作为JAK抑制剂的5苯基1,2,4三唑并1,5A吡啶2甲酰胺化合物.pdf

作为 JAK 抑制剂的 5- 苯基 -[1， 2， 4] 三唑并 [1， 5-A] 吡 啶 -2- 甲酰胺化合物
    技术领域 本发明涉及 JAK 抑制剂化合物， JAK 属于参与炎症、 自身免疫疾病、 增殖性疾病、 移 植排斥、 涉及软骨更新 (turnover) 受损的疾病、 先天软骨畸形和 / 或与 IL6 分泌过多相关 的疾病的酪氨酸激酶家族。具体而言， 本发明化合物抑制 JAK1 和 JAK2。本发明还提供所述 化合物、 含有所述化合物的药物组合物的生产方法和通过施用本发明化合物预防和 / 或治 疗炎症、 自身免疫疾病、 增殖性疾病、 移植排斥、 涉及软骨更新受损的疾病、 先天软骨畸形和 / 或与 IL6 分泌过多相关的疾病的方法。
     Janus 激酶 (JAK) 是转导细胞因子信号从膜受体到 STAT 转录因子的细胞质酪氨酸 激酶。现有技术已经描述了四种 JAK 家族成员 ： JAK1、 JAK2、 JAK3 和 TYK2。当细胞因子与其 受体结合时， JAK 家族成员自磷酸化和 / 或彼此转磷酸化， 随后 STATs 磷酸化， 然后迁移至 细胞核内以调节转录。JAK-STAT 细胞内信号转导适用于干扰素、 大多数白细胞介素以及多 种细胞因子和内分泌因子， 例如 EPO、 TPO、 GH、 OSM、 LIF、 CNTF、 GM-CSF 和 PRL(Vainchenker W. 等人 (2008))。
     遗传学模型和小分子 JAK 抑制剂的组合研究揭示了几种 JAKs 的治疗潜能。通过 小鼠和人遗传学确证 JAK3 是免疫抑制靶点 (O’ Shea J. 等人 (2004))。JAK3 抑制剂成功用 于临床开发， 最初用于器官移植排斥， 但后来也用于其它免疫炎性适应证， 例如类风湿性关 节炎 (RA)、 银屑病和克隆病 (http://clinicaltrials.gov/)。
     TYK2 是免疫炎性疾病的潜在靶点， 已经通过人遗传学和小鼠剔除研究确证 (Levy D. 和 Loomis C.(2007))。
     JAK1 是免疫炎性疾病领域的新靶点。 将 JAK1 与其它 JAKs 杂二聚化以转导细胞因 子驱动的促炎信号传导。因此， 预期抑制 JAK1 和 / 或其它 JAK 对于一系列炎性病症和其它 由 JAK 介导的信号转导驱动的疾病是具有治疗益处的。
     背景技术 软骨变性是很多疾病的标志， 其中类风湿性关节炎和骨关节炎是最主要的。类风 湿性关节炎 (RA) 是慢性关节变性疾病， 其特征在于关节结构的炎症和破坏。当疾病未受 抑制时， 由于关节功能性的丧失导致实质性的失能和疼痛， 甚至过早死亡。因此， RA 治疗的 目的不仅在于延缓疾病， 而且在于获得减轻， 从而终止关节破坏。除了疾病结果的严重性， 高度普遍的 RA( 全球～ 0.8％的成年人受到困扰 ) 意味着很高的社会经济冲击。( 关于 RA 的综述， 参见 Smolen 和 Steiner(2003) ； Lee 和 Weinblatt(2001) ； Choy 和 Panayi(2001) ； O’ Dell(2004) 和 Firestein(2003))。
     骨关节炎 ( 也称为 OA， 或磨损关节炎 ) 是最常见的关节炎形式， 其特征在于关节软 骨的损失， 通常伴随骨肥大和疼痛。关于骨关节炎的深入综述， 参见 Wieland 等人， 2005。
     骨关节炎难以治疗。目前， 尚无法治愈， 治疗集中于缓解疼痛和防止患病关节变 形。常用的治疗包括应用非甾体抗炎药 (NSAID)。尽管对于骨关节炎的治疗营养保健品例
     如软骨素和硫酸葡糖胺被确认是安全有效的选择， 然而最近的临床试验表明两种治疗不能 降低与骨关节炎有关的疼痛 (Clegg 等人， 2006)。
     刺激合成代谢过程、 阻断分解代谢过程或这两者的组合， 可以使软骨稳定， 并甚至 可能逆转损伤， 从而防止疾病的进一步恶化。已发现了矫正骨关节炎疾病期间出现的关节 软骨损伤的治疗方法， 但目前无一能原位和体内介导软骨再生。 总而言之， 目前尚没有有效 的矫正骨关节炎疾病的药物。
     Vandeghinste 等人 (WO 2005/124342) 发现 JAK1 可以作为靶点， 对它的抑制对于 数种疾病 ( 包括 OA) 的治疗可能具有相关性。小鼠中 JAK1 基因的剔除证实 JAK1 在发育过 程中发挥必要的非冗余作用 ： JAK1-/- 小鼠在出生后 24 小时内死亡并且淋巴细胞发育严重 受损。另外， JAK1-/- 细胞不对或很少对应用 II 类细胞因子受体的细胞因子、 应用 γ-c 亚 基用于信号传导的细胞因子受体和应用 gp130 亚基用于信号传导的细胞因子受体家族反 应 (Rodig 等人， 1998)。
     多组参与了软骨细胞生物学中 JAK-STAT 的信号传导。 Li 等人 (2001) 指出制癌蛋 白 M 通过活化 JAK/STAT 和 MAPK 信号传导途径而诱导初级软骨细胞中 MMP 和 TIMP3 基因表 达。 Osaki 等人 (2003) 指出软骨细胞中干扰素 γ 介导的胶原 II 抑制与 JAK-STAT 信号传导 有关。IL1-β 通过减少基质组分的表达和通过诱导胶原酶和诱导型一氧化氮合酶 (NOS2) ( 其介导一氧化氮 (NO) 的产生 ) 的表达而诱导软骨的分解代谢。Otero 等人 (2005) 指出 瘦蛋白和 IL1-β 协同诱导软骨细胞中 NO 的产生和 NOS2 mRNA 的表达， 并且指出这种作用 可以被 JAK 抑制剂阻断。Legendre 等人 (2003) 指出 IL6/IL6 受体诱导牛关节软骨细胞中 并且指出这种作 软骨特异性基质基因胶原 II、 软骨聚集蛋白聚糖核心和连接蛋白的下调， 用通过 JAK/STAT 信号传导介导。因此， 这些观察表明 JAK 激酶活性在软骨体内稳态中起作 用以及 JAK 激酶抑制剂具有治疗潜能。 JAK 家族成员还与其它病症有关， 包括骨髓增殖性障碍 (O’ Sullivan 等人， 2007， Mol Immunol.44(10) ： 2497-506)， 其中在 JAK2 中鉴定出存在突变。 这表明 JAK、 特别是 JAK2 的抑制剂还能用于治疗骨髓增殖性障碍。另外， JAK 家族、 特别是 JAK1、 JAK2 和 JAK3， 与 癌症、 特别是白血病例如急性髓性白血病 (O’ Sullivan 等人， 2007， Mol Immunol.44(10) ： 2497-506 ； Xiang 等人， 2008“ ，Identification of somatic JAK1 mutations in patients with acute myeloid leukemia( 急性髓性白血病症者中体 JAK1 突变的鉴定 )” Blood 第 一版文章， 在线发表于 2007 年 12 月 26 日 ； DOI10.1182/blood-2007-05-090308) 和急性淋 巴细胞白血病 (Mullighan 等人， 2009) 或实体瘤例如子宫平滑肌肉瘤 (Constantinescu 等 人， 2007， Trends in Biochemical Sciences 33(3) ： 122-131)、 前列腺癌 (Tam 等人， 2007， British Journal of Cancer， 97， 378-383) 相关。这些结果表明 JAK、 特别是 JAK1 和 / 或 JAK2 的抑制剂还可以用于治疗癌症 ( 白血病和实体瘤， 例如子宫平滑肌肉瘤、 前列腺癌 )。
     另外， Castleman 病、 多发性骨髓瘤、 系膜增殖性肾小球肾炎、 银屑病和卡波西肉瘤 可能归因于细胞因子 IL-6 的分泌过多， IL-6 的生物学效应是通过细胞内 JAK-STAT 信号传 Norihiro Nishimoto 和 Tadamitsu Kishimoto， Arthritis Res 导介导的 (Tetsuji Naka， 2002， 4(suppl 3) ： S233-S242)。该结果表明， JAK 的抑制剂还可以用于治疗所述疾病。
     目前的治疗不令人满意， 因此仍然需要鉴定出另外的化合物， 所述化合物可用于 治疗变性关节疾病， 例如骨关节炎、 风湿性关节炎和骨质疏松， 特别是骨关节炎。 因此， 本发
     明提供化合物、 它的制备方法和包含本发明化合物以及合适药物载体的药物组合物。本发 明还提供本发明化合物在制备用于治疗变性关节疾病的药物中的用途。 尤其是本发明提供 在体内显示显著提高的效能的新 JAK 抑制剂。
     发明概述
     本发明是基于这样一个发现 ： 本发明化合物能作为 JAK 抑制剂， 用于治疗炎症、 自 身免疫疾病、 增殖性疾病、 移植排斥、 涉及软骨更新受损的疾病、 先天软骨畸形和 / 或与 IL6 分泌过多相关的疾病。在一个具体方面， 本发明化合物是 JAK1 和 JAK2 的抑制剂。本发明 还提供了生产所述化合物的方法、 包含所述化合物的药物组合物和通过施用本发明化合物 治疗炎症、 自身免疫疾病、 增殖性疾病、 移植排斥、 涉及软骨更新受损的疾病、 先天软骨畸形 和 / 或与 IL6 分泌过多相关的疾病的方法。
     因此， 在本发明的第一方面， 提供式 (I) 的本发明化合物 ：
     本发明的化合物是新型的 JAK 抑制剂， 与结构类似的化合物相比， 其在体内显示 显著提高的效能。在一个具体的实施方案中， 本发明化合物是 JAK1 和 JAK2 抑制剂。具体 地讲， 与结构类似的化合物相比， 其在较低的体内水平即可显示这种效能的增加。 预期采用 这种效能提高的化合物可使剂量需求降低 ( 并由此使剂量方案得以改进 )。
     另一方面， 本发明提供含有本发明化合物和药物载体、 赋形剂或稀释剂的药物组 合物。 而且， 就制备和使用而言， 在文中公开的药物组合物和治疗方法中所用的本发明化合 物是药学上可接受的。在本发明的该方面， 所述药物组合物还可含有适合于与本发明化合 物联合应用的其他活性成分。
     在本发明的另一方面， 本发明提供了治疗易感或感染本文所列的那些病症的哺乳 动物的方法， 特别是与异常 JAK 活性相关的病症， 例如炎症、 自身免疫疾病、 增殖性疾病、 移 植排斥、 涉及软骨更新受损的疾病、 先天软骨畸形和 / 或与 IL6 分泌过多相关的疾病， 该方 法包括施用本文描述的治疗有效量的本发明的药物组合物或化合物。 在一个具体实施方案 中， 所述病症是与异常 JAK1 和 JAK2 活性相关的。
     在另一方面， 本发明提供了用于治疗或预防病症的本发明化合物， 所述的病症选 自本文所列的那些， 特别是可能与异常 JAK 活性相关的那些病症， 例如炎症、 自身免疫疾 病、 增殖性疾病、 移植排斥、 涉及软骨更新受损的疾病、 先天软骨畸形和 / 或与 IL6 分泌过多 相关的疾病。
     还在另一个治疗方法方面， 本发明提供了治疗本文所述的易感或感染与异常 JAK 活性相关的病症的哺乳动物的方法， 该方法包括施用有效治疗病症或预防病症的量的本文 描述的本发明药物组合物或化合物。在一个具体方面， 所述病症在病因上是与异常的 JAK1
     和 JAK2 活性相关的。
     在另一方面， 本发明提供用于治疗或预防与异常 JAK 活性相关的病症的本发明化 合物。
     在另一方面， 本发明提供采用本文后面公开的代表性的合成方案和路线合成本发 明化合物的方法。
     因此， 本发明的主要目的是提供新的化合物， 其可以修正 JAK 的活性， 从而预防或 治疗任何可能与其相关的疾病。在一个具体的方面， 本发明化合物可以调节 JAK1 和 JAK2 的活性。
     本发明的另一目的是提供可以治疗或缓解疾病或疾病症状的化合物， 所述疾病或 疾病为例如炎症、 自身免疫疾病、 增殖性疾病、 移植排斥、 涉及软骨更新受损的疾病、 先天软 骨畸形和与 IL6 分泌过多相关的疾病， 这些疾病可能与 JAK、 特别是 JAK1 和 JAK2 活性相关。
     本发明的另一目的是提供可用于治疗或预防多种疾病状态的药物组合物， 所述的 疾病状态包括与 JAK 活性相关的疾病， 例如炎症、 自身免疫疾病、 增殖性疾病、 移植排斥、 涉 及软骨更新受损的疾病、 先天软骨畸形和与 IL6 分泌过多相关的疾病。在一个具体实施方 案中， 所述疾病特别是与 JAK1 和 JAK2 活性相关的。
     考虑到随后的详述， 其它目的和优势对于本领域技术人员将是显而易见的。
     发明详述
     定义
     下列术语旨在具有下面给出的含义并且用于理解本文中的描述和本发明的范围。
     当描述本发明时， 其可以包括化合物、 包含此类化合物的药物组合物以及应用此 类化合物和组合物的方法， 除非另外说明， 下列术语， 如果存在的话， 则具有下列含义。 还应 当理解的是， 本文中描述的任何基团可以被多种取代基取代， 并且取代的基团包括在其分 别的定义范围内。除非另外说明， 术语 “取代的” 如下文定义。还应当理解的是， 本文中应 用的术语 “基” 和 “基团” 是可以互换的。
     不定冠词 “一个” 和 “一种” 在本文可以用于表示一个 ( 种 ) 或多于一个 ( 种 )( 即 至少一个 ( 种 )) 冠词的合乎语法的指代对象， 例如 “一个 ( 种 ) 类似物” 表示一个 ( 种 ) 类 似物或多于一个 ( 种 ) 类似物。
     本文所用的术语 “JAK” 涉及 Janus 激酶 (JAKs) 家族， 其是从膜受体向 STAT 转录 因子转导细胞因子信号的细胞质酪氨酸激酶。现有技术描述了四种 JAK 家族成员 ： JAK1、 JAK2、 JAK3 和 TYK2， 术语 JAK 可表示上下文所示的全体所有 JAK 家族成员或者一种或多种 JAK 家族成员。
     “药学上可接受的” 意指联邦或洲政府的管理机构或美国之外国家的相应机构已 经批准的或可批准的， 或者美国药典或其它普遍认可的药典中所列的用于动物并且更特别 是用于人的。
     “药学上可接受的盐” 意指本发明化合物的盐， 所述的盐是药学上可接受的并且具 有母体化合物的所需的药理学活性。特别的是， 此类盐是无毒的， 可以是无机或有机酸加 成盐和碱加成盐。尤其是， 此类盐包括 ： (1) 与无机酸形成的酸加成盐， 所述的无机酸例如 盐酸、 氢溴酸、 硫酸、 硝酸、 磷酸等 ； 或者与有机酸形成的酸加成盐， 所述的有机酸例如乙酸、 丙酸、 己酸、 环戊烷丙酸、 羟基乙酸、 丙酮酸、 乳酸、 丙二酸、 琥珀酸、 苹果酸、 马来酸、 富马酸、酒石酸、 柠檬酸、 苯甲酸、 3-(4- 羟基苯甲酰基 ) 苯甲酸、 肉桂酸、 扁桃酸、 甲磺酸、 乙磺酸、 1， 2- 乙二磺酸、 2- 羟基乙磺酸、 苯磺酸、 4- 氯苯磺酸、 2- 萘磺酸、 4- 甲苯磺酸、 樟脑磺酸、 4- 甲 基二环 [2.2.2]- 辛 -2- 烯 -1- 甲酸、 葡庚糖酸、 3- 苯基丙酸、 三甲基乙酸、 叔丁基乙酸、 月 桂基硫酸、 葡糖酸、 谷氨酸、 羟基萘甲酸、 水杨酸、 硬脂酸、 粘康酸等 ； 或者 (2) 当母体化合物 中存在酸性质子时， 金属离子代替该酸性质子形成的盐， 所述的金属离子例如碱金属离子、 碱土金属离子或铝离子 ； 或者与有机碱配位， 所述的有机碱例如乙醇胺、 二乙醇胺、 三乙醇 胺、 N- 甲基葡糖胺等。盐进一步包括例如钠、 钾、 钙、 镁、 铵、 四烷基铵等的盐 ； 并且当化合物 包含碱性官能团时， 形成无毒有机或无机酸的盐， 例如盐酸盐、 氢溴酸盐、 酒石酸盐、 甲磺酸 盐、 乙酸盐、 马来酸盐、 草酸盐等。术语 “药学上可接受的阳离子” 表示酸性官能团的可接受 的阳离子抗衡离子。此类阳离子例如钠、 钾、 钙、 镁、 铵、 四烷基铵阳离子等。
     “药学上可接受的介质 (vehicle)” 表示与本发明化合物一起施用的稀释剂、 佐剂、 赋形剂或载体。
     “溶剂化物” 表示通常通过溶剂解反应与溶剂缔合 (association) 的化合物形式。 这种物理的缔合包括氢键。常规的溶剂包括水、 乙醇、 乙酸等。本发明化合物可以制备成例 如结晶形式并且可以溶剂化或水化。适合的溶剂化物包括药学上可接受的溶剂化物， 例如 水合物， 并且还包括化学计量的溶剂化物和非化学计量的溶剂化物。 在某些情况中， 溶剂化 物能够分离， 例如当一个或多个溶剂分子掺入结晶固体的晶格中时。 “溶剂化物” 包括溶液 相和可分离的溶剂化物。代表性的溶剂化物包括水合物、 乙醇化物和甲醇化物。 “个体” 包括人。术语 “人” 、 “患者” 和 “个体” 在本文中是可互换应用的。
     “治疗有效量” 意指当施用于个体用于治疗疾病时化合物的量足以对疾病的治疗 有效。 “治疗有效量” 可根据化合物、 疾病及其严重程度、 所治疗个体的年龄、 体重等变化。
     “防止” 或 “预防” 表示降低获得或发展成疾病或病症的风险， 即使至少一种疾病的 临床症状不在个体中发展， 所述的个体可能暴露于致病剂或在疾病发作前易患该疾病。
     术语 “预防” 涉及 “防止” ， 表示措施或方法， 其目的在于预防而非治疗或治愈疾病。 预防措施的非限制性实例包括施用疫苗 ； 例如由于不运动而给存在血栓形成风险的医院患 者施用低分子量肝素 ； 以及在前往疟疾流行或感染疟疾风险很高的地理区域前施用抗疟疾 药， 例如氯喹。
     在一个实施方案中， 任何疾病或病症的 “治疗” 表示改善疾病或病症 ( 即阻止疾病 或减轻其至少一种临床症状的表象、 程度或严重性 )。在另一个实施方案中， “治疗” 表示改 善至少一种身体指标， 该指标可能不是个体可察觉的。在另一个实施方案中， “治疗” 表示 调节疾病或障碍， 身体上 ( 例如稳定可察觉的症状 )、 生理上 ( 例如稳定身体指标 ) 或两者。 在进一步的实施方案中， “治疗” 表示减缓疾病的进程。
     本文所用的术语 “炎症” 表示一组病症， 包括类风湿性关节炎、 骨关节炎、 幼年特发 性关节炎、 银屑病、 过敏性气道疾病 ( 例如哮喘、 鼻炎 )、 炎性肠病 ( 例如克隆病、 结肠炎 )、 内毒素驱动的疾病状态 ( 例如心脏搭桥手术后的并发症或由于例如慢性心力衰竭引起的 慢性内毒素状态 ) 以及涉及软骨的相关疾病， 例如关节疾病。该术语特别表示类风湿性关 节炎、 骨关节炎、 过敏性气道疾病 ( 例如哮喘 ) 和炎性肠病。
     本文所用的术语 “自身免疫疾病” 表示一组疾病， 包括阻塞性气道疾病， 包括病症 例如 COPD、 哮喘 ( 例如内源性哮喘、 外源性哮喘、 粉尘性哮喘、 婴儿哮喘 )， 特别是慢性或长
     期形成的哮喘 ( 例如晚期哮喘和气道高反应性 )、 支气管炎 ( 包括支气管哮喘 )、 系统性红 斑狼疮 (SLE)、 多发性硬化、 I 型糖尿病及其相关的并发症、 特应性湿疹 ( 特应性皮炎 )、 接 触性皮炎， 还包括湿疹性皮炎、 炎性肠病 ( 例如克隆病和溃疡性结肠炎 )、 动脉粥样硬化和 肌萎缩性侧索硬化。该术语特别表示 COPD、 哮喘、 系统性红斑狼疮、 I 型糖尿病和炎性肠病。
     本文所用的术语 “增殖性疾病” 表示病症， 例如癌症 ( 例如子宫平滑肌肉瘤或前列 腺癌 )、 骨髓增殖性障碍 ( 例如真性红细胞增多症、 原发性的血小板增多和骨髓纤维化 )、 白 血病 ( 例如急性髓性白血病和急性淋巴细胞白血病 )、 多发性骨髓瘤、 银屑病、 再狭窄、 硬化 性皮炎或纤维化。该术语特别表示癌症、 白血病、 多发性骨髓瘤和银屑病。
     本文所用的术语 “癌症” 表示皮肤或机体器官中细胞的恶性或良性生长， 所述的 器官为例如但不限于乳房、 前列腺、 肺、 肾、 胰、 胃或肠。癌症易于侵入相邻的组织并且扩散 ( 转移 ) 到较远的器官， 例如骨、 肝、 肺或脑。本文所用的术语癌症包括转移肿瘤细胞型， 例如但不限于黑素瘤、 淋巴瘤、 白血病、 纤维肉瘤、 横纹肌肉瘤和肥大细胞瘤， 以及组织癌类 型， 例如但不限于结肠直肠癌、 前列腺癌、 小细胞肺癌和非小细胞肺癌、 乳癌、 胰腺癌、 膀胱 癌、 肾癌、 胃癌、 胶质母细胞瘤、 原发性肝癌、 卵巢癌、 前列腺癌和子宫平滑肌肉瘤。
     本文所用的术语 “白血病” 表示血液和造血器官的肿瘤疾病。此类疾病可以导致 骨髓和免疫系统功能障碍， 这使得宿主极易感染和出血。术语白血病特别表示急性髓性白 血病 (AML) 和急性淋巴细胞白血病 (ALL)。 本文所用的术语 “移植排斥” 表示例如胰岛、 干细胞、 骨髓、 皮肤、 肌肉、 角膜组织、 神经元组织、 心脏、 肺、 心肺联合、 肾、 肝、 肠、 胰、 气管或食道的细胞、 组织或实体器官的同种 异体移植物或异种移植物的急性或慢性排斥， 或者移植物抗宿主病。
     本文所用的术语 “涉及软骨更新受损的疾病” 包括病症， 例如骨关节炎、 银屑病关 节炎、 幼年类风湿性关节炎、 痛风性关节炎、 脓毒性或感染性关节炎、 反应性关节炎、 反射 交感性营养不良、 痛性营养不良、 蒂策综合征或肋软骨炎、 纤维肌痛、 骨软骨炎、 神经源性 或神经病性关节炎、 关节病、 地方性形式的关节炎如地方性变形性骨关节炎、 Mseleni 病和 Handigodu 病、 纤维肌痛引起的变性、 系统性红斑狼疮、 硬皮病和强直性脊柱炎。
     本文所用的术语 “先天软骨畸形” 包括病症， 例如遗传性软骨溶解、 软骨发育不良 和假性软骨发育不良， 特别是但不限于小耳畸形、 无耳、 干骺端软骨发育不良和相关病症。
     本文所用的术语 “与 IL6 分泌过多相关的疾病” 包括病症， 例如 Castleman 病、 多 发性骨髓瘤、 银屑病、 卡波西肉瘤和 / 或系膜增殖性肾小球肾炎。
     “本发明化合物” 和等同表述表示包括文中所述结构式的化合物， 该表述包括药学 上可接受的盐和溶剂化物， 例如水合物， 以及药学上可接受的盐的溶剂化物， 只要上下文中 允许。类似地， 提及中间体 ( 无论它们本身是否被要求保护 ) 时包括它们的盐和溶剂化物， 只要上下文中允许。
     本发明化合物的其它衍生物的酸和酸衍生形式均具有活性， 但是酸敏感形式通常 可以在哺乳动物生物体内提供更有利的溶解性、 组织相容性或延缓释放 ( 参见 Bundgard， H.， Design of Prodrugs( 前药的设计 )， 第 7-9， 21-24 页， Elsevier， Amsterdam 1985)。
     本文所用的术语 “同位素变体” 表示在组成此类化合物的一个或多个原子上包含 非天然比例的同位素的化合物。例如， 化合物的 “同位素变体” 可以包含一个或多个非放射 2 13 15 性同位素， 例如氘 ( H 或 D)、 碳 -13( C)、 氮 -15( N) 等。应当理解的是， 制备同位素取代的
     化合物时， 以下原子 ( 当存在时 ) 可以变化， 以便例如任何氢可以是 2H/D， 任何碳可以是 13C 或任何氮可以是 15N， 并且此类原子的存在和布局可以由本领域技术人员决定。 同样， 本发明 可以包括用放射性同位素制备同位素变体， 在这种情况下， 产生的化合物例如可以用于药 物和 / 或底物组织分布研究。考虑到易于掺入和易于检测， 放射性同位素氚即 3H 和碳 -14 18 15 即 14C 特别适用于该目的。此外， 可以用正电子发射同位素取代制备化合物， 例如 11C、 F、 O 13 和 N， 并且将用于正电子发射体层摄影 (PET) 研究， 以检测底物受体占用。
     本文提供的化合物的所有同位素变体， 无论具有放射性与否， 均包括在本发明范 围内。
     “互变异构体” 指为特别的化合物结构的可互换形式并且氢原子和电子位移变化 的化合物。因此， 两种结构可以通过 π 电子和原子 ( 通常是 H) 的移动处于平衡状态。例 如， 烯醇和酮是互变异构体， 因为它们通过用酸或碱处理而快速互变。 互变异构现象的另一 个实例是苯基硝基甲烷的酸式和硝基式， 这同样是通过用酸或碱处理而形成的。
     互变异构形式可能与获得目标化合物的最佳的化学反应性和生物学活性相关。
     化合物
     本发明是基于这样一个发现 ： 本发明化合物是 JAK 抑制剂， 可以用于治疗炎症、 自 身免疫疾病、 增殖性疾病、 移植排斥、 涉及软骨更新受损的疾病、 先天软骨畸形和 / 或与 IL6 分泌过多相关的疾病。本发明还提供了生产本发明化合物的方法、 包含本发明化合物的药 物组合物， 以及通过施用本发明化合物治疗炎症、 自身免疫疾病、 增殖性疾病、 移植排斥、 涉 及软骨更新受损的疾病、 先天软骨畸形和 / 或与 IL6 分泌过多相关的疾病的方法。在一个 具体实施方案中， 本发明化合物是 JAK1 和 JAK2 抑制剂。
     因此， 在本发明的第一个方面， 公开了具有式 I 的本发明化合物 ：在一个实施方案中， 本发明化合物不是同位素变体。
     本发明化合物是新的 JAK 抑制剂。具体地讲， 该化合物是有效的 JAK1 和 JAK2 抑 制剂， 然而， 该化合物也确实可以以较低效能抑制 TYK2 和 JAK3。
     本发明化合物显示显著提高的体内效能。 尤其是令人吃惊地发现所述提高甚至超 过结构类似的化合物。应用具有所述提高的化合物可以降低剂量需求 ( 并由此产生改进的 配量方案 )。
     药物组合物
     当作为药物应用时， 本发明化合物通常以药物组合物的形式施用。此类组合物可 以以制药领域众所周知的方法制备， 并且包含至少一种活性化合物。 通常， 本发明化合物以 药用有效量施用。实际上所施用的化合物的量通常由医师根据相关情况而定， 所述的相关
     情况包括所治疗的病症、 所选的施用途径、 所施用的实际化合物、 个体患者的年龄、 体重和 响应、 患者症状的严重程度等。
     本发明的药物组合物可以通过多种途径施用， 包括口服、 直肠、 经皮、 皮下、 关节 内、 静脉内、 肌内和鼻内。根据预期的递送途径， 优选将本发明化合物配制成可注射组合物 或口服组合物或者所有用于经皮施用的软膏、 洗剂或贴剂。
     口服施用的组合物可以采用大量液体溶液剂或混悬剂或大量散剂的形式。但是， 更常见的是， 组合物是以单位剂型存在的以便于准确给药。术语 “单位剂型” 表示物理上分 离的单位， 适合作为人个体和其它哺乳动物的单位给药， 每个单位包含预定量的活性物质 ( 经计算能产生所需的治疗效果 ) 以及适合的药物赋形剂、 介质或载体。 典型的单位剂型包 括预填充的、 预测定的液体组合物的安瓿或注射器， 或者在固体组合物的情况中包括丸剂、 片剂、 胶囊剂等。 在此类组合物中， 本发明化合物通常是较少的组分 ( 约 0.1 重量％至约 50 重量％， 优选约 1 重量％至约 40 重量％ )， 剩余部分是多种介质或载体和加工助剂以有助于 形成所需的给药形式。
     适用于口服施用的液体形式可以包括含有缓冲剂、 助悬剂和分散剂、 着色剂、 矫味 剂等的适合的水性或非水性介质。固体形式可以包括例如任何以下成分或类似性质的化 合物 ： 粘合剂， 例如微晶纤维素、 黄蓍胶或明胶 ； 赋形剂例如淀粉或乳糖 ； 崩解剂， 例如海藻 酸、 Primogel 或玉米淀粉 ； 润滑剂， 例如硬脂酸镁 ； 助流剂， 例如胶体二氧化硅 ； 甜味剂， 例 如蔗糖或糖精 ； 或矫味剂， 例如薄荷、 水杨酸甲酯或柑橘调味剂。
     可注射组合物通常是基于可注射无菌盐水或磷酸盐缓冲盐水或本领域已知的其 它可注射载体。如上所述， 该组合物中活性化合物通常是较少的组分， 通常为约 0.05 重 量％至 10 重量％， 剩余部分是可注射载体等。
     经皮组合物通常配制成含有活性成分的局部软膏剂或乳膏剂， 活性成分的量的范 围通常为约 0.01％至约 20％重量、 优选约 0.1％至约 20％重量、 优选约 0.1 至约 10％重量 并且更优选约 0.5 至约 15％重量。当配制为软膏剂时， 活性成分通常与石蜡或水可混溶的 软膏基质混合。或者， 在乳膏剂中活性成分可以与例如水包油型乳膏基质一起配制。此类 经皮制剂是本领域众所周知的并且通常包含其它成分以增强活性成分或制剂的表皮穿透 稳定性。所有此类已知的经皮制剂和成分包括在本发明的范围内。
     本发明化合物还可以通过经皮装置施用。因此， 经皮施用可以应用储库或多孔膜 类型或固体基质变体的贴剂来实现。
     上述口服可施用、 可注射或局部可施用的组合物的组分仅是代表性的。其它物质 和处理技术等在 Remington’ s Pharmaceutical Sciences( 雷明顿药物学 )， 第 17 版， 1985， Mack Publishing Company， 伊斯顿， 宾夕法尼亚州的第 8 部分有描述， 将其引入本文作为参 考。
     本发明化合物还可以以缓释形式或从缓释药物递送系统中施用。 代表性的缓释物 质的描述参见 Remington’ s Pharmaceutical Sciences( 雷明顿药物学 )。
     以下制剂实施例说明可以根据本发明制备的代表性的药物组合物。 但是本发明不 限制于以下药物组合物。
     制剂 1- 片剂
     可以将本发明化合物作为干粉与干明胶粘合剂以约 1 ∶ 2 重量比混合。加入少量硬脂酸镁作为润滑剂。在压片机中将混合物制成 240-270mg 片剂 ( 每片含有 80-90mg 的活 性酰胺化合物 )。
     制剂 2- 胶囊剂
     可以将本发明化合物作为干粉与淀粉稀释剂以约 1 ∶ 1 重量比混合。将混合物填 充入 250mg 胶囊中 ( 每个胶囊含有 125mg 的活性酰胺化合物 )。
     制剂 3- 液体
     可以将本发明化合物 (125mg) 与蔗糖 (1.75g) 和黄原胶 (4mg) 混合， 并且可以将 产生的混合物混合， 通过 10 号目数的 U.S. 筛， 然后与先前制备的微晶纤维素和羧甲基纤维 素钠 (11 ∶ 89， 50mg) 的水溶液混合。 将苯甲酸钠 (10mg)、 矫味剂和着色剂用水稀释并且在 搅拌下加入。然后可以在搅拌下加入足量的水。然后加入足量的水以制成总体积为 5mL。
     制剂 4- 片剂
     可以将本发明化合物作为干粉与干明胶粘合剂以约 1 ∶ 2 重量比混合。加入少量 硬脂酸镁作为润滑剂。在压片机中将混合物制成 450-900mg 片剂 (150-300mg 的活性酰胺 化合物 )。
     制剂 5- 注射剂 可以将本发明化合物溶于或混悬于缓冲的无菌盐水可注射水性介质中至浓度为 约 5mg/mL。
     制剂 6- 局部
     将硬脂醇 (250g) 和白凡士林 (250g) 在约 75℃下熔化， 然后加入溶于水 ( 约 370g) 中的本发明化合物 (50g)、 对羟基苯甲酸甲酯 (0.25g)、 对羟基苯甲酸丙酯 (0.15g)、 十二烷 基硫酸钠 (10g) 和丙二醇 (120g) 的混合物， 并且将产生的混合物搅拌直至凝结。
     治疗方法
     本发明化合物可以用作治疗剂用于治疗哺乳动物中与 JAK 异常活性相关的或由 于 JAK 异常活性引起的病症。具体而言， 该类病症与 JAK1 和 / 或 JAK2 异常活性相关。因 此， 发现本发明化合物和本发明药物组合物用作治疗剂用于预防和 / 或治疗哺乳动物包括 人的炎症、 自身免疫疾病、 增殖性疾病、 移植排斥、 涉及软骨更新受损的疾病、 先天软骨畸形 和与 IL6 分泌过多相关的疾病。
     在另外的治疗方法方面， 本发明提供了治疗易感或感染涉及炎症的哺乳动物的方 法。 该方法包括施用有效治疗病症或预防病症量的一种或多种本文描述的本发明的药物组 合物或化合物。在具体的实施方案中， 炎症选自类风湿性关节炎、 骨关节炎、 过敏性气道疾 病 ( 例如哮喘 ) 和炎性肠病。
     另一方面， 本发明提供了本发明化合物， 其用于治疗、 防止或预防炎症。在特别的 实施方案中， 炎症选自类风湿性关节炎、 骨关节炎、 过敏性气道疾病 ( 例如哮喘 ) 和炎性肠 病。
     在另外的治疗方法方面， 本发明提供了治疗易感或感染自身免疫疾病的哺乳动物 的方法。 该方法包括施用有效治疗病症或预防病症量的一种或多种本文描述的本发明的药 物组合物或化合物。 在具体的实施方案中， 自身免疫疾病选自 COPD、 哮喘、 系统性红斑狼疮、 I 型糖尿病和炎性肠病。
     另一方面， 本发明提供本发明化合物， 其用于治疗、 防止或预防自身免疫疾病。在
     特别的实施方案中， 自身免疫疾病选自 COPD、 哮喘、 系统性红斑狼疮、 I 型糖尿病和炎性肠 病。
     在进一步的治疗方法方面， 本发明提供治疗易感或感染增殖性疾病、 特别是癌症 ( 例如实体瘤如子宫平滑肌肉瘤或前列腺癌 )、 白血病 ( 例如 AML 或 ALL)、 多发性骨髓瘤和 / 或银屑病的哺乳动物的方法。
     另一方面， 本发明提供本发明化合物， 其用于治疗、 防止或预防增殖性疾病， 特别 是癌症 ( 例如实体瘤如子宫平滑肌肉瘤或前列腺癌 )、 白血病 ( 例如 AML 或 ALL)、 多发性骨 髓瘤和 / 或银屑病。
     在另外的治疗方法方面， 本发明提供了治疗易感或感染移植排斥的哺乳动物的方 法。在特别的实施方案中， 本发明提供了治疗器官移植排斥的方法。
     另一方面， 本发明提供本发明化合物， 其用于治疗、 防止或预防移植排斥。在特别 的实施方案中， 本发明提供了治疗器官移植排斥的方法。
     在治疗方法方面， 本发明提供了在易感或感染涉及软骨更新受损的疾病的哺乳动 物中治疗、 防止或预防的方法， 该方法包括施用治疗有效量的本文描述的本发明的化合物 或一种或多种本发明药物组合物。 另一方面， 本发明提供本发明化合物， 其用于治疗、 防止或预防涉及软骨更新受损 的疾病。
     本发明还提供治疗先天软骨畸形的方法， 该方法包括施用有效量的本文描述的一 种或多种本发明药物组合物或化合物。
     另一方面， 本发明提供本发明化合物， 其用于治疗、 防止或预防先天软骨畸形。
     在进一步的治疗方法方面， 本发明提供了治疗易感或感染与 IL6 分泌过多相关的 疾病， 特别是 Castleman 病或系膜增殖性肾小球肾炎的哺乳动物的方法。
     另一方面， 本发明提供了本发明化合物， 其用于治疗、 防止或预防与 IL6 分泌过多 相关的疾病， 特别是 Castleman 病或系膜增殖性肾小球肾炎。
     作为本发明进一步的方面， 本发明提供了本发明化合物， 其用作药物特别用于治 疗或预防上述病症和疾病。 本文还提供了本发明化合物在制备用于治疗或预防上述病症和 疾病之一的药物中的用途。
     本方法的一个特别的方案包括给患有涉及炎症的个体施用有效量的本发明化合 物一段时间， 所述时间足以降低患者的炎症水平， 并且优选终止所述炎症的进程。 该方法的 特别实施方案包括给患有或易感发生类风湿性关节炎的个体患者施用有效量的本发明化 合物一段时间， 所述时间足以分别降低或预防所述患者的关节炎症， 并且优选终止所述炎 症的进程。
     本方法的另一个特别方案包括给患有以软骨或关节变性为特征的疾病病症 ( 例 如风湿性关节炎和 / 或骨关节炎 ) 的个体施用有效量的本发明化合物一段时间， 所述时间 足以降低并且优选终止所述退化的自身不断发展的进程。该方法的特别的实施方案包括 给患有或易感发生骨关节炎的个体患者施用有效量的本发明化合物一段时间， 所述时间足 以分别降低或预防所述患者关节的软骨退化， 并且优选终止所述退化的自身不断发展的进 程。在特别的实施方案中， 所述的化合物会表现出软骨合成代谢和 / 或抗分解代谢性质。
     注射剂量水平范围为约 0.1mg/kg/ 小时至至少 10mg/kg/ 小时， 全程约 1 至约 120
     小时， 特别是 24 至 96 小时。还可以施用约 0.1mg/kg 至约 10mg/kg 或更多的预装推注剂， 以获得足够的稳态水平。对于 40 至 80kg 人患者而言预计最大总剂量不超过约 2g/ 天。
     对于预防和 / 或治疗长期病症， 例如变性病症， 治疗方案通常延续数月或数年， 因 此为了患者的方便和耐受， 优选口服给药。 对于口服给药， 代表性的方案是每天 1 至 5 个、 特 别是 2 至 4 个、 通常是 3 个口服剂量。采用这些给药方式， 每个剂量提供约 0.01 至约 20mg/ kg 的本发明化合物， 对于特别的剂量， 每个提供约 0.1 至约 10mg/kg、 特别是约 1 至约 5mg/ kg。
     通常选择经皮给药以提供比用注射给药所获得的类似或更低的血液水平。
     当用于预防炎性病症的发作时， 通常在医师的告知和监督下将本发明化合物以上 述剂量水平施用于处于发生病症风险中的患者。 处于发生特别病症风险中的患者通常包括 有病症家族史的那些， 或者通过基因测定或筛选确定为特别易感发生病症的那些。
     本发明化合物可以作为单独的活性剂施用， 或者它们可以与其它活性剂组合施 用， 包括具有相同或相似治疗活性并且对于此类组合施用确定为安全且有效的其它化合 物。在特别的实施方案中， 两种 ( 或多种 ) 活性剂的共同施用使得可以显著降低所用的每 种活性剂的剂量， 从而降低所见的副作用。 在一个实施方案中， 本发明化合物与另外的治疗剂共同施用用于治疗和 / 或预防 炎症疾病， 特别的活性剂包括但不限于免疫调节剂， 例如硫唑嘌呤、 皮质类固醇 ( 例如泼尼 松龙或地塞米松 )、 环磷酰胺、 环孢素 A、 他克莫司、 麦考酚酸吗乙酯、 莫罗单抗 -CD3(OKT3， 例如 )、 ATG、 阿司匹林、 对乙酰氨基酚、 布洛芬、 萘普生和吡罗昔康。
     在一个实施方案中， 本发明化合物与其它治疗剂共同施用用于治疗和 / 或预 防关节炎 ( 例如类风湿性关节炎 )， 特别的活性剂包括但不限于镇痛药、 非甾体抗炎药 (NSAIDS)、 类固醇、 合成的 DMARDS( 例如但不限于甲氨蝶呤、 来氟米特、 柳氮磺吡啶、 金诺 芬、 金硫丁二钠、 青霉胺、 氯喹、 羟氯喹、 硫唑嘌呤和环孢素 ) 和生物制品 DMARDS( 例如但不 限于英夫利昔单抗、 依那西普、 阿达木单抗、 利妥昔单抗和阿巴他塞 )。
     在一个实施方案中， 本发明化合物与其它治疗剂共同施用用于治疗和 / 或预防 增殖性病症， 具体的活性剂包括但不限于 ： 甲氨蝶呤、 亚叶酸 (leukovorin)、 阿霉素、 强的 松 (prenisone)、 博来霉素、 环磷酰胺、 5- 氟尿嘧啶、 紫杉醇、 多西他赛、 长春新碱、 长春碱、 长春瑞滨、 多柔比星、 他莫昔芬、 托瑞米芬、 醋酸甲地孕酮、 阿那曲唑、 戈舍瑞林、 抗 -HER2 单
     克隆抗体 ( 例如 Herceptin(TM))、 卡培他滨、 盐酸雷洛昔芬、 EGFR 抑制剂 ( 例如 TarcevaTM、 ErbituxTM)、 VEGF 抑制剂 ( 例如 AvastinTM)、 蛋白酶体抑制剂 ( 例如 VelcadeTM)、 或 hsp90 抑制剂 ( 例如 17-AAG)。另外， 本发明化合物可以与其它治疗组合施用， 所述的其它治疗包括但不限于放射疗法或手术。在特别的实施方案中， 增殖性障碍选自癌 症、 骨髓增殖性疾病或白血病。
     在一个实施方案中， 本发明化合物与其它治疗剂共同施用用于治疗和 / 或预防 自身免疫疾病， 特别的活性剂包括但不限于 ： 糖皮质激素、 细胞增殖抑制剂 ( 例如嘌呤类 似物 )、 烷化剂 ( 例如氮芥 ( 环磷酰胺 )、 亚硝基脲、 铂化合物等 )、 抗代谢药 ( 例如甲氨 蝶呤、 硫唑嘌呤和巯嘌呤 )、 细胞毒抗生素 ( 例如更生霉素蒽环、 丝裂霉素 C、 博来霉素和 普 卡 霉 素 )、 抗 体 ( 例 如 抗 -CD20、 抗 -CD25 或 抗 -CD3(OTK3) 单 克 隆 抗 体、13和)、 环孢素、 他克莫司、 雷帕霉素 ( 西罗莫司 )、 干扰素 ( 例如 IFN-β)、CN 102482273 A说明书12/47 页TNF 结 合 蛋 白 ( 例 如 英 夫 利 昔 单 抗 (RemicadeTM)、 依 那 西 普 (EnbrelTM) 或 阿 达 木 单 抗 (HumiraTM))、 麦考酚酸酯、 芬戈莫德 (Fingolimod) 和多球壳菌素 (Myriocin)。
     在一个实施方案中， 本发明化合物与其它治疗剂共同施用用于治疗和 / 或预防移 植排斥， 特别的活性剂包括但不限于 ： 钙神经素抑制剂 ( 例如环孢素或他克莫司 (FK506))、 mTOR 抑制剂 ( 例如西罗莫司、 依维莫司 )、 抗增殖药 ( 例如硫唑嘌呤、 麦考酚酸 )、 皮质类固 醇 ( 例如泼尼松龙、 氢化可的松 )、 抗体 ( 例如单克隆抗 -IL-2Rα 受体抗体、 巴利昔单抗、 达克珠单抗 )、 多克隆抗 -T- 细胞抗体 ( 例如抗胸腺细胞球蛋白 (ATG)、 抗淋巴细胞球蛋白 (ALG))。
     在一个实施方案中， 本发明化合物与其它治疗剂共同施用用于治疗和 / 或预防哮 喘和 / 或鼻炎和 / 或 COPD， 特别的活性剂包括但不限于 ： β2- 肾上腺素受体激动剂 ( 例如 沙丁胺醇、 左旋沙丁胺醇、 特布他林和比托特罗 )、 肾上腺素 ( 例如吸入或片剂 )、 抗胆碱能 药 ( 例如异丙托溴铵 )、 糖皮质激素 ( 例如口服或吸入 )、 长效 β2- 激动剂 ( 例如沙美特罗、 福莫特罗、 班布特罗和缓释口服沙丁胺醇 )、 吸入的类固醇和长效支气管扩张剂的组合 ( 例 如氟替卡松 / 沙美特罗、 布地奈德 / 福莫特罗 )、 白三烯拮抗剂和合成抑制剂 ( 例如孟鲁司 特、 扎鲁司特和齐留通 )、 介质释放抑制剂 ( 例如色甘酸盐和酮替芬 )、 IgE 响应的生物调节 剂 ( 例如奥马珠单抗 )、 抗组胺药 ( 例如西替利嗪 (ceterizine)、 桂利嗪、 非索非那定 ) 和 血管收缩药 ( 例如羟甲唑啉、 赛洛唑啉、 萘甲唑啉 (nafazoline) 和曲马唑啉 )。
     另外， 本发明化合物可以与紧急治疗组合施用用于哮喘和 / 或 COPD， 此类治疗包 括氧气或氦氧混合气施用、 喷雾沙丁胺醇或特布他林 ( 任选与抗胆碱能药 ( 例如异丙托铵 ) 组合 )、 合成的类固醇 ( 口服或静脉内， 例如泼尼松、 泼尼松龙、 甲泼尼龙、 地塞米松或氢化 可的松 )、 静脉内沙丁胺醇、 非特异性 β- 激动剂、 注射或吸入的 ( 例如肾上腺素、 异他林、 异 丙肾上腺素、 奥西那林 )、 抗胆碱能药 (IV 或喷雾， 例如格隆溴铵、 阿托品、 异丙托铵 )、 甲基 黄嘌呤 ( 茶碱、 氨茶碱、 苄胺茶碱 )、 吸入麻醉药 ( 其具有支气管扩张效果 ( 异氟烷、 氟烷、 恩 氟烷 ))、 氯胺酮和静脉内硫酸镁。
     在一个实施方案中， 本发明化合物与其它治疗剂共同施用用于治疗和 / 或预防炎 性肠病 (IBD)， 特别的活性剂包括但不限于 ： 糖皮质激素 ( 例如泼尼松、 布地奈德 )、 合成的 缓解疾病的免疫调节剂 ( 例如甲氨蝶呤、 来氟米特、 柳氮磺吡啶、 美沙拉秦、 硫唑嘌呤、 6- 巯 基嘌呤和环孢素 ) 和生物制品缓解疾病的免疫调节剂 ( 例如英夫利昔单抗、 阿达木单抗、 利 妥昔单抗和阿巴他塞 )。
     在一个实施方案中， 本发明化合物与其它治疗剂共同施用用于治疗和 / 或预防系 统性红斑狼疮 (SLE)， 特别的活性剂包括但不限于 ： 缓解疾病的抗风湿药 (DMARD) 例如抗疟 疾药 ( 例如羟氯喹 (plaquenil)、 羟氯喹 (hydroxychloroquine))、 免疫抑制剂 ( 例如甲氨 蝶呤和硫唑嘌呤 )、 环磷酰胺和麦考酚酸 ； 免疫抑制药物和镇痛药， 例如非甾体抗炎药， 麻 醉剂 ( 例如右丙氧芬和复方可待因扑热息痛 (co-codamol))、 阿片 ( 例如氢可酮、 羟考酮、 美 施康定 (MS Contin) 或美沙酮 ) 和芬太尼透皮贴剂。
     在一个实施方案中， 本发明化合物与其它治疗剂共同施用用于治疗和 / 或预防 银屑病， 特别的活性剂包括但不限于 ： 局部疗法例如沐浴溶液剂、 润湿剂、 含药的乳膏剂和 TM 含煤焦油的软膏剂、 地蒽酚、 皮质类固醇如去羟米松 (Topicort )、 醋酸氟轻松、 维生素 D3 类似物 ( 例如卡泊三醇 )、 Arganoiland 类视色素 ( 阿维 A 酯、 阿维 A、 他扎罗汀 )、 全身疗法例如甲氨蝶呤、 环孢素、 类视色素、 硫鸟嘌呤、 羟基脲、 柳氮磺吡啶、 麦考酚酸吗乙酯、 硫 TM TM 唑嘌呤、 他克莫司、 富马酸酯或生物制品例如阿法赛特 (Amevive )、 依那西普 (Enbrel )、 TM TM 阿 达 木 单 抗 (Humira )、 Remicade ( 英 利 昔 单 抗 )、 瑞 体 肤 (RaptivaTM) 和 优 特 克 单 抗 (ustekinumabTM)(IL-12 和 IL-23 阻断剂 )。另外， 本发明化合物可以与其它疗法组合施用， 所述的疗法包括但不限于光疗法或光化学疗法 ( 例如补骨脂素和紫外线 A 光疗法 (PUVA))。
     共同施用包括给患者递送两种或多种治疗剂的任何方式作为相同治疗方案的部 分， 这对于技术人员而言是显而易见的。 尽管两种或多种活性剂以单个制剂可以同时施用， 但这不是必需的。活性剂可以以不同的制剂并且在不同的时间施用。
     通用合成方法
     通则
     应用以下通用方法和操作由易于获得的原料制备本发明化合物和 WO2010010190 中公开的对比实施例化合物。应该理解当给出典型的或优选的工艺条件 ( 即反应温度、 时 间、 反应物的摩尔比、 溶剂、 压力等 ) 时， 除非另外说明， 还可以应用其它工艺条件。最佳反 应条件可能由于所用的具体反应物或溶剂不同而不同， 但是这些条件是本领域技术人员通 过常规优化程序可以确定的。
     另外， 对于本领域技术人员而言显而易见的是， 可能需要常规保护基以防止某些 官能团进行不希望的反应。 选择适合的具体的官能团的保护基以及保护和脱保护的适合条 件是本领域众所周知的。 例如， T.W.Greene 和 P.G.M.Wuts， Protecting Groups in Organic Synthesis( 有机合成中的保护基 )， 第二版， Wiley， 纽约， 1991 和文中所引的文献中描述了 很多保护基及其引入和除去。
     以下方法详细描述了制备上文列出的本发明化合物和对比实施例的化合物。 本发 明化合物和对比实施例的化合物可以通过有机合成领域的技术人员用已知的或市售的原 料和试剂制备。
     除非另外说明， 所有的试剂是商品级的并且收到后未经进一步纯化而使用。市 售无水溶剂用于惰性气氛下进行的反应。除非另外说明， 试剂级的溶剂用于所有其它情 况。柱色谱是在硅胶 60(35-70μm) 上完成的。薄层色谱是用预涂层的硅胶 F-254 板 ( 厚 度 0.25mm) 进行的。1H NMR 波谱是在 Bruker DPX 400 NMR 光谱仪 (400MHz) 上记录的。 1 H NMR 波谱的化学位移 (δ) 是以相对于四甲基硅烷 (δ0.00) 或适合的残留溶剂峰即 CHCl3(δ7.27) 作为内标的百万分之几 (ppm) 报告的。峰裂数是以单峰 (s)、 双峰 (d)、 三 重峰 (t)、 四重峰 (q)、 多重峰 (m) 和宽峰 (br) 给出的。偶合常数 (J) 是以 Hz 给出的。电 喷雾 MS 谱是在 Micromass 平台 LC/MS 谱仪上获得的。所有 LCMS 分析所用的柱为 ： Waters Acquity UPLC BEH C18 1.7μm， 2.1mmID×50mm L(Part No.186002350))。 制 备 HPLC ： Waters XBridge Prep C185μm ODB 19mm ID×100mm L(Part No.186002978)。所有方法 应用 MeCN/H2O 梯度。H2O 含有 0.1％ TFA 或 0.1％ NH3。
     下列为试验部分所用的缩略词表 ：
     DCM 二氯甲烷
     DiPEA N， N- 二异丙基乙基胺
     MeCN 乙腈
     BOC 叔丁氧基 - 羰基DMF TFA THF NMR DMSO DPPA LC-MS Ppm EtOAc APCI Rt s brs m dN， N- 二甲基甲酰胺 三氟乙酸 四氢呋喃 核磁共振 二甲亚砜 二苯基磷酰基叠氮化物 液相色谱 - 质谱 百万分之几 乙酸乙酯 大气压化学电离 保留时间 单峰 宽的单峰 多重峰 双峰PdCl2dppf [1， 1′ - 二 ( 二苯基膦 ) 二茂铁 ] 二氯钯 (II) TEA 三乙胺 本发明化合物和对比实施例化合物的合成制备 本发明化合物和对比实施例化合物可以根据以下流程图生产。 通用合成方法 流程图 1其中 Ar 代表苯基 -L1- 杂环烷基， 其中 L1 是键、 -CH2- 或 --CO-， 且杂环烷基是任 选取代的。
     通则
     1.1.1 1-(6- 溴 - 吡啶 -2- 基 )-3- 乙酯基 - 硫脲 (2)
     在冷却至 5℃的 2- 氨基 -6- 溴吡啶 (1)(253.8g， 1.467mol) 的 DCM(2.5L) 溶液中历 经 15 分钟滴加乙氧基羰基异硫氰酸酯 (173.0mL， 1.467mol)。然后将反应混合物温至室温 (20℃ ) 并且搅拌 16 小时。 真空蒸发得到固体， 可以将其通过过滤收集， 用汽油 (3×600mL) 彻底洗涤并且空气干燥， 得到 (2)。该硫脲可以以本身应用于下面的步骤而无需任何纯化。 1 H(400MHz， CDCl3)δ12.03(1H， br s， NH)， 8.81(1H， d， J 7.8Hz， H-3)， 8.15(1H， br s， NH)， 7.60(1H， t， J 8.0Hz， H-4)， 7.32(1H， dd， J 7.7 和 0.6Hz， H-5)， 4.31(2H， q， J 7.1Hz， CH2)， 1.35(3H， t， J 7.1Hz， CH3)。
     1.1.2 5- 溴 -[1， 2， 4] 三唑并 [1， 5-a] 吡啶 -2- 基胺 (3)
     在盐酸羟胺 (101.8g， 1.465mol) 的 EtOH/MeOH(1 ∶ 1， 900mL) 悬浮液中加入 N， N- 二异丙基乙基胺 (145.3mL， 0.879mol)， 将混合物在室温 (20℃ ) 下搅拌 1 小时。 然后加入 1-(6- 溴 - 吡啶 -2- 基 )-3- 乙酯基 - 硫脲 (2)(89.0g， 0.293mol)， 将混合物缓慢加热至回流 ( 注意 ： 需要用漂白剂洗涤器 (bleach scrubber) 猝灭放出的 H2S)。回流 3 小时后， 将混合 物冷却并且过滤以收集沉淀的固体物。通过真空蒸发滤液、 加入 H2O(250mL) 并且过滤收集 另外的产物。 将合并的固体物依次用 H2O(250mL)、 EtOH/MeOH(1 ∶ 1， 250mL) 和 Et2O(250mL) 洗涤， 然后真空干燥， 得到固体状的三唑并吡啶衍生物 (3)。该化合物可以以本身应用于下 1 面的步骤而无需任何纯化。 H(400MHz， DMSO-d6)δ7.43-7.34(2H， m， 2× 芳族 -H)， 7.24(1H， + dd， J 6.8 和 1.8Hz， 芳族 -H)， 6.30(2H， br， NH2) ； m/z 213/215(1 ∶ 1， M+H ， 100％ )。
     1.1.3 单酰化的通用方法， 得到中间体 (4) ：
     在 5℃， 向 2- 氨基 - 三唑并吡啶 (3)(7.10g， 33.3mmol) 的干燥 CH3CN(150mL) 溶液 中加入 Et3N(11.6mL， 83.3mmol)， 随后加入环丙烷羰基氯 (83.3mmol)。 然后将反应混合物升 至室温并且搅拌， 直至所有原料 (3) 耗尽。如果需要， 再加入 Et3N(4.64mL， 33.3mmol) 和环 丙烷羰基氯 (33.3mmol)， 以确保完全反应。将溶剂真空蒸发后， 将产生的残留物用 7N 甲醇 氨溶液 (50mL) 处理， 并且在室温搅拌 ( 持续 1-16 小时 )， 以水解任何双 - 酰化的产物。产 物分离是通过真空除去挥发物， 随后用 Et2O(50mL) 研磨来完成的。将固体物经过滤收集，
     用 H2O(2×50mL)、 丙酮 (50mL) 和 Et2O(50mL) 洗涤， 然后真空干燥， 以得到所需的溴代中间 体 (4)。
     方法 A
     通过 Suzuki 偶联制备本发明化合物 (5) ：
     将适合的硼酸 (2 当量 ) 加入至溴中间体 (4) 的 1， 4- 二烷 / 水 (5 ∶ 1) 溶液中。向该溶液中加入 K2CO3(2 当量 ) 和 PdCl2dppf(5％ )。然后将产生的混合物在微波中于 140℃下加热 30 分钟 ( 该反应还可以通过在 90℃的油浴中、 在 N2 下常规加热 16 小时来进 行 )。 加入水并且将溶液用乙酸乙酯萃取。 将有机层经 MgSO4 干燥并且真空蒸发。 通过快速 色谱和制备型 HPLC 纯化后获得最终的化合物。 HPLC ： Waters XBridge Prep C18 5μm ODB 19mmID×100mm L(Part No.186002978)。所有的方法利用 MeCN/H2O 梯度。H2O 含有 0.1％ TFA 或 0.1％ NH3。
     方法 B
     B1.4 4-[2-( 环丙烷羰基 - 氨基 )-[1， 2， 4] 三唑并 [1， 5-a] 吡啶 -5- 基 ]- 苯甲酰氯
     在 N2 气氛下， 将 2 滴 DMF 加入通过方法 A 利用 4- 羧基苯基硼酸得到的 4-[2-( 环 丙烷羰基 - 氨基 )-[1， 2， 4] 三唑并 [1， 5-a] 吡啶 -5- 基 ]- 苯甲酸 (1 当量 ) 的 DCM 溶液中。 然后， 将草酰氯 (2 当量 ) 滴加到得到的溶液 ( 气体释放 ) 中。将该混合物在室温搅拌 2 小 时。经 LCMS 检测反应完成后， 除去溶剂。粗酰氯不经进一步纯化而直接用于下一个步骤。
     B2. 酰胺形成 ( 通用方法 )
     在 N2 气氛下， 将适当的胺 (1.1 当量 ) 和 Et3N(5 当量 ) 溶解在 DCM 中并在 0℃冷 却。将溶解在 DCM 中的酰氯 (B1， 1 当量 ) 滴加到所述溶液中。反应物在室温搅拌 16h。16h 后， 反应完成。将化合物用 EtOAc 和水萃取、 盐水洗涤并经无水 MgSO4 干燥。过滤有机层并 蒸发。 经制备型 HPLC 分离最终化合物。 制备型 HPLC ： Waters XBridge Prep C18 5μm ODB 19mmID×100mm L(Part No.186002978)。所有的方法利用 MeCN/H2O 梯度。H2O 含有 0.1％ TFA 或 0.1％ NH3。
     方法 C
     其中 R3a 或 R3b 与它们所连接的氮原子一起可形成环烷基。
     还原烷基化 ( 通用方法 )
     将适当的胺 (2 当量 )、 通过方法 A 制备的环丙烷甲酸 ( 例如环丙烷甲酸 5-(4- 甲 酰基 - 苯基 )-[1， 2， 4] 三唑并 [1， 5-a] 吡啶 -2- 基 ]- 酰胺 )(1 当量 ) 和 Ti(OPr)4 混合并 在室温搅拌 3 小时。将混合物在乙醇中稀释并加入 Na(CN)BH3(1 当量 )。将产生的溶液在 室温搅拌 16 小时。将混合物用水稀释并过滤。用乙醇洗涤滤液。真空蒸发合并的溶剂相。 通过制备 HPLC 分离最终的化合物。
     方法 D
     其中 R1 和 R2 与它们所连接的氮原子一起可形成杂环烷基。 烷基化反应在 N2 气氛下， 将 2-(4- 溴甲基 - 苯基 )-4， 4， 5， 5- 四甲基 -[1， 3， 2] 二氧杂环戊硼 烷 (1 当量 ) 和 Et3N(2 当量 )( 或 AgCO3) 溶解于 DCM/MeOH(4 ∶ 1 v ∶ v) 中， 并滴加胺 (2 当量 )。将产生的溶液在室温搅拌 16h。然后， 反应完成。蒸发溶剂， 将化合物用 EtOAc 和 水萃取、 盐水洗涤并经无水 MgSO4 干燥。将有机层过滤并蒸发。经快速色谱分离最终化合 物。
     Suzuki 偶联
     将得到的硼酸 (2 当量 ) 加入至环丙烷甲酸 (5- 溴 -[1， 2， 4] 三唑并 [1， 5-a] 吡 烷 / 水 (5 ∶ 1) 溶液中。在溶液中加入 K2CO3(2 当量 ) 和啶 -2- 基 )- 酰胺的 1， 4- 二Pd(dppf)Cl2(5 ％ )。然后将产生的混合物在微波中于 140 ℃下加热 30 分钟 ( 还可经传 统加热在 N2 气氛下在 90 ℃的油浴中加热 16h 来完成所述反应 )。加入水并且将溶液用 乙酸乙酯萃取。将有机层经无水 MgSO4 干燥并且真空蒸发。通过快速色谱或者制备 HPLC 纯化后获得最终化合物。HPLC ： Waters XBridge Prep C18 5μm ODB 19mm ID×100mm L(PartNo.186002978)。所有方法应用 MeCN/H2O 梯度。H2O 含有 0.1％ TFA 或 0.1％ NH3。
     本发明化合物和对比实施例化合物的合成
     化合物 1( 本发明化合物 )
     步骤 1 ：
     在 N2 气氛下， 将 2-(4- 溴甲基 - 苯基 )-4， 4， 5， 5- 四甲基 -[1， 3， 2] 二氧杂环戊硼 烷 (1 当量 ) 和 DIPEA(2 当量 ) 溶解于 DCM/MeOH(5 ∶ 1 v ∶ v) 中， 分批加入硫吗啉 1， 1- 二 氧化物 (2 当量 )。将产生的溶液在室温搅拌 16h。然后， 反应完成。蒸发溶剂， 将化合物用 EtOAc 和水萃取、 盐水洗涤并经无水 MgSO4 干燥。将有机层过滤并蒸发。未经进一步纯化而 分离最终化合物。
     步骤 2 ： Suzuki 偶联
     将 4-[4-(4， 4， 5， 5- 四 甲 基 -[1， 3， 2] 二 氧 杂 环 戊 硼 烷 -2- 基 )- 苯 基 ]- 硫 吗 啉 -1， 1- 二 氧 化 物 (1.1 当 量 ) 加 入 到 环 丙 烷 甲 酸 (5- 溴 -[1， 2， 4] 三 唑 并 [1， 5-a] 吡
     啶 -2- 基 )- 酰胺的 1， 4- 二烷 / 水 (4 ∶ 1) 溶液中。向该溶液中加入 K2CO3(2 当量 ) 和PdCl2dppf(0.03 当量 )。将产生的混合物在 N2 气氛下在 90℃的油浴中加热 16h。加入水， 将溶液用乙酸乙酯萃取。有机层经无水 MgSO4 干燥， 真空蒸发。经快速色谱纯化后得到最 终化合物。
     或者， 反应完成后， 加入钯清除剂如 1， 2- 二 ( 二苯基膦 ) 乙烷， 将反应混合物冷 却， 过滤。将滤饼再在适当的溶剂 ( 如丙酮 ) 中制成浆状物， 经过滤分离固体物， 用更多的 丙酮洗涤， 干燥。并将得到的固体物再悬浮于水中， 加入 HCl 水溶液， 并在 RT 搅拌后， 将产 生的溶液在硅藻土 (Celpure P300) 上过滤。然后， 向滤液中加入 NaOH 水溶液， 并将产生的 混悬液在 RT 搅拌， 将固体物经过滤分离， 用水洗涤， 并经抽吸干燥。最后， 将滤饼再溶解于 用钯清除剂 ( 例如 SMOPEX 234) 在 50℃处理， 过滤混悬液， 真空除去 THF/H2O 的混合物中， 有机溶剂， 将产生的浆状物用水和甲醇洗涤， 干燥和过筛， 以得到标题化合物的游离碱。
     化合物 1 的替代途径 ( 本发明化合物 ) ：
     步骤 1 ：
     将 4-( 羟甲基 ) 苯基硼酸 (1.1 当量 ) 加入到环丙烷甲酸 (5- 溴 -[1， 2， 4] 三唑并 [1， 5-a] 吡啶 -2- 基 )- 酰胺的 1， 4- 二氧杂环己烷 / 水 (4 ∶ 1) 溶液中。向该溶液中加入 K2CO3(2 当量 ) 和 PdCl2dppf(0.03 当量 )。然后将得到的混合物在 N2 气氛下于 90℃油浴中 加热 16h。加入水， 将溶液用乙酸乙酯萃取。将有机层经无水 MgSO4 干燥， 真空蒸发。未经 进一步纯化而使用得到的混合物。
     步骤 2 ：
     向环丙烷甲酸 [5-(4- 羟基甲基 - 苯基 )-[1， 2， 4] 三唑并 [1， 5-a] 吡啶 -2- 基 ]- 酰 胺的氯仿溶液中缓慢加入三溴化磷 (1.0 当量 )。 将反应混合物在室温搅拌 20 小时， 用冰和 水 (20mL) 淬灭， 用二氯甲烷萃取。将有机层经无水 MgSO4 干燥、 过滤并浓缩至干。将产生 的白色残留物在二氯甲烷 / 乙醚 2 ∶ 1 中研磨， 以得到白色固体状的目标产物。
     步骤 3 ：
     在 N2 气氛下将环丙烷甲酸 [5-(4- 羟基甲基 - 苯基 )-[1， 2， 4] 三唑并 [1， 5-a] 吡 啶 -2- 基 ]- 酰胺 (1 当量 ) 和 DIPEA(2 当量 ) 溶解于 DCM/MeOH(5 ∶ 1 v ∶ v) 中， 分批加 入硫吗啉 1， 1- 二氧化物 (1.1 当量 )。将产生的溶液在室温搅拌 16h。然后， 反应完成。蒸 发溶剂， 将化合物溶解于 DCM 中， 用水洗涤并经无水 MgSO4 干燥。将有机层过滤并蒸发。经 利用 EtOAc 的柱色谱分离最终化合物， 以得到目标产物。
     对比实施例
     化合物 2
     利用通用方法 A 和 4-[4-(4， 4， 5， 5- 四甲基 -[1， 3， 2] 二氧杂环戊硼烷 -2- 基 ) 苯 基 ]- 吗啉制备所述化合物。
     化合物 3
     利用通用方法 A 和 3-(4- 吗啉甲基 - 苯基硼酸频哪醇酯盐酸盐制备所述化合物。
     化合物 4
     利用通用方法 A 和 3-(4- 吗啉 ) 吡啶 - 硼酸频哪醇酯制备所述化合物。
     化合物 5
     利用通用方法 A 和 4-[4-(4， 4， 5， 5- 四甲基 -1， 3， 2- 二氧杂环戊硼烷 -2- 基 ) 苯 基 ]- 吗啉制备所述化合物。
     化合物 6
     利用通用方法 C 和 N- 甲基 - 哌嗪制备所述化合物。
     化合物 7
     利用通用方法 C 和哌啶制备所述化合物。
     化合物 8
     利用通用方法 C 和哌啶 -4- 甲酸酰胺制备所述化合物。
     化合物 9
     利用通用方法 C 和 1- 哌嗪 -1- 基 - 乙酮制备所述化合物。
     化合物 10
     利用通用方法 B 和硫吗啉 1， 1- 二氧化物制备所述化合物。
     化合物 11
     利用通用方法 D 和 4， 4- 二氟哌啶制备所述化合物。
     下表 I 中列出了根据本文描述的合成方法已经制备的本发明化合物和对比实施 例化合物。表 II 中给出了本发明化合物和一些对比实施例化合物的 NMR 光谱数据。
     表I
     表 II ： 本发明代表性化合物的 NMR 数据
     生物学实施例
     实施例 1- 体外测定
     实施例 1.1 ： JAK1 抑制测定
     重组人 JAK1 催化域 ( 氨基酸 866-1154 ； 目录号 08-144) 购自 Carna Biosciences。 将 10ng 的 JAK1 与 12.5μg polyGT 底物 (Sigma 目录号 P0275) 在含有或不含有 5μL 含受 试化合物或介质 (DMSO， 1％终浓度 ) 的激酶反应缓冲液 (15mM Tris-HCl pH 7.5、 1mM DTT、 33 0.01％ Tween-20、 10mMMgCl2、 2μM 非放射 ATP、 0.25μCi P-γ-ATP(GE Healthcare， 目录 号 AH9968) 终浓度 ) 中， 总体积 25μL， 在聚丙烯 96- 孔板 (Greiner， V- 底 ) 中温育。 在 30℃ 下 45 分钟后， 通过加入 25μL/ 孔的 150mM 磷酸终止反应。 应用细胞收集器 (Perkin Elmer) 将所有终止的激酶反应物转移至预先洗涤的 (75mM 磷酸 )96 孔滤板 (Perkin Elmer， 目录 号 6005177) 中。将板用 300μL/ 孔的 75mM 磷酸溶液洗涤 6 次， 并且将板的底部密封。加 入 40μL/ 孔的 Microscint-20， 将板的上部密封， 采用 Topcount(Perkin Elmer) 进行读数。 激酶活性是通过在介质的存在下获得的每分钟计数 (cpm) 减去在阳性对照抑制剂 (10μM 星形孢菌素 ) 的存在下获得的 cpm 而计算的。试验化合物抑制该活性的能力是按如下测定 的：
     抑制百分数＝ (( 在受试化合物存在下样品测得的 cpm- 含有阳性对照抑制剂的样 品测得的 cpm)/( 在介质存在下测得的 cpm- 含有阳性对照抑制剂的样品测得的 cpm)) ＊ 100。
     制备化合物的剂量稀释系列， 能够测定 JAK1 分析中剂量 - 响应反应， 计算每种化 合物的 IC50。每种化合物通常在终浓度为 1％的 DMSO 中在浓度为 20μM、 随后以 1/3 系列 稀释， 以 8 个点 (20μM-6.67μM-2.22μM-740nM-247nM-82nM-27nM-9nM) 进行试验。当化 合物系列的效能增加时， 制备更多的稀释液和 / 或降低最高浓度 ( 例如 5μM、 1μM)。
     已测定了下述化合物对 JAK1 的活性， 并在下面的表 IIIA 中列出了 IC50 值， 所述 IC50 值是利用文中所述的分析测定的。
     表 IIIA ： 化合物的 JAK1 IC50 值JAK1 IC50(nM) 47.07、 55.66、 50.1、 48.29 50.91、 52.11 291 1032 1450 3448 504.1 435 334.3 18.16 7.69实施例 1.2 JAK1 Ki 测定分析
     为了测定 Ki， 将不同量的化合物与酶混合， 酶反应是 ATP 浓度的函数。利用 Km 对 化合物浓度的双倒数图 ( 米氏方程与双倒数作图法 ) 测定 Ki。该分析中所用的是 1ng 的 JAK1(Invitrogen， PV4774)。底物是 50nM 的 Ulight-JAK-1(Tyr1023) 肽 (Perkin Elmer， TRF0121)。 在 含 有 不 同 浓 度 的 ATP 和 化 合 物 的 25mM MOPS pH 6.8、 0.01 ％ 2mM DTT、 5mM MgCl2Brij-35 中完成反应。利用 Eu- 标记的抗磷酸酪氨酸抗体 PT66(Perkin Elmer， AD0068) 测定磷酸化的底物。通过 320nm 的激发以及随后 615nm 和 665nm 的发射在易美逊 (envision， Perkin Elmer) 上完成读数。
     在该分析中测定化合物 1 时， 测得了 39nM 的 Ki 值。
     实施例 1.3 JAK2 抑制分析
     重组人 JAK2 催化域 ( 氨基酸 808-1132 ； 目录号 PV4210) 购自 Invitrogen。将 0.025mU 的 JAK2 与 2.5μg polyGT 底物 (Sigma 目录号 P0275) 在含有或不含有 5μL 含受 试化合物或介质 (DMSO， 1％终浓度 ) 的激酶反应缓冲液 (5mM MOPS pH 7.5、 9mM MgAc、 0.3mM 33 EDTA、 0.06％ Brij 和 0.6mM DTT、 1μM 非放射性 ATP、 0.25μCi P-γ-ATP(GEHealthcare， 目 录号 AH9968) 终浓度 ) 中， 总体积 25μL， 在聚丙烯 96- 孔板 (Greiner， V- 底 ) 中温育。在 30℃下 90 分钟后， 通过加入 25μL/ 孔的 150mM 磷酸终止反应。应用细胞收集器 (Perkin Elmer) 将所有终止的激酶反应物转移至预先洗涤的 (75mM 磷酸 )96 孔滤板 (Perkin Elmer， 目录号 6005177) 中。将板用 300μL/ 孔的 75mM 磷酸溶液洗涤 6 次， 将板的底部密封。加入 40μL/ 孔的 Microscint-20， 将板的上部密封， 采用 Topcount(Perkin Elmer) 进行读数。 激酶活性是通过在介质的存在下获得的 cpm 减去在阳性对照抑制剂 (10μM 星形孢菌素 ) 的存在下获得的每分钟计数 (cpm) 而计算的。受试化合物抑制该活性的能力是按如下测定 的：
     抑制百分数＝ (( 在受试化合物存在下样品测得的 cpm- 含有阳性对照抑制剂的样 品测得的 cpm)/( 在介质存在下测得的 cpm- 含有阳性对照抑制剂的样品测得的 cpm)) ＊ 100。
     制备化合物的剂量稀释系列， 能够测定 JAK2 分析中剂量 - 响应反应， 计算每种化 合物的 IC50。每种化合物通常在终浓度为 1％的 DMSO 中在浓度为 20μM、 随后 1/3 系列稀 释， 以 8 个点 (20μM-6.67μM-2.22μM-740nM-247nM-82nM-27nM-9nM) 进行试验。当化合 物系列的效能增加时， 制备更多的稀释液和 / 或降低最高浓度 ( 例如 5μM、 1μM)。
     已测定了下述化合物对 JAK2 的活性， 在下面的表 IIIB 中列出了 IC50 值， 所述 IC50 值是利用文中所述的分析测定的。
     表 IIIB ： 化合物的 JAK2 IC50 值
     实施例 1.4 JAK2 Kd 测定分析
     以 5nM 的 终 浓 度 使 用 JAK2(Invitrogen， PV4210)。 利 用 25nM 激 酶 示 踪 剂 236(Invitrogen， PV5592) 和 2nM Eu-anti-GST(Invitrogen， PV5594) 在含有不同浓度的化 合物的 50mM Hepes pH 7.5、 0.01％ Brij-35、 10mMMgCl2、 1mM EGTA 中完成结合试验。根据 生产商的方法进行示踪剂检测。
     例如， 当在该分析中测定化合物 1 时， 测得了 205nM 的 Kd 值。
     实施例 1.5 JAK3 抑制测定
     重 组 人 JAK3 催 化 域 ( 氨 基 酸 781-1124 ； 目 录 号 PV3855) 购 自 Invitrogen。 将 0.025mU 的 JAK3 与 2.5μg polyGT 底 物 (Sigma， 目 录 号 P0275) 在 含 有 或 不 含 有
     5μL 含受试化合物或介质 (DMSO， 1 ％终浓度 ) 的激酶反应缓冲液 (25mM Tris pH 7.5、 0.5mM EGTA、 0.5mM Na3VO4、 5mMb- 磷酸甘油酯、 0.01％ Triton X-100、 1μM 非放射性 ATP、 33 0.25μCi P-γ-ATP(GE Healthcare， 目录号 AH9968) 终浓度 ) 中， 总体积 25μL， 在聚丙烯 96- 孔板 (Greiner， V- 底 ) 中温育。在 30℃下 105 分钟后， 通过加入 25μL/ 孔的 150mM 磷 酸终止反应。 采用细胞收集器 (Perkin Elmer) 将所有终止的激酶反应物转移至预先洗涤的 (75mM 磷酸 )96 孔滤板 (Perkin Elmer， 目录号 6005177) 中。将板用 300μL/ 孔的 75mM 磷 酸溶液洗涤 6 次， 将板的底部密封。加入 40μL/ 孔的 Microscint-20， 将板的上部密封， 采 用 Topcount(Perkin Elmer) 进行读数。激酶活性是通过在介质的存在下获得的 cpm 减去 在阳性对照抑制剂 (10μM 星形孢菌素 ) 的存在下获得的每分钟计数 (cpm) 而计算的。受 试化合物抑制该活性的能力是按如下测定的 ：
     抑制百分数＝ (( 在受试化合物存在下样品测得的 cpm- 含有阳性对照抑制剂的样 品测得的 cpm)/( 在介质存在下测得的 cpm- 含有阳性对照抑制剂的样品测得的 cpm)) ＊ 100。
     制备化合物的剂量稀释系列， 能够测定 JAK3 分析中剂量 - 响应反应， 并且计算每 种化合物的 IC50。每种化合物通常在终浓度为 1％的 DMSO 中在浓度为 20μM， 随后 1/3 系 列稀释， 8 个点 (20μM-6.67μM-2.22μM-740nM-247nM-82nM-27nM-9nM) 进行试验。 当化合 物系列的效能增加时， 制备更多的稀释液和 / 或降低最高浓度 ( 例如 5μM、 1μM)。
     已测定了下述化合物对 JAK3 的活性， 在下面的表 IIIC 中列出了 IC50 值， 所述 IC50 值是利用文中所述的分析测定的。
     表 VIII ： 化合物的 JAK3 IC50 值
     实施例 1.6J AK3 Ki 测定分析
     为了测定 Ki， 将不同量的抑制剂与酶混合， 酶反应是 ATP 浓度的函数。利用 Km 对化合物浓度的双倒数图 ( 米氏方程与双倒数作图法 ) 测定 Ki。以 10ng/ml 的终浓度 使用 JAK3(Carna Biosciences， 09CBS-0625B)。底物是 Poly(Glu， Tyr) 钠盐 (4 ∶ 1)， MW 20000-50000(Sigma， P0275)。 在含有不同浓度的 ATP 和化合物的 25mM Tris pH 7.5、 0.01％ Triton X-100、 0.5mM EGTA、 2.5mM DTT、 0.5mM Na3VO4、 5mM b- 磷酸甘油酯、 10mMMgCl2 中完成 反应， 加入 150mM 磷酸终止反应。通过将样品装载到滤板上 ( 利用收集器， Perkin Elmer) 并随后洗涤来测定掺入底物 polyGT 中的磷酸盐。 向滤板 (Perkin Elmer) 加入闪烁液体后， 在 Topcount 闪烁计数器中测定 polyGT 中掺入的 33P。
     例如， 当在该分析中测定化合物 1 时， 测得了 353nM 的 Ki 值。
     实施例 1.7 TYK2 抑制测定
     重组人 TYK2 催化域 ( 氨基酸 871-1187 ； 目录号 08-147) 购自 Carna biosciences。 将 5ng 的 TYK2 与 12.5μg polyGT 底物 (Sigma， 目录号 P0275) 在含有或不含有 5μL 含受
     试化合物或介质 (DMSO， 1％终浓度 ) 的激酶反应缓冲液 (25mM Hepes pH 7.5、 100mM NaCl、 0.2mM Na3VO4、 0.1％ NP-40、 0.1μM 非放射性 ATP、 0.125μCi 33P-γ-ATP(GE Healthcare， 目录号 AH9968) 终浓度 ) 中， 总体积 25μL， 在聚丙烯 96- 孔板 (Greiner， V- 底 ) 中温育。 在 30℃下 90 分钟后， 通过加入 25μL/ 孔的 150mM 磷酸终止反应。 应用细胞收集器 (Perkin Elmer) 将所有终止的激酶反应物转移至预先洗涤的 (75mM 磷酸 )96 孔滤板 (Perkin Elmer， 目录号 6005177) 中。将板用 300μL/ 孔的 75mM 磷酸溶液洗涤 6 次， 将板的底部密封。加 入 40μL/ 孔的 Microscint-20， 将板的上部密封， 采用 Topcount(Perkin Elmer) 进行读数。 激酶活性是通过在介质存在下获得的每分钟计数 (cpm) 减去在阳性对照抑制剂 (10μM 星 形孢菌素 ) 存在下获得的 cpm 而计算的。受试化合物抑制该活性的能力是按如下测定的 ：
     抑制百分数＝ (( 在受试化合物存在下样品测得的 cpm- 含有阳性对照抑制剂的样 品测得的 cpm)/( 在介质存在下测得的 cpm- 含有阳性对照抑制剂的样品测得的 cpm)) ＊ 100。
     制备化合物的剂量稀释系列， 能够测定 TYK2 分析中剂量 - 响应反应， 计算每种化 合物的 IC50。每种化合物通常在终浓度为 1％的 DMSO 中在浓度为 20μM， 随后 1/3 系列稀 释， 8 个点 (20μM-6.67μM-2.22μM-740nM-247nM-82nM-27nM-9nM) 进行试验。 当化合物系 列的效能增加时， 制备更多的稀释液和 / 或降低最高浓度 ( 例如 5μM、 1μM)。
     已测定了下述化合物对 TYK2 的活性， 在下面的表 IIID 中列出了 IC50 值， 所述 IC50 值是利用文中所述的分析测定的。
     表 IIID ： 化合物的 TYK2 IC50 值
     实施例 1.8 TYK2 Kd 测定分析
     以 5nM 的终浓度使用 TYK2(Carna Biosciences， 09CBS-0983D)。 利用 50nM 激酶示 踪剂 236(Invitrogen， PV5592) 和 2nM Eu-anti-GST(Invitrogen， PV5594) 在含有不同浓度 的化合物的 50mM Hepes pH 7.5、 0.01％ Brij-35、 10mM MgCl2、 1mM EGTA 中完成结合试验。 根据生产商的方法进行示踪剂检测。
     例如， 当在该分析中测定化合物 1 时， 测得了 376nM 的 Kd 值。
     实施例 2 ： 细胞分析
     实施例 2.1 ： JAK-STAT 信号传导分析 ：
     将 HeLa 细胞维持在含有 10％热灭活的胎牛血清、 100U/mL 青霉素和 100μg/mL 链 霉素的 Dulbecco 改良的 Eagle 培养基 (DMEM) 中。将 Hela 细胞在 70％汇合时用于转染。 在 96- 孔板中将 87μL 细胞培养基中 20,000 个细胞每孔用 40ng pSTAT1(2)- 荧光素酶报 道分子 (Panomics)、 8ng 的 LacZ 报道分子 ( 作为内对照报道分子 ) 和 52ng 的 pBSK， 应用 0.32μLJet-PEI(Polyplus) 作为转染试剂进行瞬时转染。 在 37℃、 10％ CO2 下温育过夜后， 除去转染培养基。加入 75μL 的 DMEM+1.5％热灭活胎牛血清。加入 15μL 6.7× 浓度的化
     合物达 60 分钟， 然后加入 10μL 33ng/mL 终浓度的人 OSM(Peprotech)。
     所有化合物一式两份进行试验， 在终浓度 0.2％ DMSO 中， 起始 20μM， 随后 1/3 系 列稀释， 总共 8 个剂量 (20μM-6.6μM-2.2μM-740nM-250nM-82nM-27nM-9nM)。
     在 37 ℃、 10 ％ CO2 下温育过夜后， 将细胞在 100μL 裂解缓冲液 / 孔 (PBS、 0.9mM CaCl2、 0.5mM MgCl2、 5％海藻糖、 0.025％ Tergitol NP9、 0.15％ BSA) 中裂解。
     通过加入 180μLβGal 溶液 (30μL ONPG 4mg/mL+150μLβ- 半乳糖苷酶缓冲液 (0.06M Na2HPO4、 0.04M NaH2PO4、 1mM MgCl2))， 20 分钟后读取 40μL 细胞裂解液的 β- 半乳 糖苷酶活性。通过加入 50μL Na2CO3 1M 终止反应。在 405nm 处读取吸光度。
     根据厂商 (Perkin Elmer) 说明， 采用 40μL 细胞裂解液加 40μL在Envision(Perkin Elmer) 上测定荧光素酶活性。 将 10μM 的全 -JAK 抑制剂用作阳性对照 (100％抑制 )。0.5％ DMSO 用作阴性对 照 (0％抑制 )。阳性和阴性对照用于计算 z’ 和 “抑制百分数” (PIN) 值。
     抑制百分数＝ (( 在介质的存在下测得的荧光 - 在受试化合物的存在下样品测得 的荧光 )/( 在介质的存在下测得的荧光 - 不含触发物样品测得的荧光 )) ＊ 100。
     将 PIN 值在剂量 - 响应曲线中对受试化合物作图， 获得 EC50 值。
     表 IV
     实施例 2.2 ： OSM/IL-1β 信号传导分析
     OSM 和 IL-1β 表现出协同上调人软骨肉瘤细胞系 SW1353 中的 MMP13 水平。将细 胞以 15,000 个细胞 / 孔接种在体积为 120μL 的含有 10％ (v/v)FBS 和 1％青霉素 / 链霉 素 (InVitrogen) 的 DMEM(Invitrogen) 的 96- 孔板中， 在 37℃、 5％ CO2 下温育。在用 15μL OSM 和 IL-1β 浓度达 25ng/mL OSM 和 1ng/mL IL-1β 触发前， 将细胞与 15μL 在含有 2％ DMSO 的 M199 培养基中的化合物预温育 1 小时， 并且触发 48 小时后在条件培养基中测定 MMP13 水平。 MMP13 活性是采用抗体捕获活性分析来测定的。 为此目的， 将 384- 孔板 (NUNC， 460518， MaxiSorb 黑色 ) 用 35μL 的 1.5μg/mL 抗人 MMP13 抗体 (R&D Systems， MAB511) 溶 液在 4℃下包被 24 小时。 用 PBS+0.05％吐温洗涤孔 2 次后， 将剩余的结合位点用 100μL 在
     PBS 中的 5％脱脂奶粉 (Santa Cruz， sc-2325， Blotto) 在 4℃下封闭 24 小时。接着， 将孔 用 PBS+0.05％吐温洗涤 2 次， 并且加入在 100- 倍稀释的封闭缓冲液中的 35μL 1/10 稀释 的含 MMP13 的培养上清液， 在室温下温育 4 小时。接着， 将孔用 PBS+0.05％吐温洗涤 2 次， 随后通过加入 35μL 1.5mM4- 氨基苯基醋酸汞 (APMA)(Sigma， A9563) 溶液并且在 37℃下 温育 1 小时进行 MMP13 活化。将孔再次用 PBS+0.05％吐温洗涤， 随后加入 35μLMMP13 底物 (Biomol， P-126， OmniMMP 荧光底物 )。在 37℃下温育 24 小时后， 在 Perkin Elmer Wallac EnVision 2102 多标记读数器 ( 激发波长 ： 320nm， 发射波长 ： 405nm) 中测定转化底物的荧 光。抑制百分数＝ (( 在介质存在下测得的荧光 - 在受试化合物存在下样品测得的荧 光 )/( 在介质存在下测得的荧光 - 不含触发物样品测得的荧光 )) ＊ 100。
     例如， 当在该分析中测定化合物 1 时， 测得了 2242.5(±1098.5)nM 的 EC50 值。
     实施例 2.3 ： PBL 增殖分析
     将人外周血淋巴细胞 (PBL) 用 IL-2 刺激并且采用 BrdU 掺入分析测定增殖。 首先， 将 PBL 用 PHA 刺激 72 小时以诱导 IL-2 受体， 禁食 (fasted)24 小时以终止细胞增殖， 随后 用 IL-2 再刺激 72 小时 ( 包括 24 小时 BrdU 标记 )。将细胞与受试化合物预温育 1 小时， 然 后加入 IL-2。将细胞在含 10％ (v/v)FBS 的 RPMI 1640 中培养。
     实施例 2.4 全血分析 (WBA)
     2.4.1 IFN 刺激的实验设计
     为了预测受试化合物抑制 JAK1 或 JAK2 相关的体内信号传导通路， 利用人全血形 成了生理学相关的体外模型。在 WBA 分析中， 将从知情同意的人类志愿者抽取的血液离 体用化合物处理 (1h)， 随后用干扰素 α(IFNα， JAK1 依赖通路 ) 刺激 30 分钟或者用粒细 胞 - 巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF， JAK2 依赖通路 ) 刺激 2h。
     2.4.1.1 磷光体 -STAT1 分析
     对于 IFNα 而言， 利用 pSTAT1 ELISA 分析测定白血细胞提取物中经 IFNα 的信号 转导与转录激活子 -1 的磷酸化 (pSTAT1) 增加。干扰素 α(IFNα) 触发后的信号转导与转 录激活子 -1 的磷酸化是 JAK1- 介导的事件。研发了用于测定细胞提取物中磷酸化 -STAT1 水平的磷酸化 -STAT1 分析， 以评价抑制 JAK1- 依赖信号传导通路的化合物的能力。
     从知情同意的人类志愿者抽取的人全血离体用化合物处理 (1h)， 随后用 IFNα 刺 激 30 分钟。利用磷酸化 -STAT1ELISA 测定白血细胞提取物中经 IFNα 的 STAT1 的磷酸化 增加。
     ACK 裂解缓冲液由 0.15M NH4Cl、 10mM KHCO3、 0.1mM EDTA 构成。缓冲液的 pH 是 7.3。
     将 10× 细 胞 裂 解 缓 冲 液 浓 缩 物 ( 购 自 Cell Signaling 的 部 分 PathScan Phospho-STAT1(Tyr701) 夹心 ELISA 试剂盒 ) 用水稀释 10 倍。使用前向缓冲液中加入蛋白 酶抑制剂。
     将 20μg IFNα 溶解在 40μL H2O 中， 以获得 500μg/mL 储备液。 将储备液于 -20℃ 贮存。
     在 DMSO 中制备化合物的 3 倍系列稀释液 ( 最高浓度 ： 10mM)。随后， 将化合物再在 培养基中稀释 ( 稀释倍数取决于所需的化合物终浓度 )。
     2.4.1.1.1 含有化合物并用 IFNα 刺激的血液的温育
     在加肝素的试管中收集人血。将血液分成 392μL 的等份。然后， 向各等份中加 入 4μL 化合物稀释液， 将血液样品在 37℃温育 1h。将 IFNα 储备溶液在 RPMI 培养基中稀 释 1000- 倍， 以得到 500ng/mL 的工作液。将 4μL 的 500ng/mL 工作液加入到血液样品中 (IFNα 的终浓度 ： 5ng/ml)。将样品在 37℃温育 30min。
     2.4.1.1.2 细胞提取物的制备
     在刺激末期， 将 7.6mL ACK 缓冲液加入到血液样品中， 以裂解血红细胞。通过倒置 试管 5 次， 将样品混合， 将反应物在冰上培育 5min。 培育期间， RBC 的裂解应该是明显的。 通过在 300g、 4℃离心 7min 将细胞沉淀， 除去上清液。将 10mL 1×PBS 加入到各试管中， 将细 胞沉淀物再悬浮。将样品在 300g、 4℃再离心 7min。除去上清液， 将沉淀物再悬浮在 500μL 的 1×PBS 中。然后， 将细胞混悬液转移至透明的 1.5mL 微量离心管中。通过在 4℃于 700g 离心 5min 来沉淀细胞。除去上清液， 将沉淀物溶解在 150μL 细胞裂解缓冲液中。将样品 在冰上培育 15min。然后， 将样品贮存在 -80℃， 直至进一步处理。
     2.4.1.1.3 经 ELISA 测定 STAT1 的磷酸化
     将购自 Cell Signaling( 目录号 ： #7234) 的 Pathscan Phospho-STAT1(Tyr701) 夹 心 ELISA 试剂盒用于测定 Phospho-STAT1 的水平。
     在冰上解冻细胞提取物。将试管在 16,000g、 4℃离心 5min， 收集透明的溶解产物。 同时， 将试剂盒的微孔板条平衡至室温， 通过在 H2O 中稀释 20× 洗涤缓冲液来制备洗涤缓 冲液。将样品在样品稀释剂中稀释 2 倍， 将 100μL 加入到微孔板条中。将板条在 4℃培育 过夜。
     第二天， 将孔用洗涤缓冲液洗涤 3 次。向孔中加入 100μL 的检测抗体。将板条在 37℃培育 1h。然后， 将孔用洗涤缓冲液再洗涤 3 次。向各孔中加入 100μL HRP- 酶标二抗， 并在 37℃培育样品。30min 后， 将孔再洗涤 3 次， 向所有孔中加入 100μL TMB 底物。当样 品变蓝时， 加入 100μL STOP 溶液终止反应。在 450nm 测定吸收。 2.4.1.2 数据分析
     细胞提取物中 IFNα 诱导的 phosphoSTAT1 的抑制对化合物浓度作图， 并利用 2 Graphpad 软件得到 IC50 值。如果 R 比 0.8 大且斜率比 3 小， 则数据保留。
     2.4.1.2 IL-8 ELISA
     对于 GM-CSF 刺激， 利用 IL-8 ELISA 分析测定血浆中白细胞介素 -8(IL-8) 水平 的增加。粒细胞巨噬细胞 - 集落刺激因子 (GM-CSF)- 诱导的白细胞介素 8(IL-8) 表达是 JAK2- 介导的事件。研发了可用于测定血浆样品中 IL-8 水平的 IL-8 ELISA， 以评价化合物 抑制 JAK2- 依赖信号传导途径的能力。
     从知情同意的人类志愿者抽取的人全血离体用化合物处理 (1h)， 随后用 GM-CSF 刺激 2h。利用 IL-8 ELISA 分析测定血浆中 IL-8 水平的增加。
     将 10μg GM-CSF 溶解在 100μL H2O 中， 以获得 100μg/mL 的储备液。将储备液 于 -20℃贮存。
     在 DMSO 中制备化合物的 3 倍系列稀释物 ( 最高浓度 ： 10mM)。随后， 将化合物再在 培养基中稀释 ( 稀释倍数取决于所需的化合物终浓度 )。
     2.4.1.2.1 含有化合物并用 GM-CSF 刺激的血液的温育
     在加肝素的试管中收集人血。将血液分成 245μL 的等份。然后， 向各等份中加 入 25μL 化合物稀释液， 将血液样品在 37℃温育 1h。将 GM-CSF 储备溶液在 RPMI 培养基中 稀释 100- 倍， 以得到 1μg/mL 的工作液。将 2.5μL 的 1μg/mL 工作液加入到血液样品中 (GM-CSF 的终浓度 ： 10ng/ml)。将样品在 37℃温育 2h。
     2.4.1.2.2 血浆样品的制备
     将样品在 1,000g、 4℃离心 15min。收集 100μL 血浆， 于 -80℃贮存， 直到再次使 用。
     2.4.1.2.3 经 ELISA 测定 IL-8 水平
     将购自 R&D Systems( 目录号 ： Q8000B) 的人 IL-8 化学发光免疫测定试剂盒用于 测定 IL-8 水平。
     通过在 H2O 中稀释 10× 洗涤缓冲液来制备洗涤缓冲液。在使用前 4 小时， 通过将 1 份光亮试剂 (Glo Reagent)1 加入到 2 份光亮试剂 B 中制备工作光亮试剂。
     向孔中加入 100μL 分析稀释剂 RD1-86。 然后， 加入 50μL 样品 ( 血浆 )。 将 ELISA 板在室温、 500rpm 温育 2h。 用洗涤缓冲液洗涤所有孔 4 次， 并向所有孔中加入 200μL IL-8 共轭物。在室温温育 3h 后， 将孔用洗涤缓冲液洗涤 4 次， 并向所有孔中加入 100μL 工作光 亮试剂。将 ELISA 板在室温 ( 避光 ) 温育 5min。测定发光 (0.5s/ 孔读取时间 )。
     2.4.1.3 结果
     例如， 当进行所述试验设计时， 化合物 1 抑制 INFα 诱导的 pSTAT1 水平增加的 pIC50 是 6.23±0.15(SEM)， 这表明化合物可有效抑制生理环境中的 JAK1 通路。
     2.4.2 IL-6 刺激方案
     还利用人全血完成流式细胞分析， 以确定化合物离体对 JAK1 的选择性高于 JAK2。 因此， 从知情同意的人类志愿者抽取血液。 然后， 将血液在轻微振动下于 37℃平衡 30 分钟， 接着在 Eppendorf 试管中进行等分。加入不同浓度的化合物， 并在轻微振动下于 37℃温育 30 分钟， 随后对于 JAK1- 依赖通道刺激来讲， 在轻微振动下于 37℃用白细胞介素 6(IL-6) 刺激 20 分钟或者对于 JAK2- 依赖通道刺激来讲， 在轻微振动下于 37℃用 GM-CSF 刺激 20 分 钟。然后， 利用 FACS 分析评价 Phospho-STAT1 和 phospho-STAT5。 2.4.2.1 Phospho-STAT1 分析
     对于 IL-6- 刺激的白血细胞中信号转导与转录激活子 -1(pSTAT1) 的磷酸化增加， 从知情同意的人类志愿者抽取的人全血离体用化合物处理 30min， 随后用 IL-6 刺激 20 分 钟。通过 FACS 利用抗磷酸化 -STAT1 抗体测定淋巴细胞中经 IL-6 的 STAT1 磷酸化的增加。
     将 5× 溶解 / 固定缓冲液 (BD PhosFlow， 目录号 558049) 用蒸馏水稀释 5 倍， 在 37℃预热。弃去剩余的稀释的溶解 / 固定缓冲液。
     将 10μg rhIL-6(R&D Systems， 目录号 206-IL) 溶解于 1ml 的 PBS0.1％ BSA 中， 以获得 10μg/ml 的储备液。将储备液在 -80℃等份贮存。
     在 DMSO 中制备化合物的 3 倍稀释系列 (10mM 储备液 )。 对照处理的样品加入 DMSO， 而不是化合物。所有样品用 1％终浓度的 DMSO 温育。
     2.4.2.1.1 含有化合物并用 IL-6 刺激的血液的温育
     在加肝素的试管中收集人血。将血液分成 148.5μl 的等份。然后， 向各等份中加 入 1.5μl 化合物稀释液， 并将血液样品在轻微摇动下于 37℃温育 30min。向血液样品中加 入 IL-6 储备液 (1.5μl)( 终浓度 10ng/ml)， 并将样品在轻微摇动下于 37℃温育 20min。
     2.4.2.1.2 全血细胞制备和 CD4 标记
     在刺激末期， 将 3ml 预加热的 1× 溶解 / 固定缓冲液立即加入到血浆样品中、 快 速旋转摇动并在水浴中于 37℃温育 15min， 以溶解血红细胞并固定白细胞， 然后在 -80℃冷 冻， 直至进一步使用。
     对于下面的步骤， 在 37 ℃将试管融解大约 20 分钟， 并在 400g 于 4 ℃离心 5min。 将细胞沉淀物用 3mL 冷的 1×PBS 洗涤， 在离心后， 将细胞沉淀物再悬浮于 100μL 含有 3％ BSA 的 PBS 中。加入 FITC- 轭合的抗 -CD4 抗体或者对照 FITC- 轭合的同种型抗体， 在黑暗中于室温温育 20min。
     2.4.2.1.3 细胞透化并用 Phospho-STAT1 抗体标记
     用 1×PBS 洗涤细胞后， 将细胞沉淀物再悬浮于 100μl 冰冷的 1×PBS 中， 加入 900μl 冰冷的 100％甲醇。然后， 将细胞在 4℃温育 30min， 以透化。
     然后， 将透化的细胞用含有 3％ BSA 的 1×PBS 洗涤， 并最终悬浮于含有 3％ BSA 的 80μl 1×PBX 中。
     加 入 20μL PE 鼠 抗 -STAT1(pY701) 或 者 PE 鼠 IgG2aκ 同 种 型 对 照 抗 体 (BD Biosciences， 目录号分别是 612564 和 559319)， 混合， 接着在黑暗中于 4℃温育 30min。
     然后， 将细胞用 1×PBS 洗涤， 在 FACSCanto II 流式细胞仪 (BDBiosciences) 上分 析。
     2.4.2.1.4 在 FACSCanto II 上的荧光分析
     计 数 50,000 个 总 事 件， 并 在 CD4+ 细 胞 设 门 控 后， 测定淋巴细胞门控中的 Phospho-STAT1 阳性细胞。利用 FACSDiva 软件分析数据， 数据相应于根据 CD4+ 细胞上对 phospho-STAT1 阳性的细胞百分数计算的 IL-6 刺激抑制百分数。
     2.4.2.2 Phospho-STAT5 分析
     对于 GM-CSF- 刺激的白血细胞中信号转导与转录激活子 5 磷酸化的增加， 从知情 同意的人类志愿者抽取的人全血离体用化合物处理 30min， 并随后用 GM-CSF 刺激 20 分钟。 通过 FACS 利用抗磷酸化 -STAT5 抗体测定单核细胞中经 GM-CSF 的 STAT5 磷酸化增加。
     将 5× 溶解 / 固定缓冲液 (BD PhosFlow， 目录号 558049) 用蒸馏水稀释 5 倍， 在 37℃预热。弃去剩余的稀释的溶解 / 固定缓冲液。
     将 10μg rhGM-CSF(AbCys S.A.， 目录号 P300-03) 溶解于 100μl 的 PBS0.1％ BSA 中， 以获得 10μg/ml 的储备液。将储备液在 -80℃等份贮存。
     在 DMSO 中制备化合物的 3 倍稀释系列 (10mM 储备液 )。 对照处理的样品加入 DMSO， 而无任何受试化合物。所有样品用 1％终浓度的 DMSO 温育。
     2.4.2.2.1 含有化合物并用 GM-CSF 刺激的血液的温育
     在加肝素的试管中收集人血。将血液分成 148.5μl 的等份。然后， 向各等份中加 入 1.5μl 化合物稀释液， 并将血液样品在轻微摇动下于 37℃温育 30min。向血液样品中加 入 GM-CSF 储备液 (1.5μl)( 终浓度 20pg/ml)， 并将样品在轻微摇动下于 37℃温育 20min。
     2.4.2.2.2 全血细胞制备和 CD14 标记
     在刺激末期， 将 3ml 预温热的 1× 溶解 / 固定缓冲液立即加入到血浆样品中、 快 速旋转摇动并在水浴中于 37℃温育 15min， 以溶解血红细胞并固定白细胞， 然后在 -80℃冷 冻， 直至进一步使用。
     对于下面的步骤， 在 37℃将试管融解大约 20 分钟， 并在 400g 于 4℃离心 5min。将 细胞沉淀物用 3mL 冷的 1×PBS 洗涤， 并在离心后， 将细胞沉淀物再悬浮于 100μL 含有 3％ BSA 的 PBS 中。 加入 FITC 鼠抗 -CD14 抗体 (BD Biosciences， 目录号 345784) 或者对照 FITC 鼠 IgG2bκ 同种型抗体， 并在黑暗中于室温温育 20min。
     2.4.2.2.3 细胞透化并用 Phospho-STAT5 抗体标记
     用 1×PBS 洗涤细胞后， 将细胞沉淀物再悬浮于 100μl 冰冷的 1×PBS 中， 加入 900μl 冰冷的 100％甲醇。然后， 将细胞在 4℃温育 30min， 以透化。然后， 将透化的细胞用含有 3％ BSA 的 1×PBS 洗涤， 并最终悬浮于含有 3％ BSA 的 80μl 1×PBX 中。
     加 入 20μL PE 鼠 抗 -STAT5(pY694) 或 者 PE 鼠 IgG2aκ 同 种 型 对 照 抗 体 (BD Biosciences， 目录号分别是 612567 和 554680)， 混合， 接着在黑暗中于 4℃温育 30min。
     然 后，将 细 胞 用 1×PBS 洗 涤 一 次，并 在 FACSCanto II 流 式 细 胞 仪 (BDBiosciences) 上分析。
     2.4.2.2.4 在 FACSCanto II 上的荧光分析
     计数 50,000 个总事件， 并在 CD14+ 细胞设门控后， 测定 Phospho-STAT5 阳性细胞。 利用 FACSDiva 软件分析数据， 数据相应于根据 CD4+ 细胞上对 phospho-STAT5 的阳性细胞 百分数计算的 GM-CSF 刺激抑制百分数。
     2.4.2.3 结果
     当进行所述试验设计时， 对各个受试化合物来讲， 测定从 3 个健康志愿者平均值 得到的抑制百分数 (PIN)。例如， 测定化合物 1， 得到 STAT1 磷酸化抑制中的 pIC50 ＝ 6.08。
     实施例 3 ： 体内模型
     实施例 3.1 ： CIA 模型
     3.1.1 材料
     完全 Freund 佐剂 (CFA) 和不完全 Freund 佐剂 (IFA) 购自 Difco。II 型牛胶原 (CII)、 脂多糖 (LPS) 和 Enbrel 分别购自 Chondrex(Isle d’ Abeau， 法国 )、 Sigma(P4252， L’ Isle d’ Abeau， 法国 )、 Whyett(25mg 注射器， 法国 )Acros Organics(Palo Alto， CA)。所 用的所有其它试剂是试剂级并且所有溶剂是分析级。
     3.1.2 动物
     黑色刺鼠 ( 雄性， 7-8 周龄 ) 从 Harlan Laboratories(Maison-Alfort， 法国 ) 获 得。 使大鼠经历 12 小时的明 / 暗周期 (0700-1900)。 温度维持在 22℃， 随意提供食物和水。
     3.1.3 胶原诱导的关节炎 (CIA)
     试验前一天， 用 0.05M 乙酸配制 CII 溶液 (2mg/mL) 并且在 4℃下贮存。在免疫前 即刻， 将等体积的佐剂 (IFA) 和 CII 通过匀化器在预冷的玻璃瓶中、 在冰水浴中混合。如 果没有形成乳状液， 需要另外的佐剂和延长匀化。第一天在每只大鼠的尾巴根部皮内注射 0.2mL 乳状液， 第 9 天进行第二次加强剂量皮内注射 (2mg/mL 的 CII 溶液在 CFA 0.1mL 盐水 中 )。该免疫方法是由公开的方法 (Sims 等人， 2004 ； Jou 等人， 2005) 改良的。
     3.1.4 研究设计
     受试化合物的治疗效果是在大鼠 CIA 模型中试验的。将大鼠随机分入相同的组 中， 每组包括 10 只动物。 将所有大鼠在第 1 天免疫并且在第 9 天加强剂量。 治疗剂量从第 16 天持续到第 30 天。 阴性对照组是用介质 (MC0.5％ ) 处理的， 阳性对照组是用 Enbrel(10mg/ kg， 3× 周 ) 处理。通常在 3 个剂量下对目标化合物进行试验， 例如口服 3、 10、 30mg/kg。
     3.1.5 关节炎的临床评价
     根据 Khachigian 2006 ； Lin 等人， 2007 和 Nishida 等人， 2004 的方法对关节炎进 行评分。四爪各自的肿胀是根据如下关节炎评分来排列的 ： 0- 没有症状 ； 1- 轻度， 但是一 种类型的关节 ( 例如踝或腕 ) 出现明显的发红和肿胀， 或者明显的发红和肿胀限于单个指 ( 趾 )， 不管受侵袭指 ( 趾 ) 的数目多少 ； 2- 两种或多种类型的关节出现中度发红和肿胀 ；3- 整个爪 ( 包括指 ( 趾 )) 出现严重发红和肿胀 ； 4- 最重发炎的肢， 涉及多个关节 ( 每只动 物最高累积的临床关节炎得分为 16)(Nishida 等人， 2004)。
     为了进行多项研究的荟萃分析， 临床评分标准如下 ：
     临床评分的 AUC(AUC 评分 ) ： 计算各个大鼠第 1 天至第 14 天的曲线下面积 (AUC)。 本项研究中， 每只个体动物的 AUC 除以从介质得到的平均 AUC， 由此得到所述动物的数据并 乘以 100( 即将 AUC 表示为每项研究的平均介质 AUC 的百分数 )。
     从第 1 天至第 14 天的临床评分增加 ( 结束点评分 ) ： 本项研究中， 个体动物的临 床评分差除以从介质得到的平均临床评分差， 由此得到所述动物的数据并乘以 100( 即将 差表示为每项研究的平均介质临床评分差的百分数 )。
     3.1.6 关节炎发作后的体重变化 (％ )
     在 临 床 上， 体 重 减 轻 与 关 节 炎 有 关 (Shelton 等 人， 2005 ； Argiles 等 人， 1998 ； Rall， 2004 ； Walsmith 等人， 2004)。因此， 关节炎发作后体重变化可以用作非特异性端点 (endpoint)， 用于评价大鼠模型中的治疗效果。如下计算关节炎发作后体重的变化 (％ ) ：
     小鼠 ： 大鼠 ：
     3.1.7 放射学
     拍摄每只个体动物的后爪的 X- 射线照片。随机盲选的身份号分配给每张照片， 骨 侵蚀的严重度是通过两种独立的记分排列的， 应用放射学 Larsen 记分系统如下 ： 0- 正常， 具有完整的骨轮廓和正常的关节间隙 ； 1- 轻度异常， 任何一个或两个外部跖骨显示出轻度 骨侵蚀 ； 2- 明显的早期异常， 任何 3 至 5 个外部跖骨显示出骨侵蚀 ； 3- 中度破坏性异常， 所 有外部跖骨以及任何一个或两个内部跖骨显示出明显的骨侵蚀 ； 4- 严重破坏性异常， 所有 跖骨显示出明显的骨侵蚀并且至少一个内部跖关节完全侵蚀， 留下部分保留的某些骨关节 轮廓 ； 5- 残毁性异常， 没有骨质轮廓。该记分系统是由 Salvemini 等人， 2001 ； Bush 等人， 2002 ； Sims 等人， 2004 ； Jou 等人， 2005 改良的。
     3.1.8 组织学
     放射学分析后， 将小鼠的后爪固定在 10％磷酸盐缓冲福尔马林 (pH 7.4) 中， 为了 精细的组织学， 用快速骨脱钙剂脱钙 (Laboratories Eurobio) 并且包埋在石蜡中。为了确 保深入评价关节炎关节， 切割至少 4 个系列切片 (5μm 厚 )， 并且每个系列的切片两端之间 是 100μm。将切片用苏木精和伊红 (H&E) 染色。滑液炎症以及骨和软骨损伤的组织学检 测是双盲进行的。在每个爪中， 用 4- 点等级评价 4 个参数。这些参数是细胞渗透、 血管翳 严重性、 软骨侵蚀和骨侵蚀。评分是如下进行的 ： 1- 正常， 2- 轻度， 3- 中度， 4- 显著。将这 4 个评分相加并且表示为另一个得分， 即 “RA 总得分” 。
     3.1.9 跟骨 ( 足跟骨 ) 的微 - 计算机体层摄影术 (μCT) 分析
     RA 中 观 察 到 的 骨 退 化 特 别 是 出 现 在 骨 皮 质 中， 可 以 通 过 μCT 分 析 来 显 示 (Sims NA 等 人， Arthritis Rheum.50(2004)2338-2346 ： Targeting osteoclasts with zoledronic acid prevents bone destruction in collagen-induced arthritis( 用唑 来膦酸靶向破骨细胞， 防止胶原诱导的关节炎中的骨破坏 ) ； Oste L 等人， ECTC Montreal2007 ： A high throughput method of measuring bone architectural disturbance in a murine CIA model by micro-CT morphometry( 通过显微 -CT 形态测定法测定鼠 CIA 模型 中骨结构紊乱的高通量方法 )。跟骨扫描和 3D 体积重建后， 以每个片层出现的分散目标的 数目测定骨退化， 所述的片层是在垂直于骨纵轴方向在硅中分离的。 骨退化的越多， 测定到 的分散目标越多。分析了 1000 个片层， 沿根骨均匀分布 ( 间隔约 10.8μm)。
     3.1.10 稳态 PK
     在第 7 或 11 天， 用肝素铝作为抗凝剂在球后窦穴按照下列时间点收集血样 ： 给药 前、 1、 3 和 6 小时。 将全血样品离心， 将得到的血浆样品在分析前贮存于 -20℃。 用 LC-MS/MS 方法测定各个受试化合物的血浆浓度， 其中质谱在正电喷雾模式操作。 利用 ( 水平。 下面表 V 总结了所得到的本发明化合物和对比实施例化合物的几个 PK 参数结果， 结果表明本发明化合物可以改善 PK 性能 ( 例如 Cmax， T1/2)。
     表V
     美国 ) 计算药代动力学参数， 并假设给药前血浆水平等于 24 小时的血浆3.1.11 结果
     下面表 VI 总结了在大鼠 CIA 模型中得到的化合物 1 和 2 的结果， “＊” 表示在评分 中具有统计学上的显著改善， p 0.05， 相对于未治疗的对照。
     表 VI
     $-“临床评分” 指化合物 1 所得的标准的 AUC 评分 / 标准的结束点评分和化合物 2 所得的 AUC 评分 / 结束点评分。
     在 0.1mg/kg 剂量下， 化合物 1 于标准临床评分值 ( 以 AUC 表示或者以第 1 天至第
     14 天的差表示 ) 中显示统计学上的显著改进。此外， 分别在 0.3mg/kg 和 3mg/kg 剂量观察 到爪肿胀读数和 Larsen 评分中的显著统计学增加。相反， 化合物 2 仅在 10mg/kg 剂量的标 准临床评分值 ( 在第 14 天 ) 中观察到显著统计学增加。此外， 在 30mg/kg 剂量观察到脚爪 肿胀读数和 Larsen 评分中的显著统计学增加。 因此， 当比较口服剂量时， 化合物 1 在功效方 面显示高于化合物 2 的 100 倍改善。具体地讲， 化合物 1 在 3mg/kg 的剂量下， 在所有测定 中观察到统计学上地显著改善， 然而， 更高剂量的化合物 2 才能引起临床评分方面的统计 学上的显著改善。这种体内效能方面的改善不是由于提高化合物的浓度引起的， 因为显而 易见， 与 10mg/kg/ 天的化合物 2 相比， 化合物 1 在 0.1、 0.3 和 1mg/kg/ 天时的 AUC(0-24h) 更低。
     实施例 3.2 脓毒性休克模型
     注射脂多糖 (LPS) 诱导可溶性肿瘤坏死因子 (TNF-α) 快速释放入外周。该模型 用于体内分析 TNF 释放的有希望的阻断剂。
     将每组 6 只 BALB/cJ 雌性小鼠 (20g) 在设定的剂量下口服处理一次。30 分钟后， 腹膜内注射 LPS(15μg/kg ； 大肠杆菌血清型 0111:B4)。 90 分钟后， 将小鼠安乐死并且采血。 用市售的 ELISA 试剂盒测定循环 TNF-α 水平。将地塞米松 (5μg/kg) 用作参考抗炎化合 物。所选的化合物是在一个或多个剂量下试验的， 例如口服 3 和 / 或 10 和 / 或 30mg/kg。 在口服 30mg/kg 剂量下化合物 1、 2 和 10 是有活性的。
     实施例 3.3 MAB 模型
     MAB 模型提供快速评价治疗对 RA- 样炎性响应的调节 (Kachigian LM.Nature Protocols(2006)2512-2516 ： Collagen antibody-induced arthritis( 胶原抗体诱导的关 节炎 ))。将 DBA/J 小鼠静脉内注射直接对抗胶原 II 的 mAbs 的混合剂。1 天后， 开始用化 合物处理 ( 介质 ： 10％ (v/v)HPβCD)。3 天后， 小鼠接受腹膜内注射 LPS(50μg/ 小鼠 )， 导 致炎症的快速发作。继续用化合物处理， 直至 mAB 注射后 10 天。通过测定爪肿胀并且记录 每只爪的临床得分来表示炎症。四肢的累积临床关节炎得分表示炎症的严重性。评分系统 应用于各肢， 应用 0-4 的等级， 4 表示最严重的炎症。
     0 无症状
     1 轻度， 但是一种类型的关节 ( 例如踝或腕 ) 出现明显的发红和肿胀， 或者明显的 发红和肿胀限于单个指 ( 趾 )， 不管受侵袭指 ( 趾 ) 的数目为何
     2 两种或多种类型的关节出现中度发红和肿胀
     3 整个爪 ( 包括指 ( 趾 )) 出现严重发红和肿胀
     4 最重发炎的肢， 涉及多个关节
     实施例 3.4 肿瘤学模型
     Wernig 等人， Cancer Cell 13， 311， 2008 和 Geron 等人， Cancer Cell 13， 321， 2008 描述了用于确证小分子对 JAK2- 驱动的骨髓增殖性疾病的作用的体内模型。
     实施例 3.5 小鼠 IBD 模型
     Wirtz 等人， 2007 描述了用于确证小分子对 IBD 的作用的体外和体内模型。
     实施例 3.6 小鼠哮喘模型
     Nials 等人， 2008 ； Ip 等人， 2006 ； Pernis 等人， 2002 ； Kudlacz 等人， 2008 描述了用 于确证小分子对哮喘的作用的体外和体内模型。
     实施例 4 ： 药物动力学、 DMPK 和毒性模型
     实施例 4.1 热力学溶解度
     在室温下， 在玻璃瓶中将 1mg/mL 的受试化合物溶液配制在 0.2M 磷酸盐缓冲液 pH 7.4 或 0.1M 柠檬酸盐缓冲液 pH 3.0 中。
     在室温下， 将样品在旋转驱动器 STR 4(Stuart Scientific， Bibby) 中以 3.0 速度 旋转 24 小时。
     24 小时后， 将 800μL 样品转移至 eppendorf 管中并且以 14000rpm 离心 5 分钟。 然后将 200μL 样品上清液转移至 MultiscreenR 溶解度板 (Millipore， MSSLBPC50) 中， 将 上清液通过多头抽真空装置过滤 (10-12” Hg) 至干净的 Greiner 聚丙烯 V 底 96- 孔板 ( 目 录号 651201) 中。将 5μL 滤液稀释在 95μL(F20) 与在包含标准曲线的板中温育时所用的 缓冲液相同的缓冲液中 (Greiner， 目录号 651201)。
     化合物的标准曲线新配制在 DMSO 中， 从 10mM DMSO 储备液开始， 以因子 2 稀释在 DMSO(5000μM) 中， 然后进一步稀释在 DMSO 中， 至多 19.5μM。 然后将 3μL 由 5000μM 产生 的稀释系列转移至 97μL 乙腈 - 缓冲液混合物 (50/50) 中。终浓度范围是 2.5 至 150μM。
     将板用密封材料 (MA96RD-04S， www.kinesis.co.uk) 密封， 将样品在室温下、 在 LCMS(ZQ 1525， Waters) 上、 在优化条件下测定， 应用 Quanoptimize 测定分子的适合质量。
     将样品在流速为 1mL/ 分钟的 LCMS 上分析。溶剂 A 是 15mM 氨， 溶剂 B 是乙腈。样 品在 Waters 的 XBridge C18 3.5μM(2.1×30mm) 柱上、 在正离子喷雾法下展开。溶剂梯度 是 2 分钟的总运行时间， 范围为 5％ B 至 95％ B。
     用 Masslynx 软件包分析峰面积， 并且将样品的峰面积对标准曲线作图以获得化 合物的溶解度。
     溶解度值以 μM 或 μg/mL 报告。
     实施例 4.2 水溶解度
     从 10mM 在 DMSO 中的储备液开始， 在 DMSO 中制备化合物的系列稀释。将稀释系列 转移至 96 NUNC Maxisorb 板 F 底 ( 目录号 442404) 中， 在室温下加入 0.2M 磷酸盐缓冲液 pH 7.4 或 0.1M 柠檬酸盐缓冲液 pH 3.0。
     终浓度范围为 200μM 至 2.5μM， 5 个等比稀释步骤。 最终的 DMSO 浓度不超过 2％。 在每个 96- 孔板的角落点中加入 200μM 芘， 并且用作显微镜上校准 Z 轴的参考点。
     将分析板密封并且在 37℃下温育 1 小时， 同时以 230rpm 振摇。 然后将板在白光显 微镜下扫描， 得到每个浓度沉淀物的单独图片。 对沉淀物进行分析并且转换成数值， 将其绘 制成图。化合物出现完全溶解的第一个浓度是下面报告的浓度， 但是真实的浓度位于该浓 度与一个更高的稀释步骤的浓度之间。
     溶解度值以 μg/mL 报告。
     表 VII
     化合物编号 1 pH 3.0(μg/mL) ＞ 85 pH 7.4(μg/mL) ＞ 8540CN 102482273 A 2 10
     说＞ 38明书＞ 38 ＞ 87.939/47 页＞ 87.9实施例 4.3 血浆蛋白结合 ( 平衡透析 )
     将 10mM 化合物的 DMSO 储备液以因子 5 稀释在 DMSO 中。将该溶液进一步稀释在 新鲜解冻的人、 大鼠、 小鼠或狗血浆 (BioReclamation INC) 中， 终浓度为 10μM， 最终 DMSO 浓度为 0.5％ (5.5μL 在 1094.5μL 血浆中， 在 PP-Masterblock 96- 孔 (Greiner， 目录号 780285) 中 )。
     制备含嵌入物的 Pierce Red Device 板 (ThermoScientific， 目录号 89809)， 在缓 冲液槽中装入 750μL PBS 并且在血浆槽中装入 500μL 加标血浆。将板在 37℃下温育 4 小时并以 230rpm 振摇。温育后， 将两个槽中 120μL 转移至 96- 孔圆底、 PP 深孔板 (Nunc， 目录号 278743) 的 360μL 乙腈中并用铝铂盖密封。将样品混合并且在冰上放置 30 分钟。 然后将该板在 4℃下以 1200rcf 离心 30 分钟， 将上清液转移至 96- 孔 v 底 PP 板 (Greiner， 651201) 中， 用于 LCMS 分析。
     将该板用 www.kinesis.co.uk 的密封材料 (MA96RD-04S) 密封， 将样品在室温下、 在 LCMS(ZQ 1525， Waters) 上、 在优化条件下进行测定， 应用 Quanoptimize 测定分子的适合 质量。
     将样品在流速为 1mL/ 分钟的 LCMS 上分析。溶剂 A 是 15mM 氨， 溶剂 B 是乙腈。样 品在 Waters 的 XBridge C18 3.5μM(2.1×30mm) 柱上、 在正离子喷雾法下展开。溶剂梯度 是 2 分钟的总运行时间， 范围为 5％ B 至 95％ B。
     缓冲液槽和血浆槽中化合物的峰面积被认为是 100％化合物。结合血浆的百分数 由这些结果产生并且作为结合血浆的百分数报告。
     通过显微镜检查 PBS 中最终试验浓度的化合物的溶解度， 以确定是否观察到沉 淀。
     表 VIII
     化合物编号 1 2 10 11
     人 (％ ) 76.4 70.5 n/a 91.25 大鼠 (％ ) 65.7 64.5 51 76.5实施例 4.4 微粒体的稳定性
     将 DMSO 中的 10mM 化合物的储备液在 96 深孔板 (Greiner， 目录号 780285) 中、 在 182mM 磷酸盐缓冲液 pH 7.4 中稀释 1000 倍， 在 37℃预温育。
     将 40μL 去 离 子 水 加 入 至 聚 丙 烯 Matrix 2D 条 形 码 标 记 的 存 储 管 (Thermo Scientific) 的孔中， 在 37℃预温育。在 182mM 磷酸盐缓冲液 pH 7.4 中配制葡萄糖 -6- 磷酸 - 脱氢酶 (G6PDH) 工作储 备液， 并且在应用前放置在冰上。在去离子水中配制包含 MgCl2、 葡萄糖 -6- 磷酸和 NADP+ 的辅因子， 在应用前放置在冰上。
     配制包含目标物种 ( 人、 小鼠、 大鼠、 狗 ) 的肝微粒体 (Xenotech)、 先前描述的 G6PDH 和辅因子的最终工作溶液， 将该混合物在室温下温育不超过 20 分钟。
     将 30μL 预热的化合物稀释液加入至 Matrix 管的 40μL 预热的水中， 加入 30μL 微粒体混合物。最终反应浓度是 3μM 化合物、 1mg 微粒体、 0.4U/mL GDPDH、 3.3mM MgCl2、 3.3mM 葡萄糖 -6- 磷酸和 1.3mMNADP+。
     为测定零时间点的剩余化合物的百分数， 在加入微粒体混合物前向孔中加入 MeOH 或 ACN(1 ∶ 1)。将板用 Matrix Sepra sealsTM(Matrix， 目录号 4464) 密封并且震摇数秒， 确保所有组分完全混合。
     将没有终止的样品在 37℃、 300rpm 下温育， 温育 1 小时后， 用 MeOH 或 ACN(1 ∶ 1) 终止反应。
     终止反应后， 将样品混合并且在冰上放置 30 分钟以沉淀蛋白质。然后将板在 4℃ 下以 1200rcf 离心 30 分钟， 并且将上清液转移至 96- 孔 v 底 PP 板 (Greiner， 651201) 中用 于 LCMS 分析。
     将这些板用 www.kinesis.co.uk 的密封材料 (MA96RD-04S) 密封， 并且将样品在室 温下、 在 LCMS(ZQ 1525， Waters) 上、 在优化条件下测定， 应用 Quanoptimize 测定母分子的 适合的质量。
     将样品在流速为 1mL/ 分钟的 LCMS 上分析。溶剂 A 是 15mM 氨， 溶剂 B 是甲醇或乙 腈， 这取决于所用的终止溶液。样品在 Waters 的 XBridgeC18 3.5μM(2.1×30mm) 柱上、 在 正离子喷雾法下展开。溶剂梯度是 2 分钟的总运行时间， 范围为 5％ B 至 95％ B。
     0 时间点的母化合物的峰面积被认为是 100％剩余。1 小时温育后剩余百分数是 从 0 点时间计算的， 计算成剩余百分数。通过显微镜检查缓冲液中最终试验浓度的化合物 的溶解度， 报告结果。
     微粒体稳定性的数据表示为 60 分钟后剩余化合物总量的百分数。
     表 IX
     化合物编号 1 2 10 11
     人 (％ ) 87.2 73 102 51 大鼠 (％ ) 65.6 38 89 26实施例 4.5 Caco2 渗透率
     如下所述进行双向 Caco-2 分析。Caco-2 细胞取自欧洲细胞培养物保藏中心 (European Collection of Cell Cultures)(ECACC， 目录号 86010202)， 细胞培养 21 天后在24- 孔 Transwell 板 (Fisher TKT-545-020B) 中应用。
     将 2×105 个 细 胞 / 孔 接 种 在 含 有 DMEM+GlutaMAXI+1 ％ NEAA+10 ％ FBS(FetalCloneII)+1％ Pen/Strep 的平面培养基中。每隔 2-3 天更换培养基。
     将试验和参考化合物 ( 普萘洛尔和罗丹明 123 或长春碱， 均购自 Sigma) 配制在 含有 25mM HEPES(pH7.4) 的 Hanks 平衡盐溶液中， 并且在浓度为 10μM( 最终 DMSO 浓度为 0.25％ ) 下加入至 Transwell 板装置的顶端槽 (125μL) 或底外侧槽 (600μL) 中。
     将 50μM 荧光黄 (Sigma) 加入至所有孔的供体缓冲液中， 通过监测荧光黄渗透来 评价细胞层的完整性。由于荧光黄 (LY) 不能自由透过脂类屏障， 所以高度的 LY 转运表示 细胞层较差的完整性。
     在 37℃下温育 1 小时， 同时以 150rpm 在定轨摇床上震摇后， 从顶端槽 (A) 和底部 槽 (B) 中各取出 70μL， 加入至在 96 孔板中的 100μL 含有分析内标 (0.5μM 卡马西平 ) 的 50 ∶ 50 乙腈∶水溶液中。
     在包含取自底外侧和顶侧的 150μL 液体的干净 96 孔板中用 Spectramax Gemini XS(Ex 为 426nm， Em 为 538nm) 进行荧光黄测定。
     通过高效液相色谱 / 质谱 (LC-MS/MS) 测定样品中化合物的浓度。
     通过下面关系式计算表观渗透率 (Papp) 值 ：
     Papp ＝ [ 化 合 物 ] 受 体 最 终 ×V 受 体 /([ 化 合 物 ] 供 体 最 初 ×V 供 体 )/T 温 育 ×V 供 体 / 表 面 积 ×60×10-6cm/s
     V ＝槽的体积
     Tinc ＝温育时间
     表面积＝ 0.33cm2
     应用 Papp B ＞ A/Papp A ＞ B 的比值计算流出比， 该流出比为顶端细胞表面主动流出 的一个指标。
     应用下面分析接受标准 ：
     普萘洛尔 ： Papp(A ＞ B) 值≥ 20(×10-6cm/s)
     罗丹明 123 或长春碱 ： Papp(A ＞ B) 值＜ 5(×10-6cm/s) 并且流出比≥ 5。
     荧光黄渗透率 ： ≤ 100nm/s
     表X
     化合物编号 Papp A ＞ B (x10-6cm/sec) 1 2 10 11 3.33 25 0.05 36.5 15.7 0.95 97.6 0.9 流出率实施例 4.6 啮齿动物中的药物代谢动力学研究
     4.6.1 动物
     Sprague-Dawley 大鼠 ( 雄性， 5-6 周龄 ) 获自 Janvier( 法国 )。治疗前将大鼠驯 化至少 7 天， 并进行 12 小时的明 / 暗周期 (0700-1900)。温度维持在大约 22℃， 无限制提 供食物和水。施用化合物 1 和 2 前两天， 在异氟烷麻醉条件下， 对大鼠进行手术， 以在颈静 脉放置导管。手术后， 使大鼠单独居住。口服给药前 16 小时和给药后 6 小时， 大鼠不能进 食。水无限制提供。
     4.6.2 药代动力学研究
     对于静脉内途经， 将化合物配制在 PEG200/ 生理盐水中， 对于口服途经， 将化合物 配制在 0.5％甲基纤维素 ( 化合物 1 和 2) 和 10％羟丙基 -β- 环糊精 pH 3( 化合物 11) 中。 在 5ml/kg 给药体积条件下， 将受试化合物以 5mg/kg 单独食管管饲法口服给药， 在 5ml/kg 给药体积条件下， 以 1mg/kg 经尾静脉推注静脉内给药。每组包括 3 只大鼠。对于化合物 1 和 2， 经颈静脉用肝素锂作为抗凝剂、 在下列时间点采集血样 ： 0.05、 0.25、 0.5、 1、 3、 5和8小 时 ( 静脉内途经 ) 和 0.25、 0.5、 1、 3、 5、 8 小时和 24 小时 ( 口服途经 )。对于化合物 11， 血样 是经后眼眶窦用肝素锂作为抗凝剂、 在下列时间点采集 ： 0.25、 1、 3 和 6 小时 ( 口服途经 )。 将全血样品以 5000rpm 离心 10 分钟， 并且将产生的血浆样品在 -20℃下保存待分析。
     4.6.3 血浆中化合物水平的定量
     通过 LC-MS/MS 方法测定每个受试化合物的血浆浓度， 其中质谱在正离子电喷雾 模式下操作。
     4.6.4 药物动力学参数的测定
     应用 表 XI(United States) 计算药物动力学参数。实施例 4.8 7- 天大鼠毒性研究
     受试化合物的 7- 天口服毒性研究是在 Sprague-Dawley 雄性大鼠中进行的， 以评 价它们中毒的可能性和毒物动力学， 日剂量为 100、 300 和 500mg/kg/ 天， 管饲法， 恒定剂 量 - 体积为 5mL/kg/ 天。
     将受试化合物配制在纯水中的 30％ (v/v)HPβCD 中。对于毒物动力学， 每组包括 5 只主要的 (principal) 雄性大鼠和 3 只随伴 (satellite) 动物。第 4 组以相同的频率、 剂 量体积和通过相同的施用途径给予在水中的 30％ (v/v)HPβCD， 用作介质对照组。
     该研究的目的是测定不产生可鉴别的副作用事件 ( 没有可观察的副作用水 平 -NOAEL) 的最小剂量。
     实施例 4.8 肝细胞稳定性
     McGinnity 等人， Drug Metabolism and Disposition 2008， 32， 11， 1247 中描述了 评价肝细胞中代谢清除率的模型。
     实施例 4.9 QT 延长的易感性
     在 hERG 膜片钳分析中评价 QT 延长的可能性。
     常规完整细胞膜片钳 应用 Pulse v8.77 软件 (HEKA) 控制的 EPC10 放大器记录完整细胞的膜片钳。串 联电阻通常小于 10MΩ 并且补偿大于 60％， 记录没有漏减。电极是 GC150TF 吸管式玻璃制 成的 (Harvard)。
     外部浴溶液包含 ： 135mM NaCl、 5mM KCl、 1.8mM CaCl2、 5mM 葡萄糖、 10mM HEPES， pH 7.4。
     内部贴片吸管溶液包含 ： 100mM Kgluconate、 20mM KCl、 1mMCaCl2、 1mM MgCl2、 5mM Na2ATP、 2mM 谷胱甘肽、 11mM EGTA、 10mM HEPES， pH 7.2。
     药物是应用生物学 MEV-9/EVH-9 快速灌流系统灌注的。
     在 稳 定 表 达 hERG 通 道 的 HEK293 细 胞 上 进 行 所 有 的 记 录。 在 应 用 两 根 铂 棒 (Goodfellow) 固定在记录槽中的 12mm 圆形盖玻片 ( 德国玻璃， Bellco) 上培养细胞。应 用激活脉冲诱发 hERG 电流 ： +40mV， 1000ms， 随后是尾电流脉冲 ： -50mV， 2000ms， 保持电位 是 -80mV。每隔 20 秒应用一次脉冲， 所有试验在室温下进行。
     结果
     当进行所述分析时， 测得的化合物 1 的 IC50 比 150μM 大。
     结论
     本申请中提供的数据表明与结构类似的化合物相比， 化合物 1( 本发明化合物 ) 显 示显著提高的体内效能。 这种提高是出乎意料的， 并且是本领域技术人员不能预测的， 特别 是因为许多结构类似的化合物显示非常类似的体外抗 JAK1 和 JAK2 效能。
     本领域技术人员应该理解上述描述本质上是示例性的和说明性的， 旨在说明本发 明及其优选的实施方案。通过常规试验， 技术人员将意识到所做的没有脱离本发明的精神 的修改和变化是显而易见的。 因此， 本发明旨在不通过以上描述进行定义， 而是通过以下权 利要求和它们的等同描述进行定义。
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     将本说明书中引用的所有出版物 ( 包括但不限于专利和专利申请 ) 引入文中作为 参考， 如同每个单独的出版物都具体并且单独引入文中作为参考， 如同已经进行全部描述。
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     采用或/DRAW 制作本文所示的化学结构。 本文结构中碳、 氧或氮原子上出现的任何开放的化合价表示存在氢原子。 如果结构中存在手性中心但对于该 手性中心没有显示具体的立体化学， 那么则表示该结构包括与手性结构相关的两个对映异 构体。49