辅助癌症疗法 相关申请
本申请要求 2009 年 4 月 20 日提交的美国临时申请 No.61/171,008 ； 2009 年 4 月 21 日提交的美国临时申请 No.61/171,318 ； 和 2009 年 5 月 26 日提交的美国临时申请 No.61/181,195 的优先权和权益， 通过述及将其每一篇内容收入本文。
发明领域
一般而言， 本发明涉及人类疾病和病理状况的治疗。 更具体地， 本发明涉及抗血管 发生剂在辅助癌症疗法中的用途。
发明背景
癌症是对人类健康的最致命威胁之一。仅在美国， 癌症每年影响近 130 万新患者， 而且是位于心血管疾病之后的第二位死因， 占 4 例死亡中的大约 1 例。实体瘤对大多数那 些死亡负有责任。虽然某些癌症的医学治疗中已经取得了重大进步， 但是所有癌症的总体 5 年存活率在最近 20 年里只改进了约 10％。癌症 ( 或称作恶性肿瘤 ) 以不受控制的方式 快速生长和转移， 使得及时检测和治疗极端困难。 大多数当前癌症治疗方法是相对非选择性的， 而且一般在癌症发展至更恶性的阶 段之后靶向肿瘤。手术切除患病组织 ； 放疗缩小实体瘤 ； 以及化疗快速杀死正在分裂的细 胞。特别地， 化疗导致众多副作用， 在一些情况中严重到限制可给予的剂量， 并如此排除使 用潜在有效药物。此外， 癌症常常发展出对化疗药物的抗性。
对于大多数新诊断有可手术癌症的患者， 标准治疗是确定性手术 (definitive surgery) 继以化疗。 此类治疗的目标是尽可能多地消除原发性和转移性疾病以预防复发和 改善存活。事实上， 大多数这些患者在手术之后没有残留肿瘤的宏观证据。然而， 他们许多 稍后会发生复发， 而且最终可死于他们的疾病。 这是会发生的， 例如其中少数存活肿瘤细胞 在手术之前转移， 逃避了手术， 而且由于当前检测技术的限制， 在手术之后没有检测到。
因此， 手术后辅助治疗作为手术的辅助武器变得重要， 从而在这些残余微转移癌 细胞变得再建群和顽固之前消除它们。在过去几十年里， 辅助疗法的进展普遍增多， 集中 于使用各种化疗剂。许多化疗方案在辅助治疗有早期主要癌症适应证 ( 诸如肺、 乳腺和结 肠直肠癌 ) 的患者中显示出临床好处。Strauss et al.J Clin Oncol 22 ： 7019(2004) ； International Adjuvant Lung Cancer Trial Collaboration Group N Engl J Med 350 ： 351-60(2004)。Moertel et al.Ann Intern Med 122 ： 321-6(1995) ； IMPACT Lancet 345 ： 939-44(1995) ； Citron et al.J Clin Oncol 21 ： 1431-9(2003)。
尽管已确立基于化学的辅助疗法的好处， 但是与任何种类的化疗有关的一项主要 限制是重大毒性。一般地， 化疗药物并非靶向肿瘤部位， 而且不能区分正常与肿瘤细胞。由 于漫长的治疗及其对患者生活质量的持久影响， 毒性问题在辅助背景中尤其具有挑战性。 此外， 辅助化疗在复发风险更低的患者中的好处仍然不清楚， 使得是否值得让他们遭受化 疗副作用成问题。
血管发生指一系列重要的细胞事件， 其中血管内皮细胞增殖、 消减、 和重新组织，
从而从现有的血管网络形成新血管。 有令人信服的证据表明血管供应的发展对于正常和病 理的增殖过程是至关重要的。 运送氧和养分， 以及清除异化产物， 代表了多细胞生物体中发 生的大多数生长过程的限速步骤。
虽然引入新血管被认为是肿瘤血管发生的主要模式， 但是最近的数据指示一些肿 瘤可通过征用现有的宿主血管来生长。 然后被征用的血管系统消退， 导致肿瘤消退， 最终因 肿瘤边缘处缺氧诱导的血管发生而逆转。
正常和异常血管发生二者的关键正调节物之一是血管内皮细胞生长因子 (VEGF)-A。VEGF-A 是包括 VEGF-B、 VEGF-C、 VEGF-D、 VEGF-E、 VEGF-F、 和 PlGF 在内的基因 家族的一部分。VEGF-A 主要结合两种高亲和力受体酪氨酸激酶， 即 VEGFR-1(Flt-1) 和 VEGFR-2(Flk-1/KDR)， 后者是 VEGF-A 血管内皮细胞有丝分裂信号的主要递质。另外， 神经 毡蛋白 -1(neuropilin-1) 已经被鉴定为肝素结合 VEGF-A 同种型的受体， 而且可在血管发 育中发挥作用。
在作为血管发生因子之外， VEGF， 作为多效生长因子， 在其它生理过程诸如内皮细 胞存活和增殖、 血管通透性和血管舒张、 单核细胞趋化性、 和钙内流中展现出多种生物学效 应。此外， 其它研究报道了 VEGF 对少数非内皮细胞类型诸如视网膜色素上皮细胞、 胰导管 细胞、 和许旺 (Schwann) 细胞的促有丝分裂效应。
VEGF 作为病理状况中主要血管发生调节物的认识导致了涉及病理性血管发生的 状况中阻断 VEGF 活性的众多尝试。
VEGF 表达在大多数恶性肿瘤中上调， 而且 VEGF 过表达与更晚期的阶段或与许多 实体瘤中更差的预后有关。因此， 抑制 VEGF 信号传导途径的分子已用于治疗其中注意到病 理性血管发生的相对晚期实体瘤。
由于癌症仍然是最致命疾病之一， 因此人们期望有其它的治疗， 诸如辅助疗法。 本 发明解决这些和其它需要， 正如阅读下述公开后会显而易见的。
发明概述
VEGF 特异性拮抗剂与化疗组合的使用显示出在有癌症 ( 例如转移性结肠直肠癌、 非小细胞肺癌、 乳腺癌、 等 ) 的患者中有好处， 但是关于抗 VEGF 抗体在辅助疗法中的使用了 解不多。本文中的发明关注在非转移性结肠直肠癌的人类受试者中辅助使用 的临床研究中获得的结果。
因而， 本发明的特征在于辅助疗法的一种方法， 包括对有癌症的患者施用有效量 的 VEGF 特异性拮抗剂 ( 例如抗 VEGF 抗体 ) 超过 1 年。在一些实施方案中， 辅助疗法的方 法在患者中延长无疾病存活 (DFS) 或总体存活 (OS)。在一些实施方案中， 在治疗启动后约 2 至 5 年评估 ( 例如分析 )DFS 或 OS。还提供辅助疗法的一种方法， 包括对有癌症的患者施 用有效量的 VEGF 特异性拮抗剂， 其中在 VEGF 特异性拮抗剂积极治疗期间阻止或延迟癌症 发展， 且其中积极治疗持续超过 1 年。 在一些实施方案中， 在 VEGF 特异性拮抗剂积极治疗停 止后阻止或延迟癌症发展约 3 个月或 6 个月。本发明进一步提供辅助疗法的一种方法， 包 括对有癌症的患者施用有效量的 VEGF 特异性拮抗剂， 其中在 VEGF 特异性拮抗剂积极治疗 期间阻止或延迟癌症复发， 且其中 VEGF 特异性拮抗剂积极治疗持续超过 1 年。在一些实施 方案中， 在 VEGF 特异性拮抗剂积极治疗停止后阻止或延迟癌症复发约 3、 4、 5 或 6 个月。在 某些实施方案中， 在确定性手术之后对患者施用 VEGF 特异性拮抗剂。在某些实施方案中，包括施用抗 VEGF 抗体的辅助疗法在治疗启动之后继续至少 2 年、 至少 3 年、 至少 4 年、 至少 5 年、 至少 10 年或更多。
本发明提供辅助疗法的一种方法， 包括对为癌症经历过确定性手术的患者施用有 效量的 VEGF 特异性拮抗剂以在患者中延长 DFS 或 OS， 其中 VEGF 特异性拮抗剂施用超过 1 年。在一些实施方案中， 在治疗启动之后约 2 至 5 年评估 DFS 或 OS。还提供辅助疗法的一 种方法， 包括对为癌症 ( 例如原发性肿瘤 ) 经历过确定性手术的患者施用有效量的 VEGF 特 异性拮抗剂， 其中在 VEGF 特异性拮抗剂积极治疗期间阻止或延迟癌症发展， 且其中积极治 疗持续超过 1 年。在一些实施方案中， 在 VEGF 特异性拮抗剂积极治疗停止后阻止或延迟癌 症发展约 3、 4、 5 或 6 个月。本发明进一步提供辅助疗法的一种方法， 包括对为癌症 ( 例如 原发性肿瘤 ) 经历过确定性手术的患者施用有效量的 VEGF 特异性拮抗剂， 其中在 VEGF 特 异性拮抗剂积极治疗期间阻止或延迟癌症复发， 且其中 VEGF 特异性拮抗剂积极治疗持续 超过 1 年。在一些实施方案中， 在 VEGF 特异性拮抗剂积极治疗停止后阻止或延迟癌症复发 约 3、 4、 5 或 6 个月。在某些实施方案中， 包括施用抗 VEGF 抗体的辅助疗法在治疗启动之后 继续至少 2 年、 至少 3 年、 至少 4 年、 至少 5 年、 至少 10 年或更长时间。
本发明进一步提供一种治疗为癌症 ( 例如原发性肿瘤 ) 经历过确定性手术的患 者的方法， 包括对患者施用辅助疗法， 其包括有效量的 VEGF 特异性拮抗剂以在患者中延长 DFS 或 OS， 其中 VEGF 特异性拮抗剂施用超过 1 年。在一些实施方案中， 在治疗启动之后约 2 至 5 年评估 ( 例如分析 )DFS 或 OS。还提供一种治疗为癌症 ( 例如原发性肿瘤 ) 经历过确 定性手术的患者的方法， 包括对患者施用辅助疗法， 其包括有效量的 VEGF 特异性拮抗剂， 其中在 VEGF 特异性拮抗剂积极治疗期间阻止或延迟癌症发展， 且其中积极治疗持续超过 1 年。 在一些实施方案中， 在 VEGF 特异性拮抗剂积极治疗停止后阻止或延迟癌症发展约 3、 4、 5 或 6 个月。本发明结构域提供一种治疗为癌症 ( 例如原发性肿瘤 ) 经历过确定性手术的 患者的方法， 包括对患者施用辅助疗法， 其包括有效量的 VEGF 特异性拮抗剂， 其中在 VEGF 特异性拮抗剂积极治疗期间阻止或延迟癌症复发， 且其中 VEGF 特异性拮抗剂积极治疗持 续超过 1 年。在一些实施方案中， 在 VEGF 特异性拮抗剂积极治疗停止后阻止或延迟癌症复 发约 3、 4、 5 或 6 个月。在某些实施方案中， 该方法包括在治疗启动之后施用抗 VEGF 抗体至 少 2 年、 至少 3 年、 至少 4 年、 至少 5 年、 至少 10 年或更长时间。
本发明还提供一种在患者中阻止或延迟癌症复发的方法， 包括对患者施用有效量 的 VEGF 特异性拮抗剂 ( 例如抗 VEGF 抗体 ) 超过 1 年， 其中所述施用 VEGF 特异性拮抗剂 ( 例如抗 VEGF 抗体 ) 阻止癌症复发。 本发明进一步提供一种在患者中降低癌症复发可能性 的方法， 包括对患者施用有效量的 VEGF 特异性拮抗剂 ( 例如抗 VEGF 抗体 ) 超过 1 年， 其中 所述施用 VEGF 特异性拮抗剂 ( 例如抗 VEGF 抗体 ) 降低癌症复发可能性。
在本发明任何方法的一些实施方案中， 所述施用 VEGF 特异性拮抗剂阻止或降低 临床可检测肿瘤或其转移发生可能性。
在本发明的每一种方法中， 施用 VEGF 特异性拮抗剂 ( 例如抗 VEGF 抗体 ) 在治疗 启动之后继续至少 2 年、 至少 3 年、 至少 4 年、 至少 5 年、 至少 10 年或更长时间。在一些实 施方案中， 继续施用 VEGF 特异性拮抗剂 ( 例如抗 VEGF 抗体 ) 直至死亡。
在本发明的每一种方法中， 抗 VEGF 抗体可替换为 VEGF 特异性拮抗剂， 例如下文所 述 VEGF 受体分子或嵌合 VEGF 受体分子。 抗 VEGF 抗体可以是单克隆抗体、 嵌合抗体、 完全人的抗体、 或人源化抗体。 在本发明的方法中有用的例示性抗体包括贝伐单抗 (bevacizumab， )、 G6-31、 B20-4.1、 及其片段。在一些实施方案中， 抗 VEGF 抗体包括包含下述 氨基酸序列的重链可变区 ：
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYTFT NYGMNWVRQA PGKGLEWVGW
INTYTGEPTY AADFKRRFTF SLDTSKSTAY LQMNSLRAED TAVYYCAKYP
HYYGSSHWYF DVWGQGTLVT VSS (SEQ ID NO ： 1)
和包含下述氨基酸序列的轻链可变区 ：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCSASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKVLIYF
TSSLHSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YSTVPWTFGQ
GTKVEIKR (SEQ ID NO ： 2)。
在本发明方法的某些实施方案中， 抗 VEGF 抗体是贝伐单抗。
可以关于癌症治疗来实践本发明的每一种方法， 包括但不限于癌瘤、 淋巴瘤、 母 细胞瘤、 肉瘤、 和白血病。此类癌症的更特别例子包括鳞状细胞癌、 小细胞肺癌、 非小细胞 肺癌、 肺的腺癌、 肺的鳞癌、 腹膜癌、 肝细胞癌、 胃肠癌、 胰腺癌、 成胶质细胞瘤、 宫颈癌、 卵巢 癌、 肝癌、 膀胱癌、 肝肉瘤 (hepatoma)、 乳腺癌、 结肠癌、 结肠直肠癌、 子宫内膜或子宫癌、 唾 液腺癌、 肾癌、 肝癌、 前列腺癌、 肾癌、 外阴癌、 甲状腺癌、 肝癌、 胃癌、 黑素瘤、 和各种类型的 头颈癌。在本发明方法的一些实施方案中， 受试者具有非转移性结肠直肠癌。在本发明方 法的一些实施方案中， 受试者具有转移性结肠直肠癌。 在一些实施方案中， 受试者切除了 II 期或 III 期结肠癌。 在受试者经历过确定性手术的实施方案中， 一般在受试者自手术恢复一段时间之 后施用 VEGF 特异性拮抗剂 ( 例如抗 VEGF 抗体 )。此时间段可以包括伤口愈合或外科切口 愈合所需要的时间段、 降低伤口开裂风险所需要的时间段、 或受试者回到手术之前的健康 水平基本上相似或更好的健康水平所需要的时间段。完成确定性手术和首次施用抗 VEGF 抗体之间的时段也可以包括药物假期所需要的时段， 其中受试者需要或请求在治疗方案之 间有一段时间。一般地， 完成确定性手术和开始抗 VEGF 抗体疗法之间的时间段可包括不到 1 周、 1 周、 2 周、 3 周、 4 周 (28 天 )、 5 周、 6 周、 7 周、 8 周、 3 个月、 4 个月、 5 个月、 6 个月、 7个 月、 8 个月、 9 个月、 10 个月、 11 个月、 1 年、 2 年、 3 年、 或更长时间。在一个实施方案中， 确定 性手术和施用抗 VEGF 抗体之间的时间段大于 2 周且不到 1 年。在一个实施方案中， 确定性 手术和施用抗 VEGF 抗体之间的时间段是至少 28 天。
上述每一个方面可进一步包括对受试者监测癌症复发。 监测可例如通过评估无疾 病存活 (DFS) 或总体存活 (OS) 来实现。在一个实施方案中， 在治疗启动之后约 2 至 5 年评 估 DFS 或 OS。在一个实施方案中， 受试者在治疗之后没有疾病至少 1 至 5 年。
根据疾病的类型和严重性， 抗 VEGF 抗体 ( 例如贝伐单抗 ) 的优选剂量在本文中有 描述， 而且范围可以为约 1μg/kg 至约 50mg/kg， 最优选约 5mg/kg 至约 15mg/kg， 包括但不 限于 5mg/kg、 7.5mg/kg 或 10mg/kg。施药频率会随疾病的类型和严重性而变化。对于几天 或更长时间里的重复施用， 根据状况， 治疗为持续直到实现期望治疗效果， 如通过本文所述 或本领域已知方法测量的。在一个例子中， 本发明的抗 VEGF 抗体每周、 每两周、 或每三周施 用一次， 剂量范围为约 5mg/kg 至约 15mg/kg， 包括但不限于 5mg/kg、 7.5mg/kg 或 10mg/kg。 然而， 其它剂量方案可以是有用的。 本发明疗法的进展易于通过常规技术和测定法来监测。
在上述每一个方面别的实施方案中， 局部或系统 ( 例如口服或静脉内 ) 施用 VEGF 特异性拮抗剂 ( 例如抗 VEGF 抗体 )。在一些实施方案中， 延长抗 VEGF 抗体治疗直至患者在 选自下组的时间段没有癌症 ： 1 年， 2 年， 3 年， 4 年， 5 年， 6 年， 7 年， 8 年， 9 年， 10 年， 11 年， 和 12 年。
在其它实施方案中， VEGF 特异性拮抗剂治疗是单一疗法或对于 VEGF 特异性拮抗 剂治疗段期间是单一疗法， 如由临床医师或如本文所述评估的。
在其它实施方案中， VEGF 特异性拮抗剂治疗与别的抗癌疗法组合， 包括但不限于 手术、 放疗、 化疗、 分化疗法、 生物疗法、 免疫疗法、 血管发生抑制剂、 和抗增殖化合物。VEGF 特异性拮抗剂治疗还可包括上述类型的治疗方案的任何组合。 另外， 细胞毒剂、 抗血管发生 剂和抗增殖剂可以与 VEGF 特异性拮抗剂组合使用。在一个实施方案中， 抗癌疗法是化疗。 例如， 化疗剂选自例如烷化剂、 抗代谢物、 叶酸类似物、 嘧啶类似物、 嘌呤类似物及相关抑制 剂、 长春花生物碱、 表鬼臼毒素、 抗生素、 L- 天冬酰胺酶、 拓扑异构酶抑制剂、 干扰素、 铂配位 复合物、 蒽二酮取代脲、 甲肼衍生物、 肾上腺皮质阻抑剂、 肾上腺皮质类固醇、 妊娠素、 雌激 素、 抗雌激素、 雄激素、 抗雄激素、 促性腺素释放激素类似物、 等。 在一些方面， 并行施用化疗 剂和 VEGF 特异性拮抗剂。 在包括别的抗癌疗法的实施方案中， 可以在施用 VEGF 特异性拮抗剂之前、 期 间 ( 例如同时 )、 或之后用别的抗癌疗法来进一步治疗受试者。在一个实施方案中， 抗癌 疗法是化疗， 其包括施用奥沙利铂 (oxaliplatin)、 5- 氟尿嘧啶 (fluorouracil)、 亚叶酸 (leucovorin) 或其组合。 在一个实施方案中， 单独或与抗癌疗法一起施用的 VEGF 特异性拮 抗剂可以作为维持疗法来施用。
本发明的方法在预防肿瘤复发或肿瘤再生长， 例如切除原发性肿瘤之后存留的休 眠肿瘤方面或者在减少或预防微转移发生或增殖方面也是有利的。
在本发明上述每一个方面别的实施方案中， 以一定量或时间 ( 例如一定时间的特 定治疗方案 ) 施用 VEGF 特异性拮抗剂以提高或延长 ( 例如 20％、 30％、 40％、 50％、 60％、 70％、 80％、 90％、 100％或更多 ) 经历过确定性手术以治疗结肠直肠癌的受试者的存活。在 一个例子中， 作为受试者中的 DFS 或 OS 测量存活， 其中在 VEGF 特异性拮抗剂辅助治疗启动 后约 2 至 5 年评估 DFS 或 OS。在一些别的实施方案中， 该 VEGF 特异性拮抗剂用于预防或降 低受试者中癌症复发或癌症进展的可能性。
根据详述、 附图、 和权利要求， 本发明的其它特征和优点会是显而易见的。
附图简述
图 1 描绘 C-08 试验的治疗方案。分部 A ： 改良 FOLFOX6( 第 1 天奥沙利铂 (85mg/ 2 2 2 m ) 及并行亚叶酸 (400mg/m ) 和 5-FU(400mg/m IV 推注 )， 和第 1 天和第 2 天 46 小时里 2 5-FU(2400mg/m ))q 14 天， 12 个循环 (6 个月 ) ； 分部 B ： 改良 FOLFOX6 q 14 天， 12 个循环 加每个化疗循环的第 1 天在奥沙利铂之前施用贝伐单抗 (5mg/kg IV)q 14 天， 1 年。
图 2 描绘 NSABP C-08 试验的研究设计。组 1 ： 改良 FOLFOX6( 第 1 天奥沙利铂 2 2 2 (85mg/m ) 及并行亚叶酸 (400mg/m ) 和 5-FU(400mg/m IV 推注 )， 和第 1 天和第 2 天 46 小 2 时里 5-FU(2400mg/m ))q 14 天， 12 个循环 (6 个月 ) ； 组2： 改良 FOLFOX6 q 14 天， 12 个循 环加每个化疗循环的第 1 天在奥沙利铂之前施用贝伐单抗 (5mg/kg IV)q 14 天， 1 年。
发明详述
I. 定义
术语 “VEGF” 或 “VEGF-A” 用于指 165 个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子及相 关的 121 个、 145 个、 189 个和 206 个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子， 如例如 Leung et al.Science， 246 ： 1306(1989) ； 及 Houck et al.Mol.Endocrin.， 5： 1806(1991) 所述， 及其 天然存在的等位基因形式和加工形式。VEGF-A 是包括 VEGF-B、 VEGF-C、 VEGF-D、 VEGF-E、 VEGF-F 和 PlGF 在内的基因家族的一部分。VEGF-A 主要结合两种高亲和力受体酪氨酸激 酶， 即 VEGFR-1(Flt-1) 和 VEGFR-2(Flk-1/KDR)， 后者是 VEGF-A 血管内皮细胞有丝分裂信 号的主要递质。另外， 神经毡蛋白 -1 已经被鉴定为肝素结合 VEGF-A 同种型 (isoform) 的 受体， 而且可在血管发育中发挥作用。术语 “VEGF” 或 “VEGF-A” 还指来自非人物种诸如小 鼠、 大鼠或灵长类动物的 VEGF。有时， 来自特定物种的 VEGF 表示如下， hVEGF 表示人 VEGF， mVEGF 表示鼠 VEGF。术语 “VEGF” 还用于指包含 165 个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子的 氨基酸第 8-109 位或第 1-109 位的截短形式多肽。本申请中可能通过例如 “VEGF(8-109)” 、 “VEGF(1-109)” 或 “VEGF165” 来鉴别任何此类形式 VEGF。 “截短的” 天然 VEGF 的氨基酸位置 如天然 VEGF 序列中所示编号。例如， 截短的天然 VEGF 中的第 17 位氨基酸 ( 甲硫氨酸 ) 也 是天然 VEGF 中的第 17 位 ( 甲硫氨酸 )。截短的天然 VEGF 具有与天然 VEGF 相当的对 KDR 和 Flt-1 受体的结合亲和力。
“抗 VEGF 抗体” 指以足够亲和力和特异性结合 VEGF 的抗体。所选择的抗体通 常会具有对 VEGF 的结合亲和力， 例如， 该抗体可以以介于 100nM-1pM 之间的 Kd 值结合 hVEGF。抗体亲和力可通过例如基于表面等离振子共振的测定法 ( 诸如 PCT 申请公开文本 No.WO2005/012359 中所记载的 BIAcore 测定法 ) ； 酶联免疫吸附测定法 (ELISA) ； 和竞争测 定法 ( 例如 RIA) 来测定。在某些实施方案中， 本发明的抗 VEGF 抗体可用作治疗剂， 用于靶 向和干扰其中涉及 VEGF 活性的疾病或疾患。还有， 可对该抗体进行其它生物学活性测定 法， 例如为了评估其作为治疗剂的效力所进行的生物学活性测定法。此类测定法是本领域 已知的， 而且取决于抗体的靶抗原和预定用途。 例子包括 HUVEC 抑制测定法 ； 肿瘤细胞生长 抑制测定法 ( 如例如 WO 89/06692 中所记载的 ) ； 抗体依赖性细胞的细胞毒性 (ADCC) 和补 体介导的细胞毒性 (CDC) 测定法 ( 美国专利 5,500,362) ； 及激动活性或造血测定法 ( 参见 WO 95/27062)。抗 VEGF 抗体通常不会结合其它 VEGF 同系物， 诸如 VEGF-B 或 VEGF-C， 也不 会结合其它生长因子， 诸如 PlGF、 PDGF 或 bFGF。
“VEGF 拮抗剂” 指能够中和、 阻断、 抑制、 消除、 降低或干扰 VEGF 活性 ( 包括其与一 种或多种 VEGF 受体的结合 ) 的分子。VEGF 拮抗剂包括抗 VEGF 抗体及其抗原结合片段、 特 异性结合 VEGF 由此使其隔绝与一种或多种受体结合的受体分子及衍生物、 抗 VEGF 受体抗 体和 VEGF 受体拮抗剂诸如 VEGFR 酪氨酸激酶的小分子抑制剂。
“天然序列” 多肽包括与衍生自自然界的多肽具有相同氨基酸序列的多肽。如此， 天然序列多肽可以具有来自任何哺乳动物的天然存在多肽的氨基酸序列。 此类天然序列多 肽可以从自然界分离， 或者可以通过重组或合成手段来生产。术语 “天然序列” 多肽明确涵 盖该多肽的天然存在的截短或分泌形式 ( 例如胞外结构域序列 )、 天然存在的变体形式 ( 例 如可变剪接形式 )、 及天然存在的等位变体。
多肽 “变体” 意指与天然序列多肽具有至少约 80％氨基酸序列同一性的生物学活 性多肽。此类变体包括例如在多肽的 N- 末端或 C- 末端添加或删除一个或多个氨基酸残基的多肽。通常， 变体与天然序列多肽将具有至少约 80％的氨基酸序列同一性， 更优选的是， 至少约 90％的氨基酸序列同一性， 和甚至更优选的是， 至少约 95％的氨基酸序列同一性。
术语 “抗体” 在本文中以最广义使用， 包括单克隆抗体 ( 包括全长或完整单克隆抗 体 )、 多克隆抗体、 多价抗体、 多特异性抗体 ( 例如双特异性抗体 )、 及抗体片段 ( 见下文 )， 只要它们展现出期望的生物学活性。
贯穿本说明书和权利要求书， 本文中免疫球蛋白重链残基的编号方式是如 Kabat 等， 《Sequences of Proteins of Immunological Interest》 ，第 5 版， Public Health Service， National Institutes of Health， Bethesda， Md.(1991) 中的 EU 索引的编号方 式， 明确收入本文作为参考。 “如 Kabat 中的 EU 索引” 指人 IgG1 EU 抗体的残基编号方式。
在一个实施方案中， 依照本发明的 “Kd” 或 “Kd 值” 是通过如下测定法所述使用 Fab 型式的抗体和 VEGF 分子进行的放射性标记 VEGF 结合测定法 (RIA) 来测量的 ： 通过在存 125 在未标记 VEGF 的滴定系列的条件下， 用最小浓度的 I 标记 VEGF(109) 平衡 Fab， 然后用 抗 Fab 抗体包被的平板捕捉结合的 VEGF 来测量 Fab 对 VEGF 的溶液结合亲和力 (Chen， et al.， J Mol Biol 293 ： 865-881(1999))。为了确定测定条件， 用 50mM 碳酸钠 (pH 9.6) 中的 5μg/ml 捕捉用抗 Fab 抗体 (Cappel Labs) 包被微量滴定板 (Dynex) 过夜， 随后用 PBS 中的 2％ (w/v) 牛血清清蛋白在室温 ( 约 23℃ ) 封闭 2-5 小时。在非吸附平板 (Nunc#269620) 中， 将 100pM 或 26pM[125I]-VEGF(109) 与 连 续 稀 释 的 目 的 Fab( 例 如 如 Presta et al.， Cancer Res.57 ： 4593-4599(1997) 中的 Fab-12) 混合。然后将目的 Fab 保温过夜 ； 不过， 保 温可持续 65 个小时以保证达到平衡。此后， 将混合物转移至捕捉板以进行室温保温 1 小 时。然后除去溶液， 并用含 0.1％ 20 的 PBS 洗板 8 次。平板干燥后， 加入 150μl/ 孔闪烁液 (MicroScint-20 ； Packard)， 然后在 Topcount 伽马计数器 (Packard) 上对平板 计数 10 分钟。选择各 Fab 给出小于或等于最大结合之 20 ％的浓度用于竞争性结合测定 法。依照另一实施方案， Kd 或 Kd 值是通过表面等离振子共振测定法使用 BIAcoreTM-2000 或 BIAcoreTM-3000(BIAcore， Inc.， Piscataway， NJ) 在 25 ℃ 使 用 固 定 化 hVEGF(8-109) CM5 芯片在约 10 个响应单位 (RU) 测量的。简而言之， 依照供应商的说明书用盐酸 N- 乙 基 -N’ -(3- 二甲基氨基丙基 )- 碳化二亚胺 (EDC) 和 N- 羟基琥珀酰亚胺 (NHS) 活化羧甲 基化右旋糖苷生物传感器芯片 (CM5， BIAcore Inc.)。用 10mM 乙酸钠 pH 4.8 将人 VEGF 稀 释至 5μg/ml( 约 0.2μM)， 然后以 5μl/ 分钟的流速注入至获得约 10 个响应单位 (RU) 的 偶联蛋白质。注入人 VEGF 后， 注入 1M 乙醇胺以封闭未反应基团。为了进行动力学测量， 在 25℃以约 25μl/ 分钟的流速注入在含 0.05％ 20 的 PBS(PBST) 中两倍连续稀 释的 Fab(0.78nM 至 500nM)。使用简单一对一朗格缪尔 (Langmuir) 结合模型 (BIAcore Evaluation Software version 3.2) 通过同时拟合结合和解离传感图计算结合速率 (kon) 和解离速率 (koff)。平衡解离常数 (Kd) 以比率 koff/kon 计算。参见例如 Chen， Y.， et al.， J Mol Biol 293 ： 865-881(1999)。如果根据上文表面等离振子共振测定法， 结合速率超过 6 -1 -1 10 M S ， 那么结合速率可使用荧光淬灭技术来测定， 即根据分光计诸如配备了断流装置的 分光光度计 (a stop-flow equipped spectrophometer)(Aviv Instruments) 或 8000 系列 SLM-AmincoTM 分光光度计 (ThermoSpectronic) 中用搅拌比色杯的测量， 在存在浓度渐增的 人 VEGF 短形式 (8-109) 或小鼠 VEGF 的条件下， 测量 PBS， pH 7.2 中的 20nM 抗 VEGF 抗体 (Fab 形式 ) 在 25℃的荧光发射强度 ( 激发＝ 295nm ； 发射＝ 340nm， 16nm 带通 (band pass))的升高或降低。
“阻断性” 抗体或抗体 “拮抗剂” 指抑制或降低其所结合的抗原的生物学活性的抗 体。例如， VEGF 特异性拮抗性抗体结合 VEGF 并抑制 VEGF 诱导血管内皮细胞增殖或诱导血 管通透性的能力。优选的阻断性抗体或拮抗性抗体完全抑制抗原的生物学活性。
除非另有说明， 表述 “多价抗体” 贯穿本说明书用于指包含三个或更多抗原结合位 点的抗体。 例如， 多价抗体改造成具有三个或更多个抗原结合位点， 而且一般不是天然序列 IgM 或 IgA 抗体。
“抗体片段” 只包含完整抗体的一部分， 一般包括完整抗体的抗原结合位点， 因此 保留了与抗原结合的能力。此定义所涵盖的抗体片段的例子包括 ： (i)Fab 片段， 其具有 VL、 CL、 VH 和 CH1 结构域 ； (ii)Fab ′片段， 其是在 CH1 结构域的 C- 末端具有一个或多个 半胱氨酸残基的 Fab 片段 ； (iii)Fd 片段， 其具有 VH 和 CH1 结构域 ； (iv)Fd′片段， 其具有 VH 和 CH1 结构域及 CH1 结构域 C- 末端的一个或多个半胱氨酸残基 ； (v)Fv 片段， 其具有 抗体单臂的 VL 和 VH 结构域 ； (vi)dAb 片段 (Ward et al.， Nature 341 ： 544-546(1989))， 其由 VH 结构域组成 ； (vii) 分离的 CDR 区 ； (viii)F(ab′ )2 片段， 包含通过铰链区的二硫 键相连的两个 Fab′片段的二价片段 ； (ix) 单链抗体分子 ( 例如单链 Fv ； scFv)(Bird et al.， Science 242 ： 423-426(1988) 和 Huston et al.， PNAS(USA)85 ： 5879-5883(1988)) ； (x)“双抗体” ， 其具有两个抗原结合位点， 包含在同一条多肽链中相连的重链可变域 (VH) 和 轻 链 可 变 域 (VL)( 参 见 例 如 EP 404,097 ； WO93/11161 ； 和 Hollinger et al.， Proc. Natl.Acad.Sci.USA 90 ： 6444-6448(1993)) ； (xi)“线性抗体” ， 其包含一对串联的 Fd 区段 (VH-CH1-VH-CH1)， 与互补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区 (Zapata et al.， Protein Eng.8(10) ： 1057-1062(1995) 和美国专利 5,641,870)。
术语 “单克隆抗体” 在用于本文时指从一群基本上同质的抗体获得的抗体， 即构成 群体的各抗体个体是相同的， 除了可以以极小量存在的可能的天然存在突变形式外。单克 隆抗体是高度特异性的， 针对单一抗原。此外， 与典型的包含针对不同决定簇 ( 表位 ) 的不 同抗体的多克隆抗体制备物不同， 每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。 修饰语 “单克 隆” 不应解释为要求通过任何特定方法来生成抗体。例如， 将依照本发明使用的单克隆抗 体可通过最初由 Kohler 等 Nature 256 ： 495， (1975) 记载的杂交瘤方法来制备， 或者可通 过重组 DNA 方法来制备 ( 参见例如美国专利 No.4,816,567)。 “单克隆抗体” 还可使用例如 Clackson 等 Nature 352 ： 624-628， (1991) 或 Marks 等 J.Mol.Biol.222 ： 581-597， (1991) 中记载的技术从噬菌体抗体库分离。
“Fv” 片段是包含完整抗原识别和结合位点的抗体片段。该区域由紧密结合 ( 该结 合的本质可以是共价的， 例如在 scFv 中 ) 的一个重链可变域 ( 区 ) 和一个轻链可变域 ( 区 ) 的二聚体组成。正是在这种构造中， 每个可变域 ( 区 ) 的三个 CDR 相互作用而在 VH-VL 二聚 体表面上限定了一个抗原结合位点。 六个 CDR 或其子集 (subset) 一起赋予抗体以抗原结合 特异性。然而， 即使是单个可变域 ( 区 )( 或是只包含对抗原特异性的三个 CDR 的半个 Fv) 也具有识别和结合抗原的能力， 只是通常亲和力低于完整结合位点。
在用于本文时， “抗体可变域 ( 区 )” 指抗体分子的轻链和重链中包含互补决定区 (CDR ； 即 CDR1、 CDR2、 和 CDR3) 和框架区 (FR) 氨基酸序列的那部分。 VH 指重链可变域 ( 区 )。 VL 指轻链可变域 ( 区 )。依照本发明所使用的方法， 归为 CDR 和 FR 的氨基酸位置可以依照Kabat(Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health， Bethesda， Md.， 1987 和 1991)) 来限定。抗体或抗原结合片段的氨基酸编号方式也 依照 Kabat 的氨基酸编号。
在用于本文时， 术语 “互补决定区 (CDR ； 即 CDR1、 CDR2、 和 CDR3) 指抗体可变域 ( 区 ) 中其存在是抗原结合所必需的氨基酸残基。每个可变域通常具有三个 CDR， 鉴定 为 CDR1、 CDR2 和 CDR3。每个互补决定区可以包含来自如 Kabat 定义的 “互补决定区” 的 氨基酸残基 ( 即大约是轻链可变域的残基 24-34(L1)、 50-56(L2) 和 89-97(L3) 及重链 可变域的残基 31-35(H1)、 50-65(H2) 和 95-102(H3) ； Kabat 等， Sequences of Proteins of Immunological Interest， 5thEd.Public Health Service， National Institutes of Health， Bethesda， MD.(1991)) 和 / 或来自 “高变环” 的残基 ( 即大约是轻链可变域的残 基 26-32(L1)、 50-52(L2) 和 91-96(L3) 及 重 链 可 变 域 的 残 基 26-32(H1)、 53-55(H2) 和 96-101(H3) ； Chothia and Lesk， J.Mol.Biol.196 ： 901-917(1987))。 在有些情况中， 互补决 定区可以包含来自 Kabat 定义的 CDR 和高变环二者的氨基酸。例如， 抗体 4D5 重链的 CDRH1 包含氨基酸 26-35。
“框架区” ( 以下的 FR) 指可变域中 CDR 残基以外的残基。每个可变域通常具有四 个 FR， 鉴定为 FR1、 FR2、 FR3 和 FR4。如果 CDR 是依照 Kabat 定义的， 那么轻链 FR 残基位于 大约轻链残基 1-23(LCFR1)、 35-49(LCFR2)、 57-88(LCFR3)、 和 98-107(LCFR4)， 而重链 FR 残 基位于大约重链残基 1-30(HCFR1)、 36-49(HCFR2)、 66-94(HCFR3)、 和 103-113(HCFR4)。如 果 CDR 包含来自高变环的氨基酸残基， 那么轻链 FR 残基位于大约轻链残基 1-25(LCFR1)、 33-49(LCFR2)、 53-90(LCFR3)、 和 97-107(LCFR4)， 而 重 链 FR 残 基 位 于 大 约 重 链 残 基 1-25(HCFR1)、 33-52(HCFR2)、 56-95(HCFR3)、 和 102-113(HCFR4)。 在 有 些 情 况 中， 在 CDR 包含来自 Kabat 定义的 CDR 和高变环二者的氨基酸时， FR 残基将做相应的调整。例如， 当 CDRH1 包含氨基酸 H26-H35 时， 重链 FR1 残基位于 1-25 位， 而 FR2 残基位于 36-49 位。
“Fab” 片段包含轻链的可变域和恒定域及重链的可变域和第一恒定域 (CH1)。 F(ab′ )2 抗体片段包含一对 Fab 片段， 它们一般在它们羧基末端附近通过它们之间的铰链 半胱氨酸共价连接。本领域还知道抗体片段的其它化学偶联形式。
“单链 Fv” 或 “scFv” 抗体片段包含抗体的 VH 和 VL 结构域， 其中这些结构域存在于 一条多肽链上。一般而言， Fv 多肽在 VH 与 VL 结构域之间进一步包含多肽接头， 其使得 scFv 能够形成结合抗原的期望结构。 关于 scFv 的综述参见 Pluckthun， 于 《The Pharmacology of Monoclonal Antibodies》 ， 第 113 卷， Rosenburg 和 Moore 编， Springer-Verlag， New York， 第 269-315 页， 1994。
术语 “双抗体 (diabody)” 指具有两个抗原结合位点的小型抗体片段， 该片段在 同一条多肽链 (VH 及 VL) 中包含相连的重链可变域 (VH) 和轻链可变域 (VL)。通过使用过 短的接头使得同一条链上的两个结构域之间不能配对， 迫使这些结构域与另一条链的互 补结构域配对， 从而产生两个抗原结合位点。双抗体更完整的记载于例如 EP 404,097 ； WO 93/11161 ； Hollinger 等， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90 ： 6444-6448(1993)。
表述 “线性抗体” 指 Zapata 等， Protein Eng， 8(10) ： 1057-1062(1995) 中所描述 的抗体。简言之， 这些抗体包含一对串联的 Fd 区段 (VH-CH1-VH-CH1)， 该区段与互补的轻链 多肽一起形成抗原结合区对。线性抗体可以是双特异性的， 或者是单特异性的。单克隆抗体在本文中明确包括 “嵌合” 抗体 ( 免疫球蛋白 )， 其中重链和 / 或轻链的 一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源， 而 链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或 同源， 以及此类抗体的片段， 只要它们展现出期望的生物学活性 ( 美国专利 No.4,816,567 ； Morrison 等 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81 ： 6851-6855)， (1984)。
非人 ( 例如鼠 ) 抗体的 “人源化” 形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的 序列的嵌合抗体。在极大程度上， 人源化抗体指人免疫球蛋白 ( 受体抗体 ) 中的高变区残 基用具有期望特异性、 亲和力和能力的非人物种 ( 供体抗体 ) 诸如小鼠、 大鼠、 兔或非人灵 长类的高变区残基替换的免疫球蛋白。在有些情况中， 将人免疫球蛋白的 Fv 框架区 (FR) 残基用相应的非人残基替换。此外， 人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中没有发现 的残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体的性能。通常， 人源化抗体包含至少一个、 通 常两个基本上整个如下可变区， 其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的高 变环， 且所有或基本上所有 FR 区是人免疫球蛋白序列的 FR。 人源化抗体任选还包含至少部 分免疫球蛋白恒定区 (Fc)， 通常是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见 Jones et al.， Nature 321 ： 522-525(1986) ； Riechmann et al.， Nature 332 ： 323-329(1988) ； Presta， Curr.Op.Struct.Biol.2 ： 593-596(1992)。
“人抗体” 指拥有与由人生成的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列和 / 或使用 本文所公开的用于生成人抗体的任何技术生成的抗体。人抗体的这种定义明确排除包含 非人抗原结合残基的人源化抗体。人抗体可使用本领域已知的多种技术来生成。在一个 实施方案中， 人抗体是从噬菌体文库选择的， 该噬菌体文库表达人抗体 (Vaughan et al.， Nature Biotechnology 14 ： 309-314(1996) ； Sheets et al.， Proc.Natl.Acad.Sci.95 ： 6157-6162(1998) ； Hoogenboom and Winter， J.Mol.Biol.227 ： 381(1991) ； Marks et al.， J.Mol.Biol.222 ： 581(1991))。人抗体还可通过将人免疫球蛋白基因座导入内源免疫球 蛋白基因已经部分或完全灭活的转基因动物 ( 例如小鼠 ) 来生成。在受到攻击时， 观察 到人抗体生成， 它在所有方面与在人体中看到的极其相似， 包括基因重排、 装配和抗体全 集。 这 种 方 法 记 载 于 例 如 美 国 专 利 No.5,545,807 ； 5,545,806 ； 5,569,825 ； 5,625,126 ； 5,633,425 ； 5,661,016，及 以 下 科 学 出 版 物 ： Marks et al.， Bio/Technology 10 ： 779-783(1992) ； Lonberg et al.， Nature 368 ： 856-859(1994) ； Morrison， Nature 368 ： 812-13(1994) ； Fishwild et al.， Nature Biotechnology14 ： 845-51(1996) ； Neuberger， Nature Biotechnology 14 ： 826(1996) ； Lonberg and Huszar， Intern.Rev.Immunol.13 ： 65-93(1995)。或者， 人抗体可通过生成针对靶抗原的抗体的人 B 淋巴细胞的永生化来 制备 ( 此类 B 淋巴细胞可从个体回收， 或者可在体外免疫 )。参见例如 Cole et al.， Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy， Alan R.Liss， p.77(1985) ； Boerner et al.， J.Immunol.147(1) ： 86-95(1991) ； 及美国专利 No.5,750,373。
“亲和力成熟的” 抗体指在抗体的一个或多个 CDR 中具有一处或多处改变、 导致该 抗体对抗原的亲和力与没有这些改变的亲本抗体相比有所改进的抗体。优选的亲和力成 熟的抗体具有纳摩尔或甚至皮摩尔量级的对靶抗原的亲和力。亲和力成熟的抗体可通过 本领域已知规程来生成。Marks et al.， Bio/Technology 10 ： 779-783(1992) 记载了通过 VH 和 VL 结构域改组进行的亲和力成熟。以下文献记载了 CDR 和 / 或框架残基的随机诱变： Barbas et al.， Proc.Nat.Acad.Sci.USA 91 ： 3809-3813(1994) ； Schier et al.， Gene 169 ： 147-155(1995) ； Yelton et al.， J.Immunol.155 ： 1994-2004(1995) ； Jackson et al.， J.Immunol.154(7) ： 3310-9(1995) ； Hawkins et al.， J.Mol.Biol.226 ： 889-896(1992)。
抗体的 “功能性抗原结合位点” 指能够结合靶抗原的位点。抗原结合位点的抗 原结合亲和力不必像衍生该抗原结合位点的亲本抗体那样强， 但是结合抗原的能力必须 是使用已知用于评估抗体对抗原结合的多种方法之任一可测量到的。此外， 本文中多价 抗体的每个抗原结合位点的抗原结合亲和力不必在量上相同。对于本文中的多聚体抗 体， 功能性抗原结合位点的数目可以使用超速离心分析来评估， 如美国专利申请公开文本 No.20050186208 中所记载的。 依照这种分析方法， 将靶抗原与多聚体抗体以不同比例混合， 并计算复合物的平均分子量， 其中假设不同数目的功能性结合位点。将这些理论值与得到 的实际实验值进行比较以评估功能性结合位点的数目。
具有指定抗体的 “生物学特征” 的抗体指拥有该指定抗体区别于其它结合相同抗 原的抗体的一项或多项生物学特征的抗体。
为了筛选结合抗原上感兴趣抗体所结合的表位的抗体， 可以实施常规交叉阻断 测定法， 诸如 Antibodies， A Laboratory Manual， Cold Spring Harbor Laboratory， Ed Harlow and David Lane(1988) 中所记载的。
“物种依赖性抗体” 指这样一种抗体， 其对来自第一哺乳动物物种的抗原具有强于 对来自第二哺乳动物物种的该抗原同系物的结合亲和力。 通常， 物种依赖性抗体 “特异性结 -7 -8 合” 人类抗原 ( 即具有不超过约 1x10 M， 优选不超过约 1x10 M， 最优选不超过约 1x10-9M 的 结合亲和力 (Kd))， 但对来自第二非人哺乳动物物种的该抗原同系物具有比其对人类抗原 的结合亲和力弱至少约 50 倍， 或至少约 500 倍， 或至少约 1000 倍的结合亲和力。物种依赖 性抗体可以是如上定义的各种类型的抗体， 但典型的是人源化抗体或人抗体。
在用于本文时， “抗体突变体” 或 “抗体变体” 指物种依赖性抗体的氨基酸序列变 体， 其中物种依赖性抗体的一个或多个氨基酸残基发生了修饰。此类突变体与物种依赖性 抗体必然具有小于 100％的序列同一性或相似性。在一个的实施方案中， 抗体突变体所具 有的氨基酸序列与物种依赖性抗体的重链或轻链可变域的氨基酸序列具有至少 75％、 更优 选至少 80％、 更优选至少 85％、 更优选至少 90％、 最优选至少 95％的氨基酸序列同一性或 相似性。 关于此序列的同一性或相似性在本文中定义为在比对序列并在必要时引入缺口以 实现最大百分比序列同一性后， 候选序列中与物种依赖性抗体残基相同 ( 即相同残基 ) 或 相似 ( 即根据共同侧链特性来自同一组的氨基酸残基， 见下文 ) 的氨基酸残基的百分比。 N- 末端、 C- 末端、 或对可变域 ( 区 ) 之外的抗体序列内部的延伸、 删除、 或插入都不应视为 影响序列同一性或相似性。
为了延长包含本发明氨基酸序列的抗体或多肽的半衰期， 可如例如美国专利 No.5,739,277 中所记载的将补救受体结合表位附着于抗体 ( 尤其是抗体片段 )。例如， 可以将编码补救受体结合表位的核酸分子与编码本发明多肽序列的核酸在同一读码框内 相连接， 使得由改造后的核酸分子编码的融合蛋白包含补救受体结合表位和本发明的多 肽序列。在用于本文时， 术语 “补救受体结合表位” 指 IgG 分子 ( 例如 IgG1、 IgG2、 IgG3 或 IgG4) 的 Fc 区中负责延长 IgG 分子体内血清半衰期的表位 ( 例如 Ghetie et al.， Ann. Rev.Immunol.18 ： 739-766(2000)， 表 1)。其 Fc 区中有替代且血清半衰期延长的抗体还记载于 WO00/42072 ； WO 02/060919 ； Shields et al.， J.Biol.Chem.276 ： 6591-6604(2001) ； Hinton， J.Biol.Chem.279 ： 6213-6216(2004))。在另一个实施方案中， 还可以通过例如附 着其它多肽序列来延长血清半衰期。例如， 可以将在本发明的方法中有用的抗体或其它多 肽附着于血清清蛋白或血清清蛋白中结合 FcRn 受体或血清清蛋白结合肽的那部分， 使得 血清清蛋白结合该抗体或多肽， 例如此类多肽序列披露于 WO01/45746。在一个实施方案 中， 待附着的血清清蛋白肽包含氨基酸序列 DICLPRWGCLW。在另一个实施方案中， Fab 的半 衰期通过这些方法得到了延长。血清清蛋白结合肽序列还可参见 Dennis et al.， J.Biol. Chem.277 ： 35035-35043(2002)。
“嵌合 VEGF 受体蛋白” 指具有衍生自至少两种不同蛋白质 ( 其中至少一种是 VEGF 受体蛋白 ) 的氨基酸序列的 VEGF 受体分子。在某些实施方案中， 嵌合 VEGF 受体蛋白能够 结合 VEGF 并抑制 VEGF 的生物学活性。
“分离的” 抗体指已经鉴定且自其天然环境的一种成分分开和 / 或回收的多肽或 抗体。 其天然环境的污染性成分指将会干扰该抗体的诊断或治疗用途的物质， 可包括酶、 激 素、 和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在某些实施方案中， 将抗体纯化至 (1) 根据 Lowry 法的测定， 抗体重量超过 95％， 最优选重量超过 99％， (2) 足以通过使用转杯式测序 仪获得至少 15 个残基的 N- 末端或内部氨基酸序列的程度， 或 (3) 根据还原性或非还原性 条件下的 SDS-PAGE 及使用考马斯蓝或银染色， 达到同质。既然抗体天然环境的至少一种成 分不会存在， 那么分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。 然而， 分离的抗体通常将通过至 少一个纯化步骤来制备。 “片段” 指多肽和核酸分子的一部分， 其优选含有参比核酸分子或多肽全长的至少 10％、 20％、 30％、 40％、 50％、 60％、 70％、 80％、 90％、 95％、 或更多。 所述片段可含有 10、 20、 30、 40、 50、 60、 70、 80、 90、 或 100、 200、 300、 400、 500、 600、 或更多个核苷酸， 或者 10、 20、 30、 40、 50、 60、 70、 80、 90、 100、 120、 140、 160、 180、 190、 200 或更多个氨基酸。
“抗 血 管 发 生 剂”或 “血 管 发 生 抑 制 剂”指 或 直 接 或 间 接 抑 制 血 管 发 生 (angiogenesis)、 血管生成 (vasculogenesis)、 或不想要的血管通透性的小分子量物质、 多核苷酸、 多肽、 分离的蛋白质、 重组蛋白、 抗体、 或其偶联物或融合蛋白。应当理解， 抗血 管发生剂包括那些结合并阻断血管发生因子或其受体的血管发生活性的药剂。例如， 抗 血管发生剂是上文定义的血管发生剂的抗体或其它拮抗剂， 例如 VEGF-A 的抗体、 VEGF-A TM 受体 ( 例如 KDR 受体或 Flt-1 受体 ) 的抗体、 抗 PDGFR 抑制剂诸如 Gleevec (Imatinib Mesylate)。抗血管发生剂还包括天然血管发生抑制剂， 例如血管他丁 (angiostatin)、 内皮他丁 (endostatin) 等。参见例如 Klagsbrun and D’ Amore， Annu.Rev.Physiol.53 ： 217-39(1991) ； Streit and Detmar， Oncogene 22 ： 3172-3179(2003)( 例 如 列 举 恶 性 黑 素 瘤 中 抗 血 管 发 生 疗 法 的 表 3) ； Ferrara & Alitalo， Nature Medicine5(12) ： 1359-1364(1999) ； Tonini 等， Oncogene 22 ： 6549-6556(2003)( 例如列举已知抗血管发生 因子的表 2) ； Sato， Int.J.Clin.Oncol.8 ： 200-206(2003)( 例如列举临床试验中所使用的 抗血管发生剂的表 1)。
“加载剂量” 在本文中一般包括施用于患者的治疗剂的初始剂量， 后续其一个或多 个维持剂量。 一般而言， 施用单个加载剂量， 但本文中也设想了多个加载剂量。 通常， 所施用 的加载剂量的量超过所施用的维持剂量的量， 和 / 或加载剂量的施用比维持剂量更频繁，
从而比使用维持剂量更早达到化疗剂的期望稳态浓度。
“维持” (maintenance) 剂量在本文中指在治疗期间或之后施用于患者的一个或多 个剂量的治疗剂。 通常， 维持剂量以一定的治疗间隔施用， 例如以大约每周， 大约每两周， 大 约每三周， 或大约每四周的间隔施用。
“可手术的” 癌症指局限于原发性器官且适合于手术的癌症。
“存活” (survival) 指患者保持存活， 包括无疾病存活 (disease free survival) (DFS) 和总体存活 (overall survival)(OS)。存活可通过 Kaplan-Meier 法来评估， 而且存 活的任何差异可使用分层时序检验 (stratified log-rank test) 来计算。
“无疾病存活 (disease free survival)(DFS)” 指患者自治疗启动或自初始诊断 起保持一定时期活着且癌症没有复发， 诸如约 1 年、 约 2 年、 约 3 年、 约 4 年、 约 5 年、 约 10 年、 等。在本发明的一个方面， DFS 依照治疗意图原则来分析， 即在其指派疗法的基础上评 估患者。 DFS 分析中使用的事件可包括局部、 区域性和远端癌症复发， 继发性癌症发生， 及在 没有在先事件 ( 例如结肠直肠癌复发或第二原发性癌症 ) 的患者中死于任何原因。
“总体存活 (overall survival)” 指患者自治疗启动或自初始诊断起保持一定时 期活着， 诸如约 1 年、 约 2 年、 约 3 年、 约 4 年、 约 5 年、 约 10 年、 等。在本发明基础的研究中， 用于存活分析的事件是任何原因的死亡。 “延长存活 (extending survival)” 或 “提高存活可能性” 意味着使接受治疗的患 者的 DFS 和 / 或 OS 或在给定时间点时仍然活着和 / 或没有疾病的概率相对于未接受治疗 的患者 ( 即相对于未用 VEGF 特异性拮抗剂， 例如抗 VEGF 抗体治疗的患者 ) 或相对于对照 治疗方案 ( 诸如只用化疗剂的治疗， 诸如结肠直肠癌的标准治疗中使用的那些， 例如亚叶 酸、 5- 氟尿嘧啶、 奥沙利铂、 伊利替康或其组合 ) 有延长或提高。存活在治疗启动之后或在 初始诊断之后监测至少约 2 个月、 4 个月、 6 个月、 9 个月、 或至少约 1 年、 或至少约 2 年、 或至 少约 3 年、 或至少约 4 年、 或至少约 5 年、 或至少约 10 年、 等。
存活分析中的 “危害比 (hazard ratio)” 是两条存活曲线之间的差异的汇总， 代表 随访期里与对照相比治疗的死亡风险降低。危害比是事件比率的统计定义。为了本发明的 目的， 危害比定义为代表任何特定时间点时实验分部中的事件概率除以对照分部中的事件 概率。
术语 “并行” 在本文中用于指使用两种或更多种治疗剂， 其中至少部分施用在时间 上交叠。 因而， 并行施用包括如下的剂量给药方案， 一种或多种药剂的施用中断后施用一种 或多种其它药剂。
“单一疗法” 意指如下的治疗方案， 其在治疗期的过程期间只包括单一治疗剂来治 疗癌症或肿瘤。使用 VEGF 特异性拮抗剂的单一疗法意味着在治疗期期间在没有别的抗癌 疗法的情况中施用所述 VEGF 特异性拮抗剂。
“辅助疗法” 在本文中指在确定性手术 ( 其后检测不到残余疾病的迹象 ) 之后给予 的疗法， 从而来降低疾病复发 ( 局部的或转移的 ) 的风险。辅助疗法的目标是预防或延迟 癌症复发， 及因此降低癌症相关死亡的机会。
“维持疗法” 意指在初始治疗性干预的有益结果之后， 为了降低疾病复发或进展的 可能性而给予的治疗方案。维持疗法可提供任意长度的时间， 包括长至受试者终身的延长 的时段。维持疗法可在初始疗法之后或与初始或别的疗法联合提供。用于维持疗法的剂量
可变化， 而且可包括与其它类型的疗法使用的剂量相比降低的剂量。
在本文中， “标准治疗 (standard of care)” 化疗指常规使用来治疗特定癌症的化 疗剂。
“确定性手术 (definitive surgery)” 如该术语在医学界内使用的那样使用， 而且 通常指结果是潜在治愈性的外科手术。确定性手术包括例如导致肿瘤清除或切除的规程、 手术或其它， 包括那些导致所有明显可见肿瘤清除或切除的。确定性手术包括例如肿瘤的 完全的或治愈性的切除或完全总体切除。确定性手术包括以一个或多个阶段进行的规程， 而且包括例如多阶段手术规程， 其中在切除肿瘤之前实施一次或多次手术或其它规程。确 定性手术包括清除或切除肿瘤， 包括累及的器官、 部分器官和组织， 以及周围的器官， 诸如 淋巴结、 部分器官、 或组织的规程。
术语 “癌症” 和 “癌性” 指或描述哺乳动物中特征通常为细胞生长不受调控的生理 疾患。此定义中包括良性和恶性癌症以及休眠肿瘤或微转移。癌症的例子包括但不限于 癌、 淋巴瘤、 母细胞瘤、 肉瘤、 和白血病。此类癌症的更具体例子包括鳞状细胞癌、 肺癌 ( 包 括小细胞肺癌、 非小细胞肺癌、 肺的腺癌、 和肺的鳞癌 )、 腹膜癌、 肝细胞癌、 胃癌 (gastric or stomach cancer)( 包括胃肠癌 )、 胰腺癌、 成胶质细胞瘤、 宫颈癌、 卵巢癌、 肝癌 (liver cancer or hepatic carcinoma)、 膀胱癌、 肝瘤 (hepatoma)、 乳腺癌、 结肠癌、 结肠直肠癌、 子宫内膜癌或子宫癌、 唾液腺癌、 肾癌 (kidney or renal cancer)、 前列腺癌、 外阴癌、 甲状 腺癌、 及各种类型的头和颈癌， 以及 B 细胞淋巴瘤 ( 包括低级 / 滤泡性非何杰金氏淋巴瘤 (NHL)、 小淋巴细胞性 (SL)NHL、 中级 / 滤泡性 NHL、 中级弥漫性 NHL、 高级成免疫细胞性 NHL、 高级成淋巴细胞性 NHL、 高级小无核裂细胞性 NHL、 贮积病 (bulky disease)NHL、 套细胞淋 巴瘤、 AIDS 相关淋巴瘤、 和瓦尔登斯特伦氏 (Waldenstrom) 巨球蛋白血症 )、 慢性淋巴细胞 性白血病 (CLL)、 急性成淋巴细胞性白血病 (ALL)、 毛细胞性白血病、 慢性成髓细胞性白血 病、 和移植后淋巴增殖性病症 (PTLD)、 以及与瘢痣病 (phakomatoses)、 水肿 ( 诸如与脑瘤有 关的 ) 和梅格斯氏 (Meigs) 综合征有关的异常血管增殖。
“转移” 指癌自其原发部位传播至身体中的其它位置。癌细胞能脱离原发性肿瘤， 渗透入淋巴和血管， 经由血流而循环， 和在身体中其它地方的正常组织中的远端病灶 ( 转 移 ) 中生长。转移可以是当地的或远端的。认为转移是一个连续过程， 视肿瘤细胞自原发 性肿瘤脱落、 经由血流而传播、 并在远端部位停止而定。在新的部位， 该细胞建立血供且能 生长至形成危及生命的团块。肿瘤细胞内的刺激性和抑制性分子途径调节这种行为， 而且 肿瘤细胞与远端部位中的宿主细胞之间的相互作用也是重要的。
“微转移 (micrometastasis)” 指自原发性肿瘤传播至身体其它部分的少数细胞。 微转移在筛选或诊断测试中可以检测得到或检测不到。
“癌症复发” 在本文中指癌症在治疗后回来， 而且包括癌症在原发性器官中的回 来， 以及远端复发， 即癌症在原发性器官以外回来。
处于 “高癌症复发风险” 的受试者是具有更大机会经历癌症复发的受试者。例如， 相对年轻的受试者 ( 例如不到约 50 岁 )， 具有阳性淋巴结 ( 特别是 4 个或更多个累及淋巴 结， 包括 4-9 个累及淋巴结， 和 10 个或更多个累及淋巴结 ) 的那些， 及具有直径大于 2cm 的 肿瘤 ( 例如在乳腺癌患者中 ) 的那些。受试者的风险水平可以由熟练内科医师来测定。一 般地， 此类高风险受试者会具有淋巴结累及 ( 例如 4 个或更多个累及的淋巴结 ) ； 然而， 没有淋巴结累及的受试者也会是高风险的， 例如如果他们的肿瘤大于或等于 2cm 的话。
“癌症复发风险降低” 表示相对于未接受治疗的患者 ( 相对于未用 VEGF 特异性拮 抗剂， 例如抗 VEGF 抗体治疗的患者 ) 或相对于对照治疗方案 ( 诸如只用化疗剂的治疗， 诸 如结肠直肠癌的标准治疗中使用的那些， 例如亚叶酸 (leucovorin)、 5- 氟尿嘧啶、 奥沙利 铂 (oxaliplatin)、 伊利替康 (irinotecan) 或其组合 ) 降低经历癌症复发的可能性。癌症 复发在治疗启动之后或在初始诊断之后监测至少约 2 个月、 4 个月、 6 个月、 9 个月、 或至少约 1 年、 或至少约 2 年、 或至少约 3 年、 或至少约 4 年、 或至少约 5 年、 或至少约 10 年、 等。
“治疗启动” 指外科切除肿瘤之后治疗方案的开始。在一个实施方案中， 这可以指 在外科之后施用一种或多种化疗剂。或者， 这可以指 VEGF 特异性拮抗剂， 例如抗 VEGF 抗体 和一种或多种化疗剂的初始施用。
“治愈” 癌症在本文中表示开始辅助疗法之后约 2、 3、 4 或约 5 年没有癌症复发， 这 取决于癌症的类型。
“肿瘤” 在用于本文时指所有赘生性 (neoplastic) 细胞生长和增殖， 无论是恶性的 还是良性的， 及所有癌前 (pre-cancerous) 和癌性细胞和组织。
“肿瘤休眠” 指一种延长的静止状态， 其中肿瘤细胞存在但肿瘤进展在临床上不明 显。休眠的肿瘤在筛选或诊断测试中可以检测得到或检测不到。
“受试者” 指哺乳动物， 包括但不限于人或非人哺乳动物， 诸如牛、 马、 犬、 绵羊、 或 猫。优选地， 受试者指人。在本文中， 患者也是受试者。
受试者 “群体” 指一组癌症受试者， 诸如临床试验中的， 或对特定适应证诸如癌症 辅助疗法批准例如 FDA 批准之后肿瘤学家看到的。
术语 “抗癌疗法” 指在治疗癌症中有用的疗法。抗癌治疗剂的例子包括但不限 于例如外科手术、 化疗剂、 生长抑制剂、 细胞毒剂、 放射疗法中所使用的药剂、 抗血管发生 剂、 凋亡剂、 抗微管蛋白剂、 和其它治疗癌症的药剂， 诸如抗 HER-2 抗体、 抗 CD20 抗体、 表皮生长因子受体 (EGFR) 拮抗剂 ( 例如酪氨酸激酶抑制剂 )、 HER1/EGFR 抑制剂 ( 例 如 erlotinib )、 血 小 板 衍 生 生 长 因 子 抑 制 剂 ( 例 如 GleevecTM(Imatinib Mesylate))、 COX-2 抑制剂 ( 例如 celecoxib)、 干扰素、 细胞因子、 结合一种或多种以下靶物 的拮抗剂 ( 例如中和性抗体 )(ErbB2、 ErbB3、 ErbB4、 PDGFR-β、 BlyS、 APRIL、 BCMA 或 VEGF 受体、 TRAIL/Apo2)、 和其它生物活性和有机化学剂， 等。 本发明还两种或更多种这些药剂的 组合。 术语 “细胞毒剂” 在用于本文时指抑制或阻止细胞功能和 / 或引起细胞破坏的物 质。该术语意图包括放射性同位素 ( 例如 At211、 I131、 I125、 Y90、 Re186、 Re188、 Sm153、 Bi212、 p32 和 Lu 的放射性同位素 )、 化疗剂、 和毒素诸如小分子毒素或细菌、 真菌、 植物或动物起源的酶 活毒素， 包括其片段和 / 或变体。
“化疗剂” 指可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的例子包括可用于治疗癌症的 化学化合物。化疗剂的例子包括烷化剂类 (alkylating agents)， 诸如塞替派 (thiotepa) 和 环 磷 酰 胺 (cyclophosphamide) ； 磺 酸 烷 基 酯 类 (alkyl sulfonates)， 诸如白消安 (busulfan)、 英丙舒凡 (improsulfan) 和哌泊舒凡 (piposulfan) ； 氮丙啶类 (aziridines)， 诸如苯佐替派 (benzodepa)、 卡波醌 (carboquone)、 美妥替派 (meturedepa) 和乌瑞替派 (uredepa) ； 乙撑亚胺类 (ethylenimines) 和甲基蜜胺类 (methylamelamines)，
包 括 六 甲 蜜 胺 (altretamine)、 三 乙 撑 蜜 胺 (triethylenemelamine)、 三乙撑磷酰胺 (triethylenephosphoramide)、 三 乙 撑 硫 代 磷 酰 胺 (triethylenethiophosphoramide) 和三羟甲蜜胺 (trimethylolomelamine) ； 番荔枝内酯类 (acetogenins)( 尤其是布拉他 辛 (bullatacin) 和 布 拉 他 辛 酮 (bullatacinone)) ； 喜 树 碱 (camptothecin)( 包 括 合 成 类 似 物 托 泊 替 康 (topotecan)) ； 苔 藓 抑 素 (bryostatin) ； callystatin ； CC-1065( 包 括 其 阿 多 来 新 (adozelesin)、 卡 折 来 新 (carzelesin) 和 比 折 来 新 (bizelesin) 合 成类似物 )； 隐 藻 素 类 (cryptophycins)( 特 别 是 隐 藻 素 1 和 隐 藻 素 8) ； 多拉司他 汀 (dolastatin) ； duocarmycin( 包 括 合 成 类 似 物， KW-2189 和 CB1-TM1) ； 艾榴塞洛素 (eleutherobin) ； pancratistatin ； sarcodictyin ； 海 绵 抑 素 (spongistatin) ； 氮芥类 (nitrogen mustards)， 诸如苯丁酸氮芥 (chlorambucil)、 萘氮芥 (chlomaphazine)、 胆磷 酰 胺 (cholophosphamide)、 雌 莫 司 汀 (estramustine)、 异 环 磷 酰 胺 (ifosfamide)、 双氯 乙 基 甲 胺 (mechlorethamine)、 盐 酸 氧 氮 芥 (mechlorethamine oxide hydrochloride)、 美 法 仑 (melphalan)、 新 氮 芥 (novembichin)、 苯 芥 胆 甾 醇 (phenesterine)、 泼尼莫 司 汀 (prednimustine)、 曲 磷 胺 (trofosfamide)、 尿 嘧 啶 氮 芥 (uracil mustard) ； 亚 硝 脲 类 (nitrosoureas)， 诸 如 卡 莫 司 汀 (carmustine)、 氯 脲 菌 素 (chlorozotocin)、 福 莫 司 汀 (fotemustine)、 洛 莫 司 汀 (lomustine)、 尼 莫 司 汀 (nimustine) 和 雷 莫 司 汀 (ranimustine) ； 抗 生 素 类， 诸 如 烯 二 炔 类 抗 生 素 (enediyne)( 例 如 加 利 车 霉 素 (calicheamicin)， 尤其是加利车霉素 γ1I 和加利车霉素 ωI1( 参见例如 Agnew(1994) Chem.Intl.Ed.Engl.33 ： 183-186) ； 蒽环类抗生素 (dynemicin)， 包括 dynemicin A ； 二膦 酸盐类 (bisphosphonates)， 诸如氯膦酸盐 (clodronate) ； 埃斯波霉素 (esperamicin) ； 以及新制癌素 (neocarzinostatin) 发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团 )、 阿 克 拉 霉 素 (aclacinomycin)、 放 线 菌 素 (actinomycin)、 氨 茴 霉 素 (anthramycin)、 偶氮 丝 氨 酸 (azaserine)、 博 来 霉 素 (bleomycin)、 放 线 菌 素 C(cactinomycin)、 carabicin、 洋 红 霉 素 (carminomycin)、 嗜 癌 霉 素 (carzinophilin)、 色 霉 素 (chromomycin)、 放线 菌 素 D(dactinomycin)、柔 红 霉 素 (daunorubicin)、地 托 比 星 (detorubicin)、 6- 二 氮 -5- 氧 -L- 正亮氨酸、 多柔比星 (doxorubicin)( 包括吗啉代多柔比 星、 氰基吗啉代多柔比星、 2- 吡咯代多柔比星和脱氧多柔比星 )、 表柔比星 (epirubicin)、 依索比星 (esorubicin)、 伊达比星 (idarubicin)、 麻西罗霉素 (marcellomycin)、 丝裂霉素 类 (mitomycins) 诸如丝裂霉素 C、 霉酚酸 (mycophenolic acid)、 诺拉霉素 (nogalamycin)、 橄 榄 霉 素 (olivomycin)、 培 洛 霉 素 (peplomycin)、 泊 非 霉 素 (potfiromycin)、 嘌呤 霉 素 (puromycin)、三 铁 阿 霉 素 (quelamycin)、罗 多 比 星 (rodorubicin)、链 黑 菌 素 (streptonigrin)、 链 佐 星 (streptozocin)、 杀 结 核 菌 素 (tubercidin)、 乌苯美司 (ubenimex)、 净司他丁 (zinostatin)、 佐柔比星 (zorubicin) ； 抗代谢物类， 诸如甲氨蝶呤 (methotrexate) 和 5- 氟尿嘧啶 (5-FU) ； 叶酸类似物， 诸如二甲叶酸 (denopterin)、 甲氨 蝶呤 (methotrexate)、 蝶罗呤 (pteropterin)、 三甲曲沙 (trimetrexate) ； 嘌呤类似物， 诸 如 氟 达 拉 滨 (fludarabine)、 6- 巯 基 嘌 呤 (mercaptopurine)、 硫 咪 嘌 呤 (thiamiprine)、 硫 鸟 嘌 呤 (thioguanine) ； 嘧 啶 类 似 物， 诸 如 安 西 他 滨 (ancitabine)、 阿扎胞苷 (azacitidine)、 6- 氮 尿 苷 (azauridine)、 卡 莫 氟 (carmofur)、 阿 糖 胞 苷 (cytarabine)、 双脱氧尿苷 (dideoxyuridine)、 去氧氟尿苷 (doxifluridine)、 依诺他滨 (enocitabine)、氟 尿 苷 (floxuridine) ； 雄 激 素 类， 诸 如 卡 鲁 睾 酮 (calusterone)、 丙酸屈他雄酮 (dromostanolone propionate)、 表 硫 雄 醇 (epitiostanol)、 美 雄 烷 (mepitiostane)、 睾 内 酯 (testolactone) ； 抗 肾 上 腺 类， 诸 如 氨 鲁 米 特 (aminoglutethimide)、 米托坦 (mitotane)、 曲 洛 司 坦 (trilostane) ； 叶 酸 补 充 剂， 诸 如 亚 叶 酸 (folinic acid) ； 醋葡 醛 内 酯 (aceglatone) ； 醛 磷 酰 胺 糖 苷 (aldophosphamide glycoside) ； 氨基乙酰丙酸 (aminolevulinic acid) ； 恩 尿 嘧 啶 (eniluracil) ； 安 吖 啶 (amsacrine) ； bestrabucil ； 比 生 群 (bisantrene) ； 依 达 曲 沙 (edatraxate) ； 地 磷 酰 胺 (defosfamide) ； 地美可辛 (demecolcine) ； 地吖醌 (diaziquone) ； elfornithine ； 依利醋铵 (elliptinium acetate) ； 埃 坡 霉 素 (epothilone) ； 依 托 格 鲁 (etoglucid) ； 硝酸镓； 羟 脲 (hydroxyurea) ； 香 菇 多 糖 (lentinan) ； 氯 尼 达 明 (lonidamine) ； 美 登 木 素 生 物 碱 类 (maytansinoids)， 诸 如 美 登 素 (maytansine) 和 安 丝 菌 素 (ansamitocin) ； 米 托 胍 腙 (mitoguazone) ； 米 托 蒽 醌 (mitoxantrone) ； 莫 哌 达 醇 (mopidamol) ； 二 胺 硝 吖 啶 (nitracrine) ； 喷 司 他 丁 (pentostatin) ； 蛋 氨 氮 芥 (phenamet) ； 吡 柔 比 星 (pirarubicin) ； 洛索蒽醌 (losoxantrone) ； 鬼 臼 酸 (podophyllinic acid) ； 2- 乙 基 酰 肼 (ethylhydrazide) ； 丙卡 巴 肼 (procarbazine) ； 多 糖 复 合 物 (JHS Natural Products， Eugene， OR) ； 雷佐 生 (razoxane) ； 根霉素 (rhizoxin) ； 西佐喃 (sizofiran) ； 螺旋锗 (spirogermanium) ； 细 交链孢菌酮酸 (tenuazonic acid) ； 三亚胺醌 (triaziquone) ； 2， 2 ′， 2 ″ - 三氯三乙胺 ； 单端孢菌素类 (trichothecenes)( 尤其是 T-2 毒素、 疣孢菌素 (verrucarin)A、 杆孢菌素 (roridin)A 和蛇行菌素 (anguidin)) ； 乌拉坦 (urethan) ； 长春地辛 (vindesine) ； 达卡 巴 嗪 (dacarbazine) ； 甘 露 莫 司 汀 (mannomustine) ； 二 溴 甘 露 醇 (mitobronitol) ； 二溴 卫 矛 醇 (mitolactol) ； 哌 泊 溴 烷 (pipobroman) ； gacytosine ； 阿 糖 胞 苷 (arabinoside) (“Ara-C” )； 环磷酰胺 (cyclophosphamide) ； 塞替派 (thiotepa) ； 类紫杉醇类 (taxoids)， 例如 帕 利 他 塞 (paclitaxel)(Bristol-Myers Squibb Oncology， Princeton， N.J.)、 不含 克列 莫佛 (Cremophor)、 清蛋白 改造 纳米 颗粒 剂型 帕利 他 塞 (American Pharmaceutical Partners， Schaumberg， Illinois) 和 多 西 他 塞 (doxetaxel)( -Poulenc Rorer， Antony， France) ；苯 丁 酸 氮 芥 (chlorambucil) ； 吉西他滨 (gemcitabine) ； 6- 硫鸟嘌呤 (thioguanine) ； 巯 基嘌呤 (mercaptopurine) ； 甲氨蝶呤 (methotrexate) ； 铂类似物， 诸如顺铂 (cisplatin)、 奥沙利铂 (oxaliplatin) 和卡铂 (carboplatin) ； 长春碱 (vinblastine) ； 铂 (platinum) ； 依托泊苷 (etoposide)(VP-16) ； 异环磷酰胺 (ifosfamide) ； 米托蒽醌 (mitoxantrone) ； 长 春新碱 (vincristine) ； 长春瑞滨 (vinorelbine) ； 能灭瘤 (novantrone) ； 替 尼 泊 苷 (teniposide) ； 依 达 曲 沙 (edatrexate) ； 道 诺 霉 素 (daunomycin) ； 氨基蝶呤 (aminopterin) ； 希罗达 (xeloda) ； 伊本膦酸盐 (ibandronate) ； 伊立替康 (irinotecan) (Camptosar， CPT-11)( 包括伊立替康及 5-FU 和亚叶酸的治疗方案 ) ； 拓扑异构酶抑制 剂 RFS 2000 ； 二氟甲基鸟氨酸 (DMFO) ； 类视黄酸类 (retinoids)， 诸如视黄酸 (retinoic acid) ； 卡 培 他 滨 (capecitabine) ； 考 布 他 汀 (combretastatin) ； 亚 叶 酸 (leucovorin) (LV) ； 奥沙利铂 (oxaliplatin)， 包括奥沙利铂治疗方案 (FOLFOX) ； PKC-α、 Raf、 H-Ras、 EGFR ( 例如 erlotinib ) 和 VEGF-A 的、 降低细胞增殖的抑制剂 ； 及任何上述物 质的药剂学可接受的盐、 酸或衍生物。该定义还包括作用于调节或抑制激素对肿瘤作用的抗激素剂诸如抗雌激 素 类 和 选 择 性 雌 激 素 受 体 调 控 物 类 (SERM)， 包 括 例 如 他 莫 昔 芬 (tamoxifen)( 包 括 他 莫 昔 芬 )、雷 洛 昔 芬 (raloxifene)、屈 洛 昔 芬 (droloxifene)、 4- 羟 基 他 莫 昔 芬、 曲 沃 昔 芬 (trioxifene)、 那 洛 昔 芬 (keoxifene)、 LY117018、 奥 那 司 酮 (onapristone) 和 托 瑞 米 芬 (toremifene) ； 抑制在肾上 腺 中 调 节 雌 激 素 生 成 的 芳 香 酶 的 芳 香 酶 抑 制 剂， 诸 如 例 如 4(5)- 咪 唑、 氨鲁米特 (aminoglutethimide)、 醋酸甲地孕酮 (megestrolacetate)、 浓 西 美 坦 (exemestane)、福 美 坦 (formestane)、法 倔 唑 (fadrozole)、 伏 罗 唑 (vorozole)、 来 曲 唑 (letrozole) 和 阿那曲唑 (anastrozole) ； 抗雄激素类， 诸如氟他米特 (flutamide)、 尼鲁米特 (nilutamide)、 比卡 米特 (bicalutamide)、 亮丙瑞林 (leuprolide)、 和戈舍瑞林 (goserelin) ； 以及曲沙他滨 (troxacitabine)(1， 3- 二氧戊环核苷胞嘧啶类似物 ) ； 反义寡核苷酸， 特别是抑制涉及异 常 (abherant) 细胞增殖的信号途经中的基因表达的反义寡核苷酸， 诸如例如 PKC-α、 Ralf 和 H-Ras ； 核酶， 诸如 VEGF 表达抑制剂 ( 例如 核酸 ) 和 HER2 表达抑制剂 ； 疫苗， 诸如基因疗法疫苗， 例如 疫苗、 疫苗和 疫苗 ； rIL-2 ； 拓扑异构酶 1 抑制剂 ； rmRH ； 及任何上述物质的药剂学可接受的盐、 酸或衍生物。
术语 “细胞因子” 是由一种细胞群释放， 作为细胞间介质作用于另一细胞的蛋白 质的通称。此类细胞因子的例子有淋巴因子、 单核因子和传统的多肽激素。细胞因子中包 括生长激素， 诸如人生长激素、 N- 甲硫氨酰人生长激素和牛生长激素 ； 甲状旁腺素 ； 甲状腺 素； 胰岛素 ； 胰岛素原 ； 松驰素 ； 松驰素原 ； 糖蛋白激素类， 诸如促卵泡激素 (FSH)、 促甲状 腺激素 (TSH) 和促黄体激素 (LH) ； 表皮生长因子 ； 肝生长因子 ； 成纤维细胞生长因子 ； 促乳 素； 胎盘催乳激素 ； 肿瘤坏死因子 -α 和 -β ； 穆勒氏 (Mullerian) 抑制性物质 ； 小鼠促性 腺激素相关肽 ； 抑制素 ； 激活素 ； 血管内皮生长因子 ； 整联蛋白 ； 血小板生成素 (TPO) ； 神经 生长因子， 诸如 NGF-α ； 血小板生长因子 ； 转化生长因子 (TGF)， 诸如 TGF-α 和 TGF-β ； 胰 岛素样生长因子 -I 和 -II ； 红细胞生成素 (EPO) ； 骨诱导因子 (osteoinductive factor) ； 干扰素， 诸如干扰素 -α、 -β 和 -γ ； 集落刺激因子 (CSF)， 诸如巨噬细胞 CSF(M-CSF)、 粒细 胞 - 巨噬细胞 CSF(GM-CSF) 和粒细胞 CSF(G-CSF) ； 白介素 (IL)， 诸如 IL-1、 IL-1α、 IL-2、 IL-3、 IL-4、 IL-5、 IL-6、 IL-7、 IL-8、 IL-9、 IL-10、 IL-11、 IL-12 ； 肿瘤坏死因子， 诸如 TNF-α 或 TNF-β ； 及其它多肽因子， 包括 LIF 和 kit 配体 (KL)。在用于本文时， 术语细胞因子包括 来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质及天然序列细胞因子的生物学活性等效物。
“生长抑制剂” 在用于本文时指在体外和 / 或在体内抑制细胞生长的化合物或组 合物。如此， 生长抑制剂可以是显著降低处于 S 期的细胞百分比的药剂。生长抑制剂的 例子包括阻断细胞周期行进 ( 处于 S 期以外的位置 ) 的药剂， 诸如诱导 G1 停滞和 M 期停 滞的药剂。经典的 M 期阻断剂包括长春药类 (vincas)( 长春新碱 (vincristine) 和长春 碱 (vinblastine))、 和拓扑异构酶 II 抑制剂诸如多柔比星 (doxorubicin)、 表 柔 比 星 (epirubicin)、 柔 红 霉 素 (daunorubicin)、 依 托 泊 苷 (etoposide) 和 博 来 霉 素 (bleomycin)。 那 些 阻 滞 G1 的 药 剂 也 溢 出 进 入 S 期 停 滞， 例 如 DNA 烷 化 剂 类 诸 如 他 莫 昔 芬 (tamoxifen)、 泼 尼 松 (prednisone)、 达 卡 巴 嗪 (dacarbazine)、 双氯乙基甲 胺 (mechlorethamine)、顺 铂 (cisplatin)、甲 氨 喋 呤 (methotrexate)、 5- 氟 尿 嘧 啶 (5-fluorouracil) 和 ara-C。 更 多 信 息 可 参 见 The Molecular Basis of Cancer， Mendelsohn and Israel 编，第 1 章，题 为 “Cell cycle regulation， oncogenes， and antineoplastic drugs” ， Murakami et al.， WB Saunders， Philadelphia(1995)， 尤其是第 13 页。
术语 “前体药物” 在用于本申请时指与母药 (parent drug) 相比对肿瘤细胞的细 胞毒性较小并能够酶促活化或转变为更具活性母药形式的药用活性物质的前体或衍生物 形式。参见例如 Wilman， “Prodrugs in Cancer Chemotherapy” ， Biochemical Society Transactions， 14， pp.375-382， 615thMeeting Belfast(1986) 和 Stella 等， “Prodrugs ： A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery” ， Directed Drug Delivery， Borchardt 等， 编， pp.247-267， Humana Press(1985)。本发明的前体药物包括但不限于含磷酸盐 / 酯 前体药物、 含硫代磷酸盐 / 酯前体药物、 含硫酸盐 / 酯前体药物、 含肽前体药物、 D- 氨基酸 修饰前体药物、 糖基化前体药物、 含 β- 内酰胺前体药物、 含任选取代苯氧基乙酰胺的前体 药物或含任选取代苯乙酰胺的前体药物、 可转化为更具活性而无细胞毒性的药物的 5- 氟 胞嘧啶和其它 5- 氟尿苷前体药物。可衍生为本发明使用的前体药物形式的细胞毒性药物 的例子包括但不限于上文描述的那些化疗剂。 “放射疗法” 或 “放疗” 指使用定向伽马射线或贝塔射线来诱发对细胞的足够损 伤， 以限制细胞正常发挥功能的能力或全然破坏细胞。应当领会， 本领域知道许多方式来 确定治疗的剂量和持续时间。典型的治疗作为一次施用来给予， 而典型的剂量范围为每天 10-200 个单位 ( 戈瑞 (Gray))。
“降低或抑制” 指引起优选 20％或更多、 更优选 50％或更多、 且最优选 75％、 85％、 90％、 95％、 或更多的总体降低的能力。降低或抑制可以指所治疗的病症的症状、 转移或微 转移的存在或大小、 原发性肿瘤的大小、 肿瘤的存在或大小、 或血管发生性病症中血管的大 小或数目。
术语 “静脉内输注” 指以超过约 5 分钟的一段时间， 优选 30-90 分钟， 将药物导入 动物或人患者的静脉， 尽管依照本发明， 静脉内输注或可施用 10 小时或更短。
术语 “静脉内推注” 或 “静脉内快速注射” 指在约 15 分钟内或更短， 优选 5 分钟或 更短， 将药物施用到动物或人的静脉中使得机体接受药物。
术语 “皮下施用” 指通过自药物容器的相对较慢的、 持续投递， 将药物导入动物或 人患者的皮肤下， 优选在皮肤和皮下组织间的袋内。所述袋可通过夹起或拉起皮肤并远离 皮下组织来创建。
术语 “皮下输注” 指以一段时间， 包括但不限于 30 分钟或更短， 或者 90 分钟或更 短， 通过自药物容器的相对较慢的、 持续投递， 将药物导入动物或人患者的皮肤下， 优选在 皮肤和皮下组织间的袋内。任选的是， 输注可通过植入动物或人患者皮肤下的药物投递泵 的皮下植入来进行， 其中所述泵以预定的一段时间， 诸如 30 分钟、 90 分钟、 或跨越治疗方案 持续时间的一段时间， 投递预定量的药物。
术语 “皮下推注” 指将药物施用至动物或人患者的皮肤下， 其中推注药物投递优选 短于约 15 分钟， 更优选短于 5 分钟， 最优选短于 60 秒。施用优选在皮肤和皮下组织间的袋 内， 其中所述袋可通过例如夹起或拉起皮肤并远离皮下组织来创建。
“病症” 指任何会受益于使用抗 VEGF 抗体的治疗的疾患。这包括慢性和急性病症或疾病， 包括那些使哺乳动物倾向于所讨论病症的病理状况。本文中待治疗的病症的非限 制性例子包括癌症 ； 良性和恶性肿瘤 ； 白血病和淋巴样恶性肿瘤 ； 神经元、 神经胶质、 星形 胶质细胞、 下丘脑和其它腺体、 巨噬细胞、 上皮、 基质和囊胚腔病症 ； 及炎性、 血管发生性和 免疫学病症。
术语 “治疗有效量” 指在哺乳动物中有效治疗疾病或病症的药物量。在癌症的情 况中， 治疗有效量的药物可减少癌细胞的数目 ； 缩小肿瘤的尺寸 ； 抑制 ( 即一定程度的减 缓， 优选阻止 ) 癌细胞浸润入周围器官 ； 抑制 ( 即一定程度的减缓， 优选阻止 ) 肿瘤转移 ； 一 定程度的抑制肿瘤生长 ； 和 / 或一定程度的减轻一种或多种与病症有关的症状。对于肿瘤 休眠或微转移的治疗， 治疗有效量的药物可减少微转移的数目或增殖 ； 减少或预防休眠肿 瘤的生长 ； 或减少或预防治疗或切除后肿瘤的复发 ( 例如使用抗癌疗法， 诸如外科、 放疗、 或化疗 )。根据药物可阻止现有癌细胞生长和 / 或杀死现有癌细胞的程度， 它可以是细胞 抑制性的和 / 或细胞毒性的。对于癌症疗法， 可以例如通过评价存活持续时间、 无疾病存 活 (DFS)、 距疾病进展的时间 (TTP)、 无进展存活持续时间 (PFS)、 响应率 (RR)、 响应持续时 间、 消退时间、 和 / 或生活质量来测量体内功效。 有效量可改善无疾病存活 (DFS)， 改善总体 存活 (OS)， 降低复发可能性， 延长距复发的时间， 延长距远端复发 ( 即原发性部位以外的复 发 ) 的时间， 治愈癌症， 改善癌症的症状 ( 例如如使用癌症特异性调查测量的 )， 减少第二原 发性癌症的出现， 等。
“治疗” 或 “处理” 指治疗性处理和预防性或防范性措施二者。需要治疗的受试者 包括早就患有病症的受试者以及要预防病症的受试者， 包括要预防癌症发生或复发的受试 者。
如本文中使用的， “积极治疗” 指期间对患者施用治疗性药物的时间段。例如， 如果 在 1 年的过程里每 2 周对患者施用治疗性药物， 之后没有治疗或其它疗法， 那么使用治疗性 药物进行的积极治疗指对患者施用该药物的 1 年时段。
术语 “标记物” 在用于本文时指与多肽直接或间接偶联的可检测化合物或组合物。 标记物自身可以是通过自身就可检测的 ( 例如放射性同位素标记物或荧光标记物 )， 或者 在酶标记物的情况中， 可催化可检测的底物化合物或组合物的化学改变。
通过述及将此说明书中提到的所有出版物、 专利申请、 和专利收入本文， 其程度如 同明确且单独指示每一篇独立的出版物、 专利、 或专利申请通过述及来收录。
II. 抗 VEGF 抗体和拮抗剂
(i)VEGF 抗原
要用于生成抗体的 VEGF 抗原可以是例如 VEGF165 分子以及 VEGF 的其它同等型或 其含有期望表位的片段。可用于生成本发明的抗 VEGF 抗体的其它形式的 VEGF 对于本领域 技术人员会是显而易见的。
人 VEGF 首先是使用牛 VEGF cDNA 作为杂交探针筛选自人细胞制备的 cDNA 文库而 获得的。Leung et al.(1989)Science， 246 ： 1306。一种由此鉴定出的 cDNA 编码一种 165 个氨基酸的蛋白质， 其与牛 VEGF 具有超过 95％的同源性 ； 此 165 个氨基酸的蛋白质通常称 作人 VEGF(hVEGF) 或 VEGF165。人 VEGF 的促有丝分裂活性通过在哺乳动物宿主细胞中表达 人 VEGF 得到了验证。由经人 VEGF cDNA 转染的细胞条件化的培养基促进毛细血管内皮细胞增殖， 而对照细胞不然。Leung et al.(1989)Science， 见上文。
虽然可以自天然来源分离和纯化血管内皮细胞生长因子， 随后用于治疗用途， 但 是该蛋白质在滤泡细胞中相对低的浓度和回收 VEGF 在努力和费用两个方面高的成本证明 在商业上是无效的。因而， 进行进一步努力来经重组 DNA 技术克隆和表达 VEGF。( 参见例 如 Ferrara， Laboratory Investigation 72 ： 615-618(1995) 及其中引用的参考文献 )。
源自可变 RNA 剪接， VEGF 在多种组织中作为多种同二聚体形式 ( 每个单体 121、 145、 165、 189、 和 206 个氨基酸 ) 表达。VEGF121 是一种可溶性丝裂原， 不结合肝素 ； 更长形 式的 VEGF 以越来越高的亲和力结合肝素。肝素结合形式的 VEGF 可以在羧基末端被纤溶 酶切割以释放可扩散形式的 VEGF。纤溶酶切割后鉴定出的羧基末端肽的氨基酸测序是 Arg110-Ala111。作为同二聚体分离到的氨基末端 “核心” 蛋白， VEGF(1-110) 以与完整 VEGF165 同二聚体相比相似的亲和力结合中和性单克隆抗体 ( 诸如称作 4.6.1 和 3.2E3.1.1 的抗 体 ) 和可溶性形式的 VEGF 受体。
最近还鉴定出数种在结构上与 VEGF 有关的分子， 包括胎盘生长因子 (PIGF)、 VEGF-B、 VEGF-C、 VEGF-D 和 VEGF-E。Ferrara 和 Davis-Smyth(1987)Endocr.Rev.，见 上 文； Ogawa et al.J.Biological Chem.273 ： 31273-31281(1998) ； Meyer et al.EMBO J.， 18 ： 363-374(1999)。 受 体 酪 氨 酸 激 酶 Flt-4(VEGFR-3) 鉴 定 为 VEGF-C 和 VEGF-D 的 受 体。Joukov et al.EMBO.J.15 ： 1751(1996) ； Lee et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93 ： 1988-1992(1996) ； Achen et al.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95 ： 548-553。 VEGF-C 显 示出涉及对淋巴管发生的调节。Jeltsch et al.Science 276 ： 1423-1425(1997)。
已经鉴定出两种 VEGF 受体， 即 Flt-1( 也称作 VEGFR-1) 和 KDR( 也称作 VEGFR-2)。 Shibuya et al.(1990)Oncogene 8 ： 519-527 ； de Vries et al.(1992)Science 255 ： 989-991 ； Terman et al.(1992)Biochem.Biophys.Res.Commun.187 ： 1579-1586。神经毡蛋 白 -1 显示为选择性 VEGF 受体， 能够结合肝素结合性 VEGF 同等型 (Soker et al.(1998) Cell 92 ： 735-45)。Flt-1 和 KDR 都属于受体酪氨酸激酶 (RTK) 家族。RTK 包含具有多样 生物学活性的跨膜受体的大家族。目前， 鉴定出至少十九 (19) 个独特 RTK 亚家族。受体 酪氨酸激酶 (RTK) 家族包括对于多种细胞类型的生长和分化至关重要的受体 (Yarden 和 Ullrich(1988)Ann.Rev.Biochem.57 ： 433-478 ； Ullrich 和 Schlessinger(1990)Cell 61 ： 243-254)。RTK 的内在功能在配体结合后被活化， 导致受体和多种细胞底物磷酸化， 随后导 致多种细胞应答 (Ullrich & Schlessinger(1990)Cell 61 ： 203-212)。 如此， 受体酪氨酸激 酶介导的信号转导通过与特定生长因子 ( 配体 ) 的细胞外相互作用而启动， 通常接着是受 体二聚化、 刺激内在蛋白质酪氨酸激酶活性和受体转磷酸。由此为细胞内信号转导分子创 建结合位点， 并导致与一系列细胞质信号传导分子的复合物形成， 推动适宜细胞应答。( 例 如细胞分裂、 分化、 代谢影响、 细胞外微环境的变化 ) 参见 Schlessinger 和 Ullrich(1992) Neuron 9 ： 1-20。 在结构上， Flt-1 和 KDR 都具有胞外域中的七个免疫球蛋白样结构域、 单个 跨膜区、 和被激酶插入域中断的共有酪氨酸激酶序列。 Matthews et al.(1991)Proc.Natl. Acad.Sci.USA 88 ： 9026-9030 ； Terman et al.(1991)Oncogene 6 ： 1677-1683。
(ii) 抗 VEGF 抗体
在本发明的方法中有用的抗 VEGF 抗体包括任何抗体或其抗原结合片段， 它们以 足够亲和力和特异性结合 VEGF 且能降低或抑制 VEGF 的生物学活性。 抗 VEGF 抗体通常不会结合其它 VEGF 同源物， 诸如 VEGF-B 或 VEGF-C， 也不会结合其它生长因子， 诸如 PlGF、 PDGF、 或 bFGF。
在本发明的某些实施方案中， 抗 VEGF 抗体包括但不限于与由杂交瘤 ATCC HB 10709 生 成 的 单 克 隆 抗 VEGF 抗 体 A4.6.1 ； 依 照 Presta et al.(1997)Cancer Res.57 ： 4593-4599 生成的重组人源化抗 VEGF 单克隆抗体结合相同表位的单克隆抗体。 在一个实施 方案中， 抗 VEGF 抗体是 “贝伐单抗 (BV)” ， 也称作 “rhuMAb VEGF” 或 它包含 经过突变的人 IgG1 框架区和来自小鼠抗 hVEGF 单克隆抗体 A.4.6.1 的抗原结合互补决定 区， 阻断人 VEGF 结合其受体。贝伐单抗大约 93％的氨基酸序列 ( 包括大部分框架区 ) 是自 人 IgG1 衍生， 而且约 7％的序列是自小鼠抗体 A4.6.1 衍生的。
贝伐单抗和其它人源化抗 VEGF 抗体进一步记载于 2005 年 2 月 26 日公告的美国 专利 No.6,884,879。别的抗体包括 G6 或 B20 系列抗体 ( 例如 G6-31、 B20-4.1)， 如记载于 PCT 公开号 WO2005/012359、 PCT 公开号 WO2005/044853、 和美国专利申请 60/991,302， 通过 述及明确将这些专利申请的内容收入本文。对于别的抗体， 参见美国专利 No.7,060,269， 6,582,959， 6,703,020 ； 6,054,297 ； WO98/45332 ； WO 96/30046 ； WO94/10202 ； EP0666868B1 ； 美 国 专 利 申 请 公 开 文 本 No.2006009360， 20050186208， 20030206899， 20030190317， 20030203409， 和 20050112126 ； 和 Popkov et al.， Journal of Immunological Methods 288 ： 149-164(2004)。其它抗体包括那些结合 AVEGF 上包含残基 F17、 M18、 D19、 Y21、 Y25、 Q89、 I91、 K101、 E103、 和 C104 或者包含残基 F17、 Y21、 Q22、 Y25、 D63、 I83 和 Q89 的功能性 表位的。
在本发明的一个实施方案中， 抗 VEGF 抗体包含重链可变区， 其包含下述氨基酸序 列：
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYTFT NYGMNWVRQA PGKGLEWVGW INTYTGEPTY
AADFKRRFTF SLDTSKSTAY LQMNSLRAED TAVYYCAKYP HYYGSSHWYF DVWGQGTLVT
VSS(SEQ ID NO ： 1)
和轻链可变区， 其包含下述氨基酸序列 ：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCSASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKVLIYF TSSLHSGVPS
RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YSTVPWTFGQ GTKVEIKR(SEQ ID NO ： 2)。
依照本发明的 “G6 系列抗体” 指自 G6 抗体的序列衍生的抗 VEGF 抗体或依照 PCT 公开文本 No.WO2005/012359 的图 7、 24-26、 和 34-35 之任一的 G6 衍生抗体， 通过述及将其 整个公开内容收入本文。还可参见 PCT 公开文本 No.WO2005/044853， 通过述及将这些专利 申请的内容明确收入本文。在一个实施方案中， G6 系列抗体结合人 VEGF 上的功能性表位， 其包含残基 F17、 Y21、 Q22、 Y25、 D63、 I83 和 Q89。
依照本发明的 “B20 系列抗体” 指自 B20 抗体的序列衍生的抗 VEGF 抗体或依照 PCT 公开文本 No.WO2005/012359 的图 27-29 之任一的 B20 衍生抗体， 通过述及将其整个公开内 容收入本文。 还可参见 PCT 公开文本 No.WO2005/044853 和美国专利申请 60/991,302， 通过 述及将这些专利申请的内容明确收入本文。在一个实施方案中， B20 系列抗体结合人 VEGF 上的功能性表位， 其包含残基 F17、 M18、 D19、 Y21、 Y25、 Q89、 I91、 K101、 E103、 和 C104。
依照本发明的 “功能性表位” 指抗原中有力地促进抗体结合的氨基酸残基。抗原 中贡献巨大的残基中任一个的突变 ( 例如， 丙氨酸或同系物突变对野生型 VEGF 的突变 ) 会破坏抗体的结合， 使得抗体的相对亲和力比 (IC50 突变型 VEGF/IC50 野生型 VEGF) 会大于 5( 参见 WO2005/012359 的实施例 2)。在一个实施方案中， 相对亲和力比是通过溶液结合噬 菌体展示 ELISA 测定的。简言之， 将 96 孔 Maxisorp 免疫板 (NUNC) 用 Fab 形式的待测试抗 体以 PBS 中 2ug/ml 的浓度于 4℃包被过夜， 并用 PBS、 0.5 ％ BSA、 和 0.05 ％ Tween20(PBT) 于室温封闭 2 小时。首先将展示 hVEGF 丙氨酸点突变体 ( 残基 8-109 形式 ) 或野生型 hVEGF(8-109) 的噬菌体在 PBT 中的连续稀释液在 Fab 包被的板上于室温温育 15 分钟， 并 用 PBS、 0.05％ Tween20(PBST) 清洗板。用在 PBT 中 1 ∶ 5000 稀释的抗 M13 单克隆抗体辣 根过氧化物酶 (Amersham Pharmacia) 偶联物检测所结合的噬菌体， 用 3， 3’ ， 5， 5’ - 四甲基 联苯胺 (TMB， Kirkegaard & Perry Labs， Gaithersburg， MD) 底物显色大约 5 分钟， 用 1.0M H3PO4 淬灭， 并以分光光度法于 450nm 读数。IC50 值的比 (IC50， ala/IC50， wt) 代表了结合 亲和力的降低倍数 ( 相对结合亲和力 )。
(iii)VEGF 受体分子
两种表征最全面的 VEGF 受体是 VEGFR1( 也称作 Flt-1) 和 VEGFR2( 鼠同系物也称 作 KDR 和 FLK-1)。每一种受体对每一种 VEGF 家族成员的特异性有所不同， 但是 VEGF-A 结 合 Flt-1 和 KDR 二者。 全长 Flt-1 受体包括具有七个 Ig 结构域的胞外结构域、 跨膜结构域、 和具有酪氨酸激酶活性的胞内结构域。胞外结构域涉及 VEGF 结合， 而胞内结构域涉及信号 转导。
特异性结合 VEGF 的 VEGF 受体分子或其片段可以在本发明的方法中用于结合和隔 绝 VEGF 蛋白， 由此阻止它发信号。在某些实施方案中， VEGF 受体分子或其 VEGF 结合片段 是可溶性形式， 诸如 sFlt-1。受体的可溶性形式发挥对 VEGF 蛋白生物学活性的抑制效应， 其通过结合 VEGF， 由此阻止它结合其在靶细胞表面上存在的天然受体来实现。还包括 VEGF 受体融合蛋白， 下文描述了它们的例子。
嵌合 VEGF 受体蛋白指具有自至少两种不同蛋白质 ( 其中至少一种是 VEGF 受体 蛋白， 例如 flt-1 或 KDR 受体 ) 衍生的氨基酸序列且能够结合并抑制 VEGF 生物学活性的 受体分子。在某些实施方案中， 本发明的嵌合 VEGF 受体蛋白由自只有两种不同 VEGF 受体 分子衍生的氨基酸序列组成 ； 然而， 可以将包含一个、 两个、 三个、 四个、 五个、 六个、 或所有 七个来自 flt-1 和 / 或 KDR 受体胞外配体结合区的 Ig 样结构域的氨基酸序列连接至来自 其它无关蛋白质的氨基酸序列， 例如免疫球蛋白序列。与 Ig 样结构域组合的其它氨基酸 序列对于本领域普通技术人员会是显而易见的。嵌合 VEGF 受体蛋白的例子包括例如可溶 性 Flt-1/Fc、 KDR/Fc、 或 FLt 1/KDR/Fc( 也称作 VEGF Trap)( 参见例如 PCT 申请公开文本 No.WO97/44453)。
本发明的可溶性 VEGF 受体蛋白或嵌合 VEGF 受体蛋白包括没有经跨膜结构域而固 定至细胞表面的 VEGF 受体蛋白。因此， VEGF 受体 ( 包括嵌合受体蛋白 ) 的可溶性形式， 虽 然能够结合并灭活 VEGF， 但是不包含跨膜结构域， 并如此一般不会变成与该分子在其中表 达的细胞的细胞膜相结合。
III. 治疗用途
本发明提供了辅助疗法的方法， 包括对受试者施用 VEGF 特异性拮抗剂， 例如抗 VEGF 抗体超过 1 年。在一些实施方案中， 受试者具有非转移性结肠直肠癌。在该方法的一 些实施方案中， 在确定性手术之后施用 VEGF 特异性拮抗剂。本文中治疗的受试者一般处于癌症复发的风险。
在一些实施方案中， 辅助疗法的方法在患者中延长无疾病存活 (DFS) 或总体存活 (OS)。在一些实施方案中， 在治疗启动之后约 2 至 5 年评估 ( 例如分析 )DFS 或 OS。还提 供了辅助疗法的方法， 包括对有癌症的患者施用有效量的 VEGF 特异性拮抗剂， 其中在 VEGF 特异性拮抗剂积极治疗期间阻止或延迟癌症发展 (progression)， 且其中积极治疗持续超 过 1 年。在一些实施方案中， 在 VEGF 特异性拮抗剂积极治疗停止后阻止或延迟癌症发展约 3、 4、 5 或 6 个月。本发明进一步提供辅助疗法的方法， 包括对有癌症的患者施用有效量的 VEGF 特异性拮抗剂， 其中在 VEGF 特异性拮抗剂积极治疗期间阻止或延迟癌症复发， 且其中 VEGF 特异性拮抗剂的积极治疗持续超过 1 年。 在一些实施方案中， 在 VEGF 特异性拮抗剂积 极治疗停止后阻止或延迟癌症复发约 3、 4、 5 或 6 个月。在某些实施方案中， 在确定性手术 之后对患者施用 VEGF 特异性拮抗剂。在某些实施方案中， 包括施用抗 VEGF 抗体的辅助疗 法在治疗启动之后持续至少 2 年、 至少 3 年、 至少 4 年、 至少 5 年、 至少 10 年或更久。
本发明提供了辅助疗法的方法， 包括为癌症 ( 例如原发性肿瘤 ) 经历过确定性手 术的患者施用有效量的 VEGF 特异性拮抗剂以在患者中延长 DFS 或 OS， 其中施用 VEGF 特异 性拮抗剂超过 1 年。在一些实施方案中， 在治疗启动之后约 2 至 5 年评估 ( 例如分析 )DFS 或 OS。还提供了辅助疗法的方法， 包括为癌症 ( 例如原发性肿瘤 ) 经历过确定性手术的患 者施用有效量的 VEGF 特异性拮抗剂， 其中在 VEGF 特异性拮抗剂积极治疗期间阻止或延迟 癌症发展， 且其中积极治疗持续超过 1 年。 在一些实施方案中， 在 VEGF 特异性拮抗剂积极治 疗停止后阻止或延迟癌症发展约 3、 4、 5 或 6 个月。本发明进一步提供了辅助疗法的方法， 包括为癌症 ( 例如原发性肿瘤 ) 经历过确定性手术的患者施用有效量的 VEGF 特异性拮抗 剂， 其中在 VEGF 特异性拮抗剂积极治疗期间阻止或延迟癌症复发， 且其中 VEGF 特异性拮抗 剂积极治疗持续超过 1 年。在一些实施方案中， 在 VEGF 特异性拮抗剂积极治疗停止后阻止 或延迟癌症复发约 3、 4、 5 或 6 个月。在某些实施方案中， 包括施用抗 VEGF 抗体的辅助疗法 在治疗启动之后持续至少 2 年、 至少 3 年、 至少 4 年、 至少 5 年、 至少 10 年或更久。
本发明进一步提供了治疗为癌症 ( 例如原发性肿瘤 ) 经历过确定性手术的患者的 方法， 包括对患者施用辅助疗法， 其包括有效量的 VEGF 特异性拮抗剂以在患者中延长 DFS 或 OS， 其中施用 VEGF 特异性拮抗剂超过 1 年。在一些实施方案中， 在治疗启动之后约 2 至 5 年评估 ( 例如分析 )DFS 或 OS。还提供了治疗为癌症 ( 例如原发性肿瘤 ) 经历过确定性 手术的患者的方法， 包括对患者施用辅助疗法， 其包括有效量的 VEGF 特异性拮抗剂， 其中 且其中积极治疗持续超过 1 年。 在 VEGF 特异性拮抗剂积极治疗期间阻止或延迟癌症发展， 在一些实施方案中， 在 VEGF 特异性拮抗剂积极治疗停止后阻止或延迟癌症发展约 3、 4、 5或 6 个月。本发明进一步提供了治疗为癌症 ( 例如原发性肿瘤 ) 经历过确定性手术的患者的 方法， 包括对患者施用辅助疗法， 其包括有效量的 VEGF 特异性拮抗剂， 其中在 VEGF 特异性 拮抗剂积极治疗期间阻止或延迟癌症复发， 且其中 VEGF 特异性拮抗剂积极治疗持续超过 1 年。 在一些实施方案中， 在 VEGF 特异性拮抗剂积极治疗停止后阻止或延迟癌症复发约 3、 4、 5 或 6 个月。在某些实施方案中， 该方法包括在治疗启动之后施用抗 VEGF 抗体至少 2 年、 至 少 3 年、 至少 4 年、 至少 5 年、 至少 10 年或更久。
例如， 一种方法可包括下述步骤 ： a) 包括多个循环的第一阶段， 其中每个循环包 括以预定间隔对受试者施用有效量的 VEGF 特异性拮抗剂 ( 例如抗 VEGF 抗体， 诸如贝伐单抗 ) 和任选地至少一种化疗剂 ； 和 b) 包括多个循环的第二阶段， 其中每个循环包括以预定 间隔对受试者施用有效量的 VEGF 特异性拮抗剂 ( 例如抗 VEGF 抗体， 诸如贝伐单抗 )， 没有 任何化疗剂 ； 其中组合的第一和第二阶段在初始手术后处理之后持续至少 1 年。在一些实 施方案中， 所述组合的第一和第二阶段在初始手术后处理之后持续超过 1 年。在一些实施 方案中， 第二阶段在初始手术后处理之后持续超过 1 年、 至少 2 年、 至少 3 年、 至少 4 年、 至 少 5 年或至少 10 年。在一个实施方案中， 第一阶段包括第一多个治疗循环， 其中施用 VEGF 特异性拮抗剂 ( 例如贝伐单抗 ) 和第一化疗方案， 接着是第二多个治疗循环， 其中施用 VEGF 特异性拮抗剂 ( 例如抗 VEGF 抗体， 诸如贝伐单抗 ) 和第二化疗方案。
在一个例子中， 该方法包括使用改良 FOLFOX6( 第 1 天奥沙利铂 (85mg/m2) 及并行 亚叶酸 (400mg/m2) 和 5-FU(400mg/m2IV 推注 )， 及第 1 天和第 2 天 46 小时里 5-FU(2400mg/ 2 m ))q 14 天， 12 个循环 (6 个月 ) 加每个化疗循环第 1 天在奥沙利铂之前施用贝伐单抗 (5mg/kg IV)q 14 天， 施用 1 年或更久。
在一种施用方案中， 本发明的辅助疗法包括第一阶段， 其中在多个治疗循环中对 患者施用 VEGF 特异性拮抗剂 ( 例如抗 VEGF 抗体 ) 和一种或多种化疗剂 ； 和第二阶段， 其中 在多个维持循环中作为单一药剂使用 VEGF 特异性拮抗剂 ( 例如抗 VEGF 抗体 )。每个治疗 循环由 1 至 3 周组成， 取决于特定治疗方案。 例如， 治疗循环可以包括贝伐单抗作为 VEGF 特 异性拮抗剂， 而且可以是 3 周， 这意味着患者每 3 周接受 1 剂化疗和 1 剂贝伐单抗。治疗循 环也可以是 2 周， 这意味着患者隔周接受 1 剂化疗和 1 剂贝伐单抗。整个第一阶段的治疗 可以持续约 4-12 个循环。第二维持阶段期间， 可以两周一次或三周一次给予贝伐单抗， 取 决于具体循环的长度， 而且持续总共约 10-50 个循环。在某些实施方案中， 辅助疗法自治疗 启动 ( 例如初始手术后处理 ) 起持续至少 1 年， 而且会在那时之后跟踪受试者的进展。在 一些实施方案中， 抗 VEGF 抗体辅助疗法自治疗启动起持续超过 1 年、 至少 2 年、 至少 3 年、 至少 4 年、 至少 5 年或至少 10 年或直至死亡。
根据疾病的类型和严重程度， 抗 VEGF 抗体的优选剂量在约 1ug/kg 至约 50mg/kg 的范围中， 最优选约 5mg/kg 至约 15mg/kg， 包括但不限于 7.5mg/kg 或 10mg/kg。在一些方 面， 化疗方案涉及传统高剂量间歇施用。 在一些其它方面， 化疗剂使用更小且更频繁的剂量 来施用， 没有排定的中断 (“节拍化疗” (metronomic chemotherapy))。本发明的疗法的进 展易于通过常规技术和测定法来监测。
与用单独的化疗 ( 例如亚叶酸、 奥沙利铂、 5-FU、 伊利替康或其组合 ) 治疗的受试 者相比， 抗体和化疗的施用可降低癌症患者中疾病复发 ( 原发性器官中的癌症复发和 / 或 远端复发 ) 的可能性。
在一个方面， 本发明提供了辅助疗法的方法， 包括在确定性手术之后对有癌症的 患者施用有效量的抗 VEGF 抗体以在患者中延长无疾病存活 (DFS) 或总体存活 (OS)。在治 疗启动之后约 2 至 5 年评估 ( 例如分析 )DFS 或 OS。在一些实施方案中， 在治疗启动之后 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 或 10 年评估 ( 例如分析 )DFS 或 OS。本发明还提供了在患者中预防癌 症复发的方法， 包括对患者施用有效量的抗 VEGF 抗体， 其中所述施用抗 VEGF 抗体预防癌症 复发。本发明进一步提供了在患者中降低癌症复发的可能性的方法， 包括对患者施用有效 量的抗 VEGF 抗体， 其中所述施用抗 VEGF 抗体降低癌症复发的可能性。在本发明方法的一 些实施方案中， 所述施用 VEGF 特异性拮抗剂预防或降低临床可检测肿瘤或其转移发生的可能性。 对于辅助疗法， 可以以某种量或时间 ( 例如对于具体治疗方案， 随时间 ) 施用 VEGF 特异性拮抗剂， 以减轻 ( 例如 20％、 30％、 40％、 50％、 60％、 70％、 80％、 90％或 90％以上 ) 或抑制肿瘤转移 ； 以减轻或抑制肿瘤生长或肿瘤细胞增殖 ； 以减轻或阻止休眠肿瘤生长 ； 以减轻或阻止微转移生长或增殖 ； 以减轻或阻止肿瘤在治疗或切除后再生长 ； 和 / 或以一 定程度地缓解与癌症有关的一种或多种症状。
VEGF 特异性拮抗剂一般在受试者自手术恢复一段时间之后施用。 此时间段可包括 伤口愈合或手术切口愈合所需要的时段、 降低伤口开裂的风险所需要的时间段、 或受试者 回到与手术前的健康水平相比本质上相似或更好的健康水平所需要的时间段。 确定性手术 完成和第一次施用 VEGF 特异性拮抗剂之间的时段还可包括药物假期所需要的时段， 其中 受试者在各治疗方案间需要或要求一段时间。一般地， 确定性手术完成和 VEGF 特异性拮抗 剂疗法开始之间的时间段可包括小于 1 周、 1 周、 2 周、 3 周、 4 周 (28 天 )、 5 周、 6 周、 7 周、 8 周、 3 个月、 4 个月、 5 个月、 6 个月、 7 个月、 8 个月、 9 个月、 10 个月、 11 个月、 1 年、 2 年、 3 年、 或更长。在一个实施方案中， 确定性手术和施用 VEGF 特异性拮抗剂之间的时段大于 2 周且 小于 1 年。
在一个例子中， 以有效延长无疾病存活 (DFS) 或总体存活 (OS) 的量施用 VEGF 特 异性拮抗剂 ( 例如抗 VEGF 抗体 )。可以在抗体的初始施用之后约 2 至 5 年评估 ( 例如分 析 )DFS 或 OS。在某些实施方案中， 在治疗启动之后或初始诊断之后约 3-5 年、 约 4-5 年、 或 至少约 4 年、 或至少约 5 年评估 ( 例如分析 ) 受试者的 DFS 或 OS。
VEGF 特异性拮抗剂可以作为单一药剂来施用。本发明的特征还在于至少一种 VEGF 特异性拮抗剂与一种或多种别的抗癌疗法的组合的使用。 抗癌疗法的例子包括但不限 于外科手术、 放射疗法 ( 放疗 )、 生物疗法、 免疫疗法、 化学疗法、 或这些疗法的组合。另外， 细胞毒剂、 抗血管发生剂和抗增殖剂可以与 VEGF 特异性拮抗剂组合使用。
在某些方面， VEGF 特异性拮抗剂与一种或多种化疗剂组合用于在确定性手术之后 治疗结肠直肠癌的辅助疗法。多种化疗剂可用于本发明的联合治疗方法。本文中在 “定义” 部分下提供了或本文中描述了涵盖的化疗剂的例示性和非限制性列表。
在一个例子中， 本发明的特征在于 VEGF 特异性拮抗剂与一种或多种化疗剂 ( 例如 鸡尾酒形式 ) 的使用。在一些实施方案中， 在癌症是结肠直肠癌的情况中， 化疗剂可以是 特异性用于结肠直肠癌的， 而且包括但不限于亚叶酸、 5- 氟尿嘧啶、 奥沙利铂、 伊利替康或 两种或更多种此类化疗剂的组合。联合施用包括同时施用、 使用分开的配制剂或单一药物 配制剂， 及任一次序的序贯施用， 其中优选的是有一段时间所有活性剂同时发挥它们的生 物学活性。此类化疗剂的制备和剂量给药方案可依照制造商的使用说明来使用或由熟练 从业人员凭经验确定。化疗的制备和剂量给药方案还记载于 Chemotherapy Service Ed.， M.C.Perry， Williams & Wilkins， Baltimore， Md.(1992)。化疗剂可以在施用 VEGF 特异性 拮抗剂之前或之后施用， 或者可以与它同时给予。
联合施用包括使用分开的配制剂或单一药物配制剂的共施用或并行施用及任一 次序的序贯施用， 其中任选有一段时间所有活性剂同时发挥它们的生物学活性。 如此， 化疗 剂可以在施用 VEGF 特异性拮抗剂 ( 例如抗 VEGF 抗体 ) 之前或之后施用。 在此实施方案中， 至少一次化疗剂施用和至少一次 VEGF 特异性拮抗剂 ( 例如抗 VEGF 抗体 ) 施用之间的时间
优选为大约 1 个月或更短， 且最优选大约 3 周、 2 周或更短。 或者， 在单一配制剂或分开的配 制剂中对患者并行施用化疗剂和抗 VEGF 抗体。用化疗剂 ( 例如亚叶酸、 奥沙利铂、 5-FU、 伊 利替康或其组合 ) 和抗 VEGF 抗体 ( 例如贝伐单抗 ) 的组合进行的治疗可对患者产生协同 的或大于叠加的治疗好处。
如果施用的话， 化疗剂通常以其已知剂量施用， 或任选由于药物的组合作用或可 归于抗代谢物化疗剂施用的负面副作用而降低。 此类化疗剂的制备和剂量给药方案可依照 制造商的使用说明来使用或由熟练从业人员凭经验确定。
在一些其它方面， 对于本发明抗 VEGF 抗体的组合肿瘤疗法有用的其它治疗剂包 括涉及肿瘤生长的其它因子诸如 EGFR、 ErbB2( 也称作 Her2)、 ErbB3、 ErbB4、 或 TNF 的拮抗 剂。有时， 还对患者施用一种或多种细胞因子可能是有益的。在一个优选的实施方案中， 与 生长抑制剂或细胞毒剂一起共施用抗 VEGF 抗体。例如， 可以先施用生长抑制剂或细胞毒 剂， 接着是抗 VEGF 抗体。然而， 也涵盖同时施用或先施用抗 VEGF 抗体。生长抑制剂的合适 剂量就是当前所用的那些， 而且可以由于生长抑制剂与抗 VEGF 抗体的联合作用 ( 协同 ) 而 降低。
本文中的配制剂还可含有所治疗具体适应证所必需的超过一种活性化合物， 优选 活性互补且彼此没有不利影响的。例如， 可能希望在一种配制剂中进一步提供结合 EGFR、 VEGF( 例如结合 VEGF 上不同表位的抗体 )、 VEGFR、 或 ErbB2( 例如 ) 的抗体。 或者 / 另外， 所述组合物可包含细胞毒剂、 细胞因子、 生长抑制剂、 和 / 或小分子 VEGFR 拮抗 剂。合适的是， 此类分子以对于预定目的有效的量组合存在。
在某些方面， 对于本发明抗体的组合癌症疗法有用的其它治疗剂包括其它抗血 管发生剂。已经鉴定了许多抗血管发生剂， 而且是本领域已知的， 包括 Carmeliet 和 Jain Nature 407(6801) ： 249-57(2000) 列出的那些。优选地， 本发明的抗 VEGF 抗体与另一种 VEGF 拮抗剂或 VEGF 受体拮抗剂诸如 VEGF 变体、 可溶性 VEGF 受体片段、 能够阻断 VEGF 或 VEGFR 的适体、 中和性抗 VEGFR 抗体、 VEGFR 酪氨酸激酶的低分子量抑制剂及上述任何组合 联合使用。或者 / 另外， 可以对患者共施用两种或更多种抗 VEGF 抗体。
对于辅助疗法， VEGF 特异性拮抗剂的适宜剂量会取决于要治疗的疾病的类型 ( 如 上文定义的 )、 疾病的严重程度和过程、 在先疗法、 患者的临床史和对 VEGF 特异性拮抗剂的 响应、 及主治内科医师的判断。可以将 VEGF 特异性拮抗剂一次性或者在一系列治疗中适当 地施用于患者。在组合治疗方案中， 本发明的 VEGF 特异性拮抗剂和一种或多种抗癌治疗剂 以治疗有效量或协同量施用。如本文中使用的， 治疗有效量指导致如上所述癌症得到减轻 或抑制的本发明组合物的施用量和 / 或 VEGF 特异性拮抗剂和一种或多种其它治疗剂的共 施用量。治疗协同量指协同地或显著地预防癌症复发所必需的 VEGF 特异性拮抗剂和一种 或多种其它治疗剂的量。 VEGF 特异性拮抗剂和一种或多种其它治疗剂可同时或序贯施用， 量和时间足以减 少或消除肿瘤、 休眠肿瘤、 或微转移的发生或复发。 VEGF 特异性拮抗剂和一种或多种其它治 疗剂可作为维持疗法来施用， 以预防或降低肿瘤复发可能性。
正如本领域普通技术人员会理解的， 化疗剂或其它抗癌剂的适宜剂量一般大约会 是临床疗法 ( 例如单独地或与其它化疗剂组合地施用化疗剂的 ) 中早就采用的剂量。剂量 变化有可能会随所治疗的状况而发生。 施用治疗的内科医师会能够确定对受试者个体适宜
的剂量。 在上述治疗方案之外， 患者可经受放疗。
在某些实施方案中， 施用的抗 VEGF 抗体是完整裸抗体。然而， 抗 VEGF 抗体可以偶 联细胞毒剂。在某些实施方案中， 偶联的抗体和 / 或它结合的抗原被细胞内化， 导致偶联物 杀伤它结合的癌细胞方面的治疗功效升高。在一个实施方案中， 细胞毒剂靶向或干扰癌细 胞中的核酸。此类细胞毒剂的例子包括美登木素生物碱、 加利车霉素、 核糖核酸酶和 DNA 内 切核酸酶。
IV. 剂量和持续时间
VEGF 特异性拮抗剂组合物会以一种符合良好的医学实践的方式配制、 确定剂量及 施用。 在此内容中考虑的因素包括所治疗的具体病症、 所治疗的具体受试者、 患者个体的临 床状况、 病症的起因、 投递药剂的部位、 施药的方法、 施药的日程安排、 和医学从业人员知道 的其它因素。要施用的 VEGF 特异性拮抗剂的 “治疗有效量” 会由此类考虑事项来决定， 而且 是预防、 改善、 或治疗、 或稳定良性、 癌前、 或早期癌症 ； 或者治疗或预防肿瘤、 休眠的肿瘤、 或微转移发生或复发 ( 例如在新辅助疗法或辅助疗法的情况中 ) 所必需的最小量。 VEGF 特 异性拮抗剂不是必须的但任选可以与一种或多种当前用于预防或治疗癌症或发生癌症的 风险的药剂一起配制。此类其它药剂的有效量取决于配制剂中存在的 VEGF 特异性拮抗剂 的量、 病症或治疗的类型、 及上文讨论的其它因素。 这些一般以与以前所用相同的剂量和施 用路径来使用， 或者以以前所采用剂量的约 1-99％施用。
根据疾病的类型和严重程度， 约 1μg/kg 至 100mg/kg( 例如 0.1mg/kg-20mg/kg) VEGF 特异性拮抗剂作为初始候选剂量施用于患者， 无论例如通过一次或多次分开的施用或 通过持续输注。一个典型的日剂量范围可以是约 1μg/kg 至约 100mg/kg 或更多， 这取决于 上文所述因素。特别想要的剂量包括例如 7.5mg/kg、 10mg/kg、 和 15mg/kg。对于几天或更 长时间里的重复施用， 根据状况， 治疗为持续直到癌症得到治疗， 如通过上文所述或本领域 已知方法测量的。然而， 其它剂量方案可以是有用的。在一个例子中， 如果 VEGF 特异性拮 抗剂是抗体的话， 本发明的抗体每周、 每两周、 或每三周施用一次， 剂量范围为约 5mg/kg 至 约 15mg/kg， 包括但不限于 7.5mg/kg 或 10mg/kg。本发明疗法的进展易于通过常规技术和 测定法来监测。
治疗的持续时间会持续像医嘱指示的那样长时间或直到实现想要的治疗效果 ( 例如本文所述那些 )。在某些实施方案中， 治疗持续超过 1 年。在某些实施方案中， VEGF 特异性拮抗剂疗法持续 2 个月、 4 个月、 6 个月、 8 个月、 10 个月、 1 年、 2 年、 3 年、 4 年、 5 年或 长至受试者终身的时段。在某些实施方案中， 治疗持续直到疾病进展。在某些实施方案中， 在没有疾病复发的情况中治疗持续。
依照已知方法给受试者 ( 例如人类患者 ) 施用本发明的 VEGF 特异性拮抗剂， 诸 如静脉内施用 ( 像推注或通过一段时间里的连续输注 )， 通过肌肉内、 腹膜内、 脑脊髓内、 皮 下、 关节内、 滑膜内、 鞘内、 口服、 表面、 或吸入路径。如果 VEGF 拮抗作用与广泛的副作用或 毒性有关， 那么局部施用是特别想要的。 回体 (ex vivo) 策略也可用于治疗性应用。 回体策 略涉及用编码 VEGF 拮抗剂的多核苷酸转染或转导自受试者获得的细胞。然后将经过转染 或转导的细胞返回受试者。细胞可以是极其多种类型之任一， 包括但不限于造血细胞 ( 例 如， 骨髓细胞、 巨噬细胞、 单核细胞、 树突细胞、 T 细胞、 或 B 细胞 )、 成纤维细胞、 上皮细胞、 内
皮细胞、 角质形成细胞、 或肌肉细胞。
例如， 如果 VEGF 特异性拮抗剂是抗体的话， 通过任何合适手段来施用抗体， 包括 胃肠外、 皮下、 腹膜内、 肺内、 和鼻内， 及 ( 如果想要局部免疫抑制治疗的话 ) 病灶内施用。 胃 肠外输注包括肌肉内、 静脉内、 动脉内、 腹膜内、 或皮下施用。 另外， 合适的是， 通过脉冲输注 来施用抗体， 特别是使用递减剂量的抗体。 优选的是， 通过注射给予剂量给药， 最优选的是， 通过静脉内或皮下注射给予剂量给药， 这部分取决于施药是短期的还是长期的。
在另一个例子中， 在病症或肿瘤位置允许时， 局部施用 VEGF 特异性拮抗剂化合 物， 例如通过直接注射， 而且可以周期性重复注射。也可以在手术切除肿瘤后系统地 / 全身 地将 VEGF 特异性拮抗剂投递至受试者或直接投递至肿瘤细胞， 例如肿瘤或肿瘤床， 用以预 防或降低局部复发或转移 ( 例如休眠肿瘤或微转移的 )。
或者， 可以将含有编码 VEGF 特异性拮抗剂的核酸序列的抑制性核酸分子或多核 苷酸投递至受试者中的适宜细胞。在某些实施方案中， 可以将所述核酸导向肿瘤自身。
可以通过对于所采用的载体而言适宜的任何手段将核酸导入细胞中。许多此类 方法是本领域公知的 (Sambrook et al.， supra， 和 Watson et al.， Recombinant DNA， Chapter 12， 2d edition， Scientific American Books， 1992)。基因投递方法的例子包括 脂质体介导的转染、 电穿孔、 磷酸钙 /DEAE 右旋糖苷法、 基因枪、 和显微注射。 V. 药物配制剂
依照本发明使用的抗体的治疗用配制剂以冻干配制剂或水溶液的形式使用本领 域已知的标准方法， 例如通过将具有期望纯度的抗体与任选的药学可接受载体、 赋形剂或 稳定剂 (Remington’ s Pharmaceutical Sciences (20thedition)， ed.A.Gennaro， 2000， Lippincott， Williams & Wilkins， Philadelphia， PA) 混合来制备。可接受的载体、 赋形剂 或稳定剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的， 而且包括缓冲剂， 诸如磷酸盐、 柠檬酸 盐、 和其它有机酸 ； 抗氧化剂， 包括抗坏血酸和甲硫氨酸 ； 防腐剂 ( 诸如氯化十八烷基二甲 基苄基铵 ； 氯化己烷双胺 ； 苯扎氯铵、 苯索氯铵 ； 酚、 丁醇或苯甲醇 ； 对羟基苯甲酸烃基酯， 诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯 ； 邻苯二酚 ； 间苯二酚 ； 环己醇 ； 3- 戊醇 ； 和间甲酚 ) ； 低分子 量 ( 少于约 10 个残基 ) 多肽 ； 蛋白质， 诸如血清清蛋白、 明胶或免疫球蛋白 ； 亲水性聚合物， 诸如聚乙烯吡咯烷酮 ； 氨基酸， 诸如甘氨酸、 谷氨酰胺、 天冬酰胺、 组氨酸、 精氨酸或赖氨酸 ； 单糖、 二糖和其它碳水化合物， 包括葡萄糖、 甘露糖或糊精 ； 螯合剂， 诸如 EDTA ； 糖类， 诸如 蔗糖、 甘露醇、 海藻糖或山梨醇 ； 成盐相反离子， 诸如钠 ； 金属复合物 ( 例如 Zn- 蛋白质复合 TM PLURONICSTM 或聚乙二醇 (PEG)。优选的冻干 物)； 和 / 或非离子表面活性剂， 诸如 TWEEN 、 抗 VEGF 抗体配制剂记载于 WO 97/04801， 通过述及明确收入本文。 任选但优选的是， 配制剂 含有药学可接受盐， 典型的是例如氯化钠， 且优选大约为生理浓度。任选的是， 本发明的配 制剂可含有药学可接受防腐剂。在一些实施方案中， 防腐剂的浓度范围为 0.1-2.0％， 典型 的是 v/v。合适的防腐剂包括药学领域已知的那些。苯甲醇、 酚、 间甲酚、 对羟基苯甲酸甲 酯、 和对羟基苯甲酸丙酯是防腐剂的例子。 任选的是， 本发明的配制剂可包括药学可接受表 面活性剂， 其浓度为 0.005-0.02％。
在一个实施方案中， 在 100mg 和 400mg 不含防腐剂的、 单次使用管形瓶中供应贝伐 单抗来投递 4ml 或 16ml 贝伐单抗 (25mg/ml)， 用于治疗用途。在 240mg 脱水 α， α- 海藻糖 (dehydrate)、 23.2mg 磷酸钠 ( 单碱的， 单水合物 )、 4.8mg 磷酸钠 ( 二碱的， 无水的 )、 1.6mg
聚山梨酯 20、 和注射用水， USP 中配制 100mg 产物。在 960mg 脱水 α， α- 海藻糖、 92.8mg 磷酸钠 ( 单碱的， 单水合物 )、 19.2mg 磷酸钠 ( 二碱的， 无水的 )、 6.4mg 聚山梨酯 20、 和注射 用水， USP 中配制 400mg 产物。
本文中的配制剂还可含有所治疗具体适应症所必需的超过一种活性化合物， 优选 活性互补且彼此没有不利影响的。例如， 可能希望在一种配制剂中进一步提供结合 EGFR、 VEGF( 例如结合 VEGF 上不同表位的抗体 )、 VEGFR、 或 ErbB2( 例如 ) 的抗体。 或 者 / 另外， 组合物可包含细胞毒剂、 细胞因子、 生长抑制剂和 / 或小分子 VEGFR 拮抗剂。合 适的是， 此类分子以对于预定目的有效的量组合存在。 活性成分还可包载入例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊 ( 例如分 别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚 ( 甲基丙烯酸甲酯 ) 微胶囊 )、 胶状药物投递系统 ( 例 如脂质体、 清蛋白微球体、 微乳剂、 纳米颗粒和纳米胶囊 )、 或粗滴乳状液。此类技术披露于 例如 Remington’ s Pharmaceutical Sciences， 见上文。
可制备持续释放制剂。 持续释放制剂的合适例子包括含有抗体的固体疏水性聚合 物半透性基质， 该基质以定型产品的形式存在， 例如薄膜或微胶囊。 持续释放基质的例子包 括聚酯、 水凝胶 ( 例如聚 (2- 羟乙基 - 甲基丙烯酸酯 ) 或聚 ( 乙烯醇 ))、 聚交酯 ( 美国专利 No.3,773,919)、 L- 谷氨酸和 γ- 乙基 -L- 谷氨酸酯的共聚物、 不可降解的乙烯 - 乙酸乙烯、
可降解的乳酸 - 乙醇酸共聚物诸如 LUPRON DEPOTTM( 由乳酸 - 乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞 林构成的可注射微球体 ) 及聚 -D-(-)-3- 羟基丁酸。虽然诸如乙烯 - 乙酸乙烯和乳酸 - 乙 醇酸等聚合物能够释放分子 100 天以上， 但是某些水凝胶释放蛋白质的时间较短。当封装 的抗体在体内长时间维持时， 它们可能由于暴露于 37℃的潮湿环境而变性或聚集， 导致生 物学活性损失和免疫原性可能改变。可根据相关机制来设计合理的稳定化策略。例如， 如 果发现聚集机制是经由硫醇 - 二硫化物互换而形成分子间 S-S 键， 那么可通过修饰巯基、 由 酸性溶液冻干、 控制湿度、 采用适宜添加剂和开发特定的聚合物基质组合物来实现稳定化。
用于体内施用的配制剂必须是无菌的。这可容易地通过使用无菌滤膜过滤来实 现。
VI. 治疗功效
本发明提供了癌症患者中辅助疗法的方法， 其中治疗产生有益抗癌效果， 不引起 显著毒性或不利作用。本发明的治疗的功效可通过评估癌症治疗中常用的各种终点来测 量， 所述终点包括但不限于存活持续时间、 无疾病存活、 无进展存活、 距疾病进展的时间、 消 退时间、 和 / 或生活质量。因为本发明的抗血管发生剂靶向肿瘤血管系统且不必然靶向赘 生性细胞自身， 所以它们代表了一类独特的抗癌药， 并因此可要求对药物的临床响应的独 特测量和定义。本发明的抗 VEGF 抗体可引起对转移性扩散的抑制， 或者可仅仅发挥抑制肿 瘤的效果。 因而， 应当采用测定抗血管发生疗法的功效的新办法， 包括例如测量血管发生的 血浆或尿标志物及经由放射学成像来测量响应。
在一个实施方案中， 本发明提供了在人类患者中预防或降低癌症复发可能性的方 法。
在一个例子中， 以有效延长 DFS 或 OS 的量施用 VEGF 特异性拮抗剂 ( 例如抗 VEGF 抗体 )， 其中在抗体的初始施用之后约 2 至 5 年评估 ( 例如分析 )DFS 或 OS。在某些实施方 案中， 在治疗启动之后或初始诊断之后约 3-5 年、 约 4-5 年、 或至少约 4 年、 或至少约 5 年、或至少约 6 年、 或至少约 7 年、 或至少约 8 年、 或至少约 9 年、 或至少约 10 年评估 ( 例如分 析 ) 受试者的 DFS 或 OS。
在一个实施方案中， 本发明的方法可用于延长易感于或诊断有癌症或癌症复发的 受试者的存活持续时间。存活的持续时间定义为自第一次施用药物至死亡的时间。存活的 持续时间也可通过治疗组对对照组的分层危害比 (stratified hazard ratio， HR) 来测量， 其代表治疗期间患者死亡的风险。
在又一个实施方案中， 本发明的治疗显著提高用各种抗癌疗法治疗的易感于或诊 断有癌症的受试者 ( 例如人类患者 ) 组中的响应率。响应率定义为接受治疗的患者对治疗 有响应的百分比。 在一个方面， 与用单独的外科、 放疗、 或化疗治疗的组相比， 本发明使用抗 VEGF 抗体和外科手术、 放疗、 或一种或多种化疗剂的组合治疗显著提高接受治疗的患者组 中的响应率。
VII. 抗体生成
(i) 多克隆抗体
多克隆抗体优选在动物中生成， 通过多次皮下 (sc) 或腹膜内 (ip) 注射相关抗原 和佐剂。使用双功能或衍生化试剂， 例如马来酰亚氨基苯甲酰基磺基琥珀酰亚胺酯 ( 通过 半胱氨酸残基偶联 )、 N- 羟基琥珀酰亚胺 ( 通过赖氨酸残基 )、 戊二醛、 琥珀酸酐、 SOCl2 或 R1N ＝ C ＝ NR( 其中 R 和 R1 是不同的烃基 )， 将相关抗原与在待免疫物种中有免疫原性的蛋 白质偶联可能是有用的， 例如匙孔虫戚血蓝蛋白、 血清清蛋白、 牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋 白酶抑制剂。
通过将例如 100μg 或 5μg 蛋白质或偶联物 ( 分别用于兔或小鼠 ) 与 3 倍体积的 弗氏完全佐剂混和并将该溶液皮内注射于多个部位， 将动物针对抗原、 免疫原性偶联物或 衍生物进行免疫。1 个月后， 通过多个部位的皮下注射， 用弗氏完全佐剂中初始量 1/5-1/10 的肽或偶联物对动物进行加强免疫。7-14 天后， 采集动物的血液并测定血清的抗体滴度。 对动物进行加强免疫直到滴度达到平台 (plateau)。 优选的是， 将动物用相同抗原但与不同 蛋白质和 / 或通过不同交联剂偶联得到的偶联物进行加强免疫。偶联物还可在重组细胞培 养中作为蛋白质融合物来制备。同样， 适当使用凝聚剂诸如明矾来增强免疫应答。
(ii) 单克隆抗体
本领域有多种方法可用于制备本文中的单克隆抗体。例如， 单克隆抗体可以使用 最初由 Kohler 等， Nature， 256 ： 495(1975) 记载的杂交瘤方法来生成， 或者可以通过 DNA 重 组方法 ( 美国专利 No.4,816,567) 来生成。
在杂交瘤方法中， 如上所述免疫小鼠或其它适宜的宿主动物， 诸如仓鼠或猕猴， 以引发生成或能够生成如下抗体的淋巴细胞， 所述抗体将特异性结合用于免疫的蛋白质。 或者， 可以在体外免疫淋巴细胞。然后使用合适的融合剂诸如聚乙二醇将淋巴细胞与骨 髓瘤细胞融合， 以形成杂交瘤细胞 (Goding， Monoclonal Antibodies ： Principles and Practice， pp.59-103， Academic Press， 1986)。
将如此制备的杂交瘤细胞在合适的培养基中接种和培养， 所述培养基优选含有抑 制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的一种或多种物质。例如， 若亲本骨髓瘤细胞缺少 次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶 (HGPRT 或 HPRT)， 则用于杂交瘤的培养基典型的将含有 次黄嘌呤、 氨基喋呤和胸苷 (HAT 培养基 )， 这些物质阻止 HGPRT 缺陷细胞生长。优选的骨髓瘤细胞是那些高效融合、 支持所选择的抗体生产细胞稳定且高水平 地生成抗体、 且对培养基诸如 HAT 培养基敏感的骨髓瘤细胞。其中， 优选的骨髓瘤细胞 系是鼠骨髓瘤系， 诸如那些自可从索尔克研究所细胞分配中心 (Salk Institute Cell Distribution Center， San Diego， California USA) 获得的 MOPC-21 和 MPC-11 小鼠肿瘤和 可从美国典型培养物保藏中心 (American Type Culture Collection， Rockville， Maryland USA) 获得的 SP-2 或 X63-Ag8-653 细胞。人骨髓瘤和小鼠 - 人异源骨髓瘤细胞系也可用 于 生 成 人 单 克 隆 抗 体 (Kozbor， J.Immunol.， 133 ： 3001(1984) ； Brodeur 等， Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications， pp.51-63， Marcel Dekker， Inc.， New York， 1987)。
可对杂交瘤细胞正在其中生长的培养基测定针对抗原的单克隆抗体的生成。 优选 的是， 通过免疫沉淀或通过体外结合测定法， 诸如放射性免疫测定法 (RIA) 或酶联免疫吸 附测定法 (ELISA)， 测定由杂交瘤细胞生成的单克隆抗体的结合特异性。
在鉴定出生成具有期望特异性、 亲和力和 / 或活性的抗体的杂交瘤细胞后， 所述克隆就可通过有限稀释操作程序进行亚克隆， 并通过标准方法进行培养 (Goding， Monoclonal Antibodies ： Principles and Practice， pp.59-103， Academic Press， 1986)。 适于这一目的的培养基包括例如 D-MEM 或 RPMI-1640 培养基。另外， 杂交瘤细胞可在动物 中作为腹水瘤进行体内培养。
可通过常规免疫球蛋白纯化操作程序， 诸如例如蛋白 A-Sepharose、 羟磷灰石层 析、 凝胶电泳、 透析、 或亲和层析， 将由亚克隆分泌的单克隆抗体与培养基、 腹水或血清适当 分开。
编码单克隆抗体的 DNA 易于使用常规操作程序分离和测序 ( 例如通过使用能够特 异性结合编码单克隆抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针 )。杂交瘤细胞是此类 DNA 的 优选来源。一旦分离， 就可将 DNA 置于表达载体中， 然后将该表达载体转染到不另外生成免 疫球蛋白蛋白质的宿主细胞中， 诸如大肠杆菌细胞、 猿猴 COS 细胞、 中国仓鼠卵巢 (CHO) 细 胞或骨髓瘤细胞， 以在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。抗体的重组生产在下文中 有更详细描述。
在 另 一 个 实 施 方 案 中， 可 从 使 用 McCafferty 等， Nature， 348 ： 552-554(1990) 中记载的技术构建的噬菌体抗体库中分离抗体或抗体片段。Clackson 等， Nature， 352 ： 624-628(1991) 及 Marks 等， J.Mol.Biol.， 222 ： 581-597(1991) 分别记载了使用噬菌体文库 进行的鼠和人抗体的分离。后续出版物记载了通过链改组生成高亲和力 (nM 范围 ) 的人抗 体 (Marks 等， Bio/Technology 10 ： 779-783(1992))， 以及组合感染和体内重组作为构建非 常大的噬菌体文库的策略 (Waterhouse 等， Nuc.Acids Res.21 ： 2265-2266(1993))。如此， 这些技术是用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行替代方法。
也可以修饰 DNA， 例如通过用人重链和轻链恒定域的编码序列替代同源鼠序列 ( 美国专利 No.4,816,567 ； Morrison 等， Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 81 ： 6851(1984))， 或通 过将免疫球蛋白编码序列与非免疫球蛋白多肽的整个或部分编码序列共价连接。
典型地， 用此类非免疫球蛋白多肽替代抗体的恒定域， 或者用它们替代抗体的一 个抗原结合位点的可变域， 以产生嵌合二价抗体， 它包含对一种抗原具有特异性的一个抗 原结合位点和对不同抗原具有特异性的另一个抗原结合位点。(iii) 人源化抗体和人抗体
人源化抗体具有一个或多个导入其中的来自非人来源的氨基酸残基。 这些非人氨 基酸残基常常称作 “输入” 残基， 它们通常取自 “输入” 可变域。人源化可基本上遵循 Winter 及其同事的方法进行 (Jones 等， Nature， 321 ： 522-525(1986) ； Riechmann 等， Nature， 332 ： 323-327(1988) ； Verhoeyen 等， Science， 239 ： 1534-1536(1988))， 即用啮齿类 CDR 或 CDR 序 列替代人抗体的相应序列。因此， 此类 “人源化” 抗体是嵌合抗体 ( 美国专利 4,816,567)， 其中基本上小于整个人可变域的区域用来自非人物种的相应序列替代。在实践中， 人源化 抗体通常是其中一些 CDR 残基以及可能一些 FR 残基用来自啮齿类抗体中类似位点的残基 替代的人抗体。
用于制备人源化抗体的人可变域的选择， 包括轻链和重链， 对于降低抗原性非常 重要。依照所谓的 “最适” (best-fit) 法， 用啮齿类抗体的可变域序列对已知的人可变 域序列的整个文库进行筛选。然后选择与啮齿类序列最接近的人序列作为人源化抗体 的 人 框 架 (FR)(Sims 等， J.Immunol.， 151 ： 2296(1993) ； Chothia 等， J.Mol.Biol.， 196 ： 901(1987))。 另一种方法使用由特定轻链或重链亚组的所有人抗体的共有序列衍生的特定 框架。同一框架可被用于数种不同的人源化抗体 (Carter 等， Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 89 ： 4285(1992) ； Presta 等， J.Immunol.， 151 ： 2623(1993))。
更为重要的是， 抗体在人源化后保持对抗原的高亲和力及其它有利的生物学特 性。 为了实现这一目的， 依照一种优选的方法， 通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析 亲本序列和各种概念性人源化产物的方法来制备人源化抗体。 三维免疫球蛋白模型通常是 可获得的， 且为本领域技术人员所熟悉。还可获得图解和显示所选候选免疫球蛋白序列的 可能三维构象结构的计算机程序。 检查这些显示图像能够分析残基在候选免疫球蛋白序列 行使功能中的可能作用， 即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。 这样， 可从 受体和输入序列中选出 FR 残基并进行组合， 从而获得期望抗体特征， 诸如对靶抗原的亲和 力提高。通常， CDR 残基直接且最实质地涉及对抗原结合的影响。
人源化抗 VEGF 抗体及其亲和力成熟变体记载于例如 2005 年 2 月 26 日公告的美 国专利 No.6,884,879。
现在有可能生成在缺乏内源免疫球蛋白生成的情况下能够在免疫时生成人抗体 完整全集的转基因动物 ( 例如小鼠 )。例如， 已经描述了嵌合和种系突变小鼠中抗体重链 连接区 (JH) 基因的纯合删除导致内源抗体生成的完全抑制。在此类种系突变小鼠中转移 人种系免疫球蛋白基因阵列将导致在抗原攻击时生成人抗体。参见例如 Jakobovits 等， Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 90 ： 2551(1993) ； Jakobovits 等， Nature， 362 ： 255-258(1993) ； Bruggermann 等， Year in Immuno.， 7： 33(1993) ； 及 Duchosal 等， Nature， 355 ： 258(1992)。
或者， 噬菌体展示技术 (McCafferty 等， Nature 348 ： 552-553(1990)) 可用于在 体外从来自未免疫供体的免疫球蛋白可变域 (V) 基因全集生成人抗体和抗体片段。依照 这种技术， 将抗体可变域基因以符合读码框的方式克隆入丝状噬菌体诸如 M13 或 fd 的主 要或次要外壳蛋白基因， 并在噬菌体颗粒表面上展示为功能性抗体片段。因为丝状噬菌体 颗粒包含噬菌体基因组的单链 DNA 拷贝， 以抗体的功能特性为基础进行的选择也导致编码 展示那些特性的抗体的基因得到选择。如此， 噬菌体模拟 B 细胞的一些特性。噬菌体展示 可以以多种形式进行， 综述参见例如 Johnson， Kevin S. 和 Chiswell， David J.， CurrentOpinion in Structural Biology 3 ： 564-571(1993)。V 基因区段的数种来源可用于噬菌 体展示。Clackson 等， Nature 352 ： 624-628(1991) 从衍生自经免疫小鼠脾的小型 V 基因随 机组合文库中分离出大量不同的抗 唑酮抗体。 可基本上遵循 Marks 等， J.Mol.Biol.222 ： 581-597(1991) 或 Griffith 等， EMBO J.12 ： 725-734(1993) 所记载的技术， 自未免疫人供 体构建 V 基因全集和分离针对大量不同抗原 ( 包括自身抗原 ) 的抗体。还可参见美国专利 No.5,565,332 和 5,573,905。
如上所述， 还可通过体外活化 B 细胞来生成人抗体 ( 参见美国专利 No.5,567,610 和 5,229,275)。
人单克隆抗 VEGF 抗体记载于 1998 年 3 月 24 日公告的美国专利 No.5,730,977。
(iv) 抗体片段
已经开发了用于生成抗体片段的多种技术。传统上， 通过蛋白水解消化完整抗 体来衍生这些片段 ( 参见例如 Morimoto 等， Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24 ： 107-117(1992) ； 及 Brennan 等， Science， 229 ： 81(1985))。然而， 现在可直接 由重组宿主细胞生成这些片段。例如， 可以从上文讨论的噬菌体抗体库分离抗体片段。或 者， 可直接从大肠杆菌回收 Fab′ -SH 片段并化学偶联以形成 F(ab′ )2 片段 (Carter 等， Bio/Technology 10 ： 163-167(1992))。依照另一种方法， 可直接从重组宿主细胞培养物分 离 F(ab′ )2 片段。用于生成抗体片段的其它技术对熟练从业人员将是显而易见的。在其 它实施方案中， 所选抗体是单链 Fv 片段 (scFv)。参见 WO 93/16185。
(vi) 其它氨基酸序列修饰
设想了本文所述抗体的氨基酸序列修饰。例如， 可能希望改进抗体的结合亲和力 和 / 或其它生物学特性。通过将适宜的核苷酸变化引入抗体核酸或者通过肽合成来制备抗 体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如抗体氨基酸序列内的残基删除和 / 或插入和 / 或 替代。 只要最终的构建物具有期望的特性， 可进行删除、 插入和替代的任意组合以获得最终 的构建物。氨基酸变化还可改变抗体的翻译后加工， 诸如改变糖基化位点的数目或位置。
可用于鉴定抗体中作为优选诱变位置的某些残基或区域的一种方法称作 “丙氨酸 扫描诱变” ， 如 Cunningham and Wells， Science 244 ： 1081-1085(1989) 所记载的。 这里， 鉴 定了一个残基或一组靶残基 ( 例如带电荷的残基， 诸如精氨酸、 天冬氨酸、 组氨酸、 赖氨酸 和谷氨酸 )， 并用中性或带负电荷的氨基酸 ( 最优选丙氨酸或聚丙氨酸 ) 替换， 以影响氨基 酸与抗原的相互作用。然后通过在或对替代位点引入更多或其它变体， 推敲那些对替代展 现出功能敏感性的氨基酸位置。 如此， 虽然引入氨基酸序列变异的位点是预先决定的， 但是 突变本身的性质不需要预先决定。 例如， 为了分析给定位点处的突变的后果， 在靶密码子或 区域进行丙氨酸扫描诱变或随机诱变， 并对所表达的抗体变体筛选期望活性。 氨基酸序列插入包括氨基和 / 或羧基末端的融合， 长度范围从一个残基至包含上 百个或更多残基的多肽， 以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括 具有 N- 末端甲硫氨酰残基的抗体或与细胞毒性多肽融合的抗体。抗体分子的其它插入变 体包括在抗体的 N- 或 C- 末端融合酶 ( 例如用于 ADEPT) 或延长抗体血清半衰期的多肽。
另一类变体是氨基酸替代变体。 这些变体在抗体分子中有至少一个氨基酸残基用 不同残基替换。最感兴趣进行替代诱变的位点包括高变区， 但也设想了 FR 改变。
对抗体生物学特性的实质性修饰通过选择在保持以下方面的效果上显著不同的
替代来完成 ： (a) 替代区域的多肽主链的结构， 例如作为折叠片或螺旋构象， (b) 靶位点处 分子的电荷或疏水性， 或 (c) 侧链的体积。根据其侧链特性的相似性， 可以将氨基酸如下 分组 (A.L.Lehninger， Biochemistry， 第 2 版， pp.73-75， Worth Publishers， New York， (1975)) ：
(1) 非极性的 ： Ala(A)、 Val(V)、 Leu(L)、 Ile(I)、 Pro(P)、 Phe(F)、 Trp(W)、 Met(M)
(2) 不 带 电 荷 的、 极性的： Gly(G)、 Ser(S)、 Thr(T)、 Cys(C)、 Tyr(Y)、 Asn(N)、 Gln(Q)
(3) 酸性的 ： Asp(D)、 Glu(E)
(4) 碱性的 ： Lys(K)、 Arg(R)、 His(H)
或者， 基于共同的侧链特性， 可以将天然存在残基如下分组 ：
(1) 疏水性的 ： 正亮氨酸、 Met、 Ala、 Val、 Leu、 Ile ；
(2) 中性、 亲水性的 ： Cys、 Ser、 Thr、 Asn、 Gln ；
(3) 酸性的 ： Asp、 Glu ；
(4) 碱性的 ： His、 Lys、 Arg ；
(5) 影响链取向的残基 ： Gly、 Pro ； (6) 芳香族的 ： Trp、 Tyr、 Phe。
非保守替代将需要用这些类别之一的一个成员替换另一个类别的。
任何不牵涉保持抗体正确构象的半胱氨酸残基也可替代， 一般用丝氨酸， 以改进 分子的氧化稳定性和防止异常交联。相反， 可以向抗体中添加半胱氨酸键以改进其稳定性 ( 特别是当抗体是抗体片段诸如 Fv 片段时 )。
特别优选的一类替代变体牵涉替代亲本抗体 ( 例如人源化或人抗体 ) 的一个或多 个高变区残基。一般而言， 选择用于进一步开发的所得变体相对于产生它们的亲本抗体将 具有改良的生物学特性。 用于产生此类替代变体的一种便利方法涉及使用噬菌体展示的亲 和力成熟。简而言之， 将数个高变区位点 ( 例如 6-7 个位点 ) 突变， 在每个位点产生所有可 能的氨基酸替代。如此产生的抗体变体以单价形式展示在丝状噬菌体颗粒上， 作为与每个 颗粒内包装的 M13 基因 III 产物的融合物。然后如本文所公开的对噬菌体展示的变体筛选 其生物学活性 ( 例如结合亲和力 )。为了鉴定用于修饰的候选高变区位点， 可进行丙氨酸 扫描诱变以鉴定对抗原结合具有重要贡献的高变区残基。或者 / 另外， 分析抗原 - 抗体复 合物的晶体结构， 以鉴定抗体与人 VEGF 之间的接触点可能是有益的。此类接触残基及邻近 残基是依照本文详述的技术进行替代的候选位点。一旦产生此类变体， 就如本文所述对该 组变体进行筛选， 可选择在一种或多种相关测定法中具有优良特性的抗体用于进一步的开 发。
抗体的另一类氨基酸变体改变了抗体的原始糖基化样式。改变意味着删除在抗 体中发现的一个或多个碳水化合物模块， 和 / 或添加抗体中不存在的一个或多个糖基化位 点。
抗体的糖基化典型的或是 N- 连接的或是 O- 连接的。N- 连接指碳水化合物模块 附着于天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺 -X- 丝氨酸和天冬酰胺 -X- 苏氨酸 ( 其 中 X 是除脯氨酸外的任何氨基酸 ) 是将碳水化合物模块酶促附着于天冬酰胺侧链的识别序 列。如此， 多肽中这两种三肽序列任一的存在产生了潜在的糖基化位点。O- 连接的糖基化
指将糖类 N- 乙酰半乳糖胺、 半乳糖或木糖之一附着于羟基氨基酸， 最常见的是丝氨酸或苏 氨酸， 但也可使用 5- 羟脯氨酸或 5- 羟赖氨酸。
对抗体添加糖基化位点可通过改变氨基酸序列使其包含一个或多个上述三肽序 列而便利的完成 ( 用于 N- 连接的糖基化位点 )。 该改变还可通过向原始抗体的序列中添加 或替代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来进行 ( 用于 O- 连接的糖基化位点 )。
若抗体包含 Fc 区， 则可改变附着其上的碳水化合物。例如， 美国专利申请 US 2003/0157108 A1(Presta， L.) 中记载了有缺少岩藻糖的成熟碳水化合物结构附着于抗 体 Fc 区 的 抗 体。 还 可 参 见 US 2004/0093621 A1(Kyowa Hakko Kogyo Co.， Ltd.)。WO 03/011878(Jean-Mairet et al.) 和美国专利 No.6,602,684(Umana et al.) 中提到了在附 着于抗体 Fc 区的碳水化合物中有等分 N- 乙酰葡糖胺 (GlcNAc) 的抗体。 WO 97/30087(Patel et al.) 中报告了在附着于抗体 Fc 区的寡糖中有至少一个半乳糖残基的抗体。 关于有更改 碳水化合物附着于其 Fc 区的抗体还可参见 WO 98/58964(Raju， S.) 和 WO 99/22764(Raju， S.)。
可能希望在效应器功能方面修饰本发明的抗体， 例如增强抗体的抗体依赖性细胞 介导的细胞毒性 (ADCC) 和 / 或补体依赖性细胞毒性 (CDC)。这可通过在抗体 Fc 区中引 入一处或多处氨基酸替代来实现。或者 / 另外， 可以在 Fc 区中引入半胱氨酸残基， 从而容 许在该区中形成链间二硫键。如此产生的同二聚体抗体可具有改良的内在化能力和 / 或 提高的补体介导的细胞杀伤和抗体依赖性细胞的细胞毒性 (ADCC)。参见 Caron et al.， J.Exp.Med.176 ： 1191-1195(1992) 和 Shopes， B.， J.Immunol.148 ： 2918-2922(1992)。 具 有增强的抗肿瘤活性的同二聚体抗体还可使用如 Wolff et al.， Cancer Research53 ： 2560-2565(1993) 中记载的异双功能交联剂来制备。 或者， 抗体可改造成具有双重 Fc 区， 由 此可具有增强的补体溶胞和 ADCC 能力。 参见 Stevenson et al.， Anti-Cancer Drug Design 3： 219-230(1989)。
WO 00/42072(Presta， L.) 记载了在存在人效应细胞时具有改良的 ADCC 功能的抗 体， 其中所述抗体在其 Fc 区中包含氨基酸替代。优选的是， 具有改良的 ADCC 的抗体在 Fc 区的第 298、 333 和 / 或 334 位 (Eu 残基编号方式 ) 包含替代。优选的是， 改变的 Fc 区是在 这些位置中的一个、 两个或三个处包含替代或由其组成的人 IgG1 Fc 区。此类替代任选联 合提高 C1q 结合和 / 或 CDC 的替代。
WO 99/51642、 美国专利 No.6,194,551B1、 美国专利 No.6,242,195B1、 美国专利 No.6,528,624B1 和美国专利 No.6,538,124(Idusogie et al.) 中记载了具有改变的 C1q 结 合和 / 和补体依赖性细胞毒性 (CDC) 的抗体。所述抗体在其 Fc 区的第 270、 322、 326、 327、 329、 313、 333 和 / 或 334 位 (Eu 残基编号方式 ) 氨基酸中的一个或多个处包含氨基酸替代。
为了延长抗体的血清半衰期， 可以将补救受体结合表位掺入抗体 ( 尤其是抗体片 段 )， 如例如美国专利 No.5,739,277 中所记载的。 在用于本文时， 术语 “补救受体结合表位” 指 IgG 分子 ( 例如 IgG1、 IgG2、 IgG3 或 IgG4) 的 Fc 区中负责延长 IgG 分子体内血清半衰期 的表位。
WO 00/42072(Presta， L.) 和 US 2005/0014934 A1(Hinton et al.) 中记载了具有 改良的对新生儿 Fc 受体 (FcRn) 的结合和延长的半衰期的抗体。这些抗体包含其中具有一 处或多处改进 Fc 区对 FcRn 结合的替代的 Fc 区。例如， Fc 区可以在第 238、 250、 256、 265、272、 286、 303、 305、 307、 311、 312、 314、 317、 340、 356、 360、 362、 376、 378、 380、 382、 413、 424、 428 或 434 位 (Eu 残基编号方式 ) 中的一个或多个处具有替代。优选的具有改良的 FcRn 结 合的含 Fc 区抗体变体在其 Fc 区的第 307、 380 和 434 位 (Eu 残基编号方式 ) 中的一个、 两 个或三个处包含氨基酸替代。在一个实施方案中， 抗体具有 307/434 突变。
还设想了具有三个或更多 ( 优选四个 ) 功能性抗原结合位点的工程化抗体 ( 美国 专利申请 US 2002/0004587 A1， Miller et al.)。
编码抗体的氨基酸序列变体的核酸分子可通过本领域知道的多种方法来制备。 这 些方法包括但不限于从天然来源分离 ( 在天然存在氨基酸序列变体的情况中 )， 或者通过 对早期制备的抗体变体或非变体型式进行寡核苷酸介导的 ( 或定点 ) 诱变、 PCR 诱变和盒 式诱变来制备。
(v) 免疫偶联物
本发明还关于包含偶联有细胞毒剂的本文所述抗体的免疫偶联物， 所述细胞毒剂 诸如化疗剂、 毒素 ( 例如细菌、 真菌、 植物或动物起源的酶活性毒素或其片段 ) 或放射性同 位素 ( 即放射偶联物 )。
上文已经描述了可用于生成此类免疫偶联物的化疗剂。可使用的酶活性毒素及 其片段包括白喉毒素 A 链、 白喉毒素的非结合活性片段、 外毒素 A 链 ( 来自铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa))、 蓖麻毒蛋白 (ricin)A 链、 相思豆毒蛋白 (abrin)A 链、 蒴莲根 毒蛋白 (modeccin)A 链、 α- 帚曲霉素 (sarcin)、 油桐 (Aleutites fordii) 毒蛋白、 香石 竹 (dianthin) 毒蛋白、 美洲商陆 (Phytolaca americana) 毒蛋白 (PAPI、 PAPII 和 PAP-S)、 苦瓜 (Momordica charantia) 抑制物、 麻疯树毒蛋白 (curcin)、 巴豆毒蛋白 (crotin)、 肥 皂草 (sapaonaria officinalis) 抑制物、 白树毒蛋白 (gelonin)、 丝林霉素 (mitogellin)、 局限曲菌素 (restrictocin)、 酚霉素 (phenomycin)、 依诺霉素 (enomycin) 和单端孢菌素 131 131 (trichothecenes)。多种放射性核素可用于生成放射偶联抗体。例子包括 212Bi、 I、 In、 90 186 Y 和 Re。
抗体和细胞毒剂的偶联物可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备， 诸如 N- 琥珀 酰亚氨基 -3-(2- 吡啶基二硫代 ) 丙酸酯 (SPDP)， 亚氨基硫烷 (IT)， 亚氨酸酯 ( 诸如盐酸己 二酰亚氨酸二甲酯 )、 活性酯类 ( 诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯 )、 醛类 ( 诸如戊二醛 )、 双 叠氮化合物 ( 诸如双 ( 对 - 叠氮苯甲酰基 ) 己二胺 )、 双重氮衍生物 ( 诸如双 ( 对 - 重氮苯 甲酰基 ) 乙二胺 )、 二异氰酸酯 ( 诸如甲苯 2， 6- 二异氰酸酯 )、 和双活性氟化合物 ( 诸如 1， 5- 二氟 -2， 4- 二硝基苯 ) 的双功能衍生物。 例如， 可如 Vitetta 等 Science 238 ： 1098(1987) 中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。 碳 -14 标记的 1- 异硫氰酸苯甲基 -3- 甲基二亚乙基三胺 五乙酸 (MX-DTPA) 是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的例示性螯合剂。 参见 WO 94/11026。
在另一个实施方案中， 可将抗体与 “受体” ( 诸如链霉亲合素 ) 偶联从而用于肿瘤 预先靶向， 其中对患者施用抗体 - 受体偶联物， 接着使用清除剂由循环中清除未结合的偶 联物， 然后施用与细胞毒剂 ( 例如放射性核苷酸 ) 偶联的 “配体” ( 例如亲合素 )。
(vi) 免疫脂质体
本文中所公开的抗体还可配制成免疫脂质体。 含有抗体的脂质体可通过本领域已 知方法来制备， 诸如参见 Epstein 等， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82 ： 3688(1985) ； Hwang 等， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77 ： 4030(1980) ； 及美国专利 No.4,485,045 和 4,544,545。循环时间延长的脂质体披露于美国专利 No.5,013,556。
可用包含磷脂酰胆碱、 胆固醇和 PEG 衍生化磷脂酰乙醇胺 (PEG-PE) 的脂质组合物 通过反相蒸发法生成特别有用的脂质体。将脂质体挤过具有设定孔径的滤器， 产生具有期 望直径的脂质体。 可如 Martin 等， J.Biol.Chem.257 ： 286-288(1982) 中所述， 将本发明抗体 的 Fab’ 片段经二硫化物交换反应与脂质体偶联。任选在脂质体中包含化疗剂 ( 诸如多柔 比星 (Doxorubicin))。参见 Gabizon 等， J.National Cancer Inst.81(19) ： 1484(1989)。
VIII. 制品和试剂盒
在本发明的另一个实施方案中， 提供了包含可用于治疗上文所述病症的物质的制 品。制品包括容器、 标签和包装插页。合适的容器包括例如瓶子、 小管、 注射器等。容器可 用各种材料制成， 诸如玻璃或塑料。 容器中装有有效治疗疾患的组合物， 而且可具有无菌存 取口 ( 例如容器可以是具有皮下注射针头可刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小管 )。所述组 合物中的至少一种活性剂是抗 VEGF 抗体。贴在所述容器上或与其相连的标签指示该组合 物用于治疗选择的疾患。 制品可进一步包括第二容器， 其中装有制药学可接受的缓冲剂， 诸 如磷酸盐缓冲盐水、 林格氏 (Ringer) 溶液和右旋糖溶液。它还可包括商业和用户立场上所 需的其它物质， 包括其它缓冲剂、 稀释剂、 滤器、 针头和注射器。另外， 制品包含印有使用说 明的包装插页， 包括例如组合物不与另一组合物组合使用的警告， 或指示组合物的使用者 对患者施用单独的或与抗癌组合物 ( 例如亚叶酸、 5-FU、 奥沙利铂、 伊利替康或其组合 ) 组 合的抗 VEGF 抗体组合。术语 “使用说明” 意味着通过任何手段， 例如书面地， 诸如以包装插 页或其它书面推广材料的形式提供关于可应用疗法、 药疗、 处理、 处理方案、 等等的指导。
VEGF 特异性拮抗剂可单独地或与其它抗癌治疗性化合物组合地包装成试剂盒。 所 述试剂盒可包括帮助对患者施用单位剂量的任选成分， 诸如用于重建粉剂形式的管形瓶、 用于注射的注射器、 定制 IV 投递系统、 吸入器、 等。另外， 单位剂量试剂盒可含有关于制备 和施用组合物的使用说明。试剂盒可制造成用于一名患者的一次使用单位剂量、 用于一名 特定患者的多次使用 ( 以恒定的剂量或其中各种化合物的效力可随治疗进展而变化 ) ； 或 者， 所述试剂盒可含有适合于对多名患者施用的多剂 (“大量包装” )。试剂盒成分可在纸 盒、 泡罩包、 瓶、 管、 等等中装配。
本发明提供了用于治疗为癌症 ( 例如原发性肿瘤 ) 经历过确定性手术的患者的试 剂盒， 其包括包， 其中该包包含抗 VEGF 抗体组合物和关于在辅助疗法中使用抗 VEGF 抗体组 合物的说明书， 其中该说明书记载了为接受辅助疗法的患者启动辅助疗法后 1 年时 DFS 为 94.3， 危害比为 0.60。
材料保藏
以下杂交瘤细胞系已经根据布达佩斯条约的规定保藏于美国典型培养物保藏中 心 (American Type Culture Collection(ATCC)， Manassas， VA， USA) ：
抗体命名 ATCC 编号 保藏日期
A4.6.1 ATCC HB-10709 1991 年 3 月 29 日
下面的实施例仅仅意图例示本发明的实践， 不是作为限制而提供的。 实施例
实施例 1 ： 有结肠直肠癌的患者中的贝伐单抗辅助疗法此实施例关注自国家外科辅助乳腺和肠计划 (NSABP C-08) 临床试验中治疗 的结肠直肠癌受试者获得的结果的分析。该研究的主要目标是确定对用于治疗结肠 直肠癌 (colorectal cancer) 的标准化疗添加贝伐单抗的临床好处， 如通过无疾病存 活 (disease-free survival， DFS) 测 量 的。 次 要 目 的 是 确 定 延 长 总 体 存 活 (overall survival) 方面是否有临床好处。此试验中使用的标准化疗是亚叶酸、 5- 氟尿嘧啶和奥沙 利铂的组合。此试验评估贝伐单抗 (bevacizumab) 作为切除了 II 和 III 期结肠癌的患者的辅助疗法的功效。
研究设计
NSABP C-08 研究的设计描绘于图 1 和 2。
在 NSABP C-08 试验中， 使用下述治疗方案 ：
分部 A/ 组 1 ： 改良 FOLFOX6(mFOLFOX6 ： 第 1 天奥沙利铂 (85mg/m2) 及并行亚叶酸 (400mg/m2) 和 5-FU(400mg/m2IV 推注 )， 和第 1 天和第 2 天 46 小时里 5-FU(2400mg/m2))q 14 天， 12 个循环 (6 个月 ) ；
分部 B/ 组 2 ： 改良 FOLFOX6 q 14 天， 12 个循环 (6 个月 ) 加每个化疗循环的第 1 天在奥沙利铂之前施用贝伐单抗 (5mg/kg IV)q 14 天， 1 年。
贝伐单抗 ( ) 以两种管形瓶大小作为准备好胃肠外施用的清澈的至 轻微乳白色的无菌液体供应 ： 每个 100mg(25mg/ml-4ml 装填 ) 玻璃管形瓶装有贝伐单抗及 磷酸盐、 海藻糖、 聚山梨酯 20 和无菌注射用水， USP， 而每个 400mg(25mg/ml-16ml 装填 ) 玻 璃管形瓶装有贝伐单抗及磷酸盐、 海藻糖、 聚山梨酯 20、 和无菌注射用水， USP。如下施用 取出 5mg/kg 的一剂必需的量并在总体积 100ml 的 0.9％氯化钠注射液， USP 中稀释， 之后静脉内施用。
为了具备此试验的资格， 要求患者具有达到下述阶段之一的经组织学确认的结肠 腺癌 ：
(1)II 期癌瘤 (T3 或 4， N0， M0)( 肿瘤已经穿过固有肌层侵入浆膜 (subsetrosa) 或 无腹膜被服的结肠周或直肠周组织 (T3) ； 或已经直接侵入其它器官或结构， 和 / 或在内脏 腹膜上穿孔 (T4)) 或者
(2)III 期癌瘤 ( 任何 T， N1 或 2， M0)( 肿瘤已经侵入任何深度， 有累及区域淋巴结 )。
具有通过来自原发性肿瘤的直接延伸而累及邻近结构 ( 例如膀胱、 小肠、 卵巢、 等 ) 的 T4 肿瘤的患者具备资格， 如果达到所有下述条件的话 ：
(1) 整个或部分邻近结构整个地与原发性肿瘤一起切除 ；
(2) 根据外科医生的意见， 所有总体可见肿瘤被完全切除 (“治愈性切除” )；
(3) 病理学家的组织学评估确认了切除标本的边缘不涉及恶性细胞 ； 和
(4) 不会利用局部放疗。
在基于更加晚期的原发性肿瘤的分期分类方面， 具有超过一个同步原发性结肠肿 瘤的患者具备资格。
患者必须具有通过开放式剖腹手术或剖腹手术辅助结肠切除术进行的整体的完 全总体切除肿瘤 ( 治愈性切除 )。 具有两阶段外科规程 ( 首先提供减压性结肠造口术， 然后 在稍后的规程中具有确定性外科切除 ) 的患者具备资格。根据内窥镜检查， 肿瘤距肛门边 缘的远端距离必须大于或等于 12cm。如果患者不是内窥镜检查的候选者的话， 通过外科检查测定的肿瘤距肛门边缘的远端距离必须大于或等于 12cm。
患者为 18 岁或更大， 具有 0 或 1 的 ECOG 表现， 而且根据调查人员的意见， 必须具 有至少 5 年的寿命预期， 排除他们的癌症诊断。
在随机化时， 患者必须具有大于或等于 1500mm3( 或不到 1500/mm3， 如果根据调查 人员的意见， 这代表正常人种或种族变异的话 ) 的手术后绝对粒细胞计数 (AGC) 和大于或 等于 100,000/mm3 的手术后血小板计数。患者还具有正常肝和肾功能。
具有在先恶性肿瘤 ( 包括结肠直肠癌 ) 的患者具备资格， 如果它们已经无疾病至 少 5 年且他们的内科医师认为处于复发的低风险。具有已经有效治疗的皮肤鳞状或基底细 胞癌、 原位黑素瘤、 原位宫颈癌、 原位结肠或直肠癌的患者也具备资格， 即使这些状况在随 机化之前的 5 年内诊断的。
如果患者具有任何下述条件的话， 他们具备资格 ： 腺癌以外的结肠癌、 直肠肿瘤、 分离的远端或不连续的腹内转移 ( 即使切除的话 )， 为恶性肿瘤启动的系统或放射疗法， 进 入研究之前的 6 个月内与原发性结肠肿瘤无关的重大出血， 严重的或不愈合的伤口、 皮肤 溃疡或骨折， 内窥镜检查确认为活动性的胃十二指肠溃疡， 大的外科操作， 随机化之前的 28 天内开放式活检或重大外伤性损伤， 试验过程期间预期需要大的外科操作， 随机化之前的 7 天内核心活检 (core biopsy) 或其它小的操作 ( 排除安置血管通路装置 )， 不受控制的血压 ( 大于 150/90mmHg)， 在先 CNS 脑血管缺血史， 6 个月内外周动脉缺血史， 6 个月内内脏动脉 缺血史， 伴随卤代抗病毒剂， 随机化时临床显著的周围神经病 (2 级或更高的感觉神经或运 动神经毒性， 使用 3.0 版 NCI1 不利事件通用术语标准 )， 会排除使用试验中使用的任何研究 药物的非恶性系统性疾病， 随机化时妊娠或哺乳， 精神病学或成瘾性病症或根据调查人员 的意见， 会排除患者达到研究试验要求的其它状况， PT(INR) ＞ 1.5， 除非患者正在服用全 剂量抗凝剂且受试者在服用稳定剂量的华法林或稳定剂量的低分子量肝素时具有局限的 (in range)INR 且受试者没有活动性出血或与高出血风险有关的病理状况。
此试验的主要终点是无疾病存活 (duration of disease free survival， DFS) 持 续时间。DFS 事件包括第一次记录的结肠癌复发证据、 第二原发性癌症或任何原因的死亡。 次要终点是总体存活 (OS) 持续时间和与研究疗法有关的毒性。总体存活事件包括任何原 因的死亡。
结肠癌复发的诊断使用下述标准来进行。对于腹部和 / 或骨盆部位 ： 阳性细胞学 或活检， 如果是吻合的话 (if anastomatic) ；
腹部、 骨盆和腹膜后结节 ： (1) 阳性细胞学或活检， (2) 逐渐增大的结节， 如通过相 隔至少 4 周间隔的两次 CT 或 MRI 扫描证明的， (3) 在 CT 或 MRI 扫描记录的块存在下， 输尿 管阻塞， 或 (4) 单次 CT 或 MRI 扫描显示确定的块， 通过该部位处的阳性 PET 扫描确认为恶 性的。
腹膜 ( 包括内脏和壁腹膜或网膜 ) ： (1) 阳性细胞学或活检或 (2) 逐渐增大的腹膜 内实体块， 如通过相隔至少 4 周间隔的两次 CT 或 MRI 扫描证明的， 或单次扫描通过该部位 处的阳性 PET 扫描确认为恶性的。 腹水 ： 阳性细胞学
肝： (1) 阳性细胞学或活检或 (2) 与良性疾病无关的下述各项中的三项 ： (i) 最近 的或渐进的肝大， 异常肝轮廓 ； (ii) 阳性放射性核素肝扫描或声波图 ； (iii) 确认异常 CT
扫描或 MRI 扫描且与 CEA 升高有关的阳性 PET 扫描 ； (iv) 异常肝功能研究 ； 或 (V)CEA 升高， 即 CEA 滴度持续升高至正常上限值的 10 倍， 相隔 4 周间隔的两次测定确认， 在具有正常手 术后 CEA 值的患者中 ( 测定应当由同一实验室使用同一方法实施。)
未做其它规定的 (NOS) 骨盆块 ： (1) 阳性细胞学或活检或 (2) 逐渐增大的骨盆内 实体块， 如通过相隔至少 4 周间隔的两次 CT 或 MRI 扫描证明的， 或 (3) 单次 CT 扫描上的实 体块， 通过该位点处阳性 PET 扫描确认的。
腹壁、 会阴和瘢痕 ： 阳性细胞学或活检
非腹部和非骨盆部位 ：
骨骼 ： 对于所有只涉及骨的复发， 要求活检
肺： (1) 阳性细胞学、 抽吸物或活检或 (2) 觉得与肺转移一致的多处肺小结的放射 学证据。
骨髓 ： 阳性细胞学、 抽吸物、 活检或 MRI 扫描
中枢神经系统 ： (1) 阳性 CT 或 MRI 扫描， 通常在具有神经学症状的患者中 ； 或 (2) 活检或细胞学 ( 为了脑脊膜累及的诊断 )。
第二原发性癌症的诊断在可能时得到了组织学确认。
结果
在 与 积 极 治 疗 期 对 应 的 第 一 年 期 间， 来自此试验的结果指示化疗添加 与单独的化疗相比， 显著延长 DFS。数据显示这种显著的好处不伴随任何增加 的毒性或副作用。
2,710 名患者参加了研究 (1,356 名进入对照分部， 1,354 名进入实验分部 )。 由于 没有随访或阳性外科手术余地 (margin)， 对照分部的 18 名患者和实验分部的 20 名患者没 有评估功效。另外， 发现 22 名对照和 15 名实验分部患者因其它原因而不合格， 但是包括在 分析中。如此， 这些分析中包括的对照和实验分部分别有 1,338 和 1,334 名患者。中值随 访为 35.6 个月。治疗分部的患者特征得到较好地平衡。略微超过半数的患者不到 60 岁， 大约 15％超过 70 岁， 而且性别分布相等。II 期患者占大约 25％。
随机测量距事件的时间 (time to event)。除主要终点以外的所有 p 值在两方面 0.05 水平评估为显著。所有置信区间为 95％。危害比 (HR) 是自 Cox 模型计算的， 而来自距 事件的时间的 p 值来自时序检验 (log rank test)。HR 和 p 值在可能时对阳性结节数目分 层。比例通过 Fischer 氏精确方法来比较。主要分析基于首要治疗意图， 只排除没有随访的 患者和随机化时没有处于主要终点风险的患者 ( 已知具有转移或阳性外科手术余地 )。潜在 危害函数的平滑估计量通过 Muller 和 Wang(Biometrics 1994 50 ： 61-76) 的方法来计算。潜 在危害的平滑估计量通过 Gilbert et al.(Biometrics 2002 58 ： 773-80) 的方法来计算。
结果如下 ：
患者数目 mFOLFOX6 mFOLFOX6+ 贝伐单抗 1338 1334 事件数目 312 291 3 年 DFS(％ ) 75.5 77.4 0.15 p值对 于 具 有 II 期 疾 病 的 患 者， 实 验 和 对 照 分 部 的 3 年 DFS 分 别 为 87.4 ％ 和 84.7 ％ (HR ＝ 0.82 CI 0.54-1.25 ； p ＝ 0.35)， 而 III 期为 74.2 ％和 72.4 ％ (HR ＝ 0.90 CI0.76-1.07 ； p ＝ 0.23)。
最终危害比 (HR) 为 0.888， p 值为 0.146。随时间评估的危害比 (HR) 和 p 值如下 ：
治疗启动后的年数 HR p值
1 0.6 1.25 0.61 1.5 2 2.5 0.85 0.05 3 0.87 0.080.74 0.81 0.020.0004 ＜ 0.0001 0.004治疗启动后 1 年时的 DFS 为 94.3( 用 mFOLFOX6+ 贝伐单抗治疗的患者 ) 和 90.7( 单 独用 mFOLFOX6 治疗的患者 )(HR 为 0.60， p 值为 0.0004)。贝伐单抗在开头 1.25 年期间具 有强效果 (HR ＝ 0.6195％ CI 0.48-0.78， p ＜ 0.0001)。这些数据指示， 化疗添加贝伐单 抗在对患者施用贝伐单抗的积极治疗期 ( 治疗启动后开头 12 个月 ) 期间及其后不久， 赋予 了临床有意义的且显著的好处。这些结果还首次证明施用贝伐单抗超过 1 年对患者是有益 的。
根据上述描述会清楚， 可以对本文所述发明进行改变和变更， 使之适应各种应用 和状况。此类实施方案也在所附权利要求的范围内。
本申请要求 2009 年 4 月 20 日提交的美国临时申请 No.61/171,008 ； 2009 年 4 月 21 日提交的美国临时申请 No.61/171,318 ； 和 2009 年 5 月 26 日提交的美国临时申请 No.61/181,195 的优先权和权益， 通过述及将其每一篇内容收入本文。
发明领域
一般而言， 本发明涉及人类疾病和病理状况的治疗。 更具体地， 本发明涉及抗血管 发生剂在辅助癌症疗法中的用途。
发明背景
癌症是对人类健康的最致命威胁之一。仅在美国， 癌症每年影响近 130 万新患者， 而且是位于心血管疾病之后的第二位死因， 占 4 例死亡中的大约 1 例。实体瘤对大多数那 些死亡负有责任。虽然某些癌症的医学治疗中已经取得了重大进步， 但是所有癌症的总体 5 年存活率在最近 20 年里只改进了约 10％。癌症 ( 或称作恶性肿瘤 ) 以不受控制的方式 快速生长和转移， 使得及时检测和治疗极端困难。 大多数当前癌症治疗方法是相对非选择性的， 而且一般在癌症发展至更恶性的阶 段之后靶向肿瘤。手术切除患病组织 ； 放疗缩小实体瘤 ； 以及化疗快速杀死正在分裂的细 胞。特别地， 化疗导致众多副作用， 在一些情况中严重到限制可给予的剂量， 并如此排除使 用潜在有效药物。此外， 癌症常常发展出对化疗药物的抗性。
对于大多数新诊断有可手术癌症的患者， 标准治疗是确定性手术 (definitive surgery) 继以化疗。 此类治疗的目标是尽可能多地消除原发性和转移性疾病以预防复发和 改善存活。事实上， 大多数这些患者在手术之后没有残留肿瘤的宏观证据。然而， 他们许多 稍后会发生复发， 而且最终可死于他们的疾病。 这是会发生的， 例如其中少数存活肿瘤细胞 在手术之前转移， 逃避了手术， 而且由于当前检测技术的限制， 在手术之后没有检测到。
因此， 手术后辅助治疗作为手术的辅助武器变得重要， 从而在这些残余微转移癌 细胞变得再建群和顽固之前消除它们。在过去几十年里， 辅助疗法的进展普遍增多， 集中 于使用各种化疗剂。许多化疗方案在辅助治疗有早期主要癌症适应证 ( 诸如肺、 乳腺和结 肠直肠癌 ) 的患者中显示出临床好处。Strauss et al.J Clin Oncol 22 ： 7019(2004) ； International Adjuvant Lung Cancer Trial Collaboration Group N Engl J Med 350 ： 351-60(2004)。Moertel et al.Ann Intern Med 122 ： 321-6(1995) ； IMPACT Lancet 345 ： 939-44(1995) ； Citron et al.J Clin Oncol 21 ： 1431-9(2003)。
尽管已确立基于化学的辅助疗法的好处， 但是与任何种类的化疗有关的一项主要 限制是重大毒性。一般地， 化疗药物并非靶向肿瘤部位， 而且不能区分正常与肿瘤细胞。由 于漫长的治疗及其对患者生活质量的持久影响， 毒性问题在辅助背景中尤其具有挑战性。 此外， 辅助化疗在复发风险更低的患者中的好处仍然不清楚， 使得是否值得让他们遭受化 疗副作用成问题。
血管发生指一系列重要的细胞事件， 其中血管内皮细胞增殖、 消减、 和重新组织，
从而从现有的血管网络形成新血管。 有令人信服的证据表明血管供应的发展对于正常和病 理的增殖过程是至关重要的。 运送氧和养分， 以及清除异化产物， 代表了多细胞生物体中发 生的大多数生长过程的限速步骤。
虽然引入新血管被认为是肿瘤血管发生的主要模式， 但是最近的数据指示一些肿 瘤可通过征用现有的宿主血管来生长。 然后被征用的血管系统消退， 导致肿瘤消退， 最终因 肿瘤边缘处缺氧诱导的血管发生而逆转。
正常和异常血管发生二者的关键正调节物之一是血管内皮细胞生长因子 (VEGF)-A。VEGF-A 是包括 VEGF-B、 VEGF-C、 VEGF-D、 VEGF-E、 VEGF-F、 和 PlGF 在内的基因 家族的一部分。VEGF-A 主要结合两种高亲和力受体酪氨酸激酶， 即 VEGFR-1(Flt-1) 和 VEGFR-2(Flk-1/KDR)， 后者是 VEGF-A 血管内皮细胞有丝分裂信号的主要递质。另外， 神经 毡蛋白 -1(neuropilin-1) 已经被鉴定为肝素结合 VEGF-A 同种型的受体， 而且可在血管发 育中发挥作用。
在作为血管发生因子之外， VEGF， 作为多效生长因子， 在其它生理过程诸如内皮细 胞存活和增殖、 血管通透性和血管舒张、 单核细胞趋化性、 和钙内流中展现出多种生物学效 应。此外， 其它研究报道了 VEGF 对少数非内皮细胞类型诸如视网膜色素上皮细胞、 胰导管 细胞、 和许旺 (Schwann) 细胞的促有丝分裂效应。
VEGF 作为病理状况中主要血管发生调节物的认识导致了涉及病理性血管发生的 状况中阻断 VEGF 活性的众多尝试。
VEGF 表达在大多数恶性肿瘤中上调， 而且 VEGF 过表达与更晚期的阶段或与许多 实体瘤中更差的预后有关。因此， 抑制 VEGF 信号传导途径的分子已用于治疗其中注意到病 理性血管发生的相对晚期实体瘤。
由于癌症仍然是最致命疾病之一， 因此人们期望有其它的治疗， 诸如辅助疗法。 本 发明解决这些和其它需要， 正如阅读下述公开后会显而易见的。
发明概述
VEGF 特异性拮抗剂与化疗组合的使用显示出在有癌症 ( 例如转移性结肠直肠癌、 非小细胞肺癌、 乳腺癌、 等 ) 的患者中有好处， 但是关于抗 VEGF 抗体在辅助疗法中的使用了 解不多。本文中的发明关注在非转移性结肠直肠癌的人类受试者中辅助使用 的临床研究中获得的结果。
因而， 本发明的特征在于辅助疗法的一种方法， 包括对有癌症的患者施用有效量 的 VEGF 特异性拮抗剂 ( 例如抗 VEGF 抗体 ) 超过 1 年。在一些实施方案中， 辅助疗法的方 法在患者中延长无疾病存活 (DFS) 或总体存活 (OS)。在一些实施方案中， 在治疗启动后约 2 至 5 年评估 ( 例如分析 )DFS 或 OS。还提供辅助疗法的一种方法， 包括对有癌症的患者施 用有效量的 VEGF 特异性拮抗剂， 其中在 VEGF 特异性拮抗剂积极治疗期间阻止或延迟癌症 发展， 且其中积极治疗持续超过 1 年。 在一些实施方案中， 在 VEGF 特异性拮抗剂积极治疗停 止后阻止或延迟癌症发展约 3 个月或 6 个月。本发明进一步提供辅助疗法的一种方法， 包 括对有癌症的患者施用有效量的 VEGF 特异性拮抗剂， 其中在 VEGF 特异性拮抗剂积极治疗 期间阻止或延迟癌症复发， 且其中 VEGF 特异性拮抗剂积极治疗持续超过 1 年。在一些实施 方案中， 在 VEGF 特异性拮抗剂积极治疗停止后阻止或延迟癌症复发约 3、 4、 5 或 6 个月。在 某些实施方案中， 在确定性手术之后对患者施用 VEGF 特异性拮抗剂。在某些实施方案中，包括施用抗 VEGF 抗体的辅助疗法在治疗启动之后继续至少 2 年、 至少 3 年、 至少 4 年、 至少 5 年、 至少 10 年或更多。
本发明提供辅助疗法的一种方法， 包括对为癌症经历过确定性手术的患者施用有 效量的 VEGF 特异性拮抗剂以在患者中延长 DFS 或 OS， 其中 VEGF 特异性拮抗剂施用超过 1 年。在一些实施方案中， 在治疗启动之后约 2 至 5 年评估 DFS 或 OS。还提供辅助疗法的一 种方法， 包括对为癌症 ( 例如原发性肿瘤 ) 经历过确定性手术的患者施用有效量的 VEGF 特 异性拮抗剂， 其中在 VEGF 特异性拮抗剂积极治疗期间阻止或延迟癌症发展， 且其中积极治 疗持续超过 1 年。在一些实施方案中， 在 VEGF 特异性拮抗剂积极治疗停止后阻止或延迟癌 症发展约 3、 4、 5 或 6 个月。本发明进一步提供辅助疗法的一种方法， 包括对为癌症 ( 例如 原发性肿瘤 ) 经历过确定性手术的患者施用有效量的 VEGF 特异性拮抗剂， 其中在 VEGF 特 异性拮抗剂积极治疗期间阻止或延迟癌症复发， 且其中 VEGF 特异性拮抗剂积极治疗持续 超过 1 年。在一些实施方案中， 在 VEGF 特异性拮抗剂积极治疗停止后阻止或延迟癌症复发 约 3、 4、 5 或 6 个月。在某些实施方案中， 包括施用抗 VEGF 抗体的辅助疗法在治疗启动之后 继续至少 2 年、 至少 3 年、 至少 4 年、 至少 5 年、 至少 10 年或更长时间。
本发明进一步提供一种治疗为癌症 ( 例如原发性肿瘤 ) 经历过确定性手术的患 者的方法， 包括对患者施用辅助疗法， 其包括有效量的 VEGF 特异性拮抗剂以在患者中延长 DFS 或 OS， 其中 VEGF 特异性拮抗剂施用超过 1 年。在一些实施方案中， 在治疗启动之后约 2 至 5 年评估 ( 例如分析 )DFS 或 OS。还提供一种治疗为癌症 ( 例如原发性肿瘤 ) 经历过确 定性手术的患者的方法， 包括对患者施用辅助疗法， 其包括有效量的 VEGF 特异性拮抗剂， 其中在 VEGF 特异性拮抗剂积极治疗期间阻止或延迟癌症发展， 且其中积极治疗持续超过 1 年。 在一些实施方案中， 在 VEGF 特异性拮抗剂积极治疗停止后阻止或延迟癌症发展约 3、 4、 5 或 6 个月。本发明结构域提供一种治疗为癌症 ( 例如原发性肿瘤 ) 经历过确定性手术的 患者的方法， 包括对患者施用辅助疗法， 其包括有效量的 VEGF 特异性拮抗剂， 其中在 VEGF 特异性拮抗剂积极治疗期间阻止或延迟癌症复发， 且其中 VEGF 特异性拮抗剂积极治疗持 续超过 1 年。在一些实施方案中， 在 VEGF 特异性拮抗剂积极治疗停止后阻止或延迟癌症复 发约 3、 4、 5 或 6 个月。在某些实施方案中， 该方法包括在治疗启动之后施用抗 VEGF 抗体至 少 2 年、 至少 3 年、 至少 4 年、 至少 5 年、 至少 10 年或更长时间。
本发明还提供一种在患者中阻止或延迟癌症复发的方法， 包括对患者施用有效量 的 VEGF 特异性拮抗剂 ( 例如抗 VEGF 抗体 ) 超过 1 年， 其中所述施用 VEGF 特异性拮抗剂 ( 例如抗 VEGF 抗体 ) 阻止癌症复发。 本发明进一步提供一种在患者中降低癌症复发可能性 的方法， 包括对患者施用有效量的 VEGF 特异性拮抗剂 ( 例如抗 VEGF 抗体 ) 超过 1 年， 其中 所述施用 VEGF 特异性拮抗剂 ( 例如抗 VEGF 抗体 ) 降低癌症复发可能性。
在本发明任何方法的一些实施方案中， 所述施用 VEGF 特异性拮抗剂阻止或降低 临床可检测肿瘤或其转移发生可能性。
在本发明的每一种方法中， 施用 VEGF 特异性拮抗剂 ( 例如抗 VEGF 抗体 ) 在治疗 启动之后继续至少 2 年、 至少 3 年、 至少 4 年、 至少 5 年、 至少 10 年或更长时间。在一些实 施方案中， 继续施用 VEGF 特异性拮抗剂 ( 例如抗 VEGF 抗体 ) 直至死亡。
在本发明的每一种方法中， 抗 VEGF 抗体可替换为 VEGF 特异性拮抗剂， 例如下文所 述 VEGF 受体分子或嵌合 VEGF 受体分子。 抗 VEGF 抗体可以是单克隆抗体、 嵌合抗体、 完全人的抗体、 或人源化抗体。 在本发明的方法中有用的例示性抗体包括贝伐单抗 (bevacizumab， )、 G6-31、 B20-4.1、 及其片段。在一些实施方案中， 抗 VEGF 抗体包括包含下述 氨基酸序列的重链可变区 ：
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYTFT NYGMNWVRQA PGKGLEWVGW
INTYTGEPTY AADFKRRFTF SLDTSKSTAY LQMNSLRAED TAVYYCAKYP
HYYGSSHWYF DVWGQGTLVT VSS (SEQ ID NO ： 1)
和包含下述氨基酸序列的轻链可变区 ：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCSASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKVLIYF
TSSLHSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YSTVPWTFGQ
GTKVEIKR (SEQ ID NO ： 2)。
在本发明方法的某些实施方案中， 抗 VEGF 抗体是贝伐单抗。
可以关于癌症治疗来实践本发明的每一种方法， 包括但不限于癌瘤、 淋巴瘤、 母 细胞瘤、 肉瘤、 和白血病。此类癌症的更特别例子包括鳞状细胞癌、 小细胞肺癌、 非小细胞 肺癌、 肺的腺癌、 肺的鳞癌、 腹膜癌、 肝细胞癌、 胃肠癌、 胰腺癌、 成胶质细胞瘤、 宫颈癌、 卵巢 癌、 肝癌、 膀胱癌、 肝肉瘤 (hepatoma)、 乳腺癌、 结肠癌、 结肠直肠癌、 子宫内膜或子宫癌、 唾 液腺癌、 肾癌、 肝癌、 前列腺癌、 肾癌、 外阴癌、 甲状腺癌、 肝癌、 胃癌、 黑素瘤、 和各种类型的 头颈癌。在本发明方法的一些实施方案中， 受试者具有非转移性结肠直肠癌。在本发明方 法的一些实施方案中， 受试者具有转移性结肠直肠癌。 在一些实施方案中， 受试者切除了 II 期或 III 期结肠癌。 在受试者经历过确定性手术的实施方案中， 一般在受试者自手术恢复一段时间之 后施用 VEGF 特异性拮抗剂 ( 例如抗 VEGF 抗体 )。此时间段可以包括伤口愈合或外科切口 愈合所需要的时间段、 降低伤口开裂风险所需要的时间段、 或受试者回到手术之前的健康 水平基本上相似或更好的健康水平所需要的时间段。完成确定性手术和首次施用抗 VEGF 抗体之间的时段也可以包括药物假期所需要的时段， 其中受试者需要或请求在治疗方案之 间有一段时间。一般地， 完成确定性手术和开始抗 VEGF 抗体疗法之间的时间段可包括不到 1 周、 1 周、 2 周、 3 周、 4 周 (28 天 )、 5 周、 6 周、 7 周、 8 周、 3 个月、 4 个月、 5 个月、 6 个月、 7个 月、 8 个月、 9 个月、 10 个月、 11 个月、 1 年、 2 年、 3 年、 或更长时间。在一个实施方案中， 确定 性手术和施用抗 VEGF 抗体之间的时间段大于 2 周且不到 1 年。在一个实施方案中， 确定性 手术和施用抗 VEGF 抗体之间的时间段是至少 28 天。
上述每一个方面可进一步包括对受试者监测癌症复发。 监测可例如通过评估无疾 病存活 (DFS) 或总体存活 (OS) 来实现。在一个实施方案中， 在治疗启动之后约 2 至 5 年评 估 DFS 或 OS。在一个实施方案中， 受试者在治疗之后没有疾病至少 1 至 5 年。
根据疾病的类型和严重性， 抗 VEGF 抗体 ( 例如贝伐单抗 ) 的优选剂量在本文中有 描述， 而且范围可以为约 1μg/kg 至约 50mg/kg， 最优选约 5mg/kg 至约 15mg/kg， 包括但不 限于 5mg/kg、 7.5mg/kg 或 10mg/kg。施药频率会随疾病的类型和严重性而变化。对于几天 或更长时间里的重复施用， 根据状况， 治疗为持续直到实现期望治疗效果， 如通过本文所述 或本领域已知方法测量的。在一个例子中， 本发明的抗 VEGF 抗体每周、 每两周、 或每三周施 用一次， 剂量范围为约 5mg/kg 至约 15mg/kg， 包括但不限于 5mg/kg、 7.5mg/kg 或 10mg/kg。 然而， 其它剂量方案可以是有用的。 本发明疗法的进展易于通过常规技术和测定法来监测。
在上述每一个方面别的实施方案中， 局部或系统 ( 例如口服或静脉内 ) 施用 VEGF 特异性拮抗剂 ( 例如抗 VEGF 抗体 )。在一些实施方案中， 延长抗 VEGF 抗体治疗直至患者在 选自下组的时间段没有癌症 ： 1 年， 2 年， 3 年， 4 年， 5 年， 6 年， 7 年， 8 年， 9 年， 10 年， 11 年， 和 12 年。
在其它实施方案中， VEGF 特异性拮抗剂治疗是单一疗法或对于 VEGF 特异性拮抗 剂治疗段期间是单一疗法， 如由临床医师或如本文所述评估的。
在其它实施方案中， VEGF 特异性拮抗剂治疗与别的抗癌疗法组合， 包括但不限于 手术、 放疗、 化疗、 分化疗法、 生物疗法、 免疫疗法、 血管发生抑制剂、 和抗增殖化合物。VEGF 特异性拮抗剂治疗还可包括上述类型的治疗方案的任何组合。 另外， 细胞毒剂、 抗血管发生 剂和抗增殖剂可以与 VEGF 特异性拮抗剂组合使用。在一个实施方案中， 抗癌疗法是化疗。 例如， 化疗剂选自例如烷化剂、 抗代谢物、 叶酸类似物、 嘧啶类似物、 嘌呤类似物及相关抑制 剂、 长春花生物碱、 表鬼臼毒素、 抗生素、 L- 天冬酰胺酶、 拓扑异构酶抑制剂、 干扰素、 铂配位 复合物、 蒽二酮取代脲、 甲肼衍生物、 肾上腺皮质阻抑剂、 肾上腺皮质类固醇、 妊娠素、 雌激 素、 抗雌激素、 雄激素、 抗雄激素、 促性腺素释放激素类似物、 等。 在一些方面， 并行施用化疗 剂和 VEGF 特异性拮抗剂。 在包括别的抗癌疗法的实施方案中， 可以在施用 VEGF 特异性拮抗剂之前、 期 间 ( 例如同时 )、 或之后用别的抗癌疗法来进一步治疗受试者。在一个实施方案中， 抗癌 疗法是化疗， 其包括施用奥沙利铂 (oxaliplatin)、 5- 氟尿嘧啶 (fluorouracil)、 亚叶酸 (leucovorin) 或其组合。 在一个实施方案中， 单独或与抗癌疗法一起施用的 VEGF 特异性拮 抗剂可以作为维持疗法来施用。
本发明的方法在预防肿瘤复发或肿瘤再生长， 例如切除原发性肿瘤之后存留的休 眠肿瘤方面或者在减少或预防微转移发生或增殖方面也是有利的。
在本发明上述每一个方面别的实施方案中， 以一定量或时间 ( 例如一定时间的特 定治疗方案 ) 施用 VEGF 特异性拮抗剂以提高或延长 ( 例如 20％、 30％、 40％、 50％、 60％、 70％、 80％、 90％、 100％或更多 ) 经历过确定性手术以治疗结肠直肠癌的受试者的存活。在 一个例子中， 作为受试者中的 DFS 或 OS 测量存活， 其中在 VEGF 特异性拮抗剂辅助治疗启动 后约 2 至 5 年评估 DFS 或 OS。在一些别的实施方案中， 该 VEGF 特异性拮抗剂用于预防或降 低受试者中癌症复发或癌症进展的可能性。
根据详述、 附图、 和权利要求， 本发明的其它特征和优点会是显而易见的。
附图简述
图 1 描绘 C-08 试验的治疗方案。分部 A ： 改良 FOLFOX6( 第 1 天奥沙利铂 (85mg/ 2 2 2 m ) 及并行亚叶酸 (400mg/m ) 和 5-FU(400mg/m IV 推注 )， 和第 1 天和第 2 天 46 小时里 2 5-FU(2400mg/m ))q 14 天， 12 个循环 (6 个月 ) ； 分部 B ： 改良 FOLFOX6 q 14 天， 12 个循环 加每个化疗循环的第 1 天在奥沙利铂之前施用贝伐单抗 (5mg/kg IV)q 14 天， 1 年。
图 2 描绘 NSABP C-08 试验的研究设计。组 1 ： 改良 FOLFOX6( 第 1 天奥沙利铂 2 2 2 (85mg/m ) 及并行亚叶酸 (400mg/m ) 和 5-FU(400mg/m IV 推注 )， 和第 1 天和第 2 天 46 小 2 时里 5-FU(2400mg/m ))q 14 天， 12 个循环 (6 个月 ) ； 组2： 改良 FOLFOX6 q 14 天， 12 个循 环加每个化疗循环的第 1 天在奥沙利铂之前施用贝伐单抗 (5mg/kg IV)q 14 天， 1 年。
发明详述
I. 定义
术语 “VEGF” 或 “VEGF-A” 用于指 165 个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子及相 关的 121 个、 145 个、 189 个和 206 个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子， 如例如 Leung et al.Science， 246 ： 1306(1989) ； 及 Houck et al.Mol.Endocrin.， 5： 1806(1991) 所述， 及其 天然存在的等位基因形式和加工形式。VEGF-A 是包括 VEGF-B、 VEGF-C、 VEGF-D、 VEGF-E、 VEGF-F 和 PlGF 在内的基因家族的一部分。VEGF-A 主要结合两种高亲和力受体酪氨酸激 酶， 即 VEGFR-1(Flt-1) 和 VEGFR-2(Flk-1/KDR)， 后者是 VEGF-A 血管内皮细胞有丝分裂信 号的主要递质。另外， 神经毡蛋白 -1 已经被鉴定为肝素结合 VEGF-A 同种型 (isoform) 的 受体， 而且可在血管发育中发挥作用。术语 “VEGF” 或 “VEGF-A” 还指来自非人物种诸如小 鼠、 大鼠或灵长类动物的 VEGF。有时， 来自特定物种的 VEGF 表示如下， hVEGF 表示人 VEGF， mVEGF 表示鼠 VEGF。术语 “VEGF” 还用于指包含 165 个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子的 氨基酸第 8-109 位或第 1-109 位的截短形式多肽。本申请中可能通过例如 “VEGF(8-109)” 、 “VEGF(1-109)” 或 “VEGF165” 来鉴别任何此类形式 VEGF。 “截短的” 天然 VEGF 的氨基酸位置 如天然 VEGF 序列中所示编号。例如， 截短的天然 VEGF 中的第 17 位氨基酸 ( 甲硫氨酸 ) 也 是天然 VEGF 中的第 17 位 ( 甲硫氨酸 )。截短的天然 VEGF 具有与天然 VEGF 相当的对 KDR 和 Flt-1 受体的结合亲和力。
“抗 VEGF 抗体” 指以足够亲和力和特异性结合 VEGF 的抗体。所选择的抗体通 常会具有对 VEGF 的结合亲和力， 例如， 该抗体可以以介于 100nM-1pM 之间的 Kd 值结合 hVEGF。抗体亲和力可通过例如基于表面等离振子共振的测定法 ( 诸如 PCT 申请公开文本 No.WO2005/012359 中所记载的 BIAcore 测定法 ) ； 酶联免疫吸附测定法 (ELISA) ； 和竞争测 定法 ( 例如 RIA) 来测定。在某些实施方案中， 本发明的抗 VEGF 抗体可用作治疗剂， 用于靶 向和干扰其中涉及 VEGF 活性的疾病或疾患。还有， 可对该抗体进行其它生物学活性测定 法， 例如为了评估其作为治疗剂的效力所进行的生物学活性测定法。此类测定法是本领域 已知的， 而且取决于抗体的靶抗原和预定用途。 例子包括 HUVEC 抑制测定法 ； 肿瘤细胞生长 抑制测定法 ( 如例如 WO 89/06692 中所记载的 ) ； 抗体依赖性细胞的细胞毒性 (ADCC) 和补 体介导的细胞毒性 (CDC) 测定法 ( 美国专利 5,500,362) ； 及激动活性或造血测定法 ( 参见 WO 95/27062)。抗 VEGF 抗体通常不会结合其它 VEGF 同系物， 诸如 VEGF-B 或 VEGF-C， 也不 会结合其它生长因子， 诸如 PlGF、 PDGF 或 bFGF。
“VEGF 拮抗剂” 指能够中和、 阻断、 抑制、 消除、 降低或干扰 VEGF 活性 ( 包括其与一 种或多种 VEGF 受体的结合 ) 的分子。VEGF 拮抗剂包括抗 VEGF 抗体及其抗原结合片段、 特 异性结合 VEGF 由此使其隔绝与一种或多种受体结合的受体分子及衍生物、 抗 VEGF 受体抗 体和 VEGF 受体拮抗剂诸如 VEGFR 酪氨酸激酶的小分子抑制剂。
“天然序列” 多肽包括与衍生自自然界的多肽具有相同氨基酸序列的多肽。如此， 天然序列多肽可以具有来自任何哺乳动物的天然存在多肽的氨基酸序列。 此类天然序列多 肽可以从自然界分离， 或者可以通过重组或合成手段来生产。术语 “天然序列” 多肽明确涵 盖该多肽的天然存在的截短或分泌形式 ( 例如胞外结构域序列 )、 天然存在的变体形式 ( 例 如可变剪接形式 )、 及天然存在的等位变体。
多肽 “变体” 意指与天然序列多肽具有至少约 80％氨基酸序列同一性的生物学活 性多肽。此类变体包括例如在多肽的 N- 末端或 C- 末端添加或删除一个或多个氨基酸残基的多肽。通常， 变体与天然序列多肽将具有至少约 80％的氨基酸序列同一性， 更优选的是， 至少约 90％的氨基酸序列同一性， 和甚至更优选的是， 至少约 95％的氨基酸序列同一性。
术语 “抗体” 在本文中以最广义使用， 包括单克隆抗体 ( 包括全长或完整单克隆抗 体 )、 多克隆抗体、 多价抗体、 多特异性抗体 ( 例如双特异性抗体 )、 及抗体片段 ( 见下文 )， 只要它们展现出期望的生物学活性。
贯穿本说明书和权利要求书， 本文中免疫球蛋白重链残基的编号方式是如 Kabat 等， 《Sequences of Proteins of Immunological Interest》 ，第 5 版， Public Health Service， National Institutes of Health， Bethesda， Md.(1991) 中的 EU 索引的编号方 式， 明确收入本文作为参考。 “如 Kabat 中的 EU 索引” 指人 IgG1 EU 抗体的残基编号方式。
在一个实施方案中， 依照本发明的 “Kd” 或 “Kd 值” 是通过如下测定法所述使用 Fab 型式的抗体和 VEGF 分子进行的放射性标记 VEGF 结合测定法 (RIA) 来测量的 ： 通过在存 125 在未标记 VEGF 的滴定系列的条件下， 用最小浓度的 I 标记 VEGF(109) 平衡 Fab， 然后用 抗 Fab 抗体包被的平板捕捉结合的 VEGF 来测量 Fab 对 VEGF 的溶液结合亲和力 (Chen， et al.， J Mol Biol 293 ： 865-881(1999))。为了确定测定条件， 用 50mM 碳酸钠 (pH 9.6) 中的 5μg/ml 捕捉用抗 Fab 抗体 (Cappel Labs) 包被微量滴定板 (Dynex) 过夜， 随后用 PBS 中的 2％ (w/v) 牛血清清蛋白在室温 ( 约 23℃ ) 封闭 2-5 小时。在非吸附平板 (Nunc#269620) 中， 将 100pM 或 26pM[125I]-VEGF(109) 与 连 续 稀 释 的 目 的 Fab( 例 如 如 Presta et al.， Cancer Res.57 ： 4593-4599(1997) 中的 Fab-12) 混合。然后将目的 Fab 保温过夜 ； 不过， 保 温可持续 65 个小时以保证达到平衡。此后， 将混合物转移至捕捉板以进行室温保温 1 小 时。然后除去溶液， 并用含 0.1％ 20 的 PBS 洗板 8 次。平板干燥后， 加入 150μl/ 孔闪烁液 (MicroScint-20 ； Packard)， 然后在 Topcount 伽马计数器 (Packard) 上对平板 计数 10 分钟。选择各 Fab 给出小于或等于最大结合之 20 ％的浓度用于竞争性结合测定 法。依照另一实施方案， Kd 或 Kd 值是通过表面等离振子共振测定法使用 BIAcoreTM-2000 或 BIAcoreTM-3000(BIAcore， Inc.， Piscataway， NJ) 在 25 ℃ 使 用 固 定 化 hVEGF(8-109) CM5 芯片在约 10 个响应单位 (RU) 测量的。简而言之， 依照供应商的说明书用盐酸 N- 乙 基 -N’ -(3- 二甲基氨基丙基 )- 碳化二亚胺 (EDC) 和 N- 羟基琥珀酰亚胺 (NHS) 活化羧甲 基化右旋糖苷生物传感器芯片 (CM5， BIAcore Inc.)。用 10mM 乙酸钠 pH 4.8 将人 VEGF 稀 释至 5μg/ml( 约 0.2μM)， 然后以 5μl/ 分钟的流速注入至获得约 10 个响应单位 (RU) 的 偶联蛋白质。注入人 VEGF 后， 注入 1M 乙醇胺以封闭未反应基团。为了进行动力学测量， 在 25℃以约 25μl/ 分钟的流速注入在含 0.05％ 20 的 PBS(PBST) 中两倍连续稀 释的 Fab(0.78nM 至 500nM)。使用简单一对一朗格缪尔 (Langmuir) 结合模型 (BIAcore Evaluation Software version 3.2) 通过同时拟合结合和解离传感图计算结合速率 (kon) 和解离速率 (koff)。平衡解离常数 (Kd) 以比率 koff/kon 计算。参见例如 Chen， Y.， et al.， J Mol Biol 293 ： 865-881(1999)。如果根据上文表面等离振子共振测定法， 结合速率超过 6 -1 -1 10 M S ， 那么结合速率可使用荧光淬灭技术来测定， 即根据分光计诸如配备了断流装置的 分光光度计 (a stop-flow equipped spectrophometer)(Aviv Instruments) 或 8000 系列 SLM-AmincoTM 分光光度计 (ThermoSpectronic) 中用搅拌比色杯的测量， 在存在浓度渐增的 人 VEGF 短形式 (8-109) 或小鼠 VEGF 的条件下， 测量 PBS， pH 7.2 中的 20nM 抗 VEGF 抗体 (Fab 形式 ) 在 25℃的荧光发射强度 ( 激发＝ 295nm ； 发射＝ 340nm， 16nm 带通 (band pass))的升高或降低。
“阻断性” 抗体或抗体 “拮抗剂” 指抑制或降低其所结合的抗原的生物学活性的抗 体。例如， VEGF 特异性拮抗性抗体结合 VEGF 并抑制 VEGF 诱导血管内皮细胞增殖或诱导血 管通透性的能力。优选的阻断性抗体或拮抗性抗体完全抑制抗原的生物学活性。
除非另有说明， 表述 “多价抗体” 贯穿本说明书用于指包含三个或更多抗原结合位 点的抗体。 例如， 多价抗体改造成具有三个或更多个抗原结合位点， 而且一般不是天然序列 IgM 或 IgA 抗体。
“抗体片段” 只包含完整抗体的一部分， 一般包括完整抗体的抗原结合位点， 因此 保留了与抗原结合的能力。此定义所涵盖的抗体片段的例子包括 ： (i)Fab 片段， 其具有 VL、 CL、 VH 和 CH1 结构域 ； (ii)Fab ′片段， 其是在 CH1 结构域的 C- 末端具有一个或多个 半胱氨酸残基的 Fab 片段 ； (iii)Fd 片段， 其具有 VH 和 CH1 结构域 ； (iv)Fd′片段， 其具有 VH 和 CH1 结构域及 CH1 结构域 C- 末端的一个或多个半胱氨酸残基 ； (v)Fv 片段， 其具有 抗体单臂的 VL 和 VH 结构域 ； (vi)dAb 片段 (Ward et al.， Nature 341 ： 544-546(1989))， 其由 VH 结构域组成 ； (vii) 分离的 CDR 区 ； (viii)F(ab′ )2 片段， 包含通过铰链区的二硫 键相连的两个 Fab′片段的二价片段 ； (ix) 单链抗体分子 ( 例如单链 Fv ； scFv)(Bird et al.， Science 242 ： 423-426(1988) 和 Huston et al.， PNAS(USA)85 ： 5879-5883(1988)) ； (x)“双抗体” ， 其具有两个抗原结合位点， 包含在同一条多肽链中相连的重链可变域 (VH) 和 轻 链 可 变 域 (VL)( 参 见 例 如 EP 404,097 ； WO93/11161 ； 和 Hollinger et al.， Proc. Natl.Acad.Sci.USA 90 ： 6444-6448(1993)) ； (xi)“线性抗体” ， 其包含一对串联的 Fd 区段 (VH-CH1-VH-CH1)， 与互补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区 (Zapata et al.， Protein Eng.8(10) ： 1057-1062(1995) 和美国专利 5,641,870)。
术语 “单克隆抗体” 在用于本文时指从一群基本上同质的抗体获得的抗体， 即构成 群体的各抗体个体是相同的， 除了可以以极小量存在的可能的天然存在突变形式外。单克 隆抗体是高度特异性的， 针对单一抗原。此外， 与典型的包含针对不同决定簇 ( 表位 ) 的不 同抗体的多克隆抗体制备物不同， 每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。 修饰语 “单克 隆” 不应解释为要求通过任何特定方法来生成抗体。例如， 将依照本发明使用的单克隆抗 体可通过最初由 Kohler 等 Nature 256 ： 495， (1975) 记载的杂交瘤方法来制备， 或者可通 过重组 DNA 方法来制备 ( 参见例如美国专利 No.4,816,567)。 “单克隆抗体” 还可使用例如 Clackson 等 Nature 352 ： 624-628， (1991) 或 Marks 等 J.Mol.Biol.222 ： 581-597， (1991) 中记载的技术从噬菌体抗体库分离。
“Fv” 片段是包含完整抗原识别和结合位点的抗体片段。该区域由紧密结合 ( 该结 合的本质可以是共价的， 例如在 scFv 中 ) 的一个重链可变域 ( 区 ) 和一个轻链可变域 ( 区 ) 的二聚体组成。正是在这种构造中， 每个可变域 ( 区 ) 的三个 CDR 相互作用而在 VH-VL 二聚 体表面上限定了一个抗原结合位点。 六个 CDR 或其子集 (subset) 一起赋予抗体以抗原结合 特异性。然而， 即使是单个可变域 ( 区 )( 或是只包含对抗原特异性的三个 CDR 的半个 Fv) 也具有识别和结合抗原的能力， 只是通常亲和力低于完整结合位点。
在用于本文时， “抗体可变域 ( 区 )” 指抗体分子的轻链和重链中包含互补决定区 (CDR ； 即 CDR1、 CDR2、 和 CDR3) 和框架区 (FR) 氨基酸序列的那部分。 VH 指重链可变域 ( 区 )。 VL 指轻链可变域 ( 区 )。依照本发明所使用的方法， 归为 CDR 和 FR 的氨基酸位置可以依照Kabat(Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health， Bethesda， Md.， 1987 和 1991)) 来限定。抗体或抗原结合片段的氨基酸编号方式也 依照 Kabat 的氨基酸编号。
在用于本文时， 术语 “互补决定区 (CDR ； 即 CDR1、 CDR2、 和 CDR3) 指抗体可变域 ( 区 ) 中其存在是抗原结合所必需的氨基酸残基。每个可变域通常具有三个 CDR， 鉴定 为 CDR1、 CDR2 和 CDR3。每个互补决定区可以包含来自如 Kabat 定义的 “互补决定区” 的 氨基酸残基 ( 即大约是轻链可变域的残基 24-34(L1)、 50-56(L2) 和 89-97(L3) 及重链 可变域的残基 31-35(H1)、 50-65(H2) 和 95-102(H3) ； Kabat 等， Sequences of Proteins of Immunological Interest， 5thEd.Public Health Service， National Institutes of Health， Bethesda， MD.(1991)) 和 / 或来自 “高变环” 的残基 ( 即大约是轻链可变域的残 基 26-32(L1)、 50-52(L2) 和 91-96(L3) 及 重 链 可 变 域 的 残 基 26-32(H1)、 53-55(H2) 和 96-101(H3) ； Chothia and Lesk， J.Mol.Biol.196 ： 901-917(1987))。 在有些情况中， 互补决 定区可以包含来自 Kabat 定义的 CDR 和高变环二者的氨基酸。例如， 抗体 4D5 重链的 CDRH1 包含氨基酸 26-35。
“框架区” ( 以下的 FR) 指可变域中 CDR 残基以外的残基。每个可变域通常具有四 个 FR， 鉴定为 FR1、 FR2、 FR3 和 FR4。如果 CDR 是依照 Kabat 定义的， 那么轻链 FR 残基位于 大约轻链残基 1-23(LCFR1)、 35-49(LCFR2)、 57-88(LCFR3)、 和 98-107(LCFR4)， 而重链 FR 残 基位于大约重链残基 1-30(HCFR1)、 36-49(HCFR2)、 66-94(HCFR3)、 和 103-113(HCFR4)。如 果 CDR 包含来自高变环的氨基酸残基， 那么轻链 FR 残基位于大约轻链残基 1-25(LCFR1)、 33-49(LCFR2)、 53-90(LCFR3)、 和 97-107(LCFR4)， 而 重 链 FR 残 基 位 于 大 约 重 链 残 基 1-25(HCFR1)、 33-52(HCFR2)、 56-95(HCFR3)、 和 102-113(HCFR4)。 在 有 些 情 况 中， 在 CDR 包含来自 Kabat 定义的 CDR 和高变环二者的氨基酸时， FR 残基将做相应的调整。例如， 当 CDRH1 包含氨基酸 H26-H35 时， 重链 FR1 残基位于 1-25 位， 而 FR2 残基位于 36-49 位。
“Fab” 片段包含轻链的可变域和恒定域及重链的可变域和第一恒定域 (CH1)。 F(ab′ )2 抗体片段包含一对 Fab 片段， 它们一般在它们羧基末端附近通过它们之间的铰链 半胱氨酸共价连接。本领域还知道抗体片段的其它化学偶联形式。
“单链 Fv” 或 “scFv” 抗体片段包含抗体的 VH 和 VL 结构域， 其中这些结构域存在于 一条多肽链上。一般而言， Fv 多肽在 VH 与 VL 结构域之间进一步包含多肽接头， 其使得 scFv 能够形成结合抗原的期望结构。 关于 scFv 的综述参见 Pluckthun， 于 《The Pharmacology of Monoclonal Antibodies》 ， 第 113 卷， Rosenburg 和 Moore 编， Springer-Verlag， New York， 第 269-315 页， 1994。
术语 “双抗体 (diabody)” 指具有两个抗原结合位点的小型抗体片段， 该片段在 同一条多肽链 (VH 及 VL) 中包含相连的重链可变域 (VH) 和轻链可变域 (VL)。通过使用过 短的接头使得同一条链上的两个结构域之间不能配对， 迫使这些结构域与另一条链的互 补结构域配对， 从而产生两个抗原结合位点。双抗体更完整的记载于例如 EP 404,097 ； WO 93/11161 ； Hollinger 等， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90 ： 6444-6448(1993)。
表述 “线性抗体” 指 Zapata 等， Protein Eng， 8(10) ： 1057-1062(1995) 中所描述 的抗体。简言之， 这些抗体包含一对串联的 Fd 区段 (VH-CH1-VH-CH1)， 该区段与互补的轻链 多肽一起形成抗原结合区对。线性抗体可以是双特异性的， 或者是单特异性的。单克隆抗体在本文中明确包括 “嵌合” 抗体 ( 免疫球蛋白 )， 其中重链和 / 或轻链的 一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源， 而 链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或 同源， 以及此类抗体的片段， 只要它们展现出期望的生物学活性 ( 美国专利 No.4,816,567 ； Morrison 等 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81 ： 6851-6855)， (1984)。
非人 ( 例如鼠 ) 抗体的 “人源化” 形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的 序列的嵌合抗体。在极大程度上， 人源化抗体指人免疫球蛋白 ( 受体抗体 ) 中的高变区残 基用具有期望特异性、 亲和力和能力的非人物种 ( 供体抗体 ) 诸如小鼠、 大鼠、 兔或非人灵 长类的高变区残基替换的免疫球蛋白。在有些情况中， 将人免疫球蛋白的 Fv 框架区 (FR) 残基用相应的非人残基替换。此外， 人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中没有发现 的残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体的性能。通常， 人源化抗体包含至少一个、 通 常两个基本上整个如下可变区， 其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的高 变环， 且所有或基本上所有 FR 区是人免疫球蛋白序列的 FR。 人源化抗体任选还包含至少部 分免疫球蛋白恒定区 (Fc)， 通常是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见 Jones et al.， Nature 321 ： 522-525(1986) ； Riechmann et al.， Nature 332 ： 323-329(1988) ； Presta， Curr.Op.Struct.Biol.2 ： 593-596(1992)。
“人抗体” 指拥有与由人生成的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列和 / 或使用 本文所公开的用于生成人抗体的任何技术生成的抗体。人抗体的这种定义明确排除包含 非人抗原结合残基的人源化抗体。人抗体可使用本领域已知的多种技术来生成。在一个 实施方案中， 人抗体是从噬菌体文库选择的， 该噬菌体文库表达人抗体 (Vaughan et al.， Nature Biotechnology 14 ： 309-314(1996) ； Sheets et al.， Proc.Natl.Acad.Sci.95 ： 6157-6162(1998) ； Hoogenboom and Winter， J.Mol.Biol.227 ： 381(1991) ； Marks et al.， J.Mol.Biol.222 ： 581(1991))。人抗体还可通过将人免疫球蛋白基因座导入内源免疫球 蛋白基因已经部分或完全灭活的转基因动物 ( 例如小鼠 ) 来生成。在受到攻击时， 观察 到人抗体生成， 它在所有方面与在人体中看到的极其相似， 包括基因重排、 装配和抗体全 集。 这 种 方 法 记 载 于 例 如 美 国 专 利 No.5,545,807 ； 5,545,806 ； 5,569,825 ； 5,625,126 ； 5,633,425 ； 5,661,016，及 以 下 科 学 出 版 物 ： Marks et al.， Bio/Technology 10 ： 779-783(1992) ； Lonberg et al.， Nature 368 ： 856-859(1994) ； Morrison， Nature 368 ： 812-13(1994) ； Fishwild et al.， Nature Biotechnology14 ： 845-51(1996) ； Neuberger， Nature Biotechnology 14 ： 826(1996) ； Lonberg and Huszar， Intern.Rev.Immunol.13 ： 65-93(1995)。或者， 人抗体可通过生成针对靶抗原的抗体的人 B 淋巴细胞的永生化来 制备 ( 此类 B 淋巴细胞可从个体回收， 或者可在体外免疫 )。参见例如 Cole et al.， Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy， Alan R.Liss， p.77(1985) ； Boerner et al.， J.Immunol.147(1) ： 86-95(1991) ； 及美国专利 No.5,750,373。
“亲和力成熟的” 抗体指在抗体的一个或多个 CDR 中具有一处或多处改变、 导致该 抗体对抗原的亲和力与没有这些改变的亲本抗体相比有所改进的抗体。优选的亲和力成 熟的抗体具有纳摩尔或甚至皮摩尔量级的对靶抗原的亲和力。亲和力成熟的抗体可通过 本领域已知规程来生成。Marks et al.， Bio/Technology 10 ： 779-783(1992) 记载了通过 VH 和 VL 结构域改组进行的亲和力成熟。以下文献记载了 CDR 和 / 或框架残基的随机诱变： Barbas et al.， Proc.Nat.Acad.Sci.USA 91 ： 3809-3813(1994) ； Schier et al.， Gene 169 ： 147-155(1995) ； Yelton et al.， J.Immunol.155 ： 1994-2004(1995) ； Jackson et al.， J.Immunol.154(7) ： 3310-9(1995) ； Hawkins et al.， J.Mol.Biol.226 ： 889-896(1992)。
抗体的 “功能性抗原结合位点” 指能够结合靶抗原的位点。抗原结合位点的抗 原结合亲和力不必像衍生该抗原结合位点的亲本抗体那样强， 但是结合抗原的能力必须 是使用已知用于评估抗体对抗原结合的多种方法之任一可测量到的。此外， 本文中多价 抗体的每个抗原结合位点的抗原结合亲和力不必在量上相同。对于本文中的多聚体抗 体， 功能性抗原结合位点的数目可以使用超速离心分析来评估， 如美国专利申请公开文本 No.20050186208 中所记载的。 依照这种分析方法， 将靶抗原与多聚体抗体以不同比例混合， 并计算复合物的平均分子量， 其中假设不同数目的功能性结合位点。将这些理论值与得到 的实际实验值进行比较以评估功能性结合位点的数目。
具有指定抗体的 “生物学特征” 的抗体指拥有该指定抗体区别于其它结合相同抗 原的抗体的一项或多项生物学特征的抗体。
为了筛选结合抗原上感兴趣抗体所结合的表位的抗体， 可以实施常规交叉阻断 测定法， 诸如 Antibodies， A Laboratory Manual， Cold Spring Harbor Laboratory， Ed Harlow and David Lane(1988) 中所记载的。
“物种依赖性抗体” 指这样一种抗体， 其对来自第一哺乳动物物种的抗原具有强于 对来自第二哺乳动物物种的该抗原同系物的结合亲和力。 通常， 物种依赖性抗体 “特异性结 -7 -8 合” 人类抗原 ( 即具有不超过约 1x10 M， 优选不超过约 1x10 M， 最优选不超过约 1x10-9M 的 结合亲和力 (Kd))， 但对来自第二非人哺乳动物物种的该抗原同系物具有比其对人类抗原 的结合亲和力弱至少约 50 倍， 或至少约 500 倍， 或至少约 1000 倍的结合亲和力。物种依赖 性抗体可以是如上定义的各种类型的抗体， 但典型的是人源化抗体或人抗体。
在用于本文时， “抗体突变体” 或 “抗体变体” 指物种依赖性抗体的氨基酸序列变 体， 其中物种依赖性抗体的一个或多个氨基酸残基发生了修饰。此类突变体与物种依赖性 抗体必然具有小于 100％的序列同一性或相似性。在一个的实施方案中， 抗体突变体所具 有的氨基酸序列与物种依赖性抗体的重链或轻链可变域的氨基酸序列具有至少 75％、 更优 选至少 80％、 更优选至少 85％、 更优选至少 90％、 最优选至少 95％的氨基酸序列同一性或 相似性。 关于此序列的同一性或相似性在本文中定义为在比对序列并在必要时引入缺口以 实现最大百分比序列同一性后， 候选序列中与物种依赖性抗体残基相同 ( 即相同残基 ) 或 相似 ( 即根据共同侧链特性来自同一组的氨基酸残基， 见下文 ) 的氨基酸残基的百分比。 N- 末端、 C- 末端、 或对可变域 ( 区 ) 之外的抗体序列内部的延伸、 删除、 或插入都不应视为 影响序列同一性或相似性。
为了延长包含本发明氨基酸序列的抗体或多肽的半衰期， 可如例如美国专利 No.5,739,277 中所记载的将补救受体结合表位附着于抗体 ( 尤其是抗体片段 )。例如， 可以将编码补救受体结合表位的核酸分子与编码本发明多肽序列的核酸在同一读码框内 相连接， 使得由改造后的核酸分子编码的融合蛋白包含补救受体结合表位和本发明的多 肽序列。在用于本文时， 术语 “补救受体结合表位” 指 IgG 分子 ( 例如 IgG1、 IgG2、 IgG3 或 IgG4) 的 Fc 区中负责延长 IgG 分子体内血清半衰期的表位 ( 例如 Ghetie et al.， Ann. Rev.Immunol.18 ： 739-766(2000)， 表 1)。其 Fc 区中有替代且血清半衰期延长的抗体还记载于 WO00/42072 ； WO 02/060919 ； Shields et al.， J.Biol.Chem.276 ： 6591-6604(2001) ； Hinton， J.Biol.Chem.279 ： 6213-6216(2004))。在另一个实施方案中， 还可以通过例如附 着其它多肽序列来延长血清半衰期。例如， 可以将在本发明的方法中有用的抗体或其它多 肽附着于血清清蛋白或血清清蛋白中结合 FcRn 受体或血清清蛋白结合肽的那部分， 使得 血清清蛋白结合该抗体或多肽， 例如此类多肽序列披露于 WO01/45746。在一个实施方案 中， 待附着的血清清蛋白肽包含氨基酸序列 DICLPRWGCLW。在另一个实施方案中， Fab 的半 衰期通过这些方法得到了延长。血清清蛋白结合肽序列还可参见 Dennis et al.， J.Biol. Chem.277 ： 35035-35043(2002)。
“嵌合 VEGF 受体蛋白” 指具有衍生自至少两种不同蛋白质 ( 其中至少一种是 VEGF 受体蛋白 ) 的氨基酸序列的 VEGF 受体分子。在某些实施方案中， 嵌合 VEGF 受体蛋白能够 结合 VEGF 并抑制 VEGF 的生物学活性。
“分离的” 抗体指已经鉴定且自其天然环境的一种成分分开和 / 或回收的多肽或 抗体。 其天然环境的污染性成分指将会干扰该抗体的诊断或治疗用途的物质， 可包括酶、 激 素、 和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在某些实施方案中， 将抗体纯化至 (1) 根据 Lowry 法的测定， 抗体重量超过 95％， 最优选重量超过 99％， (2) 足以通过使用转杯式测序 仪获得至少 15 个残基的 N- 末端或内部氨基酸序列的程度， 或 (3) 根据还原性或非还原性 条件下的 SDS-PAGE 及使用考马斯蓝或银染色， 达到同质。既然抗体天然环境的至少一种成 分不会存在， 那么分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。 然而， 分离的抗体通常将通过至 少一个纯化步骤来制备。 “片段” 指多肽和核酸分子的一部分， 其优选含有参比核酸分子或多肽全长的至少 10％、 20％、 30％、 40％、 50％、 60％、 70％、 80％、 90％、 95％、 或更多。 所述片段可含有 10、 20、 30、 40、 50、 60、 70、 80、 90、 或 100、 200、 300、 400、 500、 600、 或更多个核苷酸， 或者 10、 20、 30、 40、 50、 60、 70、 80、 90、 100、 120、 140、 160、 180、 190、 200 或更多个氨基酸。
“抗 血 管 发 生 剂”或 “血 管 发 生 抑 制 剂”指 或 直 接 或 间 接 抑 制 血 管 发 生 (angiogenesis)、 血管生成 (vasculogenesis)、 或不想要的血管通透性的小分子量物质、 多核苷酸、 多肽、 分离的蛋白质、 重组蛋白、 抗体、 或其偶联物或融合蛋白。应当理解， 抗血 管发生剂包括那些结合并阻断血管发生因子或其受体的血管发生活性的药剂。例如， 抗 血管发生剂是上文定义的血管发生剂的抗体或其它拮抗剂， 例如 VEGF-A 的抗体、 VEGF-A TM 受体 ( 例如 KDR 受体或 Flt-1 受体 ) 的抗体、 抗 PDGFR 抑制剂诸如 Gleevec (Imatinib Mesylate)。抗血管发生剂还包括天然血管发生抑制剂， 例如血管他丁 (angiostatin)、 内皮他丁 (endostatin) 等。参见例如 Klagsbrun and D’ Amore， Annu.Rev.Physiol.53 ： 217-39(1991) ； Streit and Detmar， Oncogene 22 ： 3172-3179(2003)( 例 如 列 举 恶 性 黑 素 瘤 中 抗 血 管 发 生 疗 法 的 表 3) ； Ferrara & Alitalo， Nature Medicine5(12) ： 1359-1364(1999) ； Tonini 等， Oncogene 22 ： 6549-6556(2003)( 例如列举已知抗血管发生 因子的表 2) ； Sato， Int.J.Clin.Oncol.8 ： 200-206(2003)( 例如列举临床试验中所使用的 抗血管发生剂的表 1)。
“加载剂量” 在本文中一般包括施用于患者的治疗剂的初始剂量， 后续其一个或多 个维持剂量。 一般而言， 施用单个加载剂量， 但本文中也设想了多个加载剂量。 通常， 所施用 的加载剂量的量超过所施用的维持剂量的量， 和 / 或加载剂量的施用比维持剂量更频繁，
从而比使用维持剂量更早达到化疗剂的期望稳态浓度。
“维持” (maintenance) 剂量在本文中指在治疗期间或之后施用于患者的一个或多 个剂量的治疗剂。 通常， 维持剂量以一定的治疗间隔施用， 例如以大约每周， 大约每两周， 大 约每三周， 或大约每四周的间隔施用。
“可手术的” 癌症指局限于原发性器官且适合于手术的癌症。
“存活” (survival) 指患者保持存活， 包括无疾病存活 (disease free survival) (DFS) 和总体存活 (overall survival)(OS)。存活可通过 Kaplan-Meier 法来评估， 而且存 活的任何差异可使用分层时序检验 (stratified log-rank test) 来计算。
“无疾病存活 (disease free survival)(DFS)” 指患者自治疗启动或自初始诊断 起保持一定时期活着且癌症没有复发， 诸如约 1 年、 约 2 年、 约 3 年、 约 4 年、 约 5 年、 约 10 年、 等。在本发明的一个方面， DFS 依照治疗意图原则来分析， 即在其指派疗法的基础上评 估患者。 DFS 分析中使用的事件可包括局部、 区域性和远端癌症复发， 继发性癌症发生， 及在 没有在先事件 ( 例如结肠直肠癌复发或第二原发性癌症 ) 的患者中死于任何原因。
“总体存活 (overall survival)” 指患者自治疗启动或自初始诊断起保持一定时 期活着， 诸如约 1 年、 约 2 年、 约 3 年、 约 4 年、 约 5 年、 约 10 年、 等。在本发明基础的研究中， 用于存活分析的事件是任何原因的死亡。 “延长存活 (extending survival)” 或 “提高存活可能性” 意味着使接受治疗的患 者的 DFS 和 / 或 OS 或在给定时间点时仍然活着和 / 或没有疾病的概率相对于未接受治疗 的患者 ( 即相对于未用 VEGF 特异性拮抗剂， 例如抗 VEGF 抗体治疗的患者 ) 或相对于对照 治疗方案 ( 诸如只用化疗剂的治疗， 诸如结肠直肠癌的标准治疗中使用的那些， 例如亚叶 酸、 5- 氟尿嘧啶、 奥沙利铂、 伊利替康或其组合 ) 有延长或提高。存活在治疗启动之后或在 初始诊断之后监测至少约 2 个月、 4 个月、 6 个月、 9 个月、 或至少约 1 年、 或至少约 2 年、 或至 少约 3 年、 或至少约 4 年、 或至少约 5 年、 或至少约 10 年、 等。
存活分析中的 “危害比 (hazard ratio)” 是两条存活曲线之间的差异的汇总， 代表 随访期里与对照相比治疗的死亡风险降低。危害比是事件比率的统计定义。为了本发明的 目的， 危害比定义为代表任何特定时间点时实验分部中的事件概率除以对照分部中的事件 概率。
术语 “并行” 在本文中用于指使用两种或更多种治疗剂， 其中至少部分施用在时间 上交叠。 因而， 并行施用包括如下的剂量给药方案， 一种或多种药剂的施用中断后施用一种 或多种其它药剂。
“单一疗法” 意指如下的治疗方案， 其在治疗期的过程期间只包括单一治疗剂来治 疗癌症或肿瘤。使用 VEGF 特异性拮抗剂的单一疗法意味着在治疗期期间在没有别的抗癌 疗法的情况中施用所述 VEGF 特异性拮抗剂。
“辅助疗法” 在本文中指在确定性手术 ( 其后检测不到残余疾病的迹象 ) 之后给予 的疗法， 从而来降低疾病复发 ( 局部的或转移的 ) 的风险。辅助疗法的目标是预防或延迟 癌症复发， 及因此降低癌症相关死亡的机会。
“维持疗法” 意指在初始治疗性干预的有益结果之后， 为了降低疾病复发或进展的 可能性而给予的治疗方案。维持疗法可提供任意长度的时间， 包括长至受试者终身的延长 的时段。维持疗法可在初始疗法之后或与初始或别的疗法联合提供。用于维持疗法的剂量
可变化， 而且可包括与其它类型的疗法使用的剂量相比降低的剂量。
在本文中， “标准治疗 (standard of care)” 化疗指常规使用来治疗特定癌症的化 疗剂。
“确定性手术 (definitive surgery)” 如该术语在医学界内使用的那样使用， 而且 通常指结果是潜在治愈性的外科手术。确定性手术包括例如导致肿瘤清除或切除的规程、 手术或其它， 包括那些导致所有明显可见肿瘤清除或切除的。确定性手术包括例如肿瘤的 完全的或治愈性的切除或完全总体切除。确定性手术包括以一个或多个阶段进行的规程， 而且包括例如多阶段手术规程， 其中在切除肿瘤之前实施一次或多次手术或其它规程。确 定性手术包括清除或切除肿瘤， 包括累及的器官、 部分器官和组织， 以及周围的器官， 诸如 淋巴结、 部分器官、 或组织的规程。
术语 “癌症” 和 “癌性” 指或描述哺乳动物中特征通常为细胞生长不受调控的生理 疾患。此定义中包括良性和恶性癌症以及休眠肿瘤或微转移。癌症的例子包括但不限于 癌、 淋巴瘤、 母细胞瘤、 肉瘤、 和白血病。此类癌症的更具体例子包括鳞状细胞癌、 肺癌 ( 包 括小细胞肺癌、 非小细胞肺癌、 肺的腺癌、 和肺的鳞癌 )、 腹膜癌、 肝细胞癌、 胃癌 (gastric or stomach cancer)( 包括胃肠癌 )、 胰腺癌、 成胶质细胞瘤、 宫颈癌、 卵巢癌、 肝癌 (liver cancer or hepatic carcinoma)、 膀胱癌、 肝瘤 (hepatoma)、 乳腺癌、 结肠癌、 结肠直肠癌、 子宫内膜癌或子宫癌、 唾液腺癌、 肾癌 (kidney or renal cancer)、 前列腺癌、 外阴癌、 甲状 腺癌、 及各种类型的头和颈癌， 以及 B 细胞淋巴瘤 ( 包括低级 / 滤泡性非何杰金氏淋巴瘤 (NHL)、 小淋巴细胞性 (SL)NHL、 中级 / 滤泡性 NHL、 中级弥漫性 NHL、 高级成免疫细胞性 NHL、 高级成淋巴细胞性 NHL、 高级小无核裂细胞性 NHL、 贮积病 (bulky disease)NHL、 套细胞淋 巴瘤、 AIDS 相关淋巴瘤、 和瓦尔登斯特伦氏 (Waldenstrom) 巨球蛋白血症 )、 慢性淋巴细胞 性白血病 (CLL)、 急性成淋巴细胞性白血病 (ALL)、 毛细胞性白血病、 慢性成髓细胞性白血 病、 和移植后淋巴增殖性病症 (PTLD)、 以及与瘢痣病 (phakomatoses)、 水肿 ( 诸如与脑瘤有 关的 ) 和梅格斯氏 (Meigs) 综合征有关的异常血管增殖。
“转移” 指癌自其原发部位传播至身体中的其它位置。癌细胞能脱离原发性肿瘤， 渗透入淋巴和血管， 经由血流而循环， 和在身体中其它地方的正常组织中的远端病灶 ( 转 移 ) 中生长。转移可以是当地的或远端的。认为转移是一个连续过程， 视肿瘤细胞自原发 性肿瘤脱落、 经由血流而传播、 并在远端部位停止而定。在新的部位， 该细胞建立血供且能 生长至形成危及生命的团块。肿瘤细胞内的刺激性和抑制性分子途径调节这种行为， 而且 肿瘤细胞与远端部位中的宿主细胞之间的相互作用也是重要的。
“微转移 (micrometastasis)” 指自原发性肿瘤传播至身体其它部分的少数细胞。 微转移在筛选或诊断测试中可以检测得到或检测不到。
“癌症复发” 在本文中指癌症在治疗后回来， 而且包括癌症在原发性器官中的回 来， 以及远端复发， 即癌症在原发性器官以外回来。
处于 “高癌症复发风险” 的受试者是具有更大机会经历癌症复发的受试者。例如， 相对年轻的受试者 ( 例如不到约 50 岁 )， 具有阳性淋巴结 ( 特别是 4 个或更多个累及淋巴 结， 包括 4-9 个累及淋巴结， 和 10 个或更多个累及淋巴结 ) 的那些， 及具有直径大于 2cm 的 肿瘤 ( 例如在乳腺癌患者中 ) 的那些。受试者的风险水平可以由熟练内科医师来测定。一 般地， 此类高风险受试者会具有淋巴结累及 ( 例如 4 个或更多个累及的淋巴结 ) ； 然而， 没有淋巴结累及的受试者也会是高风险的， 例如如果他们的肿瘤大于或等于 2cm 的话。
“癌症复发风险降低” 表示相对于未接受治疗的患者 ( 相对于未用 VEGF 特异性拮 抗剂， 例如抗 VEGF 抗体治疗的患者 ) 或相对于对照治疗方案 ( 诸如只用化疗剂的治疗， 诸 如结肠直肠癌的标准治疗中使用的那些， 例如亚叶酸 (leucovorin)、 5- 氟尿嘧啶、 奥沙利 铂 (oxaliplatin)、 伊利替康 (irinotecan) 或其组合 ) 降低经历癌症复发的可能性。癌症 复发在治疗启动之后或在初始诊断之后监测至少约 2 个月、 4 个月、 6 个月、 9 个月、 或至少约 1 年、 或至少约 2 年、 或至少约 3 年、 或至少约 4 年、 或至少约 5 年、 或至少约 10 年、 等。
“治疗启动” 指外科切除肿瘤之后治疗方案的开始。在一个实施方案中， 这可以指 在外科之后施用一种或多种化疗剂。或者， 这可以指 VEGF 特异性拮抗剂， 例如抗 VEGF 抗体 和一种或多种化疗剂的初始施用。
“治愈” 癌症在本文中表示开始辅助疗法之后约 2、 3、 4 或约 5 年没有癌症复发， 这 取决于癌症的类型。
“肿瘤” 在用于本文时指所有赘生性 (neoplastic) 细胞生长和增殖， 无论是恶性的 还是良性的， 及所有癌前 (pre-cancerous) 和癌性细胞和组织。
“肿瘤休眠” 指一种延长的静止状态， 其中肿瘤细胞存在但肿瘤进展在临床上不明 显。休眠的肿瘤在筛选或诊断测试中可以检测得到或检测不到。
“受试者” 指哺乳动物， 包括但不限于人或非人哺乳动物， 诸如牛、 马、 犬、 绵羊、 或 猫。优选地， 受试者指人。在本文中， 患者也是受试者。
受试者 “群体” 指一组癌症受试者， 诸如临床试验中的， 或对特定适应证诸如癌症 辅助疗法批准例如 FDA 批准之后肿瘤学家看到的。
术语 “抗癌疗法” 指在治疗癌症中有用的疗法。抗癌治疗剂的例子包括但不限 于例如外科手术、 化疗剂、 生长抑制剂、 细胞毒剂、 放射疗法中所使用的药剂、 抗血管发生 剂、 凋亡剂、 抗微管蛋白剂、 和其它治疗癌症的药剂， 诸如抗 HER-2 抗体、 抗 CD20 抗体、 表皮生长因子受体 (EGFR) 拮抗剂 ( 例如酪氨酸激酶抑制剂 )、 HER1/EGFR 抑制剂 ( 例 如 erlotinib )、 血 小 板 衍 生 生 长 因 子 抑 制 剂 ( 例 如 GleevecTM(Imatinib Mesylate))、 COX-2 抑制剂 ( 例如 celecoxib)、 干扰素、 细胞因子、 结合一种或多种以下靶物 的拮抗剂 ( 例如中和性抗体 )(ErbB2、 ErbB3、 ErbB4、 PDGFR-β、 BlyS、 APRIL、 BCMA 或 VEGF 受体、 TRAIL/Apo2)、 和其它生物活性和有机化学剂， 等。 本发明还两种或更多种这些药剂的 组合。 术语 “细胞毒剂” 在用于本文时指抑制或阻止细胞功能和 / 或引起细胞破坏的物 质。该术语意图包括放射性同位素 ( 例如 At211、 I131、 I125、 Y90、 Re186、 Re188、 Sm153、 Bi212、 p32 和 Lu 的放射性同位素 )、 化疗剂、 和毒素诸如小分子毒素或细菌、 真菌、 植物或动物起源的酶 活毒素， 包括其片段和 / 或变体。
“化疗剂” 指可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的例子包括可用于治疗癌症的 化学化合物。化疗剂的例子包括烷化剂类 (alkylating agents)， 诸如塞替派 (thiotepa) 和 环 磷 酰 胺 (cyclophosphamide) ； 磺 酸 烷 基 酯 类 (alkyl sulfonates)， 诸如白消安 (busulfan)、 英丙舒凡 (improsulfan) 和哌泊舒凡 (piposulfan) ； 氮丙啶类 (aziridines)， 诸如苯佐替派 (benzodepa)、 卡波醌 (carboquone)、 美妥替派 (meturedepa) 和乌瑞替派 (uredepa) ； 乙撑亚胺类 (ethylenimines) 和甲基蜜胺类 (methylamelamines)，
包 括 六 甲 蜜 胺 (altretamine)、 三 乙 撑 蜜 胺 (triethylenemelamine)、 三乙撑磷酰胺 (triethylenephosphoramide)、 三 乙 撑 硫 代 磷 酰 胺 (triethylenethiophosphoramide) 和三羟甲蜜胺 (trimethylolomelamine) ； 番荔枝内酯类 (acetogenins)( 尤其是布拉他 辛 (bullatacin) 和 布 拉 他 辛 酮 (bullatacinone)) ； 喜 树 碱 (camptothecin)( 包 括 合 成 类 似 物 托 泊 替 康 (topotecan)) ； 苔 藓 抑 素 (bryostatin) ； callystatin ； CC-1065( 包 括 其 阿 多 来 新 (adozelesin)、 卡 折 来 新 (carzelesin) 和 比 折 来 新 (bizelesin) 合 成类似物 )； 隐 藻 素 类 (cryptophycins)( 特 别 是 隐 藻 素 1 和 隐 藻 素 8) ； 多拉司他 汀 (dolastatin) ； duocarmycin( 包 括 合 成 类 似 物， KW-2189 和 CB1-TM1) ； 艾榴塞洛素 (eleutherobin) ； pancratistatin ； sarcodictyin ； 海 绵 抑 素 (spongistatin) ； 氮芥类 (nitrogen mustards)， 诸如苯丁酸氮芥 (chlorambucil)、 萘氮芥 (chlomaphazine)、 胆磷 酰 胺 (cholophosphamide)、 雌 莫 司 汀 (estramustine)、 异 环 磷 酰 胺 (ifosfamide)、 双氯 乙 基 甲 胺 (mechlorethamine)、 盐 酸 氧 氮 芥 (mechlorethamine oxide hydrochloride)、 美 法 仑 (melphalan)、 新 氮 芥 (novembichin)、 苯 芥 胆 甾 醇 (phenesterine)、 泼尼莫 司 汀 (prednimustine)、 曲 磷 胺 (trofosfamide)、 尿 嘧 啶 氮 芥 (uracil mustard) ； 亚 硝 脲 类 (nitrosoureas)， 诸 如 卡 莫 司 汀 (carmustine)、 氯 脲 菌 素 (chlorozotocin)、 福 莫 司 汀 (fotemustine)、 洛 莫 司 汀 (lomustine)、 尼 莫 司 汀 (nimustine) 和 雷 莫 司 汀 (ranimustine) ； 抗 生 素 类， 诸 如 烯 二 炔 类 抗 生 素 (enediyne)( 例 如 加 利 车 霉 素 (calicheamicin)， 尤其是加利车霉素 γ1I 和加利车霉素 ωI1( 参见例如 Agnew(1994) Chem.Intl.Ed.Engl.33 ： 183-186) ； 蒽环类抗生素 (dynemicin)， 包括 dynemicin A ； 二膦 酸盐类 (bisphosphonates)， 诸如氯膦酸盐 (clodronate) ； 埃斯波霉素 (esperamicin) ； 以及新制癌素 (neocarzinostatin) 发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团 )、 阿 克 拉 霉 素 (aclacinomycin)、 放 线 菌 素 (actinomycin)、 氨 茴 霉 素 (anthramycin)、 偶氮 丝 氨 酸 (azaserine)、 博 来 霉 素 (bleomycin)、 放 线 菌 素 C(cactinomycin)、 carabicin、 洋 红 霉 素 (carminomycin)、 嗜 癌 霉 素 (carzinophilin)、 色 霉 素 (chromomycin)、 放线 菌 素 D(dactinomycin)、柔 红 霉 素 (daunorubicin)、地 托 比 星 (detorubicin)、 6- 二 氮 -5- 氧 -L- 正亮氨酸、 多柔比星 (doxorubicin)( 包括吗啉代多柔比 星、 氰基吗啉代多柔比星、 2- 吡咯代多柔比星和脱氧多柔比星 )、 表柔比星 (epirubicin)、 依索比星 (esorubicin)、 伊达比星 (idarubicin)、 麻西罗霉素 (marcellomycin)、 丝裂霉素 类 (mitomycins) 诸如丝裂霉素 C、 霉酚酸 (mycophenolic acid)、 诺拉霉素 (nogalamycin)、 橄 榄 霉 素 (olivomycin)、 培 洛 霉 素 (peplomycin)、 泊 非 霉 素 (potfiromycin)、 嘌呤 霉 素 (puromycin)、三 铁 阿 霉 素 (quelamycin)、罗 多 比 星 (rodorubicin)、链 黑 菌 素 (streptonigrin)、 链 佐 星 (streptozocin)、 杀 结 核 菌 素 (tubercidin)、 乌苯美司 (ubenimex)、 净司他丁 (zinostatin)、 佐柔比星 (zorubicin) ； 抗代谢物类， 诸如甲氨蝶呤 (methotrexate) 和 5- 氟尿嘧啶 (5-FU) ； 叶酸类似物， 诸如二甲叶酸 (denopterin)、 甲氨 蝶呤 (methotrexate)、 蝶罗呤 (pteropterin)、 三甲曲沙 (trimetrexate) ； 嘌呤类似物， 诸 如 氟 达 拉 滨 (fludarabine)、 6- 巯 基 嘌 呤 (mercaptopurine)、 硫 咪 嘌 呤 (thiamiprine)、 硫 鸟 嘌 呤 (thioguanine) ； 嘧 啶 类 似 物， 诸 如 安 西 他 滨 (ancitabine)、 阿扎胞苷 (azacitidine)、 6- 氮 尿 苷 (azauridine)、 卡 莫 氟 (carmofur)、 阿 糖 胞 苷 (cytarabine)、 双脱氧尿苷 (dideoxyuridine)、 去氧氟尿苷 (doxifluridine)、 依诺他滨 (enocitabine)、氟 尿 苷 (floxuridine) ； 雄 激 素 类， 诸 如 卡 鲁 睾 酮 (calusterone)、 丙酸屈他雄酮 (dromostanolone propionate)、 表 硫 雄 醇 (epitiostanol)、 美 雄 烷 (mepitiostane)、 睾 内 酯 (testolactone) ； 抗 肾 上 腺 类， 诸 如 氨 鲁 米 特 (aminoglutethimide)、 米托坦 (mitotane)、 曲 洛 司 坦 (trilostane) ； 叶 酸 补 充 剂， 诸 如 亚 叶 酸 (folinic acid) ； 醋葡 醛 内 酯 (aceglatone) ； 醛 磷 酰 胺 糖 苷 (aldophosphamide glycoside) ； 氨基乙酰丙酸 (aminolevulinic acid) ； 恩 尿 嘧 啶 (eniluracil) ； 安 吖 啶 (amsacrine) ； bestrabucil ； 比 生 群 (bisantrene) ； 依 达 曲 沙 (edatraxate) ； 地 磷 酰 胺 (defosfamide) ； 地美可辛 (demecolcine) ； 地吖醌 (diaziquone) ； elfornithine ； 依利醋铵 (elliptinium acetate) ； 埃 坡 霉 素 (epothilone) ； 依 托 格 鲁 (etoglucid) ； 硝酸镓； 羟 脲 (hydroxyurea) ； 香 菇 多 糖 (lentinan) ； 氯 尼 达 明 (lonidamine) ； 美 登 木 素 生 物 碱 类 (maytansinoids)， 诸 如 美 登 素 (maytansine) 和 安 丝 菌 素 (ansamitocin) ； 米 托 胍 腙 (mitoguazone) ； 米 托 蒽 醌 (mitoxantrone) ； 莫 哌 达 醇 (mopidamol) ； 二 胺 硝 吖 啶 (nitracrine) ； 喷 司 他 丁 (pentostatin) ； 蛋 氨 氮 芥 (phenamet) ； 吡 柔 比 星 (pirarubicin) ； 洛索蒽醌 (losoxantrone) ； 鬼 臼 酸 (podophyllinic acid) ； 2- 乙 基 酰 肼 (ethylhydrazide) ； 丙卡 巴 肼 (procarbazine) ； 多 糖 复 合 物 (JHS Natural Products， Eugene， OR) ； 雷佐 生 (razoxane) ； 根霉素 (rhizoxin) ； 西佐喃 (sizofiran) ； 螺旋锗 (spirogermanium) ； 细 交链孢菌酮酸 (tenuazonic acid) ； 三亚胺醌 (triaziquone) ； 2， 2 ′， 2 ″ - 三氯三乙胺 ； 单端孢菌素类 (trichothecenes)( 尤其是 T-2 毒素、 疣孢菌素 (verrucarin)A、 杆孢菌素 (roridin)A 和蛇行菌素 (anguidin)) ； 乌拉坦 (urethan) ； 长春地辛 (vindesine) ； 达卡 巴 嗪 (dacarbazine) ； 甘 露 莫 司 汀 (mannomustine) ； 二 溴 甘 露 醇 (mitobronitol) ； 二溴 卫 矛 醇 (mitolactol) ； 哌 泊 溴 烷 (pipobroman) ； gacytosine ； 阿 糖 胞 苷 (arabinoside) (“Ara-C” )； 环磷酰胺 (cyclophosphamide) ； 塞替派 (thiotepa) ； 类紫杉醇类 (taxoids)， 例如 帕 利 他 塞 (paclitaxel)(Bristol-Myers Squibb Oncology， Princeton， N.J.)、 不含 克列 莫佛 (Cremophor)、 清蛋白 改造 纳米 颗粒 剂型 帕利 他 塞 (American Pharmaceutical Partners， Schaumberg， Illinois) 和 多 西 他 塞 (doxetaxel)( -Poulenc Rorer， Antony， France) ；苯 丁 酸 氮 芥 (chlorambucil) ； 吉西他滨 (gemcitabine) ； 6- 硫鸟嘌呤 (thioguanine) ； 巯 基嘌呤 (mercaptopurine) ； 甲氨蝶呤 (methotrexate) ； 铂类似物， 诸如顺铂 (cisplatin)、 奥沙利铂 (oxaliplatin) 和卡铂 (carboplatin) ； 长春碱 (vinblastine) ； 铂 (platinum) ； 依托泊苷 (etoposide)(VP-16) ； 异环磷酰胺 (ifosfamide) ； 米托蒽醌 (mitoxantrone) ； 长 春新碱 (vincristine) ； 长春瑞滨 (vinorelbine) ； 能灭瘤 (novantrone) ； 替 尼 泊 苷 (teniposide) ； 依 达 曲 沙 (edatrexate) ； 道 诺 霉 素 (daunomycin) ； 氨基蝶呤 (aminopterin) ； 希罗达 (xeloda) ； 伊本膦酸盐 (ibandronate) ； 伊立替康 (irinotecan) (Camptosar， CPT-11)( 包括伊立替康及 5-FU 和亚叶酸的治疗方案 ) ； 拓扑异构酶抑制 剂 RFS 2000 ； 二氟甲基鸟氨酸 (DMFO) ； 类视黄酸类 (retinoids)， 诸如视黄酸 (retinoic acid) ； 卡 培 他 滨 (capecitabine) ； 考 布 他 汀 (combretastatin) ； 亚 叶 酸 (leucovorin) (LV) ； 奥沙利铂 (oxaliplatin)， 包括奥沙利铂治疗方案 (FOLFOX) ； PKC-α、 Raf、 H-Ras、 EGFR ( 例如 erlotinib ) 和 VEGF-A 的、 降低细胞增殖的抑制剂 ； 及任何上述物 质的药剂学可接受的盐、 酸或衍生物。该定义还包括作用于调节或抑制激素对肿瘤作用的抗激素剂诸如抗雌激 素 类 和 选 择 性 雌 激 素 受 体 调 控 物 类 (SERM)， 包 括 例 如 他 莫 昔 芬 (tamoxifen)( 包 括 他 莫 昔 芬 )、雷 洛 昔 芬 (raloxifene)、屈 洛 昔 芬 (droloxifene)、 4- 羟 基 他 莫 昔 芬、 曲 沃 昔 芬 (trioxifene)、 那 洛 昔 芬 (keoxifene)、 LY117018、 奥 那 司 酮 (onapristone) 和 托 瑞 米 芬 (toremifene) ； 抑制在肾上 腺 中 调 节 雌 激 素 生 成 的 芳 香 酶 的 芳 香 酶 抑 制 剂， 诸 如 例 如 4(5)- 咪 唑、 氨鲁米特 (aminoglutethimide)、 醋酸甲地孕酮 (megestrolacetate)、 浓 西 美 坦 (exemestane)、福 美 坦 (formestane)、法 倔 唑 (fadrozole)、 伏 罗 唑 (vorozole)、 来 曲 唑 (letrozole) 和 阿那曲唑 (anastrozole) ； 抗雄激素类， 诸如氟他米特 (flutamide)、 尼鲁米特 (nilutamide)、 比卡 米特 (bicalutamide)、 亮丙瑞林 (leuprolide)、 和戈舍瑞林 (goserelin) ； 以及曲沙他滨 (troxacitabine)(1， 3- 二氧戊环核苷胞嘧啶类似物 ) ； 反义寡核苷酸， 特别是抑制涉及异 常 (abherant) 细胞增殖的信号途经中的基因表达的反义寡核苷酸， 诸如例如 PKC-α、 Ralf 和 H-Ras ； 核酶， 诸如 VEGF 表达抑制剂 ( 例如 核酸 ) 和 HER2 表达抑制剂 ； 疫苗， 诸如基因疗法疫苗， 例如 疫苗、 疫苗和 疫苗 ； rIL-2 ； 拓扑异构酶 1 抑制剂 ； rmRH ； 及任何上述物质的药剂学可接受的盐、 酸或衍生物。
术语 “细胞因子” 是由一种细胞群释放， 作为细胞间介质作用于另一细胞的蛋白 质的通称。此类细胞因子的例子有淋巴因子、 单核因子和传统的多肽激素。细胞因子中包 括生长激素， 诸如人生长激素、 N- 甲硫氨酰人生长激素和牛生长激素 ； 甲状旁腺素 ； 甲状腺 素； 胰岛素 ； 胰岛素原 ； 松驰素 ； 松驰素原 ； 糖蛋白激素类， 诸如促卵泡激素 (FSH)、 促甲状 腺激素 (TSH) 和促黄体激素 (LH) ； 表皮生长因子 ； 肝生长因子 ； 成纤维细胞生长因子 ； 促乳 素； 胎盘催乳激素 ； 肿瘤坏死因子 -α 和 -β ； 穆勒氏 (Mullerian) 抑制性物质 ； 小鼠促性 腺激素相关肽 ； 抑制素 ； 激活素 ； 血管内皮生长因子 ； 整联蛋白 ； 血小板生成素 (TPO) ； 神经 生长因子， 诸如 NGF-α ； 血小板生长因子 ； 转化生长因子 (TGF)， 诸如 TGF-α 和 TGF-β ； 胰 岛素样生长因子 -I 和 -II ； 红细胞生成素 (EPO) ； 骨诱导因子 (osteoinductive factor) ； 干扰素， 诸如干扰素 -α、 -β 和 -γ ； 集落刺激因子 (CSF)， 诸如巨噬细胞 CSF(M-CSF)、 粒细 胞 - 巨噬细胞 CSF(GM-CSF) 和粒细胞 CSF(G-CSF) ； 白介素 (IL)， 诸如 IL-1、 IL-1α、 IL-2、 IL-3、 IL-4、 IL-5、 IL-6、 IL-7、 IL-8、 IL-9、 IL-10、 IL-11、 IL-12 ； 肿瘤坏死因子， 诸如 TNF-α 或 TNF-β ； 及其它多肽因子， 包括 LIF 和 kit 配体 (KL)。在用于本文时， 术语细胞因子包括 来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质及天然序列细胞因子的生物学活性等效物。
“生长抑制剂” 在用于本文时指在体外和 / 或在体内抑制细胞生长的化合物或组 合物。如此， 生长抑制剂可以是显著降低处于 S 期的细胞百分比的药剂。生长抑制剂的 例子包括阻断细胞周期行进 ( 处于 S 期以外的位置 ) 的药剂， 诸如诱导 G1 停滞和 M 期停 滞的药剂。经典的 M 期阻断剂包括长春药类 (vincas)( 长春新碱 (vincristine) 和长春 碱 (vinblastine))、 和拓扑异构酶 II 抑制剂诸如多柔比星 (doxorubicin)、 表 柔 比 星 (epirubicin)、 柔 红 霉 素 (daunorubicin)、 依 托 泊 苷 (etoposide) 和 博 来 霉 素 (bleomycin)。 那 些 阻 滞 G1 的 药 剂 也 溢 出 进 入 S 期 停 滞， 例 如 DNA 烷 化 剂 类 诸 如 他 莫 昔 芬 (tamoxifen)、 泼 尼 松 (prednisone)、 达 卡 巴 嗪 (dacarbazine)、 双氯乙基甲 胺 (mechlorethamine)、顺 铂 (cisplatin)、甲 氨 喋 呤 (methotrexate)、 5- 氟 尿 嘧 啶 (5-fluorouracil) 和 ara-C。 更 多 信 息 可 参 见 The Molecular Basis of Cancer， Mendelsohn and Israel 编，第 1 章，题 为 “Cell cycle regulation， oncogenes， and antineoplastic drugs” ， Murakami et al.， WB Saunders， Philadelphia(1995)， 尤其是第 13 页。
术语 “前体药物” 在用于本申请时指与母药 (parent drug) 相比对肿瘤细胞的细 胞毒性较小并能够酶促活化或转变为更具活性母药形式的药用活性物质的前体或衍生物 形式。参见例如 Wilman， “Prodrugs in Cancer Chemotherapy” ， Biochemical Society Transactions， 14， pp.375-382， 615thMeeting Belfast(1986) 和 Stella 等， “Prodrugs ： A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery” ， Directed Drug Delivery， Borchardt 等， 编， pp.247-267， Humana Press(1985)。本发明的前体药物包括但不限于含磷酸盐 / 酯 前体药物、 含硫代磷酸盐 / 酯前体药物、 含硫酸盐 / 酯前体药物、 含肽前体药物、 D- 氨基酸 修饰前体药物、 糖基化前体药物、 含 β- 内酰胺前体药物、 含任选取代苯氧基乙酰胺的前体 药物或含任选取代苯乙酰胺的前体药物、 可转化为更具活性而无细胞毒性的药物的 5- 氟 胞嘧啶和其它 5- 氟尿苷前体药物。可衍生为本发明使用的前体药物形式的细胞毒性药物 的例子包括但不限于上文描述的那些化疗剂。 “放射疗法” 或 “放疗” 指使用定向伽马射线或贝塔射线来诱发对细胞的足够损 伤， 以限制细胞正常发挥功能的能力或全然破坏细胞。应当领会， 本领域知道许多方式来 确定治疗的剂量和持续时间。典型的治疗作为一次施用来给予， 而典型的剂量范围为每天 10-200 个单位 ( 戈瑞 (Gray))。
“降低或抑制” 指引起优选 20％或更多、 更优选 50％或更多、 且最优选 75％、 85％、 90％、 95％、 或更多的总体降低的能力。降低或抑制可以指所治疗的病症的症状、 转移或微 转移的存在或大小、 原发性肿瘤的大小、 肿瘤的存在或大小、 或血管发生性病症中血管的大 小或数目。
术语 “静脉内输注” 指以超过约 5 分钟的一段时间， 优选 30-90 分钟， 将药物导入 动物或人患者的静脉， 尽管依照本发明， 静脉内输注或可施用 10 小时或更短。
术语 “静脉内推注” 或 “静脉内快速注射” 指在约 15 分钟内或更短， 优选 5 分钟或 更短， 将药物施用到动物或人的静脉中使得机体接受药物。
术语 “皮下施用” 指通过自药物容器的相对较慢的、 持续投递， 将药物导入动物或 人患者的皮肤下， 优选在皮肤和皮下组织间的袋内。所述袋可通过夹起或拉起皮肤并远离 皮下组织来创建。
术语 “皮下输注” 指以一段时间， 包括但不限于 30 分钟或更短， 或者 90 分钟或更 短， 通过自药物容器的相对较慢的、 持续投递， 将药物导入动物或人患者的皮肤下， 优选在 皮肤和皮下组织间的袋内。任选的是， 输注可通过植入动物或人患者皮肤下的药物投递泵 的皮下植入来进行， 其中所述泵以预定的一段时间， 诸如 30 分钟、 90 分钟、 或跨越治疗方案 持续时间的一段时间， 投递预定量的药物。
术语 “皮下推注” 指将药物施用至动物或人患者的皮肤下， 其中推注药物投递优选 短于约 15 分钟， 更优选短于 5 分钟， 最优选短于 60 秒。施用优选在皮肤和皮下组织间的袋 内， 其中所述袋可通过例如夹起或拉起皮肤并远离皮下组织来创建。
“病症” 指任何会受益于使用抗 VEGF 抗体的治疗的疾患。这包括慢性和急性病症或疾病， 包括那些使哺乳动物倾向于所讨论病症的病理状况。本文中待治疗的病症的非限 制性例子包括癌症 ； 良性和恶性肿瘤 ； 白血病和淋巴样恶性肿瘤 ； 神经元、 神经胶质、 星形 胶质细胞、 下丘脑和其它腺体、 巨噬细胞、 上皮、 基质和囊胚腔病症 ； 及炎性、 血管发生性和 免疫学病症。
术语 “治疗有效量” 指在哺乳动物中有效治疗疾病或病症的药物量。在癌症的情 况中， 治疗有效量的药物可减少癌细胞的数目 ； 缩小肿瘤的尺寸 ； 抑制 ( 即一定程度的减 缓， 优选阻止 ) 癌细胞浸润入周围器官 ； 抑制 ( 即一定程度的减缓， 优选阻止 ) 肿瘤转移 ； 一 定程度的抑制肿瘤生长 ； 和 / 或一定程度的减轻一种或多种与病症有关的症状。对于肿瘤 休眠或微转移的治疗， 治疗有效量的药物可减少微转移的数目或增殖 ； 减少或预防休眠肿 瘤的生长 ； 或减少或预防治疗或切除后肿瘤的复发 ( 例如使用抗癌疗法， 诸如外科、 放疗、 或化疗 )。根据药物可阻止现有癌细胞生长和 / 或杀死现有癌细胞的程度， 它可以是细胞 抑制性的和 / 或细胞毒性的。对于癌症疗法， 可以例如通过评价存活持续时间、 无疾病存 活 (DFS)、 距疾病进展的时间 (TTP)、 无进展存活持续时间 (PFS)、 响应率 (RR)、 响应持续时 间、 消退时间、 和 / 或生活质量来测量体内功效。 有效量可改善无疾病存活 (DFS)， 改善总体 存活 (OS)， 降低复发可能性， 延长距复发的时间， 延长距远端复发 ( 即原发性部位以外的复 发 ) 的时间， 治愈癌症， 改善癌症的症状 ( 例如如使用癌症特异性调查测量的 )， 减少第二原 发性癌症的出现， 等。
“治疗” 或 “处理” 指治疗性处理和预防性或防范性措施二者。需要治疗的受试者 包括早就患有病症的受试者以及要预防病症的受试者， 包括要预防癌症发生或复发的受试 者。
如本文中使用的， “积极治疗” 指期间对患者施用治疗性药物的时间段。例如， 如果 在 1 年的过程里每 2 周对患者施用治疗性药物， 之后没有治疗或其它疗法， 那么使用治疗性 药物进行的积极治疗指对患者施用该药物的 1 年时段。
术语 “标记物” 在用于本文时指与多肽直接或间接偶联的可检测化合物或组合物。 标记物自身可以是通过自身就可检测的 ( 例如放射性同位素标记物或荧光标记物 )， 或者 在酶标记物的情况中， 可催化可检测的底物化合物或组合物的化学改变。
通过述及将此说明书中提到的所有出版物、 专利申请、 和专利收入本文， 其程度如 同明确且单独指示每一篇独立的出版物、 专利、 或专利申请通过述及来收录。
II. 抗 VEGF 抗体和拮抗剂
(i)VEGF 抗原
要用于生成抗体的 VEGF 抗原可以是例如 VEGF165 分子以及 VEGF 的其它同等型或 其含有期望表位的片段。可用于生成本发明的抗 VEGF 抗体的其它形式的 VEGF 对于本领域 技术人员会是显而易见的。
人 VEGF 首先是使用牛 VEGF cDNA 作为杂交探针筛选自人细胞制备的 cDNA 文库而 获得的。Leung et al.(1989)Science， 246 ： 1306。一种由此鉴定出的 cDNA 编码一种 165 个氨基酸的蛋白质， 其与牛 VEGF 具有超过 95％的同源性 ； 此 165 个氨基酸的蛋白质通常称 作人 VEGF(hVEGF) 或 VEGF165。人 VEGF 的促有丝分裂活性通过在哺乳动物宿主细胞中表达 人 VEGF 得到了验证。由经人 VEGF cDNA 转染的细胞条件化的培养基促进毛细血管内皮细胞增殖， 而对照细胞不然。Leung et al.(1989)Science， 见上文。
虽然可以自天然来源分离和纯化血管内皮细胞生长因子， 随后用于治疗用途， 但 是该蛋白质在滤泡细胞中相对低的浓度和回收 VEGF 在努力和费用两个方面高的成本证明 在商业上是无效的。因而， 进行进一步努力来经重组 DNA 技术克隆和表达 VEGF。( 参见例 如 Ferrara， Laboratory Investigation 72 ： 615-618(1995) 及其中引用的参考文献 )。
源自可变 RNA 剪接， VEGF 在多种组织中作为多种同二聚体形式 ( 每个单体 121、 145、 165、 189、 和 206 个氨基酸 ) 表达。VEGF121 是一种可溶性丝裂原， 不结合肝素 ； 更长形 式的 VEGF 以越来越高的亲和力结合肝素。肝素结合形式的 VEGF 可以在羧基末端被纤溶 酶切割以释放可扩散形式的 VEGF。纤溶酶切割后鉴定出的羧基末端肽的氨基酸测序是 Arg110-Ala111。作为同二聚体分离到的氨基末端 “核心” 蛋白， VEGF(1-110) 以与完整 VEGF165 同二聚体相比相似的亲和力结合中和性单克隆抗体 ( 诸如称作 4.6.1 和 3.2E3.1.1 的抗 体 ) 和可溶性形式的 VEGF 受体。
最近还鉴定出数种在结构上与 VEGF 有关的分子， 包括胎盘生长因子 (PIGF)、 VEGF-B、 VEGF-C、 VEGF-D 和 VEGF-E。Ferrara 和 Davis-Smyth(1987)Endocr.Rev.，见 上 文； Ogawa et al.J.Biological Chem.273 ： 31273-31281(1998) ； Meyer et al.EMBO J.， 18 ： 363-374(1999)。 受 体 酪 氨 酸 激 酶 Flt-4(VEGFR-3) 鉴 定 为 VEGF-C 和 VEGF-D 的 受 体。Joukov et al.EMBO.J.15 ： 1751(1996) ； Lee et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93 ： 1988-1992(1996) ； Achen et al.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95 ： 548-553。 VEGF-C 显 示出涉及对淋巴管发生的调节。Jeltsch et al.Science 276 ： 1423-1425(1997)。
已经鉴定出两种 VEGF 受体， 即 Flt-1( 也称作 VEGFR-1) 和 KDR( 也称作 VEGFR-2)。 Shibuya et al.(1990)Oncogene 8 ： 519-527 ； de Vries et al.(1992)Science 255 ： 989-991 ； Terman et al.(1992)Biochem.Biophys.Res.Commun.187 ： 1579-1586。神经毡蛋 白 -1 显示为选择性 VEGF 受体， 能够结合肝素结合性 VEGF 同等型 (Soker et al.(1998) Cell 92 ： 735-45)。Flt-1 和 KDR 都属于受体酪氨酸激酶 (RTK) 家族。RTK 包含具有多样 生物学活性的跨膜受体的大家族。目前， 鉴定出至少十九 (19) 个独特 RTK 亚家族。受体 酪氨酸激酶 (RTK) 家族包括对于多种细胞类型的生长和分化至关重要的受体 (Yarden 和 Ullrich(1988)Ann.Rev.Biochem.57 ： 433-478 ； Ullrich 和 Schlessinger(1990)Cell 61 ： 243-254)。RTK 的内在功能在配体结合后被活化， 导致受体和多种细胞底物磷酸化， 随后导 致多种细胞应答 (Ullrich & Schlessinger(1990)Cell 61 ： 203-212)。 如此， 受体酪氨酸激 酶介导的信号转导通过与特定生长因子 ( 配体 ) 的细胞外相互作用而启动， 通常接着是受 体二聚化、 刺激内在蛋白质酪氨酸激酶活性和受体转磷酸。由此为细胞内信号转导分子创 建结合位点， 并导致与一系列细胞质信号传导分子的复合物形成， 推动适宜细胞应答。( 例 如细胞分裂、 分化、 代谢影响、 细胞外微环境的变化 ) 参见 Schlessinger 和 Ullrich(1992) Neuron 9 ： 1-20。 在结构上， Flt-1 和 KDR 都具有胞外域中的七个免疫球蛋白样结构域、 单个 跨膜区、 和被激酶插入域中断的共有酪氨酸激酶序列。 Matthews et al.(1991)Proc.Natl. Acad.Sci.USA 88 ： 9026-9030 ； Terman et al.(1991)Oncogene 6 ： 1677-1683。
(ii) 抗 VEGF 抗体
在本发明的方法中有用的抗 VEGF 抗体包括任何抗体或其抗原结合片段， 它们以 足够亲和力和特异性结合 VEGF 且能降低或抑制 VEGF 的生物学活性。 抗 VEGF 抗体通常不会结合其它 VEGF 同源物， 诸如 VEGF-B 或 VEGF-C， 也不会结合其它生长因子， 诸如 PlGF、 PDGF、 或 bFGF。
在本发明的某些实施方案中， 抗 VEGF 抗体包括但不限于与由杂交瘤 ATCC HB 10709 生 成 的 单 克 隆 抗 VEGF 抗 体 A4.6.1 ； 依 照 Presta et al.(1997)Cancer Res.57 ： 4593-4599 生成的重组人源化抗 VEGF 单克隆抗体结合相同表位的单克隆抗体。 在一个实施 方案中， 抗 VEGF 抗体是 “贝伐单抗 (BV)” ， 也称作 “rhuMAb VEGF” 或 它包含 经过突变的人 IgG1 框架区和来自小鼠抗 hVEGF 单克隆抗体 A.4.6.1 的抗原结合互补决定 区， 阻断人 VEGF 结合其受体。贝伐单抗大约 93％的氨基酸序列 ( 包括大部分框架区 ) 是自 人 IgG1 衍生， 而且约 7％的序列是自小鼠抗体 A4.6.1 衍生的。
贝伐单抗和其它人源化抗 VEGF 抗体进一步记载于 2005 年 2 月 26 日公告的美国 专利 No.6,884,879。别的抗体包括 G6 或 B20 系列抗体 ( 例如 G6-31、 B20-4.1)， 如记载于 PCT 公开号 WO2005/012359、 PCT 公开号 WO2005/044853、 和美国专利申请 60/991,302， 通过 述及明确将这些专利申请的内容收入本文。对于别的抗体， 参见美国专利 No.7,060,269， 6,582,959， 6,703,020 ； 6,054,297 ； WO98/45332 ； WO 96/30046 ； WO94/10202 ； EP0666868B1 ； 美 国 专 利 申 请 公 开 文 本 No.2006009360， 20050186208， 20030206899， 20030190317， 20030203409， 和 20050112126 ； 和 Popkov et al.， Journal of Immunological Methods 288 ： 149-164(2004)。其它抗体包括那些结合 AVEGF 上包含残基 F17、 M18、 D19、 Y21、 Y25、 Q89、 I91、 K101、 E103、 和 C104 或者包含残基 F17、 Y21、 Q22、 Y25、 D63、 I83 和 Q89 的功能性 表位的。
在本发明的一个实施方案中， 抗 VEGF 抗体包含重链可变区， 其包含下述氨基酸序 列：
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYTFT NYGMNWVRQA PGKGLEWVGW INTYTGEPTY
AADFKRRFTF SLDTSKSTAY LQMNSLRAED TAVYYCAKYP HYYGSSHWYF DVWGQGTLVT
VSS(SEQ ID NO ： 1)
和轻链可变区， 其包含下述氨基酸序列 ：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCSASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKVLIYF TSSLHSGVPS
RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YSTVPWTFGQ GTKVEIKR(SEQ ID NO ： 2)。
依照本发明的 “G6 系列抗体” 指自 G6 抗体的序列衍生的抗 VEGF 抗体或依照 PCT 公开文本 No.WO2005/012359 的图 7、 24-26、 和 34-35 之任一的 G6 衍生抗体， 通过述及将其 整个公开内容收入本文。还可参见 PCT 公开文本 No.WO2005/044853， 通过述及将这些专利 申请的内容明确收入本文。在一个实施方案中， G6 系列抗体结合人 VEGF 上的功能性表位， 其包含残基 F17、 Y21、 Q22、 Y25、 D63、 I83 和 Q89。
依照本发明的 “B20 系列抗体” 指自 B20 抗体的序列衍生的抗 VEGF 抗体或依照 PCT 公开文本 No.WO2005/012359 的图 27-29 之任一的 B20 衍生抗体， 通过述及将其整个公开内 容收入本文。 还可参见 PCT 公开文本 No.WO2005/044853 和美国专利申请 60/991,302， 通过 述及将这些专利申请的内容明确收入本文。在一个实施方案中， B20 系列抗体结合人 VEGF 上的功能性表位， 其包含残基 F17、 M18、 D19、 Y21、 Y25、 Q89、 I91、 K101、 E103、 和 C104。
依照本发明的 “功能性表位” 指抗原中有力地促进抗体结合的氨基酸残基。抗原 中贡献巨大的残基中任一个的突变 ( 例如， 丙氨酸或同系物突变对野生型 VEGF 的突变 ) 会破坏抗体的结合， 使得抗体的相对亲和力比 (IC50 突变型 VEGF/IC50 野生型 VEGF) 会大于 5( 参见 WO2005/012359 的实施例 2)。在一个实施方案中， 相对亲和力比是通过溶液结合噬 菌体展示 ELISA 测定的。简言之， 将 96 孔 Maxisorp 免疫板 (NUNC) 用 Fab 形式的待测试抗 体以 PBS 中 2ug/ml 的浓度于 4℃包被过夜， 并用 PBS、 0.5 ％ BSA、 和 0.05 ％ Tween20(PBT) 于室温封闭 2 小时。首先将展示 hVEGF 丙氨酸点突变体 ( 残基 8-109 形式 ) 或野生型 hVEGF(8-109) 的噬菌体在 PBT 中的连续稀释液在 Fab 包被的板上于室温温育 15 分钟， 并 用 PBS、 0.05％ Tween20(PBST) 清洗板。用在 PBT 中 1 ∶ 5000 稀释的抗 M13 单克隆抗体辣 根过氧化物酶 (Amersham Pharmacia) 偶联物检测所结合的噬菌体， 用 3， 3’ ， 5， 5’ - 四甲基 联苯胺 (TMB， Kirkegaard & Perry Labs， Gaithersburg， MD) 底物显色大约 5 分钟， 用 1.0M H3PO4 淬灭， 并以分光光度法于 450nm 读数。IC50 值的比 (IC50， ala/IC50， wt) 代表了结合 亲和力的降低倍数 ( 相对结合亲和力 )。
(iii)VEGF 受体分子
两种表征最全面的 VEGF 受体是 VEGFR1( 也称作 Flt-1) 和 VEGFR2( 鼠同系物也称 作 KDR 和 FLK-1)。每一种受体对每一种 VEGF 家族成员的特异性有所不同， 但是 VEGF-A 结 合 Flt-1 和 KDR 二者。 全长 Flt-1 受体包括具有七个 Ig 结构域的胞外结构域、 跨膜结构域、 和具有酪氨酸激酶活性的胞内结构域。胞外结构域涉及 VEGF 结合， 而胞内结构域涉及信号 转导。
特异性结合 VEGF 的 VEGF 受体分子或其片段可以在本发明的方法中用于结合和隔 绝 VEGF 蛋白， 由此阻止它发信号。在某些实施方案中， VEGF 受体分子或其 VEGF 结合片段 是可溶性形式， 诸如 sFlt-1。受体的可溶性形式发挥对 VEGF 蛋白生物学活性的抑制效应， 其通过结合 VEGF， 由此阻止它结合其在靶细胞表面上存在的天然受体来实现。还包括 VEGF 受体融合蛋白， 下文描述了它们的例子。
嵌合 VEGF 受体蛋白指具有自至少两种不同蛋白质 ( 其中至少一种是 VEGF 受体 蛋白， 例如 flt-1 或 KDR 受体 ) 衍生的氨基酸序列且能够结合并抑制 VEGF 生物学活性的 受体分子。在某些实施方案中， 本发明的嵌合 VEGF 受体蛋白由自只有两种不同 VEGF 受体 分子衍生的氨基酸序列组成 ； 然而， 可以将包含一个、 两个、 三个、 四个、 五个、 六个、 或所有 七个来自 flt-1 和 / 或 KDR 受体胞外配体结合区的 Ig 样结构域的氨基酸序列连接至来自 其它无关蛋白质的氨基酸序列， 例如免疫球蛋白序列。与 Ig 样结构域组合的其它氨基酸 序列对于本领域普通技术人员会是显而易见的。嵌合 VEGF 受体蛋白的例子包括例如可溶 性 Flt-1/Fc、 KDR/Fc、 或 FLt 1/KDR/Fc( 也称作 VEGF Trap)( 参见例如 PCT 申请公开文本 No.WO97/44453)。
本发明的可溶性 VEGF 受体蛋白或嵌合 VEGF 受体蛋白包括没有经跨膜结构域而固 定至细胞表面的 VEGF 受体蛋白。因此， VEGF 受体 ( 包括嵌合受体蛋白 ) 的可溶性形式， 虽 然能够结合并灭活 VEGF， 但是不包含跨膜结构域， 并如此一般不会变成与该分子在其中表 达的细胞的细胞膜相结合。
III. 治疗用途
本发明提供了辅助疗法的方法， 包括对受试者施用 VEGF 特异性拮抗剂， 例如抗 VEGF 抗体超过 1 年。在一些实施方案中， 受试者具有非转移性结肠直肠癌。在该方法的一 些实施方案中， 在确定性手术之后施用 VEGF 特异性拮抗剂。本文中治疗的受试者一般处于癌症复发的风险。
在一些实施方案中， 辅助疗法的方法在患者中延长无疾病存活 (DFS) 或总体存活 (OS)。在一些实施方案中， 在治疗启动之后约 2 至 5 年评估 ( 例如分析 )DFS 或 OS。还提 供了辅助疗法的方法， 包括对有癌症的患者施用有效量的 VEGF 特异性拮抗剂， 其中在 VEGF 特异性拮抗剂积极治疗期间阻止或延迟癌症发展 (progression)， 且其中积极治疗持续超 过 1 年。在一些实施方案中， 在 VEGF 特异性拮抗剂积极治疗停止后阻止或延迟癌症发展约 3、 4、 5 或 6 个月。本发明进一步提供辅助疗法的方法， 包括对有癌症的患者施用有效量的 VEGF 特异性拮抗剂， 其中在 VEGF 特异性拮抗剂积极治疗期间阻止或延迟癌症复发， 且其中 VEGF 特异性拮抗剂的积极治疗持续超过 1 年。 在一些实施方案中， 在 VEGF 特异性拮抗剂积 极治疗停止后阻止或延迟癌症复发约 3、 4、 5 或 6 个月。在某些实施方案中， 在确定性手术 之后对患者施用 VEGF 特异性拮抗剂。在某些实施方案中， 包括施用抗 VEGF 抗体的辅助疗 法在治疗启动之后持续至少 2 年、 至少 3 年、 至少 4 年、 至少 5 年、 至少 10 年或更久。
本发明提供了辅助疗法的方法， 包括为癌症 ( 例如原发性肿瘤 ) 经历过确定性手 术的患者施用有效量的 VEGF 特异性拮抗剂以在患者中延长 DFS 或 OS， 其中施用 VEGF 特异 性拮抗剂超过 1 年。在一些实施方案中， 在治疗启动之后约 2 至 5 年评估 ( 例如分析 )DFS 或 OS。还提供了辅助疗法的方法， 包括为癌症 ( 例如原发性肿瘤 ) 经历过确定性手术的患 者施用有效量的 VEGF 特异性拮抗剂， 其中在 VEGF 特异性拮抗剂积极治疗期间阻止或延迟 癌症发展， 且其中积极治疗持续超过 1 年。 在一些实施方案中， 在 VEGF 特异性拮抗剂积极治 疗停止后阻止或延迟癌症发展约 3、 4、 5 或 6 个月。本发明进一步提供了辅助疗法的方法， 包括为癌症 ( 例如原发性肿瘤 ) 经历过确定性手术的患者施用有效量的 VEGF 特异性拮抗 剂， 其中在 VEGF 特异性拮抗剂积极治疗期间阻止或延迟癌症复发， 且其中 VEGF 特异性拮抗 剂积极治疗持续超过 1 年。在一些实施方案中， 在 VEGF 特异性拮抗剂积极治疗停止后阻止 或延迟癌症复发约 3、 4、 5 或 6 个月。在某些实施方案中， 包括施用抗 VEGF 抗体的辅助疗法 在治疗启动之后持续至少 2 年、 至少 3 年、 至少 4 年、 至少 5 年、 至少 10 年或更久。
本发明进一步提供了治疗为癌症 ( 例如原发性肿瘤 ) 经历过确定性手术的患者的 方法， 包括对患者施用辅助疗法， 其包括有效量的 VEGF 特异性拮抗剂以在患者中延长 DFS 或 OS， 其中施用 VEGF 特异性拮抗剂超过 1 年。在一些实施方案中， 在治疗启动之后约 2 至 5 年评估 ( 例如分析 )DFS 或 OS。还提供了治疗为癌症 ( 例如原发性肿瘤 ) 经历过确定性 手术的患者的方法， 包括对患者施用辅助疗法， 其包括有效量的 VEGF 特异性拮抗剂， 其中 且其中积极治疗持续超过 1 年。 在 VEGF 特异性拮抗剂积极治疗期间阻止或延迟癌症发展， 在一些实施方案中， 在 VEGF 特异性拮抗剂积极治疗停止后阻止或延迟癌症发展约 3、 4、 5或 6 个月。本发明进一步提供了治疗为癌症 ( 例如原发性肿瘤 ) 经历过确定性手术的患者的 方法， 包括对患者施用辅助疗法， 其包括有效量的 VEGF 特异性拮抗剂， 其中在 VEGF 特异性 拮抗剂积极治疗期间阻止或延迟癌症复发， 且其中 VEGF 特异性拮抗剂积极治疗持续超过 1 年。 在一些实施方案中， 在 VEGF 特异性拮抗剂积极治疗停止后阻止或延迟癌症复发约 3、 4、 5 或 6 个月。在某些实施方案中， 该方法包括在治疗启动之后施用抗 VEGF 抗体至少 2 年、 至 少 3 年、 至少 4 年、 至少 5 年、 至少 10 年或更久。
例如， 一种方法可包括下述步骤 ： a) 包括多个循环的第一阶段， 其中每个循环包 括以预定间隔对受试者施用有效量的 VEGF 特异性拮抗剂 ( 例如抗 VEGF 抗体， 诸如贝伐单抗 ) 和任选地至少一种化疗剂 ； 和 b) 包括多个循环的第二阶段， 其中每个循环包括以预定 间隔对受试者施用有效量的 VEGF 特异性拮抗剂 ( 例如抗 VEGF 抗体， 诸如贝伐单抗 )， 没有 任何化疗剂 ； 其中组合的第一和第二阶段在初始手术后处理之后持续至少 1 年。在一些实 施方案中， 所述组合的第一和第二阶段在初始手术后处理之后持续超过 1 年。在一些实施 方案中， 第二阶段在初始手术后处理之后持续超过 1 年、 至少 2 年、 至少 3 年、 至少 4 年、 至 少 5 年或至少 10 年。在一个实施方案中， 第一阶段包括第一多个治疗循环， 其中施用 VEGF 特异性拮抗剂 ( 例如贝伐单抗 ) 和第一化疗方案， 接着是第二多个治疗循环， 其中施用 VEGF 特异性拮抗剂 ( 例如抗 VEGF 抗体， 诸如贝伐单抗 ) 和第二化疗方案。
在一个例子中， 该方法包括使用改良 FOLFOX6( 第 1 天奥沙利铂 (85mg/m2) 及并行 亚叶酸 (400mg/m2) 和 5-FU(400mg/m2IV 推注 )， 及第 1 天和第 2 天 46 小时里 5-FU(2400mg/ 2 m ))q 14 天， 12 个循环 (6 个月 ) 加每个化疗循环第 1 天在奥沙利铂之前施用贝伐单抗 (5mg/kg IV)q 14 天， 施用 1 年或更久。
在一种施用方案中， 本发明的辅助疗法包括第一阶段， 其中在多个治疗循环中对 患者施用 VEGF 特异性拮抗剂 ( 例如抗 VEGF 抗体 ) 和一种或多种化疗剂 ； 和第二阶段， 其中 在多个维持循环中作为单一药剂使用 VEGF 特异性拮抗剂 ( 例如抗 VEGF 抗体 )。每个治疗 循环由 1 至 3 周组成， 取决于特定治疗方案。 例如， 治疗循环可以包括贝伐单抗作为 VEGF 特 异性拮抗剂， 而且可以是 3 周， 这意味着患者每 3 周接受 1 剂化疗和 1 剂贝伐单抗。治疗循 环也可以是 2 周， 这意味着患者隔周接受 1 剂化疗和 1 剂贝伐单抗。整个第一阶段的治疗 可以持续约 4-12 个循环。第二维持阶段期间， 可以两周一次或三周一次给予贝伐单抗， 取 决于具体循环的长度， 而且持续总共约 10-50 个循环。在某些实施方案中， 辅助疗法自治疗 启动 ( 例如初始手术后处理 ) 起持续至少 1 年， 而且会在那时之后跟踪受试者的进展。在 一些实施方案中， 抗 VEGF 抗体辅助疗法自治疗启动起持续超过 1 年、 至少 2 年、 至少 3 年、 至少 4 年、 至少 5 年或至少 10 年或直至死亡。
根据疾病的类型和严重程度， 抗 VEGF 抗体的优选剂量在约 1ug/kg 至约 50mg/kg 的范围中， 最优选约 5mg/kg 至约 15mg/kg， 包括但不限于 7.5mg/kg 或 10mg/kg。在一些方 面， 化疗方案涉及传统高剂量间歇施用。 在一些其它方面， 化疗剂使用更小且更频繁的剂量 来施用， 没有排定的中断 (“节拍化疗” (metronomic chemotherapy))。本发明的疗法的进 展易于通过常规技术和测定法来监测。
与用单独的化疗 ( 例如亚叶酸、 奥沙利铂、 5-FU、 伊利替康或其组合 ) 治疗的受试 者相比， 抗体和化疗的施用可降低癌症患者中疾病复发 ( 原发性器官中的癌症复发和 / 或 远端复发 ) 的可能性。
在一个方面， 本发明提供了辅助疗法的方法， 包括在确定性手术之后对有癌症的 患者施用有效量的抗 VEGF 抗体以在患者中延长无疾病存活 (DFS) 或总体存活 (OS)。在治 疗启动之后约 2 至 5 年评估 ( 例如分析 )DFS 或 OS。在一些实施方案中， 在治疗启动之后 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 或 10 年评估 ( 例如分析 )DFS 或 OS。本发明还提供了在患者中预防癌 症复发的方法， 包括对患者施用有效量的抗 VEGF 抗体， 其中所述施用抗 VEGF 抗体预防癌症 复发。本发明进一步提供了在患者中降低癌症复发的可能性的方法， 包括对患者施用有效 量的抗 VEGF 抗体， 其中所述施用抗 VEGF 抗体降低癌症复发的可能性。在本发明方法的一 些实施方案中， 所述施用 VEGF 特异性拮抗剂预防或降低临床可检测肿瘤或其转移发生的可能性。 对于辅助疗法， 可以以某种量或时间 ( 例如对于具体治疗方案， 随时间 ) 施用 VEGF 特异性拮抗剂， 以减轻 ( 例如 20％、 30％、 40％、 50％、 60％、 70％、 80％、 90％或 90％以上 ) 或抑制肿瘤转移 ； 以减轻或抑制肿瘤生长或肿瘤细胞增殖 ； 以减轻或阻止休眠肿瘤生长 ； 以减轻或阻止微转移生长或增殖 ； 以减轻或阻止肿瘤在治疗或切除后再生长 ； 和 / 或以一 定程度地缓解与癌症有关的一种或多种症状。
VEGF 特异性拮抗剂一般在受试者自手术恢复一段时间之后施用。 此时间段可包括 伤口愈合或手术切口愈合所需要的时段、 降低伤口开裂的风险所需要的时间段、 或受试者 回到与手术前的健康水平相比本质上相似或更好的健康水平所需要的时间段。 确定性手术 完成和第一次施用 VEGF 特异性拮抗剂之间的时段还可包括药物假期所需要的时段， 其中 受试者在各治疗方案间需要或要求一段时间。一般地， 确定性手术完成和 VEGF 特异性拮抗 剂疗法开始之间的时间段可包括小于 1 周、 1 周、 2 周、 3 周、 4 周 (28 天 )、 5 周、 6 周、 7 周、 8 周、 3 个月、 4 个月、 5 个月、 6 个月、 7 个月、 8 个月、 9 个月、 10 个月、 11 个月、 1 年、 2 年、 3 年、 或更长。在一个实施方案中， 确定性手术和施用 VEGF 特异性拮抗剂之间的时段大于 2 周且 小于 1 年。
在一个例子中， 以有效延长无疾病存活 (DFS) 或总体存活 (OS) 的量施用 VEGF 特 异性拮抗剂 ( 例如抗 VEGF 抗体 )。可以在抗体的初始施用之后约 2 至 5 年评估 ( 例如分 析 )DFS 或 OS。在某些实施方案中， 在治疗启动之后或初始诊断之后约 3-5 年、 约 4-5 年、 或 至少约 4 年、 或至少约 5 年评估 ( 例如分析 ) 受试者的 DFS 或 OS。
VEGF 特异性拮抗剂可以作为单一药剂来施用。本发明的特征还在于至少一种 VEGF 特异性拮抗剂与一种或多种别的抗癌疗法的组合的使用。 抗癌疗法的例子包括但不限 于外科手术、 放射疗法 ( 放疗 )、 生物疗法、 免疫疗法、 化学疗法、 或这些疗法的组合。另外， 细胞毒剂、 抗血管发生剂和抗增殖剂可以与 VEGF 特异性拮抗剂组合使用。
在某些方面， VEGF 特异性拮抗剂与一种或多种化疗剂组合用于在确定性手术之后 治疗结肠直肠癌的辅助疗法。多种化疗剂可用于本发明的联合治疗方法。本文中在 “定义” 部分下提供了或本文中描述了涵盖的化疗剂的例示性和非限制性列表。
在一个例子中， 本发明的特征在于 VEGF 特异性拮抗剂与一种或多种化疗剂 ( 例如 鸡尾酒形式 ) 的使用。在一些实施方案中， 在癌症是结肠直肠癌的情况中， 化疗剂可以是 特异性用于结肠直肠癌的， 而且包括但不限于亚叶酸、 5- 氟尿嘧啶、 奥沙利铂、 伊利替康或 两种或更多种此类化疗剂的组合。联合施用包括同时施用、 使用分开的配制剂或单一药物 配制剂， 及任一次序的序贯施用， 其中优选的是有一段时间所有活性剂同时发挥它们的生 物学活性。此类化疗剂的制备和剂量给药方案可依照制造商的使用说明来使用或由熟练 从业人员凭经验确定。化疗的制备和剂量给药方案还记载于 Chemotherapy Service Ed.， M.C.Perry， Williams & Wilkins， Baltimore， Md.(1992)。化疗剂可以在施用 VEGF 特异性 拮抗剂之前或之后施用， 或者可以与它同时给予。
联合施用包括使用分开的配制剂或单一药物配制剂的共施用或并行施用及任一 次序的序贯施用， 其中任选有一段时间所有活性剂同时发挥它们的生物学活性。 如此， 化疗 剂可以在施用 VEGF 特异性拮抗剂 ( 例如抗 VEGF 抗体 ) 之前或之后施用。 在此实施方案中， 至少一次化疗剂施用和至少一次 VEGF 特异性拮抗剂 ( 例如抗 VEGF 抗体 ) 施用之间的时间
优选为大约 1 个月或更短， 且最优选大约 3 周、 2 周或更短。 或者， 在单一配制剂或分开的配 制剂中对患者并行施用化疗剂和抗 VEGF 抗体。用化疗剂 ( 例如亚叶酸、 奥沙利铂、 5-FU、 伊 利替康或其组合 ) 和抗 VEGF 抗体 ( 例如贝伐单抗 ) 的组合进行的治疗可对患者产生协同 的或大于叠加的治疗好处。
如果施用的话， 化疗剂通常以其已知剂量施用， 或任选由于药物的组合作用或可 归于抗代谢物化疗剂施用的负面副作用而降低。 此类化疗剂的制备和剂量给药方案可依照 制造商的使用说明来使用或由熟练从业人员凭经验确定。
在一些其它方面， 对于本发明抗 VEGF 抗体的组合肿瘤疗法有用的其它治疗剂包 括涉及肿瘤生长的其它因子诸如 EGFR、 ErbB2( 也称作 Her2)、 ErbB3、 ErbB4、 或 TNF 的拮抗 剂。有时， 还对患者施用一种或多种细胞因子可能是有益的。在一个优选的实施方案中， 与 生长抑制剂或细胞毒剂一起共施用抗 VEGF 抗体。例如， 可以先施用生长抑制剂或细胞毒 剂， 接着是抗 VEGF 抗体。然而， 也涵盖同时施用或先施用抗 VEGF 抗体。生长抑制剂的合适 剂量就是当前所用的那些， 而且可以由于生长抑制剂与抗 VEGF 抗体的联合作用 ( 协同 ) 而 降低。
本文中的配制剂还可含有所治疗具体适应证所必需的超过一种活性化合物， 优选 活性互补且彼此没有不利影响的。例如， 可能希望在一种配制剂中进一步提供结合 EGFR、 VEGF( 例如结合 VEGF 上不同表位的抗体 )、 VEGFR、 或 ErbB2( 例如 ) 的抗体。 或者 / 另外， 所述组合物可包含细胞毒剂、 细胞因子、 生长抑制剂、 和 / 或小分子 VEGFR 拮抗 剂。合适的是， 此类分子以对于预定目的有效的量组合存在。
在某些方面， 对于本发明抗体的组合癌症疗法有用的其它治疗剂包括其它抗血 管发生剂。已经鉴定了许多抗血管发生剂， 而且是本领域已知的， 包括 Carmeliet 和 Jain Nature 407(6801) ： 249-57(2000) 列出的那些。优选地， 本发明的抗 VEGF 抗体与另一种 VEGF 拮抗剂或 VEGF 受体拮抗剂诸如 VEGF 变体、 可溶性 VEGF 受体片段、 能够阻断 VEGF 或 VEGFR 的适体、 中和性抗 VEGFR 抗体、 VEGFR 酪氨酸激酶的低分子量抑制剂及上述任何组合 联合使用。或者 / 另外， 可以对患者共施用两种或更多种抗 VEGF 抗体。
对于辅助疗法， VEGF 特异性拮抗剂的适宜剂量会取决于要治疗的疾病的类型 ( 如 上文定义的 )、 疾病的严重程度和过程、 在先疗法、 患者的临床史和对 VEGF 特异性拮抗剂的 响应、 及主治内科医师的判断。可以将 VEGF 特异性拮抗剂一次性或者在一系列治疗中适当 地施用于患者。在组合治疗方案中， 本发明的 VEGF 特异性拮抗剂和一种或多种抗癌治疗剂 以治疗有效量或协同量施用。如本文中使用的， 治疗有效量指导致如上所述癌症得到减轻 或抑制的本发明组合物的施用量和 / 或 VEGF 特异性拮抗剂和一种或多种其它治疗剂的共 施用量。治疗协同量指协同地或显著地预防癌症复发所必需的 VEGF 特异性拮抗剂和一种 或多种其它治疗剂的量。 VEGF 特异性拮抗剂和一种或多种其它治疗剂可同时或序贯施用， 量和时间足以减 少或消除肿瘤、 休眠肿瘤、 或微转移的发生或复发。 VEGF 特异性拮抗剂和一种或多种其它治 疗剂可作为维持疗法来施用， 以预防或降低肿瘤复发可能性。
正如本领域普通技术人员会理解的， 化疗剂或其它抗癌剂的适宜剂量一般大约会 是临床疗法 ( 例如单独地或与其它化疗剂组合地施用化疗剂的 ) 中早就采用的剂量。剂量 变化有可能会随所治疗的状况而发生。 施用治疗的内科医师会能够确定对受试者个体适宜
的剂量。 在上述治疗方案之外， 患者可经受放疗。
在某些实施方案中， 施用的抗 VEGF 抗体是完整裸抗体。然而， 抗 VEGF 抗体可以偶 联细胞毒剂。在某些实施方案中， 偶联的抗体和 / 或它结合的抗原被细胞内化， 导致偶联物 杀伤它结合的癌细胞方面的治疗功效升高。在一个实施方案中， 细胞毒剂靶向或干扰癌细 胞中的核酸。此类细胞毒剂的例子包括美登木素生物碱、 加利车霉素、 核糖核酸酶和 DNA 内 切核酸酶。
IV. 剂量和持续时间
VEGF 特异性拮抗剂组合物会以一种符合良好的医学实践的方式配制、 确定剂量及 施用。 在此内容中考虑的因素包括所治疗的具体病症、 所治疗的具体受试者、 患者个体的临 床状况、 病症的起因、 投递药剂的部位、 施药的方法、 施药的日程安排、 和医学从业人员知道 的其它因素。要施用的 VEGF 特异性拮抗剂的 “治疗有效量” 会由此类考虑事项来决定， 而且 是预防、 改善、 或治疗、 或稳定良性、 癌前、 或早期癌症 ； 或者治疗或预防肿瘤、 休眠的肿瘤、 或微转移发生或复发 ( 例如在新辅助疗法或辅助疗法的情况中 ) 所必需的最小量。 VEGF 特 异性拮抗剂不是必须的但任选可以与一种或多种当前用于预防或治疗癌症或发生癌症的 风险的药剂一起配制。此类其它药剂的有效量取决于配制剂中存在的 VEGF 特异性拮抗剂 的量、 病症或治疗的类型、 及上文讨论的其它因素。 这些一般以与以前所用相同的剂量和施 用路径来使用， 或者以以前所采用剂量的约 1-99％施用。
根据疾病的类型和严重程度， 约 1μg/kg 至 100mg/kg( 例如 0.1mg/kg-20mg/kg) VEGF 特异性拮抗剂作为初始候选剂量施用于患者， 无论例如通过一次或多次分开的施用或 通过持续输注。一个典型的日剂量范围可以是约 1μg/kg 至约 100mg/kg 或更多， 这取决于 上文所述因素。特别想要的剂量包括例如 7.5mg/kg、 10mg/kg、 和 15mg/kg。对于几天或更 长时间里的重复施用， 根据状况， 治疗为持续直到癌症得到治疗， 如通过上文所述或本领域 已知方法测量的。然而， 其它剂量方案可以是有用的。在一个例子中， 如果 VEGF 特异性拮 抗剂是抗体的话， 本发明的抗体每周、 每两周、 或每三周施用一次， 剂量范围为约 5mg/kg 至 约 15mg/kg， 包括但不限于 7.5mg/kg 或 10mg/kg。本发明疗法的进展易于通过常规技术和 测定法来监测。
治疗的持续时间会持续像医嘱指示的那样长时间或直到实现想要的治疗效果 ( 例如本文所述那些 )。在某些实施方案中， 治疗持续超过 1 年。在某些实施方案中， VEGF 特异性拮抗剂疗法持续 2 个月、 4 个月、 6 个月、 8 个月、 10 个月、 1 年、 2 年、 3 年、 4 年、 5 年或 长至受试者终身的时段。在某些实施方案中， 治疗持续直到疾病进展。在某些实施方案中， 在没有疾病复发的情况中治疗持续。
依照已知方法给受试者 ( 例如人类患者 ) 施用本发明的 VEGF 特异性拮抗剂， 诸 如静脉内施用 ( 像推注或通过一段时间里的连续输注 )， 通过肌肉内、 腹膜内、 脑脊髓内、 皮 下、 关节内、 滑膜内、 鞘内、 口服、 表面、 或吸入路径。如果 VEGF 拮抗作用与广泛的副作用或 毒性有关， 那么局部施用是特别想要的。 回体 (ex vivo) 策略也可用于治疗性应用。 回体策 略涉及用编码 VEGF 拮抗剂的多核苷酸转染或转导自受试者获得的细胞。然后将经过转染 或转导的细胞返回受试者。细胞可以是极其多种类型之任一， 包括但不限于造血细胞 ( 例 如， 骨髓细胞、 巨噬细胞、 单核细胞、 树突细胞、 T 细胞、 或 B 细胞 )、 成纤维细胞、 上皮细胞、 内
皮细胞、 角质形成细胞、 或肌肉细胞。
例如， 如果 VEGF 特异性拮抗剂是抗体的话， 通过任何合适手段来施用抗体， 包括 胃肠外、 皮下、 腹膜内、 肺内、 和鼻内， 及 ( 如果想要局部免疫抑制治疗的话 ) 病灶内施用。 胃 肠外输注包括肌肉内、 静脉内、 动脉内、 腹膜内、 或皮下施用。 另外， 合适的是， 通过脉冲输注 来施用抗体， 特别是使用递减剂量的抗体。 优选的是， 通过注射给予剂量给药， 最优选的是， 通过静脉内或皮下注射给予剂量给药， 这部分取决于施药是短期的还是长期的。
在另一个例子中， 在病症或肿瘤位置允许时， 局部施用 VEGF 特异性拮抗剂化合 物， 例如通过直接注射， 而且可以周期性重复注射。也可以在手术切除肿瘤后系统地 / 全身 地将 VEGF 特异性拮抗剂投递至受试者或直接投递至肿瘤细胞， 例如肿瘤或肿瘤床， 用以预 防或降低局部复发或转移 ( 例如休眠肿瘤或微转移的 )。
或者， 可以将含有编码 VEGF 特异性拮抗剂的核酸序列的抑制性核酸分子或多核 苷酸投递至受试者中的适宜细胞。在某些实施方案中， 可以将所述核酸导向肿瘤自身。
可以通过对于所采用的载体而言适宜的任何手段将核酸导入细胞中。许多此类 方法是本领域公知的 (Sambrook et al.， supra， 和 Watson et al.， Recombinant DNA， Chapter 12， 2d edition， Scientific American Books， 1992)。基因投递方法的例子包括 脂质体介导的转染、 电穿孔、 磷酸钙 /DEAE 右旋糖苷法、 基因枪、 和显微注射。 V. 药物配制剂
依照本发明使用的抗体的治疗用配制剂以冻干配制剂或水溶液的形式使用本领 域已知的标准方法， 例如通过将具有期望纯度的抗体与任选的药学可接受载体、 赋形剂或 稳定剂 (Remington’ s Pharmaceutical Sciences (20thedition)， ed.A.Gennaro， 2000， Lippincott， Williams & Wilkins， Philadelphia， PA) 混合来制备。可接受的载体、 赋形剂 或稳定剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的， 而且包括缓冲剂， 诸如磷酸盐、 柠檬酸 盐、 和其它有机酸 ； 抗氧化剂， 包括抗坏血酸和甲硫氨酸 ； 防腐剂 ( 诸如氯化十八烷基二甲 基苄基铵 ； 氯化己烷双胺 ； 苯扎氯铵、 苯索氯铵 ； 酚、 丁醇或苯甲醇 ； 对羟基苯甲酸烃基酯， 诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯 ； 邻苯二酚 ； 间苯二酚 ； 环己醇 ； 3- 戊醇 ； 和间甲酚 ) ； 低分子 量 ( 少于约 10 个残基 ) 多肽 ； 蛋白质， 诸如血清清蛋白、 明胶或免疫球蛋白 ； 亲水性聚合物， 诸如聚乙烯吡咯烷酮 ； 氨基酸， 诸如甘氨酸、 谷氨酰胺、 天冬酰胺、 组氨酸、 精氨酸或赖氨酸 ； 单糖、 二糖和其它碳水化合物， 包括葡萄糖、 甘露糖或糊精 ； 螯合剂， 诸如 EDTA ； 糖类， 诸如 蔗糖、 甘露醇、 海藻糖或山梨醇 ； 成盐相反离子， 诸如钠 ； 金属复合物 ( 例如 Zn- 蛋白质复合 TM PLURONICSTM 或聚乙二醇 (PEG)。优选的冻干 物)； 和 / 或非离子表面活性剂， 诸如 TWEEN 、 抗 VEGF 抗体配制剂记载于 WO 97/04801， 通过述及明确收入本文。 任选但优选的是， 配制剂 含有药学可接受盐， 典型的是例如氯化钠， 且优选大约为生理浓度。任选的是， 本发明的配 制剂可含有药学可接受防腐剂。在一些实施方案中， 防腐剂的浓度范围为 0.1-2.0％， 典型 的是 v/v。合适的防腐剂包括药学领域已知的那些。苯甲醇、 酚、 间甲酚、 对羟基苯甲酸甲 酯、 和对羟基苯甲酸丙酯是防腐剂的例子。 任选的是， 本发明的配制剂可包括药学可接受表 面活性剂， 其浓度为 0.005-0.02％。
在一个实施方案中， 在 100mg 和 400mg 不含防腐剂的、 单次使用管形瓶中供应贝伐 单抗来投递 4ml 或 16ml 贝伐单抗 (25mg/ml)， 用于治疗用途。在 240mg 脱水 α， α- 海藻糖 (dehydrate)、 23.2mg 磷酸钠 ( 单碱的， 单水合物 )、 4.8mg 磷酸钠 ( 二碱的， 无水的 )、 1.6mg
聚山梨酯 20、 和注射用水， USP 中配制 100mg 产物。在 960mg 脱水 α， α- 海藻糖、 92.8mg 磷酸钠 ( 单碱的， 单水合物 )、 19.2mg 磷酸钠 ( 二碱的， 无水的 )、 6.4mg 聚山梨酯 20、 和注射 用水， USP 中配制 400mg 产物。
本文中的配制剂还可含有所治疗具体适应症所必需的超过一种活性化合物， 优选 活性互补且彼此没有不利影响的。例如， 可能希望在一种配制剂中进一步提供结合 EGFR、 VEGF( 例如结合 VEGF 上不同表位的抗体 )、 VEGFR、 或 ErbB2( 例如 ) 的抗体。 或 者 / 另外， 组合物可包含细胞毒剂、 细胞因子、 生长抑制剂和 / 或小分子 VEGFR 拮抗剂。合 适的是， 此类分子以对于预定目的有效的量组合存在。 活性成分还可包载入例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊 ( 例如分 别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚 ( 甲基丙烯酸甲酯 ) 微胶囊 )、 胶状药物投递系统 ( 例 如脂质体、 清蛋白微球体、 微乳剂、 纳米颗粒和纳米胶囊 )、 或粗滴乳状液。此类技术披露于 例如 Remington’ s Pharmaceutical Sciences， 见上文。
可制备持续释放制剂。 持续释放制剂的合适例子包括含有抗体的固体疏水性聚合 物半透性基质， 该基质以定型产品的形式存在， 例如薄膜或微胶囊。 持续释放基质的例子包 括聚酯、 水凝胶 ( 例如聚 (2- 羟乙基 - 甲基丙烯酸酯 ) 或聚 ( 乙烯醇 ))、 聚交酯 ( 美国专利 No.3,773,919)、 L- 谷氨酸和 γ- 乙基 -L- 谷氨酸酯的共聚物、 不可降解的乙烯 - 乙酸乙烯、
可降解的乳酸 - 乙醇酸共聚物诸如 LUPRON DEPOTTM( 由乳酸 - 乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞 林构成的可注射微球体 ) 及聚 -D-(-)-3- 羟基丁酸。虽然诸如乙烯 - 乙酸乙烯和乳酸 - 乙 醇酸等聚合物能够释放分子 100 天以上， 但是某些水凝胶释放蛋白质的时间较短。当封装 的抗体在体内长时间维持时， 它们可能由于暴露于 37℃的潮湿环境而变性或聚集， 导致生 物学活性损失和免疫原性可能改变。可根据相关机制来设计合理的稳定化策略。例如， 如 果发现聚集机制是经由硫醇 - 二硫化物互换而形成分子间 S-S 键， 那么可通过修饰巯基、 由 酸性溶液冻干、 控制湿度、 采用适宜添加剂和开发特定的聚合物基质组合物来实现稳定化。
用于体内施用的配制剂必须是无菌的。这可容易地通过使用无菌滤膜过滤来实 现。
VI. 治疗功效
本发明提供了癌症患者中辅助疗法的方法， 其中治疗产生有益抗癌效果， 不引起 显著毒性或不利作用。本发明的治疗的功效可通过评估癌症治疗中常用的各种终点来测 量， 所述终点包括但不限于存活持续时间、 无疾病存活、 无进展存活、 距疾病进展的时间、 消 退时间、 和 / 或生活质量。因为本发明的抗血管发生剂靶向肿瘤血管系统且不必然靶向赘 生性细胞自身， 所以它们代表了一类独特的抗癌药， 并因此可要求对药物的临床响应的独 特测量和定义。本发明的抗 VEGF 抗体可引起对转移性扩散的抑制， 或者可仅仅发挥抑制肿 瘤的效果。 因而， 应当采用测定抗血管发生疗法的功效的新办法， 包括例如测量血管发生的 血浆或尿标志物及经由放射学成像来测量响应。
在一个实施方案中， 本发明提供了在人类患者中预防或降低癌症复发可能性的方 法。
在一个例子中， 以有效延长 DFS 或 OS 的量施用 VEGF 特异性拮抗剂 ( 例如抗 VEGF 抗体 )， 其中在抗体的初始施用之后约 2 至 5 年评估 ( 例如分析 )DFS 或 OS。在某些实施方 案中， 在治疗启动之后或初始诊断之后约 3-5 年、 约 4-5 年、 或至少约 4 年、 或至少约 5 年、或至少约 6 年、 或至少约 7 年、 或至少约 8 年、 或至少约 9 年、 或至少约 10 年评估 ( 例如分 析 ) 受试者的 DFS 或 OS。
在一个实施方案中， 本发明的方法可用于延长易感于或诊断有癌症或癌症复发的 受试者的存活持续时间。存活的持续时间定义为自第一次施用药物至死亡的时间。存活的 持续时间也可通过治疗组对对照组的分层危害比 (stratified hazard ratio， HR) 来测量， 其代表治疗期间患者死亡的风险。
在又一个实施方案中， 本发明的治疗显著提高用各种抗癌疗法治疗的易感于或诊 断有癌症的受试者 ( 例如人类患者 ) 组中的响应率。响应率定义为接受治疗的患者对治疗 有响应的百分比。 在一个方面， 与用单独的外科、 放疗、 或化疗治疗的组相比， 本发明使用抗 VEGF 抗体和外科手术、 放疗、 或一种或多种化疗剂的组合治疗显著提高接受治疗的患者组 中的响应率。
VII. 抗体生成
(i) 多克隆抗体
多克隆抗体优选在动物中生成， 通过多次皮下 (sc) 或腹膜内 (ip) 注射相关抗原 和佐剂。使用双功能或衍生化试剂， 例如马来酰亚氨基苯甲酰基磺基琥珀酰亚胺酯 ( 通过 半胱氨酸残基偶联 )、 N- 羟基琥珀酰亚胺 ( 通过赖氨酸残基 )、 戊二醛、 琥珀酸酐、 SOCl2 或 R1N ＝ C ＝ NR( 其中 R 和 R1 是不同的烃基 )， 将相关抗原与在待免疫物种中有免疫原性的蛋 白质偶联可能是有用的， 例如匙孔虫戚血蓝蛋白、 血清清蛋白、 牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋 白酶抑制剂。
通过将例如 100μg 或 5μg 蛋白质或偶联物 ( 分别用于兔或小鼠 ) 与 3 倍体积的 弗氏完全佐剂混和并将该溶液皮内注射于多个部位， 将动物针对抗原、 免疫原性偶联物或 衍生物进行免疫。1 个月后， 通过多个部位的皮下注射， 用弗氏完全佐剂中初始量 1/5-1/10 的肽或偶联物对动物进行加强免疫。7-14 天后， 采集动物的血液并测定血清的抗体滴度。 对动物进行加强免疫直到滴度达到平台 (plateau)。 优选的是， 将动物用相同抗原但与不同 蛋白质和 / 或通过不同交联剂偶联得到的偶联物进行加强免疫。偶联物还可在重组细胞培 养中作为蛋白质融合物来制备。同样， 适当使用凝聚剂诸如明矾来增强免疫应答。
(ii) 单克隆抗体
本领域有多种方法可用于制备本文中的单克隆抗体。例如， 单克隆抗体可以使用 最初由 Kohler 等， Nature， 256 ： 495(1975) 记载的杂交瘤方法来生成， 或者可以通过 DNA 重 组方法 ( 美国专利 No.4,816,567) 来生成。
在杂交瘤方法中， 如上所述免疫小鼠或其它适宜的宿主动物， 诸如仓鼠或猕猴， 以引发生成或能够生成如下抗体的淋巴细胞， 所述抗体将特异性结合用于免疫的蛋白质。 或者， 可以在体外免疫淋巴细胞。然后使用合适的融合剂诸如聚乙二醇将淋巴细胞与骨 髓瘤细胞融合， 以形成杂交瘤细胞 (Goding， Monoclonal Antibodies ： Principles and Practice， pp.59-103， Academic Press， 1986)。
将如此制备的杂交瘤细胞在合适的培养基中接种和培养， 所述培养基优选含有抑 制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的一种或多种物质。例如， 若亲本骨髓瘤细胞缺少 次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶 (HGPRT 或 HPRT)， 则用于杂交瘤的培养基典型的将含有 次黄嘌呤、 氨基喋呤和胸苷 (HAT 培养基 )， 这些物质阻止 HGPRT 缺陷细胞生长。优选的骨髓瘤细胞是那些高效融合、 支持所选择的抗体生产细胞稳定且高水平 地生成抗体、 且对培养基诸如 HAT 培养基敏感的骨髓瘤细胞。其中， 优选的骨髓瘤细胞 系是鼠骨髓瘤系， 诸如那些自可从索尔克研究所细胞分配中心 (Salk Institute Cell Distribution Center， San Diego， California USA) 获得的 MOPC-21 和 MPC-11 小鼠肿瘤和 可从美国典型培养物保藏中心 (American Type Culture Collection， Rockville， Maryland USA) 获得的 SP-2 或 X63-Ag8-653 细胞。人骨髓瘤和小鼠 - 人异源骨髓瘤细胞系也可用 于 生 成 人 单 克 隆 抗 体 (Kozbor， J.Immunol.， 133 ： 3001(1984) ； Brodeur 等， Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications， pp.51-63， Marcel Dekker， Inc.， New York， 1987)。
可对杂交瘤细胞正在其中生长的培养基测定针对抗原的单克隆抗体的生成。 优选 的是， 通过免疫沉淀或通过体外结合测定法， 诸如放射性免疫测定法 (RIA) 或酶联免疫吸 附测定法 (ELISA)， 测定由杂交瘤细胞生成的单克隆抗体的结合特异性。
在鉴定出生成具有期望特异性、 亲和力和 / 或活性的抗体的杂交瘤细胞后， 所述克隆就可通过有限稀释操作程序进行亚克隆， 并通过标准方法进行培养 (Goding， Monoclonal Antibodies ： Principles and Practice， pp.59-103， Academic Press， 1986)。 适于这一目的的培养基包括例如 D-MEM 或 RPMI-1640 培养基。另外， 杂交瘤细胞可在动物 中作为腹水瘤进行体内培养。
可通过常规免疫球蛋白纯化操作程序， 诸如例如蛋白 A-Sepharose、 羟磷灰石层 析、 凝胶电泳、 透析、 或亲和层析， 将由亚克隆分泌的单克隆抗体与培养基、 腹水或血清适当 分开。
编码单克隆抗体的 DNA 易于使用常规操作程序分离和测序 ( 例如通过使用能够特 异性结合编码单克隆抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针 )。杂交瘤细胞是此类 DNA 的 优选来源。一旦分离， 就可将 DNA 置于表达载体中， 然后将该表达载体转染到不另外生成免 疫球蛋白蛋白质的宿主细胞中， 诸如大肠杆菌细胞、 猿猴 COS 细胞、 中国仓鼠卵巢 (CHO) 细 胞或骨髓瘤细胞， 以在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。抗体的重组生产在下文中 有更详细描述。
在 另 一 个 实 施 方 案 中， 可 从 使 用 McCafferty 等， Nature， 348 ： 552-554(1990) 中记载的技术构建的噬菌体抗体库中分离抗体或抗体片段。Clackson 等， Nature， 352 ： 624-628(1991) 及 Marks 等， J.Mol.Biol.， 222 ： 581-597(1991) 分别记载了使用噬菌体文库 进行的鼠和人抗体的分离。后续出版物记载了通过链改组生成高亲和力 (nM 范围 ) 的人抗 体 (Marks 等， Bio/Technology 10 ： 779-783(1992))， 以及组合感染和体内重组作为构建非 常大的噬菌体文库的策略 (Waterhouse 等， Nuc.Acids Res.21 ： 2265-2266(1993))。如此， 这些技术是用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行替代方法。
也可以修饰 DNA， 例如通过用人重链和轻链恒定域的编码序列替代同源鼠序列 ( 美国专利 No.4,816,567 ； Morrison 等， Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 81 ： 6851(1984))， 或通 过将免疫球蛋白编码序列与非免疫球蛋白多肽的整个或部分编码序列共价连接。
典型地， 用此类非免疫球蛋白多肽替代抗体的恒定域， 或者用它们替代抗体的一 个抗原结合位点的可变域， 以产生嵌合二价抗体， 它包含对一种抗原具有特异性的一个抗 原结合位点和对不同抗原具有特异性的另一个抗原结合位点。(iii) 人源化抗体和人抗体
人源化抗体具有一个或多个导入其中的来自非人来源的氨基酸残基。 这些非人氨 基酸残基常常称作 “输入” 残基， 它们通常取自 “输入” 可变域。人源化可基本上遵循 Winter 及其同事的方法进行 (Jones 等， Nature， 321 ： 522-525(1986) ； Riechmann 等， Nature， 332 ： 323-327(1988) ； Verhoeyen 等， Science， 239 ： 1534-1536(1988))， 即用啮齿类 CDR 或 CDR 序 列替代人抗体的相应序列。因此， 此类 “人源化” 抗体是嵌合抗体 ( 美国专利 4,816,567)， 其中基本上小于整个人可变域的区域用来自非人物种的相应序列替代。在实践中， 人源化 抗体通常是其中一些 CDR 残基以及可能一些 FR 残基用来自啮齿类抗体中类似位点的残基 替代的人抗体。
用于制备人源化抗体的人可变域的选择， 包括轻链和重链， 对于降低抗原性非常 重要。依照所谓的 “最适” (best-fit) 法， 用啮齿类抗体的可变域序列对已知的人可变 域序列的整个文库进行筛选。然后选择与啮齿类序列最接近的人序列作为人源化抗体 的 人 框 架 (FR)(Sims 等， J.Immunol.， 151 ： 2296(1993) ； Chothia 等， J.Mol.Biol.， 196 ： 901(1987))。 另一种方法使用由特定轻链或重链亚组的所有人抗体的共有序列衍生的特定 框架。同一框架可被用于数种不同的人源化抗体 (Carter 等， Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 89 ： 4285(1992) ； Presta 等， J.Immunol.， 151 ： 2623(1993))。
更为重要的是， 抗体在人源化后保持对抗原的高亲和力及其它有利的生物学特 性。 为了实现这一目的， 依照一种优选的方法， 通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析 亲本序列和各种概念性人源化产物的方法来制备人源化抗体。 三维免疫球蛋白模型通常是 可获得的， 且为本领域技术人员所熟悉。还可获得图解和显示所选候选免疫球蛋白序列的 可能三维构象结构的计算机程序。 检查这些显示图像能够分析残基在候选免疫球蛋白序列 行使功能中的可能作用， 即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。 这样， 可从 受体和输入序列中选出 FR 残基并进行组合， 从而获得期望抗体特征， 诸如对靶抗原的亲和 力提高。通常， CDR 残基直接且最实质地涉及对抗原结合的影响。
人源化抗 VEGF 抗体及其亲和力成熟变体记载于例如 2005 年 2 月 26 日公告的美 国专利 No.6,884,879。
现在有可能生成在缺乏内源免疫球蛋白生成的情况下能够在免疫时生成人抗体 完整全集的转基因动物 ( 例如小鼠 )。例如， 已经描述了嵌合和种系突变小鼠中抗体重链 连接区 (JH) 基因的纯合删除导致内源抗体生成的完全抑制。在此类种系突变小鼠中转移 人种系免疫球蛋白基因阵列将导致在抗原攻击时生成人抗体。参见例如 Jakobovits 等， Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 90 ： 2551(1993) ； Jakobovits 等， Nature， 362 ： 255-258(1993) ； Bruggermann 等， Year in Immuno.， 7： 33(1993) ； 及 Duchosal 等， Nature， 355 ： 258(1992)。
或者， 噬菌体展示技术 (McCafferty 等， Nature 348 ： 552-553(1990)) 可用于在 体外从来自未免疫供体的免疫球蛋白可变域 (V) 基因全集生成人抗体和抗体片段。依照 这种技术， 将抗体可变域基因以符合读码框的方式克隆入丝状噬菌体诸如 M13 或 fd 的主 要或次要外壳蛋白基因， 并在噬菌体颗粒表面上展示为功能性抗体片段。因为丝状噬菌体 颗粒包含噬菌体基因组的单链 DNA 拷贝， 以抗体的功能特性为基础进行的选择也导致编码 展示那些特性的抗体的基因得到选择。如此， 噬菌体模拟 B 细胞的一些特性。噬菌体展示 可以以多种形式进行， 综述参见例如 Johnson， Kevin S. 和 Chiswell， David J.， CurrentOpinion in Structural Biology 3 ： 564-571(1993)。V 基因区段的数种来源可用于噬菌 体展示。Clackson 等， Nature 352 ： 624-628(1991) 从衍生自经免疫小鼠脾的小型 V 基因随 机组合文库中分离出大量不同的抗 唑酮抗体。 可基本上遵循 Marks 等， J.Mol.Biol.222 ： 581-597(1991) 或 Griffith 等， EMBO J.12 ： 725-734(1993) 所记载的技术， 自未免疫人供 体构建 V 基因全集和分离针对大量不同抗原 ( 包括自身抗原 ) 的抗体。还可参见美国专利 No.5,565,332 和 5,573,905。
如上所述， 还可通过体外活化 B 细胞来生成人抗体 ( 参见美国专利 No.5,567,610 和 5,229,275)。
人单克隆抗 VEGF 抗体记载于 1998 年 3 月 24 日公告的美国专利 No.5,730,977。
(iv) 抗体片段
已经开发了用于生成抗体片段的多种技术。传统上， 通过蛋白水解消化完整抗 体来衍生这些片段 ( 参见例如 Morimoto 等， Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24 ： 107-117(1992) ； 及 Brennan 等， Science， 229 ： 81(1985))。然而， 现在可直接 由重组宿主细胞生成这些片段。例如， 可以从上文讨论的噬菌体抗体库分离抗体片段。或 者， 可直接从大肠杆菌回收 Fab′ -SH 片段并化学偶联以形成 F(ab′ )2 片段 (Carter 等， Bio/Technology 10 ： 163-167(1992))。依照另一种方法， 可直接从重组宿主细胞培养物分 离 F(ab′ )2 片段。用于生成抗体片段的其它技术对熟练从业人员将是显而易见的。在其 它实施方案中， 所选抗体是单链 Fv 片段 (scFv)。参见 WO 93/16185。
(vi) 其它氨基酸序列修饰
设想了本文所述抗体的氨基酸序列修饰。例如， 可能希望改进抗体的结合亲和力 和 / 或其它生物学特性。通过将适宜的核苷酸变化引入抗体核酸或者通过肽合成来制备抗 体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如抗体氨基酸序列内的残基删除和 / 或插入和 / 或 替代。 只要最终的构建物具有期望的特性， 可进行删除、 插入和替代的任意组合以获得最终 的构建物。氨基酸变化还可改变抗体的翻译后加工， 诸如改变糖基化位点的数目或位置。
可用于鉴定抗体中作为优选诱变位置的某些残基或区域的一种方法称作 “丙氨酸 扫描诱变” ， 如 Cunningham and Wells， Science 244 ： 1081-1085(1989) 所记载的。 这里， 鉴 定了一个残基或一组靶残基 ( 例如带电荷的残基， 诸如精氨酸、 天冬氨酸、 组氨酸、 赖氨酸 和谷氨酸 )， 并用中性或带负电荷的氨基酸 ( 最优选丙氨酸或聚丙氨酸 ) 替换， 以影响氨基 酸与抗原的相互作用。然后通过在或对替代位点引入更多或其它变体， 推敲那些对替代展 现出功能敏感性的氨基酸位置。 如此， 虽然引入氨基酸序列变异的位点是预先决定的， 但是 突变本身的性质不需要预先决定。 例如， 为了分析给定位点处的突变的后果， 在靶密码子或 区域进行丙氨酸扫描诱变或随机诱变， 并对所表达的抗体变体筛选期望活性。 氨基酸序列插入包括氨基和 / 或羧基末端的融合， 长度范围从一个残基至包含上 百个或更多残基的多肽， 以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括 具有 N- 末端甲硫氨酰残基的抗体或与细胞毒性多肽融合的抗体。抗体分子的其它插入变 体包括在抗体的 N- 或 C- 末端融合酶 ( 例如用于 ADEPT) 或延长抗体血清半衰期的多肽。
另一类变体是氨基酸替代变体。 这些变体在抗体分子中有至少一个氨基酸残基用 不同残基替换。最感兴趣进行替代诱变的位点包括高变区， 但也设想了 FR 改变。
对抗体生物学特性的实质性修饰通过选择在保持以下方面的效果上显著不同的
替代来完成 ： (a) 替代区域的多肽主链的结构， 例如作为折叠片或螺旋构象， (b) 靶位点处 分子的电荷或疏水性， 或 (c) 侧链的体积。根据其侧链特性的相似性， 可以将氨基酸如下 分组 (A.L.Lehninger， Biochemistry， 第 2 版， pp.73-75， Worth Publishers， New York， (1975)) ：
(1) 非极性的 ： Ala(A)、 Val(V)、 Leu(L)、 Ile(I)、 Pro(P)、 Phe(F)、 Trp(W)、 Met(M)
(2) 不 带 电 荷 的、 极性的： Gly(G)、 Ser(S)、 Thr(T)、 Cys(C)、 Tyr(Y)、 Asn(N)、 Gln(Q)
(3) 酸性的 ： Asp(D)、 Glu(E)
(4) 碱性的 ： Lys(K)、 Arg(R)、 His(H)
或者， 基于共同的侧链特性， 可以将天然存在残基如下分组 ：
(1) 疏水性的 ： 正亮氨酸、 Met、 Ala、 Val、 Leu、 Ile ；
(2) 中性、 亲水性的 ： Cys、 Ser、 Thr、 Asn、 Gln ；
(3) 酸性的 ： Asp、 Glu ；
(4) 碱性的 ： His、 Lys、 Arg ；
(5) 影响链取向的残基 ： Gly、 Pro ； (6) 芳香族的 ： Trp、 Tyr、 Phe。
非保守替代将需要用这些类别之一的一个成员替换另一个类别的。
任何不牵涉保持抗体正确构象的半胱氨酸残基也可替代， 一般用丝氨酸， 以改进 分子的氧化稳定性和防止异常交联。相反， 可以向抗体中添加半胱氨酸键以改进其稳定性 ( 特别是当抗体是抗体片段诸如 Fv 片段时 )。
特别优选的一类替代变体牵涉替代亲本抗体 ( 例如人源化或人抗体 ) 的一个或多 个高变区残基。一般而言， 选择用于进一步开发的所得变体相对于产生它们的亲本抗体将 具有改良的生物学特性。 用于产生此类替代变体的一种便利方法涉及使用噬菌体展示的亲 和力成熟。简而言之， 将数个高变区位点 ( 例如 6-7 个位点 ) 突变， 在每个位点产生所有可 能的氨基酸替代。如此产生的抗体变体以单价形式展示在丝状噬菌体颗粒上， 作为与每个 颗粒内包装的 M13 基因 III 产物的融合物。然后如本文所公开的对噬菌体展示的变体筛选 其生物学活性 ( 例如结合亲和力 )。为了鉴定用于修饰的候选高变区位点， 可进行丙氨酸 扫描诱变以鉴定对抗原结合具有重要贡献的高变区残基。或者 / 另外， 分析抗原 - 抗体复 合物的晶体结构， 以鉴定抗体与人 VEGF 之间的接触点可能是有益的。此类接触残基及邻近 残基是依照本文详述的技术进行替代的候选位点。一旦产生此类变体， 就如本文所述对该 组变体进行筛选， 可选择在一种或多种相关测定法中具有优良特性的抗体用于进一步的开 发。
抗体的另一类氨基酸变体改变了抗体的原始糖基化样式。改变意味着删除在抗 体中发现的一个或多个碳水化合物模块， 和 / 或添加抗体中不存在的一个或多个糖基化位 点。
抗体的糖基化典型的或是 N- 连接的或是 O- 连接的。N- 连接指碳水化合物模块 附着于天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺 -X- 丝氨酸和天冬酰胺 -X- 苏氨酸 ( 其 中 X 是除脯氨酸外的任何氨基酸 ) 是将碳水化合物模块酶促附着于天冬酰胺侧链的识别序 列。如此， 多肽中这两种三肽序列任一的存在产生了潜在的糖基化位点。O- 连接的糖基化
指将糖类 N- 乙酰半乳糖胺、 半乳糖或木糖之一附着于羟基氨基酸， 最常见的是丝氨酸或苏 氨酸， 但也可使用 5- 羟脯氨酸或 5- 羟赖氨酸。
对抗体添加糖基化位点可通过改变氨基酸序列使其包含一个或多个上述三肽序 列而便利的完成 ( 用于 N- 连接的糖基化位点 )。 该改变还可通过向原始抗体的序列中添加 或替代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来进行 ( 用于 O- 连接的糖基化位点 )。
若抗体包含 Fc 区， 则可改变附着其上的碳水化合物。例如， 美国专利申请 US 2003/0157108 A1(Presta， L.) 中记载了有缺少岩藻糖的成熟碳水化合物结构附着于抗 体 Fc 区 的 抗 体。 还 可 参 见 US 2004/0093621 A1(Kyowa Hakko Kogyo Co.， Ltd.)。WO 03/011878(Jean-Mairet et al.) 和美国专利 No.6,602,684(Umana et al.) 中提到了在附 着于抗体 Fc 区的碳水化合物中有等分 N- 乙酰葡糖胺 (GlcNAc) 的抗体。 WO 97/30087(Patel et al.) 中报告了在附着于抗体 Fc 区的寡糖中有至少一个半乳糖残基的抗体。 关于有更改 碳水化合物附着于其 Fc 区的抗体还可参见 WO 98/58964(Raju， S.) 和 WO 99/22764(Raju， S.)。
可能希望在效应器功能方面修饰本发明的抗体， 例如增强抗体的抗体依赖性细胞 介导的细胞毒性 (ADCC) 和 / 或补体依赖性细胞毒性 (CDC)。这可通过在抗体 Fc 区中引 入一处或多处氨基酸替代来实现。或者 / 另外， 可以在 Fc 区中引入半胱氨酸残基， 从而容 许在该区中形成链间二硫键。如此产生的同二聚体抗体可具有改良的内在化能力和 / 或 提高的补体介导的细胞杀伤和抗体依赖性细胞的细胞毒性 (ADCC)。参见 Caron et al.， J.Exp.Med.176 ： 1191-1195(1992) 和 Shopes， B.， J.Immunol.148 ： 2918-2922(1992)。 具 有增强的抗肿瘤活性的同二聚体抗体还可使用如 Wolff et al.， Cancer Research53 ： 2560-2565(1993) 中记载的异双功能交联剂来制备。 或者， 抗体可改造成具有双重 Fc 区， 由 此可具有增强的补体溶胞和 ADCC 能力。 参见 Stevenson et al.， Anti-Cancer Drug Design 3： 219-230(1989)。
WO 00/42072(Presta， L.) 记载了在存在人效应细胞时具有改良的 ADCC 功能的抗 体， 其中所述抗体在其 Fc 区中包含氨基酸替代。优选的是， 具有改良的 ADCC 的抗体在 Fc 区的第 298、 333 和 / 或 334 位 (Eu 残基编号方式 ) 包含替代。优选的是， 改变的 Fc 区是在 这些位置中的一个、 两个或三个处包含替代或由其组成的人 IgG1 Fc 区。此类替代任选联 合提高 C1q 结合和 / 或 CDC 的替代。
WO 99/51642、 美国专利 No.6,194,551B1、 美国专利 No.6,242,195B1、 美国专利 No.6,528,624B1 和美国专利 No.6,538,124(Idusogie et al.) 中记载了具有改变的 C1q 结 合和 / 和补体依赖性细胞毒性 (CDC) 的抗体。所述抗体在其 Fc 区的第 270、 322、 326、 327、 329、 313、 333 和 / 或 334 位 (Eu 残基编号方式 ) 氨基酸中的一个或多个处包含氨基酸替代。
为了延长抗体的血清半衰期， 可以将补救受体结合表位掺入抗体 ( 尤其是抗体片 段 )， 如例如美国专利 No.5,739,277 中所记载的。 在用于本文时， 术语 “补救受体结合表位” 指 IgG 分子 ( 例如 IgG1、 IgG2、 IgG3 或 IgG4) 的 Fc 区中负责延长 IgG 分子体内血清半衰期 的表位。
WO 00/42072(Presta， L.) 和 US 2005/0014934 A1(Hinton et al.) 中记载了具有 改良的对新生儿 Fc 受体 (FcRn) 的结合和延长的半衰期的抗体。这些抗体包含其中具有一 处或多处改进 Fc 区对 FcRn 结合的替代的 Fc 区。例如， Fc 区可以在第 238、 250、 256、 265、272、 286、 303、 305、 307、 311、 312、 314、 317、 340、 356、 360、 362、 376、 378、 380、 382、 413、 424、 428 或 434 位 (Eu 残基编号方式 ) 中的一个或多个处具有替代。优选的具有改良的 FcRn 结 合的含 Fc 区抗体变体在其 Fc 区的第 307、 380 和 434 位 (Eu 残基编号方式 ) 中的一个、 两 个或三个处包含氨基酸替代。在一个实施方案中， 抗体具有 307/434 突变。
还设想了具有三个或更多 ( 优选四个 ) 功能性抗原结合位点的工程化抗体 ( 美国 专利申请 US 2002/0004587 A1， Miller et al.)。
编码抗体的氨基酸序列变体的核酸分子可通过本领域知道的多种方法来制备。 这 些方法包括但不限于从天然来源分离 ( 在天然存在氨基酸序列变体的情况中 )， 或者通过 对早期制备的抗体变体或非变体型式进行寡核苷酸介导的 ( 或定点 ) 诱变、 PCR 诱变和盒 式诱变来制备。
(v) 免疫偶联物
本发明还关于包含偶联有细胞毒剂的本文所述抗体的免疫偶联物， 所述细胞毒剂 诸如化疗剂、 毒素 ( 例如细菌、 真菌、 植物或动物起源的酶活性毒素或其片段 ) 或放射性同 位素 ( 即放射偶联物 )。
上文已经描述了可用于生成此类免疫偶联物的化疗剂。可使用的酶活性毒素及 其片段包括白喉毒素 A 链、 白喉毒素的非结合活性片段、 外毒素 A 链 ( 来自铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa))、 蓖麻毒蛋白 (ricin)A 链、 相思豆毒蛋白 (abrin)A 链、 蒴莲根 毒蛋白 (modeccin)A 链、 α- 帚曲霉素 (sarcin)、 油桐 (Aleutites fordii) 毒蛋白、 香石 竹 (dianthin) 毒蛋白、 美洲商陆 (Phytolaca americana) 毒蛋白 (PAPI、 PAPII 和 PAP-S)、 苦瓜 (Momordica charantia) 抑制物、 麻疯树毒蛋白 (curcin)、 巴豆毒蛋白 (crotin)、 肥 皂草 (sapaonaria officinalis) 抑制物、 白树毒蛋白 (gelonin)、 丝林霉素 (mitogellin)、 局限曲菌素 (restrictocin)、 酚霉素 (phenomycin)、 依诺霉素 (enomycin) 和单端孢菌素 131 131 (trichothecenes)。多种放射性核素可用于生成放射偶联抗体。例子包括 212Bi、 I、 In、 90 186 Y 和 Re。
抗体和细胞毒剂的偶联物可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备， 诸如 N- 琥珀 酰亚氨基 -3-(2- 吡啶基二硫代 ) 丙酸酯 (SPDP)， 亚氨基硫烷 (IT)， 亚氨酸酯 ( 诸如盐酸己 二酰亚氨酸二甲酯 )、 活性酯类 ( 诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯 )、 醛类 ( 诸如戊二醛 )、 双 叠氮化合物 ( 诸如双 ( 对 - 叠氮苯甲酰基 ) 己二胺 )、 双重氮衍生物 ( 诸如双 ( 对 - 重氮苯 甲酰基 ) 乙二胺 )、 二异氰酸酯 ( 诸如甲苯 2， 6- 二异氰酸酯 )、 和双活性氟化合物 ( 诸如 1， 5- 二氟 -2， 4- 二硝基苯 ) 的双功能衍生物。 例如， 可如 Vitetta 等 Science 238 ： 1098(1987) 中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。 碳 -14 标记的 1- 异硫氰酸苯甲基 -3- 甲基二亚乙基三胺 五乙酸 (MX-DTPA) 是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的例示性螯合剂。 参见 WO 94/11026。
在另一个实施方案中， 可将抗体与 “受体” ( 诸如链霉亲合素 ) 偶联从而用于肿瘤 预先靶向， 其中对患者施用抗体 - 受体偶联物， 接着使用清除剂由循环中清除未结合的偶 联物， 然后施用与细胞毒剂 ( 例如放射性核苷酸 ) 偶联的 “配体” ( 例如亲合素 )。
(vi) 免疫脂质体
本文中所公开的抗体还可配制成免疫脂质体。 含有抗体的脂质体可通过本领域已 知方法来制备， 诸如参见 Epstein 等， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82 ： 3688(1985) ； Hwang 等， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77 ： 4030(1980) ； 及美国专利 No.4,485,045 和 4,544,545。循环时间延长的脂质体披露于美国专利 No.5,013,556。
可用包含磷脂酰胆碱、 胆固醇和 PEG 衍生化磷脂酰乙醇胺 (PEG-PE) 的脂质组合物 通过反相蒸发法生成特别有用的脂质体。将脂质体挤过具有设定孔径的滤器， 产生具有期 望直径的脂质体。 可如 Martin 等， J.Biol.Chem.257 ： 286-288(1982) 中所述， 将本发明抗体 的 Fab’ 片段经二硫化物交换反应与脂质体偶联。任选在脂质体中包含化疗剂 ( 诸如多柔 比星 (Doxorubicin))。参见 Gabizon 等， J.National Cancer Inst.81(19) ： 1484(1989)。
VIII. 制品和试剂盒
在本发明的另一个实施方案中， 提供了包含可用于治疗上文所述病症的物质的制 品。制品包括容器、 标签和包装插页。合适的容器包括例如瓶子、 小管、 注射器等。容器可 用各种材料制成， 诸如玻璃或塑料。 容器中装有有效治疗疾患的组合物， 而且可具有无菌存 取口 ( 例如容器可以是具有皮下注射针头可刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小管 )。所述组 合物中的至少一种活性剂是抗 VEGF 抗体。贴在所述容器上或与其相连的标签指示该组合 物用于治疗选择的疾患。 制品可进一步包括第二容器， 其中装有制药学可接受的缓冲剂， 诸 如磷酸盐缓冲盐水、 林格氏 (Ringer) 溶液和右旋糖溶液。它还可包括商业和用户立场上所 需的其它物质， 包括其它缓冲剂、 稀释剂、 滤器、 针头和注射器。另外， 制品包含印有使用说 明的包装插页， 包括例如组合物不与另一组合物组合使用的警告， 或指示组合物的使用者 对患者施用单独的或与抗癌组合物 ( 例如亚叶酸、 5-FU、 奥沙利铂、 伊利替康或其组合 ) 组 合的抗 VEGF 抗体组合。术语 “使用说明” 意味着通过任何手段， 例如书面地， 诸如以包装插 页或其它书面推广材料的形式提供关于可应用疗法、 药疗、 处理、 处理方案、 等等的指导。
VEGF 特异性拮抗剂可单独地或与其它抗癌治疗性化合物组合地包装成试剂盒。 所 述试剂盒可包括帮助对患者施用单位剂量的任选成分， 诸如用于重建粉剂形式的管形瓶、 用于注射的注射器、 定制 IV 投递系统、 吸入器、 等。另外， 单位剂量试剂盒可含有关于制备 和施用组合物的使用说明。试剂盒可制造成用于一名患者的一次使用单位剂量、 用于一名 特定患者的多次使用 ( 以恒定的剂量或其中各种化合物的效力可随治疗进展而变化 ) ； 或 者， 所述试剂盒可含有适合于对多名患者施用的多剂 (“大量包装” )。试剂盒成分可在纸 盒、 泡罩包、 瓶、 管、 等等中装配。
本发明提供了用于治疗为癌症 ( 例如原发性肿瘤 ) 经历过确定性手术的患者的试 剂盒， 其包括包， 其中该包包含抗 VEGF 抗体组合物和关于在辅助疗法中使用抗 VEGF 抗体组 合物的说明书， 其中该说明书记载了为接受辅助疗法的患者启动辅助疗法后 1 年时 DFS 为 94.3， 危害比为 0.60。
材料保藏
以下杂交瘤细胞系已经根据布达佩斯条约的规定保藏于美国典型培养物保藏中 心 (American Type Culture Collection(ATCC)， Manassas， VA， USA) ：
抗体命名 ATCC 编号 保藏日期
A4.6.1 ATCC HB-10709 1991 年 3 月 29 日
下面的实施例仅仅意图例示本发明的实践， 不是作为限制而提供的。 实施例
实施例 1 ： 有结肠直肠癌的患者中的贝伐单抗辅助疗法此实施例关注自国家外科辅助乳腺和肠计划 (NSABP C-08) 临床试验中治疗 的结肠直肠癌受试者获得的结果的分析。该研究的主要目标是确定对用于治疗结肠 直肠癌 (colorectal cancer) 的标准化疗添加贝伐单抗的临床好处， 如通过无疾病存 活 (disease-free survival， DFS) 测 量 的。 次 要 目 的 是 确 定 延 长 总 体 存 活 (overall survival) 方面是否有临床好处。此试验中使用的标准化疗是亚叶酸、 5- 氟尿嘧啶和奥沙 利铂的组合。此试验评估贝伐单抗 (bevacizumab) 作为切除了 II 和 III 期结肠癌的患者的辅助疗法的功效。
研究设计
NSABP C-08 研究的设计描绘于图 1 和 2。
在 NSABP C-08 试验中， 使用下述治疗方案 ：
分部 A/ 组 1 ： 改良 FOLFOX6(mFOLFOX6 ： 第 1 天奥沙利铂 (85mg/m2) 及并行亚叶酸 (400mg/m2) 和 5-FU(400mg/m2IV 推注 )， 和第 1 天和第 2 天 46 小时里 5-FU(2400mg/m2))q 14 天， 12 个循环 (6 个月 ) ；
分部 B/ 组 2 ： 改良 FOLFOX6 q 14 天， 12 个循环 (6 个月 ) 加每个化疗循环的第 1 天在奥沙利铂之前施用贝伐单抗 (5mg/kg IV)q 14 天， 1 年。
贝伐单抗 ( ) 以两种管形瓶大小作为准备好胃肠外施用的清澈的至 轻微乳白色的无菌液体供应 ： 每个 100mg(25mg/ml-4ml 装填 ) 玻璃管形瓶装有贝伐单抗及 磷酸盐、 海藻糖、 聚山梨酯 20 和无菌注射用水， USP， 而每个 400mg(25mg/ml-16ml 装填 ) 玻 璃管形瓶装有贝伐单抗及磷酸盐、 海藻糖、 聚山梨酯 20、 和无菌注射用水， USP。如下施用 取出 5mg/kg 的一剂必需的量并在总体积 100ml 的 0.9％氯化钠注射液， USP 中稀释， 之后静脉内施用。
为了具备此试验的资格， 要求患者具有达到下述阶段之一的经组织学确认的结肠 腺癌 ：
(1)II 期癌瘤 (T3 或 4， N0， M0)( 肿瘤已经穿过固有肌层侵入浆膜 (subsetrosa) 或 无腹膜被服的结肠周或直肠周组织 (T3) ； 或已经直接侵入其它器官或结构， 和 / 或在内脏 腹膜上穿孔 (T4)) 或者
(2)III 期癌瘤 ( 任何 T， N1 或 2， M0)( 肿瘤已经侵入任何深度， 有累及区域淋巴结 )。
具有通过来自原发性肿瘤的直接延伸而累及邻近结构 ( 例如膀胱、 小肠、 卵巢、 等 ) 的 T4 肿瘤的患者具备资格， 如果达到所有下述条件的话 ：
(1) 整个或部分邻近结构整个地与原发性肿瘤一起切除 ；
(2) 根据外科医生的意见， 所有总体可见肿瘤被完全切除 (“治愈性切除” )；
(3) 病理学家的组织学评估确认了切除标本的边缘不涉及恶性细胞 ； 和
(4) 不会利用局部放疗。
在基于更加晚期的原发性肿瘤的分期分类方面， 具有超过一个同步原发性结肠肿 瘤的患者具备资格。
患者必须具有通过开放式剖腹手术或剖腹手术辅助结肠切除术进行的整体的完 全总体切除肿瘤 ( 治愈性切除 )。 具有两阶段外科规程 ( 首先提供减压性结肠造口术， 然后 在稍后的规程中具有确定性外科切除 ) 的患者具备资格。根据内窥镜检查， 肿瘤距肛门边 缘的远端距离必须大于或等于 12cm。如果患者不是内窥镜检查的候选者的话， 通过外科检查测定的肿瘤距肛门边缘的远端距离必须大于或等于 12cm。
患者为 18 岁或更大， 具有 0 或 1 的 ECOG 表现， 而且根据调查人员的意见， 必须具 有至少 5 年的寿命预期， 排除他们的癌症诊断。
在随机化时， 患者必须具有大于或等于 1500mm3( 或不到 1500/mm3， 如果根据调查 人员的意见， 这代表正常人种或种族变异的话 ) 的手术后绝对粒细胞计数 (AGC) 和大于或 等于 100,000/mm3 的手术后血小板计数。患者还具有正常肝和肾功能。
具有在先恶性肿瘤 ( 包括结肠直肠癌 ) 的患者具备资格， 如果它们已经无疾病至 少 5 年且他们的内科医师认为处于复发的低风险。具有已经有效治疗的皮肤鳞状或基底细 胞癌、 原位黑素瘤、 原位宫颈癌、 原位结肠或直肠癌的患者也具备资格， 即使这些状况在随 机化之前的 5 年内诊断的。
如果患者具有任何下述条件的话， 他们具备资格 ： 腺癌以外的结肠癌、 直肠肿瘤、 分离的远端或不连续的腹内转移 ( 即使切除的话 )， 为恶性肿瘤启动的系统或放射疗法， 进 入研究之前的 6 个月内与原发性结肠肿瘤无关的重大出血， 严重的或不愈合的伤口、 皮肤 溃疡或骨折， 内窥镜检查确认为活动性的胃十二指肠溃疡， 大的外科操作， 随机化之前的 28 天内开放式活检或重大外伤性损伤， 试验过程期间预期需要大的外科操作， 随机化之前的 7 天内核心活检 (core biopsy) 或其它小的操作 ( 排除安置血管通路装置 )， 不受控制的血压 ( 大于 150/90mmHg)， 在先 CNS 脑血管缺血史， 6 个月内外周动脉缺血史， 6 个月内内脏动脉 缺血史， 伴随卤代抗病毒剂， 随机化时临床显著的周围神经病 (2 级或更高的感觉神经或运 动神经毒性， 使用 3.0 版 NCI1 不利事件通用术语标准 )， 会排除使用试验中使用的任何研究 药物的非恶性系统性疾病， 随机化时妊娠或哺乳， 精神病学或成瘾性病症或根据调查人员 的意见， 会排除患者达到研究试验要求的其它状况， PT(INR) ＞ 1.5， 除非患者正在服用全 剂量抗凝剂且受试者在服用稳定剂量的华法林或稳定剂量的低分子量肝素时具有局限的 (in range)INR 且受试者没有活动性出血或与高出血风险有关的病理状况。
此试验的主要终点是无疾病存活 (duration of disease free survival， DFS) 持 续时间。DFS 事件包括第一次记录的结肠癌复发证据、 第二原发性癌症或任何原因的死亡。 次要终点是总体存活 (OS) 持续时间和与研究疗法有关的毒性。总体存活事件包括任何原 因的死亡。
结肠癌复发的诊断使用下述标准来进行。对于腹部和 / 或骨盆部位 ： 阳性细胞学 或活检， 如果是吻合的话 (if anastomatic) ；
腹部、 骨盆和腹膜后结节 ： (1) 阳性细胞学或活检， (2) 逐渐增大的结节， 如通过相 隔至少 4 周间隔的两次 CT 或 MRI 扫描证明的， (3) 在 CT 或 MRI 扫描记录的块存在下， 输尿 管阻塞， 或 (4) 单次 CT 或 MRI 扫描显示确定的块， 通过该部位处的阳性 PET 扫描确认为恶 性的。
腹膜 ( 包括内脏和壁腹膜或网膜 ) ： (1) 阳性细胞学或活检或 (2) 逐渐增大的腹膜 内实体块， 如通过相隔至少 4 周间隔的两次 CT 或 MRI 扫描证明的， 或单次扫描通过该部位 处的阳性 PET 扫描确认为恶性的。 腹水 ： 阳性细胞学
肝： (1) 阳性细胞学或活检或 (2) 与良性疾病无关的下述各项中的三项 ： (i) 最近 的或渐进的肝大， 异常肝轮廓 ； (ii) 阳性放射性核素肝扫描或声波图 ； (iii) 确认异常 CT
扫描或 MRI 扫描且与 CEA 升高有关的阳性 PET 扫描 ； (iv) 异常肝功能研究 ； 或 (V)CEA 升高， 即 CEA 滴度持续升高至正常上限值的 10 倍， 相隔 4 周间隔的两次测定确认， 在具有正常手 术后 CEA 值的患者中 ( 测定应当由同一实验室使用同一方法实施。)
未做其它规定的 (NOS) 骨盆块 ： (1) 阳性细胞学或活检或 (2) 逐渐增大的骨盆内 实体块， 如通过相隔至少 4 周间隔的两次 CT 或 MRI 扫描证明的， 或 (3) 单次 CT 扫描上的实 体块， 通过该位点处阳性 PET 扫描确认的。
腹壁、 会阴和瘢痕 ： 阳性细胞学或活检
非腹部和非骨盆部位 ：
骨骼 ： 对于所有只涉及骨的复发， 要求活检
肺： (1) 阳性细胞学、 抽吸物或活检或 (2) 觉得与肺转移一致的多处肺小结的放射 学证据。
骨髓 ： 阳性细胞学、 抽吸物、 活检或 MRI 扫描
中枢神经系统 ： (1) 阳性 CT 或 MRI 扫描， 通常在具有神经学症状的患者中 ； 或 (2) 活检或细胞学 ( 为了脑脊膜累及的诊断 )。
第二原发性癌症的诊断在可能时得到了组织学确认。
结果
在 与 积 极 治 疗 期 对 应 的 第 一 年 期 间， 来自此试验的结果指示化疗添加 与单独的化疗相比， 显著延长 DFS。数据显示这种显著的好处不伴随任何增加 的毒性或副作用。
2,710 名患者参加了研究 (1,356 名进入对照分部， 1,354 名进入实验分部 )。 由于 没有随访或阳性外科手术余地 (margin)， 对照分部的 18 名患者和实验分部的 20 名患者没 有评估功效。另外， 发现 22 名对照和 15 名实验分部患者因其它原因而不合格， 但是包括在 分析中。如此， 这些分析中包括的对照和实验分部分别有 1,338 和 1,334 名患者。中值随 访为 35.6 个月。治疗分部的患者特征得到较好地平衡。略微超过半数的患者不到 60 岁， 大约 15％超过 70 岁， 而且性别分布相等。II 期患者占大约 25％。
随机测量距事件的时间 (time to event)。除主要终点以外的所有 p 值在两方面 0.05 水平评估为显著。所有置信区间为 95％。危害比 (HR) 是自 Cox 模型计算的， 而来自距 事件的时间的 p 值来自时序检验 (log rank test)。HR 和 p 值在可能时对阳性结节数目分 层。比例通过 Fischer 氏精确方法来比较。主要分析基于首要治疗意图， 只排除没有随访的 患者和随机化时没有处于主要终点风险的患者 ( 已知具有转移或阳性外科手术余地 )。潜在 危害函数的平滑估计量通过 Muller 和 Wang(Biometrics 1994 50 ： 61-76) 的方法来计算。潜 在危害的平滑估计量通过 Gilbert et al.(Biometrics 2002 58 ： 773-80) 的方法来计算。
结果如下 ：
患者数目 mFOLFOX6 mFOLFOX6+ 贝伐单抗 1338 1334 事件数目 312 291 3 年 DFS(％ ) 75.5 77.4 0.15 p值对 于 具 有 II 期 疾 病 的 患 者， 实 验 和 对 照 分 部 的 3 年 DFS 分 别 为 87.4 ％ 和 84.7 ％ (HR ＝ 0.82 CI 0.54-1.25 ； p ＝ 0.35)， 而 III 期为 74.2 ％和 72.4 ％ (HR ＝ 0.90 CI0.76-1.07 ； p ＝ 0.23)。
最终危害比 (HR) 为 0.888， p 值为 0.146。随时间评估的危害比 (HR) 和 p 值如下 ：
治疗启动后的年数 HR p值
1 0.6 1.25 0.61 1.5 2 2.5 0.85 0.05 3 0.87 0.080.74 0.81 0.020.0004 ＜ 0.0001 0.004治疗启动后 1 年时的 DFS 为 94.3( 用 mFOLFOX6+ 贝伐单抗治疗的患者 ) 和 90.7( 单 独用 mFOLFOX6 治疗的患者 )(HR 为 0.60， p 值为 0.0004)。贝伐单抗在开头 1.25 年期间具 有强效果 (HR ＝ 0.6195％ CI 0.48-0.78， p ＜ 0.0001)。这些数据指示， 化疗添加贝伐单 抗在对患者施用贝伐单抗的积极治疗期 ( 治疗启动后开头 12 个月 ) 期间及其后不久， 赋予 了临床有意义的且显著的好处。这些结果还首次证明施用贝伐单抗超过 1 年对患者是有益 的。
根据上述描述会清楚， 可以对本文所述发明进行改变和变更， 使之适应各种应用 和状况。此类实施方案也在所附权利要求的范围内。
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