基于官能两亲分子或大分子的具有多隔室的配制剂 本发明涉及用于至少一种治疗剂(特别地抗肿瘤剂)运输或寻靶 (vectorisation) 的 基 于 官 能 两 亲 分 子 或 大 分 子 (molécule ou macromolécules amphiphiles fonctionelles) 的具有多隔室的新型配制剂， 以及它们的制备方法， 和它们 的用途。
在抗肿瘤剂中， 顺铂为广泛使用的抗肿瘤剂， 特别地用于治疗实体肿瘤。然而， 由 于其毒性以及获得抗性 (résistance acquise ) 的出现， 它的使用受到限制。
为了克服这些缺点， 现有技术已经提出不同配制剂 : 例如专利 US5178876 描述了 用于在脂质体中封装的疏水络合物形式的铂衍生物。
专利 US6001817 描述了包含顺铂的组合物和含有至少一种核苷或者脱氧核苷的 载体 (vecteur) 的组合物。
专利 US7908160 涉及与配体连接的顺铂衍生物， 其活性根据与配体的结合是可逆 的。
申请 WO01/32139 描述了在亲脂性纳米颗粒中封装的顺铂的组合物， 所述纳米颗 粒通过重复的加热和冻结周期、 基于带负电荷的天然脂类 ( 特别地二油基磷脂酰丝氨酸 ) 获得。在该申请中指出， 顺铂在水中形成具有比不带电荷的物种更高的溶解度的带正电荷 的聚集体， 这可以使它们与带负电荷的类脂膜相互作用和使在顺铂聚集体周围的类脂膜的 重新组织。
然而， 仍然需要解决与治疗剂 ( 特别地抗肿瘤剂 ) 的寻靶有关的问题。
特别地， 寻求一种方法， 该方法可以将治疗剂 ( 特别地顺铂和 / 或它的衍生物 ) 以 具有高药理学活性地快速地运送至肿瘤细胞内部， 同时保护健康细胞， 即降低神经毒性、 肾 毒性、 听觉毒性、 消化毒性等等， 同时限制对这种治疗剂的抗药性出现的现象。
还设法提供在足够的时间后具有稳定性的载体以避免过早释放治疗剂和与在生 物介质中游离治疗剂的存在有关的缺点， 特别地在活性损失和毒性方面的缺点。
而且， 在同一配制剂的不同隔室中封装在相同配制剂中的一种或多种治疗剂的可 能性具有允许使这种 ( 这些 ) 药剂同时或分期递送至相同的靶的益处， 每一隔室能够用作 容器。
现在已经发现使用由官能两亲分子或者大分子形成的具有多隔室的配制剂显示 出改善的稳定性性质， 特别地在 37℃时的稳定性， 这允许所述治疗剂随着时间延长的寻靶 和治疗剂的快速有效的细胞内递送。
本发明的主题因此是， 根据第一方面， 呈纳米颗粒形式的具有多隔室的配制剂， 该 纳米颗粒由包含治疗剂的被至少两个具有由官能两亲分子或大分子形成的具有不同极性 的类脂层 (couches lipidiques) 包围的固体芯构成。
“纳米颗粒” 表示具有大约 1-200nm， 优选地 25-150nm 的平均直径的颗粒。
在本说明书的剩余部分中， “根据本发明的纳米颗粒” 或 “具有多隔室的纳米颗粒” 表示呈由包含治疗剂的固体芯构成的纳米颗粒形式的具有多隔室的配制剂， 该固体芯被至 少两个由官能两亲分子或大分子形成的具有不同极性的类脂层包围。
有利地， 每个类脂层构成可以包括与在芯中存在的治疗剂相同或不同的治疗剂的隔室。 根据有利的方面， 根据本发明的具有多隔室的配制剂在一种或多种治疗剂存在时 由所述具有不同极性的类脂层形成而不是由预先成型的颗粒形成， 这允许根据希望的活性 使活性成分 " 指定地 (à la carte)" 包封在所述一个或多个希望的隔室中。
这种特别的结构为根据本发明的具有多隔室的纳米颗粒赋予与治疗剂的递送相 适合的稳定性 ( 寿命 ) 并且允许它们在释放这种治疗剂之后崩解。
优选地， 第一类脂层由一种或多种阴离子型类脂构成和第二类脂层由一种或多种 阳离子型类脂构成。
“具有不同极性” 表示包围芯的每个相继类脂层由不同于前一种类脂的类脂构成， 而且每个层具有或者为负的 ( 由阴离子型类脂构成 ) 或正的 ( 由阳离子型类脂构成 ) 或者 中性的 ( 由中性类脂构成 ) 总体表面电荷。例如， 第一类脂层可以由阴离子型类脂形成并 且将携带负表面电荷， 而第二类脂层可以由阳离子型类脂形成并且将携带正表面电荷。
每一个层的表面电荷可以通过它们的 ζ 电位进行测量， 例如根据在 Andrea Mayer 等， Toxicology， 2009， 258， 139-147 或 K. Furusawa 和 K. Uchiyama， 1988， 140， 217-226 中描述的技术测量。
根据有利的方面， 根据本发明的具有多隔室的纳米颗粒可以包括交替的阴离子和 阳离子型类脂层和由一种或多种中性类脂构成的外层。
根据优选方面， 每个类脂层由至少一种式 (I) 的官能两亲化合物构成
其中 - X 表示氧或者硫原子或者亚甲基， - B 表示嘌呤碱或者嘧啶碱， 如尿嘧啶、 腺嘌呤、 鸟嘌呤、 胞嘧啶、 胸腺嘧啶、 次黄嘌呤或 者它们的衍生物， 或者非天然的单或者双环的杂环碱， 其每个环包含 4 － 7 个链节， 其任选 地被取代 ； - L1 和 L2， 是 相 同 或 者 不 同 的， 表 示 氢、 氧 羰 基 -O-C(O)-、 硫代氨基甲酸酯基 团 -O-C(S)-NH-、 碳酸酯基团 -O-C(O)-O-、 氨基甲酸酯基团 –O–C(O)-NH-、 氧原子、 磷酸酯 基团、 膦酸酯基团或者包含 1 － 4 个氮原子的杂芳基， 该杂芳基未被取代或者被直链或支链 的， 饱和或者不饱和 C2-C30 烃链取代， 或者， L1 和 L2 一起形成下式的缩酮基 (goupement cétal)或者 L1 或者 L2 表示氢， 另一个表示羟基或者包含 1-4 个氮原子的杂芳基， 该杂芳基未 被取代或者被直链或支链的 C2-C30 烷基链取代 ； - R1 和 R2， 是相同的或者不同的， 表示 : - 饱和或者部分不饱和的直链或支链的 C2-C30， 优选地 C6-C25， 特别地 C8-C25 烃链， 其任 选地完全或者部分氟化， 其未被取代或在链端的碳上被氟原子或者被苄基酯或醚或者萘基 酯或醚取代， 或者 - 二酰基链， 其中每个酰基链是 C2-C30 链， 或者 - 二酰基甘油 (diacylglycérol)、 鞘氨醇或者神经酰胺基团， 或者 - 当 L1 或 L2 表示氢， 另一个表示羟基或者包含 1-4 个氮原子的杂芳基时， R1 和 R2 不存 在； - R3 表示 : - 羟基、 氨基、 磷酸酯基团、 膦酸酯基团、 磷脂酰胆碱基团， O- 烷基磷脂酰胆碱基团、 硫 代磷酸酯基团、 、 NH2-R4、 NHR4R5 或 NR4R5R6， 其中 R4、 R5 和 R6， 是相同的或者不同的， 表示氢 原子或者直链或支链的 C1-C5 烷基链或者直链或支链的 C1-C5 羟烷基链， 或者 - 直链或支链的 C2-C30 烷基链， 其任选地被羟基取代， 或者 - 环糊精残基， 或者 - 残基其中 V 表示 -O-、 -S- 或 -NH- 键， R7 表示 H 或 CH3， 和 n=1-500， 或 - (CH2)n-V-R8 基团， 其中 R8 表示 C2-C30 烷基， 和 n=1-500， 或 - 包含 1-4 个氮原子的杂芳基， 其未被取代或者被以下基团取代 : C2-C30 烷基或 (CH2) 其中 m=1-6 和 p=0-10 和 R9 表示包含 5-7 个碳原子的环状缩酮基团， 其 m-O-(CH2)p-R9 基团， 未被取代或者被至少一个直链或支链的 C2-C30 烷基或者被甾醇残基取代， 或者 - R3 通过共价键与另一相同或者不同的式 (I) 化合物的另一相同或者不同的取代基 R3 连接， 以形成呈二聚物形式的式 (I) 化合物， 和每个类脂层具有不同于前面类脂层的极性的极性。
式 (I) 化合物的电荷通过它们包含的极性基团进行确定， 这些极性基团基本上存 在于取代基 L1、 L2 和 / 或 R3 中或由它们构成。
可以用于制备第一类脂层的阴离子型式 (I) 化合物可以例如选自阴离子型核类 脂 (nucléolipids anioniques)， 如这样的式 (I) 化合物， 其中 L1、 L2 和 / 或 R3 表示任选地被 取代的带负电荷的基团， 如， 例如磷酸酯基团、 膦酸酯基团、 羧酸酯基团、 硫酸酯基团等等。可以用于制备第一类脂层的阳离子式 (I) 化合物可以例如选自阳离子核类脂 (nucléolipids cationiques)， 如这样的式 (I) 化合物， 其中 L1、 L2 和 / 或 R3 表示任选地被 基团等等。取代的带正电荷的基团， 如， 例如铵、 、 咪唑
这些极性基团的电荷还可以根据这些基团的 pKa 而改变， 例如当它是胺、 咪唑、 磷 酸酯基团等时。
“治疗剂” 表示例如用于在体外或者在体内 ( 特别地在动物中， 包括人类， 或者还对 分离的细胞 ) 预防或者治疗病状或者恢复生物功能的天然或者合成分子， 排除核酸或者其 碎片。
这种分子可以选自例如药物的活性成分， 特别地选自抗肿瘤剂， 如: - 铂络合物， 其中特别地可以提到顺铂、 卡铂、 奥沙利铂、 奈达铂、 洛铂 (lobaplatine) 等等， 或 - 可以与铂络合物连接的钌， 或者 - 基于钌 II 和 / 或 III 的、 基于钛的不含铂的无机络合物， 例如二氯化二茂钛， 或者基 于镓的无机络合物， 例如镓盐， 如硝酸镓、 氯化镓、 KP46， 或者 - 铁衍生物， 如二茂铁 盐、 包含铁的核苷类似物、 包含基于的吡啶基五价配体 (ligands pyridyl-pentadéntate) 的铁 (II) 络合物， 或者 - 钴衍生物， 如六羰基 - 二钴络合物， 炔 - 钴络合物， 包含氮芥 (azote motarde) 配体 的 Co(III) 络合物， 或者 - 金 衍 生 物，如 Auranofin、金 (I)、 (III) 和 (III) 络 合 物、硫 代 葡 糖 金 (aurothioglucose) 等等。 有利地， 根据本发明的具有多隔室的配制剂可以封装这些分子并且保证它们在细 胞内的递送同时限制对这些化合物的获得抗病性的现象。
铂络合物， 特别地顺铂， 是用于本发明目的的优选治疗剂。
基于钌 II 和 / 或 III 的无机络合物可以是例如被称为 NAMI-A、 RAPTA-C、 KP1019 的络合物。这种非铂络合物被描述在 Ott I. 和 Gust R.， Arch. Pharm. Chem. Life Sci. 2007， 340， 117-126 ； Reedijk J.， Curr Opin Chem Biol.， 1999， 3， 236-40 ； Haimei Chen 等， J. Am. Chem. Soc， 2003， 125， 173-186。
包 含 铁 的 核 苷 类 似 物 描 述 在 Schlawe D. 等， Angew. Chem. Int. Ed.， 2004， 1731-1734。
有利地， 已经发现了构成式 (I) 化合物的分子和 / 或大分子结构可以与治疗剂形 成稳定的纳米颗粒， 所述分子和 / 或大分子结构包含由取代基 B 表示的该治疗剂的至少一 种配体 ( 核苷碱基 (nucléobase)、 核苷、 改性核苷、 核苷酸、 低聚核苷酸、 杂环等等 ) 并具有 两亲特征， 这是由于存在至少一个亲水部分 ( 磷酸根、 羧酸根等等 ) 和至少一个疏水部分 ( 单链、 双链的疏水片段和由生物来源的合成单体衍生的极性部分等等 )。
通过将式 (I) 化合物的两亲性质、 治疗剂 ( 活性剂 ) 的配体在这些化合物中的存 在和在所述治疗剂和这些化合物之间的任何静电相互作用结合， 如此获得的纳米颗粒具有 允许封装的活性成分 ( 特别地抗肿瘤剂 ) 有效并且快速的细胞内递送。
不希望将本发明限制于一种理论， 可以提出一种假定， 根据该假定， 式 (I) 化合物 的分子间相互作用导致纳米颗粒的在表面上的内聚力的增大， 其表现为在使用条件下随着
时间更大的稳定性。
基于具有可调节极性的多个类脂层的根据本发明的纳米颗粒的具有多隔室的结 构赋予它们许多优点， 特别地 : - 提高的稳定性， 特别地在生物介质中的稳定性， - 根据它们在设想的用途中的效力调节表面电势 (ζ 电位 )， - 它们的官能化 ( 引入官能度， 寻靶剂等 )， - 掺入不同治疗剂。
有利地， 所述纳米颗粒还具有与它们作为治疗剂的载体的用途相容的寿命。
在上面式 (I) 中， n 有利地为 1-500， 优选地 1-100， 特别地 1-50， 十分特别地 1-10。
“直链或者支链的 C1-C5 烷基” 例如表示甲基、 乙基、 丙基、 异 - 丙基、 正丁基、 异-丁 基、 叔丁基， 优选地甲基或者乙基。
同样， 在上面式 (I) 中， 嘌呤碱或者嘧啶碱， 或者非天然的杂环碱可以被至少一个 取代基取代， 该取代基例如选自 : 卤素、 氨基、 羧基、 羰基、 羰氨基、 羟基、 叠氮基、 氰基、 烷 基、 环烷基、 全氟烷基、 烷氧基 ( 例如， 甲氧基 )、 氧羰基、 乙烯基、 乙炔基、 丙炔基、 酰基等等。
“非天然杂环碱” 表示除了尿嘧啶、 腺嘌呤、 鸟嘌呤、 胞嘧啶、 胸腺嘧啶或者次黄嘌 呤以外的在自然界中不存在的碱。 “包含 1-4 个氮原子的杂芳基” 表示芳族的或者部分地不饱和的单环或者双环的碳 环基团， 其包含 5-12 个原子， 被 1-4 个氮原子间隔， 特别地为吡唑、 三唑、 四唑或者咪唑基。
为了制备式 (I) 化合物， 可以参考申请 WO2005/116043， 其描述了获得这类化合物 的不同路径 ( 特别地参看第 8-17 页和实施例 )。
根据随后的方面， 本发明还涉及制备呈由包含治疗剂的芯构成的实心纳米颗粒形 式的具有多隔室的配制剂的方法， 该芯被至少两个不同极性的由官能两亲分子或大分子形 成的类脂层包围， 其中每个类脂层构成可以包含与在芯中存在的治疗剂相同或不同治疗剂 的隔室， 该方法包括以下步骤 : a) 制备至少一种官能两亲分子或大分子， 特别地如上面所定义的式 (I) 的官能两亲化 合物， 和治疗剂的混合物， b) 使所述混合物经受重复加热和冻结周期， 以获得包含所述治疗剂的纳米颗粒， 和 c) 回收如此获得的包含所述治疗剂的纳米颗粒， d) 使所述纳米颗粒与至少一种官能两亲分子或大分子， 特别地如上面所定义的式 (I) 的官能两亲化合物接触， 该官能两亲分子或大分子具有与在步骤 a) 中使用的那些不同的 极性， 和 e) 回收如此获得的多隔室纳米颗粒。
优选地， 该治疗剂是抗肿瘤剂， 特别地铂络合物， 特别地顺铂。
有利地， 该方法的步骤可以重复了为获得希望的类脂层数目所必需的次数。
任选地， 在步骤 d) 和步骤 e) 之间可以进行附加步骤， 该步骤包括使由至少一种官 能两亲分子或大分子， 特别地如上面所定义的式 (I) 的官能两亲化合物构成的中性类脂层 形成， 所述分子或所述式 (I) 化合物是中性的。
根据优选方面， 在步骤 a) 和 / 或步骤 d) 中， 作为该官能两亲化合物的补充， 将使 用至少一种共类脂 (colipide)。
“共类脂” 表示与式 (I) 化合物缔合进行使用的化合物， 其参与建立纳米颗粒的一 个或多个类脂层的结构。
优选地， 将使用两性离子型共类脂。
所述共类脂可以例如选自二油基磷脂酰胆碱 (DOPC)， 二油基磷脂酰尿苷磷脂酰胆 碱 (DOUPC) 或二油基磷脂酰乙醇胺 (DOPE)。
当这些化合物与式 (I) 化合物混合进行使用时， 它们可以起共类脂作用。或者， 它 们可以被包括在式 (I) 中， 如二油基磷脂酰尿苷磷脂酰胆碱 (DOUPC)。在这种情况下， 它们 将或者起式 (I) 化合物的作用， 或者与另一种式 (I) 化合物组合起共类脂的作用。
根据另一有利的方面， 在步骤 d) 中引入与用于步骤 a) 中的治疗剂相同或不同的 治疗剂。
优选地， 用于步骤 a) 中的一种或多种式 (I) 的官能两亲化合物是阴离子型和用于 步骤 d) 中的一种或多种官能两亲化合物是阳离子型。
有利地， 中性的式 (I) 的官能两亲化合物用来构成最外类脂层， 其可以在步骤 d) 和步骤 e) 之间进行实施。
更特别地， 用于制备具有多隔室的配制剂的方法可以包括在以下通常条件下实施 的步骤， 例如， 这些条件阐明了呈由包含治疗剂的固体芯构成的纳米颗粒形式的具有多隔 室的配制剂的获得， 该固体芯被两个不同极性的由式 (I) 化合物形成的类脂层包围 : 1) 形成根据本发明的包含富集治疗剂的芯和第一类脂层的纳米颗粒 - 使式 (I) 化合物溶于有机溶剂中以形成类脂混合物， 然后使溶剂蒸发以形成第一类 脂膜 ； - 平行地， 将期望量的治疗剂， 优选地抗肿瘤剂溶于蒸馏水中 ； - 第一类脂膜在治疗剂 ( 优选地抗肿瘤剂 ) 的溶液中进行再水合。通过超声处理和加 热获得透明溶液 ； - 使溶液快速冷却， 例如通过浸入液氮中。该加热 / 冷却周期优选地进行 1-10 次， 特 别地 5-10 次， 特别地 10 次 ； - 在超声处理和离心该获得的悬浮液之后， 移除上清液并且使沉淀物再悬浮 ； - 离心后， 除去沉淀物并且回收上清液。
2) 形成根据本发明的纳米颗粒， 其包含富集治疗剂的芯和两个不同极性的类脂层 - 由具有与用于该方法的第一部分中的式 (I) 化合物的极性不同的极性的式 (I) 化合 物制备第二类脂膜 ； - 用先前回收的上清液使第二类脂膜再水合， - 在超声处理和离心该获得的悬浮液之后， 移除上清液并且使沉淀物再悬浮 ； - 在离心之后， 除去沉淀物和回收包含含有两个不同极性的类脂层的具有多隔室的纳 米颗粒的上清液。
有利地， 使上述方法的步骤重复为了获得希望的类脂层数目所必需的次数。
优选地， 类脂层的数目为 2-6。
任选地， 在该方法第二部分期间， 在允许回收根据本发明的具有多隔室的纳米颗 粒的最后一步之前， 可以进行包括使由至少一种如上面所定义的式 (I) 的官能两亲化合物 构成的类脂层形成的附加步骤， 其中所述式 (I) 化合物是中性的。根据一个优选方面， 在形成类脂混合物期间在如上所述的制备的第一部分中或在 它的第二部分中， 将使用至少一种如上面所定义的共类脂作为式 (I) 化合物的补充。
根据本发明的优选配制剂是在其中第一类脂层是阴离子型和第二类脂层是阳离 子型的那些。
有机溶剂可以例如选自在本领域中通常的有机溶剂， 如氯仿或二氯甲烷、 醇， 如甲 醇或者乙醇等等。
优 选 地 在 大 约 20 ℃ -80 ℃ 的 温 度 进 行 加 热， 并 且 在 大 约 -190 ℃ ( 液 氮 ) 至 0℃ ( 冰 ) 的温度进行冷却。合适的加热 / 冷却周期可以例如对于加热为 45℃和对于冷却 为 -78℃。
优选地， 治疗剂选自铂络合物 ( 顺铂、 卡铂等等 )， 顺铂是特别优选的， 或者可以与 铂络合物结合的钌， 或者上述的基于钌 II 或者 III、 钛、 镓、 钴、 铁或者金的不含铂的无机络 合物。
式 (I) 化合物 / 治疗剂的摩尔比 R 可以例如为 0.01-50， 特别地 R=0.2。
获得的纳米颗粒可以任选地通过聚碳酸酯过滤器被挤出， 该过滤器具有例如大约 100nm 或者 200nm 的孔径。 如此获得具有多隔室的纳米颗粒， 其由富集治疗剂 ( 活性成分 ) 的固体芯构成， 该 固体芯被至少两个由如上面所定义的式 (I) 的官能两亲化合物构成的具有不同极性的类 脂层 ( 有或者没有共类脂 ) 包围。
根据该方法的一个方面， 所述类脂混合物仅仅包含至少一种式 (I) 化合物并且不 包含共类脂。
优选地， 治疗剂以在水相中约 0.1ng/mL-10mg/mL 的浓度进行使用， 使得活性成分 在细胞内递送是显著的。
可用于形成类脂层的优选的式 (I) 化合物为其中 X 表示氧的那些。
式 (I) 化合物， 其中 B 表示胸腺嘧啶或者腺嘌呤， 也是优选的化合物。
式 (I) 化合物， 其中 L1、 L2 和 / 或 R3 表示任选地被取代的带负电荷的基团 ( 如， 例 如磷酸酯、 膦酸酯、 羧酸酯、 硫酸酯基团等等 )， 是用于获得阴离子型类脂层的优选化合物。
式 (I) 化合物， 其中 L1、 L2 和 / 或 R3 表示任选地被取代的带正电荷的基团 ( 如， 例
如铵、 、 咪唑
基团等等 )， 是用于获得阳离子型类脂层的优选化合物。根据优选方面， 本发明涉及包含这些式 (I) 化合物和治疗剂的如上面所定义的具 有多隔室的纳米颗粒， 治疗剂特别地为抗肿瘤剂， 特别是铂络合物 ( 如， 例如顺铂、 卡铂、 奥 沙利铂、 奈达铂、 洛铂 )， 或能够与铂络合物连接的钌， 或者上述基于钌、 钛、 镓、 钴、 铁或者金 的不含铂的无机络合物。顺铂是用于本发明目的的优选抗肿瘤剂。
式 (I) 化合物还可以包含具有抗肿瘤活性的基于嘌呤或者嘧啶的衍生物， 例如氮 杂胞嘧啶 (AraC)， 5- 氟尿嘧啶 (5-FU)， 碘苷 (IdU)， 2'- 脱氧 -2'- 亚甲基胞嘧啶核苷 (DMDC) 或者 5- 氯代 -6- 叠氮基 -5,6- 二氢 -2'- 脱氧尿苷。
本发明的主题还是如上所述的具有多隔室的纳米颗粒作为用于治疗剂 ( 特别地 抗肿瘤剂 ) 的运送或者寻靶的试剂的用途。
特别地， 本发明的主题还是如上所述的具有多隔室的纳米颗粒作为用于治疗剂 ( 特别地抗肿瘤剂 ) 细胞内递送的试剂的用途。本发明还涉及如上所述的具有多隔室的纳米颗粒用于制备抗肿瘤药物的用途。
本发明还涉及如上所述的具有多隔室的纳米颗粒， 其用于治疗肿瘤疾病， 特别地 癌症， 如卵巢癌、 睾丸癌、 结肠癌、 宫颈癌、 肺癌、 或者腺肉瘤等等。
所述具有多隔室的纳米颗粒可以通过如上所述的方法获得。
本发明还涉及如上所述的包含呈由包含治疗剂的固体芯构成的纳米颗粒形式的 具有多隔室的配制剂 ( 或具有多隔室的纳米颗粒 ) 和可药用载体的药物组合物， 其中所述 固体芯被至少两个由官能两亲分子或大分子形成的具有不同极性的类脂层包围。
通过以下实施例非限制性地举例说明本发明。
所有来源于化学产品供应商 (Aldrich， Alfa Aesar et Avanti Polar Lipid) 的原料产物不进行随后纯化而进行使用。溶剂不进行附加的蒸馏而进行使用。合成的化 合物使用标准的光谱分析法如 NMR1H( 在 300.13MHz)， NMR13C( 在 75.46MHz) 和 NMR31P( 在 121.49MHz) 和质谱方法 (Caractéristiques) 进行表征。在 NMR 中的化学位移 (δ) 用 ppm 并且相对于 TMS 表示。在 NMR1H 中的力偶常数 J 用 Hz 表示。Merck RP-18 F254s 板用于薄 层层析法 (CCM)。SEPHADEX LH-20(25-100μm) 二氧化硅用于通过定量色谱分离法的纯化。
以下取名为 " 制备 " 的实施例描述了用于制备式 (I) 化合物的合成中间体的制 备。式 (I) 化合物的制备和根据本发明的纳米颗粒的研究在下面在合成实施例中和取名为 " 实施例 " 的测试中进行描述。
制备 1 5'- 对甲苯磺酰基胸苷将在无水吡啶中 0.1M 溶液形式的 2g 胸苷 (8.26 毫摩尔 ) 引入到在无水氮气氛下的双 颈烧瓶中。 然后将溶液冷却至 0℃并且分小份地加入 3.935g 对甲苯磺酰氯 (2.5 当量， 20.6 毫摩尔 )。使反应介质返回到环境温度， 然后搅拌 10 小时。然后通过加入 10mL 甲醇停止 该反应， 维持搅拌 30 分钟。向混合物加入 50mL CH2Cl2， 然后它依次用 20 毫升 5%NaHCO3 溶 液、 20 毫升 NaCl 饱和溶液和 20 毫升 5%NaHCO3 溶液洗涤。在减压下去除该溶剂。期望的化 合物通过在甲醇中的重结晶而获得。
RF: 0.47(AcOEt/MeOH 9/1) 收率 : 75% NMR1H(300.13MHz， DMSO d6): δ1.77(s， 3H， CH3)， δ2.11(m， 2H， CH2)， δ2.42(s， 3H， CH3)， δ3.52(t,j =6Hz， 4H， CH2)， δ4.18(m， 1H， CH)， δ4.25(m， 3H， CH， CH2)， δ5.42(s， 1H， OH)， δ6.15(t， j =6Hz， H， CH)， δ7.38(s， 1H， CH)， δ7.46(s， 1H， CH)， δ7.49(s， 1H， CH)， δ7.78(s， 1H， CH)， δ7.81(s， 1H， CH)， δ11.28(s， 1H， 1NH).NMR13C(75.47MHz， DMSO d6): δ12.5(CH3)， δ21.6(CH3)， δ38.9(CH2)， δ70.4(CH2)， δ70.6(CH)， δ83.7(CH)， δ84.5(CH)， δ110.3(C)， δ128.1(arCH)， δ130.6(ar2CH)， δ132.6(arC)， δ136.4(arC)， δ145.6(C)， δ150.8(C=O)， δ164.1(C=O). + 高解析 MS[M+H] : 397.1。
制备 2 2'- 脱氧 -5'- 甲苯磺酰基腺苷将在无水吡啶中 0.1M 溶液形式的 2g 2'- 脱氧腺苷 (8 毫摩尔 ) 引入到在无水氮气氛 下的双颈烧瓶中。然后将溶液冷却至 0℃并且分小份地加入 3.793g 对甲苯磺酰氯 (2.5 当 量， 20 毫摩尔 )。使反应介质返回到环境温度， 然后搅拌 10 小时。然后通过加入 10mL 甲醇 停止该反应， 维持搅拌 30 分钟。 向混合物加入 50mL CH2Cl2， 然后它依次用 20 毫升 5%NaHCO3 溶液、 20 毫升 NaCl 饱和溶液和 20 毫升 5% NaHCO3 溶液洗涤。在减压下去除该溶剂。期望 的化合物通过在甲醇中的重结晶而获得。如此分离出 2.1g 白色产物。
RF: 0.37(AcOEt/MeOH 9/1) 收率 : 63%。
制备 3 5'- 叠氮基 -5'- 脱氧胸苷将为在 DMF 中 0.1M 溶液形式的 2g 如在制备 1 中描述的 5'- 对甲苯磺酰基胸苷 (5 毫 摩尔 ) 引入到在无水氮气氛下的装备有冷凝器的双颈烧瓶中。 加入 1.3g 叠氮化钠 (4 当量， 20 毫摩尔 )。然后搅拌该溶液并且在 110℃加热 10 小时。将该混合物冷却至环境温度。将 50mL CH2Cl2 加入到混合物中， 然后它连续地用两次 15mL 水然后用 15mL NaCl 饱和水溶液 洗涤。有机相在硫酸钠上干燥然后在减压下去除溶剂。期望的化合物通过在甲醇中的重结 晶而获得。如此获得 0.8 克白色固体。
RF: 0.47(AcOEt/MeOH 9/1) 收率 : 60%MS[M+H]+: 268.1。
制备 4 5'- 叠氮基 -5',2'- 二脱氧腺苷将在 DMF 中 0.1M 溶液形式的 2g 如在制备 2 中描述的 2'- 脱氧 -5'- 对甲苯磺酰基腺 苷引入到在无水氮气氛下的装备有冷凝器的双颈烧瓶中。加入 1.3g 叠氮化钠 (4 当量， 20 毫摩尔 )。然后搅拌该溶液并且在 110℃加热 10 小时。然后将该混合物冷却至环境温度。 将 50mL CH2Cl2 加入到混合物中， 然后它连续地用两次 15mL 水然后用 15mL NaCl 饱和水溶 液洗涤。有机相在硫酸钠上干燥然后在减压下去除溶剂。期望的化合物通过在甲醇中的重 结晶而获得。如此获得 0.8 克白色固体。
RF: 0.37(AcOEt/MeOH 9/1) 产率 : 60% 高解析 MS[M+H]+: 计算质量 :277.1161， 测量质量 : 277.1157。
制备 5 1- 炔丙氧基十八烷将在 DMF 中 0.5M 溶液形式的 673mg 炔丙醇 (12 毫摩尔 ) 引入到在无水氮气氛下的清 洁干燥烧瓶中。 然后将溶液冷却至 0℃并且分小份地加入 180mg 氢化钠 (0.625 当量， 7.5 毫 摩尔 )。使该反应介质返回到环境温度。加入 2g 1- 溴 - 十八烷 (0.5 当量， 6 毫摩尔 )。维 持搅拌 5 小时。然后通过加入 10mL 甲醇停止该反应并且维持搅拌 30 分钟。将 50mL CH2Cl2 加入到混合物中， 然后它连续地用两次 20mL 水和 20mL NaCl 饱和水溶液进行洗涤。有机相 在硫酸钠上干燥然后在减压下去除溶剂。在色谱柱上 ( 己烷 ) 分离后获得期望化合物。如 此分离出 1.2g 白色产物。 RF: 0.82( 己烷 ) 收率 : 65% NMR1H(300.13MHz， CDCl3): δ0.90(t， j =6Hz， 3H， CH3)， δ1.28(s， 3OH， CH2)， δ1.61(m， 2H， CH2)， δ2.43(t， j =3Hz， 1H， CH)， δ3.53(t， j =6Hz， 2H， CH2)， δ4.15(d， j =3Hz， 2H， CH2). 13 13 NMR C(75.47MHz， CDCl 3) NMR C(75.47MHz， CDCl 3): δ14.2(CH2)， δ22.7(CH2)， δ 29.4(CH 2) ， δ 29.5(CH 2) ， δ 29.6(CH 2) ， δ 32.0(CH 2) ， δ 58.0(CH 2) ， δ 26.1(CH 2) ， δ70.4(CH2)， δ74.1(CH)， δ80.1(C)。
制备 6
1,12- 炔丙氧基十二烷 12- 炔丙氧基十二烷 -1- 醇 将在 DMF 中 0.5M 溶液形式的 1g 十二烷 -1,12- 二醇 (5 毫摩尔 ) 引入到在无水氮气氛 下的清洁干燥烧瓶中。然后将溶液冷却至 0℃并且分小部分地加入 360mg 氢化钠 (hydrure d’ hydrogène)(3 当量， 15 毫摩尔 )。使该反应介质返回到环境温度。加入 1.49g 溴丙炔 (2.5 当量， 12.5 毫摩尔 )。维持搅拌 5 小时。然后通过加入 10mL 甲醇停止该反应， 维持搅 拌 30 分钟。将 50mL CH2Cl2 加入到混合物中， 然后它连续地用两次 20mL 水和 20mL NaCl 饱 和水溶液进行洗涤。有机相在硫酸钠上干燥然后在减压下去除溶剂。然后在色谱柱 ( 己烷 /ActEth 9/1) 上分离获得的产品。分离两种产品， 即 370mg 对应于 1,12- 炔丙氧基十二烷 的棕色油状物和 430mg 对应于 12- 炔丙氧基十二烷 -1- 醇的棕色固体。
1,12- 炔丙氧基十二烷RF: 0.53( 己烷 /AcOtEt 9/1) 收率 : 27% NMR1H(300.13MHz， CDCl3): δ1.31(m， 16H， CH2)， δ1.61(m， 4H， CH2)， δ2.43(t， j =3Hz， 1H， CH), δ3.52(t， j =6Hz， 4H， CH2)， δ4.15(d， j =3Hz， 4H， CH2). 13 NMR C(75.47MHz， CDCl3): δ26.1(CH2)， δ29.4(CH2)， δ29.5(CH2)， δ29.6(CH2)， δ58.0(CH2)， δ70.3(CH2)， δ74.1(CH)， δ80.1(C)。
12- 炔丙氧基十二烷 -1- 醇RF: 0.10( 己烷 /AcOtEt 9/1) 收率 : 36% NMR1H(300.13MHz， CDCl3): δ1.32(m， 16H， CH2)， δ1.59(m， 4H， CH2)， δ2.43(t， j =3Hz， 2H， CH)， δ3.52(t， j =6Hz， 2H， CH2)， δ3.65(t， j =6Hz， 2H， CH2)， δ4.15(d， j =3Hz， 2H， CH2). 13 NMR C(75.47MHz， CDCl3): δ25.8(CH2)， δ26.0(CH2)， δ29.4(2CH2)， δ29.5(2CH2)， δ 29.6(CH 2) ， δ 32.7(CH 2) ， δ 57.9(CH 2) ， δ 62.7(CH 2) ， δ 70.2(CH 2) ， δ 74.2(CH) ， δ79.9(C)。
制备 7 o - 炔丙基胆甾醇将在 DMF 中 0.5M 溶液形式的 500mg 胆甾醇 (1.3 毫摩尔 ) 引入到在无水氮气氛下的清洁干燥烧瓶中。然后将溶液冷却至 0℃并且分小部分地加入 47mg 氢化钠 (1.5 当量， 2 毫摩 尔 )。使该反应介质返回到环境温度， 加入 238 毫克溴丙炔 (1.5 当量， 2 毫摩尔 )。维持搅 拌 5 小时。然后通过加入 10mL 甲醇停止该反应并且维持搅拌 30 分钟。将 50mL CH2Cl2 加 入到混合物中， 然后它连续地用两次 20mL 水和 20mL NaCl 饱和水溶液进行洗涤。有机相在 硫酸钠上干燥然后在减压下去除溶剂。在色谱柱上 ( 己烷 /AcOEt 8/2) 纯化后获得期望化 合物。如此分离出 215mg 白色产物。
RF: 0.83( 己烷 /AcOEt 8/2) 收率 : 39%。
实施例 1 胸苷 3'-(1,2- 二肉豆蔻酰 -sn - 丙三氧基 -3- 磷酸酯 )(di c14dT)在 氮 气 下， 将 5'-O-(4,4'- 二 甲 氧 基 三 苯 甲 基 )-2'- 脱 氧 胸 苷 ,3'-[(2- 氰 基 - 乙 基 )-N,N- 二异丙基 )] 亚磷酰胺 (0.500g， 1 当量， 0.67 毫摩尔 )， 1,2- 二肉豆蔻酰 -sn - 丙 三醇 (0.447g， 1.3 当量， 0.87 毫摩尔 ) 和在乙腈中 0.45M 四唑溶液 (2mL， 1.3 当量， 0.87 毫 摩尔 ) 溶于 4mL 无水乙睛中。在环境温度下磁力搅拌该反应介质 24 小时。然后通过加入 43mL 在 THF/Pyr/H2O 中 0.02M I2 溶液氧化该混合物。 在环境温度下 12 小时后， 在真空下将 溶剂蒸发掉。将残留物溶于 8 毫升二氯甲烷中。然后， 在 5 小时期间将 0.2 毫升的 1,5- 二 氮杂双环 [5.4.0] 十一 -7- 烯 (DBU)(1.3 当量， 0.87 毫摩尔 ) 加入到该反应介质中。反应 介质用 0.1N 的 HCl 溶液然后用 Na2S2O7 饱和溶液洗涤。有机相在真空下进行浓缩。通过快 速色谱分离法 (381mg) 使用洗脱梯度 (MeOH/DCM 9:1-1:1) 纯化后获得化合物。
产率 : 69% RF: 0.34(DCM/MeOH 9:1) NMR1H (300MHz， CDCl3): δ(ppm)0.84(t， 6H， J=6.92Hz， 2*CH3)， 1.21(m， 40H， 20*CH2)， 1.42(dd， 4H， J1=8.45Hz， J2=15.68Hz， 2*CH2)， 1.89(s， 3H， Me)， 2.30(dd， 4H， J1=7.43Hz， J2=15.92Hz， 2*CH2)， 2.83(t， 2H， J=5.84， H2')， 3.84(m， 1H， H3')， 4.09-4.35(m， 7H， 2*CH2( 丙 三醇 )， H4'， H5')， 5.27(s， 1H， CH 丙三醇 )， 6.22(t， 1H， J=6.81Hz， H1')， 7.61(s， 1H， Hbase). 13 NMR C(75MHz， CDCl 3): δ(ppm)19.29(CH 3)， 23.71(CH2)， 26.57(CH 2)， 28.73(CH 2)，32.76(CH2)， 37.85(CH2)， 48.90(CH2)， 166.15(C=O). 31 NMR P(121MHz， CDCl3): δ(ppm)0.61. 高解析率 FAB 质谱 - 理论 m/z=815.4823 观测 m/z=815.4794。
实施例 2 胸苷 3'-(1,2- 二棕榈酰 -sn - 丙三氧基 -3- 磷酸酯 )(di c16dT)在 氮 气 下， 将 5'-O-(4,4'- 二 甲 氧 基 三 苯 甲 基 )-2'- 脱 氧 胸 苷， 3'-[(2- 氰 基 - 乙 基 )-N,N- 二异丙基 )] 亚磷酰胺 (0.500g， 1 当量， 0.67 毫摩尔 )， 1,2- 二棕榈酰 -sn - 丙三 醇 (0.496g， 1.3 当量， 0.87 毫摩尔 / 溶解在 3mL THF 中 ) 和在乙腈中 0.45M 四唑溶液 (2mL， 1.3 当量， 0.87 毫摩尔 ) 溶于 3mL 无水乙睛中。 在环境温度下和在氮气下磁力搅拌该反应介 质 24 小时。然后通过加入 43mL 在 THF/Pyr/H2O 中 0.02M I2 溶液氧化该混合物。在环境温 度下 12 小时之后， 在真空下将溶剂蒸发掉并且使用泵在 P2O5 下干燥过夜。将残留物溶于 8 毫升二氯甲烷中。然后， 在 5 小时期间将 0.2 毫升的 1,5- 二氮杂双环 [5.4.0] 十一 -7- 烯 (DBU)(1.3 当量， 0.87 毫摩尔 ) 加入到该反应介质。反应介质用 0.1N 的 HCl 溶液然后用 Na2S2O3 饱和溶液洗涤。有机相在真空下进行浓缩。通过快速色谱分离法 (180mg) 使用洗脱 梯度 (MeOH/DCM 98:2-1:1) 纯化后获得化合物。
产率 : 24% RF: 0.3(DCM/MeOH 8:2) NMR1H(300MHz， CDCl3): δ(ppm)0.88(t， 6H， J=6.9Hz， 2*CH3)， 1.25(m， 48H， 24*CH2)， 1.42(dd， 4H， J1=8.4Hz， J2=15.6Hz 12*CH2)， 1.90(s， 3H， Me)， 2.33(m， 4H， 2*CH2)， 2.83(t， 2H， J=5.6Hz， H2')， 3.84(m， 1H， H3')， 4.09-4.35(m， 7H， 2*CH2( 丙三醇 )， H4'， H5')， 5.27(s， 1H， CH 丙三醇 )， 6.21(t， 1H， J=6.7Hz， HT)， 7.54(s， 1H， Hbase). 13 NMR C(75MHz， CDCl3): δ(ppm)12.4(CH3base)， 14.1(CH3 链 )， 19.6(CH2)， 19.7(CH2)， 22.6(CH 2) ， 24.8(CH 2) ， 29.1-29.6(CH 2) ， 31.9(CH 2) ， 33.9(CH 2) ， 34.1(CH 2) ， 61.5(CH 2) ， 61.7(CH2)， 62.5(CH2)， 62.6(CH2)， 66.1(CH2)， 66.2(CH2)， 69.1(CH)， 78.8(CH)， 85.5(CH)， 86.1(CH)， 111.3(Cbase)， 136.8(CHbase)， 150.5(C=Obase)， 164.1(C=Obase)， 173.0(C=O 链 )， 173.5(C=O 链 ).NMR31P(121MHz， CDCl3): δ(ppm)2.1. 质谱 ESI-: 理论 m/z=872.5 观测 m/z=871.3。
实施例 3 5'-(4- 十六烷氧基甲基 -[1,2,3] 三唑 -1- 基 )-5',2' 二脱氧胸苷将 200mg 如在制备 3 中描述的 5'- 叠氮基 -5'- 脱氧胸苷 (0.75 毫摩尔 ) 和 231mg 为 0.1M 溶液 ( 在 THF 和水的混合物 (1/1) 中 ) 形式的如在制备 5 中描述的 1- 炔丙氧基十八 烷 (1 当量 ) 引入烧瓶中。然后， 依次加入以下 : 30 毫克的抗坏血酸钠 (0.2 当量， 0.15 毫 摩尔 ) 和 12 毫克的硫酸铜 (0.1 当量， 0.075 毫摩尔 )。搅拌该反应介质并且在 60℃加热 5 小时。然后将该混合物冷却至环境温度。该反应介质立即被吸附到二氧化硅上， 并且蒸发 除去溶剂。在二氧化硅柱上色谱分离法 (AcOEt/MeOH 8/2) 之后获得 180 毫克白色固体。
RF: 0.72(AcOEt/MeOH 8/2) 收率 : 42% 高解析 MS[M+H]+: 计算质量 : 576.4125， 测量质量 :576.4120。
实施例 4 5'-(4- 十六烷氧基甲基 -[1,2,3] 三唑 -1- 基 )-5',2'- 二脱氧腺苷将 200mg 如在制备 4 中描述的 5'- 叠氮基 -5',2'- 二脱氧腺苷 (0.72 毫摩尔 ) 和 223mg 为 0.1M 溶液 ( 在 THF 和水的混合物 (1/1) 中 ) 形式的如在制备 5 中描述的 1- 炔丙氧基 十八烷 (1 当量 ) 引入烧瓶中。 然后， 依次加入以下 : 30 毫克的抗坏血酸钠 (0.2 当量， 0.15 毫摩尔 ) 和 12 毫克的硫酸铜 (0.1 当量， 0.075 毫摩尔 )。搅拌该反应介质并且在 60℃加热 5 小时， 然后将混合物冷却至环境温度。该反应介质立即被吸附到二氧化硅上， 并且蒸发去 掉溶剂。在柱色谱分离法 (AcOEt/MeOH 8/2) 之后获得 150 毫克白色固体。RF: 0.65(AcOEt/MeOH 8/2) 收率 : 35% NMR1H(300.13MHz， CDCl3): δ0.89(t， j =6Hz， 3H， CH3)， δ1.26(m， 3OH， CH2)， δ1.55(m， 2H， CH2)， δ2.54(m， 1H， CH2)， δ3.06(m， 1H， CH2)， δ3.45(t， j =6Hz， 2H， CH2)， δ4.50(m， 4H， CH2， CH)， δ4.89(m， ???)， δ5.88(s， 2H， NH2)， δ6.40(t， j =6Hz， 1H， CH)， δ7.42(s， 1H， CH)， δ7.81(s， 1H， CH)， δ8.35(s， 1H， CH). + 高解析 MS[M+H] : 计算质量 :585.4241， 测量质量 : 585.4254。
实施例 5 5'-(4-((O- 胆甾烯基 )- 甲基 )-[1,2,3] 三唑 -1- 基 )-5',2' 二脱氧胸苷将 170 毫克如在制备 3 中描述的 5'- 叠氮基 -5'- 脱氧胸苷 (0.63 毫摩尔 ) 和 270 毫 克为在 THF/ 水混合物 (1/1) 中 0.1M 溶液形式的如在制备 7 中描述的 o- 炔丙基胆甾醇 (1 当量 ) 引入到在烧瓶中。依次加入以下 : 20mg 抗坏血酸钠 (0.2 当量， 0.13 毫摩尔 ) 和 10 毫克硫酸铜 (0.1 当量， 0.063 毫摩尔 )。搅拌该反应介质并且在 60℃加热 5 小时。然后将 该混合物冷却至环境温度。该反应介质立即被吸附到二氧化硅上， 并且蒸发掉溶剂。通过 柱色谱分离法 (AcOEt/MeOH 8/2) 获得纯化合物。获得 260 毫克白色固体。
RF: 0.57(AcOEt/MeOH 8/2) 收率 : 59% MS[M+H]+: 692.3。
实施例 6 1,12- 双 -[5'-(4-( 甲基 )-[1,2,3] 三唑 -1- 基 )-5',2' 二脱氧胸苷 ]- 氧基十二烷将 100 毫克如在制备 3 中描述的 5'- 叠氮基 -5'- 脱氧胸苷 (0.375 毫摩尔 ) 和 52 毫克为在 THF/ 水混合物 (1/1) 中的 0.1M 溶液形式的由在制备 6 中描述的化合物制备的 1,12- 二炔丙氧基十二烷 (0.5 当量 ) 引入到在烧瓶中。依次加入以下 : 15 毫克的抗坏血 酸钠 (0.2 当量， 0.075 毫摩尔 ) 和 6 毫克的硫酸铜 (0.1 当量， 0.0375 毫摩尔 )。搅拌该反 应介质并且在 60℃加热 5 小时。然后将该混合物冷却至环境温度。该反应介质立即被吸附 到二氧化硅上， 并且蒸发掉溶剂。通过柱色谱分离法 (AcOEt/MeOH 8/2) 获得纯化合物。获 得 90 毫克白色固体。
收率 : 59% 1 NMR H(300.13MHz， MeOHd4): δ1.28(m， 16H， CH2)， δ0.83(m， 4H， CH2)， δ1.89(s， 6H， CH3)， δ2.17(s， 2H， CH2)， δ2.25(m， 4H， CH2)， δ3.51(t， j =6Hz， 4H， CH2)， δ4.18(m， 2H， CH) δ4.42(m， 2H， OH) δ4.58(s， 4H， CH2)， δ4.76(qd， j =6Hz， 4H， CH2)， δ6.21(t， j =6Hz， 2H， CH)， δ7.23(s， 2H， CH)， δ7.99(s， 2H， CH)。
实施例 7 5'-(4-(1(R )- 羟基 - 己基 )-[1,2,3] 三唑 -1- 基 )-5',2' 二脱氧胸苷将 215mg 如在制备 3 中描述的 5'- 叠氮基 -5'- 脱氧胸苷 (0.8 毫摩尔 ) 和 101.5 毫克 为在 THF/ 水混合物 (1/1) 中的 0.1M 溶液形式的 (R) 辛 -1- 炔 -3- 醇 (1 当量 ) 引入在烧 瓶中。依次加入以下 : 31.5 毫克的抗坏血酸钠 (0.2 当量， 0.15 毫摩尔 ) 和 13 毫克的硫酸 铜 (0.1 当量， 0.075 毫摩尔 )。搅拌该反应介质并且在 60℃加热 5 小时。然后将该混合物 冷却至环境温度。然后该反应介质立即被吸附到二氧化硅上， 并且蒸发掉溶剂。通过柱色 谱分离法 (AcEt/MeOH 9/1) 获得纯化合物。获得 240 毫克白色固体。
RF: 0.48(AcEt/MeOH 9/1) 收率 : 76% 测量质量 :576.4120。 高解析 MS[M+H]+: 计算质量 :576.4125，
实施例 85'-(4-(1-(S) - 羟基 - 己基 )-[1,2,3] 三唑 -1- 基 )-5',2' 二脱氧胸苷将 215mg 如在制备 3 中描述的 5'- 叠氮基 -5'- 脱氧胸苷 (0.8 毫摩尔 ) 和 101.5 毫克 为在 THF/ 水混合物 (1/1) 中的 0.1M 溶液形式的 (S) 辛 -1- 炔 -3- 醇 (1 当量 ) 引入在烧 瓶中。依次加入以下 : 31.5 毫克的抗坏血酸钠 (0.2 当量， 0.15 毫摩尔 ) 和 13 毫克的硫酸 铜 (0.1 当量， 0.075 毫摩尔 )。搅拌该反应介质并且在 60℃加热 5 小时。然后将该混合物 冷却至环境温度。然后该反应介质立即被吸附到二氧化硅上， 并且蒸发掉溶剂。通过柱色 谱分离法 (AcOEt/MeOH 85/15) 获得纯化合物。获得 255 毫克白色固体。
RF: 0.48(AcOEt/MeOH 85/15) 收率 : 78% 高解析 MS[M+H]+: 计算质量 :576.4125， 测量质量 :576.4120。
实施例 9 5'-(4-(1- 羟基 - 己基 )-[1,2,3] 三唑 -1- 基 )-5',2' 二脱氧腺苷将 200mg 如在制备 3 中描述的 5'- 叠氮基 -5'- 脱氧胸苷 (0.75 毫摩尔 ) 和 95 毫克为 在 THF/ 水混合物 (1/1) 中 0.1M 溶液形式的辛 -1- 炔 -3- 醇的外消旋混合物 (1 当量 ) 引 入到烧瓶中。依次加入以下 : 30 毫克的抗坏血酸钠 (0.2 当量， 0.15 毫摩尔 ) 和 12 毫克的 硫酸铜 (0.1 当量， 0.075 毫摩尔 )。搅拌该反应介质并且在 60℃加热 5 小时。然后将该混 合物冷却至环境温度。该反应介质立即被吸附到二氧化硅上， 并且蒸发掉溶剂。通过柱色 谱分离法 (AcOEt/MeOH 8/2) 获得纯化合物。获得 240 毫克白色固体。 RF: 0.47(AcOEt/MeOH 8/2) 产率 : 80% 高解析 MS[M+H]+: 计算质量 :576.4125， 测量质量 :576.4120。
实施例 10: 制备具有多隔室的纳米颗粒 在实施例 2 中制备的化合物胸苷 3'-(1,2- 二棕榈酰 -sn- 丙三氧基 -3- 磷酸酯 ) (di C16 dT) 用作阴离子型式 (I) 化合物， 二油基磷脂酰胆碱 (DOPC) 用作共类脂和如在
Pauline Chabaud 等， Bioconjugate Chem.， 2006， 17， 466-472 描述地进行制备的化合物 (N-[5'-(2',3'- 二油酰基 ) 尿苷 ]-N',N',N'- 三甲基铵甲苯磺酸盐 )(DOTAU) 用作阳离子 型式 (I) 化合物。
1) 制备母液-a) 制备顺铂溶液 将 15 毫克顺铂溶解在 10mL milliQ 水 ( 终浓度 : 5mM) 中。搅拌这种悬浮液 1 分钟 ( 涡旋 )， 然后在 37℃温育 24 小时。
-b) 制备类脂溶液 溶液 A: 将 20mg di C16 dT 溶解在 2mL 二氯甲烷 (10mg/mL) 中。这种样品在 -20℃储 存。
溶液 B: DOPC: 在 -20℃储存的在二氯甲烷中的 20 毫克 / 毫升溶液。
溶液 C: DOTAU: 在 -20℃储存的在二氯甲烷中的 20mg/mL 溶液。
2) 用于第一层的类脂配制剂的制备在 2 毫升 Eppendorf® 试管中使 52.3μL 溶液 A 与 47.2μL 溶液 B 混合。这些体积对 应于 1/1 的两种类脂的摩尔比。
在氮气下蒸发掉二氯甲烷以获得均匀的类脂膜。
3) 纳米颗粒的制备 ( 第一阴离子型类脂层 )使用 1.2 毫升在 37℃预先温育的顺铂溶液以再水合该预先制备的类脂膜。在环境温 度下温育该混合物过夜。进行一系列 10 个加热 (55℃水浴 ) 和冷冻 ( 干冰 / 甲醇 -72℃ ) 周期。
4) 洗涤并且回收包含第一阴离子型类脂层的纳米颗粒一旦完成一系列 10 个周期， 搅拌该悬浮液并且放置在玻璃溶血管中， 然后使其经受超 声处理 7 分钟。在超声处理后， 以 10000rpm/5min/20℃离心该悬浮液。丢弃上清液， 并且将 纳米颗粒沉淀物再悬浮在 1mL MilliQ 水中。再次重复该步骤。
以 1000rpm/2.5min/20℃离心该悬浮液。丢弃沉淀物并且该上清液包含阴离子型 纳米颗粒。
根据描述在 Andrea Mayer 等 Toxicology， 2009， 258， 139-147 或 K. Furusawa 和 K. Uchiyama， 1988， 140， 217-226 中的技术测量的 ζ 电位 (potential zeta) 为 -43.3+6mV。
5) 制备包含第一阴离子型类脂层和第二阳离子型类脂层的纳米颗粒使 180μL 溶液 C 沉积在 2 毫升 Eppendorf® 管中。使用压缩氮气将二氯甲烷蒸发掉以 获得均匀的类脂膜。
6) 洗涤并且回收具有多隔室的纳米颗粒 ( 阳离子型表层 )使用在步骤 4) 中制备的阴离子型纳米颗粒的悬浮液再水合阳离子型类脂膜。
进行涡旋搅拌 5 分钟然后超声处理一分钟。
在 20℃以 10000rpm 离心该悬浮液 5 分钟以除去未与纳米颗粒连接的类脂。去除 上清液， 然后使用 1mL MilliQ 水使沉淀物再水合。
以 1000rpm/2.5min/20℃离心该悬浮液。丢弃沉淀物和上清液包含具有阳离子型 表面层的多隔室纳米颗粒。
如先前测量的 ζ 电位为 42.3+8mV。实施例 11: 稳定性试验 ( 释放的顺铂 %) 根据实施例 10 的操作方式制备的纳米颗粒通过 ICP 光谱法进行测定 ( 测定值对应于 总浓度 )。将纳米颗粒的悬浮液等分到 5 个 Eppendorf® 管 (150μL) 中。在 37℃在搅拌下 (300rpm) 温育后者持续不同时间段 (0， 2.5， 5， 10 和 24 小时 )。
在给定时间 (x)， 以 14000rpm/10min/20℃离心该管并且测定 50μL 的上清液 ( 小 心地回收以免再悬浮该沉淀物 )。
作为对比， 根据相同的操作方式制备基于 1,2- 二油酰基 -sn- 丙三氧基 -3-[ 二氧 磷基 -L- 丝氨酸 ](DOPS) 与 1,2- 二油酰基 -sn- 丙三氧基 -3- 磷酰胆碱 (DOPC)( 作为共类 脂 ) 的纳米颗粒。这些纳米颗粒包括单个阴离子型类脂层。
顺铂的释放百分比根据以下方程式进行计算 : 释放的顺铂 %=Cx-C0/Ct-C0 Cx ： 在给定时间点 (x) 存在的浓度。
C0 ： 在温育之前在上清液中存在的浓度。
Ct ： 不温育和不离心时存在的总浓度。
顺铂作为温育时间的函数的释放曲线显示在图 1 中。 在实施例 10 的步骤 4 结束时获得的包含单个阴离子型类脂层的纳米颗粒 ( 标示 为 NP-) 用符号 - ◆ - 表示， 在实施例 10 的步骤 6 结束时获得的包含第一阴离子型类脂层 和第二阳离子型类脂层的根据本发明的纳米颗粒 ( 标示为 NP+) 用符号 - ■ - 表示和基于 DOPC/DOPS 的纳米颗粒 ( 标示为 PS) 用符号 - ▲ - 表示。
结果显示， 对于根据本发明的 NP+ 纳米颗粒， 该半寿期 ( 为释放 50% 顺铂所必需的 温育时间 ) 大于 24 小时， 而对于基于 DOPC/DOPS 的纳米颗粒为约 6.5 小时。
而且， 在相同的温育时间 (6.5 小时 ) 之后， 可以看出纳米颗粒 NP-( 单层 ) 已经释 放它们的顺铂含量的 30% 以上， 而根据本发明的 NP+ 纳米颗粒已经释放它们的顺铂的 20% 以下， 这显示了在 37℃时 NP+ 纳米颗粒的显著稳定性。
实施例 12: 在胎牛血清存在时稳定性试验 ( 释放顺铂 %) 根据实施例 10 的操作方式制备的纳米颗粒通过 ICP 光谱法 (ICP optique) 进行测定 ( 测定值对应于总浓度 )。将纳米颗粒的悬浮液等分在 5 个 Eppendorf® 管 (150μL) 中。 在 20℃使后者在 10000rpm 离心 5min。通过 ICP 光谱法测定 50μL 上清液并且分离剩余的 100μL。使用 150μL 胎牛血清 (SVF， ref Invitrogen10270-106) 再水合该包含纳米颗粒 的沉淀物。在 37℃在搅拌 (300rpm) 下温育样品达不同时间段 (0， 2.5， 5， 10 和 24 小时 )。
在给定时间点 (x)， 以 14000rpm/10min/20℃离心该管并且测定 50μL 上清液 ( 小 心地回收以便不使该沉淀物再悬浮 )。
作为对比， 根据相同的操作方式制备基于 1,2- 二油酰基 -sn- 丙三氧基 -3-[ 二氧 磷基 -L- 丝氨酸 ](DOPS) 与 1,2- 二油酰基 -sn- 丙三氧基 -3- 磷酰胆碱 (DOPC)( 作为共类 脂 ) 的纳米颗粒。
顺铂的释放百分比根据以下方程式进行计算 : 释放的顺铂 %=Cx-C0/Ct-C0 Cx: 在给定时间 (x) 存在的浓度。
C0: 在温育之前和在与 SVF 接触之前在上清液中存在的浓度。
Ct: 不温育和不离心时存在的总浓度。
顺铂作为温育时间的函数的释放曲线显示在图 2 中。
在实施例 10 中获得的包含第一阴离子型类脂层和第二阳离子型类脂层的根据本 发明的纳米颗粒 ( 标示为 NP+) 用符号 - ■ - 表示和基于 DOPC/DOPS 的纳米颗粒 ( 标示为 PS) 用符号 - ▲ - 表示。
结果显示， 对于根据本发明的 NP+ 纳米颗粒， 该为释放 90% 顺铂所必需的温育时间 大于 24 小时， 而对于基于 PS 纳米颗粒其为低于 2 小时。
实施例 13: 细胞内顺铂的测定 操作方式 80% 汇合 (10cm 直径皿 (boîte)) 的 IGROV1 细胞 ( 对顺铂敏感的卵巢腺癌系 ) 用 100μM 游离顺铂或封装在实施例 10 的纳米颗粒中的顺铂处理 2、 4 或 6 小时。在完成该处理后， 使 用 PBS 进行两次洗涤处理。细胞用胰蛋白酶处理并且再悬浮在 PBS 中。进行使用 PBS 两次 洗涤细胞悬浮液 ( 离心 1000rpm/1 分钟 )。将细胞悬浮在 1mL PBS 中并且计数。
使用 SKV03 细胞进行相同的过程 ( 抗顺铂的卵巢腺癌系 )。
ICP 光谱 (ICP-optique) 测定 使用 500μL 细胞溶解溶液 ( 来自 SIGMA 的溶胞缓冲液 ) 溶解 106 个细胞。使用具有 1% HNO3 酸的 MilliQ 水使该体积补充至 5mL。
结果 在图 3 中表示结果， 其显示作为时间函数的在细胞溶解之后释放的顺铂的浓度 ( 用纳 6 摩尔 /10 细胞 /100μM 处理来表示 )， 对应于在处理细胞中内部化顺铂的浓度。
垂直 ( 在左边 )、 水平 ( 居中 ) 和方格 ( 在右边 ) 画影线的柱对应于分别地在 2 小 时、 4 小时和 6 小时期间的细胞处理。
结果显示， 在实施例 10 中获得的包含第一阴离子型类脂层和第二阳离子型类脂 层的根据本发明的纳米颗粒 ( 标示为 NP+) 存在时顺铂的内在化是比在 PS 纳米颗粒和游离 顺铂的情况下是明显更有效的。
例如， 在相同条件 (106 个 IGROV1 细胞， 100μM， 2 小时 ) 下， 0.5 纳摩尔顺铂在游 离顺铂的情况下被内在化 (internalisé)， 而在根据本发明的纳米颗粒 NP+ 的情况下该内 在化 (20 纳摩尔 ) 为 40 倍 ( 图 3A)。
关于抗顺铂的 SKOV3 细胞系， 在相同条件下 (106 个 SKOV3 细胞， 100μM， 2 小时 )， 在根据本发明的纳米颗粒 NP+ 的情况下内在化 (30 纳摩尔 ) 为在游离顺铂的情况下 (0.5 纳摩尔 ) 的 60 倍 ( 图 3B)。
实 施 例 14: 具 有 多 隔 室 的 纳 米 颗 粒 对 不 同 肿 瘤 系 的 细 胞 毒 素 效 果 (effets cytotoxiques) 的研究 操作方式a/ 细胞的制备和处理 :该研究在于对一组肿瘤系 (un panel de lignées tumorales) 测定抑制 50% 细胞增殖 的浓度 (IC50)， 即 - 对顺铂敏感的 A2780( 人卵巢癌上皮细胞瘤 ) 和抗顺铂的 A2780/CisPt ( 人卵巢癌上 皮细胞瘤 )- 对顺铂敏感的 IGROV-1( 人卵巢癌 ) 和抗顺铂的 IGROV-1/CisPt( 人卵巢癌 ) - 对顺铂敏感的 L1210( 小鼠淋巴细胞性白血病 ) 和抗顺铂的 L1210/CisPt( 小鼠淋巴 细胞性白血病 )( 人白血病 ) -NIH:OVCAR3( 卵巢癌 )， 和 -P388( 小鼠淋巴瘤 )。
在 96 孔板中， 使每孔 2500 个细胞 ( 卵巢腺癌系， 等等 ) 在 100μL 具有血清的培 养基中进行温育。在 24 小时之后吸出该培养基并且细胞用在 100μL 无血清的培养基中不 同浓度 (500， 100， 10， 1， 0.1， 0.01， 0.001μM) 的游离顺铂或封装在实施例 10 的纳米颗粒中 的顺铂处理。在处理 24 小时之后， 除去培养基并且细胞用 100μL PBS 洗涤两次然后使用 100μL 具有血清的培养基进行温育。
b/ 毒性的揭示 :在两次洗涤之后 48 小时， 细胞成活力通过加入 20μL MTS 进行揭示。在 490nm 的吸光 度在 37℃温育 2-4 小时之后进行测量。吸光度与细胞成活力成正比例。
c/ 结果 :结果在图 4 中显示， 图 4 显示使用游离顺铂 ( 在左边的淡灰色柱 ) 或使用在实施例 10 的步骤 6 结束时获得的包含顺铂的包括第一阴离子型类脂层和第二阳离子型类脂层的根 据本发明的纳米颗粒 ( 标示为 NP+)( 在右方的深灰色柱 ) 为了获得 50% 细胞死亡所必需的 浓度 (IC50)。
结果显示， 在所有研究的对顺铂敏感的或抗顺铂的细胞系中根据本发明的纳米颗 粒是比游离顺铂更有效的。
例如， 在对顺铂敏感的细胞系 A2780 的情况下， 使用 0.23μM 根据本发明的纳米颗 粒获得 50% 细胞死亡， 而为获得相同的死亡率必须使用 4.68μM 游离顺铂。
对抗顺铂的 A2780 系使用 0.21μM 根据本发明的纳米颗粒获得 50% 细胞死亡， 相 反地则要使用 29.21μM 游离顺铂。在这种情况下， 对敏感性 A2780 系和抵抗性 A2780 系， 根据本发明的纳米颗粒的效力分别地是游离顺铂的 18 和 140 倍。
实施例 15: 具有多隔室的纳米颗粒对 IGROV-1 和 SKOV3 肿瘤系的细胞毒素效果的 研究 操作方式a/ 细胞的制备和处理 :在 96 孔板中使每孔 2500 个细胞 (IGROV1、 SKOV3、 卵巢腺癌系 ) 在 100μL 具有血清的 培养基中进行温育。在 24 小时之后吸出该培养基并且细胞用在 100μL 无血清的培养基中 不同浓度 (500， 100， 10， 1， 0.1， 0.01， 0.001μM) 的游离顺铂或封装在实施例 10 的纳米颗粒 中的顺铂处理。在处理 24 小时之后， 除去培养基并且细胞用 100μL PBS 洗涤两次然后使 用 100μL 具有血清的培养基进行温育。
b/ 毒性的揭示 :在该两次洗涤之后 48 小时， 细胞成活力通过加入 20μL MTS 揭示。在 490nm 的吸光度 在 37℃温育 2-4 小时之后进行测量。吸光度与细胞成活力成正比例。
c/ 结果 :在图 5 中显示结果， 其显示为获得 50% 细胞死亡所必需的浓度 (IC50)， 其中分别使用游离顺铂 ( 柱 1， 在左边 )、 基于 DOPC/DOPS 的对照纳米颗粒 ( 标示为 PS)( 柱 2， 中间靠左边 )、 在实施例 10 的步骤 4 结束时获得的包含唯一阴离子型类脂层的纳米颗粒 ( 标示为 NP-)( 柱 3， 中间靠右边 ) 和在实施例 10 的步骤 6 结束时获得的包含第一阴离子型类脂层和第二阳 离子型类脂层根据本发明的纳米颗粒 ( 标示为 NP+)( 右方的柱 )。
图 5A 涉及 IGROV1 细胞系和图 5B 涉及 SKOV3 细胞系。
结果表明， 在 IGROV1( 对顺铂敏感的 ) 和 SKOV3( 抗顺铂的 ) 两个细胞系中， 根据 本发明的包含顺铂的纳米颗粒 NP+ 是比游离顺铂更有效的。
对 IGROV1 细胞系， 使用 0.18μM 包含顺铂的纳米颗粒 NP+ 得到 50% 细胞死亡， 而 必须使用 2.41μM 游离顺铂以获得该结果。对 SKOV3 细胞系， 使用 0.29μM 包含顺铂的纳 米颗粒 NP+ 获得 50% 细胞死亡而使用 4.3μM 游离顺铂获得 50% 细胞死亡。
根据本发明的包含顺铂的纳米颗粒 (NP+) 的效力分别地是游离顺铂对 IGROV1 和 SKOV3 的效力的 13 和 14 倍。
实施例 16: 根据本发明的纳米颗粒的具有多隔室结构的验证 纳米颗粒的配制剂使用不同标记物进行制备， 以一方面研究标记物在类脂层中的位 置， 和在另一方面研究纳米颗粒在它们进入细胞之后的状态。
亲类脂荧光探针被插入在配制剂中一方面作为标记物， 和在另一方面作为模仿前 体药物的类脂化合物 ( 例如， 抗癌核苷的类脂共轭类似物， 如 5-FU)。
制备以下不同的个配制剂 : 配制剂 A: diC 16dT/DOPC50/50 配制剂 B: DOTAU/DOPC50/50 配制剂 C: diC 16dT/DOPC/DOPE/ 荧光素 49.25/49.25/0.5 (λex=483nm， λem=518nm) 配制剂 D:DOTAU/DOPC/DOPE/ 若丹明 49.25/49.25/0.5 (λex=550nm， λem=590nm) 根据本发明的纳米颗粒 NP1， NP2 和 NP3 如此使用如下定义的不同组合物进行制备 :纳米颗粒 NP1 NP2 NP3 第一层 配制剂 C 配制剂 A 配制剂 C 第二层 配制剂 B 配制剂 D 配制剂 D在图 6 中显示纳米颗粒 NP1、 NP2 和 NP3。在每一种纳米颗粒中， 白色层表示未标 记的类脂层， 灰色层表示使用荧光素标记的层 ( 配制剂 C)， 黑色层表示使用若丹明标记的 层 ( 配制剂 D) 和点状的中心表示掺入的顺铂。
对已经温育的 SKV03 细胞进行 FACS( 荧光活化细胞分类 ) 测量 : - 不存在根据本发明的纳米颗粒作为对照 ( 图 7A) - 存在 NP1 纳米颗粒， 其中第一层进行标记 ( 图 7B)， - 存在 NP2 纳米颗粒， 其中第二层进行标记 ( 图 7C)， 和 - 存在 NP3 纳米颗粒， 其中该两个层进行标记 ( 图 7D)。
获得的 FACS 数据显示在带有这些标记物的 NP3 纳米颗粒存在时在温育之后在 SKV03 细胞中存在两种荧光标记物 ( 荧光素、 若丹明 )。这些结果显示， 一方面根据本发明 的纳米颗粒具有多隔室结构， 和在另一方面在该细胞中内在化之后保持完整。
荧光显微术实验证实通过 FACS 获得的结果。图像显示标记的 NP1、 NP2 和 NP3 纳 米颗粒被完好地内在化在 SKVO3 细胞中。