列 的多肽， 或其片段或变体。在一个实施方案中， 适体与包含 SEQ ID NO ： 6、 7 和 8 中的氨基酸 序列的 4CL 蛋白， 或其片段或表位结合。在特定的实施方案中， 在植物的叶组织中选择性表 达编码适体的核酸， 例如通过使用叶特异性启动子。
本发明也涉及甘蔗植物， 其中木质素生物合成已被调节 ( 例如， 下调 )。在一个实 施方案中， 在叶细胞和 / 或组织中选择性下调木质素生物合成。在一个实施方案中， 在甘蔗 植物中抑制或下调一种或多种 4CL 基因的表达和 / 或由 4CL 基因编码的蛋白质的翻译或 活性。在一个实施方案中， 4CL 基因编码包含 AMP 结合基序序列 ( 例如 SEQ ID NO ： 34) 和 / 或 SEQ ID NO ： 54 的特征基序序列的 4CL 多肽。在一个实施方案中， 被抑制的 4CL 基因是 4CL-L， 4CL-M 或 4CL-N。在一个实施方案中， 4CL-M， 4CL-L 和 4CL-N 基因分别编码具有 SEQ ID NO ： 6、 7 和 8 中所示的氨基酸序列的多肽， 或其片段或变体。 在特定的实施方案中， 4CL-L 基因包含 SEQ ID NO ： 1 中所示的核苷酸序列的全部或部分， 4CL-M 基因包含 SEQ ID NO ： 2 中所示的核苷酸序列的全部或部分， 4CL-N 基因包含 SEQ ID NO ： 3 中所示的核苷酸序列的 全部或部分。本发明的甘蔗植物可具有掺入其基因组的靶向一种或多种 4CL 基因 ( 例如 4CL-M， 4CL-N 和 / 或 4CL-L) 的反义、 共抑制、 RNAi 或核酶核酸。本发明的甘蔗植物可在其 基因组中具有突变的 4CL 基因， 其中 4CL 基因的表达被抑制， 和 / 或其中 4CL 多肽具有抑制 或降低 4CL 多肽的功能活性 ( 例如酶活性 ) 的突变。本发明的甘蔗植物也可具有掺入其基 因组的核酸， 所述核酸编码结合 4CL 蛋白并抑制其酶活性的一种或多种抗体 ( 或其抗原结 合片段 ) 和 / 或适体。
任选地， 本文公开的植物可还展示主要有利于种子公司、 栽培者或粮食加工者的一种或多种农艺性状， 例如除草剂抗性、 病毒抗性、 细菌病原体抗性、 昆虫抗性、 线虫抗 性 和 真 菌 抗 性。 见， 例 如 美 国 专 利 号 5,569,823 ； 5,304,730 ； 5,495,071 ； 6,329,504 ； 和 6,337,431。这样的性状也可为提高植物活力或产量的性状 ( 包括允许植物在不同的温 度、 土壤条件和日光和降水水平下生长的性状 )， 或允许鉴定展示目的性状的植物的性状 ( 例如， 可选择的标记物基因， 种皮颜色等等 )。在例如美国专利号 5,569,823 ； 5,304,730 ； 5,495,071 ； 6,329,504 ； 6,337,431 ； 5,767,366 ； 5,928,937 ； 4,761,373 ； 5,013,659 ； 4,975,374 ； 5,162,602 ； 4,940,835 ； 4,769,061 ； 5,554,798 ； 5,879,903 ， 5,276,268 ； 5,561,236 ； 4,810,648 ； 和 6,084,155 ； 欧洲申请号 0242246 ； 美国专利申请号 20010016956 和 www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/ 的万维网上描述了多种目的性 状， 以及将这些性状引入植物的方法。
本发明也涉及甘蔗植物组织和植物部分， 包括但不限于， 来自本发明的具有被调 节 ( 例如下调 ) 的木质素生物合成的、 可从其再生植物的甘蔗植物的植物细胞、 植物原生质 体、 植物细胞组织培养物、 植物愈伤组织、 植物块 (clump) 和植物中完整的植物细胞， 或植 物的部分， 例如枝、 核、 穗、 穗轴、 果壳、 根尖、 花药、 种子、 根、 胚、 下胚轴、 子叶、 花粉、 胚珠、 花 药、 幼苗、 梗、 茎、 叶、 果和花。在一个实施方案中， 在植物组织或植物细胞中抑制或下调一 种或多种 4CL 基因或其基因产物的表达。在一个实施方案中， 被抑制的 4CL 基因是 4CL-M， 4CL-L 或 4CL-N。在一个实施方案中， 4CL-M， 4CL-L 和 4CL-N 基因分别编码具有 SEQ ID NO ： 6、 7 和 8 中所示的氨基酸序列的多肽， 或其片段或变体。在特定的实施方案中， 4CL-L 基因 包含 SEQ ID NO ： 1 中所示的核苷酸序列的全部或部分， 4CL-M 基因包含 SEQ ID NO ： 2 中所 示的核苷酸序列的全部或部分， 4CL-N 基因包含 SEQ IDNO ： 3 中所示的核苷酸序列的全部或 部分。
本发明也涉及具有被调节的或下调的木质素生物合成的甘蔗细胞或原生质体。 在一个实施方案中， 在甘蔗细胞或原生质体中抑制或下调一种或多种 4CL 基因的表达， 或 由 4CL 基因编码的蛋白质的翻译或活性。在一个实施方案中， 被抑制的 4CL 基因是 4CL-M， 4CL-L 或 4CL-N。在一个实施方案中， 4CL-M， 4CL-L 和 4CL-N 基因分别编码具有 SEQ ID NO ： 6、 7 和 8 中所示的氨基酸序列的多肽， 或其片段或变体。在特定的实施方案中， 4CL-L 基因 包含 SEQ ID NO ： 1 中所示的核苷酸序列的全部或部分， 4CL-M 基因包含 SEQ ID NO ： 2 中所 示的核苷酸序列的全部或部分， 4CL-N 基因包含 SEQ IDNO ： 3 中所示的核苷酸序列的全部或 部分。
本发明也涉及产生具有降低的或下调的木质素生物合成的甘蔗植物的方法。 在一 个实施方案中， 在甘蔗植物的叶细胞和 / 或组织中降低或下调木质素生物合成。在另一个 实施方案中， 在甘蔗植物的茎组织中降低或下调木质素生物合成。 在一个实施方案中， 本发 明的方法包括抑制或遏制一种或多种 4CL 基因的表达， 或抑制由 4CL 基因编码的蛋白质的 翻译或活性 ( 例如酶活性 )。在一个实施方案中， 4CL 基因编码包含 AMP 结合基序序列 ( 例 如 SEQ ID NO ： 34) 和 / 或 SEQ ID NO ： 54 的特征基序序列的 4CL 多肽。在一个实施方案中， 被抑制的 4CL 基因是 4CL-M， 4CL-L 或 4CL-N。在一个实施方案中， 4CL-M， 4CL-L 和 4CL-N 基 因分别编码具有 SEQ ID NO ： 6、 7 和 8 中所示的氨基酸序列的多肽， 或其片段或变体。在特 定的实施方案中， 4CL-L 基因包含 SEQ ID NO ： 1 中所示的核苷酸序列的全部或部分， 4CL-M 基因包含 SEQ ID NO ： 2 中所示的核苷酸序列的全部或部分， 4CL-N 基因包含 SEQ IDNO ： 3中所示的核苷酸序列的全部或部分。在一个实施方案中， 使用反义核酸、 共抑制、 RNA 干扰或 核酶抑制靶基因的表达。在另一个实施方案中， 通过基因突变抑制靶基因的表达。在另一 个实施方案中， 通过表达与蛋白质结合的抗体或其抗原结合片段， 和 / 或适体， 或通过在基 因中提供抑制基因的 mRNA 翻译为蛋白质的突变或破坏或抑制编码的蛋白质的功能的突变 ( 例如通过氨基酸序列中的改变 )， 在植物中抑制靶基因编码的蛋白质的活性。可使用本领 域已知的标准方法和材料将提供靶基因表达抑制的核酸构建体引入植物基因组， 并由此制 备转化的和转基因的植物。
可在表达构建体中提供对本发明有用的多核苷酸。 本发明的表达构建体一般包括 在将要表达表达构建体的预期的宿主细胞中有功能的调控元件。因此， 本领域普通技术人 员可选择用于细菌宿主细胞、 酵母宿主细胞、 植物宿主细胞、 昆虫宿主细胞、 哺乳动物宿主 细胞和人宿主细胞的调控元件。调控元件包括启动子、 转录终止序列、 翻译终止序列、 增强 子和多聚腺苷酸化元件。如本文使用的， 术语 “表达构建体” 指提供有效连接的核酸序列的 转录的核酸序列的组合。如本文使用的， 术语 “有效连接的” 指描述的组件的并置， 其中所 述组件处于允许其以其预期的方式发挥功能的关系之中。大体上， 有效连接的组件处于相 邻关系。
本发明的表达构建体可包含与本发明的多核苷酸序列有效连接的启动子序列。 可 使用本领域已知的标准技术将启动子掺入多核苷酸。 可在本发明的表达构建体中使用多拷 贝启动子或多个启动子。 在优选的实施方案中， 可将启动子置于这样的位置， 即其相距表达 构建体中的转录起始位点的距离与其相距其天然遗传环境中的转录起始位点的距离相同。 在此距离上允许一些基本上不降低启动子活性的变化。 在表达构建体中一般包含转录起始 位点。
如果将在植物细胞中提供表达构建体或将表达构建体引入植物细胞， 那么可使用 植物病毒启动子， 例如花椰菜花叶病毒 (CaMV)35S( 包括增强的 CaMV 35S 启动子 ( 见， 例如 美国专利号 5,106,739))， 或 CaMV 19S 启动子或木薯叶脉花叶 ( 启动子 )。可用于植物中 的表达构建体的其他启动子包括， 例如 prolifera 启动子、 Ap3 启动子、 热休克启动子、 根癌 农杆菌 (A.tumefaciens) 的 T-DNA 1′ - 或 2′ - 启动子、 多半乳糖醛酸酶启动子、 矮牵牛 花的查耳酮合酶 A(CHS-A) 启动子、 烟草 PR-1a 启动子、 泛素启动子、 肌动蛋白启动子、 alcA 基因启动子、 pin2 启动子 (Xu 等人， 1993)、 玉米 WipI 启动子、 玉米 trpA 基因启动子 ( 美国 专利号 5,625,136)、 玉米 CDPK 基因启动子， 且也可使用 RUBISCO SSU 启动子 ( 美国专利号 5,034,322)。在本发明中可使用组织特异性启动子， 例如果特异性启动子， 如番茄的 E8 启 动子 ( 登记号 ： AF515784 ； Good 等人 (1994))。 在本发明的核酸构建体中可使用的叶特异性 启动子包括 Cab1 启动子 (Brusslan 和 Tobin， 1992)、 Cab19 启动子 (Bassett 等人， 2007)、 PPDK 启动子 (Matsuoka 等人， 1993) 和核酮糖二磷酸羧化酶 (RBCS) 启动子 (Matsuoka 等 人 (1994) 和美国专利号 7,723,575)。可用于本发明的表达构建体的其它的植物叶特异性 启动子包括， 但不限于， Act1 启动子 ( 美国公开的申请号 20090031441)、 AS-1 启动子 ( 美 国专利号 5,256,558)、 RBC-3A 启动子 ( 美国专利号 5,023,179)、 CaMV 35S 启动子 (Odell 等人， 1985)、 增强的 CaMV35S 启动子、 玄参花叶病毒 (FMV) 启动子 (Richins 等人， 1987)、 甘露碱合酶 (mas) 启动子、 章鱼碱合酶 (ocs) 启动子等等， 例如来自 CaMV 19S(Lawton 等 人， 1987)、 nos(Ebert 等人， 1987)、 Adh(Walker 等人， 1987)、 蔗糖合酶 (Yang 等人、 1990)、α- 微管蛋白、 泛素、 肌动蛋白 (Wang 等人、 1992)、 cab(Sullivan 等人、 1989)、 磷酸烯醇式丙 酮酸羟化酶 (PEPCase)(Hudspeth 等人、 1989) 的启动子， 或与 R 基因复合物有关的启动子 (Chandler 等人、 1989)。又见公开的美国申请 2007/006346 和 Yamamoto 等人 (1997) ； Kwon 等人 (1994) ； Yamamoto 等人。 果特异性启动子如花器官特异性启动子可用于本发明的表达 构建体， 从而在植物的花器官中表达本发明多核苷酸。花器官特异性启动子的实例包括在 美国专利号 6,462,185 ； 5,639,948 ； 和 5,589,610 中描述的任意启动子序列。也可使用种 子特异性启动子如 β- 云扁豆蛋白基因 ( 例如菜豆的 ) 或大豆球蛋白基因 ( 例如大豆的 ) 等等的启动子。根特异性启动子， 如在美国专利号 6,455,760 或美国专利号 6,696,623， 或 在 公 开 的 美 国 专 利 申 请 号 20040078841 ； 20040067506 ； 20040019934 ； 20030177536 ； 20030084486 ； 或 20040123349 中描述的任意启动子序列可用于本发明的表达构建体。 木质 部特异性启动子包括稻的肉桂酸 -4- 羟化酶 (C4H)。也设想将组成型启动子 ( 如 CaMV、 泛 素、 肌动蛋白或 NOS 启动子 )、 发育调控型启动子和诱导型启动子 ( 如可被热、 光、 激素或化 学品诱导的那些启动子 ) 用于本发明的多核苷酸表达构建体。
鉴定和表征植物基因组 DNA 中的启动子区的方法是本领域已知的， 并包括， 例如 在以下参考文献中描述的那些 ： Jordano 等人 (1989) ； Bustos 等人 (1989) ； Green 等人 (1988) ； Meier 等人 (1991) ； 和 Zhang 等人 (1996)。公开的美国申请 2009/0199307 也描述 了使用差异显示鉴定组织特异性启动子的方法 ( 见， 例如美国专利号 5,599,672)。在差异 显示中， 比较了来自不同组织类型的 mRNA。 通过鉴定仅在特定组织类型， 或组织类型集合中 存在的 mRNA 种类， 可鉴定出以组织特异性方式表达的相应基因。可通过逆转录酶转录 RNA 以产生 cDNA， 并可使用 cDNA 分离含有全长基因的克隆。 也可使用 cDNA 从相应基因中分离部 分同源或同源的启动子、 增强子或终止子， 使用例如抑制 PCR。又见美国专利号 5,723,763。
本发明的表达构建体也可任选地包含转录终止序列， 翻译终止序列， 编码信号肽 的序列， 和 / 或增强子元件。一般可从真核或病毒基因序列的 3’ 非翻译区获得转录终止 区。可将转录终止序列置于编码序列的下游以提供有效的终止。信号肽序列是一般存在于 蛋白质的氨基端的短氨基酸序列， 其负责有效连接的成熟多肽再定位到范围广泛的翻译后 细胞目的地， 所述目的地的范围从特定细胞器区室到蛋白质作用位点和细胞外环境。通过 使用有效连接的信号肽序列， 将基因产物靶向预期的细胞和 / 或细胞外目的地， 设想将此 用于本发明的多肽。经典的增强子是提高基因转录的顺式作用元件， 并也可包含在表达构 建体中。经典的增强子元件是本领域已知的， 包括但不限于 CaMV 35S 增强子元件、 巨细胞 病毒 (CMV) 早期启动子增强子元件和 SV40 增强子元件。增强基因表达的内含子介导的增 强子元件也是本领域已知的。这些元件必须存在于转录区内且是方向依赖的。实例包括玉 米 shrunken-1 增强子元件 (Clancy 和 Hannah， 2002)。
在表达构建体中也可包含引导从表达构建体上转录的 mRNA 的多聚腺苷酸化的 DNA 序列， 并包括但不限于 CaMV 35S、 章鱼碱合酶或胭脂碱合酶信号。本发明的表达构建体 也可包含引导其他基因转座的多核苷酸序列， 即转座子。
表达构建体也可包含用于选择转化细胞的一种或多种显性可选择标记物基因， 包 括例如编码抗生素抗性的基因。抗生素抗性基因可提供对一种或多种以下抗生素的抗性 ： 潮霉素、 卡那霉素、 博来霉素、 G418、 链霉素、 巴龙霉素、 新霉素和壮观霉素。 可通过新霉素磷 酸转移酶 (NPT II) 提供卡那霉素抗性。用于细胞转化筛选的其它标记物包括编码 β- 葡糖醛酸酶 (GUS)、 β- 半乳糖苷酶、 荧光素酶、 胭脂碱合酶、 氯霉素乙酰基转移酶 (CAT)、 绿色 荧光蛋白 (GFP) 或增强的 GFP(Yang 等人 (1996)) 的基因。
本发明也涉及包含编码预期蛋白质的本发明的多核苷酸的多核苷酸载体， 所述载 体将提供给用本发明的生物反应器装置提供的细胞。 在本发明的表达构建体或多核苷酸的 5’ 和 3’ 端可包含独特的限制酶位点， 以允许其插入多核苷酸载体。如本文使用的， 术语 “载 体” 指任意遗传元件， 包括例如质粒、 粘粒、 染色体、 噬菌体、 病毒等等， 当与合适的控制元件 相联系时其能够复制， 且其可在细胞间转移多核苷酸序列。载体包含允许载体在选定的宿 主细胞中复制的核苷酸序列。用于表达和 / 或克隆的若干载体是现有的， 并包括但不限于， pBR322， pUC 系列， M13 系列， 和 pBLUESCRIPT 载体 (Stratagene， La Jolla， CA)。
本发明的多核苷酸可由 RNA 或 DNA 组成。优选地， 多核苷酸由 DNA 组成。本发明 也包含与本文公开的多核苷酸序列互补的多核苷酸。
用 基 因 转 化 植 物 细 胞 的 技 术 是 本 领 域 已 知 的， 并包括例如农杆菌 (Agrobacterium) 感染、 基因枪法、 电穿孔、 氯化钙处理、 PEG 介导的转化等。见， 例如美国专 利号 5,036,006 ； 5,591,616 ； 5,100,792 ； 公开的美国申请号 2006/0260011 ； 和公开的 PCT 申请号 WO 93/07278 和 WO93/21335。 美国专利号 5,661,017 教导了用异源多核苷酸转化藻 类细胞的方法和材料。使用本领域已知的标准方法可选择、 重新分化和培养转化细胞为包 含和表达本发明的多核苷酸的植物。 在本发明的范围内也包含任意转化的或转基因的本发 明的植物细胞或植物的种子和其他植物组织和后代。 也可根据与本文示例的这些序列的更具体的同一性和 / 或相似性范围定义本发 明的多核苷酸和多肽。序列同一性将一般地大于 60 ％， 优选地大于 75 ％， 更优选地大于 80％， 甚至更优选地大于 90％， 和可大于 95％。与本文示例的序列相比， 序列的同一性和 / 或相似性可为 49， 50， 51， 52， 53， 54， 55， 56， 57， 58， 59， 60， 61， 62， 63， 64， 65， 66， 67， 68， 69， 70， 71， 72， 73， 74， 75， 76， 77， 78， 79， 80， 81， 82， 83， 84， 85， 86， 87， 88， 89， 90， 91， 92， 93， 94， 95， 96， 97， 98， 或 99 ％。除非另外指定， 可使用如在 Karlin 和 Altschul(1993) 中修改的 Karlin 和 Altschul(1990) 算法测定如本文使用的 2 个序列的百分比序列同一性和 / 或相 似性。 这样的算法包含在 Altschul 等人 (1990) 的 NBLAST 和 XBLAST 程序中。 可使用 NBLAST 程序， 分数＝ 100， 字长＝ 12 进行 BLAST 搜索， 以得到具有预期百分比序列同一性的序列。 为了比较目的获得有缺口的比对， 可使用如 Altschul 等人 (1997) 描述的 Gapped BLAST。 当使用 BLAST 和 Gapped BLAST 程序， 可使用各个程序 (NBLAST 和 XBLAST) 的默认参数。见 NCBI/NIH 网站。
本发明也设想与编码本发明的多肽的多核苷酸序列具有足够同源的序列， 从而在 标准的严格条件和标准方法下允许与该序列杂交 (Maniatis， T. 等人， 1982) 的那些本发明 的多核苷酸分子 ( 和编码本发明的多肽的那些多核苷酸分子 )。 如本文使用的， 用于杂交的 “严格的” 条件指这样的条件， 其中一般在 6x SSPE， 5x Denhardt 溶液， 0.1％ SDS， 0.1mg/ml 变性 DNA 中在低于 DNA 杂合体的解链温度 (Tm) 的 20-25C 下过夜进行杂交。解链温度有以 下公式 (Beltz， G.A. 等人， 1983) 描述 ：
Tm ＝ 81.5C+16.6Log[Na+]+0.41( ％ G+C)-0.61( ％甲酰胺 )-600/ 双链体的长度 ( 以碱基对为单位 )。
一般如下进行洗涤 ：
a) 在 1x SSPE， 0.1％ SDS 中在室温进行 15 分钟， 2 次 ( 低严格度的洗涤 )。
b) 在 0.2x SSPE， 0.1％ SDS 中在 Tm-20C 下进行 15 分钟， 1 次 ( 中严格度的洗涤 )。
如本文使用的， 术语 “核酸” 和 “多核苷酸序列” 指单链或双链形式的脱氧核糖核 苷酸或核糖核苷酸聚合物， 除非另外限制， 其包含可与天然存在的核苷酸类似的方式发挥 功能的天然核苷酸的已知类似物。多核苷酸序列包括被转录为 RNA 的 DNA 链序列和被翻译 为蛋白质的 RNA 序列二者。多核苷酸序列包括全长序列以及来源于全长序列的较短序列二 者。 应当理解， 特定多核苷酸序列包含天然序列的简并密码子， 或可被引入以在特定宿主细 胞中提供密码子偏好的序列。 在本发明范围内的多核苷酸序列还包含与编码本发明的多肽 的序列特异性杂交的序列。 多核苷酸包含作为单独的链的或在双链体中的正义和反义链二 者。
在本发明的范围内也视为包含具有除了在本发明的多肽中特别示例的氨基酸取 代以外的氨基酸取代的多肽。 例如， 可用非天然氨基酸取代本发明的多肽的氨基酸， 只要具 有取代的氨基酸的多肽基本上保留与氨基酸未被取代的多肽相同的活性。 非天然氨基酸的 实例包括， 但不限于， 鸟氨酸、 瓜氨酸、 羟脯氨酸、 高丝氨酸、 苯甘氨酸、 牛磺酸、 碘化酪氨酸、 2， 4- 二氨基丁酸、 α- 氨基异丁酸、 4- 氨基丁酸、 2- 氨基丁酸、 γ- 氨基丁酸、 ε- 氨基己酸、 6- 氨基己酸、 2- 氨基异丁酸、 3- 氨基丙酸、 正亮氨酸、 正缬氨酸、 肌氨酸、 高瓜氨酸、 磺丙氨 酸、 τ- 丁基甘氨酸、 τ- 丁基丙氨酸、 苯甘氨酸、 丙氨酸环己酯、 β- 丙氨酸、 氟代氨基酸， 专 门设计的氨基酸如 β- 甲基氨基酸、 C- 甲基氨基酸、 N- 甲基氨基酸， 和一般的氨基酸类似 物。非天然氨基酸也包括具有衍生化的侧基的氨基酸。此外， 蛋白质中的任意氨基酸可为 D( 右旋 ) 型或 L( 左旋 ) 型。 氨基酸可一般被分为以下种类 ： 非极性、 无电荷极性、 碱性和酸性。在本发明的范 围内包括保守取代， 其中具有一类氨基酸的多肽被同类的另一种氨基酸替换， 只要具有取 代的多肽仍基本上保留与没有取代的多肽相同的生物学活性。 非极性氨基酸包括 Ala， Val， Leu， Ile， Pro， Met， Phe， 和 Trp。无电荷极性氨基酸包括 Gly， Ser， Thr， Cys， Tyr， Asn， 和 Gln。酸性氨基酸包括 Asp 和 Glu。碱性氨基酸包括 Lys， Arg， 和 His。
一旦在表达系统中掺入本发明的核酸序列， 就可将其转化进植物细胞。词语 “植 物” 指任意植物， 特别是种子植物， “植物细胞” 是植物的结构和生理学单位， 其包含细胞壁， 但也可指原生质体。植物细胞可为分离的单个细胞或培养细胞的形式， 或作为更高等的有 机体单位例如植物组织或植物器官的一部分。术语 “转化” 指导致在遗传上被稳定继承的 核酸片段至宿主细胞基因组的转移。包含转化的核酸片段的宿主细胞被称为 “转基因” 细 胞， 和包含转基因细胞的生物被称为 “转基因生物” 。
转 化 植 物 和 植 物 细 胞 的 方 法 的 实 例 包 括 农 杆 菌 介 导 的 转 化 (Deblaere 等 人 (1987)) 和微粒轰击技术 (Klein 等人 (1987) ； 美国专利号 4,945,050)。通过技术人员熟 知的方法可从转基因细胞再生全植物 ( 见， 例如 Fromm 等人 (1990))。
可以多种本领域公认的方式将本发明的表达构建体引入植物细胞。 术语 “引入” 在 多核苷酸 ( 例如编码本文公开的酶的核苷酸 ) 的情况下， 旨在表示以这样的方式将多核苷 酸呈递给植物， 即， 使多核苷酸能进入植物细胞内部。当要引入多于一种多核苷酸时， 这些 多核苷酸可被组装为单个核苷酸构建体的一部分， 或作为单独的核苷酸构建体， 并可位于 相同或不同的转化载体上。
因此， 可在单个转化事件中， 在单独的多个转化事件中， 或例如在植物中将这些多 核苷酸引入目的宿主细胞， 作为育种方案的一部分。本发明的方法不依赖于特定的将一种 或多种多核苷酸引入植物的方法， 只要多核苷酸能进入植物的至少一个细胞的内部。将多 核苷酸引入植物的方法是本领域已知的， 并包括但不限于， 瞬时转化法、 稳定转化法和病毒 介导法。
“瞬时转化” 在多核苷酸的情况下旨在表示， 多核苷酸被引入植物但不整合进植物 的基因组。
在将多核苷酸引入植物的情况下， “稳定引入” 或 “稳定引入的” 旨在表示， 引入的 多核苷酸被稳定掺入植物基因组， 因此植物被多核苷酸稳定地转化。
“稳定转化” 或 “稳定转化的” 旨在表示， 引入植物的多核苷酸 ( 例如， 本文描述的 核苷酸构建体 ) 整合进植物的基因组， 并能够被其后代继承， 更特别地， 被多个连续世代的 后代继承。
可用于植物转化的多种转化载体是在植物转化领域的普通技术人员已知的， 且与 本发明有关的基因可与任意这些载体共同使用。 载体的选择将取决于优选的转化技术和用 于转化的靶物种。对某些靶物种， 可优选不同的抗生素或除草剂选择标记物。
再生转化植物的方法是本领域熟知的。例如， Ti 质粒载体已被用于外源 DNA 的递 送， 以及直接的 DNA 摄取、 脂质体、 电穿孔、 显微注射和微粒。另外， 来自农杆菌属的细菌可 被用于转化植物细胞。下面描述了转化双子叶和单子叶植物的代表性技术， 以及代表性质 体转化技术。
许多载体可用于使用根癌农杆菌的转化。其一般携带至少一种 T-DNA 边界序列， 并包括如 pBIN19(Bevan(1984)) 的载体。为了构建用于农杆菌转化的载体， 见， 例如美国专 利申请公开号 2006/0260011。
不使用根癌农杆菌的转化规避了在选择的转化载体中对 T-DNA 序列的需要， 因此 也可使用缺乏这些序列的载体。不依赖农杆菌的转化技术包括， 但不限于， 通过颗粒轰击、 原生质体摄取 ( 例如 PEG 和电穿孔 ) 和显微注射。载体的选择大部分取决于用于转化的物 种的优选的选择。有关这些载体的构建， 见例如美国公开的申请号 2006/0260011。
用于双子叶植物的转化技术是本领域熟知的， 并包括基于农杆菌的技术和不需要 农杆菌的技术。非农杆菌的技术包括通过原生质体或细胞直接摄取外源遗传物质， 并可例 如通过 PEG 或电穿孔介导的摄取、 颗粒轰击介导的递送或显微注射实现。Paszkowski 等人 (1984)， Potrykus 等人 (1985)， Reich 等人 (1986)， 和 Klein 等人 (1987) 描述了这些技术 的实例。在每种情况下， 使用本领域已知的标准技术将转化细胞再生为整株植物。
农杆菌介导的转化是转化双子叶植物的优选技术， 因为其高转化效率及其对许多 不同物种的广泛实用性。农杆菌转化一般包括将携带目的外源 DNA 的二元载体转移至合适 的农杆菌菌株， 这可能依赖于宿主农杆菌菌株在共驻留的 Ti 质粒或染色体上携带的 vir 基 因的补足 (complement)(Uknes 等人 (1993))。通过使用携带重组二元载体的大肠杆菌、 携 带能够将重组二元载体移动至靶农杆菌菌株的质粒的辅助大肠杆菌菌株的三亲株交配程 序实现重组二元载体至农杆菌的转移。可选地， 可通过 DNA 转化将重组二元载体转移至农 杆菌 (Hofgen 和 Willmitzer(1988))。
重组农杆菌对靶植物物种的转化通常包括共培养农杆菌与来自植物的外植体， 并遵照本领域熟知的方案。在携带存在于二元质粒 T-DNA 边界之间的抗生素或除草剂抗性标 记物的选择培养基上再生转化的组织。
用基因转化植物细胞的另一种方法包括在植物组织和细胞上推进 (propel) 惰性 或生物活性颗粒。在美国专利号 4,945,050， 5,036,006， 和 5,100,792 中公开了此技术。大 体上， 此技术包括在能够有效穿透细胞的外表面的条件下在细胞上推进惰性或生物活性颗 粒， 并在其内部提供掺入。 当使用惰性颗粒时， 可通过用包含预期基因的载体覆盖颗粒将载 体引入细胞。可选地， 可用载体包围细胞， 从而通过颗粒将载体携带进细胞。也可将生物活 性颗粒 ( 例如， 干酵母细胞、 干细菌或噬菌体， 其分别含有试图引入的 DNA) 推进植物细胞组 织。
大多数单子叶物种的转化现在也已变为常规技术。优选的技术包括使用 PEG 或 电穿孔技术将基因直接转移进原生质体， 和颗粒轰击进愈伤组织。可使用单个 DNA 种类或 多个 DNA 种类 ( 即共转化 ) 进行转化， 且这些技术都适用于本发明。共转化可具有以下优 势： 避免构建完整载体， 和产生具有不连锁的目的基因和可选择标记物的基因座的转基因 植物， 这使得能够在以后的世代中去除可选择的标记物， 这应当被认为是理想的。
专利申请 EP 0292435， EP 0392225， 和 WO 93/07278 描述了从玉米的原种自交系 制备愈伤组织和原生质体， 使用 PEG 或电穿孔转化原生质体， 和从转化的原生质体再生玉 米植物的技术。Gordon-Kamm 等人 (1990) 和 Fromm 等人 (1990) 公开了使用颗粒轰击转 化 A188 来源的玉米系的技术。此外， WO 93/07278 和 Koziel 等人 (1993) 描述了通过颗 粒轰击转化玉米的原种自交系的技术。此技术使用从授粉后 14-15 天的玉米穗上切除的 1.5-2.5mm 长的未成熟的玉米胚和 PDS-1000He 基因枪装置用于轰击。
通过用本发明的核酸序列转化得到的植物可为任意的品种广泛的植物物种， 包 括单子叶和双子叶植物物种。可通过育种将本发明的基因表达与其他对生产和质量的重 要特征组合掺入植物系。也可通过育种或通过普通的基因工程技术将本文公开的本发明 的多核苷酸掺入植物系或维持在植物系中。育种方法和技术是本领域已知的。见， 例如 Welsh(1981) ； Wood(1983) ； Mayo(1987) ； Singh(1986) ； 以及 Wricke 和 Weber(1986)。
通过有性生殖或营养生长传递改造进上述转基因种子和植物的遗传特性， 并可因 此在后代植物中维持和传播所述遗传特性。一般地， 维持和繁殖利用为了适合特定目的如 耕种、 播种或收割而开发的已知农业方法。
相关技术是本领域熟知的， 并包括但不限于， 杂交、 近交、 回交育种、 多系育种 (multi-line breeding)、 双单倍体近交、 品种混合、 种间杂交、 非整倍体技术， 等等。 杂交技 术也包括通过机械、 遗传 ( 包括转基因 )、 化学或生物化学手段使植物不育以产生雄性或雌 性不育的植物。
用于本发明的目的， “甘蔗” 指任意甘蔗属植物或杂种。在本发明的范围内的甘蔗 植物包括， 例如斑茅 (Saccharum arundinaceum)、 Saccharumbengalense、 肉质花穗野生种 (Saccharum edule)、 白甘蔗 (Saccharumofficinarum)、 狭叶斑茅 (Saccharum procerum)、 沙 生 蔗 茅 (Saccharumravennae)、 大 茎 野 生 种 (Saccharum robustum)、 竹 蔗 (Saccharum sinense) 和割手密 (Saccharum spontaneum)。本发明的甘蔗植物可为近交系或杂种。杂 种植物包括通过组成目前所有的商业甘蔗和 energycane 种质的白甘蔗杂交材料由传统的 割手密生成的杂种， 和通过用近亲或远亲物种杂交甘蔗产生的任意其他杂种。可与甘蔗杂交以产生杂种植物或新的甘蔗品种的其他物种的实例包括芒属 (Miscanthus)、 蔗茅属 (Erianthus) 和甜高粱属 (Sorghum)。
“分离的” 表示 “通过人工操作” 从其自然状态改变的， 即， 如果其出现在自然界， 其 已从其本来的环境中被改变或移动， 或被改变和移动。 例如， 在活动物中以天然状态天然存 在的多核苷酸或多肽不是 “分离的” ， 但如本文使用的术语， 从其天然状态的共同存在的材 料中分开的相同的多核苷酸或多肽是 “分离的” 。例如， 就多核苷酸而言， 术语分离的表示， 从其天然存在的染色体和细胞中分开的。如果序列从其天然存在的染色体和细胞中分开， 但被插入其不天然存在的染色体或细胞的基因环境中， 则其也是分离的。
如本文使用的， 术语 “转基因的” 指包含外源多核苷酸 ( 即基因 ) 的植物， 所述外源 多核苷酸在转化的植物中被稳定维持并在连续世代中通过后代稳定继承。术语 “转基因植 物” 可指最初转化的植物或最初转化的植物的后代。 用于转化植物、 植物细胞或植物组织的 技术可包括， 但不限于， 使用根癌农杆菌或发根农杆菌 (A.rhizogenes) 作为转化剂用 DNA 转化， 电穿孔、 DNA 注射、 微粒轰击和颗粒加速。见， 例如 EP 295959 和 EP 138341。如本文 使用的， 术语 “植物材料” 或 “植物部分” 包括植物细胞、 植物原生质体、 可从其再生植物的植 物细胞组织培养物、 植物愈伤组织、 植物块和植物中完整的植物细胞， 或植物的部分， 如胚、 花粉、 胚珠、 种子、 叶、 花、 枝、 果、 核、 穗、 穗轴、 果壳、 梗、 根、 根尖、 花药、 块茎、 根茎等等。
材料和方法
植 物 材 料。 在 表 达 分 析 中 使 用 野 外 培 养 的 成 熟 甘 蔗 ( 甘 蔗 属 杂 交 种 ) 变 种 CP88-1762 和温室培养的未成熟的 CP88-1762 和 L 79-1002。
RNA 提取、 基因分离和 RT-PCR。使用 TRIzol 试剂 (Invitrogen) 从叶、 茎、 节和根 分离总 RNA。使用 cDNA 合成试剂盒 (Bio-Rad) 从 1ug 总 RNA 合成第一链 cDNA。
甘蔗 4CL 的分离
Sc4CL-L
通过 RACE(cDNA 末端的快速扩增 ) 技术得到部分 4CL-L。使用 SMARTRACE 试剂盒 (Clontech) 根据制造商的说明书进行 RACE。从 2ug 总 RNA 合成 5’ - 和 3’ -RACE 预备 cDNA 库， 并使用这些库作为 PCR 模板。基于 4CL-L 的部分基因组 DNA 序列设计初级 (LPF ： 5’ -CG TTGCCTGTGAAGTCCGGCGC-3’ (SEQ ID NO ： 17)) 和巢式 (LNF ： 5’ -CCACGGCGAAGACCATCGACTCG-3 ’ (SEQ IDNO ： 18)) 基因特异性引物。使用 LPF 和制造商提供的通用引物混合物 (UPM) 进行 初级 PCR。PCR 条件由 25 个循环的 94℃ 30 秒， 68℃ 60 秒和 72℃ 180 秒组成。将初级 PCR 产物从 1 稀释到 50 并用作次级 PCR 的模板， 次级 PCR 使用 LNF 和制造商提供的巢式通用引 物 (NUP)。第二个 PCR 在与第一个 PCR 相同的条件的 20 个循环下进行。将 3’ -RACE PCR 产物克隆进 pCR2.1TOPO 载体 (Invitrogen) 并测序。
Sc4CL-M
通过 DNA 文库筛选分离 4CL-M。从野外培养的植物 (Belle Grade 和 Citra， FL) 收获甘蔗 ( 甘蔗属杂交种 ) 变种 CP88-1762 的叶、 节间、 节和未成熟的卷叶。从水培溶液培 养的植物中收集根和新生幼苗。使用 Trizol(Invitrogen) 从每种组织中提取总 RNA， 并以 相同的比例混合来自每种样品的总 RNA。使用 Oligotex mRNA Mini 试剂盒 (Qiagen) 从混 合的总 RNA 提纯 mRNA。从 5.9ug mRNA 合成 cDNA 并使用 cDNA 合成试剂盒和 ZAP-cDNA 合 成试剂盒 (Stratagene) 连接至 Uni-ZAP XR 载体。使用 ZAP-cDNA GigapackIII Gold 克隆 试剂盒根据制造商的说明书 (Stratagene) 进行包装和扩增。用于筛选， 使用随机引物试剂 32 盒 (Promega) 通过 PCR 生成 447bp 的部分 4CLM 特异性探针并用 P-dCTP 标记。筛选了约 2.0x 105 的重组噬菌体， 并分离了 1 个阳性噬菌体。为了得到包含 cDNA 的 pBluscript 噬 菌粒， 进行了体内切除并对分离物测序。
Sc4CL-N
使用从甘蔗 EST 序列推断的基因特异性引物从 cDNA 上 PCR 扩增 4CL-N。在 DFCI 白甘蔗基因索引 (SoGI ； http://compbio.dfci.harvard.edu/cgi-bin/tgi/gireport.pl ？ gudb ＝ s_officinarum) 中使用 “4- 香豆酸辅酶 A 连接酶” 作为关键词检索的主题。检测 出具有完整的开放阅读框的假设的共有 (TC) 序列 TC88322， 并用于引物设计。分别从起 始和终止密码子区设计了正向引物 (4CL1F ： 5’ -ATGGGTTCCGTGGACACGGCGGTCGCG-3’ (SEQ ID NO ： 19)) 和反向引物 (4CL1R ： 5’ -TCAGTGAACACCGGCGGCGAGCCTGG-3’ (SEQ ID NO ： 20))。 使用 Trizol 根据制造商的说明书 (Invitrogen) 从叶、 节间、 节和幼苗分离总 RNA， 并使用 iScript cDNA 合成试剂盒 (Bio-rad) 进行 cDNA 合成。使用 200ng 来自每个组织的 cDNA 混 合物作为 PCR 模板。使用 TaKaRa LA taq 聚合酶 (Takara BIO Inc.) 进行 PCR， 且 PCR 条件 由 35 个循环的 95℃ 45 秒， 56℃ 45 秒和 72℃ 120 秒组成。将 2 次独立扩增的 PCR 产物克 隆进 pCR2.1TOPO 载体 (Invitrogen) 并测序。Sc4CL RNAi 抑制构建体的构建
基于 Sc4CL-L(SEQ ID NO ： 1) 和 Sc4CL-M(SEQ ID NO ： 2) 的测序信息， 设计了特异 性引物以分别扩增名为外显子 2 和外显子 1 的 200bp 区域。将对应 2 个限制酶 EcoRI 和 XbaI 的序列加入正向引物， 对反向引物加入特异性对应 EcoRV 限制酶的序列， 以便于亚克 隆。使用由通过 Bg4CL 天然内含子分隔开的 2 个反向重复和转录终止子 CaMV35SpolyA 组 成的质粒 pWFBgH4CL_RNAi 构建 Sc4CL 干扰构建体。在 2 个单独和相继的亚克隆步骤中， 用 Sc4CL 特异性序列替换质粒 pWF BgH4CL_RNAi 中的反向重复。然后亚克隆稻 C4H 启动子并 产生 2 个构建体 Sc4CL-Li 和 Sc4CL-Mi(SEQ ID NO ： 4 和 SEQ ID NO ： 5)。
4CLi 甘蔗系的产生
使用甘蔗 ( 甘蔗属杂交种 ) 变种 CP88-1762 的未成熟的卷叶的横切面在补充了 20g/L 蔗糖和 13.6uM 2， 4-D， pH 调节为 5.8 的改良的 MS 基础培养基 (CI-3)(Chengalrayan 和 Gallo-Meagher， 2001) 上诱导愈伤组织。在诱导了愈伤组织后， 使用如以前描述的 PDS-1000/He 基因枪颗粒递送系统 (Bio-Rad)(James 等人， 2008) 进行基因枪基因转移。如 描述的使用遗传霉素进行选择 (Chengalrayan 和 Gallo-Meagher， 2001)， 但略加修改， 其中 对再生的植物进行了进一步的选择， 即将其在生根阶段在含有巴龙霉素 (30mg/L) 的 MS 基 础培养基中亚培养， 进行 4 次两周一次的亚培养。将发育出健康的根的选定的植物转移至 土壤并转移至温室。
转基因系的表征
在选择和再生植物以后， 通过 NPTII-ELISA 和 PCR 确认转基因甘蔗植物。使用 Pathoscreen nptII ELISA 试剂盒 (Agdia) 根据制造商的说明书进行总蛋白质提取和 NPTII-ELISA。使用 DNeasy Plant Mini 试剂盒 (Qiagen) 从每株再生的植物的展开的叶中 提取基因组 DNA。使用 75ng 基因组 DNA 作为 PCR 模板。为了检测每种表达构建体， 从每个 基因和启动子区设计引物如下 ： 用于 Sc4CL-Mi 和 Sc4CL-Li RNAi 构建体， 4CL SF(5’ -CATCA AGGGTACGGGATGAC-3’ (SEQ ID NO ： 21)) 和 OSPRO SR(5’ -GTAGCCTGCTAGTCTTCTCTCTCATT-3’ ( SEQ ID NO ： 22))。使用 iTaq 聚合酶 (Bio-Rad) 按如下条件进行 PCR ： 35 个循环的 95℃ 30 秒， 58 ℃ 30 秒和 72 ℃ 60 秒。用于 Northern 印迹分析， 从植物的第三片叶 ( 用于 4CL-Li 系 ) 和约 25cm 长的侧分蘖 ( 用于 4CL-Mi 系 ) 中提取总 RNA(Sambrook et at.， 1989)。在 相同的发育阶段从在与转基因植物相同的条件下培养的野生型植物中收集样品。 在电泳和 转移了 20ug 总 RNA 后， 使用来自靶向的 4CL 基因的开放阅读框的放射性标记的探针进行 Northern 杂交。
如 Browning(1967) 描述的分别从 4CL-Li 系和 4CL-Mi 系的衰老的叶和节间中使 用 Klason 程序在转基因甘蔗和非转基因 ( 野生型 ) 甘蔗植物中定量总木质素， 但略加修改 (Yoshihara 等人， 1984)。简单地说， 在研磨干样品 (0.5-1mm 筛选 ) 后， 用 50％的温热乙醇 提取样品以去除可溶性糖， 并干燥。然后， 使用 12M H2SO4 水解 0.1g 干细胞壁样品， 在 30℃ 进行 2 小时。用蒸馏水稀释内含物并高压灭菌 1 小时。高压灭菌后， 通过过滤收集不溶的 材料 ( 木质素和灰分 ) 并称重。然后在 500℃燃烧木质素 5 小时。在此步骤后， 称重灰分并 通过燃烧前和后的重量差异计算木质素。
本文提及和引用的所有专利、 专利申请、 临时申请和出版物以其整体引入作为参 考， 包括所有的图和表， 只要其不与本说明书的明确教导不一致。以下是说明用于实践本发明的程序的实施例。这些实施例不应被视为限制性的。 除非另外指出， 所有百分比是以重量计的， 且所有溶剂混合物比例是以体积计的。
实施例 1—— Sc4CL 基因的分离
在本研究中分离和表征了 2 个全长的和 1 个部分的甘蔗 4CL 基因的序列。 Sc4CL-N 和 Sc4CL-M 的 cDNA 序列具有 1665 和 1728 核苷酸的开放阅读框， 分别编码 555 和 576 氨基 酸的蛋白质。部分的 Sc4CL-L cDNA 序列长 616bp， 其包含 3’ UTR， 和 141 氨基酸残基的开 放阅读框。Sc4CL-N 和 Sc4CL-M 之间的配对比较显示 59％的相似性。Sc4CL-N 与以前鉴定 的 4CL 关联最紧密， 分别显示了与甜高粱的 Sb4CL 样 1 和稻的 Os4CL3 的 96％和 86％的相 似性， 而 Sc4CL-M 与 Sb4CL 样 1 和 Os4CL3 共有较低的相似性， 但其显示了与 Sb4CL 样 2 和 Os4CL3( 分别为 96％和 83％ ) 的较高的相似性。Sc4CL 与拟南芥 At4CL 的推断的氨基酸序 列的比较显示了范围从 60％ -63％的相似性 ( 表 2)。
Sc4CL 和已功能表征的其他 4CL、 白杨 Ptd4CL 和拟南芥 At4CL 之间的比对 ( 通过 CLUSTALW(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl ？ page ＝ /NPSA/npsa_ clustalw.html) 使用默认参数进行 ) 显示了保守的 AMP 结合基序 ( 见， 例如 SEQ ID NO ： 34， 35， 36， 37， 38， 39， 40， 41， 42， 和 43) 和特征基序 “GEICIRG” (SEQ ID NO ： 54)， 其被认为是底 物识别位点 (Ehlting 等人 2001)。系统发生分析显示， 在禾本科中的 4CL 基因家族成员可 被分为 2 个主要的在系统发生上有联系的群组， 组 I 和组 II。Sc4CL-N 和 Sc4CL-M 分别被 归为植物 4CL 组 I 和组 II。组 I 包括玉蜀黍 4CL2、 稻 4CL1、 拟南芥 4CL1、 黑麦草 4CL2、 白 杨 4CL3、 白杨 4CL1、 白杨 4CL2、 拟南芥 4CL2、 甜高粱 04g005210、 玉蜀黍 LOC542166 和玉蜀黍 ACF84437。组 II 包括稻 4CL2、 甜高粱 04g031010、 拟南芥 4CL3、 黑麦草 4CL1、 白杨 4CL4、 拟 南芥 4CL4、 稻 4CL3、 稻 4CL5、 甜高粱 10g026130、 黑麦草 4CL3 和稻 4CL4。
表 2.4CL 氨基酸序列之间的百分比相似性
Sc ： 甘蔗， Sb ： 甜高粱， Os ： 稻， At ： 拟南芥
实施例 2—— 4CL 基因的表达谱
甘蔗 4CL-M 主要在茎中表达， 而 Sc4CL-L 主要在叶中表达 ( 表 3)。这提示， 可以组 织特异性方式调控不同 4CL 基因的表达， 并提供了在特定组织中抑制木质素的机会。
表 3.Sc4CL 基因的组织和栽培品种特异性表达
-L、 S 和 N 分别表示叶、 茎和节。
实施例 3—— 4CL 下调的甘蔗的生成
RNAi 是用于作物改良和研究基因功能的有力工具。因此， 为了研究每个 4CL 基因 产物在木质素生物合成中的生理作用， 利用 Sc4CL 的序列信息生成了 4CL 下调的甘蔗， 生 成了 2 个靶向 Sc4CL-L 和 Sc4CL-M 基因的不同区域的、 处于木质部特异性启动子、 稻香豆 酸 -4- 羟化酶 (C4H) 启动子 (Fouad 和 Altpeter， 尚未发表 ) 和 CaMV 35S 多聚腺苷酸信号 控制下的 RNA 抑制构建体 (SEQ ID NO ： 4 和 SEQ ID NO ： 5)。使用基因枪基因转移， 将生成 的具有处于具有第一内含子、 35S 3’ UTR 的强组成型玉米泛素启动子 (pUbi) 调控下的可选 择的 nptII 基因的抑制盒各自或同时共同引入胚发生甘蔗愈伤组织。当生成若干转基因系 时， 使用 nptII/ 遗传霉素和巴龙霉素选择系统进行转基因事件的选择。
利用 2 个生成的抑制盒进行了共 88 次轰击， 并在愈伤组织选择后再生了 160 株植 物。使用 Pathoscreen nptII ELISA 试剂盒 ( 表 4)， 152 株独立的植物显示了 NPTII 表达。 使用 PCR 确认了在转基因植物的基因组 DNA 中 4CL-RNAi 抑制盒的存在 ( 表 4)。
在转基因甘蔗植物中的甘蔗 4CL 的表达分析指示了相比非转基因 (WT) 甘蔗， 在若 干转基因甘蔗植物中 Sc4CL-L( 表 5) 和 Sc4CL-M 基因 ( 表 6) 的抑制。
表 4. 转基因 4CLi 甘蔗的总结
NA ＝未分析的 表 5. 在甘蔗 4CL-Li 转基因植物的衰老的叶中的 4CL-L 基因表达水平和木质素含量
1- 相对 WT 表达 (100％ ) 的基于 RNA 印迹分析的表达 2-2-3 次生物学重复的平均值， 通过分析相同基因型的 2-3 株个体植物生成。 表 6. 在甘蔗 4CL-Mi 转基因植物的未成熟的节间中的 4CL-M 基因表达水平和木质素含量
1- 基于相对 WT 表达 (100％ ) 的 RNA 印迹分析的表达
2-2 次生物学重复的平均值， 通过分析相同基因型的 2 株个体植物生成。
实施例 4- 具有减少的木质素的甘蔗的生成
根据标准方案在品系中使用 Klason 程序在 4CL-Li 转基因植物和非转基因甘蔗的 衰老的叶中定量总木质素。如在表 5 中所示， Klason 木质素在非转基因甘蔗植物的衰老的 叶中为约 23.6％。相对而言， 具有 4CL-L 基因抑制的转基因系 14-2A 在衰老的叶中具有平 均 21％的 Klason 木质素 ( 表 5)， 表明通过 4CL-L 抑制总木质素减少了 11％。也在 4CL-Mi 系 ( 表 6) 和野生型植物中的未成熟的节间中分析了木质素。品系 4a 展示了相比野生型植 物的约 8％的总木质素的减少。品系 5b-A1 也显示了类似水平的木质素减少 ( 表 6)。预期 在成熟的节间中在这些转基因 4CL-Mi 植物中的更高的木质素减少， 在成熟的节间中非转 基因植物的木质素含量增加至超过 20％。
实施例 5—— 4CLM 表达的定量 PCR 分析
定量实时 RT-PCR 分析确认了在若干转基因系中的 4CLM 抑制。 表 7 显示了 4CLM 基 因相对参考基因 ( 甘蔗 GAPDH) 的相对表达比例。表 7 显示了在包括品系 4A 和 5BA1 的转 基因甘蔗系中的 4CLM 转录物的强抑制。收获发育匹配的侧分蘖并从第一节间提取总 RNA。 从 3’ UTR 设计 4CLM 基因特异性引物。平行进行所有反应， 且一式三份进行每个反应。使用 Q- 基因软件计算标准误。
表 7.4CLM 表达的定量 PCR 分析
实施例 6——植物 4CL 基因间的进化趋异的估计
在表 8 中显示了甘蔗 4CL 和其他植物 4CL 间的分析中的每个位点上的氨基酸取代 数。所有结果基于氨基酸序列的配对分析。使用 MEGA4(Zuckerkandl 和 Pauling(1965) ； Tamura 等人 (2007)) 中的泊松校正法进行分析。 从数据集中去除含有缺口和缺失数据的所 有位置 ( 完全缺失选项 )。在最终的数据集中共有 513 个位置。
表 8. 植物 4CL 间的进化趋异的估计
Sc ： 甘蔗， Sb ： 甜高粱， Zm ： 玉蜀黍， At ： 拟南芥， Lp ： 黑麦草， Os ： 稻， Po ： 白杨杂种 ( 毛果杨 (Populus trichocarpa)x 美洲黑杨 (Populusdeltoids))
表 8 继续
Sc ： 甘蔗， Sb ： 甜高粱， Zm ： 玉蜀黍， At ： 拟南芥， Lp ： 黑麦草， Os ： 稻， Po ： 白杨杂种 ( 毛果杨 (Populus trichocarpa)x 美洲黑杨 (Populusdeltoids))
表 8 继续
Sc ： 甘蔗， Sb ： 甜高粱， Zm ： 玉蜀黍， At ： 拟南芥， Lp ： 黑麦草， Os ： 稻， Po ： 白杨杂种 ( 毛果杨 (Populus trichocaroa)x 美洲黑杨 (Populusdeltoids))
应当理解， 本文描述的实施例和实施方案仅是为了说明的目的， 对本领域技术人 员建议根据其的多种修改或变化， 且这些修改和变化将被包括在本申请的精神和范围内和 随附的权利要求书的范围内。另外， 本文公开的任意发明或其实施方案的任意元素或限制 可与本文公开的任意其他发明或其实施方案的任意和 / 或所有其他元素或限制 ( 分别地或 以任意组合 ) 组合， 且所有这些组合视为在本发明的范围内， 而不加限制。
参考文献
美国专利号 4,761,373
美国专利号 4,769,061
美国专利号 4,810,648
美国专利号 4,940,835 美国专利号 4,945,050 美国专利号 4,975,374 美国专利号 4,987,071 美国专利号 5,013,659 美国专利号 5,023,179 美国专利号 5,034,322 美国专利号 5,036,006 美国专利号 5,093,246 美国专利号 5,100,792 美国专利号 5,106,739 美国专利号 5,116,742 美国专利号 5,162,602 美国专利号 5,256,558 美国专利号 5,270,163 美国专利号 5,276,268 美国专利号 5,304,730 美国专利号 5,495,071 美国专利号 5,554,798 美国专利号 5,561,236 美国专利号 5,569,823 美国专利号 5,582,981 美国专利号 5,589,610 美国专利号 5,591,616 美国专利号 5,595,877 美国专利号 5,599,672 美国专利号 5,625,136 美国专利号 5,639,948 美国专利号 5,661,017 美国专利号 5,723,763 美国专利号 5,767,366 美国专利号 5,817,785 美国专利号 5,879,903 美国专利号 5,928,937 美国专利号 6,084,155 美国专利号 6,329,504 美国专利号 6,337,431 美国专利号 6,344,318 美国专利号 6,455,760美国专利号 6,462,185
美国专利号 6,506,559
美国专利号 6,696,623
美国专利号 6,933,116
美国专利号 7,056,704
美国专利号 7,078,196
美国专利号 7,232,086
美国专利号 7,282,564
美国专利号 7,365,058
美国专利号 7,368,236
美国专利号 7,538,095
美国专利号 7,700,759
美国专利号 7,723,575
美国公开的申请号 20010016956
美国公开的申请号 20030084486
美国公开的申请号 20030177536
美国公开的申请号 20040019934
美国公开的申请号 20040067506
美国公开的申请号 20040078841
美国公开的申请号 20040123349
美国公开的申请号 20060260011
美国公开的申请号 2007006346
美国公开的申请号 20090031441
美国公开的申请号 20090199307
PCT 公开的申请号 WO 93/07278
PCT 公开的申请号 WO 93/21335
EP 0242246
EP 0292435
EP 0392225
EP 138341
EP 295959
Agrawal 等 人 (2003)Microbiology and Molecular Biology Reviews， 67(4) ： 657-685.
Altschul， S.F. 等 人 (1990)“Basic Local Alignment Search Tool” J.Mol. Biol.215 ： 403-410.
Altschul， S.F. 等人 (1997)“Gapped BLAST and PSI-BLAST ： A NewGeneration of Protein Database Search Programs” Nucl.AcidsRes.25 ： 3389-3402.
Bartel， D. 和 Szostak， J.W.Science 261 ： 1411-1418(1993).
Bassett， C.L.， Callahan， A.， Artlip， T.， Scorza， R.Srinivasan， C.(2007)“Aminimal peach type II chlorophyll a/b-binding proteinpromoter retains tissue-specificity and light regulation intomato” BMC Biotechnol.， 7： 47.
Beltz ，G.A. ，Jacobs ，K.A. ，Eickbush ，T.H. ，Cherbas ，P.T. ，Kafatos ， F.C.(1983)“Isolation of multigene families and determinationof homologies by filter hybridization methods” Methods ofEnzymology， R.Wu， L.Grossman 和 K.Moldave[eds.]AcademicPress， New York 100 ： 266-285.
B e v a n ，M . ( 1 9 8 4 ) “ B i n a r y A g r o b a c t e r i u m v e c t o r s f o r planttransformation” Nucl.Acids Res.， 12(22) ： 8711-21.
Browning， B.L.1967.Methods of wood chemistry.Wiley-Interscience， New York.
Brusslan， J.A. 和 Tobin， E.M.(1992)“Light-independentdevelopmental regulation of cab gene expression in Arabidopsisthaliana seedlings” Proc Natl Acad Sci USA， 89(16) ： 7791-5.
Bustos 等人 (1989)Plant Cell， 1： 839-854.
Chandler 等 人 (1989)“Two Regulatory Genes of the Maize AnthocyaninPathway Are Homologous ： Isolation of B Utilizing R GenomicSequences” The Plant Cell， 1： 1175-1183. Chengalrayan， K. 和 Gallo-Meagher， M.(2001)“Effect of variousgrowth regulators on shoot regeneration of sugarcane” In VitroCell.Dev.Biol.Plant， 37 ： 434 439.
Clancy， M. 和 Hannah， L.C.(2002)“Splicing of the maize Sh1 firstintron is essential for enhancement of gene expression， and aT-rich motif increases expression without affecting splicing” Plant Physiol.130(2) ： 918-29.
Deblaere， R.， Reynaerts， A.， Hofte， H.， Hernalsteens， J.-P.， Leemans， J.， 和 Van Montagu， M.(1987)“Vectors for cloning in plantcells” Methods Enzymol.， 153 ： 77-292.
Doran， T. 和 Helliwell， C.(2009)RNA interference ： Methods forplants and animals ； Publisher ： CABI， Wallingford， UK.Ebert 等人 (1987)Proc.Nat′ l Acad.Sci. USA.84 ： 5745-5749.
Ehlting， J.， Buttner， D.， Wang， Q.， Douglas， C.J.， Somssich， I.， 和 Kombrink， E.(1999).Three 4-coumarate ： coenzyme A ligasesin Arabidopsis thaliana represent two evolutionarily divergentclasses in angiosperms.Plant J.19， 920.
Ellington， A.D. 和 Szostak， J.W.(1990) “In vitro selection of RNAmolecules that bind specific ligands” Nature， 346(6287) ： 818-822.
Fromm 等人 Biotechnology 8 ： 833-839(1990).
Good， X. 等人 (1994)“Reduced ethylene synthesis by transgenictomatoes expressing S-adenosylmethionine hydrolase” PlantMolec.Biol.26 ： 781-790.
Gordon-Kamm 等人 PlANt Cell 2 ： 603-618(1990).
Green 等人， EMBO J.， 7： 4035-4044(1988).
Haselhoff 和 Gerlach Nature 334 ： 585-591(1988).
Hofgen&Willmitzer， Nucl.Acids Res.16 ： 9877(1988).
Hoppe-Seyler， F. 和 Butz， K.(2000)“Peptide aptamers ： powerful newtools for molecular medicine” J.Mol.Med.， 78(8) ： 426-430.
Hudspeth 等人 (1989)Plant Mol.Biol.， 12 ： 579-589.
James VA， Neibaur I， Altpeter F ： Stress inducible expression of theDREB1A transcription factor from xeric， Hordeum spontaneum L.in turf and forage grass(Paspalum notatum Flugge)enhancesabiotic stress tolerance.Transgenic Res 2008， 17 ： 93-104.
Jordano 等人， Plant Cell， 1： 855-866(1989).
Karlin S.， Altschul， S.F.(1990)“Methods for Assessing theStatistical Significance of Molecular Sequence Features byUsing General Scoring Schemes” Proc.Natl.Acad.Sci.USA87 ： 2264-2268.
Karlin S.， Altschul， S.F.(1993) “Applications and Statistics forMultiple High-Scoring Segments in Molecular Sequences” Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90 ： 5873-5877. Klein 等人 (1987)Nature 327 ： 70-73.
Koziel 等人 (1993)Biotechnology 11 ： 194-200.
Kusaba(2004)Current Opinion in Biotechnology， 15 ： 139-143.
Kwon 等人 (1994)Plant Physiol.105 ： 357-67.
Lawton 等人 (1987)Plant Mol.Biol.9 ： 315-324.
Maniatis ， T. ， Fritsch ， E.F. ， Sambrook ， J.(1982)Molecular Cloning ： A Laboratory Manual， Cold Spring Harbor Laboratory， Cold SpringHarbor， NY.
Matsuoka 等人 (1993) “Tissue-specific light regulatedexpression directed by the promoter of a C4 gene， maize pyruvate， orthophosphate dikinase， in a C3 plant， rice” PNAS USA， 90(20) ： 9586-90.
Matsuoka 等人 (1994)Plant J.6 ： 311-319.
Mayo， O.(1987)The Theory of Plant Breeding， Second Edition， Clarendon Press， Oxford.
Meier 等人 (1991)Plant Cell， 3： 309-316.
Milhavet 等人 (2003)Pharmacological Reviews， 55(4) ： 629-648.
Odell 等人 (1985)Nature 313 ： 810-812.
Paszkowski 等人 (1984)EMBO J.3 ： 2717-2722.
Potrykus 等人 (1985)Mol.Gen.Genet.199 ： 169-177.
Reich 等人 (1986)Biotechnology 4 ： 1001-1004.
Richins 等人 (1987)Nucleic Acids Res.20 ： 8451.
Sambrook， J.， Fritsch， E.F.， 和 Maniatis， T.(1989)Molecular Cloning ： A Laboratory Manual. 卷 1 和 3.Cold Spring Harbor LaboratoryPress， Cold Spring Harbor， NY.
Singh， D.P.(1986)Breeding for Resistance to Diseases and InsectPests， Springer-Verlag， NY.
Sullivan 等 人 (1989)“Isolation and characterization of a maizechlorophyll a/b binding protein gene that produces high levelsof mRNA in the dark” Mol.Gen.Genet.， 215(3) ： 431-440.
Tamura K.， Dudley J.， Nei M.， 和 Kumar S(2007)MEGA4 ： MolecularEvolutionary Genetics Analysis(MEGA)software version 4.0.Molecular Biology and Evolution 24 ： 1596-1599.
Theander， O.， 和 E.A.Westerlund(1986).Studies on dietary fiber.3.Improved procedures for analysis of dietary fiber.J.Agric.Food Chem.34 ： 330 336
Uknes 等人 (1993)Plant Cell 5 ： 159-169.
Walker 等人 (1987)Proc.Nat′ l Acad.Sci.USA， 84 ： 6624-6628.
Wang 等 人 (1992)“Characterization of cis-Acting ElementsRegulating Transcription from the Promoter of a ConstitutivelyActive Rice Actin Gene” Molecular and Cellular Biology， 12(8) ： 3399-3406.
Welsh J.R.(1981)Fundamentals of Plant Genetics and Breeding ， JohnWiley&Sons， NY.
Wood D.R.(1983)(Ed.)Crop Breeding， American Society of AgronomyMadison， Wis.
Wricke 和 Weber(1986)Quantitative Genetics and Selection PlantBreeding， Walter de Gruyter and Co.， Berlin.
www.lifesci.sus sex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/
Xu， D.， McElroy， D.， Thornburg， R.W.， Wu， R. 等人 (1993)“Systemicinduction of a potato pin2 promoter by wounding， methyljasmonate， and abscisicacid in transgenicrice plants” PlantMolecular Biology 22 ： 573-588.
Yamamoto 等人 (1994)Plant Cell Physiol.35 ： 773-778.
Yamamoto 等人 (1997)Plant J.12(2) ： 255-265.
Yang 等人 (1990)Proc.Nat′ l Acad.Sci.USA， 87 ： 4144-4148.
Yang， T.T. 等人 (1996)“Optimized Codon Usage and ChromophoreMutations Provide Enhanced Sensitivity with the GreenFluorescent Protein” Nucleic Acid Research 24(22) ： 4592-4593.
Y o s h i h a r a ，K . ，T . K o b a y a s h i ，T . F u j i i ， 和 I . A k a m a t s u ( 1 9 8 4 ) . A novelmodification of Klason lignin quantitative method.J.JapanTappi 38 ： 86 95.
Zhang 等人 (1996)Plant Physiology， 110 ： 1069-1079.
Zubieta， C， Kota， P， Ferrer， J.L.， Dixon， R.A.， Noel， J.P.(2002)“Structural basis for the modulation of lignin monomermethylation by caffeic acid/5-hydroxyferulic acid3/5-O-methyltransferase” Plant Cell.， 14(6) ： 1265-77.
本申请要求享有在 2009 年 6 月 5 日提交的美国临时申请序列号 61/217,950 的权 益， 在此以其整体引入作为参考， 包括任意图、 表、 核酸序列、 氨基酸序列和附图。
政府支持
此申请的主题得到 USDA-CSRRES 研究基金 (grant) 的支持， 基金号 00075788。因 此， 政府在此发明中具有一定权利。
发明背景
甘蔗是出产生物质最高的生产者。通常， 农民通过露天燃烧减少甘蔗采割期后的 叶残留物， 这对空气质量具有负面影响。在经酸水解预处理以去除作为酶水解的物理屏障 的木质素后， 可从甘蔗叶残留物中制造燃料级乙醇。因此， 下调木质素生物合成途径的酶 是提高从半纤维素甘蔗残留物中生产生物乙醇的效率的有前景的策略。在木质素途径中， 4- 香豆酸 -CoA 连接酶 (4CL) 是一种关键酶， 其催化 4- 香豆酸和其他羟基肉桂酸的 CoA 硫 酯的形成。然而， 甘蔗具有复杂的多倍体基因组， 且这些基因属于一个大基因家族。其广泛 的底物特异性使鉴定特异性参与木质素生物合成的直向同源物很困难。因此， 在本领域中 存在这样的需要， 即抑制甘蔗中木质素生物合成的手段。
发明概述
本发明涉及调节甘蔗植物中木质素生物合成的材料和方法。在一个方面， 下调了 木质素生物合成。可被靶向从而实现在甘蔗中木质素的下调的基因及其编码的蛋白质包 括， 例如 4- 香豆酸 -CoA 连接酶 (4CL)。在特定的实施方案中， 4CL 基因是 4CL-M， 4CL-N， 或 4CL-L。在另一个实施方案中， 在甘蔗植物的茎组织中减少或下调木质素生物合成。使用本 领域已知的标准技术， 可抑制或下调一种或多种靶基因的表达。 在特定的实施方案中， 抑制 或下调 4CL-L 基因的表达。
本发明也涉及木质素生物合成已被下调的甘蔗植物、 植物组织和植物细胞。在特 定的实施方案中， 在甘蔗植物中抑制或下调一种或多种 4CL 基因的表达。
本发明也涉及产生具有减少的或下调的木质素生物合成的甘蔗植物的方法。 在一 个实施方案中， 在甘蔗植物的叶组织中减少或下调木质素生物合成。 在另一个实施方案中， 在甘蔗植物的茎组织中减少或下调木质素生物合成。在一个实施方案中， 本发明的方法包 括抑制或遏制一种或多种 4CL 基因的表达。在一个实施方案中， 使用反义核酸或 RNA 干扰 抑制所述基因。
序列简述
SEQ ID NO ： 1 是本发明的 4CL-L 基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO ： 2 是本发明的 4CL-M 基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO ： 3 是本发明的 4CL-N 基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO ： 4 是本发明的 Sc4CL-Li RNAi 构建体的核苷酸序列。
SEQ ID NO ： 5 是本发明的 Sc4CL-Mi RNAi 构建体的核苷酸序列。
SEQ ID NO ： 6 是 SEQ ID NO ： 1 编码的氨基酸序列。
本发明涉及调节甘蔗植物中木质素生物合成的材料和方法。在一个方面， 下调了 木质素生物合成。可被靶向从而实现在甘蔗中木质素的下调的基因及其编码的蛋白质包 括， 例如 4- 香豆酸 -CoA 连接酶 (4CL)。在特定的实施方案中， 4CL 基因是 4CL-M， 4CL-N， 或 4CL-L。在另一个实施方案中， 在甘蔗植物的茎组织中减少或下调木质素生物合成。使用本 领域已知的标准技术， 可抑制或下调一种或多种靶基因的表达。 在特定的实施方案中， 抑制 或下调 4CL-L 基因的表达。
本发明也涉及木质素生物合成已被下调的甘蔗植物、 植物组织和植物细胞。在特 定的实施方案中， 在甘蔗植物中抑制或下调一种或多种 4CL 基因的表达。
本发明也涉及产生具有减少的或下调的木质素生物合成的甘蔗植物的方法。 在一 个实施方案中， 在甘蔗植物的叶组织中减少或下调木质素生物合成。 在另一个实施方案中， 在甘蔗植物的茎组织中减少或下调木质素生物合成。在一个实施方案中， 本发明的方法包 括抑制或遏制一种或多种 4CL 基因的表达。在一个实施方案中， 使用反义核酸或 RNA 干扰 抑制所述基因。
序列简述
SEQ ID NO ： 1 是本发明的 4CL-L 基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO ： 2 是本发明的 4CL-M 基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO ： 3 是本发明的 4CL-N 基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO ： 4 是本发明的 Sc4CL-Li RNAi 构建体的核苷酸序列。
SEQ ID NO ： 5 是本发明的 Sc4CL-Mi RNAi 构建体的核苷酸序列。
SEQ ID NO ： 6 是 SEQ ID NO ： 1 编码的氨基酸序列。
SEQ SEQ SEQ SEQ SEQ SEQ SEQ SEQ SEQ SEQ SEQ SEQ SEQ SEQ SEQID ID ID ID ID ID ID ID ID ID ID ID ID ID IDNO ： 7 是 SEQ ID NO ： 2 编码的氨基酸序列。 NO ： 8 是 SEQ ID NO ： 3 编码的氨基酸序列。 NO ： 9 是拟南芥 (Arabidopsis thaliana)4CL1 的氨基酸序列。 NO ： 10 是拟南芥 4CL2 的氨基酸序列。 NO ： 11 是拟南芥 4CL3 的氨基酸序列。 NO ： 12 是拟南芥 4CL4 的氨基酸序列。 NO ： 13 是白杨 (Poplar)4CL1 的氨基酸序列。 NO ： 14 是白杨 4CL2 的氨基酸序列。 NO ： 15 是白杨 4CL3 的氨基酸序列。 NO ： 16 是白杨 4CL4 的氨基酸序列。 NO ： 17 是基于 4CL-L 的部分基因组 DNA 序列的基因特异性引物。 NO ： 18 是基于 4CL-L 的部分基因组 DNA 序列的基因特异性引物。 NO ： 19 是用于 4CL-N 的正向引物。 NO ： 20 是用于 4CL-N 的反向引物。 NO ： 21 是用于 4CL-M 和 4CL-L RNAi 构建体的正向引物。SEQ ID NO ： 22 是用于 4CL-M 和 4CL-L RNAi 构建体的反向引物。
SEQ ID NO ： 23 是甜高粱 (Sorghum bicolor)04g005210(XP_002451647) 的 4CL 多 肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO ： 24 是甜高粱 10g026130(XP_002438783) 的 4CL 多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO ： 25 是甜高粱 04g031010(XP_002452704) 的 4CL 多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO ： 26 是玉蜀黍 (Zea mays)LOC542166(NP_001105258) 的 4CL 多肽的氨 基酸序列。
SEQ ID NO ： 27 是黑麦草 (Lolium perenne)4CL3(AAF37734) 的 4CL 多肽的氨基酸 序列。
SEQ ID NO ： 28 是黑麦草 4CL2(AAF37733) 的 4CL 多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO ： 29 是黑麦草 4CL1(AAF37732) 的 4CL 多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO ： 30 是稻 (Oryza sativa)4CL3(NP_001046069) 的 4CL 多肽的氨基酸序 列。
SEQ ID NO ： 31 是稻 4CL4(NP_001058252) 的 4CL 多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO ： 32 是稻 4CL1(NP_001061353) 的 4CL 多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO ： 33 是稻 4CL2(NP_001047819) 的 4CL 多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO ： 34 显示了拟南芥 4CL1 的保守的 AMP 结合基序。
SEQ ID NO ： 35 显示了拟南芥 4CL2 的保守的 AMP 结合基序。
SEQ ID NO ： 36 显示了拟南芥 4CL3 的保守的 AMP 结合基序。
SEQ ID NO ： 37 显示了拟南芥 4CL4 的保守的 AMP 结合基序。
SEQ ID NO ： 38 显示了白杨 4CL1 的保守的 AMP 结合基序。
SEQ ID NO ： 39 显示了白杨 4CL2 的保守的 AMP 结合基序。
SEQ ID NO ： 40 显示了白杨 4CL3 的保守的 AMP 结合基序。
SEQ ID NO ： 41 显示了白杨 4CL4 的保守的 AMP 结合基序。SEQ ID NO ： 42 显示了甘蔗 4CL1 的保守的 AMP 结合基序。
SEQ ID NO ： 43 显示了甘蔗 4CLM 的保守的 AMP 结合基序。
SEQ ID NO ： 44 显示了拟南芥 4CL1 的特征基序。
SEQ ID NO ： 45 显示了拟南芥 4CL2 的特征基序。
SEQ ID NO ： 46 显示了拟南芥 4CL3 的特征基序。
SEQ ID NO ： 47 显示了拟南芥 4CL4 的特征基序。
SEQ ID NO ： 48 显示了白杨 4CL1 的特征基序。
SEQ ID NO ： 49 显示了白杨 4CL2 的特征基序。
SEQ ID NO ： 50 显示了白杨 4CL3 的特征基序。
SEQ ID NO ： 51 显示了白杨 4CL4 的特征基序。
SEQ ID NO ： 52 显示了甘蔗 4CL1 的特征基序。
SEQ ID NO ： 53 显示了甘蔗 4CLM 的特征基序。
SEQ ID NO ： 54 显示了 4CL 基因的共同的特征基序。
发明详述
本发明涉及调节植物 ( 特别是甘蔗植物 ) 中木质素生物合成的材料和方法。在一 个实施方案中， 在植物中下调了木质素生物合成。本发明设想使用可用于抑制或降低基因 表达 ( 包括在转录、 转录后和翻译水平上 ) 和 / 或基因编码的蛋白质的功能或活性的任何 方法。可被靶向从而实现甘蔗中木质素生物合成的下调的基因及其编码的蛋白质包括， 但 不限于， 4- 香豆酸 -CoA 连接酶 (4CL)。在一个实施方案中， 4CL 基因编码包含 AMP 结合基 序序列 ( 例如 SEQ ID NO ： 34) 和 / 或 SEQ ID NO ： 54 的特征基序序列的 4CL 多肽。在一个 实施方案中， 4CL 基因是 4CL-M， 4CL-L， 或 4CL-N。在一个实施方案中， 4CL-L 基因编码具有 SEQ ID NO ： 6 中所示的氨基酸序列的多肽， 或其片段或变体。在另一个实施方案中， 4CL-M 基因编码具有 SEQ IDNO ： 7 中所示的氨基酸序列的多肽， 或其片段或变体。在另一个实施 方案中， 4CL-N 基因编码具有 SEQ ID NO ： 8 中所示的氨基酸序列的多肽， 或其片段或变体。 在特定的实施方案中， 4CL-L 基因包含 SEQ ID NO ： 1 中所示的核苷酸序列的全部或部分， 和 4CL-M 基因包含 SEQ ID NO ： 2 中所示的核苷酸序列的全部或部分。在特定的实施方案中， 4CL-N 基因包含 SEQ ID NO ： 3 中所示的核苷酸序列的全部或部分。
使用本领域已知的标准技术， 可抑制或下调甘蔗植物中一种或多种靶基因的表 达。在一个实施方案中， 在叶细胞和 / 或组织中选择性下调木质素生物合成。在特定的实 施方案中， 抑制或下调一种或多种 4CL 基因的表达和 / 或 4CL 基因编码的蛋白质的翻译或 功能。在一个实施方案中， 4CL 基因编码包含 AMP 结合基序序列 ( 例如 SEQ ID NO ： 34) 和 / 或 SEQ ID NO ： 54 的特征基序序列的 4CL 多肽。 在更特定的实施方案中， 抑制或下调 4CL-M， 4CL-L， 和 / 或 4CL-N 基因的表达。 在一个实施方案中， 使用反义技术下调靶基因的表达。 在 另一个实施方案中， 可使用共抑制技术抑制或下调靶基因的表达。 在另一个实施方案中， 使 用 RNA 干扰 (RNAi) 技术下调靶基因的表达， 包括例如使用短干扰 RNA(siRNA)。 在另一个实 施方案中， 可在本发明的甘蔗植物中提供靶基因的突变， 例如 “敲除” 突变。也可抑制靶基 因编码的蛋白质的表达和 / 或活性 ( 例如酶活性 )， 例如通过使蛋白质接触结合蛋白质并阻 碍其功能活性的抗体或适体。
可使用反义技术抑制参与甘蔗中木质素生物合成的靶基因的表达。在反义方法中， 在植物细胞中提供与靶基因的 mRNA 的核苷酸序列杂交的核酸。可在甘蔗植物的基因组 中掺入 ( 例如稳定地 ) 在表达时提供与 mRNA 杂交的核酸的核酸构建体。反义核酸可与靶 序列的整条编码链、 或其部分、 或靶序列的非编码部分、 或靶序列的编码和非编码两部分杂 交。反义构建体可与同反义核酸杂交的 mRNA 的部分具有例如至少约 70％、 至少约 75％、 至少约 80％、 至少约 85％、 至少约 90％、 至少约 95％、 至少约 96％、 97％、 98％或 99％的序 列同一性， 或高达 100％的序列同一性。反义核酸可包含任意合适的核苷酸数。例如， 本发 明的反义核酸构建体可包含至少 5， 6， 7， 8， 9， 10， 11， 12， 13， 14， 15， 16， 17， 18， 19， 20， 21， 22， 23， 24， 25， 26， 27， 28， 29， 30， 31， 32， 33， 34， 35， 36， 37， 38， 39， 40 或更多个核苷酸。在一个实 施方案中， 反义核酸包含至少约 40、 或至少约 50、 或至少约 60、 或至少约 70、 或至少约 80、 或 至少约 90、 或至少约 100、 或至少约 150、 或至少约 200、 或至少约 250、 或至少约 300、 或至少 约 350、 或至少约 400、 或至少约 450、 或至少约 500、 或至少约 550、 或至少约 600 或更多个核 苷酸。在一个实施方案中， 反义构建体在植物的叶细胞和 / 或组织中选择性表达， 例如通过 使用叶特异性启动子。下调或抑制靶基因表达的反义方法是本领域已知的。可从用核酸构 建体转化的和 / 或掺入核酸构建体的细胞培养包含和表达反义核酸构建体的植物。
也可使用共抑制或转录后基因沉默 (PTGS) 技术抑制参与甘蔗中木质素生物合成 的靶基因的表达。大体上， 在植物细胞中以正向和在适于核酸表达的构建体中 ( 例如， 包 含与能够在植物细胞中驱动转录的启动子序列有效连接的核酸的构建体 ) 提供对应靶基 因序列且与其具有序列同源性的核酸序列。核酸可与靶基因序列具有例如至少约 70％、 至 少约 75％、 至少约 80％、 至少约 85％、 至少约 90％、 至少约 95％、 至少约 96％、 97％、 98％或 99％的序列同一性， 或高达 100％的序列同一性。在一个实施方案中， 核酸构建体在植物的 叶细胞和 / 或组织中选择性表达， 例如通过使用叶特异性启动子。可从用核酸构建体转化 的和 / 或掺入核酸构建体的细胞培养包含和表达核酸构建体的植物。
也可使用 RNA 干扰 (RNAi) 技术抑制参与甘蔗中木质素生物合成的靶基因的表达。 在 RNAi 中， 在植物细胞中提供与靶基因表达的 mRNA 的全部或部分互补的双链 RNA 分子。 双 链 RNA 分子被加工为较小的 RNA 分子， 其然后被加工进沉默复合物， 所述沉默复合物导致靶 基因表达的抑制， 例如通过切割靶基因 mRNA。大体上， RNAi 分子具有 100 或更多个核苷酸， 更典型地具有 200 或更多个核苷酸。 可通过在细胞中引入和表达导致 RNAi 分子转录和产生 的核酸构建体提供 RNAi 分子。在一个实施方案中， 通过表达提供微 RNA(miRNA) 的核酸的 RNA 干扰视为包含在本发明的范围内。 miRNA 一般是已经从包含发夹结构的较长的前体 RNA 上被加工的 19-23 个核苷酸的 RNA。 在另一个实施方案中， 通过表达提供短干扰 RNA(siRNA) 的核酸的 RNA 干扰视为包含在本发明的范围内。 siRNA 一般是已经从较长的前体双链 RNA 上 被加工的具有 3’ 突出端的 20-25 个核苷酸的 RNA。 可从用提供 RNAi 分子的多核苷酸分子转 化的和 / 或掺入上述多核苷酸分子的细胞培养包含和表达 RNAi 分子 ( 包括 miRNA 和 siRNA) 的植物。在例如美国专利号 7,056,704 ； 7,078,196 ； 7,365,058 ； 7,232,086 ； 6,506,559 ； 7,282,564 ； 和 7,538,095 中已描述了用于 RNA 干扰的方法和材料， 并在 Milhavet 等人 (2003) ； Agrawal 等人 (2003) ； Kusaba(2004) ； 以及 Doran 和 Helliwell(2009) 中综述。在 一个实施方案中， 本发明的用于抑制植物中的 4CL 基因表达的 RNAi 构建体包含 SEQ ID NO ： 4 或 SEQ ID NO ： 5 的核苷酸序列的全部或部分。在特定的实施方案中， 在植物的叶细胞和 / 或组织中选择性表达 RNAi 分子， 例如通过使用叶特异性启动子。也可使用核酶技术抑制参与甘蔗中木质素生物合成的靶基因的表达。 核酶是一类 RNA， 其可被设计为以特异性的序列依赖性方式酶促切割和失活其他 RNA 靶。通过切割靶 RNA， 核酶抑制翻译， 因此阻止靶基因的表达。使用本领域已知的方法可在实验室化学合成 核酶并在结构上改造以提高其稳定性和催化活性。通过本领域已知的基因递送机制， 可将 编码核酶的核苷酸序列引入植物细胞并掺入植物基因组。可从用核酶编码序列转化的和 / 或掺入核酶编码序列的细胞培养包含和表达核酶编码序列的植物。具有对 4CL 的特异性的 核酶可包括与一种或多种 4CL mRNA 的至少一部分的核苷酸序列互补的一种或多种序列， 和 具有已知的负责 mRNA 切割的催化序列的序列 ( 见美国专利号 5,093,246 或 Haselhoff 等 人 1988)。例如， 可构建四膜虫 (Tetrahymena)L-19 IVS RNA 的衍生物， 其中活性位点的核 苷酸序列与将要在 4CL mRNA 中切割的核苷酸序列互补 ( 见例如美国专利号 4,987,071 ； 和 美国专利号 5,116,742)。可选地， 可使用编码 4CL 蛋白质的 4CL mRNA 从 RNA 分子库中选择 具有特定核糖核酸酶活性的催化 RNA( 见例如 Bartel 等人 1993)。 在一个实施方案中， 在植 物的叶细胞和 / 或组织中选择性表达核酶， 例如通过使用叶特异性启动子。
除了抑制参与甘蔗中的木质素生物合成的靶基因以外， 本发明还设想在靶基因中 的突变， 或其中可对植物细胞提供突变的基因， 在所述植物细胞中靶基因表达或基因产物 水平或活性被降低或抑制。在一个实施方案中， 将突变的 4CL 基因掺入甘蔗植物的基因组， 其中突变的 4CL 基因展示基因转录物或其翻译的减少的或无表达。在一个实施方案中， 在 植物的 4CL 基因中引入突变， 所述突变导致 4CL 基因的转录减少， 或 mRNA 的翻译减少， 和/ 或导致展示降低的酶活性的蛋白质。在特定的实施方案中， 在 4CL 基因的蛋白质编码区引 入一种或多种突变。在另一个实施方案中， 在 4CL 基因转录起始位点的上游和 / 或转录起 始位点的下游引入突变。在一个实施方案中， 在 4CL 基因调控序列中或附近， 例如在启动子 序列中引入突变。突变可阻碍或抑制 4CL 基因序列的转录， 例如通过阻碍或抑制转录因子 或聚合酶结合 4CL 核酸序列。在一个实施方案中， 在植物的叶细胞和 / 或叶组织中选择性 引入 4CL 基因中的突变。突变也可包括抑制或降低 4CL 多肽的功能活性 ( 例如酶活性 ) 的 一种或多种核苷酸或氨基酸插入、 缺失和 / 或取代。创造和引入突变的方法是本领域已知 的。在一个实施方案中， 在植物中的一个或多个野生型 4CL 基因中引入突变。在另一个实 施方案中， 突变的 4CL 基因替换植物中的一个或多个野生型 4CL 基因。在一个实施方案中， 在植物的叶细胞和 / 或组织中选择性表达突变的 4CL 基因。
除了抑制或遏制参与木质素生物合成的靶基因以外， 也可抑制由本发明的靶基因 编码的蛋白质的活性 ( 例如酶活性 )。 在一个实施方案中， 可在甘蔗植物的细胞中掺入和表 达编码与蛋白质结合并抑制其活性 ( 例如酶活性 ) 的抗体或其抗原结合片段的核酸。可从 用所述核酸转化的和 / 或掺入所述核酸的细胞培养包含和表达编码抗体或其抗原结合片 段的核酸的植物。 制备结合和抑制特定靶蛋白的抗体的方法和获得编码抗体的核酸的方法 是本领域熟知的。在一个实施方案中， 抗体是单克隆抗体， 或其抗原结合片段。抗原结合片 段包括， 但不限于 F(ab′ )2， Fab′， Fab， 和 Fv， 并可使用本领域已知的标准方法制备。抗体 可来源于能够产生针对靶蛋白表位的抗体的任意动物， 并包括例如人、 灵长类、 小鼠、 大鼠、 山羊、 绵羊、 猪和牛。在特定的实施方案中， 抗体结合 4CL 蛋白。在一个实施方案中， 4CL 基 因编码包含 AMP 结合基序序列 ( 例如 SEQ ID NO ： 34) 和 / 或 SEQ IDNO ： 54 的特征基序序列 的 4CL 多肽。在更特定的实施方案中， 4CL 蛋白由 4CL-M 基因、 4CL-L 基因或 4CL-N 基因编码。在特定的实施方案中， 4CL-L 基因包含 SEQ ID NO ： 1 中所示的核苷酸序列的全部或部 分， 4CL-M 基因包含 SEQ ID NO ： 2 中所示的核苷酸序列的全部或部分， 4CL-N 基因包含 SEQ IDNO ： 3 中所示的核苷酸序列的全部或部分。在一个实施方案中， 4CL-M， 4CL-L 和 4CL-N 基 因分别编码具有 SEQ ID NO ： 6、 7 和 8 中所示的氨基酸序列的多肽， 或其片段或变体。在一 个实施方案中， 抗体与包含 SEQ ID NO ： 6、 7 和 8 中的氨基酸序列的 4CL 蛋白， 或其片段或表 位结合。 在特定的实施方案中， 在植物的叶组织中选择性表达编码抗体的核酸， 例如通过使 用叶特异性启动子。
也可通过表达和 / 或使靶蛋白接触结合特定靶蛋白的适体抑制参与木质素生物 合成的靶基因编码的蛋白质的活性 ( 例如酶活性 )。适体是可被选择用于结合靶分子的 寡核苷酸或肽 ( 见， 例如， Ellington 和 Szostak(1990) 以及 Hoppe-Seyler 和 Butz(2000) 和 美 国 专 利 号 5,582,981 ； 5,270,163 ； 5,595,877 ； 5,817,785 ； 6,344,318 ； 6,933,116 ； 7,368,236 ； 和 7,700,759)。在一个实施方案中， 在植物细胞中掺入和表达编码与参与木 质素生物合成的蛋白结合的适体的核酸。可从用所述核酸转化的和 / 或掺入所述核酸的 细胞培养包含和表达编码适体的核酸的植物。在一个实施方案中， 适体结合并抑制 4CL 蛋 白。在一个实施方案中， 4CL 基因编码包含 AMP 结合基序序列 ( 例如 SEQ ID NO ： 34) 和 / 或 SEQ ID NO ： 54 的特征基序序列的 4CL 多肽。在特定的实施方案中， 4CL 蛋白由本发明的 4CL-L、 4CL-M 或 4CL-N 基因编码。在特定的实施方案中， 4CL-L 基因包含 SEQ IDNO ： 1 中所 示的核苷酸序列的全部或部分， 4CL-M 基因包含 SEQ ID NO ： 2 中所示的核苷酸序列的全部 或部分， 4CL-N 基因包含 SEQ ID NO ： 3 中所示的核苷酸序列的全部或部分。在一个实施方 案中， 4CL-M， 4CL-L 和 4CL-N 基因分别编码具有 SEQ ID NO ： 6、 7 和 8 中所示的氨基酸序列 的多肽， 或其片段或变体。在一个实施方案中， 适体与包含 SEQ ID NO ： 6、 7 和 8 中的氨基酸 序列的 4CL 蛋白， 或其片段或表位结合。在特定的实施方案中， 在植物的叶组织中选择性表 达编码适体的核酸， 例如通过使用叶特异性启动子。
本发明也涉及甘蔗植物， 其中木质素生物合成已被调节 ( 例如， 下调 )。在一个实 施方案中， 在叶细胞和 / 或组织中选择性下调木质素生物合成。在一个实施方案中， 在甘蔗 植物中抑制或下调一种或多种 4CL 基因的表达和 / 或由 4CL 基因编码的蛋白质的翻译或 活性。在一个实施方案中， 4CL 基因编码包含 AMP 结合基序序列 ( 例如 SEQ ID NO ： 34) 和 / 或 SEQ ID NO ： 54 的特征基序序列的 4CL 多肽。在一个实施方案中， 被抑制的 4CL 基因是 4CL-L， 4CL-M 或 4CL-N。在一个实施方案中， 4CL-M， 4CL-L 和 4CL-N 基因分别编码具有 SEQ ID NO ： 6、 7 和 8 中所示的氨基酸序列的多肽， 或其片段或变体。 在特定的实施方案中， 4CL-L 基因包含 SEQ ID NO ： 1 中所示的核苷酸序列的全部或部分， 4CL-M 基因包含 SEQ ID NO ： 2 中所示的核苷酸序列的全部或部分， 4CL-N 基因包含 SEQ ID NO ： 3 中所示的核苷酸序列的 全部或部分。本发明的甘蔗植物可具有掺入其基因组的靶向一种或多种 4CL 基因 ( 例如 4CL-M， 4CL-N 和 / 或 4CL-L) 的反义、 共抑制、 RNAi 或核酶核酸。本发明的甘蔗植物可在其 基因组中具有突变的 4CL 基因， 其中 4CL 基因的表达被抑制， 和 / 或其中 4CL 多肽具有抑制 或降低 4CL 多肽的功能活性 ( 例如酶活性 ) 的突变。本发明的甘蔗植物也可具有掺入其基 因组的核酸， 所述核酸编码结合 4CL 蛋白并抑制其酶活性的一种或多种抗体 ( 或其抗原结 合片段 ) 和 / 或适体。
任选地， 本文公开的植物可还展示主要有利于种子公司、 栽培者或粮食加工者的一种或多种农艺性状， 例如除草剂抗性、 病毒抗性、 细菌病原体抗性、 昆虫抗性、 线虫抗 性 和 真 菌 抗 性。 见， 例 如 美 国 专 利 号 5,569,823 ； 5,304,730 ； 5,495,071 ； 6,329,504 ； 和 6,337,431。这样的性状也可为提高植物活力或产量的性状 ( 包括允许植物在不同的温 度、 土壤条件和日光和降水水平下生长的性状 )， 或允许鉴定展示目的性状的植物的性状 ( 例如， 可选择的标记物基因， 种皮颜色等等 )。在例如美国专利号 5,569,823 ； 5,304,730 ； 5,495,071 ； 6,329,504 ； 6,337,431 ； 5,767,366 ； 5,928,937 ； 4,761,373 ； 5,013,659 ； 4,975,374 ； 5,162,602 ； 4,940,835 ； 4,769,061 ； 5,554,798 ； 5,879,903 ， 5,276,268 ； 5,561,236 ； 4,810,648 ； 和 6,084,155 ； 欧洲申请号 0242246 ； 美国专利申请号 20010016956 和 www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/ 的万维网上描述了多种目的性 状， 以及将这些性状引入植物的方法。
本发明也涉及甘蔗植物组织和植物部分， 包括但不限于， 来自本发明的具有被调 节 ( 例如下调 ) 的木质素生物合成的、 可从其再生植物的甘蔗植物的植物细胞、 植物原生质 体、 植物细胞组织培养物、 植物愈伤组织、 植物块 (clump) 和植物中完整的植物细胞， 或植 物的部分， 例如枝、 核、 穗、 穗轴、 果壳、 根尖、 花药、 种子、 根、 胚、 下胚轴、 子叶、 花粉、 胚珠、 花 药、 幼苗、 梗、 茎、 叶、 果和花。在一个实施方案中， 在植物组织或植物细胞中抑制或下调一 种或多种 4CL 基因或其基因产物的表达。在一个实施方案中， 被抑制的 4CL 基因是 4CL-M， 4CL-L 或 4CL-N。在一个实施方案中， 4CL-M， 4CL-L 和 4CL-N 基因分别编码具有 SEQ ID NO ： 6、 7 和 8 中所示的氨基酸序列的多肽， 或其片段或变体。在特定的实施方案中， 4CL-L 基因 包含 SEQ ID NO ： 1 中所示的核苷酸序列的全部或部分， 4CL-M 基因包含 SEQ ID NO ： 2 中所 示的核苷酸序列的全部或部分， 4CL-N 基因包含 SEQ IDNO ： 3 中所示的核苷酸序列的全部或 部分。
本发明也涉及具有被调节的或下调的木质素生物合成的甘蔗细胞或原生质体。 在一个实施方案中， 在甘蔗细胞或原生质体中抑制或下调一种或多种 4CL 基因的表达， 或 由 4CL 基因编码的蛋白质的翻译或活性。在一个实施方案中， 被抑制的 4CL 基因是 4CL-M， 4CL-L 或 4CL-N。在一个实施方案中， 4CL-M， 4CL-L 和 4CL-N 基因分别编码具有 SEQ ID NO ： 6、 7 和 8 中所示的氨基酸序列的多肽， 或其片段或变体。在特定的实施方案中， 4CL-L 基因 包含 SEQ ID NO ： 1 中所示的核苷酸序列的全部或部分， 4CL-M 基因包含 SEQ ID NO ： 2 中所 示的核苷酸序列的全部或部分， 4CL-N 基因包含 SEQ IDNO ： 3 中所示的核苷酸序列的全部或 部分。
本发明也涉及产生具有降低的或下调的木质素生物合成的甘蔗植物的方法。 在一 个实施方案中， 在甘蔗植物的叶细胞和 / 或组织中降低或下调木质素生物合成。在另一个 实施方案中， 在甘蔗植物的茎组织中降低或下调木质素生物合成。 在一个实施方案中， 本发 明的方法包括抑制或遏制一种或多种 4CL 基因的表达， 或抑制由 4CL 基因编码的蛋白质的 翻译或活性 ( 例如酶活性 )。在一个实施方案中， 4CL 基因编码包含 AMP 结合基序序列 ( 例 如 SEQ ID NO ： 34) 和 / 或 SEQ ID NO ： 54 的特征基序序列的 4CL 多肽。在一个实施方案中， 被抑制的 4CL 基因是 4CL-M， 4CL-L 或 4CL-N。在一个实施方案中， 4CL-M， 4CL-L 和 4CL-N 基 因分别编码具有 SEQ ID NO ： 6、 7 和 8 中所示的氨基酸序列的多肽， 或其片段或变体。在特 定的实施方案中， 4CL-L 基因包含 SEQ ID NO ： 1 中所示的核苷酸序列的全部或部分， 4CL-M 基因包含 SEQ ID NO ： 2 中所示的核苷酸序列的全部或部分， 4CL-N 基因包含 SEQ IDNO ： 3中所示的核苷酸序列的全部或部分。在一个实施方案中， 使用反义核酸、 共抑制、 RNA 干扰或 核酶抑制靶基因的表达。在另一个实施方案中， 通过基因突变抑制靶基因的表达。在另一 个实施方案中， 通过表达与蛋白质结合的抗体或其抗原结合片段， 和 / 或适体， 或通过在基 因中提供抑制基因的 mRNA 翻译为蛋白质的突变或破坏或抑制编码的蛋白质的功能的突变 ( 例如通过氨基酸序列中的改变 )， 在植物中抑制靶基因编码的蛋白质的活性。可使用本领 域已知的标准方法和材料将提供靶基因表达抑制的核酸构建体引入植物基因组， 并由此制 备转化的和转基因的植物。
可在表达构建体中提供对本发明有用的多核苷酸。 本发明的表达构建体一般包括 在将要表达表达构建体的预期的宿主细胞中有功能的调控元件。因此， 本领域普通技术人 员可选择用于细菌宿主细胞、 酵母宿主细胞、 植物宿主细胞、 昆虫宿主细胞、 哺乳动物宿主 细胞和人宿主细胞的调控元件。调控元件包括启动子、 转录终止序列、 翻译终止序列、 增强 子和多聚腺苷酸化元件。如本文使用的， 术语 “表达构建体” 指提供有效连接的核酸序列的 转录的核酸序列的组合。如本文使用的， 术语 “有效连接的” 指描述的组件的并置， 其中所 述组件处于允许其以其预期的方式发挥功能的关系之中。大体上， 有效连接的组件处于相 邻关系。
本发明的表达构建体可包含与本发明的多核苷酸序列有效连接的启动子序列。 可 使用本领域已知的标准技术将启动子掺入多核苷酸。 可在本发明的表达构建体中使用多拷 贝启动子或多个启动子。 在优选的实施方案中， 可将启动子置于这样的位置， 即其相距表达 构建体中的转录起始位点的距离与其相距其天然遗传环境中的转录起始位点的距离相同。 在此距离上允许一些基本上不降低启动子活性的变化。 在表达构建体中一般包含转录起始 位点。
如果将在植物细胞中提供表达构建体或将表达构建体引入植物细胞， 那么可使用 植物病毒启动子， 例如花椰菜花叶病毒 (CaMV)35S( 包括增强的 CaMV 35S 启动子 ( 见， 例如 美国专利号 5,106,739))， 或 CaMV 19S 启动子或木薯叶脉花叶 ( 启动子 )。可用于植物中 的表达构建体的其他启动子包括， 例如 prolifera 启动子、 Ap3 启动子、 热休克启动子、 根癌 农杆菌 (A.tumefaciens) 的 T-DNA 1′ - 或 2′ - 启动子、 多半乳糖醛酸酶启动子、 矮牵牛 花的查耳酮合酶 A(CHS-A) 启动子、 烟草 PR-1a 启动子、 泛素启动子、 肌动蛋白启动子、 alcA 基因启动子、 pin2 启动子 (Xu 等人， 1993)、 玉米 WipI 启动子、 玉米 trpA 基因启动子 ( 美国 专利号 5,625,136)、 玉米 CDPK 基因启动子， 且也可使用 RUBISCO SSU 启动子 ( 美国专利号 5,034,322)。在本发明中可使用组织特异性启动子， 例如果特异性启动子， 如番茄的 E8 启 动子 ( 登记号 ： AF515784 ； Good 等人 (1994))。 在本发明的核酸构建体中可使用的叶特异性 启动子包括 Cab1 启动子 (Brusslan 和 Tobin， 1992)、 Cab19 启动子 (Bassett 等人， 2007)、 PPDK 启动子 (Matsuoka 等人， 1993) 和核酮糖二磷酸羧化酶 (RBCS) 启动子 (Matsuoka 等 人 (1994) 和美国专利号 7,723,575)。可用于本发明的表达构建体的其它的植物叶特异性 启动子包括， 但不限于， Act1 启动子 ( 美国公开的申请号 20090031441)、 AS-1 启动子 ( 美 国专利号 5,256,558)、 RBC-3A 启动子 ( 美国专利号 5,023,179)、 CaMV 35S 启动子 (Odell 等人， 1985)、 增强的 CaMV35S 启动子、 玄参花叶病毒 (FMV) 启动子 (Richins 等人， 1987)、 甘露碱合酶 (mas) 启动子、 章鱼碱合酶 (ocs) 启动子等等， 例如来自 CaMV 19S(Lawton 等 人， 1987)、 nos(Ebert 等人， 1987)、 Adh(Walker 等人， 1987)、 蔗糖合酶 (Yang 等人、 1990)、α- 微管蛋白、 泛素、 肌动蛋白 (Wang 等人、 1992)、 cab(Sullivan 等人、 1989)、 磷酸烯醇式丙 酮酸羟化酶 (PEPCase)(Hudspeth 等人、 1989) 的启动子， 或与 R 基因复合物有关的启动子 (Chandler 等人、 1989)。又见公开的美国申请 2007/006346 和 Yamamoto 等人 (1997) ； Kwon 等人 (1994) ； Yamamoto 等人。 果特异性启动子如花器官特异性启动子可用于本发明的表达 构建体， 从而在植物的花器官中表达本发明多核苷酸。花器官特异性启动子的实例包括在 美国专利号 6,462,185 ； 5,639,948 ； 和 5,589,610 中描述的任意启动子序列。也可使用种 子特异性启动子如 β- 云扁豆蛋白基因 ( 例如菜豆的 ) 或大豆球蛋白基因 ( 例如大豆的 ) 等等的启动子。根特异性启动子， 如在美国专利号 6,455,760 或美国专利号 6,696,623， 或 在 公 开 的 美 国 专 利 申 请 号 20040078841 ； 20040067506 ； 20040019934 ； 20030177536 ； 20030084486 ； 或 20040123349 中描述的任意启动子序列可用于本发明的表达构建体。 木质 部特异性启动子包括稻的肉桂酸 -4- 羟化酶 (C4H)。也设想将组成型启动子 ( 如 CaMV、 泛 素、 肌动蛋白或 NOS 启动子 )、 发育调控型启动子和诱导型启动子 ( 如可被热、 光、 激素或化 学品诱导的那些启动子 ) 用于本发明的多核苷酸表达构建体。
鉴定和表征植物基因组 DNA 中的启动子区的方法是本领域已知的， 并包括， 例如 在以下参考文献中描述的那些 ： Jordano 等人 (1989) ； Bustos 等人 (1989) ； Green 等人 (1988) ； Meier 等人 (1991) ； 和 Zhang 等人 (1996)。公开的美国申请 2009/0199307 也描述 了使用差异显示鉴定组织特异性启动子的方法 ( 见， 例如美国专利号 5,599,672)。在差异 显示中， 比较了来自不同组织类型的 mRNA。 通过鉴定仅在特定组织类型， 或组织类型集合中 存在的 mRNA 种类， 可鉴定出以组织特异性方式表达的相应基因。可通过逆转录酶转录 RNA 以产生 cDNA， 并可使用 cDNA 分离含有全长基因的克隆。 也可使用 cDNA 从相应基因中分离部 分同源或同源的启动子、 增强子或终止子， 使用例如抑制 PCR。又见美国专利号 5,723,763。
本发明的表达构建体也可任选地包含转录终止序列， 翻译终止序列， 编码信号肽 的序列， 和 / 或增强子元件。一般可从真核或病毒基因序列的 3’ 非翻译区获得转录终止 区。可将转录终止序列置于编码序列的下游以提供有效的终止。信号肽序列是一般存在于 蛋白质的氨基端的短氨基酸序列， 其负责有效连接的成熟多肽再定位到范围广泛的翻译后 细胞目的地， 所述目的地的范围从特定细胞器区室到蛋白质作用位点和细胞外环境。通过 使用有效连接的信号肽序列， 将基因产物靶向预期的细胞和 / 或细胞外目的地， 设想将此 用于本发明的多肽。经典的增强子是提高基因转录的顺式作用元件， 并也可包含在表达构 建体中。经典的增强子元件是本领域已知的， 包括但不限于 CaMV 35S 增强子元件、 巨细胞 病毒 (CMV) 早期启动子增强子元件和 SV40 增强子元件。增强基因表达的内含子介导的增 强子元件也是本领域已知的。这些元件必须存在于转录区内且是方向依赖的。实例包括玉 米 shrunken-1 增强子元件 (Clancy 和 Hannah， 2002)。
在表达构建体中也可包含引导从表达构建体上转录的 mRNA 的多聚腺苷酸化的 DNA 序列， 并包括但不限于 CaMV 35S、 章鱼碱合酶或胭脂碱合酶信号。本发明的表达构建体 也可包含引导其他基因转座的多核苷酸序列， 即转座子。
表达构建体也可包含用于选择转化细胞的一种或多种显性可选择标记物基因， 包 括例如编码抗生素抗性的基因。抗生素抗性基因可提供对一种或多种以下抗生素的抗性 ： 潮霉素、 卡那霉素、 博来霉素、 G418、 链霉素、 巴龙霉素、 新霉素和壮观霉素。 可通过新霉素磷 酸转移酶 (NPT II) 提供卡那霉素抗性。用于细胞转化筛选的其它标记物包括编码 β- 葡糖醛酸酶 (GUS)、 β- 半乳糖苷酶、 荧光素酶、 胭脂碱合酶、 氯霉素乙酰基转移酶 (CAT)、 绿色 荧光蛋白 (GFP) 或增强的 GFP(Yang 等人 (1996)) 的基因。
本发明也涉及包含编码预期蛋白质的本发明的多核苷酸的多核苷酸载体， 所述载 体将提供给用本发明的生物反应器装置提供的细胞。 在本发明的表达构建体或多核苷酸的 5’ 和 3’ 端可包含独特的限制酶位点， 以允许其插入多核苷酸载体。如本文使用的， 术语 “载 体” 指任意遗传元件， 包括例如质粒、 粘粒、 染色体、 噬菌体、 病毒等等， 当与合适的控制元件 相联系时其能够复制， 且其可在细胞间转移多核苷酸序列。载体包含允许载体在选定的宿 主细胞中复制的核苷酸序列。用于表达和 / 或克隆的若干载体是现有的， 并包括但不限于， pBR322， pUC 系列， M13 系列， 和 pBLUESCRIPT 载体 (Stratagene， La Jolla， CA)。
本发明的多核苷酸可由 RNA 或 DNA 组成。优选地， 多核苷酸由 DNA 组成。本发明 也包含与本文公开的多核苷酸序列互补的多核苷酸。
用 基 因 转 化 植 物 细 胞 的 技 术 是 本 领 域 已 知 的， 并包括例如农杆菌 (Agrobacterium) 感染、 基因枪法、 电穿孔、 氯化钙处理、 PEG 介导的转化等。见， 例如美国专 利号 5,036,006 ； 5,591,616 ； 5,100,792 ； 公开的美国申请号 2006/0260011 ； 和公开的 PCT 申请号 WO 93/07278 和 WO93/21335。 美国专利号 5,661,017 教导了用异源多核苷酸转化藻 类细胞的方法和材料。使用本领域已知的标准方法可选择、 重新分化和培养转化细胞为包 含和表达本发明的多核苷酸的植物。 在本发明的范围内也包含任意转化的或转基因的本发 明的植物细胞或植物的种子和其他植物组织和后代。 也可根据与本文示例的这些序列的更具体的同一性和 / 或相似性范围定义本发 明的多核苷酸和多肽。序列同一性将一般地大于 60 ％， 优选地大于 75 ％， 更优选地大于 80％， 甚至更优选地大于 90％， 和可大于 95％。与本文示例的序列相比， 序列的同一性和 / 或相似性可为 49， 50， 51， 52， 53， 54， 55， 56， 57， 58， 59， 60， 61， 62， 63， 64， 65， 66， 67， 68， 69， 70， 71， 72， 73， 74， 75， 76， 77， 78， 79， 80， 81， 82， 83， 84， 85， 86， 87， 88， 89， 90， 91， 92， 93， 94， 95， 96， 97， 98， 或 99 ％。除非另外指定， 可使用如在 Karlin 和 Altschul(1993) 中修改的 Karlin 和 Altschul(1990) 算法测定如本文使用的 2 个序列的百分比序列同一性和 / 或相 似性。 这样的算法包含在 Altschul 等人 (1990) 的 NBLAST 和 XBLAST 程序中。 可使用 NBLAST 程序， 分数＝ 100， 字长＝ 12 进行 BLAST 搜索， 以得到具有预期百分比序列同一性的序列。 为了比较目的获得有缺口的比对， 可使用如 Altschul 等人 (1997) 描述的 Gapped BLAST。 当使用 BLAST 和 Gapped BLAST 程序， 可使用各个程序 (NBLAST 和 XBLAST) 的默认参数。见 NCBI/NIH 网站。
本发明也设想与编码本发明的多肽的多核苷酸序列具有足够同源的序列， 从而在 标准的严格条件和标准方法下允许与该序列杂交 (Maniatis， T. 等人， 1982) 的那些本发明 的多核苷酸分子 ( 和编码本发明的多肽的那些多核苷酸分子 )。 如本文使用的， 用于杂交的 “严格的” 条件指这样的条件， 其中一般在 6x SSPE， 5x Denhardt 溶液， 0.1％ SDS， 0.1mg/ml 变性 DNA 中在低于 DNA 杂合体的解链温度 (Tm) 的 20-25C 下过夜进行杂交。解链温度有以 下公式 (Beltz， G.A. 等人， 1983) 描述 ：
Tm ＝ 81.5C+16.6Log[Na+]+0.41( ％ G+C)-0.61( ％甲酰胺 )-600/ 双链体的长度 ( 以碱基对为单位 )。
一般如下进行洗涤 ：
a) 在 1x SSPE， 0.1％ SDS 中在室温进行 15 分钟， 2 次 ( 低严格度的洗涤 )。
b) 在 0.2x SSPE， 0.1％ SDS 中在 Tm-20C 下进行 15 分钟， 1 次 ( 中严格度的洗涤 )。
如本文使用的， 术语 “核酸” 和 “多核苷酸序列” 指单链或双链形式的脱氧核糖核 苷酸或核糖核苷酸聚合物， 除非另外限制， 其包含可与天然存在的核苷酸类似的方式发挥 功能的天然核苷酸的已知类似物。多核苷酸序列包括被转录为 RNA 的 DNA 链序列和被翻译 为蛋白质的 RNA 序列二者。多核苷酸序列包括全长序列以及来源于全长序列的较短序列二 者。 应当理解， 特定多核苷酸序列包含天然序列的简并密码子， 或可被引入以在特定宿主细 胞中提供密码子偏好的序列。 在本发明范围内的多核苷酸序列还包含与编码本发明的多肽 的序列特异性杂交的序列。 多核苷酸包含作为单独的链的或在双链体中的正义和反义链二 者。
在本发明的范围内也视为包含具有除了在本发明的多肽中特别示例的氨基酸取 代以外的氨基酸取代的多肽。 例如， 可用非天然氨基酸取代本发明的多肽的氨基酸， 只要具 有取代的氨基酸的多肽基本上保留与氨基酸未被取代的多肽相同的活性。 非天然氨基酸的 实例包括， 但不限于， 鸟氨酸、 瓜氨酸、 羟脯氨酸、 高丝氨酸、 苯甘氨酸、 牛磺酸、 碘化酪氨酸、 2， 4- 二氨基丁酸、 α- 氨基异丁酸、 4- 氨基丁酸、 2- 氨基丁酸、 γ- 氨基丁酸、 ε- 氨基己酸、 6- 氨基己酸、 2- 氨基异丁酸、 3- 氨基丙酸、 正亮氨酸、 正缬氨酸、 肌氨酸、 高瓜氨酸、 磺丙氨 酸、 τ- 丁基甘氨酸、 τ- 丁基丙氨酸、 苯甘氨酸、 丙氨酸环己酯、 β- 丙氨酸、 氟代氨基酸， 专 门设计的氨基酸如 β- 甲基氨基酸、 C- 甲基氨基酸、 N- 甲基氨基酸， 和一般的氨基酸类似 物。非天然氨基酸也包括具有衍生化的侧基的氨基酸。此外， 蛋白质中的任意氨基酸可为 D( 右旋 ) 型或 L( 左旋 ) 型。 氨基酸可一般被分为以下种类 ： 非极性、 无电荷极性、 碱性和酸性。在本发明的范 围内包括保守取代， 其中具有一类氨基酸的多肽被同类的另一种氨基酸替换， 只要具有取 代的多肽仍基本上保留与没有取代的多肽相同的生物学活性。 非极性氨基酸包括 Ala， Val， Leu， Ile， Pro， Met， Phe， 和 Trp。无电荷极性氨基酸包括 Gly， Ser， Thr， Cys， Tyr， Asn， 和 Gln。酸性氨基酸包括 Asp 和 Glu。碱性氨基酸包括 Lys， Arg， 和 His。
一旦在表达系统中掺入本发明的核酸序列， 就可将其转化进植物细胞。词语 “植 物” 指任意植物， 特别是种子植物， “植物细胞” 是植物的结构和生理学单位， 其包含细胞壁， 但也可指原生质体。植物细胞可为分离的单个细胞或培养细胞的形式， 或作为更高等的有 机体单位例如植物组织或植物器官的一部分。术语 “转化” 指导致在遗传上被稳定继承的 核酸片段至宿主细胞基因组的转移。包含转化的核酸片段的宿主细胞被称为 “转基因” 细 胞， 和包含转基因细胞的生物被称为 “转基因生物” 。
转 化 植 物 和 植 物 细 胞 的 方 法 的 实 例 包 括 农 杆 菌 介 导 的 转 化 (Deblaere 等 人 (1987)) 和微粒轰击技术 (Klein 等人 (1987) ； 美国专利号 4,945,050)。通过技术人员熟 知的方法可从转基因细胞再生全植物 ( 见， 例如 Fromm 等人 (1990))。
可以多种本领域公认的方式将本发明的表达构建体引入植物细胞。 术语 “引入” 在 多核苷酸 ( 例如编码本文公开的酶的核苷酸 ) 的情况下， 旨在表示以这样的方式将多核苷 酸呈递给植物， 即， 使多核苷酸能进入植物细胞内部。当要引入多于一种多核苷酸时， 这些 多核苷酸可被组装为单个核苷酸构建体的一部分， 或作为单独的核苷酸构建体， 并可位于 相同或不同的转化载体上。
因此， 可在单个转化事件中， 在单独的多个转化事件中， 或例如在植物中将这些多 核苷酸引入目的宿主细胞， 作为育种方案的一部分。本发明的方法不依赖于特定的将一种 或多种多核苷酸引入植物的方法， 只要多核苷酸能进入植物的至少一个细胞的内部。将多 核苷酸引入植物的方法是本领域已知的， 并包括但不限于， 瞬时转化法、 稳定转化法和病毒 介导法。
“瞬时转化” 在多核苷酸的情况下旨在表示， 多核苷酸被引入植物但不整合进植物 的基因组。
在将多核苷酸引入植物的情况下， “稳定引入” 或 “稳定引入的” 旨在表示， 引入的 多核苷酸被稳定掺入植物基因组， 因此植物被多核苷酸稳定地转化。
“稳定转化” 或 “稳定转化的” 旨在表示， 引入植物的多核苷酸 ( 例如， 本文描述的 核苷酸构建体 ) 整合进植物的基因组， 并能够被其后代继承， 更特别地， 被多个连续世代的 后代继承。
可用于植物转化的多种转化载体是在植物转化领域的普通技术人员已知的， 且与 本发明有关的基因可与任意这些载体共同使用。 载体的选择将取决于优选的转化技术和用 于转化的靶物种。对某些靶物种， 可优选不同的抗生素或除草剂选择标记物。
再生转化植物的方法是本领域熟知的。例如， Ti 质粒载体已被用于外源 DNA 的递 送， 以及直接的 DNA 摄取、 脂质体、 电穿孔、 显微注射和微粒。另外， 来自农杆菌属的细菌可 被用于转化植物细胞。下面描述了转化双子叶和单子叶植物的代表性技术， 以及代表性质 体转化技术。
许多载体可用于使用根癌农杆菌的转化。其一般携带至少一种 T-DNA 边界序列， 并包括如 pBIN19(Bevan(1984)) 的载体。为了构建用于农杆菌转化的载体， 见， 例如美国专 利申请公开号 2006/0260011。
不使用根癌农杆菌的转化规避了在选择的转化载体中对 T-DNA 序列的需要， 因此 也可使用缺乏这些序列的载体。不依赖农杆菌的转化技术包括， 但不限于， 通过颗粒轰击、 原生质体摄取 ( 例如 PEG 和电穿孔 ) 和显微注射。载体的选择大部分取决于用于转化的物 种的优选的选择。有关这些载体的构建， 见例如美国公开的申请号 2006/0260011。
用于双子叶植物的转化技术是本领域熟知的， 并包括基于农杆菌的技术和不需要 农杆菌的技术。非农杆菌的技术包括通过原生质体或细胞直接摄取外源遗传物质， 并可例 如通过 PEG 或电穿孔介导的摄取、 颗粒轰击介导的递送或显微注射实现。Paszkowski 等人 (1984)， Potrykus 等人 (1985)， Reich 等人 (1986)， 和 Klein 等人 (1987) 描述了这些技术 的实例。在每种情况下， 使用本领域已知的标准技术将转化细胞再生为整株植物。
农杆菌介导的转化是转化双子叶植物的优选技术， 因为其高转化效率及其对许多 不同物种的广泛实用性。农杆菌转化一般包括将携带目的外源 DNA 的二元载体转移至合适 的农杆菌菌株， 这可能依赖于宿主农杆菌菌株在共驻留的 Ti 质粒或染色体上携带的 vir 基 因的补足 (complement)(Uknes 等人 (1993))。通过使用携带重组二元载体的大肠杆菌、 携 带能够将重组二元载体移动至靶农杆菌菌株的质粒的辅助大肠杆菌菌株的三亲株交配程 序实现重组二元载体至农杆菌的转移。可选地， 可通过 DNA 转化将重组二元载体转移至农 杆菌 (Hofgen 和 Willmitzer(1988))。
重组农杆菌对靶植物物种的转化通常包括共培养农杆菌与来自植物的外植体， 并遵照本领域熟知的方案。在携带存在于二元质粒 T-DNA 边界之间的抗生素或除草剂抗性标 记物的选择培养基上再生转化的组织。
用基因转化植物细胞的另一种方法包括在植物组织和细胞上推进 (propel) 惰性 或生物活性颗粒。在美国专利号 4,945,050， 5,036,006， 和 5,100,792 中公开了此技术。大 体上， 此技术包括在能够有效穿透细胞的外表面的条件下在细胞上推进惰性或生物活性颗 粒， 并在其内部提供掺入。 当使用惰性颗粒时， 可通过用包含预期基因的载体覆盖颗粒将载 体引入细胞。可选地， 可用载体包围细胞， 从而通过颗粒将载体携带进细胞。也可将生物活 性颗粒 ( 例如， 干酵母细胞、 干细菌或噬菌体， 其分别含有试图引入的 DNA) 推进植物细胞组 织。
大多数单子叶物种的转化现在也已变为常规技术。优选的技术包括使用 PEG 或 电穿孔技术将基因直接转移进原生质体， 和颗粒轰击进愈伤组织。可使用单个 DNA 种类或 多个 DNA 种类 ( 即共转化 ) 进行转化， 且这些技术都适用于本发明。共转化可具有以下优 势： 避免构建完整载体， 和产生具有不连锁的目的基因和可选择标记物的基因座的转基因 植物， 这使得能够在以后的世代中去除可选择的标记物， 这应当被认为是理想的。
专利申请 EP 0292435， EP 0392225， 和 WO 93/07278 描述了从玉米的原种自交系 制备愈伤组织和原生质体， 使用 PEG 或电穿孔转化原生质体， 和从转化的原生质体再生玉 米植物的技术。Gordon-Kamm 等人 (1990) 和 Fromm 等人 (1990) 公开了使用颗粒轰击转 化 A188 来源的玉米系的技术。此外， WO 93/07278 和 Koziel 等人 (1993) 描述了通过颗 粒轰击转化玉米的原种自交系的技术。此技术使用从授粉后 14-15 天的玉米穗上切除的 1.5-2.5mm 长的未成熟的玉米胚和 PDS-1000He 基因枪装置用于轰击。
通过用本发明的核酸序列转化得到的植物可为任意的品种广泛的植物物种， 包 括单子叶和双子叶植物物种。可通过育种将本发明的基因表达与其他对生产和质量的重 要特征组合掺入植物系。也可通过育种或通过普通的基因工程技术将本文公开的本发明 的多核苷酸掺入植物系或维持在植物系中。育种方法和技术是本领域已知的。见， 例如 Welsh(1981) ； Wood(1983) ； Mayo(1987) ； Singh(1986) ； 以及 Wricke 和 Weber(1986)。
通过有性生殖或营养生长传递改造进上述转基因种子和植物的遗传特性， 并可因 此在后代植物中维持和传播所述遗传特性。一般地， 维持和繁殖利用为了适合特定目的如 耕种、 播种或收割而开发的已知农业方法。
相关技术是本领域熟知的， 并包括但不限于， 杂交、 近交、 回交育种、 多系育种 (multi-line breeding)、 双单倍体近交、 品种混合、 种间杂交、 非整倍体技术， 等等。 杂交技 术也包括通过机械、 遗传 ( 包括转基因 )、 化学或生物化学手段使植物不育以产生雄性或雌 性不育的植物。
用于本发明的目的， “甘蔗” 指任意甘蔗属植物或杂种。在本发明的范围内的甘蔗 植物包括， 例如斑茅 (Saccharum arundinaceum)、 Saccharumbengalense、 肉质花穗野生种 (Saccharum edule)、 白甘蔗 (Saccharumofficinarum)、 狭叶斑茅 (Saccharum procerum)、 沙 生 蔗 茅 (Saccharumravennae)、 大 茎 野 生 种 (Saccharum robustum)、 竹 蔗 (Saccharum sinense) 和割手密 (Saccharum spontaneum)。本发明的甘蔗植物可为近交系或杂种。杂 种植物包括通过组成目前所有的商业甘蔗和 energycane 种质的白甘蔗杂交材料由传统的 割手密生成的杂种， 和通过用近亲或远亲物种杂交甘蔗产生的任意其他杂种。可与甘蔗杂交以产生杂种植物或新的甘蔗品种的其他物种的实例包括芒属 (Miscanthus)、 蔗茅属 (Erianthus) 和甜高粱属 (Sorghum)。
“分离的” 表示 “通过人工操作” 从其自然状态改变的， 即， 如果其出现在自然界， 其 已从其本来的环境中被改变或移动， 或被改变和移动。 例如， 在活动物中以天然状态天然存 在的多核苷酸或多肽不是 “分离的” ， 但如本文使用的术语， 从其天然状态的共同存在的材 料中分开的相同的多核苷酸或多肽是 “分离的” 。例如， 就多核苷酸而言， 术语分离的表示， 从其天然存在的染色体和细胞中分开的。如果序列从其天然存在的染色体和细胞中分开， 但被插入其不天然存在的染色体或细胞的基因环境中， 则其也是分离的。
如本文使用的， 术语 “转基因的” 指包含外源多核苷酸 ( 即基因 ) 的植物， 所述外源 多核苷酸在转化的植物中被稳定维持并在连续世代中通过后代稳定继承。术语 “转基因植 物” 可指最初转化的植物或最初转化的植物的后代。 用于转化植物、 植物细胞或植物组织的 技术可包括， 但不限于， 使用根癌农杆菌或发根农杆菌 (A.rhizogenes) 作为转化剂用 DNA 转化， 电穿孔、 DNA 注射、 微粒轰击和颗粒加速。见， 例如 EP 295959 和 EP 138341。如本文 使用的， 术语 “植物材料” 或 “植物部分” 包括植物细胞、 植物原生质体、 可从其再生植物的植 物细胞组织培养物、 植物愈伤组织、 植物块和植物中完整的植物细胞， 或植物的部分， 如胚、 花粉、 胚珠、 种子、 叶、 花、 枝、 果、 核、 穗、 穗轴、 果壳、 梗、 根、 根尖、 花药、 块茎、 根茎等等。
材料和方法
植 物 材 料。 在 表 达 分 析 中 使 用 野 外 培 养 的 成 熟 甘 蔗 ( 甘 蔗 属 杂 交 种 ) 变 种 CP88-1762 和温室培养的未成熟的 CP88-1762 和 L 79-1002。
RNA 提取、 基因分离和 RT-PCR。使用 TRIzol 试剂 (Invitrogen) 从叶、 茎、 节和根 分离总 RNA。使用 cDNA 合成试剂盒 (Bio-Rad) 从 1ug 总 RNA 合成第一链 cDNA。
甘蔗 4CL 的分离
Sc4CL-L
通过 RACE(cDNA 末端的快速扩增 ) 技术得到部分 4CL-L。使用 SMARTRACE 试剂盒 (Clontech) 根据制造商的说明书进行 RACE。从 2ug 总 RNA 合成 5’ - 和 3’ -RACE 预备 cDNA 库， 并使用这些库作为 PCR 模板。基于 4CL-L 的部分基因组 DNA 序列设计初级 (LPF ： 5’ -CG TTGCCTGTGAAGTCCGGCGC-3’ (SEQ ID NO ： 17)) 和巢式 (LNF ： 5’ -CCACGGCGAAGACCATCGACTCG-3 ’ (SEQ IDNO ： 18)) 基因特异性引物。使用 LPF 和制造商提供的通用引物混合物 (UPM) 进行 初级 PCR。PCR 条件由 25 个循环的 94℃ 30 秒， 68℃ 60 秒和 72℃ 180 秒组成。将初级 PCR 产物从 1 稀释到 50 并用作次级 PCR 的模板， 次级 PCR 使用 LNF 和制造商提供的巢式通用引 物 (NUP)。第二个 PCR 在与第一个 PCR 相同的条件的 20 个循环下进行。将 3’ -RACE PCR 产物克隆进 pCR2.1TOPO 载体 (Invitrogen) 并测序。
Sc4CL-M
通过 DNA 文库筛选分离 4CL-M。从野外培养的植物 (Belle Grade 和 Citra， FL) 收获甘蔗 ( 甘蔗属杂交种 ) 变种 CP88-1762 的叶、 节间、 节和未成熟的卷叶。从水培溶液培 养的植物中收集根和新生幼苗。使用 Trizol(Invitrogen) 从每种组织中提取总 RNA， 并以 相同的比例混合来自每种样品的总 RNA。使用 Oligotex mRNA Mini 试剂盒 (Qiagen) 从混 合的总 RNA 提纯 mRNA。从 5.9ug mRNA 合成 cDNA 并使用 cDNA 合成试剂盒和 ZAP-cDNA 合 成试剂盒 (Stratagene) 连接至 Uni-ZAP XR 载体。使用 ZAP-cDNA GigapackIII Gold 克隆 试剂盒根据制造商的说明书 (Stratagene) 进行包装和扩增。用于筛选， 使用随机引物试剂 32 盒 (Promega) 通过 PCR 生成 447bp 的部分 4CLM 特异性探针并用 P-dCTP 标记。筛选了约 2.0x 105 的重组噬菌体， 并分离了 1 个阳性噬菌体。为了得到包含 cDNA 的 pBluscript 噬 菌粒， 进行了体内切除并对分离物测序。
Sc4CL-N
使用从甘蔗 EST 序列推断的基因特异性引物从 cDNA 上 PCR 扩增 4CL-N。在 DFCI 白甘蔗基因索引 (SoGI ； http://compbio.dfci.harvard.edu/cgi-bin/tgi/gireport.pl ？ gudb ＝ s_officinarum) 中使用 “4- 香豆酸辅酶 A 连接酶” 作为关键词检索的主题。检测 出具有完整的开放阅读框的假设的共有 (TC) 序列 TC88322， 并用于引物设计。分别从起 始和终止密码子区设计了正向引物 (4CL1F ： 5’ -ATGGGTTCCGTGGACACGGCGGTCGCG-3’ (SEQ ID NO ： 19)) 和反向引物 (4CL1R ： 5’ -TCAGTGAACACCGGCGGCGAGCCTGG-3’ (SEQ ID NO ： 20))。 使用 Trizol 根据制造商的说明书 (Invitrogen) 从叶、 节间、 节和幼苗分离总 RNA， 并使用 iScript cDNA 合成试剂盒 (Bio-rad) 进行 cDNA 合成。使用 200ng 来自每个组织的 cDNA 混 合物作为 PCR 模板。使用 TaKaRa LA taq 聚合酶 (Takara BIO Inc.) 进行 PCR， 且 PCR 条件 由 35 个循环的 95℃ 45 秒， 56℃ 45 秒和 72℃ 120 秒组成。将 2 次独立扩增的 PCR 产物克 隆进 pCR2.1TOPO 载体 (Invitrogen) 并测序。Sc4CL RNAi 抑制构建体的构建
基于 Sc4CL-L(SEQ ID NO ： 1) 和 Sc4CL-M(SEQ ID NO ： 2) 的测序信息， 设计了特异 性引物以分别扩增名为外显子 2 和外显子 1 的 200bp 区域。将对应 2 个限制酶 EcoRI 和 XbaI 的序列加入正向引物， 对反向引物加入特异性对应 EcoRV 限制酶的序列， 以便于亚克 隆。使用由通过 Bg4CL 天然内含子分隔开的 2 个反向重复和转录终止子 CaMV35SpolyA 组 成的质粒 pWFBgH4CL_RNAi 构建 Sc4CL 干扰构建体。在 2 个单独和相继的亚克隆步骤中， 用 Sc4CL 特异性序列替换质粒 pWF BgH4CL_RNAi 中的反向重复。然后亚克隆稻 C4H 启动子并 产生 2 个构建体 Sc4CL-Li 和 Sc4CL-Mi(SEQ ID NO ： 4 和 SEQ ID NO ： 5)。
4CLi 甘蔗系的产生
使用甘蔗 ( 甘蔗属杂交种 ) 变种 CP88-1762 的未成熟的卷叶的横切面在补充了 20g/L 蔗糖和 13.6uM 2， 4-D， pH 调节为 5.8 的改良的 MS 基础培养基 (CI-3)(Chengalrayan 和 Gallo-Meagher， 2001) 上诱导愈伤组织。在诱导了愈伤组织后， 使用如以前描述的 PDS-1000/He 基因枪颗粒递送系统 (Bio-Rad)(James 等人， 2008) 进行基因枪基因转移。如 描述的使用遗传霉素进行选择 (Chengalrayan 和 Gallo-Meagher， 2001)， 但略加修改， 其中 对再生的植物进行了进一步的选择， 即将其在生根阶段在含有巴龙霉素 (30mg/L) 的 MS 基 础培养基中亚培养， 进行 4 次两周一次的亚培养。将发育出健康的根的选定的植物转移至 土壤并转移至温室。
转基因系的表征
在选择和再生植物以后， 通过 NPTII-ELISA 和 PCR 确认转基因甘蔗植物。使用 Pathoscreen nptII ELISA 试剂盒 (Agdia) 根据制造商的说明书进行总蛋白质提取和 NPTII-ELISA。使用 DNeasy Plant Mini 试剂盒 (Qiagen) 从每株再生的植物的展开的叶中 提取基因组 DNA。使用 75ng 基因组 DNA 作为 PCR 模板。为了检测每种表达构建体， 从每个 基因和启动子区设计引物如下 ： 用于 Sc4CL-Mi 和 Sc4CL-Li RNAi 构建体， 4CL SF(5’ -CATCA AGGGTACGGGATGAC-3’ (SEQ ID NO ： 21)) 和 OSPRO SR(5’ -GTAGCCTGCTAGTCTTCTCTCTCATT-3’ ( SEQ ID NO ： 22))。使用 iTaq 聚合酶 (Bio-Rad) 按如下条件进行 PCR ： 35 个循环的 95℃ 30 秒， 58 ℃ 30 秒和 72 ℃ 60 秒。用于 Northern 印迹分析， 从植物的第三片叶 ( 用于 4CL-Li 系 ) 和约 25cm 长的侧分蘖 ( 用于 4CL-Mi 系 ) 中提取总 RNA(Sambrook et at.， 1989)。在 相同的发育阶段从在与转基因植物相同的条件下培养的野生型植物中收集样品。 在电泳和 转移了 20ug 总 RNA 后， 使用来自靶向的 4CL 基因的开放阅读框的放射性标记的探针进行 Northern 杂交。
如 Browning(1967) 描述的分别从 4CL-Li 系和 4CL-Mi 系的衰老的叶和节间中使 用 Klason 程序在转基因甘蔗和非转基因 ( 野生型 ) 甘蔗植物中定量总木质素， 但略加修改 (Yoshihara 等人， 1984)。简单地说， 在研磨干样品 (0.5-1mm 筛选 ) 后， 用 50％的温热乙醇 提取样品以去除可溶性糖， 并干燥。然后， 使用 12M H2SO4 水解 0.1g 干细胞壁样品， 在 30℃ 进行 2 小时。用蒸馏水稀释内含物并高压灭菌 1 小时。高压灭菌后， 通过过滤收集不溶的 材料 ( 木质素和灰分 ) 并称重。然后在 500℃燃烧木质素 5 小时。在此步骤后， 称重灰分并 通过燃烧前和后的重量差异计算木质素。
本文提及和引用的所有专利、 专利申请、 临时申请和出版物以其整体引入作为参 考， 包括所有的图和表， 只要其不与本说明书的明确教导不一致。以下是说明用于实践本发明的程序的实施例。这些实施例不应被视为限制性的。 除非另外指出， 所有百分比是以重量计的， 且所有溶剂混合物比例是以体积计的。
实施例 1—— Sc4CL 基因的分离
在本研究中分离和表征了 2 个全长的和 1 个部分的甘蔗 4CL 基因的序列。 Sc4CL-N 和 Sc4CL-M 的 cDNA 序列具有 1665 和 1728 核苷酸的开放阅读框， 分别编码 555 和 576 氨基 酸的蛋白质。部分的 Sc4CL-L cDNA 序列长 616bp， 其包含 3’ UTR， 和 141 氨基酸残基的开 放阅读框。Sc4CL-N 和 Sc4CL-M 之间的配对比较显示 59％的相似性。Sc4CL-N 与以前鉴定 的 4CL 关联最紧密， 分别显示了与甜高粱的 Sb4CL 样 1 和稻的 Os4CL3 的 96％和 86％的相 似性， 而 Sc4CL-M 与 Sb4CL 样 1 和 Os4CL3 共有较低的相似性， 但其显示了与 Sb4CL 样 2 和 Os4CL3( 分别为 96％和 83％ ) 的较高的相似性。Sc4CL 与拟南芥 At4CL 的推断的氨基酸序 列的比较显示了范围从 60％ -63％的相似性 ( 表 2)。
Sc4CL 和已功能表征的其他 4CL、 白杨 Ptd4CL 和拟南芥 At4CL 之间的比对 ( 通过 CLUSTALW(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl ？ page ＝ /NPSA/npsa_ clustalw.html) 使用默认参数进行 ) 显示了保守的 AMP 结合基序 ( 见， 例如 SEQ ID NO ： 34， 35， 36， 37， 38， 39， 40， 41， 42， 和 43) 和特征基序 “GEICIRG” (SEQ ID NO ： 54)， 其被认为是底 物识别位点 (Ehlting 等人 2001)。系统发生分析显示， 在禾本科中的 4CL 基因家族成员可 被分为 2 个主要的在系统发生上有联系的群组， 组 I 和组 II。Sc4CL-N 和 Sc4CL-M 分别被 归为植物 4CL 组 I 和组 II。组 I 包括玉蜀黍 4CL2、 稻 4CL1、 拟南芥 4CL1、 黑麦草 4CL2、 白 杨 4CL3、 白杨 4CL1、 白杨 4CL2、 拟南芥 4CL2、 甜高粱 04g005210、 玉蜀黍 LOC542166 和玉蜀黍 ACF84437。组 II 包括稻 4CL2、 甜高粱 04g031010、 拟南芥 4CL3、 黑麦草 4CL1、 白杨 4CL4、 拟 南芥 4CL4、 稻 4CL3、 稻 4CL5、 甜高粱 10g026130、 黑麦草 4CL3 和稻 4CL4。
表 2.4CL 氨基酸序列之间的百分比相似性
Sc ： 甘蔗， Sb ： 甜高粱， Os ： 稻， At ： 拟南芥
实施例 2—— 4CL 基因的表达谱
甘蔗 4CL-M 主要在茎中表达， 而 Sc4CL-L 主要在叶中表达 ( 表 3)。这提示， 可以组 织特异性方式调控不同 4CL 基因的表达， 并提供了在特定组织中抑制木质素的机会。
表 3.Sc4CL 基因的组织和栽培品种特异性表达
-L、 S 和 N 分别表示叶、 茎和节。
实施例 3—— 4CL 下调的甘蔗的生成
RNAi 是用于作物改良和研究基因功能的有力工具。因此， 为了研究每个 4CL 基因 产物在木质素生物合成中的生理作用， 利用 Sc4CL 的序列信息生成了 4CL 下调的甘蔗， 生 成了 2 个靶向 Sc4CL-L 和 Sc4CL-M 基因的不同区域的、 处于木质部特异性启动子、 稻香豆 酸 -4- 羟化酶 (C4H) 启动子 (Fouad 和 Altpeter， 尚未发表 ) 和 CaMV 35S 多聚腺苷酸信号 控制下的 RNA 抑制构建体 (SEQ ID NO ： 4 和 SEQ ID NO ： 5)。使用基因枪基因转移， 将生成 的具有处于具有第一内含子、 35S 3’ UTR 的强组成型玉米泛素启动子 (pUbi) 调控下的可选 择的 nptII 基因的抑制盒各自或同时共同引入胚发生甘蔗愈伤组织。当生成若干转基因系 时， 使用 nptII/ 遗传霉素和巴龙霉素选择系统进行转基因事件的选择。
利用 2 个生成的抑制盒进行了共 88 次轰击， 并在愈伤组织选择后再生了 160 株植 物。使用 Pathoscreen nptII ELISA 试剂盒 ( 表 4)， 152 株独立的植物显示了 NPTII 表达。 使用 PCR 确认了在转基因植物的基因组 DNA 中 4CL-RNAi 抑制盒的存在 ( 表 4)。
在转基因甘蔗植物中的甘蔗 4CL 的表达分析指示了相比非转基因 (WT) 甘蔗， 在若 干转基因甘蔗植物中 Sc4CL-L( 表 5) 和 Sc4CL-M 基因 ( 表 6) 的抑制。
表 4. 转基因 4CLi 甘蔗的总结
NA ＝未分析的 表 5. 在甘蔗 4CL-Li 转基因植物的衰老的叶中的 4CL-L 基因表达水平和木质素含量
1- 相对 WT 表达 (100％ ) 的基于 RNA 印迹分析的表达 2-2-3 次生物学重复的平均值， 通过分析相同基因型的 2-3 株个体植物生成。 表 6. 在甘蔗 4CL-Mi 转基因植物的未成熟的节间中的 4CL-M 基因表达水平和木质素含量
1- 基于相对 WT 表达 (100％ ) 的 RNA 印迹分析的表达
2-2 次生物学重复的平均值， 通过分析相同基因型的 2 株个体植物生成。
实施例 4- 具有减少的木质素的甘蔗的生成
根据标准方案在品系中使用 Klason 程序在 4CL-Li 转基因植物和非转基因甘蔗的 衰老的叶中定量总木质素。如在表 5 中所示， Klason 木质素在非转基因甘蔗植物的衰老的 叶中为约 23.6％。相对而言， 具有 4CL-L 基因抑制的转基因系 14-2A 在衰老的叶中具有平 均 21％的 Klason 木质素 ( 表 5)， 表明通过 4CL-L 抑制总木质素减少了 11％。也在 4CL-Mi 系 ( 表 6) 和野生型植物中的未成熟的节间中分析了木质素。品系 4a 展示了相比野生型植 物的约 8％的总木质素的减少。品系 5b-A1 也显示了类似水平的木质素减少 ( 表 6)。预期 在成熟的节间中在这些转基因 4CL-Mi 植物中的更高的木质素减少， 在成熟的节间中非转 基因植物的木质素含量增加至超过 20％。
实施例 5—— 4CLM 表达的定量 PCR 分析
定量实时 RT-PCR 分析确认了在若干转基因系中的 4CLM 抑制。 表 7 显示了 4CLM 基 因相对参考基因 ( 甘蔗 GAPDH) 的相对表达比例。表 7 显示了在包括品系 4A 和 5BA1 的转 基因甘蔗系中的 4CLM 转录物的强抑制。收获发育匹配的侧分蘖并从第一节间提取总 RNA。 从 3’ UTR 设计 4CLM 基因特异性引物。平行进行所有反应， 且一式三份进行每个反应。使用 Q- 基因软件计算标准误。
表 7.4CLM 表达的定量 PCR 分析
实施例 6——植物 4CL 基因间的进化趋异的估计
在表 8 中显示了甘蔗 4CL 和其他植物 4CL 间的分析中的每个位点上的氨基酸取代 数。所有结果基于氨基酸序列的配对分析。使用 MEGA4(Zuckerkandl 和 Pauling(1965) ； Tamura 等人 (2007)) 中的泊松校正法进行分析。 从数据集中去除含有缺口和缺失数据的所 有位置 ( 完全缺失选项 )。在最终的数据集中共有 513 个位置。
表 8. 植物 4CL 间的进化趋异的估计
Sc ： 甘蔗， Sb ： 甜高粱， Zm ： 玉蜀黍， At ： 拟南芥， Lp ： 黑麦草， Os ： 稻， Po ： 白杨杂种 ( 毛果杨 (Populus trichocarpa)x 美洲黑杨 (Populusdeltoids))
表 8 继续
Sc ： 甘蔗， Sb ： 甜高粱， Zm ： 玉蜀黍， At ： 拟南芥， Lp ： 黑麦草， Os ： 稻， Po ： 白杨杂种 ( 毛果杨 (Populus trichocarpa)x 美洲黑杨 (Populusdeltoids))
表 8 继续
Sc ： 甘蔗， Sb ： 甜高粱， Zm ： 玉蜀黍， At ： 拟南芥， Lp ： 黑麦草， Os ： 稻， Po ： 白杨杂种 ( 毛果杨 (Populus trichocaroa)x 美洲黑杨 (Populusdeltoids))
应当理解， 本文描述的实施例和实施方案仅是为了说明的目的， 对本领域技术人 员建议根据其的多种修改或变化， 且这些修改和变化将被包括在本申请的精神和范围内和 随附的权利要求书的范围内。另外， 本文公开的任意发明或其实施方案的任意元素或限制 可与本文公开的任意其他发明或其实施方案的任意和 / 或所有其他元素或限制 ( 分别地或 以任意组合 ) 组合， 且所有这些组合视为在本发明的范围内， 而不加限制。
参考文献
美国专利号 4,761,373
美国专利号 4,769,061
美国专利号 4,810,648
美国专利号 4,940,835 美国专利号 4,945,050 美国专利号 4,975,374 美国专利号 4,987,071 美国专利号 5,013,659 美国专利号 5,023,179 美国专利号 5,034,322 美国专利号 5,036,006 美国专利号 5,093,246 美国专利号 5,100,792 美国专利号 5,106,739 美国专利号 5,116,742 美国专利号 5,162,602 美国专利号 5,256,558 美国专利号 5,270,163 美国专利号 5,276,268 美国专利号 5,304,730 美国专利号 5,495,071 美国专利号 5,554,798 美国专利号 5,561,236 美国专利号 5,569,823 美国专利号 5,582,981 美国专利号 5,589,610 美国专利号 5,591,616 美国专利号 5,595,877 美国专利号 5,599,672 美国专利号 5,625,136 美国专利号 5,639,948 美国专利号 5,661,017 美国专利号 5,723,763 美国专利号 5,767,366 美国专利号 5,817,785 美国专利号 5,879,903 美国专利号 5,928,937 美国专利号 6,084,155 美国专利号 6,329,504 美国专利号 6,337,431 美国专利号 6,344,318 美国专利号 6,455,760美国专利号 6,462,185
美国专利号 6,506,559
美国专利号 6,696,623
美国专利号 6,933,116
美国专利号 7,056,704
美国专利号 7,078,196
美国专利号 7,232,086
美国专利号 7,282,564
美国专利号 7,365,058
美国专利号 7,368,236
美国专利号 7,538,095
美国专利号 7,700,759
美国专利号 7,723,575
美国公开的申请号 20010016956
美国公开的申请号 20030084486
美国公开的申请号 20030177536
美国公开的申请号 20040019934
美国公开的申请号 20040067506
美国公开的申请号 20040078841
美国公开的申请号 20040123349
美国公开的申请号 20060260011
美国公开的申请号 2007006346
美国公开的申请号 20090031441
美国公开的申请号 20090199307
PCT 公开的申请号 WO 93/07278
PCT 公开的申请号 WO 93/21335
EP 0242246
EP 0292435
EP 0392225
EP 138341
EP 295959
Agrawal 等 人 (2003)Microbiology and Molecular Biology Reviews， 67(4) ： 657-685.
Altschul， S.F. 等 人 (1990)“Basic Local Alignment Search Tool” J.Mol. Biol.215 ： 403-410.
Altschul， S.F. 等人 (1997)“Gapped BLAST and PSI-BLAST ： A NewGeneration of Protein Database Search Programs” Nucl.AcidsRes.25 ： 3389-3402.
Bartel， D. 和 Szostak， J.W.Science 261 ： 1411-1418(1993).
Bassett， C.L.， Callahan， A.， Artlip， T.， Scorza， R.Srinivasan， C.(2007)“Aminimal peach type II chlorophyll a/b-binding proteinpromoter retains tissue-specificity and light regulation intomato” BMC Biotechnol.， 7： 47.
Beltz ，G.A. ，Jacobs ，K.A. ，Eickbush ，T.H. ，Cherbas ，P.T. ，Kafatos ， F.C.(1983)“Isolation of multigene families and determinationof homologies by filter hybridization methods” Methods ofEnzymology， R.Wu， L.Grossman 和 K.Moldave[eds.]AcademicPress， New York 100 ： 266-285.
B e v a n ，M . ( 1 9 8 4 ) “ B i n a r y A g r o b a c t e r i u m v e c t o r s f o r planttransformation” Nucl.Acids Res.， 12(22) ： 8711-21.
Browning， B.L.1967.Methods of wood chemistry.Wiley-Interscience， New York.
Brusslan， J.A. 和 Tobin， E.M.(1992)“Light-independentdevelopmental regulation of cab gene expression in Arabidopsisthaliana seedlings” Proc Natl Acad Sci USA， 89(16) ： 7791-5.
Bustos 等人 (1989)Plant Cell， 1： 839-854.
Chandler 等 人 (1989)“Two Regulatory Genes of the Maize AnthocyaninPathway Are Homologous ： Isolation of B Utilizing R GenomicSequences” The Plant Cell， 1： 1175-1183. Chengalrayan， K. 和 Gallo-Meagher， M.(2001)“Effect of variousgrowth regulators on shoot regeneration of sugarcane” In VitroCell.Dev.Biol.Plant， 37 ： 434 439.
Clancy， M. 和 Hannah， L.C.(2002)“Splicing of the maize Sh1 firstintron is essential for enhancement of gene expression， and aT-rich motif increases expression without affecting splicing” Plant Physiol.130(2) ： 918-29.
Deblaere， R.， Reynaerts， A.， Hofte， H.， Hernalsteens， J.-P.， Leemans， J.， 和 Van Montagu， M.(1987)“Vectors for cloning in plantcells” Methods Enzymol.， 153 ： 77-292.
Doran， T. 和 Helliwell， C.(2009)RNA interference ： Methods forplants and animals ； Publisher ： CABI， Wallingford， UK.Ebert 等人 (1987)Proc.Nat′ l Acad.Sci. USA.84 ： 5745-5749.
Ehlting， J.， Buttner， D.， Wang， Q.， Douglas， C.J.， Somssich， I.， 和 Kombrink， E.(1999).Three 4-coumarate ： coenzyme A ligasesin Arabidopsis thaliana represent two evolutionarily divergentclasses in angiosperms.Plant J.19， 920.
Ellington， A.D. 和 Szostak， J.W.(1990) “In vitro selection of RNAmolecules that bind specific ligands” Nature， 346(6287) ： 818-822.
Fromm 等人 Biotechnology 8 ： 833-839(1990).
Good， X. 等人 (1994)“Reduced ethylene synthesis by transgenictomatoes expressing S-adenosylmethionine hydrolase” PlantMolec.Biol.26 ： 781-790.
Gordon-Kamm 等人 PlANt Cell 2 ： 603-618(1990).
Green 等人， EMBO J.， 7： 4035-4044(1988).
Haselhoff 和 Gerlach Nature 334 ： 585-591(1988).
Hofgen&Willmitzer， Nucl.Acids Res.16 ： 9877(1988).
Hoppe-Seyler， F. 和 Butz， K.(2000)“Peptide aptamers ： powerful newtools for molecular medicine” J.Mol.Med.， 78(8) ： 426-430.
Hudspeth 等人 (1989)Plant Mol.Biol.， 12 ： 579-589.
James VA， Neibaur I， Altpeter F ： Stress inducible expression of theDREB1A transcription factor from xeric， Hordeum spontaneum L.in turf and forage grass(Paspalum notatum Flugge)enhancesabiotic stress tolerance.Transgenic Res 2008， 17 ： 93-104.
Jordano 等人， Plant Cell， 1： 855-866(1989).
Karlin S.， Altschul， S.F.(1990)“Methods for Assessing theStatistical Significance of Molecular Sequence Features byUsing General Scoring Schemes” Proc.Natl.Acad.Sci.USA87 ： 2264-2268.
Karlin S.， Altschul， S.F.(1993) “Applications and Statistics forMultiple High-Scoring Segments in Molecular Sequences” Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90 ： 5873-5877. Klein 等人 (1987)Nature 327 ： 70-73.
Koziel 等人 (1993)Biotechnology 11 ： 194-200.
Kusaba(2004)Current Opinion in Biotechnology， 15 ： 139-143.
Kwon 等人 (1994)Plant Physiol.105 ： 357-67.
Lawton 等人 (1987)Plant Mol.Biol.9 ： 315-324.
Maniatis ， T. ， Fritsch ， E.F. ， Sambrook ， J.(1982)Molecular Cloning ： A Laboratory Manual， Cold Spring Harbor Laboratory， Cold SpringHarbor， NY.
Matsuoka 等人 (1993) “Tissue-specific light regulatedexpression directed by the promoter of a C4 gene， maize pyruvate， orthophosphate dikinase， in a C3 plant， rice” PNAS USA， 90(20) ： 9586-90.
Matsuoka 等人 (1994)Plant J.6 ： 311-319.
Mayo， O.(1987)The Theory of Plant Breeding， Second Edition， Clarendon Press， Oxford.
Meier 等人 (1991)Plant Cell， 3： 309-316.
Milhavet 等人 (2003)Pharmacological Reviews， 55(4) ： 629-648.
Odell 等人 (1985)Nature 313 ： 810-812.
Paszkowski 等人 (1984)EMBO J.3 ： 2717-2722.
Potrykus 等人 (1985)Mol.Gen.Genet.199 ： 169-177.
Reich 等人 (1986)Biotechnology 4 ： 1001-1004.
Richins 等人 (1987)Nucleic Acids Res.20 ： 8451.
Sambrook， J.， Fritsch， E.F.， 和 Maniatis， T.(1989)Molecular Cloning ： A Laboratory Manual. 卷 1 和 3.Cold Spring Harbor LaboratoryPress， Cold Spring Harbor， NY.
Singh， D.P.(1986)Breeding for Resistance to Diseases and InsectPests， Springer-Verlag， NY.
Sullivan 等 人 (1989)“Isolation and characterization of a maizechlorophyll a/b binding protein gene that produces high levelsof mRNA in the dark” Mol.Gen.Genet.， 215(3) ： 431-440.
Tamura K.， Dudley J.， Nei M.， 和 Kumar S(2007)MEGA4 ： MolecularEvolutionary Genetics Analysis(MEGA)software version 4.0.Molecular Biology and Evolution 24 ： 1596-1599.
Theander， O.， 和 E.A.Westerlund(1986).Studies on dietary fiber.3.Improved procedures for analysis of dietary fiber.J.Agric.Food Chem.34 ： 330 336
Uknes 等人 (1993)Plant Cell 5 ： 159-169.
Walker 等人 (1987)Proc.Nat′ l Acad.Sci.USA， 84 ： 6624-6628.
Wang 等 人 (1992)“Characterization of cis-Acting ElementsRegulating Transcription from the Promoter of a ConstitutivelyActive Rice Actin Gene” Molecular and Cellular Biology， 12(8) ： 3399-3406.
Welsh J.R.(1981)Fundamentals of Plant Genetics and Breeding ， JohnWiley&Sons， NY.
Wood D.R.(1983)(Ed.)Crop Breeding， American Society of AgronomyMadison， Wis.
Wricke 和 Weber(1986)Quantitative Genetics and Selection PlantBreeding， Walter de Gruyter and Co.， Berlin.
www.lifesci.sus sex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/
Xu， D.， McElroy， D.， Thornburg， R.W.， Wu， R. 等人 (1993)“Systemicinduction of a potato pin2 promoter by wounding， methyljasmonate， and abscisicacid in transgenicrice plants” PlantMolecular Biology 22 ： 573-588.
Yamamoto 等人 (1994)Plant Cell Physiol.35 ： 773-778.
Yamamoto 等人 (1997)Plant J.12(2) ： 255-265.
Yang 等人 (1990)Proc.Nat′ l Acad.Sci.USA， 87 ： 4144-4148.
Yang， T.T. 等人 (1996)“Optimized Codon Usage and ChromophoreMutations Provide Enhanced Sensitivity with the GreenFluorescent Protein” Nucleic Acid Research 24(22) ： 4592-4593.
Y o s h i h a r a ，K . ，T . K o b a y a s h i ，T . F u j i i ， 和 I . A k a m a t s u ( 1 9 8 4 ) . A novelmodification of Klason lignin quantitative method.J.JapanTappi 38 ： 86 95.
Zhang 等人 (1996)Plant Physiology， 110 ： 1069-1079.
Zubieta， C， Kota， P， Ferrer， J.L.， Dixon， R.A.， Noel， J.P.(2002)“Structural basis for the modulation of lignin monomermethylation by caffeic acid/5-hydroxyferulic acid3/5-O-methyltransferase” Plant Cell.， 14(6) ： 1265-77.
Zuckerkandl E&Paul ing L(1965)Evolutionary divergence andconvergence in proteins， pp.97-166 in Evolving Genes andProteins， edited by V.Bryson 和H.J.Vogel.Academic Press， NewYork.36CN 102458099 A
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SEQ ID NO ： 23 是甜高粱 (Sorghum bicolor)04g005210(XP_002451647) 的 4CL 多 肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO ： 24 是甜高粱 10g026130(XP_002438783) 的 4CL 多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO ： 25 是甜高粱 04g031010(XP_002452704) 的 4CL 多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO ： 26 是玉蜀黍 (Zea mays)LOC542166(NP_001105258) 的 4CL 多肽的氨 基酸序列。
SEQ ID NO ： 27 是黑麦草 (Lolium perenne)4CL3(AAF37734) 的 4CL 多肽的氨基酸 序列。
SEQ ID NO ： 28 是黑麦草 4CL2(AAF37733) 的 4CL 多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO ： 29 是黑麦草 4CL1(AAF37732) 的 4CL 多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO ： 30 是稻 (Oryza sativa)4CL3(NP_001046069) 的 4CL 多肽的氨基酸序 列。
SEQ ID NO ： 31 是稻 4CL4(NP_001058252) 的 4CL 多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO ： 32 是稻 4CL1(NP_001061353) 的 4CL 多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO ： 33 是稻 4CL2(NP_001047819) 的 4CL 多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO ： 34 显示了拟南芥 4CL1 的保守的 AMP 结合基序。
SEQ ID NO ： 35 显示了拟南芥 4CL2 的保守的 AMP 结合基序。
SEQ ID NO ： 36 显示了拟南芥 4CL3 的保守的 AMP 结合基序。
SEQ ID NO ： 37 显示了拟南芥 4CL4 的保守的 AMP 结合基序。
SEQ ID NO ： 38 显示了白杨 4CL1 的保守的 AMP 结合基序。
SEQ ID NO ： 39 显示了白杨 4CL2 的保守的 AMP 结合基序。
SEQ ID NO ： 40 显示了白杨 4CL3 的保守的 AMP 结合基序。
SEQ ID NO ： 41 显示了白杨 4CL4 的保守的 AMP 结合基序。SEQ ID NO ： 42 显示了甘蔗 4CL1 的保守的 AMP 结合基序。
SEQ ID NO ： 43 显示了甘蔗 4CLM 的保守的 AMP 结合基序。
SEQ ID NO ： 44 显示了拟南芥 4CL1 的特征基序。
SEQ ID NO ： 45 显示了拟南芥 4CL2 的特征基序。
SEQ ID NO ： 46 显示了拟南芥 4CL3 的特征基序。
SEQ ID NO ： 47 显示了拟南芥 4CL4 的特征基序。
SEQ ID NO ： 48 显示了白杨 4CL1 的特征基序。
SEQ ID NO ： 49 显示了白杨 4CL2 的特征基序。
SEQ ID NO ： 50 显示了白杨 4CL3 的特征基序。
SEQ ID NO ： 51 显示了白杨 4CL4 的特征基序。
SEQ ID NO ： 52 显示了甘蔗 4CL1 的特征基序。
SEQ ID NO ： 53 显示了甘蔗 4CLM 的特征基序。
SEQ ID NO ： 54 显示了 4CL 基因的共同的特征基序。
发明详述
本发明涉及调节植物 ( 特别是甘蔗植物 ) 中木质素生物合成的材料和方法。在一 个实施方案中， 在植物中下调了木质素生物合成。本发明设想使用可用于抑制或降低基因 表达 ( 包括在转录、 转录后和翻译水平上 ) 和 / 或基因编码的蛋白质的功能或活性的任何 方法。可被靶向从而实现甘蔗中木质素生物合成的下调的基因及其编码的蛋白质包括， 但 不限于， 4- 香豆酸 -CoA 连接酶 (4CL)。在一个实施方案中， 4CL 基因编码包含 AMP 结合基 序序列 ( 例如 SEQ ID NO ： 34) 和 / 或 SEQ ID NO ： 54 的特征基序序列的 4CL 多肽。在一个 实施方案中， 4CL 基因是 4CL-M， 4CL-L， 或 4CL-N。在一个实施方案中， 4CL-L 基因编码具有 SEQ ID NO ： 6 中所示的氨基酸序列的多肽， 或其片段或变体。在另一个实施方案中， 4CL-M 基因编码具有 SEQ IDNO ： 7 中所示的氨基酸序列的多肽， 或其片段或变体。在另一个实施 方案中， 4CL-N 基因编码具有 SEQ ID NO ： 8 中所示的氨基酸序列的多肽， 或其片段或变体。 在特定的实施方案中， 4CL-L 基因包含 SEQ ID NO ： 1 中所示的核苷酸序列的全部或部分， 和 4CL-M 基因包含 SEQ ID NO ： 2 中所示的核苷酸序列的全部或部分。在特定的实施方案中， 4CL-N 基因包含 SEQ ID NO ： 3 中所示的核苷酸序列的全部或部分。
使用本领域已知的标准技术， 可抑制或下调甘蔗植物中一种或多种靶基因的表 达。在一个实施方案中， 在叶细胞和 / 或组织中选择性下调木质素生物合成。在特定的实 施方案中， 抑制或下调一种或多种 4CL 基因的表达和 / 或 4CL 基因编码的蛋白质的翻译或 功能。在一个实施方案中， 4CL 基因编码包含 AMP 结合基序序列 ( 例如 SEQ ID NO ： 34) 和 / 或 SEQ ID NO ： 54 的特征基序序列的 4CL 多肽。 在更特定的实施方案中， 抑制或下调 4CL-M， 4CL-L， 和 / 或 4CL-N 基因的表达。 在一个实施方案中， 使用反义技术下调靶基因的表达。 在 另一个实施方案中， 可使用共抑制技术抑制或下调靶基因的表达。 在另一个实施方案中， 使 用 RNA 干扰 (RNAi) 技术下调靶基因的表达， 包括例如使用短干扰 RNA(siRNA)。 在另一个实 施方案中， 可在本发明的甘蔗植物中提供靶基因的突变， 例如 “敲除” 突变。也可抑制靶基 因编码的蛋白质的表达和 / 或活性 ( 例如酶活性 )， 例如通过使蛋白质接触结合蛋白质并阻 碍其功能活性的抗体或适体。
可使用反义技术抑制参与甘蔗中木质素生物合成的靶基因的表达。在反义方法中， 在植物细胞中提供与靶基因的 mRNA 的核苷酸序列杂交的核酸。可在甘蔗植物的基因组 中掺入 ( 例如稳定地 ) 在表达时提供与 mRNA 杂交的核酸的核酸构建体。反义核酸可与靶 序列的整条编码链、 或其部分、 或靶序列的非编码部分、 或靶序列的编码和非编码两部分杂 交。反义构建体可与同反义核酸杂交的 mRNA 的部分具有例如至少约 70％、 至少约 75％、 至少约 80％、 至少约 85％、 至少约 90％、 至少约 95％、 至少约 96％、 97％、 98％或 99％的序 列同一性， 或高达 100％的序列同一性。反义核酸可包含任意合适的核苷酸数。例如， 本发 明的反义核酸构建体可包含至少 5， 6， 7， 8， 9， 10， 11， 12， 13， 14， 15， 16， 17， 18， 19， 20， 21， 22， 23， 24， 25， 26， 27， 28， 29， 30， 31， 32， 33， 34， 35， 36， 37， 38， 39， 40 或更多个核苷酸。在一个实 施方案中， 反义核酸包含至少约 40、 或至少约 50、 或至少约 60、 或至少约 70、 或至少约 80、 或 至少约 90、 或至少约 100、 或至少约 150、 或至少约 200、 或至少约 250、 或至少约 300、 或至少 约 350、 或至少约 400、 或至少约 450、 或至少约 500、 或至少约 550、 或至少约 600 或更多个核 苷酸。在一个实施方案中， 反义构建体在植物的叶细胞和 / 或组织中选择性表达， 例如通过 使用叶特异性启动子。下调或抑制靶基因表达的反义方法是本领域已知的。可从用核酸构 建体转化的和 / 或掺入核酸构建体的细胞培养包含和表达反义核酸构建体的植物。
也可使用共抑制或转录后基因沉默 (PTGS) 技术抑制参与甘蔗中木质素生物合成 的靶基因的表达。大体上， 在植物细胞中以正向和在适于核酸表达的构建体中 ( 例如， 包 含与能够在植物细胞中驱动转录的启动子序列有效连接的核酸的构建体 ) 提供对应靶基 因序列且与其具有序列同源性的核酸序列。核酸可与靶基因序列具有例如至少约 70％、 至 少约 75％、 至少约 80％、 至少约 85％、 至少约 90％、 至少约 95％、 至少约 96％、 97％、 98％或 99％的序列同一性， 或高达 100％的序列同一性。在一个实施方案中， 核酸构建体在植物的 叶细胞和 / 或组织中选择性表达， 例如通过使用叶特异性启动子。可从用核酸构建体转化 的和 / 或掺入核酸构建体的细胞培养包含和表达核酸构建体的植物。
也可使用 RNA 干扰 (RNAi) 技术抑制参与甘蔗中木质素生物合成的靶基因的表达。 在 RNAi 中， 在植物细胞中提供与靶基因表达的 mRNA 的全部或部分互补的双链 RNA 分子。 双 链 RNA 分子被加工为较小的 RNA 分子， 其然后被加工进沉默复合物， 所述沉默复合物导致靶 基因表达的抑制， 例如通过切割靶基因 mRNA。大体上， RNAi 分子具有 100 或更多个核苷酸， 更典型地具有 200 或更多个核苷酸。 可通过在细胞中引入和表达导致 RNAi 分子转录和产生 的核酸构建体提供 RNAi 分子。在一个实施方案中， 通过表达提供微 RNA(miRNA) 的核酸的 RNA 干扰视为包含在本发明的范围内。 miRNA 一般是已经从包含发夹结构的较长的前体 RNA 上被加工的 19-23 个核苷酸的 RNA。 在另一个实施方案中， 通过表达提供短干扰 RNA(siRNA) 的核酸的 RNA 干扰视为包含在本发明的范围内。 siRNA 一般是已经从较长的前体双链 RNA 上 被加工的具有 3’ 突出端的 20-25 个核苷酸的 RNA。 可从用提供 RNAi 分子的多核苷酸分子转 化的和 / 或掺入上述多核苷酸分子的细胞培养包含和表达 RNAi 分子 ( 包括 miRNA 和 siRNA) 的植物。在例如美国专利号 7,056,704 ； 7,078,196 ； 7,365,058 ； 7,232,086 ； 6,506,559 ； 7,282,564 ； 和 7,538,095 中已描述了用于 RNA 干扰的方法和材料， 并在 Milhavet 等人 (2003) ； Agrawal 等人 (2003) ； Kusaba(2004) ； 以及 Doran 和 Helliwell(2009) 中综述。在 一个实施方案中， 本发明的用于抑制植物中的 4CL 基因表达的 RNAi 构建体包含 SEQ ID NO ： 4 或 SEQ ID NO ： 5 的核苷酸序列的全部或部分。在特定的实施方案中， 在植物的叶细胞和 / 或组织中选择性表达 RNAi 分子， 例如通过使用叶特异性启动子。也可使用核酶技术抑制参与甘蔗中木质素生物合成的靶基因的表达。 核酶是一类 RNA， 其可被设计为以特异性的序列依赖性方式酶促切割和失活其他 RNA 靶。通过切割靶 RNA， 核酶抑制翻译， 因此阻止靶基因的表达。使用本领域已知的方法可在实验室化学合成 核酶并在结构上改造以提高其稳定性和催化活性。通过本领域已知的基因递送机制， 可将 编码核酶的核苷酸序列引入植物细胞并掺入植物基因组。可从用核酶编码序列转化的和 / 或掺入核酶编码序列的细胞培养包含和表达核酶编码序列的植物。具有对 4CL 的特异性的 核酶可包括与一种或多种 4CL mRNA 的至少一部分的核苷酸序列互补的一种或多种序列， 和 具有已知的负责 mRNA 切割的催化序列的序列 ( 见美国专利号 5,093,246 或 Haselhoff 等 人 1988)。例如， 可构建四膜虫 (Tetrahymena)L-19 IVS RNA 的衍生物， 其中活性位点的核 苷酸序列与将要在 4CL mRNA 中切割的核苷酸序列互补 ( 见例如美国专利号 4,987,071 ； 和 美国专利号 5,116,742)。可选地， 可使用编码 4CL 蛋白质的 4CL mRNA 从 RNA 分子库中选择 具有特定核糖核酸酶活性的催化 RNA( 见例如 Bartel 等人 1993)。 在一个实施方案中， 在植 物的叶细胞和 / 或组织中选择性表达核酶， 例如通过使用叶特异性启动子。
除了抑制参与甘蔗中的木质素生物合成的靶基因以外， 本发明还设想在靶基因中 的突变， 或其中可对植物细胞提供突变的基因， 在所述植物细胞中靶基因表达或基因产物 水平或活性被降低或抑制。在一个实施方案中， 将突变的 4CL 基因掺入甘蔗植物的基因组， 其中突变的 4CL 基因展示基因转录物或其翻译的减少的或无表达。在一个实施方案中， 在 植物的 4CL 基因中引入突变， 所述突变导致 4CL 基因的转录减少， 或 mRNA 的翻译减少， 和/ 或导致展示降低的酶活性的蛋白质。在特定的实施方案中， 在 4CL 基因的蛋白质编码区引 入一种或多种突变。在另一个实施方案中， 在 4CL 基因转录起始位点的上游和 / 或转录起 始位点的下游引入突变。在一个实施方案中， 在 4CL 基因调控序列中或附近， 例如在启动子 序列中引入突变。突变可阻碍或抑制 4CL 基因序列的转录， 例如通过阻碍或抑制转录因子 或聚合酶结合 4CL 核酸序列。在一个实施方案中， 在植物的叶细胞和 / 或叶组织中选择性 引入 4CL 基因中的突变。突变也可包括抑制或降低 4CL 多肽的功能活性 ( 例如酶活性 ) 的 一种或多种核苷酸或氨基酸插入、 缺失和 / 或取代。创造和引入突变的方法是本领域已知 的。在一个实施方案中， 在植物中的一个或多个野生型 4CL 基因中引入突变。在另一个实 施方案中， 突变的 4CL 基因替换植物中的一个或多个野生型 4CL 基因。在一个实施方案中， 在植物的叶细胞和 / 或组织中选择性表达突变的 4CL 基因。
除了抑制或遏制参与木质素生物合成的靶基因以外， 也可抑制由本发明的靶基因 编码的蛋白质的活性 ( 例如酶活性 )。 在一个实施方案中， 可在甘蔗植物的细胞中掺入和表 达编码与蛋白质结合并抑制其活性 ( 例如酶活性 ) 的抗体或其抗原结合片段的核酸。可从 用所述核酸转化的和 / 或掺入所述核酸的细胞培养包含和表达编码抗体或其抗原结合片 段的核酸的植物。 制备结合和抑制特定靶蛋白的抗体的方法和获得编码抗体的核酸的方法 是本领域熟知的。在一个实施方案中， 抗体是单克隆抗体， 或其抗原结合片段。抗原结合片 段包括， 但不限于 F(ab′ )2， Fab′， Fab， 和 Fv， 并可使用本领域已知的标准方法制备。抗体 可来源于能够产生针对靶蛋白表位的抗体的任意动物， 并包括例如人、 灵长类、 小鼠、 大鼠、 山羊、 绵羊、 猪和牛。在特定的实施方案中， 抗体结合 4CL 蛋白。在一个实施方案中， 4CL 基 因编码包含 AMP 结合基序序列 ( 例如 SEQ ID NO ： 34) 和 / 或 SEQ IDNO ： 54 的特征基序序列 的 4CL 多肽。在更特定的实施方案中， 4CL 蛋白由 4CL-M 基因、 4CL-L 基因或 4CL-N 基因编码。在特定的实施方案中， 4CL-L 基因包含 SEQ ID NO ： 1 中所示的核苷酸序列的全部或部 分， 4CL-M 基因包含 SEQ ID NO ： 2 中所示的核苷酸序列的全部或部分， 4CL-N 基因包含 SEQ IDNO ： 3 中所示的核苷酸序列的全部或部分。在一个实施方案中， 4CL-M， 4CL-L 和 4CL-N 基 因分别编码具有 SEQ ID NO ： 6、 7 和 8 中所示的氨基酸序列的多肽， 或其片段或变体。在一 个实施方案中， 抗体与包含 SEQ ID NO ： 6、 7 和 8 中的氨基酸序列的 4CL 蛋白， 或其片段或表 位结合。 在特定的实施方案中， 在植物的叶组织中选择性表达编码抗体的核酸， 例如通过使 用叶特异性启动子。
也可通过表达和 / 或使靶蛋白接触结合特定靶蛋白的适体抑制参与木质素生物 合成的靶基因编码的蛋白质的活性 ( 例如酶活性 )。适体是可被选择用于结合靶分子的 寡核苷酸或肽 ( 见， 例如， Ellington 和 Szostak(1990) 以及 Hoppe-Seyler 和 Butz(2000) 和 美 国 专 利 号 5,582,981 ； 5,270,163 ； 5,595,877 ； 5,817,785 ； 6,344,318 ； 6,933,116 ； 7,368,236 ； 和 7,700,759)。在一个实施方案中， 在植物细胞中掺入和表达编码与参与木 质素生物合成的蛋白结合的适体的核酸。可从用所述核酸转化的和 / 或掺入所述核酸的 细胞培养包含和表达编码适体的核酸的植物。在一个实施方案中， 适体结合并抑制 4CL 蛋 白。在一个实施方案中， 4CL 基因编码包含 AMP 结合基序序列 ( 例如 SEQ ID NO ： 34) 和 / 或 SEQ ID NO ： 54 的特征基序序列的 4CL 多肽。在特定的实施方案中， 4CL 蛋白由本发明的 4CL-L、 4CL-M 或 4CL-N 基因编码。在特定的实施方案中， 4CL-L 基因包含 SEQ IDNO ： 1 中所 示的核苷酸序列的全部或部分， 4CL-M 基因包含 SEQ ID NO ： 2 中所示的核苷酸序列的全部 或部分， 4CL-N 基因包含 SEQ ID NO ： 3 中所示的核苷酸序列的全部或部分。在一个实施方 案中， 4CL-M， 4CL-L 和 4CL-N 基因分别编码具有 SEQ ID NO ： 6、 7 和 8 中所示的氨基酸序列 的多肽， 或其片段或变体。在一个实施方案中， 适体与包含 SEQ ID NO ： 6、 7 和 8 中的氨基酸 序列的 4CL 蛋白， 或其片段或表位结合。在特定的实施方案中， 在植物的叶组织中选择性表 达编码适体的核酸， 例如通过使用叶特异性启动子。
本发明也涉及甘蔗植物， 其中木质素生物合成已被调节 ( 例如， 下调 )。在一个实 施方案中， 在叶细胞和 / 或组织中选择性下调木质素生物合成。在一个实施方案中， 在甘蔗 植物中抑制或下调一种或多种 4CL 基因的表达和 / 或由 4CL 基因编码的蛋白质的翻译或 活性。在一个实施方案中， 4CL 基因编码包含 AMP 结合基序序列 ( 例如 SEQ ID NO ： 34) 和 / 或 SEQ ID NO ： 54 的特征基序序列的 4CL 多肽。在一个实施方案中， 被抑制的 4CL 基因是 4CL-L， 4CL-M 或 4CL-N。在一个实施方案中， 4CL-M， 4CL-L 和 4CL-N 基因分别编码具有 SEQ ID NO ： 6、 7 和 8 中所示的氨基酸序列的多肽， 或其片段或变体。 在特定的实施方案中， 4CL-L 基因包含 SEQ ID NO ： 1 中所示的核苷酸序列的全部或部分， 4CL-M 基因包含 SEQ ID NO ： 2 中所示的核苷酸序列的全部或部分， 4CL-N 基因包含 SEQ ID NO ： 3 中所示的核苷酸序列的 全部或部分。本发明的甘蔗植物可具有掺入其基因组的靶向一种或多种 4CL 基因 ( 例如 4CL-M， 4CL-N 和 / 或 4CL-L) 的反义、 共抑制、 RNAi 或核酶核酸。本发明的甘蔗植物可在其 基因组中具有突变的 4CL 基因， 其中 4CL 基因的表达被抑制， 和 / 或其中 4CL 多肽具有抑制 或降低 4CL 多肽的功能活性 ( 例如酶活性 ) 的突变。本发明的甘蔗植物也可具有掺入其基 因组的核酸， 所述核酸编码结合 4CL 蛋白并抑制其酶活性的一种或多种抗体 ( 或其抗原结 合片段 ) 和 / 或适体。
任选地， 本文公开的植物可还展示主要有利于种子公司、 栽培者或粮食加工者的一种或多种农艺性状， 例如除草剂抗性、 病毒抗性、 细菌病原体抗性、 昆虫抗性、 线虫抗 性 和 真 菌 抗 性。 见， 例 如 美 国 专 利 号 5,569,823 ； 5,304,730 ； 5,495,071 ； 6,329,504 ； 和 6,337,431。这样的性状也可为提高植物活力或产量的性状 ( 包括允许植物在不同的温 度、 土壤条件和日光和降水水平下生长的性状 )， 或允许鉴定展示目的性状的植物的性状 ( 例如， 可选择的标记物基因， 种皮颜色等等 )。在例如美国专利号 5,569,823 ； 5,304,730 ； 5,495,071 ； 6,329,504 ； 6,337,431 ； 5,767,366 ； 5,928,937 ； 4,761,373 ； 5,013,659 ； 4,975,374 ； 5,162,602 ； 4,940,835 ； 4,769,061 ； 5,554,798 ； 5,879,903 ， 5,276,268 ； 5,561,236 ； 4,810,648 ； 和 6,084,155 ； 欧洲申请号 0242246 ； 美国专利申请号 20010016956 和 www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/ 的万维网上描述了多种目的性 状， 以及将这些性状引入植物的方法。
本发明也涉及甘蔗植物组织和植物部分， 包括但不限于， 来自本发明的具有被调 节 ( 例如下调 ) 的木质素生物合成的、 可从其再生植物的甘蔗植物的植物细胞、 植物原生质 体、 植物细胞组织培养物、 植物愈伤组织、 植物块 (clump) 和植物中完整的植物细胞， 或植 物的部分， 例如枝、 核、 穗、 穗轴、 果壳、 根尖、 花药、 种子、 根、 胚、 下胚轴、 子叶、 花粉、 胚珠、 花 药、 幼苗、 梗、 茎、 叶、 果和花。在一个实施方案中， 在植物组织或植物细胞中抑制或下调一 种或多种 4CL 基因或其基因产物的表达。在一个实施方案中， 被抑制的 4CL 基因是 4CL-M， 4CL-L 或 4CL-N。在一个实施方案中， 4CL-M， 4CL-L 和 4CL-N 基因分别编码具有 SEQ ID NO ： 6、 7 和 8 中所示的氨基酸序列的多肽， 或其片段或变体。在特定的实施方案中， 4CL-L 基因 包含 SEQ ID NO ： 1 中所示的核苷酸序列的全部或部分， 4CL-M 基因包含 SEQ ID NO ： 2 中所 示的核苷酸序列的全部或部分， 4CL-N 基因包含 SEQ IDNO ： 3 中所示的核苷酸序列的全部或 部分。
本发明也涉及具有被调节的或下调的木质素生物合成的甘蔗细胞或原生质体。 在一个实施方案中， 在甘蔗细胞或原生质体中抑制或下调一种或多种 4CL 基因的表达， 或 由 4CL 基因编码的蛋白质的翻译或活性。在一个实施方案中， 被抑制的 4CL 基因是 4CL-M， 4CL-L 或 4CL-N。在一个实施方案中， 4CL-M， 4CL-L 和 4CL-N 基因分别编码具有 SEQ ID NO ： 6、 7 和 8 中所示的氨基酸序列的多肽， 或其片段或变体。在特定的实施方案中， 4CL-L 基因 包含 SEQ ID NO ： 1 中所示的核苷酸序列的全部或部分， 4CL-M 基因包含 SEQ ID NO ： 2 中所 示的核苷酸序列的全部或部分， 4CL-N 基因包含 SEQ IDNO ： 3 中所示的核苷酸序列的全部或 部分。
本发明也涉及产生具有降低的或下调的木质素生物合成的甘蔗植物的方法。 在一 个实施方案中， 在甘蔗植物的叶细胞和 / 或组织中降低或下调木质素生物合成。在另一个 实施方案中， 在甘蔗植物的茎组织中降低或下调木质素生物合成。 在一个实施方案中， 本发 明的方法包括抑制或遏制一种或多种 4CL 基因的表达， 或抑制由 4CL 基因编码的蛋白质的 翻译或活性 ( 例如酶活性 )。在一个实施方案中， 4CL 基因编码包含 AMP 结合基序序列 ( 例 如 SEQ ID NO ： 34) 和 / 或 SEQ ID NO ： 54 的特征基序序列的 4CL 多肽。在一个实施方案中， 被抑制的 4CL 基因是 4CL-M， 4CL-L 或 4CL-N。在一个实施方案中， 4CL-M， 4CL-L 和 4CL-N 基 因分别编码具有 SEQ ID NO ： 6、 7 和 8 中所示的氨基酸序列的多肽， 或其片段或变体。在特 定的实施方案中， 4CL-L 基因包含 SEQ ID NO ： 1 中所示的核苷酸序列的全部或部分， 4CL-M 基因包含 SEQ ID NO ： 2 中所示的核苷酸序列的全部或部分， 4CL-N 基因包含 SEQ IDNO ： 3中所示的核苷酸序列的全部或部分。在一个实施方案中， 使用反义核酸、 共抑制、 RNA 干扰或 核酶抑制靶基因的表达。在另一个实施方案中， 通过基因突变抑制靶基因的表达。在另一 个实施方案中， 通过表达与蛋白质结合的抗体或其抗原结合片段， 和 / 或适体， 或通过在基 因中提供抑制基因的 mRNA 翻译为蛋白质的突变或破坏或抑制编码的蛋白质的功能的突变 ( 例如通过氨基酸序列中的改变 )， 在植物中抑制靶基因编码的蛋白质的活性。可使用本领 域已知的标准方法和材料将提供靶基因表达抑制的核酸构建体引入植物基因组， 并由此制 备转化的和转基因的植物。
可在表达构建体中提供对本发明有用的多核苷酸。 本发明的表达构建体一般包括 在将要表达表达构建体的预期的宿主细胞中有功能的调控元件。因此， 本领域普通技术人 员可选择用于细菌宿主细胞、 酵母宿主细胞、 植物宿主细胞、 昆虫宿主细胞、 哺乳动物宿主 细胞和人宿主细胞的调控元件。调控元件包括启动子、 转录终止序列、 翻译终止序列、 增强 子和多聚腺苷酸化元件。如本文使用的， 术语 “表达构建体” 指提供有效连接的核酸序列的 转录的核酸序列的组合。如本文使用的， 术语 “有效连接的” 指描述的组件的并置， 其中所 述组件处于允许其以其预期的方式发挥功能的关系之中。大体上， 有效连接的组件处于相 邻关系。
本发明的表达构建体可包含与本发明的多核苷酸序列有效连接的启动子序列。 可 使用本领域已知的标准技术将启动子掺入多核苷酸。 可在本发明的表达构建体中使用多拷 贝启动子或多个启动子。 在优选的实施方案中， 可将启动子置于这样的位置， 即其相距表达 构建体中的转录起始位点的距离与其相距其天然遗传环境中的转录起始位点的距离相同。 在此距离上允许一些基本上不降低启动子活性的变化。 在表达构建体中一般包含转录起始 位点。
如果将在植物细胞中提供表达构建体或将表达构建体引入植物细胞， 那么可使用 植物病毒启动子， 例如花椰菜花叶病毒 (CaMV)35S( 包括增强的 CaMV 35S 启动子 ( 见， 例如 美国专利号 5,106,739))， 或 CaMV 19S 启动子或木薯叶脉花叶 ( 启动子 )。可用于植物中 的表达构建体的其他启动子包括， 例如 prolifera 启动子、 Ap3 启动子、 热休克启动子、 根癌 农杆菌 (A.tumefaciens) 的 T-DNA 1′ - 或 2′ - 启动子、 多半乳糖醛酸酶启动子、 矮牵牛 花的查耳酮合酶 A(CHS-A) 启动子、 烟草 PR-1a 启动子、 泛素启动子、 肌动蛋白启动子、 alcA 基因启动子、 pin2 启动子 (Xu 等人， 1993)、 玉米 WipI 启动子、 玉米 trpA 基因启动子 ( 美国 专利号 5,625,136)、 玉米 CDPK 基因启动子， 且也可使用 RUBISCO SSU 启动子 ( 美国专利号 5,034,322)。在本发明中可使用组织特异性启动子， 例如果特异性启动子， 如番茄的 E8 启 动子 ( 登记号 ： AF515784 ； Good 等人 (1994))。 在本发明的核酸构建体中可使用的叶特异性 启动子包括 Cab1 启动子 (Brusslan 和 Tobin， 1992)、 Cab19 启动子 (Bassett 等人， 2007)、 PPDK 启动子 (Matsuoka 等人， 1993) 和核酮糖二磷酸羧化酶 (RBCS) 启动子 (Matsuoka 等 人 (1994) 和美国专利号 7,723,575)。可用于本发明的表达构建体的其它的植物叶特异性 启动子包括， 但不限于， Act1 启动子 ( 美国公开的申请号 20090031441)、 AS-1 启动子 ( 美 国专利号 5,256,558)、 RBC-3A 启动子 ( 美国专利号 5,023,179)、 CaMV 35S 启动子 (Odell 等人， 1985)、 增强的 CaMV35S 启动子、 玄参花叶病毒 (FMV) 启动子 (Richins 等人， 1987)、 甘露碱合酶 (mas) 启动子、 章鱼碱合酶 (ocs) 启动子等等， 例如来自 CaMV 19S(Lawton 等 人， 1987)、 nos(Ebert 等人， 1987)、 Adh(Walker 等人， 1987)、 蔗糖合酶 (Yang 等人、 1990)、α- 微管蛋白、 泛素、 肌动蛋白 (Wang 等人、 1992)、 cab(Sullivan 等人、 1989)、 磷酸烯醇式丙 酮酸羟化酶 (PEPCase)(Hudspeth 等人、 1989) 的启动子， 或与 R 基因复合物有关的启动子 (Chandler 等人、 1989)。又见公开的美国申请 2007/006346 和 Yamamoto 等人 (1997) ； Kwon 等人 (1994) ； Yamamoto 等人。 果特异性启动子如花器官特异性启动子可用于本发明的表达 构建体， 从而在植物的花器官中表达本发明多核苷酸。花器官特异性启动子的实例包括在 美国专利号 6,462,185 ； 5,639,948 ； 和 5,589,610 中描述的任意启动子序列。也可使用种 子特异性启动子如 β- 云扁豆蛋白基因 ( 例如菜豆的 ) 或大豆球蛋白基因 ( 例如大豆的 ) 等等的启动子。根特异性启动子， 如在美国专利号 6,455,760 或美国专利号 6,696,623， 或 在 公 开 的 美 国 专 利 申 请 号 20040078841 ； 20040067506 ； 20040019934 ； 20030177536 ； 20030084486 ； 或 20040123349 中描述的任意启动子序列可用于本发明的表达构建体。 木质 部特异性启动子包括稻的肉桂酸 -4- 羟化酶 (C4H)。也设想将组成型启动子 ( 如 CaMV、 泛 素、 肌动蛋白或 NOS 启动子 )、 发育调控型启动子和诱导型启动子 ( 如可被热、 光、 激素或化 学品诱导的那些启动子 ) 用于本发明的多核苷酸表达构建体。
鉴定和表征植物基因组 DNA 中的启动子区的方法是本领域已知的， 并包括， 例如 在以下参考文献中描述的那些 ： Jordano 等人 (1989) ； Bustos 等人 (1989) ； Green 等人 (1988) ； Meier 等人 (1991) ； 和 Zhang 等人 (1996)。公开的美国申请 2009/0199307 也描述 了使用差异显示鉴定组织特异性启动子的方法 ( 见， 例如美国专利号 5,599,672)。在差异 显示中， 比较了来自不同组织类型的 mRNA。 通过鉴定仅在特定组织类型， 或组织类型集合中 存在的 mRNA 种类， 可鉴定出以组织特异性方式表达的相应基因。可通过逆转录酶转录 RNA 以产生 cDNA， 并可使用 cDNA 分离含有全长基因的克隆。 也可使用 cDNA 从相应基因中分离部 分同源或同源的启动子、 增强子或终止子， 使用例如抑制 PCR。又见美国专利号 5,723,763。
本发明的表达构建体也可任选地包含转录终止序列， 翻译终止序列， 编码信号肽 的序列， 和 / 或增强子元件。一般可从真核或病毒基因序列的 3’ 非翻译区获得转录终止 区。可将转录终止序列置于编码序列的下游以提供有效的终止。信号肽序列是一般存在于 蛋白质的氨基端的短氨基酸序列， 其负责有效连接的成熟多肽再定位到范围广泛的翻译后 细胞目的地， 所述目的地的范围从特定细胞器区室到蛋白质作用位点和细胞外环境。通过 使用有效连接的信号肽序列， 将基因产物靶向预期的细胞和 / 或细胞外目的地， 设想将此 用于本发明的多肽。经典的增强子是提高基因转录的顺式作用元件， 并也可包含在表达构 建体中。经典的增强子元件是本领域已知的， 包括但不限于 CaMV 35S 增强子元件、 巨细胞 病毒 (CMV) 早期启动子增强子元件和 SV40 增强子元件。增强基因表达的内含子介导的增 强子元件也是本领域已知的。这些元件必须存在于转录区内且是方向依赖的。实例包括玉 米 shrunken-1 增强子元件 (Clancy 和 Hannah， 2002)。
在表达构建体中也可包含引导从表达构建体上转录的 mRNA 的多聚腺苷酸化的 DNA 序列， 并包括但不限于 CaMV 35S、 章鱼碱合酶或胭脂碱合酶信号。本发明的表达构建体 也可包含引导其他基因转座的多核苷酸序列， 即转座子。
表达构建体也可包含用于选择转化细胞的一种或多种显性可选择标记物基因， 包 括例如编码抗生素抗性的基因。抗生素抗性基因可提供对一种或多种以下抗生素的抗性 ： 潮霉素、 卡那霉素、 博来霉素、 G418、 链霉素、 巴龙霉素、 新霉素和壮观霉素。 可通过新霉素磷 酸转移酶 (NPT II) 提供卡那霉素抗性。用于细胞转化筛选的其它标记物包括编码 β- 葡糖醛酸酶 (GUS)、 β- 半乳糖苷酶、 荧光素酶、 胭脂碱合酶、 氯霉素乙酰基转移酶 (CAT)、 绿色 荧光蛋白 (GFP) 或增强的 GFP(Yang 等人 (1996)) 的基因。
本发明也涉及包含编码预期蛋白质的本发明的多核苷酸的多核苷酸载体， 所述载 体将提供给用本发明的生物反应器装置提供的细胞。 在本发明的表达构建体或多核苷酸的 5’ 和 3’ 端可包含独特的限制酶位点， 以允许其插入多核苷酸载体。如本文使用的， 术语 “载 体” 指任意遗传元件， 包括例如质粒、 粘粒、 染色体、 噬菌体、 病毒等等， 当与合适的控制元件 相联系时其能够复制， 且其可在细胞间转移多核苷酸序列。载体包含允许载体在选定的宿 主细胞中复制的核苷酸序列。用于表达和 / 或克隆的若干载体是现有的， 并包括但不限于， pBR322， pUC 系列， M13 系列， 和 pBLUESCRIPT 载体 (Stratagene， La Jolla， CA)。
本发明的多核苷酸可由 RNA 或 DNA 组成。优选地， 多核苷酸由 DNA 组成。本发明 也包含与本文公开的多核苷酸序列互补的多核苷酸。
用 基 因 转 化 植 物 细 胞 的 技 术 是 本 领 域 已 知 的， 并包括例如农杆菌 (Agrobacterium) 感染、 基因枪法、 电穿孔、 氯化钙处理、 PEG 介导的转化等。见， 例如美国专 利号 5,036,006 ； 5,591,616 ； 5,100,792 ； 公开的美国申请号 2006/0260011 ； 和公开的 PCT 申请号 WO 93/07278 和 WO93/21335。 美国专利号 5,661,017 教导了用异源多核苷酸转化藻 类细胞的方法和材料。使用本领域已知的标准方法可选择、 重新分化和培养转化细胞为包 含和表达本发明的多核苷酸的植物。 在本发明的范围内也包含任意转化的或转基因的本发 明的植物细胞或植物的种子和其他植物组织和后代。 也可根据与本文示例的这些序列的更具体的同一性和 / 或相似性范围定义本发 明的多核苷酸和多肽。序列同一性将一般地大于 60 ％， 优选地大于 75 ％， 更优选地大于 80％， 甚至更优选地大于 90％， 和可大于 95％。与本文示例的序列相比， 序列的同一性和 / 或相似性可为 49， 50， 51， 52， 53， 54， 55， 56， 57， 58， 59， 60， 61， 62， 63， 64， 65， 66， 67， 68， 69， 70， 71， 72， 73， 74， 75， 76， 77， 78， 79， 80， 81， 82， 83， 84， 85， 86， 87， 88， 89， 90， 91， 92， 93， 94， 95， 96， 97， 98， 或 99 ％。除非另外指定， 可使用如在 Karlin 和 Altschul(1993) 中修改的 Karlin 和 Altschul(1990) 算法测定如本文使用的 2 个序列的百分比序列同一性和 / 或相 似性。 这样的算法包含在 Altschul 等人 (1990) 的 NBLAST 和 XBLAST 程序中。 可使用 NBLAST 程序， 分数＝ 100， 字长＝ 12 进行 BLAST 搜索， 以得到具有预期百分比序列同一性的序列。 为了比较目的获得有缺口的比对， 可使用如 Altschul 等人 (1997) 描述的 Gapped BLAST。 当使用 BLAST 和 Gapped BLAST 程序， 可使用各个程序 (NBLAST 和 XBLAST) 的默认参数。见 NCBI/NIH 网站。
本发明也设想与编码本发明的多肽的多核苷酸序列具有足够同源的序列， 从而在 标准的严格条件和标准方法下允许与该序列杂交 (Maniatis， T. 等人， 1982) 的那些本发明 的多核苷酸分子 ( 和编码本发明的多肽的那些多核苷酸分子 )。 如本文使用的， 用于杂交的 “严格的” 条件指这样的条件， 其中一般在 6x SSPE， 5x Denhardt 溶液， 0.1％ SDS， 0.1mg/ml 变性 DNA 中在低于 DNA 杂合体的解链温度 (Tm) 的 20-25C 下过夜进行杂交。解链温度有以 下公式 (Beltz， G.A. 等人， 1983) 描述 ：
Tm ＝ 81.5C+16.6Log[Na+]+0.41( ％ G+C)-0.61( ％甲酰胺 )-600/ 双链体的长度 ( 以碱基对为单位 )。
一般如下进行洗涤 ：
a) 在 1x SSPE， 0.1％ SDS 中在室温进行 15 分钟， 2 次 ( 低严格度的洗涤 )。
b) 在 0.2x SSPE， 0.1％ SDS 中在 Tm-20C 下进行 15 分钟， 1 次 ( 中严格度的洗涤 )。
如本文使用的， 术语 “核酸” 和 “多核苷酸序列” 指单链或双链形式的脱氧核糖核 苷酸或核糖核苷酸聚合物， 除非另外限制， 其包含可与天然存在的核苷酸类似的方式发挥 功能的天然核苷酸的已知类似物。多核苷酸序列包括被转录为 RNA 的 DNA 链序列和被翻译 为蛋白质的 RNA 序列二者。多核苷酸序列包括全长序列以及来源于全长序列的较短序列二 者。 应当理解， 特定多核苷酸序列包含天然序列的简并密码子， 或可被引入以在特定宿主细 胞中提供密码子偏好的序列。 在本发明范围内的多核苷酸序列还包含与编码本发明的多肽 的序列特异性杂交的序列。 多核苷酸包含作为单独的链的或在双链体中的正义和反义链二 者。
在本发明的范围内也视为包含具有除了在本发明的多肽中特别示例的氨基酸取 代以外的氨基酸取代的多肽。 例如， 可用非天然氨基酸取代本发明的多肽的氨基酸， 只要具 有取代的氨基酸的多肽基本上保留与氨基酸未被取代的多肽相同的活性。 非天然氨基酸的 实例包括， 但不限于， 鸟氨酸、 瓜氨酸、 羟脯氨酸、 高丝氨酸、 苯甘氨酸、 牛磺酸、 碘化酪氨酸、 2， 4- 二氨基丁酸、 α- 氨基异丁酸、 4- 氨基丁酸、 2- 氨基丁酸、 γ- 氨基丁酸、 ε- 氨基己酸、 6- 氨基己酸、 2- 氨基异丁酸、 3- 氨基丙酸、 正亮氨酸、 正缬氨酸、 肌氨酸、 高瓜氨酸、 磺丙氨 酸、 τ- 丁基甘氨酸、 τ- 丁基丙氨酸、 苯甘氨酸、 丙氨酸环己酯、 β- 丙氨酸、 氟代氨基酸， 专 门设计的氨基酸如 β- 甲基氨基酸、 C- 甲基氨基酸、 N- 甲基氨基酸， 和一般的氨基酸类似 物。非天然氨基酸也包括具有衍生化的侧基的氨基酸。此外， 蛋白质中的任意氨基酸可为 D( 右旋 ) 型或 L( 左旋 ) 型。 氨基酸可一般被分为以下种类 ： 非极性、 无电荷极性、 碱性和酸性。在本发明的范 围内包括保守取代， 其中具有一类氨基酸的多肽被同类的另一种氨基酸替换， 只要具有取 代的多肽仍基本上保留与没有取代的多肽相同的生物学活性。 非极性氨基酸包括 Ala， Val， Leu， Ile， Pro， Met， Phe， 和 Trp。无电荷极性氨基酸包括 Gly， Ser， Thr， Cys， Tyr， Asn， 和 Gln。酸性氨基酸包括 Asp 和 Glu。碱性氨基酸包括 Lys， Arg， 和 His。
一旦在表达系统中掺入本发明的核酸序列， 就可将其转化进植物细胞。词语 “植 物” 指任意植物， 特别是种子植物， “植物细胞” 是植物的结构和生理学单位， 其包含细胞壁， 但也可指原生质体。植物细胞可为分离的单个细胞或培养细胞的形式， 或作为更高等的有 机体单位例如植物组织或植物器官的一部分。术语 “转化” 指导致在遗传上被稳定继承的 核酸片段至宿主细胞基因组的转移。包含转化的核酸片段的宿主细胞被称为 “转基因” 细 胞， 和包含转基因细胞的生物被称为 “转基因生物” 。
转 化 植 物 和 植 物 细 胞 的 方 法 的 实 例 包 括 农 杆 菌 介 导 的 转 化 (Deblaere 等 人 (1987)) 和微粒轰击技术 (Klein 等人 (1987) ； 美国专利号 4,945,050)。通过技术人员熟 知的方法可从转基因细胞再生全植物 ( 见， 例如 Fromm 等人 (1990))。
可以多种本领域公认的方式将本发明的表达构建体引入植物细胞。 术语 “引入” 在 多核苷酸 ( 例如编码本文公开的酶的核苷酸 ) 的情况下， 旨在表示以这样的方式将多核苷 酸呈递给植物， 即， 使多核苷酸能进入植物细胞内部。当要引入多于一种多核苷酸时， 这些 多核苷酸可被组装为单个核苷酸构建体的一部分， 或作为单独的核苷酸构建体， 并可位于 相同或不同的转化载体上。
因此， 可在单个转化事件中， 在单独的多个转化事件中， 或例如在植物中将这些多 核苷酸引入目的宿主细胞， 作为育种方案的一部分。本发明的方法不依赖于特定的将一种 或多种多核苷酸引入植物的方法， 只要多核苷酸能进入植物的至少一个细胞的内部。将多 核苷酸引入植物的方法是本领域已知的， 并包括但不限于， 瞬时转化法、 稳定转化法和病毒 介导法。
“瞬时转化” 在多核苷酸的情况下旨在表示， 多核苷酸被引入植物但不整合进植物 的基因组。
在将多核苷酸引入植物的情况下， “稳定引入” 或 “稳定引入的” 旨在表示， 引入的 多核苷酸被稳定掺入植物基因组， 因此植物被多核苷酸稳定地转化。
“稳定转化” 或 “稳定转化的” 旨在表示， 引入植物的多核苷酸 ( 例如， 本文描述的 核苷酸构建体 ) 整合进植物的基因组， 并能够被其后代继承， 更特别地， 被多个连续世代的 后代继承。
可用于植物转化的多种转化载体是在植物转化领域的普通技术人员已知的， 且与 本发明有关的基因可与任意这些载体共同使用。 载体的选择将取决于优选的转化技术和用 于转化的靶物种。对某些靶物种， 可优选不同的抗生素或除草剂选择标记物。
再生转化植物的方法是本领域熟知的。例如， Ti 质粒载体已被用于外源 DNA 的递 送， 以及直接的 DNA 摄取、 脂质体、 电穿孔、 显微注射和微粒。另外， 来自农杆菌属的细菌可 被用于转化植物细胞。下面描述了转化双子叶和单子叶植物的代表性技术， 以及代表性质 体转化技术。
许多载体可用于使用根癌农杆菌的转化。其一般携带至少一种 T-DNA 边界序列， 并包括如 pBIN19(Bevan(1984)) 的载体。为了构建用于农杆菌转化的载体， 见， 例如美国专 利申请公开号 2006/0260011。
不使用根癌农杆菌的转化规避了在选择的转化载体中对 T-DNA 序列的需要， 因此 也可使用缺乏这些序列的载体。不依赖农杆菌的转化技术包括， 但不限于， 通过颗粒轰击、 原生质体摄取 ( 例如 PEG 和电穿孔 ) 和显微注射。载体的选择大部分取决于用于转化的物 种的优选的选择。有关这些载体的构建， 见例如美国公开的申请号 2006/0260011。
用于双子叶植物的转化技术是本领域熟知的， 并包括基于农杆菌的技术和不需要 农杆菌的技术。非农杆菌的技术包括通过原生质体或细胞直接摄取外源遗传物质， 并可例 如通过 PEG 或电穿孔介导的摄取、 颗粒轰击介导的递送或显微注射实现。Paszkowski 等人 (1984)， Potrykus 等人 (1985)， Reich 等人 (1986)， 和 Klein 等人 (1987) 描述了这些技术 的实例。在每种情况下， 使用本领域已知的标准技术将转化细胞再生为整株植物。
农杆菌介导的转化是转化双子叶植物的优选技术， 因为其高转化效率及其对许多 不同物种的广泛实用性。农杆菌转化一般包括将携带目的外源 DNA 的二元载体转移至合适 的农杆菌菌株， 这可能依赖于宿主农杆菌菌株在共驻留的 Ti 质粒或染色体上携带的 vir 基 因的补足 (complement)(Uknes 等人 (1993))。通过使用携带重组二元载体的大肠杆菌、 携 带能够将重组二元载体移动至靶农杆菌菌株的质粒的辅助大肠杆菌菌株的三亲株交配程 序实现重组二元载体至农杆菌的转移。可选地， 可通过 DNA 转化将重组二元载体转移至农 杆菌 (Hofgen 和 Willmitzer(1988))。
重组农杆菌对靶植物物种的转化通常包括共培养农杆菌与来自植物的外植体， 并遵照本领域熟知的方案。在携带存在于二元质粒 T-DNA 边界之间的抗生素或除草剂抗性标 记物的选择培养基上再生转化的组织。
用基因转化植物细胞的另一种方法包括在植物组织和细胞上推进 (propel) 惰性 或生物活性颗粒。在美国专利号 4,945,050， 5,036,006， 和 5,100,792 中公开了此技术。大 体上， 此技术包括在能够有效穿透细胞的外表面的条件下在细胞上推进惰性或生物活性颗 粒， 并在其内部提供掺入。 当使用惰性颗粒时， 可通过用包含预期基因的载体覆盖颗粒将载 体引入细胞。可选地， 可用载体包围细胞， 从而通过颗粒将载体携带进细胞。也可将生物活 性颗粒 ( 例如， 干酵母细胞、 干细菌或噬菌体， 其分别含有试图引入的 DNA) 推进植物细胞组 织。
大多数单子叶物种的转化现在也已变为常规技术。优选的技术包括使用 PEG 或 电穿孔技术将基因直接转移进原生质体， 和颗粒轰击进愈伤组织。可使用单个 DNA 种类或 多个 DNA 种类 ( 即共转化 ) 进行转化， 且这些技术都适用于本发明。共转化可具有以下优 势： 避免构建完整载体， 和产生具有不连锁的目的基因和可选择标记物的基因座的转基因 植物， 这使得能够在以后的世代中去除可选择的标记物， 这应当被认为是理想的。
专利申请 EP 0292435， EP 0392225， 和 WO 93/07278 描述了从玉米的原种自交系 制备愈伤组织和原生质体， 使用 PEG 或电穿孔转化原生质体， 和从转化的原生质体再生玉 米植物的技术。Gordon-Kamm 等人 (1990) 和 Fromm 等人 (1990) 公开了使用颗粒轰击转 化 A188 来源的玉米系的技术。此外， WO 93/07278 和 Koziel 等人 (1993) 描述了通过颗 粒轰击转化玉米的原种自交系的技术。此技术使用从授粉后 14-15 天的玉米穗上切除的 1.5-2.5mm 长的未成熟的玉米胚和 PDS-1000He 基因枪装置用于轰击。
通过用本发明的核酸序列转化得到的植物可为任意的品种广泛的植物物种， 包 括单子叶和双子叶植物物种。可通过育种将本发明的基因表达与其他对生产和质量的重 要特征组合掺入植物系。也可通过育种或通过普通的基因工程技术将本文公开的本发明 的多核苷酸掺入植物系或维持在植物系中。育种方法和技术是本领域已知的。见， 例如 Welsh(1981) ； Wood(1983) ； Mayo(1987) ； Singh(1986) ； 以及 Wricke 和 Weber(1986)。
通过有性生殖或营养生长传递改造进上述转基因种子和植物的遗传特性， 并可因 此在后代植物中维持和传播所述遗传特性。一般地， 维持和繁殖利用为了适合特定目的如 耕种、 播种或收割而开发的已知农业方法。
相关技术是本领域熟知的， 并包括但不限于， 杂交、 近交、 回交育种、 多系育种 (multi-line breeding)、 双单倍体近交、 品种混合、 种间杂交、 非整倍体技术， 等等。 杂交技 术也包括通过机械、 遗传 ( 包括转基因 )、 化学或生物化学手段使植物不育以产生雄性或雌 性不育的植物。
用于本发明的目的， “甘蔗” 指任意甘蔗属植物或杂种。在本发明的范围内的甘蔗 植物包括， 例如斑茅 (Saccharum arundinaceum)、 Saccharumbengalense、 肉质花穗野生种 (Saccharum edule)、 白甘蔗 (Saccharumofficinarum)、 狭叶斑茅 (Saccharum procerum)、 沙 生 蔗 茅 (Saccharumravennae)、 大 茎 野 生 种 (Saccharum robustum)、 竹 蔗 (Saccharum sinense) 和割手密 (Saccharum spontaneum)。本发明的甘蔗植物可为近交系或杂种。杂 种植物包括通过组成目前所有的商业甘蔗和 energycane 种质的白甘蔗杂交材料由传统的 割手密生成的杂种， 和通过用近亲或远亲物种杂交甘蔗产生的任意其他杂种。可与甘蔗杂交以产生杂种植物或新的甘蔗品种的其他物种的实例包括芒属 (Miscanthus)、 蔗茅属 (Erianthus) 和甜高粱属 (Sorghum)。
“分离的” 表示 “通过人工操作” 从其自然状态改变的， 即， 如果其出现在自然界， 其 已从其本来的环境中被改变或移动， 或被改变和移动。 例如， 在活动物中以天然状态天然存 在的多核苷酸或多肽不是 “分离的” ， 但如本文使用的术语， 从其天然状态的共同存在的材 料中分开的相同的多核苷酸或多肽是 “分离的” 。例如， 就多核苷酸而言， 术语分离的表示， 从其天然存在的染色体和细胞中分开的。如果序列从其天然存在的染色体和细胞中分开， 但被插入其不天然存在的染色体或细胞的基因环境中， 则其也是分离的。
如本文使用的， 术语 “转基因的” 指包含外源多核苷酸 ( 即基因 ) 的植物， 所述外源 多核苷酸在转化的植物中被稳定维持并在连续世代中通过后代稳定继承。术语 “转基因植 物” 可指最初转化的植物或最初转化的植物的后代。 用于转化植物、 植物细胞或植物组织的 技术可包括， 但不限于， 使用根癌农杆菌或发根农杆菌 (A.rhizogenes) 作为转化剂用 DNA 转化， 电穿孔、 DNA 注射、 微粒轰击和颗粒加速。见， 例如 EP 295959 和 EP 138341。如本文 使用的， 术语 “植物材料” 或 “植物部分” 包括植物细胞、 植物原生质体、 可从其再生植物的植 物细胞组织培养物、 植物愈伤组织、 植物块和植物中完整的植物细胞， 或植物的部分， 如胚、 花粉、 胚珠、 种子、 叶、 花、 枝、 果、 核、 穗、 穗轴、 果壳、 梗、 根、 根尖、 花药、 块茎、 根茎等等。
材料和方法
植 物 材 料。 在 表 达 分 析 中 使 用 野 外 培 养 的 成 熟 甘 蔗 ( 甘 蔗 属 杂 交 种 ) 变 种 CP88-1762 和温室培养的未成熟的 CP88-1762 和 L 79-1002。
RNA 提取、 基因分离和 RT-PCR。使用 TRIzol 试剂 (Invitrogen) 从叶、 茎、 节和根 分离总 RNA。使用 cDNA 合成试剂盒 (Bio-Rad) 从 1ug 总 RNA 合成第一链 cDNA。
甘蔗 4CL 的分离
Sc4CL-L
通过 RACE(cDNA 末端的快速扩增 ) 技术得到部分 4CL-L。使用 SMARTRACE 试剂盒 (Clontech) 根据制造商的说明书进行 RACE。从 2ug 总 RNA 合成 5’ - 和 3’ -RACE 预备 cDNA 库， 并使用这些库作为 PCR 模板。基于 4CL-L 的部分基因组 DNA 序列设计初级 (LPF ： 5’ -CG TTGCCTGTGAAGTCCGGCGC-3’ (SEQ ID NO ： 17)) 和巢式 (LNF ： 5’ -CCACGGCGAAGACCATCGACTCG-3 ’ (SEQ IDNO ： 18)) 基因特异性引物。使用 LPF 和制造商提供的通用引物混合物 (UPM) 进行 初级 PCR。PCR 条件由 25 个循环的 94℃ 30 秒， 68℃ 60 秒和 72℃ 180 秒组成。将初级 PCR 产物从 1 稀释到 50 并用作次级 PCR 的模板， 次级 PCR 使用 LNF 和制造商提供的巢式通用引 物 (NUP)。第二个 PCR 在与第一个 PCR 相同的条件的 20 个循环下进行。将 3’ -RACE PCR 产物克隆进 pCR2.1TOPO 载体 (Invitrogen) 并测序。
Sc4CL-M
通过 DNA 文库筛选分离 4CL-M。从野外培养的植物 (Belle Grade 和 Citra， FL) 收获甘蔗 ( 甘蔗属杂交种 ) 变种 CP88-1762 的叶、 节间、 节和未成熟的卷叶。从水培溶液培 养的植物中收集根和新生幼苗。使用 Trizol(Invitrogen) 从每种组织中提取总 RNA， 并以 相同的比例混合来自每种样品的总 RNA。使用 Oligotex mRNA Mini 试剂盒 (Qiagen) 从混 合的总 RNA 提纯 mRNA。从 5.9ug mRNA 合成 cDNA 并使用 cDNA 合成试剂盒和 ZAP-cDNA 合 成试剂盒 (Stratagene) 连接至 Uni-ZAP XR 载体。使用 ZAP-cDNA GigapackIII Gold 克隆 试剂盒根据制造商的说明书 (Stratagene) 进行包装和扩增。用于筛选， 使用随机引物试剂 32 盒 (Promega) 通过 PCR 生成 447bp 的部分 4CLM 特异性探针并用 P-dCTP 标记。筛选了约 2.0x 105 的重组噬菌体， 并分离了 1 个阳性噬菌体。为了得到包含 cDNA 的 pBluscript 噬 菌粒， 进行了体内切除并对分离物测序。
Sc4CL-N
使用从甘蔗 EST 序列推断的基因特异性引物从 cDNA 上 PCR 扩增 4CL-N。在 DFCI 白甘蔗基因索引 (SoGI ； http://compbio.dfci.harvard.edu/cgi-bin/tgi/gireport.pl ？ gudb ＝ s_officinarum) 中使用 “4- 香豆酸辅酶 A 连接酶” 作为关键词检索的主题。检测 出具有完整的开放阅读框的假设的共有 (TC) 序列 TC88322， 并用于引物设计。分别从起 始和终止密码子区设计了正向引物 (4CL1F ： 5’ -ATGGGTTCCGTGGACACGGCGGTCGCG-3’ (SEQ ID NO ： 19)) 和反向引物 (4CL1R ： 5’ -TCAGTGAACACCGGCGGCGAGCCTGG-3’ (SEQ ID NO ： 20))。 使用 Trizol 根据制造商的说明书 (Invitrogen) 从叶、 节间、 节和幼苗分离总 RNA， 并使用 iScript cDNA 合成试剂盒 (Bio-rad) 进行 cDNA 合成。使用 200ng 来自每个组织的 cDNA 混 合物作为 PCR 模板。使用 TaKaRa LA taq 聚合酶 (Takara BIO Inc.) 进行 PCR， 且 PCR 条件 由 35 个循环的 95℃ 45 秒， 56℃ 45 秒和 72℃ 120 秒组成。将 2 次独立扩增的 PCR 产物克 隆进 pCR2.1TOPO 载体 (Invitrogen) 并测序。Sc4CL RNAi 抑制构建体的构建
基于 Sc4CL-L(SEQ ID NO ： 1) 和 Sc4CL-M(SEQ ID NO ： 2) 的测序信息， 设计了特异 性引物以分别扩增名为外显子 2 和外显子 1 的 200bp 区域。将对应 2 个限制酶 EcoRI 和 XbaI 的序列加入正向引物， 对反向引物加入特异性对应 EcoRV 限制酶的序列， 以便于亚克 隆。使用由通过 Bg4CL 天然内含子分隔开的 2 个反向重复和转录终止子 CaMV35SpolyA 组 成的质粒 pWFBgH4CL_RNAi 构建 Sc4CL 干扰构建体。在 2 个单独和相继的亚克隆步骤中， 用 Sc4CL 特异性序列替换质粒 pWF BgH4CL_RNAi 中的反向重复。然后亚克隆稻 C4H 启动子并 产生 2 个构建体 Sc4CL-Li 和 Sc4CL-Mi(SEQ ID NO ： 4 和 SEQ ID NO ： 5)。
4CLi 甘蔗系的产生
使用甘蔗 ( 甘蔗属杂交种 ) 变种 CP88-1762 的未成熟的卷叶的横切面在补充了 20g/L 蔗糖和 13.6uM 2， 4-D， pH 调节为 5.8 的改良的 MS 基础培养基 (CI-3)(Chengalrayan 和 Gallo-Meagher， 2001) 上诱导愈伤组织。在诱导了愈伤组织后， 使用如以前描述的 PDS-1000/He 基因枪颗粒递送系统 (Bio-Rad)(James 等人， 2008) 进行基因枪基因转移。如 描述的使用遗传霉素进行选择 (Chengalrayan 和 Gallo-Meagher， 2001)， 但略加修改， 其中 对再生的植物进行了进一步的选择， 即将其在生根阶段在含有巴龙霉素 (30mg/L) 的 MS 基 础培养基中亚培养， 进行 4 次两周一次的亚培养。将发育出健康的根的选定的植物转移至 土壤并转移至温室。
转基因系的表征
在选择和再生植物以后， 通过 NPTII-ELISA 和 PCR 确认转基因甘蔗植物。使用 Pathoscreen nptII ELISA 试剂盒 (Agdia) 根据制造商的说明书进行总蛋白质提取和 NPTII-ELISA。使用 DNeasy Plant Mini 试剂盒 (Qiagen) 从每株再生的植物的展开的叶中 提取基因组 DNA。使用 75ng 基因组 DNA 作为 PCR 模板。为了检测每种表达构建体， 从每个 基因和启动子区设计引物如下 ： 用于 Sc4CL-Mi 和 Sc4CL-Li RNAi 构建体， 4CL SF(5’ -CATCA AGGGTACGGGATGAC-3’ (SEQ ID NO ： 21)) 和 OSPRO SR(5’ -GTAGCCTGCTAGTCTTCTCTCTCATT-3’ ( SEQ ID NO ： 22))。使用 iTaq 聚合酶 (Bio-Rad) 按如下条件进行 PCR ： 35 个循环的 95℃ 30 秒， 58 ℃ 30 秒和 72 ℃ 60 秒。用于 Northern 印迹分析， 从植物的第三片叶 ( 用于 4CL-Li 系 ) 和约 25cm 长的侧分蘖 ( 用于 4CL-Mi 系 ) 中提取总 RNA(Sambrook et at.， 1989)。在 相同的发育阶段从在与转基因植物相同的条件下培养的野生型植物中收集样品。 在电泳和 转移了 20ug 总 RNA 后， 使用来自靶向的 4CL 基因的开放阅读框的放射性标记的探针进行 Northern 杂交。
如 Browning(1967) 描述的分别从 4CL-Li 系和 4CL-Mi 系的衰老的叶和节间中使 用 Klason 程序在转基因甘蔗和非转基因 ( 野生型 ) 甘蔗植物中定量总木质素， 但略加修改 (Yoshihara 等人， 1984)。简单地说， 在研磨干样品 (0.5-1mm 筛选 ) 后， 用 50％的温热乙醇 提取样品以去除可溶性糖， 并干燥。然后， 使用 12M H2SO4 水解 0.1g 干细胞壁样品， 在 30℃ 进行 2 小时。用蒸馏水稀释内含物并高压灭菌 1 小时。高压灭菌后， 通过过滤收集不溶的 材料 ( 木质素和灰分 ) 并称重。然后在 500℃燃烧木质素 5 小时。在此步骤后， 称重灰分并 通过燃烧前和后的重量差异计算木质素。
本文提及和引用的所有专利、 专利申请、 临时申请和出版物以其整体引入作为参 考， 包括所有的图和表， 只要其不与本说明书的明确教导不一致。以下是说明用于实践本发明的程序的实施例。这些实施例不应被视为限制性的。 除非另外指出， 所有百分比是以重量计的， 且所有溶剂混合物比例是以体积计的。
实施例 1—— Sc4CL 基因的分离
在本研究中分离和表征了 2 个全长的和 1 个部分的甘蔗 4CL 基因的序列。 Sc4CL-N 和 Sc4CL-M 的 cDNA 序列具有 1665 和 1728 核苷酸的开放阅读框， 分别编码 555 和 576 氨基 酸的蛋白质。部分的 Sc4CL-L cDNA 序列长 616bp， 其包含 3’ UTR， 和 141 氨基酸残基的开 放阅读框。Sc4CL-N 和 Sc4CL-M 之间的配对比较显示 59％的相似性。Sc4CL-N 与以前鉴定 的 4CL 关联最紧密， 分别显示了与甜高粱的 Sb4CL 样 1 和稻的 Os4CL3 的 96％和 86％的相 似性， 而 Sc4CL-M 与 Sb4CL 样 1 和 Os4CL3 共有较低的相似性， 但其显示了与 Sb4CL 样 2 和 Os4CL3( 分别为 96％和 83％ ) 的较高的相似性。Sc4CL 与拟南芥 At4CL 的推断的氨基酸序 列的比较显示了范围从 60％ -63％的相似性 ( 表 2)。
Sc4CL 和已功能表征的其他 4CL、 白杨 Ptd4CL 和拟南芥 At4CL 之间的比对 ( 通过 CLUSTALW(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl ？ page ＝ /NPSA/npsa_ clustalw.html) 使用默认参数进行 ) 显示了保守的 AMP 结合基序 ( 见， 例如 SEQ ID NO ： 34， 35， 36， 37， 38， 39， 40， 41， 42， 和 43) 和特征基序 “GEICIRG” (SEQ ID NO ： 54)， 其被认为是底 物识别位点 (Ehlting 等人 2001)。系统发生分析显示， 在禾本科中的 4CL 基因家族成员可 被分为 2 个主要的在系统发生上有联系的群组， 组 I 和组 II。Sc4CL-N 和 Sc4CL-M 分别被 归为植物 4CL 组 I 和组 II。组 I 包括玉蜀黍 4CL2、 稻 4CL1、 拟南芥 4CL1、 黑麦草 4CL2、 白 杨 4CL3、 白杨 4CL1、 白杨 4CL2、 拟南芥 4CL2、 甜高粱 04g005210、 玉蜀黍 LOC542166 和玉蜀黍 ACF84437。组 II 包括稻 4CL2、 甜高粱 04g031010、 拟南芥 4CL3、 黑麦草 4CL1、 白杨 4CL4、 拟 南芥 4CL4、 稻 4CL3、 稻 4CL5、 甜高粱 10g026130、 黑麦草 4CL3 和稻 4CL4。
表 2.4CL 氨基酸序列之间的百分比相似性
Sc ： 甘蔗， Sb ： 甜高粱， Os ： 稻， At ： 拟南芥
实施例 2—— 4CL 基因的表达谱
甘蔗 4CL-M 主要在茎中表达， 而 Sc4CL-L 主要在叶中表达 ( 表 3)。这提示， 可以组 织特异性方式调控不同 4CL 基因的表达， 并提供了在特定组织中抑制木质素的机会。
表 3.Sc4CL 基因的组织和栽培品种特异性表达
-L、 S 和 N 分别表示叶、 茎和节。
实施例 3—— 4CL 下调的甘蔗的生成
RNAi 是用于作物改良和研究基因功能的有力工具。因此， 为了研究每个 4CL 基因 产物在木质素生物合成中的生理作用， 利用 Sc4CL 的序列信息生成了 4CL 下调的甘蔗， 生 成了 2 个靶向 Sc4CL-L 和 Sc4CL-M 基因的不同区域的、 处于木质部特异性启动子、 稻香豆 酸 -4- 羟化酶 (C4H) 启动子 (Fouad 和 Altpeter， 尚未发表 ) 和 CaMV 35S 多聚腺苷酸信号 控制下的 RNA 抑制构建体 (SEQ ID NO ： 4 和 SEQ ID NO ： 5)。使用基因枪基因转移， 将生成 的具有处于具有第一内含子、 35S 3’ UTR 的强组成型玉米泛素启动子 (pUbi) 调控下的可选 择的 nptII 基因的抑制盒各自或同时共同引入胚发生甘蔗愈伤组织。当生成若干转基因系 时， 使用 nptII/ 遗传霉素和巴龙霉素选择系统进行转基因事件的选择。
利用 2 个生成的抑制盒进行了共 88 次轰击， 并在愈伤组织选择后再生了 160 株植 物。使用 Pathoscreen nptII ELISA 试剂盒 ( 表 4)， 152 株独立的植物显示了 NPTII 表达。 使用 PCR 确认了在转基因植物的基因组 DNA 中 4CL-RNAi 抑制盒的存在 ( 表 4)。
在转基因甘蔗植物中的甘蔗 4CL 的表达分析指示了相比非转基因 (WT) 甘蔗， 在若 干转基因甘蔗植物中 Sc4CL-L( 表 5) 和 Sc4CL-M 基因 ( 表 6) 的抑制。
表 4. 转基因 4CLi 甘蔗的总结
NA ＝未分析的 表 5. 在甘蔗 4CL-Li 转基因植物的衰老的叶中的 4CL-L 基因表达水平和木质素含量
1- 相对 WT 表达 (100％ ) 的基于 RNA 印迹分析的表达 2-2-3 次生物学重复的平均值， 通过分析相同基因型的 2-3 株个体植物生成。 表 6. 在甘蔗 4CL-Mi 转基因植物的未成熟的节间中的 4CL-M 基因表达水平和木质素含量
1- 基于相对 WT 表达 (100％ ) 的 RNA 印迹分析的表达
2-2 次生物学重复的平均值， 通过分析相同基因型的 2 株个体植物生成。
实施例 4- 具有减少的木质素的甘蔗的生成
根据标准方案在品系中使用 Klason 程序在 4CL-Li 转基因植物和非转基因甘蔗的 衰老的叶中定量总木质素。如在表 5 中所示， Klason 木质素在非转基因甘蔗植物的衰老的 叶中为约 23.6％。相对而言， 具有 4CL-L 基因抑制的转基因系 14-2A 在衰老的叶中具有平 均 21％的 Klason 木质素 ( 表 5)， 表明通过 4CL-L 抑制总木质素减少了 11％。也在 4CL-Mi 系 ( 表 6) 和野生型植物中的未成熟的节间中分析了木质素。品系 4a 展示了相比野生型植 物的约 8％的总木质素的减少。品系 5b-A1 也显示了类似水平的木质素减少 ( 表 6)。预期 在成熟的节间中在这些转基因 4CL-Mi 植物中的更高的木质素减少， 在成熟的节间中非转 基因植物的木质素含量增加至超过 20％。
实施例 5—— 4CLM 表达的定量 PCR 分析
定量实时 RT-PCR 分析确认了在若干转基因系中的 4CLM 抑制。 表 7 显示了 4CLM 基 因相对参考基因 ( 甘蔗 GAPDH) 的相对表达比例。表 7 显示了在包括品系 4A 和 5BA1 的转 基因甘蔗系中的 4CLM 转录物的强抑制。收获发育匹配的侧分蘖并从第一节间提取总 RNA。 从 3’ UTR 设计 4CLM 基因特异性引物。平行进行所有反应， 且一式三份进行每个反应。使用 Q- 基因软件计算标准误。
表 7.4CLM 表达的定量 PCR 分析
实施例 6——植物 4CL 基因间的进化趋异的估计
在表 8 中显示了甘蔗 4CL 和其他植物 4CL 间的分析中的每个位点上的氨基酸取代 数。所有结果基于氨基酸序列的配对分析。使用 MEGA4(Zuckerkandl 和 Pauling(1965) ； Tamura 等人 (2007)) 中的泊松校正法进行分析。 从数据集中去除含有缺口和缺失数据的所 有位置 ( 完全缺失选项 )。在最终的数据集中共有 513 个位置。
表 8. 植物 4CL 间的进化趋异的估计
Sc ： 甘蔗， Sb ： 甜高粱， Zm ： 玉蜀黍， At ： 拟南芥， Lp ： 黑麦草， Os ： 稻， Po ： 白杨杂种 ( 毛果杨 (Populus trichocarpa)x 美洲黑杨 (Populusdeltoids))
表 8 继续
Sc ： 甘蔗， Sb ： 甜高粱， Zm ： 玉蜀黍， At ： 拟南芥， Lp ： 黑麦草， Os ： 稻， Po ： 白杨杂种 ( 毛果杨 (Populus trichocarpa)x 美洲黑杨 (Populusdeltoids))
表 8 继续
Sc ： 甘蔗， Sb ： 甜高粱， Zm ： 玉蜀黍， At ： 拟南芥， Lp ： 黑麦草， Os ： 稻， Po ： 白杨杂种 ( 毛果杨 (Populus trichocaroa)x 美洲黑杨 (Populusdeltoids))
应当理解， 本文描述的实施例和实施方案仅是为了说明的目的， 对本领域技术人 员建议根据其的多种修改或变化， 且这些修改和变化将被包括在本申请的精神和范围内和 随附的权利要求书的范围内。另外， 本文公开的任意发明或其实施方案的任意元素或限制 可与本文公开的任意其他发明或其实施方案的任意和 / 或所有其他元素或限制 ( 分别地或 以任意组合 ) 组合， 且所有这些组合视为在本发明的范围内， 而不加限制。
参考文献
美国专利号 4,761,373
美国专利号 4,769,061
美国专利号 4,810,648
美国专利号 4,940,835 美国专利号 4,945,050 美国专利号 4,975,374 美国专利号 4,987,071 美国专利号 5,013,659 美国专利号 5,023,179 美国专利号 5,034,322 美国专利号 5,036,006 美国专利号 5,093,246 美国专利号 5,100,792 美国专利号 5,106,739 美国专利号 5,116,742 美国专利号 5,162,602 美国专利号 5,256,558 美国专利号 5,270,163 美国专利号 5,276,268 美国专利号 5,304,730 美国专利号 5,495,071 美国专利号 5,554,798 美国专利号 5,561,236 美国专利号 5,569,823 美国专利号 5,582,981 美国专利号 5,589,610 美国专利号 5,591,616 美国专利号 5,595,877 美国专利号 5,599,672 美国专利号 5,625,136 美国专利号 5,639,948 美国专利号 5,661,017 美国专利号 5,723,763 美国专利号 5,767,366 美国专利号 5,817,785 美国专利号 5,879,903 美国专利号 5,928,937 美国专利号 6,084,155 美国专利号 6,329,504 美国专利号 6,337,431 美国专利号 6,344,318 美国专利号 6,455,760美国专利号 6,462,185
美国专利号 6,506,559
美国专利号 6,696,623
美国专利号 6,933,116
美国专利号 7,056,704
美国专利号 7,078,196
美国专利号 7,232,086
美国专利号 7,282,564
美国专利号 7,365,058
美国专利号 7,368,236
美国专利号 7,538,095
美国专利号 7,700,759
美国专利号 7,723,575
美国公开的申请号 20010016956
美国公开的申请号 20030084486
美国公开的申请号 20030177536
美国公开的申请号 20040019934
美国公开的申请号 20040067506
美国公开的申请号 20040078841
美国公开的申请号 20040123349
美国公开的申请号 20060260011
美国公开的申请号 2007006346
美国公开的申请号 20090031441
美国公开的申请号 20090199307
PCT 公开的申请号 WO 93/07278
PCT 公开的申请号 WO 93/21335
EP 0242246
EP 0292435
EP 0392225
EP 138341
EP 295959
Agrawal 等 人 (2003)Microbiology and Molecular Biology Reviews， 67(4) ： 657-685.
Altschul， S.F. 等 人 (1990)“Basic Local Alignment Search Tool” J.Mol. Biol.215 ： 403-410.
Altschul， S.F. 等人 (1997)“Gapped BLAST and PSI-BLAST ： A NewGeneration of Protein Database Search Programs” Nucl.AcidsRes.25 ： 3389-3402.
Bartel， D. 和 Szostak， J.W.Science 261 ： 1411-1418(1993).
Bassett， C.L.， Callahan， A.， Artlip， T.， Scorza， R.Srinivasan， C.(2007)“Aminimal peach type II chlorophyll a/b-binding proteinpromoter retains tissue-specificity and light regulation intomato” BMC Biotechnol.， 7： 47.
Beltz ，G.A. ，Jacobs ，K.A. ，Eickbush ，T.H. ，Cherbas ，P.T. ，Kafatos ， F.C.(1983)“Isolation of multigene families and determinationof homologies by filter hybridization methods” Methods ofEnzymology， R.Wu， L.Grossman 和 K.Moldave[eds.]AcademicPress， New York 100 ： 266-285.
B e v a n ，M . ( 1 9 8 4 ) “ B i n a r y A g r o b a c t e r i u m v e c t o r s f o r planttransformation” Nucl.Acids Res.， 12(22) ： 8711-21.
Browning， B.L.1967.Methods of wood chemistry.Wiley-Interscience， New York.
Brusslan， J.A. 和 Tobin， E.M.(1992)“Light-independentdevelopmental regulation of cab gene expression in Arabidopsisthaliana seedlings” Proc Natl Acad Sci USA， 89(16) ： 7791-5.
Bustos 等人 (1989)Plant Cell， 1： 839-854.
Chandler 等 人 (1989)“Two Regulatory Genes of the Maize AnthocyaninPathway Are Homologous ： Isolation of B Utilizing R GenomicSequences” The Plant Cell， 1： 1175-1183. Chengalrayan， K. 和 Gallo-Meagher， M.(2001)“Effect of variousgrowth regulators on shoot regeneration of sugarcane” In VitroCell.Dev.Biol.Plant， 37 ： 434 439.
Clancy， M. 和 Hannah， L.C.(2002)“Splicing of the maize Sh1 firstintron is essential for enhancement of gene expression， and aT-rich motif increases expression without affecting splicing” Plant Physiol.130(2) ： 918-29.
Deblaere， R.， Reynaerts， A.， Hofte， H.， Hernalsteens， J.-P.， Leemans， J.， 和 Van Montagu， M.(1987)“Vectors for cloning in plantcells” Methods Enzymol.， 153 ： 77-292.
Doran， T. 和 Helliwell， C.(2009)RNA interference ： Methods forplants and animals ； Publisher ： CABI， Wallingford， UK.Ebert 等人 (1987)Proc.Nat′ l Acad.Sci. USA.84 ： 5745-5749.
Ehlting， J.， Buttner， D.， Wang， Q.， Douglas， C.J.， Somssich， I.， 和 Kombrink， E.(1999).Three 4-coumarate ： coenzyme A ligasesin Arabidopsis thaliana represent two evolutionarily divergentclasses in angiosperms.Plant J.19， 920.
Ellington， A.D. 和 Szostak， J.W.(1990) “In vitro selection of RNAmolecules that bind specific ligands” Nature， 346(6287) ： 818-822.
Fromm 等人 Biotechnology 8 ： 833-839(1990).
Good， X. 等人 (1994)“Reduced ethylene synthesis by transgenictomatoes expressing S-adenosylmethionine hydrolase” PlantMolec.Biol.26 ： 781-790.
Gordon-Kamm 等人 PlANt Cell 2 ： 603-618(1990).
Green 等人， EMBO J.， 7： 4035-4044(1988).
Haselhoff 和 Gerlach Nature 334 ： 585-591(1988).
Hofgen&Willmitzer， Nucl.Acids Res.16 ： 9877(1988).
Hoppe-Seyler， F. 和 Butz， K.(2000)“Peptide aptamers ： powerful newtools for molecular medicine” J.Mol.Med.， 78(8) ： 426-430.
Hudspeth 等人 (1989)Plant Mol.Biol.， 12 ： 579-589.
James VA， Neibaur I， Altpeter F ： Stress inducible expression of theDREB1A transcription factor from xeric， Hordeum spontaneum L.in turf and forage grass(Paspalum notatum Flugge)enhancesabiotic stress tolerance.Transgenic Res 2008， 17 ： 93-104.
Jordano 等人， Plant Cell， 1： 855-866(1989).
Karlin S.， Altschul， S.F.(1990)“Methods for Assessing theStatistical Significance of Molecular Sequence Features byUsing General Scoring Schemes” Proc.Natl.Acad.Sci.USA87 ： 2264-2268.
Karlin S.， Altschul， S.F.(1993) “Applications and Statistics forMultiple High-Scoring Segments in Molecular Sequences” Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90 ： 5873-5877. Klein 等人 (1987)Nature 327 ： 70-73.
Koziel 等人 (1993)Biotechnology 11 ： 194-200.
Kusaba(2004)Current Opinion in Biotechnology， 15 ： 139-143.
Kwon 等人 (1994)Plant Physiol.105 ： 357-67.
Lawton 等人 (1987)Plant Mol.Biol.9 ： 315-324.
Maniatis ， T. ， Fritsch ， E.F. ， Sambrook ， J.(1982)Molecular Cloning ： A Laboratory Manual， Cold Spring Harbor Laboratory， Cold SpringHarbor， NY.
Matsuoka 等人 (1993) “Tissue-specific light regulatedexpression directed by the promoter of a C4 gene， maize pyruvate， orthophosphate dikinase， in a C3 plant， rice” PNAS USA， 90(20) ： 9586-90.
Matsuoka 等人 (1994)Plant J.6 ： 311-319.
Mayo， O.(1987)The Theory of Plant Breeding， Second Edition， Clarendon Press， Oxford.
Meier 等人 (1991)Plant Cell， 3： 309-316.
Milhavet 等人 (2003)Pharmacological Reviews， 55(4) ： 629-648.
Odell 等人 (1985)Nature 313 ： 810-812.
Paszkowski 等人 (1984)EMBO J.3 ： 2717-2722.
Potrykus 等人 (1985)Mol.Gen.Genet.199 ： 169-177.
Reich 等人 (1986)Biotechnology 4 ： 1001-1004.
Richins 等人 (1987)Nucleic Acids Res.20 ： 8451.
Sambrook， J.， Fritsch， E.F.， 和 Maniatis， T.(1989)Molecular Cloning ： A Laboratory Manual. 卷 1 和 3.Cold Spring Harbor LaboratoryPress， Cold Spring Harbor， NY.
Singh， D.P.(1986)Breeding for Resistance to Diseases and InsectPests， Springer-Verlag， NY.
Sullivan 等 人 (1989)“Isolation and characterization of a maizechlorophyll a/b binding protein gene that produces high levelsof mRNA in the dark” Mol.Gen.Genet.， 215(3) ： 431-440.
Tamura K.， Dudley J.， Nei M.， 和 Kumar S(2007)MEGA4 ： MolecularEvolutionary Genetics Analysis(MEGA)software version 4.0.Molecular Biology and Evolution 24 ： 1596-1599.
Theander， O.， 和 E.A.Westerlund(1986).Studies on dietary fiber.3.Improved procedures for analysis of dietary fiber.J.Agric.Food Chem.34 ： 330 336
Uknes 等人 (1993)Plant Cell 5 ： 159-169.
Walker 等人 (1987)Proc.Nat′ l Acad.Sci.USA， 84 ： 6624-6628.
Wang 等 人 (1992)“Characterization of cis-Acting ElementsRegulating Transcription from the Promoter of a ConstitutivelyActive Rice Actin Gene” Molecular and Cellular Biology， 12(8) ： 3399-3406.
Welsh J.R.(1981)Fundamentals of Plant Genetics and Breeding ， JohnWiley&Sons， NY.
Wood D.R.(1983)(Ed.)Crop Breeding， American Society of AgronomyMadison， Wis.
Wricke 和 Weber(1986)Quantitative Genetics and Selection PlantBreeding， Walter de Gruyter and Co.， Berlin.
www.lifesci.sus sex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/
Xu， D.， McElroy， D.， Thornburg， R.W.， Wu， R. 等人 (1993)“Systemicinduction of a potato pin2 promoter by wounding， methyljasmonate， and abscisicacid in transgenicrice plants” PlantMolecular Biology 22 ： 573-588.
Yamamoto 等人 (1994)Plant Cell Physiol.35 ： 773-778.
Yamamoto 等人 (1997)Plant J.12(2) ： 255-265.
Yang 等人 (1990)Proc.Nat′ l Acad.Sci.USA， 87 ： 4144-4148.
Yang， T.T. 等人 (1996)“Optimized Codon Usage and ChromophoreMutations Provide Enhanced Sensitivity with the GreenFluorescent Protein” Nucleic Acid Research 24(22) ： 4592-4593.
Y o s h i h a r a ，K . ，T . K o b a y a s h i ，T . F u j i i ， 和 I . A k a m a t s u ( 1 9 8 4 ) . A novelmodification of Klason lignin quantitative method.J.JapanTappi 38 ： 86 95.
Zhang 等人 (1996)Plant Physiology， 110 ： 1069-1079.
Zubieta， C， Kota， P， Ferrer， J.L.， Dixon， R.A.， Noel， J.P.(2002)“Structural basis for the modulation of lignin monomermethylation by caffeic acid/5-hydroxyferulic acid3/5-O-methyltransferase” Plant Cell.， 14(6) ： 1265-77.
Zuckerkandl E&Paul ing L(1965)Evolutionary divergence andconvergence in proteins， pp.97-166 in Evolving Genes andProteins， edited by V.Bryson 和H.J.Vogel.Academic Press， NewYork.36CN 102458099 A
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SEQ ID NO ： 43 显示了甘蔗 4CLM 的保守的 AMP 结合基序。
SEQ ID NO ： 44 显示了拟南芥 4CL1 的特征基序。
SEQ ID NO ： 45 显示了拟南芥 4CL2 的特征基序。
SEQ ID NO ： 46 显示了拟南芥 4CL3 的特征基序。
SEQ ID NO ： 47 显示了拟南芥 4CL4 的特征基序。
SEQ ID NO ： 48 显示了白杨 4CL1 的特征基序。
SEQ ID NO ： 49 显示了白杨 4CL2 的特征基序。
SEQ ID NO ： 50 显示了白杨 4CL3 的特征基序。
SEQ ID NO ： 51 显示了白杨 4CL4 的特征基序。
SEQ ID NO ： 52 显示了甘蔗 4CL1 的特征基序。
SEQ ID NO ： 53 显示了甘蔗 4CLM 的特征基序。
SEQ ID NO ： 54 显示了 4CL 基因的共同的特征基序。
发明详述
本发明涉及调节植物 ( 特别是甘蔗植物 ) 中木质素生物合成的材料和方法。在一 个实施方案中， 在植物中下调了木质素生物合成。本发明设想使用可用于抑制或降低基因 表达 ( 包括在转录、 转录后和翻译水平上 ) 和 / 或基因编码的蛋白质的功能或活性的任何 方法。可被靶向从而实现甘蔗中木质素生物合成的下调的基因及其编码的蛋白质包括， 但 不限于， 4- 香豆酸 -CoA 连接酶 (4CL)。在一个实施方案中， 4CL 基因编码包含 AMP 结合基 序序列 ( 例如 SEQ ID NO ： 34) 和 / 或 SEQ ID NO ： 54 的特征基序序列的 4CL 多肽。在一个 实施方案中， 4CL 基因是 4CL-M， 4CL-L， 或 4CL-N。在一个实施方案中， 4CL-L 基因编码具有 SEQ ID NO ： 6 中所示的氨基酸序列的多肽， 或其片段或变体。在另一个实施方案中， 4CL-M 基因编码具有 SEQ IDNO ： 7 中所示的氨基酸序列的多肽， 或其片段或变体。在另一个实施 方案中， 4CL-N 基因编码具有 SEQ ID NO ： 8 中所示的氨基酸序列的多肽， 或其片段或变体。 在特定的实施方案中， 4CL-L 基因包含 SEQ ID NO ： 1 中所示的核苷酸序列的全部或部分， 和 4CL-M 基因包含 SEQ ID NO ： 2 中所示的核苷酸序列的全部或部分。在特定的实施方案中， 4CL-N 基因包含 SEQ ID NO ： 3 中所示的核苷酸序列的全部或部分。
使用本领域已知的标准技术， 可抑制或下调甘蔗植物中一种或多种靶基因的表 达。在一个实施方案中， 在叶细胞和 / 或组织中选择性下调木质素生物合成。在特定的实 施方案中， 抑制或下调一种或多种 4CL 基因的表达和 / 或 4CL 基因编码的蛋白质的翻译或 功能。在一个实施方案中， 4CL 基因编码包含 AMP 结合基序序列 ( 例如 SEQ ID NO ： 34) 和 / 或 SEQ ID NO ： 54 的特征基序序列的 4CL 多肽。 在更特定的实施方案中， 抑制或下调 4CL-M， 4CL-L， 和 / 或 4CL-N 基因的表达。 在一个实施方案中， 使用反义技术下调靶基因的表达。 在 另一个实施方案中， 可使用共抑制技术抑制或下调靶基因的表达。 在另一个实施方案中， 使 用 RNA 干扰 (RNAi) 技术下调靶基因的表达， 包括例如使用短干扰 RNA(siRNA)。 在另一个实 施方案中， 可在本发明的甘蔗植物中提供靶基因的突变， 例如 “敲除” 突变。也可抑制靶基 因编码的蛋白质的表达和 / 或活性 ( 例如酶活性 )， 例如通过使蛋白质接触结合蛋白质并阻 碍其功能活性的抗体或适体。
可使用反义技术抑制参与甘蔗中木质素生物合成的靶基因的表达。在反义方法中， 在植物细胞中提供与靶基因的 mRNA 的核苷酸序列杂交的核酸。可在甘蔗植物的基因组 中掺入 ( 例如稳定地 ) 在表达时提供与 mRNA 杂交的核酸的核酸构建体。反义核酸可与靶 序列的整条编码链、 或其部分、 或靶序列的非编码部分、 或靶序列的编码和非编码两部分杂 交。反义构建体可与同反义核酸杂交的 mRNA 的部分具有例如至少约 70％、 至少约 75％、 至少约 80％、 至少约 85％、 至少约 90％、 至少约 95％、 至少约 96％、 97％、 98％或 99％的序 列同一性， 或高达 100％的序列同一性。反义核酸可包含任意合适的核苷酸数。例如， 本发 明的反义核酸构建体可包含至少 5， 6， 7， 8， 9， 10， 11， 12， 13， 14， 15， 16， 17， 18， 19， 20， 21， 22， 23， 24， 25， 26， 27， 28， 29， 30， 31， 32， 33， 34， 35， 36， 37， 38， 39， 40 或更多个核苷酸。在一个实 施方案中， 反义核酸包含至少约 40、 或至少约 50、 或至少约 60、 或至少约 70、 或至少约 80、 或 至少约 90、 或至少约 100、 或至少约 150、 或至少约 200、 或至少约 250、 或至少约 300、 或至少 约 350、 或至少约 400、 或至少约 450、 或至少约 500、 或至少约 550、 或至少约 600 或更多个核 苷酸。在一个实施方案中， 反义构建体在植物的叶细胞和 / 或组织中选择性表达， 例如通过 使用叶特异性启动子。下调或抑制靶基因表达的反义方法是本领域已知的。可从用核酸构 建体转化的和 / 或掺入核酸构建体的细胞培养包含和表达反义核酸构建体的植物。
也可使用共抑制或转录后基因沉默 (PTGS) 技术抑制参与甘蔗中木质素生物合成 的靶基因的表达。大体上， 在植物细胞中以正向和在适于核酸表达的构建体中 ( 例如， 包 含与能够在植物细胞中驱动转录的启动子序列有效连接的核酸的构建体 ) 提供对应靶基 因序列且与其具有序列同源性的核酸序列。核酸可与靶基因序列具有例如至少约 70％、 至 少约 75％、 至少约 80％、 至少约 85％、 至少约 90％、 至少约 95％、 至少约 96％、 97％、 98％或 99％的序列同一性， 或高达 100％的序列同一性。在一个实施方案中， 核酸构建体在植物的 叶细胞和 / 或组织中选择性表达， 例如通过使用叶特异性启动子。可从用核酸构建体转化 的和 / 或掺入核酸构建体的细胞培养包含和表达核酸构建体的植物。
也可使用 RNA 干扰 (RNAi) 技术抑制参与甘蔗中木质素生物合成的靶基因的表达。 在 RNAi 中， 在植物细胞中提供与靶基因表达的 mRNA 的全部或部分互补的双链 RNA 分子。 双 链 RNA 分子被加工为较小的 RNA 分子， 其然后被加工进沉默复合物， 所述沉默复合物导致靶 基因表达的抑制， 例如通过切割靶基因 mRNA。大体上， RNAi 分子具有 100 或更多个核苷酸， 更典型地具有 200 或更多个核苷酸。 可通过在细胞中引入和表达导致 RNAi 分子转录和产生 的核酸构建体提供 RNAi 分子。在一个实施方案中， 通过表达提供微 RNA(miRNA) 的核酸的 RNA 干扰视为包含在本发明的范围内。 miRNA 一般是已经从包含发夹结构的较长的前体 RNA 上被加工的 19-23 个核苷酸的 RNA。 在另一个实施方案中， 通过表达提供短干扰 RNA(siRNA) 的核酸的 RNA 干扰视为包含在本发明的范围内。 siRNA 一般是已经从较长的前体双链 RNA 上 被加工的具有 3’ 突出端的 20-25 个核苷酸的 RNA。 可从用提供 RNAi 分子的多核苷酸分子转 化的和 / 或掺入上述多核苷酸分子的细胞培养包含和表达 RNAi 分子 ( 包括 miRNA 和 siRNA) 的植物。在例如美国专利号 7,056,704 ； 7,078,196 ； 7,365,058 ； 7,232,086 ； 6,506,559 ； 7,282,564 ； 和 7,538,095 中已描述了用于 RNA 干扰的方法和材料， 并在 Milhavet 等人 (2003) ； Agrawal 等人 (2003) ； Kusaba(2004) ； 以及 Doran 和 Helliwell(2009) 中综述。在 一个实施方案中， 本发明的用于抑制植物中的 4CL 基因表达的 RNAi 构建体包含 SEQ ID NO ： 4 或 SEQ ID NO ： 5 的核苷酸序列的全部或部分。在特定的实施方案中， 在植物的叶细胞和 / 或组织中选择性表达 RNAi 分子， 例如通过使用叶特异性启动子。也可使用核酶技术抑制参与甘蔗中木质素生物合成的靶基因的表达。 核酶是一类 RNA， 其可被设计为以特异性的序列依赖性方式酶促切割和失活其他 RNA 靶。通过切割靶 RNA， 核酶抑制翻译， 因此阻止靶基因的表达。使用本领域已知的方法可在实验室化学合成 核酶并在结构上改造以提高其稳定性和催化活性。通过本领域已知的基因递送机制， 可将 编码核酶的核苷酸序列引入植物细胞并掺入植物基因组。可从用核酶编码序列转化的和 / 或掺入核酶编码序列的细胞培养包含和表达核酶编码序列的植物。具有对 4CL 的特异性的 核酶可包括与一种或多种 4CL mRNA 的至少一部分的核苷酸序列互补的一种或多种序列， 和 具有已知的负责 mRNA 切割的催化序列的序列 ( 见美国专利号 5,093,246 或 Haselhoff 等 人 1988)。例如， 可构建四膜虫 (Tetrahymena)L-19 IVS RNA 的衍生物， 其中活性位点的核 苷酸序列与将要在 4CL mRNA 中切割的核苷酸序列互补 ( 见例如美国专利号 4,987,071 ； 和 美国专利号 5,116,742)。可选地， 可使用编码 4CL 蛋白质的 4CL mRNA 从 RNA 分子库中选择 具有特定核糖核酸酶活性的催化 RNA( 见例如 Bartel 等人 1993)。 在一个实施方案中， 在植 物的叶细胞和 / 或组织中选择性表达核酶， 例如通过使用叶特异性启动子。
除了抑制参与甘蔗中的木质素生物合成的靶基因以外， 本发明还设想在靶基因中 的突变， 或其中可对植物细胞提供突变的基因， 在所述植物细胞中靶基因表达或基因产物 水平或活性被降低或抑制。在一个实施方案中， 将突变的 4CL 基因掺入甘蔗植物的基因组， 其中突变的 4CL 基因展示基因转录物或其翻译的减少的或无表达。在一个实施方案中， 在 植物的 4CL 基因中引入突变， 所述突变导致 4CL 基因的转录减少， 或 mRNA 的翻译减少， 和/ 或导致展示降低的酶活性的蛋白质。在特定的实施方案中， 在 4CL 基因的蛋白质编码区引 入一种或多种突变。在另一个实施方案中， 在 4CL 基因转录起始位点的上游和 / 或转录起 始位点的下游引入突变。在一个实施方案中， 在 4CL 基因调控序列中或附近， 例如在启动子 序列中引入突变。突变可阻碍或抑制 4CL 基因序列的转录， 例如通过阻碍或抑制转录因子 或聚合酶结合 4CL 核酸序列。在一个实施方案中， 在植物的叶细胞和 / 或叶组织中选择性 引入 4CL 基因中的突变。突变也可包括抑制或降低 4CL 多肽的功能活性 ( 例如酶活性 ) 的 一种或多种核苷酸或氨基酸插入、 缺失和 / 或取代。创造和引入突变的方法是本领域已知 的。在一个实施方案中， 在植物中的一个或多个野生型 4CL 基因中引入突变。在另一个实 施方案中， 突变的 4CL 基因替换植物中的一个或多个野生型 4CL 基因。在一个实施方案中， 在植物的叶细胞和 / 或组织中选择性表达突变的 4CL 基因。
除了抑制或遏制参与木质素生物合成的靶基因以外， 也可抑制由本发明的靶基因 编码的蛋白质的活性 ( 例如酶活性 )。 在一个实施方案中， 可在甘蔗植物的细胞中掺入和表 达编码与蛋白质结合并抑制其活性 ( 例如酶活性 ) 的抗体或其抗原结合片段的核酸。可从 用所述核酸转化的和 / 或掺入所述核酸的细胞培养包含和表达编码抗体或其抗原结合片 段的核酸的植物。 制备结合和抑制特定靶蛋白的抗体的方法和获得编码抗体的核酸的方法 是本领域熟知的。在一个实施方案中， 抗体是单克隆抗体， 或其抗原结合片段。抗原结合片 段包括， 但不限于 F(ab′ )2， Fab′， Fab， 和 Fv， 并可使用本领域已知的标准方法制备。抗体 可来源于能够产生针对靶蛋白表位的抗体的任意动物， 并包括例如人、 灵长类、 小鼠、 大鼠、 山羊、 绵羊、 猪和牛。在特定的实施方案中， 抗体结合 4CL 蛋白。在一个实施方案中， 4CL 基 因编码包含 AMP 结合基序序列 ( 例如 SEQ ID NO ： 34) 和 / 或 SEQ IDNO ： 54 的特征基序序列 的 4CL 多肽。在更特定的实施方案中， 4CL 蛋白由 4CL-M 基因、 4CL-L 基因或 4CL-N 基因编码。在特定的实施方案中， 4CL-L 基因包含 SEQ ID NO ： 1 中所示的核苷酸序列的全部或部 分， 4CL-M 基因包含 SEQ ID NO ： 2 中所示的核苷酸序列的全部或部分， 4CL-N 基因包含 SEQ IDNO ： 3 中所示的核苷酸序列的全部或部分。在一个实施方案中， 4CL-M， 4CL-L 和 4CL-N 基 因分别编码具有 SEQ ID NO ： 6、 7 和 8 中所示的氨基酸序列的多肽， 或其片段或变体。在一 个实施方案中， 抗体与包含 SEQ ID NO ： 6、 7 和 8 中的氨基酸序列的 4CL 蛋白， 或其片段或表 位结合。 在特定的实施方案中， 在植物的叶组织中选择性表达编码抗体的核酸， 例如通过使 用叶特异性启动子。
也可通过表达和 / 或使靶蛋白接触结合特定靶蛋白的适体抑制参与木质素生物 合成的靶基因编码的蛋白质的活性 ( 例如酶活性 )。适体是可被选择用于结合靶分子的 寡核苷酸或肽 ( 见， 例如， Ellington 和 Szostak(1990) 以及 Hoppe-Seyler 和 Butz(2000) 和 美 国 专 利 号 5,582,981 ； 5,270,163 ； 5,595,877 ； 5,817,785 ； 6,344,318 ； 6,933,116 ； 7,368,236 ； 和 7,700,759)。在一个实施方案中， 在植物细胞中掺入和表达编码与参与木 质素生物合成的蛋白结合的适体的核酸。可从用所述核酸转化的和 / 或掺入所述核酸的 细胞培养包含和表达编码适体的核酸的植物。在一个实施方案中， 适体结合并抑制 4CL 蛋 白。在一个实施方案中， 4CL 基因编码包含 AMP 结合基序序列 ( 例如 SEQ ID NO ： 34) 和 / 或 SEQ ID NO ： 54 的特征基序序列的 4CL 多肽。在特定的实施方案中， 4CL 蛋白由本发明的 4CL-L、 4CL-M 或 4CL-N 基因编码。在特定的实施方案中， 4CL-L 基因包含 SEQ IDNO ： 1 中所 示的核苷酸序列的全部或部分， 4CL-M 基因包含 SEQ ID NO ： 2 中所示的核苷酸序列的全部 或部分， 4CL-N 基因包含 SEQ ID NO ： 3 中所示的核苷酸序列的全部或部分。在一个实施方 案中， 4CL-M， 4CL-L 和 4CL-N 基因分别编码具有 SEQ ID NO ： 6、 7 和 8 中所示的氨基酸序列 的多肽， 或其片段或变体。在一个实施方案中， 适体与包含 SEQ ID NO ： 6、 7 和 8 中的氨基酸 序列的 4CL 蛋白， 或其片段或表位结合。在特定的实施方案中， 在植物的叶组织中选择性表 达编码适体的核酸， 例如通过使用叶特异性启动子。
本发明也涉及甘蔗植物， 其中木质素生物合成已被调节 ( 例如， 下调 )。在一个实 施方案中， 在叶细胞和 / 或组织中选择性下调木质素生物合成。在一个实施方案中， 在甘蔗 植物中抑制或下调一种或多种 4CL 基因的表达和 / 或由 4CL 基因编码的蛋白质的翻译或 活性。在一个实施方案中， 4CL 基因编码包含 AMP 结合基序序列 ( 例如 SEQ ID NO ： 34) 和 / 或 SEQ ID NO ： 54 的特征基序序列的 4CL 多肽。在一个实施方案中， 被抑制的 4CL 基因是 4CL-L， 4CL-M 或 4CL-N。在一个实施方案中， 4CL-M， 4CL-L 和 4CL-N 基因分别编码具有 SEQ ID NO ： 6、 7 和 8 中所示的氨基酸序列的多肽， 或其片段或变体。 在特定的实施方案中， 4CL-L 基因包含 SEQ ID NO ： 1 中所示的核苷酸序列的全部或部分， 4CL-M 基因包含 SEQ ID NO ： 2 中所示的核苷酸序列的全部或部分， 4CL-N 基因包含 SEQ ID NO ： 3 中所示的核苷酸序列的 全部或部分。本发明的甘蔗植物可具有掺入其基因组的靶向一种或多种 4CL 基因 ( 例如 4CL-M， 4CL-N 和 / 或 4CL-L) 的反义、 共抑制、 RNAi 或核酶核酸。本发明的甘蔗植物可在其 基因组中具有突变的 4CL 基因， 其中 4CL 基因的表达被抑制， 和 / 或其中 4CL 多肽具有抑制 或降低 4CL 多肽的功能活性 ( 例如酶活性 ) 的突变。本发明的甘蔗植物也可具有掺入其基 因组的核酸， 所述核酸编码结合 4CL 蛋白并抑制其酶活性的一种或多种抗体 ( 或其抗原结 合片段 ) 和 / 或适体。
任选地， 本文公开的植物可还展示主要有利于种子公司、 栽培者或粮食加工者的一种或多种农艺性状， 例如除草剂抗性、 病毒抗性、 细菌病原体抗性、 昆虫抗性、 线虫抗 性 和 真 菌 抗 性。 见， 例 如 美 国 专 利 号 5,569,823 ； 5,304,730 ； 5,495,071 ； 6,329,504 ； 和 6,337,431。这样的性状也可为提高植物活力或产量的性状 ( 包括允许植物在不同的温 度、 土壤条件和日光和降水水平下生长的性状 )， 或允许鉴定展示目的性状的植物的性状 ( 例如， 可选择的标记物基因， 种皮颜色等等 )。在例如美国专利号 5,569,823 ； 5,304,730 ； 5,495,071 ； 6,329,504 ； 6,337,431 ； 5,767,366 ； 5,928,937 ； 4,761,373 ； 5,013,659 ； 4,975,374 ； 5,162,602 ； 4,940,835 ； 4,769,061 ； 5,554,798 ； 5,879,903 ， 5,276,268 ； 5,561,236 ； 4,810,648 ； 和 6,084,155 ； 欧洲申请号 0242246 ； 美国专利申请号 20010016956 和 www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/ 的万维网上描述了多种目的性 状， 以及将这些性状引入植物的方法。
本发明也涉及甘蔗植物组织和植物部分， 包括但不限于， 来自本发明的具有被调 节 ( 例如下调 ) 的木质素生物合成的、 可从其再生植物的甘蔗植物的植物细胞、 植物原生质 体、 植物细胞组织培养物、 植物愈伤组织、 植物块 (clump) 和植物中完整的植物细胞， 或植 物的部分， 例如枝、 核、 穗、 穗轴、 果壳、 根尖、 花药、 种子、 根、 胚、 下胚轴、 子叶、 花粉、 胚珠、 花 药、 幼苗、 梗、 茎、 叶、 果和花。在一个实施方案中， 在植物组织或植物细胞中抑制或下调一 种或多种 4CL 基因或其基因产物的表达。在一个实施方案中， 被抑制的 4CL 基因是 4CL-M， 4CL-L 或 4CL-N。在一个实施方案中， 4CL-M， 4CL-L 和 4CL-N 基因分别编码具有 SEQ ID NO ： 6、 7 和 8 中所示的氨基酸序列的多肽， 或其片段或变体。在特定的实施方案中， 4CL-L 基因 包含 SEQ ID NO ： 1 中所示的核苷酸序列的全部或部分， 4CL-M 基因包含 SEQ ID NO ： 2 中所 示的核苷酸序列的全部或部分， 4CL-N 基因包含 SEQ IDNO ： 3 中所示的核苷酸序列的全部或 部分。
本发明也涉及具有被调节的或下调的木质素生物合成的甘蔗细胞或原生质体。 在一个实施方案中， 在甘蔗细胞或原生质体中抑制或下调一种或多种 4CL 基因的表达， 或 由 4CL 基因编码的蛋白质的翻译或活性。在一个实施方案中， 被抑制的 4CL 基因是 4CL-M， 4CL-L 或 4CL-N。在一个实施方案中， 4CL-M， 4CL-L 和 4CL-N 基因分别编码具有 SEQ ID NO ： 6、 7 和 8 中所示的氨基酸序列的多肽， 或其片段或变体。在特定的实施方案中， 4CL-L 基因 包含 SEQ ID NO ： 1 中所示的核苷酸序列的全部或部分， 4CL-M 基因包含 SEQ ID NO ： 2 中所 示的核苷酸序列的全部或部分， 4CL-N 基因包含 SEQ IDNO ： 3 中所示的核苷酸序列的全部或 部分。
本发明也涉及产生具有降低的或下调的木质素生物合成的甘蔗植物的方法。 在一 个实施方案中， 在甘蔗植物的叶细胞和 / 或组织中降低或下调木质素生物合成。在另一个 实施方案中， 在甘蔗植物的茎组织中降低或下调木质素生物合成。 在一个实施方案中， 本发 明的方法包括抑制或遏制一种或多种 4CL 基因的表达， 或抑制由 4CL 基因编码的蛋白质的 翻译或活性 ( 例如酶活性 )。在一个实施方案中， 4CL 基因编码包含 AMP 结合基序序列 ( 例 如 SEQ ID NO ： 34) 和 / 或 SEQ ID NO ： 54 的特征基序序列的 4CL 多肽。在一个实施方案中， 被抑制的 4CL 基因是 4CL-M， 4CL-L 或 4CL-N。在一个实施方案中， 4CL-M， 4CL-L 和 4CL-N 基 因分别编码具有 SEQ ID NO ： 6、 7 和 8 中所示的氨基酸序列的多肽， 或其片段或变体。在特 定的实施方案中， 4CL-L 基因包含 SEQ ID NO ： 1 中所示的核苷酸序列的全部或部分， 4CL-M 基因包含 SEQ ID NO ： 2 中所示的核苷酸序列的全部或部分， 4CL-N 基因包含 SEQ IDNO ： 3中所示的核苷酸序列的全部或部分。在一个实施方案中， 使用反义核酸、 共抑制、 RNA 干扰或 核酶抑制靶基因的表达。在另一个实施方案中， 通过基因突变抑制靶基因的表达。在另一 个实施方案中， 通过表达与蛋白质结合的抗体或其抗原结合片段， 和 / 或适体， 或通过在基 因中提供抑制基因的 mRNA 翻译为蛋白质的突变或破坏或抑制编码的蛋白质的功能的突变 ( 例如通过氨基酸序列中的改变 )， 在植物中抑制靶基因编码的蛋白质的活性。可使用本领 域已知的标准方法和材料将提供靶基因表达抑制的核酸构建体引入植物基因组， 并由此制 备转化的和转基因的植物。
可在表达构建体中提供对本发明有用的多核苷酸。 本发明的表达构建体一般包括 在将要表达表达构建体的预期的宿主细胞中有功能的调控元件。因此， 本领域普通技术人 员可选择用于细菌宿主细胞、 酵母宿主细胞、 植物宿主细胞、 昆虫宿主细胞、 哺乳动物宿主 细胞和人宿主细胞的调控元件。调控元件包括启动子、 转录终止序列、 翻译终止序列、 增强 子和多聚腺苷酸化元件。如本文使用的， 术语 “表达构建体” 指提供有效连接的核酸序列的 转录的核酸序列的组合。如本文使用的， 术语 “有效连接的” 指描述的组件的并置， 其中所 述组件处于允许其以其预期的方式发挥功能的关系之中。大体上， 有效连接的组件处于相 邻关系。
本发明的表达构建体可包含与本发明的多核苷酸序列有效连接的启动子序列。 可 使用本领域已知的标准技术将启动子掺入多核苷酸。 可在本发明的表达构建体中使用多拷 贝启动子或多个启动子。 在优选的实施方案中， 可将启动子置于这样的位置， 即其相距表达 构建体中的转录起始位点的距离与其相距其天然遗传环境中的转录起始位点的距离相同。 在此距离上允许一些基本上不降低启动子活性的变化。 在表达构建体中一般包含转录起始 位点。
如果将在植物细胞中提供表达构建体或将表达构建体引入植物细胞， 那么可使用 植物病毒启动子， 例如花椰菜花叶病毒 (CaMV)35S( 包括增强的 CaMV 35S 启动子 ( 见， 例如 美国专利号 5,106,739))， 或 CaMV 19S 启动子或木薯叶脉花叶 ( 启动子 )。可用于植物中 的表达构建体的其他启动子包括， 例如 prolifera 启动子、 Ap3 启动子、 热休克启动子、 根癌 农杆菌 (A.tumefaciens) 的 T-DNA 1′ - 或 2′ - 启动子、 多半乳糖醛酸酶启动子、 矮牵牛 花的查耳酮合酶 A(CHS-A) 启动子、 烟草 PR-1a 启动子、 泛素启动子、 肌动蛋白启动子、 alcA 基因启动子、 pin2 启动子 (Xu 等人， 1993)、 玉米 WipI 启动子、 玉米 trpA 基因启动子 ( 美国 专利号 5,625,136)、 玉米 CDPK 基因启动子， 且也可使用 RUBISCO SSU 启动子 ( 美国专利号 5,034,322)。在本发明中可使用组织特异性启动子， 例如果特异性启动子， 如番茄的 E8 启 动子 ( 登记号 ： AF515784 ； Good 等人 (1994))。 在本发明的核酸构建体中可使用的叶特异性 启动子包括 Cab1 启动子 (Brusslan 和 Tobin， 1992)、 Cab19 启动子 (Bassett 等人， 2007)、 PPDK 启动子 (Matsuoka 等人， 1993) 和核酮糖二磷酸羧化酶 (RBCS) 启动子 (Matsuoka 等 人 (1994) 和美国专利号 7,723,575)。可用于本发明的表达构建体的其它的植物叶特异性 启动子包括， 但不限于， Act1 启动子 ( 美国公开的申请号 20090031441)、 AS-1 启动子 ( 美 国专利号 5,256,558)、 RBC-3A 启动子 ( 美国专利号 5,023,179)、 CaMV 35S 启动子 (Odell 等人， 1985)、 增强的 CaMV35S 启动子、 玄参花叶病毒 (FMV) 启动子 (Richins 等人， 1987)、 甘露碱合酶 (mas) 启动子、 章鱼碱合酶 (ocs) 启动子等等， 例如来自 CaMV 19S(Lawton 等 人， 1987)、 nos(Ebert 等人， 1987)、 Adh(Walker 等人， 1987)、 蔗糖合酶 (Yang 等人、 1990)、α- 微管蛋白、 泛素、 肌动蛋白 (Wang 等人、 1992)、 cab(Sullivan 等人、 1989)、 磷酸烯醇式丙 酮酸羟化酶 (PEPCase)(Hudspeth 等人、 1989) 的启动子， 或与 R 基因复合物有关的启动子 (Chandler 等人、 1989)。又见公开的美国申请 2007/006346 和 Yamamoto 等人 (1997) ； Kwon 等人 (1994) ； Yamamoto 等人。 果特异性启动子如花器官特异性启动子可用于本发明的表达 构建体， 从而在植物的花器官中表达本发明多核苷酸。花器官特异性启动子的实例包括在 美国专利号 6,462,185 ； 5,639,948 ； 和 5,589,610 中描述的任意启动子序列。也可使用种 子特异性启动子如 β- 云扁豆蛋白基因 ( 例如菜豆的 ) 或大豆球蛋白基因 ( 例如大豆的 ) 等等的启动子。根特异性启动子， 如在美国专利号 6,455,760 或美国专利号 6,696,623， 或 在 公 开 的 美 国 专 利 申 请 号 20040078841 ； 20040067506 ； 20040019934 ； 20030177536 ； 20030084486 ； 或 20040123349 中描述的任意启动子序列可用于本发明的表达构建体。 木质 部特异性启动子包括稻的肉桂酸 -4- 羟化酶 (C4H)。也设想将组成型启动子 ( 如 CaMV、 泛 素、 肌动蛋白或 NOS 启动子 )、 发育调控型启动子和诱导型启动子 ( 如可被热、 光、 激素或化 学品诱导的那些启动子 ) 用于本发明的多核苷酸表达构建体。
鉴定和表征植物基因组 DNA 中的启动子区的方法是本领域已知的， 并包括， 例如 在以下参考文献中描述的那些 ： Jordano 等人 (1989) ； Bustos 等人 (1989) ； Green 等人 (1988) ； Meier 等人 (1991) ； 和 Zhang 等人 (1996)。公开的美国申请 2009/0199307 也描述 了使用差异显示鉴定组织特异性启动子的方法 ( 见， 例如美国专利号 5,599,672)。在差异 显示中， 比较了来自不同组织类型的 mRNA。 通过鉴定仅在特定组织类型， 或组织类型集合中 存在的 mRNA 种类， 可鉴定出以组织特异性方式表达的相应基因。可通过逆转录酶转录 RNA 以产生 cDNA， 并可使用 cDNA 分离含有全长基因的克隆。 也可使用 cDNA 从相应基因中分离部 分同源或同源的启动子、 增强子或终止子， 使用例如抑制 PCR。又见美国专利号 5,723,763。
本发明的表达构建体也可任选地包含转录终止序列， 翻译终止序列， 编码信号肽 的序列， 和 / 或增强子元件。一般可从真核或病毒基因序列的 3’ 非翻译区获得转录终止 区。可将转录终止序列置于编码序列的下游以提供有效的终止。信号肽序列是一般存在于 蛋白质的氨基端的短氨基酸序列， 其负责有效连接的成熟多肽再定位到范围广泛的翻译后 细胞目的地， 所述目的地的范围从特定细胞器区室到蛋白质作用位点和细胞外环境。通过 使用有效连接的信号肽序列， 将基因产物靶向预期的细胞和 / 或细胞外目的地， 设想将此 用于本发明的多肽。经典的增强子是提高基因转录的顺式作用元件， 并也可包含在表达构 建体中。经典的增强子元件是本领域已知的， 包括但不限于 CaMV 35S 增强子元件、 巨细胞 病毒 (CMV) 早期启动子增强子元件和 SV40 增强子元件。增强基因表达的内含子介导的增 强子元件也是本领域已知的。这些元件必须存在于转录区内且是方向依赖的。实例包括玉 米 shrunken-1 增强子元件 (Clancy 和 Hannah， 2002)。
在表达构建体中也可包含引导从表达构建体上转录的 mRNA 的多聚腺苷酸化的 DNA 序列， 并包括但不限于 CaMV 35S、 章鱼碱合酶或胭脂碱合酶信号。本发明的表达构建体 也可包含引导其他基因转座的多核苷酸序列， 即转座子。
表达构建体也可包含用于选择转化细胞的一种或多种显性可选择标记物基因， 包 括例如编码抗生素抗性的基因。抗生素抗性基因可提供对一种或多种以下抗生素的抗性 ： 潮霉素、 卡那霉素、 博来霉素、 G418、 链霉素、 巴龙霉素、 新霉素和壮观霉素。 可通过新霉素磷 酸转移酶 (NPT II) 提供卡那霉素抗性。用于细胞转化筛选的其它标记物包括编码 β- 葡糖醛酸酶 (GUS)、 β- 半乳糖苷酶、 荧光素酶、 胭脂碱合酶、 氯霉素乙酰基转移酶 (CAT)、 绿色 荧光蛋白 (GFP) 或增强的 GFP(Yang 等人 (1996)) 的基因。
本发明也涉及包含编码预期蛋白质的本发明的多核苷酸的多核苷酸载体， 所述载 体将提供给用本发明的生物反应器装置提供的细胞。 在本发明的表达构建体或多核苷酸的 5’ 和 3’ 端可包含独特的限制酶位点， 以允许其插入多核苷酸载体。如本文使用的， 术语 “载 体” 指任意遗传元件， 包括例如质粒、 粘粒、 染色体、 噬菌体、 病毒等等， 当与合适的控制元件 相联系时其能够复制， 且其可在细胞间转移多核苷酸序列。载体包含允许载体在选定的宿 主细胞中复制的核苷酸序列。用于表达和 / 或克隆的若干载体是现有的， 并包括但不限于， pBR322， pUC 系列， M13 系列， 和 pBLUESCRIPT 载体 (Stratagene， La Jolla， CA)。
本发明的多核苷酸可由 RNA 或 DNA 组成。优选地， 多核苷酸由 DNA 组成。本发明 也包含与本文公开的多核苷酸序列互补的多核苷酸。
用 基 因 转 化 植 物 细 胞 的 技 术 是 本 领 域 已 知 的， 并包括例如农杆菌 (Agrobacterium) 感染、 基因枪法、 电穿孔、 氯化钙处理、 PEG 介导的转化等。见， 例如美国专 利号 5,036,006 ； 5,591,616 ； 5,100,792 ； 公开的美国申请号 2006/0260011 ； 和公开的 PCT 申请号 WO 93/07278 和 WO93/21335。 美国专利号 5,661,017 教导了用异源多核苷酸转化藻 类细胞的方法和材料。使用本领域已知的标准方法可选择、 重新分化和培养转化细胞为包 含和表达本发明的多核苷酸的植物。 在本发明的范围内也包含任意转化的或转基因的本发 明的植物细胞或植物的种子和其他植物组织和后代。 也可根据与本文示例的这些序列的更具体的同一性和 / 或相似性范围定义本发 明的多核苷酸和多肽。序列同一性将一般地大于 60 ％， 优选地大于 75 ％， 更优选地大于 80％， 甚至更优选地大于 90％， 和可大于 95％。与本文示例的序列相比， 序列的同一性和 / 或相似性可为 49， 50， 51， 52， 53， 54， 55， 56， 57， 58， 59， 60， 61， 62， 63， 64， 65， 66， 67， 68， 69， 70， 71， 72， 73， 74， 75， 76， 77， 78， 79， 80， 81， 82， 83， 84， 85， 86， 87， 88， 89， 90， 91， 92， 93， 94， 95， 96， 97， 98， 或 99 ％。除非另外指定， 可使用如在 Karlin 和 Altschul(1993) 中修改的 Karlin 和 Altschul(1990) 算法测定如本文使用的 2 个序列的百分比序列同一性和 / 或相 似性。 这样的算法包含在 Altschul 等人 (1990) 的 NBLAST 和 XBLAST 程序中。 可使用 NBLAST 程序， 分数＝ 100， 字长＝ 12 进行 BLAST 搜索， 以得到具有预期百分比序列同一性的序列。 为了比较目的获得有缺口的比对， 可使用如 Altschul 等人 (1997) 描述的 Gapped BLAST。 当使用 BLAST 和 Gapped BLAST 程序， 可使用各个程序 (NBLAST 和 XBLAST) 的默认参数。见 NCBI/NIH 网站。
本发明也设想与编码本发明的多肽的多核苷酸序列具有足够同源的序列， 从而在 标准的严格条件和标准方法下允许与该序列杂交 (Maniatis， T. 等人， 1982) 的那些本发明 的多核苷酸分子 ( 和编码本发明的多肽的那些多核苷酸分子 )。 如本文使用的， 用于杂交的 “严格的” 条件指这样的条件， 其中一般在 6x SSPE， 5x Denhardt 溶液， 0.1％ SDS， 0.1mg/ml 变性 DNA 中在低于 DNA 杂合体的解链温度 (Tm) 的 20-25C 下过夜进行杂交。解链温度有以 下公式 (Beltz， G.A. 等人， 1983) 描述 ：
Tm ＝ 81.5C+16.6Log[Na+]+0.41( ％ G+C)-0.61( ％甲酰胺 )-600/ 双链体的长度 ( 以碱基对为单位 )。
一般如下进行洗涤 ：
a) 在 1x SSPE， 0.1％ SDS 中在室温进行 15 分钟， 2 次 ( 低严格度的洗涤 )。
b) 在 0.2x SSPE， 0.1％ SDS 中在 Tm-20C 下进行 15 分钟， 1 次 ( 中严格度的洗涤 )。
如本文使用的， 术语 “核酸” 和 “多核苷酸序列” 指单链或双链形式的脱氧核糖核 苷酸或核糖核苷酸聚合物， 除非另外限制， 其包含可与天然存在的核苷酸类似的方式发挥 功能的天然核苷酸的已知类似物。多核苷酸序列包括被转录为 RNA 的 DNA 链序列和被翻译 为蛋白质的 RNA 序列二者。多核苷酸序列包括全长序列以及来源于全长序列的较短序列二 者。 应当理解， 特定多核苷酸序列包含天然序列的简并密码子， 或可被引入以在特定宿主细 胞中提供密码子偏好的序列。 在本发明范围内的多核苷酸序列还包含与编码本发明的多肽 的序列特异性杂交的序列。 多核苷酸包含作为单独的链的或在双链体中的正义和反义链二 者。
在本发明的范围内也视为包含具有除了在本发明的多肽中特别示例的氨基酸取 代以外的氨基酸取代的多肽。 例如， 可用非天然氨基酸取代本发明的多肽的氨基酸， 只要具 有取代的氨基酸的多肽基本上保留与氨基酸未被取代的多肽相同的活性。 非天然氨基酸的 实例包括， 但不限于， 鸟氨酸、 瓜氨酸、 羟脯氨酸、 高丝氨酸、 苯甘氨酸、 牛磺酸、 碘化酪氨酸、 2， 4- 二氨基丁酸、 α- 氨基异丁酸、 4- 氨基丁酸、 2- 氨基丁酸、 γ- 氨基丁酸、 ε- 氨基己酸、 6- 氨基己酸、 2- 氨基异丁酸、 3- 氨基丙酸、 正亮氨酸、 正缬氨酸、 肌氨酸、 高瓜氨酸、 磺丙氨 酸、 τ- 丁基甘氨酸、 τ- 丁基丙氨酸、 苯甘氨酸、 丙氨酸环己酯、 β- 丙氨酸、 氟代氨基酸， 专 门设计的氨基酸如 β- 甲基氨基酸、 C- 甲基氨基酸、 N- 甲基氨基酸， 和一般的氨基酸类似 物。非天然氨基酸也包括具有衍生化的侧基的氨基酸。此外， 蛋白质中的任意氨基酸可为 D( 右旋 ) 型或 L( 左旋 ) 型。 氨基酸可一般被分为以下种类 ： 非极性、 无电荷极性、 碱性和酸性。在本发明的范 围内包括保守取代， 其中具有一类氨基酸的多肽被同类的另一种氨基酸替换， 只要具有取 代的多肽仍基本上保留与没有取代的多肽相同的生物学活性。 非极性氨基酸包括 Ala， Val， Leu， Ile， Pro， Met， Phe， 和 Trp。无电荷极性氨基酸包括 Gly， Ser， Thr， Cys， Tyr， Asn， 和 Gln。酸性氨基酸包括 Asp 和 Glu。碱性氨基酸包括 Lys， Arg， 和 His。
一旦在表达系统中掺入本发明的核酸序列， 就可将其转化进植物细胞。词语 “植 物” 指任意植物， 特别是种子植物， “植物细胞” 是植物的结构和生理学单位， 其包含细胞壁， 但也可指原生质体。植物细胞可为分离的单个细胞或培养细胞的形式， 或作为更高等的有 机体单位例如植物组织或植物器官的一部分。术语 “转化” 指导致在遗传上被稳定继承的 核酸片段至宿主细胞基因组的转移。包含转化的核酸片段的宿主细胞被称为 “转基因” 细 胞， 和包含转基因细胞的生物被称为 “转基因生物” 。
转 化 植 物 和 植 物 细 胞 的 方 法 的 实 例 包 括 农 杆 菌 介 导 的 转 化 (Deblaere 等 人 (1987)) 和微粒轰击技术 (Klein 等人 (1987) ； 美国专利号 4,945,050)。通过技术人员熟 知的方法可从转基因细胞再生全植物 ( 见， 例如 Fromm 等人 (1990))。
可以多种本领域公认的方式将本发明的表达构建体引入植物细胞。 术语 “引入” 在 多核苷酸 ( 例如编码本文公开的酶的核苷酸 ) 的情况下， 旨在表示以这样的方式将多核苷 酸呈递给植物， 即， 使多核苷酸能进入植物细胞内部。当要引入多于一种多核苷酸时， 这些 多核苷酸可被组装为单个核苷酸构建体的一部分， 或作为单独的核苷酸构建体， 并可位于 相同或不同的转化载体上。
因此， 可在单个转化事件中， 在单独的多个转化事件中， 或例如在植物中将这些多 核苷酸引入目的宿主细胞， 作为育种方案的一部分。本发明的方法不依赖于特定的将一种 或多种多核苷酸引入植物的方法， 只要多核苷酸能进入植物的至少一个细胞的内部。将多 核苷酸引入植物的方法是本领域已知的， 并包括但不限于， 瞬时转化法、 稳定转化法和病毒 介导法。
“瞬时转化” 在多核苷酸的情况下旨在表示， 多核苷酸被引入植物但不整合进植物 的基因组。
在将多核苷酸引入植物的情况下， “稳定引入” 或 “稳定引入的” 旨在表示， 引入的 多核苷酸被稳定掺入植物基因组， 因此植物被多核苷酸稳定地转化。
“稳定转化” 或 “稳定转化的” 旨在表示， 引入植物的多核苷酸 ( 例如， 本文描述的 核苷酸构建体 ) 整合进植物的基因组， 并能够被其后代继承， 更特别地， 被多个连续世代的 后代继承。
可用于植物转化的多种转化载体是在植物转化领域的普通技术人员已知的， 且与 本发明有关的基因可与任意这些载体共同使用。 载体的选择将取决于优选的转化技术和用 于转化的靶物种。对某些靶物种， 可优选不同的抗生素或除草剂选择标记物。
再生转化植物的方法是本领域熟知的。例如， Ti 质粒载体已被用于外源 DNA 的递 送， 以及直接的 DNA 摄取、 脂质体、 电穿孔、 显微注射和微粒。另外， 来自农杆菌属的细菌可 被用于转化植物细胞。下面描述了转化双子叶和单子叶植物的代表性技术， 以及代表性质 体转化技术。
许多载体可用于使用根癌农杆菌的转化。其一般携带至少一种 T-DNA 边界序列， 并包括如 pBIN19(Bevan(1984)) 的载体。为了构建用于农杆菌转化的载体， 见， 例如美国专 利申请公开号 2006/0260011。
不使用根癌农杆菌的转化规避了在选择的转化载体中对 T-DNA 序列的需要， 因此 也可使用缺乏这些序列的载体。不依赖农杆菌的转化技术包括， 但不限于， 通过颗粒轰击、 原生质体摄取 ( 例如 PEG 和电穿孔 ) 和显微注射。载体的选择大部分取决于用于转化的物 种的优选的选择。有关这些载体的构建， 见例如美国公开的申请号 2006/0260011。
用于双子叶植物的转化技术是本领域熟知的， 并包括基于农杆菌的技术和不需要 农杆菌的技术。非农杆菌的技术包括通过原生质体或细胞直接摄取外源遗传物质， 并可例 如通过 PEG 或电穿孔介导的摄取、 颗粒轰击介导的递送或显微注射实现。Paszkowski 等人 (1984)， Potrykus 等人 (1985)， Reich 等人 (1986)， 和 Klein 等人 (1987) 描述了这些技术 的实例。在每种情况下， 使用本领域已知的标准技术将转化细胞再生为整株植物。
农杆菌介导的转化是转化双子叶植物的优选技术， 因为其高转化效率及其对许多 不同物种的广泛实用性。农杆菌转化一般包括将携带目的外源 DNA 的二元载体转移至合适 的农杆菌菌株， 这可能依赖于宿主农杆菌菌株在共驻留的 Ti 质粒或染色体上携带的 vir 基 因的补足 (complement)(Uknes 等人 (1993))。通过使用携带重组二元载体的大肠杆菌、 携 带能够将重组二元载体移动至靶农杆菌菌株的质粒的辅助大肠杆菌菌株的三亲株交配程 序实现重组二元载体至农杆菌的转移。可选地， 可通过 DNA 转化将重组二元载体转移至农 杆菌 (Hofgen 和 Willmitzer(1988))。
重组农杆菌对靶植物物种的转化通常包括共培养农杆菌与来自植物的外植体， 并遵照本领域熟知的方案。在携带存在于二元质粒 T-DNA 边界之间的抗生素或除草剂抗性标 记物的选择培养基上再生转化的组织。
用基因转化植物细胞的另一种方法包括在植物组织和细胞上推进 (propel) 惰性 或生物活性颗粒。在美国专利号 4,945,050， 5,036,006， 和 5,100,792 中公开了此技术。大 体上， 此技术包括在能够有效穿透细胞的外表面的条件下在细胞上推进惰性或生物活性颗 粒， 并在其内部提供掺入。 当使用惰性颗粒时， 可通过用包含预期基因的载体覆盖颗粒将载 体引入细胞。可选地， 可用载体包围细胞， 从而通过颗粒将载体携带进细胞。也可将生物活 性颗粒 ( 例如， 干酵母细胞、 干细菌或噬菌体， 其分别含有试图引入的 DNA) 推进植物细胞组 织。
大多数单子叶物种的转化现在也已变为常规技术。优选的技术包括使用 PEG 或 电穿孔技术将基因直接转移进原生质体， 和颗粒轰击进愈伤组织。可使用单个 DNA 种类或 多个 DNA 种类 ( 即共转化 ) 进行转化， 且这些技术都适用于本发明。共转化可具有以下优 势： 避免构建完整载体， 和产生具有不连锁的目的基因和可选择标记物的基因座的转基因 植物， 这使得能够在以后的世代中去除可选择的标记物， 这应当被认为是理想的。
专利申请 EP 0292435， EP 0392225， 和 WO 93/07278 描述了从玉米的原种自交系 制备愈伤组织和原生质体， 使用 PEG 或电穿孔转化原生质体， 和从转化的原生质体再生玉 米植物的技术。Gordon-Kamm 等人 (1990) 和 Fromm 等人 (1990) 公开了使用颗粒轰击转 化 A188 来源的玉米系的技术。此外， WO 93/07278 和 Koziel 等人 (1993) 描述了通过颗 粒轰击转化玉米的原种自交系的技术。此技术使用从授粉后 14-15 天的玉米穗上切除的 1.5-2.5mm 长的未成熟的玉米胚和 PDS-1000He 基因枪装置用于轰击。
通过用本发明的核酸序列转化得到的植物可为任意的品种广泛的植物物种， 包 括单子叶和双子叶植物物种。可通过育种将本发明的基因表达与其他对生产和质量的重 要特征组合掺入植物系。也可通过育种或通过普通的基因工程技术将本文公开的本发明 的多核苷酸掺入植物系或维持在植物系中。育种方法和技术是本领域已知的。见， 例如 Welsh(1981) ； Wood(1983) ； Mayo(1987) ； Singh(1986) ； 以及 Wricke 和 Weber(1986)。
通过有性生殖或营养生长传递改造进上述转基因种子和植物的遗传特性， 并可因 此在后代植物中维持和传播所述遗传特性。一般地， 维持和繁殖利用为了适合特定目的如 耕种、 播种或收割而开发的已知农业方法。
相关技术是本领域熟知的， 并包括但不限于， 杂交、 近交、 回交育种、 多系育种 (multi-line breeding)、 双单倍体近交、 品种混合、 种间杂交、 非整倍体技术， 等等。 杂交技 术也包括通过机械、 遗传 ( 包括转基因 )、 化学或生物化学手段使植物不育以产生雄性或雌 性不育的植物。
用于本发明的目的， “甘蔗” 指任意甘蔗属植物或杂种。在本发明的范围内的甘蔗 植物包括， 例如斑茅 (Saccharum arundinaceum)、 Saccharumbengalense、 肉质花穗野生种 (Saccharum edule)、 白甘蔗 (Saccharumofficinarum)、 狭叶斑茅 (Saccharum procerum)、 沙 生 蔗 茅 (Saccharumravennae)、 大 茎 野 生 种 (Saccharum robustum)、 竹 蔗 (Saccharum sinense) 和割手密 (Saccharum spontaneum)。本发明的甘蔗植物可为近交系或杂种。杂 种植物包括通过组成目前所有的商业甘蔗和 energycane 种质的白甘蔗杂交材料由传统的 割手密生成的杂种， 和通过用近亲或远亲物种杂交甘蔗产生的任意其他杂种。可与甘蔗杂交以产生杂种植物或新的甘蔗品种的其他物种的实例包括芒属 (Miscanthus)、 蔗茅属 (Erianthus) 和甜高粱属 (Sorghum)。
“分离的” 表示 “通过人工操作” 从其自然状态改变的， 即， 如果其出现在自然界， 其 已从其本来的环境中被改变或移动， 或被改变和移动。 例如， 在活动物中以天然状态天然存 在的多核苷酸或多肽不是 “分离的” ， 但如本文使用的术语， 从其天然状态的共同存在的材 料中分开的相同的多核苷酸或多肽是 “分离的” 。例如， 就多核苷酸而言， 术语分离的表示， 从其天然存在的染色体和细胞中分开的。如果序列从其天然存在的染色体和细胞中分开， 但被插入其不天然存在的染色体或细胞的基因环境中， 则其也是分离的。
如本文使用的， 术语 “转基因的” 指包含外源多核苷酸 ( 即基因 ) 的植物， 所述外源 多核苷酸在转化的植物中被稳定维持并在连续世代中通过后代稳定继承。术语 “转基因植 物” 可指最初转化的植物或最初转化的植物的后代。 用于转化植物、 植物细胞或植物组织的 技术可包括， 但不限于， 使用根癌农杆菌或发根农杆菌 (A.rhizogenes) 作为转化剂用 DNA 转化， 电穿孔、 DNA 注射、 微粒轰击和颗粒加速。见， 例如 EP 295959 和 EP 138341。如本文 使用的， 术语 “植物材料” 或 “植物部分” 包括植物细胞、 植物原生质体、 可从其再生植物的植 物细胞组织培养物、 植物愈伤组织、 植物块和植物中完整的植物细胞， 或植物的部分， 如胚、 花粉、 胚珠、 种子、 叶、 花、 枝、 果、 核、 穗、 穗轴、 果壳、 梗、 根、 根尖、 花药、 块茎、 根茎等等。
材料和方法
植 物 材 料。 在 表 达 分 析 中 使 用 野 外 培 养 的 成 熟 甘 蔗 ( 甘 蔗 属 杂 交 种 ) 变 种 CP88-1762 和温室培养的未成熟的 CP88-1762 和 L 79-1002。
RNA 提取、 基因分离和 RT-PCR。使用 TRIzol 试剂 (Invitrogen) 从叶、 茎、 节和根 分离总 RNA。使用 cDNA 合成试剂盒 (Bio-Rad) 从 1ug 总 RNA 合成第一链 cDNA。
甘蔗 4CL 的分离
Sc4CL-L
通过 RACE(cDNA 末端的快速扩增 ) 技术得到部分 4CL-L。使用 SMARTRACE 试剂盒 (Clontech) 根据制造商的说明书进行 RACE。从 2ug 总 RNA 合成 5’ - 和 3’ -RACE 预备 cDNA 库， 并使用这些库作为 PCR 模板。基于 4CL-L 的部分基因组 DNA 序列设计初级 (LPF ： 5’ -CG TTGCCTGTGAAGTCCGGCGC-3’ (SEQ ID NO ： 17)) 和巢式 (LNF ： 5’ -CCACGGCGAAGACCATCGACTCG-3 ’ (SEQ IDNO ： 18)) 基因特异性引物。使用 LPF 和制造商提供的通用引物混合物 (UPM) 进行 初级 PCR。PCR 条件由 25 个循环的 94℃ 30 秒， 68℃ 60 秒和 72℃ 180 秒组成。将初级 PCR 产物从 1 稀释到 50 并用作次级 PCR 的模板， 次级 PCR 使用 LNF 和制造商提供的巢式通用引 物 (NUP)。第二个 PCR 在与第一个 PCR 相同的条件的 20 个循环下进行。将 3’ -RACE PCR 产物克隆进 pCR2.1TOPO 载体 (Invitrogen) 并测序。
Sc4CL-M
通过 DNA 文库筛选分离 4CL-M。从野外培养的植物 (Belle Grade 和 Citra， FL) 收获甘蔗 ( 甘蔗属杂交种 ) 变种 CP88-1762 的叶、 节间、 节和未成熟的卷叶。从水培溶液培 养的植物中收集根和新生幼苗。使用 Trizol(Invitrogen) 从每种组织中提取总 RNA， 并以 相同的比例混合来自每种样品的总 RNA。使用 Oligotex mRNA Mini 试剂盒 (Qiagen) 从混 合的总 RNA 提纯 mRNA。从 5.9ug mRNA 合成 cDNA 并使用 cDNA 合成试剂盒和 ZAP-cDNA 合 成试剂盒 (Stratagene) 连接至 Uni-ZAP XR 载体。使用 ZAP-cDNA GigapackIII Gold 克隆 试剂盒根据制造商的说明书 (Stratagene) 进行包装和扩增。用于筛选， 使用随机引物试剂 32 盒 (Promega) 通过 PCR 生成 447bp 的部分 4CLM 特异性探针并用 P-dCTP 标记。筛选了约 2.0x 105 的重组噬菌体， 并分离了 1 个阳性噬菌体。为了得到包含 cDNA 的 pBluscript 噬 菌粒， 进行了体内切除并对分离物测序。
Sc4CL-N
使用从甘蔗 EST 序列推断的基因特异性引物从 cDNA 上 PCR 扩增 4CL-N。在 DFCI 白甘蔗基因索引 (SoGI ； http://compbio.dfci.harvard.edu/cgi-bin/tgi/gireport.pl ？ gudb ＝ s_officinarum) 中使用 “4- 香豆酸辅酶 A 连接酶” 作为关键词检索的主题。检测 出具有完整的开放阅读框的假设的共有 (TC) 序列 TC88322， 并用于引物设计。分别从起 始和终止密码子区设计了正向引物 (4CL1F ： 5’ -ATGGGTTCCGTGGACACGGCGGTCGCG-3’ (SEQ ID NO ： 19)) 和反向引物 (4CL1R ： 5’ -TCAGTGAACACCGGCGGCGAGCCTGG-3’ (SEQ ID NO ： 20))。 使用 Trizol 根据制造商的说明书 (Invitrogen) 从叶、 节间、 节和幼苗分离总 RNA， 并使用 iScript cDNA 合成试剂盒 (Bio-rad) 进行 cDNA 合成。使用 200ng 来自每个组织的 cDNA 混 合物作为 PCR 模板。使用 TaKaRa LA taq 聚合酶 (Takara BIO Inc.) 进行 PCR， 且 PCR 条件 由 35 个循环的 95℃ 45 秒， 56℃ 45 秒和 72℃ 120 秒组成。将 2 次独立扩增的 PCR 产物克 隆进 pCR2.1TOPO 载体 (Invitrogen) 并测序。Sc4CL RNAi 抑制构建体的构建
基于 Sc4CL-L(SEQ ID NO ： 1) 和 Sc4CL-M(SEQ ID NO ： 2) 的测序信息， 设计了特异 性引物以分别扩增名为外显子 2 和外显子 1 的 200bp 区域。将对应 2 个限制酶 EcoRI 和 XbaI 的序列加入正向引物， 对反向引物加入特异性对应 EcoRV 限制酶的序列， 以便于亚克 隆。使用由通过 Bg4CL 天然内含子分隔开的 2 个反向重复和转录终止子 CaMV35SpolyA 组 成的质粒 pWFBgH4CL_RNAi 构建 Sc4CL 干扰构建体。在 2 个单独和相继的亚克隆步骤中， 用 Sc4CL 特异性序列替换质粒 pWF BgH4CL_RNAi 中的反向重复。然后亚克隆稻 C4H 启动子并 产生 2 个构建体 Sc4CL-Li 和 Sc4CL-Mi(SEQ ID NO ： 4 和 SEQ ID NO ： 5)。
4CLi 甘蔗系的产生
使用甘蔗 ( 甘蔗属杂交种 ) 变种 CP88-1762 的未成熟的卷叶的横切面在补充了 20g/L 蔗糖和 13.6uM 2， 4-D， pH 调节为 5.8 的改良的 MS 基础培养基 (CI-3)(Chengalrayan 和 Gallo-Meagher， 2001) 上诱导愈伤组织。在诱导了愈伤组织后， 使用如以前描述的 PDS-1000/He 基因枪颗粒递送系统 (Bio-Rad)(James 等人， 2008) 进行基因枪基因转移。如 描述的使用遗传霉素进行选择 (Chengalrayan 和 Gallo-Meagher， 2001)， 但略加修改， 其中 对再生的植物进行了进一步的选择， 即将其在生根阶段在含有巴龙霉素 (30mg/L) 的 MS 基 础培养基中亚培养， 进行 4 次两周一次的亚培养。将发育出健康的根的选定的植物转移至 土壤并转移至温室。
转基因系的表征
在选择和再生植物以后， 通过 NPTII-ELISA 和 PCR 确认转基因甘蔗植物。使用 Pathoscreen nptII ELISA 试剂盒 (Agdia) 根据制造商的说明书进行总蛋白质提取和 NPTII-ELISA。使用 DNeasy Plant Mini 试剂盒 (Qiagen) 从每株再生的植物的展开的叶中 提取基因组 DNA。使用 75ng 基因组 DNA 作为 PCR 模板。为了检测每种表达构建体， 从每个 基因和启动子区设计引物如下 ： 用于 Sc4CL-Mi 和 Sc4CL-Li RNAi 构建体， 4CL SF(5’ -CATCA AGGGTACGGGATGAC-3’ (SEQ ID NO ： 21)) 和 OSPRO SR(5’ -GTAGCCTGCTAGTCTTCTCTCTCATT-3’ ( SEQ ID NO ： 22))。使用 iTaq 聚合酶 (Bio-Rad) 按如下条件进行 PCR ： 35 个循环的 95℃ 30 秒， 58 ℃ 30 秒和 72 ℃ 60 秒。用于 Northern 印迹分析， 从植物的第三片叶 ( 用于 4CL-Li 系 ) 和约 25cm 长的侧分蘖 ( 用于 4CL-Mi 系 ) 中提取总 RNA(Sambrook et at.， 1989)。在 相同的发育阶段从在与转基因植物相同的条件下培养的野生型植物中收集样品。 在电泳和 转移了 20ug 总 RNA 后， 使用来自靶向的 4CL 基因的开放阅读框的放射性标记的探针进行 Northern 杂交。
如 Browning(1967) 描述的分别从 4CL-Li 系和 4CL-Mi 系的衰老的叶和节间中使 用 Klason 程序在转基因甘蔗和非转基因 ( 野生型 ) 甘蔗植物中定量总木质素， 但略加修改 (Yoshihara 等人， 1984)。简单地说， 在研磨干样品 (0.5-1mm 筛选 ) 后， 用 50％的温热乙醇 提取样品以去除可溶性糖， 并干燥。然后， 使用 12M H2SO4 水解 0.1g 干细胞壁样品， 在 30℃ 进行 2 小时。用蒸馏水稀释内含物并高压灭菌 1 小时。高压灭菌后， 通过过滤收集不溶的 材料 ( 木质素和灰分 ) 并称重。然后在 500℃燃烧木质素 5 小时。在此步骤后， 称重灰分并 通过燃烧前和后的重量差异计算木质素。
本文提及和引用的所有专利、 专利申请、 临时申请和出版物以其整体引入作为参 考， 包括所有的图和表， 只要其不与本说明书的明确教导不一致。以下是说明用于实践本发明的程序的实施例。这些实施例不应被视为限制性的。 除非另外指出， 所有百分比是以重量计的， 且所有溶剂混合物比例是以体积计的。
实施例 1—— Sc4CL 基因的分离
在本研究中分离和表征了 2 个全长的和 1 个部分的甘蔗 4CL 基因的序列。 Sc4CL-N 和 Sc4CL-M 的 cDNA 序列具有 1665 和 1728 核苷酸的开放阅读框， 分别编码 555 和 576 氨基 酸的蛋白质。部分的 Sc4CL-L cDNA 序列长 616bp， 其包含 3’ UTR， 和 141 氨基酸残基的开 放阅读框。Sc4CL-N 和 Sc4CL-M 之间的配对比较显示 59％的相似性。Sc4CL-N 与以前鉴定 的 4CL 关联最紧密， 分别显示了与甜高粱的 Sb4CL 样 1 和稻的 Os4CL3 的 96％和 86％的相 似性， 而 Sc4CL-M 与 Sb4CL 样 1 和 Os4CL3 共有较低的相似性， 但其显示了与 Sb4CL 样 2 和 Os4CL3( 分别为 96％和 83％ ) 的较高的相似性。Sc4CL 与拟南芥 At4CL 的推断的氨基酸序 列的比较显示了范围从 60％ -63％的相似性 ( 表 2)。
Sc4CL 和已功能表征的其他 4CL、 白杨 Ptd4CL 和拟南芥 At4CL 之间的比对 ( 通过 CLUSTALW(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl ？ page ＝ /NPSA/npsa_ clustalw.html) 使用默认参数进行 ) 显示了保守的 AMP 结合基序 ( 见， 例如 SEQ ID NO ： 34， 35， 36， 37， 38， 39， 40， 41， 42， 和 43) 和特征基序 “GEICIRG” (SEQ ID NO ： 54)， 其被认为是底 物识别位点 (Ehlting 等人 2001)。系统发生分析显示， 在禾本科中的 4CL 基因家族成员可 被分为 2 个主要的在系统发生上有联系的群组， 组 I 和组 II。Sc4CL-N 和 Sc4CL-M 分别被 归为植物 4CL 组 I 和组 II。组 I 包括玉蜀黍 4CL2、 稻 4CL1、 拟南芥 4CL1、 黑麦草 4CL2、 白 杨 4CL3、 白杨 4CL1、 白杨 4CL2、 拟南芥 4CL2、 甜高粱 04g005210、 玉蜀黍 LOC542166 和玉蜀黍 ACF84437。组 II 包括稻 4CL2、 甜高粱 04g031010、 拟南芥 4CL3、 黑麦草 4CL1、 白杨 4CL4、 拟 南芥 4CL4、 稻 4CL3、 稻 4CL5、 甜高粱 10g026130、 黑麦草 4CL3 和稻 4CL4。
表 2.4CL 氨基酸序列之间的百分比相似性
Sc ： 甘蔗， Sb ： 甜高粱， Os ： 稻， At ： 拟南芥
实施例 2—— 4CL 基因的表达谱
甘蔗 4CL-M 主要在茎中表达， 而 Sc4CL-L 主要在叶中表达 ( 表 3)。这提示， 可以组 织特异性方式调控不同 4CL 基因的表达， 并提供了在特定组织中抑制木质素的机会。
表 3.Sc4CL 基因的组织和栽培品种特异性表达
-L、 S 和 N 分别表示叶、 茎和节。
实施例 3—— 4CL 下调的甘蔗的生成
RNAi 是用于作物改良和研究基因功能的有力工具。因此， 为了研究每个 4CL 基因 产物在木质素生物合成中的生理作用， 利用 Sc4CL 的序列信息生成了 4CL 下调的甘蔗， 生 成了 2 个靶向 Sc4CL-L 和 Sc4CL-M 基因的不同区域的、 处于木质部特异性启动子、 稻香豆 酸 -4- 羟化酶 (C4H) 启动子 (Fouad 和 Altpeter， 尚未发表 ) 和 CaMV 35S 多聚腺苷酸信号 控制下的 RNA 抑制构建体 (SEQ ID NO ： 4 和 SEQ ID NO ： 5)。使用基因枪基因转移， 将生成 的具有处于具有第一内含子、 35S 3’ UTR 的强组成型玉米泛素启动子 (pUbi) 调控下的可选 择的 nptII 基因的抑制盒各自或同时共同引入胚发生甘蔗愈伤组织。当生成若干转基因系 时， 使用 nptII/ 遗传霉素和巴龙霉素选择系统进行转基因事件的选择。
利用 2 个生成的抑制盒进行了共 88 次轰击， 并在愈伤组织选择后再生了 160 株植 物。使用 Pathoscreen nptII ELISA 试剂盒 ( 表 4)， 152 株独立的植物显示了 NPTII 表达。 使用 PCR 确认了在转基因植物的基因组 DNA 中 4CL-RNAi 抑制盒的存在 ( 表 4)。
在转基因甘蔗植物中的甘蔗 4CL 的表达分析指示了相比非转基因 (WT) 甘蔗， 在若 干转基因甘蔗植物中 Sc4CL-L( 表 5) 和 Sc4CL-M 基因 ( 表 6) 的抑制。
表 4. 转基因 4CLi 甘蔗的总结
NA ＝未分析的 表 5. 在甘蔗 4CL-Li 转基因植物的衰老的叶中的 4CL-L 基因表达水平和木质素含量
1- 相对 WT 表达 (100％ ) 的基于 RNA 印迹分析的表达 2-2-3 次生物学重复的平均值， 通过分析相同基因型的 2-3 株个体植物生成。 表 6. 在甘蔗 4CL-Mi 转基因植物的未成熟的节间中的 4CL-M 基因表达水平和木质素含量
1- 基于相对 WT 表达 (100％ ) 的 RNA 印迹分析的表达
2-2 次生物学重复的平均值， 通过分析相同基因型的 2 株个体植物生成。
实施例 4- 具有减少的木质素的甘蔗的生成
根据标准方案在品系中使用 Klason 程序在 4CL-Li 转基因植物和非转基因甘蔗的 衰老的叶中定量总木质素。如在表 5 中所示， Klason 木质素在非转基因甘蔗植物的衰老的 叶中为约 23.6％。相对而言， 具有 4CL-L 基因抑制的转基因系 14-2A 在衰老的叶中具有平 均 21％的 Klason 木质素 ( 表 5)， 表明通过 4CL-L 抑制总木质素减少了 11％。也在 4CL-Mi 系 ( 表 6) 和野生型植物中的未成熟的节间中分析了木质素。品系 4a 展示了相比野生型植 物的约 8％的总木质素的减少。品系 5b-A1 也显示了类似水平的木质素减少 ( 表 6)。预期 在成熟的节间中在这些转基因 4CL-Mi 植物中的更高的木质素减少， 在成熟的节间中非转 基因植物的木质素含量增加至超过 20％。
实施例 5—— 4CLM 表达的定量 PCR 分析
定量实时 RT-PCR 分析确认了在若干转基因系中的 4CLM 抑制。 表 7 显示了 4CLM 基 因相对参考基因 ( 甘蔗 GAPDH) 的相对表达比例。表 7 显示了在包括品系 4A 和 5BA1 的转 基因甘蔗系中的 4CLM 转录物的强抑制。收获发育匹配的侧分蘖并从第一节间提取总 RNA。 从 3’ UTR 设计 4CLM 基因特异性引物。平行进行所有反应， 且一式三份进行每个反应。使用 Q- 基因软件计算标准误。
表 7.4CLM 表达的定量 PCR 分析
实施例 6——植物 4CL 基因间的进化趋异的估计
在表 8 中显示了甘蔗 4CL 和其他植物 4CL 间的分析中的每个位点上的氨基酸取代 数。所有结果基于氨基酸序列的配对分析。使用 MEGA4(Zuckerkandl 和 Pauling(1965) ； Tamura 等人 (2007)) 中的泊松校正法进行分析。 从数据集中去除含有缺口和缺失数据的所 有位置 ( 完全缺失选项 )。在最终的数据集中共有 513 个位置。
表 8. 植物 4CL 间的进化趋异的估计
Sc ： 甘蔗， Sb ： 甜高粱， Zm ： 玉蜀黍， At ： 拟南芥， Lp ： 黑麦草， Os ： 稻， Po ： 白杨杂种 ( 毛果杨 (Populus trichocarpa)x 美洲黑杨 (Populusdeltoids))
表 8 继续
Sc ： 甘蔗， Sb ： 甜高粱， Zm ： 玉蜀黍， At ： 拟南芥， Lp ： 黑麦草， Os ： 稻， Po ： 白杨杂种 ( 毛果杨 (Populus trichocarpa)x 美洲黑杨 (Populusdeltoids))
表 8 继续
Sc ： 甘蔗， Sb ： 甜高粱， Zm ： 玉蜀黍， At ： 拟南芥， Lp ： 黑麦草， Os ： 稻， Po ： 白杨杂种 ( 毛果杨 (Populus trichocaroa)x 美洲黑杨 (Populusdeltoids))
应当理解， 本文描述的实施例和实施方案仅是为了说明的目的， 对本领域技术人 员建议根据其的多种修改或变化， 且这些修改和变化将被包括在本申请的精神和范围内和 随附的权利要求书的范围内。另外， 本文公开的任意发明或其实施方案的任意元素或限制 可与本文公开的任意其他发明或其实施方案的任意和 / 或所有其他元素或限制 ( 分别地或 以任意组合 ) 组合， 且所有这些组合视为在本发明的范围内， 而不加限制。
参考文献
美国专利号 4,761,373
美国专利号 4,769,061
美国专利号 4,810,648
美国专利号 4,940,835 美国专利号 4,945,050 美国专利号 4,975,374 美国专利号 4,987,071 美国专利号 5,013,659 美国专利号 5,023,179 美国专利号 5,034,322 美国专利号 5,036,006 美国专利号 5,093,246 美国专利号 5,100,792 美国专利号 5,106,739 美国专利号 5,116,742 美国专利号 5,162,602 美国专利号 5,256,558 美国专利号 5,270,163 美国专利号 5,276,268 美国专利号 5,304,730 美国专利号 5,495,071 美国专利号 5,554,798 美国专利号 5,561,236 美国专利号 5,569,823 美国专利号 5,582,981 美国专利号 5,589,610 美国专利号 5,591,616 美国专利号 5,595,877 美国专利号 5,599,672 美国专利号 5,625,136 美国专利号 5,639,948 美国专利号 5,661,017 美国专利号 5,723,763 美国专利号 5,767,366 美国专利号 5,817,785 美国专利号 5,879,903 美国专利号 5,928,937 美国专利号 6,084,155 美国专利号 6,329,504 美国专利号 6,337,431 美国专利号 6,344,318 美国专利号 6,455,760美国专利号 6,462,185
美国专利号 6,506,559
美国专利号 6,696,623
美国专利号 6,933,116
美国专利号 7,056,704
美国专利号 7,078,196
美国专利号 7,232,086
美国专利号 7,282,564
美国专利号 7,365,058
美国专利号 7,368,236
美国专利号 7,538,095
美国专利号 7,700,759
美国专利号 7,723,575
美国公开的申请号 20010016956
美国公开的申请号 20030084486
美国公开的申请号 20030177536
美国公开的申请号 20040019934
美国公开的申请号 20040067506
美国公开的申请号 20040078841
美国公开的申请号 20040123349
美国公开的申请号 20060260011
美国公开的申请号 2007006346
美国公开的申请号 20090031441
美国公开的申请号 20090199307
PCT 公开的申请号 WO 93/07278
PCT 公开的申请号 WO 93/21335
EP 0242246
EP 0292435
EP 0392225
EP 138341
EP 295959
Agrawal 等 人 (2003)Microbiology and Molecular Biology Reviews， 67(4) ： 657-685.
Altschul， S.F. 等 人 (1990)“Basic Local Alignment Search Tool” J.Mol. Biol.215 ： 403-410.
Altschul， S.F. 等人 (1997)“Gapped BLAST and PSI-BLAST ： A NewGeneration of Protein Database Search Programs” Nucl.AcidsRes.25 ： 3389-3402.
Bartel， D. 和 Szostak， J.W.Science 261 ： 1411-1418(1993).
Bassett， C.L.， Callahan， A.， Artlip， T.， Scorza， R.Srinivasan， C.(2007)“Aminimal peach type II chlorophyll a/b-binding proteinpromoter retains tissue-specificity and light regulation intomato” BMC Biotechnol.， 7： 47.
Beltz ，G.A. ，Jacobs ，K.A. ，Eickbush ，T.H. ，Cherbas ，P.T. ，Kafatos ， F.C.(1983)“Isolation of multigene families and determinationof homologies by filter hybridization methods” Methods ofEnzymology， R.Wu， L.Grossman 和 K.Moldave[eds.]AcademicPress， New York 100 ： 266-285.
B e v a n ，M . ( 1 9 8 4 ) “ B i n a r y A g r o b a c t e r i u m v e c t o r s f o r planttransformation” Nucl.Acids Res.， 12(22) ： 8711-21.
Browning， B.L.1967.Methods of wood chemistry.Wiley-Interscience， New York.
Brusslan， J.A. 和 Tobin， E.M.(1992)“Light-independentdevelopmental regulation of cab gene expression in Arabidopsisthaliana seedlings” Proc Natl Acad Sci USA， 89(16) ： 7791-5.
Bustos 等人 (1989)Plant Cell， 1： 839-854.
Chandler 等 人 (1989)“Two Regulatory Genes of the Maize AnthocyaninPathway Are Homologous ： Isolation of B Utilizing R GenomicSequences” The Plant Cell， 1： 1175-1183. Chengalrayan， K. 和 Gallo-Meagher， M.(2001)“Effect of variousgrowth regulators on shoot regeneration of sugarcane” In VitroCell.Dev.Biol.Plant， 37 ： 434 439.
Clancy， M. 和 Hannah， L.C.(2002)“Splicing of the maize Sh1 firstintron is essential for enhancement of gene expression， and aT-rich motif increases expression without affecting splicing” Plant Physiol.130(2) ： 918-29.
Deblaere， R.， Reynaerts， A.， Hofte， H.， Hernalsteens， J.-P.， Leemans， J.， 和 Van Montagu， M.(1987)“Vectors for cloning in plantcells” Methods Enzymol.， 153 ： 77-292.
Doran， T. 和 Helliwell， C.(2009)RNA interference ： Methods forplants and animals ； Publisher ： CABI， Wallingford， UK.Ebert 等人 (1987)Proc.Nat′ l Acad.Sci. USA.84 ： 5745-5749.
Ehlting， J.， Buttner， D.， Wang， Q.， Douglas， C.J.， Somssich， I.， 和 Kombrink， E.(1999).Three 4-coumarate ： coenzyme A ligasesin Arabidopsis thaliana represent two evolutionarily divergentclasses in angiosperms.Plant J.19， 920.
Ellington， A.D. 和 Szostak， J.W.(1990) “In vitro selection of RNAmolecules that bind specific ligands” Nature， 346(6287) ： 818-822.
Fromm 等人 Biotechnology 8 ： 833-839(1990).
Good， X. 等人 (1994)“Reduced ethylene synthesis by transgenictomatoes expressing S-adenosylmethionine hydrolase” PlantMolec.Biol.26 ： 781-790.
Gordon-Kamm 等人 PlANt Cell 2 ： 603-618(1990).
Green 等人， EMBO J.， 7： 4035-4044(1988).
Haselhoff 和 Gerlach Nature 334 ： 585-591(1988).
Hofgen&Willmitzer， Nucl.Acids Res.16 ： 9877(1988).
Hoppe-Seyler， F. 和 Butz， K.(2000)“Peptide aptamers ： powerful newtools for molecular medicine” J.Mol.Med.， 78(8) ： 426-430.
Hudspeth 等人 (1989)Plant Mol.Biol.， 12 ： 579-589.
James VA， Neibaur I， Altpeter F ： Stress inducible expression of theDREB1A transcription factor from xeric， Hordeum spontaneum L.in turf and forage grass(Paspalum notatum Flugge)enhancesabiotic stress tolerance.Transgenic Res 2008， 17 ： 93-104.
Jordano 等人， Plant Cell， 1： 855-866(1989).
Karlin S.， Altschul， S.F.(1990)“Methods for Assessing theStatistical Significance of Molecular Sequence Features byUsing General Scoring Schemes” Proc.Natl.Acad.Sci.USA87 ： 2264-2268.
Karlin S.， Altschul， S.F.(1993) “Applications and Statistics forMultiple High-Scoring Segments in Molecular Sequences” Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90 ： 5873-5877. Klein 等人 (1987)Nature 327 ： 70-73.
Koziel 等人 (1993)Biotechnology 11 ： 194-200.
Kusaba(2004)Current Opinion in Biotechnology， 15 ： 139-143.
Kwon 等人 (1994)Plant Physiol.105 ： 357-67.
Lawton 等人 (1987)Plant Mol.Biol.9 ： 315-324.
Maniatis ， T. ， Fritsch ， E.F. ， Sambrook ， J.(1982)Molecular Cloning ： A Laboratory Manual， Cold Spring Harbor Laboratory， Cold SpringHarbor， NY.
Matsuoka 等人 (1993) “Tissue-specific light regulatedexpression directed by the promoter of a C4 gene， maize pyruvate， orthophosphate dikinase， in a C3 plant， rice” PNAS USA， 90(20) ： 9586-90.
Matsuoka 等人 (1994)Plant J.6 ： 311-319.
Mayo， O.(1987)The Theory of Plant Breeding， Second Edition， Clarendon Press， Oxford.
Meier 等人 (1991)Plant Cell， 3： 309-316.
Milhavet 等人 (2003)Pharmacological Reviews， 55(4) ： 629-648.
Odell 等人 (1985)Nature 313 ： 810-812.
Paszkowski 等人 (1984)EMBO J.3 ： 2717-2722.
Potrykus 等人 (1985)Mol.Gen.Genet.199 ： 169-177.
Reich 等人 (1986)Biotechnology 4 ： 1001-1004.
Richins 等人 (1987)Nucleic Acids Res.20 ： 8451.
Sambrook， J.， Fritsch， E.F.， 和 Maniatis， T.(1989)Molecular Cloning ： A Laboratory Manual. 卷 1 和 3.Cold Spring Harbor LaboratoryPress， Cold Spring Harbor， NY.
Singh， D.P.(1986)Breeding for Resistance to Diseases and InsectPests， Springer-Verlag， NY.
Sullivan 等 人 (1989)“Isolation and characterization of a maizechlorophyll a/b binding protein gene that produces high levelsof mRNA in the dark” Mol.Gen.Genet.， 215(3) ： 431-440.
Tamura K.， Dudley J.， Nei M.， 和 Kumar S(2007)MEGA4 ： MolecularEvolutionary Genetics Analysis(MEGA)software version 4.0.Molecular Biology and Evolution 24 ： 1596-1599.
Theander， O.， 和 E.A.Westerlund(1986).Studies on dietary fiber.3.Improved procedures for analysis of dietary fiber.J.Agric.Food Chem.34 ： 330 336
Uknes 等人 (1993)Plant Cell 5 ： 159-169.
Walker 等人 (1987)Proc.Nat′ l Acad.Sci.USA， 84 ： 6624-6628.
Wang 等 人 (1992)“Characterization of cis-Acting ElementsRegulating Transcription from the Promoter of a ConstitutivelyActive Rice Actin Gene” Molecular and Cellular Biology， 12(8) ： 3399-3406.
Welsh J.R.(1981)Fundamentals of Plant Genetics and Breeding ， JohnWiley&Sons， NY.
Wood D.R.(1983)(Ed.)Crop Breeding， American Society of AgronomyMadison， Wis.
Wricke 和 Weber(1986)Quantitative Genetics and Selection PlantBreeding， Walter de Gruyter and Co.， Berlin.
www.lifesci.sus sex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/
Xu， D.， McElroy， D.， Thornburg， R.W.， Wu， R. 等人 (1993)“Systemicinduction of a potato pin2 promoter by wounding， methyljasmonate， and abscisicacid in transgenicrice plants” PlantMolecular Biology 22 ： 573-588.
Yamamoto 等人 (1994)Plant Cell Physiol.35 ： 773-778.
Yamamoto 等人 (1997)Plant J.12(2) ： 255-265.
Yang 等人 (1990)Proc.Nat′ l Acad.Sci.USA， 87 ： 4144-4148.
Yang， T.T. 等人 (1996)“Optimized Codon Usage and ChromophoreMutations Provide Enhanced Sensitivity with the GreenFluorescent Protein” Nucleic Acid Research 24(22) ： 4592-4593.
Y o s h i h a r a ，K . ，T . K o b a y a s h i ，T . F u j i i ， 和 I . A k a m a t s u ( 1 9 8 4 ) . A novelmodification of Klason lignin quantitative method.J.JapanTappi 38 ： 86 95.
Zhang 等人 (1996)Plant Physiology， 110 ： 1069-1079.
Zubieta， C， Kota， P， Ferrer， J.L.， Dixon， R.A.， Noel， J.P.(2002)“Structural basis for the modulation of lignin monomermethylation by caffeic acid/5-hydroxyferulic acid3/5-O-methyltransferase” Plant Cell.， 14(6) ： 1265-77.
Zuckerkandl E&Paul ing L(1965)Evolutionary divergence andconvergence in proteins， pp.97-166 in Evolving Genes andProteins， edited by V.Bryson 和H.J.Vogel.Academic Press， NewYork.36CN 102458099 A
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除了抑制参与甘蔗中的木质素生物合成的靶基因以外， 本发明还设想在靶基因中 的突变， 或其中可对植物细胞提供突变的基因， 在所述植物细胞中靶基因表达或基因产物 水平或活性被降低或抑制。在一个实施方案中， 将突变的 4CL 基因掺入甘蔗植物的基因组， 其中突变的 4CL 基因展示基因转录物或其翻译的减少的或无表达。在一个实施方案中， 在 植物的 4CL 基因中引入突变， 所述突变导致 4CL 基因的转录减少， 或 mRNA 的翻译减少， 和/ 或导致展示降低的酶活性的蛋白质。在特定的实施方案中， 在 4CL 基因的蛋白质编码区引 入一种或多种突变。在另一个实施方案中， 在 4CL 基因转录起始位点的上游和 / 或转录起 始位点的下游引入突变。在一个实施方案中， 在 4CL 基因调控序列中或附近， 例如在启动子 序列中引入突变。突变可阻碍或抑制 4CL 基因序列的转录， 例如通过阻碍或抑制转录因子 或聚合酶结合 4CL 核酸序列。在一个实施方案中， 在植物的叶细胞和 / 或叶组织中选择性 引入 4CL 基因中的突变。突变也可包括抑制或降低 4CL 多肽的功能活性 ( 例如酶活性 ) 的 一种或多种核苷酸或氨基酸插入、 缺失和 / 或取代。创造和引入突变的方法是本领域已知 的。在一个实施方案中， 在植物中的一个或多个野生型 4CL 基因中引入突变。在另一个实 施方案中， 突变的 4CL 基因替换植物中的一个或多个野生型 4CL 基因。在一个实施方案中， 在植物的叶细胞和 / 或组织中选择性表达突变的 4CL 基因。
除了抑制或遏制参与木质素生物合成的靶基因以外， 也可抑制由本发明的靶基因 编码的蛋白质的活性 ( 例如酶活性 )。 在一个实施方案中， 可在甘蔗植物的细胞中掺入和表 达编码与蛋白质结合并抑制其活性 ( 例如酶活性 ) 的抗体或其抗原结合片段的核酸。可从 用所述核酸转化的和 / 或掺入所述核酸的细胞培养包含和表达编码抗体或其抗原结合片 段的核酸的植物。 制备结合和抑制特定靶蛋白的抗体的方法和获得编码抗体的核酸的方法 是本领域熟知的。在一个实施方案中， 抗体是单克隆抗体， 或其抗原结合片段。抗原结合片 段包括， 但不限于 F(ab′ )2， Fab′， Fab， 和 Fv， 并可使用本领域已知的标准方法制备。抗体 可来源于能够产生针对靶蛋白表位的抗体的任意动物， 并包括例如人、 灵长类、 小鼠、 大鼠、 山羊、 绵羊、 猪和牛。在特定的实施方案中， 抗体结合 4CL 蛋白。在一个实施方案中， 4CL 基 因编码包含 AMP 结合基序序列 ( 例如 SEQ ID NO ： 34) 和 / 或 SEQ IDNO ： 54 的特征基序序列 的 4CL 多肽。在更特定的实施方案中， 4CL 蛋白由 4CL-M 基因、 4CL-L 基因或 4CL-N 基因编码。在特定的实施方案中， 4CL-L 基因包含 SEQ ID NO ： 1 中所示的核苷酸序列的全部或部 分， 4CL-M 基因包含 SEQ ID NO ： 2 中所示的核苷酸序列的全部或部分， 4CL-N 基因包含 SEQ IDNO ： 3 中所示的核苷酸序列的全部或部分。在一个实施方案中， 4CL-M， 4CL-L 和 4CL-N 基 因分别编码具有 SEQ ID NO ： 6、 7 和 8 中所示的氨基酸序列的多肽， 或其片段或变体。在一 个实施方案中， 抗体与包含 SEQ ID NO ： 6、 7 和 8 中的氨基酸序列的 4CL 蛋白， 或其片段或表 位结合。 在特定的实施方案中， 在植物的叶组织中选择性表达编码抗体的核酸， 例如通过使 用叶特异性启动子。
也可通过表达和 / 或使靶蛋白接触结合特定靶蛋白的适体抑制参与木质素生物 合成的靶基因编码的蛋白质的活性 ( 例如酶活性 )。适体是可被选择用于结合靶分子的 寡核苷酸或肽 ( 见， 例如， Ellington 和 Szostak(1990) 以及 Hoppe-Seyler 和 Butz(2000) 和 美 国 专 利 号 5,582,981 ； 5,270,163 ； 5,595,877 ； 5,817,785 ； 6,344,318 ； 6,933,116 ； 7,368,236 ； 和 7,700,759)。在一个实施方案中， 在植物细胞中掺入和表达编码与参与木 质素生物合成的蛋白结合的适体的核酸。可从用所述核酸转化的和 / 或掺入所述核酸的 细胞培养包含和表达编码适体的核酸的植物。在一个实施方案中， 适体结合并抑制 4CL 蛋 白。在一个实施方案中， 4CL 基因编码包含 AMP 结合基序序列 ( 例如 SEQ ID NO ： 34) 和 / 或 SEQ ID NO ： 54 的特征基序序列的 4CL 多肽。在特定的实施方案中， 4CL 蛋白由本发明的 4CL-L、 4CL-M 或 4CL-N 基因编码。在特定的实施方案中， 4CL-L 基因包含 SEQ IDNO ： 1 中所 示的核苷酸序列的全部或部分， 4CL-M 基因包含 SEQ ID NO ： 2 中所示的核苷酸序列的全部 或部分， 4CL-N 基因包含 SEQ ID NO ： 3 中所示的核苷酸序列的全部或部分。在一个实施方 案中， 4CL-M， 4CL-L 和 4CL-N 基因分别编码具有 SEQ ID NO ： 6、 7 和 8 中所示的氨基酸序列 的多肽， 或其片段或变体。在一个实施方案中， 适体与包含 SEQ ID NO ： 6、 7 和 8 中的氨基酸 序列的 4CL 蛋白， 或其片段或表位结合。在特定的实施方案中， 在植物的叶组织中选择性表 达编码适体的核酸， 例如通过使用叶特异性启动子。
本发明也涉及甘蔗植物， 其中木质素生物合成已被调节 ( 例如， 下调 )。在一个实 施方案中， 在叶细胞和 / 或组织中选择性下调木质素生物合成。在一个实施方案中， 在甘蔗 植物中抑制或下调一种或多种 4CL 基因的表达和 / 或由 4CL 基因编码的蛋白质的翻译或 活性。在一个实施方案中， 4CL 基因编码包含 AMP 结合基序序列 ( 例如 SEQ ID NO ： 34) 和 / 或 SEQ ID NO ： 54 的特征基序序列的 4CL 多肽。在一个实施方案中， 被抑制的 4CL 基因是 4CL-L， 4CL-M 或 4CL-N。在一个实施方案中， 4CL-M， 4CL-L 和 4CL-N 基因分别编码具有 SEQ ID NO ： 6、 7 和 8 中所示的氨基酸序列的多肽， 或其片段或变体。 在特定的实施方案中， 4CL-L 基因包含 SEQ ID NO ： 1 中所示的核苷酸序列的全部或部分， 4CL-M 基因包含 SEQ ID NO ： 2 中所示的核苷酸序列的全部或部分， 4CL-N 基因包含 SEQ ID NO ： 3 中所示的核苷酸序列的 全部或部分。本发明的甘蔗植物可具有掺入其基因组的靶向一种或多种 4CL 基因 ( 例如 4CL-M， 4CL-N 和 / 或 4CL-L) 的反义、 共抑制、 RNAi 或核酶核酸。本发明的甘蔗植物可在其 基因组中具有突变的 4CL 基因， 其中 4CL 基因的表达被抑制， 和 / 或其中 4CL 多肽具有抑制 或降低 4CL 多肽的功能活性 ( 例如酶活性 ) 的突变。本发明的甘蔗植物也可具有掺入其基 因组的核酸， 所述核酸编码结合 4CL 蛋白并抑制其酶活性的一种或多种抗体 ( 或其抗原结 合片段 ) 和 / 或适体。
任选地， 本文公开的植物可还展示主要有利于种子公司、 栽培者或粮食加工者的一种或多种农艺性状， 例如除草剂抗性、 病毒抗性、 细菌病原体抗性、 昆虫抗性、 线虫抗 性 和 真 菌 抗 性。 见， 例 如 美 国 专 利 号 5,569,823 ； 5,304,730 ； 5,495,071 ； 6,329,504 ； 和 6,337,431。这样的性状也可为提高植物活力或产量的性状 ( 包括允许植物在不同的温 度、 土壤条件和日光和降水水平下生长的性状 )， 或允许鉴定展示目的性状的植物的性状 ( 例如， 可选择的标记物基因， 种皮颜色等等 )。在例如美国专利号 5,569,823 ； 5,304,730 ； 5,495,071 ； 6,329,504 ； 6,337,431 ； 5,767,366 ； 5,928,937 ； 4,761,373 ； 5,013,659 ； 4,975,374 ； 5,162,602 ； 4,940,835 ； 4,769,061 ； 5,554,798 ； 5,879,903 ， 5,276,268 ； 5,561,236 ； 4,810,648 ； 和 6,084,155 ； 欧洲申请号 0242246 ； 美国专利申请号 20010016956 和 www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/ 的万维网上描述了多种目的性 状， 以及将这些性状引入植物的方法。
本发明也涉及甘蔗植物组织和植物部分， 包括但不限于， 来自本发明的具有被调 节 ( 例如下调 ) 的木质素生物合成的、 可从其再生植物的甘蔗植物的植物细胞、 植物原生质 体、 植物细胞组织培养物、 植物愈伤组织、 植物块 (clump) 和植物中完整的植物细胞， 或植 物的部分， 例如枝、 核、 穗、 穗轴、 果壳、 根尖、 花药、 种子、 根、 胚、 下胚轴、 子叶、 花粉、 胚珠、 花 药、 幼苗、 梗、 茎、 叶、 果和花。在一个实施方案中， 在植物组织或植物细胞中抑制或下调一 种或多种 4CL 基因或其基因产物的表达。在一个实施方案中， 被抑制的 4CL 基因是 4CL-M， 4CL-L 或 4CL-N。在一个实施方案中， 4CL-M， 4CL-L 和 4CL-N 基因分别编码具有 SEQ ID NO ： 6、 7 和 8 中所示的氨基酸序列的多肽， 或其片段或变体。在特定的实施方案中， 4CL-L 基因 包含 SEQ ID NO ： 1 中所示的核苷酸序列的全部或部分， 4CL-M 基因包含 SEQ ID NO ： 2 中所 示的核苷酸序列的全部或部分， 4CL-N 基因包含 SEQ IDNO ： 3 中所示的核苷酸序列的全部或 部分。
本发明也涉及具有被调节的或下调的木质素生物合成的甘蔗细胞或原生质体。 在一个实施方案中， 在甘蔗细胞或原生质体中抑制或下调一种或多种 4CL 基因的表达， 或 由 4CL 基因编码的蛋白质的翻译或活性。在一个实施方案中， 被抑制的 4CL 基因是 4CL-M， 4CL-L 或 4CL-N。在一个实施方案中， 4CL-M， 4CL-L 和 4CL-N 基因分别编码具有 SEQ ID NO ： 6、 7 和 8 中所示的氨基酸序列的多肽， 或其片段或变体。在特定的实施方案中， 4CL-L 基因 包含 SEQ ID NO ： 1 中所示的核苷酸序列的全部或部分， 4CL-M 基因包含 SEQ ID NO ： 2 中所 示的核苷酸序列的全部或部分， 4CL-N 基因包含 SEQ IDNO ： 3 中所示的核苷酸序列的全部或 部分。
本发明也涉及产生具有降低的或下调的木质素生物合成的甘蔗植物的方法。 在一 个实施方案中， 在甘蔗植物的叶细胞和 / 或组织中降低或下调木质素生物合成。在另一个 实施方案中， 在甘蔗植物的茎组织中降低或下调木质素生物合成。 在一个实施方案中， 本发 明的方法包括抑制或遏制一种或多种 4CL 基因的表达， 或抑制由 4CL 基因编码的蛋白质的 翻译或活性 ( 例如酶活性 )。在一个实施方案中， 4CL 基因编码包含 AMP 结合基序序列 ( 例 如 SEQ ID NO ： 34) 和 / 或 SEQ ID NO ： 54 的特征基序序列的 4CL 多肽。在一个实施方案中， 被抑制的 4CL 基因是 4CL-M， 4CL-L 或 4CL-N。在一个实施方案中， 4CL-M， 4CL-L 和 4CL-N 基 因分别编码具有 SEQ ID NO ： 6、 7 和 8 中所示的氨基酸序列的多肽， 或其片段或变体。在特 定的实施方案中， 4CL-L 基因包含 SEQ ID NO ： 1 中所示的核苷酸序列的全部或部分， 4CL-M 基因包含 SEQ ID NO ： 2 中所示的核苷酸序列的全部或部分， 4CL-N 基因包含 SEQ IDNO ： 3中所示的核苷酸序列的全部或部分。在一个实施方案中， 使用反义核酸、 共抑制、 RNA 干扰或 核酶抑制靶基因的表达。在另一个实施方案中， 通过基因突变抑制靶基因的表达。在另一 个实施方案中， 通过表达与蛋白质结合的抗体或其抗原结合片段， 和 / 或适体， 或通过在基 因中提供抑制基因的 mRNA 翻译为蛋白质的突变或破坏或抑制编码的蛋白质的功能的突变 ( 例如通过氨基酸序列中的改变 )， 在植物中抑制靶基因编码的蛋白质的活性。可使用本领 域已知的标准方法和材料将提供靶基因表达抑制的核酸构建体引入植物基因组， 并由此制 备转化的和转基因的植物。
可在表达构建体中提供对本发明有用的多核苷酸。 本发明的表达构建体一般包括 在将要表达表达构建体的预期的宿主细胞中有功能的调控元件。因此， 本领域普通技术人 员可选择用于细菌宿主细胞、 酵母宿主细胞、 植物宿主细胞、 昆虫宿主细胞、 哺乳动物宿主 细胞和人宿主细胞的调控元件。调控元件包括启动子、 转录终止序列、 翻译终止序列、 增强 子和多聚腺苷酸化元件。如本文使用的， 术语 “表达构建体” 指提供有效连接的核酸序列的 转录的核酸序列的组合。如本文使用的， 术语 “有效连接的” 指描述的组件的并置， 其中所 述组件处于允许其以其预期的方式发挥功能的关系之中。大体上， 有效连接的组件处于相 邻关系。
本发明的表达构建体可包含与本发明的多核苷酸序列有效连接的启动子序列。 可 使用本领域已知的标准技术将启动子掺入多核苷酸。 可在本发明的表达构建体中使用多拷 贝启动子或多个启动子。 在优选的实施方案中， 可将启动子置于这样的位置， 即其相距表达 构建体中的转录起始位点的距离与其相距其天然遗传环境中的转录起始位点的距离相同。 在此距离上允许一些基本上不降低启动子活性的变化。 在表达构建体中一般包含转录起始 位点。
如果将在植物细胞中提供表达构建体或将表达构建体引入植物细胞， 那么可使用 植物病毒启动子， 例如花椰菜花叶病毒 (CaMV)35S( 包括增强的 CaMV 35S 启动子 ( 见， 例如 美国专利号 5,106,739))， 或 CaMV 19S 启动子或木薯叶脉花叶 ( 启动子 )。可用于植物中 的表达构建体的其他启动子包括， 例如 prolifera 启动子、 Ap3 启动子、 热休克启动子、 根癌 农杆菌 (A.tumefaciens) 的 T-DNA 1′ - 或 2′ - 启动子、 多半乳糖醛酸酶启动子、 矮牵牛 花的查耳酮合酶 A(CHS-A) 启动子、 烟草 PR-1a 启动子、 泛素启动子、 肌动蛋白启动子、 alcA 基因启动子、 pin2 启动子 (Xu 等人， 1993)、 玉米 WipI 启动子、 玉米 trpA 基因启动子 ( 美国 专利号 5,625,136)、 玉米 CDPK 基因启动子， 且也可使用 RUBISCO SSU 启动子 ( 美国专利号 5,034,322)。在本发明中可使用组织特异性启动子， 例如果特异性启动子， 如番茄的 E8 启 动子 ( 登记号 ： AF515784 ； Good 等人 (1994))。 在本发明的核酸构建体中可使用的叶特异性 启动子包括 Cab1 启动子 (Brusslan 和 Tobin， 1992)、 Cab19 启动子 (Bassett 等人， 2007)、 PPDK 启动子 (Matsuoka 等人， 1993) 和核酮糖二磷酸羧化酶 (RBCS) 启动子 (Matsuoka 等 人 (1994) 和美国专利号 7,723,575)。可用于本发明的表达构建体的其它的植物叶特异性 启动子包括， 但不限于， Act1 启动子 ( 美国公开的申请号 20090031441)、 AS-1 启动子 ( 美 国专利号 5,256,558)、 RBC-3A 启动子 ( 美国专利号 5,023,179)、 CaMV 35S 启动子 (Odell 等人， 1985)、 增强的 CaMV35S 启动子、 玄参花叶病毒 (FMV) 启动子 (Richins 等人， 1987)、 甘露碱合酶 (mas) 启动子、 章鱼碱合酶 (ocs) 启动子等等， 例如来自 CaMV 19S(Lawton 等 人， 1987)、 nos(Ebert 等人， 1987)、 Adh(Walker 等人， 1987)、 蔗糖合酶 (Yang 等人、 1990)、α- 微管蛋白、 泛素、 肌动蛋白 (Wang 等人、 1992)、 cab(Sullivan 等人、 1989)、 磷酸烯醇式丙 酮酸羟化酶 (PEPCase)(Hudspeth 等人、 1989) 的启动子， 或与 R 基因复合物有关的启动子 (Chandler 等人、 1989)。又见公开的美国申请 2007/006346 和 Yamamoto 等人 (1997) ； Kwon 等人 (1994) ； Yamamoto 等人。 果特异性启动子如花器官特异性启动子可用于本发明的表达 构建体， 从而在植物的花器官中表达本发明多核苷酸。花器官特异性启动子的实例包括在 美国专利号 6,462,185 ； 5,639,948 ； 和 5,589,610 中描述的任意启动子序列。也可使用种 子特异性启动子如 β- 云扁豆蛋白基因 ( 例如菜豆的 ) 或大豆球蛋白基因 ( 例如大豆的 ) 等等的启动子。根特异性启动子， 如在美国专利号 6,455,760 或美国专利号 6,696,623， 或 在 公 开 的 美 国 专 利 申 请 号 20040078841 ； 20040067506 ； 20040019934 ； 20030177536 ； 20030084486 ； 或 20040123349 中描述的任意启动子序列可用于本发明的表达构建体。 木质 部特异性启动子包括稻的肉桂酸 -4- 羟化酶 (C4H)。也设想将组成型启动子 ( 如 CaMV、 泛 素、 肌动蛋白或 NOS 启动子 )、 发育调控型启动子和诱导型启动子 ( 如可被热、 光、 激素或化 学品诱导的那些启动子 ) 用于本发明的多核苷酸表达构建体。
鉴定和表征植物基因组 DNA 中的启动子区的方法是本领域已知的， 并包括， 例如 在以下参考文献中描述的那些 ： Jordano 等人 (1989) ； Bustos 等人 (1989) ； Green 等人 (1988) ； Meier 等人 (1991) ； 和 Zhang 等人 (1996)。公开的美国申请 2009/0199307 也描述 了使用差异显示鉴定组织特异性启动子的方法 ( 见， 例如美国专利号 5,599,672)。在差异 显示中， 比较了来自不同组织类型的 mRNA。 通过鉴定仅在特定组织类型， 或组织类型集合中 存在的 mRNA 种类， 可鉴定出以组织特异性方式表达的相应基因。可通过逆转录酶转录 RNA 以产生 cDNA， 并可使用 cDNA 分离含有全长基因的克隆。 也可使用 cDNA 从相应基因中分离部 分同源或同源的启动子、 增强子或终止子， 使用例如抑制 PCR。又见美国专利号 5,723,763。
本发明的表达构建体也可任选地包含转录终止序列， 翻译终止序列， 编码信号肽 的序列， 和 / 或增强子元件。一般可从真核或病毒基因序列的 3’ 非翻译区获得转录终止 区。可将转录终止序列置于编码序列的下游以提供有效的终止。信号肽序列是一般存在于 蛋白质的氨基端的短氨基酸序列， 其负责有效连接的成熟多肽再定位到范围广泛的翻译后 细胞目的地， 所述目的地的范围从特定细胞器区室到蛋白质作用位点和细胞外环境。通过 使用有效连接的信号肽序列， 将基因产物靶向预期的细胞和 / 或细胞外目的地， 设想将此 用于本发明的多肽。经典的增强子是提高基因转录的顺式作用元件， 并也可包含在表达构 建体中。经典的增强子元件是本领域已知的， 包括但不限于 CaMV 35S 增强子元件、 巨细胞 病毒 (CMV) 早期启动子增强子元件和 SV40 增强子元件。增强基因表达的内含子介导的增 强子元件也是本领域已知的。这些元件必须存在于转录区内且是方向依赖的。实例包括玉 米 shrunken-1 增强子元件 (Clancy 和 Hannah， 2002)。
在表达构建体中也可包含引导从表达构建体上转录的 mRNA 的多聚腺苷酸化的 DNA 序列， 并包括但不限于 CaMV 35S、 章鱼碱合酶或胭脂碱合酶信号。本发明的表达构建体 也可包含引导其他基因转座的多核苷酸序列， 即转座子。
表达构建体也可包含用于选择转化细胞的一种或多种显性可选择标记物基因， 包 括例如编码抗生素抗性的基因。抗生素抗性基因可提供对一种或多种以下抗生素的抗性 ： 潮霉素、 卡那霉素、 博来霉素、 G418、 链霉素、 巴龙霉素、 新霉素和壮观霉素。 可通过新霉素磷 酸转移酶 (NPT II) 提供卡那霉素抗性。用于细胞转化筛选的其它标记物包括编码 β- 葡糖醛酸酶 (GUS)、 β- 半乳糖苷酶、 荧光素酶、 胭脂碱合酶、 氯霉素乙酰基转移酶 (CAT)、 绿色 荧光蛋白 (GFP) 或增强的 GFP(Yang 等人 (1996)) 的基因。
本发明也涉及包含编码预期蛋白质的本发明的多核苷酸的多核苷酸载体， 所述载 体将提供给用本发明的生物反应器装置提供的细胞。 在本发明的表达构建体或多核苷酸的 5’ 和 3’ 端可包含独特的限制酶位点， 以允许其插入多核苷酸载体。如本文使用的， 术语 “载 体” 指任意遗传元件， 包括例如质粒、 粘粒、 染色体、 噬菌体、 病毒等等， 当与合适的控制元件 相联系时其能够复制， 且其可在细胞间转移多核苷酸序列。载体包含允许载体在选定的宿 主细胞中复制的核苷酸序列。用于表达和 / 或克隆的若干载体是现有的， 并包括但不限于， pBR322， pUC 系列， M13 系列， 和 pBLUESCRIPT 载体 (Stratagene， La Jolla， CA)。
本发明的多核苷酸可由 RNA 或 DNA 组成。优选地， 多核苷酸由 DNA 组成。本发明 也包含与本文公开的多核苷酸序列互补的多核苷酸。
用 基 因 转 化 植 物 细 胞 的 技 术 是 本 领 域 已 知 的， 并包括例如农杆菌 (Agrobacterium) 感染、 基因枪法、 电穿孔、 氯化钙处理、 PEG 介导的转化等。见， 例如美国专 利号 5,036,006 ； 5,591,616 ； 5,100,792 ； 公开的美国申请号 2006/0260011 ； 和公开的 PCT 申请号 WO 93/07278 和 WO93/21335。 美国专利号 5,661,017 教导了用异源多核苷酸转化藻 类细胞的方法和材料。使用本领域已知的标准方法可选择、 重新分化和培养转化细胞为包 含和表达本发明的多核苷酸的植物。 在本发明的范围内也包含任意转化的或转基因的本发 明的植物细胞或植物的种子和其他植物组织和后代。 也可根据与本文示例的这些序列的更具体的同一性和 / 或相似性范围定义本发 明的多核苷酸和多肽。序列同一性将一般地大于 60 ％， 优选地大于 75 ％， 更优选地大于 80％， 甚至更优选地大于 90％， 和可大于 95％。与本文示例的序列相比， 序列的同一性和 / 或相似性可为 49， 50， 51， 52， 53， 54， 55， 56， 57， 58， 59， 60， 61， 62， 63， 64， 65， 66， 67， 68， 69， 70， 71， 72， 73， 74， 75， 76， 77， 78， 79， 80， 81， 82， 83， 84， 85， 86， 87， 88， 89， 90， 91， 92， 93， 94， 95， 96， 97， 98， 或 99 ％。除非另外指定， 可使用如在 Karlin 和 Altschul(1993) 中修改的 Karlin 和 Altschul(1990) 算法测定如本文使用的 2 个序列的百分比序列同一性和 / 或相 似性。 这样的算法包含在 Altschul 等人 (1990) 的 NBLAST 和 XBLAST 程序中。 可使用 NBLAST 程序， 分数＝ 100， 字长＝ 12 进行 BLAST 搜索， 以得到具有预期百分比序列同一性的序列。 为了比较目的获得有缺口的比对， 可使用如 Altschul 等人 (1997) 描述的 Gapped BLAST。 当使用 BLAST 和 Gapped BLAST 程序， 可使用各个程序 (NBLAST 和 XBLAST) 的默认参数。见 NCBI/NIH 网站。
本发明也设想与编码本发明的多肽的多核苷酸序列具有足够同源的序列， 从而在 标准的严格条件和标准方法下允许与该序列杂交 (Maniatis， T. 等人， 1982) 的那些本发明 的多核苷酸分子 ( 和编码本发明的多肽的那些多核苷酸分子 )。 如本文使用的， 用于杂交的 “严格的” 条件指这样的条件， 其中一般在 6x SSPE， 5x Denhardt 溶液， 0.1％ SDS， 0.1mg/ml 变性 DNA 中在低于 DNA 杂合体的解链温度 (Tm) 的 20-25C 下过夜进行杂交。解链温度有以 下公式 (Beltz， G.A. 等人， 1983) 描述 ：
Tm ＝ 81.5C+16.6Log[Na+]+0.41( ％ G+C)-0.61( ％甲酰胺 )-600/ 双链体的长度 ( 以碱基对为单位 )。
一般如下进行洗涤 ：
a) 在 1x SSPE， 0.1％ SDS 中在室温进行 15 分钟， 2 次 ( 低严格度的洗涤 )。
b) 在 0.2x SSPE， 0.1％ SDS 中在 Tm-20C 下进行 15 分钟， 1 次 ( 中严格度的洗涤 )。
如本文使用的， 术语 “核酸” 和 “多核苷酸序列” 指单链或双链形式的脱氧核糖核 苷酸或核糖核苷酸聚合物， 除非另外限制， 其包含可与天然存在的核苷酸类似的方式发挥 功能的天然核苷酸的已知类似物。多核苷酸序列包括被转录为 RNA 的 DNA 链序列和被翻译 为蛋白质的 RNA 序列二者。多核苷酸序列包括全长序列以及来源于全长序列的较短序列二 者。 应当理解， 特定多核苷酸序列包含天然序列的简并密码子， 或可被引入以在特定宿主细 胞中提供密码子偏好的序列。 在本发明范围内的多核苷酸序列还包含与编码本发明的多肽 的序列特异性杂交的序列。 多核苷酸包含作为单独的链的或在双链体中的正义和反义链二 者。
在本发明的范围内也视为包含具有除了在本发明的多肽中特别示例的氨基酸取 代以外的氨基酸取代的多肽。 例如， 可用非天然氨基酸取代本发明的多肽的氨基酸， 只要具 有取代的氨基酸的多肽基本上保留与氨基酸未被取代的多肽相同的活性。 非天然氨基酸的 实例包括， 但不限于， 鸟氨酸、 瓜氨酸、 羟脯氨酸、 高丝氨酸、 苯甘氨酸、 牛磺酸、 碘化酪氨酸、 2， 4- 二氨基丁酸、 α- 氨基异丁酸、 4- 氨基丁酸、 2- 氨基丁酸、 γ- 氨基丁酸、 ε- 氨基己酸、 6- 氨基己酸、 2- 氨基异丁酸、 3- 氨基丙酸、 正亮氨酸、 正缬氨酸、 肌氨酸、 高瓜氨酸、 磺丙氨 酸、 τ- 丁基甘氨酸、 τ- 丁基丙氨酸、 苯甘氨酸、 丙氨酸环己酯、 β- 丙氨酸、 氟代氨基酸， 专 门设计的氨基酸如 β- 甲基氨基酸、 C- 甲基氨基酸、 N- 甲基氨基酸， 和一般的氨基酸类似 物。非天然氨基酸也包括具有衍生化的侧基的氨基酸。此外， 蛋白质中的任意氨基酸可为 D( 右旋 ) 型或 L( 左旋 ) 型。 氨基酸可一般被分为以下种类 ： 非极性、 无电荷极性、 碱性和酸性。在本发明的范 围内包括保守取代， 其中具有一类氨基酸的多肽被同类的另一种氨基酸替换， 只要具有取 代的多肽仍基本上保留与没有取代的多肽相同的生物学活性。 非极性氨基酸包括 Ala， Val， Leu， Ile， Pro， Met， Phe， 和 Trp。无电荷极性氨基酸包括 Gly， Ser， Thr， Cys， Tyr， Asn， 和 Gln。酸性氨基酸包括 Asp 和 Glu。碱性氨基酸包括 Lys， Arg， 和 His。
一旦在表达系统中掺入本发明的核酸序列， 就可将其转化进植物细胞。词语 “植 物” 指任意植物， 特别是种子植物， “植物细胞” 是植物的结构和生理学单位， 其包含细胞壁， 但也可指原生质体。植物细胞可为分离的单个细胞或培养细胞的形式， 或作为更高等的有 机体单位例如植物组织或植物器官的一部分。术语 “转化” 指导致在遗传上被稳定继承的 核酸片段至宿主细胞基因组的转移。包含转化的核酸片段的宿主细胞被称为 “转基因” 细 胞， 和包含转基因细胞的生物被称为 “转基因生物” 。
转 化 植 物 和 植 物 细 胞 的 方 法 的 实 例 包 括 农 杆 菌 介 导 的 转 化 (Deblaere 等 人 (1987)) 和微粒轰击技术 (Klein 等人 (1987) ； 美国专利号 4,945,050)。通过技术人员熟 知的方法可从转基因细胞再生全植物 ( 见， 例如 Fromm 等人 (1990))。
可以多种本领域公认的方式将本发明的表达构建体引入植物细胞。 术语 “引入” 在 多核苷酸 ( 例如编码本文公开的酶的核苷酸 ) 的情况下， 旨在表示以这样的方式将多核苷 酸呈递给植物， 即， 使多核苷酸能进入植物细胞内部。当要引入多于一种多核苷酸时， 这些 多核苷酸可被组装为单个核苷酸构建体的一部分， 或作为单独的核苷酸构建体， 并可位于 相同或不同的转化载体上。
因此， 可在单个转化事件中， 在单独的多个转化事件中， 或例如在植物中将这些多 核苷酸引入目的宿主细胞， 作为育种方案的一部分。本发明的方法不依赖于特定的将一种 或多种多核苷酸引入植物的方法， 只要多核苷酸能进入植物的至少一个细胞的内部。将多 核苷酸引入植物的方法是本领域已知的， 并包括但不限于， 瞬时转化法、 稳定转化法和病毒 介导法。
“瞬时转化” 在多核苷酸的情况下旨在表示， 多核苷酸被引入植物但不整合进植物 的基因组。
在将多核苷酸引入植物的情况下， “稳定引入” 或 “稳定引入的” 旨在表示， 引入的 多核苷酸被稳定掺入植物基因组， 因此植物被多核苷酸稳定地转化。
“稳定转化” 或 “稳定转化的” 旨在表示， 引入植物的多核苷酸 ( 例如， 本文描述的 核苷酸构建体 ) 整合进植物的基因组， 并能够被其后代继承， 更特别地， 被多个连续世代的 后代继承。
可用于植物转化的多种转化载体是在植物转化领域的普通技术人员已知的， 且与 本发明有关的基因可与任意这些载体共同使用。 载体的选择将取决于优选的转化技术和用 于转化的靶物种。对某些靶物种， 可优选不同的抗生素或除草剂选择标记物。
再生转化植物的方法是本领域熟知的。例如， Ti 质粒载体已被用于外源 DNA 的递 送， 以及直接的 DNA 摄取、 脂质体、 电穿孔、 显微注射和微粒。另外， 来自农杆菌属的细菌可 被用于转化植物细胞。下面描述了转化双子叶和单子叶植物的代表性技术， 以及代表性质 体转化技术。
许多载体可用于使用根癌农杆菌的转化。其一般携带至少一种 T-DNA 边界序列， 并包括如 pBIN19(Bevan(1984)) 的载体。为了构建用于农杆菌转化的载体， 见， 例如美国专 利申请公开号 2006/0260011。
不使用根癌农杆菌的转化规避了在选择的转化载体中对 T-DNA 序列的需要， 因此 也可使用缺乏这些序列的载体。不依赖农杆菌的转化技术包括， 但不限于， 通过颗粒轰击、 原生质体摄取 ( 例如 PEG 和电穿孔 ) 和显微注射。载体的选择大部分取决于用于转化的物 种的优选的选择。有关这些载体的构建， 见例如美国公开的申请号 2006/0260011。
用于双子叶植物的转化技术是本领域熟知的， 并包括基于农杆菌的技术和不需要 农杆菌的技术。非农杆菌的技术包括通过原生质体或细胞直接摄取外源遗传物质， 并可例 如通过 PEG 或电穿孔介导的摄取、 颗粒轰击介导的递送或显微注射实现。Paszkowski 等人 (1984)， Potrykus 等人 (1985)， Reich 等人 (1986)， 和 Klein 等人 (1987) 描述了这些技术 的实例。在每种情况下， 使用本领域已知的标准技术将转化细胞再生为整株植物。
农杆菌介导的转化是转化双子叶植物的优选技术， 因为其高转化效率及其对许多 不同物种的广泛实用性。农杆菌转化一般包括将携带目的外源 DNA 的二元载体转移至合适 的农杆菌菌株， 这可能依赖于宿主农杆菌菌株在共驻留的 Ti 质粒或染色体上携带的 vir 基 因的补足 (complement)(Uknes 等人 (1993))。通过使用携带重组二元载体的大肠杆菌、 携 带能够将重组二元载体移动至靶农杆菌菌株的质粒的辅助大肠杆菌菌株的三亲株交配程 序实现重组二元载体至农杆菌的转移。可选地， 可通过 DNA 转化将重组二元载体转移至农 杆菌 (Hofgen 和 Willmitzer(1988))。
重组农杆菌对靶植物物种的转化通常包括共培养农杆菌与来自植物的外植体， 并遵照本领域熟知的方案。在携带存在于二元质粒 T-DNA 边界之间的抗生素或除草剂抗性标 记物的选择培养基上再生转化的组织。
用基因转化植物细胞的另一种方法包括在植物组织和细胞上推进 (propel) 惰性 或生物活性颗粒。在美国专利号 4,945,050， 5,036,006， 和 5,100,792 中公开了此技术。大 体上， 此技术包括在能够有效穿透细胞的外表面的条件下在细胞上推进惰性或生物活性颗 粒， 并在其内部提供掺入。 当使用惰性颗粒时， 可通过用包含预期基因的载体覆盖颗粒将载 体引入细胞。可选地， 可用载体包围细胞， 从而通过颗粒将载体携带进细胞。也可将生物活 性颗粒 ( 例如， 干酵母细胞、 干细菌或噬菌体， 其分别含有试图引入的 DNA) 推进植物细胞组 织。
大多数单子叶物种的转化现在也已变为常规技术。优选的技术包括使用 PEG 或 电穿孔技术将基因直接转移进原生质体， 和颗粒轰击进愈伤组织。可使用单个 DNA 种类或 多个 DNA 种类 ( 即共转化 ) 进行转化， 且这些技术都适用于本发明。共转化可具有以下优 势： 避免构建完整载体， 和产生具有不连锁的目的基因和可选择标记物的基因座的转基因 植物， 这使得能够在以后的世代中去除可选择的标记物， 这应当被认为是理想的。
专利申请 EP 0292435， EP 0392225， 和 WO 93/07278 描述了从玉米的原种自交系 制备愈伤组织和原生质体， 使用 PEG 或电穿孔转化原生质体， 和从转化的原生质体再生玉 米植物的技术。Gordon-Kamm 等人 (1990) 和 Fromm 等人 (1990) 公开了使用颗粒轰击转 化 A188 来源的玉米系的技术。此外， WO 93/07278 和 Koziel 等人 (1993) 描述了通过颗 粒轰击转化玉米的原种自交系的技术。此技术使用从授粉后 14-15 天的玉米穗上切除的 1.5-2.5mm 长的未成熟的玉米胚和 PDS-1000He 基因枪装置用于轰击。
通过用本发明的核酸序列转化得到的植物可为任意的品种广泛的植物物种， 包 括单子叶和双子叶植物物种。可通过育种将本发明的基因表达与其他对生产和质量的重 要特征组合掺入植物系。也可通过育种或通过普通的基因工程技术将本文公开的本发明 的多核苷酸掺入植物系或维持在植物系中。育种方法和技术是本领域已知的。见， 例如 Welsh(1981) ； Wood(1983) ； Mayo(1987) ； Singh(1986) ； 以及 Wricke 和 Weber(1986)。
通过有性生殖或营养生长传递改造进上述转基因种子和植物的遗传特性， 并可因 此在后代植物中维持和传播所述遗传特性。一般地， 维持和繁殖利用为了适合特定目的如 耕种、 播种或收割而开发的已知农业方法。
相关技术是本领域熟知的， 并包括但不限于， 杂交、 近交、 回交育种、 多系育种 (multi-line breeding)、 双单倍体近交、 品种混合、 种间杂交、 非整倍体技术， 等等。 杂交技 术也包括通过机械、 遗传 ( 包括转基因 )、 化学或生物化学手段使植物不育以产生雄性或雌 性不育的植物。
用于本发明的目的， “甘蔗” 指任意甘蔗属植物或杂种。在本发明的范围内的甘蔗 植物包括， 例如斑茅 (Saccharum arundinaceum)、 Saccharumbengalense、 肉质花穗野生种 (Saccharum edule)、 白甘蔗 (Saccharumofficinarum)、 狭叶斑茅 (Saccharum procerum)、 沙 生 蔗 茅 (Saccharumravennae)、 大 茎 野 生 种 (Saccharum robustum)、 竹 蔗 (Saccharum sinense) 和割手密 (Saccharum spontaneum)。本发明的甘蔗植物可为近交系或杂种。杂 种植物包括通过组成目前所有的商业甘蔗和 energycane 种质的白甘蔗杂交材料由传统的 割手密生成的杂种， 和通过用近亲或远亲物种杂交甘蔗产生的任意其他杂种。可与甘蔗杂交以产生杂种植物或新的甘蔗品种的其他物种的实例包括芒属 (Miscanthus)、 蔗茅属 (Erianthus) 和甜高粱属 (Sorghum)。
“分离的” 表示 “通过人工操作” 从其自然状态改变的， 即， 如果其出现在自然界， 其 已从其本来的环境中被改变或移动， 或被改变和移动。 例如， 在活动物中以天然状态天然存 在的多核苷酸或多肽不是 “分离的” ， 但如本文使用的术语， 从其天然状态的共同存在的材 料中分开的相同的多核苷酸或多肽是 “分离的” 。例如， 就多核苷酸而言， 术语分离的表示， 从其天然存在的染色体和细胞中分开的。如果序列从其天然存在的染色体和细胞中分开， 但被插入其不天然存在的染色体或细胞的基因环境中， 则其也是分离的。
如本文使用的， 术语 “转基因的” 指包含外源多核苷酸 ( 即基因 ) 的植物， 所述外源 多核苷酸在转化的植物中被稳定维持并在连续世代中通过后代稳定继承。术语 “转基因植 物” 可指最初转化的植物或最初转化的植物的后代。 用于转化植物、 植物细胞或植物组织的 技术可包括， 但不限于， 使用根癌农杆菌或发根农杆菌 (A.rhizogenes) 作为转化剂用 DNA 转化， 电穿孔、 DNA 注射、 微粒轰击和颗粒加速。见， 例如 EP 295959 和 EP 138341。如本文 使用的， 术语 “植物材料” 或 “植物部分” 包括植物细胞、 植物原生质体、 可从其再生植物的植 物细胞组织培养物、 植物愈伤组织、 植物块和植物中完整的植物细胞， 或植物的部分， 如胚、 花粉、 胚珠、 种子、 叶、 花、 枝、 果、 核、 穗、 穗轴、 果壳、 梗、 根、 根尖、 花药、 块茎、 根茎等等。
材料和方法
植 物 材 料。 在 表 达 分 析 中 使 用 野 外 培 养 的 成 熟 甘 蔗 ( 甘 蔗 属 杂 交 种 ) 变 种 CP88-1762 和温室培养的未成熟的 CP88-1762 和 L 79-1002。
RNA 提取、 基因分离和 RT-PCR。使用 TRIzol 试剂 (Invitrogen) 从叶、 茎、 节和根 分离总 RNA。使用 cDNA 合成试剂盒 (Bio-Rad) 从 1ug 总 RNA 合成第一链 cDNA。
甘蔗 4CL 的分离
Sc4CL-L
通过 RACE(cDNA 末端的快速扩增 ) 技术得到部分 4CL-L。使用 SMARTRACE 试剂盒 (Clontech) 根据制造商的说明书进行 RACE。从 2ug 总 RNA 合成 5’ - 和 3’ -RACE 预备 cDNA 库， 并使用这些库作为 PCR 模板。基于 4CL-L 的部分基因组 DNA 序列设计初级 (LPF ： 5’ -CG TTGCCTGTGAAGTCCGGCGC-3’ (SEQ ID NO ： 17)) 和巢式 (LNF ： 5’ -CCACGGCGAAGACCATCGACTCG-3 ’ (SEQ IDNO ： 18)) 基因特异性引物。使用 LPF 和制造商提供的通用引物混合物 (UPM) 进行 初级 PCR。PCR 条件由 25 个循环的 94℃ 30 秒， 68℃ 60 秒和 72℃ 180 秒组成。将初级 PCR 产物从 1 稀释到 50 并用作次级 PCR 的模板， 次级 PCR 使用 LNF 和制造商提供的巢式通用引 物 (NUP)。第二个 PCR 在与第一个 PCR 相同的条件的 20 个循环下进行。将 3’ -RACE PCR 产物克隆进 pCR2.1TOPO 载体 (Invitrogen) 并测序。
Sc4CL-M
通过 DNA 文库筛选分离 4CL-M。从野外培养的植物 (Belle Grade 和 Citra， FL) 收获甘蔗 ( 甘蔗属杂交种 ) 变种 CP88-1762 的叶、 节间、 节和未成熟的卷叶。从水培溶液培 养的植物中收集根和新生幼苗。使用 Trizol(Invitrogen) 从每种组织中提取总 RNA， 并以 相同的比例混合来自每种样品的总 RNA。使用 Oligotex mRNA Mini 试剂盒 (Qiagen) 从混 合的总 RNA 提纯 mRNA。从 5.9ug mRNA 合成 cDNA 并使用 cDNA 合成试剂盒和 ZAP-cDNA 合 成试剂盒 (Stratagene) 连接至 Uni-ZAP XR 载体。使用 ZAP-cDNA GigapackIII Gold 克隆 试剂盒根据制造商的说明书 (Stratagene) 进行包装和扩增。用于筛选， 使用随机引物试剂 32 盒 (Promega) 通过 PCR 生成 447bp 的部分 4CLM 特异性探针并用 P-dCTP 标记。筛选了约 2.0x 105 的重组噬菌体， 并分离了 1 个阳性噬菌体。为了得到包含 cDNA 的 pBluscript 噬 菌粒， 进行了体内切除并对分离物测序。
Sc4CL-N
使用从甘蔗 EST 序列推断的基因特异性引物从 cDNA 上 PCR 扩增 4CL-N。在 DFCI 白甘蔗基因索引 (SoGI ； http://compbio.dfci.harvard.edu/cgi-bin/tgi/gireport.pl ？ gudb ＝ s_officinarum) 中使用 “4- 香豆酸辅酶 A 连接酶” 作为关键词检索的主题。检测 出具有完整的开放阅读框的假设的共有 (TC) 序列 TC88322， 并用于引物设计。分别从起 始和终止密码子区设计了正向引物 (4CL1F ： 5’ -ATGGGTTCCGTGGACACGGCGGTCGCG-3’ (SEQ ID NO ： 19)) 和反向引物 (4CL1R ： 5’ -TCAGTGAACACCGGCGGCGAGCCTGG-3’ (SEQ ID NO ： 20))。 使用 Trizol 根据制造商的说明书 (Invitrogen) 从叶、 节间、 节和幼苗分离总 RNA， 并使用 iScript cDNA 合成试剂盒 (Bio-rad) 进行 cDNA 合成。使用 200ng 来自每个组织的 cDNA 混 合物作为 PCR 模板。使用 TaKaRa LA taq 聚合酶 (Takara BIO Inc.) 进行 PCR， 且 PCR 条件 由 35 个循环的 95℃ 45 秒， 56℃ 45 秒和 72℃ 120 秒组成。将 2 次独立扩增的 PCR 产物克 隆进 pCR2.1TOPO 载体 (Invitrogen) 并测序。Sc4CL RNAi 抑制构建体的构建
基于 Sc4CL-L(SEQ ID NO ： 1) 和 Sc4CL-M(SEQ ID NO ： 2) 的测序信息， 设计了特异 性引物以分别扩增名为外显子 2 和外显子 1 的 200bp 区域。将对应 2 个限制酶 EcoRI 和 XbaI 的序列加入正向引物， 对反向引物加入特异性对应 EcoRV 限制酶的序列， 以便于亚克 隆。使用由通过 Bg4CL 天然内含子分隔开的 2 个反向重复和转录终止子 CaMV35SpolyA 组 成的质粒 pWFBgH4CL_RNAi 构建 Sc4CL 干扰构建体。在 2 个单独和相继的亚克隆步骤中， 用 Sc4CL 特异性序列替换质粒 pWF BgH4CL_RNAi 中的反向重复。然后亚克隆稻 C4H 启动子并 产生 2 个构建体 Sc4CL-Li 和 Sc4CL-Mi(SEQ ID NO ： 4 和 SEQ ID NO ： 5)。
4CLi 甘蔗系的产生
使用甘蔗 ( 甘蔗属杂交种 ) 变种 CP88-1762 的未成熟的卷叶的横切面在补充了 20g/L 蔗糖和 13.6uM 2， 4-D， pH 调节为 5.8 的改良的 MS 基础培养基 (CI-3)(Chengalrayan 和 Gallo-Meagher， 2001) 上诱导愈伤组织。在诱导了愈伤组织后， 使用如以前描述的 PDS-1000/He 基因枪颗粒递送系统 (Bio-Rad)(James 等人， 2008) 进行基因枪基因转移。如 描述的使用遗传霉素进行选择 (Chengalrayan 和 Gallo-Meagher， 2001)， 但略加修改， 其中 对再生的植物进行了进一步的选择， 即将其在生根阶段在含有巴龙霉素 (30mg/L) 的 MS 基 础培养基中亚培养， 进行 4 次两周一次的亚培养。将发育出健康的根的选定的植物转移至 土壤并转移至温室。
转基因系的表征
在选择和再生植物以后， 通过 NPTII-ELISA 和 PCR 确认转基因甘蔗植物。使用 Pathoscreen nptII ELISA 试剂盒 (Agdia) 根据制造商的说明书进行总蛋白质提取和 NPTII-ELISA。使用 DNeasy Plant Mini 试剂盒 (Qiagen) 从每株再生的植物的展开的叶中 提取基因组 DNA。使用 75ng 基因组 DNA 作为 PCR 模板。为了检测每种表达构建体， 从每个 基因和启动子区设计引物如下 ： 用于 Sc4CL-Mi 和 Sc4CL-Li RNAi 构建体， 4CL SF(5’ -CATCA AGGGTACGGGATGAC-3’ (SEQ ID NO ： 21)) 和 OSPRO SR(5’ -GTAGCCTGCTAGTCTTCTCTCTCATT-3’ ( SEQ ID NO ： 22))。使用 iTaq 聚合酶 (Bio-Rad) 按如下条件进行 PCR ： 35 个循环的 95℃ 30 秒， 58 ℃ 30 秒和 72 ℃ 60 秒。用于 Northern 印迹分析， 从植物的第三片叶 ( 用于 4CL-Li 系 ) 和约 25cm 长的侧分蘖 ( 用于 4CL-Mi 系 ) 中提取总 RNA(Sambrook et at.， 1989)。在 相同的发育阶段从在与转基因植物相同的条件下培养的野生型植物中收集样品。 在电泳和 转移了 20ug 总 RNA 后， 使用来自靶向的 4CL 基因的开放阅读框的放射性标记的探针进行 Northern 杂交。
如 Browning(1967) 描述的分别从 4CL-Li 系和 4CL-Mi 系的衰老的叶和节间中使 用 Klason 程序在转基因甘蔗和非转基因 ( 野生型 ) 甘蔗植物中定量总木质素， 但略加修改 (Yoshihara 等人， 1984)。简单地说， 在研磨干样品 (0.5-1mm 筛选 ) 后， 用 50％的温热乙醇 提取样品以去除可溶性糖， 并干燥。然后， 使用 12M H2SO4 水解 0.1g 干细胞壁样品， 在 30℃ 进行 2 小时。用蒸馏水稀释内含物并高压灭菌 1 小时。高压灭菌后， 通过过滤收集不溶的 材料 ( 木质素和灰分 ) 并称重。然后在 500℃燃烧木质素 5 小时。在此步骤后， 称重灰分并 通过燃烧前和后的重量差异计算木质素。
本文提及和引用的所有专利、 专利申请、 临时申请和出版物以其整体引入作为参 考， 包括所有的图和表， 只要其不与本说明书的明确教导不一致。以下是说明用于实践本发明的程序的实施例。这些实施例不应被视为限制性的。 除非另外指出， 所有百分比是以重量计的， 且所有溶剂混合物比例是以体积计的。
实施例 1—— Sc4CL 基因的分离
在本研究中分离和表征了 2 个全长的和 1 个部分的甘蔗 4CL 基因的序列。 Sc4CL-N 和 Sc4CL-M 的 cDNA 序列具有 1665 和 1728 核苷酸的开放阅读框， 分别编码 555 和 576 氨基 酸的蛋白质。部分的 Sc4CL-L cDNA 序列长 616bp， 其包含 3’ UTR， 和 141 氨基酸残基的开 放阅读框。Sc4CL-N 和 Sc4CL-M 之间的配对比较显示 59％的相似性。Sc4CL-N 与以前鉴定 的 4CL 关联最紧密， 分别显示了与甜高粱的 Sb4CL 样 1 和稻的 Os4CL3 的 96％和 86％的相 似性， 而 Sc4CL-M 与 Sb4CL 样 1 和 Os4CL3 共有较低的相似性， 但其显示了与 Sb4CL 样 2 和 Os4CL3( 分别为 96％和 83％ ) 的较高的相似性。Sc4CL 与拟南芥 At4CL 的推断的氨基酸序 列的比较显示了范围从 60％ -63％的相似性 ( 表 2)。
Sc4CL 和已功能表征的其他 4CL、 白杨 Ptd4CL 和拟南芥 At4CL 之间的比对 ( 通过 CLUSTALW(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl ？ page ＝ /NPSA/npsa_ clustalw.html) 使用默认参数进行 ) 显示了保守的 AMP 结合基序 ( 见， 例如 SEQ ID NO ： 34， 35， 36， 37， 38， 39， 40， 41， 42， 和 43) 和特征基序 “GEICIRG” (SEQ ID NO ： 54)， 其被认为是底 物识别位点 (Ehlting 等人 2001)。系统发生分析显示， 在禾本科中的 4CL 基因家族成员可 被分为 2 个主要的在系统发生上有联系的群组， 组 I 和组 II。Sc4CL-N 和 Sc4CL-M 分别被 归为植物 4CL 组 I 和组 II。组 I 包括玉蜀黍 4CL2、 稻 4CL1、 拟南芥 4CL1、 黑麦草 4CL2、 白 杨 4CL3、 白杨 4CL1、 白杨 4CL2、 拟南芥 4CL2、 甜高粱 04g005210、 玉蜀黍 LOC542166 和玉蜀黍 ACF84437。组 II 包括稻 4CL2、 甜高粱 04g031010、 拟南芥 4CL3、 黑麦草 4CL1、 白杨 4CL4、 拟 南芥 4CL4、 稻 4CL3、 稻 4CL5、 甜高粱 10g026130、 黑麦草 4CL3 和稻 4CL4。
表 2.4CL 氨基酸序列之间的百分比相似性
Sc ： 甘蔗， Sb ： 甜高粱， Os ： 稻， At ： 拟南芥
实施例 2—— 4CL 基因的表达谱
甘蔗 4CL-M 主要在茎中表达， 而 Sc4CL-L 主要在叶中表达 ( 表 3)。这提示， 可以组 织特异性方式调控不同 4CL 基因的表达， 并提供了在特定组织中抑制木质素的机会。
表 3.Sc4CL 基因的组织和栽培品种特异性表达
-L、 S 和 N 分别表示叶、 茎和节。
实施例 3—— 4CL 下调的甘蔗的生成
RNAi 是用于作物改良和研究基因功能的有力工具。因此， 为了研究每个 4CL 基因 产物在木质素生物合成中的生理作用， 利用 Sc4CL 的序列信息生成了 4CL 下调的甘蔗， 生 成了 2 个靶向 Sc4CL-L 和 Sc4CL-M 基因的不同区域的、 处于木质部特异性启动子、 稻香豆 酸 -4- 羟化酶 (C4H) 启动子 (Fouad 和 Altpeter， 尚未发表 ) 和 CaMV 35S 多聚腺苷酸信号 控制下的 RNA 抑制构建体 (SEQ ID NO ： 4 和 SEQ ID NO ： 5)。使用基因枪基因转移， 将生成 的具有处于具有第一内含子、 35S 3’ UTR 的强组成型玉米泛素启动子 (pUbi) 调控下的可选 择的 nptII 基因的抑制盒各自或同时共同引入胚发生甘蔗愈伤组织。当生成若干转基因系 时， 使用 nptII/ 遗传霉素和巴龙霉素选择系统进行转基因事件的选择。
利用 2 个生成的抑制盒进行了共 88 次轰击， 并在愈伤组织选择后再生了 160 株植 物。使用 Pathoscreen nptII ELISA 试剂盒 ( 表 4)， 152 株独立的植物显示了 NPTII 表达。 使用 PCR 确认了在转基因植物的基因组 DNA 中 4CL-RNAi 抑制盒的存在 ( 表 4)。
在转基因甘蔗植物中的甘蔗 4CL 的表达分析指示了相比非转基因 (WT) 甘蔗， 在若 干转基因甘蔗植物中 Sc4CL-L( 表 5) 和 Sc4CL-M 基因 ( 表 6) 的抑制。
表 4. 转基因 4CLi 甘蔗的总结
NA ＝未分析的 表 5. 在甘蔗 4CL-Li 转基因植物的衰老的叶中的 4CL-L 基因表达水平和木质素含量
1- 相对 WT 表达 (100％ ) 的基于 RNA 印迹分析的表达 2-2-3 次生物学重复的平均值， 通过分析相同基因型的 2-3 株个体植物生成。 表 6. 在甘蔗 4CL-Mi 转基因植物的未成熟的节间中的 4CL-M 基因表达水平和木质素含量
1- 基于相对 WT 表达 (100％ ) 的 RNA 印迹分析的表达
2-2 次生物学重复的平均值， 通过分析相同基因型的 2 株个体植物生成。
实施例 4- 具有减少的木质素的甘蔗的生成
根据标准方案在品系中使用 Klason 程序在 4CL-Li 转基因植物和非转基因甘蔗的 衰老的叶中定量总木质素。如在表 5 中所示， Klason 木质素在非转基因甘蔗植物的衰老的 叶中为约 23.6％。相对而言， 具有 4CL-L 基因抑制的转基因系 14-2A 在衰老的叶中具有平 均 21％的 Klason 木质素 ( 表 5)， 表明通过 4CL-L 抑制总木质素减少了 11％。也在 4CL-Mi 系 ( 表 6) 和野生型植物中的未成熟的节间中分析了木质素。品系 4a 展示了相比野生型植 物的约 8％的总木质素的减少。品系 5b-A1 也显示了类似水平的木质素减少 ( 表 6)。预期 在成熟的节间中在这些转基因 4CL-Mi 植物中的更高的木质素减少， 在成熟的节间中非转 基因植物的木质素含量增加至超过 20％。
实施例 5—— 4CLM 表达的定量 PCR 分析
定量实时 RT-PCR 分析确认了在若干转基因系中的 4CLM 抑制。 表 7 显示了 4CLM 基 因相对参考基因 ( 甘蔗 GAPDH) 的相对表达比例。表 7 显示了在包括品系 4A 和 5BA1 的转 基因甘蔗系中的 4CLM 转录物的强抑制。收获发育匹配的侧分蘖并从第一节间提取总 RNA。 从 3’ UTR 设计 4CLM 基因特异性引物。平行进行所有反应， 且一式三份进行每个反应。使用 Q- 基因软件计算标准误。
表 7.4CLM 表达的定量 PCR 分析
实施例 6——植物 4CL 基因间的进化趋异的估计
在表 8 中显示了甘蔗 4CL 和其他植物 4CL 间的分析中的每个位点上的氨基酸取代 数。所有结果基于氨基酸序列的配对分析。使用 MEGA4(Zuckerkandl 和 Pauling(1965) ； Tamura 等人 (2007)) 中的泊松校正法进行分析。 从数据集中去除含有缺口和缺失数据的所 有位置 ( 完全缺失选项 )。在最终的数据集中共有 513 个位置。
表 8. 植物 4CL 间的进化趋异的估计
Sc ： 甘蔗， Sb ： 甜高粱， Zm ： 玉蜀黍， At ： 拟南芥， Lp ： 黑麦草， Os ： 稻， Po ： 白杨杂种 ( 毛果杨 (Populus trichocarpa)x 美洲黑杨 (Populusdeltoids))
表 8 继续
Sc ： 甘蔗， Sb ： 甜高粱， Zm ： 玉蜀黍， At ： 拟南芥， Lp ： 黑麦草， Os ： 稻， Po ： 白杨杂种 ( 毛果杨 (Populus trichocarpa)x 美洲黑杨 (Populusdeltoids))
表 8 继续
Sc ： 甘蔗， Sb ： 甜高粱， Zm ： 玉蜀黍， At ： 拟南芥， Lp ： 黑麦草， Os ： 稻， Po ： 白杨杂种 ( 毛果杨 (Populus trichocaroa)x 美洲黑杨 (Populusdeltoids))
应当理解， 本文描述的实施例和实施方案仅是为了说明的目的， 对本领域技术人 员建议根据其的多种修改或变化， 且这些修改和变化将被包括在本申请的精神和范围内和 随附的权利要求书的范围内。另外， 本文公开的任意发明或其实施方案的任意元素或限制 可与本文公开的任意其他发明或其实施方案的任意和 / 或所有其他元素或限制 ( 分别地或 以任意组合 ) 组合， 且所有这些组合视为在本发明的范围内， 而不加限制。
参考文献
美国专利号 4,761,373
美国专利号 4,769,061
美国专利号 4,810,648
美国专利号 4,940,835 美国专利号 4,945,050 美国专利号 4,975,374 美国专利号 4,987,071 美国专利号 5,013,659 美国专利号 5,023,179 美国专利号 5,034,322 美国专利号 5,036,006 美国专利号 5,093,246 美国专利号 5,100,792 美国专利号 5,106,739 美国专利号 5,116,742 美国专利号 5,162,602 美国专利号 5,256,558 美国专利号 5,270,163 美国专利号 5,276,268 美国专利号 5,304,730 美国专利号 5,495,071 美国专利号 5,554,798 美国专利号 5,561,236 美国专利号 5,569,823 美国专利号 5,582,981 美国专利号 5,589,610 美国专利号 5,591,616 美国专利号 5,595,877 美国专利号 5,599,672 美国专利号 5,625,136 美国专利号 5,639,948 美国专利号 5,661,017 美国专利号 5,723,763 美国专利号 5,767,366 美国专利号 5,817,785 美国专利号 5,879,903 美国专利号 5,928,937 美国专利号 6,084,155 美国专利号 6,329,504 美国专利号 6,337,431 美国专利号 6,344,318 美国专利号 6,455,760美国专利号 6,462,185
美国专利号 6,506,559
美国专利号 6,696,623
美国专利号 6,933,116
美国专利号 7,056,704
美国专利号 7,078,196
美国专利号 7,232,086
美国专利号 7,282,564
美国专利号 7,365,058
美国专利号 7,368,236
美国专利号 7,538,095
美国专利号 7,700,759
美国专利号 7,723,575
美国公开的申请号 20010016956
美国公开的申请号 20030084486
美国公开的申请号 20030177536
美国公开的申请号 20040019934
美国公开的申请号 20040067506
美国公开的申请号 20040078841
美国公开的申请号 20040123349
美国公开的申请号 20060260011
美国公开的申请号 2007006346
美国公开的申请号 20090031441
美国公开的申请号 20090199307
PCT 公开的申请号 WO 93/07278
PCT 公开的申请号 WO 93/21335
EP 0242246
EP 0292435
EP 0392225
EP 138341
EP 295959
Agrawal 等 人 (2003)Microbiology and Molecular Biology Reviews， 67(4) ： 657-685.
Altschul， S.F. 等 人 (1990)“Basic Local Alignment Search Tool” J.Mol. Biol.215 ： 403-410.
Altschul， S.F. 等人 (1997)“Gapped BLAST and PSI-BLAST ： A NewGeneration of Protein Database Search Programs” Nucl.AcidsRes.25 ： 3389-3402.
Bartel， D. 和 Szostak， J.W.Science 261 ： 1411-1418(1993).
Bassett， C.L.， Callahan， A.， Artlip， T.， Scorza， R.Srinivasan， C.(2007)“Aminimal peach type II chlorophyll a/b-binding proteinpromoter retains tissue-specificity and light regulation intomato” BMC Biotechnol.， 7： 47.
Beltz ，G.A. ，Jacobs ，K.A. ，Eickbush ，T.H. ，Cherbas ，P.T. ，Kafatos ， F.C.(1983)“Isolation of multigene families and determinationof homologies by filter hybridization methods” Methods ofEnzymology， R.Wu， L.Grossman 和 K.Moldave[eds.]AcademicPress， New York 100 ： 266-285.
B e v a n ，M . ( 1 9 8 4 ) “ B i n a r y A g r o b a c t e r i u m v e c t o r s f o r planttransformation” Nucl.Acids Res.， 12(22) ： 8711-21.
Browning， B.L.1967.Methods of wood chemistry.Wiley-Interscience， New York.
Brusslan， J.A. 和 Tobin， E.M.(1992)“Light-independentdevelopmental regulation of cab gene expression in Arabidopsisthaliana seedlings” Proc Natl Acad Sci USA， 89(16) ： 7791-5.
Bustos 等人 (1989)Plant Cell， 1： 839-854.
Chandler 等 人 (1989)“Two Regulatory Genes of the Maize AnthocyaninPathway Are Homologous ： Isolation of B Utilizing R GenomicSequences” The Plant Cell， 1： 1175-1183. Chengalrayan， K. 和 Gallo-Meagher， M.(2001)“Effect of variousgrowth regulators on shoot regeneration of sugarcane” In VitroCell.Dev.Biol.Plant， 37 ： 434 439.
Clancy， M. 和 Hannah， L.C.(2002)“Splicing of the maize Sh1 firstintron is essential for enhancement of gene expression， and aT-rich motif increases expression without affecting splicing” Plant Physiol.130(2) ： 918-29.
Deblaere， R.， Reynaerts， A.， Hofte， H.， Hernalsteens， J.-P.， Leemans， J.， 和 Van Montagu， M.(1987)“Vectors for cloning in plantcells” Methods Enzymol.， 153 ： 77-292.
Doran， T. 和 Helliwell， C.(2009)RNA interference ： Methods forplants and animals ； Publisher ： CABI， Wallingford， UK.Ebert 等人 (1987)Proc.Nat′ l Acad.Sci. USA.84 ： 5745-5749.
Ehlting， J.， Buttner， D.， Wang， Q.， Douglas， C.J.， Somssich， I.， 和 Kombrink， E.(1999).Three 4-coumarate ： coenzyme A ligasesin Arabidopsis thaliana represent two evolutionarily divergentclasses in angiosperms.Plant J.19， 920.
Ellington， A.D. 和 Szostak， J.W.(1990) “In vitro selection of RNAmolecules that bind specific ligands” Nature， 346(6287) ： 818-822.
Fromm 等人 Biotechnology 8 ： 833-839(1990).
Good， X. 等人 (1994)“Reduced ethylene synthesis by transgenictomatoes expressing S-adenosylmethionine hydrolase” PlantMolec.Biol.26 ： 781-790.
Gordon-Kamm 等人 PlANt Cell 2 ： 603-618(1990).
Green 等人， EMBO J.， 7： 4035-4044(1988).
Haselhoff 和 Gerlach Nature 334 ： 585-591(1988).
Hofgen&Willmitzer， Nucl.Acids Res.16 ： 9877(1988).
Hoppe-Seyler， F. 和 Butz， K.(2000)“Peptide aptamers ： powerful newtools for molecular medicine” J.Mol.Med.， 78(8) ： 426-430.
Hudspeth 等人 (1989)Plant Mol.Biol.， 12 ： 579-589.
James VA， Neibaur I， Altpeter F ： Stress inducible expression of theDREB1A transcription factor from xeric， Hordeum spontaneum L.in turf and forage grass(Paspalum notatum Flugge)enhancesabiotic stress tolerance.Transgenic Res 2008， 17 ： 93-104.
Jordano 等人， Plant Cell， 1： 855-866(1989).
Karlin S.， Altschul， S.F.(1990)“Methods for Assessing theStatistical Significance of Molecular Sequence Features byUsing General Scoring Schemes” Proc.Natl.Acad.Sci.USA87 ： 2264-2268.
Karlin S.， Altschul， S.F.(1993) “Applications and Statistics forMultiple High-Scoring Segments in Molecular Sequences” Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90 ： 5873-5877. Klein 等人 (1987)Nature 327 ： 70-73.
Koziel 等人 (1993)Biotechnology 11 ： 194-200.
Kusaba(2004)Current Opinion in Biotechnology， 15 ： 139-143.
Kwon 等人 (1994)Plant Physiol.105 ： 357-67.
Lawton 等人 (1987)Plant Mol.Biol.9 ： 315-324.
Maniatis ， T. ， Fritsch ， E.F. ， Sambrook ， J.(1982)Molecular Cloning ： A Laboratory Manual， Cold Spring Harbor Laboratory， Cold SpringHarbor， NY.
Matsuoka 等人 (1993) “Tissue-specific light regulatedexpression directed by the promoter of a C4 gene， maize pyruvate， orthophosphate dikinase， in a C3 plant， rice” PNAS USA， 90(20) ： 9586-90.
Matsuoka 等人 (1994)Plant J.6 ： 311-319.
Mayo， O.(1987)The Theory of Plant Breeding， Second Edition， Clarendon Press， Oxford.
Meier 等人 (1991)Plant Cell， 3： 309-316.
Milhavet 等人 (2003)Pharmacological Reviews， 55(4) ： 629-648.
Odell 等人 (1985)Nature 313 ： 810-812.
Paszkowski 等人 (1984)EMBO J.3 ： 2717-2722.
Potrykus 等人 (1985)Mol.Gen.Genet.199 ： 169-177.
Reich 等人 (1986)Biotechnology 4 ： 1001-1004.
Richins 等人 (1987)Nucleic Acids Res.20 ： 8451.
Sambrook， J.， Fritsch， E.F.， 和 Maniatis， T.(1989)Molecular Cloning ： A Laboratory Manual. 卷 1 和 3.Cold Spring Harbor LaboratoryPress， Cold Spring Harbor， NY.
Singh， D.P.(1986)Breeding for Resistance to Diseases and InsectPests， Springer-Verlag， NY.
Sullivan 等 人 (1989)“Isolation and characterization of a maizechlorophyll a/b binding protein gene that produces high levelsof mRNA in the dark” Mol.Gen.Genet.， 215(3) ： 431-440.
Tamura K.， Dudley J.， Nei M.， 和 Kumar S(2007)MEGA4 ： MolecularEvolutionary Genetics Analysis(MEGA)software version 4.0.Molecular Biology and Evolution 24 ： 1596-1599.
Theander， O.， 和 E.A.Westerlund(1986).Studies on dietary fiber.3.Improved procedures for analysis of dietary fiber.J.Agric.Food Chem.34 ： 330 336
Uknes 等人 (1993)Plant Cell 5 ： 159-169.
Walker 等人 (1987)Proc.Nat′ l Acad.Sci.USA， 84 ： 6624-6628.
Wang 等 人 (1992)“Characterization of cis-Acting ElementsRegulating Transcription from the Promoter of a ConstitutivelyActive Rice Actin Gene” Molecular and Cellular Biology， 12(8) ： 3399-3406.
Welsh J.R.(1981)Fundamentals of Plant Genetics and Breeding ， JohnWiley&Sons， NY.
Wood D.R.(1983)(Ed.)Crop Breeding， American Society of AgronomyMadison， Wis.
Wricke 和 Weber(1986)Quantitative Genetics and Selection PlantBreeding， Walter de Gruyter and Co.， Berlin.
www.lifesci.sus sex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/
Xu， D.， McElroy， D.， Thornburg， R.W.， Wu， R. 等人 (1993)“Systemicinduction of a potato pin2 promoter by wounding， methyljasmonate， and abscisicacid in transgenicrice plants” PlantMolecular Biology 22 ： 573-588.
Yamamoto 等人 (1994)Plant Cell Physiol.35 ： 773-778.
Yamamoto 等人 (1997)Plant J.12(2) ： 255-265.
Yang 等人 (1990)Proc.Nat′ l Acad.Sci.USA， 87 ： 4144-4148.
Yang， T.T. 等人 (1996)“Optimized Codon Usage and ChromophoreMutations Provide Enhanced Sensitivity with the GreenFluorescent Protein” Nucleic Acid Research 24(22) ： 4592-4593.
Y o s h i h a r a ，K . ，T . K o b a y a s h i ，T . F u j i i ， 和 I . A k a m a t s u ( 1 9 8 4 ) . A novelmodification of Klason lignin quantitative method.J.JapanTappi 38 ： 86 95.
Zhang 等人 (1996)Plant Physiology， 110 ： 1069-1079.
Zubieta， C， Kota， P， Ferrer， J.L.， Dixon， R.A.， Noel， J.P.(2002)“Structural basis for the modulation of lignin monomermethylation by caffeic acid/5-hydroxyferulic acid3/5-O-methyltransferase” Plant Cell.， 14(6) ： 1265-77.
Zuckerkandl E&Paul ing L(1965)Evolutionary divergence andconvergence in proteins， pp.97-166 in Evolving Genes andProteins， edited by V.Bryson 和H.J.Vogel.Academic Press， NewYork.36CN 102458099 A
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