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包含血凝素的嵌合流感病毒样颗粒
    发明领域 本申请要求于 2009 年 6 月 24 日提交的美国临时申请 No.61/220,161 的优先权。
     本发明涉及病毒样颗粒。更具体而言， 本发明涉及包含嵌合流感血凝素的病毒样 颗粒和生产嵌合流感病毒样颗粒的方法。
     发明背景
     流感是由呼吸道病毒引起的人死亡的首要原因， 在流感季节， 估计全世界 10 ～ 20％的人口被感染， 每年导致 250 ～ 500,000 的死亡。
     目前抗击人流感的方法是每年接种。疫苗通常是几种毒株的组合， 这些毒株被预 测为即将到来的流感季节的强势毒株 (dominant strain)， 但是每年生产的疫苗剂数量不 足以接种全世界人口。例如， 根据目前的产量加拿大和美国获得足以免疫其约三分之一人 口的疫苗剂， 而仅有 17％的欧洲人口可接种疫苗——在世界范围的流感大流行到来时， 该 产量是不够的。 即使在给定年份中所需的年产量可以某种方式实现， 但强势毒株逐年变化， 因此在一年中的低需求时间大量储备是不实际的。经济、 大规模地生产有效的流感疫苗是 政府和私营企业等极为关注的。
     流感血凝素 (HA) 表面糖蛋白是受体结合蛋白也是膜融合蛋白。它是具有相同亚 基的三聚体， 每个亚基包含两条二硫键连接的多肽 HA1 和 HA2， 它们来自前体 HA0 的蛋白水 解切割， HA0 的 N 端有信号肽序列， HA0 的 C 端有膜锚定序列。形成 HA1 和 HA2 的切割产生 较小多肽 HA2 的 N 端， HA2 的 C 端有膜锚定序列。切割对膜融合活性是必需的， 但对免疫原 性不是必需的。HA2 的 N 端序列被称为 “融合肽” ， 因为类似疏水序列的切割也是其他病毒 融合蛋白所需要的， 并且该序列 20 个残基的合成肽类似物在体外与膜融合。
     一般来说， 球形 “头部” 的表面包含几个柔性环， 其具有良好表征并且可变的抗原 区域， 称为位点 A、 B、 C、 D 和 E( 综述见 Wiley 等， 1987.Annu Rev Biochem 56 ： 365-394)。 已描述了在一些位点 ( 例如 B 和 E) 插入或替换短肽序列以进行免疫研究 (Garcia-Sastré 等 1995.Biologicals 23 ： 171-178)。大小从 53 至 246 个氨基酸的表皮生长因子 (EGF)、 单 链 抗 体 (scFV) 和 IgG 的 Fc 结 构 域 已 被 插 入 到 H7 的 N 端， 并且已成功表达嵌合体 (Hatziioannou 等， 1999.Human Gene Therapy 10 ： 1533-1544)。 最 近， 炭疽芽孢杆菌 (Bacillus anthracis) 保护性抗原的 90 和 140 个氨基酸的结构域已被融合到 H3 的氨基 末端 (Li 等， 2005.J.Virol 79 ： 10003-1002)。Copeland(Copeland 等， 2005.J.Virol 79 ： 6459-6471) 描述了在 H3 柄 (stalk) 上表达 gp120Env HIV 表面糖蛋白， 其中 gp120 结构域 替换了 HA 的整个球状头部。
     已开发了几种重组产物作为候选重组流感疫苗。这些方法集中于甲型流感病毒 HA 和 NA 蛋白的表达、 生产和纯化， 包括用杆状病毒感染的昆虫细胞 (Crawford 等， 1999 Vaccine 17 ： 2265-74 ； Johansson， 1999 Vaccine 17 ： 2073-80)、 病毒载体和 DNA 疫苗构建 体 (Olsen 等， 1997 Vaccine 15 ： 1149-56) 表达这些蛋白质。
     生产用于疫苗目的的非感染性流感病毒株是避免意外感染的一种方法。作为替 代， 已研究了用作培养病毒之替代物的病毒样颗粒 (virus-like particle， VLP)。VLP 模拟
     病毒衣壳的结构， 但缺少基因组， 因此不能复制或提供用于再次感染的工具。 目前流感病毒 VLP 的生产技术依赖于多种病毒蛋白的共表达， 这种依赖性是这些技术的缺点， 因为在大流 行和每年流行的情形中， 响应时间对于接种来说是至关重要的。需要更简单的 VLP 生产系 统 ( 例如依赖于仅一种或几种病毒蛋白的表达而不需要表达非结构病毒蛋白 ) 来加快疫苗 的开发。
     包膜病毒可在从被感染细胞 “出芽” 时获得脂质包膜， 并且从质膜或内部细胞器 的膜获得膜。例如在哺乳动物细胞或杆状病毒细胞系统中， 流感病毒从质膜出芽 (Quan 等 2007 J.Virol 81 ： 3514-3524)。已知仅有几种包膜病毒感染植物 ( 例如， 番茄斑萎病毒 (Tospovirus) 和弹状病毒 (Rhabdovirus) 的成员 )。已知的植物包膜病毒的特征在于从宿 主细胞的内膜出芽， 而不是从质膜出芽。虽然已在植物宿主中生产了少量重组 VLP， 但它们 均不来源于质膜， 这引出了如下问题， 即是否可以在植物中生产质膜来源的 VLP， 包括流感 病毒 VLP。
     在任何系统中形成 VLP 都对蛋白质结构要求很高——改变对应于选定球状结构之 表面环的短序列可能对多肽本身的表达没有太大影响， 但是缺乏证明这些改变影响 VLP 形 成的结构研究。HA 多个区域的协调和结构 ( 例如膜锚定序列， 将球状头部与膜分隔开的三 聚体柄或茎区域 ) 随病毒而进化， 并且可能不能进行类似的改变而不对 HA 三聚体完整性和 VLP 的形成造成损失。
     在 WO 2009/009876 中， 本发明人已描述了流感 HAVLP 的生产。 发明内容 本发明涉及病毒样颗粒。更具体而言， 本发明涉及包含嵌合流感血凝素的病毒样 颗粒和生产嵌合流感血凝素病毒样颗粒的方法。
     本发明的一个目的是提供改进的嵌合流感病毒样颗粒 (VLP)。
     本发明提供了包含嵌合流感 HA 的多肽， 该嵌合流感 HA 包含茎结构域簇 (stem domain cluster， SDC)、 头 部 结 构 域 簇 (head domain cluster， HDC) 和 跨 膜 结 构 域 簇 (transmembrane domain cluster， TDC)， 其中 ： SDC 包含 F’ 1、 F’ 2 和 F 亚结构域 ； HDC 包含 RB、 E1 和 E2 亚结构域 ； TDC 包含 TmD 和 Ctail 亚结构域 ； 并且其中至少一个亚结构域来自 第一流感 HA， 其他亚结构域来自一种或更多种第二流感 HA。第一和第二流感 HA 可独立地 选自 H1、 H3、 H5 和 B。而且， 多肽可以包含信号肽。
     本发明还提供了编码包含嵌合流感 HA 之多肽的核酸， 该嵌合流感 HA 包含茎结构 域簇 (SDC)、 头部结构域簇 (HDC) 和跨膜结构域簇 (TDC)， 其中 ： SDC 包含 F’ 1、 F’ 2和F亚 结构域 ； HDC 包含 RB、 E1 和 E2 亚结构域 ； TDC 包含 TmD 和 Ctail 亚结构域 ； 并且其中至少一 个亚结构域来自第一流感 HA， 其他亚结构域来自一种或更多种第二流感 HA。 ， 核酸还可以 编码除所述 SDC、 HDC 和 TDC 外包含信号肽的多肽。
     还提供了在植物中生产嵌合流感病毒样颗粒 (VLP) 的方法， 该方法包括 ：
     a) 向植物或其部分引入编码嵌合流感 HA 的核酸， 该嵌合流感 HA 包含信号肽、 茎 结构域簇 (SDC)、 头部结构域簇 (HDC) 和跨膜结构域簇 (TDC)， 其中 ： SDC 包含 F’ 1、 F’ 2和 F 亚结构域 ； HDC 包含 RB、 E1 和 E2 亚结构域 ； TDC 包含 TmD 和 Ctail 亚结构域 ； 并且其中至 少一个亚结构域来自第一流感 HA， 其他亚结构域来自一种或更多种第二流感 HA， 和
     b) 在允许核酸表达的条件下孵育植物或其部分， 从而生产 VLP。
     本发明包括上述方法， 其中在引入步骤 ( 步骤 a) 中， 核酸以瞬时方式引入植物中。 或者， 在引入步骤 ( 步骤 a) 中， 核酸被引入植物并且稳定整合。 该方法还可包括步骤 ： c) 收 获宿主并纯化 VLP。
     本发明提供了包含嵌合流感 HA 或编码嵌合流感 HA 之核酸序列的植物或其部分， 该嵌合流感 HA 包含茎结构域簇 (SDC)、 头部结构域簇 (HDC) 和跨膜结构域簇 (TDC)， 其中 ： SDC 包含 F’ 1、 F’ 2 和 F 亚结构域 ； HDC 包含 RB、 E1 和 E2 亚结构域 ； TDC 包含 TmD 和 Ctail 亚结构域 ； 并且其中至少一个亚结构域来自第一流感 HA， 其他结构域来自一种或更多种第 二流感 HA。
     该植物或其部分还可包含核酸， 该核酸包含与在植物中有活性之调控区有效连接 的编码一种或多于一种伴侣蛋白 (chaperone protein) 的核苷酸序列。所述一种或多于一 种伴侣蛋白可选自 Hsp40 和 Hsp70。
     本发明涉及包含嵌合流感 HA 的病毒样颗粒 (VLP)， 该嵌合流感 HA 包含茎结构域 簇 (SDC)、 头部结构域簇 (HDC) 和跨膜结构域簇 (TDC)， 其中 ： SDC 包含 F’ 1、 F’ 2 和 F 亚结 构域 ； HDC 包含 RB、 E1 和 E2 亚结构域 ； TDC 包含 TmD 和 Ctail 亚结构域 ； 并且其中至少一个 亚结构域来自第一流感 HA， 其他结构域来自一种或更多种第二流感 HA。VLP 还可包含植物 特异性的 N- 聚糖或修饰的 N- 聚糖。 还提供了包含有效剂量的上述 VLP 和可药用载体的组合物。
     在本发明的另一方面， 提供了在对象中诱导对流感病毒感染的免疫的方法， 包括 向对象施用 VLP。VLP 可以经口、 皮内、 鼻内、 肌内、 腹腔内、 静脉内或皮下施用给对象。
     可与编码嵌合 HA 蛋白之序列有效连接的调控区包括在植物细胞、 昆虫细胞或酵 母细胞中有效的调控区。这样的调控区可包括质体蓝素调控区、 核酮糖 1， 5- 二磷酸羧化酶 / 加氧酶 (RuBisCO) 调控区、 叶绿素 a/b 结合蛋白 (CAB) 调控区或 ST-LS1 调控区。 其他调控 区包括 5’ UTR、 3’ UTR 或终止子序列。质体蓝素调控区可以是苜蓿质体蓝素调控区 ； 5’ UTR、 3’ UTR 或终止子序列也可以是苜蓿序列。
     本发明提供了嵌合流感 HA 多肽， 由第一流感和第二流感构成， 第一流感和第二流 感可独立地选自 B、 H1、 H2、 H3、 H4、 H5、 H6、 H7、 H8、 H9、 H10、 H11、 H12、 H13、 H14、 H15 和 H16 ； 前提是第一流感和第二流感不是相同的流感类型、 亚型或不具有相同的来源。
     根据本发明的一些方面， 嵌合流感 HA 多肽包含信号肽序列， 所述信号肽序列可选 自天然信号肽序列、 苜蓿 PDI 信号肽序列、 流感 H5 信号肽序列和流感 H1 信号肽序列。
     本发明提供了在能够生产 VLP 的宿主 ( 包括植物、 昆虫或酵母 ) 中生产包含嵌合 流感血凝素 (HA) 的 VLP 的方法， 其包括在宿主中引入编码嵌合流感 HA 的核酸， 和在允许核 酸表达的条件下孵育宿主， 从而生产 VLP， 该嵌合流感 HA 包含茎结构域簇 (SDC)、 头部结构 域簇 (HDC) 和跨膜结构域簇 (TDC)， 其中 ： SDC 包含 F’ 1、 F’ 2 和 F 亚结构域 ； HDC 包含 RB、 E1 和 E2 亚结构域 ； TDC 包含 TmD 和 Ctail 亚结构域 ； 并且其中至少一个亚结构域来自第一 流感 HA， 其他结构域来自一种或更多种第二流感 HA。
     与在昆虫细胞培养物中生产 VLP 相比， 在植物中生产这些颗粒具有若干优点。植 物脂质可刺激特定免疫细胞并增强所诱导的免疫应答。植物的膜由脂质、 磷脂酰胆碱 (PC) 和磷脂酰乙醇胺 (PE) 构成， 并且还包含植物和一些细菌及原生动物所特有的鞘糖脂。鞘脂
     类不常见的原因是它们不是甘油酯 ( 例如 PC 或 PE)， 而是由与含有多于 18 个碳的脂肪酸链 形成酰胺键的长链氨基醇组成。PC 和 PE 以及鞘糖脂可结合哺乳动物免疫细胞 ( 例如抗原 呈递细胞 (APC)， 如树突状细胞和巨噬细胞 ) 和另一些细胞 ( 包括胸腺和肝脏中的 B 淋巴 细胞和 T 淋巴细胞 ) 表达的 CD1 分子。此外， 除植物脂质的存在所具有的潜在佐剂作用外， 植物 N- 聚糖促进抗原呈递细胞捕获糖蛋白抗原的能力对在植物中生产嵌合 VLP 也可以是 有利的。不希望受理论限制， 预计由植物生产的嵌合 VLP 比在其他生产体系中制得的嵌合 VLP 诱导更强的免疫反应， 并且与由活或减毒全病毒疫苗诱导的免疫反应相比， 由这些植物 生产的嵌合 VLP 诱导的免疫反应更强。
     与由全病毒制得的疫苗相比嵌合 VLP 具有优势， 这是因为它们无感染性， 因此限 制性生物防范问题不再像使用感染性全病毒时那么重要， 并且不是生产所必需的。由植物 生产的嵌合 VLP 的另一优点是， 允许表达系统生长在温室或田间， 从而显著地更经济并适 于扩大规模。
     另外， 植物不包含参与合成唾液酸残基以及将其添加到蛋白质中的酶。 VLP 的生产 可以不需要神经氨酸酶 (NA)， 并且不需要共表达 NA 或者用唾液酸酶 ( 神经氨酸酶 ) 处理生 产细胞或提取物以确保 VLP 在植物中的生产。
     该发明概述未必描述本发明的所有发明特征。
     附图简述
     通过参照附图的以下描述， 本发明的这些和其他特征会更加明显， 在附图中 ：
     图 1 显示 HA 亚结构域的示意图。SP ： 信号肽， F’ 1、 F’ 2和F： 融合亚结构域 ； RB ： 受体结合亚结构域， E1 和 E2 ： 酯酶亚结构域， TMD/CT ： 跨膜和胞质尾区亚结构域。图 1B 显示基于质体蓝素的表达盒 ( 构建体号 774、 540、 660、 690、 691、 696) 的示意图， 该表 达盒表达天然和嵌合形式的血凝素 H1A/ 布里斯班 /59/2007(H1/Bri)、 血凝素 H1A/ 新喀 里多尼亚 /20/99(H1/NC) 和血凝素 H5A/ 印度尼西亚 /5/05(H5/Indo)。Plasto pro ： 苜 蓿质体蓝素启动子， Plasto ter ： 苜蓿质体蓝素终止子， SP ： 信号肽， RB ： 受体结合亚结构 域， E1-RB-E2 ： 酯酶和受体结合亚结构域， TMD/CT ： 跨膜和胞质尾亚结构域， PDI ： 苜蓿蛋 白二硫键异构酶。图 1C 显示几种流感 HA 的氨基酸序列比对， 附加了结构比对 ： (B/ 佛罗 里 达 /4/2006(B 佛 罗 里 达 )， SEQ ID NO ： 94(GenBank 登 录 号 ACA33493.1 ； B/ 马 来 西 亚 /2506/2004(B- 马 来 西 亚 )， SEQ ID NO ： 95(GenBank 登 录 号 ABU99194.1) ； H1/Bri(A- 布 里斯班 )， SEQ ID NO ： 96(GenBank 登录号 ADE28750.1 ； H1A/ 所罗门群岛 /3/2006(A-Sol. Isl)， SEQ ID NO ： 97(GenBank 登 录 号 ABU99109.1) ； H1/NC(A-NewCal)， SEQ ID NO ： 98(GenBank 登录号 AAP34324.1 ； H2A/ 新加坡 /1/1957(A- 新加坡 )， SEQ ID NO ： 99(GenBank 登 录 号 AAA64366.1) ； H3A/ 布 里 斯 班 /10/2007(A- 布 里 斯 班 )， SEQ IDNO ： 100(GenBank 登录号 ACI26318.1) ； H3A/ 威斯康星 /67/2005(A-WCN)， SEQ ID NO ： 101(GenBank 登录号 ABO37599.1) ； H5A/ 安徽 /1/2005(A- 安徽 )， SEQ ID NO ： 102(GenBank 登录号 ABD28180.1) ； H5A/ 越南 /1194/2004(A- 越南 )， SEQ ID NO ： 103(GenBank 登录号 ACR48874.1) ； H5-Indo， SEQ ID NO ： 104(GenBank 登录号 ABW06108.1。标示了 F’ 1、 酯酶 1、 受体结合、 酯酶 2、 F′ 2、 肽融合、 TMD/CT 亚结构域之间的界限以及二硫桥。
     图 2 显 示 用 构 建 体 690、 734(SEQ ID NO ： 11)、 696(SEQ ID NO ： 112)( 上 图 ) 和 691(SEQ ID NO ： 113)( 下图 ) 表达的嵌合 HA 所示亚结构域的氨基酸序列。SEQ ID NO ： 111的 1-92 位氨基酸是 H5/Indo 的 F’ 1+E1 结构域 ； 93-263 位氨基酸是 H1/ 布里斯班的 RB 头 部结构域， 264-552 位氨基酸是 H5/Indo 的 E2+F’ 2 结构域。SEQ ID NO ： 112 的 1-92 位氨基 酸是 H5/NC 的 F’ 1+E1 结构域 ； 93-301 位氨基酸是 H5/Indo 的 RB 头部结构域， 302-586 位氨 基酸是 H1/NC 的 E2+F’ 2 结构域。SEQ ID NO ： 113 的 1-42 位氨基酸是 H5/Indo 的 F’ 1结 构域 ； 43-273 位氨基酸是 H1/ 布里斯班的 E1-RB-E2 头部结构域， 274-552 位氨基酸是 H5/ Indo 的 F’ 2 结构域。
     图 3 显示构建体 690 和 734(SEQ ID NO ： 80) 编码区的氨基酸序列， 其包含 H1/Bri 的 RB 亚结构域、 H5/Indo 信号肽和包含 H5/Indo F’ 1、 E1、 E2 和 F 亚结构域的茎结构域复 合体 (stem domain complex， SDC)。
     图 4 显示构建体 691(SEQ ID NO ： 81) 编码区的氨基酸序列， 其包含 H1/Bri 头部结 构域复合体 (HDC)( 包含 E1、 RB、 E2)、 H5/Indo 信号肽和包含 H5/Indo F’ 1、 F’ 2 和 F 亚结 构域的茎结构域复合体 (SDC)。
     图 5 显示构建体 696(SEQ ID NO ： 82) 编码区的氨基酸序列， 其包含 H5/Indo 的 RB 亚结构域、 PDI 信号肽和包含 F’ 1、 E1、 E2 和 F’ 2 的 H1/NC 茎结构域复合体。
     图 6 显示在植物中天然形式、 构建体 774( 包含 H1/Bri)、 构建体 692( 包含 H1/Bri 的头部结构域复合体 (HDC)) 和构建体 690( 包含与 H5/Indo 茎结构域复合体 (SDC) 融合的 H1/Bri 的 RB 亚结构域 ) 的 H1/Bri 表达的免疫印迹分析。对于每个构建体， 分析来自 3 个 独立植物的总蛋白提取物。 对于所分析的每个植物， 上样的蛋白质为 20 微克。 用抗 HA 单克 隆抗体 ( 抗 H1- 布里斯班 ； FII 10-I50) 显示 Western 印迹。构建体 774 表达具有 H1/Bri 天然信号肽的 H1/Bri ； 构建体 690、 691 表达具有 H5/Indo 天然信号肽的 HA。
     图 7 显示天然形式、 构建体 660( 包含 H5/Indo) 或构建体 696( 包含与 H1/NC SDC、 E1 和 E2 亚结构域融合的 H1/Indo RB 亚结构域 ) 的 H5/Indo 表达的免疫印迹分析。对于每 个构建体， 分析来自 3 个独立植物的总蛋白提取物。对于所分析的每个植物， 上样的蛋白质 为 20 微克。用抗 H5 印度尼西亚多克隆抗体 (ITC IT-003-005V) 显示 Western 印迹。构建 体 660 表达具有其天然信号肽的 H5/Indo ； 构建体 696 表达具有 PDI 信号肽的嵌合 HA。
     图 8 显示基于 35SCPMV/HT 的表达盒的示意图， 该表达盒表达天然 ( 构建体 732) 和 嵌合 ( 构建体 733 和 734) 形式的 H1/Bri。构建体 733 包含 PDI 信号肽和 H1/Bri 的 HDC、 SDC 和跨膜结构域复合体 (transmembrane domain complex， TDC)， 构建体 734 包含 H5/Indo 信号肽、 F’ 1、 E1、 E2、 F’ 2、 F 和来自 H1/Bri 的 RB。35S Dro ： CaMV 35S 启动子， NOS ter ： 胭脂氨酸合酶终止子， SP ： 信号肽， RB ： 受体结合亚结构域， E1-RB-E2 ： 酯酶和受体结合亚结 构域， TMD/CT ： 跨膜和胞质尾亚结构域， PDI ： 苜蓿蛋白二硫键异构酶 ； CPMV-HT ： 可过量翻译 (hyper translatable) 的豇豆花叶病毒表达系统的 5’ 和 3’ 元件。
     图 9 显示天然形式、 构建体 732( 包含在基于 35SCPMV/HT 的表达盒控制下的 H1/ Bri)、 构建体 733( 包含与 H1/Bri 融合的 PDI 信号肽 ； 在基于 35SCPMV/HT 的表达盒的控制 下 ) 或构建体 734( 包含与 H5/Indo SDC、 E1 和 E2 亚结构域融合的 H1/Bri RB 亚结构域 ； 在 基于 35SCPMV/HT 的表达盒的控制下 ) 的 H1/Bri 表达的免疫印迹分析。对于每个构建体， 分析来自 3 个独立植物的总蛋白提取物。对于所分析的每个植物， 上样蛋白为 5 微克。用 抗 HA 单克隆抗体检测 (FII 10-I50) 显示 Western 印迹。
     图 10 显示基于 35SCPMV/HT 的表达盒的示意图， 该表达盒表达 H3A/ 布里斯班/10/2007(H3/Bri) 和 B/ 佛罗里达 /4/2006HA(B/Flo) 血凝素。构建体 736 包含与 PDI 信 号肽融合的 H3/Bri。构建体 737 包含与 PDI 信号肽融合的 H3/Bri 和 H5/Indo TMD/CT。构 建体 739 包含与 PDI 信号肽融合的 B/Flo。构建体 745 包含与 PDI 信号肽融合的 B/Flo 和 H5/Indo TMD/CT。35S pro ： CaMV 35S 启动子， NOS ter ： 胭脂氨酸合酶终止子， SP ： 信号肽， RB ： 受体结合亚结构域， E1-RB-E2 ： 酯酶和受体结合亚结构域， TMD/CT ： 跨膜和胞质尾亚结 构域， PDI ： 苜蓿蛋白二硫键异构酶 ； CPMV-HT ： 可过量翻译的豇豆花叶病毒表达系统的 5’ 和 3’ 元件。
     图 11 显示构建体 745 和 737 中的融合边界。HA 序列的起始用锥形头箭头标示。 跨膜结构域的氨基酸为 QILSIYSTVA， ， 其前面是部分胞外结构域的氨基酸。
     图 12 显示嵌合 H5/H3 血凝素 (SEQ ID NO ： 83， 构建体 737) 的氨基酸序列， 其包含 PDI 信号肽、 H3A/ 布里斯班 /10/2007 的胞外结构域和 H5A/ 印度尼西亚 /5/2005 的 TMD/CT。
     图 13 显示嵌合 H5/B 血凝素 (SEQ ID NO ： 84) 的氨基酸序列， 其包含构建体号 745 的开放阅读框所编码的 B/ 佛罗里达 /4/2006 的胞外结构域和 H5A/ 印度尼西亚 /5/2005 的 TMD/CT。
     图 14 显示天然形式、 构建体 739( 包含 PDI-B/Flo) 或构建体 745( 包含与 H5/Indo TDC 融合的 B/Flo HDC 和 SDC) 的 B/Flo 表达的免疫印迹分析。对于每个构建体， 分析来自 3 个独立植物的总蛋白提取物。 对于所分析的每个植物， 上样的蛋白为 20 微克。 用抗 HA B/ 佛罗里达多克隆抗体 (NIBSC 07/356) 显示 Western 印迹。 图 15 显示天然形式、 构建体 736( 包含 PDI sp-H3/Bri) 或构建体 737( 与 H5/Indo TDC 融合的 H3/Bri HDC 和 SDC) 的 H3/Bri 表达的免疫印迹分析。对于每个构建体， 分析来 自 3 个独立植物的总蛋白提取物。对于所分析的每个植物， 上样的蛋白为 20 微克。用抗 H3 布里斯班多克隆抗体 (NIBSC 08/124) 显示 Western 印迹。
     图 16 显示用构建体号 745 侵染之植物的叶蛋白质提取物的体积排阻色谱。对于 每种级分， 显示洗脱级分的相对蛋白含量。在级分 7 至 15 中使用抗 HA B/ 佛罗里达多克隆 抗体 (NIBSC 07/356) 对血凝素进行的免疫检测 (Western 印迹 ) 在图下显示。箭头标示蓝 葡聚糖 2000 的洗脱峰 ( 级分 8)。
     图 17 显示合成片段的核酸序列 (SEQ ID NO ： 52)， 其包含完整 H5(A/ 印度尼西亚 /5/05(H5N1)) 编码区 ( 包含信号肽和终止密码子 )， 在 5’ 侧翼有 HindIII 位点， 在 3’ 侧翼 有 SacI 位点。
     图 18 显示构建体 660 的核酸序列 (SEQ ID NO ： 53)， 构建体 660 是 HA 表达盒， 其 包含苜蓿质体蓝素启动子和 5’ UTR、 H5 型 A/ 印度尼西亚 /5/05(H5N1) 血凝素的编码序列、 苜蓿质体蓝素 3’ UTR 和终止子序列。
     图 19 显示无 TmD 和 Ctail 的野生型 H1(A/ 新喀里多尼亚 /20/99(H1N1))(GenBank 登录号 AY289929) 编码序列的核酸序列 (SEQ ID NO ： 54)。
     图 20 显示合成片段的核酸序列 (SEQ ID NO ： 55)， 该合成片段包含缺少 TmD 和 Ctail 的 H1(A/ 新喀里多尼亚 /20/99(H1N1)) 编码序列。在 5’ 区， 最后几个核苷酸来自 PDI SP 并且包含 BglII 限制性位点， 在 3’ SacI/StuI 双位点位于紧邻终止密码子的下游。
     图 21 显示包含 C-ter H1(A/ 新喀里多尼亚 /20/99(H1N1)) 编码序列 ( 包含 TmD 和 Ctail) 的合成片段的核酸序列 (SEQ ID NO ： 56)， 其从 KpnI 位点至终止密码子 (3’ 侧翼
     是 SacI/StuI 双位点 )。
     图 22 显示来自紫苜蓿 (Medicago sativa) 蛋白二硫键异构酶 mRNA 的核苷酸序列。 GenBank 登录号 Z11499(SEQ ID NO ： 57)。核苷酸 32-103 编码 PDI 信号肽。
     图 23 显示 PromPlasto-PDISP-Plasto 3’ UTR 质粒的核苷酸序列。图 23A 显示 PromPlasto-PDISP(SEQ ID NO ： 58) 的核苷酸序列。图 23B 显示 Plasto 3’ UTR(SEQ ID NO ： 85) 的核苷酸序列。蛋白二硫键异构酶 (PDI) 信号肽序列用下划线表示。用于克隆的 BglII(AGATCT) 和 SacI(GAGCTC) 限制性位点以黑体显示。
     图 24 显示 HA 表达盒的核酸序列 (SEQ ID NO ： 59 ； 构建体 540)， 该表达盒包含苜 蓿质体蓝素启动子和 5’ UTR、 PDI 信号肽和 H1 型 A/ 新喀里多尼亚 /20/99(H1N1) 的编码序 列、 苜蓿质体蓝素 3’ UTR 和终止子序列。来自 A/ 新喀里多尼亚 /20/1999 的 H1 编码序列用 下划线表示。
     图 25 显示合成片段的核酸序列 (SEQ ID NO ： 60)， 其包含完整 H1(A/ 布里斯班 /59/07(H1N1)) 编码区 ( 包含信号肽和终止密码子 )， 在 5’ 侧翼有以 DraIII 位点起始的苜 蓿质体蓝素基因序列 ( 对应于起始 ATG 上游前 84 个核苷酸 )， 3’ 侧翼有 SacI 位点。
     图 26 显示 HA 表达盒的核酸序列 (SEQ ID NO ： 61， 构建体 774)， 该 HA 表达盒包含 苜蓿质体蓝素启动子和 5’ UTR、 H1 型 A/ 布里斯班 /59/07(H1N1) 的血凝素编码序列、 苜蓿 质体蓝素 3’ UTR 和终止子序列。 图 27 显示表达盒号 828(SEQ ID NO ： 62) 的核酸序列， 从 PacI( 启动子上游 ) 至 AscI( 紧邻 NOS 终止子的下游 )。CPMV HT 3’ UTR 序列用下划线表示， 其中突变的 ATG 用黑 体表示。Apa1 限制性位点用下划线和斜体表示。
     图 28 显示嵌合 H5/H1 表达盒的核酸序列 (SEQ ID NO ： 63， 构建体 690)， 该表达盒 包含苜蓿质体蓝素启动子和 5’ UTR、 嵌合血凝素编码序列、 苜蓿质体蓝素 3’ UTR 和终止子序 列。嵌合 HA 编码序列用下划线表示。
     图 29 显示嵌合 H5/H1 表达盒的核酸序列 (SEQ ID NO ： 64， 构建体 691)， 该表达盒 包含苜蓿质体蓝素启动子和 5’ UTR、 嵌合血凝素编码序列、 苜蓿质体蓝素 3’ UTR 和终止子序 列。嵌合 HA 编码序列用下划线表示。
     图 30 显示嵌合 H1/H5 表达盒的核酸序列 (SEQ ID NO ： 65， 构建体 696)， 该表达盒 包含苜蓿质体蓝素启动子和 5’ UTR、 嵌合血凝素编码序列、 苜蓿质体蓝素 3’ UTR 和终止子序 列。嵌合 HA 编码序列用下划线表示。
     图 31 显示 HA 表达盒的核酸序列 (SEQ ID NO ： 66， 构建体 732)， 该 HA 表达盒包 含 CaMV 35S 启动子、 CPMV-HT 5’ UTR、 H1 型 A/ 布里斯班 /59/07(H1N1) 血凝素编码序列、 CPMV-HT 3’ UTR 和 NOS 终止子序列。H1/Bri 的编码序列用下划线标示。
     图 32 显示中间构建体 787 从 ATG 到终止的编码序列的核酸序列 (SEQ ID NO ： 67)。
     图 33 显示 SpPDI H1/Bri 表达盒的核酸序列 (SEQ ID NO ： 68， 构建体号 733)， 该 表达盒包含 CaMV 35S 启动子、 CPMV-HT 5’ UTR、 PDI 信号肽编码序列、 H1 型 A/ 布里斯班 /59/07(H1N1) 血凝素编码序列、 CPMV-HT 3’ UTR 和 NOS 终止子序列。SpPDI H1/Bri 编码序 列用下划线表示。
     图 34 显示嵌合 H5/H1 表达盒的核酸序列 (SEQ ID NO ： 69， 构建体 734)， 该表达盒 包含 CaMV 35S 启动子、 CPMV-HT 5’ UTR、 嵌合血凝素编码序列、 CPMV-HT 3’ UTR 和 NOS 终止
     子序列。嵌合 HA 的编码序列用下划线表示。
     图 35 显示合成片段的核酸序列 (SEQ ID NO ： 70)， 该合成片段包含完整 H3(A/ 布 里斯班 /10/07(H3N2)) 编码区 ( 包含信号肽和终止密码子 )， 5’ 侧翼有以 DraIII 位点起始 的苜蓿质体蓝素基因序列 ( 对应于起始 ATG 上游前 84 个核苷酸 )， 3’ 侧翼有 SacI 位点。
     图 36 显示 HA 表达盒的核酸序列 (SEQ ID NO ： 71， 构建体 736)， 该 HA 表达盒包含 CaMV 35S 启动子、 CPMV-HT 5’ UTR、 PDI 信号肽编码序列、 H3 型 A/ 布里斯班 /10/07(H2N3) 血凝素编码序列、 CPMV-HT3’ UTR 和 NOS 终止子序列。Sp PDI H3/Bris 编码序列用下划线 表示。
     图 37 显示嵌合 H5/H3 表达盒的核酸序列 (SEQ ID NO ： 72， 构建体号 737)， 该表达 盒包含 CaMV 35S 启动子、 CPMV-HT 5’ UTR、 嵌合血凝素编码序列、 CPMV-HT 3’ UTR 和 NOS 终 止子序列。嵌合 HA 的编码序列用下划线表示。
     图 38 显示合成片段的核酸序列 (SEQ ID NO ： 73)， 该合成片段包含完整 HA(B/ 佛 罗里达 /4/06) 编码区 ( 包含信号肽和终止密码子 )， 5’ 侧翼有以 DraIII 位点起始的苜蓿 质体蓝素基因序列 ( 对应于起始 ATG 上游前 84 个核苷酸 )， 3’ 侧翼有 SacI 位点。
     图 39 显示 HA 表达盒的核酸序列 (SEQ ID NO ： 74， 构建体 739)， 该 HA 表达盒包含 CaMV 35S 启动子、 CPMV-HT 5’ UTR、 PDI 信号肽编码序列、 HA 型 B/ 佛罗里达 /4/06 血凝素 编码序列、 CPMV-HT 3’ UTR 和 NOS 终止子序列。Sp PDI B/Flo 编码序列用下划线表示。
     图 40 显示嵌合 H5/B 表达盒的核酸序列 (SEQ ID NO ： 75， 构建体 745)， 该表达盒包 含 CaMV 35S 启动子、 CPMV-HT 5’ UTR、 嵌合血凝素编码序列、 CPMV-HT 3’ UTR 和 NOS 终止子 序列。嵌合 HA 的编码序列用下划线表示。
     图 41 显示编码 Msj1 的核酸序列 (SEQ ID NO ： 76)。
     图 42 显示部分构建体号 R850 的核酸序列 (SEQ ID NO ： 77)， 从 HindIII( 在多克 隆位点中， 启动子上游 ) 至 EcoRI( 紧邻 NOS 终止子的下游 )。HSP40 编码序列用下划线表 示。
     图 43 显示部分构建体号 R860 的核酸序列 (SEQ ID NO ： 78)， 从 HindIII( 在多克 隆位点中， 启动子上游 ) 至 EcoRI( 紧邻 NOS 终止子的下游 )。HSP70 编码序列用下划线表 示。
     图 44 显示部分构建体号 R870 的核酸序列 (SEQ ID NO ： 79)， 从 HindIII( 在多克 隆位点中， 启动子 5’ 上游 ) 至 EcoRI( 紧邻 NOS 终止子的下游 )。HSP40 编码序列用下划线 和斜体表示， HSP70 编码序列用下划线表示。A) 核苷酸 1-4946 ； B) 核苷酸 4947-9493。
     图 45 显示构建体 R472 的示意图。
     图 46 显 示 甲 型 流 感 的 二 硫 桥 模 式。 桥 编 号 ： 1)Cys4HA1-Cys137HA2、 2)Cys60HA1-Cys72HA1 、 3)Cys94HA1-Cys143HA1 、 4)Cys292HA1-Cys318HA1 、 5) Cys144HA2-Cys148HA2 和 6)Cys52HA1-Cys277HA1。甲和乙亚型之间二硫桥的差异 ( 图 47) 用箭头标示。使用成熟 H3 蛋白的编号。
     图 47 显 示 乙 型 流 感 HA 的 二 硫 桥 模 式。 桥 编 号 ： 1)Cys4HA1-Cys137HA2、 2)Cys60HA1-Cys72HA1 、 3)Cys94HA1-Cys143HA1 、 4)Cys292HA1-Cys318HA 1 、 5) Cys144HA2-Cys148HA2 、 6)Cys52HA1-Cys277HA1 、 7)Cys54HA1-Cys57HA1 和 8) Cys178HA1-Cys272HA1。甲和乙亚型之间二硫桥的差异 ( 图 46) 用箭头标示。使用成熟 H3蛋白的编号。
     图 48 显示结构域替换 (swap) 融合连接的示意图。图 48A 显示来自 H1/Bri、 H3/ Bri 和 B/Flo 的 RB 亚结构域与 H5/Indo SDC 的融合， 和 H5/Indo 的 RB 亚结构域与 H1/NC 茎 结构域的融合。图 48B 显示来自 H1/Bri、 H3/Bri 或 B/Flo 的 E1-RB-E2 亚结构域 (HDC) 与 H5/Indo SDC 的融合， 和 H5/Indo HDC 与 H1/NC SDC 的融合。
     图 49A 显示 H1A/ 加利福尼亚 /04/09 的核苷酸序列 (SEQ ID NO ： 86)。苜蓿蛋白 二硫键异构酶信号肽编码序列用下划线表示， 成熟 H1 编码序列用黑体突出显示。图 49B 显 示 H1A/ 加利福尼亚 /04/09 的氨基酸序列 (SEQID NO ： 87)。苜蓿蛋白二硫键异构酶信号肽 序列用下划线表示。
     图 50 显示用未稀释的 AGL1/747 侵染、 与 AGL1/443( 空载体 ) 共侵染和与 AGL1/ R870(HSP40/HSP70) 共侵染后， H5/B 嵌合血凝素 ( 构建体 747， 包含与 H5/Indo TDC 融合的 B/Flo HDC 和 SDC) 表达的免疫印迹分析。对于每个构建体， 分析来自 3 个独立植物的总蛋 白提取物。对于所分析的每个植物， 上样的蛋白为 20 微克。用抗 B/ 佛罗里达多克隆抗体 (NIBSC) 显示 Western 印迹。
     图 51A 显示 2X35S 启动子序列 (SEQ ID NO ： 88) 的核苷酸序列。图 51B 显示构建 体 747(SEQ ID NO ： 93) 从 PacI(35S 启动子上游 ) 至 AscI( 紧邻 NOS 终止子下游 ) 的核苷 酸序列。嵌合 HA 的编码序列用下划线表示。2X35S 启动子序列用斜体表示。 详细描述
     本发明涉及病毒样颗粒。更具体而言， 本发明涉及包含嵌合流感血凝素的病毒样 颗粒和生产嵌合流感病毒样颗粒的方法。
     下面描述的是一个优选的实施方案。
     本发明提供了包含编码嵌合流感血凝素 (HA) 之核苷酸序列的核酸， 其与在植物 中有活性的调控区有效连接。
     此外， 本发明提供了在植物中生产病毒样颗粒 (VLP) 的方法。所述方法包括向植 物或植物部分中引入编码嵌合流感 HA 的核酸序列 ( 与在植物中有活性的调控区有效连 接 )， 并且在允许该核酸表达的条件下孵育植物或植物部分， 从而产生 VLP。
     本发明还提供了包含嵌合流感 HA 的 VLP。可以通过本发明提供的方法生产 VLP。
     “嵌合蛋白” 或 “嵌合多肽” 是指包含来自于两种或多于两种来源的氨基酸序列的 蛋白质或多肽， 例如但不限于， 作为单个多肽融合的两种或更多种流感类型或亚型或者不 同来源的流感。嵌合蛋白或多肽可以包含与剩余多肽或蛋白质相同或异源的信号肽。嵌合 蛋白或嵌合多肽可以作为转录本从嵌合核苷酸序列中转录， 嵌合蛋白或嵌合多肽在合成后 被切割， 并且根据需要结合形成多聚体蛋白。 因此， 嵌合蛋白或嵌合多肽还包括这样的蛋白 质或多肽， 其包含通过二硫桥连接的亚基 ( 即多聚体蛋白 )。例如， 包含来自两种或更多种 来源的氨基酸序列的嵌合多肽可被加工成亚基， 该亚基通过二硫桥连接， 产生嵌合蛋白或 嵌合多肽 ( 见图 46 和 47)。多肽可以是血凝素 (HA)， 每个形成多肽的两条或更多条氨基酸 序列可以从不同的 HA 获得， 以生产嵌合 HA 或嵌合流感 HA。嵌合 HA 还可以包括这样的氨 基酸序列， 其包含在蛋白合成后或过程中被切割的异源信号肽 ( 嵌合 HA 前体蛋白 )。优选 地， 嵌合多肽或嵌合流感 HA 不是天然的。编码嵌合多肽的核酸可以被描述成 “嵌合核酸” 或 “嵌合核苷酸序列” 。包含嵌合 HA 的病毒样颗粒可以被描述成 “嵌合 VLP” 。
     本发明多个实施方案的嵌合流感 HA 可包含茎结构域复合体 (SDC)、 头部结构域复 合体 (HDC) 和跨膜结构域复合体 (TDC)， 其中 SDC、 HDC 或 TDC 中的一个或多于一个亚结构 域来自第一流感 HA 类型、 亚型或者来自一个来源， 并且 SDC、 HDC 或 TDC 中的一个或多于一 个亚结构域来自第二流感 HA 类型、 亚型或者来自第二或不同来源。如本文所述， “SDC” 包 含 F’ 1、 F’ 2 和 F 亚结构域， “HDC” 包含 RB、 E1 和 E2 亚结构域， “TDC” 包含 TmD 和 Ctail 亚 结构域 (TMD/CT ； 参见图 1A、 46 和 47)。
     术语 “病毒样颗粒” (VLP) 或 “VLP” 是指自组装并包含结构蛋白 ( 如流感 HA 蛋白 或嵌合流感 HA 蛋白 ) 的结构。一般来说 VLP 和嵌合 VLP 的形态和抗原性类似于感染中产 生的病毒粒， 但是缺乏足以复制的遗传信息， 因此不具有感染性。VLP 和嵌合 VLP 可以在适 当的宿主细胞 ( 包括植物宿主细胞 ) 中生产。从宿主细胞中提取后， 在适当条件下分离并 进一步纯化后， VLP 和嵌合 VLP 可以作为完整结构被纯化。
     本发明的产生于流感来源蛋白的嵌合 VLP 或 VLP 不包含 M1 蛋白。已知 M1 蛋白结 合 RNA(Wakefield and Brownlee， 1989)， 而 RNA 是 VLP 制备时的污染物。在嵌合 VLP 产品 获得监管批准时， 不希望存在 RNA， 因此缺失 RNA 的嵌合 VLP 制剂是有利的。
     本发明的嵌合 VLP 可以在特征为缺少使蛋白质唾液酸化之能力的宿主细胞中产 生， 所述宿主细胞如植物细胞、 昆虫细胞、 真菌和其他生物 ( 包括海绵动物、 腔肠动物、 环节 动物、 节肢动物、 软体动物、 线形动物 (nemathelminthea)、 trochelmintes、 扁形动物、 毛颚 动物、 触手动物、 衣原体、 螺旋体、 革兰氏阳性细菌、 蓝细菌、 古细菌等。参见例如 Gupta 等， 1999.Nucleic Acids Research 27 ： 370-372 ； Toukach 等， 2007.NucleicAcids Research 35 ： D280-D286 ； Nakahara 等， 2008.Nucleic Acids Research 36 ： D368-D371。如本文所述 生产的 VLP 通常不含有神经氨酸酶 (NA)。然而， 如果期望获得包含 HA 和 NA 的 VLP， 可以将 NA 与 HA 共表达。
     本发明还提供包含从表达嵌合 HA 的细胞的质膜获得脂质包膜的嵌合 HA 的 VLP。 例如， 如果嵌合 HA 在基于植物的系统中表达， 那么得到的 VLP 可从该植物细胞的质膜获得 脂质包膜。
     一般而言， 术语 “脂质” 是指脂溶性的 ( 亲脂性 ) 天然分子。根据本发明的一些方 面在植物中生产的嵌合 VLP 可以与植物来源的脂质形成复合物。植物来源的脂质可以是脂 双层的形式， 并且还可以包含包裹 VLP 的包膜。 植物来源的脂质可以包含生产 VLP 之植物的 质膜脂质组分， 包括磷脂， 三、 二和单甘油酯， 以及脂溶性固醇或包含固醇的代谢物。 实例包 括磷脂酰胆碱 (PC)、 磷脂酰乙醇胺 (PE)、 磷脂酰肌醇、 磷脂酰丝氨酸、 鞘糖脂、 植物固醇或 其组合。植物来源的脂质还可称为 “植物脂质” 。植物固醇的例子包括菜油甾醇、 豆甾醇、 麦 角甾醇、 菜籽甾醇、 Δ-7- 豆甾醇、 Δ-7- 燕麦甾醇、 daunosterol、 谷甾醇， 24- 甲基胆固醇、 胆固醇或 β- 谷甾醇——参见例如， Mongrand 等， 2004。本领域技术人员应理解细胞质膜 的脂质成分可随获得细胞的细胞或生物或物种的培养或生长条件而异。一般而言， β- 谷 甾醇是最丰富的植物甾醇。
     细胞膜通常包含脂双层以及多种功能的蛋白质。 在脂双层中可发现局部集中的特 定脂质， 称为 “脂筏 (lipid raft)” 。鞘酯和固醇中富含这些脂筏微结构域。不希望受理论 限制， 脂筏可在胞吞和胞吐作用、 病毒或其他感染原的进入或逸出、 细胞间信号转导、 与细 胞或生物的其他结构组分 ( 例如细胞内和细胞外基质 ) 的相互作用中起重要作用。本发明包括包含嵌合 HA 的 VLP， 其中 HA 的亚结构域可以从可感染人的任何类型、 亚型的流感病毒中获得， 包括例如 B、 H1、 H2、 H3、 H4、 H5、 H6、 H7、 H8、 H9、 H10、 H11、 H12、 H13、 H14、 H15 和 H16 类型或亚型。在一些实施方案中， 流感病毒可以是 H1、 H3、 H5 或 B 类型或亚 型。H1、 H3、 H5 或 B 类型或亚型的非限制性例子包括 A/ 新喀里多尼亚 /20/99 亚型 (H1N1) ( “H1/NC” ； SEQ ID NO ： 56)、 H1A/ 加利福尼亚 /04/09 亚型 (H1N1)(″ H1/Cal″； SEQ ID NO ： 86)、 A/ 印度尼西亚 /5/05 亚型 (H5N1)(“H5/Indo” )、 A/ 布里斯班 /59/2007(“H1/Bri” ) 和 B/ 佛罗里达 /4/2006(“B/Flo” ) 和 H3A/ 布里斯班 /10/2007(“H3/Bri” )。并且， 嵌 合 HA 可以包含分离自一种或更多种现有或新鉴定流感病毒的一种或更多种血凝素亚结构 域， 。
     本发明还涉及感染其他哺乳动物或宿主动物的流感病毒， 所述动物如人、 灵长类、 马、 猪、 鸟类、 水禽、 候鸟、 鹌鹑、 鸭、 鹅、 家禽、 鸡、 骆驼、 犬科动物、 狗、 猫科动物、 猫、 虎、 豹、 麝 猫、 水貂、 石貂、 雪貂、 宠物、 家畜、 小鼠、 大鼠、 海豹、 鲸等。一些流感病毒可以感染超过一种 宿主动物。
     对于流感病毒， 本文所用术语 “血凝素” 或 “HA” 是指流感病毒颗粒的结构糖蛋白。 流感血凝素的结构已有深入的研究， 并且显示高度保守的二级、 三级和四级结构。即使氨 基酸序列变化仍观察到此结构保守性 ( 参见例如 Skehel 和 Wiley， 2000 Ann Rev Biochem 69 ： 531-69 ； Vaccaro 等 2005， 通过引用并入本文 )。编码 HA 的核苷酸序列是公知的并 且可获得， 参见例如 BioDefense and Public Health base( 例如 URL ： biohealthbase. org/GSearch/home.do ？ decorator ＝ Influenza) 或美国国立生物技术信息中心 (NCBI ； 参 见 URL ： ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez ？ db ＝ nuccore&cmd ＝ search&term ＝ influenza)， 两者均通过引用并入本文。
     HA 单体可进一步分为 3 个功能性结构域——茎结构域或茎结构域簇 (SDC)、 球状 头部结构域或头部结构域簇 (HDC) 和跨膜结构域簇 (TDC)。SDC 包含 4 个亚结构域， 融合 肽 F、 F’ 1 和 F’ 2( 该亚结构域一般可以称为 “骨架” )。TDC 包含两个亚结构域， 跨膜 (TmD) 和 C 端尾部 (CT)。HDC 包含三个亚结构域， 残留酯酶结构域 E1’ 和 E2 以及受体结合结构域 RB。SDC 和 HDC 可以统称为 “胞外结构域” 。Ha 等 2002(EMBO J.21 ： 865-875 ； 通过引用并入 本文 ) 发表的文献根据 X 射线结晶结构， 阐明了几个流感亚型中 SDC 和 HDC 多种亚结构域 的相对定位。图 1A 显示与 HA1 和 HA2 多肽 N 端和 C 端相关的亚结构域示意图。图 1C 提供 多种流感亚型的标示的结构比对。
     流感病毒血凝素中允许氨基酸变化。该变化提供不断被鉴定的新毒株。新毒株之 间感染性可以有差异。但是， 保持了血凝素三聚体的形成， 其随后形成 VLP。因此本发明提 供了包含嵌合 HA 的血凝素氨基酸序列或编码在植物中形成 VLP 的嵌合血凝素氨基酸序列 的核酸， 并且包括已知序列和可产生的变体 HA 序列。本发明还涉及包含 TDC、 SDC 和 HDC 的 嵌合 HA 多肽的用途。例如嵌合 HA 蛋白可以是 HA0， 或包含来自两种或更多种流感类型之 HA1 和 HA2 亚结构域的经切割嵌合 HA。嵌合 HA 蛋白可以用于使用植物或植物细胞表达系 统生产或形成 VLP。
     HA0 可以表达并折叠形成三聚体， 然后可组装成 VLP。HA0 的切割产生 HA1 和 HA2 多肽， 它们通过二硫桥连接 ( 参见图 1C、 46 和 47 对二硫桥模式的图解 )。对于感染性病毒 颗粒， 需要前体 HA0 的切割来引发 HA2 的构象变化， 该变化释放融合肽 ( 在 HA2 多肽的 N端 ) 并使其可用于融合细胞和病毒膜。但是， VLP 没有感染性， 不需要切割 HA 形成 HA1 和 HA2( 例如在疫苗生产中 )。未切割的 HA0 前体也组装成三聚体并从质膜出芽形成 VLP 纳米 颗粒。
     HA0 多肽包含几个结构域。 HDC 的 RB 亚结构域在抗原区包含几个环， 称为位点 A-E。 可以中和感染性流感病毒的抗体经常靶向一个或更多个这些位点。残留酯酶亚结构域 (E1 和 E2) 可在融合中发挥作用， 并且可结合 Ca++。F、 F’ 1 和 F’ 2 结构域相互作用并协同形成 茎， 使得 HA 三聚体的头部位于膜之上。TmD 和 CT 可参与折叠 HA 在膜上的锚定。TmD 可在 HA 对脂筏的亲和中发挥作用， 而 CT 可在 HA 的分泌中发挥作用， 并且 CT 亚结构域中存在的 一些半胱氨酸残基可是棕榈酰化的。信号肽 (SP) 还可存在于 HA0 多肽的 N 端。图 2 以及 表 4 和 5 提供了一些流感病毒亚型的 SP、 F’ 1、 F’ 2、 E1、 RB、 E2 和 F 结构域的氨基酸序列的 实例。
     在流感血凝素的表达和 / 或分泌过程中对 N 端信号肽 (SP) 序列进行加工可在 HA 折叠中发挥作用。术语 “信号肽” 一般是指通常见于血凝素多肽 N 端的短 ( 约 5-30 个氨基 酸 ) 氨基酸序列， 其可指导新翻译的多肽转位至特定细胞器， 或者辅助多肽链的特定结构 域相对于其他结构域的定位。血凝素的信号肽将蛋白质的转位靶向至内质网， 已提出该信 号肽辅助近 N 端结构域相对于新生血凝素多肽之膜锚定结构域的定位， 以辅助成熟血凝素 的切割和折叠。
     HA 在宿主细胞内质网 (ER) 膜内的插入、 信号肽切割和蛋白质糖基化是共翻译事 件。HA 的正确折叠需要蛋白质糖基化和至少 6 个链内二硫键的形成 ( 参见图 46 和 47)。 在图 46 中， 显示甲亚型 HA 的每个单体具有 6 个保守二硫桥。通过比较， B HA 的单体 ( 图 47) 具有 7 个二硫桥， 其中 5 个在甲型中有对应结构 ( 综述见 Skehel 和 Wiley， 2000.Ann Rev Biochem 69 ： 531-569 ； 在如 Gamblin 等 2004， Science 303 ： 1838-1842 中描述了阐释 分子内和分子间二硫桥和其他保守氨基酸及其相对位置的结构实例 ； 两者均通过引用并入 本文 )。本领域技术人员应理解， 重要的是制备嵌合 HA 时保证获得类似排列的二硫桥。
     信号肽可以是血凝素中天然存在的， 或者信号肽可与被表达血凝素的初级序列异 源。嵌合 HA 可以包含来自第一流感类型、 亚型或毒株的信号肽， 而其余的 HA 来自一种或多 于一种的不同流感类型、 亚型或毒株。例如 HA 亚型 B H1、 H2、 H3、 H5、 H6、 H7、 H9 或乙型流 感的天然 SP 可用于在植物系统中表达 HA。在本发明的一些实施方案中， SP 可以来自乙型、 H1、 H3 或 H5 流感 ； 或来自亚型 H1/Bri、 H1/NC、 H5/Indo、 H3/Bri 或 B/Flo。
     SP 还可以是非天然的， 例如来自非流感病毒之病毒的结构蛋白或血凝素， 或者来 自植物、 动物或细菌多肽。可以使用的信号肽的非限制性实例是苜蓿蛋白二硫键异构酶 (PDI SP ； 登记号 Z11499 的 32-103 位核苷酸 ； SEQ ID NO ： 34 ； 图 17)， 其具有氨基酸序列 ：
     MAKNVAIFGLLFSLLLLVPSQIFAEE(32-103 位核苷酸 ； SEQ ID NO ： 34)。
     因此本发明提供了包含天然或非天然信号肽的嵌合流感血凝素和编码该嵌合血 凝素的核酸。
     血凝素的正确折叠对蛋白质稳定性、 多聚体形成、 VLP 形成和 HA 的功能 ( 血细胞 凝集能力 ) 等流感血凝素特性可以是重要的。蛋白质折叠可受一个或更多个因素影响， 包 括但不限于 ： 蛋白质序列、 蛋白质相对丰度、 细胞内拥挤程度、 可与折叠的、 部分折叠的或未 折叠的蛋白质结合或瞬时联合的辅因子的可获得性、 一种或更多种伴侣蛋白的存在等。热休克蛋白 (Hsp) 或应激蛋白是伴侣蛋白的实例， 其可参与多种细胞过程， 包括 蛋白质合成、 细胞内运输、 错误折叠的防止、 蛋白质凝集的防止、 蛋白质复合物的组装和去 组装、 蛋白质折叠和蛋白质解聚。这样的伴侣蛋白的实例包括但不限于 Hsp60、 Hsp65、 Hsp 70、 Hsp90、 Hsp100、 Hsp20-30、 Hsp10、 Hsp100-200、 Hsp100、 Hsp90、 Lon、 TF55、 FKBP、 亲环蛋 白 (cyclophilin)、 ClpP、 GrpE、 泛素、 钙联蛋白 (calnexin) 和蛋白质二硫键异构酶 ( 参见 例如 Macario， A.J.L.， Cold Spring Harbor Laboratory Res.25 ： 59-70.1995 ； Parsell， D.A.&Lindquist， S.Ann.Rev.Genet.27 ： 437-496(1993) ； 美国专利 No.5,232,833)。 如本文 所述， 伴侣蛋白 ( 例如但不限于 Hsp40 和 Hsp70) 可以用于保证嵌合 HA 的折叠。
     Hsp70 的 实 例 包 括 来 自 哺 乳 动 物 细 胞 的 Hsp72 和 Hsc73、 来自细菌特别是分 枝 杆 菌 ( 如 麻 风 分 枝 杆 菌 (Mycobacterium leprae)、 结 核 分 枝 杆 菌 (Mycobacterium tuberculosis) 和牛分枝杆菌 (Mycobacterium bovis)( 例如卡介苗 (Bacille-Calmette Guerin) ： 本文中称为 Hsp71)) 的 DnaK。 来自大肠杆菌、 酵母和其他原核生物的 DnaK 以及来 自真核生物 ( 例如拟南芥 (A.thaliana)) 的 BiP 和 Grp78(Lin 等， 2001(Cell Stress and Chaperones 6 ： 201-208))。 Hsp70 的具体实例是拟南芥 Hsp70( 由 Genbank ref ： AY120747.1 编码 )。Hsp70 能够特异性地结合 ATP 以及未折叠的多肽和肽， 从而参与蛋白质折叠和去折 叠和蛋白质复合物的组装和去组装。
     Hsp40 的实例包括来自原核生物 ( 例如大肠杆菌和分枝杆菌 ) 的 DnaJ 和来自真核 生物 ( 例如苜蓿 ) 的 HSJ1、 HDJ1 和 Hsp40(Frugis 等， 1999.Plant Molecular Biology 40 ： 397-408)。Hsp40 的具体实例是紫花苜蓿 (M.sativa)MsJ1(AJ000995.1 或 SEQ ID NO ： 76)。 Hsp40 在蛋白质折叠、 耐热和 DNA 复制等细胞活动中作为分子伴侣起作用。图 41 显示编码 Msj1 的核酸序列 (SEQ ID NO ： 76)。
     在 Hsp 中， Hsp70 及其辅伴侣蛋白 (co-chaperone)Hsp40 参与合成完成前正在翻译 的和新合成的多肽的稳定。不希望受理论的限制， Hsp40 与未折叠 ( 新生或新转移的 ) 多 肽的疏水片区 (patch) 结合， 从而有利于 Hsp70-ATP 复合物与多肽的相互作用。 ATP 水解导 致多肽、 Hsp70 和 ADP 之间形成稳定的复合物并释放 Hsp40。Hsp70-ADP 复合物与多肽之疏 水片区的联合阻止其与其他疏水片区的相互作用， 防止不正确折叠和与其他蛋白质的凝集 ( 综述见 Hartl， FU.1996.Nature 381 ： 571-579)。
     天然伴侣蛋白可能能够利于低水平的重组蛋白质的正确折叠， 然而随着表达水平 的增加， 天然伴侣蛋白的丰富可成为限制因素。农杆菌浸染叶中血凝素的高水平表达可导 致血凝素多肽在胞质溶胶中累积， 而共表达一种或更多种伴侣蛋白 ( 例如 Hsp70、 Hsp40 或 者 Hsp70 和 Hsp40 两者 ) 可降低错误折叠或凝集的血凝素多肽的水平， 并且增加显示出允 许血细胞凝集和 / 或病毒样颗粒形成之三级和四级结构特性的多肽数。SEQ IDNO ： 77 是构 建体号 R850 从 HindIII( 在多克隆位点中， 启动子上游 ) 至 EcoRI( 紧邻 NOS 终止子的下游 ) 的部分核酸序列， 其编码 HSP40( 下划线 )。SEQ ID NO ： 78 是构建体号 R860 从 HindIII( 在 多克隆位点中， 启动子上游 ) 至 EcoRI( 紧邻 NOS 终止子的下游 ) 的部分核酸序列， 其编码 HSP70( 下划线 )。SEQ ID NO ： 79 是构建体号 R870 从 HindIII( 在多克隆位点中， 启动子 5’ 上游 ) 至 EcoRI( 紧邻 NOS 终止子的下游 ) 的部分核酸序列， 其编码 HSP40( 下划线， 斜体 ) 和 HSP70( 下划线 )。
     因此， 本发明还提供了在植物中生产嵌合流感 VLP 的方法， 其中编码嵌合流感 HA的第一核酸与编码伴侣蛋白的第二核酸共表达。 第一和第二核酸可以在同一步骤中引入植 物， 或者可以顺次引入植物。
     可通过例如血细胞凝集测定、 电子显微镜观察或体积排阻色谱来评估 VLP 的结构 和大小。
     对于体积排阻色谱， 可通过以下方法从植物组织中提取全部可溶性蛋白质 ： 将冷 冻粉碎的植物材料在提取缓冲液中匀浆 (Polytron)， 通过离心除去不溶性物质。用 PEG 进 行沉淀也可以是有利的。定量可溶性蛋白质， 并将提取物通过 SephacrylTM 柱。可用蓝葡聚 糖 2000 作为校准标准。在进行色谱后， 可通过免疫印迹进一步分析级分以确定级分中的蛋 白质成分。
     本发明还提供了这样的植物， 其包含编码一种或更多种嵌合流感血凝素的核酸和 编码一种或更多种伴侣蛋白的核酸。
     本发明包括核苷酸序列 ：
     SEQ ID NO ： 63( 构建体 690 ； 包含苜蓿质体蓝素启动子和 5’ UTR、 嵌合血凝素编码 序列、 苜蓿质体蓝素 3’ UTR 和终止子序列的嵌合 H5/H1 表达盒 )， SEQ ID NO ： 63 下划线部 分编码 H5/Indo 的 SP、 F’ 1、 E1-H1/Bri 的 RB-H5/Indo 的 E2、 F’ 2、 F、 TMD/CT ； SEQ ID NO ： 64( 构建体 691 ； 包含苜蓿质体蓝素启动子和 5’ UTR、 嵌合血凝素编码 序列、 苜蓿质体蓝素 3’ UTR 和终止子序列的嵌合 H5/H1 表达盒 )， SEQ ID NO ： 64 下划线部 分编码 H5/Indo 的 SP、 F’ 1-H1/Bri 的 E1、 RB、 E2-H5/Indo 的 F’ 2、 F、 TMD/CT ；
     SEQ ID NO ： 65( 构建体 696 ； 包含苜蓿质体蓝素启动子和 5’ UTR、 嵌合血凝素编码 序列、 苜蓿质体蓝素 3’ UTR 和终止子序列的嵌合 H1/H5 表达盒 )， SEQ ID NO ： 65 下划线部 分编码 PDI SP-H1/NC 的 F’ 1、 E1-H5/Indo 的 RB-H1/NC 的 E2、 F’ 2、 F、 TMD/CT ；
     SEQ ID NO ： 68( 构建体 733 ； 包含 CaMV 35S 启动子、 CPMV-HT5’ UTR、 PDI 信号肽编 码序列、 H1 型 A/ 布里斯班 /59/07(H1N1) 血凝素编码序列、 CPMV-HT 3’ UTR 和 NOS 终止子 序列的 SpPDI H1/Bri 表达盒 )， SEQ ID NO ： 68 的下划线部分编码 PDI SP-H1/BRI 的 F’ 1、 E1、 RB、 E2、 F’ 2、 F、 TMD/CT ；
     SEQ ID NO ： 69( 构建体 734 ； 包含 CaMV 35S 启动子、 CPMV-HT 5’ UTR、 嵌合血凝素 编码序列、 CPMV-HT 3’ UTR 和 NOS 终止子序列的嵌合 H5/H1 表达盒 )。嵌合 HA 的编码序列 用下划线表示， 其编码与 SEQID NO ： 63 相同的嵌合 HA ；
     SEQ ID NO ： 71( 构建体 736 ； 包含 CaMV 35S 启动子、 CPMV-HT 5’ UTR、 PDI 信号肽编 码序列、 H3 型 A/ 布里斯班 /10/07(H2N3) 血凝素编码序列、 CPMV-HT 3’ UTR 和 NOS 终止子 序列的 HA 表达盒 )， SEQ ID NO ： 71 的下划线部分编码 PDI SP-H3/Bri 的 F’ 1、 E1、 RB、 E2、 F’ 2、 F、 TMD/CT ；
     SEQ ID NO ： 72( 构建体 737 ； 包含 CaMV 35S 启动子、 CPMV-HT 5’ UTR、 嵌合血凝素 编码序列、 CPMV-HT 3’ UTR 和 NOS 终止子序列的嵌合 H5/H3 表达盒 )， SEQ ID NO ： 72 下划 线部分编码 PDI SP-H5/Indo 的 F’ 1、 E1、 RB、 E2、 F’ 2、 F、 TMD/CT ；
     SEQ ID NO ： 74( 构建体 739 ； 包含 CaMV 35S 启动子、 CPMV-HT 5’ UTR、 PDI 信号肽 编码序列、 HA 型 B/ 佛罗里达 /4/06 的血凝素编码序列、 CPMV-HT 3’ UTR 和 NOS 终止子序列 的 HA 表达盒 )， SEQ ID NO ： 74 的下划线部分编码 PDI SP-B/Flo 的 F’ 1、 E1、 RB、 E2、 F’ 2、 F、 TMD/CT ；
     SEQ ID NO ： 75( 构建体 734 ； 包含 CaMV 35S 启动子、 CPMV-HT 5’ UTR、 嵌合血凝素 编码序列、 CPMV-HT 3’ UTR 和 NOS 终止子序列的嵌合 H5/B 表达盒 )， SEQ ID NO ： 75 下划线 部分编码 PDI SP-B/Flo 的 F’ 1、 E1、 RB、 E2、 F’ 2、 F-H5/Indo 的 TND/CT。
     本发明还包括在严格杂交条件下与任一 SEQ ID NO ： 63-65、 68、 69 和 71-75 下划线 部分杂交的核苷酸序列。本发明还包括在严格杂交条件下与任一 SEQ ID NO ： 63-65、 68、 69 和 71-75 下划线部分的互补序列杂交的核苷酸序列。这些与 SEQ ID NO ： 63-65、 68、 69 和 71-75 下划线部分或 SEQ ID NO ： 63-65、 68、 69 和 71-75 下划线部分的互补序列杂交的核苷 酸序列编码嵌合血凝素蛋白， 其表达形成嵌合 VLP， 并且当施用给对象时， 嵌合 VLP 诱导抗 体产生。例如， 所述核苷酸序列在植物细胞内表达形成嵌合 VLP， 所述嵌合 VLP 可用于产生 能结合 HA( 包括一种或更多种流感类型或亚型的成熟 HA、 HA0、 HA1 或 HA2) 的抗体， 当施用 给对象时， 所述 VLP 诱导免疫应答。
     严 格 杂 交 条 件 下 的 杂 交 是 本 领 域 已 知 的 ( 参 见 例 如 Current Protocols in Molecular Biology， Ausubel 等 编， 1995 及 增 刊 ； Maniatis 等， Molecular Cloning(A Laboratory Manual)， Cold Spring Harbor Laboratory， 1982 ； Sambrook 和 Russell， Molecular Cloning ： A Laboratory Manual， 第 3 版， 2001 ； 每个均通过引用并入本文 )。一 种该严格杂交条件的实例可以是在 65℃下于 4×SSC 中杂交约 16-20 小时， 然后在 65℃下 于 0.1×SSC 中清洗 1 小时， 或在 65℃下于 0.1×SSC 中清洗两次 ( 每次 20 或 30 分钟 )。或 者， 一个示例性严格杂交条件可以是在 42℃下于 50％甲酰胺， 4×SSC 中过夜 (16 ～ 20 小 时 )， 然后在 65℃下于 0.1×SSC 中清洗 1 小时， 或在 65℃下于 0.1×SSC 中清洗 2 次 ( 每 次 20 或 30 分钟 )， 或者过夜 (16 ～ 20 小时 )， 或者在 65℃下于 Church 水性磷酸盐缓冲液 (7％ SDS ； 0.5M NaPO4 缓冲液 pH 7.2 ； 10mM EDTA) 中杂交， 在 50℃下于 0.1×SSC， 0.1％ SDS 中清洗 2 次 ( 每次 20 或 30 分钟 )， 或者在 65℃下于 2×SSC， 0.1％ SDS 中清洗 2 次 ( 每次 20 或 30 分钟 )。
     此外， 本发明包括这样的核苷酸序列， 其特征为与编码任一 SEQ ID NO ： 63、 SEQ ID NO ： 64、 SEQ ID NO ： 65、 SEQ ID NO ： 68、 SEQ ID NO ： 69、 SEQ ID NO ： 71、 SEQ ID NO ： 72、 SEQ ID NO ： 74、 SEQ ID NO ： 75 下划线部分之嵌合 HA 的核苷酸序列有约 70％、 75％、 80％、 85％、 87 ％、 90 ％、 91 ％、 92 ％、 93 ％、 94 ％、 95 ％、 96 ％、 97 ％、 98 ％、 99 ％、 100 ％或其间任意量的序 列同一性或序列相似性， 其中该核苷酸序列编码血凝素蛋白， 其在表达时形成嵌合 VLP， 该 嵌合 VLP 诱导抗体产生。 例如， 所述核苷酸序列在植物细胞内表达形成嵌合 VLP， 该嵌合 VLP 可用于产生能结合 HA( 包括成熟 HA、 HA0、 HA1 或 HA2) 的抗体， 当施用给对象时， 所述 VLP 诱 导免疫应答。
     “免疫应答” 一般是指获得性免疫系统的应答。获得性免疫系统通常包括体液应答 和细胞介导的应答。体液应答是由 B 淋巴细胞谱系的细胞 (B 细胞 ) 产生的分泌抗体所介 导的免疫方面。分泌抗体结合入侵微生物 ( 例如病毒或细菌 ) 表面上的抗原， 标示它们以 进行破坏。体液免疫一般是指抗体产生和伴随其的过程， 以及抗体的效应物功能， 包括 Th2 细胞活化和细胞因子产生、 记忆细胞形成、 调理素促进胞吞作用、 病原体清除等。术语 “调 节” 是指根据通常知晓或使用的任意测定法 ( 其中一些在本文中举例说明 ) 测定的特定应 答或参数的升高或降低。
     细胞介导的应答是这样的免疫应答， 其不涉及抗体， 而涉及巨噬细胞、 自然杀伤细胞 (NK)、 抗原特异性细胞毒性 T 淋巴细胞的活化， 以及多种细胞因子应答于抗原的释放。 细 胞介导的免疫一般指一些 Th 细胞的活化、 Tc 细胞的活化和 T 细胞介导的应答。细胞介导 的免疫在对病毒感染的应答中尤为重要。
     例如， 可使用 ELISPOT 测定来测量对抗原特异性 CD8 阳性 T 淋巴细胞的诱导 ； 可使 用增殖测定来测量对 CD4 阳性 T 淋巴细胞的刺激。可使用 ELISA 测定来定量抗流感病毒抗 体的效价 ； 还可使用抗同种型抗体 ( 例如抗 IgG、 抗 IgA、 抗 IgE 或抗 IgM) 来测量抗原特异 性或交叉反应性抗体的同种型。实施这些测定的方法和技术是本领域公知的。
     血细胞凝集抑制 (HI 或 HAI) 测定也可用于证明由疫苗或疫苗组合物诱导的抗体 的效力， 所述疫苗或疫苗组合物包含可抑制由重组 HA 所致之红血细胞 (RBC) 凝集的嵌合 HA 或嵌合 VLP。血清样品的血细胞凝集抑制性抗体效价可通过微量滴定 HAI 来评估 (Aymard 等， 1973)。可使用任何来自几个物种的红细胞， 例如马、 火鸡、 鸡等。该测定给出有关 HA 三 聚体在 VLP 表面上组装的间接信息， 证实 HA 抗原位点的正确展示。
     交叉反应性 HAI 滴定还可用于证明免疫应答对与疫苗亚型相关的其他病毒株的 效力。例如， 可以在 HAI 测定中将用包含嵌合血凝素 ( 包含第一流感类型或亚型的 HDC) 之 疫苗组合物免疫的对象的血清与第二株全病毒或病毒颗粒一起使用， 并且测定 HAI 效价。
     不希望受理论限制， HA 结合来自不同动物之 RBC 的能力是由 HA 对 α2， 3 或 α2， 6 键合唾液酸的亲和力以及这些唾液酸在 RBC 表面上的存在来驱动的。马和禽类的流感病 毒 HA 使来自所有几个物种 ( 包括火鸡、 鸡、 鸭、 豚鼠、 人、 绵羊、 马和牛 ) 的红细胞凝集 ； 而人 HA 结合火鸡、 鸡、 鸭、 豚鼠、 人和绵羊的红细胞 (Ito T. 等， 1997， Virology， 卷 227， 493-499 ； 以及 Medeiros R 等， 2001， Virology， 卷 289， 74-85)。
     细胞因子的存在或水平也可以被定量。例如， 用 ELISA( 例如 BD Biosciences OptEIA 试剂盒 ) 测量 IFN-γ 和 IL-4 分泌细胞来表征 T 辅助细胞应答 (Th1/Th2)。 可培养从 对象得到的外周血单核细胞 (PBMC) 或脾细胞， 并分析上清。还可使用标志物特异性荧光标 记和本领域已知方法， 通过荧光激活细胞分选 (fluorescence-activated cell sorting， FACS) 对 T 淋巴细胞定量。
     还可进行微量中和测定来表征对象中的免疫应答， 参见例如 Rowe 等， 1973 的方 法。可通过几种方法得到病毒中和效价， 包括 ： 1) 在对细胞进行结晶紫固定 / 着色之后， 计 数裂解斑 ( 空斑测定 ) ； 2) 显微镜观察培养物中的细胞裂解 ； 3) 对 NP 病毒蛋白 ( 与病毒感 染宿主细胞有关 ) 进行 ELISA 和分光光度检测。
     序列同一性或序列相似性可利用序列比较程序来确定， 例如 DNASIS 所提供的 ( 例 如， 使用但不限于下述参数 ： 空隙罚分 5、 顶部对角线数 (#of top diagonal)5、 固定的空 隙罚分 10、 k 元祖 2、 游隙 10， 窗口大小 5)。然而， 其他用于比较的序列比对方法是本领域 熟知的， 例如 Smith&Waterman 算法 (1981， Adv.Appl.Math.2 ： 482)、 Needleman&Wunsch 算 法 (J.Mol.Biol.48 ： 443， 1970)、 Pearson&Lipman 算法 (1988， Proc.Nat’ l.Acad.Sci.USA 85 ： 2444)， 以及这些算法的计算机执行 ( 例如 GAP、 BESTFIT、 FASTA 和 BLAST(Altschul 等， 1990.J.Mol Biol 215 ： 403-410))， 或者通过人工比对和目视检查。可以对核酸或氨 基酸序列进行比较或比对， 并使用任何现有技术已知的几种软件包测定共有序列， 例如 MULTALIN(Corpet F.， 1988， Nucl Acids Res.， 16(22)， 10881-10890)、 BLAST、 CLUSTAL 等 ； 或者可以人工比对序列并确定序列间的相似度和差异。蛋白质、 融合蛋白或多肽的片段或部分包含含有特定蛋白质或多肽之一部分氨基 酸组成的肽或多肽， 前提是在表达时所述片段可形成嵌合 VLP。 例如所述片段可以包含抗原 性区域、 应激应答诱导区域或含有蛋白质或多肽之功能性结构域的区域。所述片段还可包 含同一总家族的蛋白质共有的区域或结构域， 或者片段可包含足以特异性鉴定其来源全长 蛋白质的氨基酸序列。
     例如， 片段或部分可包含蛋白质全长的约 60％至约 100％或其间任意量， 前提是 在表达时该片段可形成嵌合 VLP。例如， 蛋白质全长的约 60 ％至约 100 ％、 约 70 ％至约 100％、 约 80％至约 100％、 约 90％至约 100％、 约 95％至约 100％， 或其间任意量。或者， 根 据嵌合 HA， 片段或部分可以为约 150 至约 500 个氨基酸或其间任意量， 前提是在表达时所 述片段可形成嵌合 VLP。例如， 根据嵌合 HA， 片段或部分可以为约 150 至约 500 个氨基酸或 其间任意量、 约 200 至约 500 个氨基酸或其间任意量、 约 250 至约 500 个氨基酸或其间任意 量、 约 300 至约 500 个氨基酸或其间任意量、 约 350 至约 500 个氨基酸或其间任意量、 约 400 至约 500 个氨基酸或其间任意量、 约 450 至约 500 个氨基酸或其间任意量， 前提是在表达时 片段可形成嵌合 VLP。例如， 可从嵌合 HA 蛋白的 C 端、 N 端或者 N 和 C 两端去除约 5、 10、 20、 30、 40 或 50 个氨基酸或其间任意量， 前提是在表达时所述片段可形成嵌合 VLP。
     任意给定序列中的氨基酸编号是相对于该特定序列的， 然而， 本领域技术人员可 根据结构和 / 或序列容易地确定序列中特定氨基酸的 “等同性” 。例如， 如果去除了 6 个 N 端氨基酸， 那么这将改变氨基酸的具体编码标识 ( 例如， 相对于蛋白质全长而言 )， 但是不 会改变结构中氨基酸的相对位置。
     本发明描述了 ( 但不限于 ) 在植物、 植物部分或植物细胞中编码嵌合 HA 的核酸的 表达， 以及适于生产疫苗的植物中生产嵌合流感 VLP。这些核酸的实例包括但不限于， 例如 SEQ ID NO ： 63、 SEQ ID NO ： 64、 SEQ ID NO ： 65、 SEQ ID NO ： 68、 SEQ ID NO ： 69、 SEQ ID NO ： 71、 SEQ ID NO ： 72、 SEQ ID NO ： 74、 SEQ ID NO ： 75。
     本发明还提供了在植物、 植物部分或植物细胞中表达编码嵌合 HA 的核酸 ( 例如但 不限于 SEQ ID NO ： 63、 SEQ ID NO ： 64、 SEQ ID NO ： 65、 SEQ ID NO ： 68、 SEQ ID NO ： 69、 SEQ ID NO ： 71、 SEQ ID NO ： 72、 SEQID NO ： 74、 SEQ ID NO ： 75)， 以及在转化的植物细胞中生产包 含重组流感结构蛋白的候选流感疫苗或试剂， 所述重组流感结构蛋白自组装成功能性和免 疫原性的同型大分子蛋白结构， 包括亚病毒流感颗粒和嵌合流感 VLP。
     因此， 本发明提供了嵌合 VLP， 和通过表达单个嵌合包膜蛋白在植物表达系统中生 产嵌合 VLP 的方法。
     编码流感亚型嵌合 HA 的核酸 ( 例如 SEQ ID NO ： 63、 SEQ ID NO ： 64、 SEQ ID NO ： 65、 SEQ ID NO ： 68、 SEQ ID NO ： 69、 SEQ ID NO ： 71、 SEQ ID NO ： 72、 SEQ ID NO ： 74、 SEQ ID NO ： 75) 可以通过使用 HA RNA 通过反转录和聚合酶链式反应 (PCR) 合成。例如， 可以从 H1/ NC、 H1/Bri、 H3/Bri、 B/Flo 或 H5/Indo 中或者从感染了这些或其他流感病毒类型或亚型的 细胞中分离 RNA。对于反转录和 PCR， 可以使用 HA RNA 特异性寡核苷酸引物。另外， 编码嵌 合 HA 的核酸可以使用本领域技术人员已知的方法化学合成。
     本发明还涉及包含编码嵌合 HA 之核酸 ( 如上所述， 其与在植物中有效的调控元件 有效连接 ) 的基因构建体。在植物细胞中有效并可用于本发明的调控元件的实例包括但 不限于质体蓝素调控区 (US 7,125,978 ； 其通过引用并入本文 ) 或核酮糖 1， 5- 二磷酸羧化酶 / 加氧酶 (RuBisCO ； US4,962,028 ； 其通过引用并入本文 )、 叶绿素 a/b 结合蛋白 (CAB ； Leutwiler 等 ； 1986 ； 其通过引用并入本文 )、 ST-LS1( 与光系统 II 的放氧复合物相关， 描述 于 Stockhaus 等 1987、 1989 中 ； 其通过引用并入本文 ) 的调控区。
     本发明的基因构建体还包含组成型启动子， 其指导与启动子有效连接的基因在植 物各部分中表达并在整个植物发育过程中持续表达。 组成型启动子的一个非限制性的实例 是与 CaMV 35S 转录本相关的组成型启动子 ( 例如， Odell 等， 1985， Nature， 313 ： 810-812， 通过引用并入本文 )。
     包含质体蓝素调控区的序列的实例是 SEQ ID NO ： 58 的序列 5’端至编码 PDI 信号肽的下划线序列。调控元件或调控区可增强与其有效连接的核苷酸序列的翻译， 其 中核苷酸序列可编码蛋白质或多肽。调控区的另一实例是源自豇豆花叶病毒 (Cowpea Mosaic Virus， CPMV) 非翻译区的调控区， 其可用于优先翻译与其有效连接的核苷酸序 列。这一 CPMV 调控区用于可过量翻译的 CMPV-HT 系统中， 参见例如 Sainsbury 等， 2008， Plant Physiology 148 ： 1212-1218 ； Sainsbury 等， 2008 Plant BiotechnologyJournal 6 ： 82-92， 两者均通过引用并入本文 )。
     因此， 本发明的一方面提供了包含与编码嵌合流感 HA 之序列有效连接的调控区 的核酸。所述调控区可以是质体蓝素调控元件， 所述嵌合流感 HA 可包含来自 H5/Indo、 H1/ Bri、 H3/Bri、 H1/NC、 B/Flo 流感类型、 亚型或毒株的亚结构域。包含质体蓝素调控元件和嵌 合流感 HA 的核酸序列在本文中通过 SEQ ID NO ： 63 和 64 示例。包含 35S 调控元件和嵌合 流感 HA 的核酸序列在本文中通过 SEQ ID NO ： 68、 69 和 71-75 示例。
     在另一方面， 本发明提供包含 CPMV 调控区和嵌合流感 HA( 包含来自 H5/Indo、 H1/ Bri、 H3/Bri、 H1/NC、 B/Flo 流感类型、 亚型或毒株的亚结构域 ) 的核酸。包含 CPMP 调控元 件和嵌合 HA 的核酸序列在本文中通过 SEQ ID NO ： 66-69 和 71-75 示例。
     在植物中产生的嵌合流感 VLP 从质膜中出芽， 因而嵌合 VLP 的脂质组成反映产生 它们的植物细胞或植物组织类型。根据本发明生产的 VLP 包含两种或多于多种类型或亚型 流感的嵌合 HA， 其与植物来源的脂质复合。植物脂质可刺激特异免疫细胞并增强所诱导的 免疫应答。
     植物脂质如 PC( 磷脂酰胆碱 ) 和 PE( 磷脂酰乙醇胺 ) 以及鞘糖脂可结合哺乳动物 免疫细胞 ( 例如抗原呈递细胞 (APC)， 如树突状细胞和巨噬细胞 ) 和其他细胞 ( 包括胸腺和 肝脏中的 B 淋巴细胞和 T 淋巴细胞 ) 表达的 CD1 分子。( 综述见 Tsuji M.2006 Cell Mol Life Sci 63 ： 1889-98)。CD1 分子在结构上与主要组织相容性复合体 (MHC)I 类分子相似， 其作用是将糖脂抗原呈递给 NKT 细胞 ( 自然杀伤 T 细胞 )。活化后， NKT 细胞激活固有免疫 细胞 ( 例如 NK 细胞和树突状细胞 ) 并且还激活获得性免疫细胞 ( 例如产生抗体的 B 细胞 和 T 细胞 )。
     存在于与脂双层 ( 例如质膜来源的包膜 ) 复合之流感 VLP 中的植物固醇可提供有 利的疫苗组合物。不希望受理论限制， 与脂双层 ( 例如质膜来源的包膜 ) 复合的由植物生 产的 VLP( 包括包含嵌合 HA 的 VLP) 比在其他表达系统中制得的 VLP 可诱导更强的免疫反 应， 并且可与由活或减毒全病毒疫苗所诱导的免疫反应相似。
     因此， 在一些实施方案中， 本发明提供了与植物来源的脂双层复合的 VLP( 包含嵌 合 HA)。在一些实施方案中， 所述植物来源的脂双层可包括 VLP 的包膜。在植物内生产的 VLP 可包含含有植物特异性 N- 聚糖的嵌合 HA。 因此， 本发明还提 供了包含具有植物特异性 N- 聚糖的嵌合 HA 的 VLP。
     此外， 植物中 N- 聚糖的修饰是已知的 ( 参见例如 WO 2008/151440 ； 其通过引用并 入本文 )， 并且可产生含有经修饰 N- 聚糖的嵌合 HA。可得到包含经修饰糖基化模式 ( 例如 岩藻糖基化减少、 木糖基化减少、 或岩藻糖基化和木糖基化二者均减少 ) 之 N- 聚糖的 HA， 或 者可得到含有经修饰糖基化模式的嵌合 HA， 其中蛋白质缺少岩藻糖基化、 木糖基化或两者 皆缺少， 并包含增加的半乳糖基化。此外， 与表达嵌合 HA 的野生型植物相比， 翻译后修饰的 调节 ( 例如末端添加半乳糖 ) 可导致所表达嵌合 HA 的岩藻糖基化和木糖基化降低。
     例如 ( 但不视为限制 )， 合成具有经修饰糖基化模式的嵌合 HA 可通过使目的蛋白 质与编码 β-1， 4- 半乳糖基转移酶 (GalT)( 例如但不限于哺乳动物 GalT 或人 GalT， 然而 也可以使用其他来源的 GalT) 的核苷酸序列共表达来实现。还可将 GalT 的催化结构域与 N- 乙酰氨基葡萄糖基转移酶 (GNT1) 的 CTS 结构域 ( 即胞质尾、 跨膜结构域、 茎区 ) 融合以 产生 GNT1-GalT 杂合酶， 并且该杂合酶可与 HA 共表达。HA 还可与编码 N- 乙酰氨基葡萄糖 基转移酶 III(GnT-III)( 例如但不限于哺乳动物 GnT-III 或人 GnT-III， 还可使用其他来源 的 GnT-III) 的核苷酸序列共表达。另外， 还可使用包含与 GnT-III 融合的 GNT1 之 CTS 的 GNT1-GnT-III 杂合酶。
     因此， 本发明还包括含有嵌合 HA 的 VLP， 所述嵌合 HA 具有经修饰的 N- 聚糖。
     不希望受理论限制， 嵌合 HA 上存在的植物 N- 聚糖可通过促进抗原呈递细胞与 HA 的结合来刺激免疫应答。Saint-jore-Dupas 等 (Trends Biotechnol 25 ： 317-23， 2007) 已 提出使用植物 N 聚糖来刺激免疫应答。此外， VLP 的构象对于抗原呈递可以是有利的， 并且 当与植物来源的脂质层复合时增强 VLP 的佐剂作用。
     “调控区” 、 “调控元件” 或 “启动子” 是指通常 ( 但不总是 ) 位于基因的蛋白质编码 区上游的一部分核酸， 其可由 DNA 或 RNA 或者 DNA 和 RNA 两者构成。当调控区有活性并与 目的基因有效相连或有效连接时， 可导致目的基因的表达。 调控元件可以介导器官特异性， 或控制发育基因或时序基因的活化。 “调控区” 包括启动子元件、 显示启动子基础活性的核 心启动子元件、 可响应于外部刺激而被诱导的元件、 介导启动子活性的元件 ( 例如负调控 元件或转录增强子 )。本文所用的 “调控区” 还包括在转录后具有活性的元件， 例如调节基 因表达的调控元件， 例如翻译增强子和转录增强子、 翻译抑制子和转录抑制子、 上游激活序 列和 mRNA 不稳定性决定子 (mRNA instability determinant)。这后几种元件中有几种可 位于编码区附近。
     在本公开内容中， 术语 “调控元件” 或 “调控区” 一般是指通常 ( 但不总是 ) 位于 结构基因编码序列上游 (5’ ) 的 DNA 序列， 其通过提供转录在特定位点起始所需的 RNA 聚合 酶和 / 或其他因子的识别来控制编码区表达。 然而， 应当理解的是， 位于内含子中或序列 3’ 的其他核苷酸序列也可对调控目的编码区的表达有贡献。为确保在特定位点起始而为 RNA 聚合酶或其他转录因子提供识别的调控元件的一个实例是启动子元件。大多数 ( 但不是全 部 ) 真核生物启动子元件包含 TATA 盒， 其是由腺苷和胸苷核苷酸碱基对组成的保守核酸序 列， 通常位于转录起始位点上游约 25 个碱基对处。启动子元件包含负责起始转录的基础启 动子元件以及调节基因表达的其他调控元件 ( 如上文所述 )。
     存在几种类型的调控区， 包括受发育调节的、 诱导型的或组成型的调控区。 受发育调节的调控区或对所控制基因的差异性表达进行控制的调控区在特定器官或器官之组织 中、 在该器官或组织发育过程的特定时间被活化。 然而， 受发育调节的一些调控区也可偏好 性地在某些器官或组织的特定发育阶段具有活性， 它们还可以以受发育调节的方式具有活 性， 或在植物的其他器官或组织内为基础水平。组织特异性调控区 ( 例如参见特异性调控 区 ) 的实例包括 napin 启动子和 cruciferin 启动子 (Rask 等， 1998， J.Plant Physiol.152 ： 595-599 ； Bilodeau 等， 1994， Plant Cell 14 ： 125-130)。叶特异性启动子的实例包括质体 蓝素启动子 ( 参见例如 SEQ ID NO ： 58) ； US 7,125,978， 其通过引用并入本文。
     诱导型调控区是能够响应于诱导物而直接或间接激活一种或更多种 DNA 序列或 基因之转录的调控区。当不存在诱导物时， DNA 序列或基因不会被转录。通常， 特异性结合 诱导型调控区以激活转录的蛋白因子可以以无活性形式存在， 然后被诱导物直接或间接转 化成活性形式。然而， 也可以不存在蛋白因子。诱导物可以是化学剂， 例如蛋白质、 代谢物、 生长调节剂、 除草剂或酚类化合物， 或通过热、 冷、 盐或毒性元素直接施加的生理压力， 或通 过病原体或致病剂 ( 例如病毒 ) 的作用间接施加的生理压力。可通过向细胞或植物外部施 加诱导物 ( 例如通过喷洒、 浇水、 加热或类似方法 ) 使含有诱导型调控区的植物细胞暴露于 诱导物。 诱导型调控元件可来源于植物基因或非植物基因 ( 例如 Gatz， C. 和 Lenk， I.R.P.， 1998， Trends Plant Sci.3， 352-358， 其通过引用并入本文 )。可用的诱导型启动子的实例 包括但不限于四环素诱导型启动子 (Gatz， C.， 1997， Ann.Rev.Plant Physiol.Plant Mol. Biol.48， 89-108， 其通过引用并入本文 )、 类固醇诱导型启动子 (Aoyama， T. 和 Chua， N.H.， 1997， Plant J.2， 397-404， 其通过引用并入本文 ) 和乙醇诱导型启动子 (Salter， M.G 等， 1998， Plant Journal 16， 127-132 ； Caddick， M.X. 等， 1998， Nature Biotech.16， 177-180， 其通过引用并入本文 )、 细胞分裂素诱导型 IB6 和 CKI1 基因 (Brandstatter， I. 和 Kieber， J.J.， 1998， Plant Cell 10， 1009-1019 ； Kakimoto， T.， 1996， Science 274， 982-985， 其 通过引用并入本文 ) 以及生长素诱导型元件 DR5(Ulmasov， T. 等， 1997， Plant Cell 9， 1963-1971， 其通过引用并入本文 )。
     组成型调控区指导基因在植物各部分表达并在整个植物发育过程中持续表达。 已 知的组成型调控元件的实例包括与以下相关的启动子 ： CaMV 35S 转录本 (Odell 等， 1985， Nature， 313 ： 810-812)、 水稻肌动蛋白 1(Zhang 等， 1991， Plant Cell， 3： 1155-1165)、 肌动 蛋白 2(An 等， 1996， Plant J.， 10 ： 107-121) 或 tms 2(U.S.5,428,147， 其通过引用并入本 文 ) 以及磷酸丙糖异构酶 1 基因 (Xu 等， 1994， Plant Physiol.106 ： 459-467)、 玉米泛素 1 基 因 (Cornejo 等， 1993， Plant Mol.Biol.29 ： 637-646)、 拟南芥泛素 1 和 6 基因 (Holtorf 等， 1995， Plant Mol.Biol.29 ： 637-646)、 烟草翻译起始因子 4A 基因 (Mandel 等， 1995， Plant Mol.Biol.29 ： 995-1004)。本文所用的术语 “组成型” 不一定指受所述组成型调控区控制的 基因在所有细胞类型中以相同水平表达， 而是指基因在多种细胞类型中表达， 尽管常常观 察到不同的丰度。 组成型调控元件可与其他序列偶联以进一步增强与其有效连接之核苷酸 序列的转录和 / 或翻译。例如， CMPV-HT 系统源自豇豆花叶病毒 (CPMV) 的非翻译区， 并显 示增强相关编码序列的翻译。
     “天然” 是指核酸或氨基酸序列是天然存在的， 或 “野生型” 。
     “有效连接” 是指特定序列 ( 例如调控元件与目的编码区 ) 直接或间接地相互作用 以实现预定功能 ( 例如介导或调节基因表达 )。例如有效连接的序列之间的相互作用可通过与所述有效连接之序列相互作用的蛋白质来介导。
     本发明的一种或更多种核苷酸序列可在被本发明核苷酸序列、 或构建体或载体转 化的任意合适的植物宿主中表达。合适宿主的实例包括但不限于农作物， 包括苜蓿、 油菜、 芸苔属 (Brassica spp.)、 玉米、 烟草属 (Nicotiana spp.)、 苜蓿、 马铃薯、 人参、 豌豆、 燕麦、 水稻、 大豆、 小麦、 大麦、 向日葵、 棉花等。
     本发明的一种或更多种嵌合基因构建体还可包含 3’ 非翻译区。3’ 非翻译区是指 这样的基因部分， 其包含含有多腺苷酸化信号和能够影响 mRNA 加工或基因表达之任意其 他调控信号的 DNA 区段。多腺苷酸化信号的特征一般在于向 mRNA 前体的 3’ 端添加多腺苷 酸链。多腺苷酸化信号常通过存在经典形式 5’ AATAAA-3’ 的同源物来鉴定， 但是也会出现 变体。
     合适的 3’ 区的非限制性实例是含有以下基因的多腺苷酸化信号的 3’ 转录的非翻 译区 ： 农杆菌致瘤 (Ti) 质粒基因 ( 例如胭脂氨酸合酶 (Nos 基因 )) 以及植物基因 ( 例如大 豆贮藏蛋白基因 )、 核酮糖 -1， 5- 二磷酸羧化酶的小亚基基因 (ssRUBISCO ； US 4,962,028， 其通过引用并入本文 )、 用于调节质体蓝素表达的启动子 ( 描述于 US 7,125,978( 其通过引 用并入本文 ))。 本发明的一种或更多种嵌合基因构建体还可以进一步包括增强子， 根据需要可以 是翻译或转录增强子。增强子可以位于被转录序列的 5’ 或 3’ 。增强子区域是本领域技术 人员公知的， 并且可包括 ATG 起始密码子、 邻近序列等。如果存在起始密码子， 则其可在编 码序列的读码框的相 (phase) 中 (“框内” (“in frame” ))， 以提供转录序列的正确翻译。
     为了帮助鉴定转化的植物细胞， 可进一步处理本发明的构建体使其包含植物选择 标记。可用的选择标记包括提供针对化学品 ( 例如抗生素， 如庆大霉素、 潮霉素、 卡那霉素 ； 或除草剂， 如膦丝菌素 (phosphinothrycin)、 草甘膦、 氯磺隆等 ) 的抗性的酶。 类似地， 可使 用产生可通过颜色变化进行鉴定之化合物的酶 ( 例如 GUS(β- 葡萄糖醛酸酶 )) 或提供发 光的酶 ( 如萤光素酶或 GFP)。
     认为是本发明一部分的还有包含本发明嵌合基因构建体的转基因植物、 植物细胞 或种子。由植物细胞再生完整植物的方法也是本领域已知的。一般而言， 将转化植物细胞 培养在合适的培养基中， 所述培养基可包含选择剂 ( 例如抗生素 )， 其中使用选择标记以帮 助鉴定转化的植物细胞。愈伤组织形成后， 可根据已知方法应用合适的植物激素来促进芽 的形成， 将芽移至生根培养基中以再生植物。然后， 通过种子或利用植物无性繁殖技术， 植 物可用于建立可重复的世代。还可以不使用组织培养物来形成转基因植物。
     认为是本发明一部分的还有包含嵌合基因构建体的转基因植物、 树木、 酵母、 细 菌、 真菌、 昆虫和动物细胞， 所述嵌合基因构建体含有编码本发明之用于产生 VLP 的重组嵌 合 HA 或 HA0 的核酸。
     为了在多种可用于转化或瞬时表达的宿主生物中表达， 还可以将本发明的调控元 件与目的编码区相组合。这样的生物包括但不限于植物 ( 单子叶植物和双子叶植物 )， 例 如但不限于玉米、 谷类植物、 小麦、 大麦、 燕麦、 烟草属、 芸苔属、 大豆、 菜豆、 豌豆、 苜蓿、 马铃 薯、 番茄、 人参和拟南芥。
     用于这些生物的稳定转化和再生的方法已在本领域中建立并且是本领域技术人 员已知的。获得转化植物和再生植物的方法对本发明来说不是关键的。
     “转化” 是指表现为基因型、 表型或二者兼有的遗传信息 ( 核苷酸序列 ) 在种间转移。 遗传信息从嵌合构建体向宿主的种间转移可以是可遗传的并且认为遗传信息的转移是 稳定的， 或者转移可以是瞬时的并且遗传信息的转移是不可遗传的。
     术语 “植物物质” 是指来源于植物的任何材料。 植物物质可包括完整植物、 组织、 细 胞或其任意部分。此外， 植物物质可包括细胞内植物组分、 细胞外植物组分、 植物的液体或 固体提取物或者其组合。此外， 植物物质可包括来自植物叶、 茎、 果实、 根或其组合的植物、 植物细胞、 组织、 液体提取物或其组合。 植物物质可包括未进行任何处理步骤的植物或其部 分。植物的一部分可包含植物物质。然而， 还考虑可对所述植物材料施加下定义的最少处 理步骤或更严格的处理， 包括使用本领域公知的技术 ( 包括但不限于色谱、 电泳等 ) 进行部 分或大量蛋白质纯化。
     术语 “最少处理” 是指部分纯化包含目的蛋白的植物物质 ( 例如植物或其部分 ) 以 得到植物提取物、 匀浆、 植物匀浆的级分等 ( 即最少处理 )。部分纯化可包括但不限于破坏 植物细胞结构从而产生含有可溶性植物组分和不溶性植物组分的组合物， 不溶性植物组分 可通过例如但不限于离心、 过滤或其组合进行分离。 在此方面， 可使用真空或离心提取容易 地获得叶或其他组织的细胞外间隙中分泌的蛋白质， 或可以通过穿过滚轴或研磨等在压力 下进行组织提取， 从而将蛋白从细胞外间隙中挤压或释放。最少处理还可包括制备可溶性 蛋白质的粗提物， 因为这些制备物中将具有可忽略的来自次级植物产物的污染。 另外， 最少 处理可包括从叶中水性提取可溶性蛋白质， 然后用任意合适的盐进行沉淀。其他方法可包 括大规模的浸渍和汁液提取， 以允许直接使用提取物。
     可将植物物质 ( 形式为植物材料或组织 ) 经口递送给对象。植物物质可作为膳食 补充剂的一部分与其他食物一起施用， 或者被装入胶囊中。植物物质或组织还可以被浓缩 以改善或增进适口性， 或者按照需要与其他材料、 成分或药物赋形剂一起提供。
     可施用本发明 VLP 的对象或目标生物的实例包括但不限于人、 灵长类、 鸟类、 水 禽、 候鸟、 鹌鹑、 鸭、 鹅、 家禽、 鸡、 猪、 绵羊、 马科动物、 马、 骆驼、 犬科动物、 狗、 猫科动物、 猫、 虎、 豹、 麝猫、 水貂、 石貂、 雪貂、 宠物、 家畜、 兔、 小鼠、 大鼠、 豚鼠或其他啮齿动物、 海豹、 鲸 等。这些目标生物是示例性的， 并且不视为限制本发明的应用和用途。
     考虑根据需要和情形， 以多种方式将含有本发明一些实施方式的嵌合 HA 或表达 含有本发明一些实施方式之嵌合 HA 的 VLP 的植物施用给对象或目标生物。例如， 可在使用 之前将得自植物的嵌合 HA 以粗提物、 部分纯化或纯化的形式被提取。如果嵌合 HA 是至少 部分纯化的， 那么其可以在可食用植物或不可食用植物中产生。此外， 如果经口施用嵌合 HA， 则可以收集植物组织并直接给对象食用， 或者可在食用之前干燥收集的组织， 或者可以 不预先收集而使动物在植物上进食。 认为在本发明范围内的还有将收集的植物组织作为动 物饲料的食物补充剂。如果向动物饲喂的植物组织不进行或几乎不进行进一步处理， 则优 选所施用的植物组织是可食用的。
     转录后基因沉默 (PTGS) 可参与限制转基因在植物中的表达， 来自马铃薯 Y 病毒的 沉默抑制子 (HcPro) 的共表达可用于抵抗转基因 mRNA 的特异性降解 (Brigneti 等， 1998)。 可替代的沉默抑制子是本领域熟知的， 并且可如本文所述使用 (Chiba 等， 2006， Virology 346 ： 7-14， 其 通 过 引 用 并 入 本 文 )， 例 如 但 不 限 于 TEV-p1/HC-Pro( 烟 草 蚀 纹 病 毒 -p1/ HC-Pro)、 BYV-p21、 番茄丛矮病毒的 p19(TBSV p19)、 番茄皱缩病毒的衣壳蛋白 (TCV-CP)、 黄瓜花叶病毒的 2b(CMV-2b)、 马铃薯 X 病毒的 p25(PVX-p25)、 马铃薯 M 病毒的 p11(PVM-p11)、 马铃薯 S 病毒的 p11(PVS-p11)、 蓝莓枯黄病毒的 p16(BScV-p16)、 柑橘衰退病毒 (Citrus tristexa virus) 的 p23(CTV-p23)、 葡萄卷叶相关病毒 -2 的 p24(GLRaV-2 p24)、 葡萄病 毒 A 的 p10(GVA-p10)、 葡萄病毒 B 的 p14(GVB-p14)、 白芷潜伏性病毒 (Heracleum latent virus) 的 p10(HLV-p10) 或大蒜普通潜伏性病毒的 p16(GCLV-p16)。因此， 沉默抑制子 ( 例 如但不限于 HcPro、 TEV-p1/HC-Pro、 BYV-p21、 TBSV p19、 TCV-CP、 CMV-2b、 PVX-p25、 PVM-p11、 PVS-p11、 BScV-p16、 CTV-p23、 GLRaV-2p24、 GBV-p14、 HLV-p10、 GCLV-p16 或 GVA-p10) 可与 编码目的蛋白的核酸序列共表达以进一步确保在植物中生产高水平的蛋白质。
     此外， 如本文所述生产的 VLP 不包含神经氨酸酶 (NA)。然而， 如期望包含 HA 和 NA 的 VLP， 可以将 NA 与 HA 共表达。
     因此， 本发明还包括合适的载体， 其含有适用于稳定或瞬时表达系统中的嵌合 HA 序列。还可在一种或多于一种的构建体中提供遗传信息。例如， 可将编码目的蛋白的核苷 酸序列引入一种构建体， 将编码修饰目的蛋白糖基化之蛋白质的第二核苷酸序列引入单独 的构建体中。然后， 可将这些核苷酸序列在植物中共表达。然而， 也可使用这样的构建体， 其包含编码目的蛋白和修饰目的蛋白糖基化之蛋白质两者的核苷酸序列。在此情形中， 核 苷酸序列将包含第一序列和第二序列， 所述第一序列包含与启动子或调控区有效连接的编 码目的蛋白的第一核酸序列， 所述第二序列包含编码修饰目的蛋白糖基化模式之蛋白质的 第二核酸序列， 该第二核酸序列与启动子或调控区有效连接。
     “共表达” 是指两种或两种以上核苷酸序列大致同时在植物中以及在植物的同一 组织中表达。然而， 核苷酸序列不必严格地同时表达。而是两种或更多种核苷酸序列的表 达方式使得所编码产物有机会相互作用。例如， 修饰目的蛋白糖基化的蛋白质可在目的蛋 白表达前或表达期间表达， 使得发生对目的蛋白的糖基化修饰。可使用瞬时表达系统共表 达两种或两种以上的核苷酸序列， 其中所述两种或更多种序列大致同时在适于这两种序列 表达的条件下被引入植物中。或者， 可以用编码目的蛋白的额外序列以瞬时或稳定方式转 化含有核苷酸序列之一 ( 例如编码修饰目的蛋白糖基化模式的蛋白质的序列 ) 的平台植物 (platform plant)。在此情形中， 编码修饰目的蛋白糖基化模式之蛋白质的序列可在期望 的发育阶段表达在期望的组织内表达， 或者可使用诱导型启动子诱导其表达， 而编码目的 蛋白的额外序列可在相似条件下在同一组织内表达， 以确保核苷酸序列的共表达。
     可使用 Ti 质粒、 Ri 质粒、 植物病毒载体、 直接 DNA 转化、 显微注射、 电穿孔、 侵染等 将本发明的构建体引入植物细胞中。这些技术的综述参见例如 Weissbach 和 Weissbach， Methods for Plant Molecular Biology， Academy Press， 纽约 VIII， 421-463 页 (1988) ； Geierson 和 Corey， Plant Molecular Biology， 第 2 版 (1988) 以 及 Miki 和 Iyer， Fundamentals of Gene Transfer in Plants.Plant Metabolism，第 2 版， DT.Dennis， DH Turpin， DD Lefebrve， DB Layzell( 编 )， Addison Wesly， Langmans Ltd.London， 561-579 页 (1997)。其他方法包括直接 DNA 摄取、 使用脂质体、 电穿孔 ( 例如使用原生质 体 )、 显微注射、 微弹 (microprojectile) 或 whisker 以及真空侵染。参见例如 Bilang 等 (Gene 100 ： 247-250(1991))、 Scheid 等 (Mol.Gen.Genet.228 ： 104-112， 1991)、 Guerche 等 (Plant Science 52 ： 111-116， 1987)、 Neuhause 等 (Theor.Appl Genet.75 ： 30-36， 1987)、 Klein 等， Nature 327 ： 70-73(1987)、 Howell 等 (Science 208 ： 1265， 1980)、 Horsch 等(Science 227 ： 1229-1231， 1985)、 DeBlock 等， Plant Physiology 91 ： 694-701， 1989)、 Liu 和 Lomonossoff(J.Virol Meth， 105 ： 343-348， 2002) ； 美国专利 No.4,945,050 ； 5,036,006 ； 5,100,792 ； 6,403,865 ； 5,625,136( 所有这些文献均通过引用并入本文 )。
     可使用瞬时表达法表达本发明的构建体 ( 参见 Liu 和 Lomonossoff， 2002， Journal of Virological Methods， 105 ： 343-348， 其通过引用并入本文 )。或者， 可使用基于真空的 瞬时表达法， 如 Kapila 等 1997 Plant Science 122 ： 101-108( 其通过引用并入本文 ) 所 述。这些方法可包括， 例如但不限于农杆菌接种法或农杆菌侵染法， 然而， 也可使用如上文 所述的其他瞬时方法。使用农杆菌接种法或农杆菌侵染时， 含有期望核酸的农杆菌混合物 进入组织 ( 例如叶、 植物的地上部分 ( 包括茎、 叶和花 )、 植物的其他部分 ( 茎、 根、 花 ) 或整 个植株 ) 的细胞间隙中。穿过表皮后， 农杆菌感染细胞并将 t-DNA 拷贝移至细胞中。t-DNA 以附加体形式转录并且 mRNA 被翻译， 使目的蛋白在感染细胞中产生， 然而， t-DNA 在核内的 传代是瞬时的。
     本发明提供的包含嵌合 HA 的 VLP 可与现有流感疫苗组合使用， 以补充所述疫苗使 其更加有效， 或降低所需的施用剂量。 如本领域技术人员所已知的， 疫苗可针对一种或更多 种流感病毒。 合适的疫苗的实例包括但不限于从 Sanofi-Pasteur、 ID Biomedical、 Merial、 Sinovac、 Chiron、 Roche、 MedImmune、 GlaxoSmithKline、 Novartis、 Sanofi-Ayentis、 Serono、 Shire Pharmaceuticals 等购得的疫苗。
     如期望， 可将本发明的 VLP 与本领域技术人员已知的合适佐剂混合。此外， VLP 可 用于疫苗组合物， 其含有用于治疗上述靶标生物的有效剂量 VLP。此外， 根据本发明生产的 VLP 可与使用不同流感蛋白质 ( 例如神经氨酸酶 (NA)) 得到的 VLP 相组合。
     因此， 本发明提供了用于诱导动物或靶标生物中针对流感病毒感染的免疫的方 法， 其包括施用有效剂量的疫苗， 所述疫苗含有一种或多于一种 VLP。疫苗可经口、 皮内、 鼻 内、 肌内、 腹腔内、 静脉内或皮下施用。
     本发明多个实施方案的组合物可包含两种或更多种流感毒株或亚型的 VLP。 “两种 或更多种” 是指两种、 三种、 四种、 五种、 六种、 七种、 八种、 九种、 十种或更多种毒株或亚型。 所示毒株或亚型可以是单一亚型 ( 例如， 所有都为 H1N1， 或所有都为 H5N1)， 或者可以是亚 型的组合。示例性亚型和毒株包括 H5/Indo、 H1/Bri、 H1/NC、 H3/Bri、 B/Flo。对毒株和亚 型之组合的选择可取决于对象可能暴露于流感的地区， 动物物种 ( 例如水禽类、 农业动物 ( 例如猪 ) 等 ) 与待免疫人群的接近程度以及所述动物物种携带、 暴露于或可能暴露于的 毒株， 对亚型或毒株内抗原漂移的预测， 或者这些因素的组合。 过去几年所使用的组合的实 例可见于世界卫生组织 (WHO) 保存的数据库 ( 见 URL ： who.int/csr/dieease/influenza/ vaccine recommendations1/en)。
     两种或更多种 VLP 可单独表达， 随后将纯化的或半纯化的 VLP 相组合。或者， VLP 可在同一宿主 ( 例如植物、 植物部分或植物细胞 ) 中共表达。VLP 可以期望的比例 ( 例如大 致相等的比例 ) 组合或生产， 或者可以组合以使一种亚型或毒株占组合物中 VLP 的大部分。
     因此， 本发明提供了包含两种或更多种毒株或亚型的 VLP 的组合物。
     还提供了包含包装材料和包含含有嵌合 HA 之 VLP 的组合物的产品。该组合物包 含生理上或药理上可接受的赋形剂， 包装材料可以包含标明组合物活性成分 ( 例如 VLP) 的 标签。还提供了包含组合物的试剂盒， 所述组合物包含编码本文所述嵌合 HA 之核酸以 及使用该核酸生产嵌合 HA 或包含嵌合 HA 的 VLP 的说明书。该试剂盒可用于生产包含嵌合 HA 的 VLP， 说明书可以包括， 例如在植物或植物细胞中表达核酸的信息， 从植物或植物组织 中收获和获得 VLP 的说明。
     在另一个实施方案中， 提供了用于制备药物的试剂盒， 其包含含有嵌合 HA 的 VLP 及其使用说明书。说明书可以包含制备药物的一系列步骤， 药物可用于在施用对象中诱导 治疗性或预防性免疫应答。 该试剂盒还可包含说明剂量浓度、 剂量间隔、 优选施用方法等的 说明书。
     本发明将通过下面的实施例更详细的说明。但是应当理解， 这些实施例仅用于说 明的目的， 不应以任何方式用于限制本发明的范围。
     本文描述的序列汇总如下。
     材料与方法
     1.HA 表达盒的组装
     A-pCAMBIAPlasto
     使用 Sambrook 和 Russell(2001 ； 其通过引用并入本文 ) 的一般分子生物学方案 完成所有操作。表 1 显示用于表达盒组装的寡核苷酸引物。第一个克隆步骤是组装受体 质粒， 其包含苜蓿质体蓝素基因的上游和下游调控元件。使用寡核苷酸引物 XmaI-pPlas. c(SEQ ID NO ： 1) 和 SacI-ATG-pPlas.r(SEQ ID NO ： 2) 从苜蓿基因组 DNA 中扩增质体蓝 素启动子和 5’ UTR 序列。所得扩增产物用 XmaI 和 SacI 消化并与预先经同样的酶消化的 pCAMBIA2300(Cambia， Canberra， Australia) 连接， 以形成 pCAMBIApromoPlasto。类似地， 使用引物 SacI-PlasTer.c(SEQ ID NO ： 3) 和 EcoRI-PlasTer.r(SEQ ID NO ： 4) 从苜蓿基因 组 DNA 中扩增质体蓝素基因的 3’ UTR 序列和终止子， 所得产物用 SacI 和 EcoRI 消化， 然后 插入到 pCAMBIApromoPlasto 的相同位点中， 以形成 pCAMBIAPlasto。
     B-Plasto- 天然 SP-H5A/ 印度尼西亚 /5/05( 构建体号 660)
     Epoch Biolabs(Sugar Land， TX， USA) 合 成 了 编 码 流 感 毒 株 A/ 印 度 尼 西 亚 /5/05(H5N1 ； 登录号 LANL ISDN125873) 之血凝素的片段。所产生的包含完整 H5 编码区 的片段示于 (SEQ ID NO ： 52， 图 17)， 该编码区包含天然信号肽， 其侧翼为紧邻起始 ATG 上 游 的 HindIII 位 点 以 及 紧 邻 终 止 密 码 子 (TAA) 下 游 的 SacI 位 点。 通 过 Darveau 等 (1995) 所示的基于 PCR 的连接方法将 H5 编码区克隆到基于质体蓝素的表达盒中。简 言 之， 使 用 引 物 Plato-443c(SEQ ID NO ： 5) 和 SpHA(Ind)-Plasto.r(SEQ ID NO ： 6)， 以 pCAMBIApromoPlasto 作为模板进行第一 PCR 扩增。平行地， 使用引物 Plasto-SpHA(SEQ ID NO ： 7) 和 HA(Ind)-Sac.r(SEQ ID NO ： 8)， 以 H5 编码片段 (SEQ ID NO ： 52 ； 图 17) 作为模板 进行第二扩增。 将由两个反应得到的扩增物混合， 将混合物作为模板， 使用 Plato-443c(SEQ ID NO ： 5) 和 HA(Ind)-Sac.r(SEQ ID NO ： 8) 作 为 引 物 进 行 第 三 反 应 ( 组 装 反 应 )。 用 BamHI( 在质体蓝素启动子中 ) 和 SacI( 在片段的 3’ 端 ) 消化所得片段， 并将其克隆到预先 用相同酶消化的 pCAMBIAPlasto 中。所得质粒称为 660， 其示于图 18 中 (SEQ ID NO ： 53)。
     C-Plasto-PDI SP-H1A/ 新喀里多尼亚 /20/99( 构建体号 540)
     将流感毒株 A/ 新喀里多尼亚 /20/99(H1N1)H1 基因的开放阅读框合成为两个片段 (Plant Biotechnology Institute， National Research Council， Saskatoon， Canada)。 所 合成的第一片段对应于缺少 5’ 端信号肽编码序列和 3’ 端跨膜结构域编码序列的野生型 H1 编码序列 (GenBank 登录号 AY289929 ； SEQ ID NO ： 54 ； 图 19)。片段的 5’ 端由编码 PDISP 的 末端核苷酸 ( 含有 BglII 限制性位点 ) 构成， 并且将 SacI/StuI 双位点添加在紧邻该片段 3’ 端终止密码子下游， 得到 SEQ ID NO ： 55( 图 20)。还合成了编码 H1 蛋白 C 端 ( 包含跨膜 结构域和胞质尾 ) 的第二片段， 其从 KpnI 位点至终止密码子， 其 3’ 侧翼是 SacI 和 StuI 限 制性位点 (SEQ ID NO.56 ； 图 21)。
     第一 H1 片段用 BglII 和 SacI 消化， 并克隆到含有质体蓝素启动子和 5’ UTR( 与苜 蓿蛋白质二硫键异构酶 (PDI) 基因 (32-103 位核苷酸 ； 登录号 Z11499 ； SEQ ID NO ： 57 ； 图
     22) 的信号肽融合 ) 之二元载体 (pCAMBIAPlasto) 的同样位点中， 得到位于质体蓝素调控 元件的下游的 PDI-H1 嵌合基因。基于质体蓝素的表达盒序列示于 SEQ ID NO.58( 图 23)， 其含有启动子和 BglII 限制性位点上游的 PDI 信号肽， 以及 SacI 位点下游的质体蓝素终止 子。通过将预先用 KpnI 和 SacI 消化的合成片段 (SEQ ID NO ： 56 ； 图 21) 插入到 H1 表达质 粒中来添加 H1 编码区的 C 端 ( 编码跨膜结构域和胞质尾 )。所得构建体称为 540， 其示于 SEQ ID NO.59( 图 24)。
     D-Plasto- 天然 SP-H1A/ 布里斯班 /59/07( 构建体号 774)
     按照下列步骤组装指导 A/ 布里斯班 /59/07 的 H1 表达的表达盒号 774。合成包含 完整血凝素编码序列 ( 从 ATG 到终止 ) 的合成片段， 其 3’ 侧翼是对应于质体蓝素 ATG 上游 前 84 个核苷酸以 DraIII 限制性位点起始的的苜蓿质体蓝素基因序列。该合成片段还包含 紧邻终止密码子下游的 SacI 位点。
     合成片段由 Top Gene Technologies(Montreal， QC， Cahada) 合成。所合成的片段 示于 SEQ ID NO.60( 图 25)。对于完整表达盒的组装， 将合成片段用 DraIII 和 SacI 消化并 克隆到预先用同样的酶消化的 pCAMBIAPlasto 中， 得到构建体 774(SEQ ID NO.61 ； 图 26)。
     E-CPMV HT-LC C51( 构建体号 828)
     CPMV-HT 表达盒使用 35S 启动子来控制包含目的编码序列之 mRNA 的表达， 目的编 码序列的 5′侧翼为来自豇豆花叶病毒 (CPMV)RNA2 的 1-512 位核苷酸 ( 其在 115 和 161 位 具有突变的 ATG) 并且 3′侧翼为来自 CPMV RNA2 的 3330-3481 位核苷酸 ( 对应于 3′ UTR) 和其后的 NOS 终止子。使用质粒 pBD-C5-1LC(Sainsbury 等， 2008 ； Plant Biotechnology Journal 6 ： 82-92 以及 PCT 公开 WO 2007/135480) 来组装基于 CPMV-HT 的血凝素表达盒。 使用基于 PCR 的连接方法 (Darveau 等， Methods in Neuroscience 26 ： 77-85(1995)) 实现 CPMV RNA2 第 115 和 161 位的 ATG 的突变。 使用 pBD-C5-1LC 作为模板进行两个单独的 PCR。 用于第一扩增的引物是 pBinPlus.2613c(SEQ ID NO ： 9) 和 Mut-ATG115.r(SEQ ID NO ： 10)。 用于第二扩增的引物是 Mut-ATG161.c(SEQ ID NO ： 11) 和 LC-C5-1.110r(SEQ ID NO ： 12)。 将 获得的两片段混合， 并用作使用引物 pBinPlus.2613c(SEQ ID NO ： 9) 和 LC-C5-1.110r(SEQ ID NO ： 12) 之第三扩增的模板。所得片段用 PacI 和 ApaI 消化， 并克隆至用同样的酶消化 的 pBD-C5-1LC 中。所得构建体称为 828， 其示于图 27 中 (SEQ ID NO ： 62)。
     F-H5A/ 印度尼西亚 /5/05 骨架中的 H1A/ 布里斯班 /59/07 受体结合 (RB) 结构域 ( 构建体号 690)
     使用 Darveau 等 (Methods in Neuroscience 26 ： 77-85(1995)) 报道的基于 PCR 连接方法， 用 H1A/ 布里斯班 /59/07 的 RB 结构域替换 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 中的 RB 结 构域来制备嵌合 HA。在第一轮 PCR 中， 将质体蓝素启动子区段融合到天然信号肽上， 使用 引物 Plasto-443c(SEQ ID NO ： 5) 和 E1H1B-E1H5I.r(SEQ ID NO ： 13)， 以构建体号 660(SEQ ID NO ： 53， 图 18) 为模板扩增 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 的 F’ 1 和 E1 结构域。使用引物 E1 H5N-E1 H1B.c(SEQ ID NO ： 14) 和 E2 H5I-RB H1B.r(SEQ ID NO ： 15)， 以构建体号 774(SEQ ID NO ： 61 ； 图 26) 为模板扩增含有 H1A/ 布里斯班 /59/07 之 RB 结构域编码序列的第二片 段。使用引物 RBH1B-E2 H5I.c(SEQ ID NO ： 16) 和 HA(Ind)-SacI.r(SEQ ID NO ： 8)， 以构 建体号 660(SEQ ID NO 53 ； 图 18) 为模板扩增含有 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 的 E2、 F’ 2、 F、 跨膜和胞质结构域的第三片段。然后混合扩增产物， 并用作使用引物 Plasto-443c(SEQ IDNO ： 5) 和 HA(Ind)-SacI.r(SEQ ID NO ： 8) 之第二轮扩增 ( 组装反应 ) 的模板。所得片段用 BamHI( 在质体蓝素启动子中 ) 和 SacI( 在终止密码子后 ) 消化， 并克隆进预先用同样的限 制性酶消化的构建体号 660(SEQ ID NO ： 53 ； 图 18) 中， 得到构建体号 690(SEQ ID NO ： 63)。 该构建体示于图 28 中。
     G-H5A/ 印度尼西亚 /5/05 骨架中的 H1A/ 布里斯班 /59/07 酯酶和受体结合结构域 (E1-RB-E2)( 构建体号 691)
     使用 Darveau 等 (Methods in Neuroscience 26 ： 77-85(1995)) 报道的基于 PCR 连接方法， 用 H1A/ 布里斯班 /59/07 的 E1-RB-E2 结构域替换 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 中的 E1-RB-E2 结构域来组装嵌合 HA。在第一轮 PCR 中， 将质体蓝素启动子区段融合到天然信号 肽上， 使用引物 Plasto-443c(SEQ ID NO ： 5) 和 E1H1B-F’ 1H5I.r(SEQ ID NO ： 17)， 以构建体 号 660(SEQ ID NO ： 53， 图 18) 为模板扩增 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 的 F’ 1 结构域。平行地， 扩增其他两个片段。使用引物 F’ 1H5N-E1H1B.c(SEQ ID NO ： 18) 和 F’ 2H5I-E2H1B.r(SEQ ID NO ： 19)， 以构建体号 774(SEQ ID NO ： 61 ； 图 26) 为模板扩增含有 H1A/ 布里斯班 /59/07 之 E1-RB-E2 结构域编码序列的第二片段。对于第三片段， 使用引物 E2H1B-F’ 2H5I.c(SEQ ID NO ： 20) 和 HA(Ind)-SacI.r(SEQ ID NO ： 8)， 以构建体号 660(SEQ ID NO 53 ； 图 18) 为 模板扩增 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 的 F’ 2、 F、 跨膜和胞质结构域。然后混合扩增产物， 并用 作使用引物 Plasto-443c(SEQ ID NO ： 5) 和 HA(Ind)-SacI.r(SEQ ID NO ： 8) 之第二轮扩增 ( 组装反应 ) 的模板。所得片段用 BamHI( 在质体蓝素启动子中 ) 和 SacI( 在终止密码子 后 ) 消化， 并克隆进预先用同样的限制性酶消化的构建体号 660(SEQ ID NO ： 53 ； 图 18) 中， 得到构建体号 691(SEQ ID NO ： 64)。该构建体示于图 29 中。
     H-H1A/ 新喀里多尼亚 /20/99 骨架中的 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 受体结合 (RB) 结 构域 ( 构建体号 696)
     使用 Darveau 等 (Methods in Neuroscience 26 ： 77-85(1995)) 报道的基于 PCR 连接方法， 用 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 的 RB 结构域替换 H1A/ 新喀里多尼亚 /20/99 中的 RB 结构域来制备嵌合 HA。在第一轮 PCR 中， 将质体蓝素启动子区段融合到苜蓿蛋白二硫键异 构酶信号肽 (PDISP ； 登录号 Z11499， SEQ ID NO ： 57 第 32-103 位核苷酸 ； 图 22) 上， 使用引 物 Plasto-443c(SEQ ID NO ： 5) 和 E1H5I-E1H1NC.r(SEQ ID NO ： 21)， 以构建体号 540(SEQ ID NO ： 59， 图 24) 为模板扩增 H1A/ 新喀里多尼亚 /20/99 的 F’ 1 和 E1 结构域。使用引物 E1H1NC-E1H5I.c(SEQ ID NO ： 22) 和 E2H1NC-RB H5I.r(SEQ ID NO ： 23)， 以构建体号 660(SEQ ID NO ： 53 ； 图 18) 为模板扩增含有 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 之 RB 结构域编码序列的第二片 段。 使用引物 RB H5I-E2 H1NC.c(SEQ ID NO ： 24) 和 HA-SacI.r(SEQID NO ： 25)， 以构建体号 F’ 2、 F、 跨膜 540(SEQ ID NO ： 59 ； 图 24) 为模板扩增含有 H1A/ 新喀里多尼亚 /20/99 的 E2、 和胞质结构域的第三片段。然后混合扩增产物， 并用作使用引物 Plasto-443c(SEQ ID NO ： 5) 和 HA-SacI.r(SEQ ID NO ： 25) 之第二轮扩增 ( 组装反应 ) 的模板。所得片段用 BglII 和 SacI 消化， 并克隆至预先用同样的限制性酶消化的构建体号 540(SEQ ID NO ： 59， 图 24) 中， 获得构建体号 696(SEQ ID NO ： 65)。该构建体示于图 30 中。
     I- 将 H1A/ 布里斯班 /59/2007 组装进 CPMV-HT 表达盒 ( 构建体号 732)
     按照以下所述将来自 H1A/ 布里斯班 /59/2007 的 HA 编码序列克隆进 CPMV-HT 中。 通过使用构建体号 774(SEQ ID NO ： 61 ； 图 26) 作为模板， 用引物 ApaI-H1B.c(SEQ ID NO ：26) 和 StuI-H1B.r(SEQ ID NO ： 27) 进行 PCR 扩增， 从而将限制性位点 ApaI( 紧邻 ATG 上游 ) 和 StuI( 紧邻终止密码子下游 ) 添加至血凝素编码序列中。所得片段用 ApaI 和 StuI 限制 性酶消化， 并克隆至用同样的酶消化的构建体号 828(SEQ ID NO ： 62， 图 27) 中。所得的盒 称为构建体号 732(SEQ ID NO ： 66， 图 31)。
     J- 将 SpPDI-H1A/ 布里斯班 /59/2007 组装进 CPMV-HT 表达盒 ( 构建体号 733)
     按照以下所述将编码苜蓿蛋白二硫键异构酶信号肽的序列 (PDISP ； SEQ ID NO ： 57 第 32-103 位核苷酸， 图 22 ； 登录号 Z11499) 与来自 A/ 布里斯班 /59/2007 之 H1 的 HA0 编码 序列融合， 并将所得片段克隆至 CPMV-HT 中。 通过使用构建体 774(SEQ ID NO ： 61， 图 26) 作 为模板， 用引物 SpPDI-H1B.c(SEQ ID NO ： 28) 和 SacI-H1B.r(SEQ ID NO ： 29) 扩增得到 H1 编码序列。所得片段在 H1 编码序列 5’ 侧翼为编码 PDISP 的最后几个核苷酸 ( 包含 BglII 限制性位点 )， 3’ 侧翼为 SacI 限制性位点。将该片段用 BglII 和 SacI 消化， 并克隆至预先 用同样的限制性酶消化的构建体号 540(SEQ ID NO ： 59， 图 24) 中。称为构建体号 787(SEQ ID NO 67) 的中间盒编码序列显示于图 32 中。通过使用构建体号 787(SEQ ID NO ： 67 ； 图 32) 作为模板， 用引物 ApaI-SpPDI.c(SEQ ID NO ： 30) 和 StuI-H1B.r(SEQ ID NO ： 27) 进行 PCR 扩增， 从而将限制性位点 ApaI( 紧邻 ATG 上游 ) 和 StuI( 紧邻终止密码子下游 ) 添加 至血凝素编码序列中。所得片段用 ApaI 和 StuI 限制性酶消化， 并克隆至用同样的酶消化 的构建体号 828(SEQ ID NO ： 62， 图 27) 中。所得的盒称为构建体号 733(SEQ ID NO ： 68， 图 33)。
     K- 在 CPMV-HT 表达盒中组装 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 骨架中的 H1A/ 布里斯班 /59/07 受体结合 (RB) 结构域 ( 构建体号 734)
     按 照 以 下 所 述 将 嵌 合 HA 的 编 码 序 列 ( 在 H5A/ 印 度 尼 西 亚 /5/05 骨 架 中 具 有 H1A/ 布 里 斯 班 /59/07 的 RB 结 构 域 ) 克 隆 到 CPMV-HT 中。 通 过 使 用 构 建 体 690(SEQ ID NO ： 63 ； 图 28) 作 为 模 板， 用 引 物 ApaI-H5(A-Indo).1c(SEQ ID NO ： 31) 和 H5(A-Indo)-StuI.1707r(SEQ ID NO ： 32) 进行 PCR 扩增， 从而将限制性位点 ApaI( 紧邻 ATG 上游 ) 和 StuI( 紧邻终止密码子下游 ) 添加至嵌合血凝素编码序列中。所得片段用 ApaI 和 StuI 限制性酶消化， 并克隆至用同样的酶消化的构建体号 828(SEQ ID NO ： 62， 图 27) 中。 所得的盒称为构建体号 734(SEQ ID NO ： 69， 图 34)。
     L- 将 SpPDI-H3A/ 布里斯班 /10/2007 组装进 CPMV-HT 表达盒 ( 构建体号 736)
     按照以下所述将编码苜蓿 PDI 信号肽的序列与来自 H3A/ 布里斯班 /10/2007 的 HA0 融合， 并克隆至 CPMV-HT 中。首先， 合成包含完整血凝素编码序列 ( 从 ATG 到终止 ) 的 合成片段， 其 3’ 侧翼是对应于质体蓝素 ATG 上游前 84 个核苷酸 ( 以 DraIII 限制性位点起 始 ) 的苜蓿质体蓝素基因序列。该合成片段还包含紧邻终止子之后的 SacI 位点。合成片 段由 TopGene Technologies(Montreal， QC， Canada) 合成。所合成的片段示于 SEQ ID NO ： 70( 图 35)， 并进一步用作基于 PCR 的连接的模板。
     其次， 按照以下所述将苜蓿蛋白二硫键异构酶 (PDISP)( 核苷酸 32-103 ； 登录号 Z11499 ； SEQ ID NO ： 57 ； 图 22) 信号肽与紧邻 ATG 上游的 ApaI 限制性位点和终止密码子下 游的 StuI 限制性位点一起连接到来自 A/ 布里斯班 /10/2007 之 H3 的 HA0 编码序列上。使 用 Darveau 等 (Methods in Neuroscience 26 ： 77-85(1995)) 报道的基于 PCR 的连接方法， 将 PDISP 与 H3 编码序列连接。在第一轮 PCR 中， 使用引物 ApaI-SpPDI.c(SEQ ID NO ： 30)和 H3B-SpPDI.r(SEQ ID NO ： 33)， 以构建体 540(SEQ ID NO ： 59 ； 图 24) 为模板扩增 PDISP 信号肽。平行地， 使用引物 SpPDI-H3B.c(SEQ ID NO ： 34) 和 StuI-H3B.r(SEQ ID NO ： 35)， 以先前合成的片段 (SEQ ID NO ： 70 ； 图 35) 为模板扩增含有 H3A/ 布里斯班 /10/2007 部分 编码序列 ( 从密码子 17 到终止密码子 ) 的另一片段。然后混合扩增产物， 并用作使用引 物 ApaI-SpPDI.c(SEQ ID NO ： 30) 和 StuI-H3B.r(SEQ ID NO ： 35) 之第二轮扩增 ( 组装反 应 ) 的模板。所得片段用 ApaI 和 StuI 限制性酶消化， 并克隆至用同样的酶消化的构建体 号 828(SEQ ID NO ： 62， 图 27) 中。所得的盒称为构建体号 736(SEQ ID NO ： 71， 图 36)。
     M- 在 CPMV-HT 表 达 盒 中 组 装 嵌 合 SpPDI-H3A/ 布 里 斯 班 /10/2007( 胞 外 结 构 域 )+H5A/ 印度尼西亚 /5/2005(TmD+Cyto tail)( 构建体号 737)
     按照以下所述将编码苜蓿 PDI 信号肽的序列融合到 H3A/ 布里斯班 /10/2007 胞外 结构域和 H5A/ 印度尼西亚 /5/2005 的跨膜和胞质结构域上， 并克隆到 CPMV-HT 中。使用 Darveau 等 (Methods in Neuroscience 26 ： 77-85(1995)) 报道的基于 PCR 的连接方法， 将 PDISP-H3 编码序列与 H5 跨膜结构域融合。在第一轮 PCR 中， 通过使用引物 ApaI-SpPDI. c(SEQ ID NO ： 30) 和 TmD H5I-H3B.r(SEQ ID NO ： 36)， 以构建体号 736(SEQ ID NO ： 71 ； 图 36) 为模板扩增产生包含 PDISP 信号肽和 H3 布里斯班胞外结构域的片段。平行地， 使 用 引 物 H3B-TmD H5I.c(SEQ ID NO ： 37) 和 H5(A-Indo)-StuI.1707r(SEQ ID NO ： 32)， 以 构建体号 660(SEQ ID NO ： 53 ； 图 18) 为模板扩增含有 H5 印度尼西亚之跨膜和胞质结构 域的另一片段。然后混合扩增产物， 并用作使用引物 ApaI-SpPDI.c(SEQ ID NO ： 30) 和 H5(A-Indo)-StuI.1707r(SEQ ID NO ： 32) 之第二轮扩增 ( 组装反应 ) 的模板。所得片段用 ApaI 和 StuI 限制性酶消化， 并克隆至用同样的酶消化的构建体号 828(SEQ ID NO ： 62， 图 27) 中。所得的盒称为构建体号 737(SEQ ID NO ： 72， 图 37)。
     N- 将 SpPDI-HA B/ 佛罗里达 /4/2006 组装进 CPMV-HT 表达盒 ( 构建体号 739)
     按照以下所述将编码苜蓿 PDI 信号肽的序列与来自 HA B/ 布里斯班 /4/2006 的 HA0 融合， 并克隆至 CPMV-HT 中。首先， 合成包含完整血凝素编码序列 ( 从 ATG 到终止 ) 的 合成片段， 其 3’ 侧翼是对应于质体蓝素 ATG 上游前 84 个核苷酸 ( 以 DraIII 限制性位点起 始 ) 的苜蓿质体蓝素基因序列。合成片段还包含紧邻终止密码子之后的 SacI 限制性位点。 该合成片段由 Epoch Biolabs(Sugar Land， Texas， USA) 合成。所合成的片段示于 SEQ ID NO73( 图 38)， 并进一步用作基于 PCR 的连接的模板。
     其次， 按照以下所述将苜蓿蛋白二硫键异构酶 (PDISP)(SEQ ID NO ： 57 核苷酸 32-103 位 ； 图 22 ； 登录号 Z11499) 信号肽与紧邻上游 ATG 的 ApaI 限制性位点和终止密码 子下游的 StuI 限制性位点一起连接到来自 B/ 佛罗里达 /4/2006 之 HA 的 HA0 编码序列上。 使用 Darveau 等 (Methods in Neuroscience 26 ： 77-85(1995)) 报道的基于 PCR 的连接方 法， 将 PDISP 与 HA 编码序列连接。在第一轮 PCR 中， 使用引物 ApaI-SpPDI.c(SEQ ID NO ： 30) 和 HBF-SpPDI.r(SEQ ID NO ： 38)， 以构建体号 540(SEQ ID NO ： 59 ； 图 24) 为模板扩增 PDISP 信号肽。平行地， 使用引物 SpPDI-H3B.c(SEQ ID NO ： 39) 和 StuI-HBF.r(SEQ ID NO ： 40)， 以先前合成的片段 (SEQ ID NO ： 73 ； 图 38) 为模板扩增含有来自 B/ 佛罗里达 /4/2006 之 HA 的部分编码序列 ( 从密码子 16 到终止密码子 ) 的另一片段。然后混合扩增产物， 并 用作使用引物 ApaI-SpPDI.c(SEQ ID NO ： 30) 和 StuI-HBF.r(SEQ IDNO ： 40) 之第二轮扩增 ( 组装反应 ) 的模板。所得片段用 ApaI 和 StuI 限制性酶消化， 并克隆至用同样的酶消化的构建体号 828(SEQ ID NO ： 62， 图 27) 中。所得的盒称为构建体号 739(SEQ ID NO ： 74， 图 39)。 O- 在 CPMV-HT 表达盒中组装嵌合 SpPDI-HA B/ 佛罗里达 /4/2006( 胞外结构域 )+H5A/ 印度尼西亚 /5/2005(TmD+Cyto tail)( 构建体号 745)。
     按照以下所述将编码苜蓿 PDI 信号肽的序列融合到 HA B/ 佛罗里达 /4/2006 胞外 结构域和 H5A/ 印度尼西亚 /5/2005 的跨膜和胞质结构域上， 并克隆到 CPMV-HT 中。使用 Darveau 等 (Methods in Neuroscience 26 ： 77-85(1995)) 报道的基于 PCR 的连接方法， 将 PDISP-B/ 佛罗里达 /4/2006 胞外结构域编码序列与 H5 跨膜和胞质结构域融合。在第一轮 PCR 中， 使用引物 ApaI-SpPDI.c(SEQ ID NO ： 30) 和 TmD H5I-B Flo.r(SEQ ID NO ： 41)， 以构 建体号 739(SEQ ID NO ： 74 ； 图 39) 为模板扩增产生包含与 HA B/ 佛罗里达 /4/2006 胞外结 构域融合的 PDISP 信号肽的片段。平行地， 使用引物 B Flo-TmD H5I.c(SEQ ID NO ： 42) 和 H5(A-Indo)-StuI.1707r(SEQ ID NO ： 32)， 以构建体号 660(SEQ ID NO ： 53 ； 图 18) 为模板扩 增含有 H5 印度尼西亚跨膜和胞质结构域的另一片段。然后混合扩增产物， 并用作使用引物 ApaI-SpPDI.c(SEQ ID NO ： 30) 和 H5(A-Indo)-StuI.1707r(SEQ ID NO ： 32) 之第二轮扩增 ( 组装反应 ) 的模板。所得片段用 ApaI 和 StuI 限制性酶消化， 并克隆至用同样的酶消化 的构建体号 828(SEQ ID NO ： 62， 图 27) 中。所得的盒称为构建体号 745(SEQ ID NO ： 75， 图 40)。
     P- 在 2X35S-CPMV-HT 表达盒中组装嵌合 SpPDI-HA B/ 佛罗里达 /4/2006+H5A/ 印 度尼西亚 /5/2005(TmD+Cyto tail)( 构建体号 747)
     按照以下所述将编码苜蓿 PDI 信号肽的序列融合到来自 HA B/ 佛罗里达 /4/2006 的 HA0 和 H5A/ 印度尼西亚 /5/2005 的跨膜和胞质结构域上， 并克隆到 2X35S-CPMV-HT 中。 使用 Darveau 等 (Methods in Neuroscience 26 ： 77-85(1995)) 报道的基于 PCR 的连接方 法进行启动子转换。使用引物 PacI-MCS-2X35S.c(SEQ ID NO ： 89) 和 CPMV 5’ UTR-2X35S. r(SEQ ID NO ： 90) ：
     以含有 2X35S 启动子的质粒为模板通过 PCR 扩增含有 2X35S 启动子 (SEQ ID NO ： 88 ： 图 50A) 的第一片段。 平行地， 使用引物 2X35S-CPMV 5’ UTR.c(SEO ID NO ： 91) 和 ApaI-M prot.r(SEO ID NO ： 92) ：
     以构建体 745(SEQ ID NO ： 75 ； 图 40) 为模板进行第二 PCR。然后混合所得的两种 片段并用作使用引物 PacI-MCS-2X35S.c(SEQ ID NO ： 89) 和 ApaI-M prot.r(SEQ ID NO ： 92) 之第二轮 PCR( 组装反应 ) 的模板。所得片段用 PacI 和 ApaI 消化， 并克隆至用同样的酶消 化的构建体 745(SEQ ID NO ： 75， 图 40) 中。 表达盒称为构建体 747(SEQ ID NO ： 93)， 其序列 示于图 50B 中。
     2. 伴侣蛋白表达盒的组装
     组装了两种热休克蛋白 (Hsp) 表达盒。在第一种盒中， 拟南芥 ( 哥伦比亚生态 型 ) 胞浆 HSP70(Lin 等 (2001)Cell stress and Chaperones 6 ： 201-208 中的 Athsp70-1) 的表达被苜蓿亚硝酸还原酶 (Nir) 和苜蓿质体蓝素启动子的嵌合启动子组合元件 (Nir/ Plasto) 控制。还组装了第二种盒， 其包含嵌合 Nir/Plasto 启动子控制下的苜蓿胞浆 HSP40(MsJ1 ； Frugis 等 (1999)Plant Molecular Biology 40 ： 397-408) 编码区。
     首先， 组装了在植物二元载体中含有苜蓿亚硝酸还原酶启动子 (Nir)、 GUS 报 告基因和 NOS 终止子的接纳质粒 (acceptor plasmid)。用 HindIII 和 EcoRI 消化质粒 pNir3K51( 先前描述于美国专利 No.6,420,548 中 )。将所得片段克隆进用同样的限制性酶 消化的 pCAMBIA2300(Cambia， Canberra， Australia) 中， 得到 pCAMBIA-Nir3K51。
     通 过 基 于 PCR 的 连 接 方 法 (Darveau 等， Methods in Neuroscience 26 ： 77-85(1995))， 将 Hsp70 和 Hsp40 的编码序列分别克隆进接纳质粒 pCAMBIANir3K51 中。
     对于 Hsp40， 使用引物 Hsp40Luz.1c(SEQ ID NO ： 43) 和 Hsp40Luz-SacI.1272r(SEQ ID NO ： 44)， 通 过 RT-PCR 从 苜 蓿 (Rangclander 生 态 型 ) 叶 总 RNA 中 扩 增 Msj1 编 码 序 列 (SEQ ID NO ： 76 ； 图 41)。使用构建体 660(SEQ ID NO ： 53 ； 图 18) 作为模板， 用引物 Plasto-443c(SEQ ID NO ： 5) 和 Hsp40Luz-Plasto.r(SEQ ID NO ： 45) 进行第二扩增。然后 混合 PCR 产物， 并用作使用引物 Plasto-443c(SEQ ID NO ： 5) 和 Hsp40Luz-SacI.1272r(SEQ ID NO ： 44) 之第三扩增 ( 组装反应 ) 的模板。所得片段用 HpaI( 在质体蓝素启动子中 ) 消 化， 并克隆进预先用 HpaI( 在 Nir 启动子中 ) 和 SacI 消化并用 T4DNA 聚合酶处理以产生平 末端的 pCAMBIANir3K51 中。筛选正确取向的所得克隆， 并测序以检验序列完整性。所得质 粒称为 R850， 其示于图 42 中 (SEQ ID NO ： 77)。使用引物 Hsp70Ara.1c(SEQ ID NO ： 46) 和 Hsp70Ara-SacI.1956r(SEQ ID NO ： 47)， 通过 RT-PCR 从拟南芥叶 RNA 中扩增 Athsp70-1 的 编码区。使用构建体 660(SEQ ID NO ： 53， 图 18) 作为模板， 用引物 Plato-443c(SEQ ID NO ： 5) 和 Hsp70Ara-Plasto.r(SEQ ID NO ： 48) 进行第二扩增。然后混合 PCR 产物， 并作使用引 物 Plasto-443c(SEQ ID NO ： 5) 和 Hsp70ARA-SacI.1956r(SEQ ID NO ： 47) 之第三扩增 ( 组 装反应 ) 的模板。所得片段用 HpaI( 在质体蓝素启动子中 ) 消化， 并克隆进用 HpaI( 在 Nir 启动子中 ) 和 SacI 消化并用 T4DNA 聚合酶处理以产生平末端的 pCAMBIANir3K51 中。筛选 正确取向的所得克隆， 并测序以检验序列完整性。所得质粒称为 R860， 其示于图 43 中 (SEQ ID NO ： 78)。
     按照以下所述组装双 Hsp 表达质粒。 R860(SEQ ID NO ： 78 ； 图 43) 用 BsrBI(NOS 终 止子下游 ) 消化， 用 T4DNA 聚合酶处理以产生平末端， 并用 SbfI( 嵌合 NIR/Plasto 启动子 的上游 ) 消化。将所得片段 ( 嵌合 Nir/Plasto 启动子 -HSP70 编码序列 -Nos 终止子 ) 克 隆进预先用 SbfI 和 SmaI( 均位于嵌合 Nir/Plasto 启动子上游的多克隆位点中 ) 消化的 R850(SEQ ID NO ： 77 ； 图 42) 中。所得质粒称为 R870， 其示于图 44 中 (SEQ ID NO ： 79)。3. 其他表达盒的组装
     HcPro 表达盒
     如 Hamilton 等 (2002) 所述制备 HcPro 构建体 (35HcPro)。对所有克隆进行测 序以证实构建体的完整性。通过电穿孔 (Mattanovich 等， 1989) 用质粒转化根瘤农杆菌 (Agrobacteium tumefaciens)(AGL1 ； ATCC， Manassas， VA 20108， USA)。通过限制性图谱证 实所有根瘤农杆菌株的完整性。
     P19 表达盒
     通 过 基 于 PCR 的 连 接 方 法 (Darveau 等， Methods in Neuroscience 26 ： 77-85(1995)) 将番茄丛矮病毒 (TBSV)p19 蛋白的编码序列与苜蓿质体蓝素表达盒连接。 在 第一轮 PCR 中， 使用构建体 660(SEQ ID NO ： 53) 作为模板， 用引物 Plasto-443c(SEQ ID NO ： 5) 和 supP19-plasto.r(SEQ ID NO ： 49) 扩增质体蓝素启动子的区段。平行地， 使用构建体 35S ： p19( 如 Voinnet 等， The Plant Journal 33 ： 949-956(2003) 所述 ) 作为模板， 用引物 supP19-1c(SEQ ID NO ： 50) 和 SupP19-SacI.r(SEQ ID NO ： 51) 扩增含有 p19 编码序列的另 一片段。 然后混合扩增产物， 并用作使用引物 Plasto-443c(SEQ ID NO ： 5) 和 SupP19-SacI. r(SEQ ID NO ： 51) 之第二轮扩增 ( 组装反应 ) 的模板。所得片段用 BamHI( 在质体蓝素启 动子中 ) 和 SacI( 在 p19 编码序列末端 ) 消化， 并克隆进预先用同样的限制性酶消化的构 建体号 660(SEQ ID NO ： 53 ； 图 18) 中， 得到构建体号 R472。质粒 R472 示于图 45 中。
     构建体号 443
     构建体号 443 对应 pCAMBIA2300( 空载体 )。
     表 1. 用于表达盒组装的寡核苷酸引物。
     表2： 用于表达带有天然或 PDI 信号肽的流感血凝素的农杆菌菌株农杆菌菌株 AGL1/540 AGL1/774 AGL1/787 AGL1/732 AGL1/736 AGL1/660 AGL1/739 AGLI/828 AGLI/690 AGLI/691 AGLI/696 AGLI/733 表达的 HA H1(A/ 新喀里多尼亚 /20/99) H1(A/ 布里斯班 /59/2007) H1(A/ 布里斯班 /59/2007) H1(A/ 布里斯班 /59/2007) H3(A/ 布里斯班 /10/2007) H5(A 印度尼西亚 /5/2005) B(B/ 佛罗里达 /4/2006) CPMV HT-LC C51 H1/Bris RB+H5/Indo SDC H1/Bri E1-RB-E2+H5SDC H5/Indo RB+H1/NC SDC H1/Bri 信号肽 PDI 天然 PDI 天然 PDI 天然 PDI C51LC 天然 天然 PDI PDI 表达盒 质体蓝素 质体蓝素 质体蓝素 35S/CPMV-HT 35S/CPMV-HT 质体蓝素 35S/CPMV-HT 35S/CPMV-HT Plasto Plasto Plasto 35S/CPMV-HT40CN 102482328 A AGLI/734 AGLI/737 AGLI/745 AGL1/747
     说H1/Bri RB+H5/Indo SDC明书天然 PDI PDI PDI 35S/CPMV-HT 35S/CPMV-HT 35S/CPMV-HT 2X35S/CPMV-HT39/45 页H3/Bri 胞外结构域 +H5/Indo TDC B/Flo 胞外结构域 _H5/Indo TDC B/Flo 胞外结构域 _H5/Indo TDC4. 植物生物质的准备、 接种、 农杆菌侵染和收获
     在 填 装 市 售 泥 炭 基 质 的 平 地 上 从 种 子 培 养 本 塞 姆 氏 烟 草 (Nicotiana benthamiana)。使植物以 16/8 光照周期生长在温室中， 温度放方案白天 25℃ / 晚上 20℃。 播种 3 周后， 挑出各株幼苗， 移栽到盆中， 并在同样的环境条件下在温室中再生长 3 周。转 化前， 在以下所述的不同时间通过掐掉植物的芽或通过化学处理植物而除去顶芽和腋芽。
     在补充有 10mM 2-[N- 吗啉 ] 乙磺酸 (MES)、 20μM 乙酰丁香酮、 50μg/ml 卡那霉 素和 25μg/ml 羧苄青霉素的 YEB 培养基 (pH 5.6) 中培养用每种构建体转染的农杆菌， 直 至其 OD600 为 0.6 至 1.6。使用前将农杆菌混悬液离心并重悬在侵染培养基 (10mM MgCl2 和 10mM MES， pH 5.6) 中。如 Liu 和 Lomonossoff(2002， Journal of Virological Methods， 105 ： 343-348) 所述进行注射器侵染。对于真空侵染， 将根瘤农杆菌混悬液离心， 重悬在侵 染培养基中， 并储存在 4℃过夜。在侵染当天， 将分批培养物在 2.5 倍培养物体积中稀释并 在使用前温热。在 20-40 托真空下， 使本塞姆氏烟草或普通烟草 (N.tabacum) 的整个植株 倒置于气密性不锈钢罐中的细菌混悬液中 2 分钟。注射器或真空侵染后， 将植株移回温室 中培养 4-5 天直至收获。除非另外指明， 否则所有侵染均通过与 AGL1/35S-HcPro 以 1 ∶ 1 共侵染来进行， 具有 CPMV-HT 盒的毒株除外 ( 其与毒株 AGL1/R472 以 1 ∶ 1 共侵染 )。
     5. 叶片取样和总蛋白质提取
     培养后， 收获植株的地上部分， 冷冻在 -80℃， 破碎成碎片。通过将每个冷冻破碎 植物材料的样品在 3 倍体积的冷 50mM Tris(pH 8.0)0.15M NaCl， 0.04％焦亚硫酸钠和 1mM 苯甲基磺酰氟中匀浆 (Polytron) 来提取总的可溶性蛋白质。匀浆后， 于 4℃下以 20,000g 离心浆液 20 分钟， 将这些澄清的粗提物 ( 上清液 ) 用于分析。使用牛血清白蛋白作为参照 标准， 通过 Bradford 测定 (Bio-Rad， Hercules， CA) 来测定澄清的粗提物的总蛋白质含量。
     6. 蛋白质分析和免疫印迹
     蛋白浓度通过 BCA 蛋白测定 (Pierce Biochemicals， Rockport IL) 来测定。在还 原条件下通过 SDS-PAGE 分离蛋白质， 并用考马斯蓝染色。对经染色的凝胶进行扫描， 并使 用 ImageJ Software(NIH) 进行密度分析。
     用丙酮来沉淀来自 SEC 洗脱级分的蛋白质 (Bollag 等， 1996)， 重悬在 1/5 体积的 平衡 / 洗脱缓冲液中， 在还原条件下通过 SDS-PAGE 分离并电转移到聚偏氟乙烯 (PVDF) 膜 (Roche Diagnostics Corporation， Indianapolis， IN) 上用于免疫检测。 在免疫印迹之前， 用 Tris 缓冲盐水 (TBS-T) 中 5％脱脂奶和 0.1％ Tween-20 在 4℃下封闭膜 16-18 小时。
     通过用 2μg/ml 的合适抗体 ( 表 6)( 在 2％脱脂奶、 0.1％ TBS-Tween20 中 ) 孵育 进行免疫印迹。 用于化学发光检测的第二抗体示于表 4 中， 如所示将其在 2％脱脂奶、 0.1％
     TBS-Tween 20 中稀释。使用 luminol(Roche Diagnostics Corporation) 作为底物， 通过 化学发光检测免疫反应性复合物。使用 EZ-Link Plus 活化辣根过氧化物酶缀合试剂盒 (Pierce， Rockford， IL) 进行人 IgG 抗体的辣根过氧化物酶缀合。用作检测 H1、 H3 和 B 亚 型之对照的失活全病毒 (WIV) 从 National Institute for Biological Standards and Control(NIBSC) 购得。
     表3： 用于所表达蛋白质免疫印迹的电泳条件、 抗体和稀释
     FII ： Fitzgerald Industries International， Concord， MA， USA ；
     NIBSC ： National Institute for Biological Standards and Control ；
     JIR ： Jackson ImmunoResearch， West Grove， PA， USA ；
     ITC ： Immune Technology Corporation， Woodside， N Y， USA ；
     7.SEC 前的澄清和浓缩
     为了改善分辨率和增加洗脱级分的信号， 使用以下方法对待加载到体积排阻色谱 上的提取物粗蛋白提取物进行澄清和浓缩。 提取物在 4℃下以 70000g 离心 20 分钟， 沉淀通 过用 1 体积 ( 相比最初的提取物体积 ) 的提取缓冲液 (50mM Tris， pH8.0， 0.15M NaCl) 重 悬来清洗两次， 并在 4℃下以 70000g 离心 20 分钟。获得的沉淀重悬在 1/3 体积 ( 相比最初 的提取物体积 ) 中， 加入 20％ (w/v)PEG3350 然后在冰上孵育 1 小时使蛋白 ( 包括 VLP) 沉 淀。在 4℃下以 10000g 离心 20 分钟回收沉淀的蛋白质， 并重悬在 1/15 体积 ( 相比最初的 提取物体积 ) 的提取缓冲液中。完全重悬蛋白质后， 在 4℃下以 20000g 离心 5 分钟沉淀不 溶物， 回收清澈的上清液。
     8. 蛋白质提取物的体积排阻色谱
     装 填 32ml SephacrylTMS-500 高 分 辨 率 珠 (S-500HR ： GE Healthcare， Uppsala， Sweden， 货 号 17-0613-10) 的 体 积 排 阻 色 谱 (SEC) 柱， 用 平 衡 / 洗 脱 缓 冲 液 (50mM 的
     Tris(pH8)， 150mM NaCl) 平衡。将 1.5mL 粗蛋白质提取物加载到该柱上， 然后用 45mL 平 衡 / 洗脱缓冲液进行洗脱步骤。以 1.5mL 级分收集洗脱液， 洗脱级分的相对蛋白质含量这 样通过将 10μL 级分与 200μL 稀释的 Bio-Rad 蛋白染色试剂 (Bio-Rad， Hercales， CA) 混 合来监测。用 2 倍柱体积的 0.2N NaOH 清洗该柱， 然后用 10 倍柱体积的 50mM Tris(pH8)、 150mM NaCl 和 20％乙醇清洗。 每次分离之后用蓝葡聚糖 2000(GE HealthCare Bio-Science Corp.， Piscataway， NJ， USA) 校准柱。在每次分离之间对蓝葡聚糖 2000 和宿主可溶性蛋白 质的洗脱曲线进行比较， 以确保所用柱之间的洗脱曲线的一致性。
     实施例 1 ： 流感亚型茎上 RB 和 / 或酯酶结构域的替换策略
     H5/Indo 的 RB 亚结构域可以用 H1、 H3 或 B HA 的 RB 亚结构域替换。 得到的嵌合 HA 提供 SDC H5/Indo 以形成 VLP， 并显示包含 H1、 H3 或 B 免疫原性位点的 RB 亚结构域。H5/ Indo RB 亚结构域可以插入到 H1 茎上 (H1/NC)。图 15A 和 15B 显示了所示亚结构域融合位 点的氨基酸序列， 相应亚结构域的氨基酸序列显示在图 2( 构建体 690、 734、 696 和 691) 和 表 4( 构建体 900 和 745) 和表 5( 构建体 910、 920 和 930) 中。图 2 和表 4、 5 中显示的氨基 酸序列不包含信号肽序列。
     表 4 亚结构域和嵌合流感 HA。包含异源 RB 亚结构域的嵌合流感 HA。
     序列 SEQ ID NO ： 105 的 1-92 位氨基酸是 H5/Indo 的 F’ 1+E1 结构域 ； 93-259 位氨 基酸是 H3/ 布里斯班的 RB 头部结构域， 260-548 位氨基酸是 H5/Indo 的 E2+F’ 2 结构域。
     序列 SEQ ID NO ： 106 的 1-92 位氨基酸是 H5/Indo 的 F’ 1+E1 结构域 ； 93-276 位氨 基酸是 B/ 佛罗里达的 RB 头部结构域， 277-565 位氨基酸是 H5/Indo 的 E2+F’ 2 结构域。
     表 5 亚结构域和嵌合流感 HA。包含异源 RB 亚结构域的嵌合流感 HA。
     SEQ ID NO ： 107 的 1-42 位氨基酸是 H5/Indo 的 N 端 F’ 1 结构域 ； 43-228 位氨基 酸是 H3/ 布里斯班的 E1-RB-E2 头部结构域， 229-507 位氨基酸是 H5/Indo 的 F’ 2 结构域。
     SEQ ID NO ： 108 的 1-42 位氨基酸是 H5/Indo 的 N 端 F’ 1 结构域 ； 43-281 位氨基 酸是 B/ 佛罗里达的 E1-RB-E2 头部结构域 ； 282-556 位氨基酸是 H5/Indo 的 F’ 2 结构域。
     SEQ ID NO ： 109 的 1-42 位氨基酸是 H1/NC 的 N 端 F’ 1 结构域 ； 43-273 位氨基酸 是 H5/Indo 的 E1-RB-E2 头部结构域， 274-548 位氨基酸是 H1/NC 的 F’ 2 结构域。
     各个嵌合体的融合位点选择在邻近 ( 但不必然直接位于 ) 各个亚结构域的 N 和 C 端——不希望被理论约束， 选择这些融合位点以使嵌合 HA 的稳定性最大化。例如， 在 RB 亚 结构域的 N 端观察到结构和序列的保守性 (Ha 等 2002， EMBO J.21 ： 865-875 ； 在此通过引用 并入本文 )。 发现初级序列中变化较少的区域位于 E1 亚结构域 15 个氨基酸之前的 C-F Y-P 三联体中。此半胱氨酸参与在 HA 中保守的 3 号二硫桥 ( 参见图 46 和 47)。此半胱氨酸处 的连接可以为嵌合 HA 提供相对天然序列更加适合或更优的稳定性。RB 的 C 端提供保守特 征： 例如， 在比对中， 在所有 HA 中观察到的位点 1 处的保守丝氨酸残基和以 β 折叠起始的 E2 亚结构域 (Ha 等， 2002， EMBO J.21 ： 865-875 ； 其通过引用并入本文 )。因此， 此 RB 的 C 端 可以融合到 E2 亚结构域该 β 折叠结构的起始氨基酸上。并且， 对于在 H5/Indo SDC 上包 含 H1/NC、 H1Bri、 H3/Bri 或 B/Flo 的 RB 亚结构域的嵌合体和在 H1SDC 上包含 H5/Indo RB 但是在 H5 茎上 亚结构域的嵌合体 ( 共 6 个 )， 二硫桥模式没有变化或者没有实质性的变化， B RB 的杂交 HA 上添加了二硫桥 (8 号二硫键 )。添加此二硫桥不应当干扰 HA 的折叠 ( 因 为其位于 RB 结构域中， 并且半胱氨酸在序列中邻近 )， 并且可以提供更加稳定的杂交 HA。
     第一流感类型的 E1-RB-E2 亚结构域被替换为第二流感类型的 E1-RB-E2 亚结构 域。这种安排可以在 H5-VLP 表面显示更多的第二流感类型的氨基酸。在此实施例中， 将 H1、 H3 或 B 的 HDC 放置在 H5/IndoSDC 上， 将 H5/Indo 的 HDC 放置在 H1/NC SDC 上 ( 表 5)。
     用保守的半胱氨酸残基 ( 构成 HA 类型 A 中的 6 号二硫桥和 HA 类型 B 中的 7 号二 硫桥 ) 确定 HDC 的连接。E2 亚结构域 C 端的 HDC 连接用另一保守半胱氨酸残基确定， 其构 成 H5/Indo SDC 上流感类型 H1 或 H3 或者 H1SDC 上流感类型 H5 的 6 号二硫桥 (F’ 2 亚结构 域的第二氨基酸 )。对于乙型流感嵌合体， 在第一个半胱氨酸处建立连接， 该半胱氨酸构成 4 号二硫桥 ( 在 F’ 2 亚结构域上相隔 4 个氨基酸的位置， 并在 HA 之间保守 )。所得嵌合体 的二硫桥模式没有显示任何变化—— H1/H3/H5 杂交 HA 含有 6 个二硫桥， B 杂交 HA 具有 7 个二硫键。
     实施例 2 ： 用 H1A/ 布 里 斯 班 /59/2007 的 受 体 结 合 (RB) 或 受 体 结 合 和 酯 酶 (E1-RB-E2) 亚结构域替换 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 的相应部分 ： 嵌合体和天然形式的表达 的比较。
     为了将 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 的 VLP 高累积水平与 H1A/ 布里斯班 /59/2007 的 抗原性特点相联合， 设计了包含与 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 茎结构域簇融合的 H1A/ 布里斯 班 /59/2007 结构域的嵌合血凝素。表达 H5/H1 血凝素融合蛋白的表达盒显示于图 1， 产生 的成熟融合蛋白的氨基酸序列显示于图 2。
     为了比较 H5/H1 嵌合血凝素与其天然形式的累积水平， 用 AGL1/774、 AGL1/691 和 AGL1/690 侵染本塞姆氏烟草 (Nicotiana Benthamiana) 植株， 经过 6 天的孵育期后收获 叶。为了确定农杆菌侵染的叶中每种 HA 形式的累积水平， 从被侵染的叶组织中提取蛋白并 用抗 HA 单克隆抗体进行 Western 印迹分析。在用 AGL1/690 侵染的叶子提取物中检测到 约为 75kDa 的独特条带 ( 图 3)， 大小对应流感血凝素未切割的 HA0 形式， 但是在 AGL1/774 或 AGL1/691 中未检测到， 这表明包含与 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 骨架融合的 H1A/ 布里斯班 /59/2007 受体结合区的嵌合血凝素的累积水平高于 H1A/ 布里斯班 /59/2007 的天然形式 (AGL1/774)， 也高于联合 H1A/ 布里斯班 /59/2007 的酯酶和受体结合区和 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 骨架的嵌合血凝素。 用作阳性对照的灭活全病毒 (WIV)(H1A/ 布里斯班 /59/2007) 检 测为多个条带， 主要条带在约 80kDa 处， 对应 H1A/ 布里斯班 /59/2007 前体 HA0 的分子量。 这 些结果证明， 用 H1A/ 布里斯班 /59/2007 的受体结合区替换 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 的相应 部分产生嵌合血凝素， 其显示 H1 的抗原区并且其在植物中比天然 H1A/ 布里斯班 /59/2007 累积水平更高。但是， 其中 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 中酯酶和受体结合区被 H1A/ 布里斯班 /59/2007 的对应部分替换的嵌合血凝素在植物中没有累积到可以检测的水平。
     对将 H1A/ 布里斯班 /59/2007 的受体结合区与 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 骨架的融合 作为植物中呈递 H1 抗原之 VLP 的累积水平增加方法在基于 CPMV-HT 的强表达盒控制下进 行了再次评价。 还将此融合策略与增加累积水平的信号肽替换方法进行了比较。 在 CPMV-HT 控制下表达 H5/H1 血凝素融合蛋白的表达盒显示于图 8， 产生的成熟融合蛋白的氨基酸序 列显示于图 2。
     用 AGL1/732、 AGL1/733 或 AGL1/734 侵染本塞姆氏烟草植株， 6 天的孵育期后收 获烟草叶。为了确定农杆菌侵染的叶中每种 HA 形式的累积水平， 首先从被侵染的叶组织 中提取蛋白并用抗 H1( 布里斯班 ) 多克隆抗体进行 Western 印迹分析。在用 AGL1/732、AGL1/733 和 AGL1/734 侵染的叶提取物中检测到约为 75kDa 的独特条带 ( 图 6)， 大小对应 流感血凝素未切割的 HA0 形式， 但是， 虽然在所有分析的提取物中均检测到血凝素， 仍然可 以观察到累积水平的重要差异。在这些条件下， H1A/ 布里斯班 /59/2007 表达使用其天然 信号肽 (732) 几乎检测不到， 用 PDI 的信号肽替换信号肽后得到高累积水平的成熟 H1A/ 布 里斯班 /59/2007(733)， 嵌合 H5/H1 血凝素 (734) 累积水平最高。总之， 这些结果表明， 将 H1 的受体结合结构域与 H5 骨架融合导致呈递 H1 抗原之血凝素的高累积， 并且在植物中这 些融合蛋白的累积水平高于信号肽替换或未替换的天然形式所获得的累积水平。
     实施例 3 ： 用 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 的受体结合 (RB) 亚结构域替换 H1A/ 新喀里 多尼亚 /20/99 的相应部分。嵌合和天然形式的表达的比较。
     还评价了 H1 骨架 ( 来自 A/ 新喀里多尼亚 /20/99) 在呈递 H5 抗原区中的用途。 表 达 H1/H5 血凝素融合蛋白的表达盒显示于图 1， 产生的成熟融合蛋白的氨基酸序列显示于 图 2。
     为了比较 H1/H5 嵌合血凝素与其天然形式的累积水平， 用 AGL1/660 和 AGL1/696 侵染本塞姆氏烟草植株， 经过 6 天的孵育期后收获烟草叶。为了确定农杆菌侵染的叶子中 每种 HA 形式的累积水平， 从被侵染的叶组织中提取蛋白病用抗 H5( 印度尼西亚 ) 多克隆 抗体进行 Western 印迹分析。在用 AGL1/660 和 AGL1/696 侵染的叶提取物中检测到约为 75kDa 的独特条带 ( 图 7)， 大小对应流感血凝素未切割的 HA0 形式， 表明天然 H5A/ 印度尼 西亚 /5/05 和 H1/H5 嵌合血凝素两者均在植物中高水平累积。
     实施例 4 ： 用 H3 或 B 型流感的相应部分替换 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 的胞外结构 域。嵌合体和天然形式的表达的比较。
     评价了呈递 H3 和 B 型毒株血凝素抗原区同时增加它们在植物中的累积的以下策 略： 将 H3A/ 布里斯班 /10/2007 或 B 佛罗里达 /4/2006 的胞外结构域与来自 H5A/ 印度尼西 亚 /5/05 的跨膜和胞质亚结构域融合。表达 H5/H3 和 H5/B 血凝素融合蛋白的表达盒显示 于图 10， 融合边界的氨基酸显示于图 11。
     比较 H5/B 嵌合血凝素 (745) 与天然 HA B(739) 在本塞姆氏烟草植株中的累积水 平。 用 AGL1/739 和 AGL1/745 侵染植株， 经过 6 天的孵育期后收获烟草叶。 为了确定农杆菌 侵染的叶中每种 HA 形式的累积水平， 首先从被侵染的叶组织中提取蛋白并用抗 B( 佛罗里 达 ) 多克隆抗体进行 Western 印迹分析。 在用 AGL1/739 侵染的一个植株的叶提取物中检测 到约为 75kDa 的独特条带 ( 图 14)， 大小对应流感血凝素未切割的 HA0 形式， 而用 AGL1/745 侵染的 3 个植株显示相应血凝素阳性信号， 表明血凝素的 H5/B 嵌合形式比 B 血凝素天然形 式更经常获得高累积水平。
     类似地， 比较 H5/H3 嵌合血凝素 (737) 与其天然形式 (736) 在本塞姆氏烟草中的 累积水平。用 AGL1/736 和 AGL1/737 侵染植株， 经过 6 天的孵育期后收获烟草叶。为了确 定农杆菌侵染的叶子中每种 HA 形式的累积水平， 从被侵染的叶组织中提取蛋白病并用抗 H3( 布里斯班 ) 多克隆抗体进行 Western 印迹分析。在用 AGL1/736 和 AGL1/737 侵染的叶 提取物中检测到约为 75kDa 的独特条带 ( 图 15)， 大小对应流感血凝素未切割的 HA0 形式。 该结果表明来自 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 的跨膜和胞质亚结构域与 H3A/ 布里斯班 /10/2007 胞外结构域的融合获得与天然 H3A/ 布里斯班 /10/2007 累积水平类似的嵌合血凝素。
     使用体积排阻色谱评价来自 H5/B 嵌合血凝素 ( 构建体号 745) 表达的 VLP 生产。通过体积排阻色谱 (SEC) 在 SephacrylTM S-500HR 柱 (GE Healthcare Bio-Science Corp.， Piscataway， NJ， USA) 上对来自 AGL1/745 侵染植株的浓缩蛋白提取物 (1.5mL) 进行分级。 如图 16 所示， 蓝葡聚糖 (2M Da) 洗脱峰早在组分 8 中出现。将 200μL 每种 SEC 洗脱级分 中的蛋白质用丙酮沉淀法浓缩 (5 倍 ) 并用抗 B( 佛罗里达 ) 多克隆抗体进行 Western 印迹 分析 ( 图 16)， 嵌合血凝素主要出现在组分 7 中， 表明 HA 整合成高分子量结构。不希望被理 论束缚， 这表明嵌合 HA 蛋白组装成大型超结构或者其粘附到高分子量结构上。所获得的结 果表明， HA B 佛罗里达 /4/2006 胞外结构域与 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 的跨膜和胞质亚结 构域构成的嵌合 HA 组装成高分子量颗粒， 并且这些高分子量颗粒的洗脱谱与流感 VLP 的不 同。
     实施例 5 ： H5/B 嵌合血凝素 ( 构建体 747 ； 包含与 H5/Indo TDC 融合的 B/Flo HDC 和 SDC) 与 Hsp70 和 Hsp40 共表达并与信号肽修饰相组合。
     在共同待决申请 PCT/CA2009/000032 中描述了在植物中表达 Hsp40 和 Hsp70 以及 与流感血凝素共表达。植物来源的胞浆 Hsp70 和 Hsp40( 构建体号 R870) 可以与嵌合血凝 素共表达以增加它们在植物中的累积水平。用含有表达期望嵌合 HA 之表达盒的 AGL1 和 AGL1/R870 以及 AGL1/35ShcPro 的混合物 ( 比例为 1 ∶ 1 ∶ 1) 的细菌悬液农杆菌侵染本塞 姆氏烟草植物进行共表达。
     评价在塞姆氏烟草植株中与 HSP40 和 HSP70 共表达的 H5/B 嵌合血凝素 ( 融合 H5/ Indo TDC 的 B/Flo HDC 和 SDC) 的累积水平。用 AGL1/747、 AGL1/747+AGL1/443( 空载体 ) 或 AGL1/747+AGL1/R870(HSP40/HSP70) 侵染植株， 经过 6 天的孵育期后收获烟草叶。为了 确定农杆菌侵染的叶中 H5/B 嵌合 HA 的累积水平， 首先从被侵染的叶组织中提取蛋白并用 抗 B( 佛罗里达 ) 多克隆抗体进行 Western 印迹分析。在用 AGL1/747+AGL1/R870 侵染的 3 株植株的叶提取物中检测到约为 75kDa 的独特条带 ( 图 50)， 大小对应流感血凝素未切割的 HA0 形式， 而 AGL1/747+ 对照载体 (443) 侵染的 3 个植株未显示信号 ( 在所使用的暴露条件 下 )， 表明 H5/B 嵌合形式的血凝素在与 HSP40 和 HSP70 伴侣蛋白共表达时高水平累积。
     所有引用的文献均通过引用并入本文， 就如同每个具体的文献均具体和单独显示 为通过引用并入本文的一样， 并且如同它们在本文中被完全给出一样。本文对参考文献的 引用不被解释为或认为是认同这些参考文献是本发明的现有技术。
     在说明书中大量使用了一些术语， 并且提供了定义帮助理解本发明的多个方面。 在说明书中使用的实例 ( 包括术语的实例 ) 仅用作说明目的， 而不旨在限制本发明实施方 案的范围和含义。数值范围包括定义范围的数值。在说明书中， 词语 “包含” 用作开放式术 语， 基本上等同于术语 “包括但不限于” ， 词语 “含有” 具有相应的含义。
     本发明涉及病毒样颗粒。更具体而言， 本发明涉及包含嵌合流感血凝素的病毒样 颗粒和生产嵌合流感病毒样颗粒的方法。
     发明背景
     流感是由呼吸道病毒引起的人死亡的首要原因， 在流感季节， 估计全世界 10 ～ 20％的人口被感染， 每年导致 250 ～ 500,000 的死亡。
     目前抗击人流感的方法是每年接种。疫苗通常是几种毒株的组合， 这些毒株被预 测为即将到来的流感季节的强势毒株 (dominant strain)， 但是每年生产的疫苗剂数量不 足以接种全世界人口。例如， 根据目前的产量加拿大和美国获得足以免疫其约三分之一人 口的疫苗剂， 而仅有 17％的欧洲人口可接种疫苗——在世界范围的流感大流行到来时， 该 产量是不够的。 即使在给定年份中所需的年产量可以某种方式实现， 但强势毒株逐年变化， 因此在一年中的低需求时间大量储备是不实际的。经济、 大规模地生产有效的流感疫苗是 政府和私营企业等极为关注的。
     流感血凝素 (HA) 表面糖蛋白是受体结合蛋白也是膜融合蛋白。它是具有相同亚 基的三聚体， 每个亚基包含两条二硫键连接的多肽 HA1 和 HA2， 它们来自前体 HA0 的蛋白水 解切割， HA0 的 N 端有信号肽序列， HA0 的 C 端有膜锚定序列。形成 HA1 和 HA2 的切割产生 较小多肽 HA2 的 N 端， HA2 的 C 端有膜锚定序列。切割对膜融合活性是必需的， 但对免疫原 性不是必需的。HA2 的 N 端序列被称为 “融合肽” ， 因为类似疏水序列的切割也是其他病毒 融合蛋白所需要的， 并且该序列 20 个残基的合成肽类似物在体外与膜融合。
     一般来说， 球形 “头部” 的表面包含几个柔性环， 其具有良好表征并且可变的抗原 区域， 称为位点 A、 B、 C、 D 和 E( 综述见 Wiley 等， 1987.Annu Rev Biochem 56 ： 365-394)。 已描述了在一些位点 ( 例如 B 和 E) 插入或替换短肽序列以进行免疫研究 (Garcia-Sastré 等 1995.Biologicals 23 ： 171-178)。大小从 53 至 246 个氨基酸的表皮生长因子 (EGF)、 单 链 抗 体 (scFV) 和 IgG 的 Fc 结 构 域 已 被 插 入 到 H7 的 N 端， 并且已成功表达嵌合体 (Hatziioannou 等， 1999.Human Gene Therapy 10 ： 1533-1544)。 最 近， 炭疽芽孢杆菌 (Bacillus anthracis) 保护性抗原的 90 和 140 个氨基酸的结构域已被融合到 H3 的氨基 末端 (Li 等， 2005.J.Virol 79 ： 10003-1002)。Copeland(Copeland 等， 2005.J.Virol 79 ： 6459-6471) 描述了在 H3 柄 (stalk) 上表达 gp120Env HIV 表面糖蛋白， 其中 gp120 结构域 替换了 HA 的整个球状头部。
     已开发了几种重组产物作为候选重组流感疫苗。这些方法集中于甲型流感病毒 HA 和 NA 蛋白的表达、 生产和纯化， 包括用杆状病毒感染的昆虫细胞 (Crawford 等， 1999 Vaccine 17 ： 2265-74 ； Johansson， 1999 Vaccine 17 ： 2073-80)、 病毒载体和 DNA 疫苗构建 体 (Olsen 等， 1997 Vaccine 15 ： 1149-56) 表达这些蛋白质。
     生产用于疫苗目的的非感染性流感病毒株是避免意外感染的一种方法。作为替 代， 已研究了用作培养病毒之替代物的病毒样颗粒 (virus-like particle， VLP)。VLP 模拟
     病毒衣壳的结构， 但缺少基因组， 因此不能复制或提供用于再次感染的工具。 目前流感病毒 VLP 的生产技术依赖于多种病毒蛋白的共表达， 这种依赖性是这些技术的缺点， 因为在大流 行和每年流行的情形中， 响应时间对于接种来说是至关重要的。需要更简单的 VLP 生产系 统 ( 例如依赖于仅一种或几种病毒蛋白的表达而不需要表达非结构病毒蛋白 ) 来加快疫苗 的开发。
     包膜病毒可在从被感染细胞 “出芽” 时获得脂质包膜， 并且从质膜或内部细胞器 的膜获得膜。例如在哺乳动物细胞或杆状病毒细胞系统中， 流感病毒从质膜出芽 (Quan 等 2007 J.Virol 81 ： 3514-3524)。已知仅有几种包膜病毒感染植物 ( 例如， 番茄斑萎病毒 (Tospovirus) 和弹状病毒 (Rhabdovirus) 的成员 )。已知的植物包膜病毒的特征在于从宿 主细胞的内膜出芽， 而不是从质膜出芽。虽然已在植物宿主中生产了少量重组 VLP， 但它们 均不来源于质膜， 这引出了如下问题， 即是否可以在植物中生产质膜来源的 VLP， 包括流感 病毒 VLP。
     在任何系统中形成 VLP 都对蛋白质结构要求很高——改变对应于选定球状结构之 表面环的短序列可能对多肽本身的表达没有太大影响， 但是缺乏证明这些改变影响 VLP 形 成的结构研究。HA 多个区域的协调和结构 ( 例如膜锚定序列， 将球状头部与膜分隔开的三 聚体柄或茎区域 ) 随病毒而进化， 并且可能不能进行类似的改变而不对 HA 三聚体完整性和 VLP 的形成造成损失。
     在 WO 2009/009876 中， 本发明人已描述了流感 HAVLP 的生产。 发明内容 本发明涉及病毒样颗粒。更具体而言， 本发明涉及包含嵌合流感血凝素的病毒样 颗粒和生产嵌合流感血凝素病毒样颗粒的方法。
     本发明的一个目的是提供改进的嵌合流感病毒样颗粒 (VLP)。
     本发明提供了包含嵌合流感 HA 的多肽， 该嵌合流感 HA 包含茎结构域簇 (stem domain cluster， SDC)、 头 部 结 构 域 簇 (head domain cluster， HDC) 和 跨 膜 结 构 域 簇 (transmembrane domain cluster， TDC)， 其中 ： SDC 包含 F’ 1、 F’ 2 和 F 亚结构域 ； HDC 包含 RB、 E1 和 E2 亚结构域 ； TDC 包含 TmD 和 Ctail 亚结构域 ； 并且其中至少一个亚结构域来自 第一流感 HA， 其他亚结构域来自一种或更多种第二流感 HA。第一和第二流感 HA 可独立地 选自 H1、 H3、 H5 和 B。而且， 多肽可以包含信号肽。
     本发明还提供了编码包含嵌合流感 HA 之多肽的核酸， 该嵌合流感 HA 包含茎结构 域簇 (SDC)、 头部结构域簇 (HDC) 和跨膜结构域簇 (TDC)， 其中 ： SDC 包含 F’ 1、 F’ 2和F亚 结构域 ； HDC 包含 RB、 E1 和 E2 亚结构域 ； TDC 包含 TmD 和 Ctail 亚结构域 ； 并且其中至少一 个亚结构域来自第一流感 HA， 其他亚结构域来自一种或更多种第二流感 HA。 ， 核酸还可以 编码除所述 SDC、 HDC 和 TDC 外包含信号肽的多肽。
     还提供了在植物中生产嵌合流感病毒样颗粒 (VLP) 的方法， 该方法包括 ：
     a) 向植物或其部分引入编码嵌合流感 HA 的核酸， 该嵌合流感 HA 包含信号肽、 茎 结构域簇 (SDC)、 头部结构域簇 (HDC) 和跨膜结构域簇 (TDC)， 其中 ： SDC 包含 F’ 1、 F’ 2和 F 亚结构域 ； HDC 包含 RB、 E1 和 E2 亚结构域 ； TDC 包含 TmD 和 Ctail 亚结构域 ； 并且其中至 少一个亚结构域来自第一流感 HA， 其他亚结构域来自一种或更多种第二流感 HA， 和
     本发明的一个目的是提供改进的嵌合流感病毒样颗粒 (VLP)。
     本发明提供了包含嵌合流感 HA 的多肽， 该嵌合流感 HA 包含茎结构域簇 (stem domain cluster， SDC)、 头 部 结 构 域 簇 (head domain cluster， HDC) 和 跨 膜 结 构 域 簇 (transmembrane domain cluster， TDC)， 其中 ： SDC 包含 F’ 1、 F’ 2 和 F 亚结构域 ； HDC 包含 RB、 E1 和 E2 亚结构域 ； TDC 包含 TmD 和 Ctail 亚结构域 ； 并且其中至少一个亚结构域来自 第一流感 HA， 其他亚结构域来自一种或更多种第二流感 HA。第一和第二流感 HA 可独立地 选自 H1、 H3、 H5 和 B。而且， 多肽可以包含信号肽。
     本发明还提供了编码包含嵌合流感 HA 之多肽的核酸， 该嵌合流感 HA 包含茎结构 域簇 (SDC)、 头部结构域簇 (HDC) 和跨膜结构域簇 (TDC)， 其中 ： SDC 包含 F’ 1、 F’ 2和F亚 结构域 ； HDC 包含 RB、 E1 和 E2 亚结构域 ； TDC 包含 TmD 和 Ctail 亚结构域 ； 并且其中至少一 个亚结构域来自第一流感 HA， 其他亚结构域来自一种或更多种第二流感 HA。 ， 核酸还可以 编码除所述 SDC、 HDC 和 TDC 外包含信号肽的多肽。
     还提供了在植物中生产嵌合流感病毒样颗粒 (VLP) 的方法， 该方法包括 ：
     a) 向植物或其部分引入编码嵌合流感 HA 的核酸， 该嵌合流感 HA 包含信号肽、 茎 结构域簇 (SDC)、 头部结构域簇 (HDC) 和跨膜结构域簇 (TDC)， 其中 ： SDC 包含 F’ 1、 F’ 2和 F 亚结构域 ； HDC 包含 RB、 E1 和 E2 亚结构域 ； TDC 包含 TmD 和 Ctail 亚结构域 ； 并且其中至 少一个亚结构域来自第一流感 HA， 其他亚结构域来自一种或更多种第二流感 HA， 和
     b) 在允许核酸表达的条件下孵育植物或其部分， 从而生产 VLP。
     本发明包括上述方法， 其中在引入步骤 ( 步骤 a) 中， 核酸以瞬时方式引入植物中。 或者， 在引入步骤 ( 步骤 a) 中， 核酸被引入植物并且稳定整合。 该方法还可包括步骤 ： c) 收 获宿主并纯化 VLP。
     本发明提供了包含嵌合流感 HA 或编码嵌合流感 HA 之核酸序列的植物或其部分， 该嵌合流感 HA 包含茎结构域簇 (SDC)、 头部结构域簇 (HDC) 和跨膜结构域簇 (TDC)， 其中 ： SDC 包含 F’ 1、 F’ 2 和 F 亚结构域 ； HDC 包含 RB、 E1 和 E2 亚结构域 ； TDC 包含 TmD 和 Ctail 亚结构域 ； 并且其中至少一个亚结构域来自第一流感 HA， 其他结构域来自一种或更多种第 二流感 HA。
     该植物或其部分还可包含核酸， 该核酸包含与在植物中有活性之调控区有效连接 的编码一种或多于一种伴侣蛋白 (chaperone protein) 的核苷酸序列。所述一种或多于一 种伴侣蛋白可选自 Hsp40 和 Hsp70。
     本发明涉及包含嵌合流感 HA 的病毒样颗粒 (VLP)， 该嵌合流感 HA 包含茎结构域 簇 (SDC)、 头部结构域簇 (HDC) 和跨膜结构域簇 (TDC)， 其中 ： SDC 包含 F’ 1、 F’ 2 和 F 亚结 构域 ； HDC 包含 RB、 E1 和 E2 亚结构域 ； TDC 包含 TmD 和 Ctail 亚结构域 ； 并且其中至少一个 亚结构域来自第一流感 HA， 其他结构域来自一种或更多种第二流感 HA。VLP 还可包含植物 特异性的 N- 聚糖或修饰的 N- 聚糖。 还提供了包含有效剂量的上述 VLP 和可药用载体的组合物。
     在本发明的另一方面， 提供了在对象中诱导对流感病毒感染的免疫的方法， 包括 向对象施用 VLP。VLP 可以经口、 皮内、 鼻内、 肌内、 腹腔内、 静脉内或皮下施用给对象。
     可与编码嵌合 HA 蛋白之序列有效连接的调控区包括在植物细胞、 昆虫细胞或酵 母细胞中有效的调控区。这样的调控区可包括质体蓝素调控区、 核酮糖 1， 5- 二磷酸羧化酶 / 加氧酶 (RuBisCO) 调控区、 叶绿素 a/b 结合蛋白 (CAB) 调控区或 ST-LS1 调控区。 其他调控 区包括 5’ UTR、 3’ UTR 或终止子序列。质体蓝素调控区可以是苜蓿质体蓝素调控区 ； 5’ UTR、 3’ UTR 或终止子序列也可以是苜蓿序列。
     本发明提供了嵌合流感 HA 多肽， 由第一流感和第二流感构成， 第一流感和第二流 感可独立地选自 B、 H1、 H2、 H3、 H4、 H5、 H6、 H7、 H8、 H9、 H10、 H11、 H12、 H13、 H14、 H15 和 H16 ； 前提是第一流感和第二流感不是相同的流感类型、 亚型或不具有相同的来源。
     根据本发明的一些方面， 嵌合流感 HA 多肽包含信号肽序列， 所述信号肽序列可选 自天然信号肽序列、 苜蓿 PDI 信号肽序列、 流感 H5 信号肽序列和流感 H1 信号肽序列。
     本发明提供了在能够生产 VLP 的宿主 ( 包括植物、 昆虫或酵母 ) 中生产包含嵌合 流感血凝素 (HA) 的 VLP 的方法， 其包括在宿主中引入编码嵌合流感 HA 的核酸， 和在允许核 酸表达的条件下孵育宿主， 从而生产 VLP， 该嵌合流感 HA 包含茎结构域簇 (SDC)、 头部结构 域簇 (HDC) 和跨膜结构域簇 (TDC)， 其中 ： SDC 包含 F’ 1、 F’ 2 和 F 亚结构域 ； HDC 包含 RB、 E1 和 E2 亚结构域 ； TDC 包含 TmD 和 Ctail 亚结构域 ； 并且其中至少一个亚结构域来自第一 流感 HA， 其他结构域来自一种或更多种第二流感 HA。
     与在昆虫细胞培养物中生产 VLP 相比， 在植物中生产这些颗粒具有若干优点。植 物脂质可刺激特定免疫细胞并增强所诱导的免疫应答。植物的膜由脂质、 磷脂酰胆碱 (PC) 和磷脂酰乙醇胺 (PE) 构成， 并且还包含植物和一些细菌及原生动物所特有的鞘糖脂。鞘脂
     类不常见的原因是它们不是甘油酯 ( 例如 PC 或 PE)， 而是由与含有多于 18 个碳的脂肪酸链 形成酰胺键的长链氨基醇组成。PC 和 PE 以及鞘糖脂可结合哺乳动物免疫细胞 ( 例如抗原 呈递细胞 (APC)， 如树突状细胞和巨噬细胞 ) 和另一些细胞 ( 包括胸腺和肝脏中的 B 淋巴 细胞和 T 淋巴细胞 ) 表达的 CD1 分子。此外， 除植物脂质的存在所具有的潜在佐剂作用外， 植物 N- 聚糖促进抗原呈递细胞捕获糖蛋白抗原的能力对在植物中生产嵌合 VLP 也可以是 有利的。不希望受理论限制， 预计由植物生产的嵌合 VLP 比在其他生产体系中制得的嵌合 VLP 诱导更强的免疫反应， 并且与由活或减毒全病毒疫苗诱导的免疫反应相比， 由这些植物 生产的嵌合 VLP 诱导的免疫反应更强。
     与由全病毒制得的疫苗相比嵌合 VLP 具有优势， 这是因为它们无感染性， 因此限 制性生物防范问题不再像使用感染性全病毒时那么重要， 并且不是生产所必需的。由植物 生产的嵌合 VLP 的另一优点是， 允许表达系统生长在温室或田间， 从而显著地更经济并适 于扩大规模。
     另外， 植物不包含参与合成唾液酸残基以及将其添加到蛋白质中的酶。 VLP 的生产 可以不需要神经氨酸酶 (NA)， 并且不需要共表达 NA 或者用唾液酸酶 ( 神经氨酸酶 ) 处理生 产细胞或提取物以确保 VLP 在植物中的生产。
     该发明概述未必描述本发明的所有发明特征。
     附图简述
     通过参照附图的以下描述， 本发明的这些和其他特征会更加明显， 在附图中 ：
     图 1 显示 HA 亚结构域的示意图。SP ： 信号肽， F’ 1、 F’ 2和F： 融合亚结构域 ； RB ： 受体结合亚结构域， E1 和 E2 ： 酯酶亚结构域， TMD/CT ： 跨膜和胞质尾区亚结构域。图 1B 显示基于质体蓝素的表达盒 ( 构建体号 774、 540、 660、 690、 691、 696) 的示意图， 该表 达盒表达天然和嵌合形式的血凝素 H1A/ 布里斯班 /59/2007(H1/Bri)、 血凝素 H1A/ 新喀 里多尼亚 /20/99(H1/NC) 和血凝素 H5A/ 印度尼西亚 /5/05(H5/Indo)。Plasto pro ： 苜 蓿质体蓝素启动子， Plasto ter ： 苜蓿质体蓝素终止子， SP ： 信号肽， RB ： 受体结合亚结构 域， E1-RB-E2 ： 酯酶和受体结合亚结构域， TMD/CT ： 跨膜和胞质尾亚结构域， PDI ： 苜蓿蛋 白二硫键异构酶。图 1C 显示几种流感 HA 的氨基酸序列比对， 附加了结构比对 ： (B/ 佛罗 里 达 /4/2006(B 佛 罗 里 达 )， SEQ ID NO ： 94(GenBank 登 录 号 ACA33493.1 ； B/ 马 来 西 亚 /2506/2004(B- 马 来 西 亚 )， SEQ ID NO ： 95(GenBank 登 录 号 ABU99194.1) ； H1/Bri(A- 布 里斯班 )， SEQ ID NO ： 96(GenBank 登录号 ADE28750.1 ； H1A/ 所罗门群岛 /3/2006(A-Sol. Isl)， SEQ ID NO ： 97(GenBank 登 录 号 ABU99109.1) ； H1/NC(A-NewCal)， SEQ ID NO ： 98(GenBank 登录号 AAP34324.1 ； H2A/ 新加坡 /1/1957(A- 新加坡 )， SEQ ID NO ： 99(GenBank 登 录 号 AAA64366.1) ； H3A/ 布 里 斯 班 /10/2007(A- 布 里 斯 班 )， SEQ IDNO ： 100(GenBank 登录号 ACI26318.1) ； H3A/ 威斯康星 /67/2005(A-WCN)， SEQ ID NO ： 101(GenBank 登录号 ABO37599.1) ； H5A/ 安徽 /1/2005(A- 安徽 )， SEQ ID NO ： 102(GenBank 登录号 ABD28180.1) ； H5A/ 越南 /1194/2004(A- 越南 )， SEQ ID NO ： 103(GenBank 登录号 ACR48874.1) ； H5-Indo， SEQ ID NO ： 104(GenBank 登录号 ABW06108.1。标示了 F’ 1、 酯酶 1、 受体结合、 酯酶 2、 F′ 2、 肽融合、 TMD/CT 亚结构域之间的界限以及二硫桥。
     图 2 显 示 用 构 建 体 690、 734(SEQ ID NO ： 11)、 696(SEQ ID NO ： 112)( 上 图 ) 和 691(SEQ ID NO ： 113)( 下图 ) 表达的嵌合 HA 所示亚结构域的氨基酸序列。SEQ ID NO ： 111的 1-92 位氨基酸是 H5/Indo 的 F’ 1+E1 结构域 ； 93-263 位氨基酸是 H1/ 布里斯班的 RB 头 部结构域， 264-552 位氨基酸是 H5/Indo 的 E2+F’ 2 结构域。SEQ ID NO ： 112 的 1-92 位氨基 酸是 H5/NC 的 F’ 1+E1 结构域 ； 93-301 位氨基酸是 H5/Indo 的 RB 头部结构域， 302-586 位氨 基酸是 H1/NC 的 E2+F’ 2 结构域。SEQ ID NO ： 113 的 1-42 位氨基酸是 H5/Indo 的 F’ 1结 构域 ； 43-273 位氨基酸是 H1/ 布里斯班的 E1-RB-E2 头部结构域， 274-552 位氨基酸是 H5/ Indo 的 F’ 2 结构域。
     图 3 显示构建体 690 和 734(SEQ ID NO ： 80) 编码区的氨基酸序列， 其包含 H1/Bri 的 RB 亚结构域、 H5/Indo 信号肽和包含 H5/Indo F’ 1、 E1、 E2 和 F 亚结构域的茎结构域复 合体 (stem domain complex， SDC)。
     图 4 显示构建体 691(SEQ ID NO ： 81) 编码区的氨基酸序列， 其包含 H1/Bri 头部结 构域复合体 (HDC)( 包含 E1、 RB、 E2)、 H5/Indo 信号肽和包含 H5/Indo F’ 1、 F’ 2 和 F 亚结 构域的茎结构域复合体 (SDC)。
     图 5 显示构建体 696(SEQ ID NO ： 82) 编码区的氨基酸序列， 其包含 H5/Indo 的 RB 亚结构域、 PDI 信号肽和包含 F’ 1、 E1、 E2 和 F’ 2 的 H1/NC 茎结构域复合体。
     图 6 显示在植物中天然形式、 构建体 774( 包含 H1/Bri)、 构建体 692( 包含 H1/Bri 的头部结构域复合体 (HDC)) 和构建体 690( 包含与 H5/Indo 茎结构域复合体 (SDC) 融合的 H1/Bri 的 RB 亚结构域 ) 的 H1/Bri 表达的免疫印迹分析。对于每个构建体， 分析来自 3 个 独立植物的总蛋白提取物。 对于所分析的每个植物， 上样的蛋白质为 20 微克。 用抗 HA 单克 隆抗体 ( 抗 H1- 布里斯班 ； FII 10-I50) 显示 Western 印迹。构建体 774 表达具有 H1/Bri 天然信号肽的 H1/Bri ； 构建体 690、 691 表达具有 H5/Indo 天然信号肽的 HA。
     图 7 显示天然形式、 构建体 660( 包含 H5/Indo) 或构建体 696( 包含与 H1/NC SDC、 E1 和 E2 亚结构域融合的 H1/Indo RB 亚结构域 ) 的 H5/Indo 表达的免疫印迹分析。对于每 个构建体， 分析来自 3 个独立植物的总蛋白提取物。对于所分析的每个植物， 上样的蛋白质 为 20 微克。用抗 H5 印度尼西亚多克隆抗体 (ITC IT-003-005V) 显示 Western 印迹。构建 体 660 表达具有其天然信号肽的 H5/Indo ； 构建体 696 表达具有 PDI 信号肽的嵌合 HA。
     图 8 显示基于 35SCPMV/HT 的表达盒的示意图， 该表达盒表达天然 ( 构建体 732) 和 嵌合 ( 构建体 733 和 734) 形式的 H1/Bri。构建体 733 包含 PDI 信号肽和 H1/Bri 的 HDC、 SDC 和跨膜结构域复合体 (transmembrane domain complex， TDC)， 构建体 734 包含 H5/Indo 信号肽、 F’ 1、 E1、 E2、 F’ 2、 F 和来自 H1/Bri 的 RB。35S Dro ： CaMV 35S 启动子， NOS ter ： 胭脂氨酸合酶终止子， SP ： 信号肽， RB ： 受体结合亚结构域， E1-RB-E2 ： 酯酶和受体结合亚结 构域， TMD/CT ： 跨膜和胞质尾亚结构域， PDI ： 苜蓿蛋白二硫键异构酶 ； CPMV-HT ： 可过量翻译 (hyper translatable) 的豇豆花叶病毒表达系统的 5’ 和 3’ 元件。
     图 9 显示天然形式、 构建体 732( 包含在基于 35SCPMV/HT 的表达盒控制下的 H1/ Bri)、 构建体 733( 包含与 H1/Bri 融合的 PDI 信号肽 ； 在基于 35SCPMV/HT 的表达盒的控制 下 ) 或构建体 734( 包含与 H5/Indo SDC、 E1 和 E2 亚结构域融合的 H1/Bri RB 亚结构域 ； 在 基于 35SCPMV/HT 的表达盒的控制下 ) 的 H1/Bri 表达的免疫印迹分析。对于每个构建体， 分析来自 3 个独立植物的总蛋白提取物。对于所分析的每个植物， 上样蛋白为 5 微克。用 抗 HA 单克隆抗体检测 (FII 10-I50) 显示 Western 印迹。
     图 10 显示基于 35SCPMV/HT 的表达盒的示意图， 该表达盒表达 H3A/ 布里斯班/10/2007(H3/Bri) 和 B/ 佛罗里达 /4/2006HA(B/Flo) 血凝素。构建体 736 包含与 PDI 信 号肽融合的 H3/Bri。构建体 737 包含与 PDI 信号肽融合的 H3/Bri 和 H5/Indo TMD/CT。构 建体 739 包含与 PDI 信号肽融合的 B/Flo。构建体 745 包含与 PDI 信号肽融合的 B/Flo 和 H5/Indo TMD/CT。35S pro ： CaMV 35S 启动子， NOS ter ： 胭脂氨酸合酶终止子， SP ： 信号肽， RB ： 受体结合亚结构域， E1-RB-E2 ： 酯酶和受体结合亚结构域， TMD/CT ： 跨膜和胞质尾亚结 构域， PDI ： 苜蓿蛋白二硫键异构酶 ； CPMV-HT ： 可过量翻译的豇豆花叶病毒表达系统的 5’ 和 3’ 元件。
     图 11 显示构建体 745 和 737 中的融合边界。HA 序列的起始用锥形头箭头标示。 跨膜结构域的氨基酸为 QILSIYSTVA， ， 其前面是部分胞外结构域的氨基酸。
     图 12 显示嵌合 H5/H3 血凝素 (SEQ ID NO ： 83， 构建体 737) 的氨基酸序列， 其包含 PDI 信号肽、 H3A/ 布里斯班 /10/2007 的胞外结构域和 H5A/ 印度尼西亚 /5/2005 的 TMD/CT。
     图 13 显示嵌合 H5/B 血凝素 (SEQ ID NO ： 84) 的氨基酸序列， 其包含构建体号 745 的开放阅读框所编码的 B/ 佛罗里达 /4/2006 的胞外结构域和 H5A/ 印度尼西亚 /5/2005 的 TMD/CT。
     图 14 显示天然形式、 构建体 739( 包含 PDI-B/Flo) 或构建体 745( 包含与 H5/Indo TDC 融合的 B/Flo HDC 和 SDC) 的 B/Flo 表达的免疫印迹分析。对于每个构建体， 分析来自 3 个独立植物的总蛋白提取物。 对于所分析的每个植物， 上样的蛋白为 20 微克。 用抗 HA B/ 佛罗里达多克隆抗体 (NIBSC 07/356) 显示 Western 印迹。 图 15 显示天然形式、 构建体 736( 包含 PDI sp-H3/Bri) 或构建体 737( 与 H5/Indo TDC 融合的 H3/Bri HDC 和 SDC) 的 H3/Bri 表达的免疫印迹分析。对于每个构建体， 分析来 自 3 个独立植物的总蛋白提取物。对于所分析的每个植物， 上样的蛋白为 20 微克。用抗 H3 布里斯班多克隆抗体 (NIBSC 08/124) 显示 Western 印迹。
     图 16 显示用构建体号 745 侵染之植物的叶蛋白质提取物的体积排阻色谱。对于 每种级分， 显示洗脱级分的相对蛋白含量。在级分 7 至 15 中使用抗 HA B/ 佛罗里达多克隆 抗体 (NIBSC 07/356) 对血凝素进行的免疫检测 (Western 印迹 ) 在图下显示。箭头标示蓝 葡聚糖 2000 的洗脱峰 ( 级分 8)。
     图 17 显示合成片段的核酸序列 (SEQ ID NO ： 52)， 其包含完整 H5(A/ 印度尼西亚 /5/05(H5N1)) 编码区 ( 包含信号肽和终止密码子 )， 在 5’ 侧翼有 HindIII 位点， 在 3’ 侧翼 有 SacI 位点。
     图 18 显示构建体 660 的核酸序列 (SEQ ID NO ： 53)， 构建体 660 是 HA 表达盒， 其 包含苜蓿质体蓝素启动子和 5’ UTR、 H5 型 A/ 印度尼西亚 /5/05(H5N1) 血凝素的编码序列、 苜蓿质体蓝素 3’ UTR 和终止子序列。
     图 19 显示无 TmD 和 Ctail 的野生型 H1(A/ 新喀里多尼亚 /20/99(H1N1))(GenBank 登录号 AY289929) 编码序列的核酸序列 (SEQ ID NO ： 54)。
     图 20 显示合成片段的核酸序列 (SEQ ID NO ： 55)， 该合成片段包含缺少 TmD 和 Ctail 的 H1(A/ 新喀里多尼亚 /20/99(H1N1)) 编码序列。在 5’ 区， 最后几个核苷酸来自 PDI SP 并且包含 BglII 限制性位点， 在 3’ SacI/StuI 双位点位于紧邻终止密码子的下游。
     图 21 显示包含 C-ter H1(A/ 新喀里多尼亚 /20/99(H1N1)) 编码序列 ( 包含 TmD 和 Ctail) 的合成片段的核酸序列 (SEQ ID NO ： 56)， 其从 KpnI 位点至终止密码子 (3’ 侧翼
     是 SacI/StuI 双位点 )。
     图 22 显示来自紫苜蓿 (Medicago sativa) 蛋白二硫键异构酶 mRNA 的核苷酸序列。 GenBank 登录号 Z11499(SEQ ID NO ： 57)。核苷酸 32-103 编码 PDI 信号肽。
     图 23 显示 PromPlasto-PDISP-Plasto 3’ UTR 质粒的核苷酸序列。图 23A 显示 PromPlasto-PDISP(SEQ ID NO ： 58) 的核苷酸序列。图 23B 显示 Plasto 3’ UTR(SEQ ID NO ： 85) 的核苷酸序列。蛋白二硫键异构酶 (PDI) 信号肽序列用下划线表示。用于克隆的 BglII(AGATCT) 和 SacI(GAGCTC) 限制性位点以黑体显示。
     图 24 显示 HA 表达盒的核酸序列 (SEQ ID NO ： 59 ； 构建体 540)， 该表达盒包含苜 蓿质体蓝素启动子和 5’ UTR、 PDI 信号肽和 H1 型 A/ 新喀里多尼亚 /20/99(H1N1) 的编码序 列、 苜蓿质体蓝素 3’ UTR 和终止子序列。来自 A/ 新喀里多尼亚 /20/1999 的 H1 编码序列用 下划线表示。
     图 25 显示合成片段的核酸序列 (SEQ ID NO ： 60)， 其包含完整 H1(A/ 布里斯班 /59/07(H1N1)) 编码区 ( 包含信号肽和终止密码子 )， 在 5’ 侧翼有以 DraIII 位点起始的苜 蓿质体蓝素基因序列 ( 对应于起始 ATG 上游前 84 个核苷酸 )， 3’ 侧翼有 SacI 位点。
     图 26 显示 HA 表达盒的核酸序列 (SEQ ID NO ： 61， 构建体 774)， 该 HA 表达盒包含 苜蓿质体蓝素启动子和 5’ UTR、 H1 型 A/ 布里斯班 /59/07(H1N1) 的血凝素编码序列、 苜蓿 质体蓝素 3’ UTR 和终止子序列。 图 27 显示表达盒号 828(SEQ ID NO ： 62) 的核酸序列， 从 PacI( 启动子上游 ) 至 AscI( 紧邻 NOS 终止子的下游 )。CPMV HT 3’ UTR 序列用下划线表示， 其中突变的 ATG 用黑 体表示。Apa1 限制性位点用下划线和斜体表示。
     图 28 显示嵌合 H5/H1 表达盒的核酸序列 (SEQ ID NO ： 63， 构建体 690)， 该表达盒 包含苜蓿质体蓝素启动子和 5’ UTR、 嵌合血凝素编码序列、 苜蓿质体蓝素 3’ UTR 和终止子序 列。嵌合 HA 编码序列用下划线表示。
     图 29 显示嵌合 H5/H1 表达盒的核酸序列 (SEQ ID NO ： 64， 构建体 691)， 该表达盒 包含苜蓿质体蓝素启动子和 5’ UTR、 嵌合血凝素编码序列、 苜蓿质体蓝素 3’ UTR 和终止子序 列。嵌合 HA 编码序列用下划线表示。
     图 30 显示嵌合 H1/H5 表达盒的核酸序列 (SEQ ID NO ： 65， 构建体 696)， 该表达盒 包含苜蓿质体蓝素启动子和 5’ UTR、 嵌合血凝素编码序列、 苜蓿质体蓝素 3’ UTR 和终止子序 列。嵌合 HA 编码序列用下划线表示。
     图 31 显示 HA 表达盒的核酸序列 (SEQ ID NO ： 66， 构建体 732)， 该 HA 表达盒包 含 CaMV 35S 启动子、 CPMV-HT 5’ UTR、 H1 型 A/ 布里斯班 /59/07(H1N1) 血凝素编码序列、 CPMV-HT 3’ UTR 和 NOS 终止子序列。H1/Bri 的编码序列用下划线标示。
     图 32 显示中间构建体 787 从 ATG 到终止的编码序列的核酸序列 (SEQ ID NO ： 67)。
     图 33 显示 SpPDI H1/Bri 表达盒的核酸序列 (SEQ ID NO ： 68， 构建体号 733)， 该 表达盒包含 CaMV 35S 启动子、 CPMV-HT 5’ UTR、 PDI 信号肽编码序列、 H1 型 A/ 布里斯班 /59/07(H1N1) 血凝素编码序列、 CPMV-HT 3’ UTR 和 NOS 终止子序列。SpPDI H1/Bri 编码序 列用下划线表示。
     图 34 显示嵌合 H5/H1 表达盒的核酸序列 (SEQ ID NO ： 69， 构建体 734)， 该表达盒 包含 CaMV 35S 启动子、 CPMV-HT 5’ UTR、 嵌合血凝素编码序列、 CPMV-HT 3’ UTR 和 NOS 终止
     子序列。嵌合 HA 的编码序列用下划线表示。
     图 35 显示合成片段的核酸序列 (SEQ ID NO ： 70)， 该合成片段包含完整 H3(A/ 布 里斯班 /10/07(H3N2)) 编码区 ( 包含信号肽和终止密码子 )， 5’ 侧翼有以 DraIII 位点起始 的苜蓿质体蓝素基因序列 ( 对应于起始 ATG 上游前 84 个核苷酸 )， 3’ 侧翼有 SacI 位点。
     图 36 显示 HA 表达盒的核酸序列 (SEQ ID NO ： 71， 构建体 736)， 该 HA 表达盒包含 CaMV 35S 启动子、 CPMV-HT 5’ UTR、 PDI 信号肽编码序列、 H3 型 A/ 布里斯班 /10/07(H2N3) 血凝素编码序列、 CPMV-HT3’ UTR 和 NOS 终止子序列。Sp PDI H3/Bris 编码序列用下划线 表示。
     图 37 显示嵌合 H5/H3 表达盒的核酸序列 (SEQ ID NO ： 72， 构建体号 737)， 该表达 盒包含 CaMV 35S 启动子、 CPMV-HT 5’ UTR、 嵌合血凝素编码序列、 CPMV-HT 3’ UTR 和 NOS 终 止子序列。嵌合 HA 的编码序列用下划线表示。
     图 38 显示合成片段的核酸序列 (SEQ ID NO ： 73)， 该合成片段包含完整 HA(B/ 佛 罗里达 /4/06) 编码区 ( 包含信号肽和终止密码子 )， 5’ 侧翼有以 DraIII 位点起始的苜蓿 质体蓝素基因序列 ( 对应于起始 ATG 上游前 84 个核苷酸 )， 3’ 侧翼有 SacI 位点。
     图 39 显示 HA 表达盒的核酸序列 (SEQ ID NO ： 74， 构建体 739)， 该 HA 表达盒包含 CaMV 35S 启动子、 CPMV-HT 5’ UTR、 PDI 信号肽编码序列、 HA 型 B/ 佛罗里达 /4/06 血凝素 编码序列、 CPMV-HT 3’ UTR 和 NOS 终止子序列。Sp PDI B/Flo 编码序列用下划线表示。
     图 40 显示嵌合 H5/B 表达盒的核酸序列 (SEQ ID NO ： 75， 构建体 745)， 该表达盒包 含 CaMV 35S 启动子、 CPMV-HT 5’ UTR、 嵌合血凝素编码序列、 CPMV-HT 3’ UTR 和 NOS 终止子 序列。嵌合 HA 的编码序列用下划线表示。
     图 41 显示编码 Msj1 的核酸序列 (SEQ ID NO ： 76)。
     图 42 显示部分构建体号 R850 的核酸序列 (SEQ ID NO ： 77)， 从 HindIII( 在多克 隆位点中， 启动子上游 ) 至 EcoRI( 紧邻 NOS 终止子的下游 )。HSP40 编码序列用下划线表 示。
     图 43 显示部分构建体号 R860 的核酸序列 (SEQ ID NO ： 78)， 从 HindIII( 在多克 隆位点中， 启动子上游 ) 至 EcoRI( 紧邻 NOS 终止子的下游 )。HSP70 编码序列用下划线表 示。
     图 44 显示部分构建体号 R870 的核酸序列 (SEQ ID NO ： 79)， 从 HindIII( 在多克 隆位点中， 启动子 5’ 上游 ) 至 EcoRI( 紧邻 NOS 终止子的下游 )。HSP40 编码序列用下划线 和斜体表示， HSP70 编码序列用下划线表示。A) 核苷酸 1-4946 ； B) 核苷酸 4947-9493。
     图 45 显示构建体 R472 的示意图。
     图 46 显 示 甲 型 流 感 的 二 硫 桥 模 式。 桥 编 号 ： 1)Cys4HA1-Cys137HA2、 2)Cys60HA1-Cys72HA1 、 3)Cys94HA1-Cys143HA1 、 4)Cys292HA1-Cys318HA1 、 5) Cys144HA2-Cys148HA2 和 6)Cys52HA1-Cys277HA1。甲和乙亚型之间二硫桥的差异 ( 图 47) 用箭头标示。使用成熟 H3 蛋白的编号。
     图 47 显 示 乙 型 流 感 HA 的 二 硫 桥 模 式。 桥 编 号 ： 1)Cys4HA1-Cys137HA2、 2)Cys60HA1-Cys72HA1 、 3)Cys94HA1-Cys143HA1 、 4)Cys292HA1-Cys318HA 1 、 5) Cys144HA2-Cys148HA2 、 6)Cys52HA1-Cys277HA1 、 7)Cys54HA1-Cys57HA1 和 8) Cys178HA1-Cys272HA1。甲和乙亚型之间二硫桥的差异 ( 图 46) 用箭头标示。使用成熟 H3蛋白的编号。
     图 48 显示结构域替换 (swap) 融合连接的示意图。图 48A 显示来自 H1/Bri、 H3/ Bri 和 B/Flo 的 RB 亚结构域与 H5/Indo SDC 的融合， 和 H5/Indo 的 RB 亚结构域与 H1/NC 茎 结构域的融合。图 48B 显示来自 H1/Bri、 H3/Bri 或 B/Flo 的 E1-RB-E2 亚结构域 (HDC) 与 H5/Indo SDC 的融合， 和 H5/Indo HDC 与 H1/NC SDC 的融合。
     图 49A 显示 H1A/ 加利福尼亚 /04/09 的核苷酸序列 (SEQ ID NO ： 86)。苜蓿蛋白 二硫键异构酶信号肽编码序列用下划线表示， 成熟 H1 编码序列用黑体突出显示。图 49B 显 示 H1A/ 加利福尼亚 /04/09 的氨基酸序列 (SEQID NO ： 87)。苜蓿蛋白二硫键异构酶信号肽 序列用下划线表示。
     图 50 显示用未稀释的 AGL1/747 侵染、 与 AGL1/443( 空载体 ) 共侵染和与 AGL1/ R870(HSP40/HSP70) 共侵染后， H5/B 嵌合血凝素 ( 构建体 747， 包含与 H5/Indo TDC 融合的 B/Flo HDC 和 SDC) 表达的免疫印迹分析。对于每个构建体， 分析来自 3 个独立植物的总蛋 白提取物。对于所分析的每个植物， 上样的蛋白为 20 微克。用抗 B/ 佛罗里达多克隆抗体 (NIBSC) 显示 Western 印迹。
     图 51A 显示 2X35S 启动子序列 (SEQ ID NO ： 88) 的核苷酸序列。图 51B 显示构建 体 747(SEQ ID NO ： 93) 从 PacI(35S 启动子上游 ) 至 AscI( 紧邻 NOS 终止子下游 ) 的核苷 酸序列。嵌合 HA 的编码序列用下划线表示。2X35S 启动子序列用斜体表示。 详细描述
     本发明涉及病毒样颗粒。更具体而言， 本发明涉及包含嵌合流感血凝素的病毒样 颗粒和生产嵌合流感病毒样颗粒的方法。
     下面描述的是一个优选的实施方案。
     本发明提供了包含编码嵌合流感血凝素 (HA) 之核苷酸序列的核酸， 其与在植物 中有活性的调控区有效连接。
     此外， 本发明提供了在植物中生产病毒样颗粒 (VLP) 的方法。所述方法包括向植 物或植物部分中引入编码嵌合流感 HA 的核酸序列 ( 与在植物中有活性的调控区有效连 接 )， 并且在允许该核酸表达的条件下孵育植物或植物部分， 从而产生 VLP。
     本发明还提供了包含嵌合流感 HA 的 VLP。可以通过本发明提供的方法生产 VLP。
     “嵌合蛋白” 或 “嵌合多肽” 是指包含来自于两种或多于两种来源的氨基酸序列的 蛋白质或多肽， 例如但不限于， 作为单个多肽融合的两种或更多种流感类型或亚型或者不 同来源的流感。嵌合蛋白或多肽可以包含与剩余多肽或蛋白质相同或异源的信号肽。嵌合 蛋白或嵌合多肽可以作为转录本从嵌合核苷酸序列中转录， 嵌合蛋白或嵌合多肽在合成后 被切割， 并且根据需要结合形成多聚体蛋白。 因此， 嵌合蛋白或嵌合多肽还包括这样的蛋白 质或多肽， 其包含通过二硫桥连接的亚基 ( 即多聚体蛋白 )。例如， 包含来自两种或更多种 来源的氨基酸序列的嵌合多肽可被加工成亚基， 该亚基通过二硫桥连接， 产生嵌合蛋白或 嵌合多肽 ( 见图 46 和 47)。多肽可以是血凝素 (HA)， 每个形成多肽的两条或更多条氨基酸 序列可以从不同的 HA 获得， 以生产嵌合 HA 或嵌合流感 HA。嵌合 HA 还可以包括这样的氨 基酸序列， 其包含在蛋白合成后或过程中被切割的异源信号肽 ( 嵌合 HA 前体蛋白 )。优选 地， 嵌合多肽或嵌合流感 HA 不是天然的。编码嵌合多肽的核酸可以被描述成 “嵌合核酸” 或 “嵌合核苷酸序列” 。包含嵌合 HA 的病毒样颗粒可以被描述成 “嵌合 VLP” 。
     本发明多个实施方案的嵌合流感 HA 可包含茎结构域复合体 (SDC)、 头部结构域复 合体 (HDC) 和跨膜结构域复合体 (TDC)， 其中 SDC、 HDC 或 TDC 中的一个或多于一个亚结构 域来自第一流感 HA 类型、 亚型或者来自一个来源， 并且 SDC、 HDC 或 TDC 中的一个或多于一 个亚结构域来自第二流感 HA 类型、 亚型或者来自第二或不同来源。如本文所述， “SDC” 包 含 F’ 1、 F’ 2 和 F 亚结构域， “HDC” 包含 RB、 E1 和 E2 亚结构域， “TDC” 包含 TmD 和 Ctail 亚 结构域 (TMD/CT ； 参见图 1A、 46 和 47)。
     术语 “病毒样颗粒” (VLP) 或 “VLP” 是指自组装并包含结构蛋白 ( 如流感 HA 蛋白 或嵌合流感 HA 蛋白 ) 的结构。一般来说 VLP 和嵌合 VLP 的形态和抗原性类似于感染中产 生的病毒粒， 但是缺乏足以复制的遗传信息， 因此不具有感染性。VLP 和嵌合 VLP 可以在适 当的宿主细胞 ( 包括植物宿主细胞 ) 中生产。从宿主细胞中提取后， 在适当条件下分离并 进一步纯化后， VLP 和嵌合 VLP 可以作为完整结构被纯化。
     本发明的产生于流感来源蛋白的嵌合 VLP 或 VLP 不包含 M1 蛋白。已知 M1 蛋白结 合 RNA(Wakefield and Brownlee， 1989)， 而 RNA 是 VLP 制备时的污染物。在嵌合 VLP 产品 获得监管批准时， 不希望存在 RNA， 因此缺失 RNA 的嵌合 VLP 制剂是有利的。
     本发明的嵌合 VLP 可以在特征为缺少使蛋白质唾液酸化之能力的宿主细胞中产 生， 所述宿主细胞如植物细胞、 昆虫细胞、 真菌和其他生物 ( 包括海绵动物、 腔肠动物、 环节 动物、 节肢动物、 软体动物、 线形动物 (nemathelminthea)、 trochelmintes、 扁形动物、 毛颚 动物、 触手动物、 衣原体、 螺旋体、 革兰氏阳性细菌、 蓝细菌、 古细菌等。参见例如 Gupta 等， 1999.Nucleic Acids Research 27 ： 370-372 ； Toukach 等， 2007.NucleicAcids Research 35 ： D280-D286 ； Nakahara 等， 2008.Nucleic Acids Research 36 ： D368-D371。如本文所述 生产的 VLP 通常不含有神经氨酸酶 (NA)。然而， 如果期望获得包含 HA 和 NA 的 VLP， 可以将 NA 与 HA 共表达。
     本发明还提供包含从表达嵌合 HA 的细胞的质膜获得脂质包膜的嵌合 HA 的 VLP。 例如， 如果嵌合 HA 在基于植物的系统中表达， 那么得到的 VLP 可从该植物细胞的质膜获得 脂质包膜。
     一般而言， 术语 “脂质” 是指脂溶性的 ( 亲脂性 ) 天然分子。根据本发明的一些方 面在植物中生产的嵌合 VLP 可以与植物来源的脂质形成复合物。植物来源的脂质可以是脂 双层的形式， 并且还可以包含包裹 VLP 的包膜。 植物来源的脂质可以包含生产 VLP 之植物的 质膜脂质组分， 包括磷脂， 三、 二和单甘油酯， 以及脂溶性固醇或包含固醇的代谢物。 实例包 括磷脂酰胆碱 (PC)、 磷脂酰乙醇胺 (PE)、 磷脂酰肌醇、 磷脂酰丝氨酸、 鞘糖脂、 植物固醇或 其组合。植物来源的脂质还可称为 “植物脂质” 。植物固醇的例子包括菜油甾醇、 豆甾醇、 麦 角甾醇、 菜籽甾醇、 Δ-7- 豆甾醇、 Δ-7- 燕麦甾醇、 daunosterol、 谷甾醇， 24- 甲基胆固醇、 胆固醇或 β- 谷甾醇——参见例如， Mongrand 等， 2004。本领域技术人员应理解细胞质膜 的脂质成分可随获得细胞的细胞或生物或物种的培养或生长条件而异。一般而言， β- 谷 甾醇是最丰富的植物甾醇。
     细胞膜通常包含脂双层以及多种功能的蛋白质。 在脂双层中可发现局部集中的特 定脂质， 称为 “脂筏 (lipid raft)” 。鞘酯和固醇中富含这些脂筏微结构域。不希望受理论 限制， 脂筏可在胞吞和胞吐作用、 病毒或其他感染原的进入或逸出、 细胞间信号转导、 与细 胞或生物的其他结构组分 ( 例如细胞内和细胞外基质 ) 的相互作用中起重要作用。本发明包括包含嵌合 HA 的 VLP， 其中 HA 的亚结构域可以从可感染人的任何类型、 亚型的流感病毒中获得， 包括例如 B、 H1、 H2、 H3、 H4、 H5、 H6、 H7、 H8、 H9、 H10、 H11、 H12、 H13、 H14、 H15 和 H16 类型或亚型。在一些实施方案中， 流感病毒可以是 H1、 H3、 H5 或 B 类型或亚 型。H1、 H3、 H5 或 B 类型或亚型的非限制性例子包括 A/ 新喀里多尼亚 /20/99 亚型 (H1N1) ( “H1/NC” ； SEQ ID NO ： 56)、 H1A/ 加利福尼亚 /04/09 亚型 (H1N1)(″ H1/Cal″； SEQ ID NO ： 86)、 A/ 印度尼西亚 /5/05 亚型 (H5N1)(“H5/Indo” )、 A/ 布里斯班 /59/2007(“H1/Bri” ) 和 B/ 佛罗里达 /4/2006(“B/Flo” ) 和 H3A/ 布里斯班 /10/2007(“H3/Bri” )。并且， 嵌 合 HA 可以包含分离自一种或更多种现有或新鉴定流感病毒的一种或更多种血凝素亚结构 域， 。
     本发明还涉及感染其他哺乳动物或宿主动物的流感病毒， 所述动物如人、 灵长类、 马、 猪、 鸟类、 水禽、 候鸟、 鹌鹑、 鸭、 鹅、 家禽、 鸡、 骆驼、 犬科动物、 狗、 猫科动物、 猫、 虎、 豹、 麝 猫、 水貂、 石貂、 雪貂、 宠物、 家畜、 小鼠、 大鼠、 海豹、 鲸等。一些流感病毒可以感染超过一种 宿主动物。
     对于流感病毒， 本文所用术语 “血凝素” 或 “HA” 是指流感病毒颗粒的结构糖蛋白。 流感血凝素的结构已有深入的研究， 并且显示高度保守的二级、 三级和四级结构。即使氨 基酸序列变化仍观察到此结构保守性 ( 参见例如 Skehel 和 Wiley， 2000 Ann Rev Biochem 69 ： 531-69 ； Vaccaro 等 2005， 通过引用并入本文 )。编码 HA 的核苷酸序列是公知的并 且可获得， 参见例如 BioDefense and Public Health base( 例如 URL ： biohealthbase. org/GSearch/home.do ？ decorator ＝ Influenza) 或美国国立生物技术信息中心 (NCBI ； 参 见 URL ： ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez ？ db ＝ nuccore&cmd ＝ search&term ＝ influenza)， 两者均通过引用并入本文。
     HA 单体可进一步分为 3 个功能性结构域——茎结构域或茎结构域簇 (SDC)、 球状 头部结构域或头部结构域簇 (HDC) 和跨膜结构域簇 (TDC)。SDC 包含 4 个亚结构域， 融合 肽 F、 F’ 1 和 F’ 2( 该亚结构域一般可以称为 “骨架” )。TDC 包含两个亚结构域， 跨膜 (TmD) 和 C 端尾部 (CT)。HDC 包含三个亚结构域， 残留酯酶结构域 E1’ 和 E2 以及受体结合结构域 RB。SDC 和 HDC 可以统称为 “胞外结构域” 。Ha 等 2002(EMBO J.21 ： 865-875 ； 通过引用并入 本文 ) 发表的文献根据 X 射线结晶结构， 阐明了几个流感亚型中 SDC 和 HDC 多种亚结构域 的相对定位。图 1A 显示与 HA1 和 HA2 多肽 N 端和 C 端相关的亚结构域示意图。图 1C 提供 多种流感亚型的标示的结构比对。
     流感病毒血凝素中允许氨基酸变化。该变化提供不断被鉴定的新毒株。新毒株之 间感染性可以有差异。但是， 保持了血凝素三聚体的形成， 其随后形成 VLP。因此本发明提 供了包含嵌合 HA 的血凝素氨基酸序列或编码在植物中形成 VLP 的嵌合血凝素氨基酸序列 的核酸， 并且包括已知序列和可产生的变体 HA 序列。本发明还涉及包含 TDC、 SDC 和 HDC 的 嵌合 HA 多肽的用途。例如嵌合 HA 蛋白可以是 HA0， 或包含来自两种或更多种流感类型之 HA1 和 HA2 亚结构域的经切割嵌合 HA。嵌合 HA 蛋白可以用于使用植物或植物细胞表达系 统生产或形成 VLP。
     HA0 可以表达并折叠形成三聚体， 然后可组装成 VLP。HA0 的切割产生 HA1 和 HA2 多肽， 它们通过二硫桥连接 ( 参见图 1C、 46 和 47 对二硫桥模式的图解 )。对于感染性病毒 颗粒， 需要前体 HA0 的切割来引发 HA2 的构象变化， 该变化释放融合肽 ( 在 HA2 多肽的 N端 ) 并使其可用于融合细胞和病毒膜。但是， VLP 没有感染性， 不需要切割 HA 形成 HA1 和 HA2( 例如在疫苗生产中 )。未切割的 HA0 前体也组装成三聚体并从质膜出芽形成 VLP 纳米 颗粒。
     HA0 多肽包含几个结构域。 HDC 的 RB 亚结构域在抗原区包含几个环， 称为位点 A-E。 可以中和感染性流感病毒的抗体经常靶向一个或更多个这些位点。残留酯酶亚结构域 (E1 和 E2) 可在融合中发挥作用， 并且可结合 Ca++。F、 F’ 1 和 F’ 2 结构域相互作用并协同形成 茎， 使得 HA 三聚体的头部位于膜之上。TmD 和 CT 可参与折叠 HA 在膜上的锚定。TmD 可在 HA 对脂筏的亲和中发挥作用， 而 CT 可在 HA 的分泌中发挥作用， 并且 CT 亚结构域中存在的 一些半胱氨酸残基可是棕榈酰化的。信号肽 (SP) 还可存在于 HA0 多肽的 N 端。图 2 以及 表 4 和 5 提供了一些流感病毒亚型的 SP、 F’ 1、 F’ 2、 E1、 RB、 E2 和 F 结构域的氨基酸序列的 实例。
     在流感血凝素的表达和 / 或分泌过程中对 N 端信号肽 (SP) 序列进行加工可在 HA 折叠中发挥作用。术语 “信号肽” 一般是指通常见于血凝素多肽 N 端的短 ( 约 5-30 个氨基 酸 ) 氨基酸序列， 其可指导新翻译的多肽转位至特定细胞器， 或者辅助多肽链的特定结构 域相对于其他结构域的定位。血凝素的信号肽将蛋白质的转位靶向至内质网， 已提出该信 号肽辅助近 N 端结构域相对于新生血凝素多肽之膜锚定结构域的定位， 以辅助成熟血凝素 的切割和折叠。
     HA 在宿主细胞内质网 (ER) 膜内的插入、 信号肽切割和蛋白质糖基化是共翻译事 件。HA 的正确折叠需要蛋白质糖基化和至少 6 个链内二硫键的形成 ( 参见图 46 和 47)。 在图 46 中， 显示甲亚型 HA 的每个单体具有 6 个保守二硫桥。通过比较， B HA 的单体 ( 图 47) 具有 7 个二硫桥， 其中 5 个在甲型中有对应结构 ( 综述见 Skehel 和 Wiley， 2000.Ann Rev Biochem 69 ： 531-569 ； 在如 Gamblin 等 2004， Science 303 ： 1838-1842 中描述了阐释 分子内和分子间二硫桥和其他保守氨基酸及其相对位置的结构实例 ； 两者均通过引用并入 本文 )。本领域技术人员应理解， 重要的是制备嵌合 HA 时保证获得类似排列的二硫桥。
     信号肽可以是血凝素中天然存在的， 或者信号肽可与被表达血凝素的初级序列异 源。嵌合 HA 可以包含来自第一流感类型、 亚型或毒株的信号肽， 而其余的 HA 来自一种或多 于一种的不同流感类型、 亚型或毒株。例如 HA 亚型 B H1、 H2、 H3、 H5、 H6、 H7、 H9 或乙型流 感的天然 SP 可用于在植物系统中表达 HA。在本发明的一些实施方案中， SP 可以来自乙型、 H1、 H3 或 H5 流感 ； 或来自亚型 H1/Bri、 H1/NC、 H5/Indo、 H3/Bri 或 B/Flo。
     SP 还可以是非天然的， 例如来自非流感病毒之病毒的结构蛋白或血凝素， 或者来 自植物、 动物或细菌多肽。可以使用的信号肽的非限制性实例是苜蓿蛋白二硫键异构酶 (PDI SP ； 登记号 Z11499 的 32-103 位核苷酸 ； SEQ ID NO ： 34 ； 图 17)， 其具有氨基酸序列 ：
     MAKNVAIFGLLFSLLLLVPSQIFAEE(32-103 位核苷酸 ； SEQ ID NO ： 34)。
     因此本发明提供了包含天然或非天然信号肽的嵌合流感血凝素和编码该嵌合血 凝素的核酸。
     血凝素的正确折叠对蛋白质稳定性、 多聚体形成、 VLP 形成和 HA 的功能 ( 血细胞 凝集能力 ) 等流感血凝素特性可以是重要的。蛋白质折叠可受一个或更多个因素影响， 包 括但不限于 ： 蛋白质序列、 蛋白质相对丰度、 细胞内拥挤程度、 可与折叠的、 部分折叠的或未 折叠的蛋白质结合或瞬时联合的辅因子的可获得性、 一种或更多种伴侣蛋白的存在等。热休克蛋白 (Hsp) 或应激蛋白是伴侣蛋白的实例， 其可参与多种细胞过程， 包括 蛋白质合成、 细胞内运输、 错误折叠的防止、 蛋白质凝集的防止、 蛋白质复合物的组装和去 组装、 蛋白质折叠和蛋白质解聚。这样的伴侣蛋白的实例包括但不限于 Hsp60、 Hsp65、 Hsp 70、 Hsp90、 Hsp100、 Hsp20-30、 Hsp10、 Hsp100-200、 Hsp100、 Hsp90、 Lon、 TF55、 FKBP、 亲环蛋 白 (cyclophilin)、 ClpP、 GrpE、 泛素、 钙联蛋白 (calnexin) 和蛋白质二硫键异构酶 ( 参见 例如 Macario， A.J.L.， Cold Spring Harbor Laboratory Res.25 ： 59-70.1995 ； Parsell， D.A.&Lindquist， S.Ann.Rev.Genet.27 ： 437-496(1993) ； 美国专利 No.5,232,833)。 如本文 所述， 伴侣蛋白 ( 例如但不限于 Hsp40 和 Hsp70) 可以用于保证嵌合 HA 的折叠。
     Hsp70 的 实 例 包 括 来 自 哺 乳 动 物 细 胞 的 Hsp72 和 Hsc73、 来自细菌特别是分 枝 杆 菌 ( 如 麻 风 分 枝 杆 菌 (Mycobacterium leprae)、 结 核 分 枝 杆 菌 (Mycobacterium tuberculosis) 和牛分枝杆菌 (Mycobacterium bovis)( 例如卡介苗 (Bacille-Calmette Guerin) ： 本文中称为 Hsp71)) 的 DnaK。 来自大肠杆菌、 酵母和其他原核生物的 DnaK 以及来 自真核生物 ( 例如拟南芥 (A.thaliana)) 的 BiP 和 Grp78(Lin 等， 2001(Cell Stress and Chaperones 6 ： 201-208))。 Hsp70 的具体实例是拟南芥 Hsp70( 由 Genbank ref ： AY120747.1 编码 )。Hsp70 能够特异性地结合 ATP 以及未折叠的多肽和肽， 从而参与蛋白质折叠和去折 叠和蛋白质复合物的组装和去组装。
     Hsp40 的实例包括来自原核生物 ( 例如大肠杆菌和分枝杆菌 ) 的 DnaJ 和来自真核 生物 ( 例如苜蓿 ) 的 HSJ1、 HDJ1 和 Hsp40(Frugis 等， 1999.Plant Molecular Biology 40 ： 397-408)。Hsp40 的具体实例是紫花苜蓿 (M.sativa)MsJ1(AJ000995.1 或 SEQ ID NO ： 76)。 Hsp40 在蛋白质折叠、 耐热和 DNA 复制等细胞活动中作为分子伴侣起作用。图 41 显示编码 Msj1 的核酸序列 (SEQ ID NO ： 76)。
     在 Hsp 中， Hsp70 及其辅伴侣蛋白 (co-chaperone)Hsp40 参与合成完成前正在翻译 的和新合成的多肽的稳定。不希望受理论的限制， Hsp40 与未折叠 ( 新生或新转移的 ) 多 肽的疏水片区 (patch) 结合， 从而有利于 Hsp70-ATP 复合物与多肽的相互作用。 ATP 水解导 致多肽、 Hsp70 和 ADP 之间形成稳定的复合物并释放 Hsp40。Hsp70-ADP 复合物与多肽之疏 水片区的联合阻止其与其他疏水片区的相互作用， 防止不正确折叠和与其他蛋白质的凝集 ( 综述见 Hartl， FU.1996.Nature 381 ： 571-579)。
     天然伴侣蛋白可能能够利于低水平的重组蛋白质的正确折叠， 然而随着表达水平 的增加， 天然伴侣蛋白的丰富可成为限制因素。农杆菌浸染叶中血凝素的高水平表达可导 致血凝素多肽在胞质溶胶中累积， 而共表达一种或更多种伴侣蛋白 ( 例如 Hsp70、 Hsp40 或 者 Hsp70 和 Hsp40 两者 ) 可降低错误折叠或凝集的血凝素多肽的水平， 并且增加显示出允 许血细胞凝集和 / 或病毒样颗粒形成之三级和四级结构特性的多肽数。SEQ IDNO ： 77 是构 建体号 R850 从 HindIII( 在多克隆位点中， 启动子上游 ) 至 EcoRI( 紧邻 NOS 终止子的下游 ) 的部分核酸序列， 其编码 HSP40( 下划线 )。SEQ ID NO ： 78 是构建体号 R860 从 HindIII( 在 多克隆位点中， 启动子上游 ) 至 EcoRI( 紧邻 NOS 终止子的下游 ) 的部分核酸序列， 其编码 HSP70( 下划线 )。SEQ ID NO ： 79 是构建体号 R870 从 HindIII( 在多克隆位点中， 启动子 5’ 上游 ) 至 EcoRI( 紧邻 NOS 终止子的下游 ) 的部分核酸序列， 其编码 HSP40( 下划线， 斜体 ) 和 HSP70( 下划线 )。
     因此， 本发明还提供了在植物中生产嵌合流感 VLP 的方法， 其中编码嵌合流感 HA的第一核酸与编码伴侣蛋白的第二核酸共表达。 第一和第二核酸可以在同一步骤中引入植 物， 或者可以顺次引入植物。
     可通过例如血细胞凝集测定、 电子显微镜观察或体积排阻色谱来评估 VLP 的结构 和大小。
     对于体积排阻色谱， 可通过以下方法从植物组织中提取全部可溶性蛋白质 ： 将冷 冻粉碎的植物材料在提取缓冲液中匀浆 (Polytron)， 通过离心除去不溶性物质。用 PEG 进 行沉淀也可以是有利的。定量可溶性蛋白质， 并将提取物通过 SephacrylTM 柱。可用蓝葡聚 糖 2000 作为校准标准。在进行色谱后， 可通过免疫印迹进一步分析级分以确定级分中的蛋 白质成分。
     本发明还提供了这样的植物， 其包含编码一种或更多种嵌合流感血凝素的核酸和 编码一种或更多种伴侣蛋白的核酸。
     本发明包括核苷酸序列 ：
     SEQ ID NO ： 63( 构建体 690 ； 包含苜蓿质体蓝素启动子和 5’ UTR、 嵌合血凝素编码 序列、 苜蓿质体蓝素 3’ UTR 和终止子序列的嵌合 H5/H1 表达盒 )， SEQ ID NO ： 63 下划线部 分编码 H5/Indo 的 SP、 F’ 1、 E1-H1/Bri 的 RB-H5/Indo 的 E2、 F’ 2、 F、 TMD/CT ； SEQ ID NO ： 64( 构建体 691 ； 包含苜蓿质体蓝素启动子和 5’ UTR、 嵌合血凝素编码 序列、 苜蓿质体蓝素 3’ UTR 和终止子序列的嵌合 H5/H1 表达盒 )， SEQ ID NO ： 64 下划线部 分编码 H5/Indo 的 SP、 F’ 1-H1/Bri 的 E1、 RB、 E2-H5/Indo 的 F’ 2、 F、 TMD/CT ；
     SEQ ID NO ： 65( 构建体 696 ； 包含苜蓿质体蓝素启动子和 5’ UTR、 嵌合血凝素编码 序列、 苜蓿质体蓝素 3’ UTR 和终止子序列的嵌合 H1/H5 表达盒 )， SEQ ID NO ： 65 下划线部 分编码 PDI SP-H1/NC 的 F’ 1、 E1-H5/Indo 的 RB-H1/NC 的 E2、 F’ 2、 F、 TMD/CT ；
     SEQ ID NO ： 68( 构建体 733 ； 包含 CaMV 35S 启动子、 CPMV-HT5’ UTR、 PDI 信号肽编 码序列、 H1 型 A/ 布里斯班 /59/07(H1N1) 血凝素编码序列、 CPMV-HT 3’ UTR 和 NOS 终止子 序列的 SpPDI H1/Bri 表达盒 )， SEQ ID NO ： 68 的下划线部分编码 PDI SP-H1/BRI 的 F’ 1、 E1、 RB、 E2、 F’ 2、 F、 TMD/CT ；
     SEQ ID NO ： 69( 构建体 734 ； 包含 CaMV 35S 启动子、 CPMV-HT 5’ UTR、 嵌合血凝素 编码序列、 CPMV-HT 3’ UTR 和 NOS 终止子序列的嵌合 H5/H1 表达盒 )。嵌合 HA 的编码序列 用下划线表示， 其编码与 SEQID NO ： 63 相同的嵌合 HA ；
     SEQ ID NO ： 71( 构建体 736 ； 包含 CaMV 35S 启动子、 CPMV-HT 5’ UTR、 PDI 信号肽编 码序列、 H3 型 A/ 布里斯班 /10/07(H2N3) 血凝素编码序列、 CPMV-HT 3’ UTR 和 NOS 终止子 序列的 HA 表达盒 )， SEQ ID NO ： 71 的下划线部分编码 PDI SP-H3/Bri 的 F’ 1、 E1、 RB、 E2、 F’ 2、 F、 TMD/CT ；
     SEQ ID NO ： 72( 构建体 737 ； 包含 CaMV 35S 启动子、 CPMV-HT 5’ UTR、 嵌合血凝素 编码序列、 CPMV-HT 3’ UTR 和 NOS 终止子序列的嵌合 H5/H3 表达盒 )， SEQ ID NO ： 72 下划 线部分编码 PDI SP-H5/Indo 的 F’ 1、 E1、 RB、 E2、 F’ 2、 F、 TMD/CT ；
     SEQ ID NO ： 74( 构建体 739 ； 包含 CaMV 35S 启动子、 CPMV-HT 5’ UTR、 PDI 信号肽 编码序列、 HA 型 B/ 佛罗里达 /4/06 的血凝素编码序列、 CPMV-HT 3’ UTR 和 NOS 终止子序列 的 HA 表达盒 )， SEQ ID NO ： 74 的下划线部分编码 PDI SP-B/Flo 的 F’ 1、 E1、 RB、 E2、 F’ 2、 F、 TMD/CT ；
     SEQ ID NO ： 75( 构建体 734 ； 包含 CaMV 35S 启动子、 CPMV-HT 5’ UTR、 嵌合血凝素 编码序列、 CPMV-HT 3’ UTR 和 NOS 终止子序列的嵌合 H5/B 表达盒 )， SEQ ID NO ： 75 下划线 部分编码 PDI SP-B/Flo 的 F’ 1、 E1、 RB、 E2、 F’ 2、 F-H5/Indo 的 TND/CT。
     本发明还包括在严格杂交条件下与任一 SEQ ID NO ： 63-65、 68、 69 和 71-75 下划线 部分杂交的核苷酸序列。本发明还包括在严格杂交条件下与任一 SEQ ID NO ： 63-65、 68、 69 和 71-75 下划线部分的互补序列杂交的核苷酸序列。这些与 SEQ ID NO ： 63-65、 68、 69 和 71-75 下划线部分或 SEQ ID NO ： 63-65、 68、 69 和 71-75 下划线部分的互补序列杂交的核苷 酸序列编码嵌合血凝素蛋白， 其表达形成嵌合 VLP， 并且当施用给对象时， 嵌合 VLP 诱导抗 体产生。例如， 所述核苷酸序列在植物细胞内表达形成嵌合 VLP， 所述嵌合 VLP 可用于产生 能结合 HA( 包括一种或更多种流感类型或亚型的成熟 HA、 HA0、 HA1 或 HA2) 的抗体， 当施用 给对象时， 所述 VLP 诱导免疫应答。
     严 格 杂 交 条 件 下 的 杂 交 是 本 领 域 已 知 的 ( 参 见 例 如 Current Protocols in Molecular Biology， Ausubel 等 编， 1995 及 增 刊 ； Maniatis 等， Molecular Cloning(A Laboratory Manual)， Cold Spring Harbor Laboratory， 1982 ； Sambrook 和 Russell， Molecular Cloning ： A Laboratory Manual， 第 3 版， 2001 ； 每个均通过引用并入本文 )。一 种该严格杂交条件的实例可以是在 65℃下于 4×SSC 中杂交约 16-20 小时， 然后在 65℃下 于 0.1×SSC 中清洗 1 小时， 或在 65℃下于 0.1×SSC 中清洗两次 ( 每次 20 或 30 分钟 )。或 者， 一个示例性严格杂交条件可以是在 42℃下于 50％甲酰胺， 4×SSC 中过夜 (16 ～ 20 小 时 )， 然后在 65℃下于 0.1×SSC 中清洗 1 小时， 或在 65℃下于 0.1×SSC 中清洗 2 次 ( 每 次 20 或 30 分钟 )， 或者过夜 (16 ～ 20 小时 )， 或者在 65℃下于 Church 水性磷酸盐缓冲液 (7％ SDS ； 0.5M NaPO4 缓冲液 pH 7.2 ； 10mM EDTA) 中杂交， 在 50℃下于 0.1×SSC， 0.1％ SDS 中清洗 2 次 ( 每次 20 或 30 分钟 )， 或者在 65℃下于 2×SSC， 0.1％ SDS 中清洗 2 次 ( 每次 20 或 30 分钟 )。
     此外， 本发明包括这样的核苷酸序列， 其特征为与编码任一 SEQ ID NO ： 63、 SEQ ID NO ： 64、 SEQ ID NO ： 65、 SEQ ID NO ： 68、 SEQ ID NO ： 69、 SEQ ID NO ： 71、 SEQ ID NO ： 72、 SEQ ID NO ： 74、 SEQ ID NO ： 75 下划线部分之嵌合 HA 的核苷酸序列有约 70％、 75％、 80％、 85％、 87 ％、 90 ％、 91 ％、 92 ％、 93 ％、 94 ％、 95 ％、 96 ％、 97 ％、 98 ％、 99 ％、 100 ％或其间任意量的序 列同一性或序列相似性， 其中该核苷酸序列编码血凝素蛋白， 其在表达时形成嵌合 VLP， 该 嵌合 VLP 诱导抗体产生。 例如， 所述核苷酸序列在植物细胞内表达形成嵌合 VLP， 该嵌合 VLP 可用于产生能结合 HA( 包括成熟 HA、 HA0、 HA1 或 HA2) 的抗体， 当施用给对象时， 所述 VLP 诱 导免疫应答。
     “免疫应答” 一般是指获得性免疫系统的应答。获得性免疫系统通常包括体液应答 和细胞介导的应答。体液应答是由 B 淋巴细胞谱系的细胞 (B 细胞 ) 产生的分泌抗体所介 导的免疫方面。分泌抗体结合入侵微生物 ( 例如病毒或细菌 ) 表面上的抗原， 标示它们以 进行破坏。体液免疫一般是指抗体产生和伴随其的过程， 以及抗体的效应物功能， 包括 Th2 细胞活化和细胞因子产生、 记忆细胞形成、 调理素促进胞吞作用、 病原体清除等。术语 “调 节” 是指根据通常知晓或使用的任意测定法 ( 其中一些在本文中举例说明 ) 测定的特定应 答或参数的升高或降低。
     细胞介导的应答是这样的免疫应答， 其不涉及抗体， 而涉及巨噬细胞、 自然杀伤细胞 (NK)、 抗原特异性细胞毒性 T 淋巴细胞的活化， 以及多种细胞因子应答于抗原的释放。 细 胞介导的免疫一般指一些 Th 细胞的活化、 Tc 细胞的活化和 T 细胞介导的应答。细胞介导 的免疫在对病毒感染的应答中尤为重要。
     例如， 可使用 ELISPOT 测定来测量对抗原特异性 CD8 阳性 T 淋巴细胞的诱导 ； 可使 用增殖测定来测量对 CD4 阳性 T 淋巴细胞的刺激。可使用 ELISA 测定来定量抗流感病毒抗 体的效价 ； 还可使用抗同种型抗体 ( 例如抗 IgG、 抗 IgA、 抗 IgE 或抗 IgM) 来测量抗原特异 性或交叉反应性抗体的同种型。实施这些测定的方法和技术是本领域公知的。
     血细胞凝集抑制 (HI 或 HAI) 测定也可用于证明由疫苗或疫苗组合物诱导的抗体 的效力， 所述疫苗或疫苗组合物包含可抑制由重组 HA 所致之红血细胞 (RBC) 凝集的嵌合 HA 或嵌合 VLP。血清样品的血细胞凝集抑制性抗体效价可通过微量滴定 HAI 来评估 (Aymard 等， 1973)。可使用任何来自几个物种的红细胞， 例如马、 火鸡、 鸡等。该测定给出有关 HA 三 聚体在 VLP 表面上组装的间接信息， 证实 HA 抗原位点的正确展示。
     交叉反应性 HAI 滴定还可用于证明免疫应答对与疫苗亚型相关的其他病毒株的 效力。例如， 可以在 HAI 测定中将用包含嵌合血凝素 ( 包含第一流感类型或亚型的 HDC) 之 疫苗组合物免疫的对象的血清与第二株全病毒或病毒颗粒一起使用， 并且测定 HAI 效价。
     不希望受理论限制， HA 结合来自不同动物之 RBC 的能力是由 HA 对 α2， 3 或 α2， 6 键合唾液酸的亲和力以及这些唾液酸在 RBC 表面上的存在来驱动的。马和禽类的流感病 毒 HA 使来自所有几个物种 ( 包括火鸡、 鸡、 鸭、 豚鼠、 人、 绵羊、 马和牛 ) 的红细胞凝集 ； 而人 HA 结合火鸡、 鸡、 鸭、 豚鼠、 人和绵羊的红细胞 (Ito T. 等， 1997， Virology， 卷 227， 493-499 ； 以及 Medeiros R 等， 2001， Virology， 卷 289， 74-85)。
     细胞因子的存在或水平也可以被定量。例如， 用 ELISA( 例如 BD Biosciences OptEIA 试剂盒 ) 测量 IFN-γ 和 IL-4 分泌细胞来表征 T 辅助细胞应答 (Th1/Th2)。 可培养从 对象得到的外周血单核细胞 (PBMC) 或脾细胞， 并分析上清。还可使用标志物特异性荧光标 记和本领域已知方法， 通过荧光激活细胞分选 (fluorescence-activated cell sorting， FACS) 对 T 淋巴细胞定量。
     还可进行微量中和测定来表征对象中的免疫应答， 参见例如 Rowe 等， 1973 的方 法。可通过几种方法得到病毒中和效价， 包括 ： 1) 在对细胞进行结晶紫固定 / 着色之后， 计 数裂解斑 ( 空斑测定 ) ； 2) 显微镜观察培养物中的细胞裂解 ； 3) 对 NP 病毒蛋白 ( 与病毒感 染宿主细胞有关 ) 进行 ELISA 和分光光度检测。
     序列同一性或序列相似性可利用序列比较程序来确定， 例如 DNASIS 所提供的 ( 例 如， 使用但不限于下述参数 ： 空隙罚分 5、 顶部对角线数 (#of top diagonal)5、 固定的空 隙罚分 10、 k 元祖 2、 游隙 10， 窗口大小 5)。然而， 其他用于比较的序列比对方法是本领域 熟知的， 例如 Smith&Waterman 算法 (1981， Adv.Appl.Math.2 ： 482)、 Needleman&Wunsch 算 法 (J.Mol.Biol.48 ： 443， 1970)、 Pearson&Lipman 算法 (1988， Proc.Nat’ l.Acad.Sci.USA 85 ： 2444)， 以及这些算法的计算机执行 ( 例如 GAP、 BESTFIT、 FASTA 和 BLAST(Altschul 等， 1990.J.Mol Biol 215 ： 403-410))， 或者通过人工比对和目视检查。可以对核酸或氨 基酸序列进行比较或比对， 并使用任何现有技术已知的几种软件包测定共有序列， 例如 MULTALIN(Corpet F.， 1988， Nucl Acids Res.， 16(22)， 10881-10890)、 BLAST、 CLUSTAL 等 ； 或者可以人工比对序列并确定序列间的相似度和差异。蛋白质、 融合蛋白或多肽的片段或部分包含含有特定蛋白质或多肽之一部分氨基 酸组成的肽或多肽， 前提是在表达时所述片段可形成嵌合 VLP。 例如所述片段可以包含抗原 性区域、 应激应答诱导区域或含有蛋白质或多肽之功能性结构域的区域。所述片段还可包 含同一总家族的蛋白质共有的区域或结构域， 或者片段可包含足以特异性鉴定其来源全长 蛋白质的氨基酸序列。
     例如， 片段或部分可包含蛋白质全长的约 60％至约 100％或其间任意量， 前提是 在表达时该片段可形成嵌合 VLP。例如， 蛋白质全长的约 60 ％至约 100 ％、 约 70 ％至约 100％、 约 80％至约 100％、 约 90％至约 100％、 约 95％至约 100％， 或其间任意量。或者， 根 据嵌合 HA， 片段或部分可以为约 150 至约 500 个氨基酸或其间任意量， 前提是在表达时所 述片段可形成嵌合 VLP。例如， 根据嵌合 HA， 片段或部分可以为约 150 至约 500 个氨基酸或 其间任意量、 约 200 至约 500 个氨基酸或其间任意量、 约 250 至约 500 个氨基酸或其间任意 量、 约 300 至约 500 个氨基酸或其间任意量、 约 350 至约 500 个氨基酸或其间任意量、 约 400 至约 500 个氨基酸或其间任意量、 约 450 至约 500 个氨基酸或其间任意量， 前提是在表达时 片段可形成嵌合 VLP。例如， 可从嵌合 HA 蛋白的 C 端、 N 端或者 N 和 C 两端去除约 5、 10、 20、 30、 40 或 50 个氨基酸或其间任意量， 前提是在表达时所述片段可形成嵌合 VLP。
     任意给定序列中的氨基酸编号是相对于该特定序列的， 然而， 本领域技术人员可 根据结构和 / 或序列容易地确定序列中特定氨基酸的 “等同性” 。例如， 如果去除了 6 个 N 端氨基酸， 那么这将改变氨基酸的具体编码标识 ( 例如， 相对于蛋白质全长而言 )， 但是不 会改变结构中氨基酸的相对位置。
     本发明描述了 ( 但不限于 ) 在植物、 植物部分或植物细胞中编码嵌合 HA 的核酸的 表达， 以及适于生产疫苗的植物中生产嵌合流感 VLP。这些核酸的实例包括但不限于， 例如 SEQ ID NO ： 63、 SEQ ID NO ： 64、 SEQ ID NO ： 65、 SEQ ID NO ： 68、 SEQ ID NO ： 69、 SEQ ID NO ： 71、 SEQ ID NO ： 72、 SEQ ID NO ： 74、 SEQ ID NO ： 75。
     本发明还提供了在植物、 植物部分或植物细胞中表达编码嵌合 HA 的核酸 ( 例如但 不限于 SEQ ID NO ： 63、 SEQ ID NO ： 64、 SEQ ID NO ： 65、 SEQ ID NO ： 68、 SEQ ID NO ： 69、 SEQ ID NO ： 71、 SEQ ID NO ： 72、 SEQID NO ： 74、 SEQ ID NO ： 75)， 以及在转化的植物细胞中生产包 含重组流感结构蛋白的候选流感疫苗或试剂， 所述重组流感结构蛋白自组装成功能性和免 疫原性的同型大分子蛋白结构， 包括亚病毒流感颗粒和嵌合流感 VLP。
     因此， 本发明提供了嵌合 VLP， 和通过表达单个嵌合包膜蛋白在植物表达系统中生 产嵌合 VLP 的方法。
     编码流感亚型嵌合 HA 的核酸 ( 例如 SEQ ID NO ： 63、 SEQ ID NO ： 64、 SEQ ID NO ： 65、 SEQ ID NO ： 68、 SEQ ID NO ： 69、 SEQ ID NO ： 71、 SEQ ID NO ： 72、 SEQ ID NO ： 74、 SEQ ID NO ： 75) 可以通过使用 HA RNA 通过反转录和聚合酶链式反应 (PCR) 合成。例如， 可以从 H1/ NC、 H1/Bri、 H3/Bri、 B/Flo 或 H5/Indo 中或者从感染了这些或其他流感病毒类型或亚型的 细胞中分离 RNA。对于反转录和 PCR， 可以使用 HA RNA 特异性寡核苷酸引物。另外， 编码嵌 合 HA 的核酸可以使用本领域技术人员已知的方法化学合成。
     本发明还涉及包含编码嵌合 HA 之核酸 ( 如上所述， 其与在植物中有效的调控元件 有效连接 ) 的基因构建体。在植物细胞中有效并可用于本发明的调控元件的实例包括但 不限于质体蓝素调控区 (US 7,125,978 ； 其通过引用并入本文 ) 或核酮糖 1， 5- 二磷酸羧化酶 / 加氧酶 (RuBisCO ； US4,962,028 ； 其通过引用并入本文 )、 叶绿素 a/b 结合蛋白 (CAB ； Leutwiler 等 ； 1986 ； 其通过引用并入本文 )、 ST-LS1( 与光系统 II 的放氧复合物相关， 描述 于 Stockhaus 等 1987、 1989 中 ； 其通过引用并入本文 ) 的调控区。
     本发明的基因构建体还包含组成型启动子， 其指导与启动子有效连接的基因在植 物各部分中表达并在整个植物发育过程中持续表达。 组成型启动子的一个非限制性的实例 是与 CaMV 35S 转录本相关的组成型启动子 ( 例如， Odell 等， 1985， Nature， 313 ： 810-812， 通过引用并入本文 )。
     包含质体蓝素调控区的序列的实例是 SEQ ID NO ： 58 的序列 5’端至编码 PDI 信号肽的下划线序列。调控元件或调控区可增强与其有效连接的核苷酸序列的翻译， 其 中核苷酸序列可编码蛋白质或多肽。调控区的另一实例是源自豇豆花叶病毒 (Cowpea Mosaic Virus， CPMV) 非翻译区的调控区， 其可用于优先翻译与其有效连接的核苷酸序 列。这一 CPMV 调控区用于可过量翻译的 CMPV-HT 系统中， 参见例如 Sainsbury 等， 2008， Plant Physiology 148 ： 1212-1218 ； Sainsbury 等， 2008 Plant BiotechnologyJournal 6 ： 82-92， 两者均通过引用并入本文 )。
     因此， 本发明的一方面提供了包含与编码嵌合流感 HA 之序列有效连接的调控区 的核酸。所述调控区可以是质体蓝素调控元件， 所述嵌合流感 HA 可包含来自 H5/Indo、 H1/ Bri、 H3/Bri、 H1/NC、 B/Flo 流感类型、 亚型或毒株的亚结构域。包含质体蓝素调控元件和嵌 合流感 HA 的核酸序列在本文中通过 SEQ ID NO ： 63 和 64 示例。包含 35S 调控元件和嵌合 流感 HA 的核酸序列在本文中通过 SEQ ID NO ： 68、 69 和 71-75 示例。
     在另一方面， 本发明提供包含 CPMV 调控区和嵌合流感 HA( 包含来自 H5/Indo、 H1/ Bri、 H3/Bri、 H1/NC、 B/Flo 流感类型、 亚型或毒株的亚结构域 ) 的核酸。包含 CPMP 调控元 件和嵌合 HA 的核酸序列在本文中通过 SEQ ID NO ： 66-69 和 71-75 示例。
     在植物中产生的嵌合流感 VLP 从质膜中出芽， 因而嵌合 VLP 的脂质组成反映产生 它们的植物细胞或植物组织类型。根据本发明生产的 VLP 包含两种或多于多种类型或亚型 流感的嵌合 HA， 其与植物来源的脂质复合。植物脂质可刺激特异免疫细胞并增强所诱导的 免疫应答。
     植物脂质如 PC( 磷脂酰胆碱 ) 和 PE( 磷脂酰乙醇胺 ) 以及鞘糖脂可结合哺乳动物 免疫细胞 ( 例如抗原呈递细胞 (APC)， 如树突状细胞和巨噬细胞 ) 和其他细胞 ( 包括胸腺和 肝脏中的 B 淋巴细胞和 T 淋巴细胞 ) 表达的 CD1 分子。( 综述见 Tsuji M.2006 Cell Mol Life Sci 63 ： 1889-98)。CD1 分子在结构上与主要组织相容性复合体 (MHC)I 类分子相似， 其作用是将糖脂抗原呈递给 NKT 细胞 ( 自然杀伤 T 细胞 )。活化后， NKT 细胞激活固有免疫 细胞 ( 例如 NK 细胞和树突状细胞 ) 并且还激活获得性免疫细胞 ( 例如产生抗体的 B 细胞 和 T 细胞 )。
     存在于与脂双层 ( 例如质膜来源的包膜 ) 复合之流感 VLP 中的植物固醇可提供有 利的疫苗组合物。不希望受理论限制， 与脂双层 ( 例如质膜来源的包膜 ) 复合的由植物生 产的 VLP( 包括包含嵌合 HA 的 VLP) 比在其他表达系统中制得的 VLP 可诱导更强的免疫反 应， 并且可与由活或减毒全病毒疫苗所诱导的免疫反应相似。
     因此， 在一些实施方案中， 本发明提供了与植物来源的脂双层复合的 VLP( 包含嵌 合 HA)。在一些实施方案中， 所述植物来源的脂双层可包括 VLP 的包膜。在植物内生产的 VLP 可包含含有植物特异性 N- 聚糖的嵌合 HA。 因此， 本发明还提 供了包含具有植物特异性 N- 聚糖的嵌合 HA 的 VLP。
     此外， 植物中 N- 聚糖的修饰是已知的 ( 参见例如 WO 2008/151440 ； 其通过引用并 入本文 )， 并且可产生含有经修饰 N- 聚糖的嵌合 HA。可得到包含经修饰糖基化模式 ( 例如 岩藻糖基化减少、 木糖基化减少、 或岩藻糖基化和木糖基化二者均减少 ) 之 N- 聚糖的 HA， 或 者可得到含有经修饰糖基化模式的嵌合 HA， 其中蛋白质缺少岩藻糖基化、 木糖基化或两者 皆缺少， 并包含增加的半乳糖基化。此外， 与表达嵌合 HA 的野生型植物相比， 翻译后修饰的 调节 ( 例如末端添加半乳糖 ) 可导致所表达嵌合 HA 的岩藻糖基化和木糖基化降低。
     例如 ( 但不视为限制 )， 合成具有经修饰糖基化模式的嵌合 HA 可通过使目的蛋白 质与编码 β-1， 4- 半乳糖基转移酶 (GalT)( 例如但不限于哺乳动物 GalT 或人 GalT， 然而 也可以使用其他来源的 GalT) 的核苷酸序列共表达来实现。还可将 GalT 的催化结构域与 N- 乙酰氨基葡萄糖基转移酶 (GNT1) 的 CTS 结构域 ( 即胞质尾、 跨膜结构域、 茎区 ) 融合以 产生 GNT1-GalT 杂合酶， 并且该杂合酶可与 HA 共表达。HA 还可与编码 N- 乙酰氨基葡萄糖 基转移酶 III(GnT-III)( 例如但不限于哺乳动物 GnT-III 或人 GnT-III， 还可使用其他来源 的 GnT-III) 的核苷酸序列共表达。另外， 还可使用包含与 GnT-III 融合的 GNT1 之 CTS 的 GNT1-GnT-III 杂合酶。
     因此， 本发明还包括含有嵌合 HA 的 VLP， 所述嵌合 HA 具有经修饰的 N- 聚糖。
     不希望受理论限制， 嵌合 HA 上存在的植物 N- 聚糖可通过促进抗原呈递细胞与 HA 的结合来刺激免疫应答。Saint-jore-Dupas 等 (Trends Biotechnol 25 ： 317-23， 2007) 已 提出使用植物 N 聚糖来刺激免疫应答。此外， VLP 的构象对于抗原呈递可以是有利的， 并且 当与植物来源的脂质层复合时增强 VLP 的佐剂作用。
     “调控区” 、 “调控元件” 或 “启动子” 是指通常 ( 但不总是 ) 位于基因的蛋白质编码 区上游的一部分核酸， 其可由 DNA 或 RNA 或者 DNA 和 RNA 两者构成。当调控区有活性并与 目的基因有效相连或有效连接时， 可导致目的基因的表达。 调控元件可以介导器官特异性， 或控制发育基因或时序基因的活化。 “调控区” 包括启动子元件、 显示启动子基础活性的核 心启动子元件、 可响应于外部刺激而被诱导的元件、 介导启动子活性的元件 ( 例如负调控 元件或转录增强子 )。本文所用的 “调控区” 还包括在转录后具有活性的元件， 例如调节基 因表达的调控元件， 例如翻译增强子和转录增强子、 翻译抑制子和转录抑制子、 上游激活序 列和 mRNA 不稳定性决定子 (mRNA instability determinant)。这后几种元件中有几种可 位于编码区附近。
     在本公开内容中， 术语 “调控元件” 或 “调控区” 一般是指通常 ( 但不总是 ) 位于 结构基因编码序列上游 (5’ ) 的 DNA 序列， 其通过提供转录在特定位点起始所需的 RNA 聚合 酶和 / 或其他因子的识别来控制编码区表达。 然而， 应当理解的是， 位于内含子中或序列 3’ 的其他核苷酸序列也可对调控目的编码区的表达有贡献。为确保在特定位点起始而为 RNA 聚合酶或其他转录因子提供识别的调控元件的一个实例是启动子元件。大多数 ( 但不是全 部 ) 真核生物启动子元件包含 TATA 盒， 其是由腺苷和胸苷核苷酸碱基对组成的保守核酸序 列， 通常位于转录起始位点上游约 25 个碱基对处。启动子元件包含负责起始转录的基础启 动子元件以及调节基因表达的其他调控元件 ( 如上文所述 )。
     存在几种类型的调控区， 包括受发育调节的、 诱导型的或组成型的调控区。 受发育调节的调控区或对所控制基因的差异性表达进行控制的调控区在特定器官或器官之组织 中、 在该器官或组织发育过程的特定时间被活化。 然而， 受发育调节的一些调控区也可偏好 性地在某些器官或组织的特定发育阶段具有活性， 它们还可以以受发育调节的方式具有活 性， 或在植物的其他器官或组织内为基础水平。组织特异性调控区 ( 例如参见特异性调控 区 ) 的实例包括 napin 启动子和 cruciferin 启动子 (Rask 等， 1998， J.Plant Physiol.152 ： 595-599 ； Bilodeau 等， 1994， Plant Cell 14 ： 125-130)。叶特异性启动子的实例包括质体 蓝素启动子 ( 参见例如 SEQ ID NO ： 58) ； US 7,125,978， 其通过引用并入本文。
     诱导型调控区是能够响应于诱导物而直接或间接激活一种或更多种 DNA 序列或 基因之转录的调控区。当不存在诱导物时， DNA 序列或基因不会被转录。通常， 特异性结合 诱导型调控区以激活转录的蛋白因子可以以无活性形式存在， 然后被诱导物直接或间接转 化成活性形式。然而， 也可以不存在蛋白因子。诱导物可以是化学剂， 例如蛋白质、 代谢物、 生长调节剂、 除草剂或酚类化合物， 或通过热、 冷、 盐或毒性元素直接施加的生理压力， 或通 过病原体或致病剂 ( 例如病毒 ) 的作用间接施加的生理压力。可通过向细胞或植物外部施 加诱导物 ( 例如通过喷洒、 浇水、 加热或类似方法 ) 使含有诱导型调控区的植物细胞暴露于 诱导物。 诱导型调控元件可来源于植物基因或非植物基因 ( 例如 Gatz， C. 和 Lenk， I.R.P.， 1998， Trends Plant Sci.3， 352-358， 其通过引用并入本文 )。可用的诱导型启动子的实例 包括但不限于四环素诱导型启动子 (Gatz， C.， 1997， Ann.Rev.Plant Physiol.Plant Mol. Biol.48， 89-108， 其通过引用并入本文 )、 类固醇诱导型启动子 (Aoyama， T. 和 Chua， N.H.， 1997， Plant J.2， 397-404， 其通过引用并入本文 ) 和乙醇诱导型启动子 (Salter， M.G 等， 1998， Plant Journal 16， 127-132 ； Caddick， M.X. 等， 1998， Nature Biotech.16， 177-180， 其通过引用并入本文 )、 细胞分裂素诱导型 IB6 和 CKI1 基因 (Brandstatter， I. 和 Kieber， J.J.， 1998， Plant Cell 10， 1009-1019 ； Kakimoto， T.， 1996， Science 274， 982-985， 其 通过引用并入本文 ) 以及生长素诱导型元件 DR5(Ulmasov， T. 等， 1997， Plant Cell 9， 1963-1971， 其通过引用并入本文 )。
     组成型调控区指导基因在植物各部分表达并在整个植物发育过程中持续表达。 已 知的组成型调控元件的实例包括与以下相关的启动子 ： CaMV 35S 转录本 (Odell 等， 1985， Nature， 313 ： 810-812)、 水稻肌动蛋白 1(Zhang 等， 1991， Plant Cell， 3： 1155-1165)、 肌动 蛋白 2(An 等， 1996， Plant J.， 10 ： 107-121) 或 tms 2(U.S.5,428,147， 其通过引用并入本 文 ) 以及磷酸丙糖异构酶 1 基因 (Xu 等， 1994， Plant Physiol.106 ： 459-467)、 玉米泛素 1 基 因 (Cornejo 等， 1993， Plant Mol.Biol.29 ： 637-646)、 拟南芥泛素 1 和 6 基因 (Holtorf 等， 1995， Plant Mol.Biol.29 ： 637-646)、 烟草翻译起始因子 4A 基因 (Mandel 等， 1995， Plant Mol.Biol.29 ： 995-1004)。本文所用的术语 “组成型” 不一定指受所述组成型调控区控制的 基因在所有细胞类型中以相同水平表达， 而是指基因在多种细胞类型中表达， 尽管常常观 察到不同的丰度。 组成型调控元件可与其他序列偶联以进一步增强与其有效连接之核苷酸 序列的转录和 / 或翻译。例如， CMPV-HT 系统源自豇豆花叶病毒 (CPMV) 的非翻译区， 并显 示增强相关编码序列的翻译。
     “天然” 是指核酸或氨基酸序列是天然存在的， 或 “野生型” 。
     “有效连接” 是指特定序列 ( 例如调控元件与目的编码区 ) 直接或间接地相互作用 以实现预定功能 ( 例如介导或调节基因表达 )。例如有效连接的序列之间的相互作用可通过与所述有效连接之序列相互作用的蛋白质来介导。
     本发明的一种或更多种核苷酸序列可在被本发明核苷酸序列、 或构建体或载体转 化的任意合适的植物宿主中表达。合适宿主的实例包括但不限于农作物， 包括苜蓿、 油菜、 芸苔属 (Brassica spp.)、 玉米、 烟草属 (Nicotiana spp.)、 苜蓿、 马铃薯、 人参、 豌豆、 燕麦、 水稻、 大豆、 小麦、 大麦、 向日葵、 棉花等。
     本发明的一种或更多种嵌合基因构建体还可包含 3’ 非翻译区。3’ 非翻译区是指 这样的基因部分， 其包含含有多腺苷酸化信号和能够影响 mRNA 加工或基因表达之任意其 他调控信号的 DNA 区段。多腺苷酸化信号的特征一般在于向 mRNA 前体的 3’ 端添加多腺苷 酸链。多腺苷酸化信号常通过存在经典形式 5’ AATAAA-3’ 的同源物来鉴定， 但是也会出现 变体。
     合适的 3’ 区的非限制性实例是含有以下基因的多腺苷酸化信号的 3’ 转录的非翻 译区 ： 农杆菌致瘤 (Ti) 质粒基因 ( 例如胭脂氨酸合酶 (Nos 基因 )) 以及植物基因 ( 例如大 豆贮藏蛋白基因 )、 核酮糖 -1， 5- 二磷酸羧化酶的小亚基基因 (ssRUBISCO ； US 4,962,028， 其通过引用并入本文 )、 用于调节质体蓝素表达的启动子 ( 描述于 US 7,125,978( 其通过引 用并入本文 ))。 本发明的一种或更多种嵌合基因构建体还可以进一步包括增强子， 根据需要可以 是翻译或转录增强子。增强子可以位于被转录序列的 5’ 或 3’ 。增强子区域是本领域技术 人员公知的， 并且可包括 ATG 起始密码子、 邻近序列等。如果存在起始密码子， 则其可在编 码序列的读码框的相 (phase) 中 (“框内” (“in frame” ))， 以提供转录序列的正确翻译。
     为了帮助鉴定转化的植物细胞， 可进一步处理本发明的构建体使其包含植物选择 标记。可用的选择标记包括提供针对化学品 ( 例如抗生素， 如庆大霉素、 潮霉素、 卡那霉素 ； 或除草剂， 如膦丝菌素 (phosphinothrycin)、 草甘膦、 氯磺隆等 ) 的抗性的酶。 类似地， 可使 用产生可通过颜色变化进行鉴定之化合物的酶 ( 例如 GUS(β- 葡萄糖醛酸酶 )) 或提供发 光的酶 ( 如萤光素酶或 GFP)。
     认为是本发明一部分的还有包含本发明嵌合基因构建体的转基因植物、 植物细胞 或种子。由植物细胞再生完整植物的方法也是本领域已知的。一般而言， 将转化植物细胞 培养在合适的培养基中， 所述培养基可包含选择剂 ( 例如抗生素 )， 其中使用选择标记以帮 助鉴定转化的植物细胞。愈伤组织形成后， 可根据已知方法应用合适的植物激素来促进芽 的形成， 将芽移至生根培养基中以再生植物。然后， 通过种子或利用植物无性繁殖技术， 植 物可用于建立可重复的世代。还可以不使用组织培养物来形成转基因植物。
     认为是本发明一部分的还有包含嵌合基因构建体的转基因植物、 树木、 酵母、 细 菌、 真菌、 昆虫和动物细胞， 所述嵌合基因构建体含有编码本发明之用于产生 VLP 的重组嵌 合 HA 或 HA0 的核酸。
     为了在多种可用于转化或瞬时表达的宿主生物中表达， 还可以将本发明的调控元 件与目的编码区相组合。这样的生物包括但不限于植物 ( 单子叶植物和双子叶植物 )， 例 如但不限于玉米、 谷类植物、 小麦、 大麦、 燕麦、 烟草属、 芸苔属、 大豆、 菜豆、 豌豆、 苜蓿、 马铃 薯、 番茄、 人参和拟南芥。
     用于这些生物的稳定转化和再生的方法已在本领域中建立并且是本领域技术人 员已知的。获得转化植物和再生植物的方法对本发明来说不是关键的。
    
     “转化” 是指表现为基因型、 表型或二者兼有的遗传信息 ( 核苷酸序列 ) 在种间转移。 遗传信息从嵌合构建体向宿主的种间转移可以是可遗传的并且认为遗传信息的转移是 稳定的， 或者转移可以是瞬时的并且遗传信息的转移是不可遗传的。
     术语 “植物物质” 是指来源于植物的任何材料。 植物物质可包括完整植物、 组织、 细 胞或其任意部分。此外， 植物物质可包括细胞内植物组分、 细胞外植物组分、 植物的液体或 固体提取物或者其组合。此外， 植物物质可包括来自植物叶、 茎、 果实、 根或其组合的植物、 植物细胞、 组织、 液体提取物或其组合。 植物物质可包括未进行任何处理步骤的植物或其部 分。植物的一部分可包含植物物质。然而， 还考虑可对所述植物材料施加下定义的最少处 理步骤或更严格的处理， 包括使用本领域公知的技术 ( 包括但不限于色谱、 电泳等 ) 进行部 分或大量蛋白质纯化。
     术语 “最少处理” 是指部分纯化包含目的蛋白的植物物质 ( 例如植物或其部分 ) 以 得到植物提取物、 匀浆、 植物匀浆的级分等 ( 即最少处理 )。部分纯化可包括但不限于破坏 植物细胞结构从而产生含有可溶性植物组分和不溶性植物组分的组合物， 不溶性植物组分 可通过例如但不限于离心、 过滤或其组合进行分离。 在此方面， 可使用真空或离心提取容易 地获得叶或其他组织的细胞外间隙中分泌的蛋白质， 或可以通过穿过滚轴或研磨等在压力 下进行组织提取， 从而将蛋白从细胞外间隙中挤压或释放。最少处理还可包括制备可溶性 蛋白质的粗提物， 因为这些制备物中将具有可忽略的来自次级植物产物的污染。 另外， 最少 处理可包括从叶中水性提取可溶性蛋白质， 然后用任意合适的盐进行沉淀。其他方法可包 括大规模的浸渍和汁液提取， 以允许直接使用提取物。
     可将植物物质 ( 形式为植物材料或组织 ) 经口递送给对象。植物物质可作为膳食 补充剂的一部分与其他食物一起施用， 或者被装入胶囊中。植物物质或组织还可以被浓缩 以改善或增进适口性， 或者按照需要与其他材料、 成分或药物赋形剂一起提供。
     可施用本发明 VLP 的对象或目标生物的实例包括但不限于人、 灵长类、 鸟类、 水 禽、 候鸟、 鹌鹑、 鸭、 鹅、 家禽、 鸡、 猪、 绵羊、 马科动物、 马、 骆驼、 犬科动物、 狗、 猫科动物、 猫、 虎、 豹、 麝猫、 水貂、 石貂、 雪貂、 宠物、 家畜、 兔、 小鼠、 大鼠、 豚鼠或其他啮齿动物、 海豹、 鲸 等。这些目标生物是示例性的， 并且不视为限制本发明的应用和用途。
     考虑根据需要和情形， 以多种方式将含有本发明一些实施方式的嵌合 HA 或表达 含有本发明一些实施方式之嵌合 HA 的 VLP 的植物施用给对象或目标生物。例如， 可在使用 之前将得自植物的嵌合 HA 以粗提物、 部分纯化或纯化的形式被提取。如果嵌合 HA 是至少 部分纯化的， 那么其可以在可食用植物或不可食用植物中产生。此外， 如果经口施用嵌合 HA， 则可以收集植物组织并直接给对象食用， 或者可在食用之前干燥收集的组织， 或者可以 不预先收集而使动物在植物上进食。 认为在本发明范围内的还有将收集的植物组织作为动 物饲料的食物补充剂。如果向动物饲喂的植物组织不进行或几乎不进行进一步处理， 则优 选所施用的植物组织是可食用的。
     转录后基因沉默 (PTGS) 可参与限制转基因在植物中的表达， 来自马铃薯 Y 病毒的 沉默抑制子 (HcPro) 的共表达可用于抵抗转基因 mRNA 的特异性降解 (Brigneti 等， 1998)。 可替代的沉默抑制子是本领域熟知的， 并且可如本文所述使用 (Chiba 等， 2006， Virology 346 ： 7-14， 其 通 过 引 用 并 入 本 文 )， 例 如 但 不 限 于 TEV-p1/HC-Pro( 烟 草 蚀 纹 病 毒 -p1/ HC-Pro)、 BYV-p21、 番茄丛矮病毒的 p19(TBSV p19)、 番茄皱缩病毒的衣壳蛋白 (TCV-CP)、 黄瓜花叶病毒的 2b(CMV-2b)、 马铃薯 X 病毒的 p25(PVX-p25)、 马铃薯 M 病毒的 p11(PVM-p11)、 马铃薯 S 病毒的 p11(PVS-p11)、 蓝莓枯黄病毒的 p16(BScV-p16)、 柑橘衰退病毒 (Citrus tristexa virus) 的 p23(CTV-p23)、 葡萄卷叶相关病毒 -2 的 p24(GLRaV-2 p24)、 葡萄病 毒 A 的 p10(GVA-p10)、 葡萄病毒 B 的 p14(GVB-p14)、 白芷潜伏性病毒 (Heracleum latent virus) 的 p10(HLV-p10) 或大蒜普通潜伏性病毒的 p16(GCLV-p16)。因此， 沉默抑制子 ( 例 如但不限于 HcPro、 TEV-p1/HC-Pro、 BYV-p21、 TBSV p19、 TCV-CP、 CMV-2b、 PVX-p25、 PVM-p11、 PVS-p11、 BScV-p16、 CTV-p23、 GLRaV-2p24、 GBV-p14、 HLV-p10、 GCLV-p16 或 GVA-p10) 可与 编码目的蛋白的核酸序列共表达以进一步确保在植物中生产高水平的蛋白质。
     此外， 如本文所述生产的 VLP 不包含神经氨酸酶 (NA)。然而， 如期望包含 HA 和 NA 的 VLP， 可以将 NA 与 HA 共表达。
     因此， 本发明还包括合适的载体， 其含有适用于稳定或瞬时表达系统中的嵌合 HA 序列。还可在一种或多于一种的构建体中提供遗传信息。例如， 可将编码目的蛋白的核苷 酸序列引入一种构建体， 将编码修饰目的蛋白糖基化之蛋白质的第二核苷酸序列引入单独 的构建体中。然后， 可将这些核苷酸序列在植物中共表达。然而， 也可使用这样的构建体， 其包含编码目的蛋白和修饰目的蛋白糖基化之蛋白质两者的核苷酸序列。在此情形中， 核 苷酸序列将包含第一序列和第二序列， 所述第一序列包含与启动子或调控区有效连接的编 码目的蛋白的第一核酸序列， 所述第二序列包含编码修饰目的蛋白糖基化模式之蛋白质的 第二核酸序列， 该第二核酸序列与启动子或调控区有效连接。
     “共表达” 是指两种或两种以上核苷酸序列大致同时在植物中以及在植物的同一 组织中表达。然而， 核苷酸序列不必严格地同时表达。而是两种或更多种核苷酸序列的表 达方式使得所编码产物有机会相互作用。例如， 修饰目的蛋白糖基化的蛋白质可在目的蛋 白表达前或表达期间表达， 使得发生对目的蛋白的糖基化修饰。可使用瞬时表达系统共表 达两种或两种以上的核苷酸序列， 其中所述两种或更多种序列大致同时在适于这两种序列 表达的条件下被引入植物中。或者， 可以用编码目的蛋白的额外序列以瞬时或稳定方式转 化含有核苷酸序列之一 ( 例如编码修饰目的蛋白糖基化模式的蛋白质的序列 ) 的平台植物 (platform plant)。在此情形中， 编码修饰目的蛋白糖基化模式之蛋白质的序列可在期望 的发育阶段表达在期望的组织内表达， 或者可使用诱导型启动子诱导其表达， 而编码目的 蛋白的额外序列可在相似条件下在同一组织内表达， 以确保核苷酸序列的共表达。
     可使用 Ti 质粒、 Ri 质粒、 植物病毒载体、 直接 DNA 转化、 显微注射、 电穿孔、 侵染等 将本发明的构建体引入植物细胞中。这些技术的综述参见例如 Weissbach 和 Weissbach， Methods for Plant Molecular Biology， Academy Press， 纽约 VIII， 421-463 页 (1988) ； Geierson 和 Corey， Plant Molecular Biology， 第 2 版 (1988) 以 及 Miki 和 Iyer， Fundamentals of Gene Transfer in Plants.Plant Metabolism，第 2 版， DT.Dennis， DH Turpin， DD Lefebrve， DB Layzell( 编 )， Addison Wesly， Langmans Ltd.London， 561-579 页 (1997)。其他方法包括直接 DNA 摄取、 使用脂质体、 电穿孔 ( 例如使用原生质 体 )、 显微注射、 微弹 (microprojectile) 或 whisker 以及真空侵染。参见例如 Bilang 等 (Gene 100 ： 247-250(1991))、 Scheid 等 (Mol.Gen.Genet.228 ： 104-112， 1991)、 Guerche 等 (Plant Science 52 ： 111-116， 1987)、 Neuhause 等 (Theor.Appl Genet.75 ： 30-36， 1987)、 Klein 等， Nature 327 ： 70-73(1987)、 Howell 等 (Science 208 ： 1265， 1980)、 Horsch 等(Science 227 ： 1229-1231， 1985)、 DeBlock 等， Plant Physiology 91 ： 694-701， 1989)、 Liu 和 Lomonossoff(J.Virol Meth， 105 ： 343-348， 2002) ； 美国专利 No.4,945,050 ； 5,036,006 ； 5,100,792 ； 6,403,865 ； 5,625,136( 所有这些文献均通过引用并入本文 )。
     可使用瞬时表达法表达本发明的构建体 ( 参见 Liu 和 Lomonossoff， 2002， Journal of Virological Methods， 105 ： 343-348， 其通过引用并入本文 )。或者， 可使用基于真空的 瞬时表达法， 如 Kapila 等 1997 Plant Science 122 ： 101-108( 其通过引用并入本文 ) 所 述。这些方法可包括， 例如但不限于农杆菌接种法或农杆菌侵染法， 然而， 也可使用如上文 所述的其他瞬时方法。使用农杆菌接种法或农杆菌侵染时， 含有期望核酸的农杆菌混合物 进入组织 ( 例如叶、 植物的地上部分 ( 包括茎、 叶和花 )、 植物的其他部分 ( 茎、 根、 花 ) 或整 个植株 ) 的细胞间隙中。穿过表皮后， 农杆菌感染细胞并将 t-DNA 拷贝移至细胞中。t-DNA 以附加体形式转录并且 mRNA 被翻译， 使目的蛋白在感染细胞中产生， 然而， t-DNA 在核内的 传代是瞬时的。
     本发明提供的包含嵌合 HA 的 VLP 可与现有流感疫苗组合使用， 以补充所述疫苗使 其更加有效， 或降低所需的施用剂量。 如本领域技术人员所已知的， 疫苗可针对一种或更多 种流感病毒。 合适的疫苗的实例包括但不限于从 Sanofi-Pasteur、 ID Biomedical、 Merial、 Sinovac、 Chiron、 Roche、 MedImmune、 GlaxoSmithKline、 Novartis、 Sanofi-Ayentis、 Serono、 Shire Pharmaceuticals 等购得的疫苗。
     如期望， 可将本发明的 VLP 与本领域技术人员已知的合适佐剂混合。此外， VLP 可 用于疫苗组合物， 其含有用于治疗上述靶标生物的有效剂量 VLP。此外， 根据本发明生产的 VLP 可与使用不同流感蛋白质 ( 例如神经氨酸酶 (NA)) 得到的 VLP 相组合。
     因此， 本发明提供了用于诱导动物或靶标生物中针对流感病毒感染的免疫的方 法， 其包括施用有效剂量的疫苗， 所述疫苗含有一种或多于一种 VLP。疫苗可经口、 皮内、 鼻 内、 肌内、 腹腔内、 静脉内或皮下施用。
     本发明多个实施方案的组合物可包含两种或更多种流感毒株或亚型的 VLP。 “两种 或更多种” 是指两种、 三种、 四种、 五种、 六种、 七种、 八种、 九种、 十种或更多种毒株或亚型。 所示毒株或亚型可以是单一亚型 ( 例如， 所有都为 H1N1， 或所有都为 H5N1)， 或者可以是亚 型的组合。示例性亚型和毒株包括 H5/Indo、 H1/Bri、 H1/NC、 H3/Bri、 B/Flo。对毒株和亚 型之组合的选择可取决于对象可能暴露于流感的地区， 动物物种 ( 例如水禽类、 农业动物 ( 例如猪 ) 等 ) 与待免疫人群的接近程度以及所述动物物种携带、 暴露于或可能暴露于的 毒株， 对亚型或毒株内抗原漂移的预测， 或者这些因素的组合。 过去几年所使用的组合的实 例可见于世界卫生组织 (WHO) 保存的数据库 ( 见 URL ： who.int/csr/dieease/influenza/ vaccine recommendations1/en)。
     两种或更多种 VLP 可单独表达， 随后将纯化的或半纯化的 VLP 相组合。或者， VLP 可在同一宿主 ( 例如植物、 植物部分或植物细胞 ) 中共表达。VLP 可以期望的比例 ( 例如大 致相等的比例 ) 组合或生产， 或者可以组合以使一种亚型或毒株占组合物中 VLP 的大部分。
     因此， 本发明提供了包含两种或更多种毒株或亚型的 VLP 的组合物。
     还提供了包含包装材料和包含含有嵌合 HA 之 VLP 的组合物的产品。该组合物包 含生理上或药理上可接受的赋形剂， 包装材料可以包含标明组合物活性成分 ( 例如 VLP) 的 标签。还提供了包含组合物的试剂盒， 所述组合物包含编码本文所述嵌合 HA 之核酸以 及使用该核酸生产嵌合 HA 或包含嵌合 HA 的 VLP 的说明书。该试剂盒可用于生产包含嵌合 HA 的 VLP， 说明书可以包括， 例如在植物或植物细胞中表达核酸的信息， 从植物或植物组织 中收获和获得 VLP 的说明。
     在另一个实施方案中， 提供了用于制备药物的试剂盒， 其包含含有嵌合 HA 的 VLP 及其使用说明书。说明书可以包含制备药物的一系列步骤， 药物可用于在施用对象中诱导 治疗性或预防性免疫应答。 该试剂盒还可包含说明剂量浓度、 剂量间隔、 优选施用方法等的 说明书。
     本发明将通过下面的实施例更详细的说明。但是应当理解， 这些实施例仅用于说 明的目的， 不应以任何方式用于限制本发明的范围。
     本文描述的序列汇总如下。
    
    
    材料与方法
     1.HA 表达盒的组装
     A-pCAMBIAPlasto
     使用 Sambrook 和 Russell(2001 ； 其通过引用并入本文 ) 的一般分子生物学方案 完成所有操作。表 1 显示用于表达盒组装的寡核苷酸引物。第一个克隆步骤是组装受体 质粒， 其包含苜蓿质体蓝素基因的上游和下游调控元件。使用寡核苷酸引物 XmaI-pPlas. c(SEQ ID NO ： 1) 和 SacI-ATG-pPlas.r(SEQ ID NO ： 2) 从苜蓿基因组 DNA 中扩增质体蓝 素启动子和 5’ UTR 序列。所得扩增产物用 XmaI 和 SacI 消化并与预先经同样的酶消化的 pCAMBIA2300(Cambia， Canberra， Australia) 连接， 以形成 pCAMBIApromoPlasto。类似地， 使用引物 SacI-PlasTer.c(SEQ ID NO ： 3) 和 EcoRI-PlasTer.r(SEQ ID NO ： 4) 从苜蓿基因 组 DNA 中扩增质体蓝素基因的 3’ UTR 序列和终止子， 所得产物用 SacI 和 EcoRI 消化， 然后 插入到 pCAMBIApromoPlasto 的相同位点中， 以形成 pCAMBIAPlasto。
     B-Plasto- 天然 SP-H5A/ 印度尼西亚 /5/05( 构建体号 660)
     Epoch Biolabs(Sugar Land， TX， USA) 合 成 了 编 码 流 感 毒 株 A/ 印 度 尼 西 亚 /5/05(H5N1 ； 登录号 LANL ISDN125873) 之血凝素的片段。所产生的包含完整 H5 编码区 的片段示于 (SEQ ID NO ： 52， 图 17)， 该编码区包含天然信号肽， 其侧翼为紧邻起始 ATG 上 游 的 HindIII 位 点 以 及 紧 邻 终 止 密 码 子 (TAA) 下 游 的 SacI 位 点。 通 过 Darveau 等 (1995) 所示的基于 PCR 的连接方法将 H5 编码区克隆到基于质体蓝素的表达盒中。简 言 之， 使 用 引 物 Plato-443c(SEQ ID NO ： 5) 和 SpHA(Ind)-Plasto.r(SEQ ID NO ： 6)， 以 pCAMBIApromoPlasto 作为模板进行第一 PCR 扩增。平行地， 使用引物 Plasto-SpHA(SEQ ID NO ： 7) 和 HA(Ind)-Sac.r(SEQ ID NO ： 8)， 以 H5 编码片段 (SEQ ID NO ： 52 ； 图 17) 作为模板 进行第二扩增。 将由两个反应得到的扩增物混合， 将混合物作为模板， 使用 Plato-443c(SEQ ID NO ： 5) 和 HA(Ind)-Sac.r(SEQ ID NO ： 8) 作 为 引 物 进 行 第 三 反 应 ( 组 装 反 应 )。 用 BamHI( 在质体蓝素启动子中 ) 和 SacI( 在片段的 3’ 端 ) 消化所得片段， 并将其克隆到预先 用相同酶消化的 pCAMBIAPlasto 中。所得质粒称为 660， 其示于图 18 中 (SEQ ID NO ： 53)。
     C-Plasto-PDI SP-H1A/ 新喀里多尼亚 /20/99( 构建体号 540)
     将流感毒株 A/ 新喀里多尼亚 /20/99(H1N1)H1 基因的开放阅读框合成为两个片段 (Plant Biotechnology Institute， National Research Council， Saskatoon， Canada)。 所 合成的第一片段对应于缺少 5’ 端信号肽编码序列和 3’ 端跨膜结构域编码序列的野生型 H1 编码序列 (GenBank 登录号 AY289929 ； SEQ ID NO ： 54 ； 图 19)。片段的 5’ 端由编码 PDISP 的 末端核苷酸 ( 含有 BglII 限制性位点 ) 构成， 并且将 SacI/StuI 双位点添加在紧邻该片段 3’ 端终止密码子下游， 得到 SEQ ID NO ： 55( 图 20)。还合成了编码 H1 蛋白 C 端 ( 包含跨膜 结构域和胞质尾 ) 的第二片段， 其从 KpnI 位点至终止密码子， 其 3’ 侧翼是 SacI 和 StuI 限 制性位点 (SEQ ID NO.56 ； 图 21)。
     第一 H1 片段用 BglII 和 SacI 消化， 并克隆到含有质体蓝素启动子和 5’ UTR( 与苜 蓿蛋白质二硫键异构酶 (PDI) 基因 (32-103 位核苷酸 ； 登录号 Z11499 ； SEQ ID NO ： 57 ； 图
     22) 的信号肽融合 ) 之二元载体 (pCAMBIAPlasto) 的同样位点中， 得到位于质体蓝素调控 元件的下游的 PDI-H1 嵌合基因。基于质体蓝素的表达盒序列示于 SEQ ID NO.58( 图 23)， 其含有启动子和 BglII 限制性位点上游的 PDI 信号肽， 以及 SacI 位点下游的质体蓝素终止 子。通过将预先用 KpnI 和 SacI 消化的合成片段 (SEQ ID NO ： 56 ； 图 21) 插入到 H1 表达质 粒中来添加 H1 编码区的 C 端 ( 编码跨膜结构域和胞质尾 )。所得构建体称为 540， 其示于 SEQ ID NO.59( 图 24)。
     D-Plasto- 天然 SP-H1A/ 布里斯班 /59/07( 构建体号 774)
     按照下列步骤组装指导 A/ 布里斯班 /59/07 的 H1 表达的表达盒号 774。合成包含 完整血凝素编码序列 ( 从 ATG 到终止 ) 的合成片段， 其 3’ 侧翼是对应于质体蓝素 ATG 上游 前 84 个核苷酸以 DraIII 限制性位点起始的的苜蓿质体蓝素基因序列。该合成片段还包含 紧邻终止密码子下游的 SacI 位点。
     合成片段由 Top Gene Technologies(Montreal， QC， Cahada) 合成。所合成的片段 示于 SEQ ID NO.60( 图 25)。对于完整表达盒的组装， 将合成片段用 DraIII 和 SacI 消化并 克隆到预先用同样的酶消化的 pCAMBIAPlasto 中， 得到构建体 774(SEQ ID NO.61 ； 图 26)。
     E-CPMV HT-LC C51( 构建体号 828)
     CPMV-HT 表达盒使用 35S 启动子来控制包含目的编码序列之 mRNA 的表达， 目的编 码序列的 5′侧翼为来自豇豆花叶病毒 (CPMV)RNA2 的 1-512 位核苷酸 ( 其在 115 和 161 位 具有突变的 ATG) 并且 3′侧翼为来自 CPMV RNA2 的 3330-3481 位核苷酸 ( 对应于 3′ UTR) 和其后的 NOS 终止子。使用质粒 pBD-C5-1LC(Sainsbury 等， 2008 ； Plant Biotechnology Journal 6 ： 82-92 以及 PCT 公开 WO 2007/135480) 来组装基于 CPMV-HT 的血凝素表达盒。 使用基于 PCR 的连接方法 (Darveau 等， Methods in Neuroscience 26 ： 77-85(1995)) 实现 CPMV RNA2 第 115 和 161 位的 ATG 的突变。 使用 pBD-C5-1LC 作为模板进行两个单独的 PCR。 用于第一扩增的引物是 pBinPlus.2613c(SEQ ID NO ： 9) 和 Mut-ATG115.r(SEQ ID NO ： 10)。 用于第二扩增的引物是 Mut-ATG161.c(SEQ ID NO ： 11) 和 LC-C5-1.110r(SEQ ID NO ： 12)。 将 获得的两片段混合， 并用作使用引物 pBinPlus.2613c(SEQ ID NO ： 9) 和 LC-C5-1.110r(SEQ ID NO ： 12) 之第三扩增的模板。所得片段用 PacI 和 ApaI 消化， 并克隆至用同样的酶消化 的 pBD-C5-1LC 中。所得构建体称为 828， 其示于图 27 中 (SEQ ID NO ： 62)。
     F-H5A/ 印度尼西亚 /5/05 骨架中的 H1A/ 布里斯班 /59/07 受体结合 (RB) 结构域 ( 构建体号 690)
     使用 Darveau 等 (Methods in Neuroscience 26 ： 77-85(1995)) 报道的基于 PCR 连接方法， 用 H1A/ 布里斯班 /59/07 的 RB 结构域替换 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 中的 RB 结 构域来制备嵌合 HA。在第一轮 PCR 中， 将质体蓝素启动子区段融合到天然信号肽上， 使用 引物 Plasto-443c(SEQ ID NO ： 5) 和 E1H1B-E1H5I.r(SEQ ID NO ： 13)， 以构建体号 660(SEQ ID NO ： 53， 图 18) 为模板扩增 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 的 F’ 1 和 E1 结构域。使用引物 E1 H5N-E1 H1B.c(SEQ ID NO ： 14) 和 E2 H5I-RB H1B.r(SEQ ID NO ： 15)， 以构建体号 774(SEQ ID NO ： 61 ； 图 26) 为模板扩增含有 H1A/ 布里斯班 /59/07 之 RB 结构域编码序列的第二片 段。使用引物 RBH1B-E2 H5I.c(SEQ ID NO ： 16) 和 HA(Ind)-SacI.r(SEQ ID NO ： 8)， 以构 建体号 660(SEQ ID NO 53 ； 图 18) 为模板扩增含有 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 的 E2、 F’ 2、 F、 跨膜和胞质结构域的第三片段。然后混合扩增产物， 并用作使用引物 Plasto-443c(SEQ IDNO ： 5) 和 HA(Ind)-SacI.r(SEQ ID NO ： 8) 之第二轮扩增 ( 组装反应 ) 的模板。所得片段用 BamHI( 在质体蓝素启动子中 ) 和 SacI( 在终止密码子后 ) 消化， 并克隆进预先用同样的限 制性酶消化的构建体号 660(SEQ ID NO ： 53 ； 图 18) 中， 得到构建体号 690(SEQ ID NO ： 63)。 该构建体示于图 28 中。
     G-H5A/ 印度尼西亚 /5/05 骨架中的 H1A/ 布里斯班 /59/07 酯酶和受体结合结构域 (E1-RB-E2)( 构建体号 691)
     使用 Darveau 等 (Methods in Neuroscience 26 ： 77-85(1995)) 报道的基于 PCR 连接方法， 用 H1A/ 布里斯班 /59/07 的 E1-RB-E2 结构域替换 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 中的 E1-RB-E2 结构域来组装嵌合 HA。在第一轮 PCR 中， 将质体蓝素启动子区段融合到天然信号 肽上， 使用引物 Plasto-443c(SEQ ID NO ： 5) 和 E1H1B-F’ 1H5I.r(SEQ ID NO ： 17)， 以构建体 号 660(SEQ ID NO ： 53， 图 18) 为模板扩增 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 的 F’ 1 结构域。平行地， 扩增其他两个片段。使用引物 F’ 1H5N-E1H1B.c(SEQ ID NO ： 18) 和 F’ 2H5I-E2H1B.r(SEQ ID NO ： 19)， 以构建体号 774(SEQ ID NO ： 61 ； 图 26) 为模板扩增含有 H1A/ 布里斯班 /59/07 之 E1-RB-E2 结构域编码序列的第二片段。对于第三片段， 使用引物 E2H1B-F’ 2H5I.c(SEQ ID NO ： 20) 和 HA(Ind)-SacI.r(SEQ ID NO ： 8)， 以构建体号 660(SEQ ID NO 53 ； 图 18) 为 模板扩增 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 的 F’ 2、 F、 跨膜和胞质结构域。然后混合扩增产物， 并用 作使用引物 Plasto-443c(SEQ ID NO ： 5) 和 HA(Ind)-SacI.r(SEQ ID NO ： 8) 之第二轮扩增 ( 组装反应 ) 的模板。所得片段用 BamHI( 在质体蓝素启动子中 ) 和 SacI( 在终止密码子 后 ) 消化， 并克隆进预先用同样的限制性酶消化的构建体号 660(SEQ ID NO ： 53 ； 图 18) 中， 得到构建体号 691(SEQ ID NO ： 64)。该构建体示于图 29 中。
     H-H1A/ 新喀里多尼亚 /20/99 骨架中的 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 受体结合 (RB) 结 构域 ( 构建体号 696)
     使用 Darveau 等 (Methods in Neuroscience 26 ： 77-85(1995)) 报道的基于 PCR 连接方法， 用 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 的 RB 结构域替换 H1A/ 新喀里多尼亚 /20/99 中的 RB 结构域来制备嵌合 HA。在第一轮 PCR 中， 将质体蓝素启动子区段融合到苜蓿蛋白二硫键异 构酶信号肽 (PDISP ； 登录号 Z11499， SEQ ID NO ： 57 第 32-103 位核苷酸 ； 图 22) 上， 使用引 物 Plasto-443c(SEQ ID NO ： 5) 和 E1H5I-E1H1NC.r(SEQ ID NO ： 21)， 以构建体号 540(SEQ ID NO ： 59， 图 24) 为模板扩增 H1A/ 新喀里多尼亚 /20/99 的 F’ 1 和 E1 结构域。使用引物 E1H1NC-E1H5I.c(SEQ ID NO ： 22) 和 E2H1NC-RB H5I.r(SEQ ID NO ： 23)， 以构建体号 660(SEQ ID NO ： 53 ； 图 18) 为模板扩增含有 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 之 RB 结构域编码序列的第二片 段。 使用引物 RB H5I-E2 H1NC.c(SEQ ID NO ： 24) 和 HA-SacI.r(SEQID NO ： 25)， 以构建体号 F’ 2、 F、 跨膜 540(SEQ ID NO ： 59 ； 图 24) 为模板扩增含有 H1A/ 新喀里多尼亚 /20/99 的 E2、 和胞质结构域的第三片段。然后混合扩增产物， 并用作使用引物 Plasto-443c(SEQ ID NO ： 5) 和 HA-SacI.r(SEQ ID NO ： 25) 之第二轮扩增 ( 组装反应 ) 的模板。所得片段用 BglII 和 SacI 消化， 并克隆至预先用同样的限制性酶消化的构建体号 540(SEQ ID NO ： 59， 图 24) 中， 获得构建体号 696(SEQ ID NO ： 65)。该构建体示于图 30 中。
     I- 将 H1A/ 布里斯班 /59/2007 组装进 CPMV-HT 表达盒 ( 构建体号 732)
     按照以下所述将来自 H1A/ 布里斯班 /59/2007 的 HA 编码序列克隆进 CPMV-HT 中。 通过使用构建体号 774(SEQ ID NO ： 61 ； 图 26) 作为模板， 用引物 ApaI-H1B.c(SEQ ID NO ：26) 和 StuI-H1B.r(SEQ ID NO ： 27) 进行 PCR 扩增， 从而将限制性位点 ApaI( 紧邻 ATG 上游 ) 和 StuI( 紧邻终止密码子下游 ) 添加至血凝素编码序列中。所得片段用 ApaI 和 StuI 限制 性酶消化， 并克隆至用同样的酶消化的构建体号 828(SEQ ID NO ： 62， 图 27) 中。所得的盒 称为构建体号 732(SEQ ID NO ： 66， 图 31)。
     J- 将 SpPDI-H1A/ 布里斯班 /59/2007 组装进 CPMV-HT 表达盒 ( 构建体号 733)
     按照以下所述将编码苜蓿蛋白二硫键异构酶信号肽的序列 (PDISP ； SEQ ID NO ： 57 第 32-103 位核苷酸， 图 22 ； 登录号 Z11499) 与来自 A/ 布里斯班 /59/2007 之 H1 的 HA0 编码 序列融合， 并将所得片段克隆至 CPMV-HT 中。 通过使用构建体 774(SEQ ID NO ： 61， 图 26) 作 为模板， 用引物 SpPDI-H1B.c(SEQ ID NO ： 28) 和 SacI-H1B.r(SEQ ID NO ： 29) 扩增得到 H1 编码序列。所得片段在 H1 编码序列 5’ 侧翼为编码 PDISP 的最后几个核苷酸 ( 包含 BglII 限制性位点 )， 3’ 侧翼为 SacI 限制性位点。将该片段用 BglII 和 SacI 消化， 并克隆至预先 用同样的限制性酶消化的构建体号 540(SEQ ID NO ： 59， 图 24) 中。称为构建体号 787(SEQ ID NO 67) 的中间盒编码序列显示于图 32 中。通过使用构建体号 787(SEQ ID NO ： 67 ； 图 32) 作为模板， 用引物 ApaI-SpPDI.c(SEQ ID NO ： 30) 和 StuI-H1B.r(SEQ ID NO ： 27) 进行 PCR 扩增， 从而将限制性位点 ApaI( 紧邻 ATG 上游 ) 和 StuI( 紧邻终止密码子下游 ) 添加 至血凝素编码序列中。所得片段用 ApaI 和 StuI 限制性酶消化， 并克隆至用同样的酶消化 的构建体号 828(SEQ ID NO ： 62， 图 27) 中。所得的盒称为构建体号 733(SEQ ID NO ： 68， 图 33)。
     K- 在 CPMV-HT 表达盒中组装 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 骨架中的 H1A/ 布里斯班 /59/07 受体结合 (RB) 结构域 ( 构建体号 734)
     按 照 以 下 所 述 将 嵌 合 HA 的 编 码 序 列 ( 在 H5A/ 印 度 尼 西 亚 /5/05 骨 架 中 具 有 H1A/ 布 里 斯 班 /59/07 的 RB 结 构 域 ) 克 隆 到 CPMV-HT 中。 通 过 使 用 构 建 体 690(SEQ ID NO ： 63 ； 图 28) 作 为 模 板， 用 引 物 ApaI-H5(A-Indo).1c(SEQ ID NO ： 31) 和 H5(A-Indo)-StuI.1707r(SEQ ID NO ： 32) 进行 PCR 扩增， 从而将限制性位点 ApaI( 紧邻 ATG 上游 ) 和 StuI( 紧邻终止密码子下游 ) 添加至嵌合血凝素编码序列中。所得片段用 ApaI 和 StuI 限制性酶消化， 并克隆至用同样的酶消化的构建体号 828(SEQ ID NO ： 62， 图 27) 中。 所得的盒称为构建体号 734(SEQ ID NO ： 69， 图 34)。
     L- 将 SpPDI-H3A/ 布里斯班 /10/2007 组装进 CPMV-HT 表达盒 ( 构建体号 736)
     按照以下所述将编码苜蓿 PDI 信号肽的序列与来自 H3A/ 布里斯班 /10/2007 的 HA0 融合， 并克隆至 CPMV-HT 中。首先， 合成包含完整血凝素编码序列 ( 从 ATG 到终止 ) 的 合成片段， 其 3’ 侧翼是对应于质体蓝素 ATG 上游前 84 个核苷酸 ( 以 DraIII 限制性位点起 始 ) 的苜蓿质体蓝素基因序列。该合成片段还包含紧邻终止子之后的 SacI 位点。合成片 段由 TopGene Technologies(Montreal， QC， Canada) 合成。所合成的片段示于 SEQ ID NO ： 70( 图 35)， 并进一步用作基于 PCR 的连接的模板。
     其次， 按照以下所述将苜蓿蛋白二硫键异构酶 (PDISP)( 核苷酸 32-103 ； 登录号 Z11499 ； SEQ ID NO ： 57 ； 图 22) 信号肽与紧邻 ATG 上游的 ApaI 限制性位点和终止密码子下 游的 StuI 限制性位点一起连接到来自 A/ 布里斯班 /10/2007 之 H3 的 HA0 编码序列上。使 用 Darveau 等 (Methods in Neuroscience 26 ： 77-85(1995)) 报道的基于 PCR 的连接方法， 将 PDISP 与 H3 编码序列连接。在第一轮 PCR 中， 使用引物 ApaI-SpPDI.c(SEQ ID NO ： 30)和 H3B-SpPDI.r(SEQ ID NO ： 33)， 以构建体 540(SEQ ID NO ： 59 ； 图 24) 为模板扩增 PDISP 信号肽。平行地， 使用引物 SpPDI-H3B.c(SEQ ID NO ： 34) 和 StuI-H3B.r(SEQ ID NO ： 35)， 以先前合成的片段 (SEQ ID NO ： 70 ； 图 35) 为模板扩增含有 H3A/ 布里斯班 /10/2007 部分 编码序列 ( 从密码子 17 到终止密码子 ) 的另一片段。然后混合扩增产物， 并用作使用引 物 ApaI-SpPDI.c(SEQ ID NO ： 30) 和 StuI-H3B.r(SEQ ID NO ： 35) 之第二轮扩增 ( 组装反 应 ) 的模板。所得片段用 ApaI 和 StuI 限制性酶消化， 并克隆至用同样的酶消化的构建体 号 828(SEQ ID NO ： 62， 图 27) 中。所得的盒称为构建体号 736(SEQ ID NO ： 71， 图 36)。
     M- 在 CPMV-HT 表 达 盒 中 组 装 嵌 合 SpPDI-H3A/ 布 里 斯 班 /10/2007( 胞 外 结 构 域 )+H5A/ 印度尼西亚 /5/2005(TmD+Cyto tail)( 构建体号 737)
     按照以下所述将编码苜蓿 PDI 信号肽的序列融合到 H3A/ 布里斯班 /10/2007 胞外 结构域和 H5A/ 印度尼西亚 /5/2005 的跨膜和胞质结构域上， 并克隆到 CPMV-HT 中。使用 Darveau 等 (Methods in Neuroscience 26 ： 77-85(1995)) 报道的基于 PCR 的连接方法， 将 PDISP-H3 编码序列与 H5 跨膜结构域融合。在第一轮 PCR 中， 通过使用引物 ApaI-SpPDI. c(SEQ ID NO ： 30) 和 TmD H5I-H3B.r(SEQ ID NO ： 36)， 以构建体号 736(SEQ ID NO ： 71 ； 图 36) 为模板扩增产生包含 PDISP 信号肽和 H3 布里斯班胞外结构域的片段。平行地， 使 用 引 物 H3B-TmD H5I.c(SEQ ID NO ： 37) 和 H5(A-Indo)-StuI.1707r(SEQ ID NO ： 32)， 以 构建体号 660(SEQ ID NO ： 53 ； 图 18) 为模板扩增含有 H5 印度尼西亚之跨膜和胞质结构 域的另一片段。然后混合扩增产物， 并用作使用引物 ApaI-SpPDI.c(SEQ ID NO ： 30) 和 H5(A-Indo)-StuI.1707r(SEQ ID NO ： 32) 之第二轮扩增 ( 组装反应 ) 的模板。所得片段用 ApaI 和 StuI 限制性酶消化， 并克隆至用同样的酶消化的构建体号 828(SEQ ID NO ： 62， 图 27) 中。所得的盒称为构建体号 737(SEQ ID NO ： 72， 图 37)。
     N- 将 SpPDI-HA B/ 佛罗里达 /4/2006 组装进 CPMV-HT 表达盒 ( 构建体号 739)
     按照以下所述将编码苜蓿 PDI 信号肽的序列与来自 HA B/ 布里斯班 /4/2006 的 HA0 融合， 并克隆至 CPMV-HT 中。首先， 合成包含完整血凝素编码序列 ( 从 ATG 到终止 ) 的 合成片段， 其 3’ 侧翼是对应于质体蓝素 ATG 上游前 84 个核苷酸 ( 以 DraIII 限制性位点起 始 ) 的苜蓿质体蓝素基因序列。合成片段还包含紧邻终止密码子之后的 SacI 限制性位点。 该合成片段由 Epoch Biolabs(Sugar Land， Texas， USA) 合成。所合成的片段示于 SEQ ID NO73( 图 38)， 并进一步用作基于 PCR 的连接的模板。
     其次， 按照以下所述将苜蓿蛋白二硫键异构酶 (PDISP)(SEQ ID NO ： 57 核苷酸 32-103 位 ； 图 22 ； 登录号 Z11499) 信号肽与紧邻上游 ATG 的 ApaI 限制性位点和终止密码 子下游的 StuI 限制性位点一起连接到来自 B/ 佛罗里达 /4/2006 之 HA 的 HA0 编码序列上。 使用 Darveau 等 (Methods in Neuroscience 26 ： 77-85(1995)) 报道的基于 PCR 的连接方 法， 将 PDISP 与 HA 编码序列连接。在第一轮 PCR 中， 使用引物 ApaI-SpPDI.c(SEQ ID NO ： 30) 和 HBF-SpPDI.r(SEQ ID NO ： 38)， 以构建体号 540(SEQ ID NO ： 59 ； 图 24) 为模板扩增 PDISP 信号肽。平行地， 使用引物 SpPDI-H3B.c(SEQ ID NO ： 39) 和 StuI-HBF.r(SEQ ID NO ： 40)， 以先前合成的片段 (SEQ ID NO ： 73 ； 图 38) 为模板扩增含有来自 B/ 佛罗里达 /4/2006 之 HA 的部分编码序列 ( 从密码子 16 到终止密码子 ) 的另一片段。然后混合扩增产物， 并 用作使用引物 ApaI-SpPDI.c(SEQ ID NO ： 30) 和 StuI-HBF.r(SEQ IDNO ： 40) 之第二轮扩增 ( 组装反应 ) 的模板。所得片段用 ApaI 和 StuI 限制性酶消化， 并克隆至用同样的酶消化的构建体号 828(SEQ ID NO ： 62， 图 27) 中。所得的盒称为构建体号 739(SEQ ID NO ： 74， 图 39)。 O- 在 CPMV-HT 表达盒中组装嵌合 SpPDI-HA B/ 佛罗里达 /4/2006( 胞外结构域 )+H5A/ 印度尼西亚 /5/2005(TmD+Cyto tail)( 构建体号 745)。
     按照以下所述将编码苜蓿 PDI 信号肽的序列融合到 HA B/ 佛罗里达 /4/2006 胞外 结构域和 H5A/ 印度尼西亚 /5/2005 的跨膜和胞质结构域上， 并克隆到 CPMV-HT 中。使用 Darveau 等 (Methods in Neuroscience 26 ： 77-85(1995)) 报道的基于 PCR 的连接方法， 将 PDISP-B/ 佛罗里达 /4/2006 胞外结构域编码序列与 H5 跨膜和胞质结构域融合。在第一轮 PCR 中， 使用引物 ApaI-SpPDI.c(SEQ ID NO ： 30) 和 TmD H5I-B Flo.r(SEQ ID NO ： 41)， 以构 建体号 739(SEQ ID NO ： 74 ； 图 39) 为模板扩增产生包含与 HA B/ 佛罗里达 /4/2006 胞外结 构域融合的 PDISP 信号肽的片段。平行地， 使用引物 B Flo-TmD H5I.c(SEQ ID NO ： 42) 和 H5(A-Indo)-StuI.1707r(SEQ ID NO ： 32)， 以构建体号 660(SEQ ID NO ： 53 ； 图 18) 为模板扩 增含有 H5 印度尼西亚跨膜和胞质结构域的另一片段。然后混合扩增产物， 并用作使用引物 ApaI-SpPDI.c(SEQ ID NO ： 30) 和 H5(A-Indo)-StuI.1707r(SEQ ID NO ： 32) 之第二轮扩增 ( 组装反应 ) 的模板。所得片段用 ApaI 和 StuI 限制性酶消化， 并克隆至用同样的酶消化 的构建体号 828(SEQ ID NO ： 62， 图 27) 中。所得的盒称为构建体号 745(SEQ ID NO ： 75， 图 40)。
     P- 在 2X35S-CPMV-HT 表达盒中组装嵌合 SpPDI-HA B/ 佛罗里达 /4/2006+H5A/ 印 度尼西亚 /5/2005(TmD+Cyto tail)( 构建体号 747)
     按照以下所述将编码苜蓿 PDI 信号肽的序列融合到来自 HA B/ 佛罗里达 /4/2006 的 HA0 和 H5A/ 印度尼西亚 /5/2005 的跨膜和胞质结构域上， 并克隆到 2X35S-CPMV-HT 中。 使用 Darveau 等 (Methods in Neuroscience 26 ： 77-85(1995)) 报道的基于 PCR 的连接方 法进行启动子转换。使用引物 PacI-MCS-2X35S.c(SEQ ID NO ： 89) 和 CPMV 5’ UTR-2X35S. r(SEQ ID NO ： 90) ：
    以含有 2X35S 启动子的质粒为模板通过 PCR 扩增含有 2X35S 启动子 (SEQ ID NO ： 88 ： 图 50A) 的第一片段。 平行地， 使用引物 2X35S-CPMV 5’ UTR.c(SEO ID NO ： 91) 和 ApaI-M prot.r(SEO ID NO ： 92) ：
    以构建体 745(SEQ ID NO ： 75 ； 图 40) 为模板进行第二 PCR。然后混合所得的两种 片段并用作使用引物 PacI-MCS-2X35S.c(SEQ ID NO ： 89) 和 ApaI-M prot.r(SEQ ID NO ： 92) 之第二轮 PCR( 组装反应 ) 的模板。所得片段用 PacI 和 ApaI 消化， 并克隆至用同样的酶消 化的构建体 745(SEQ ID NO ： 75， 图 40) 中。 表达盒称为构建体 747(SEQ ID NO ： 93)， 其序列 示于图 50B 中。
     2. 伴侣蛋白表达盒的组装
     组装了两种热休克蛋白 (Hsp) 表达盒。在第一种盒中， 拟南芥 ( 哥伦比亚生态 型 ) 胞浆 HSP70(Lin 等 (2001)Cell stress and Chaperones 6 ： 201-208 中的 Athsp70-1) 的表达被苜蓿亚硝酸还原酶 (Nir) 和苜蓿质体蓝素启动子的嵌合启动子组合元件 (Nir/ Plasto) 控制。还组装了第二种盒， 其包含嵌合 Nir/Plasto 启动子控制下的苜蓿胞浆 HSP40(MsJ1 ； Frugis 等 (1999)Plant Molecular Biology 40 ： 397-408) 编码区。
     首先， 组装了在植物二元载体中含有苜蓿亚硝酸还原酶启动子 (Nir)、 GUS 报 告基因和 NOS 终止子的接纳质粒 (acceptor plasmid)。用 HindIII 和 EcoRI 消化质粒 pNir3K51( 先前描述于美国专利 No.6,420,548 中 )。将所得片段克隆进用同样的限制性酶 消化的 pCAMBIA2300(Cambia， Canberra， Australia) 中， 得到 pCAMBIA-Nir3K51。
     通 过 基 于 PCR 的 连 接 方 法 (Darveau 等， Methods in Neuroscience 26 ： 77-85(1995))， 将 Hsp70 和 Hsp40 的编码序列分别克隆进接纳质粒 pCAMBIANir3K51 中。
     对于 Hsp40， 使用引物 Hsp40Luz.1c(SEQ ID NO ： 43) 和 Hsp40Luz-SacI.1272r(SEQ ID NO ： 44)， 通 过 RT-PCR 从 苜 蓿 (Rangclander 生 态 型 ) 叶 总 RNA 中 扩 增 Msj1 编 码 序 列 (SEQ ID NO ： 76 ； 图 41)。使用构建体 660(SEQ ID NO ： 53 ； 图 18) 作为模板， 用引物 Plasto-443c(SEQ ID NO ： 5) 和 Hsp40Luz-Plasto.r(SEQ ID NO ： 45) 进行第二扩增。然后 混合 PCR 产物， 并用作使用引物 Plasto-443c(SEQ ID NO ： 5) 和 Hsp40Luz-SacI.1272r(SEQ ID NO ： 44) 之第三扩增 ( 组装反应 ) 的模板。所得片段用 HpaI( 在质体蓝素启动子中 ) 消 化， 并克隆进预先用 HpaI( 在 Nir 启动子中 ) 和 SacI 消化并用 T4DNA 聚合酶处理以产生平 末端的 pCAMBIANir3K51 中。筛选正确取向的所得克隆， 并测序以检验序列完整性。所得质 粒称为 R850， 其示于图 42 中 (SEQ ID NO ： 77)。使用引物 Hsp70Ara.1c(SEQ ID NO ： 46) 和 Hsp70Ara-SacI.1956r(SEQ ID NO ： 47)， 通过 RT-PCR 从拟南芥叶 RNA 中扩增 Athsp70-1 的 编码区。使用构建体 660(SEQ ID NO ： 53， 图 18) 作为模板， 用引物 Plato-443c(SEQ ID NO ： 5) 和 Hsp70Ara-Plasto.r(SEQ ID NO ： 48) 进行第二扩增。然后混合 PCR 产物， 并作使用引 物 Plasto-443c(SEQ ID NO ： 5) 和 Hsp70ARA-SacI.1956r(SEQ ID NO ： 47) 之第三扩增 ( 组 装反应 ) 的模板。所得片段用 HpaI( 在质体蓝素启动子中 ) 消化， 并克隆进用 HpaI( 在 Nir 启动子中 ) 和 SacI 消化并用 T4DNA 聚合酶处理以产生平末端的 pCAMBIANir3K51 中。筛选 正确取向的所得克隆， 并测序以检验序列完整性。所得质粒称为 R860， 其示于图 43 中 (SEQ ID NO ： 78)。
     按照以下所述组装双 Hsp 表达质粒。 R860(SEQ ID NO ： 78 ； 图 43) 用 BsrBI(NOS 终 止子下游 ) 消化， 用 T4DNA 聚合酶处理以产生平末端， 并用 SbfI( 嵌合 NIR/Plasto 启动子 的上游 ) 消化。将所得片段 ( 嵌合 Nir/Plasto 启动子 -HSP70 编码序列 -Nos 终止子 ) 克 隆进预先用 SbfI 和 SmaI( 均位于嵌合 Nir/Plasto 启动子上游的多克隆位点中 ) 消化的 R850(SEQ ID NO ： 77 ； 图 42) 中。所得质粒称为 R870， 其示于图 44 中 (SEQ ID NO ： 79)。3. 其他表达盒的组装
     HcPro 表达盒
     如 Hamilton 等 (2002) 所述制备 HcPro 构建体 (35HcPro)。对所有克隆进行测 序以证实构建体的完整性。通过电穿孔 (Mattanovich 等， 1989) 用质粒转化根瘤农杆菌 (Agrobacteium tumefaciens)(AGL1 ； ATCC， Manassas， VA 20108， USA)。通过限制性图谱证 实所有根瘤农杆菌株的完整性。
     P19 表达盒
     通 过 基 于 PCR 的 连 接 方 法 (Darveau 等， Methods in Neuroscience 26 ： 77-85(1995)) 将番茄丛矮病毒 (TBSV)p19 蛋白的编码序列与苜蓿质体蓝素表达盒连接。 在 第一轮 PCR 中， 使用构建体 660(SEQ ID NO ： 53) 作为模板， 用引物 Plasto-443c(SEQ ID NO ： 5) 和 supP19-plasto.r(SEQ ID NO ： 49) 扩增质体蓝素启动子的区段。平行地， 使用构建体 35S ： p19( 如 Voinnet 等， The Plant Journal 33 ： 949-956(2003) 所述 ) 作为模板， 用引物 supP19-1c(SEQ ID NO ： 50) 和 SupP19-SacI.r(SEQ ID NO ： 51) 扩增含有 p19 编码序列的另 一片段。 然后混合扩增产物， 并用作使用引物 Plasto-443c(SEQ ID NO ： 5) 和 SupP19-SacI. r(SEQ ID NO ： 51) 之第二轮扩增 ( 组装反应 ) 的模板。所得片段用 BamHI( 在质体蓝素启 动子中 ) 和 SacI( 在 p19 编码序列末端 ) 消化， 并克隆进预先用同样的限制性酶消化的构 建体号 660(SEQ ID NO ： 53 ； 图 18) 中， 得到构建体号 R472。质粒 R472 示于图 45 中。
     构建体号 443
     构建体号 443 对应 pCAMBIA2300( 空载体 )。
     表 1. 用于表达盒组装的寡核苷酸引物。
    
    
    表2： 用于表达带有天然或 PDI 信号肽的流感血凝素的农杆菌菌株农杆菌菌株 AGL1/540 AGL1/774 AGL1/787 AGL1/732 AGL1/736 AGL1/660 AGL1/739 AGLI/828 AGLI/690 AGLI/691 AGLI/696 AGLI/733 表达的 HA H1(A/ 新喀里多尼亚 /20/99) H1(A/ 布里斯班 /59/2007) H1(A/ 布里斯班 /59/2007) H1(A/ 布里斯班 /59/2007) H3(A/ 布里斯班 /10/2007) H5(A 印度尼西亚 /5/2005) B(B/ 佛罗里达 /4/2006) CPMV HT-LC C51 H1/Bris RB+H5/Indo SDC H1/Bri E1-RB-E2+H5SDC H5/Indo RB+H1/NC SDC H1/Bri 信号肽 PDI 天然 PDI 天然 PDI 天然 PDI C51LC 天然 天然 PDI PDI 表达盒 质体蓝素 质体蓝素 质体蓝素 35S/CPMV-HT 35S/CPMV-HT 质体蓝素 35S/CPMV-HT 35S/CPMV-HT Plasto Plasto Plasto 35S/CPMV-HT40CN 102482328 A AGLI/734 AGLI/737 AGLI/745 AGL1/747
    说H1/Bri RB+H5/Indo SDC明书天然 PDI PDI PDI 35S/CPMV-HT 35S/CPMV-HT 35S/CPMV-HT 2X35S/CPMV-HT39/45 页H3/Bri 胞外结构域 +H5/Indo TDC B/Flo 胞外结构域 _H5/Indo TDC B/Flo 胞外结构域 _H5/Indo TDC4. 植物生物质的准备、 接种、 农杆菌侵染和收获
     在 填 装 市 售 泥 炭 基 质 的 平 地 上 从 种 子 培 养 本 塞 姆 氏 烟 草 (Nicotiana benthamiana)。使植物以 16/8 光照周期生长在温室中， 温度放方案白天 25℃ / 晚上 20℃。 播种 3 周后， 挑出各株幼苗， 移栽到盆中， 并在同样的环境条件下在温室中再生长 3 周。转 化前， 在以下所述的不同时间通过掐掉植物的芽或通过化学处理植物而除去顶芽和腋芽。
     在补充有 10mM 2-[N- 吗啉 ] 乙磺酸 (MES)、 20μM 乙酰丁香酮、 50μg/ml 卡那霉 素和 25μg/ml 羧苄青霉素的 YEB 培养基 (pH 5.6) 中培养用每种构建体转染的农杆菌， 直 至其 OD600 为 0.6 至 1.6。使用前将农杆菌混悬液离心并重悬在侵染培养基 (10mM MgCl2 和 10mM MES， pH 5.6) 中。如 Liu 和 Lomonossoff(2002， Journal of Virological Methods， 105 ： 343-348) 所述进行注射器侵染。对于真空侵染， 将根瘤农杆菌混悬液离心， 重悬在侵 染培养基中， 并储存在 4℃过夜。在侵染当天， 将分批培养物在 2.5 倍培养物体积中稀释并 在使用前温热。在 20-40 托真空下， 使本塞姆氏烟草或普通烟草 (N.tabacum) 的整个植株 倒置于气密性不锈钢罐中的细菌混悬液中 2 分钟。注射器或真空侵染后， 将植株移回温室 中培养 4-5 天直至收获。除非另外指明， 否则所有侵染均通过与 AGL1/35S-HcPro 以 1 ∶ 1 共侵染来进行， 具有 CPMV-HT 盒的毒株除外 ( 其与毒株 AGL1/R472 以 1 ∶ 1 共侵染 )。
     5. 叶片取样和总蛋白质提取
     培养后， 收获植株的地上部分， 冷冻在 -80℃， 破碎成碎片。通过将每个冷冻破碎 植物材料的样品在 3 倍体积的冷 50mM Tris(pH 8.0)0.15M NaCl， 0.04％焦亚硫酸钠和 1mM 苯甲基磺酰氟中匀浆 (Polytron) 来提取总的可溶性蛋白质。匀浆后， 于 4℃下以 20,000g 离心浆液 20 分钟， 将这些澄清的粗提物 ( 上清液 ) 用于分析。使用牛血清白蛋白作为参照 标准， 通过 Bradford 测定 (Bio-Rad， Hercules， CA) 来测定澄清的粗提物的总蛋白质含量。
     6. 蛋白质分析和免疫印迹
     蛋白浓度通过 BCA 蛋白测定 (Pierce Biochemicals， Rockport IL) 来测定。在还 原条件下通过 SDS-PAGE 分离蛋白质， 并用考马斯蓝染色。对经染色的凝胶进行扫描， 并使 用 ImageJ Software(NIH) 进行密度分析。
     用丙酮来沉淀来自 SEC 洗脱级分的蛋白质 (Bollag 等， 1996)， 重悬在 1/5 体积的 平衡 / 洗脱缓冲液中， 在还原条件下通过 SDS-PAGE 分离并电转移到聚偏氟乙烯 (PVDF) 膜 (Roche Diagnostics Corporation， Indianapolis， IN) 上用于免疫检测。 在免疫印迹之前， 用 Tris 缓冲盐水 (TBS-T) 中 5％脱脂奶和 0.1％ Tween-20 在 4℃下封闭膜 16-18 小时。
    通过用 2μg/ml 的合适抗体 ( 表 6)( 在 2％脱脂奶、 0.1％ TBS-Tween20 中 ) 孵育 进行免疫印迹。 用于化学发光检测的第二抗体示于表 4 中， 如所示将其在 2％脱脂奶、 0.1％
     TBS-Tween 20 中稀释。使用 luminol(Roche Diagnostics Corporation) 作为底物， 通过 化学发光检测免疫反应性复合物。使用 EZ-Link Plus 活化辣根过氧化物酶缀合试剂盒 (Pierce， Rockford， IL) 进行人 IgG 抗体的辣根过氧化物酶缀合。用作检测 H1、 H3 和 B 亚 型之对照的失活全病毒 (WIV) 从 National Institute for Biological Standards and Control(NIBSC) 购得。
     表3： 用于所表达蛋白质免疫印迹的电泳条件、 抗体和稀释
    FII ： Fitzgerald Industries International， Concord， MA， USA ；
     NIBSC ： National Institute for Biological Standards and Control ；
     JIR ： Jackson ImmunoResearch， West Grove， PA， USA ；
     ITC ： Immune Technology Corporation， Woodside， N Y， USA ；
     7.SEC 前的澄清和浓缩
     为了改善分辨率和增加洗脱级分的信号， 使用以下方法对待加载到体积排阻色谱 上的提取物粗蛋白提取物进行澄清和浓缩。 提取物在 4℃下以 70000g 离心 20 分钟， 沉淀通 过用 1 体积 ( 相比最初的提取物体积 ) 的提取缓冲液 (50mM Tris， pH8.0， 0.15M NaCl) 重 悬来清洗两次， 并在 4℃下以 70000g 离心 20 分钟。获得的沉淀重悬在 1/3 体积 ( 相比最初 的提取物体积 ) 中， 加入 20％ (w/v)PEG3350 然后在冰上孵育 1 小时使蛋白 ( 包括 VLP) 沉 淀。在 4℃下以 10000g 离心 20 分钟回收沉淀的蛋白质， 并重悬在 1/15 体积 ( 相比最初的 提取物体积 ) 的提取缓冲液中。完全重悬蛋白质后， 在 4℃下以 20000g 离心 5 分钟沉淀不 溶物， 回收清澈的上清液。
     8. 蛋白质提取物的体积排阻色谱
     装 填 32ml SephacrylTMS-500 高 分 辨 率 珠 (S-500HR ： GE Healthcare， Uppsala， Sweden， 货 号 17-0613-10) 的 体 积 排 阻 色 谱 (SEC) 柱， 用 平 衡 / 洗 脱 缓 冲 液 (50mM 的
     Tris(pH8)， 150mM NaCl) 平衡。将 1.5mL 粗蛋白质提取物加载到该柱上， 然后用 45mL 平 衡 / 洗脱缓冲液进行洗脱步骤。以 1.5mL 级分收集洗脱液， 洗脱级分的相对蛋白质含量这 样通过将 10μL 级分与 200μL 稀释的 Bio-Rad 蛋白染色试剂 (Bio-Rad， Hercales， CA) 混 合来监测。用 2 倍柱体积的 0.2N NaOH 清洗该柱， 然后用 10 倍柱体积的 50mM Tris(pH8)、 150mM NaCl 和 20％乙醇清洗。 每次分离之后用蓝葡聚糖 2000(GE HealthCare Bio-Science Corp.， Piscataway， NJ， USA) 校准柱。在每次分离之间对蓝葡聚糖 2000 和宿主可溶性蛋白 质的洗脱曲线进行比较， 以确保所用柱之间的洗脱曲线的一致性。
     实施例 1 ： 流感亚型茎上 RB 和 / 或酯酶结构域的替换策略
     H5/Indo 的 RB 亚结构域可以用 H1、 H3 或 B HA 的 RB 亚结构域替换。 得到的嵌合 HA 提供 SDC H5/Indo 以形成 VLP， 并显示包含 H1、 H3 或 B 免疫原性位点的 RB 亚结构域。H5/ Indo RB 亚结构域可以插入到 H1 茎上 (H1/NC)。图 15A 和 15B 显示了所示亚结构域融合位 点的氨基酸序列， 相应亚结构域的氨基酸序列显示在图 2( 构建体 690、 734、 696 和 691) 和 表 4( 构建体 900 和 745) 和表 5( 构建体 910、 920 和 930) 中。图 2 和表 4、 5 中显示的氨基 酸序列不包含信号肽序列。
     表 4 亚结构域和嵌合流感 HA。包含异源 RB 亚结构域的嵌合流感 HA。
    序列 SEQ ID NO ： 105 的 1-92 位氨基酸是 H5/Indo 的 F’ 1+E1 结构域 ； 93-259 位氨 基酸是 H3/ 布里斯班的 RB 头部结构域， 260-548 位氨基酸是 H5/Indo 的 E2+F’ 2 结构域。
     序列 SEQ ID NO ： 106 的 1-92 位氨基酸是 H5/Indo 的 F’ 1+E1 结构域 ； 93-276 位氨 基酸是 B/ 佛罗里达的 RB 头部结构域， 277-565 位氨基酸是 H5/Indo 的 E2+F’ 2 结构域。
     表 5 亚结构域和嵌合流感 HA。包含异源 RB 亚结构域的嵌合流感 HA。
    
    SEQ ID NO ： 107 的 1-42 位氨基酸是 H5/Indo 的 N 端 F’ 1 结构域 ； 43-228 位氨基 酸是 H3/ 布里斯班的 E1-RB-E2 头部结构域， 229-507 位氨基酸是 H5/Indo 的 F’ 2 结构域。
     SEQ ID NO ： 108 的 1-42 位氨基酸是 H5/Indo 的 N 端 F’ 1 结构域 ； 43-281 位氨基 酸是 B/ 佛罗里达的 E1-RB-E2 头部结构域 ； 282-556 位氨基酸是 H5/Indo 的 F’ 2 结构域。
     SEQ ID NO ： 109 的 1-42 位氨基酸是 H1/NC 的 N 端 F’ 1 结构域 ； 43-273 位氨基酸 是 H5/Indo 的 E1-RB-E2 头部结构域， 274-548 位氨基酸是 H1/NC 的 F’ 2 结构域。
     各个嵌合体的融合位点选择在邻近 ( 但不必然直接位于 ) 各个亚结构域的 N 和 C 端——不希望被理论约束， 选择这些融合位点以使嵌合 HA 的稳定性最大化。例如， 在 RB 亚 结构域的 N 端观察到结构和序列的保守性 (Ha 等 2002， EMBO J.21 ： 865-875 ； 在此通过引用 并入本文 )。 发现初级序列中变化较少的区域位于 E1 亚结构域 15 个氨基酸之前的 C-F Y-P 三联体中。此半胱氨酸参与在 HA 中保守的 3 号二硫桥 ( 参见图 46 和 47)。此半胱氨酸处 的连接可以为嵌合 HA 提供相对天然序列更加适合或更优的稳定性。RB 的 C 端提供保守特 征： 例如， 在比对中， 在所有 HA 中观察到的位点 1 处的保守丝氨酸残基和以 β 折叠起始的 E2 亚结构域 (Ha 等， 2002， EMBO J.21 ： 865-875 ； 其通过引用并入本文 )。因此， 此 RB 的 C 端 可以融合到 E2 亚结构域该 β 折叠结构的起始氨基酸上。并且， 对于在 H5/Indo SDC 上包 含 H1/NC、 H1Bri、 H3/Bri 或 B/Flo 的 RB 亚结构域的嵌合体和在 H1SDC 上包含 H5/Indo RB 但是在 H5 茎上 亚结构域的嵌合体 ( 共 6 个 )， 二硫桥模式没有变化或者没有实质性的变化， B RB 的杂交 HA 上添加了二硫桥 (8 号二硫键 )。添加此二硫桥不应当干扰 HA 的折叠 ( 因 为其位于 RB 结构域中， 并且半胱氨酸在序列中邻近 )， 并且可以提供更加稳定的杂交 HA。
     第一流感类型的 E1-RB-E2 亚结构域被替换为第二流感类型的 E1-RB-E2 亚结构 域。这种安排可以在 H5-VLP 表面显示更多的第二流感类型的氨基酸。在此实施例中， 将 H1、 H3 或 B 的 HDC 放置在 H5/IndoSDC 上， 将 H5/Indo 的 HDC 放置在 H1/NC SDC 上 ( 表 5)。
     用保守的半胱氨酸残基 ( 构成 HA 类型 A 中的 6 号二硫桥和 HA 类型 B 中的 7 号二 硫桥 ) 确定 HDC 的连接。E2 亚结构域 C 端的 HDC 连接用另一保守半胱氨酸残基确定， 其构 成 H5/Indo SDC 上流感类型 H1 或 H3 或者 H1SDC 上流感类型 H5 的 6 号二硫桥 (F’ 2 亚结构 域的第二氨基酸 )。对于乙型流感嵌合体， 在第一个半胱氨酸处建立连接， 该半胱氨酸构成 4 号二硫桥 ( 在 F’ 2 亚结构域上相隔 4 个氨基酸的位置， 并在 HA 之间保守 )。所得嵌合体 的二硫桥模式没有显示任何变化—— H1/H3/H5 杂交 HA 含有 6 个二硫桥， B 杂交 HA 具有 7 个二硫键。
     实施例 2 ： 用 H1A/ 布 里 斯 班 /59/2007 的 受 体 结 合 (RB) 或 受 体 结 合 和 酯 酶 (E1-RB-E2) 亚结构域替换 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 的相应部分 ： 嵌合体和天然形式的表达 的比较。
     为了将 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 的 VLP 高累积水平与 H1A/ 布里斯班 /59/2007 的 抗原性特点相联合， 设计了包含与 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 茎结构域簇融合的 H1A/ 布里斯 班 /59/2007 结构域的嵌合血凝素。表达 H5/H1 血凝素融合蛋白的表达盒显示于图 1， 产生 的成熟融合蛋白的氨基酸序列显示于图 2。
     为了比较 H5/H1 嵌合血凝素与其天然形式的累积水平， 用 AGL1/774、 AGL1/691 和 AGL1/690 侵染本塞姆氏烟草 (Nicotiana Benthamiana) 植株， 经过 6 天的孵育期后收获 叶。为了确定农杆菌侵染的叶中每种 HA 形式的累积水平， 从被侵染的叶组织中提取蛋白并 用抗 HA 单克隆抗体进行 Western 印迹分析。在用 AGL1/690 侵染的叶子提取物中检测到 约为 75kDa 的独特条带 ( 图 3)， 大小对应流感血凝素未切割的 HA0 形式， 但是在 AGL1/774 或 AGL1/691 中未检测到， 这表明包含与 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 骨架融合的 H1A/ 布里斯班 /59/2007 受体结合区的嵌合血凝素的累积水平高于 H1A/ 布里斯班 /59/2007 的天然形式 (AGL1/774)， 也高于联合 H1A/ 布里斯班 /59/2007 的酯酶和受体结合区和 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 骨架的嵌合血凝素。 用作阳性对照的灭活全病毒 (WIV)(H1A/ 布里斯班 /59/2007) 检 测为多个条带， 主要条带在约 80kDa 处， 对应 H1A/ 布里斯班 /59/2007 前体 HA0 的分子量。 这 些结果证明， 用 H1A/ 布里斯班 /59/2007 的受体结合区替换 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 的相应 部分产生嵌合血凝素， 其显示 H1 的抗原区并且其在植物中比天然 H1A/ 布里斯班 /59/2007 累积水平更高。但是， 其中 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 中酯酶和受体结合区被 H1A/ 布里斯班 /59/2007 的对应部分替换的嵌合血凝素在植物中没有累积到可以检测的水平。
     对将 H1A/ 布里斯班 /59/2007 的受体结合区与 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 骨架的融合 作为植物中呈递 H1 抗原之 VLP 的累积水平增加方法在基于 CPMV-HT 的强表达盒控制下进 行了再次评价。 还将此融合策略与增加累积水平的信号肽替换方法进行了比较。 在 CPMV-HT 控制下表达 H5/H1 血凝素融合蛋白的表达盒显示于图 8， 产生的成熟融合蛋白的氨基酸序 列显示于图 2。
     用 AGL1/732、 AGL1/733 或 AGL1/734 侵染本塞姆氏烟草植株， 6 天的孵育期后收 获烟草叶。为了确定农杆菌侵染的叶中每种 HA 形式的累积水平， 首先从被侵染的叶组织 中提取蛋白并用抗 H1( 布里斯班 ) 多克隆抗体进行 Western 印迹分析。在用 AGL1/732、AGL1/733 和 AGL1/734 侵染的叶提取物中检测到约为 75kDa 的独特条带 ( 图 6)， 大小对应 流感血凝素未切割的 HA0 形式， 但是， 虽然在所有分析的提取物中均检测到血凝素， 仍然可 以观察到累积水平的重要差异。在这些条件下， H1A/ 布里斯班 /59/2007 表达使用其天然 信号肽 (732) 几乎检测不到， 用 PDI 的信号肽替换信号肽后得到高累积水平的成熟 H1A/ 布 里斯班 /59/2007(733)， 嵌合 H5/H1 血凝素 (734) 累积水平最高。总之， 这些结果表明， 将 H1 的受体结合结构域与 H5 骨架融合导致呈递 H1 抗原之血凝素的高累积， 并且在植物中这 些融合蛋白的累积水平高于信号肽替换或未替换的天然形式所获得的累积水平。
     实施例 3 ： 用 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 的受体结合 (RB) 亚结构域替换 H1A/ 新喀里 多尼亚 /20/99 的相应部分。嵌合和天然形式的表达的比较。
     还评价了 H1 骨架 ( 来自 A/ 新喀里多尼亚 /20/99) 在呈递 H5 抗原区中的用途。 表 达 H1/H5 血凝素融合蛋白的表达盒显示于图 1， 产生的成熟融合蛋白的氨基酸序列显示于 图 2。
     为了比较 H1/H5 嵌合血凝素与其天然形式的累积水平， 用 AGL1/660 和 AGL1/696 侵染本塞姆氏烟草植株， 经过 6 天的孵育期后收获烟草叶。为了确定农杆菌侵染的叶子中 每种 HA 形式的累积水平， 从被侵染的叶组织中提取蛋白病用抗 H5( 印度尼西亚 ) 多克隆 抗体进行 Western 印迹分析。在用 AGL1/660 和 AGL1/696 侵染的叶提取物中检测到约为 75kDa 的独特条带 ( 图 7)， 大小对应流感血凝素未切割的 HA0 形式， 表明天然 H5A/ 印度尼 西亚 /5/05 和 H1/H5 嵌合血凝素两者均在植物中高水平累积。
     实施例 4 ： 用 H3 或 B 型流感的相应部分替换 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 的胞外结构 域。嵌合体和天然形式的表达的比较。
     评价了呈递 H3 和 B 型毒株血凝素抗原区同时增加它们在植物中的累积的以下策 略： 将 H3A/ 布里斯班 /10/2007 或 B 佛罗里达 /4/2006 的胞外结构域与来自 H5A/ 印度尼西 亚 /5/05 的跨膜和胞质亚结构域融合。表达 H5/H3 和 H5/B 血凝素融合蛋白的表达盒显示 于图 10， 融合边界的氨基酸显示于图 11。
     比较 H5/B 嵌合血凝素 (745) 与天然 HA B(739) 在本塞姆氏烟草植株中的累积水 平。 用 AGL1/739 和 AGL1/745 侵染植株， 经过 6 天的孵育期后收获烟草叶。 为了确定农杆菌 侵染的叶中每种 HA 形式的累积水平， 首先从被侵染的叶组织中提取蛋白并用抗 B( 佛罗里 达 ) 多克隆抗体进行 Western 印迹分析。 在用 AGL1/739 侵染的一个植株的叶提取物中检测 到约为 75kDa 的独特条带 ( 图 14)， 大小对应流感血凝素未切割的 HA0 形式， 而用 AGL1/745 侵染的 3 个植株显示相应血凝素阳性信号， 表明血凝素的 H5/B 嵌合形式比 B 血凝素天然形 式更经常获得高累积水平。
     类似地， 比较 H5/H3 嵌合血凝素 (737) 与其天然形式 (736) 在本塞姆氏烟草中的 累积水平。用 AGL1/736 和 AGL1/737 侵染植株， 经过 6 天的孵育期后收获烟草叶。为了确 定农杆菌侵染的叶子中每种 HA 形式的累积水平， 从被侵染的叶组织中提取蛋白病并用抗 H3( 布里斯班 ) 多克隆抗体进行 Western 印迹分析。在用 AGL1/736 和 AGL1/737 侵染的叶 提取物中检测到约为 75kDa 的独特条带 ( 图 15)， 大小对应流感血凝素未切割的 HA0 形式。 该结果表明来自 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 的跨膜和胞质亚结构域与 H3A/ 布里斯班 /10/2007 胞外结构域的融合获得与天然 H3A/ 布里斯班 /10/2007 累积水平类似的嵌合血凝素。
     使用体积排阻色谱评价来自 H5/B 嵌合血凝素 ( 构建体号 745) 表达的 VLP 生产。通过体积排阻色谱 (SEC) 在 SephacrylTM S-500HR 柱 (GE Healthcare Bio-Science Corp.， Piscataway， NJ， USA) 上对来自 AGL1/745 侵染植株的浓缩蛋白提取物 (1.5mL) 进行分级。 如图 16 所示， 蓝葡聚糖 (2M Da) 洗脱峰早在组分 8 中出现。将 200μL 每种 SEC 洗脱级分 中的蛋白质用丙酮沉淀法浓缩 (5 倍 ) 并用抗 B( 佛罗里达 ) 多克隆抗体进行 Western 印迹 分析 ( 图 16)， 嵌合血凝素主要出现在组分 7 中， 表明 HA 整合成高分子量结构。不希望被理 论束缚， 这表明嵌合 HA 蛋白组装成大型超结构或者其粘附到高分子量结构上。所获得的结 果表明， HA B 佛罗里达 /4/2006 胞外结构域与 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 的跨膜和胞质亚结 构域构成的嵌合 HA 组装成高分子量颗粒， 并且这些高分子量颗粒的洗脱谱与流感 VLP 的不 同。
     实施例 5 ： H5/B 嵌合血凝素 ( 构建体 747 ； 包含与 H5/Indo TDC 融合的 B/Flo HDC 和 SDC) 与 Hsp70 和 Hsp40 共表达并与信号肽修饰相组合。
     在共同待决申请 PCT/CA2009/000032 中描述了在植物中表达 Hsp40 和 Hsp70 以及 与流感血凝素共表达。植物来源的胞浆 Hsp70 和 Hsp40( 构建体号 R870) 可以与嵌合血凝 素共表达以增加它们在植物中的累积水平。用含有表达期望嵌合 HA 之表达盒的 AGL1 和 AGL1/R870 以及 AGL1/35ShcPro 的混合物 ( 比例为 1 ∶ 1 ∶ 1) 的细菌悬液农杆菌侵染本塞 姆氏烟草植物进行共表达。
     评价在塞姆氏烟草植株中与 HSP40 和 HSP70 共表达的 H5/B 嵌合血凝素 ( 融合 H5/ Indo TDC 的 B/Flo HDC 和 SDC) 的累积水平。用 AGL1/747、 AGL1/747+AGL1/443( 空载体 ) 或 AGL1/747+AGL1/R870(HSP40/HSP70) 侵染植株， 经过 6 天的孵育期后收获烟草叶。为了 确定农杆菌侵染的叶中 H5/B 嵌合 HA 的累积水平， 首先从被侵染的叶组织中提取蛋白并用 抗 B( 佛罗里达 ) 多克隆抗体进行 Western 印迹分析。在用 AGL1/747+AGL1/R870 侵染的 3 株植株的叶提取物中检测到约为 75kDa 的独特条带 ( 图 50)， 大小对应流感血凝素未切割的 HA0 形式， 而 AGL1/747+ 对照载体 (443) 侵染的 3 个植株未显示信号 ( 在所使用的暴露条件 下 )， 表明 H5/B 嵌合形式的血凝素在与 HSP40 和 HSP70 伴侣蛋白共表达时高水平累积。
     所有引用的文献均通过引用并入本文， 就如同每个具体的文献均具体和单独显示 为通过引用并入本文的一样， 并且如同它们在本文中被完全给出一样。本文对参考文献的 引用不被解释为或认为是认同这些参考文献是本发明的现有技术。
     在说明书中大量使用了一些术语， 并且提供了定义帮助理解本发明的多个方面。 在说明书中使用的实例 ( 包括术语的实例 ) 仅用作说明目的， 而不旨在限制本发明实施方 案的范围和含义。数值范围包括定义范围的数值。在说明书中， 词语 “包含” 用作开放式术 语， 基本上等同于术语 “包括但不限于” ， 词语 “含有” 具有相应的含义。
     本发明的一个或多个目前优选的实施方案已通过示例方式进行了描述。 本发明包 括基本如上文所述和参照实施例和附图的所有实施方案、 修饰和变化。对本领域技术人员 来说显然的是， 在不偏离权利要求中限定的本发明范围的前提下， 可以进行一些变化和修 饰。 这些修饰的实例包括本发明任何方面以基本相同的方法为获得相同结果而进行的已知 等价方案的替换。47CN 102482328 A
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     本发明包括上述方法， 其中在引入步骤 ( 步骤 a) 中， 核酸以瞬时方式引入植物中。 或者， 在引入步骤 ( 步骤 a) 中， 核酸被引入植物并且稳定整合。 该方法还可包括步骤 ： c) 收 获宿主并纯化 VLP。
     本发明提供了包含嵌合流感 HA 或编码嵌合流感 HA 之核酸序列的植物或其部分， 该嵌合流感 HA 包含茎结构域簇 (SDC)、 头部结构域簇 (HDC) 和跨膜结构域簇 (TDC)， 其中 ： SDC 包含 F’ 1、 F’ 2 和 F 亚结构域 ； HDC 包含 RB、 E1 和 E2 亚结构域 ； TDC 包含 TmD 和 Ctail 亚结构域 ； 并且其中至少一个亚结构域来自第一流感 HA， 其他结构域来自一种或更多种第 二流感 HA。
     该植物或其部分还可包含核酸， 该核酸包含与在植物中有活性之调控区有效连接 的编码一种或多于一种伴侣蛋白 (chaperone protein) 的核苷酸序列。所述一种或多于一 种伴侣蛋白可选自 Hsp40 和 Hsp70。
     本发明涉及包含嵌合流感 HA 的病毒样颗粒 (VLP)， 该嵌合流感 HA 包含茎结构域 簇 (SDC)、 头部结构域簇 (HDC) 和跨膜结构域簇 (TDC)， 其中 ： SDC 包含 F’ 1、 F’ 2 和 F 亚结 构域 ； HDC 包含 RB、 E1 和 E2 亚结构域 ； TDC 包含 TmD 和 Ctail 亚结构域 ； 并且其中至少一个 亚结构域来自第一流感 HA， 其他结构域来自一种或更多种第二流感 HA。VLP 还可包含植物 特异性的 N- 聚糖或修饰的 N- 聚糖。 还提供了包含有效剂量的上述 VLP 和可药用载体的组合物。
     在本发明的另一方面， 提供了在对象中诱导对流感病毒感染的免疫的方法， 包括 向对象施用 VLP。VLP 可以经口、 皮内、 鼻内、 肌内、 腹腔内、 静脉内或皮下施用给对象。
     可与编码嵌合 HA 蛋白之序列有效连接的调控区包括在植物细胞、 昆虫细胞或酵 母细胞中有效的调控区。这样的调控区可包括质体蓝素调控区、 核酮糖 1， 5- 二磷酸羧化酶 / 加氧酶 (RuBisCO) 调控区、 叶绿素 a/b 结合蛋白 (CAB) 调控区或 ST-LS1 调控区。 其他调控 区包括 5’ UTR、 3’ UTR 或终止子序列。质体蓝素调控区可以是苜蓿质体蓝素调控区 ； 5’ UTR、 3’ UTR 或终止子序列也可以是苜蓿序列。
     本发明提供了嵌合流感 HA 多肽， 由第一流感和第二流感构成， 第一流感和第二流 感可独立地选自 B、 H1、 H2、 H3、 H4、 H5、 H6、 H7、 H8、 H9、 H10、 H11、 H12、 H13、 H14、 H15 和 H16 ； 前提是第一流感和第二流感不是相同的流感类型、 亚型或不具有相同的来源。
     根据本发明的一些方面， 嵌合流感 HA 多肽包含信号肽序列， 所述信号肽序列可选 自天然信号肽序列、 苜蓿 PDI 信号肽序列、 流感 H5 信号肽序列和流感 H1 信号肽序列。
     本发明提供了在能够生产 VLP 的宿主 ( 包括植物、 昆虫或酵母 ) 中生产包含嵌合 流感血凝素 (HA) 的 VLP 的方法， 其包括在宿主中引入编码嵌合流感 HA 的核酸， 和在允许核 酸表达的条件下孵育宿主， 从而生产 VLP， 该嵌合流感 HA 包含茎结构域簇 (SDC)、 头部结构 域簇 (HDC) 和跨膜结构域簇 (TDC)， 其中 ： SDC 包含 F’ 1、 F’ 2 和 F 亚结构域 ； HDC 包含 RB、 E1 和 E2 亚结构域 ； TDC 包含 TmD 和 Ctail 亚结构域 ； 并且其中至少一个亚结构域来自第一 流感 HA， 其他结构域来自一种或更多种第二流感 HA。
     与在昆虫细胞培养物中生产 VLP 相比， 在植物中生产这些颗粒具有若干优点。植 物脂质可刺激特定免疫细胞并增强所诱导的免疫应答。植物的膜由脂质、 磷脂酰胆碱 (PC) 和磷脂酰乙醇胺 (PE) 构成， 并且还包含植物和一些细菌及原生动物所特有的鞘糖脂。鞘脂
     在本发明的另一方面， 提供了在对象中诱导对流感病毒感染的免疫的方法， 包括 向对象施用 VLP。VLP 可以经口、 皮内、 鼻内、 肌内、 腹腔内、 静脉内或皮下施用给对象。
     可与编码嵌合 HA 蛋白之序列有效连接的调控区包括在植物细胞、 昆虫细胞或酵 母细胞中有效的调控区。这样的调控区可包括质体蓝素调控区、 核酮糖 1， 5- 二磷酸羧化酶 / 加氧酶 (RuBisCO) 调控区、 叶绿素 a/b 结合蛋白 (CAB) 调控区或 ST-LS1 调控区。 其他调控 区包括 5’ UTR、 3’ UTR 或终止子序列。质体蓝素调控区可以是苜蓿质体蓝素调控区 ； 5’ UTR、 3’ UTR 或终止子序列也可以是苜蓿序列。
     本发明提供了嵌合流感 HA 多肽， 由第一流感和第二流感构成， 第一流感和第二流 感可独立地选自 B、 H1、 H2、 H3、 H4、 H5、 H6、 H7、 H8、 H9、 H10、 H11、 H12、 H13、 H14、 H15 和 H16 ； 前提是第一流感和第二流感不是相同的流感类型、 亚型或不具有相同的来源。
     根据本发明的一些方面， 嵌合流感 HA 多肽包含信号肽序列， 所述信号肽序列可选 自天然信号肽序列、 苜蓿 PDI 信号肽序列、 流感 H5 信号肽序列和流感 H1 信号肽序列。
     本发明提供了在能够生产 VLP 的宿主 ( 包括植物、 昆虫或酵母 ) 中生产包含嵌合 流感血凝素 (HA) 的 VLP 的方法， 其包括在宿主中引入编码嵌合流感 HA 的核酸， 和在允许核 酸表达的条件下孵育宿主， 从而生产 VLP， 该嵌合流感 HA 包含茎结构域簇 (SDC)、 头部结构 域簇 (HDC) 和跨膜结构域簇 (TDC)， 其中 ： SDC 包含 F’ 1、 F’ 2 和 F 亚结构域 ； HDC 包含 RB、 E1 和 E2 亚结构域 ； TDC 包含 TmD 和 Ctail 亚结构域 ； 并且其中至少一个亚结构域来自第一 流感 HA， 其他结构域来自一种或更多种第二流感 HA。
     与在昆虫细胞培养物中生产 VLP 相比， 在植物中生产这些颗粒具有若干优点。植 物脂质可刺激特定免疫细胞并增强所诱导的免疫应答。植物的膜由脂质、 磷脂酰胆碱 (PC) 和磷脂酰乙醇胺 (PE) 构成， 并且还包含植物和一些细菌及原生动物所特有的鞘糖脂。鞘脂
     类不常见的原因是它们不是甘油酯 ( 例如 PC 或 PE)， 而是由与含有多于 18 个碳的脂肪酸链 形成酰胺键的长链氨基醇组成。PC 和 PE 以及鞘糖脂可结合哺乳动物免疫细胞 ( 例如抗原 呈递细胞 (APC)， 如树突状细胞和巨噬细胞 ) 和另一些细胞 ( 包括胸腺和肝脏中的 B 淋巴 细胞和 T 淋巴细胞 ) 表达的 CD1 分子。此外， 除植物脂质的存在所具有的潜在佐剂作用外， 植物 N- 聚糖促进抗原呈递细胞捕获糖蛋白抗原的能力对在植物中生产嵌合 VLP 也可以是 有利的。不希望受理论限制， 预计由植物生产的嵌合 VLP 比在其他生产体系中制得的嵌合 VLP 诱导更强的免疫反应， 并且与由活或减毒全病毒疫苗诱导的免疫反应相比， 由这些植物 生产的嵌合 VLP 诱导的免疫反应更强。
     与由全病毒制得的疫苗相比嵌合 VLP 具有优势， 这是因为它们无感染性， 因此限 制性生物防范问题不再像使用感染性全病毒时那么重要， 并且不是生产所必需的。由植物 生产的嵌合 VLP 的另一优点是， 允许表达系统生长在温室或田间， 从而显著地更经济并适 于扩大规模。
     另外， 植物不包含参与合成唾液酸残基以及将其添加到蛋白质中的酶。 VLP 的生产 可以不需要神经氨酸酶 (NA)， 并且不需要共表达 NA 或者用唾液酸酶 ( 神经氨酸酶 ) 处理生 产细胞或提取物以确保 VLP 在植物中的生产。
     该发明概述未必描述本发明的所有发明特征。
     附图简述
     通过参照附图的以下描述， 本发明的这些和其他特征会更加明显， 在附图中 ：
     图 1 显示 HA 亚结构域的示意图。SP ： 信号肽， F’ 1、 F’ 2和F： 融合亚结构域 ； RB ： 受体结合亚结构域， E1 和 E2 ： 酯酶亚结构域， TMD/CT ： 跨膜和胞质尾区亚结构域。图 1B 显示基于质体蓝素的表达盒 ( 构建体号 774、 540、 660、 690、 691、 696) 的示意图， 该表 达盒表达天然和嵌合形式的血凝素 H1A/ 布里斯班 /59/2007(H1/Bri)、 血凝素 H1A/ 新喀 里多尼亚 /20/99(H1/NC) 和血凝素 H5A/ 印度尼西亚 /5/05(H5/Indo)。Plasto pro ： 苜 蓿质体蓝素启动子， Plasto ter ： 苜蓿质体蓝素终止子， SP ： 信号肽， RB ： 受体结合亚结构 域， E1-RB-E2 ： 酯酶和受体结合亚结构域， TMD/CT ： 跨膜和胞质尾亚结构域， PDI ： 苜蓿蛋 白二硫键异构酶。图 1C 显示几种流感 HA 的氨基酸序列比对， 附加了结构比对 ： (B/ 佛罗 里 达 /4/2006(B 佛 罗 里 达 )， SEQ ID NO ： 94(GenBank 登 录 号 ACA33493.1 ； B/ 马 来 西 亚 /2506/2004(B- 马 来 西 亚 )， SEQ ID NO ： 95(GenBank 登 录 号 ABU99194.1) ； H1/Bri(A- 布 里斯班 )， SEQ ID NO ： 96(GenBank 登录号 ADE28750.1 ； H1A/ 所罗门群岛 /3/2006(A-Sol. Isl)， SEQ ID NO ： 97(GenBank 登 录 号 ABU99109.1) ； H1/NC(A-NewCal)， SEQ ID NO ： 98(GenBank 登录号 AAP34324.1 ； H2A/ 新加坡 /1/1957(A- 新加坡 )， SEQ ID NO ： 99(GenBank 登 录 号 AAA64366.1) ； H3A/ 布 里 斯 班 /10/2007(A- 布 里 斯 班 )， SEQ IDNO ： 100(GenBank 登录号 ACI26318.1) ； H3A/ 威斯康星 /67/2005(A-WCN)， SEQ ID NO ： 101(GenBank 登录号 ABO37599.1) ； H5A/ 安徽 /1/2005(A- 安徽 )， SEQ ID NO ： 102(GenBank 登录号 ABD28180.1) ； H5A/ 越南 /1194/2004(A- 越南 )， SEQ ID NO ： 103(GenBank 登录号 ACR48874.1) ； H5-Indo， SEQ ID NO ： 104(GenBank 登录号 ABW06108.1。标示了 F’ 1、 酯酶 1、 受体结合、 酯酶 2、 F′ 2、 肽融合、 TMD/CT 亚结构域之间的界限以及二硫桥。
     图 2 显 示 用 构 建 体 690、 734(SEQ ID NO ： 11)、 696(SEQ ID NO ： 112)( 上 图 ) 和 691(SEQ ID NO ： 113)( 下图 ) 表达的嵌合 HA 所示亚结构域的氨基酸序列。SEQ ID NO ： 111的 1-92 位氨基酸是 H5/Indo 的 F’ 1+E1 结构域 ； 93-263 位氨基酸是 H1/ 布里斯班的 RB 头 部结构域， 264-552 位氨基酸是 H5/Indo 的 E2+F’ 2 结构域。SEQ ID NO ： 112 的 1-92 位氨基 酸是 H5/NC 的 F’ 1+E1 结构域 ； 93-301 位氨基酸是 H5/Indo 的 RB 头部结构域， 302-586 位氨 基酸是 H1/NC 的 E2+F’ 2 结构域。SEQ ID NO ： 113 的 1-42 位氨基酸是 H5/Indo 的 F’ 1结 构域 ； 43-273 位氨基酸是 H1/ 布里斯班的 E1-RB-E2 头部结构域， 274-552 位氨基酸是 H5/ Indo 的 F’ 2 结构域。
     图 3 显示构建体 690 和 734(SEQ ID NO ： 80) 编码区的氨基酸序列， 其包含 H1/Bri 的 RB 亚结构域、 H5/Indo 信号肽和包含 H5/Indo F’ 1、 E1、 E2 和 F 亚结构域的茎结构域复 合体 (stem domain complex， SDC)。
     图 4 显示构建体 691(SEQ ID NO ： 81) 编码区的氨基酸序列， 其包含 H1/Bri 头部结 构域复合体 (HDC)( 包含 E1、 RB、 E2)、 H5/Indo 信号肽和包含 H5/Indo F’ 1、 F’ 2 和 F 亚结 构域的茎结构域复合体 (SDC)。
     图 5 显示构建体 696(SEQ ID NO ： 82) 编码区的氨基酸序列， 其包含 H5/Indo 的 RB 亚结构域、 PDI 信号肽和包含 F’ 1、 E1、 E2 和 F’ 2 的 H1/NC 茎结构域复合体。
     图 6 显示在植物中天然形式、 构建体 774( 包含 H1/Bri)、 构建体 692( 包含 H1/Bri 的头部结构域复合体 (HDC)) 和构建体 690( 包含与 H5/Indo 茎结构域复合体 (SDC) 融合的 H1/Bri 的 RB 亚结构域 ) 的 H1/Bri 表达的免疫印迹分析。对于每个构建体， 分析来自 3 个 独立植物的总蛋白提取物。 对于所分析的每个植物， 上样的蛋白质为 20 微克。 用抗 HA 单克 隆抗体 ( 抗 H1- 布里斯班 ； FII 10-I50) 显示 Western 印迹。构建体 774 表达具有 H1/Bri 天然信号肽的 H1/Bri ； 构建体 690、 691 表达具有 H5/Indo 天然信号肽的 HA。
     图 7 显示天然形式、 构建体 660( 包含 H5/Indo) 或构建体 696( 包含与 H1/NC SDC、 E1 和 E2 亚结构域融合的 H1/Indo RB 亚结构域 ) 的 H5/Indo 表达的免疫印迹分析。对于每 个构建体， 分析来自 3 个独立植物的总蛋白提取物。对于所分析的每个植物， 上样的蛋白质 为 20 微克。用抗 H5 印度尼西亚多克隆抗体 (ITC IT-003-005V) 显示 Western 印迹。构建 体 660 表达具有其天然信号肽的 H5/Indo ； 构建体 696 表达具有 PDI 信号肽的嵌合 HA。
     图 8 显示基于 35SCPMV/HT 的表达盒的示意图， 该表达盒表达天然 ( 构建体 732) 和 嵌合 ( 构建体 733 和 734) 形式的 H1/Bri。构建体 733 包含 PDI 信号肽和 H1/Bri 的 HDC、 SDC 和跨膜结构域复合体 (transmembrane domain complex， TDC)， 构建体 734 包含 H5/Indo 信号肽、 F’ 1、 E1、 E2、 F’ 2、 F 和来自 H1/Bri 的 RB。35S Dro ： CaMV 35S 启动子， NOS ter ： 胭脂氨酸合酶终止子， SP ： 信号肽， RB ： 受体结合亚结构域， E1-RB-E2 ： 酯酶和受体结合亚结 构域， TMD/CT ： 跨膜和胞质尾亚结构域， PDI ： 苜蓿蛋白二硫键异构酶 ； CPMV-HT ： 可过量翻译 (hyper translatable) 的豇豆花叶病毒表达系统的 5’ 和 3’ 元件。
     图 9 显示天然形式、 构建体 732( 包含在基于 35SCPMV/HT 的表达盒控制下的 H1/ Bri)、 构建体 733( 包含与 H1/Bri 融合的 PDI 信号肽 ； 在基于 35SCPMV/HT 的表达盒的控制 下 ) 或构建体 734( 包含与 H5/Indo SDC、 E1 和 E2 亚结构域融合的 H1/Bri RB 亚结构域 ； 在 基于 35SCPMV/HT 的表达盒的控制下 ) 的 H1/Bri 表达的免疫印迹分析。对于每个构建体， 分析来自 3 个独立植物的总蛋白提取物。对于所分析的每个植物， 上样蛋白为 5 微克。用 抗 HA 单克隆抗体检测 (FII 10-I50) 显示 Western 印迹。
     图 10 显示基于 35SCPMV/HT 的表达盒的示意图， 该表达盒表达 H3A/ 布里斯班/10/2007(H3/Bri) 和 B/ 佛罗里达 /4/2006HA(B/Flo) 血凝素。构建体 736 包含与 PDI 信 号肽融合的 H3/Bri。构建体 737 包含与 PDI 信号肽融合的 H3/Bri 和 H5/Indo TMD/CT。构 建体 739 包含与 PDI 信号肽融合的 B/Flo。构建体 745 包含与 PDI 信号肽融合的 B/Flo 和 H5/Indo TMD/CT。35S pro ： CaMV 35S 启动子， NOS ter ： 胭脂氨酸合酶终止子， SP ： 信号肽， RB ： 受体结合亚结构域， E1-RB-E2 ： 酯酶和受体结合亚结构域， TMD/CT ： 跨膜和胞质尾亚结 构域， PDI ： 苜蓿蛋白二硫键异构酶 ； CPMV-HT ： 可过量翻译的豇豆花叶病毒表达系统的 5’ 和 3’ 元件。
     图 11 显示构建体 745 和 737 中的融合边界。HA 序列的起始用锥形头箭头标示。 跨膜结构域的氨基酸为 QILSIYSTVA， ， 其前面是部分胞外结构域的氨基酸。
     图 12 显示嵌合 H5/H3 血凝素 (SEQ ID NO ： 83， 构建体 737) 的氨基酸序列， 其包含 PDI 信号肽、 H3A/ 布里斯班 /10/2007 的胞外结构域和 H5A/ 印度尼西亚 /5/2005 的 TMD/CT。
     图 13 显示嵌合 H5/B 血凝素 (SEQ ID NO ： 84) 的氨基酸序列， 其包含构建体号 745 的开放阅读框所编码的 B/ 佛罗里达 /4/2006 的胞外结构域和 H5A/ 印度尼西亚 /5/2005 的 TMD/CT。
     图 14 显示天然形式、 构建体 739( 包含 PDI-B/Flo) 或构建体 745( 包含与 H5/Indo TDC 融合的 B/Flo HDC 和 SDC) 的 B/Flo 表达的免疫印迹分析。对于每个构建体， 分析来自 3 个独立植物的总蛋白提取物。 对于所分析的每个植物， 上样的蛋白为 20 微克。 用抗 HA B/ 佛罗里达多克隆抗体 (NIBSC 07/356) 显示 Western 印迹。 图 15 显示天然形式、 构建体 736( 包含 PDI sp-H3/Bri) 或构建体 737( 与 H5/Indo TDC 融合的 H3/Bri HDC 和 SDC) 的 H3/Bri 表达的免疫印迹分析。对于每个构建体， 分析来 自 3 个独立植物的总蛋白提取物。对于所分析的每个植物， 上样的蛋白为 20 微克。用抗 H3 布里斯班多克隆抗体 (NIBSC 08/124) 显示 Western 印迹。
     图 16 显示用构建体号 745 侵染之植物的叶蛋白质提取物的体积排阻色谱。对于 每种级分， 显示洗脱级分的相对蛋白含量。在级分 7 至 15 中使用抗 HA B/ 佛罗里达多克隆 抗体 (NIBSC 07/356) 对血凝素进行的免疫检测 (Western 印迹 ) 在图下显示。箭头标示蓝 葡聚糖 2000 的洗脱峰 ( 级分 8)。
     图 17 显示合成片段的核酸序列 (SEQ ID NO ： 52)， 其包含完整 H5(A/ 印度尼西亚 /5/05(H5N1)) 编码区 ( 包含信号肽和终止密码子 )， 在 5’ 侧翼有 HindIII 位点， 在 3’ 侧翼 有 SacI 位点。
     图 18 显示构建体 660 的核酸序列 (SEQ ID NO ： 53)， 构建体 660 是 HA 表达盒， 其 包含苜蓿质体蓝素启动子和 5’ UTR、 H5 型 A/ 印度尼西亚 /5/05(H5N1) 血凝素的编码序列、 苜蓿质体蓝素 3’ UTR 和终止子序列。
     图 19 显示无 TmD 和 Ctail 的野生型 H1(A/ 新喀里多尼亚 /20/99(H1N1))(GenBank 登录号 AY289929) 编码序列的核酸序列 (SEQ ID NO ： 54)。
     图 20 显示合成片段的核酸序列 (SEQ ID NO ： 55)， 该合成片段包含缺少 TmD 和 Ctail 的 H1(A/ 新喀里多尼亚 /20/99(H1N1)) 编码序列。在 5’ 区， 最后几个核苷酸来自 PDI SP 并且包含 BglII 限制性位点， 在 3’ SacI/StuI 双位点位于紧邻终止密码子的下游。
     图 21 显示包含 C-ter H1(A/ 新喀里多尼亚 /20/99(H1N1)) 编码序列 ( 包含 TmD 和 Ctail) 的合成片段的核酸序列 (SEQ ID NO ： 56)， 其从 KpnI 位点至终止密码子 (3’ 侧翼
     图 16 显示用构建体号 745 侵染之植物的叶蛋白质提取物的体积排阻色谱。对于 每种级分， 显示洗脱级分的相对蛋白含量。在级分 7 至 15 中使用抗 HA B/ 佛罗里达多克隆 抗体 (NIBSC 07/356) 对血凝素进行的免疫检测 (Western 印迹 ) 在图下显示。箭头标示蓝 葡聚糖 2000 的洗脱峰 ( 级分 8)。
     图 17 显示合成片段的核酸序列 (SEQ ID NO ： 52)， 其包含完整 H5(A/ 印度尼西亚 /5/05(H5N1)) 编码区 ( 包含信号肽和终止密码子 )， 在 5’ 侧翼有 HindIII 位点， 在 3’ 侧翼 有 SacI 位点。
     图 18 显示构建体 660 的核酸序列 (SEQ ID NO ： 53)， 构建体 660 是 HA 表达盒， 其 包含苜蓿质体蓝素启动子和 5’ UTR、 H5 型 A/ 印度尼西亚 /5/05(H5N1) 血凝素的编码序列、 苜蓿质体蓝素 3’ UTR 和终止子序列。
     图 19 显示无 TmD 和 Ctail 的野生型 H1(A/ 新喀里多尼亚 /20/99(H1N1))(GenBank 登录号 AY289929) 编码序列的核酸序列 (SEQ ID NO ： 54)。
     图 20 显示合成片段的核酸序列 (SEQ ID NO ： 55)， 该合成片段包含缺少 TmD 和 Ctail 的 H1(A/ 新喀里多尼亚 /20/99(H1N1)) 编码序列。在 5’ 区， 最后几个核苷酸来自 PDI SP 并且包含 BglII 限制性位点， 在 3’ SacI/StuI 双位点位于紧邻终止密码子的下游。
     图 21 显示包含 C-ter H1(A/ 新喀里多尼亚 /20/99(H1N1)) 编码序列 ( 包含 TmD 和 Ctail) 的合成片段的核酸序列 (SEQ ID NO ： 56)， 其从 KpnI 位点至终止密码子 (3’ 侧翼
     是 SacI/StuI 双位点 )。
     图 22 显示来自紫苜蓿 (Medicago sativa) 蛋白二硫键异构酶 mRNA 的核苷酸序列。 GenBank 登录号 Z11499(SEQ ID NO ： 57)。核苷酸 32-103 编码 PDI 信号肽。
     图 23 显示 PromPlasto-PDISP-Plasto 3’ UTR 质粒的核苷酸序列。图 23A 显示 PromPlasto-PDISP(SEQ ID NO ： 58) 的核苷酸序列。图 23B 显示 Plasto 3’ UTR(SEQ ID NO ： 85) 的核苷酸序列。蛋白二硫键异构酶 (PDI) 信号肽序列用下划线表示。用于克隆的 BglII(AGATCT) 和 SacI(GAGCTC) 限制性位点以黑体显示。
     图 24 显示 HA 表达盒的核酸序列 (SEQ ID NO ： 59 ； 构建体 540)， 该表达盒包含苜 蓿质体蓝素启动子和 5’ UTR、 PDI 信号肽和 H1 型 A/ 新喀里多尼亚 /20/99(H1N1) 的编码序 列、 苜蓿质体蓝素 3’ UTR 和终止子序列。来自 A/ 新喀里多尼亚 /20/1999 的 H1 编码序列用 下划线表示。
     图 25 显示合成片段的核酸序列 (SEQ ID NO ： 60)， 其包含完整 H1(A/ 布里斯班 /59/07(H1N1)) 编码区 ( 包含信号肽和终止密码子 )， 在 5’ 侧翼有以 DraIII 位点起始的苜 蓿质体蓝素基因序列 ( 对应于起始 ATG 上游前 84 个核苷酸 )， 3’ 侧翼有 SacI 位点。
     图 26 显示 HA 表达盒的核酸序列 (SEQ ID NO ： 61， 构建体 774)， 该 HA 表达盒包含 苜蓿质体蓝素启动子和 5’ UTR、 H1 型 A/ 布里斯班 /59/07(H1N1) 的血凝素编码序列、 苜蓿 质体蓝素 3’ UTR 和终止子序列。 图 27 显示表达盒号 828(SEQ ID NO ： 62) 的核酸序列， 从 PacI( 启动子上游 ) 至 AscI( 紧邻 NOS 终止子的下游 )。CPMV HT 3’ UTR 序列用下划线表示， 其中突变的 ATG 用黑 体表示。Apa1 限制性位点用下划线和斜体表示。
     图 28 显示嵌合 H5/H1 表达盒的核酸序列 (SEQ ID NO ： 63， 构建体 690)， 该表达盒 包含苜蓿质体蓝素启动子和 5’ UTR、 嵌合血凝素编码序列、 苜蓿质体蓝素 3’ UTR 和终止子序 列。嵌合 HA 编码序列用下划线表示。
     图 29 显示嵌合 H5/H1 表达盒的核酸序列 (SEQ ID NO ： 64， 构建体 691)， 该表达盒 包含苜蓿质体蓝素启动子和 5’ UTR、 嵌合血凝素编码序列、 苜蓿质体蓝素 3’ UTR 和终止子序 列。嵌合 HA 编码序列用下划线表示。
     图 30 显示嵌合 H1/H5 表达盒的核酸序列 (SEQ ID NO ： 65， 构建体 696)， 该表达盒 包含苜蓿质体蓝素启动子和 5’ UTR、 嵌合血凝素编码序列、 苜蓿质体蓝素 3’ UTR 和终止子序 列。嵌合 HA 编码序列用下划线表示。
     图 31 显示 HA 表达盒的核酸序列 (SEQ ID NO ： 66， 构建体 732)， 该 HA 表达盒包 含 CaMV 35S 启动子、 CPMV-HT 5’ UTR、 H1 型 A/ 布里斯班 /59/07(H1N1) 血凝素编码序列、 CPMV-HT 3’ UTR 和 NOS 终止子序列。H1/Bri 的编码序列用下划线标示。
     图 32 显示中间构建体 787 从 ATG 到终止的编码序列的核酸序列 (SEQ ID NO ： 67)。
     图 33 显示 SpPDI H1/Bri 表达盒的核酸序列 (SEQ ID NO ： 68， 构建体号 733)， 该 表达盒包含 CaMV 35S 启动子、 CPMV-HT 5’ UTR、 PDI 信号肽编码序列、 H1 型 A/ 布里斯班 /59/07(H1N1) 血凝素编码序列、 CPMV-HT 3’ UTR 和 NOS 终止子序列。SpPDI H1/Bri 编码序 列用下划线表示。
     图 34 显示嵌合 H5/H1 表达盒的核酸序列 (SEQ ID NO ： 69， 构建体 734)， 该表达盒 包含 CaMV 35S 启动子、 CPMV-HT 5’ UTR、 嵌合血凝素编码序列、 CPMV-HT 3’ UTR 和 NOS 终止
     图 28 显示嵌合 H5/H1 表达盒的核酸序列 (SEQ ID NO ： 63， 构建体 690)， 该表达盒 包含苜蓿质体蓝素启动子和 5’ UTR、 嵌合血凝素编码序列、 苜蓿质体蓝素 3’ UTR 和终止子序 列。嵌合 HA 编码序列用下划线表示。
     图 29 显示嵌合 H5/H1 表达盒的核酸序列 (SEQ ID NO ： 64， 构建体 691)， 该表达盒 包含苜蓿质体蓝素启动子和 5’ UTR、 嵌合血凝素编码序列、 苜蓿质体蓝素 3’ UTR 和终止子序 列。嵌合 HA 编码序列用下划线表示。
     图 30 显示嵌合 H1/H5 表达盒的核酸序列 (SEQ ID NO ： 65， 构建体 696)， 该表达盒 包含苜蓿质体蓝素启动子和 5’ UTR、 嵌合血凝素编码序列、 苜蓿质体蓝素 3’ UTR 和终止子序 列。嵌合 HA 编码序列用下划线表示。
     图 31 显示 HA 表达盒的核酸序列 (SEQ ID NO ： 66， 构建体 732)， 该 HA 表达盒包 含 CaMV 35S 启动子、 CPMV-HT 5’ UTR、 H1 型 A/ 布里斯班 /59/07(H1N1) 血凝素编码序列、 CPMV-HT 3’ UTR 和 NOS 终止子序列。H1/Bri 的编码序列用下划线标示。
     图 32 显示中间构建体 787 从 ATG 到终止的编码序列的核酸序列 (SEQ ID NO ： 67)。
     图 33 显示 SpPDI H1/Bri 表达盒的核酸序列 (SEQ ID NO ： 68， 构建体号 733)， 该 表达盒包含 CaMV 35S 启动子、 CPMV-HT 5’ UTR、 PDI 信号肽编码序列、 H1 型 A/ 布里斯班 /59/07(H1N1) 血凝素编码序列、 CPMV-HT 3’ UTR 和 NOS 终止子序列。SpPDI H1/Bri 编码序 列用下划线表示。
     图 34 显示嵌合 H5/H1 表达盒的核酸序列 (SEQ ID NO ： 69， 构建体 734)， 该表达盒 包含 CaMV 35S 启动子、 CPMV-HT 5’ UTR、 嵌合血凝素编码序列、 CPMV-HT 3’ UTR 和 NOS 终止
     子序列。嵌合 HA 的编码序列用下划线表示。
     图 35 显示合成片段的核酸序列 (SEQ ID NO ： 70)， 该合成片段包含完整 H3(A/ 布 里斯班 /10/07(H3N2)) 编码区 ( 包含信号肽和终止密码子 )， 5’ 侧翼有以 DraIII 位点起始 的苜蓿质体蓝素基因序列 ( 对应于起始 ATG 上游前 84 个核苷酸 )， 3’ 侧翼有 SacI 位点。
     图 36 显示 HA 表达盒的核酸序列 (SEQ ID NO ： 71， 构建体 736)， 该 HA 表达盒包含 CaMV 35S 启动子、 CPMV-HT 5’ UTR、 PDI 信号肽编码序列、 H3 型 A/ 布里斯班 /10/07(H2N3) 血凝素编码序列、 CPMV-HT3’ UTR 和 NOS 终止子序列。Sp PDI H3/Bris 编码序列用下划线 表示。
     图 37 显示嵌合 H5/H3 表达盒的核酸序列 (SEQ ID NO ： 72， 构建体号 737)， 该表达 盒包含 CaMV 35S 启动子、 CPMV-HT 5’ UTR、 嵌合血凝素编码序列、 CPMV-HT 3’ UTR 和 NOS 终 止子序列。嵌合 HA 的编码序列用下划线表示。
     图 38 显示合成片段的核酸序列 (SEQ ID NO ： 73)， 该合成片段包含完整 HA(B/ 佛 罗里达 /4/06) 编码区 ( 包含信号肽和终止密码子 )， 5’ 侧翼有以 DraIII 位点起始的苜蓿 质体蓝素基因序列 ( 对应于起始 ATG 上游前 84 个核苷酸 )， 3’ 侧翼有 SacI 位点。
     图 39 显示 HA 表达盒的核酸序列 (SEQ ID NO ： 74， 构建体 739)， 该 HA 表达盒包含 CaMV 35S 启动子、 CPMV-HT 5’ UTR、 PDI 信号肽编码序列、 HA 型 B/ 佛罗里达 /4/06 血凝素 编码序列、 CPMV-HT 3’ UTR 和 NOS 终止子序列。Sp PDI B/Flo 编码序列用下划线表示。
     图 40 显示嵌合 H5/B 表达盒的核酸序列 (SEQ ID NO ： 75， 构建体 745)， 该表达盒包 含 CaMV 35S 启动子、 CPMV-HT 5’ UTR、 嵌合血凝素编码序列、 CPMV-HT 3’ UTR 和 NOS 终止子 序列。嵌合 HA 的编码序列用下划线表示。
     图 41 显示编码 Msj1 的核酸序列 (SEQ ID NO ： 76)。
     图 42 显示部分构建体号 R850 的核酸序列 (SEQ ID NO ： 77)， 从 HindIII( 在多克 隆位点中， 启动子上游 ) 至 EcoRI( 紧邻 NOS 终止子的下游 )。HSP40 编码序列用下划线表 示。
     图 43 显示部分构建体号 R860 的核酸序列 (SEQ ID NO ： 78)， 从 HindIII( 在多克 隆位点中， 启动子上游 ) 至 EcoRI( 紧邻 NOS 终止子的下游 )。HSP70 编码序列用下划线表 示。
     图 44 显示部分构建体号 R870 的核酸序列 (SEQ ID NO ： 79)， 从 HindIII( 在多克 隆位点中， 启动子 5’ 上游 ) 至 EcoRI( 紧邻 NOS 终止子的下游 )。HSP40 编码序列用下划线 和斜体表示， HSP70 编码序列用下划线表示。A) 核苷酸 1-4946 ； B) 核苷酸 4947-9493。
     图 45 显示构建体 R472 的示意图。
     图 46 显 示 甲 型 流 感 的 二 硫 桥 模 式。 桥 编 号 ： 1)Cys4HA1-Cys137HA2、 2)Cys60HA1-Cys72HA1 、 3)Cys94HA1-Cys143HA1 、 4)Cys292HA1-Cys318HA1 、 5) Cys144HA2-Cys148HA2 和 6)Cys52HA1-Cys277HA1。甲和乙亚型之间二硫桥的差异 ( 图 47) 用箭头标示。使用成熟 H3 蛋白的编号。
     图 47 显 示 乙 型 流 感 HA 的 二 硫 桥 模 式。 桥 编 号 ： 1)Cys4HA1-Cys137HA2、 2)Cys60HA1-Cys72HA1 、 3)Cys94HA1-Cys143HA1 、 4)Cys292HA1-Cys318HA 1 、 5) Cys144HA2-Cys148HA2 、 6)Cys52HA1-Cys277HA1 、 7)Cys54HA1-Cys57HA1 和 8) Cys178HA1-Cys272HA1。甲和乙亚型之间二硫桥的差异 ( 图 46) 用箭头标示。使用成熟 H3蛋白的编号。
     图 48 显示结构域替换 (swap) 融合连接的示意图。图 48A 显示来自 H1/Bri、 H3/ Bri 和 B/Flo 的 RB 亚结构域与 H5/Indo SDC 的融合， 和 H5/Indo 的 RB 亚结构域与 H1/NC 茎 结构域的融合。图 48B 显示来自 H1/Bri、 H3/Bri 或 B/Flo 的 E1-RB-E2 亚结构域 (HDC) 与 H5/Indo SDC 的融合， 和 H5/Indo HDC 与 H1/NC SDC 的融合。
     图 49A 显示 H1A/ 加利福尼亚 /04/09 的核苷酸序列 (SEQ ID NO ： 86)。苜蓿蛋白 二硫键异构酶信号肽编码序列用下划线表示， 成熟 H1 编码序列用黑体突出显示。图 49B 显 示 H1A/ 加利福尼亚 /04/09 的氨基酸序列 (SEQID NO ： 87)。苜蓿蛋白二硫键异构酶信号肽 序列用下划线表示。
     图 50 显示用未稀释的 AGL1/747 侵染、 与 AGL1/443( 空载体 ) 共侵染和与 AGL1/ R870(HSP40/HSP70) 共侵染后， H5/B 嵌合血凝素 ( 构建体 747， 包含与 H5/Indo TDC 融合的 B/Flo HDC 和 SDC) 表达的免疫印迹分析。对于每个构建体， 分析来自 3 个独立植物的总蛋 白提取物。对于所分析的每个植物， 上样的蛋白为 20 微克。用抗 B/ 佛罗里达多克隆抗体 (NIBSC) 显示 Western 印迹。
     图 51A 显示 2X35S 启动子序列 (SEQ ID NO ： 88) 的核苷酸序列。图 51B 显示构建 体 747(SEQ ID NO ： 93) 从 PacI(35S 启动子上游 ) 至 AscI( 紧邻 NOS 终止子下游 ) 的核苷 酸序列。嵌合 HA 的编码序列用下划线表示。2X35S 启动子序列用斜体表示。 详细描述
     本发明涉及病毒样颗粒。更具体而言， 本发明涉及包含嵌合流感血凝素的病毒样 颗粒和生产嵌合流感病毒样颗粒的方法。
     下面描述的是一个优选的实施方案。
     本发明提供了包含编码嵌合流感血凝素 (HA) 之核苷酸序列的核酸， 其与在植物 中有活性的调控区有效连接。
     此外， 本发明提供了在植物中生产病毒样颗粒 (VLP) 的方法。所述方法包括向植 物或植物部分中引入编码嵌合流感 HA 的核酸序列 ( 与在植物中有活性的调控区有效连 接 )， 并且在允许该核酸表达的条件下孵育植物或植物部分， 从而产生 VLP。
     本发明还提供了包含嵌合流感 HA 的 VLP。可以通过本发明提供的方法生产 VLP。
     “嵌合蛋白” 或 “嵌合多肽” 是指包含来自于两种或多于两种来源的氨基酸序列的 蛋白质或多肽， 例如但不限于， 作为单个多肽融合的两种或更多种流感类型或亚型或者不 同来源的流感。嵌合蛋白或多肽可以包含与剩余多肽或蛋白质相同或异源的信号肽。嵌合 蛋白或嵌合多肽可以作为转录本从嵌合核苷酸序列中转录， 嵌合蛋白或嵌合多肽在合成后 被切割， 并且根据需要结合形成多聚体蛋白。 因此， 嵌合蛋白或嵌合多肽还包括这样的蛋白 质或多肽， 其包含通过二硫桥连接的亚基 ( 即多聚体蛋白 )。例如， 包含来自两种或更多种 来源的氨基酸序列的嵌合多肽可被加工成亚基， 该亚基通过二硫桥连接， 产生嵌合蛋白或 嵌合多肽 ( 见图 46 和 47)。多肽可以是血凝素 (HA)， 每个形成多肽的两条或更多条氨基酸 序列可以从不同的 HA 获得， 以生产嵌合 HA 或嵌合流感 HA。嵌合 HA 还可以包括这样的氨 基酸序列， 其包含在蛋白合成后或过程中被切割的异源信号肽 ( 嵌合 HA 前体蛋白 )。优选 地， 嵌合多肽或嵌合流感 HA 不是天然的。编码嵌合多肽的核酸可以被描述成 “嵌合核酸” 或 “嵌合核苷酸序列” 。包含嵌合 HA 的病毒样颗粒可以被描述成 “嵌合 VLP” 。
     本发明涉及病毒样颗粒。更具体而言， 本发明涉及包含嵌合流感血凝素的病毒样 颗粒和生产嵌合流感病毒样颗粒的方法。
     下面描述的是一个优选的实施方案。
     本发明提供了包含编码嵌合流感血凝素 (HA) 之核苷酸序列的核酸， 其与在植物 中有活性的调控区有效连接。
     此外， 本发明提供了在植物中生产病毒样颗粒 (VLP) 的方法。所述方法包括向植 物或植物部分中引入编码嵌合流感 HA 的核酸序列 ( 与在植物中有活性的调控区有效连 接 )， 并且在允许该核酸表达的条件下孵育植物或植物部分， 从而产生 VLP。
     本发明还提供了包含嵌合流感 HA 的 VLP。可以通过本发明提供的方法生产 VLP。
     “嵌合蛋白” 或 “嵌合多肽” 是指包含来自于两种或多于两种来源的氨基酸序列的 蛋白质或多肽， 例如但不限于， 作为单个多肽融合的两种或更多种流感类型或亚型或者不 同来源的流感。嵌合蛋白或多肽可以包含与剩余多肽或蛋白质相同或异源的信号肽。嵌合 蛋白或嵌合多肽可以作为转录本从嵌合核苷酸序列中转录， 嵌合蛋白或嵌合多肽在合成后 被切割， 并且根据需要结合形成多聚体蛋白。 因此， 嵌合蛋白或嵌合多肽还包括这样的蛋白 质或多肽， 其包含通过二硫桥连接的亚基 ( 即多聚体蛋白 )。例如， 包含来自两种或更多种 来源的氨基酸序列的嵌合多肽可被加工成亚基， 该亚基通过二硫桥连接， 产生嵌合蛋白或 嵌合多肽 ( 见图 46 和 47)。多肽可以是血凝素 (HA)， 每个形成多肽的两条或更多条氨基酸 序列可以从不同的 HA 获得， 以生产嵌合 HA 或嵌合流感 HA。嵌合 HA 还可以包括这样的氨 基酸序列， 其包含在蛋白合成后或过程中被切割的异源信号肽 ( 嵌合 HA 前体蛋白 )。优选 地， 嵌合多肽或嵌合流感 HA 不是天然的。编码嵌合多肽的核酸可以被描述成 “嵌合核酸” 或 “嵌合核苷酸序列” 。包含嵌合 HA 的病毒样颗粒可以被描述成 “嵌合 VLP” 。
     本发明多个实施方案的嵌合流感 HA 可包含茎结构域复合体 (SDC)、 头部结构域复 合体 (HDC) 和跨膜结构域复合体 (TDC)， 其中 SDC、 HDC 或 TDC 中的一个或多于一个亚结构 域来自第一流感 HA 类型、 亚型或者来自一个来源， 并且 SDC、 HDC 或 TDC 中的一个或多于一 个亚结构域来自第二流感 HA 类型、 亚型或者来自第二或不同来源。如本文所述， “SDC” 包 含 F’ 1、 F’ 2 和 F 亚结构域， “HDC” 包含 RB、 E1 和 E2 亚结构域， “TDC” 包含 TmD 和 Ctail 亚 结构域 (TMD/CT ； 参见图 1A、 46 和 47)。
     术语 “病毒样颗粒” (VLP) 或 “VLP” 是指自组装并包含结构蛋白 ( 如流感 HA 蛋白 或嵌合流感 HA 蛋白 ) 的结构。一般来说 VLP 和嵌合 VLP 的形态和抗原性类似于感染中产 生的病毒粒， 但是缺乏足以复制的遗传信息， 因此不具有感染性。VLP 和嵌合 VLP 可以在适 当的宿主细胞 ( 包括植物宿主细胞 ) 中生产。从宿主细胞中提取后， 在适当条件下分离并 进一步纯化后， VLP 和嵌合 VLP 可以作为完整结构被纯化。
     本发明的产生于流感来源蛋白的嵌合 VLP 或 VLP 不包含 M1 蛋白。已知 M1 蛋白结 合 RNA(Wakefield and Brownlee， 1989)， 而 RNA 是 VLP 制备时的污染物。在嵌合 VLP 产品 获得监管批准时， 不希望存在 RNA， 因此缺失 RNA 的嵌合 VLP 制剂是有利的。
     本发明的嵌合 VLP 可以在特征为缺少使蛋白质唾液酸化之能力的宿主细胞中产 生， 所述宿主细胞如植物细胞、 昆虫细胞、 真菌和其他生物 ( 包括海绵动物、 腔肠动物、 环节 动物、 节肢动物、 软体动物、 线形动物 (nemathelminthea)、 trochelmintes、 扁形动物、 毛颚 动物、 触手动物、 衣原体、 螺旋体、 革兰氏阳性细菌、 蓝细菌、 古细菌等。参见例如 Gupta 等， 1999.Nucleic Acids Research 27 ： 370-372 ； Toukach 等， 2007.NucleicAcids Research 35 ： D280-D286 ； Nakahara 等， 2008.Nucleic Acids Research 36 ： D368-D371。如本文所述 生产的 VLP 通常不含有神经氨酸酶 (NA)。然而， 如果期望获得包含 HA 和 NA 的 VLP， 可以将 NA 与 HA 共表达。
     本发明还提供包含从表达嵌合 HA 的细胞的质膜获得脂质包膜的嵌合 HA 的 VLP。 例如， 如果嵌合 HA 在基于植物的系统中表达， 那么得到的 VLP 可从该植物细胞的质膜获得 脂质包膜。
     一般而言， 术语 “脂质” 是指脂溶性的 ( 亲脂性 ) 天然分子。根据本发明的一些方 面在植物中生产的嵌合 VLP 可以与植物来源的脂质形成复合物。植物来源的脂质可以是脂 双层的形式， 并且还可以包含包裹 VLP 的包膜。 植物来源的脂质可以包含生产 VLP 之植物的 质膜脂质组分， 包括磷脂， 三、 二和单甘油酯， 以及脂溶性固醇或包含固醇的代谢物。 实例包 括磷脂酰胆碱 (PC)、 磷脂酰乙醇胺 (PE)、 磷脂酰肌醇、 磷脂酰丝氨酸、 鞘糖脂、 植物固醇或 其组合。植物来源的脂质还可称为 “植物脂质” 。植物固醇的例子包括菜油甾醇、 豆甾醇、 麦 角甾醇、 菜籽甾醇、 Δ-7- 豆甾醇、 Δ-7- 燕麦甾醇、 daunosterol、 谷甾醇， 24- 甲基胆固醇、 胆固醇或 β- 谷甾醇——参见例如， Mongrand 等， 2004。本领域技术人员应理解细胞质膜 的脂质成分可随获得细胞的细胞或生物或物种的培养或生长条件而异。一般而言， β- 谷 甾醇是最丰富的植物甾醇。
     细胞膜通常包含脂双层以及多种功能的蛋白质。 在脂双层中可发现局部集中的特 定脂质， 称为 “脂筏 (lipid raft)” 。鞘酯和固醇中富含这些脂筏微结构域。不希望受理论 限制， 脂筏可在胞吞和胞吐作用、 病毒或其他感染原的进入或逸出、 细胞间信号转导、 与细 胞或生物的其他结构组分 ( 例如细胞内和细胞外基质 ) 的相互作用中起重要作用。本发明包括包含嵌合 HA 的 VLP， 其中 HA 的亚结构域可以从可感染人的任何类型、 亚型的流感病毒中获得， 包括例如 B、 H1、 H2、 H3、 H4、 H5、 H6、 H7、 H8、 H9、 H10、 H11、 H12、 H13、 H14、 H15 和 H16 类型或亚型。在一些实施方案中， 流感病毒可以是 H1、 H3、 H5 或 B 类型或亚 型。H1、 H3、 H5 或 B 类型或亚型的非限制性例子包括 A/ 新喀里多尼亚 /20/99 亚型 (H1N1) ( “H1/NC” ； SEQ ID NO ： 56)、 H1A/ 加利福尼亚 /04/09 亚型 (H1N1)(″ H1/Cal″； SEQ ID NO ： 86)、 A/ 印度尼西亚 /5/05 亚型 (H5N1)(“H5/Indo” )、 A/ 布里斯班 /59/2007(“H1/Bri” ) 和 B/ 佛罗里达 /4/2006(“B/Flo” ) 和 H3A/ 布里斯班 /10/2007(“H3/Bri” )。并且， 嵌 合 HA 可以包含分离自一种或更多种现有或新鉴定流感病毒的一种或更多种血凝素亚结构 域， 。
     本发明还涉及感染其他哺乳动物或宿主动物的流感病毒， 所述动物如人、 灵长类、 马、 猪、 鸟类、 水禽、 候鸟、 鹌鹑、 鸭、 鹅、 家禽、 鸡、 骆驼、 犬科动物、 狗、 猫科动物、 猫、 虎、 豹、 麝 猫、 水貂、 石貂、 雪貂、 宠物、 家畜、 小鼠、 大鼠、 海豹、 鲸等。一些流感病毒可以感染超过一种 宿主动物。
     对于流感病毒， 本文所用术语 “血凝素” 或 “HA” 是指流感病毒颗粒的结构糖蛋白。 流感血凝素的结构已有深入的研究， 并且显示高度保守的二级、 三级和四级结构。即使氨 基酸序列变化仍观察到此结构保守性 ( 参见例如 Skehel 和 Wiley， 2000 Ann Rev Biochem 69 ： 531-69 ； Vaccaro 等 2005， 通过引用并入本文 )。编码 HA 的核苷酸序列是公知的并 且可获得， 参见例如 BioDefense and Public Health base( 例如 URL ： biohealthbase. org/GSearch/home.do ？ decorator ＝ Influenza) 或美国国立生物技术信息中心 (NCBI ； 参 见 URL ： ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez ？ db ＝ nuccore&cmd ＝ search&term ＝ influenza)， 两者均通过引用并入本文。
     HA 单体可进一步分为 3 个功能性结构域——茎结构域或茎结构域簇 (SDC)、 球状 头部结构域或头部结构域簇 (HDC) 和跨膜结构域簇 (TDC)。SDC 包含 4 个亚结构域， 融合 肽 F、 F’ 1 和 F’ 2( 该亚结构域一般可以称为 “骨架” )。TDC 包含两个亚结构域， 跨膜 (TmD) 和 C 端尾部 (CT)。HDC 包含三个亚结构域， 残留酯酶结构域 E1’ 和 E2 以及受体结合结构域 RB。SDC 和 HDC 可以统称为 “胞外结构域” 。Ha 等 2002(EMBO J.21 ： 865-875 ； 通过引用并入 本文 ) 发表的文献根据 X 射线结晶结构， 阐明了几个流感亚型中 SDC 和 HDC 多种亚结构域 的相对定位。图 1A 显示与 HA1 和 HA2 多肽 N 端和 C 端相关的亚结构域示意图。图 1C 提供 多种流感亚型的标示的结构比对。
     流感病毒血凝素中允许氨基酸变化。该变化提供不断被鉴定的新毒株。新毒株之 间感染性可以有差异。但是， 保持了血凝素三聚体的形成， 其随后形成 VLP。因此本发明提 供了包含嵌合 HA 的血凝素氨基酸序列或编码在植物中形成 VLP 的嵌合血凝素氨基酸序列 的核酸， 并且包括已知序列和可产生的变体 HA 序列。本发明还涉及包含 TDC、 SDC 和 HDC 的 嵌合 HA 多肽的用途。例如嵌合 HA 蛋白可以是 HA0， 或包含来自两种或更多种流感类型之 HA1 和 HA2 亚结构域的经切割嵌合 HA。嵌合 HA 蛋白可以用于使用植物或植物细胞表达系 统生产或形成 VLP。
     HA0 可以表达并折叠形成三聚体， 然后可组装成 VLP。HA0 的切割产生 HA1 和 HA2 多肽， 它们通过二硫桥连接 ( 参见图 1C、 46 和 47 对二硫桥模式的图解 )。对于感染性病毒 颗粒， 需要前体 HA0 的切割来引发 HA2 的构象变化， 该变化释放融合肽 ( 在 HA2 多肽的 N端 ) 并使其可用于融合细胞和病毒膜。但是， VLP 没有感染性， 不需要切割 HA 形成 HA1 和 HA2( 例如在疫苗生产中 )。未切割的 HA0 前体也组装成三聚体并从质膜出芽形成 VLP 纳米 颗粒。
     HA0 多肽包含几个结构域。 HDC 的 RB 亚结构域在抗原区包含几个环， 称为位点 A-E。 可以中和感染性流感病毒的抗体经常靶向一个或更多个这些位点。残留酯酶亚结构域 (E1 和 E2) 可在融合中发挥作用， 并且可结合 Ca++。F、 F’ 1 和 F’ 2 结构域相互作用并协同形成 茎， 使得 HA 三聚体的头部位于膜之上。TmD 和 CT 可参与折叠 HA 在膜上的锚定。TmD 可在 HA 对脂筏的亲和中发挥作用， 而 CT 可在 HA 的分泌中发挥作用， 并且 CT 亚结构域中存在的 一些半胱氨酸残基可是棕榈酰化的。信号肽 (SP) 还可存在于 HA0 多肽的 N 端。图 2 以及 表 4 和 5 提供了一些流感病毒亚型的 SP、 F’ 1、 F’ 2、 E1、 RB、 E2 和 F 结构域的氨基酸序列的 实例。
     在流感血凝素的表达和 / 或分泌过程中对 N 端信号肽 (SP) 序列进行加工可在 HA 折叠中发挥作用。术语 “信号肽” 一般是指通常见于血凝素多肽 N 端的短 ( 约 5-30 个氨基 酸 ) 氨基酸序列， 其可指导新翻译的多肽转位至特定细胞器， 或者辅助多肽链的特定结构 域相对于其他结构域的定位。血凝素的信号肽将蛋白质的转位靶向至内质网， 已提出该信 号肽辅助近 N 端结构域相对于新生血凝素多肽之膜锚定结构域的定位， 以辅助成熟血凝素 的切割和折叠。
     HA 在宿主细胞内质网 (ER) 膜内的插入、 信号肽切割和蛋白质糖基化是共翻译事 件。HA 的正确折叠需要蛋白质糖基化和至少 6 个链内二硫键的形成 ( 参见图 46 和 47)。 在图 46 中， 显示甲亚型 HA 的每个单体具有 6 个保守二硫桥。通过比较， B HA 的单体 ( 图 47) 具有 7 个二硫桥， 其中 5 个在甲型中有对应结构 ( 综述见 Skehel 和 Wiley， 2000.Ann Rev Biochem 69 ： 531-569 ； 在如 Gamblin 等 2004， Science 303 ： 1838-1842 中描述了阐释 分子内和分子间二硫桥和其他保守氨基酸及其相对位置的结构实例 ； 两者均通过引用并入 本文 )。本领域技术人员应理解， 重要的是制备嵌合 HA 时保证获得类似排列的二硫桥。
     信号肽可以是血凝素中天然存在的， 或者信号肽可与被表达血凝素的初级序列异 源。嵌合 HA 可以包含来自第一流感类型、 亚型或毒株的信号肽， 而其余的 HA 来自一种或多 于一种的不同流感类型、 亚型或毒株。例如 HA 亚型 B H1、 H2、 H3、 H5、 H6、 H7、 H9 或乙型流 感的天然 SP 可用于在植物系统中表达 HA。在本发明的一些实施方案中， SP 可以来自乙型、 H1、 H3 或 H5 流感 ； 或来自亚型 H1/Bri、 H1/NC、 H5/Indo、 H3/Bri 或 B/Flo。
     SP 还可以是非天然的， 例如来自非流感病毒之病毒的结构蛋白或血凝素， 或者来 自植物、 动物或细菌多肽。可以使用的信号肽的非限制性实例是苜蓿蛋白二硫键异构酶 (PDI SP ； 登记号 Z11499 的 32-103 位核苷酸 ； SEQ ID NO ： 34 ； 图 17)， 其具有氨基酸序列 ：
     MAKNVAIFGLLFSLLLLVPSQIFAEE(32-103 位核苷酸 ； SEQ ID NO ： 34)。
     因此本发明提供了包含天然或非天然信号肽的嵌合流感血凝素和编码该嵌合血 凝素的核酸。
     血凝素的正确折叠对蛋白质稳定性、 多聚体形成、 VLP 形成和 HA 的功能 ( 血细胞 凝集能力 ) 等流感血凝素特性可以是重要的。蛋白质折叠可受一个或更多个因素影响， 包 括但不限于 ： 蛋白质序列、 蛋白质相对丰度、 细胞内拥挤程度、 可与折叠的、 部分折叠的或未 折叠的蛋白质结合或瞬时联合的辅因子的可获得性、 一种或更多种伴侣蛋白的存在等。热休克蛋白 (Hsp) 或应激蛋白是伴侣蛋白的实例， 其可参与多种细胞过程， 包括 蛋白质合成、 细胞内运输、 错误折叠的防止、 蛋白质凝集的防止、 蛋白质复合物的组装和去 组装、 蛋白质折叠和蛋白质解聚。这样的伴侣蛋白的实例包括但不限于 Hsp60、 Hsp65、 Hsp 70、 Hsp90、 Hsp100、 Hsp20-30、 Hsp10、 Hsp100-200、 Hsp100、 Hsp90、 Lon、 TF55、 FKBP、 亲环蛋 白 (cyclophilin)、 ClpP、 GrpE、 泛素、 钙联蛋白 (calnexin) 和蛋白质二硫键异构酶 ( 参见 例如 Macario， A.J.L.， Cold Spring Harbor Laboratory Res.25 ： 59-70.1995 ； Parsell， D.A.&Lindquist， S.Ann.Rev.Genet.27 ： 437-496(1993) ； 美国专利 No.5,232,833)。 如本文 所述， 伴侣蛋白 ( 例如但不限于 Hsp40 和 Hsp70) 可以用于保证嵌合 HA 的折叠。
     Hsp70 的 实 例 包 括 来 自 哺 乳 动 物 细 胞 的 Hsp72 和 Hsc73、 来自细菌特别是分 枝 杆 菌 ( 如 麻 风 分 枝 杆 菌 (Mycobacterium leprae)、 结 核 分 枝 杆 菌 (Mycobacterium tuberculosis) 和牛分枝杆菌 (Mycobacterium bovis)( 例如卡介苗 (Bacille-Calmette Guerin) ： 本文中称为 Hsp71)) 的 DnaK。 来自大肠杆菌、 酵母和其他原核生物的 DnaK 以及来 自真核生物 ( 例如拟南芥 (A.thaliana)) 的 BiP 和 Grp78(Lin 等， 2001(Cell Stress and Chaperones 6 ： 201-208))。 Hsp70 的具体实例是拟南芥 Hsp70( 由 Genbank ref ： AY120747.1 编码 )。Hsp70 能够特异性地结合 ATP 以及未折叠的多肽和肽， 从而参与蛋白质折叠和去折 叠和蛋白质复合物的组装和去组装。
     Hsp40 的实例包括来自原核生物 ( 例如大肠杆菌和分枝杆菌 ) 的 DnaJ 和来自真核 生物 ( 例如苜蓿 ) 的 HSJ1、 HDJ1 和 Hsp40(Frugis 等， 1999.Plant Molecular Biology 40 ： 397-408)。Hsp40 的具体实例是紫花苜蓿 (M.sativa)MsJ1(AJ000995.1 或 SEQ ID NO ： 76)。 Hsp40 在蛋白质折叠、 耐热和 DNA 复制等细胞活动中作为分子伴侣起作用。图 41 显示编码 Msj1 的核酸序列 (SEQ ID NO ： 76)。
     在 Hsp 中， Hsp70 及其辅伴侣蛋白 (co-chaperone)Hsp40 参与合成完成前正在翻译 的和新合成的多肽的稳定。不希望受理论的限制， Hsp40 与未折叠 ( 新生或新转移的 ) 多 肽的疏水片区 (patch) 结合， 从而有利于 Hsp70-ATP 复合物与多肽的相互作用。 ATP 水解导 致多肽、 Hsp70 和 ADP 之间形成稳定的复合物并释放 Hsp40。Hsp70-ADP 复合物与多肽之疏 水片区的联合阻止其与其他疏水片区的相互作用， 防止不正确折叠和与其他蛋白质的凝集 ( 综述见 Hartl， FU.1996.Nature 381 ： 571-579)。
     天然伴侣蛋白可能能够利于低水平的重组蛋白质的正确折叠， 然而随着表达水平 的增加， 天然伴侣蛋白的丰富可成为限制因素。农杆菌浸染叶中血凝素的高水平表达可导 致血凝素多肽在胞质溶胶中累积， 而共表达一种或更多种伴侣蛋白 ( 例如 Hsp70、 Hsp40 或 者 Hsp70 和 Hsp40 两者 ) 可降低错误折叠或凝集的血凝素多肽的水平， 并且增加显示出允 许血细胞凝集和 / 或病毒样颗粒形成之三级和四级结构特性的多肽数。SEQ IDNO ： 77 是构 建体号 R850 从 HindIII( 在多克隆位点中， 启动子上游 ) 至 EcoRI( 紧邻 NOS 终止子的下游 ) 的部分核酸序列， 其编码 HSP40( 下划线 )。SEQ ID NO ： 78 是构建体号 R860 从 HindIII( 在 多克隆位点中， 启动子上游 ) 至 EcoRI( 紧邻 NOS 终止子的下游 ) 的部分核酸序列， 其编码 HSP70( 下划线 )。SEQ ID NO ： 79 是构建体号 R870 从 HindIII( 在多克隆位点中， 启动子 5’ 上游 ) 至 EcoRI( 紧邻 NOS 终止子的下游 ) 的部分核酸序列， 其编码 HSP40( 下划线， 斜体 ) 和 HSP70( 下划线 )。
     因此， 本发明还提供了在植物中生产嵌合流感 VLP 的方法， 其中编码嵌合流感 HA的第一核酸与编码伴侣蛋白的第二核酸共表达。 第一和第二核酸可以在同一步骤中引入植 物， 或者可以顺次引入植物。
     可通过例如血细胞凝集测定、 电子显微镜观察或体积排阻色谱来评估 VLP 的结构 和大小。
     对于体积排阻色谱， 可通过以下方法从植物组织中提取全部可溶性蛋白质 ： 将冷 冻粉碎的植物材料在提取缓冲液中匀浆 (Polytron)， 通过离心除去不溶性物质。用 PEG 进 行沉淀也可以是有利的。定量可溶性蛋白质， 并将提取物通过 SephacrylTM 柱。可用蓝葡聚 糖 2000 作为校准标准。在进行色谱后， 可通过免疫印迹进一步分析级分以确定级分中的蛋 白质成分。
     本发明还提供了这样的植物， 其包含编码一种或更多种嵌合流感血凝素的核酸和 编码一种或更多种伴侣蛋白的核酸。
     本发明包括核苷酸序列 ：
     SEQ ID NO ： 63( 构建体 690 ； 包含苜蓿质体蓝素启动子和 5’ UTR、 嵌合血凝素编码 序列、 苜蓿质体蓝素 3’ UTR 和终止子序列的嵌合 H5/H1 表达盒 )， SEQ ID NO ： 63 下划线部 分编码 H5/Indo 的 SP、 F’ 1、 E1-H1/Bri 的 RB-H5/Indo 的 E2、 F’ 2、 F、 TMD/CT ； SEQ ID NO ： 64( 构建体 691 ； 包含苜蓿质体蓝素启动子和 5’ UTR、 嵌合血凝素编码 序列、 苜蓿质体蓝素 3’ UTR 和终止子序列的嵌合 H5/H1 表达盒 )， SEQ ID NO ： 64 下划线部 分编码 H5/Indo 的 SP、 F’ 1-H1/Bri 的 E1、 RB、 E2-H5/Indo 的 F’ 2、 F、 TMD/CT ；
     SEQ ID NO ： 65( 构建体 696 ； 包含苜蓿质体蓝素启动子和 5’ UTR、 嵌合血凝素编码 序列、 苜蓿质体蓝素 3’ UTR 和终止子序列的嵌合 H1/H5 表达盒 )， SEQ ID NO ： 65 下划线部 分编码 PDI SP-H1/NC 的 F’ 1、 E1-H5/Indo 的 RB-H1/NC 的 E2、 F’ 2、 F、 TMD/CT ；
     SEQ ID NO ： 68( 构建体 733 ； 包含 CaMV 35S 启动子、 CPMV-HT5’ UTR、 PDI 信号肽编 码序列、 H1 型 A/ 布里斯班 /59/07(H1N1) 血凝素编码序列、 CPMV-HT 3’ UTR 和 NOS 终止子 序列的 SpPDI H1/Bri 表达盒 )， SEQ ID NO ： 68 的下划线部分编码 PDI SP-H1/BRI 的 F’ 1、 E1、 RB、 E2、 F’ 2、 F、 TMD/CT ；
     SEQ ID NO ： 69( 构建体 734 ； 包含 CaMV 35S 启动子、 CPMV-HT 5’ UTR、 嵌合血凝素 编码序列、 CPMV-HT 3’ UTR 和 NOS 终止子序列的嵌合 H5/H1 表达盒 )。嵌合 HA 的编码序列 用下划线表示， 其编码与 SEQID NO ： 63 相同的嵌合 HA ；
     SEQ ID NO ： 71( 构建体 736 ； 包含 CaMV 35S 启动子、 CPMV-HT 5’ UTR、 PDI 信号肽编 码序列、 H3 型 A/ 布里斯班 /10/07(H2N3) 血凝素编码序列、 CPMV-HT 3’ UTR 和 NOS 终止子 序列的 HA 表达盒 )， SEQ ID NO ： 71 的下划线部分编码 PDI SP-H3/Bri 的 F’ 1、 E1、 RB、 E2、 F’ 2、 F、 TMD/CT ；
     SEQ ID NO ： 72( 构建体 737 ； 包含 CaMV 35S 启动子、 CPMV-HT 5’ UTR、 嵌合血凝素 编码序列、 CPMV-HT 3’ UTR 和 NOS 终止子序列的嵌合 H5/H3 表达盒 )， SEQ ID NO ： 72 下划 线部分编码 PDI SP-H5/Indo 的 F’ 1、 E1、 RB、 E2、 F’ 2、 F、 TMD/CT ；
     SEQ ID NO ： 74( 构建体 739 ； 包含 CaMV 35S 启动子、 CPMV-HT 5’ UTR、 PDI 信号肽 编码序列、 HA 型 B/ 佛罗里达 /4/06 的血凝素编码序列、 CPMV-HT 3’ UTR 和 NOS 终止子序列 的 HA 表达盒 )， SEQ ID NO ： 74 的下划线部分编码 PDI SP-B/Flo 的 F’ 1、 E1、 RB、 E2、 F’ 2、 F、 TMD/CT ；
     SEQ ID NO ： 75( 构建体 734 ； 包含 CaMV 35S 启动子、 CPMV-HT 5’ UTR、 嵌合血凝素 编码序列、 CPMV-HT 3’ UTR 和 NOS 终止子序列的嵌合 H5/B 表达盒 )， SEQ ID NO ： 75 下划线 部分编码 PDI SP-B/Flo 的 F’ 1、 E1、 RB、 E2、 F’ 2、 F-H5/Indo 的 TND/CT。
     本发明还包括在严格杂交条件下与任一 SEQ ID NO ： 63-65、 68、 69 和 71-75 下划线 部分杂交的核苷酸序列。本发明还包括在严格杂交条件下与任一 SEQ ID NO ： 63-65、 68、 69 和 71-75 下划线部分的互补序列杂交的核苷酸序列。这些与 SEQ ID NO ： 63-65、 68、 69 和 71-75 下划线部分或 SEQ ID NO ： 63-65、 68、 69 和 71-75 下划线部分的互补序列杂交的核苷 酸序列编码嵌合血凝素蛋白， 其表达形成嵌合 VLP， 并且当施用给对象时， 嵌合 VLP 诱导抗 体产生。例如， 所述核苷酸序列在植物细胞内表达形成嵌合 VLP， 所述嵌合 VLP 可用于产生 能结合 HA( 包括一种或更多种流感类型或亚型的成熟 HA、 HA0、 HA1 或 HA2) 的抗体， 当施用 给对象时， 所述 VLP 诱导免疫应答。
     严 格 杂 交 条 件 下 的 杂 交 是 本 领 域 已 知 的 ( 参 见 例 如 Current Protocols in Molecular Biology， Ausubel 等 编， 1995 及 增 刊 ； Maniatis 等， Molecular Cloning(A Laboratory Manual)， Cold Spring Harbor Laboratory， 1982 ； Sambrook 和 Russell， Molecular Cloning ： A Laboratory Manual， 第 3 版， 2001 ； 每个均通过引用并入本文 )。一 种该严格杂交条件的实例可以是在 65℃下于 4×SSC 中杂交约 16-20 小时， 然后在 65℃下 于 0.1×SSC 中清洗 1 小时， 或在 65℃下于 0.1×SSC 中清洗两次 ( 每次 20 或 30 分钟 )。或 者， 一个示例性严格杂交条件可以是在 42℃下于 50％甲酰胺， 4×SSC 中过夜 (16 ～ 20 小 时 )， 然后在 65℃下于 0.1×SSC 中清洗 1 小时， 或在 65℃下于 0.1×SSC 中清洗 2 次 ( 每 次 20 或 30 分钟 )， 或者过夜 (16 ～ 20 小时 )， 或者在 65℃下于 Church 水性磷酸盐缓冲液 (7％ SDS ； 0.5M NaPO4 缓冲液 pH 7.2 ； 10mM EDTA) 中杂交， 在 50℃下于 0.1×SSC， 0.1％ SDS 中清洗 2 次 ( 每次 20 或 30 分钟 )， 或者在 65℃下于 2×SSC， 0.1％ SDS 中清洗 2 次 ( 每次 20 或 30 分钟 )。
     此外， 本发明包括这样的核苷酸序列， 其特征为与编码任一 SEQ ID NO ： 63、 SEQ ID NO ： 64、 SEQ ID NO ： 65、 SEQ ID NO ： 68、 SEQ ID NO ： 69、 SEQ ID NO ： 71、 SEQ ID NO ： 72、 SEQ ID NO ： 74、 SEQ ID NO ： 75 下划线部分之嵌合 HA 的核苷酸序列有约 70％、 75％、 80％、 85％、 87 ％、 90 ％、 91 ％、 92 ％、 93 ％、 94 ％、 95 ％、 96 ％、 97 ％、 98 ％、 99 ％、 100 ％或其间任意量的序 列同一性或序列相似性， 其中该核苷酸序列编码血凝素蛋白， 其在表达时形成嵌合 VLP， 该 嵌合 VLP 诱导抗体产生。 例如， 所述核苷酸序列在植物细胞内表达形成嵌合 VLP， 该嵌合 VLP 可用于产生能结合 HA( 包括成熟 HA、 HA0、 HA1 或 HA2) 的抗体， 当施用给对象时， 所述 VLP 诱 导免疫应答。
     “免疫应答” 一般是指获得性免疫系统的应答。获得性免疫系统通常包括体液应答 和细胞介导的应答。体液应答是由 B 淋巴细胞谱系的细胞 (B 细胞 ) 产生的分泌抗体所介 导的免疫方面。分泌抗体结合入侵微生物 ( 例如病毒或细菌 ) 表面上的抗原， 标示它们以 进行破坏。体液免疫一般是指抗体产生和伴随其的过程， 以及抗体的效应物功能， 包括 Th2 细胞活化和细胞因子产生、 记忆细胞形成、 调理素促进胞吞作用、 病原体清除等。术语 “调 节” 是指根据通常知晓或使用的任意测定法 ( 其中一些在本文中举例说明 ) 测定的特定应 答或参数的升高或降低。
     细胞介导的应答是这样的免疫应答， 其不涉及抗体， 而涉及巨噬细胞、 自然杀伤细胞 (NK)、 抗原特异性细胞毒性 T 淋巴细胞的活化， 以及多种细胞因子应答于抗原的释放。 细 胞介导的免疫一般指一些 Th 细胞的活化、 Tc 细胞的活化和 T 细胞介导的应答。细胞介导 的免疫在对病毒感染的应答中尤为重要。
     例如， 可使用 ELISPOT 测定来测量对抗原特异性 CD8 阳性 T 淋巴细胞的诱导 ； 可使 用增殖测定来测量对 CD4 阳性 T 淋巴细胞的刺激。可使用 ELISA 测定来定量抗流感病毒抗 体的效价 ； 还可使用抗同种型抗体 ( 例如抗 IgG、 抗 IgA、 抗 IgE 或抗 IgM) 来测量抗原特异 性或交叉反应性抗体的同种型。实施这些测定的方法和技术是本领域公知的。
     血细胞凝集抑制 (HI 或 HAI) 测定也可用于证明由疫苗或疫苗组合物诱导的抗体 的效力， 所述疫苗或疫苗组合物包含可抑制由重组 HA 所致之红血细胞 (RBC) 凝集的嵌合 HA 或嵌合 VLP。血清样品的血细胞凝集抑制性抗体效价可通过微量滴定 HAI 来评估 (Aymard 等， 1973)。可使用任何来自几个物种的红细胞， 例如马、 火鸡、 鸡等。该测定给出有关 HA 三 聚体在 VLP 表面上组装的间接信息， 证实 HA 抗原位点的正确展示。
     交叉反应性 HAI 滴定还可用于证明免疫应答对与疫苗亚型相关的其他病毒株的 效力。例如， 可以在 HAI 测定中将用包含嵌合血凝素 ( 包含第一流感类型或亚型的 HDC) 之 疫苗组合物免疫的对象的血清与第二株全病毒或病毒颗粒一起使用， 并且测定 HAI 效价。
     不希望受理论限制， HA 结合来自不同动物之 RBC 的能力是由 HA 对 α2， 3 或 α2， 6 键合唾液酸的亲和力以及这些唾液酸在 RBC 表面上的存在来驱动的。马和禽类的流感病 毒 HA 使来自所有几个物种 ( 包括火鸡、 鸡、 鸭、 豚鼠、 人、 绵羊、 马和牛 ) 的红细胞凝集 ； 而人 HA 结合火鸡、 鸡、 鸭、 豚鼠、 人和绵羊的红细胞 (Ito T. 等， 1997， Virology， 卷 227， 493-499 ； 以及 Medeiros R 等， 2001， Virology， 卷 289， 74-85)。
     细胞因子的存在或水平也可以被定量。例如， 用 ELISA( 例如 BD Biosciences OptEIA 试剂盒 ) 测量 IFN-γ 和 IL-4 分泌细胞来表征 T 辅助细胞应答 (Th1/Th2)。 可培养从 对象得到的外周血单核细胞 (PBMC) 或脾细胞， 并分析上清。还可使用标志物特异性荧光标 记和本领域已知方法， 通过荧光激活细胞分选 (fluorescence-activated cell sorting， FACS) 对 T 淋巴细胞定量。
     还可进行微量中和测定来表征对象中的免疫应答， 参见例如 Rowe 等， 1973 的方 法。可通过几种方法得到病毒中和效价， 包括 ： 1) 在对细胞进行结晶紫固定 / 着色之后， 计 数裂解斑 ( 空斑测定 ) ； 2) 显微镜观察培养物中的细胞裂解 ； 3) 对 NP 病毒蛋白 ( 与病毒感 染宿主细胞有关 ) 进行 ELISA 和分光光度检测。
     序列同一性或序列相似性可利用序列比较程序来确定， 例如 DNASIS 所提供的 ( 例 如， 使用但不限于下述参数 ： 空隙罚分 5、 顶部对角线数 (#of top diagonal)5、 固定的空 隙罚分 10、 k 元祖 2、 游隙 10， 窗口大小 5)。然而， 其他用于比较的序列比对方法是本领域 熟知的， 例如 Smith&Waterman 算法 (1981， Adv.Appl.Math.2 ： 482)、 Needleman&Wunsch 算 法 (J.Mol.Biol.48 ： 443， 1970)、 Pearson&Lipman 算法 (1988， Proc.Nat’ l.Acad.Sci.USA 85 ： 2444)， 以及这些算法的计算机执行 ( 例如 GAP、 BESTFIT、 FASTA 和 BLAST(Altschul 等， 1990.J.Mol Biol 215 ： 403-410))， 或者通过人工比对和目视检查。可以对核酸或氨 基酸序列进行比较或比对， 并使用任何现有技术已知的几种软件包测定共有序列， 例如 MULTALIN(Corpet F.， 1988， Nucl Acids Res.， 16(22)， 10881-10890)、 BLAST、 CLUSTAL 等 ； 或者可以人工比对序列并确定序列间的相似度和差异。蛋白质、 融合蛋白或多肽的片段或部分包含含有特定蛋白质或多肽之一部分氨基 酸组成的肽或多肽， 前提是在表达时所述片段可形成嵌合 VLP。 例如所述片段可以包含抗原 性区域、 应激应答诱导区域或含有蛋白质或多肽之功能性结构域的区域。所述片段还可包 含同一总家族的蛋白质共有的区域或结构域， 或者片段可包含足以特异性鉴定其来源全长 蛋白质的氨基酸序列。
     例如， 片段或部分可包含蛋白质全长的约 60％至约 100％或其间任意量， 前提是 在表达时该片段可形成嵌合 VLP。例如， 蛋白质全长的约 60 ％至约 100 ％、 约 70 ％至约 100％、 约 80％至约 100％、 约 90％至约 100％、 约 95％至约 100％， 或其间任意量。或者， 根 据嵌合 HA， 片段或部分可以为约 150 至约 500 个氨基酸或其间任意量， 前提是在表达时所 述片段可形成嵌合 VLP。例如， 根据嵌合 HA， 片段或部分可以为约 150 至约 500 个氨基酸或 其间任意量、 约 200 至约 500 个氨基酸或其间任意量、 约 250 至约 500 个氨基酸或其间任意 量、 约 300 至约 500 个氨基酸或其间任意量、 约 350 至约 500 个氨基酸或其间任意量、 约 400 至约 500 个氨基酸或其间任意量、 约 450 至约 500 个氨基酸或其间任意量， 前提是在表达时 片段可形成嵌合 VLP。例如， 可从嵌合 HA 蛋白的 C 端、 N 端或者 N 和 C 两端去除约 5、 10、 20、 30、 40 或 50 个氨基酸或其间任意量， 前提是在表达时所述片段可形成嵌合 VLP。
     任意给定序列中的氨基酸编号是相对于该特定序列的， 然而， 本领域技术人员可 根据结构和 / 或序列容易地确定序列中特定氨基酸的 “等同性” 。例如， 如果去除了 6 个 N 端氨基酸， 那么这将改变氨基酸的具体编码标识 ( 例如， 相对于蛋白质全长而言 )， 但是不 会改变结构中氨基酸的相对位置。
     本发明描述了 ( 但不限于 ) 在植物、 植物部分或植物细胞中编码嵌合 HA 的核酸的 表达， 以及适于生产疫苗的植物中生产嵌合流感 VLP。这些核酸的实例包括但不限于， 例如 SEQ ID NO ： 63、 SEQ ID NO ： 64、 SEQ ID NO ： 65、 SEQ ID NO ： 68、 SEQ ID NO ： 69、 SEQ ID NO ： 71、 SEQ ID NO ： 72、 SEQ ID NO ： 74、 SEQ ID NO ： 75。
     本发明还提供了在植物、 植物部分或植物细胞中表达编码嵌合 HA 的核酸 ( 例如但 不限于 SEQ ID NO ： 63、 SEQ ID NO ： 64、 SEQ ID NO ： 65、 SEQ ID NO ： 68、 SEQ ID NO ： 69、 SEQ ID NO ： 71、 SEQ ID NO ： 72、 SEQID NO ： 74、 SEQ ID NO ： 75)， 以及在转化的植物细胞中生产包 含重组流感结构蛋白的候选流感疫苗或试剂， 所述重组流感结构蛋白自组装成功能性和免 疫原性的同型大分子蛋白结构， 包括亚病毒流感颗粒和嵌合流感 VLP。
     因此， 本发明提供了嵌合 VLP， 和通过表达单个嵌合包膜蛋白在植物表达系统中生 产嵌合 VLP 的方法。
     编码流感亚型嵌合 HA 的核酸 ( 例如 SEQ ID NO ： 63、 SEQ ID NO ： 64、 SEQ ID NO ： 65、 SEQ ID NO ： 68、 SEQ ID NO ： 69、 SEQ ID NO ： 71、 SEQ ID NO ： 72、 SEQ ID NO ： 74、 SEQ ID NO ： 75) 可以通过使用 HA RNA 通过反转录和聚合酶链式反应 (PCR) 合成。例如， 可以从 H1/ NC、 H1/Bri、 H3/Bri、 B/Flo 或 H5/Indo 中或者从感染了这些或其他流感病毒类型或亚型的 细胞中分离 RNA。对于反转录和 PCR， 可以使用 HA RNA 特异性寡核苷酸引物。另外， 编码嵌 合 HA 的核酸可以使用本领域技术人员已知的方法化学合成。
     本发明还涉及包含编码嵌合 HA 之核酸 ( 如上所述， 其与在植物中有效的调控元件 有效连接 ) 的基因构建体。在植物细胞中有效并可用于本发明的调控元件的实例包括但 不限于质体蓝素调控区 (US 7,125,978 ； 其通过引用并入本文 ) 或核酮糖 1， 5- 二磷酸羧化酶 / 加氧酶 (RuBisCO ； US4,962,028 ； 其通过引用并入本文 )、 叶绿素 a/b 结合蛋白 (CAB ； Leutwiler 等 ； 1986 ； 其通过引用并入本文 )、 ST-LS1( 与光系统 II 的放氧复合物相关， 描述 于 Stockhaus 等 1987、 1989 中 ； 其通过引用并入本文 ) 的调控区。
     本发明的基因构建体还包含组成型启动子， 其指导与启动子有效连接的基因在植 物各部分中表达并在整个植物发育过程中持续表达。 组成型启动子的一个非限制性的实例 是与 CaMV 35S 转录本相关的组成型启动子 ( 例如， Odell 等， 1985， Nature， 313 ： 810-812， 通过引用并入本文 )。
     包含质体蓝素调控区的序列的实例是 SEQ ID NO ： 58 的序列 5’端至编码 PDI 信号肽的下划线序列。调控元件或调控区可增强与其有效连接的核苷酸序列的翻译， 其 中核苷酸序列可编码蛋白质或多肽。调控区的另一实例是源自豇豆花叶病毒 (Cowpea Mosaic Virus， CPMV) 非翻译区的调控区， 其可用于优先翻译与其有效连接的核苷酸序 列。这一 CPMV 调控区用于可过量翻译的 CMPV-HT 系统中， 参见例如 Sainsbury 等， 2008， Plant Physiology 148 ： 1212-1218 ； Sainsbury 等， 2008 Plant BiotechnologyJournal 6 ： 82-92， 两者均通过引用并入本文 )。
     因此， 本发明的一方面提供了包含与编码嵌合流感 HA 之序列有效连接的调控区 的核酸。所述调控区可以是质体蓝素调控元件， 所述嵌合流感 HA 可包含来自 H5/Indo、 H1/ Bri、 H3/Bri、 H1/NC、 B/Flo 流感类型、 亚型或毒株的亚结构域。包含质体蓝素调控元件和嵌 合流感 HA 的核酸序列在本文中通过 SEQ ID NO ： 63 和 64 示例。包含 35S 调控元件和嵌合 流感 HA 的核酸序列在本文中通过 SEQ ID NO ： 68、 69 和 71-75 示例。
     在另一方面， 本发明提供包含 CPMV 调控区和嵌合流感 HA( 包含来自 H5/Indo、 H1/ Bri、 H3/Bri、 H1/NC、 B/Flo 流感类型、 亚型或毒株的亚结构域 ) 的核酸。包含 CPMP 调控元 件和嵌合 HA 的核酸序列在本文中通过 SEQ ID NO ： 66-69 和 71-75 示例。
     在植物中产生的嵌合流感 VLP 从质膜中出芽， 因而嵌合 VLP 的脂质组成反映产生 它们的植物细胞或植物组织类型。根据本发明生产的 VLP 包含两种或多于多种类型或亚型 流感的嵌合 HA， 其与植物来源的脂质复合。植物脂质可刺激特异免疫细胞并增强所诱导的 免疫应答。
     植物脂质如 PC( 磷脂酰胆碱 ) 和 PE( 磷脂酰乙醇胺 ) 以及鞘糖脂可结合哺乳动物 免疫细胞 ( 例如抗原呈递细胞 (APC)， 如树突状细胞和巨噬细胞 ) 和其他细胞 ( 包括胸腺和 肝脏中的 B 淋巴细胞和 T 淋巴细胞 ) 表达的 CD1 分子。( 综述见 Tsuji M.2006 Cell Mol Life Sci 63 ： 1889-98)。CD1 分子在结构上与主要组织相容性复合体 (MHC)I 类分子相似， 其作用是将糖脂抗原呈递给 NKT 细胞 ( 自然杀伤 T 细胞 )。活化后， NKT 细胞激活固有免疫 细胞 ( 例如 NK 细胞和树突状细胞 ) 并且还激活获得性免疫细胞 ( 例如产生抗体的 B 细胞 和 T 细胞 )。
     存在于与脂双层 ( 例如质膜来源的包膜 ) 复合之流感 VLP 中的植物固醇可提供有 利的疫苗组合物。不希望受理论限制， 与脂双层 ( 例如质膜来源的包膜 ) 复合的由植物生 产的 VLP( 包括包含嵌合 HA 的 VLP) 比在其他表达系统中制得的 VLP 可诱导更强的免疫反 应， 并且可与由活或减毒全病毒疫苗所诱导的免疫反应相似。
     因此， 在一些实施方案中， 本发明提供了与植物来源的脂双层复合的 VLP( 包含嵌 合 HA)。在一些实施方案中， 所述植物来源的脂双层可包括 VLP 的包膜。在植物内生产的 VLP 可包含含有植物特异性 N- 聚糖的嵌合 HA。 因此， 本发明还提 供了包含具有植物特异性 N- 聚糖的嵌合 HA 的 VLP。
     此外， 植物中 N- 聚糖的修饰是已知的 ( 参见例如 WO 2008/151440 ； 其通过引用并 入本文 )， 并且可产生含有经修饰 N- 聚糖的嵌合 HA。可得到包含经修饰糖基化模式 ( 例如 岩藻糖基化减少、 木糖基化减少、 或岩藻糖基化和木糖基化二者均减少 ) 之 N- 聚糖的 HA， 或 者可得到含有经修饰糖基化模式的嵌合 HA， 其中蛋白质缺少岩藻糖基化、 木糖基化或两者 皆缺少， 并包含增加的半乳糖基化。此外， 与表达嵌合 HA 的野生型植物相比， 翻译后修饰的 调节 ( 例如末端添加半乳糖 ) 可导致所表达嵌合 HA 的岩藻糖基化和木糖基化降低。
     例如 ( 但不视为限制 )， 合成具有经修饰糖基化模式的嵌合 HA 可通过使目的蛋白 质与编码 β-1， 4- 半乳糖基转移酶 (GalT)( 例如但不限于哺乳动物 GalT 或人 GalT， 然而 也可以使用其他来源的 GalT) 的核苷酸序列共表达来实现。还可将 GalT 的催化结构域与 N- 乙酰氨基葡萄糖基转移酶 (GNT1) 的 CTS 结构域 ( 即胞质尾、 跨膜结构域、 茎区 ) 融合以 产生 GNT1-GalT 杂合酶， 并且该杂合酶可与 HA 共表达。HA 还可与编码 N- 乙酰氨基葡萄糖 基转移酶 III(GnT-III)( 例如但不限于哺乳动物 GnT-III 或人 GnT-III， 还可使用其他来源 的 GnT-III) 的核苷酸序列共表达。另外， 还可使用包含与 GnT-III 融合的 GNT1 之 CTS 的 GNT1-GnT-III 杂合酶。
     因此， 本发明还包括含有嵌合 HA 的 VLP， 所述嵌合 HA 具有经修饰的 N- 聚糖。
     不希望受理论限制， 嵌合 HA 上存在的植物 N- 聚糖可通过促进抗原呈递细胞与 HA 的结合来刺激免疫应答。Saint-jore-Dupas 等 (Trends Biotechnol 25 ： 317-23， 2007) 已 提出使用植物 N 聚糖来刺激免疫应答。此外， VLP 的构象对于抗原呈递可以是有利的， 并且 当与植物来源的脂质层复合时增强 VLP 的佐剂作用。
     “调控区” 、 “调控元件” 或 “启动子” 是指通常 ( 但不总是 ) 位于基因的蛋白质编码 区上游的一部分核酸， 其可由 DNA 或 RNA 或者 DNA 和 RNA 两者构成。当调控区有活性并与 目的基因有效相连或有效连接时， 可导致目的基因的表达。 调控元件可以介导器官特异性， 或控制发育基因或时序基因的活化。 “调控区” 包括启动子元件、 显示启动子基础活性的核 心启动子元件、 可响应于外部刺激而被诱导的元件、 介导启动子活性的元件 ( 例如负调控 元件或转录增强子 )。本文所用的 “调控区” 还包括在转录后具有活性的元件， 例如调节基 因表达的调控元件， 例如翻译增强子和转录增强子、 翻译抑制子和转录抑制子、 上游激活序 列和 mRNA 不稳定性决定子 (mRNA instability determinant)。这后几种元件中有几种可 位于编码区附近。
     在本公开内容中， 术语 “调控元件” 或 “调控区” 一般是指通常 ( 但不总是 ) 位于 结构基因编码序列上游 (5’ ) 的 DNA 序列， 其通过提供转录在特定位点起始所需的 RNA 聚合 酶和 / 或其他因子的识别来控制编码区表达。 然而， 应当理解的是， 位于内含子中或序列 3’ 的其他核苷酸序列也可对调控目的编码区的表达有贡献。为确保在特定位点起始而为 RNA 聚合酶或其他转录因子提供识别的调控元件的一个实例是启动子元件。大多数 ( 但不是全 部 ) 真核生物启动子元件包含 TATA 盒， 其是由腺苷和胸苷核苷酸碱基对组成的保守核酸序 列， 通常位于转录起始位点上游约 25 个碱基对处。启动子元件包含负责起始转录的基础启 动子元件以及调节基因表达的其他调控元件 ( 如上文所述 )。
     存在几种类型的调控区， 包括受发育调节的、 诱导型的或组成型的调控区。 受发育调节的调控区或对所控制基因的差异性表达进行控制的调控区在特定器官或器官之组织 中、 在该器官或组织发育过程的特定时间被活化。 然而， 受发育调节的一些调控区也可偏好 性地在某些器官或组织的特定发育阶段具有活性， 它们还可以以受发育调节的方式具有活 性， 或在植物的其他器官或组织内为基础水平。组织特异性调控区 ( 例如参见特异性调控 区 ) 的实例包括 napin 启动子和 cruciferin 启动子 (Rask 等， 1998， J.Plant Physiol.152 ： 595-599 ； Bilodeau 等， 1994， Plant Cell 14 ： 125-130)。叶特异性启动子的实例包括质体 蓝素启动子 ( 参见例如 SEQ ID NO ： 58) ； US 7,125,978， 其通过引用并入本文。
     诱导型调控区是能够响应于诱导物而直接或间接激活一种或更多种 DNA 序列或 基因之转录的调控区。当不存在诱导物时， DNA 序列或基因不会被转录。通常， 特异性结合 诱导型调控区以激活转录的蛋白因子可以以无活性形式存在， 然后被诱导物直接或间接转 化成活性形式。然而， 也可以不存在蛋白因子。诱导物可以是化学剂， 例如蛋白质、 代谢物、 生长调节剂、 除草剂或酚类化合物， 或通过热、 冷、 盐或毒性元素直接施加的生理压力， 或通 过病原体或致病剂 ( 例如病毒 ) 的作用间接施加的生理压力。可通过向细胞或植物外部施 加诱导物 ( 例如通过喷洒、 浇水、 加热或类似方法 ) 使含有诱导型调控区的植物细胞暴露于 诱导物。 诱导型调控元件可来源于植物基因或非植物基因 ( 例如 Gatz， C. 和 Lenk， I.R.P.， 1998， Trends Plant Sci.3， 352-358， 其通过引用并入本文 )。可用的诱导型启动子的实例 包括但不限于四环素诱导型启动子 (Gatz， C.， 1997， Ann.Rev.Plant Physiol.Plant Mol. Biol.48， 89-108， 其通过引用并入本文 )、 类固醇诱导型启动子 (Aoyama， T. 和 Chua， N.H.， 1997， Plant J.2， 397-404， 其通过引用并入本文 ) 和乙醇诱导型启动子 (Salter， M.G 等， 1998， Plant Journal 16， 127-132 ； Caddick， M.X. 等， 1998， Nature Biotech.16， 177-180， 其通过引用并入本文 )、 细胞分裂素诱导型 IB6 和 CKI1 基因 (Brandstatter， I. 和 Kieber， J.J.， 1998， Plant Cell 10， 1009-1019 ； Kakimoto， T.， 1996， Science 274， 982-985， 其 通过引用并入本文 ) 以及生长素诱导型元件 DR5(Ulmasov， T. 等， 1997， Plant Cell 9， 1963-1971， 其通过引用并入本文 )。
     组成型调控区指导基因在植物各部分表达并在整个植物发育过程中持续表达。 已 知的组成型调控元件的实例包括与以下相关的启动子 ： CaMV 35S 转录本 (Odell 等， 1985， Nature， 313 ： 810-812)、 水稻肌动蛋白 1(Zhang 等， 1991， Plant Cell， 3： 1155-1165)、 肌动 蛋白 2(An 等， 1996， Plant J.， 10 ： 107-121) 或 tms 2(U.S.5,428,147， 其通过引用并入本 文 ) 以及磷酸丙糖异构酶 1 基因 (Xu 等， 1994， Plant Physiol.106 ： 459-467)、 玉米泛素 1 基 因 (Cornejo 等， 1993， Plant Mol.Biol.29 ： 637-646)、 拟南芥泛素 1 和 6 基因 (Holtorf 等， 1995， Plant Mol.Biol.29 ： 637-646)、 烟草翻译起始因子 4A 基因 (Mandel 等， 1995， Plant Mol.Biol.29 ： 995-1004)。本文所用的术语 “组成型” 不一定指受所述组成型调控区控制的 基因在所有细胞类型中以相同水平表达， 而是指基因在多种细胞类型中表达， 尽管常常观 察到不同的丰度。 组成型调控元件可与其他序列偶联以进一步增强与其有效连接之核苷酸 序列的转录和 / 或翻译。例如， CMPV-HT 系统源自豇豆花叶病毒 (CPMV) 的非翻译区， 并显 示增强相关编码序列的翻译。
     “天然” 是指核酸或氨基酸序列是天然存在的， 或 “野生型” 。
     “有效连接” 是指特定序列 ( 例如调控元件与目的编码区 ) 直接或间接地相互作用 以实现预定功能 ( 例如介导或调节基因表达 )。例如有效连接的序列之间的相互作用可通过与所述有效连接之序列相互作用的蛋白质来介导。
     本发明的一种或更多种核苷酸序列可在被本发明核苷酸序列、 或构建体或载体转 化的任意合适的植物宿主中表达。合适宿主的实例包括但不限于农作物， 包括苜蓿、 油菜、 芸苔属 (Brassica spp.)、 玉米、 烟草属 (Nicotiana spp.)、 苜蓿、 马铃薯、 人参、 豌豆、 燕麦、 水稻、 大豆、 小麦、 大麦、 向日葵、 棉花等。
     本发明的一种或更多种嵌合基因构建体还可包含 3’ 非翻译区。3’ 非翻译区是指 这样的基因部分， 其包含含有多腺苷酸化信号和能够影响 mRNA 加工或基因表达之任意其 他调控信号的 DNA 区段。多腺苷酸化信号的特征一般在于向 mRNA 前体的 3’ 端添加多腺苷 酸链。多腺苷酸化信号常通过存在经典形式 5’ AATAAA-3’ 的同源物来鉴定， 但是也会出现 变体。
     合适的 3’ 区的非限制性实例是含有以下基因的多腺苷酸化信号的 3’ 转录的非翻 译区 ： 农杆菌致瘤 (Ti) 质粒基因 ( 例如胭脂氨酸合酶 (Nos 基因 )) 以及植物基因 ( 例如大 豆贮藏蛋白基因 )、 核酮糖 -1， 5- 二磷酸羧化酶的小亚基基因 (ssRUBISCO ； US 4,962,028， 其通过引用并入本文 )、 用于调节质体蓝素表达的启动子 ( 描述于 US 7,125,978( 其通过引 用并入本文 ))。 本发明的一种或更多种嵌合基因构建体还可以进一步包括增强子， 根据需要可以 是翻译或转录增强子。增强子可以位于被转录序列的 5’ 或 3’ 。增强子区域是本领域技术 人员公知的， 并且可包括 ATG 起始密码子、 邻近序列等。如果存在起始密码子， 则其可在编 码序列的读码框的相 (phase) 中 (“框内” (“in frame” ))， 以提供转录序列的正确翻译。
     为了帮助鉴定转化的植物细胞， 可进一步处理本发明的构建体使其包含植物选择 标记。可用的选择标记包括提供针对化学品 ( 例如抗生素， 如庆大霉素、 潮霉素、 卡那霉素 ； 或除草剂， 如膦丝菌素 (phosphinothrycin)、 草甘膦、 氯磺隆等 ) 的抗性的酶。 类似地， 可使 用产生可通过颜色变化进行鉴定之化合物的酶 ( 例如 GUS(β- 葡萄糖醛酸酶 )) 或提供发 光的酶 ( 如萤光素酶或 GFP)。
     认为是本发明一部分的还有包含本发明嵌合基因构建体的转基因植物、 植物细胞 或种子。由植物细胞再生完整植物的方法也是本领域已知的。一般而言， 将转化植物细胞 培养在合适的培养基中， 所述培养基可包含选择剂 ( 例如抗生素 )， 其中使用选择标记以帮 助鉴定转化的植物细胞。愈伤组织形成后， 可根据已知方法应用合适的植物激素来促进芽 的形成， 将芽移至生根培养基中以再生植物。然后， 通过种子或利用植物无性繁殖技术， 植 物可用于建立可重复的世代。还可以不使用组织培养物来形成转基因植物。
     认为是本发明一部分的还有包含嵌合基因构建体的转基因植物、 树木、 酵母、 细 菌、 真菌、 昆虫和动物细胞， 所述嵌合基因构建体含有编码本发明之用于产生 VLP 的重组嵌 合 HA 或 HA0 的核酸。
     为了在多种可用于转化或瞬时表达的宿主生物中表达， 还可以将本发明的调控元 件与目的编码区相组合。这样的生物包括但不限于植物 ( 单子叶植物和双子叶植物 )， 例 如但不限于玉米、 谷类植物、 小麦、 大麦、 燕麦、 烟草属、 芸苔属、 大豆、 菜豆、 豌豆、 苜蓿、 马铃 薯、 番茄、 人参和拟南芥。
     用于这些生物的稳定转化和再生的方法已在本领域中建立并且是本领域技术人 员已知的。获得转化植物和再生植物的方法对本发明来说不是关键的。
    
     “转化” 是指表现为基因型、 表型或二者兼有的遗传信息 ( 核苷酸序列 ) 在种间转移。 遗传信息从嵌合构建体向宿主的种间转移可以是可遗传的并且认为遗传信息的转移是 稳定的， 或者转移可以是瞬时的并且遗传信息的转移是不可遗传的。
     术语 “植物物质” 是指来源于植物的任何材料。 植物物质可包括完整植物、 组织、 细 胞或其任意部分。此外， 植物物质可包括细胞内植物组分、 细胞外植物组分、 植物的液体或 固体提取物或者其组合。此外， 植物物质可包括来自植物叶、 茎、 果实、 根或其组合的植物、 植物细胞、 组织、 液体提取物或其组合。 植物物质可包括未进行任何处理步骤的植物或其部 分。植物的一部分可包含植物物质。然而， 还考虑可对所述植物材料施加下定义的最少处 理步骤或更严格的处理， 包括使用本领域公知的技术 ( 包括但不限于色谱、 电泳等 ) 进行部 分或大量蛋白质纯化。
     术语 “最少处理” 是指部分纯化包含目的蛋白的植物物质 ( 例如植物或其部分 ) 以 得到植物提取物、 匀浆、 植物匀浆的级分等 ( 即最少处理 )。部分纯化可包括但不限于破坏 植物细胞结构从而产生含有可溶性植物组分和不溶性植物组分的组合物， 不溶性植物组分 可通过例如但不限于离心、 过滤或其组合进行分离。 在此方面， 可使用真空或离心提取容易 地获得叶或其他组织的细胞外间隙中分泌的蛋白质， 或可以通过穿过滚轴或研磨等在压力 下进行组织提取， 从而将蛋白从细胞外间隙中挤压或释放。最少处理还可包括制备可溶性 蛋白质的粗提物， 因为这些制备物中将具有可忽略的来自次级植物产物的污染。 另外， 最少 处理可包括从叶中水性提取可溶性蛋白质， 然后用任意合适的盐进行沉淀。其他方法可包 括大规模的浸渍和汁液提取， 以允许直接使用提取物。
     可将植物物质 ( 形式为植物材料或组织 ) 经口递送给对象。植物物质可作为膳食 补充剂的一部分与其他食物一起施用， 或者被装入胶囊中。植物物质或组织还可以被浓缩 以改善或增进适口性， 或者按照需要与其他材料、 成分或药物赋形剂一起提供。
     可施用本发明 VLP 的对象或目标生物的实例包括但不限于人、 灵长类、 鸟类、 水 禽、 候鸟、 鹌鹑、 鸭、 鹅、 家禽、 鸡、 猪、 绵羊、 马科动物、 马、 骆驼、 犬科动物、 狗、 猫科动物、 猫、 虎、 豹、 麝猫、 水貂、 石貂、 雪貂、 宠物、 家畜、 兔、 小鼠、 大鼠、 豚鼠或其他啮齿动物、 海豹、 鲸 等。这些目标生物是示例性的， 并且不视为限制本发明的应用和用途。
     考虑根据需要和情形， 以多种方式将含有本发明一些实施方式的嵌合 HA 或表达 含有本发明一些实施方式之嵌合 HA 的 VLP 的植物施用给对象或目标生物。例如， 可在使用 之前将得自植物的嵌合 HA 以粗提物、 部分纯化或纯化的形式被提取。如果嵌合 HA 是至少 部分纯化的， 那么其可以在可食用植物或不可食用植物中产生。此外， 如果经口施用嵌合 HA， 则可以收集植物组织并直接给对象食用， 或者可在食用之前干燥收集的组织， 或者可以 不预先收集而使动物在植物上进食。 认为在本发明范围内的还有将收集的植物组织作为动 物饲料的食物补充剂。如果向动物饲喂的植物组织不进行或几乎不进行进一步处理， 则优 选所施用的植物组织是可食用的。
     转录后基因沉默 (PTGS) 可参与限制转基因在植物中的表达， 来自马铃薯 Y 病毒的 沉默抑制子 (HcPro) 的共表达可用于抵抗转基因 mRNA 的特异性降解 (Brigneti 等， 1998)。 可替代的沉默抑制子是本领域熟知的， 并且可如本文所述使用 (Chiba 等， 2006， Virology 346 ： 7-14， 其 通 过 引 用 并 入 本 文 )， 例 如 但 不 限 于 TEV-p1/HC-Pro( 烟 草 蚀 纹 病 毒 -p1/ HC-Pro)、 BYV-p21、 番茄丛矮病毒的 p19(TBSV p19)、 番茄皱缩病毒的衣壳蛋白 (TCV-CP)、 黄瓜花叶病毒的 2b(CMV-2b)、 马铃薯 X 病毒的 p25(PVX-p25)、 马铃薯 M 病毒的 p11(PVM-p11)、 马铃薯 S 病毒的 p11(PVS-p11)、 蓝莓枯黄病毒的 p16(BScV-p16)、 柑橘衰退病毒 (Citrus tristexa virus) 的 p23(CTV-p23)、 葡萄卷叶相关病毒 -2 的 p24(GLRaV-2 p24)、 葡萄病 毒 A 的 p10(GVA-p10)、 葡萄病毒 B 的 p14(GVB-p14)、 白芷潜伏性病毒 (Heracleum latent virus) 的 p10(HLV-p10) 或大蒜普通潜伏性病毒的 p16(GCLV-p16)。因此， 沉默抑制子 ( 例 如但不限于 HcPro、 TEV-p1/HC-Pro、 BYV-p21、 TBSV p19、 TCV-CP、 CMV-2b、 PVX-p25、 PVM-p11、 PVS-p11、 BScV-p16、 CTV-p23、 GLRaV-2p24、 GBV-p14、 HLV-p10、 GCLV-p16 或 GVA-p10) 可与 编码目的蛋白的核酸序列共表达以进一步确保在植物中生产高水平的蛋白质。
     此外， 如本文所述生产的 VLP 不包含神经氨酸酶 (NA)。然而， 如期望包含 HA 和 NA 的 VLP， 可以将 NA 与 HA 共表达。
     因此， 本发明还包括合适的载体， 其含有适用于稳定或瞬时表达系统中的嵌合 HA 序列。还可在一种或多于一种的构建体中提供遗传信息。例如， 可将编码目的蛋白的核苷 酸序列引入一种构建体， 将编码修饰目的蛋白糖基化之蛋白质的第二核苷酸序列引入单独 的构建体中。然后， 可将这些核苷酸序列在植物中共表达。然而， 也可使用这样的构建体， 其包含编码目的蛋白和修饰目的蛋白糖基化之蛋白质两者的核苷酸序列。在此情形中， 核 苷酸序列将包含第一序列和第二序列， 所述第一序列包含与启动子或调控区有效连接的编 码目的蛋白的第一核酸序列， 所述第二序列包含编码修饰目的蛋白糖基化模式之蛋白质的 第二核酸序列， 该第二核酸序列与启动子或调控区有效连接。
     “共表达” 是指两种或两种以上核苷酸序列大致同时在植物中以及在植物的同一 组织中表达。然而， 核苷酸序列不必严格地同时表达。而是两种或更多种核苷酸序列的表 达方式使得所编码产物有机会相互作用。例如， 修饰目的蛋白糖基化的蛋白质可在目的蛋 白表达前或表达期间表达， 使得发生对目的蛋白的糖基化修饰。可使用瞬时表达系统共表 达两种或两种以上的核苷酸序列， 其中所述两种或更多种序列大致同时在适于这两种序列 表达的条件下被引入植物中。或者， 可以用编码目的蛋白的额外序列以瞬时或稳定方式转 化含有核苷酸序列之一 ( 例如编码修饰目的蛋白糖基化模式的蛋白质的序列 ) 的平台植物 (platform plant)。在此情形中， 编码修饰目的蛋白糖基化模式之蛋白质的序列可在期望 的发育阶段表达在期望的组织内表达， 或者可使用诱导型启动子诱导其表达， 而编码目的 蛋白的额外序列可在相似条件下在同一组织内表达， 以确保核苷酸序列的共表达。
     可使用 Ti 质粒、 Ri 质粒、 植物病毒载体、 直接 DNA 转化、 显微注射、 电穿孔、 侵染等 将本发明的构建体引入植物细胞中。这些技术的综述参见例如 Weissbach 和 Weissbach， Methods for Plant Molecular Biology， Academy Press， 纽约 VIII， 421-463 页 (1988) ； Geierson 和 Corey， Plant Molecular Biology， 第 2 版 (1988) 以 及 Miki 和 Iyer， Fundamentals of Gene Transfer in Plants.Plant Metabolism，第 2 版， DT.Dennis， DH Turpin， DD Lefebrve， DB Layzell( 编 )， Addison Wesly， Langmans Ltd.London， 561-579 页 (1997)。其他方法包括直接 DNA 摄取、 使用脂质体、 电穿孔 ( 例如使用原生质 体 )、 显微注射、 微弹 (microprojectile) 或 whisker 以及真空侵染。参见例如 Bilang 等 (Gene 100 ： 247-250(1991))、 Scheid 等 (Mol.Gen.Genet.228 ： 104-112， 1991)、 Guerche 等 (Plant Science 52 ： 111-116， 1987)、 Neuhause 等 (Theor.Appl Genet.75 ： 30-36， 1987)、 Klein 等， Nature 327 ： 70-73(1987)、 Howell 等 (Science 208 ： 1265， 1980)、 Horsch 等(Science 227 ： 1229-1231， 1985)、 DeBlock 等， Plant Physiology 91 ： 694-701， 1989)、 Liu 和 Lomonossoff(J.Virol Meth， 105 ： 343-348， 2002) ； 美国专利 No.4,945,050 ； 5,036,006 ； 5,100,792 ； 6,403,865 ； 5,625,136( 所有这些文献均通过引用并入本文 )。
     可使用瞬时表达法表达本发明的构建体 ( 参见 Liu 和 Lomonossoff， 2002， Journal of Virological Methods， 105 ： 343-348， 其通过引用并入本文 )。或者， 可使用基于真空的 瞬时表达法， 如 Kapila 等 1997 Plant Science 122 ： 101-108( 其通过引用并入本文 ) 所 述。这些方法可包括， 例如但不限于农杆菌接种法或农杆菌侵染法， 然而， 也可使用如上文 所述的其他瞬时方法。使用农杆菌接种法或农杆菌侵染时， 含有期望核酸的农杆菌混合物 进入组织 ( 例如叶、 植物的地上部分 ( 包括茎、 叶和花 )、 植物的其他部分 ( 茎、 根、 花 ) 或整 个植株 ) 的细胞间隙中。穿过表皮后， 农杆菌感染细胞并将 t-DNA 拷贝移至细胞中。t-DNA 以附加体形式转录并且 mRNA 被翻译， 使目的蛋白在感染细胞中产生， 然而， t-DNA 在核内的 传代是瞬时的。
     本发明提供的包含嵌合 HA 的 VLP 可与现有流感疫苗组合使用， 以补充所述疫苗使 其更加有效， 或降低所需的施用剂量。 如本领域技术人员所已知的， 疫苗可针对一种或更多 种流感病毒。 合适的疫苗的实例包括但不限于从 Sanofi-Pasteur、 ID Biomedical、 Merial、 Sinovac、 Chiron、 Roche、 MedImmune、 GlaxoSmithKline、 Novartis、 Sanofi-Ayentis、 Serono、 Shire Pharmaceuticals 等购得的疫苗。
     如期望， 可将本发明的 VLP 与本领域技术人员已知的合适佐剂混合。此外， VLP 可 用于疫苗组合物， 其含有用于治疗上述靶标生物的有效剂量 VLP。此外， 根据本发明生产的 VLP 可与使用不同流感蛋白质 ( 例如神经氨酸酶 (NA)) 得到的 VLP 相组合。
     因此， 本发明提供了用于诱导动物或靶标生物中针对流感病毒感染的免疫的方 法， 其包括施用有效剂量的疫苗， 所述疫苗含有一种或多于一种 VLP。疫苗可经口、 皮内、 鼻 内、 肌内、 腹腔内、 静脉内或皮下施用。
     本发明多个实施方案的组合物可包含两种或更多种流感毒株或亚型的 VLP。 “两种 或更多种” 是指两种、 三种、 四种、 五种、 六种、 七种、 八种、 九种、 十种或更多种毒株或亚型。 所示毒株或亚型可以是单一亚型 ( 例如， 所有都为 H1N1， 或所有都为 H5N1)， 或者可以是亚 型的组合。示例性亚型和毒株包括 H5/Indo、 H1/Bri、 H1/NC、 H3/Bri、 B/Flo。对毒株和亚 型之组合的选择可取决于对象可能暴露于流感的地区， 动物物种 ( 例如水禽类、 农业动物 ( 例如猪 ) 等 ) 与待免疫人群的接近程度以及所述动物物种携带、 暴露于或可能暴露于的 毒株， 对亚型或毒株内抗原漂移的预测， 或者这些因素的组合。 过去几年所使用的组合的实 例可见于世界卫生组织 (WHO) 保存的数据库 ( 见 URL ： who.int/csr/dieease/influenza/ vaccine recommendations1/en)。
     两种或更多种 VLP 可单独表达， 随后将纯化的或半纯化的 VLP 相组合。或者， VLP 可在同一宿主 ( 例如植物、 植物部分或植物细胞 ) 中共表达。VLP 可以期望的比例 ( 例如大 致相等的比例 ) 组合或生产， 或者可以组合以使一种亚型或毒株占组合物中 VLP 的大部分。
     因此， 本发明提供了包含两种或更多种毒株或亚型的 VLP 的组合物。
     还提供了包含包装材料和包含含有嵌合 HA 之 VLP 的组合物的产品。该组合物包 含生理上或药理上可接受的赋形剂， 包装材料可以包含标明组合物活性成分 ( 例如 VLP) 的 标签。还提供了包含组合物的试剂盒， 所述组合物包含编码本文所述嵌合 HA 之核酸以 及使用该核酸生产嵌合 HA 或包含嵌合 HA 的 VLP 的说明书。该试剂盒可用于生产包含嵌合 HA 的 VLP， 说明书可以包括， 例如在植物或植物细胞中表达核酸的信息， 从植物或植物组织 中收获和获得 VLP 的说明。
     在另一个实施方案中， 提供了用于制备药物的试剂盒， 其包含含有嵌合 HA 的 VLP 及其使用说明书。说明书可以包含制备药物的一系列步骤， 药物可用于在施用对象中诱导 治疗性或预防性免疫应答。 该试剂盒还可包含说明剂量浓度、 剂量间隔、 优选施用方法等的 说明书。
     本发明将通过下面的实施例更详细的说明。但是应当理解， 这些实施例仅用于说 明的目的， 不应以任何方式用于限制本发明的范围。
     本文描述的序列汇总如下。
    
    
    材料与方法
     1.HA 表达盒的组装
     A-pCAMBIAPlasto
     使用 Sambrook 和 Russell(2001 ； 其通过引用并入本文 ) 的一般分子生物学方案 完成所有操作。表 1 显示用于表达盒组装的寡核苷酸引物。第一个克隆步骤是组装受体 质粒， 其包含苜蓿质体蓝素基因的上游和下游调控元件。使用寡核苷酸引物 XmaI-pPlas. c(SEQ ID NO ： 1) 和 SacI-ATG-pPlas.r(SEQ ID NO ： 2) 从苜蓿基因组 DNA 中扩增质体蓝 素启动子和 5’ UTR 序列。所得扩增产物用 XmaI 和 SacI 消化并与预先经同样的酶消化的 pCAMBIA2300(Cambia， Canberra， Australia) 连接， 以形成 pCAMBIApromoPlasto。类似地， 使用引物 SacI-PlasTer.c(SEQ ID NO ： 3) 和 EcoRI-PlasTer.r(SEQ ID NO ： 4) 从苜蓿基因 组 DNA 中扩增质体蓝素基因的 3’ UTR 序列和终止子， 所得产物用 SacI 和 EcoRI 消化， 然后 插入到 pCAMBIApromoPlasto 的相同位点中， 以形成 pCAMBIAPlasto。
     B-Plasto- 天然 SP-H5A/ 印度尼西亚 /5/05( 构建体号 660)
     Epoch Biolabs(Sugar Land， TX， USA) 合 成 了 编 码 流 感 毒 株 A/ 印 度 尼 西 亚 /5/05(H5N1 ； 登录号 LANL ISDN125873) 之血凝素的片段。所产生的包含完整 H5 编码区 的片段示于 (SEQ ID NO ： 52， 图 17)， 该编码区包含天然信号肽， 其侧翼为紧邻起始 ATG 上 游 的 HindIII 位 点 以 及 紧 邻 终 止 密 码 子 (TAA) 下 游 的 SacI 位 点。 通 过 Darveau 等 (1995) 所示的基于 PCR 的连接方法将 H5 编码区克隆到基于质体蓝素的表达盒中。简 言 之， 使 用 引 物 Plato-443c(SEQ ID NO ： 5) 和 SpHA(Ind)-Plasto.r(SEQ ID NO ： 6)， 以 pCAMBIApromoPlasto 作为模板进行第一 PCR 扩增。平行地， 使用引物 Plasto-SpHA(SEQ ID NO ： 7) 和 HA(Ind)-Sac.r(SEQ ID NO ： 8)， 以 H5 编码片段 (SEQ ID NO ： 52 ； 图 17) 作为模板 进行第二扩增。 将由两个反应得到的扩增物混合， 将混合物作为模板， 使用 Plato-443c(SEQ ID NO ： 5) 和 HA(Ind)-Sac.r(SEQ ID NO ： 8) 作 为 引 物 进 行 第 三 反 应 ( 组 装 反 应 )。 用 BamHI( 在质体蓝素启动子中 ) 和 SacI( 在片段的 3’ 端 ) 消化所得片段， 并将其克隆到预先 用相同酶消化的 pCAMBIAPlasto 中。所得质粒称为 660， 其示于图 18 中 (SEQ ID NO ： 53)。
     C-Plasto-PDI SP-H1A/ 新喀里多尼亚 /20/99( 构建体号 540)
     将流感毒株 A/ 新喀里多尼亚 /20/99(H1N1)H1 基因的开放阅读框合成为两个片段 (Plant Biotechnology Institute， National Research Council， Saskatoon， Canada)。 所 合成的第一片段对应于缺少 5’ 端信号肽编码序列和 3’ 端跨膜结构域编码序列的野生型 H1 编码序列 (GenBank 登录号 AY289929 ； SEQ ID NO ： 54 ； 图 19)。片段的 5’ 端由编码 PDISP 的 末端核苷酸 ( 含有 BglII 限制性位点 ) 构成， 并且将 SacI/StuI 双位点添加在紧邻该片段 3’ 端终止密码子下游， 得到 SEQ ID NO ： 55( 图 20)。还合成了编码 H1 蛋白 C 端 ( 包含跨膜 结构域和胞质尾 ) 的第二片段， 其从 KpnI 位点至终止密码子， 其 3’ 侧翼是 SacI 和 StuI 限 制性位点 (SEQ ID NO.56 ； 图 21)。
     第一 H1 片段用 BglII 和 SacI 消化， 并克隆到含有质体蓝素启动子和 5’ UTR( 与苜 蓿蛋白质二硫键异构酶 (PDI) 基因 (32-103 位核苷酸 ； 登录号 Z11499 ； SEQ ID NO ： 57 ； 图
     22) 的信号肽融合 ) 之二元载体 (pCAMBIAPlasto) 的同样位点中， 得到位于质体蓝素调控 元件的下游的 PDI-H1 嵌合基因。基于质体蓝素的表达盒序列示于 SEQ ID NO.58( 图 23)， 其含有启动子和 BglII 限制性位点上游的 PDI 信号肽， 以及 SacI 位点下游的质体蓝素终止 子。通过将预先用 KpnI 和 SacI 消化的合成片段 (SEQ ID NO ： 56 ； 图 21) 插入到 H1 表达质 粒中来添加 H1 编码区的 C 端 ( 编码跨膜结构域和胞质尾 )。所得构建体称为 540， 其示于 SEQ ID NO.59( 图 24)。
     D-Plasto- 天然 SP-H1A/ 布里斯班 /59/07( 构建体号 774)
     按照下列步骤组装指导 A/ 布里斯班 /59/07 的 H1 表达的表达盒号 774。合成包含 完整血凝素编码序列 ( 从 ATG 到终止 ) 的合成片段， 其 3’ 侧翼是对应于质体蓝素 ATG 上游 前 84 个核苷酸以 DraIII 限制性位点起始的的苜蓿质体蓝素基因序列。该合成片段还包含 紧邻终止密码子下游的 SacI 位点。
     合成片段由 Top Gene Technologies(Montreal， QC， Cahada) 合成。所合成的片段 示于 SEQ ID NO.60( 图 25)。对于完整表达盒的组装， 将合成片段用 DraIII 和 SacI 消化并 克隆到预先用同样的酶消化的 pCAMBIAPlasto 中， 得到构建体 774(SEQ ID NO.61 ； 图 26)。
     E-CPMV HT-LC C51( 构建体号 828)
     CPMV-HT 表达盒使用 35S 启动子来控制包含目的编码序列之 mRNA 的表达， 目的编 码序列的 5′侧翼为来自豇豆花叶病毒 (CPMV)RNA2 的 1-512 位核苷酸 ( 其在 115 和 161 位 具有突变的 ATG) 并且 3′侧翼为来自 CPMV RNA2 的 3330-3481 位核苷酸 ( 对应于 3′ UTR) 和其后的 NOS 终止子。使用质粒 pBD-C5-1LC(Sainsbury 等， 2008 ； Plant Biotechnology Journal 6 ： 82-92 以及 PCT 公开 WO 2007/135480) 来组装基于 CPMV-HT 的血凝素表达盒。 使用基于 PCR 的连接方法 (Darveau 等， Methods in Neuroscience 26 ： 77-85(1995)) 实现 CPMV RNA2 第 115 和 161 位的 ATG 的突变。 使用 pBD-C5-1LC 作为模板进行两个单独的 PCR。 用于第一扩增的引物是 pBinPlus.2613c(SEQ ID NO ： 9) 和 Mut-ATG115.r(SEQ ID NO ： 10)。 用于第二扩增的引物是 Mut-ATG161.c(SEQ ID NO ： 11) 和 LC-C5-1.110r(SEQ ID NO ： 12)。 将 获得的两片段混合， 并用作使用引物 pBinPlus.2613c(SEQ ID NO ： 9) 和 LC-C5-1.110r(SEQ ID NO ： 12) 之第三扩增的模板。所得片段用 PacI 和 ApaI 消化， 并克隆至用同样的酶消化 的 pBD-C5-1LC 中。所得构建体称为 828， 其示于图 27 中 (SEQ ID NO ： 62)。
     F-H5A/ 印度尼西亚 /5/05 骨架中的 H1A/ 布里斯班 /59/07 受体结合 (RB) 结构域 ( 构建体号 690)
     使用 Darveau 等 (Methods in Neuroscience 26 ： 77-85(1995)) 报道的基于 PCR 连接方法， 用 H1A/ 布里斯班 /59/07 的 RB 结构域替换 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 中的 RB 结 构域来制备嵌合 HA。在第一轮 PCR 中， 将质体蓝素启动子区段融合到天然信号肽上， 使用 引物 Plasto-443c(SEQ ID NO ： 5) 和 E1H1B-E1H5I.r(SEQ ID NO ： 13)， 以构建体号 660(SEQ ID NO ： 53， 图 18) 为模板扩增 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 的 F’ 1 和 E1 结构域。使用引物 E1 H5N-E1 H1B.c(SEQ ID NO ： 14) 和 E2 H5I-RB H1B.r(SEQ ID NO ： 15)， 以构建体号 774(SEQ ID NO ： 61 ； 图 26) 为模板扩增含有 H1A/ 布里斯班 /59/07 之 RB 结构域编码序列的第二片 段。使用引物 RBH1B-E2 H5I.c(SEQ ID NO ： 16) 和 HA(Ind)-SacI.r(SEQ ID NO ： 8)， 以构 建体号 660(SEQ ID NO 53 ； 图 18) 为模板扩增含有 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 的 E2、 F’ 2、 F、 跨膜和胞质结构域的第三片段。然后混合扩增产物， 并用作使用引物 Plasto-443c(SEQ IDNO ： 5) 和 HA(Ind)-SacI.r(SEQ ID NO ： 8) 之第二轮扩增 ( 组装反应 ) 的模板。所得片段用 BamHI( 在质体蓝素启动子中 ) 和 SacI( 在终止密码子后 ) 消化， 并克隆进预先用同样的限 制性酶消化的构建体号 660(SEQ ID NO ： 53 ； 图 18) 中， 得到构建体号 690(SEQ ID NO ： 63)。 该构建体示于图 28 中。
     G-H5A/ 印度尼西亚 /5/05 骨架中的 H1A/ 布里斯班 /59/07 酯酶和受体结合结构域 (E1-RB-E2)( 构建体号 691)
     使用 Darveau 等 (Methods in Neuroscience 26 ： 77-85(1995)) 报道的基于 PCR 连接方法， 用 H1A/ 布里斯班 /59/07 的 E1-RB-E2 结构域替换 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 中的 E1-RB-E2 结构域来组装嵌合 HA。在第一轮 PCR 中， 将质体蓝素启动子区段融合到天然信号 肽上， 使用引物 Plasto-443c(SEQ ID NO ： 5) 和 E1H1B-F’ 1H5I.r(SEQ ID NO ： 17)， 以构建体 号 660(SEQ ID NO ： 53， 图 18) 为模板扩增 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 的 F’ 1 结构域。平行地， 扩增其他两个片段。使用引物 F’ 1H5N-E1H1B.c(SEQ ID NO ： 18) 和 F’ 2H5I-E2H1B.r(SEQ ID NO ： 19)， 以构建体号 774(SEQ ID NO ： 61 ； 图 26) 为模板扩增含有 H1A/ 布里斯班 /59/07 之 E1-RB-E2 结构域编码序列的第二片段。对于第三片段， 使用引物 E2H1B-F’ 2H5I.c(SEQ ID NO ： 20) 和 HA(Ind)-SacI.r(SEQ ID NO ： 8)， 以构建体号 660(SEQ ID NO 53 ； 图 18) 为 模板扩增 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 的 F’ 2、 F、 跨膜和胞质结构域。然后混合扩增产物， 并用 作使用引物 Plasto-443c(SEQ ID NO ： 5) 和 HA(Ind)-SacI.r(SEQ ID NO ： 8) 之第二轮扩增 ( 组装反应 ) 的模板。所得片段用 BamHI( 在质体蓝素启动子中 ) 和 SacI( 在终止密码子 后 ) 消化， 并克隆进预先用同样的限制性酶消化的构建体号 660(SEQ ID NO ： 53 ； 图 18) 中， 得到构建体号 691(SEQ ID NO ： 64)。该构建体示于图 29 中。
     H-H1A/ 新喀里多尼亚 /20/99 骨架中的 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 受体结合 (RB) 结 构域 ( 构建体号 696)
     使用 Darveau 等 (Methods in Neuroscience 26 ： 77-85(1995)) 报道的基于 PCR 连接方法， 用 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 的 RB 结构域替换 H1A/ 新喀里多尼亚 /20/99 中的 RB 结构域来制备嵌合 HA。在第一轮 PCR 中， 将质体蓝素启动子区段融合到苜蓿蛋白二硫键异 构酶信号肽 (PDISP ； 登录号 Z11499， SEQ ID NO ： 57 第 32-103 位核苷酸 ； 图 22) 上， 使用引 物 Plasto-443c(SEQ ID NO ： 5) 和 E1H5I-E1H1NC.r(SEQ ID NO ： 21)， 以构建体号 540(SEQ ID NO ： 59， 图 24) 为模板扩增 H1A/ 新喀里多尼亚 /20/99 的 F’ 1 和 E1 结构域。使用引物 E1H1NC-E1H5I.c(SEQ ID NO ： 22) 和 E2H1NC-RB H5I.r(SEQ ID NO ： 23)， 以构建体号 660(SEQ ID NO ： 53 ； 图 18) 为模板扩增含有 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 之 RB 结构域编码序列的第二片 段。 使用引物 RB H5I-E2 H1NC.c(SEQ ID NO ： 24) 和 HA-SacI.r(SEQID NO ： 25)， 以构建体号 F’ 2、 F、 跨膜 540(SEQ ID NO ： 59 ； 图 24) 为模板扩增含有 H1A/ 新喀里多尼亚 /20/99 的 E2、 和胞质结构域的第三片段。然后混合扩增产物， 并用作使用引物 Plasto-443c(SEQ ID NO ： 5) 和 HA-SacI.r(SEQ ID NO ： 25) 之第二轮扩增 ( 组装反应 ) 的模板。所得片段用 BglII 和 SacI 消化， 并克隆至预先用同样的限制性酶消化的构建体号 540(SEQ ID NO ： 59， 图 24) 中， 获得构建体号 696(SEQ ID NO ： 65)。该构建体示于图 30 中。
     I- 将 H1A/ 布里斯班 /59/2007 组装进 CPMV-HT 表达盒 ( 构建体号 732)
     按照以下所述将来自 H1A/ 布里斯班 /59/2007 的 HA 编码序列克隆进 CPMV-HT 中。 通过使用构建体号 774(SEQ ID NO ： 61 ； 图 26) 作为模板， 用引物 ApaI-H1B.c(SEQ ID NO ：26) 和 StuI-H1B.r(SEQ ID NO ： 27) 进行 PCR 扩增， 从而将限制性位点 ApaI( 紧邻 ATG 上游 ) 和 StuI( 紧邻终止密码子下游 ) 添加至血凝素编码序列中。所得片段用 ApaI 和 StuI 限制 性酶消化， 并克隆至用同样的酶消化的构建体号 828(SEQ ID NO ： 62， 图 27) 中。所得的盒 称为构建体号 732(SEQ ID NO ： 66， 图 31)。
     J- 将 SpPDI-H1A/ 布里斯班 /59/2007 组装进 CPMV-HT 表达盒 ( 构建体号 733)
     按照以下所述将编码苜蓿蛋白二硫键异构酶信号肽的序列 (PDISP ； SEQ ID NO ： 57 第 32-103 位核苷酸， 图 22 ； 登录号 Z11499) 与来自 A/ 布里斯班 /59/2007 之 H1 的 HA0 编码 序列融合， 并将所得片段克隆至 CPMV-HT 中。 通过使用构建体 774(SEQ ID NO ： 61， 图 26) 作 为模板， 用引物 SpPDI-H1B.c(SEQ ID NO ： 28) 和 SacI-H1B.r(SEQ ID NO ： 29) 扩增得到 H1 编码序列。所得片段在 H1 编码序列 5’ 侧翼为编码 PDISP 的最后几个核苷酸 ( 包含 BglII 限制性位点 )， 3’ 侧翼为 SacI 限制性位点。将该片段用 BglII 和 SacI 消化， 并克隆至预先 用同样的限制性酶消化的构建体号 540(SEQ ID NO ： 59， 图 24) 中。称为构建体号 787(SEQ ID NO 67) 的中间盒编码序列显示于图 32 中。通过使用构建体号 787(SEQ ID NO ： 67 ； 图 32) 作为模板， 用引物 ApaI-SpPDI.c(SEQ ID NO ： 30) 和 StuI-H1B.r(SEQ ID NO ： 27) 进行 PCR 扩增， 从而将限制性位点 ApaI( 紧邻 ATG 上游 ) 和 StuI( 紧邻终止密码子下游 ) 添加 至血凝素编码序列中。所得片段用 ApaI 和 StuI 限制性酶消化， 并克隆至用同样的酶消化 的构建体号 828(SEQ ID NO ： 62， 图 27) 中。所得的盒称为构建体号 733(SEQ ID NO ： 68， 图 33)。
     K- 在 CPMV-HT 表达盒中组装 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 骨架中的 H1A/ 布里斯班 /59/07 受体结合 (RB) 结构域 ( 构建体号 734)
     按 照 以 下 所 述 将 嵌 合 HA 的 编 码 序 列 ( 在 H5A/ 印 度 尼 西 亚 /5/05 骨 架 中 具 有 H1A/ 布 里 斯 班 /59/07 的 RB 结 构 域 ) 克 隆 到 CPMV-HT 中。 通 过 使 用 构 建 体 690(SEQ ID NO ： 63 ； 图 28) 作 为 模 板， 用 引 物 ApaI-H5(A-Indo).1c(SEQ ID NO ： 31) 和 H5(A-Indo)-StuI.1707r(SEQ ID NO ： 32) 进行 PCR 扩增， 从而将限制性位点 ApaI( 紧邻 ATG 上游 ) 和 StuI( 紧邻终止密码子下游 ) 添加至嵌合血凝素编码序列中。所得片段用 ApaI 和 StuI 限制性酶消化， 并克隆至用同样的酶消化的构建体号 828(SEQ ID NO ： 62， 图 27) 中。 所得的盒称为构建体号 734(SEQ ID NO ： 69， 图 34)。
     L- 将 SpPDI-H3A/ 布里斯班 /10/2007 组装进 CPMV-HT 表达盒 ( 构建体号 736)
     按照以下所述将编码苜蓿 PDI 信号肽的序列与来自 H3A/ 布里斯班 /10/2007 的 HA0 融合， 并克隆至 CPMV-HT 中。首先， 合成包含完整血凝素编码序列 ( 从 ATG 到终止 ) 的 合成片段， 其 3’ 侧翼是对应于质体蓝素 ATG 上游前 84 个核苷酸 ( 以 DraIII 限制性位点起 始 ) 的苜蓿质体蓝素基因序列。该合成片段还包含紧邻终止子之后的 SacI 位点。合成片 段由 TopGene Technologies(Montreal， QC， Canada) 合成。所合成的片段示于 SEQ ID NO ： 70( 图 35)， 并进一步用作基于 PCR 的连接的模板。
     其次， 按照以下所述将苜蓿蛋白二硫键异构酶 (PDISP)( 核苷酸 32-103 ； 登录号 Z11499 ； SEQ ID NO ： 57 ； 图 22) 信号肽与紧邻 ATG 上游的 ApaI 限制性位点和终止密码子下 游的 StuI 限制性位点一起连接到来自 A/ 布里斯班 /10/2007 之 H3 的 HA0 编码序列上。使 用 Darveau 等 (Methods in Neuroscience 26 ： 77-85(1995)) 报道的基于 PCR 的连接方法， 将 PDISP 与 H3 编码序列连接。在第一轮 PCR 中， 使用引物 ApaI-SpPDI.c(SEQ ID NO ： 30)和 H3B-SpPDI.r(SEQ ID NO ： 33)， 以构建体 540(SEQ ID NO ： 59 ； 图 24) 为模板扩增 PDISP 信号肽。平行地， 使用引物 SpPDI-H3B.c(SEQ ID NO ： 34) 和 StuI-H3B.r(SEQ ID NO ： 35)， 以先前合成的片段 (SEQ ID NO ： 70 ； 图 35) 为模板扩增含有 H3A/ 布里斯班 /10/2007 部分 编码序列 ( 从密码子 17 到终止密码子 ) 的另一片段。然后混合扩增产物， 并用作使用引 物 ApaI-SpPDI.c(SEQ ID NO ： 30) 和 StuI-H3B.r(SEQ ID NO ： 35) 之第二轮扩增 ( 组装反 应 ) 的模板。所得片段用 ApaI 和 StuI 限制性酶消化， 并克隆至用同样的酶消化的构建体 号 828(SEQ ID NO ： 62， 图 27) 中。所得的盒称为构建体号 736(SEQ ID NO ： 71， 图 36)。
     M- 在 CPMV-HT 表 达 盒 中 组 装 嵌 合 SpPDI-H3A/ 布 里 斯 班 /10/2007( 胞 外 结 构 域 )+H5A/ 印度尼西亚 /5/2005(TmD+Cyto tail)( 构建体号 737)
     按照以下所述将编码苜蓿 PDI 信号肽的序列融合到 H3A/ 布里斯班 /10/2007 胞外 结构域和 H5A/ 印度尼西亚 /5/2005 的跨膜和胞质结构域上， 并克隆到 CPMV-HT 中。使用 Darveau 等 (Methods in Neuroscience 26 ： 77-85(1995)) 报道的基于 PCR 的连接方法， 将 PDISP-H3 编码序列与 H5 跨膜结构域融合。在第一轮 PCR 中， 通过使用引物 ApaI-SpPDI. c(SEQ ID NO ： 30) 和 TmD H5I-H3B.r(SEQ ID NO ： 36)， 以构建体号 736(SEQ ID NO ： 71 ； 图 36) 为模板扩增产生包含 PDISP 信号肽和 H3 布里斯班胞外结构域的片段。平行地， 使 用 引 物 H3B-TmD H5I.c(SEQ ID NO ： 37) 和 H5(A-Indo)-StuI.1707r(SEQ ID NO ： 32)， 以 构建体号 660(SEQ ID NO ： 53 ； 图 18) 为模板扩增含有 H5 印度尼西亚之跨膜和胞质结构 域的另一片段。然后混合扩增产物， 并用作使用引物 ApaI-SpPDI.c(SEQ ID NO ： 30) 和 H5(A-Indo)-StuI.1707r(SEQ ID NO ： 32) 之第二轮扩增 ( 组装反应 ) 的模板。所得片段用 ApaI 和 StuI 限制性酶消化， 并克隆至用同样的酶消化的构建体号 828(SEQ ID NO ： 62， 图 27) 中。所得的盒称为构建体号 737(SEQ ID NO ： 72， 图 37)。
     N- 将 SpPDI-HA B/ 佛罗里达 /4/2006 组装进 CPMV-HT 表达盒 ( 构建体号 739)
     按照以下所述将编码苜蓿 PDI 信号肽的序列与来自 HA B/ 布里斯班 /4/2006 的 HA0 融合， 并克隆至 CPMV-HT 中。首先， 合成包含完整血凝素编码序列 ( 从 ATG 到终止 ) 的 合成片段， 其 3’ 侧翼是对应于质体蓝素 ATG 上游前 84 个核苷酸 ( 以 DraIII 限制性位点起 始 ) 的苜蓿质体蓝素基因序列。合成片段还包含紧邻终止密码子之后的 SacI 限制性位点。 该合成片段由 Epoch Biolabs(Sugar Land， Texas， USA) 合成。所合成的片段示于 SEQ ID NO73( 图 38)， 并进一步用作基于 PCR 的连接的模板。
     其次， 按照以下所述将苜蓿蛋白二硫键异构酶 (PDISP)(SEQ ID NO ： 57 核苷酸 32-103 位 ； 图 22 ； 登录号 Z11499) 信号肽与紧邻上游 ATG 的 ApaI 限制性位点和终止密码 子下游的 StuI 限制性位点一起连接到来自 B/ 佛罗里达 /4/2006 之 HA 的 HA0 编码序列上。 使用 Darveau 等 (Methods in Neuroscience 26 ： 77-85(1995)) 报道的基于 PCR 的连接方 法， 将 PDISP 与 HA 编码序列连接。在第一轮 PCR 中， 使用引物 ApaI-SpPDI.c(SEQ ID NO ： 30) 和 HBF-SpPDI.r(SEQ ID NO ： 38)， 以构建体号 540(SEQ ID NO ： 59 ； 图 24) 为模板扩增 PDISP 信号肽。平行地， 使用引物 SpPDI-H3B.c(SEQ ID NO ： 39) 和 StuI-HBF.r(SEQ ID NO ： 40)， 以先前合成的片段 (SEQ ID NO ： 73 ； 图 38) 为模板扩增含有来自 B/ 佛罗里达 /4/2006 之 HA 的部分编码序列 ( 从密码子 16 到终止密码子 ) 的另一片段。然后混合扩增产物， 并 用作使用引物 ApaI-SpPDI.c(SEQ ID NO ： 30) 和 StuI-HBF.r(SEQ IDNO ： 40) 之第二轮扩增 ( 组装反应 ) 的模板。所得片段用 ApaI 和 StuI 限制性酶消化， 并克隆至用同样的酶消化的构建体号 828(SEQ ID NO ： 62， 图 27) 中。所得的盒称为构建体号 739(SEQ ID NO ： 74， 图 39)。 O- 在 CPMV-HT 表达盒中组装嵌合 SpPDI-HA B/ 佛罗里达 /4/2006( 胞外结构域 )+H5A/ 印度尼西亚 /5/2005(TmD+Cyto tail)( 构建体号 745)。
     按照以下所述将编码苜蓿 PDI 信号肽的序列融合到 HA B/ 佛罗里达 /4/2006 胞外 结构域和 H5A/ 印度尼西亚 /5/2005 的跨膜和胞质结构域上， 并克隆到 CPMV-HT 中。使用 Darveau 等 (Methods in Neuroscience 26 ： 77-85(1995)) 报道的基于 PCR 的连接方法， 将 PDISP-B/ 佛罗里达 /4/2006 胞外结构域编码序列与 H5 跨膜和胞质结构域融合。在第一轮 PCR 中， 使用引物 ApaI-SpPDI.c(SEQ ID NO ： 30) 和 TmD H5I-B Flo.r(SEQ ID NO ： 41)， 以构 建体号 739(SEQ ID NO ： 74 ； 图 39) 为模板扩增产生包含与 HA B/ 佛罗里达 /4/2006 胞外结 构域融合的 PDISP 信号肽的片段。平行地， 使用引物 B Flo-TmD H5I.c(SEQ ID NO ： 42) 和 H5(A-Indo)-StuI.1707r(SEQ ID NO ： 32)， 以构建体号 660(SEQ ID NO ： 53 ； 图 18) 为模板扩 增含有 H5 印度尼西亚跨膜和胞质结构域的另一片段。然后混合扩增产物， 并用作使用引物 ApaI-SpPDI.c(SEQ ID NO ： 30) 和 H5(A-Indo)-StuI.1707r(SEQ ID NO ： 32) 之第二轮扩增 ( 组装反应 ) 的模板。所得片段用 ApaI 和 StuI 限制性酶消化， 并克隆至用同样的酶消化 的构建体号 828(SEQ ID NO ： 62， 图 27) 中。所得的盒称为构建体号 745(SEQ ID NO ： 75， 图 40)。
     P- 在 2X35S-CPMV-HT 表达盒中组装嵌合 SpPDI-HA B/ 佛罗里达 /4/2006+H5A/ 印 度尼西亚 /5/2005(TmD+Cyto tail)( 构建体号 747)
     按照以下所述将编码苜蓿 PDI 信号肽的序列融合到来自 HA B/ 佛罗里达 /4/2006 的 HA0 和 H5A/ 印度尼西亚 /5/2005 的跨膜和胞质结构域上， 并克隆到 2X35S-CPMV-HT 中。 使用 Darveau 等 (Methods in Neuroscience 26 ： 77-85(1995)) 报道的基于 PCR 的连接方 法进行启动子转换。使用引物 PacI-MCS-2X35S.c(SEQ ID NO ： 89) 和 CPMV 5’ UTR-2X35S. r(SEQ ID NO ： 90) ：
    以含有 2X35S 启动子的质粒为模板通过 PCR 扩增含有 2X35S 启动子 (SEQ ID NO ： 88 ： 图 50A) 的第一片段。 平行地， 使用引物 2X35S-CPMV 5’ UTR.c(SEO ID NO ： 91) 和 ApaI-M prot.r(SEO ID NO ： 92) ：
    以构建体 745(SEQ ID NO ： 75 ； 图 40) 为模板进行第二 PCR。然后混合所得的两种 片段并用作使用引物 PacI-MCS-2X35S.c(SEQ ID NO ： 89) 和 ApaI-M prot.r(SEQ ID NO ： 92) 之第二轮 PCR( 组装反应 ) 的模板。所得片段用 PacI 和 ApaI 消化， 并克隆至用同样的酶消 化的构建体 745(SEQ ID NO ： 75， 图 40) 中。 表达盒称为构建体 747(SEQ ID NO ： 93)， 其序列 示于图 50B 中。
     2. 伴侣蛋白表达盒的组装
     组装了两种热休克蛋白 (Hsp) 表达盒。在第一种盒中， 拟南芥 ( 哥伦比亚生态 型 ) 胞浆 HSP70(Lin 等 (2001)Cell stress and Chaperones 6 ： 201-208 中的 Athsp70-1) 的表达被苜蓿亚硝酸还原酶 (Nir) 和苜蓿质体蓝素启动子的嵌合启动子组合元件 (Nir/ Plasto) 控制。还组装了第二种盒， 其包含嵌合 Nir/Plasto 启动子控制下的苜蓿胞浆 HSP40(MsJ1 ； Frugis 等 (1999)Plant Molecular Biology 40 ： 397-408) 编码区。
     首先， 组装了在植物二元载体中含有苜蓿亚硝酸还原酶启动子 (Nir)、 GUS 报 告基因和 NOS 终止子的接纳质粒 (acceptor plasmid)。用 HindIII 和 EcoRI 消化质粒 pNir3K51( 先前描述于美国专利 No.6,420,548 中 )。将所得片段克隆进用同样的限制性酶 消化的 pCAMBIA2300(Cambia， Canberra， Australia) 中， 得到 pCAMBIA-Nir3K51。
     通 过 基 于 PCR 的 连 接 方 法 (Darveau 等， Methods in Neuroscience 26 ： 77-85(1995))， 将 Hsp70 和 Hsp40 的编码序列分别克隆进接纳质粒 pCAMBIANir3K51 中。
     对于 Hsp40， 使用引物 Hsp40Luz.1c(SEQ ID NO ： 43) 和 Hsp40Luz-SacI.1272r(SEQ ID NO ： 44)， 通 过 RT-PCR 从 苜 蓿 (Rangclander 生 态 型 ) 叶 总 RNA 中 扩 增 Msj1 编 码 序 列 (SEQ ID NO ： 76 ； 图 41)。使用构建体 660(SEQ ID NO ： 53 ； 图 18) 作为模板， 用引物 Plasto-443c(SEQ ID NO ： 5) 和 Hsp40Luz-Plasto.r(SEQ ID NO ： 45) 进行第二扩增。然后 混合 PCR 产物， 并用作使用引物 Plasto-443c(SEQ ID NO ： 5) 和 Hsp40Luz-SacI.1272r(SEQ ID NO ： 44) 之第三扩增 ( 组装反应 ) 的模板。所得片段用 HpaI( 在质体蓝素启动子中 ) 消 化， 并克隆进预先用 HpaI( 在 Nir 启动子中 ) 和 SacI 消化并用 T4DNA 聚合酶处理以产生平 末端的 pCAMBIANir3K51 中。筛选正确取向的所得克隆， 并测序以检验序列完整性。所得质 粒称为 R850， 其示于图 42 中 (SEQ ID NO ： 77)。使用引物 Hsp70Ara.1c(SEQ ID NO ： 46) 和 Hsp70Ara-SacI.1956r(SEQ ID NO ： 47)， 通过 RT-PCR 从拟南芥叶 RNA 中扩增 Athsp70-1 的 编码区。使用构建体 660(SEQ ID NO ： 53， 图 18) 作为模板， 用引物 Plato-443c(SEQ ID NO ： 5) 和 Hsp70Ara-Plasto.r(SEQ ID NO ： 48) 进行第二扩增。然后混合 PCR 产物， 并作使用引 物 Plasto-443c(SEQ ID NO ： 5) 和 Hsp70ARA-SacI.1956r(SEQ ID NO ： 47) 之第三扩增 ( 组 装反应 ) 的模板。所得片段用 HpaI( 在质体蓝素启动子中 ) 消化， 并克隆进用 HpaI( 在 Nir 启动子中 ) 和 SacI 消化并用 T4DNA 聚合酶处理以产生平末端的 pCAMBIANir3K51 中。筛选 正确取向的所得克隆， 并测序以检验序列完整性。所得质粒称为 R860， 其示于图 43 中 (SEQ ID NO ： 78)。
     按照以下所述组装双 Hsp 表达质粒。 R860(SEQ ID NO ： 78 ； 图 43) 用 BsrBI(NOS 终 止子下游 ) 消化， 用 T4DNA 聚合酶处理以产生平末端， 并用 SbfI( 嵌合 NIR/Plasto 启动子 的上游 ) 消化。将所得片段 ( 嵌合 Nir/Plasto 启动子 -HSP70 编码序列 -Nos 终止子 ) 克 隆进预先用 SbfI 和 SmaI( 均位于嵌合 Nir/Plasto 启动子上游的多克隆位点中 ) 消化的 R850(SEQ ID NO ： 77 ； 图 42) 中。所得质粒称为 R870， 其示于图 44 中 (SEQ ID NO ： 79)。3. 其他表达盒的组装
     HcPro 表达盒
     如 Hamilton 等 (2002) 所述制备 HcPro 构建体 (35HcPro)。对所有克隆进行测 序以证实构建体的完整性。通过电穿孔 (Mattanovich 等， 1989) 用质粒转化根瘤农杆菌 (Agrobacteium tumefaciens)(AGL1 ； ATCC， Manassas， VA 20108， USA)。通过限制性图谱证 实所有根瘤农杆菌株的完整性。
     P19 表达盒
     通 过 基 于 PCR 的 连 接 方 法 (Darveau 等， Methods in Neuroscience 26 ： 77-85(1995)) 将番茄丛矮病毒 (TBSV)p19 蛋白的编码序列与苜蓿质体蓝素表达盒连接。 在 第一轮 PCR 中， 使用构建体 660(SEQ ID NO ： 53) 作为模板， 用引物 Plasto-443c(SEQ ID NO ： 5) 和 supP19-plasto.r(SEQ ID NO ： 49) 扩增质体蓝素启动子的区段。平行地， 使用构建体 35S ： p19( 如 Voinnet 等， The Plant Journal 33 ： 949-956(2003) 所述 ) 作为模板， 用引物 supP19-1c(SEQ ID NO ： 50) 和 SupP19-SacI.r(SEQ ID NO ： 51) 扩增含有 p19 编码序列的另 一片段。 然后混合扩增产物， 并用作使用引物 Plasto-443c(SEQ ID NO ： 5) 和 SupP19-SacI. r(SEQ ID NO ： 51) 之第二轮扩增 ( 组装反应 ) 的模板。所得片段用 BamHI( 在质体蓝素启 动子中 ) 和 SacI( 在 p19 编码序列末端 ) 消化， 并克隆进预先用同样的限制性酶消化的构 建体号 660(SEQ ID NO ： 53 ； 图 18) 中， 得到构建体号 R472。质粒 R472 示于图 45 中。
     构建体号 443
     构建体号 443 对应 pCAMBIA2300( 空载体 )。
     表 1. 用于表达盒组装的寡核苷酸引物。
    
    
    表2： 用于表达带有天然或 PDI 信号肽的流感血凝素的农杆菌菌株农杆菌菌株 AGL1/540 AGL1/774 AGL1/787 AGL1/732 AGL1/736 AGL1/660 AGL1/739 AGLI/828 AGLI/690 AGLI/691 AGLI/696 AGLI/733 表达的 HA H1(A/ 新喀里多尼亚 /20/99) H1(A/ 布里斯班 /59/2007) H1(A/ 布里斯班 /59/2007) H1(A/ 布里斯班 /59/2007) H3(A/ 布里斯班 /10/2007) H5(A 印度尼西亚 /5/2005) B(B/ 佛罗里达 /4/2006) CPMV HT-LC C51 H1/Bris RB+H5/Indo SDC H1/Bri E1-RB-E2+H5SDC H5/Indo RB+H1/NC SDC H1/Bri 信号肽 PDI 天然 PDI 天然 PDI 天然 PDI C51LC 天然 天然 PDI PDI 表达盒 质体蓝素 质体蓝素 质体蓝素 35S/CPMV-HT 35S/CPMV-HT 质体蓝素 35S/CPMV-HT 35S/CPMV-HT Plasto Plasto Plasto 35S/CPMV-HT40CN 102482328 A AGLI/734 AGLI/737 AGLI/745 AGL1/747
    说H1/Bri RB+H5/Indo SDC明书天然 PDI PDI PDI 35S/CPMV-HT 35S/CPMV-HT 35S/CPMV-HT 2X35S/CPMV-HT39/45 页H3/Bri 胞外结构域 +H5/Indo TDC B/Flo 胞外结构域 _H5/Indo TDC B/Flo 胞外结构域 _H5/Indo TDC4. 植物生物质的准备、 接种、 农杆菌侵染和收获
     在 填 装 市 售 泥 炭 基 质 的 平 地 上 从 种 子 培 养 本 塞 姆 氏 烟 草 (Nicotiana benthamiana)。使植物以 16/8 光照周期生长在温室中， 温度放方案白天 25℃ / 晚上 20℃。 播种 3 周后， 挑出各株幼苗， 移栽到盆中， 并在同样的环境条件下在温室中再生长 3 周。转 化前， 在以下所述的不同时间通过掐掉植物的芽或通过化学处理植物而除去顶芽和腋芽。
     在补充有 10mM 2-[N- 吗啉 ] 乙磺酸 (MES)、 20μM 乙酰丁香酮、 50μg/ml 卡那霉 素和 25μg/ml 羧苄青霉素的 YEB 培养基 (pH 5.6) 中培养用每种构建体转染的农杆菌， 直 至其 OD600 为 0.6 至 1.6。使用前将农杆菌混悬液离心并重悬在侵染培养基 (10mM MgCl2 和 10mM MES， pH 5.6) 中。如 Liu 和 Lomonossoff(2002， Journal of Virological Methods， 105 ： 343-348) 所述进行注射器侵染。对于真空侵染， 将根瘤农杆菌混悬液离心， 重悬在侵 染培养基中， 并储存在 4℃过夜。在侵染当天， 将分批培养物在 2.5 倍培养物体积中稀释并 在使用前温热。在 20-40 托真空下， 使本塞姆氏烟草或普通烟草 (N.tabacum) 的整个植株 倒置于气密性不锈钢罐中的细菌混悬液中 2 分钟。注射器或真空侵染后， 将植株移回温室 中培养 4-5 天直至收获。除非另外指明， 否则所有侵染均通过与 AGL1/35S-HcPro 以 1 ∶ 1 共侵染来进行， 具有 CPMV-HT 盒的毒株除外 ( 其与毒株 AGL1/R472 以 1 ∶ 1 共侵染 )。
     5. 叶片取样和总蛋白质提取
     培养后， 收获植株的地上部分， 冷冻在 -80℃， 破碎成碎片。通过将每个冷冻破碎 植物材料的样品在 3 倍体积的冷 50mM Tris(pH 8.0)0.15M NaCl， 0.04％焦亚硫酸钠和 1mM 苯甲基磺酰氟中匀浆 (Polytron) 来提取总的可溶性蛋白质。匀浆后， 于 4℃下以 20,000g 离心浆液 20 分钟， 将这些澄清的粗提物 ( 上清液 ) 用于分析。使用牛血清白蛋白作为参照 标准， 通过 Bradford 测定 (Bio-Rad， Hercules， CA) 来测定澄清的粗提物的总蛋白质含量。
     6. 蛋白质分析和免疫印迹
     蛋白浓度通过 BCA 蛋白测定 (Pierce Biochemicals， Rockport IL) 来测定。在还 原条件下通过 SDS-PAGE 分离蛋白质， 并用考马斯蓝染色。对经染色的凝胶进行扫描， 并使 用 ImageJ Software(NIH) 进行密度分析。
     用丙酮来沉淀来自 SEC 洗脱级分的蛋白质 (Bollag 等， 1996)， 重悬在 1/5 体积的 平衡 / 洗脱缓冲液中， 在还原条件下通过 SDS-PAGE 分离并电转移到聚偏氟乙烯 (PVDF) 膜 (Roche Diagnostics Corporation， Indianapolis， IN) 上用于免疫检测。 在免疫印迹之前， 用 Tris 缓冲盐水 (TBS-T) 中 5％脱脂奶和 0.1％ Tween-20 在 4℃下封闭膜 16-18 小时。
    通过用 2μg/ml 的合适抗体 ( 表 6)( 在 2％脱脂奶、 0.1％ TBS-Tween20 中 ) 孵育 进行免疫印迹。 用于化学发光检测的第二抗体示于表 4 中， 如所示将其在 2％脱脂奶、 0.1％
     TBS-Tween 20 中稀释。使用 luminol(Roche Diagnostics Corporation) 作为底物， 通过 化学发光检测免疫反应性复合物。使用 EZ-Link Plus 活化辣根过氧化物酶缀合试剂盒 (Pierce， Rockford， IL) 进行人 IgG 抗体的辣根过氧化物酶缀合。用作检测 H1、 H3 和 B 亚 型之对照的失活全病毒 (WIV) 从 National Institute for Biological Standards and Control(NIBSC) 购得。
     表3： 用于所表达蛋白质免疫印迹的电泳条件、 抗体和稀释
    FII ： Fitzgerald Industries International， Concord， MA， USA ；
     NIBSC ： National Institute for Biological Standards and Control ；
     JIR ： Jackson ImmunoResearch， West Grove， PA， USA ；
     ITC ： Immune Technology Corporation， Woodside， N Y， USA ；
     7.SEC 前的澄清和浓缩
     为了改善分辨率和增加洗脱级分的信号， 使用以下方法对待加载到体积排阻色谱 上的提取物粗蛋白提取物进行澄清和浓缩。 提取物在 4℃下以 70000g 离心 20 分钟， 沉淀通 过用 1 体积 ( 相比最初的提取物体积 ) 的提取缓冲液 (50mM Tris， pH8.0， 0.15M NaCl) 重 悬来清洗两次， 并在 4℃下以 70000g 离心 20 分钟。获得的沉淀重悬在 1/3 体积 ( 相比最初 的提取物体积 ) 中， 加入 20％ (w/v)PEG3350 然后在冰上孵育 1 小时使蛋白 ( 包括 VLP) 沉 淀。在 4℃下以 10000g 离心 20 分钟回收沉淀的蛋白质， 并重悬在 1/15 体积 ( 相比最初的 提取物体积 ) 的提取缓冲液中。完全重悬蛋白质后， 在 4℃下以 20000g 离心 5 分钟沉淀不 溶物， 回收清澈的上清液。
     8. 蛋白质提取物的体积排阻色谱
     装 填 32ml SephacrylTMS-500 高 分 辨 率 珠 (S-500HR ： GE Healthcare， Uppsala， Sweden， 货 号 17-0613-10) 的 体 积 排 阻 色 谱 (SEC) 柱， 用 平 衡 / 洗 脱 缓 冲 液 (50mM 的
     Tris(pH8)， 150mM NaCl) 平衡。将 1.5mL 粗蛋白质提取物加载到该柱上， 然后用 45mL 平 衡 / 洗脱缓冲液进行洗脱步骤。以 1.5mL 级分收集洗脱液， 洗脱级分的相对蛋白质含量这 样通过将 10μL 级分与 200μL 稀释的 Bio-Rad 蛋白染色试剂 (Bio-Rad， Hercales， CA) 混 合来监测。用 2 倍柱体积的 0.2N NaOH 清洗该柱， 然后用 10 倍柱体积的 50mM Tris(pH8)、 150mM NaCl 和 20％乙醇清洗。 每次分离之后用蓝葡聚糖 2000(GE HealthCare Bio-Science Corp.， Piscataway， NJ， USA) 校准柱。在每次分离之间对蓝葡聚糖 2000 和宿主可溶性蛋白 质的洗脱曲线进行比较， 以确保所用柱之间的洗脱曲线的一致性。
     实施例 1 ： 流感亚型茎上 RB 和 / 或酯酶结构域的替换策略
     H5/Indo 的 RB 亚结构域可以用 H1、 H3 或 B HA 的 RB 亚结构域替换。 得到的嵌合 HA 提供 SDC H5/Indo 以形成 VLP， 并显示包含 H1、 H3 或 B 免疫原性位点的 RB 亚结构域。H5/ Indo RB 亚结构域可以插入到 H1 茎上 (H1/NC)。图 15A 和 15B 显示了所示亚结构域融合位 点的氨基酸序列， 相应亚结构域的氨基酸序列显示在图 2( 构建体 690、 734、 696 和 691) 和 表 4( 构建体 900 和 745) 和表 5( 构建体 910、 920 和 930) 中。图 2 和表 4、 5 中显示的氨基 酸序列不包含信号肽序列。
     表 4 亚结构域和嵌合流感 HA。包含异源 RB 亚结构域的嵌合流感 HA。
    序列 SEQ ID NO ： 105 的 1-92 位氨基酸是 H5/Indo 的 F’ 1+E1 结构域 ； 93-259 位氨 基酸是 H3/ 布里斯班的 RB 头部结构域， 260-548 位氨基酸是 H5/Indo 的 E2+F’ 2 结构域。
     序列 SEQ ID NO ： 106 的 1-92 位氨基酸是 H5/Indo 的 F’ 1+E1 结构域 ； 93-276 位氨 基酸是 B/ 佛罗里达的 RB 头部结构域， 277-565 位氨基酸是 H5/Indo 的 E2+F’ 2 结构域。
     表 5 亚结构域和嵌合流感 HA。包含异源 RB 亚结构域的嵌合流感 HA。
    
    SEQ ID NO ： 107 的 1-42 位氨基酸是 H5/Indo 的 N 端 F’ 1 结构域 ； 43-228 位氨基 酸是 H3/ 布里斯班的 E1-RB-E2 头部结构域， 229-507 位氨基酸是 H5/Indo 的 F’ 2 结构域。
     SEQ ID NO ： 108 的 1-42 位氨基酸是 H5/Indo 的 N 端 F’ 1 结构域 ； 43-281 位氨基 酸是 B/ 佛罗里达的 E1-RB-E2 头部结构域 ； 282-556 位氨基酸是 H5/Indo 的 F’ 2 结构域。
     SEQ ID NO ： 109 的 1-42 位氨基酸是 H1/NC 的 N 端 F’ 1 结构域 ； 43-273 位氨基酸 是 H5/Indo 的 E1-RB-E2 头部结构域， 274-548 位氨基酸是 H1/NC 的 F’ 2 结构域。
     各个嵌合体的融合位点选择在邻近 ( 但不必然直接位于 ) 各个亚结构域的 N 和 C 端——不希望被理论约束， 选择这些融合位点以使嵌合 HA 的稳定性最大化。例如， 在 RB 亚 结构域的 N 端观察到结构和序列的保守性 (Ha 等 2002， EMBO J.21 ： 865-875 ； 在此通过引用 并入本文 )。 发现初级序列中变化较少的区域位于 E1 亚结构域 15 个氨基酸之前的 C-F Y-P 三联体中。此半胱氨酸参与在 HA 中保守的 3 号二硫桥 ( 参见图 46 和 47)。此半胱氨酸处 的连接可以为嵌合 HA 提供相对天然序列更加适合或更优的稳定性。RB 的 C 端提供保守特 征： 例如， 在比对中， 在所有 HA 中观察到的位点 1 处的保守丝氨酸残基和以 β 折叠起始的 E2 亚结构域 (Ha 等， 2002， EMBO J.21 ： 865-875 ； 其通过引用并入本文 )。因此， 此 RB 的 C 端 可以融合到 E2 亚结构域该 β 折叠结构的起始氨基酸上。并且， 对于在 H5/Indo SDC 上包 含 H1/NC、 H1Bri、 H3/Bri 或 B/Flo 的 RB 亚结构域的嵌合体和在 H1SDC 上包含 H5/Indo RB 但是在 H5 茎上 亚结构域的嵌合体 ( 共 6 个 )， 二硫桥模式没有变化或者没有实质性的变化， B RB 的杂交 HA 上添加了二硫桥 (8 号二硫键 )。添加此二硫桥不应当干扰 HA 的折叠 ( 因 为其位于 RB 结构域中， 并且半胱氨酸在序列中邻近 )， 并且可以提供更加稳定的杂交 HA。
     第一流感类型的 E1-RB-E2 亚结构域被替换为第二流感类型的 E1-RB-E2 亚结构 域。这种安排可以在 H5-VLP 表面显示更多的第二流感类型的氨基酸。在此实施例中， 将 H1、 H3 或 B 的 HDC 放置在 H5/IndoSDC 上， 将 H5/Indo 的 HDC 放置在 H1/NC SDC 上 ( 表 5)。
     用保守的半胱氨酸残基 ( 构成 HA 类型 A 中的 6 号二硫桥和 HA 类型 B 中的 7 号二 硫桥 ) 确定 HDC 的连接。E2 亚结构域 C 端的 HDC 连接用另一保守半胱氨酸残基确定， 其构 成 H5/Indo SDC 上流感类型 H1 或 H3 或者 H1SDC 上流感类型 H5 的 6 号二硫桥 (F’ 2 亚结构 域的第二氨基酸 )。对于乙型流感嵌合体， 在第一个半胱氨酸处建立连接， 该半胱氨酸构成 4 号二硫桥 ( 在 F’ 2 亚结构域上相隔 4 个氨基酸的位置， 并在 HA 之间保守 )。所得嵌合体 的二硫桥模式没有显示任何变化—— H1/H3/H5 杂交 HA 含有 6 个二硫桥， B 杂交 HA 具有 7 个二硫键。
     实施例 2 ： 用 H1A/ 布 里 斯 班 /59/2007 的 受 体 结 合 (RB) 或 受 体 结 合 和 酯 酶 (E1-RB-E2) 亚结构域替换 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 的相应部分 ： 嵌合体和天然形式的表达 的比较。
     为了将 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 的 VLP 高累积水平与 H1A/ 布里斯班 /59/2007 的 抗原性特点相联合， 设计了包含与 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 茎结构域簇融合的 H1A/ 布里斯 班 /59/2007 结构域的嵌合血凝素。表达 H5/H1 血凝素融合蛋白的表达盒显示于图 1， 产生 的成熟融合蛋白的氨基酸序列显示于图 2。
     为了比较 H5/H1 嵌合血凝素与其天然形式的累积水平， 用 AGL1/774、 AGL1/691 和 AGL1/690 侵染本塞姆氏烟草 (Nicotiana Benthamiana) 植株， 经过 6 天的孵育期后收获 叶。为了确定农杆菌侵染的叶中每种 HA 形式的累积水平， 从被侵染的叶组织中提取蛋白并 用抗 HA 单克隆抗体进行 Western 印迹分析。在用 AGL1/690 侵染的叶子提取物中检测到 约为 75kDa 的独特条带 ( 图 3)， 大小对应流感血凝素未切割的 HA0 形式， 但是在 AGL1/774 或 AGL1/691 中未检测到， 这表明包含与 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 骨架融合的 H1A/ 布里斯班 /59/2007 受体结合区的嵌合血凝素的累积水平高于 H1A/ 布里斯班 /59/2007 的天然形式 (AGL1/774)， 也高于联合 H1A/ 布里斯班 /59/2007 的酯酶和受体结合区和 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 骨架的嵌合血凝素。 用作阳性对照的灭活全病毒 (WIV)(H1A/ 布里斯班 /59/2007) 检 测为多个条带， 主要条带在约 80kDa 处， 对应 H1A/ 布里斯班 /59/2007 前体 HA0 的分子量。 这 些结果证明， 用 H1A/ 布里斯班 /59/2007 的受体结合区替换 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 的相应 部分产生嵌合血凝素， 其显示 H1 的抗原区并且其在植物中比天然 H1A/ 布里斯班 /59/2007 累积水平更高。但是， 其中 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 中酯酶和受体结合区被 H1A/ 布里斯班 /59/2007 的对应部分替换的嵌合血凝素在植物中没有累积到可以检测的水平。
     对将 H1A/ 布里斯班 /59/2007 的受体结合区与 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 骨架的融合 作为植物中呈递 H1 抗原之 VLP 的累积水平增加方法在基于 CPMV-HT 的强表达盒控制下进 行了再次评价。 还将此融合策略与增加累积水平的信号肽替换方法进行了比较。 在 CPMV-HT 控制下表达 H5/H1 血凝素融合蛋白的表达盒显示于图 8， 产生的成熟融合蛋白的氨基酸序 列显示于图 2。
     用 AGL1/732、 AGL1/733 或 AGL1/734 侵染本塞姆氏烟草植株， 6 天的孵育期后收 获烟草叶。为了确定农杆菌侵染的叶中每种 HA 形式的累积水平， 首先从被侵染的叶组织 中提取蛋白并用抗 H1( 布里斯班 ) 多克隆抗体进行 Western 印迹分析。在用 AGL1/732、AGL1/733 和 AGL1/734 侵染的叶提取物中检测到约为 75kDa 的独特条带 ( 图 6)， 大小对应 流感血凝素未切割的 HA0 形式， 但是， 虽然在所有分析的提取物中均检测到血凝素， 仍然可 以观察到累积水平的重要差异。在这些条件下， H1A/ 布里斯班 /59/2007 表达使用其天然 信号肽 (732) 几乎检测不到， 用 PDI 的信号肽替换信号肽后得到高累积水平的成熟 H1A/ 布 里斯班 /59/2007(733)， 嵌合 H5/H1 血凝素 (734) 累积水平最高。总之， 这些结果表明， 将 H1 的受体结合结构域与 H5 骨架融合导致呈递 H1 抗原之血凝素的高累积， 并且在植物中这 些融合蛋白的累积水平高于信号肽替换或未替换的天然形式所获得的累积水平。
     实施例 3 ： 用 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 的受体结合 (RB) 亚结构域替换 H1A/ 新喀里 多尼亚 /20/99 的相应部分。嵌合和天然形式的表达的比较。
     还评价了 H1 骨架 ( 来自 A/ 新喀里多尼亚 /20/99) 在呈递 H5 抗原区中的用途。 表 达 H1/H5 血凝素融合蛋白的表达盒显示于图 1， 产生的成熟融合蛋白的氨基酸序列显示于 图 2。
     为了比较 H1/H5 嵌合血凝素与其天然形式的累积水平， 用 AGL1/660 和 AGL1/696 侵染本塞姆氏烟草植株， 经过 6 天的孵育期后收获烟草叶。为了确定农杆菌侵染的叶子中 每种 HA 形式的累积水平， 从被侵染的叶组织中提取蛋白病用抗 H5( 印度尼西亚 ) 多克隆 抗体进行 Western 印迹分析。在用 AGL1/660 和 AGL1/696 侵染的叶提取物中检测到约为 75kDa 的独特条带 ( 图 7)， 大小对应流感血凝素未切割的 HA0 形式， 表明天然 H5A/ 印度尼 西亚 /5/05 和 H1/H5 嵌合血凝素两者均在植物中高水平累积。
     实施例 4 ： 用 H3 或 B 型流感的相应部分替换 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 的胞外结构 域。嵌合体和天然形式的表达的比较。
     评价了呈递 H3 和 B 型毒株血凝素抗原区同时增加它们在植物中的累积的以下策 略： 将 H3A/ 布里斯班 /10/2007 或 B 佛罗里达 /4/2006 的胞外结构域与来自 H5A/ 印度尼西 亚 /5/05 的跨膜和胞质亚结构域融合。表达 H5/H3 和 H5/B 血凝素融合蛋白的表达盒显示 于图 10， 融合边界的氨基酸显示于图 11。
     比较 H5/B 嵌合血凝素 (745) 与天然 HA B(739) 在本塞姆氏烟草植株中的累积水 平。 用 AGL1/739 和 AGL1/745 侵染植株， 经过 6 天的孵育期后收获烟草叶。 为了确定农杆菌 侵染的叶中每种 HA 形式的累积水平， 首先从被侵染的叶组织中提取蛋白并用抗 B( 佛罗里 达 ) 多克隆抗体进行 Western 印迹分析。 在用 AGL1/739 侵染的一个植株的叶提取物中检测 到约为 75kDa 的独特条带 ( 图 14)， 大小对应流感血凝素未切割的 HA0 形式， 而用 AGL1/745 侵染的 3 个植株显示相应血凝素阳性信号， 表明血凝素的 H5/B 嵌合形式比 B 血凝素天然形 式更经常获得高累积水平。
     类似地， 比较 H5/H3 嵌合血凝素 (737) 与其天然形式 (736) 在本塞姆氏烟草中的 累积水平。用 AGL1/736 和 AGL1/737 侵染植株， 经过 6 天的孵育期后收获烟草叶。为了确 定农杆菌侵染的叶子中每种 HA 形式的累积水平， 从被侵染的叶组织中提取蛋白病并用抗 H3( 布里斯班 ) 多克隆抗体进行 Western 印迹分析。在用 AGL1/736 和 AGL1/737 侵染的叶 提取物中检测到约为 75kDa 的独特条带 ( 图 15)， 大小对应流感血凝素未切割的 HA0 形式。 该结果表明来自 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 的跨膜和胞质亚结构域与 H3A/ 布里斯班 /10/2007 胞外结构域的融合获得与天然 H3A/ 布里斯班 /10/2007 累积水平类似的嵌合血凝素。
     使用体积排阻色谱评价来自 H5/B 嵌合血凝素 ( 构建体号 745) 表达的 VLP 生产。通过体积排阻色谱 (SEC) 在 SephacrylTM S-500HR 柱 (GE Healthcare Bio-Science Corp.， Piscataway， NJ， USA) 上对来自 AGL1/745 侵染植株的浓缩蛋白提取物 (1.5mL) 进行分级。 如图 16 所示， 蓝葡聚糖 (2M Da) 洗脱峰早在组分 8 中出现。将 200μL 每种 SEC 洗脱级分 中的蛋白质用丙酮沉淀法浓缩 (5 倍 ) 并用抗 B( 佛罗里达 ) 多克隆抗体进行 Western 印迹 分析 ( 图 16)， 嵌合血凝素主要出现在组分 7 中， 表明 HA 整合成高分子量结构。不希望被理 论束缚， 这表明嵌合 HA 蛋白组装成大型超结构或者其粘附到高分子量结构上。所获得的结 果表明， HA B 佛罗里达 /4/2006 胞外结构域与 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 的跨膜和胞质亚结 构域构成的嵌合 HA 组装成高分子量颗粒， 并且这些高分子量颗粒的洗脱谱与流感 VLP 的不 同。
     实施例 5 ： H5/B 嵌合血凝素 ( 构建体 747 ； 包含与 H5/Indo TDC 融合的 B/Flo HDC 和 SDC) 与 Hsp70 和 Hsp40 共表达并与信号肽修饰相组合。
     在共同待决申请 PCT/CA2009/000032 中描述了在植物中表达 Hsp40 和 Hsp70 以及 与流感血凝素共表达。植物来源的胞浆 Hsp70 和 Hsp40( 构建体号 R870) 可以与嵌合血凝 素共表达以增加它们在植物中的累积水平。用含有表达期望嵌合 HA 之表达盒的 AGL1 和 AGL1/R870 以及 AGL1/35ShcPro 的混合物 ( 比例为 1 ∶ 1 ∶ 1) 的细菌悬液农杆菌侵染本塞 姆氏烟草植物进行共表达。
     评价在塞姆氏烟草植株中与 HSP40 和 HSP70 共表达的 H5/B 嵌合血凝素 ( 融合 H5/ Indo TDC 的 B/Flo HDC 和 SDC) 的累积水平。用 AGL1/747、 AGL1/747+AGL1/443( 空载体 ) 或 AGL1/747+AGL1/R870(HSP40/HSP70) 侵染植株， 经过 6 天的孵育期后收获烟草叶。为了 确定农杆菌侵染的叶中 H5/B 嵌合 HA 的累积水平， 首先从被侵染的叶组织中提取蛋白并用 抗 B( 佛罗里达 ) 多克隆抗体进行 Western 印迹分析。在用 AGL1/747+AGL1/R870 侵染的 3 株植株的叶提取物中检测到约为 75kDa 的独特条带 ( 图 50)， 大小对应流感血凝素未切割的 HA0 形式， 而 AGL1/747+ 对照载体 (443) 侵染的 3 个植株未显示信号 ( 在所使用的暴露条件 下 )， 表明 H5/B 嵌合形式的血凝素在与 HSP40 和 HSP70 伴侣蛋白共表达时高水平累积。
     所有引用的文献均通过引用并入本文， 就如同每个具体的文献均具体和单独显示 为通过引用并入本文的一样， 并且如同它们在本文中被完全给出一样。本文对参考文献的 引用不被解释为或认为是认同这些参考文献是本发明的现有技术。
     在说明书中大量使用了一些术语， 并且提供了定义帮助理解本发明的多个方面。 在说明书中使用的实例 ( 包括术语的实例 ) 仅用作说明目的， 而不旨在限制本发明实施方 案的范围和含义。数值范围包括定义范围的数值。在说明书中， 词语 “包含” 用作开放式术 语， 基本上等同于术语 “包括但不限于” ， 词语 “含有” 具有相应的含义。
     本发明的一个或多个目前优选的实施方案已通过示例方式进行了描述。 本发明包 括基本如上文所述和参照实施例和附图的所有实施方案、 修饰和变化。对本领域技术人员 来说显然的是， 在不偏离权利要求中限定的本发明范围的前提下， 可以进行一些变化和修 饰。 这些修饰的实例包括本发明任何方面以基本相同的方法为获得相同结果而进行的已知 等价方案的替换。47CN 102482328 A
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     术语 “病毒样颗粒” (VLP) 或 “VLP” 是指自组装并包含结构蛋白 ( 如流感 HA 蛋白 或嵌合流感 HA 蛋白 ) 的结构。一般来说 VLP 和嵌合 VLP 的形态和抗原性类似于感染中产 生的病毒粒， 但是缺乏足以复制的遗传信息， 因此不具有感染性。VLP 和嵌合 VLP 可以在适 当的宿主细胞 ( 包括植物宿主细胞 ) 中生产。从宿主细胞中提取后， 在适当条件下分离并 进一步纯化后， VLP 和嵌合 VLP 可以作为完整结构被纯化。
     本发明的产生于流感来源蛋白的嵌合 VLP 或 VLP 不包含 M1 蛋白。已知 M1 蛋白结 合 RNA(Wakefield and Brownlee， 1989)， 而 RNA 是 VLP 制备时的污染物。在嵌合 VLP 产品 获得监管批准时， 不希望存在 RNA， 因此缺失 RNA 的嵌合 VLP 制剂是有利的。
     本发明的嵌合 VLP 可以在特征为缺少使蛋白质唾液酸化之能力的宿主细胞中产 生， 所述宿主细胞如植物细胞、 昆虫细胞、 真菌和其他生物 ( 包括海绵动物、 腔肠动物、 环节 动物、 节肢动物、 软体动物、 线形动物 (nemathelminthea)、 trochelmintes、 扁形动物、 毛颚 动物、 触手动物、 衣原体、 螺旋体、 革兰氏阳性细菌、 蓝细菌、 古细菌等。参见例如 Gupta 等， 1999.Nucleic Acids Research 27 ： 370-372 ； Toukach 等， 2007.NucleicAcids Research 35 ： D280-D286 ； Nakahara 等， 2008.Nucleic Acids Research 36 ： D368-D371。如本文所述 生产的 VLP 通常不含有神经氨酸酶 (NA)。然而， 如果期望获得包含 HA 和 NA 的 VLP， 可以将 NA 与 HA 共表达。
     本发明还提供包含从表达嵌合 HA 的细胞的质膜获得脂质包膜的嵌合 HA 的 VLP。 例如， 如果嵌合 HA 在基于植物的系统中表达， 那么得到的 VLP 可从该植物细胞的质膜获得 脂质包膜。
     一般而言， 术语 “脂质” 是指脂溶性的 ( 亲脂性 ) 天然分子。根据本发明的一些方 面在植物中生产的嵌合 VLP 可以与植物来源的脂质形成复合物。植物来源的脂质可以是脂 双层的形式， 并且还可以包含包裹 VLP 的包膜。 植物来源的脂质可以包含生产 VLP 之植物的 质膜脂质组分， 包括磷脂， 三、 二和单甘油酯， 以及脂溶性固醇或包含固醇的代谢物。 实例包 括磷脂酰胆碱 (PC)、 磷脂酰乙醇胺 (PE)、 磷脂酰肌醇、 磷脂酰丝氨酸、 鞘糖脂、 植物固醇或 其组合。植物来源的脂质还可称为 “植物脂质” 。植物固醇的例子包括菜油甾醇、 豆甾醇、 麦 角甾醇、 菜籽甾醇、 Δ-7- 豆甾醇、 Δ-7- 燕麦甾醇、 daunosterol、 谷甾醇， 24- 甲基胆固醇、 胆固醇或 β- 谷甾醇——参见例如， Mongrand 等， 2004。本领域技术人员应理解细胞质膜 的脂质成分可随获得细胞的细胞或生物或物种的培养或生长条件而异。一般而言， β- 谷 甾醇是最丰富的植物甾醇。
     细胞膜通常包含脂双层以及多种功能的蛋白质。 在脂双层中可发现局部集中的特 定脂质， 称为 “脂筏 (lipid raft)” 。鞘酯和固醇中富含这些脂筏微结构域。不希望受理论 限制， 脂筏可在胞吞和胞吐作用、 病毒或其他感染原的进入或逸出、 细胞间信号转导、 与细 胞或生物的其他结构组分 ( 例如细胞内和细胞外基质 ) 的相互作用中起重要作用。本发明包括包含嵌合 HA 的 VLP， 其中 HA 的亚结构域可以从可感染人的任何类型、 亚型的流感病毒中获得， 包括例如 B、 H1、 H2、 H3、 H4、 H5、 H6、 H7、 H8、 H9、 H10、 H11、 H12、 H13、 H14、 H15 和 H16 类型或亚型。在一些实施方案中， 流感病毒可以是 H1、 H3、 H5 或 B 类型或亚 型。H1、 H3、 H5 或 B 类型或亚型的非限制性例子包括 A/ 新喀里多尼亚 /20/99 亚型 (H1N1) ( “H1/NC” ； SEQ ID NO ： 56)、 H1A/ 加利福尼亚 /04/09 亚型 (H1N1)(″ H1/Cal″； SEQ ID NO ： 86)、 A/ 印度尼西亚 /5/05 亚型 (H5N1)(“H5/Indo” )、 A/ 布里斯班 /59/2007(“H1/Bri” ) 和 B/ 佛罗里达 /4/2006(“B/Flo” ) 和 H3A/ 布里斯班 /10/2007(“H3/Bri” )。并且， 嵌 合 HA 可以包含分离自一种或更多种现有或新鉴定流感病毒的一种或更多种血凝素亚结构 域， 。
     本发明还涉及感染其他哺乳动物或宿主动物的流感病毒， 所述动物如人、 灵长类、 马、 猪、 鸟类、 水禽、 候鸟、 鹌鹑、 鸭、 鹅、 家禽、 鸡、 骆驼、 犬科动物、 狗、 猫科动物、 猫、 虎、 豹、 麝 猫、 水貂、 石貂、 雪貂、 宠物、 家畜、 小鼠、 大鼠、 海豹、 鲸等。一些流感病毒可以感染超过一种 宿主动物。
     对于流感病毒， 本文所用术语 “血凝素” 或 “HA” 是指流感病毒颗粒的结构糖蛋白。 流感血凝素的结构已有深入的研究， 并且显示高度保守的二级、 三级和四级结构。即使氨 基酸序列变化仍观察到此结构保守性 ( 参见例如 Skehel 和 Wiley， 2000 Ann Rev Biochem 69 ： 531-69 ； Vaccaro 等 2005， 通过引用并入本文 )。编码 HA 的核苷酸序列是公知的并 且可获得， 参见例如 BioDefense and Public Health base( 例如 URL ： biohealthbase. org/GSearch/home.do ？ decorator ＝ Influenza) 或美国国立生物技术信息中心 (NCBI ； 参 见 URL ： ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez ？ db ＝ nuccore&cmd ＝ search&term ＝ influenza)， 两者均通过引用并入本文。
     HA 单体可进一步分为 3 个功能性结构域——茎结构域或茎结构域簇 (SDC)、 球状 头部结构域或头部结构域簇 (HDC) 和跨膜结构域簇 (TDC)。SDC 包含 4 个亚结构域， 融合 肽 F、 F’ 1 和 F’ 2( 该亚结构域一般可以称为 “骨架” )。TDC 包含两个亚结构域， 跨膜 (TmD) 和 C 端尾部 (CT)。HDC 包含三个亚结构域， 残留酯酶结构域 E1’ 和 E2 以及受体结合结构域 RB。SDC 和 HDC 可以统称为 “胞外结构域” 。Ha 等 2002(EMBO J.21 ： 865-875 ； 通过引用并入 本文 ) 发表的文献根据 X 射线结晶结构， 阐明了几个流感亚型中 SDC 和 HDC 多种亚结构域 的相对定位。图 1A 显示与 HA1 和 HA2 多肽 N 端和 C 端相关的亚结构域示意图。图 1C 提供 多种流感亚型的标示的结构比对。
     流感病毒血凝素中允许氨基酸变化。该变化提供不断被鉴定的新毒株。新毒株之 间感染性可以有差异。但是， 保持了血凝素三聚体的形成， 其随后形成 VLP。因此本发明提 供了包含嵌合 HA 的血凝素氨基酸序列或编码在植物中形成 VLP 的嵌合血凝素氨基酸序列 的核酸， 并且包括已知序列和可产生的变体 HA 序列。本发明还涉及包含 TDC、 SDC 和 HDC 的 嵌合 HA 多肽的用途。例如嵌合 HA 蛋白可以是 HA0， 或包含来自两种或更多种流感类型之 HA1 和 HA2 亚结构域的经切割嵌合 HA。嵌合 HA 蛋白可以用于使用植物或植物细胞表达系 统生产或形成 VLP。
     HA0 可以表达并折叠形成三聚体， 然后可组装成 VLP。HA0 的切割产生 HA1 和 HA2 多肽， 它们通过二硫桥连接 ( 参见图 1C、 46 和 47 对二硫桥模式的图解 )。对于感染性病毒 颗粒， 需要前体 HA0 的切割来引发 HA2 的构象变化， 该变化释放融合肽 ( 在 HA2 多肽的 N端 ) 并使其可用于融合细胞和病毒膜。但是， VLP 没有感染性， 不需要切割 HA 形成 HA1 和 HA2( 例如在疫苗生产中 )。未切割的 HA0 前体也组装成三聚体并从质膜出芽形成 VLP 纳米 颗粒。
     HA0 多肽包含几个结构域。 HDC 的 RB 亚结构域在抗原区包含几个环， 称为位点 A-E。 可以中和感染性流感病毒的抗体经常靶向一个或更多个这些位点。残留酯酶亚结构域 (E1 和 E2) 可在融合中发挥作用， 并且可结合 Ca++。F、 F’ 1 和 F’ 2 结构域相互作用并协同形成 茎， 使得 HA 三聚体的头部位于膜之上。TmD 和 CT 可参与折叠 HA 在膜上的锚定。TmD 可在 HA 对脂筏的亲和中发挥作用， 而 CT 可在 HA 的分泌中发挥作用， 并且 CT 亚结构域中存在的 一些半胱氨酸残基可是棕榈酰化的。信号肽 (SP) 还可存在于 HA0 多肽的 N 端。图 2 以及 表 4 和 5 提供了一些流感病毒亚型的 SP、 F’ 1、 F’ 2、 E1、 RB、 E2 和 F 结构域的氨基酸序列的 实例。
     在流感血凝素的表达和 / 或分泌过程中对 N 端信号肽 (SP) 序列进行加工可在 HA 折叠中发挥作用。术语 “信号肽” 一般是指通常见于血凝素多肽 N 端的短 ( 约 5-30 个氨基 酸 ) 氨基酸序列， 其可指导新翻译的多肽转位至特定细胞器， 或者辅助多肽链的特定结构 域相对于其他结构域的定位。血凝素的信号肽将蛋白质的转位靶向至内质网， 已提出该信 号肽辅助近 N 端结构域相对于新生血凝素多肽之膜锚定结构域的定位， 以辅助成熟血凝素 的切割和折叠。
     HA 在宿主细胞内质网 (ER) 膜内的插入、 信号肽切割和蛋白质糖基化是共翻译事 件。HA 的正确折叠需要蛋白质糖基化和至少 6 个链内二硫键的形成 ( 参见图 46 和 47)。 在图 46 中， 显示甲亚型 HA 的每个单体具有 6 个保守二硫桥。通过比较， B HA 的单体 ( 图 47) 具有 7 个二硫桥， 其中 5 个在甲型中有对应结构 ( 综述见 Skehel 和 Wiley， 2000.Ann Rev Biochem 69 ： 531-569 ； 在如 Gamblin 等 2004， Science 303 ： 1838-1842 中描述了阐释 分子内和分子间二硫桥和其他保守氨基酸及其相对位置的结构实例 ； 两者均通过引用并入 本文 )。本领域技术人员应理解， 重要的是制备嵌合 HA 时保证获得类似排列的二硫桥。
     信号肽可以是血凝素中天然存在的， 或者信号肽可与被表达血凝素的初级序列异 源。嵌合 HA 可以包含来自第一流感类型、 亚型或毒株的信号肽， 而其余的 HA 来自一种或多 于一种的不同流感类型、 亚型或毒株。例如 HA 亚型 B H1、 H2、 H3、 H5、 H6、 H7、 H9 或乙型流 感的天然 SP 可用于在植物系统中表达 HA。在本发明的一些实施方案中， SP 可以来自乙型、 H1、 H3 或 H5 流感 ； 或来自亚型 H1/Bri、 H1/NC、 H5/Indo、 H3/Bri 或 B/Flo。
     SP 还可以是非天然的， 例如来自非流感病毒之病毒的结构蛋白或血凝素， 或者来 自植物、 动物或细菌多肽。可以使用的信号肽的非限制性实例是苜蓿蛋白二硫键异构酶 (PDI SP ； 登记号 Z11499 的 32-103 位核苷酸 ； SEQ ID NO ： 34 ； 图 17)， 其具有氨基酸序列 ：
     MAKNVAIFGLLFSLLLLVPSQIFAEE(32-103 位核苷酸 ； SEQ ID NO ： 34)。
     因此本发明提供了包含天然或非天然信号肽的嵌合流感血凝素和编码该嵌合血 凝素的核酸。
     血凝素的正确折叠对蛋白质稳定性、 多聚体形成、 VLP 形成和 HA 的功能 ( 血细胞 凝集能力 ) 等流感血凝素特性可以是重要的。蛋白质折叠可受一个或更多个因素影响， 包 括但不限于 ： 蛋白质序列、 蛋白质相对丰度、 细胞内拥挤程度、 可与折叠的、 部分折叠的或未 折叠的蛋白质结合或瞬时联合的辅因子的可获得性、 一种或更多种伴侣蛋白的存在等。热休克蛋白 (Hsp) 或应激蛋白是伴侣蛋白的实例， 其可参与多种细胞过程， 包括 蛋白质合成、 细胞内运输、 错误折叠的防止、 蛋白质凝集的防止、 蛋白质复合物的组装和去 组装、 蛋白质折叠和蛋白质解聚。这样的伴侣蛋白的实例包括但不限于 Hsp60、 Hsp65、 Hsp 70、 Hsp90、 Hsp100、 Hsp20-30、 Hsp10、 Hsp100-200、 Hsp100、 Hsp90、 Lon、 TF55、 FKBP、 亲环蛋 白 (cyclophilin)、 ClpP、 GrpE、 泛素、 钙联蛋白 (calnexin) 和蛋白质二硫键异构酶 ( 参见 例如 Macario， A.J.L.， Cold Spring Harbor Laboratory Res.25 ： 59-70.1995 ； Parsell， D.A.&Lindquist， S.Ann.Rev.Genet.27 ： 437-496(1993) ； 美国专利 No.5,232,833)。 如本文 所述， 伴侣蛋白 ( 例如但不限于 Hsp40 和 Hsp70) 可以用于保证嵌合 HA 的折叠。
     Hsp70 的 实 例 包 括 来 自 哺 乳 动 物 细 胞 的 Hsp72 和 Hsc73、 来自细菌特别是分 枝 杆 菌 ( 如 麻 风 分 枝 杆 菌 (Mycobacterium leprae)、 结 核 分 枝 杆 菌 (Mycobacterium tuberculosis) 和牛分枝杆菌 (Mycobacterium bovis)( 例如卡介苗 (Bacille-Calmette Guerin) ： 本文中称为 Hsp71)) 的 DnaK。 来自大肠杆菌、 酵母和其他原核生物的 DnaK 以及来 自真核生物 ( 例如拟南芥 (A.thaliana)) 的 BiP 和 Grp78(Lin 等， 2001(Cell Stress and Chaperones 6 ： 201-208))。 Hsp70 的具体实例是拟南芥 Hsp70( 由 Genbank ref ： AY120747.1 编码 )。Hsp70 能够特异性地结合 ATP 以及未折叠的多肽和肽， 从而参与蛋白质折叠和去折 叠和蛋白质复合物的组装和去组装。
     Hsp40 的实例包括来自原核生物 ( 例如大肠杆菌和分枝杆菌 ) 的 DnaJ 和来自真核 生物 ( 例如苜蓿 ) 的 HSJ1、 HDJ1 和 Hsp40(Frugis 等， 1999.Plant Molecular Biology 40 ： 397-408)。Hsp40 的具体实例是紫花苜蓿 (M.sativa)MsJ1(AJ000995.1 或 SEQ ID NO ： 76)。 Hsp40 在蛋白质折叠、 耐热和 DNA 复制等细胞活动中作为分子伴侣起作用。图 41 显示编码 Msj1 的核酸序列 (SEQ ID NO ： 76)。
     在 Hsp 中， Hsp70 及其辅伴侣蛋白 (co-chaperone)Hsp40 参与合成完成前正在翻译 的和新合成的多肽的稳定。不希望受理论的限制， Hsp40 与未折叠 ( 新生或新转移的 ) 多 肽的疏水片区 (patch) 结合， 从而有利于 Hsp70-ATP 复合物与多肽的相互作用。 ATP 水解导 致多肽、 Hsp70 和 ADP 之间形成稳定的复合物并释放 Hsp40。Hsp70-ADP 复合物与多肽之疏 水片区的联合阻止其与其他疏水片区的相互作用， 防止不正确折叠和与其他蛋白质的凝集 ( 综述见 Hartl， FU.1996.Nature 381 ： 571-579)。
     天然伴侣蛋白可能能够利于低水平的重组蛋白质的正确折叠， 然而随着表达水平 的增加， 天然伴侣蛋白的丰富可成为限制因素。农杆菌浸染叶中血凝素的高水平表达可导 致血凝素多肽在胞质溶胶中累积， 而共表达一种或更多种伴侣蛋白 ( 例如 Hsp70、 Hsp40 或 者 Hsp70 和 Hsp40 两者 ) 可降低错误折叠或凝集的血凝素多肽的水平， 并且增加显示出允 许血细胞凝集和 / 或病毒样颗粒形成之三级和四级结构特性的多肽数。SEQ IDNO ： 77 是构 建体号 R850 从 HindIII( 在多克隆位点中， 启动子上游 ) 至 EcoRI( 紧邻 NOS 终止子的下游 ) 的部分核酸序列， 其编码 HSP40( 下划线 )。SEQ ID NO ： 78 是构建体号 R860 从 HindIII( 在 多克隆位点中， 启动子上游 ) 至 EcoRI( 紧邻 NOS 终止子的下游 ) 的部分核酸序列， 其编码 HSP70( 下划线 )。SEQ ID NO ： 79 是构建体号 R870 从 HindIII( 在多克隆位点中， 启动子 5’ 上游 ) 至 EcoRI( 紧邻 NOS 终止子的下游 ) 的部分核酸序列， 其编码 HSP40( 下划线， 斜体 ) 和 HSP70( 下划线 )。
     因此， 本发明还提供了在植物中生产嵌合流感 VLP 的方法， 其中编码嵌合流感 HA的第一核酸与编码伴侣蛋白的第二核酸共表达。 第一和第二核酸可以在同一步骤中引入植 物， 或者可以顺次引入植物。
     可通过例如血细胞凝集测定、 电子显微镜观察或体积排阻色谱来评估 VLP 的结构 和大小。
     对于体积排阻色谱， 可通过以下方法从植物组织中提取全部可溶性蛋白质 ： 将冷 冻粉碎的植物材料在提取缓冲液中匀浆 (Polytron)， 通过离心除去不溶性物质。用 PEG 进 行沉淀也可以是有利的。定量可溶性蛋白质， 并将提取物通过 SephacrylTM 柱。可用蓝葡聚 糖 2000 作为校准标准。在进行色谱后， 可通过免疫印迹进一步分析级分以确定级分中的蛋 白质成分。
     本发明还提供了这样的植物， 其包含编码一种或更多种嵌合流感血凝素的核酸和 编码一种或更多种伴侣蛋白的核酸。
     本发明包括核苷酸序列 ：
     SEQ ID NO ： 63( 构建体 690 ； 包含苜蓿质体蓝素启动子和 5’ UTR、 嵌合血凝素编码 序列、 苜蓿质体蓝素 3’ UTR 和终止子序列的嵌合 H5/H1 表达盒 )， SEQ ID NO ： 63 下划线部 分编码 H5/Indo 的 SP、 F’ 1、 E1-H1/Bri 的 RB-H5/Indo 的 E2、 F’ 2、 F、 TMD/CT ； SEQ ID NO ： 64( 构建体 691 ； 包含苜蓿质体蓝素启动子和 5’ UTR、 嵌合血凝素编码 序列、 苜蓿质体蓝素 3’ UTR 和终止子序列的嵌合 H5/H1 表达盒 )， SEQ ID NO ： 64 下划线部 分编码 H5/Indo 的 SP、 F’ 1-H1/Bri 的 E1、 RB、 E2-H5/Indo 的 F’ 2、 F、 TMD/CT ；
     SEQ ID NO ： 65( 构建体 696 ； 包含苜蓿质体蓝素启动子和 5’ UTR、 嵌合血凝素编码 序列、 苜蓿质体蓝素 3’ UTR 和终止子序列的嵌合 H1/H5 表达盒 )， SEQ ID NO ： 65 下划线部 分编码 PDI SP-H1/NC 的 F’ 1、 E1-H5/Indo 的 RB-H1/NC 的 E2、 F’ 2、 F、 TMD/CT ；
     SEQ ID NO ： 68( 构建体 733 ； 包含 CaMV 35S 启动子、 CPMV-HT5’ UTR、 PDI 信号肽编 码序列、 H1 型 A/ 布里斯班 /59/07(H1N1) 血凝素编码序列、 CPMV-HT 3’ UTR 和 NOS 终止子 序列的 SpPDI H1/Bri 表达盒 )， SEQ ID NO ： 68 的下划线部分编码 PDI SP-H1/BRI 的 F’ 1、 E1、 RB、 E2、 F’ 2、 F、 TMD/CT ；
     SEQ ID NO ： 69( 构建体 734 ； 包含 CaMV 35S 启动子、 CPMV-HT 5’ UTR、 嵌合血凝素 编码序列、 CPMV-HT 3’ UTR 和 NOS 终止子序列的嵌合 H5/H1 表达盒 )。嵌合 HA 的编码序列 用下划线表示， 其编码与 SEQID NO ： 63 相同的嵌合 HA ；
     SEQ ID NO ： 71( 构建体 736 ； 包含 CaMV 35S 启动子、 CPMV-HT 5’ UTR、 PDI 信号肽编 码序列、 H3 型 A/ 布里斯班 /10/07(H2N3) 血凝素编码序列、 CPMV-HT 3’ UTR 和 NOS 终止子 序列的 HA 表达盒 )， SEQ ID NO ： 71 的下划线部分编码 PDI SP-H3/Bri 的 F’ 1、 E1、 RB、 E2、 F’ 2、 F、 TMD/CT ；
     SEQ ID NO ： 72( 构建体 737 ； 包含 CaMV 35S 启动子、 CPMV-HT 5’ UTR、 嵌合血凝素 编码序列、 CPMV-HT 3’ UTR 和 NOS 终止子序列的嵌合 H5/H3 表达盒 )， SEQ ID NO ： 72 下划 线部分编码 PDI SP-H5/Indo 的 F’ 1、 E1、 RB、 E2、 F’ 2、 F、 TMD/CT ；
     SEQ ID NO ： 74( 构建体 739 ； 包含 CaMV 35S 启动子、 CPMV-HT 5’ UTR、 PDI 信号肽 编码序列、 HA 型 B/ 佛罗里达 /4/06 的血凝素编码序列、 CPMV-HT 3’ UTR 和 NOS 终止子序列 的 HA 表达盒 )， SEQ ID NO ： 74 的下划线部分编码 PDI SP-B/Flo 的 F’ 1、 E1、 RB、 E2、 F’ 2、 F、 TMD/CT ；
     SEQ ID NO ： 75( 构建体 734 ； 包含 CaMV 35S 启动子、 CPMV-HT 5’ UTR、 嵌合血凝素 编码序列、 CPMV-HT 3’ UTR 和 NOS 终止子序列的嵌合 H5/B 表达盒 )， SEQ ID NO ： 75 下划线 部分编码 PDI SP-B/Flo 的 F’ 1、 E1、 RB、 E2、 F’ 2、 F-H5/Indo 的 TND/CT。
     本发明还包括在严格杂交条件下与任一 SEQ ID NO ： 63-65、 68、 69 和 71-75 下划线 部分杂交的核苷酸序列。本发明还包括在严格杂交条件下与任一 SEQ ID NO ： 63-65、 68、 69 和 71-75 下划线部分的互补序列杂交的核苷酸序列。这些与 SEQ ID NO ： 63-65、 68、 69 和 71-75 下划线部分或 SEQ ID NO ： 63-65、 68、 69 和 71-75 下划线部分的互补序列杂交的核苷 酸序列编码嵌合血凝素蛋白， 其表达形成嵌合 VLP， 并且当施用给对象时， 嵌合 VLP 诱导抗 体产生。例如， 所述核苷酸序列在植物细胞内表达形成嵌合 VLP， 所述嵌合 VLP 可用于产生 能结合 HA( 包括一种或更多种流感类型或亚型的成熟 HA、 HA0、 HA1 或 HA2) 的抗体， 当施用 给对象时， 所述 VLP 诱导免疫应答。
     严 格 杂 交 条 件 下 的 杂 交 是 本 领 域 已 知 的 ( 参 见 例 如 Current Protocols in Molecular Biology， Ausubel 等 编， 1995 及 增 刊 ； Maniatis 等， Molecular Cloning(A Laboratory Manual)， Cold Spring Harbor Laboratory， 1982 ； Sambrook 和 Russell， Molecular Cloning ： A Laboratory Manual， 第 3 版， 2001 ； 每个均通过引用并入本文 )。一 种该严格杂交条件的实例可以是在 65℃下于 4×SSC 中杂交约 16-20 小时， 然后在 65℃下 于 0.1×SSC 中清洗 1 小时， 或在 65℃下于 0.1×SSC 中清洗两次 ( 每次 20 或 30 分钟 )。或 者， 一个示例性严格杂交条件可以是在 42℃下于 50％甲酰胺， 4×SSC 中过夜 (16 ～ 20 小 时 )， 然后在 65℃下于 0.1×SSC 中清洗 1 小时， 或在 65℃下于 0.1×SSC 中清洗 2 次 ( 每 次 20 或 30 分钟 )， 或者过夜 (16 ～ 20 小时 )， 或者在 65℃下于 Church 水性磷酸盐缓冲液 (7％ SDS ； 0.5M NaPO4 缓冲液 pH 7.2 ； 10mM EDTA) 中杂交， 在 50℃下于 0.1×SSC， 0.1％ SDS 中清洗 2 次 ( 每次 20 或 30 分钟 )， 或者在 65℃下于 2×SSC， 0.1％ SDS 中清洗 2 次 ( 每次 20 或 30 分钟 )。
     此外， 本发明包括这样的核苷酸序列， 其特征为与编码任一 SEQ ID NO ： 63、 SEQ ID NO ： 64、 SEQ ID NO ： 65、 SEQ ID NO ： 68、 SEQ ID NO ： 69、 SEQ ID NO ： 71、 SEQ ID NO ： 72、 SEQ ID NO ： 74、 SEQ ID NO ： 75 下划线部分之嵌合 HA 的核苷酸序列有约 70％、 75％、 80％、 85％、 87 ％、 90 ％、 91 ％、 92 ％、 93 ％、 94 ％、 95 ％、 96 ％、 97 ％、 98 ％、 99 ％、 100 ％或其间任意量的序 列同一性或序列相似性， 其中该核苷酸序列编码血凝素蛋白， 其在表达时形成嵌合 VLP， 该 嵌合 VLP 诱导抗体产生。 例如， 所述核苷酸序列在植物细胞内表达形成嵌合 VLP， 该嵌合 VLP 可用于产生能结合 HA( 包括成熟 HA、 HA0、 HA1 或 HA2) 的抗体， 当施用给对象时， 所述 VLP 诱 导免疫应答。
     “免疫应答” 一般是指获得性免疫系统的应答。获得性免疫系统通常包括体液应答 和细胞介导的应答。体液应答是由 B 淋巴细胞谱系的细胞 (B 细胞 ) 产生的分泌抗体所介 导的免疫方面。分泌抗体结合入侵微生物 ( 例如病毒或细菌 ) 表面上的抗原， 标示它们以 进行破坏。体液免疫一般是指抗体产生和伴随其的过程， 以及抗体的效应物功能， 包括 Th2 细胞活化和细胞因子产生、 记忆细胞形成、 调理素促进胞吞作用、 病原体清除等。术语 “调 节” 是指根据通常知晓或使用的任意测定法 ( 其中一些在本文中举例说明 ) 测定的特定应 答或参数的升高或降低。
     细胞介导的应答是这样的免疫应答， 其不涉及抗体， 而涉及巨噬细胞、 自然杀伤细胞 (NK)、 抗原特异性细胞毒性 T 淋巴细胞的活化， 以及多种细胞因子应答于抗原的释放。 细 胞介导的免疫一般指一些 Th 细胞的活化、 Tc 细胞的活化和 T 细胞介导的应答。细胞介导 的免疫在对病毒感染的应答中尤为重要。
     例如， 可使用 ELISPOT 测定来测量对抗原特异性 CD8 阳性 T 淋巴细胞的诱导 ； 可使 用增殖测定来测量对 CD4 阳性 T 淋巴细胞的刺激。可使用 ELISA 测定来定量抗流感病毒抗 体的效价 ； 还可使用抗同种型抗体 ( 例如抗 IgG、 抗 IgA、 抗 IgE 或抗 IgM) 来测量抗原特异 性或交叉反应性抗体的同种型。实施这些测定的方法和技术是本领域公知的。
     血细胞凝集抑制 (HI 或 HAI) 测定也可用于证明由疫苗或疫苗组合物诱导的抗体 的效力， 所述疫苗或疫苗组合物包含可抑制由重组 HA 所致之红血细胞 (RBC) 凝集的嵌合 HA 或嵌合 VLP。血清样品的血细胞凝集抑制性抗体效价可通过微量滴定 HAI 来评估 (Aymard 等， 1973)。可使用任何来自几个物种的红细胞， 例如马、 火鸡、 鸡等。该测定给出有关 HA 三 聚体在 VLP 表面上组装的间接信息， 证实 HA 抗原位点的正确展示。
     交叉反应性 HAI 滴定还可用于证明免疫应答对与疫苗亚型相关的其他病毒株的 效力。例如， 可以在 HAI 测定中将用包含嵌合血凝素 ( 包含第一流感类型或亚型的 HDC) 之 疫苗组合物免疫的对象的血清与第二株全病毒或病毒颗粒一起使用， 并且测定 HAI 效价。
     不希望受理论限制， HA 结合来自不同动物之 RBC 的能力是由 HA 对 α2， 3 或 α2， 6 键合唾液酸的亲和力以及这些唾液酸在 RBC 表面上的存在来驱动的。马和禽类的流感病 毒 HA 使来自所有几个物种 ( 包括火鸡、 鸡、 鸭、 豚鼠、 人、 绵羊、 马和牛 ) 的红细胞凝集 ； 而人 HA 结合火鸡、 鸡、 鸭、 豚鼠、 人和绵羊的红细胞 (Ito T. 等， 1997， Virology， 卷 227， 493-499 ； 以及 Medeiros R 等， 2001， Virology， 卷 289， 74-85)。
     细胞因子的存在或水平也可以被定量。例如， 用 ELISA( 例如 BD Biosciences OptEIA 试剂盒 ) 测量 IFN-γ 和 IL-4 分泌细胞来表征 T 辅助细胞应答 (Th1/Th2)。 可培养从 对象得到的外周血单核细胞 (PBMC) 或脾细胞， 并分析上清。还可使用标志物特异性荧光标 记和本领域已知方法， 通过荧光激活细胞分选 (fluorescence-activated cell sorting， FACS) 对 T 淋巴细胞定量。
     还可进行微量中和测定来表征对象中的免疫应答， 参见例如 Rowe 等， 1973 的方 法。可通过几种方法得到病毒中和效价， 包括 ： 1) 在对细胞进行结晶紫固定 / 着色之后， 计 数裂解斑 ( 空斑测定 ) ； 2) 显微镜观察培养物中的细胞裂解 ； 3) 对 NP 病毒蛋白 ( 与病毒感 染宿主细胞有关 ) 进行 ELISA 和分光光度检测。
     序列同一性或序列相似性可利用序列比较程序来确定， 例如 DNASIS 所提供的 ( 例 如， 使用但不限于下述参数 ： 空隙罚分 5、 顶部对角线数 (#of top diagonal)5、 固定的空 隙罚分 10、 k 元祖 2、 游隙 10， 窗口大小 5)。然而， 其他用于比较的序列比对方法是本领域 熟知的， 例如 Smith&Waterman 算法 (1981， Adv.Appl.Math.2 ： 482)、 Needleman&Wunsch 算 法 (J.Mol.Biol.48 ： 443， 1970)、 Pearson&Lipman 算法 (1988， Proc.Nat’ l.Acad.Sci.USA 85 ： 2444)， 以及这些算法的计算机执行 ( 例如 GAP、 BESTFIT、 FASTA 和 BLAST(Altschul 等， 1990.J.Mol Biol 215 ： 403-410))， 或者通过人工比对和目视检查。可以对核酸或氨 基酸序列进行比较或比对， 并使用任何现有技术已知的几种软件包测定共有序列， 例如 MULTALIN(Corpet F.， 1988， Nucl Acids Res.， 16(22)， 10881-10890)、 BLAST、 CLUSTAL 等 ； 或者可以人工比对序列并确定序列间的相似度和差异。蛋白质、 融合蛋白或多肽的片段或部分包含含有特定蛋白质或多肽之一部分氨基 酸组成的肽或多肽， 前提是在表达时所述片段可形成嵌合 VLP。 例如所述片段可以包含抗原 性区域、 应激应答诱导区域或含有蛋白质或多肽之功能性结构域的区域。所述片段还可包 含同一总家族的蛋白质共有的区域或结构域， 或者片段可包含足以特异性鉴定其来源全长 蛋白质的氨基酸序列。
     例如， 片段或部分可包含蛋白质全长的约 60％至约 100％或其间任意量， 前提是 在表达时该片段可形成嵌合 VLP。例如， 蛋白质全长的约 60 ％至约 100 ％、 约 70 ％至约 100％、 约 80％至约 100％、 约 90％至约 100％、 约 95％至约 100％， 或其间任意量。或者， 根 据嵌合 HA， 片段或部分可以为约 150 至约 500 个氨基酸或其间任意量， 前提是在表达时所 述片段可形成嵌合 VLP。例如， 根据嵌合 HA， 片段或部分可以为约 150 至约 500 个氨基酸或 其间任意量、 约 200 至约 500 个氨基酸或其间任意量、 约 250 至约 500 个氨基酸或其间任意 量、 约 300 至约 500 个氨基酸或其间任意量、 约 350 至约 500 个氨基酸或其间任意量、 约 400 至约 500 个氨基酸或其间任意量、 约 450 至约 500 个氨基酸或其间任意量， 前提是在表达时 片段可形成嵌合 VLP。例如， 可从嵌合 HA 蛋白的 C 端、 N 端或者 N 和 C 两端去除约 5、 10、 20、 30、 40 或 50 个氨基酸或其间任意量， 前提是在表达时所述片段可形成嵌合 VLP。
     任意给定序列中的氨基酸编号是相对于该特定序列的， 然而， 本领域技术人员可 根据结构和 / 或序列容易地确定序列中特定氨基酸的 “等同性” 。例如， 如果去除了 6 个 N 端氨基酸， 那么这将改变氨基酸的具体编码标识 ( 例如， 相对于蛋白质全长而言 )， 但是不 会改变结构中氨基酸的相对位置。
     本发明描述了 ( 但不限于 ) 在植物、 植物部分或植物细胞中编码嵌合 HA 的核酸的 表达， 以及适于生产疫苗的植物中生产嵌合流感 VLP。这些核酸的实例包括但不限于， 例如 SEQ ID NO ： 63、 SEQ ID NO ： 64、 SEQ ID NO ： 65、 SEQ ID NO ： 68、 SEQ ID NO ： 69、 SEQ ID NO ： 71、 SEQ ID NO ： 72、 SEQ ID NO ： 74、 SEQ ID NO ： 75。
     本发明还提供了在植物、 植物部分或植物细胞中表达编码嵌合 HA 的核酸 ( 例如但 不限于 SEQ ID NO ： 63、 SEQ ID NO ： 64、 SEQ ID NO ： 65、 SEQ ID NO ： 68、 SEQ ID NO ： 69、 SEQ ID NO ： 71、 SEQ ID NO ： 72、 SEQID NO ： 74、 SEQ ID NO ： 75)， 以及在转化的植物细胞中生产包 含重组流感结构蛋白的候选流感疫苗或试剂， 所述重组流感结构蛋白自组装成功能性和免 疫原性的同型大分子蛋白结构， 包括亚病毒流感颗粒和嵌合流感 VLP。
     因此， 本发明提供了嵌合 VLP， 和通过表达单个嵌合包膜蛋白在植物表达系统中生 产嵌合 VLP 的方法。
     编码流感亚型嵌合 HA 的核酸 ( 例如 SEQ ID NO ： 63、 SEQ ID NO ： 64、 SEQ ID NO ： 65、 SEQ ID NO ： 68、 SEQ ID NO ： 69、 SEQ ID NO ： 71、 SEQ ID NO ： 72、 SEQ ID NO ： 74、 SEQ ID NO ： 75) 可以通过使用 HA RNA 通过反转录和聚合酶链式反应 (PCR) 合成。例如， 可以从 H1/ NC、 H1/Bri、 H3/Bri、 B/Flo 或 H5/Indo 中或者从感染了这些或其他流感病毒类型或亚型的 细胞中分离 RNA。对于反转录和 PCR， 可以使用 HA RNA 特异性寡核苷酸引物。另外， 编码嵌 合 HA 的核酸可以使用本领域技术人员已知的方法化学合成。
     本发明还涉及包含编码嵌合 HA 之核酸 ( 如上所述， 其与在植物中有效的调控元件 有效连接 ) 的基因构建体。在植物细胞中有效并可用于本发明的调控元件的实例包括但 不限于质体蓝素调控区 (US 7,125,978 ； 其通过引用并入本文 ) 或核酮糖 1， 5- 二磷酸羧化酶 / 加氧酶 (RuBisCO ； US4,962,028 ； 其通过引用并入本文 )、 叶绿素 a/b 结合蛋白 (CAB ； Leutwiler 等 ； 1986 ； 其通过引用并入本文 )、 ST-LS1( 与光系统 II 的放氧复合物相关， 描述 于 Stockhaus 等 1987、 1989 中 ； 其通过引用并入本文 ) 的调控区。
     本发明的基因构建体还包含组成型启动子， 其指导与启动子有效连接的基因在植 物各部分中表达并在整个植物发育过程中持续表达。 组成型启动子的一个非限制性的实例 是与 CaMV 35S 转录本相关的组成型启动子 ( 例如， Odell 等， 1985， Nature， 313 ： 810-812， 通过引用并入本文 )。
     包含质体蓝素调控区的序列的实例是 SEQ ID NO ： 58 的序列 5’端至编码 PDI 信号肽的下划线序列。调控元件或调控区可增强与其有效连接的核苷酸序列的翻译， 其 中核苷酸序列可编码蛋白质或多肽。调控区的另一实例是源自豇豆花叶病毒 (Cowpea Mosaic Virus， CPMV) 非翻译区的调控区， 其可用于优先翻译与其有效连接的核苷酸序 列。这一 CPMV 调控区用于可过量翻译的 CMPV-HT 系统中， 参见例如 Sainsbury 等， 2008， Plant Physiology 148 ： 1212-1218 ； Sainsbury 等， 2008 Plant BiotechnologyJournal 6 ： 82-92， 两者均通过引用并入本文 )。
     因此， 本发明的一方面提供了包含与编码嵌合流感 HA 之序列有效连接的调控区 的核酸。所述调控区可以是质体蓝素调控元件， 所述嵌合流感 HA 可包含来自 H5/Indo、 H1/ Bri、 H3/Bri、 H1/NC、 B/Flo 流感类型、 亚型或毒株的亚结构域。包含质体蓝素调控元件和嵌 合流感 HA 的核酸序列在本文中通过 SEQ ID NO ： 63 和 64 示例。包含 35S 调控元件和嵌合 流感 HA 的核酸序列在本文中通过 SEQ ID NO ： 68、 69 和 71-75 示例。
     在另一方面， 本发明提供包含 CPMV 调控区和嵌合流感 HA( 包含来自 H5/Indo、 H1/ Bri、 H3/Bri、 H1/NC、 B/Flo 流感类型、 亚型或毒株的亚结构域 ) 的核酸。包含 CPMP 调控元 件和嵌合 HA 的核酸序列在本文中通过 SEQ ID NO ： 66-69 和 71-75 示例。
     在植物中产生的嵌合流感 VLP 从质膜中出芽， 因而嵌合 VLP 的脂质组成反映产生 它们的植物细胞或植物组织类型。根据本发明生产的 VLP 包含两种或多于多种类型或亚型 流感的嵌合 HA， 其与植物来源的脂质复合。植物脂质可刺激特异免疫细胞并增强所诱导的 免疫应答。
     植物脂质如 PC( 磷脂酰胆碱 ) 和 PE( 磷脂酰乙醇胺 ) 以及鞘糖脂可结合哺乳动物 免疫细胞 ( 例如抗原呈递细胞 (APC)， 如树突状细胞和巨噬细胞 ) 和其他细胞 ( 包括胸腺和 肝脏中的 B 淋巴细胞和 T 淋巴细胞 ) 表达的 CD1 分子。( 综述见 Tsuji M.2006 Cell Mol Life Sci 63 ： 1889-98)。CD1 分子在结构上与主要组织相容性复合体 (MHC)I 类分子相似， 其作用是将糖脂抗原呈递给 NKT 细胞 ( 自然杀伤 T 细胞 )。活化后， NKT 细胞激活固有免疫 细胞 ( 例如 NK 细胞和树突状细胞 ) 并且还激活获得性免疫细胞 ( 例如产生抗体的 B 细胞 和 T 细胞 )。
     存在于与脂双层 ( 例如质膜来源的包膜 ) 复合之流感 VLP 中的植物固醇可提供有 利的疫苗组合物。不希望受理论限制， 与脂双层 ( 例如质膜来源的包膜 ) 复合的由植物生 产的 VLP( 包括包含嵌合 HA 的 VLP) 比在其他表达系统中制得的 VLP 可诱导更强的免疫反 应， 并且可与由活或减毒全病毒疫苗所诱导的免疫反应相似。
     因此， 在一些实施方案中， 本发明提供了与植物来源的脂双层复合的 VLP( 包含嵌 合 HA)。在一些实施方案中， 所述植物来源的脂双层可包括 VLP 的包膜。在植物内生产的 VLP 可包含含有植物特异性 N- 聚糖的嵌合 HA。 因此， 本发明还提 供了包含具有植物特异性 N- 聚糖的嵌合 HA 的 VLP。
     此外， 植物中 N- 聚糖的修饰是已知的 ( 参见例如 WO 2008/151440 ； 其通过引用并 入本文 )， 并且可产生含有经修饰 N- 聚糖的嵌合 HA。可得到包含经修饰糖基化模式 ( 例如 岩藻糖基化减少、 木糖基化减少、 或岩藻糖基化和木糖基化二者均减少 ) 之 N- 聚糖的 HA， 或 者可得到含有经修饰糖基化模式的嵌合 HA， 其中蛋白质缺少岩藻糖基化、 木糖基化或两者 皆缺少， 并包含增加的半乳糖基化。此外， 与表达嵌合 HA 的野生型植物相比， 翻译后修饰的 调节 ( 例如末端添加半乳糖 ) 可导致所表达嵌合 HA 的岩藻糖基化和木糖基化降低。
     例如 ( 但不视为限制 )， 合成具有经修饰糖基化模式的嵌合 HA 可通过使目的蛋白 质与编码 β-1， 4- 半乳糖基转移酶 (GalT)( 例如但不限于哺乳动物 GalT 或人 GalT， 然而 也可以使用其他来源的 GalT) 的核苷酸序列共表达来实现。还可将 GalT 的催化结构域与 N- 乙酰氨基葡萄糖基转移酶 (GNT1) 的 CTS 结构域 ( 即胞质尾、 跨膜结构域、 茎区 ) 融合以 产生 GNT1-GalT 杂合酶， 并且该杂合酶可与 HA 共表达。HA 还可与编码 N- 乙酰氨基葡萄糖 基转移酶 III(GnT-III)( 例如但不限于哺乳动物 GnT-III 或人 GnT-III， 还可使用其他来源 的 GnT-III) 的核苷酸序列共表达。另外， 还可使用包含与 GnT-III 融合的 GNT1 之 CTS 的 GNT1-GnT-III 杂合酶。
     因此， 本发明还包括含有嵌合 HA 的 VLP， 所述嵌合 HA 具有经修饰的 N- 聚糖。
     不希望受理论限制， 嵌合 HA 上存在的植物 N- 聚糖可通过促进抗原呈递细胞与 HA 的结合来刺激免疫应答。Saint-jore-Dupas 等 (Trends Biotechnol 25 ： 317-23， 2007) 已 提出使用植物 N 聚糖来刺激免疫应答。此外， VLP 的构象对于抗原呈递可以是有利的， 并且 当与植物来源的脂质层复合时增强 VLP 的佐剂作用。
     “调控区” 、 “调控元件” 或 “启动子” 是指通常 ( 但不总是 ) 位于基因的蛋白质编码 区上游的一部分核酸， 其可由 DNA 或 RNA 或者 DNA 和 RNA 两者构成。当调控区有活性并与 目的基因有效相连或有效连接时， 可导致目的基因的表达。 调控元件可以介导器官特异性， 或控制发育基因或时序基因的活化。 “调控区” 包括启动子元件、 显示启动子基础活性的核 心启动子元件、 可响应于外部刺激而被诱导的元件、 介导启动子活性的元件 ( 例如负调控 元件或转录增强子 )。本文所用的 “调控区” 还包括在转录后具有活性的元件， 例如调节基 因表达的调控元件， 例如翻译增强子和转录增强子、 翻译抑制子和转录抑制子、 上游激活序 列和 mRNA 不稳定性决定子 (mRNA instability determinant)。这后几种元件中有几种可 位于编码区附近。
     在本公开内容中， 术语 “调控元件” 或 “调控区” 一般是指通常 ( 但不总是 ) 位于 结构基因编码序列上游 (5’ ) 的 DNA 序列， 其通过提供转录在特定位点起始所需的 RNA 聚合 酶和 / 或其他因子的识别来控制编码区表达。 然而， 应当理解的是， 位于内含子中或序列 3’ 的其他核苷酸序列也可对调控目的编码区的表达有贡献。为确保在特定位点起始而为 RNA 聚合酶或其他转录因子提供识别的调控元件的一个实例是启动子元件。大多数 ( 但不是全 部 ) 真核生物启动子元件包含 TATA 盒， 其是由腺苷和胸苷核苷酸碱基对组成的保守核酸序 列， 通常位于转录起始位点上游约 25 个碱基对处。启动子元件包含负责起始转录的基础启 动子元件以及调节基因表达的其他调控元件 ( 如上文所述 )。
     存在几种类型的调控区， 包括受发育调节的、 诱导型的或组成型的调控区。 受发育调节的调控区或对所控制基因的差异性表达进行控制的调控区在特定器官或器官之组织 中、 在该器官或组织发育过程的特定时间被活化。 然而， 受发育调节的一些调控区也可偏好 性地在某些器官或组织的特定发育阶段具有活性， 它们还可以以受发育调节的方式具有活 性， 或在植物的其他器官或组织内为基础水平。组织特异性调控区 ( 例如参见特异性调控 区 ) 的实例包括 napin 启动子和 cruciferin 启动子 (Rask 等， 1998， J.Plant Physiol.152 ： 595-599 ； Bilodeau 等， 1994， Plant Cell 14 ： 125-130)。叶特异性启动子的实例包括质体 蓝素启动子 ( 参见例如 SEQ ID NO ： 58) ； US 7,125,978， 其通过引用并入本文。
     诱导型调控区是能够响应于诱导物而直接或间接激活一种或更多种 DNA 序列或 基因之转录的调控区。当不存在诱导物时， DNA 序列或基因不会被转录。通常， 特异性结合 诱导型调控区以激活转录的蛋白因子可以以无活性形式存在， 然后被诱导物直接或间接转 化成活性形式。然而， 也可以不存在蛋白因子。诱导物可以是化学剂， 例如蛋白质、 代谢物、 生长调节剂、 除草剂或酚类化合物， 或通过热、 冷、 盐或毒性元素直接施加的生理压力， 或通 过病原体或致病剂 ( 例如病毒 ) 的作用间接施加的生理压力。可通过向细胞或植物外部施 加诱导物 ( 例如通过喷洒、 浇水、 加热或类似方法 ) 使含有诱导型调控区的植物细胞暴露于 诱导物。 诱导型调控元件可来源于植物基因或非植物基因 ( 例如 Gatz， C. 和 Lenk， I.R.P.， 1998， Trends Plant Sci.3， 352-358， 其通过引用并入本文 )。可用的诱导型启动子的实例 包括但不限于四环素诱导型启动子 (Gatz， C.， 1997， Ann.Rev.Plant Physiol.Plant Mol. Biol.48， 89-108， 其通过引用并入本文 )、 类固醇诱导型启动子 (Aoyama， T. 和 Chua， N.H.， 1997， Plant J.2， 397-404， 其通过引用并入本文 ) 和乙醇诱导型启动子 (Salter， M.G 等， 1998， Plant Journal 16， 127-132 ； Caddick， M.X. 等， 1998， Nature Biotech.16， 177-180， 其通过引用并入本文 )、 细胞分裂素诱导型 IB6 和 CKI1 基因 (Brandstatter， I. 和 Kieber， J.J.， 1998， Plant Cell 10， 1009-1019 ； Kakimoto， T.， 1996， Science 274， 982-985， 其 通过引用并入本文 ) 以及生长素诱导型元件 DR5(Ulmasov， T. 等， 1997， Plant Cell 9， 1963-1971， 其通过引用并入本文 )。
     组成型调控区指导基因在植物各部分表达并在整个植物发育过程中持续表达。 已 知的组成型调控元件的实例包括与以下相关的启动子 ： CaMV 35S 转录本 (Odell 等， 1985， Nature， 313 ： 810-812)、 水稻肌动蛋白 1(Zhang 等， 1991， Plant Cell， 3： 1155-1165)、 肌动 蛋白 2(An 等， 1996， Plant J.， 10 ： 107-121) 或 tms 2(U.S.5,428,147， 其通过引用并入本 文 ) 以及磷酸丙糖异构酶 1 基因 (Xu 等， 1994， Plant Physiol.106 ： 459-467)、 玉米泛素 1 基 因 (Cornejo 等， 1993， Plant Mol.Biol.29 ： 637-646)、 拟南芥泛素 1 和 6 基因 (Holtorf 等， 1995， Plant Mol.Biol.29 ： 637-646)、 烟草翻译起始因子 4A 基因 (Mandel 等， 1995， Plant Mol.Biol.29 ： 995-1004)。本文所用的术语 “组成型” 不一定指受所述组成型调控区控制的 基因在所有细胞类型中以相同水平表达， 而是指基因在多种细胞类型中表达， 尽管常常观 察到不同的丰度。 组成型调控元件可与其他序列偶联以进一步增强与其有效连接之核苷酸 序列的转录和 / 或翻译。例如， CMPV-HT 系统源自豇豆花叶病毒 (CPMV) 的非翻译区， 并显 示增强相关编码序列的翻译。
     “天然” 是指核酸或氨基酸序列是天然存在的， 或 “野生型” 。
     “有效连接” 是指特定序列 ( 例如调控元件与目的编码区 ) 直接或间接地相互作用 以实现预定功能 ( 例如介导或调节基因表达 )。例如有效连接的序列之间的相互作用可通过与所述有效连接之序列相互作用的蛋白质来介导。
     本发明的一种或更多种核苷酸序列可在被本发明核苷酸序列、 或构建体或载体转 化的任意合适的植物宿主中表达。合适宿主的实例包括但不限于农作物， 包括苜蓿、 油菜、 芸苔属 (Brassica spp.)、 玉米、 烟草属 (Nicotiana spp.)、 苜蓿、 马铃薯、 人参、 豌豆、 燕麦、 水稻、 大豆、 小麦、 大麦、 向日葵、 棉花等。
     本发明的一种或更多种嵌合基因构建体还可包含 3’ 非翻译区。3’ 非翻译区是指 这样的基因部分， 其包含含有多腺苷酸化信号和能够影响 mRNA 加工或基因表达之任意其 他调控信号的 DNA 区段。多腺苷酸化信号的特征一般在于向 mRNA 前体的 3’ 端添加多腺苷 酸链。多腺苷酸化信号常通过存在经典形式 5’ AATAAA-3’ 的同源物来鉴定， 但是也会出现 变体。
     合适的 3’ 区的非限制性实例是含有以下基因的多腺苷酸化信号的 3’ 转录的非翻 译区 ： 农杆菌致瘤 (Ti) 质粒基因 ( 例如胭脂氨酸合酶 (Nos 基因 )) 以及植物基因 ( 例如大 豆贮藏蛋白基因 )、 核酮糖 -1， 5- 二磷酸羧化酶的小亚基基因 (ssRUBISCO ； US 4,962,028， 其通过引用并入本文 )、 用于调节质体蓝素表达的启动子 ( 描述于 US 7,125,978( 其通过引 用并入本文 ))。 本发明的一种或更多种嵌合基因构建体还可以进一步包括增强子， 根据需要可以 是翻译或转录增强子。增强子可以位于被转录序列的 5’ 或 3’ 。增强子区域是本领域技术 人员公知的， 并且可包括 ATG 起始密码子、 邻近序列等。如果存在起始密码子， 则其可在编 码序列的读码框的相 (phase) 中 (“框内” (“in frame” ))， 以提供转录序列的正确翻译。
     为了帮助鉴定转化的植物细胞， 可进一步处理本发明的构建体使其包含植物选择 标记。可用的选择标记包括提供针对化学品 ( 例如抗生素， 如庆大霉素、 潮霉素、 卡那霉素 ； 或除草剂， 如膦丝菌素 (phosphinothrycin)、 草甘膦、 氯磺隆等 ) 的抗性的酶。 类似地， 可使 用产生可通过颜色变化进行鉴定之化合物的酶 ( 例如 GUS(β- 葡萄糖醛酸酶 )) 或提供发 光的酶 ( 如萤光素酶或 GFP)。
     认为是本发明一部分的还有包含本发明嵌合基因构建体的转基因植物、 植物细胞 或种子。由植物细胞再生完整植物的方法也是本领域已知的。一般而言， 将转化植物细胞 培养在合适的培养基中， 所述培养基可包含选择剂 ( 例如抗生素 )， 其中使用选择标记以帮 助鉴定转化的植物细胞。愈伤组织形成后， 可根据已知方法应用合适的植物激素来促进芽 的形成， 将芽移至生根培养基中以再生植物。然后， 通过种子或利用植物无性繁殖技术， 植 物可用于建立可重复的世代。还可以不使用组织培养物来形成转基因植物。
     认为是本发明一部分的还有包含嵌合基因构建体的转基因植物、 树木、 酵母、 细 菌、 真菌、 昆虫和动物细胞， 所述嵌合基因构建体含有编码本发明之用于产生 VLP 的重组嵌 合 HA 或 HA0 的核酸。
     为了在多种可用于转化或瞬时表达的宿主生物中表达， 还可以将本发明的调控元 件与目的编码区相组合。这样的生物包括但不限于植物 ( 单子叶植物和双子叶植物 )， 例 如但不限于玉米、 谷类植物、 小麦、 大麦、 燕麦、 烟草属、 芸苔属、 大豆、 菜豆、 豌豆、 苜蓿、 马铃 薯、 番茄、 人参和拟南芥。
     用于这些生物的稳定转化和再生的方法已在本领域中建立并且是本领域技术人 员已知的。获得转化植物和再生植物的方法对本发明来说不是关键的。
    
     “转化” 是指表现为基因型、 表型或二者兼有的遗传信息 ( 核苷酸序列 ) 在种间转移。 遗传信息从嵌合构建体向宿主的种间转移可以是可遗传的并且认为遗传信息的转移是 稳定的， 或者转移可以是瞬时的并且遗传信息的转移是不可遗传的。
     术语 “植物物质” 是指来源于植物的任何材料。 植物物质可包括完整植物、 组织、 细 胞或其任意部分。此外， 植物物质可包括细胞内植物组分、 细胞外植物组分、 植物的液体或 固体提取物或者其组合。此外， 植物物质可包括来自植物叶、 茎、 果实、 根或其组合的植物、 植物细胞、 组织、 液体提取物或其组合。 植物物质可包括未进行任何处理步骤的植物或其部 分。植物的一部分可包含植物物质。然而， 还考虑可对所述植物材料施加下定义的最少处 理步骤或更严格的处理， 包括使用本领域公知的技术 ( 包括但不限于色谱、 电泳等 ) 进行部 分或大量蛋白质纯化。
     术语 “最少处理” 是指部分纯化包含目的蛋白的植物物质 ( 例如植物或其部分 ) 以 得到植物提取物、 匀浆、 植物匀浆的级分等 ( 即最少处理 )。部分纯化可包括但不限于破坏 植物细胞结构从而产生含有可溶性植物组分和不溶性植物组分的组合物， 不溶性植物组分 可通过例如但不限于离心、 过滤或其组合进行分离。 在此方面， 可使用真空或离心提取容易 地获得叶或其他组织的细胞外间隙中分泌的蛋白质， 或可以通过穿过滚轴或研磨等在压力 下进行组织提取， 从而将蛋白从细胞外间隙中挤压或释放。最少处理还可包括制备可溶性 蛋白质的粗提物， 因为这些制备物中将具有可忽略的来自次级植物产物的污染。 另外， 最少 处理可包括从叶中水性提取可溶性蛋白质， 然后用任意合适的盐进行沉淀。其他方法可包 括大规模的浸渍和汁液提取， 以允许直接使用提取物。
     可将植物物质 ( 形式为植物材料或组织 ) 经口递送给对象。植物物质可作为膳食 补充剂的一部分与其他食物一起施用， 或者被装入胶囊中。植物物质或组织还可以被浓缩 以改善或增进适口性， 或者按照需要与其他材料、 成分或药物赋形剂一起提供。
     可施用本发明 VLP 的对象或目标生物的实例包括但不限于人、 灵长类、 鸟类、 水 禽、 候鸟、 鹌鹑、 鸭、 鹅、 家禽、 鸡、 猪、 绵羊、 马科动物、 马、 骆驼、 犬科动物、 狗、 猫科动物、 猫、 虎、 豹、 麝猫、 水貂、 石貂、 雪貂、 宠物、 家畜、 兔、 小鼠、 大鼠、 豚鼠或其他啮齿动物、 海豹、 鲸 等。这些目标生物是示例性的， 并且不视为限制本发明的应用和用途。
     考虑根据需要和情形， 以多种方式将含有本发明一些实施方式的嵌合 HA 或表达 含有本发明一些实施方式之嵌合 HA 的 VLP 的植物施用给对象或目标生物。例如， 可在使用 之前将得自植物的嵌合 HA 以粗提物、 部分纯化或纯化的形式被提取。如果嵌合 HA 是至少 部分纯化的， 那么其可以在可食用植物或不可食用植物中产生。此外， 如果经口施用嵌合 HA， 则可以收集植物组织并直接给对象食用， 或者可在食用之前干燥收集的组织， 或者可以 不预先收集而使动物在植物上进食。 认为在本发明范围内的还有将收集的植物组织作为动 物饲料的食物补充剂。如果向动物饲喂的植物组织不进行或几乎不进行进一步处理， 则优 选所施用的植物组织是可食用的。
     转录后基因沉默 (PTGS) 可参与限制转基因在植物中的表达， 来自马铃薯 Y 病毒的 沉默抑制子 (HcPro) 的共表达可用于抵抗转基因 mRNA 的特异性降解 (Brigneti 等， 1998)。 可替代的沉默抑制子是本领域熟知的， 并且可如本文所述使用 (Chiba 等， 2006， Virology 346 ： 7-14， 其 通 过 引 用 并 入 本 文 )， 例 如 但 不 限 于 TEV-p1/HC-Pro( 烟 草 蚀 纹 病 毒 -p1/ HC-Pro)、 BYV-p21、 番茄丛矮病毒的 p19(TBSV p19)、 番茄皱缩病毒的衣壳蛋白 (TCV-CP)、 黄瓜花叶病毒的 2b(CMV-2b)、 马铃薯 X 病毒的 p25(PVX-p25)、 马铃薯 M 病毒的 p11(PVM-p11)、 马铃薯 S 病毒的 p11(PVS-p11)、 蓝莓枯黄病毒的 p16(BScV-p16)、 柑橘衰退病毒 (Citrus tristexa virus) 的 p23(CTV-p23)、 葡萄卷叶相关病毒 -2 的 p24(GLRaV-2 p24)、 葡萄病 毒 A 的 p10(GVA-p10)、 葡萄病毒 B 的 p14(GVB-p14)、 白芷潜伏性病毒 (Heracleum latent virus) 的 p10(HLV-p10) 或大蒜普通潜伏性病毒的 p16(GCLV-p16)。因此， 沉默抑制子 ( 例 如但不限于 HcPro、 TEV-p1/HC-Pro、 BYV-p21、 TBSV p19、 TCV-CP、 CMV-2b、 PVX-p25、 PVM-p11、 PVS-p11、 BScV-p16、 CTV-p23、 GLRaV-2p24、 GBV-p14、 HLV-p10、 GCLV-p16 或 GVA-p10) 可与 编码目的蛋白的核酸序列共表达以进一步确保在植物中生产高水平的蛋白质。
     此外， 如本文所述生产的 VLP 不包含神经氨酸酶 (NA)。然而， 如期望包含 HA 和 NA 的 VLP， 可以将 NA 与 HA 共表达。
     因此， 本发明还包括合适的载体， 其含有适用于稳定或瞬时表达系统中的嵌合 HA 序列。还可在一种或多于一种的构建体中提供遗传信息。例如， 可将编码目的蛋白的核苷 酸序列引入一种构建体， 将编码修饰目的蛋白糖基化之蛋白质的第二核苷酸序列引入单独 的构建体中。然后， 可将这些核苷酸序列在植物中共表达。然而， 也可使用这样的构建体， 其包含编码目的蛋白和修饰目的蛋白糖基化之蛋白质两者的核苷酸序列。在此情形中， 核 苷酸序列将包含第一序列和第二序列， 所述第一序列包含与启动子或调控区有效连接的编 码目的蛋白的第一核酸序列， 所述第二序列包含编码修饰目的蛋白糖基化模式之蛋白质的 第二核酸序列， 该第二核酸序列与启动子或调控区有效连接。
     “共表达” 是指两种或两种以上核苷酸序列大致同时在植物中以及在植物的同一 组织中表达。然而， 核苷酸序列不必严格地同时表达。而是两种或更多种核苷酸序列的表 达方式使得所编码产物有机会相互作用。例如， 修饰目的蛋白糖基化的蛋白质可在目的蛋 白表达前或表达期间表达， 使得发生对目的蛋白的糖基化修饰。可使用瞬时表达系统共表 达两种或两种以上的核苷酸序列， 其中所述两种或更多种序列大致同时在适于这两种序列 表达的条件下被引入植物中。或者， 可以用编码目的蛋白的额外序列以瞬时或稳定方式转 化含有核苷酸序列之一 ( 例如编码修饰目的蛋白糖基化模式的蛋白质的序列 ) 的平台植物 (platform plant)。在此情形中， 编码修饰目的蛋白糖基化模式之蛋白质的序列可在期望 的发育阶段表达在期望的组织内表达， 或者可使用诱导型启动子诱导其表达， 而编码目的 蛋白的额外序列可在相似条件下在同一组织内表达， 以确保核苷酸序列的共表达。
     可使用 Ti 质粒、 Ri 质粒、 植物病毒载体、 直接 DNA 转化、 显微注射、 电穿孔、 侵染等 将本发明的构建体引入植物细胞中。这些技术的综述参见例如 Weissbach 和 Weissbach， Methods for Plant Molecular Biology， Academy Press， 纽约 VIII， 421-463 页 (1988) ； Geierson 和 Corey， Plant Molecular Biology， 第 2 版 (1988) 以 及 Miki 和 Iyer， Fundamentals of Gene Transfer in Plants.Plant Metabolism，第 2 版， DT.Dennis， DH Turpin， DD Lefebrve， DB Layzell( 编 )， Addison Wesly， Langmans Ltd.London， 561-579 页 (1997)。其他方法包括直接 DNA 摄取、 使用脂质体、 电穿孔 ( 例如使用原生质 体 )、 显微注射、 微弹 (microprojectile) 或 whisker 以及真空侵染。参见例如 Bilang 等 (Gene 100 ： 247-250(1991))、 Scheid 等 (Mol.Gen.Genet.228 ： 104-112， 1991)、 Guerche 等 (Plant Science 52 ： 111-116， 1987)、 Neuhause 等 (Theor.Appl Genet.75 ： 30-36， 1987)、 Klein 等， Nature 327 ： 70-73(1987)、 Howell 等 (Science 208 ： 1265， 1980)、 Horsch 等(Science 227 ： 1229-1231， 1985)、 DeBlock 等， Plant Physiology 91 ： 694-701， 1989)、 Liu 和 Lomonossoff(J.Virol Meth， 105 ： 343-348， 2002) ； 美国专利 No.4,945,050 ； 5,036,006 ； 5,100,792 ； 6,403,865 ； 5,625,136( 所有这些文献均通过引用并入本文 )。
     可使用瞬时表达法表达本发明的构建体 ( 参见 Liu 和 Lomonossoff， 2002， Journal of Virological Methods， 105 ： 343-348， 其通过引用并入本文 )。或者， 可使用基于真空的 瞬时表达法， 如 Kapila 等 1997 Plant Science 122 ： 101-108( 其通过引用并入本文 ) 所 述。这些方法可包括， 例如但不限于农杆菌接种法或农杆菌侵染法， 然而， 也可使用如上文 所述的其他瞬时方法。使用农杆菌接种法或农杆菌侵染时， 含有期望核酸的农杆菌混合物 进入组织 ( 例如叶、 植物的地上部分 ( 包括茎、 叶和花 )、 植物的其他部分 ( 茎、 根、 花 ) 或整 个植株 ) 的细胞间隙中。穿过表皮后， 农杆菌感染细胞并将 t-DNA 拷贝移至细胞中。t-DNA 以附加体形式转录并且 mRNA 被翻译， 使目的蛋白在感染细胞中产生， 然而， t-DNA 在核内的 传代是瞬时的。
     本发明提供的包含嵌合 HA 的 VLP 可与现有流感疫苗组合使用， 以补充所述疫苗使 其更加有效， 或降低所需的施用剂量。 如本领域技术人员所已知的， 疫苗可针对一种或更多 种流感病毒。 合适的疫苗的实例包括但不限于从 Sanofi-Pasteur、 ID Biomedical、 Merial、 Sinovac、 Chiron、 Roche、 MedImmune、 GlaxoSmithKline、 Novartis、 Sanofi-Ayentis、 Serono、 Shire Pharmaceuticals 等购得的疫苗。
     如期望， 可将本发明的 VLP 与本领域技术人员已知的合适佐剂混合。此外， VLP 可 用于疫苗组合物， 其含有用于治疗上述靶标生物的有效剂量 VLP。此外， 根据本发明生产的 VLP 可与使用不同流感蛋白质 ( 例如神经氨酸酶 (NA)) 得到的 VLP 相组合。
     因此， 本发明提供了用于诱导动物或靶标生物中针对流感病毒感染的免疫的方 法， 其包括施用有效剂量的疫苗， 所述疫苗含有一种或多于一种 VLP。疫苗可经口、 皮内、 鼻 内、 肌内、 腹腔内、 静脉内或皮下施用。
     本发明多个实施方案的组合物可包含两种或更多种流感毒株或亚型的 VLP。 “两种 或更多种” 是指两种、 三种、 四种、 五种、 六种、 七种、 八种、 九种、 十种或更多种毒株或亚型。 所示毒株或亚型可以是单一亚型 ( 例如， 所有都为 H1N1， 或所有都为 H5N1)， 或者可以是亚 型的组合。示例性亚型和毒株包括 H5/Indo、 H1/Bri、 H1/NC、 H3/Bri、 B/Flo。对毒株和亚 型之组合的选择可取决于对象可能暴露于流感的地区， 动物物种 ( 例如水禽类、 农业动物 ( 例如猪 ) 等 ) 与待免疫人群的接近程度以及所述动物物种携带、 暴露于或可能暴露于的 毒株， 对亚型或毒株内抗原漂移的预测， 或者这些因素的组合。 过去几年所使用的组合的实 例可见于世界卫生组织 (WHO) 保存的数据库 ( 见 URL ： who.int/csr/dieease/influenza/ vaccine recommendations1/en)。
     两种或更多种 VLP 可单独表达， 随后将纯化的或半纯化的 VLP 相组合。或者， VLP 可在同一宿主 ( 例如植物、 植物部分或植物细胞 ) 中共表达。VLP 可以期望的比例 ( 例如大 致相等的比例 ) 组合或生产， 或者可以组合以使一种亚型或毒株占组合物中 VLP 的大部分。
     因此， 本发明提供了包含两种或更多种毒株或亚型的 VLP 的组合物。
     还提供了包含包装材料和包含含有嵌合 HA 之 VLP 的组合物的产品。该组合物包 含生理上或药理上可接受的赋形剂， 包装材料可以包含标明组合物活性成分 ( 例如 VLP) 的 标签。还提供了包含组合物的试剂盒， 所述组合物包含编码本文所述嵌合 HA 之核酸以 及使用该核酸生产嵌合 HA 或包含嵌合 HA 的 VLP 的说明书。该试剂盒可用于生产包含嵌合 HA 的 VLP， 说明书可以包括， 例如在植物或植物细胞中表达核酸的信息， 从植物或植物组织 中收获和获得 VLP 的说明。
     在另一个实施方案中， 提供了用于制备药物的试剂盒， 其包含含有嵌合 HA 的 VLP 及其使用说明书。说明书可以包含制备药物的一系列步骤， 药物可用于在施用对象中诱导 治疗性或预防性免疫应答。 该试剂盒还可包含说明剂量浓度、 剂量间隔、 优选施用方法等的 说明书。
     本发明将通过下面的实施例更详细的说明。但是应当理解， 这些实施例仅用于说 明的目的， 不应以任何方式用于限制本发明的范围。
     本文描述的序列汇总如下。
    
    
    材料与方法
     1.HA 表达盒的组装
     A-pCAMBIAPlasto
     使用 Sambrook 和 Russell(2001 ； 其通过引用并入本文 ) 的一般分子生物学方案 完成所有操作。表 1 显示用于表达盒组装的寡核苷酸引物。第一个克隆步骤是组装受体 质粒， 其包含苜蓿质体蓝素基因的上游和下游调控元件。使用寡核苷酸引物 XmaI-pPlas. c(SEQ ID NO ： 1) 和 SacI-ATG-pPlas.r(SEQ ID NO ： 2) 从苜蓿基因组 DNA 中扩增质体蓝 素启动子和 5’ UTR 序列。所得扩增产物用 XmaI 和 SacI 消化并与预先经同样的酶消化的 pCAMBIA2300(Cambia， Canberra， Australia) 连接， 以形成 pCAMBIApromoPlasto。类似地， 使用引物 SacI-PlasTer.c(SEQ ID NO ： 3) 和 EcoRI-PlasTer.r(SEQ ID NO ： 4) 从苜蓿基因 组 DNA 中扩增质体蓝素基因的 3’ UTR 序列和终止子， 所得产物用 SacI 和 EcoRI 消化， 然后 插入到 pCAMBIApromoPlasto 的相同位点中， 以形成 pCAMBIAPlasto。
     B-Plasto- 天然 SP-H5A/ 印度尼西亚 /5/05( 构建体号 660)
     Epoch Biolabs(Sugar Land， TX， USA) 合 成 了 编 码 流 感 毒 株 A/ 印 度 尼 西 亚 /5/05(H5N1 ； 登录号 LANL ISDN125873) 之血凝素的片段。所产生的包含完整 H5 编码区 的片段示于 (SEQ ID NO ： 52， 图 17)， 该编码区包含天然信号肽， 其侧翼为紧邻起始 ATG 上 游 的 HindIII 位 点 以 及 紧 邻 终 止 密 码 子 (TAA) 下 游 的 SacI 位 点。 通 过 Darveau 等 (1995) 所示的基于 PCR 的连接方法将 H5 编码区克隆到基于质体蓝素的表达盒中。简 言 之， 使 用 引 物 Plato-443c(SEQ ID NO ： 5) 和 SpHA(Ind)-Plasto.r(SEQ ID NO ： 6)， 以 pCAMBIApromoPlasto 作为模板进行第一 PCR 扩增。平行地， 使用引物 Plasto-SpHA(SEQ ID NO ： 7) 和 HA(Ind)-Sac.r(SEQ ID NO ： 8)， 以 H5 编码片段 (SEQ ID NO ： 52 ； 图 17) 作为模板 进行第二扩增。 将由两个反应得到的扩增物混合， 将混合物作为模板， 使用 Plato-443c(SEQ ID NO ： 5) 和 HA(Ind)-Sac.r(SEQ ID NO ： 8) 作 为 引 物 进 行 第 三 反 应 ( 组 装 反 应 )。 用 BamHI( 在质体蓝素启动子中 ) 和 SacI( 在片段的 3’ 端 ) 消化所得片段， 并将其克隆到预先 用相同酶消化的 pCAMBIAPlasto 中。所得质粒称为 660， 其示于图 18 中 (SEQ ID NO ： 53)。
     C-Plasto-PDI SP-H1A/ 新喀里多尼亚 /20/99( 构建体号 540)
     将流感毒株 A/ 新喀里多尼亚 /20/99(H1N1)H1 基因的开放阅读框合成为两个片段 (Plant Biotechnology Institute， National Research Council， Saskatoon， Canada)。 所 合成的第一片段对应于缺少 5’ 端信号肽编码序列和 3’ 端跨膜结构域编码序列的野生型 H1 编码序列 (GenBank 登录号 AY289929 ； SEQ ID NO ： 54 ； 图 19)。片段的 5’ 端由编码 PDISP 的 末端核苷酸 ( 含有 BglII 限制性位点 ) 构成， 并且将 SacI/StuI 双位点添加在紧邻该片段 3’ 端终止密码子下游， 得到 SEQ ID NO ： 55( 图 20)。还合成了编码 H1 蛋白 C 端 ( 包含跨膜 结构域和胞质尾 ) 的第二片段， 其从 KpnI 位点至终止密码子， 其 3’ 侧翼是 SacI 和 StuI 限 制性位点 (SEQ ID NO.56 ； 图 21)。
     第一 H1 片段用 BglII 和 SacI 消化， 并克隆到含有质体蓝素启动子和 5’ UTR( 与苜 蓿蛋白质二硫键异构酶 (PDI) 基因 (32-103 位核苷酸 ； 登录号 Z11499 ； SEQ ID NO ： 57 ； 图
     22) 的信号肽融合 ) 之二元载体 (pCAMBIAPlasto) 的同样位点中， 得到位于质体蓝素调控 元件的下游的 PDI-H1 嵌合基因。基于质体蓝素的表达盒序列示于 SEQ ID NO.58( 图 23)， 其含有启动子和 BglII 限制性位点上游的 PDI 信号肽， 以及 SacI 位点下游的质体蓝素终止 子。通过将预先用 KpnI 和 SacI 消化的合成片段 (SEQ ID NO ： 56 ； 图 21) 插入到 H1 表达质 粒中来添加 H1 编码区的 C 端 ( 编码跨膜结构域和胞质尾 )。所得构建体称为 540， 其示于 SEQ ID NO.59( 图 24)。
     D-Plasto- 天然 SP-H1A/ 布里斯班 /59/07( 构建体号 774)
     按照下列步骤组装指导 A/ 布里斯班 /59/07 的 H1 表达的表达盒号 774。合成包含 完整血凝素编码序列 ( 从 ATG 到终止 ) 的合成片段， 其 3’ 侧翼是对应于质体蓝素 ATG 上游 前 84 个核苷酸以 DraIII 限制性位点起始的的苜蓿质体蓝素基因序列。该合成片段还包含 紧邻终止密码子下游的 SacI 位点。
     合成片段由 Top Gene Technologies(Montreal， QC， Cahada) 合成。所合成的片段 示于 SEQ ID NO.60( 图 25)。对于完整表达盒的组装， 将合成片段用 DraIII 和 SacI 消化并 克隆到预先用同样的酶消化的 pCAMBIAPlasto 中， 得到构建体 774(SEQ ID NO.61 ； 图 26)。
     E-CPMV HT-LC C51( 构建体号 828)
     CPMV-HT 表达盒使用 35S 启动子来控制包含目的编码序列之 mRNA 的表达， 目的编 码序列的 5′侧翼为来自豇豆花叶病毒 (CPMV)RNA2 的 1-512 位核苷酸 ( 其在 115 和 161 位 具有突变的 ATG) 并且 3′侧翼为来自 CPMV RNA2 的 3330-3481 位核苷酸 ( 对应于 3′ UTR) 和其后的 NOS 终止子。使用质粒 pBD-C5-1LC(Sainsbury 等， 2008 ； Plant Biotechnology Journal 6 ： 82-92 以及 PCT 公开 WO 2007/135480) 来组装基于 CPMV-HT 的血凝素表达盒。 使用基于 PCR 的连接方法 (Darveau 等， Methods in Neuroscience 26 ： 77-85(1995)) 实现 CPMV RNA2 第 115 和 161 位的 ATG 的突变。 使用 pBD-C5-1LC 作为模板进行两个单独的 PCR。 用于第一扩增的引物是 pBinPlus.2613c(SEQ ID NO ： 9) 和 Mut-ATG115.r(SEQ ID NO ： 10)。 用于第二扩增的引物是 Mut-ATG161.c(SEQ ID NO ： 11) 和 LC-C5-1.110r(SEQ ID NO ： 12)。 将 获得的两片段混合， 并用作使用引物 pBinPlus.2613c(SEQ ID NO ： 9) 和 LC-C5-1.110r(SEQ ID NO ： 12) 之第三扩增的模板。所得片段用 PacI 和 ApaI 消化， 并克隆至用同样的酶消化 的 pBD-C5-1LC 中。所得构建体称为 828， 其示于图 27 中 (SEQ ID NO ： 62)。
     F-H5A/ 印度尼西亚 /5/05 骨架中的 H1A/ 布里斯班 /59/07 受体结合 (RB) 结构域 ( 构建体号 690)
     使用 Darveau 等 (Methods in Neuroscience 26 ： 77-85(1995)) 报道的基于 PCR 连接方法， 用 H1A/ 布里斯班 /59/07 的 RB 结构域替换 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 中的 RB 结 构域来制备嵌合 HA。在第一轮 PCR 中， 将质体蓝素启动子区段融合到天然信号肽上， 使用 引物 Plasto-443c(SEQ ID NO ： 5) 和 E1H1B-E1H5I.r(SEQ ID NO ： 13)， 以构建体号 660(SEQ ID NO ： 53， 图 18) 为模板扩增 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 的 F’ 1 和 E1 结构域。使用引物 E1 H5N-E1 H1B.c(SEQ ID NO ： 14) 和 E2 H5I-RB H1B.r(SEQ ID NO ： 15)， 以构建体号 774(SEQ ID NO ： 61 ； 图 26) 为模板扩增含有 H1A/ 布里斯班 /59/07 之 RB 结构域编码序列的第二片 段。使用引物 RBH1B-E2 H5I.c(SEQ ID NO ： 16) 和 HA(Ind)-SacI.r(SEQ ID NO ： 8)， 以构 建体号 660(SEQ ID NO 53 ； 图 18) 为模板扩增含有 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 的 E2、 F’ 2、 F、 跨膜和胞质结构域的第三片段。然后混合扩增产物， 并用作使用引物 Plasto-443c(SEQ IDNO ： 5) 和 HA(Ind)-SacI.r(SEQ ID NO ： 8) 之第二轮扩增 ( 组装反应 ) 的模板。所得片段用 BamHI( 在质体蓝素启动子中 ) 和 SacI( 在终止密码子后 ) 消化， 并克隆进预先用同样的限 制性酶消化的构建体号 660(SEQ ID NO ： 53 ； 图 18) 中， 得到构建体号 690(SEQ ID NO ： 63)。 该构建体示于图 28 中。
     G-H5A/ 印度尼西亚 /5/05 骨架中的 H1A/ 布里斯班 /59/07 酯酶和受体结合结构域 (E1-RB-E2)( 构建体号 691)
     使用 Darveau 等 (Methods in Neuroscience 26 ： 77-85(1995)) 报道的基于 PCR 连接方法， 用 H1A/ 布里斯班 /59/07 的 E1-RB-E2 结构域替换 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 中的 E1-RB-E2 结构域来组装嵌合 HA。在第一轮 PCR 中， 将质体蓝素启动子区段融合到天然信号 肽上， 使用引物 Plasto-443c(SEQ ID NO ： 5) 和 E1H1B-F’ 1H5I.r(SEQ ID NO ： 17)， 以构建体 号 660(SEQ ID NO ： 53， 图 18) 为模板扩增 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 的 F’ 1 结构域。平行地， 扩增其他两个片段。使用引物 F’ 1H5N-E1H1B.c(SEQ ID NO ： 18) 和 F’ 2H5I-E2H1B.r(SEQ ID NO ： 19)， 以构建体号 774(SEQ ID NO ： 61 ； 图 26) 为模板扩增含有 H1A/ 布里斯班 /59/07 之 E1-RB-E2 结构域编码序列的第二片段。对于第三片段， 使用引物 E2H1B-F’ 2H5I.c(SEQ ID NO ： 20) 和 HA(Ind)-SacI.r(SEQ ID NO ： 8)， 以构建体号 660(SEQ ID NO 53 ； 图 18) 为 模板扩增 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 的 F’ 2、 F、 跨膜和胞质结构域。然后混合扩增产物， 并用 作使用引物 Plasto-443c(SEQ ID NO ： 5) 和 HA(Ind)-SacI.r(SEQ ID NO ： 8) 之第二轮扩增 ( 组装反应 ) 的模板。所得片段用 BamHI( 在质体蓝素启动子中 ) 和 SacI( 在终止密码子 后 ) 消化， 并克隆进预先用同样的限制性酶消化的构建体号 660(SEQ ID NO ： 53 ； 图 18) 中， 得到构建体号 691(SEQ ID NO ： 64)。该构建体示于图 29 中。
     H-H1A/ 新喀里多尼亚 /20/99 骨架中的 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 受体结合 (RB) 结 构域 ( 构建体号 696)
     使用 Darveau 等 (Methods in Neuroscience 26 ： 77-85(1995)) 报道的基于 PCR 连接方法， 用 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 的 RB 结构域替换 H1A/ 新喀里多尼亚 /20/99 中的 RB 结构域来制备嵌合 HA。在第一轮 PCR 中， 将质体蓝素启动子区段融合到苜蓿蛋白二硫键异 构酶信号肽 (PDISP ； 登录号 Z11499， SEQ ID NO ： 57 第 32-103 位核苷酸 ； 图 22) 上， 使用引 物 Plasto-443c(SEQ ID NO ： 5) 和 E1H5I-E1H1NC.r(SEQ ID NO ： 21)， 以构建体号 540(SEQ ID NO ： 59， 图 24) 为模板扩增 H1A/ 新喀里多尼亚 /20/99 的 F’ 1 和 E1 结构域。使用引物 E1H1NC-E1H5I.c(SEQ ID NO ： 22) 和 E2H1NC-RB H5I.r(SEQ ID NO ： 23)， 以构建体号 660(SEQ ID NO ： 53 ； 图 18) 为模板扩增含有 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 之 RB 结构域编码序列的第二片 段。 使用引物 RB H5I-E2 H1NC.c(SEQ ID NO ： 24) 和 HA-SacI.r(SEQID NO ： 25)， 以构建体号 F’ 2、 F、 跨膜 540(SEQ ID NO ： 59 ； 图 24) 为模板扩增含有 H1A/ 新喀里多尼亚 /20/99 的 E2、 和胞质结构域的第三片段。然后混合扩增产物， 并用作使用引物 Plasto-443c(SEQ ID NO ： 5) 和 HA-SacI.r(SEQ ID NO ： 25) 之第二轮扩增 ( 组装反应 ) 的模板。所得片段用 BglII 和 SacI 消化， 并克隆至预先用同样的限制性酶消化的构建体号 540(SEQ ID NO ： 59， 图 24) 中， 获得构建体号 696(SEQ ID NO ： 65)。该构建体示于图 30 中。
     I- 将 H1A/ 布里斯班 /59/2007 组装进 CPMV-HT 表达盒 ( 构建体号 732)
     按照以下所述将来自 H1A/ 布里斯班 /59/2007 的 HA 编码序列克隆进 CPMV-HT 中。 通过使用构建体号 774(SEQ ID NO ： 61 ； 图 26) 作为模板， 用引物 ApaI-H1B.c(SEQ ID NO ：26) 和 StuI-H1B.r(SEQ ID NO ： 27) 进行 PCR 扩增， 从而将限制性位点 ApaI( 紧邻 ATG 上游 ) 和 StuI( 紧邻终止密码子下游 ) 添加至血凝素编码序列中。所得片段用 ApaI 和 StuI 限制 性酶消化， 并克隆至用同样的酶消化的构建体号 828(SEQ ID NO ： 62， 图 27) 中。所得的盒 称为构建体号 732(SEQ ID NO ： 66， 图 31)。
     J- 将 SpPDI-H1A/ 布里斯班 /59/2007 组装进 CPMV-HT 表达盒 ( 构建体号 733)
     按照以下所述将编码苜蓿蛋白二硫键异构酶信号肽的序列 (PDISP ； SEQ ID NO ： 57 第 32-103 位核苷酸， 图 22 ； 登录号 Z11499) 与来自 A/ 布里斯班 /59/2007 之 H1 的 HA0 编码 序列融合， 并将所得片段克隆至 CPMV-HT 中。 通过使用构建体 774(SEQ ID NO ： 61， 图 26) 作 为模板， 用引物 SpPDI-H1B.c(SEQ ID NO ： 28) 和 SacI-H1B.r(SEQ ID NO ： 29) 扩增得到 H1 编码序列。所得片段在 H1 编码序列 5’ 侧翼为编码 PDISP 的最后几个核苷酸 ( 包含 BglII 限制性位点 )， 3’ 侧翼为 SacI 限制性位点。将该片段用 BglII 和 SacI 消化， 并克隆至预先 用同样的限制性酶消化的构建体号 540(SEQ ID NO ： 59， 图 24) 中。称为构建体号 787(SEQ ID NO 67) 的中间盒编码序列显示于图 32 中。通过使用构建体号 787(SEQ ID NO ： 67 ； 图 32) 作为模板， 用引物 ApaI-SpPDI.c(SEQ ID NO ： 30) 和 StuI-H1B.r(SEQ ID NO ： 27) 进行 PCR 扩增， 从而将限制性位点 ApaI( 紧邻 ATG 上游 ) 和 StuI( 紧邻终止密码子下游 ) 添加 至血凝素编码序列中。所得片段用 ApaI 和 StuI 限制性酶消化， 并克隆至用同样的酶消化 的构建体号 828(SEQ ID NO ： 62， 图 27) 中。所得的盒称为构建体号 733(SEQ ID NO ： 68， 图 33)。
     K- 在 CPMV-HT 表达盒中组装 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 骨架中的 H1A/ 布里斯班 /59/07 受体结合 (RB) 结构域 ( 构建体号 734)
     按 照 以 下 所 述 将 嵌 合 HA 的 编 码 序 列 ( 在 H5A/ 印 度 尼 西 亚 /5/05 骨 架 中 具 有 H1A/ 布 里 斯 班 /59/07 的 RB 结 构 域 ) 克 隆 到 CPMV-HT 中。 通 过 使 用 构 建 体 690(SEQ ID NO ： 63 ； 图 28) 作 为 模 板， 用 引 物 ApaI-H5(A-Indo).1c(SEQ ID NO ： 31) 和 H5(A-Indo)-StuI.1707r(SEQ ID NO ： 32) 进行 PCR 扩增， 从而将限制性位点 ApaI( 紧邻 ATG 上游 ) 和 StuI( 紧邻终止密码子下游 ) 添加至嵌合血凝素编码序列中。所得片段用 ApaI 和 StuI 限制性酶消化， 并克隆至用同样的酶消化的构建体号 828(SEQ ID NO ： 62， 图 27) 中。 所得的盒称为构建体号 734(SEQ ID NO ： 69， 图 34)。
     L- 将 SpPDI-H3A/ 布里斯班 /10/2007 组装进 CPMV-HT 表达盒 ( 构建体号 736)
     按照以下所述将编码苜蓿 PDI 信号肽的序列与来自 H3A/ 布里斯班 /10/2007 的 HA0 融合， 并克隆至 CPMV-HT 中。首先， 合成包含完整血凝素编码序列 ( 从 ATG 到终止 ) 的 合成片段， 其 3’ 侧翼是对应于质体蓝素 ATG 上游前 84 个核苷酸 ( 以 DraIII 限制性位点起 始 ) 的苜蓿质体蓝素基因序列。该合成片段还包含紧邻终止子之后的 SacI 位点。合成片 段由 TopGene Technologies(Montreal， QC， Canada) 合成。所合成的片段示于 SEQ ID NO ： 70( 图 35)， 并进一步用作基于 PCR 的连接的模板。
     其次， 按照以下所述将苜蓿蛋白二硫键异构酶 (PDISP)( 核苷酸 32-103 ； 登录号 Z11499 ； SEQ ID NO ： 57 ； 图 22) 信号肽与紧邻 ATG 上游的 ApaI 限制性位点和终止密码子下 游的 StuI 限制性位点一起连接到来自 A/ 布里斯班 /10/2007 之 H3 的 HA0 编码序列上。使 用 Darveau 等 (Methods in Neuroscience 26 ： 77-85(1995)) 报道的基于 PCR 的连接方法， 将 PDISP 与 H3 编码序列连接。在第一轮 PCR 中， 使用引物 ApaI-SpPDI.c(SEQ ID NO ： 30)和 H3B-SpPDI.r(SEQ ID NO ： 33)， 以构建体 540(SEQ ID NO ： 59 ； 图 24) 为模板扩增 PDISP 信号肽。平行地， 使用引物 SpPDI-H3B.c(SEQ ID NO ： 34) 和 StuI-H3B.r(SEQ ID NO ： 35)， 以先前合成的片段 (SEQ ID NO ： 70 ； 图 35) 为模板扩增含有 H3A/ 布里斯班 /10/2007 部分 编码序列 ( 从密码子 17 到终止密码子 ) 的另一片段。然后混合扩增产物， 并用作使用引 物 ApaI-SpPDI.c(SEQ ID NO ： 30) 和 StuI-H3B.r(SEQ ID NO ： 35) 之第二轮扩增 ( 组装反 应 ) 的模板。所得片段用 ApaI 和 StuI 限制性酶消化， 并克隆至用同样的酶消化的构建体 号 828(SEQ ID NO ： 62， 图 27) 中。所得的盒称为构建体号 736(SEQ ID NO ： 71， 图 36)。
     M- 在 CPMV-HT 表 达 盒 中 组 装 嵌 合 SpPDI-H3A/ 布 里 斯 班 /10/2007( 胞 外 结 构 域 )+H5A/ 印度尼西亚 /5/2005(TmD+Cyto tail)( 构建体号 737)
     按照以下所述将编码苜蓿 PDI 信号肽的序列融合到 H3A/ 布里斯班 /10/2007 胞外 结构域和 H5A/ 印度尼西亚 /5/2005 的跨膜和胞质结构域上， 并克隆到 CPMV-HT 中。使用 Darveau 等 (Methods in Neuroscience 26 ： 77-85(1995)) 报道的基于 PCR 的连接方法， 将 PDISP-H3 编码序列与 H5 跨膜结构域融合。在第一轮 PCR 中， 通过使用引物 ApaI-SpPDI. c(SEQ ID NO ： 30) 和 TmD H5I-H3B.r(SEQ ID NO ： 36)， 以构建体号 736(SEQ ID NO ： 71 ； 图 36) 为模板扩增产生包含 PDISP 信号肽和 H3 布里斯班胞外结构域的片段。平行地， 使 用 引 物 H3B-TmD H5I.c(SEQ ID NO ： 37) 和 H5(A-Indo)-StuI.1707r(SEQ ID NO ： 32)， 以 构建体号 660(SEQ ID NO ： 53 ； 图 18) 为模板扩增含有 H5 印度尼西亚之跨膜和胞质结构 域的另一片段。然后混合扩增产物， 并用作使用引物 ApaI-SpPDI.c(SEQ ID NO ： 30) 和 H5(A-Indo)-StuI.1707r(SEQ ID NO ： 32) 之第二轮扩增 ( 组装反应 ) 的模板。所得片段用 ApaI 和 StuI 限制性酶消化， 并克隆至用同样的酶消化的构建体号 828(SEQ ID NO ： 62， 图 27) 中。所得的盒称为构建体号 737(SEQ ID NO ： 72， 图 37)。
     N- 将 SpPDI-HA B/ 佛罗里达 /4/2006 组装进 CPMV-HT 表达盒 ( 构建体号 739)
     按照以下所述将编码苜蓿 PDI 信号肽的序列与来自 HA B/ 布里斯班 /4/2006 的 HA0 融合， 并克隆至 CPMV-HT 中。首先， 合成包含完整血凝素编码序列 ( 从 ATG 到终止 ) 的 合成片段， 其 3’ 侧翼是对应于质体蓝素 ATG 上游前 84 个核苷酸 ( 以 DraIII 限制性位点起 始 ) 的苜蓿质体蓝素基因序列。合成片段还包含紧邻终止密码子之后的 SacI 限制性位点。 该合成片段由 Epoch Biolabs(Sugar Land， Texas， USA) 合成。所合成的片段示于 SEQ ID NO73( 图 38)， 并进一步用作基于 PCR 的连接的模板。
     其次， 按照以下所述将苜蓿蛋白二硫键异构酶 (PDISP)(SEQ ID NO ： 57 核苷酸 32-103 位 ； 图 22 ； 登录号 Z11499) 信号肽与紧邻上游 ATG 的 ApaI 限制性位点和终止密码 子下游的 StuI 限制性位点一起连接到来自 B/ 佛罗里达 /4/2006 之 HA 的 HA0 编码序列上。 使用 Darveau 等 (Methods in Neuroscience 26 ： 77-85(1995)) 报道的基于 PCR 的连接方 法， 将 PDISP 与 HA 编码序列连接。在第一轮 PCR 中， 使用引物 ApaI-SpPDI.c(SEQ ID NO ： 30) 和 HBF-SpPDI.r(SEQ ID NO ： 38)， 以构建体号 540(SEQ ID NO ： 59 ； 图 24) 为模板扩增 PDISP 信号肽。平行地， 使用引物 SpPDI-H3B.c(SEQ ID NO ： 39) 和 StuI-HBF.r(SEQ ID NO ： 40)， 以先前合成的片段 (SEQ ID NO ： 73 ； 图 38) 为模板扩增含有来自 B/ 佛罗里达 /4/2006 之 HA 的部分编码序列 ( 从密码子 16 到终止密码子 ) 的另一片段。然后混合扩增产物， 并 用作使用引物 ApaI-SpPDI.c(SEQ ID NO ： 30) 和 StuI-HBF.r(SEQ IDNO ： 40) 之第二轮扩增 ( 组装反应 ) 的模板。所得片段用 ApaI 和 StuI 限制性酶消化， 并克隆至用同样的酶消化的构建体号 828(SEQ ID NO ： 62， 图 27) 中。所得的盒称为构建体号 739(SEQ ID NO ： 74， 图 39)。 O- 在 CPMV-HT 表达盒中组装嵌合 SpPDI-HA B/ 佛罗里达 /4/2006( 胞外结构域 )+H5A/ 印度尼西亚 /5/2005(TmD+Cyto tail)( 构建体号 745)。
     按照以下所述将编码苜蓿 PDI 信号肽的序列融合到 HA B/ 佛罗里达 /4/2006 胞外 结构域和 H5A/ 印度尼西亚 /5/2005 的跨膜和胞质结构域上， 并克隆到 CPMV-HT 中。使用 Darveau 等 (Methods in Neuroscience 26 ： 77-85(1995)) 报道的基于 PCR 的连接方法， 将 PDISP-B/ 佛罗里达 /4/2006 胞外结构域编码序列与 H5 跨膜和胞质结构域融合。在第一轮 PCR 中， 使用引物 ApaI-SpPDI.c(SEQ ID NO ： 30) 和 TmD H5I-B Flo.r(SEQ ID NO ： 41)， 以构 建体号 739(SEQ ID NO ： 74 ； 图 39) 为模板扩增产生包含与 HA B/ 佛罗里达 /4/2006 胞外结 构域融合的 PDISP 信号肽的片段。平行地， 使用引物 B Flo-TmD H5I.c(SEQ ID NO ： 42) 和 H5(A-Indo)-StuI.1707r(SEQ ID NO ： 32)， 以构建体号 660(SEQ ID NO ： 53 ； 图 18) 为模板扩 增含有 H5 印度尼西亚跨膜和胞质结构域的另一片段。然后混合扩增产物， 并用作使用引物 ApaI-SpPDI.c(SEQ ID NO ： 30) 和 H5(A-Indo)-StuI.1707r(SEQ ID NO ： 32) 之第二轮扩增 ( 组装反应 ) 的模板。所得片段用 ApaI 和 StuI 限制性酶消化， 并克隆至用同样的酶消化 的构建体号 828(SEQ ID NO ： 62， 图 27) 中。所得的盒称为构建体号 745(SEQ ID NO ： 75， 图 40)。
     P- 在 2X35S-CPMV-HT 表达盒中组装嵌合 SpPDI-HA B/ 佛罗里达 /4/2006+H5A/ 印 度尼西亚 /5/2005(TmD+Cyto tail)( 构建体号 747)
     按照以下所述将编码苜蓿 PDI 信号肽的序列融合到来自 HA B/ 佛罗里达 /4/2006 的 HA0 和 H5A/ 印度尼西亚 /5/2005 的跨膜和胞质结构域上， 并克隆到 2X35S-CPMV-HT 中。 使用 Darveau 等 (Methods in Neuroscience 26 ： 77-85(1995)) 报道的基于 PCR 的连接方 法进行启动子转换。使用引物 PacI-MCS-2X35S.c(SEQ ID NO ： 89) 和 CPMV 5’ UTR-2X35S. r(SEQ ID NO ： 90) ：
    以含有 2X35S 启动子的质粒为模板通过 PCR 扩增含有 2X35S 启动子 (SEQ ID NO ： 88 ： 图 50A) 的第一片段。 平行地， 使用引物 2X35S-CPMV 5’ UTR.c(SEO ID NO ： 91) 和 ApaI-M prot.r(SEO ID NO ： 92) ：
    以构建体 745(SEQ ID NO ： 75 ； 图 40) 为模板进行第二 PCR。然后混合所得的两种 片段并用作使用引物 PacI-MCS-2X35S.c(SEQ ID NO ： 89) 和 ApaI-M prot.r(SEQ ID NO ： 92) 之第二轮 PCR( 组装反应 ) 的模板。所得片段用 PacI 和 ApaI 消化， 并克隆至用同样的酶消 化的构建体 745(SEQ ID NO ： 75， 图 40) 中。 表达盒称为构建体 747(SEQ ID NO ： 93)， 其序列 示于图 50B 中。
     2. 伴侣蛋白表达盒的组装
     组装了两种热休克蛋白 (Hsp) 表达盒。在第一种盒中， 拟南芥 ( 哥伦比亚生态 型 ) 胞浆 HSP70(Lin 等 (2001)Cell stress and Chaperones 6 ： 201-208 中的 Athsp70-1) 的表达被苜蓿亚硝酸还原酶 (Nir) 和苜蓿质体蓝素启动子的嵌合启动子组合元件 (Nir/ Plasto) 控制。还组装了第二种盒， 其包含嵌合 Nir/Plasto 启动子控制下的苜蓿胞浆 HSP40(MsJ1 ； Frugis 等 (1999)Plant Molecular Biology 40 ： 397-408) 编码区。
     首先， 组装了在植物二元载体中含有苜蓿亚硝酸还原酶启动子 (Nir)、 GUS 报 告基因和 NOS 终止子的接纳质粒 (acceptor plasmid)。用 HindIII 和 EcoRI 消化质粒 pNir3K51( 先前描述于美国专利 No.6,420,548 中 )。将所得片段克隆进用同样的限制性酶 消化的 pCAMBIA2300(Cambia， Canberra， Australia) 中， 得到 pCAMBIA-Nir3K51。
     通 过 基 于 PCR 的 连 接 方 法 (Darveau 等， Methods in Neuroscience 26 ： 77-85(1995))， 将 Hsp70 和 Hsp40 的编码序列分别克隆进接纳质粒 pCAMBIANir3K51 中。
     对于 Hsp40， 使用引物 Hsp40Luz.1c(SEQ ID NO ： 43) 和 Hsp40Luz-SacI.1272r(SEQ ID NO ： 44)， 通 过 RT-PCR 从 苜 蓿 (Rangclander 生 态 型 ) 叶 总 RNA 中 扩 增 Msj1 编 码 序 列 (SEQ ID NO ： 76 ； 图 41)。使用构建体 660(SEQ ID NO ： 53 ； 图 18) 作为模板， 用引物 Plasto-443c(SEQ ID NO ： 5) 和 Hsp40Luz-Plasto.r(SEQ ID NO ： 45) 进行第二扩增。然后 混合 PCR 产物， 并用作使用引物 Plasto-443c(SEQ ID NO ： 5) 和 Hsp40Luz-SacI.1272r(SEQ ID NO ： 44) 之第三扩增 ( 组装反应 ) 的模板。所得片段用 HpaI( 在质体蓝素启动子中 ) 消 化， 并克隆进预先用 HpaI( 在 Nir 启动子中 ) 和 SacI 消化并用 T4DNA 聚合酶处理以产生平 末端的 pCAMBIANir3K51 中。筛选正确取向的所得克隆， 并测序以检验序列完整性。所得质 粒称为 R850， 其示于图 42 中 (SEQ ID NO ： 77)。使用引物 Hsp70Ara.1c(SEQ ID NO ： 46) 和 Hsp70Ara-SacI.1956r(SEQ ID NO ： 47)， 通过 RT-PCR 从拟南芥叶 RNA 中扩增 Athsp70-1 的 编码区。使用构建体 660(SEQ ID NO ： 53， 图 18) 作为模板， 用引物 Plato-443c(SEQ ID NO ： 5) 和 Hsp70Ara-Plasto.r(SEQ ID NO ： 48) 进行第二扩增。然后混合 PCR 产物， 并作使用引 物 Plasto-443c(SEQ ID NO ： 5) 和 Hsp70ARA-SacI.1956r(SEQ ID NO ： 47) 之第三扩增 ( 组 装反应 ) 的模板。所得片段用 HpaI( 在质体蓝素启动子中 ) 消化， 并克隆进用 HpaI( 在 Nir 启动子中 ) 和 SacI 消化并用 T4DNA 聚合酶处理以产生平末端的 pCAMBIANir3K51 中。筛选 正确取向的所得克隆， 并测序以检验序列完整性。所得质粒称为 R860， 其示于图 43 中 (SEQ ID NO ： 78)。
     按照以下所述组装双 Hsp 表达质粒。 R860(SEQ ID NO ： 78 ； 图 43) 用 BsrBI(NOS 终 止子下游 ) 消化， 用 T4DNA 聚合酶处理以产生平末端， 并用 SbfI( 嵌合 NIR/Plasto 启动子 的上游 ) 消化。将所得片段 ( 嵌合 Nir/Plasto 启动子 -HSP70 编码序列 -Nos 终止子 ) 克 隆进预先用 SbfI 和 SmaI( 均位于嵌合 Nir/Plasto 启动子上游的多克隆位点中 ) 消化的 R850(SEQ ID NO ： 77 ； 图 42) 中。所得质粒称为 R870， 其示于图 44 中 (SEQ ID NO ： 79)。3. 其他表达盒的组装
     HcPro 表达盒
     如 Hamilton 等 (2002) 所述制备 HcPro 构建体 (35HcPro)。对所有克隆进行测 序以证实构建体的完整性。通过电穿孔 (Mattanovich 等， 1989) 用质粒转化根瘤农杆菌 (Agrobacteium tumefaciens)(AGL1 ； ATCC， Manassas， VA 20108， USA)。通过限制性图谱证 实所有根瘤农杆菌株的完整性。
     P19 表达盒
     通 过 基 于 PCR 的 连 接 方 法 (Darveau 等， Methods in Neuroscience 26 ： 77-85(1995)) 将番茄丛矮病毒 (TBSV)p19 蛋白的编码序列与苜蓿质体蓝素表达盒连接。 在 第一轮 PCR 中， 使用构建体 660(SEQ ID NO ： 53) 作为模板， 用引物 Plasto-443c(SEQ ID NO ： 5) 和 supP19-plasto.r(SEQ ID NO ： 49) 扩增质体蓝素启动子的区段。平行地， 使用构建体 35S ： p19( 如 Voinnet 等， The Plant Journal 33 ： 949-956(2003) 所述 ) 作为模板， 用引物 supP19-1c(SEQ ID NO ： 50) 和 SupP19-SacI.r(SEQ ID NO ： 51) 扩增含有 p19 编码序列的另 一片段。 然后混合扩增产物， 并用作使用引物 Plasto-443c(SEQ ID NO ： 5) 和 SupP19-SacI. r(SEQ ID NO ： 51) 之第二轮扩增 ( 组装反应 ) 的模板。所得片段用 BamHI( 在质体蓝素启 动子中 ) 和 SacI( 在 p19 编码序列末端 ) 消化， 并克隆进预先用同样的限制性酶消化的构 建体号 660(SEQ ID NO ： 53 ； 图 18) 中， 得到构建体号 R472。质粒 R472 示于图 45 中。
     构建体号 443
     构建体号 443 对应 pCAMBIA2300( 空载体 )。
     表 1. 用于表达盒组装的寡核苷酸引物。
    
    
    表2： 用于表达带有天然或 PDI 信号肽的流感血凝素的农杆菌菌株农杆菌菌株 AGL1/540 AGL1/774 AGL1/787 AGL1/732 AGL1/736 AGL1/660 AGL1/739 AGLI/828 AGLI/690 AGLI/691 AGLI/696 AGLI/733 表达的 HA H1(A/ 新喀里多尼亚 /20/99) H1(A/ 布里斯班 /59/2007) H1(A/ 布里斯班 /59/2007) H1(A/ 布里斯班 /59/2007) H3(A/ 布里斯班 /10/2007) H5(A 印度尼西亚 /5/2005) B(B/ 佛罗里达 /4/2006) CPMV HT-LC C51 H1/Bris RB+H5/Indo SDC H1/Bri E1-RB-E2+H5SDC H5/Indo RB+H1/NC SDC H1/Bri 信号肽 PDI 天然 PDI 天然 PDI 天然 PDI C51LC 天然 天然 PDI PDI 表达盒 质体蓝素 质体蓝素 质体蓝素 35S/CPMV-HT 35S/CPMV-HT 质体蓝素 35S/CPMV-HT 35S/CPMV-HT Plasto Plasto Plasto 35S/CPMV-HT40CN 102482328 A AGLI/734 AGLI/737 AGLI/745 AGL1/747
    说H1/Bri RB+H5/Indo SDC明书天然 PDI PDI PDI 35S/CPMV-HT 35S/CPMV-HT 35S/CPMV-HT 2X35S/CPMV-HT39/45 页H3/Bri 胞外结构域 +H5/Indo TDC B/Flo 胞外结构域 _H5/Indo TDC B/Flo 胞外结构域 _H5/Indo TDC4. 植物生物质的准备、 接种、 农杆菌侵染和收获
     在 填 装 市 售 泥 炭 基 质 的 平 地 上 从 种 子 培 养 本 塞 姆 氏 烟 草 (Nicotiana benthamiana)。使植物以 16/8 光照周期生长在温室中， 温度放方案白天 25℃ / 晚上 20℃。 播种 3 周后， 挑出各株幼苗， 移栽到盆中， 并在同样的环境条件下在温室中再生长 3 周。转 化前， 在以下所述的不同时间通过掐掉植物的芽或通过化学处理植物而除去顶芽和腋芽。
     在补充有 10mM 2-[N- 吗啉 ] 乙磺酸 (MES)、 20μM 乙酰丁香酮、 50μg/ml 卡那霉 素和 25μg/ml 羧苄青霉素的 YEB 培养基 (pH 5.6) 中培养用每种构建体转染的农杆菌， 直 至其 OD600 为 0.6 至 1.6。使用前将农杆菌混悬液离心并重悬在侵染培养基 (10mM MgCl2 和 10mM MES， pH 5.6) 中。如 Liu 和 Lomonossoff(2002， Journal of Virological Methods， 105 ： 343-348) 所述进行注射器侵染。对于真空侵染， 将根瘤农杆菌混悬液离心， 重悬在侵 染培养基中， 并储存在 4℃过夜。在侵染当天， 将分批培养物在 2.5 倍培养物体积中稀释并 在使用前温热。在 20-40 托真空下， 使本塞姆氏烟草或普通烟草 (N.tabacum) 的整个植株 倒置于气密性不锈钢罐中的细菌混悬液中 2 分钟。注射器或真空侵染后， 将植株移回温室 中培养 4-5 天直至收获。除非另外指明， 否则所有侵染均通过与 AGL1/35S-HcPro 以 1 ∶ 1 共侵染来进行， 具有 CPMV-HT 盒的毒株除外 ( 其与毒株 AGL1/R472 以 1 ∶ 1 共侵染 )。
     5. 叶片取样和总蛋白质提取
     培养后， 收获植株的地上部分， 冷冻在 -80℃， 破碎成碎片。通过将每个冷冻破碎 植物材料的样品在 3 倍体积的冷 50mM Tris(pH 8.0)0.15M NaCl， 0.04％焦亚硫酸钠和 1mM 苯甲基磺酰氟中匀浆 (Polytron) 来提取总的可溶性蛋白质。匀浆后， 于 4℃下以 20,000g 离心浆液 20 分钟， 将这些澄清的粗提物 ( 上清液 ) 用于分析。使用牛血清白蛋白作为参照 标准， 通过 Bradford 测定 (Bio-Rad， Hercules， CA) 来测定澄清的粗提物的总蛋白质含量。
     6. 蛋白质分析和免疫印迹
     蛋白浓度通过 BCA 蛋白测定 (Pierce Biochemicals， Rockport IL) 来测定。在还 原条件下通过 SDS-PAGE 分离蛋白质， 并用考马斯蓝染色。对经染色的凝胶进行扫描， 并使 用 ImageJ Software(NIH) 进行密度分析。
     用丙酮来沉淀来自 SEC 洗脱级分的蛋白质 (Bollag 等， 1996)， 重悬在 1/5 体积的 平衡 / 洗脱缓冲液中， 在还原条件下通过 SDS-PAGE 分离并电转移到聚偏氟乙烯 (PVDF) 膜 (Roche Diagnostics Corporation， Indianapolis， IN) 上用于免疫检测。 在免疫印迹之前， 用 Tris 缓冲盐水 (TBS-T) 中 5％脱脂奶和 0.1％ Tween-20 在 4℃下封闭膜 16-18 小时。
    通过用 2μg/ml 的合适抗体 ( 表 6)( 在 2％脱脂奶、 0.1％ TBS-Tween20 中 ) 孵育 进行免疫印迹。 用于化学发光检测的第二抗体示于表 4 中， 如所示将其在 2％脱脂奶、 0.1％
     TBS-Tween 20 中稀释。使用 luminol(Roche Diagnostics Corporation) 作为底物， 通过 化学发光检测免疫反应性复合物。使用 EZ-Link Plus 活化辣根过氧化物酶缀合试剂盒 (Pierce， Rockford， IL) 进行人 IgG 抗体的辣根过氧化物酶缀合。用作检测 H1、 H3 和 B 亚 型之对照的失活全病毒 (WIV) 从 National Institute for Biological Standards and Control(NIBSC) 购得。
     表3： 用于所表达蛋白质免疫印迹的电泳条件、 抗体和稀释
    FII ： Fitzgerald Industries International， Concord， MA， USA ；
     NIBSC ： National Institute for Biological Standards and Control ；
     JIR ： Jackson ImmunoResearch， West Grove， PA， USA ；
     ITC ： Immune Technology Corporation， Woodside， N Y， USA ；
     7.SEC 前的澄清和浓缩
     为了改善分辨率和增加洗脱级分的信号， 使用以下方法对待加载到体积排阻色谱 上的提取物粗蛋白提取物进行澄清和浓缩。 提取物在 4℃下以 70000g 离心 20 分钟， 沉淀通 过用 1 体积 ( 相比最初的提取物体积 ) 的提取缓冲液 (50mM Tris， pH8.0， 0.15M NaCl) 重 悬来清洗两次， 并在 4℃下以 70000g 离心 20 分钟。获得的沉淀重悬在 1/3 体积 ( 相比最初 的提取物体积 ) 中， 加入 20％ (w/v)PEG3350 然后在冰上孵育 1 小时使蛋白 ( 包括 VLP) 沉 淀。在 4℃下以 10000g 离心 20 分钟回收沉淀的蛋白质， 并重悬在 1/15 体积 ( 相比最初的 提取物体积 ) 的提取缓冲液中。完全重悬蛋白质后， 在 4℃下以 20000g 离心 5 分钟沉淀不 溶物， 回收清澈的上清液。
     8. 蛋白质提取物的体积排阻色谱
     装 填 32ml SephacrylTMS-500 高 分 辨 率 珠 (S-500HR ： GE Healthcare， Uppsala， Sweden， 货 号 17-0613-10) 的 体 积 排 阻 色 谱 (SEC) 柱， 用 平 衡 / 洗 脱 缓 冲 液 (50mM 的
     Tris(pH8)， 150mM NaCl) 平衡。将 1.5mL 粗蛋白质提取物加载到该柱上， 然后用 45mL 平 衡 / 洗脱缓冲液进行洗脱步骤。以 1.5mL 级分收集洗脱液， 洗脱级分的相对蛋白质含量这 样通过将 10μL 级分与 200μL 稀释的 Bio-Rad 蛋白染色试剂 (Bio-Rad， Hercales， CA) 混 合来监测。用 2 倍柱体积的 0.2N NaOH 清洗该柱， 然后用 10 倍柱体积的 50mM Tris(pH8)、 150mM NaCl 和 20％乙醇清洗。 每次分离之后用蓝葡聚糖 2000(GE HealthCare Bio-Science Corp.， Piscataway， NJ， USA) 校准柱。在每次分离之间对蓝葡聚糖 2000 和宿主可溶性蛋白 质的洗脱曲线进行比较， 以确保所用柱之间的洗脱曲线的一致性。
     实施例 1 ： 流感亚型茎上 RB 和 / 或酯酶结构域的替换策略
     H5/Indo 的 RB 亚结构域可以用 H1、 H3 或 B HA 的 RB 亚结构域替换。 得到的嵌合 HA 提供 SDC H5/Indo 以形成 VLP， 并显示包含 H1、 H3 或 B 免疫原性位点的 RB 亚结构域。H5/ Indo RB 亚结构域可以插入到 H1 茎上 (H1/NC)。图 15A 和 15B 显示了所示亚结构域融合位 点的氨基酸序列， 相应亚结构域的氨基酸序列显示在图 2( 构建体 690、 734、 696 和 691) 和 表 4( 构建体 900 和 745) 和表 5( 构建体 910、 920 和 930) 中。图 2 和表 4、 5 中显示的氨基 酸序列不包含信号肽序列。
     表 4 亚结构域和嵌合流感 HA。包含异源 RB 亚结构域的嵌合流感 HA。
    序列 SEQ ID NO ： 105 的 1-92 位氨基酸是 H5/Indo 的 F’ 1+E1 结构域 ； 93-259 位氨 基酸是 H3/ 布里斯班的 RB 头部结构域， 260-548 位氨基酸是 H5/Indo 的 E2+F’ 2 结构域。
     序列 SEQ ID NO ： 106 的 1-92 位氨基酸是 H5/Indo 的 F’ 1+E1 结构域 ； 93-276 位氨 基酸是 B/ 佛罗里达的 RB 头部结构域， 277-565 位氨基酸是 H5/Indo 的 E2+F’ 2 结构域。
     表 5 亚结构域和嵌合流感 HA。包含异源 RB 亚结构域的嵌合流感 HA。
    
    SEQ ID NO ： 107 的 1-42 位氨基酸是 H5/Indo 的 N 端 F’ 1 结构域 ； 43-228 位氨基 酸是 H3/ 布里斯班的 E1-RB-E2 头部结构域， 229-507 位氨基酸是 H5/Indo 的 F’ 2 结构域。
     SEQ ID NO ： 108 的 1-42 位氨基酸是 H5/Indo 的 N 端 F’ 1 结构域 ； 43-281 位氨基 酸是 B/ 佛罗里达的 E1-RB-E2 头部结构域 ； 282-556 位氨基酸是 H5/Indo 的 F’ 2 结构域。
     SEQ ID NO ： 109 的 1-42 位氨基酸是 H1/NC 的 N 端 F’ 1 结构域 ； 43-273 位氨基酸 是 H5/Indo 的 E1-RB-E2 头部结构域， 274-548 位氨基酸是 H1/NC 的 F’ 2 结构域。
     各个嵌合体的融合位点选择在邻近 ( 但不必然直接位于 ) 各个亚结构域的 N 和 C 端——不希望被理论约束， 选择这些融合位点以使嵌合 HA 的稳定性最大化。例如， 在 RB 亚 结构域的 N 端观察到结构和序列的保守性 (Ha 等 2002， EMBO J.21 ： 865-875 ； 在此通过引用 并入本文 )。 发现初级序列中变化较少的区域位于 E1 亚结构域 15 个氨基酸之前的 C-F Y-P 三联体中。此半胱氨酸参与在 HA 中保守的 3 号二硫桥 ( 参见图 46 和 47)。此半胱氨酸处 的连接可以为嵌合 HA 提供相对天然序列更加适合或更优的稳定性。RB 的 C 端提供保守特 征： 例如， 在比对中， 在所有 HA 中观察到的位点 1 处的保守丝氨酸残基和以 β 折叠起始的 E2 亚结构域 (Ha 等， 2002， EMBO J.21 ： 865-875 ； 其通过引用并入本文 )。因此， 此 RB 的 C 端 可以融合到 E2 亚结构域该 β 折叠结构的起始氨基酸上。并且， 对于在 H5/Indo SDC 上包 含 H1/NC、 H1Bri、 H3/Bri 或 B/Flo 的 RB 亚结构域的嵌合体和在 H1SDC 上包含 H5/Indo RB 但是在 H5 茎上 亚结构域的嵌合体 ( 共 6 个 )， 二硫桥模式没有变化或者没有实质性的变化， B RB 的杂交 HA 上添加了二硫桥 (8 号二硫键 )。添加此二硫桥不应当干扰 HA 的折叠 ( 因 为其位于 RB 结构域中， 并且半胱氨酸在序列中邻近 )， 并且可以提供更加稳定的杂交 HA。
     第一流感类型的 E1-RB-E2 亚结构域被替换为第二流感类型的 E1-RB-E2 亚结构 域。这种安排可以在 H5-VLP 表面显示更多的第二流感类型的氨基酸。在此实施例中， 将 H1、 H3 或 B 的 HDC 放置在 H5/IndoSDC 上， 将 H5/Indo 的 HDC 放置在 H1/NC SDC 上 ( 表 5)。
     用保守的半胱氨酸残基 ( 构成 HA 类型 A 中的 6 号二硫桥和 HA 类型 B 中的 7 号二 硫桥 ) 确定 HDC 的连接。E2 亚结构域 C 端的 HDC 连接用另一保守半胱氨酸残基确定， 其构 成 H5/Indo SDC 上流感类型 H1 或 H3 或者 H1SDC 上流感类型 H5 的 6 号二硫桥 (F’ 2 亚结构 域的第二氨基酸 )。对于乙型流感嵌合体， 在第一个半胱氨酸处建立连接， 该半胱氨酸构成 4 号二硫桥 ( 在 F’ 2 亚结构域上相隔 4 个氨基酸的位置， 并在 HA 之间保守 )。所得嵌合体 的二硫桥模式没有显示任何变化—— H1/H3/H5 杂交 HA 含有 6 个二硫桥， B 杂交 HA 具有 7 个二硫键。
     实施例 2 ： 用 H1A/ 布 里 斯 班 /59/2007 的 受 体 结 合 (RB) 或 受 体 结 合 和 酯 酶 (E1-RB-E2) 亚结构域替换 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 的相应部分 ： 嵌合体和天然形式的表达 的比较。
     为了将 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 的 VLP 高累积水平与 H1A/ 布里斯班 /59/2007 的 抗原性特点相联合， 设计了包含与 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 茎结构域簇融合的 H1A/ 布里斯 班 /59/2007 结构域的嵌合血凝素。表达 H5/H1 血凝素融合蛋白的表达盒显示于图 1， 产生 的成熟融合蛋白的氨基酸序列显示于图 2。
     为了比较 H5/H1 嵌合血凝素与其天然形式的累积水平， 用 AGL1/774、 AGL1/691 和 AGL1/690 侵染本塞姆氏烟草 (Nicotiana Benthamiana) 植株， 经过 6 天的孵育期后收获 叶。为了确定农杆菌侵染的叶中每种 HA 形式的累积水平， 从被侵染的叶组织中提取蛋白并 用抗 HA 单克隆抗体进行 Western 印迹分析。在用 AGL1/690 侵染的叶子提取物中检测到 约为 75kDa 的独特条带 ( 图 3)， 大小对应流感血凝素未切割的 HA0 形式， 但是在 AGL1/774 或 AGL1/691 中未检测到， 这表明包含与 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 骨架融合的 H1A/ 布里斯班 /59/2007 受体结合区的嵌合血凝素的累积水平高于 H1A/ 布里斯班 /59/2007 的天然形式 (AGL1/774)， 也高于联合 H1A/ 布里斯班 /59/2007 的酯酶和受体结合区和 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 骨架的嵌合血凝素。 用作阳性对照的灭活全病毒 (WIV)(H1A/ 布里斯班 /59/2007) 检 测为多个条带， 主要条带在约 80kDa 处， 对应 H1A/ 布里斯班 /59/2007 前体 HA0 的分子量。 这 些结果证明， 用 H1A/ 布里斯班 /59/2007 的受体结合区替换 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 的相应 部分产生嵌合血凝素， 其显示 H1 的抗原区并且其在植物中比天然 H1A/ 布里斯班 /59/2007 累积水平更高。但是， 其中 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 中酯酶和受体结合区被 H1A/ 布里斯班 /59/2007 的对应部分替换的嵌合血凝素在植物中没有累积到可以检测的水平。
     对将 H1A/ 布里斯班 /59/2007 的受体结合区与 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 骨架的融合 作为植物中呈递 H1 抗原之 VLP 的累积水平增加方法在基于 CPMV-HT 的强表达盒控制下进 行了再次评价。 还将此融合策略与增加累积水平的信号肽替换方法进行了比较。 在 CPMV-HT 控制下表达 H5/H1 血凝素融合蛋白的表达盒显示于图 8， 产生的成熟融合蛋白的氨基酸序 列显示于图 2。
     用 AGL1/732、 AGL1/733 或 AGL1/734 侵染本塞姆氏烟草植株， 6 天的孵育期后收 获烟草叶。为了确定农杆菌侵染的叶中每种 HA 形式的累积水平， 首先从被侵染的叶组织 中提取蛋白并用抗 H1( 布里斯班 ) 多克隆抗体进行 Western 印迹分析。在用 AGL1/732、AGL1/733 和 AGL1/734 侵染的叶提取物中检测到约为 75kDa 的独特条带 ( 图 6)， 大小对应 流感血凝素未切割的 HA0 形式， 但是， 虽然在所有分析的提取物中均检测到血凝素， 仍然可 以观察到累积水平的重要差异。在这些条件下， H1A/ 布里斯班 /59/2007 表达使用其天然 信号肽 (732) 几乎检测不到， 用 PDI 的信号肽替换信号肽后得到高累积水平的成熟 H1A/ 布 里斯班 /59/2007(733)， 嵌合 H5/H1 血凝素 (734) 累积水平最高。总之， 这些结果表明， 将 H1 的受体结合结构域与 H5 骨架融合导致呈递 H1 抗原之血凝素的高累积， 并且在植物中这 些融合蛋白的累积水平高于信号肽替换或未替换的天然形式所获得的累积水平。
     实施例 3 ： 用 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 的受体结合 (RB) 亚结构域替换 H1A/ 新喀里 多尼亚 /20/99 的相应部分。嵌合和天然形式的表达的比较。
     还评价了 H1 骨架 ( 来自 A/ 新喀里多尼亚 /20/99) 在呈递 H5 抗原区中的用途。 表 达 H1/H5 血凝素融合蛋白的表达盒显示于图 1， 产生的成熟融合蛋白的氨基酸序列显示于 图 2。
     为了比较 H1/H5 嵌合血凝素与其天然形式的累积水平， 用 AGL1/660 和 AGL1/696 侵染本塞姆氏烟草植株， 经过 6 天的孵育期后收获烟草叶。为了确定农杆菌侵染的叶子中 每种 HA 形式的累积水平， 从被侵染的叶组织中提取蛋白病用抗 H5( 印度尼西亚 ) 多克隆 抗体进行 Western 印迹分析。在用 AGL1/660 和 AGL1/696 侵染的叶提取物中检测到约为 75kDa 的独特条带 ( 图 7)， 大小对应流感血凝素未切割的 HA0 形式， 表明天然 H5A/ 印度尼 西亚 /5/05 和 H1/H5 嵌合血凝素两者均在植物中高水平累积。
     实施例 4 ： 用 H3 或 B 型流感的相应部分替换 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 的胞外结构 域。嵌合体和天然形式的表达的比较。
     评价了呈递 H3 和 B 型毒株血凝素抗原区同时增加它们在植物中的累积的以下策 略： 将 H3A/ 布里斯班 /10/2007 或 B 佛罗里达 /4/2006 的胞外结构域与来自 H5A/ 印度尼西 亚 /5/05 的跨膜和胞质亚结构域融合。表达 H5/H3 和 H5/B 血凝素融合蛋白的表达盒显示 于图 10， 融合边界的氨基酸显示于图 11。
     比较 H5/B 嵌合血凝素 (745) 与天然 HA B(739) 在本塞姆氏烟草植株中的累积水 平。 用 AGL1/739 和 AGL1/745 侵染植株， 经过 6 天的孵育期后收获烟草叶。 为了确定农杆菌 侵染的叶中每种 HA 形式的累积水平， 首先从被侵染的叶组织中提取蛋白并用抗 B( 佛罗里 达 ) 多克隆抗体进行 Western 印迹分析。 在用 AGL1/739 侵染的一个植株的叶提取物中检测 到约为 75kDa 的独特条带 ( 图 14)， 大小对应流感血凝素未切割的 HA0 形式， 而用 AGL1/745 侵染的 3 个植株显示相应血凝素阳性信号， 表明血凝素的 H5/B 嵌合形式比 B 血凝素天然形 式更经常获得高累积水平。
     类似地， 比较 H5/H3 嵌合血凝素 (737) 与其天然形式 (736) 在本塞姆氏烟草中的 累积水平。用 AGL1/736 和 AGL1/737 侵染植株， 经过 6 天的孵育期后收获烟草叶。为了确 定农杆菌侵染的叶子中每种 HA 形式的累积水平， 从被侵染的叶组织中提取蛋白病并用抗 H3( 布里斯班 ) 多克隆抗体进行 Western 印迹分析。在用 AGL1/736 和 AGL1/737 侵染的叶 提取物中检测到约为 75kDa 的独特条带 ( 图 15)， 大小对应流感血凝素未切割的 HA0 形式。 该结果表明来自 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 的跨膜和胞质亚结构域与 H3A/ 布里斯班 /10/2007 胞外结构域的融合获得与天然 H3A/ 布里斯班 /10/2007 累积水平类似的嵌合血凝素。
     使用体积排阻色谱评价来自 H5/B 嵌合血凝素 ( 构建体号 745) 表达的 VLP 生产。通过体积排阻色谱 (SEC) 在 SephacrylTM S-500HR 柱 (GE Healthcare Bio-Science Corp.， Piscataway， NJ， USA) 上对来自 AGL1/745 侵染植株的浓缩蛋白提取物 (1.5mL) 进行分级。 如图 16 所示， 蓝葡聚糖 (2M Da) 洗脱峰早在组分 8 中出现。将 200μL 每种 SEC 洗脱级分 中的蛋白质用丙酮沉淀法浓缩 (5 倍 ) 并用抗 B( 佛罗里达 ) 多克隆抗体进行 Western 印迹 分析 ( 图 16)， 嵌合血凝素主要出现在组分 7 中， 表明 HA 整合成高分子量结构。不希望被理 论束缚， 这表明嵌合 HA 蛋白组装成大型超结构或者其粘附到高分子量结构上。所获得的结 果表明， HA B 佛罗里达 /4/2006 胞外结构域与 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 的跨膜和胞质亚结 构域构成的嵌合 HA 组装成高分子量颗粒， 并且这些高分子量颗粒的洗脱谱与流感 VLP 的不 同。
     实施例 5 ： H5/B 嵌合血凝素 ( 构建体 747 ； 包含与 H5/Indo TDC 融合的 B/Flo HDC 和 SDC) 与 Hsp70 和 Hsp40 共表达并与信号肽修饰相组合。
     在共同待决申请 PCT/CA2009/000032 中描述了在植物中表达 Hsp40 和 Hsp70 以及 与流感血凝素共表达。植物来源的胞浆 Hsp70 和 Hsp40( 构建体号 R870) 可以与嵌合血凝 素共表达以增加它们在植物中的累积水平。用含有表达期望嵌合 HA 之表达盒的 AGL1 和 AGL1/R870 以及 AGL1/35ShcPro 的混合物 ( 比例为 1 ∶ 1 ∶ 1) 的细菌悬液农杆菌侵染本塞 姆氏烟草植物进行共表达。
     评价在塞姆氏烟草植株中与 HSP40 和 HSP70 共表达的 H5/B 嵌合血凝素 ( 融合 H5/ Indo TDC 的 B/Flo HDC 和 SDC) 的累积水平。用 AGL1/747、 AGL1/747+AGL1/443( 空载体 ) 或 AGL1/747+AGL1/R870(HSP40/HSP70) 侵染植株， 经过 6 天的孵育期后收获烟草叶。为了 确定农杆菌侵染的叶中 H5/B 嵌合 HA 的累积水平， 首先从被侵染的叶组织中提取蛋白并用 抗 B( 佛罗里达 ) 多克隆抗体进行 Western 印迹分析。在用 AGL1/747+AGL1/R870 侵染的 3 株植株的叶提取物中检测到约为 75kDa 的独特条带 ( 图 50)， 大小对应流感血凝素未切割的 HA0 形式， 而 AGL1/747+ 对照载体 (443) 侵染的 3 个植株未显示信号 ( 在所使用的暴露条件 下 )， 表明 H5/B 嵌合形式的血凝素在与 HSP40 和 HSP70 伴侣蛋白共表达时高水平累积。
     所有引用的文献均通过引用并入本文， 就如同每个具体的文献均具体和单独显示 为通过引用并入本文的一样， 并且如同它们在本文中被完全给出一样。本文对参考文献的 引用不被解释为或认为是认同这些参考文献是本发明的现有技术。
     在说明书中大量使用了一些术语， 并且提供了定义帮助理解本发明的多个方面。 在说明书中使用的实例 ( 包括术语的实例 ) 仅用作说明目的， 而不旨在限制本发明实施方 案的范围和含义。数值范围包括定义范围的数值。在说明书中， 词语 “包含” 用作开放式术 语， 基本上等同于术语 “包括但不限于” ， 词语 “含有” 具有相应的含义。
     本发明的一个或多个目前优选的实施方案已通过示例方式进行了描述。 本发明包 括基本如上文所述和参照实施例和附图的所有实施方案、 修饰和变化。对本领域技术人员 来说显然的是， 在不偏离权利要求中限定的本发明范围的前提下， 可以进行一些变化和修 饰。 这些修饰的实例包括本发明任何方面以基本相同的方法为获得相同结果而进行的已知 等价方案的替换。47CN 102482328 A
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     本发明还涉及感染其他哺乳动物或宿主动物的流感病毒， 所述动物如人、 灵长类、 马、 猪、 鸟类、 水禽、 候鸟、 鹌鹑、 鸭、 鹅、 家禽、 鸡、 骆驼、 犬科动物、 狗、 猫科动物、 猫、 虎、 豹、 麝 猫、 水貂、 石貂、 雪貂、 宠物、 家畜、 小鼠、 大鼠、 海豹、 鲸等。一些流感病毒可以感染超过一种 宿主动物。
     对于流感病毒， 本文所用术语 “血凝素” 或 “HA” 是指流感病毒颗粒的结构糖蛋白。 流感血凝素的结构已有深入的研究， 并且显示高度保守的二级、 三级和四级结构。即使氨 基酸序列变化仍观察到此结构保守性 ( 参见例如 Skehel 和 Wiley， 2000 Ann Rev Biochem 69 ： 531-69 ； Vaccaro 等 2005， 通过引用并入本文 )。编码 HA 的核苷酸序列是公知的并 且可获得， 参见例如 BioDefense and Public Health base( 例如 URL ： biohealthbase. org/GSearch/home.do ？ decorator ＝ Influenza) 或美国国立生物技术信息中心 (NCBI ； 参 见 URL ： ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez ？ db ＝ nuccore&cmd ＝ search&term ＝ influenza)， 两者均通过引用并入本文。
     HA 单体可进一步分为 3 个功能性结构域——茎结构域或茎结构域簇 (SDC)、 球状 头部结构域或头部结构域簇 (HDC) 和跨膜结构域簇 (TDC)。SDC 包含 4 个亚结构域， 融合 肽 F、 F’ 1 和 F’ 2( 该亚结构域一般可以称为 “骨架” )。TDC 包含两个亚结构域， 跨膜 (TmD) 和 C 端尾部 (CT)。HDC 包含三个亚结构域， 残留酯酶结构域 E1’ 和 E2 以及受体结合结构域 RB。SDC 和 HDC 可以统称为 “胞外结构域” 。Ha 等 2002(EMBO J.21 ： 865-875 ； 通过引用并入 本文 ) 发表的文献根据 X 射线结晶结构， 阐明了几个流感亚型中 SDC 和 HDC 多种亚结构域 的相对定位。图 1A 显示与 HA1 和 HA2 多肽 N 端和 C 端相关的亚结构域示意图。图 1C 提供 多种流感亚型的标示的结构比对。
     流感病毒血凝素中允许氨基酸变化。该变化提供不断被鉴定的新毒株。新毒株之 间感染性可以有差异。但是， 保持了血凝素三聚体的形成， 其随后形成 VLP。因此本发明提 供了包含嵌合 HA 的血凝素氨基酸序列或编码在植物中形成 VLP 的嵌合血凝素氨基酸序列 的核酸， 并且包括已知序列和可产生的变体 HA 序列。本发明还涉及包含 TDC、 SDC 和 HDC 的 嵌合 HA 多肽的用途。例如嵌合 HA 蛋白可以是 HA0， 或包含来自两种或更多种流感类型之 HA1 和 HA2 亚结构域的经切割嵌合 HA。嵌合 HA 蛋白可以用于使用植物或植物细胞表达系 统生产或形成 VLP。
     HA0 可以表达并折叠形成三聚体， 然后可组装成 VLP。HA0 的切割产生 HA1 和 HA2 多肽， 它们通过二硫桥连接 ( 参见图 1C、 46 和 47 对二硫桥模式的图解 )。对于感染性病毒 颗粒， 需要前体 HA0 的切割来引发 HA2 的构象变化， 该变化释放融合肽 ( 在 HA2 多肽的 N端 ) 并使其可用于融合细胞和病毒膜。但是， VLP 没有感染性， 不需要切割 HA 形成 HA1 和 HA2( 例如在疫苗生产中 )。未切割的 HA0 前体也组装成三聚体并从质膜出芽形成 VLP 纳米 颗粒。
     HA0 多肽包含几个结构域。 HDC 的 RB 亚结构域在抗原区包含几个环， 称为位点 A-E。 可以中和感染性流感病毒的抗体经常靶向一个或更多个这些位点。残留酯酶亚结构域 (E1 和 E2) 可在融合中发挥作用， 并且可结合 Ca++。F、 F’ 1 和 F’ 2 结构域相互作用并协同形成 茎， 使得 HA 三聚体的头部位于膜之上。TmD 和 CT 可参与折叠 HA 在膜上的锚定。TmD 可在 HA 对脂筏的亲和中发挥作用， 而 CT 可在 HA 的分泌中发挥作用， 并且 CT 亚结构域中存在的 一些半胱氨酸残基可是棕榈酰化的。信号肽 (SP) 还可存在于 HA0 多肽的 N 端。图 2 以及 表 4 和 5 提供了一些流感病毒亚型的 SP、 F’ 1、 F’ 2、 E1、 RB、 E2 和 F 结构域的氨基酸序列的 实例。
     在流感血凝素的表达和 / 或分泌过程中对 N 端信号肽 (SP) 序列进行加工可在 HA 折叠中发挥作用。术语 “信号肽” 一般是指通常见于血凝素多肽 N 端的短 ( 约 5-30 个氨基 酸 ) 氨基酸序列， 其可指导新翻译的多肽转位至特定细胞器， 或者辅助多肽链的特定结构 域相对于其他结构域的定位。血凝素的信号肽将蛋白质的转位靶向至内质网， 已提出该信 号肽辅助近 N 端结构域相对于新生血凝素多肽之膜锚定结构域的定位， 以辅助成熟血凝素 的切割和折叠。
     HA 在宿主细胞内质网 (ER) 膜内的插入、 信号肽切割和蛋白质糖基化是共翻译事 件。HA 的正确折叠需要蛋白质糖基化和至少 6 个链内二硫键的形成 ( 参见图 46 和 47)。 在图 46 中， 显示甲亚型 HA 的每个单体具有 6 个保守二硫桥。通过比较， B HA 的单体 ( 图 47) 具有 7 个二硫桥， 其中 5 个在甲型中有对应结构 ( 综述见 Skehel 和 Wiley， 2000.Ann Rev Biochem 69 ： 531-569 ； 在如 Gamblin 等 2004， Science 303 ： 1838-1842 中描述了阐释 分子内和分子间二硫桥和其他保守氨基酸及其相对位置的结构实例 ； 两者均通过引用并入 本文 )。本领域技术人员应理解， 重要的是制备嵌合 HA 时保证获得类似排列的二硫桥。
     信号肽可以是血凝素中天然存在的， 或者信号肽可与被表达血凝素的初级序列异 源。嵌合 HA 可以包含来自第一流感类型、 亚型或毒株的信号肽， 而其余的 HA 来自一种或多 于一种的不同流感类型、 亚型或毒株。例如 HA 亚型 B H1、 H2、 H3、 H5、 H6、 H7、 H9 或乙型流 感的天然 SP 可用于在植物系统中表达 HA。在本发明的一些实施方案中， SP 可以来自乙型、 H1、 H3 或 H5 流感 ； 或来自亚型 H1/Bri、 H1/NC、 H5/Indo、 H3/Bri 或 B/Flo。
     SP 还可以是非天然的， 例如来自非流感病毒之病毒的结构蛋白或血凝素， 或者来 自植物、 动物或细菌多肽。可以使用的信号肽的非限制性实例是苜蓿蛋白二硫键异构酶 (PDI SP ； 登记号 Z11499 的 32-103 位核苷酸 ； SEQ ID NO ： 34 ； 图 17)， 其具有氨基酸序列 ：
     MAKNVAIFGLLFSLLLLVPSQIFAEE(32-103 位核苷酸 ； SEQ ID NO ： 34)。
     因此本发明提供了包含天然或非天然信号肽的嵌合流感血凝素和编码该嵌合血 凝素的核酸。
     血凝素的正确折叠对蛋白质稳定性、 多聚体形成、 VLP 形成和 HA 的功能 ( 血细胞 凝集能力 ) 等流感血凝素特性可以是重要的。蛋白质折叠可受一个或更多个因素影响， 包 括但不限于 ： 蛋白质序列、 蛋白质相对丰度、 细胞内拥挤程度、 可与折叠的、 部分折叠的或未 折叠的蛋白质结合或瞬时联合的辅因子的可获得性、 一种或更多种伴侣蛋白的存在等。热休克蛋白 (Hsp) 或应激蛋白是伴侣蛋白的实例， 其可参与多种细胞过程， 包括 蛋白质合成、 细胞内运输、 错误折叠的防止、 蛋白质凝集的防止、 蛋白质复合物的组装和去 组装、 蛋白质折叠和蛋白质解聚。这样的伴侣蛋白的实例包括但不限于 Hsp60、 Hsp65、 Hsp 70、 Hsp90、 Hsp100、 Hsp20-30、 Hsp10、 Hsp100-200、 Hsp100、 Hsp90、 Lon、 TF55、 FKBP、 亲环蛋 白 (cyclophilin)、 ClpP、 GrpE、 泛素、 钙联蛋白 (calnexin) 和蛋白质二硫键异构酶 ( 参见 例如 Macario， A.J.L.， Cold Spring Harbor Laboratory Res.25 ： 59-70.1995 ； Parsell， D.A.&Lindquist， S.Ann.Rev.Genet.27 ： 437-496(1993) ； 美国专利 No.5,232,833)。 如本文 所述， 伴侣蛋白 ( 例如但不限于 Hsp40 和 Hsp70) 可以用于保证嵌合 HA 的折叠。
     Hsp70 的 实 例 包 括 来 自 哺 乳 动 物 细 胞 的 Hsp72 和 Hsc73、 来自细菌特别是分 枝 杆 菌 ( 如 麻 风 分 枝 杆 菌 (Mycobacterium leprae)、 结 核 分 枝 杆 菌 (Mycobacterium tuberculosis) 和牛分枝杆菌 (Mycobacterium bovis)( 例如卡介苗 (Bacille-Calmette Guerin) ： 本文中称为 Hsp71)) 的 DnaK。 来自大肠杆菌、 酵母和其他原核生物的 DnaK 以及来 自真核生物 ( 例如拟南芥 (A.thaliana)) 的 BiP 和 Grp78(Lin 等， 2001(Cell Stress and Chaperones 6 ： 201-208))。 Hsp70 的具体实例是拟南芥 Hsp70( 由 Genbank ref ： AY120747.1 编码 )。Hsp70 能够特异性地结合 ATP 以及未折叠的多肽和肽， 从而参与蛋白质折叠和去折 叠和蛋白质复合物的组装和去组装。
     Hsp40 的实例包括来自原核生物 ( 例如大肠杆菌和分枝杆菌 ) 的 DnaJ 和来自真核 生物 ( 例如苜蓿 ) 的 HSJ1、 HDJ1 和 Hsp40(Frugis 等， 1999.Plant Molecular Biology 40 ： 397-408)。Hsp40 的具体实例是紫花苜蓿 (M.sativa)MsJ1(AJ000995.1 或 SEQ ID NO ： 76)。 Hsp40 在蛋白质折叠、 耐热和 DNA 复制等细胞活动中作为分子伴侣起作用。图 41 显示编码 Msj1 的核酸序列 (SEQ ID NO ： 76)。
     在 Hsp 中， Hsp70 及其辅伴侣蛋白 (co-chaperone)Hsp40 参与合成完成前正在翻译 的和新合成的多肽的稳定。不希望受理论的限制， Hsp40 与未折叠 ( 新生或新转移的 ) 多 肽的疏水片区 (patch) 结合， 从而有利于 Hsp70-ATP 复合物与多肽的相互作用。 ATP 水解导 致多肽、 Hsp70 和 ADP 之间形成稳定的复合物并释放 Hsp40。Hsp70-ADP 复合物与多肽之疏 水片区的联合阻止其与其他疏水片区的相互作用， 防止不正确折叠和与其他蛋白质的凝集 ( 综述见 Hartl， FU.1996.Nature 381 ： 571-579)。
     天然伴侣蛋白可能能够利于低水平的重组蛋白质的正确折叠， 然而随着表达水平 的增加， 天然伴侣蛋白的丰富可成为限制因素。农杆菌浸染叶中血凝素的高水平表达可导 致血凝素多肽在胞质溶胶中累积， 而共表达一种或更多种伴侣蛋白 ( 例如 Hsp70、 Hsp40 或 者 Hsp70 和 Hsp40 两者 ) 可降低错误折叠或凝集的血凝素多肽的水平， 并且增加显示出允 许血细胞凝集和 / 或病毒样颗粒形成之三级和四级结构特性的多肽数。SEQ IDNO ： 77 是构 建体号 R850 从 HindIII( 在多克隆位点中， 启动子上游 ) 至 EcoRI( 紧邻 NOS 终止子的下游 ) 的部分核酸序列， 其编码 HSP40( 下划线 )。SEQ ID NO ： 78 是构建体号 R860 从 HindIII( 在 多克隆位点中， 启动子上游 ) 至 EcoRI( 紧邻 NOS 终止子的下游 ) 的部分核酸序列， 其编码 HSP70( 下划线 )。SEQ ID NO ： 79 是构建体号 R870 从 HindIII( 在多克隆位点中， 启动子 5’ 上游 ) 至 EcoRI( 紧邻 NOS 终止子的下游 ) 的部分核酸序列， 其编码 HSP40( 下划线， 斜体 ) 和 HSP70( 下划线 )。
     因此， 本发明还提供了在植物中生产嵌合流感 VLP 的方法， 其中编码嵌合流感 HA的第一核酸与编码伴侣蛋白的第二核酸共表达。 第一和第二核酸可以在同一步骤中引入植 物， 或者可以顺次引入植物。
     可通过例如血细胞凝集测定、 电子显微镜观察或体积排阻色谱来评估 VLP 的结构 和大小。
     对于体积排阻色谱， 可通过以下方法从植物组织中提取全部可溶性蛋白质 ： 将冷 冻粉碎的植物材料在提取缓冲液中匀浆 (Polytron)， 通过离心除去不溶性物质。用 PEG 进 行沉淀也可以是有利的。定量可溶性蛋白质， 并将提取物通过 SephacrylTM 柱。可用蓝葡聚 糖 2000 作为校准标准。在进行色谱后， 可通过免疫印迹进一步分析级分以确定级分中的蛋 白质成分。
     本发明还提供了这样的植物， 其包含编码一种或更多种嵌合流感血凝素的核酸和 编码一种或更多种伴侣蛋白的核酸。
     本发明包括核苷酸序列 ：
     SEQ ID NO ： 63( 构建体 690 ； 包含苜蓿质体蓝素启动子和 5’ UTR、 嵌合血凝素编码 序列、 苜蓿质体蓝素 3’ UTR 和终止子序列的嵌合 H5/H1 表达盒 )， SEQ ID NO ： 63 下划线部 分编码 H5/Indo 的 SP、 F’ 1、 E1-H1/Bri 的 RB-H5/Indo 的 E2、 F’ 2、 F、 TMD/CT ； SEQ ID NO ： 64( 构建体 691 ； 包含苜蓿质体蓝素启动子和 5’ UTR、 嵌合血凝素编码 序列、 苜蓿质体蓝素 3’ UTR 和终止子序列的嵌合 H5/H1 表达盒 )， SEQ ID NO ： 64 下划线部 分编码 H5/Indo 的 SP、 F’ 1-H1/Bri 的 E1、 RB、 E2-H5/Indo 的 F’ 2、 F、 TMD/CT ；
     SEQ ID NO ： 65( 构建体 696 ； 包含苜蓿质体蓝素启动子和 5’ UTR、 嵌合血凝素编码 序列、 苜蓿质体蓝素 3’ UTR 和终止子序列的嵌合 H1/H5 表达盒 )， SEQ ID NO ： 65 下划线部 分编码 PDI SP-H1/NC 的 F’ 1、 E1-H5/Indo 的 RB-H1/NC 的 E2、 F’ 2、 F、 TMD/CT ；
     SEQ ID NO ： 68( 构建体 733 ； 包含 CaMV 35S 启动子、 CPMV-HT5’ UTR、 PDI 信号肽编 码序列、 H1 型 A/ 布里斯班 /59/07(H1N1) 血凝素编码序列、 CPMV-HT 3’ UTR 和 NOS 终止子 序列的 SpPDI H1/Bri 表达盒 )， SEQ ID NO ： 68 的下划线部分编码 PDI SP-H1/BRI 的 F’ 1、 E1、 RB、 E2、 F’ 2、 F、 TMD/CT ；
     SEQ ID NO ： 69( 构建体 734 ； 包含 CaMV 35S 启动子、 CPMV-HT 5’ UTR、 嵌合血凝素 编码序列、 CPMV-HT 3’ UTR 和 NOS 终止子序列的嵌合 H5/H1 表达盒 )。嵌合 HA 的编码序列 用下划线表示， 其编码与 SEQID NO ： 63 相同的嵌合 HA ；
     SEQ ID NO ： 71( 构建体 736 ； 包含 CaMV 35S 启动子、 CPMV-HT 5’ UTR、 PDI 信号肽编 码序列、 H3 型 A/ 布里斯班 /10/07(H2N3) 血凝素编码序列、 CPMV-HT 3’ UTR 和 NOS 终止子 序列的 HA 表达盒 )， SEQ ID NO ： 71 的下划线部分编码 PDI SP-H3/Bri 的 F’ 1、 E1、 RB、 E2、 F’ 2、 F、 TMD/CT ；
     SEQ ID NO ： 72( 构建体 737 ； 包含 CaMV 35S 启动子、 CPMV-HT 5’ UTR、 嵌合血凝素 编码序列、 CPMV-HT 3’ UTR 和 NOS 终止子序列的嵌合 H5/H3 表达盒 )， SEQ ID NO ： 72 下划 线部分编码 PDI SP-H5/Indo 的 F’ 1、 E1、 RB、 E2、 F’ 2、 F、 TMD/CT ；
     SEQ ID NO ： 74( 构建体 739 ； 包含 CaMV 35S 启动子、 CPMV-HT 5’ UTR、 PDI 信号肽 编码序列、 HA 型 B/ 佛罗里达 /4/06 的血凝素编码序列、 CPMV-HT 3’ UTR 和 NOS 终止子序列 的 HA 表达盒 )， SEQ ID NO ： 74 的下划线部分编码 PDI SP-B/Flo 的 F’ 1、 E1、 RB、 E2、 F’ 2、 F、 TMD/CT ；
     SEQ ID NO ： 75( 构建体 734 ； 包含 CaMV 35S 启动子、 CPMV-HT 5’ UTR、 嵌合血凝素 编码序列、 CPMV-HT 3’ UTR 和 NOS 终止子序列的嵌合 H5/B 表达盒 )， SEQ ID NO ： 75 下划线 部分编码 PDI SP-B/Flo 的 F’ 1、 E1、 RB、 E2、 F’ 2、 F-H5/Indo 的 TND/CT。
     本发明还包括在严格杂交条件下与任一 SEQ ID NO ： 63-65、 68、 69 和 71-75 下划线 部分杂交的核苷酸序列。本发明还包括在严格杂交条件下与任一 SEQ ID NO ： 63-65、 68、 69 和 71-75 下划线部分的互补序列杂交的核苷酸序列。这些与 SEQ ID NO ： 63-65、 68、 69 和 71-75 下划线部分或 SEQ ID NO ： 63-65、 68、 69 和 71-75 下划线部分的互补序列杂交的核苷 酸序列编码嵌合血凝素蛋白， 其表达形成嵌合 VLP， 并且当施用给对象时， 嵌合 VLP 诱导抗 体产生。例如， 所述核苷酸序列在植物细胞内表达形成嵌合 VLP， 所述嵌合 VLP 可用于产生 能结合 HA( 包括一种或更多种流感类型或亚型的成熟 HA、 HA0、 HA1 或 HA2) 的抗体， 当施用 给对象时， 所述 VLP 诱导免疫应答。
     严 格 杂 交 条 件 下 的 杂 交 是 本 领 域 已 知 的 ( 参 见 例 如 Current Protocols in Molecular Biology， Ausubel 等 编， 1995 及 增 刊 ； Maniatis 等， Molecular Cloning(A Laboratory Manual)， Cold Spring Harbor Laboratory， 1982 ； Sambrook 和 Russell， Molecular Cloning ： A Laboratory Manual， 第 3 版， 2001 ； 每个均通过引用并入本文 )。一 种该严格杂交条件的实例可以是在 65℃下于 4×SSC 中杂交约 16-20 小时， 然后在 65℃下 于 0.1×SSC 中清洗 1 小时， 或在 65℃下于 0.1×SSC 中清洗两次 ( 每次 20 或 30 分钟 )。或 者， 一个示例性严格杂交条件可以是在 42℃下于 50％甲酰胺， 4×SSC 中过夜 (16 ～ 20 小 时 )， 然后在 65℃下于 0.1×SSC 中清洗 1 小时， 或在 65℃下于 0.1×SSC 中清洗 2 次 ( 每 次 20 或 30 分钟 )， 或者过夜 (16 ～ 20 小时 )， 或者在 65℃下于 Church 水性磷酸盐缓冲液 (7％ SDS ； 0.5M NaPO4 缓冲液 pH 7.2 ； 10mM EDTA) 中杂交， 在 50℃下于 0.1×SSC， 0.1％ SDS 中清洗 2 次 ( 每次 20 或 30 分钟 )， 或者在 65℃下于 2×SSC， 0.1％ SDS 中清洗 2 次 ( 每次 20 或 30 分钟 )。
     此外， 本发明包括这样的核苷酸序列， 其特征为与编码任一 SEQ ID NO ： 63、 SEQ ID NO ： 64、 SEQ ID NO ： 65、 SEQ ID NO ： 68、 SEQ ID NO ： 69、 SEQ ID NO ： 71、 SEQ ID NO ： 72、 SEQ ID NO ： 74、 SEQ ID NO ： 75 下划线部分之嵌合 HA 的核苷酸序列有约 70％、 75％、 80％、 85％、 87 ％、 90 ％、 91 ％、 92 ％、 93 ％、 94 ％、 95 ％、 96 ％、 97 ％、 98 ％、 99 ％、 100 ％或其间任意量的序 列同一性或序列相似性， 其中该核苷酸序列编码血凝素蛋白， 其在表达时形成嵌合 VLP， 该 嵌合 VLP 诱导抗体产生。 例如， 所述核苷酸序列在植物细胞内表达形成嵌合 VLP， 该嵌合 VLP 可用于产生能结合 HA( 包括成熟 HA、 HA0、 HA1 或 HA2) 的抗体， 当施用给对象时， 所述 VLP 诱 导免疫应答。
     “免疫应答” 一般是指获得性免疫系统的应答。获得性免疫系统通常包括体液应答 和细胞介导的应答。体液应答是由 B 淋巴细胞谱系的细胞 (B 细胞 ) 产生的分泌抗体所介 导的免疫方面。分泌抗体结合入侵微生物 ( 例如病毒或细菌 ) 表面上的抗原， 标示它们以 进行破坏。体液免疫一般是指抗体产生和伴随其的过程， 以及抗体的效应物功能， 包括 Th2 细胞活化和细胞因子产生、 记忆细胞形成、 调理素促进胞吞作用、 病原体清除等。术语 “调 节” 是指根据通常知晓或使用的任意测定法 ( 其中一些在本文中举例说明 ) 测定的特定应 答或参数的升高或降低。
     细胞介导的应答是这样的免疫应答， 其不涉及抗体， 而涉及巨噬细胞、 自然杀伤细胞 (NK)、 抗原特异性细胞毒性 T 淋巴细胞的活化， 以及多种细胞因子应答于抗原的释放。 细 胞介导的免疫一般指一些 Th 细胞的活化、 Tc 细胞的活化和 T 细胞介导的应答。细胞介导 的免疫在对病毒感染的应答中尤为重要。
     例如， 可使用 ELISPOT 测定来测量对抗原特异性 CD8 阳性 T 淋巴细胞的诱导 ； 可使 用增殖测定来测量对 CD4 阳性 T 淋巴细胞的刺激。可使用 ELISA 测定来定量抗流感病毒抗 体的效价 ； 还可使用抗同种型抗体 ( 例如抗 IgG、 抗 IgA、 抗 IgE 或抗 IgM) 来测量抗原特异 性或交叉反应性抗体的同种型。实施这些测定的方法和技术是本领域公知的。
     血细胞凝集抑制 (HI 或 HAI) 测定也可用于证明由疫苗或疫苗组合物诱导的抗体 的效力， 所述疫苗或疫苗组合物包含可抑制由重组 HA 所致之红血细胞 (RBC) 凝集的嵌合 HA 或嵌合 VLP。血清样品的血细胞凝集抑制性抗体效价可通过微量滴定 HAI 来评估 (Aymard 等， 1973)。可使用任何来自几个物种的红细胞， 例如马、 火鸡、 鸡等。该测定给出有关 HA 三 聚体在 VLP 表面上组装的间接信息， 证实 HA 抗原位点的正确展示。
     交叉反应性 HAI 滴定还可用于证明免疫应答对与疫苗亚型相关的其他病毒株的 效力。例如， 可以在 HAI 测定中将用包含嵌合血凝素 ( 包含第一流感类型或亚型的 HDC) 之 疫苗组合物免疫的对象的血清与第二株全病毒或病毒颗粒一起使用， 并且测定 HAI 效价。
     不希望受理论限制， HA 结合来自不同动物之 RBC 的能力是由 HA 对 α2， 3 或 α2， 6 键合唾液酸的亲和力以及这些唾液酸在 RBC 表面上的存在来驱动的。马和禽类的流感病 毒 HA 使来自所有几个物种 ( 包括火鸡、 鸡、 鸭、 豚鼠、 人、 绵羊、 马和牛 ) 的红细胞凝集 ； 而人 HA 结合火鸡、 鸡、 鸭、 豚鼠、 人和绵羊的红细胞 (Ito T. 等， 1997， Virology， 卷 227， 493-499 ； 以及 Medeiros R 等， 2001， Virology， 卷 289， 74-85)。
     细胞因子的存在或水平也可以被定量。例如， 用 ELISA( 例如 BD Biosciences OptEIA 试剂盒 ) 测量 IFN-γ 和 IL-4 分泌细胞来表征 T 辅助细胞应答 (Th1/Th2)。 可培养从 对象得到的外周血单核细胞 (PBMC) 或脾细胞， 并分析上清。还可使用标志物特异性荧光标 记和本领域已知方法， 通过荧光激活细胞分选 (fluorescence-activated cell sorting， FACS) 对 T 淋巴细胞定量。
     还可进行微量中和测定来表征对象中的免疫应答， 参见例如 Rowe 等， 1973 的方 法。可通过几种方法得到病毒中和效价， 包括 ： 1) 在对细胞进行结晶紫固定 / 着色之后， 计 数裂解斑 ( 空斑测定 ) ； 2) 显微镜观察培养物中的细胞裂解 ； 3) 对 NP 病毒蛋白 ( 与病毒感 染宿主细胞有关 ) 进行 ELISA 和分光光度检测。
     序列同一性或序列相似性可利用序列比较程序来确定， 例如 DNASIS 所提供的 ( 例 如， 使用但不限于下述参数 ： 空隙罚分 5、 顶部对角线数 (#of top diagonal)5、 固定的空 隙罚分 10、 k 元祖 2、 游隙 10， 窗口大小 5)。然而， 其他用于比较的序列比对方法是本领域 熟知的， 例如 Smith&Waterman 算法 (1981， Adv.Appl.Math.2 ： 482)、 Needleman&Wunsch 算 法 (J.Mol.Biol.48 ： 443， 1970)、 Pearson&Lipman 算法 (1988， Proc.Nat’ l.Acad.Sci.USA 85 ： 2444)， 以及这些算法的计算机执行 ( 例如 GAP、 BESTFIT、 FASTA 和 BLAST(Altschul 等， 1990.J.Mol Biol 215 ： 403-410))， 或者通过人工比对和目视检查。可以对核酸或氨 基酸序列进行比较或比对， 并使用任何现有技术已知的几种软件包测定共有序列， 例如 MULTALIN(Corpet F.， 1988， Nucl Acids Res.， 16(22)， 10881-10890)、 BLAST、 CLUSTAL 等 ； 或者可以人工比对序列并确定序列间的相似度和差异。蛋白质、 融合蛋白或多肽的片段或部分包含含有特定蛋白质或多肽之一部分氨基 酸组成的肽或多肽， 前提是在表达时所述片段可形成嵌合 VLP。 例如所述片段可以包含抗原 性区域、 应激应答诱导区域或含有蛋白质或多肽之功能性结构域的区域。所述片段还可包 含同一总家族的蛋白质共有的区域或结构域， 或者片段可包含足以特异性鉴定其来源全长 蛋白质的氨基酸序列。
     例如， 片段或部分可包含蛋白质全长的约 60％至约 100％或其间任意量， 前提是 在表达时该片段可形成嵌合 VLP。例如， 蛋白质全长的约 60 ％至约 100 ％、 约 70 ％至约 100％、 约 80％至约 100％、 约 90％至约 100％、 约 95％至约 100％， 或其间任意量。或者， 根 据嵌合 HA， 片段或部分可以为约 150 至约 500 个氨基酸或其间任意量， 前提是在表达时所 述片段可形成嵌合 VLP。例如， 根据嵌合 HA， 片段或部分可以为约 150 至约 500 个氨基酸或 其间任意量、 约 200 至约 500 个氨基酸或其间任意量、 约 250 至约 500 个氨基酸或其间任意 量、 约 300 至约 500 个氨基酸或其间任意量、 约 350 至约 500 个氨基酸或其间任意量、 约 400 至约 500 个氨基酸或其间任意量、 约 450 至约 500 个氨基酸或其间任意量， 前提是在表达时 片段可形成嵌合 VLP。例如， 可从嵌合 HA 蛋白的 C 端、 N 端或者 N 和 C 两端去除约 5、 10、 20、 30、 40 或 50 个氨基酸或其间任意量， 前提是在表达时所述片段可形成嵌合 VLP。
     任意给定序列中的氨基酸编号是相对于该特定序列的， 然而， 本领域技术人员可 根据结构和 / 或序列容易地确定序列中特定氨基酸的 “等同性” 。例如， 如果去除了 6 个 N 端氨基酸， 那么这将改变氨基酸的具体编码标识 ( 例如， 相对于蛋白质全长而言 )， 但是不 会改变结构中氨基酸的相对位置。
     本发明描述了 ( 但不限于 ) 在植物、 植物部分或植物细胞中编码嵌合 HA 的核酸的 表达， 以及适于生产疫苗的植物中生产嵌合流感 VLP。这些核酸的实例包括但不限于， 例如 SEQ ID NO ： 63、 SEQ ID NO ： 64、 SEQ ID NO ： 65、 SEQ ID NO ： 68、 SEQ ID NO ： 69、 SEQ ID NO ： 71、 SEQ ID NO ： 72、 SEQ ID NO ： 74、 SEQ ID NO ： 75。
     本发明还提供了在植物、 植物部分或植物细胞中表达编码嵌合 HA 的核酸 ( 例如但 不限于 SEQ ID NO ： 63、 SEQ ID NO ： 64、 SEQ ID NO ： 65、 SEQ ID NO ： 68、 SEQ ID NO ： 69、 SEQ ID NO ： 71、 SEQ ID NO ： 72、 SEQID NO ： 74、 SEQ ID NO ： 75)， 以及在转化的植物细胞中生产包 含重组流感结构蛋白的候选流感疫苗或试剂， 所述重组流感结构蛋白自组装成功能性和免 疫原性的同型大分子蛋白结构， 包括亚病毒流感颗粒和嵌合流感 VLP。
     因此， 本发明提供了嵌合 VLP， 和通过表达单个嵌合包膜蛋白在植物表达系统中生 产嵌合 VLP 的方法。
     编码流感亚型嵌合 HA 的核酸 ( 例如 SEQ ID NO ： 63、 SEQ ID NO ： 64、 SEQ ID NO ： 65、 SEQ ID NO ： 68、 SEQ ID NO ： 69、 SEQ ID NO ： 71、 SEQ ID NO ： 72、 SEQ ID NO ： 74、 SEQ ID NO ： 75) 可以通过使用 HA RNA 通过反转录和聚合酶链式反应 (PCR) 合成。例如， 可以从 H1/ NC、 H1/Bri、 H3/Bri、 B/Flo 或 H5/Indo 中或者从感染了这些或其他流感病毒类型或亚型的 细胞中分离 RNA。对于反转录和 PCR， 可以使用 HA RNA 特异性寡核苷酸引物。另外， 编码嵌 合 HA 的核酸可以使用本领域技术人员已知的方法化学合成。
     本发明还涉及包含编码嵌合 HA 之核酸 ( 如上所述， 其与在植物中有效的调控元件 有效连接 ) 的基因构建体。在植物细胞中有效并可用于本发明的调控元件的实例包括但 不限于质体蓝素调控区 (US 7,125,978 ； 其通过引用并入本文 ) 或核酮糖 1， 5- 二磷酸羧化酶 / 加氧酶 (RuBisCO ； US4,962,028 ； 其通过引用并入本文 )、 叶绿素 a/b 结合蛋白 (CAB ； Leutwiler 等 ； 1986 ； 其通过引用并入本文 )、 ST-LS1( 与光系统 II 的放氧复合物相关， 描述 于 Stockhaus 等 1987、 1989 中 ； 其通过引用并入本文 ) 的调控区。
     本发明的基因构建体还包含组成型启动子， 其指导与启动子有效连接的基因在植 物各部分中表达并在整个植物发育过程中持续表达。 组成型启动子的一个非限制性的实例 是与 CaMV 35S 转录本相关的组成型启动子 ( 例如， Odell 等， 1985， Nature， 313 ： 810-812， 通过引用并入本文 )。
     包含质体蓝素调控区的序列的实例是 SEQ ID NO ： 58 的序列 5’端至编码 PDI 信号肽的下划线序列。调控元件或调控区可增强与其有效连接的核苷酸序列的翻译， 其 中核苷酸序列可编码蛋白质或多肽。调控区的另一实例是源自豇豆花叶病毒 (Cowpea Mosaic Virus， CPMV) 非翻译区的调控区， 其可用于优先翻译与其有效连接的核苷酸序 列。这一 CPMV 调控区用于可过量翻译的 CMPV-HT 系统中， 参见例如 Sainsbury 等， 2008， Plant Physiology 148 ： 1212-1218 ； Sainsbury 等， 2008 Plant BiotechnologyJournal 6 ： 82-92， 两者均通过引用并入本文 )。
     因此， 本发明的一方面提供了包含与编码嵌合流感 HA 之序列有效连接的调控区 的核酸。所述调控区可以是质体蓝素调控元件， 所述嵌合流感 HA 可包含来自 H5/Indo、 H1/ Bri、 H3/Bri、 H1/NC、 B/Flo 流感类型、 亚型或毒株的亚结构域。包含质体蓝素调控元件和嵌 合流感 HA 的核酸序列在本文中通过 SEQ ID NO ： 63 和 64 示例。包含 35S 调控元件和嵌合 流感 HA 的核酸序列在本文中通过 SEQ ID NO ： 68、 69 和 71-75 示例。
     在另一方面， 本发明提供包含 CPMV 调控区和嵌合流感 HA( 包含来自 H5/Indo、 H1/ Bri、 H3/Bri、 H1/NC、 B/Flo 流感类型、 亚型或毒株的亚结构域 ) 的核酸。包含 CPMP 调控元 件和嵌合 HA 的核酸序列在本文中通过 SEQ ID NO ： 66-69 和 71-75 示例。
     在植物中产生的嵌合流感 VLP 从质膜中出芽， 因而嵌合 VLP 的脂质组成反映产生 它们的植物细胞或植物组织类型。根据本发明生产的 VLP 包含两种或多于多种类型或亚型 流感的嵌合 HA， 其与植物来源的脂质复合。植物脂质可刺激特异免疫细胞并增强所诱导的 免疫应答。
     植物脂质如 PC( 磷脂酰胆碱 ) 和 PE( 磷脂酰乙醇胺 ) 以及鞘糖脂可结合哺乳动物 免疫细胞 ( 例如抗原呈递细胞 (APC)， 如树突状细胞和巨噬细胞 ) 和其他细胞 ( 包括胸腺和 肝脏中的 B 淋巴细胞和 T 淋巴细胞 ) 表达的 CD1 分子。( 综述见 Tsuji M.2006 Cell Mol Life Sci 63 ： 1889-98)。CD1 分子在结构上与主要组织相容性复合体 (MHC)I 类分子相似， 其作用是将糖脂抗原呈递给 NKT 细胞 ( 自然杀伤 T 细胞 )。活化后， NKT 细胞激活固有免疫 细胞 ( 例如 NK 细胞和树突状细胞 ) 并且还激活获得性免疫细胞 ( 例如产生抗体的 B 细胞 和 T 细胞 )。
     存在于与脂双层 ( 例如质膜来源的包膜 ) 复合之流感 VLP 中的植物固醇可提供有 利的疫苗组合物。不希望受理论限制， 与脂双层 ( 例如质膜来源的包膜 ) 复合的由植物生 产的 VLP( 包括包含嵌合 HA 的 VLP) 比在其他表达系统中制得的 VLP 可诱导更强的免疫反 应， 并且可与由活或减毒全病毒疫苗所诱导的免疫反应相似。
     因此， 在一些实施方案中， 本发明提供了与植物来源的脂双层复合的 VLP( 包含嵌 合 HA)。在一些实施方案中， 所述植物来源的脂双层可包括 VLP 的包膜。在植物内生产的 VLP 可包含含有植物特异性 N- 聚糖的嵌合 HA。 因此， 本发明还提 供了包含具有植物特异性 N- 聚糖的嵌合 HA 的 VLP。
     此外， 植物中 N- 聚糖的修饰是已知的 ( 参见例如 WO 2008/151440 ； 其通过引用并 入本文 )， 并且可产生含有经修饰 N- 聚糖的嵌合 HA。可得到包含经修饰糖基化模式 ( 例如 岩藻糖基化减少、 木糖基化减少、 或岩藻糖基化和木糖基化二者均减少 ) 之 N- 聚糖的 HA， 或 者可得到含有经修饰糖基化模式的嵌合 HA， 其中蛋白质缺少岩藻糖基化、 木糖基化或两者 皆缺少， 并包含增加的半乳糖基化。此外， 与表达嵌合 HA 的野生型植物相比， 翻译后修饰的 调节 ( 例如末端添加半乳糖 ) 可导致所表达嵌合 HA 的岩藻糖基化和木糖基化降低。
     例如 ( 但不视为限制 )， 合成具有经修饰糖基化模式的嵌合 HA 可通过使目的蛋白 质与编码 β-1， 4- 半乳糖基转移酶 (GalT)( 例如但不限于哺乳动物 GalT 或人 GalT， 然而 也可以使用其他来源的 GalT) 的核苷酸序列共表达来实现。还可将 GalT 的催化结构域与 N- 乙酰氨基葡萄糖基转移酶 (GNT1) 的 CTS 结构域 ( 即胞质尾、 跨膜结构域、 茎区 ) 融合以 产生 GNT1-GalT 杂合酶， 并且该杂合酶可与 HA 共表达。HA 还可与编码 N- 乙酰氨基葡萄糖 基转移酶 III(GnT-III)( 例如但不限于哺乳动物 GnT-III 或人 GnT-III， 还可使用其他来源 的 GnT-III) 的核苷酸序列共表达。另外， 还可使用包含与 GnT-III 融合的 GNT1 之 CTS 的 GNT1-GnT-III 杂合酶。
     因此， 本发明还包括含有嵌合 HA 的 VLP， 所述嵌合 HA 具有经修饰的 N- 聚糖。
     不希望受理论限制， 嵌合 HA 上存在的植物 N- 聚糖可通过促进抗原呈递细胞与 HA 的结合来刺激免疫应答。Saint-jore-Dupas 等 (Trends Biotechnol 25 ： 317-23， 2007) 已 提出使用植物 N 聚糖来刺激免疫应答。此外， VLP 的构象对于抗原呈递可以是有利的， 并且 当与植物来源的脂质层复合时增强 VLP 的佐剂作用。
     “调控区” 、 “调控元件” 或 “启动子” 是指通常 ( 但不总是 ) 位于基因的蛋白质编码 区上游的一部分核酸， 其可由 DNA 或 RNA 或者 DNA 和 RNA 两者构成。当调控区有活性并与 目的基因有效相连或有效连接时， 可导致目的基因的表达。 调控元件可以介导器官特异性， 或控制发育基因或时序基因的活化。 “调控区” 包括启动子元件、 显示启动子基础活性的核 心启动子元件、 可响应于外部刺激而被诱导的元件、 介导启动子活性的元件 ( 例如负调控 元件或转录增强子 )。本文所用的 “调控区” 还包括在转录后具有活性的元件， 例如调节基 因表达的调控元件， 例如翻译增强子和转录增强子、 翻译抑制子和转录抑制子、 上游激活序 列和 mRNA 不稳定性决定子 (mRNA instability determinant)。这后几种元件中有几种可 位于编码区附近。
     在本公开内容中， 术语 “调控元件” 或 “调控区” 一般是指通常 ( 但不总是 ) 位于 结构基因编码序列上游 (5’ ) 的 DNA 序列， 其通过提供转录在特定位点起始所需的 RNA 聚合 酶和 / 或其他因子的识别来控制编码区表达。 然而， 应当理解的是， 位于内含子中或序列 3’ 的其他核苷酸序列也可对调控目的编码区的表达有贡献。为确保在特定位点起始而为 RNA 聚合酶或其他转录因子提供识别的调控元件的一个实例是启动子元件。大多数 ( 但不是全 部 ) 真核生物启动子元件包含 TATA 盒， 其是由腺苷和胸苷核苷酸碱基对组成的保守核酸序 列， 通常位于转录起始位点上游约 25 个碱基对处。启动子元件包含负责起始转录的基础启 动子元件以及调节基因表达的其他调控元件 ( 如上文所述 )。
     存在几种类型的调控区， 包括受发育调节的、 诱导型的或组成型的调控区。 受发育调节的调控区或对所控制基因的差异性表达进行控制的调控区在特定器官或器官之组织 中、 在该器官或组织发育过程的特定时间被活化。 然而， 受发育调节的一些调控区也可偏好 性地在某些器官或组织的特定发育阶段具有活性， 它们还可以以受发育调节的方式具有活 性， 或在植物的其他器官或组织内为基础水平。组织特异性调控区 ( 例如参见特异性调控 区 ) 的实例包括 napin 启动子和 cruciferin 启动子 (Rask 等， 1998， J.Plant Physiol.152 ： 595-599 ； Bilodeau 等， 1994， Plant Cell 14 ： 125-130)。叶特异性启动子的实例包括质体 蓝素启动子 ( 参见例如 SEQ ID NO ： 58) ； US 7,125,978， 其通过引用并入本文。
     诱导型调控区是能够响应于诱导物而直接或间接激活一种或更多种 DNA 序列或 基因之转录的调控区。当不存在诱导物时， DNA 序列或基因不会被转录。通常， 特异性结合 诱导型调控区以激活转录的蛋白因子可以以无活性形式存在， 然后被诱导物直接或间接转 化成活性形式。然而， 也可以不存在蛋白因子。诱导物可以是化学剂， 例如蛋白质、 代谢物、 生长调节剂、 除草剂或酚类化合物， 或通过热、 冷、 盐或毒性元素直接施加的生理压力， 或通 过病原体或致病剂 ( 例如病毒 ) 的作用间接施加的生理压力。可通过向细胞或植物外部施 加诱导物 ( 例如通过喷洒、 浇水、 加热或类似方法 ) 使含有诱导型调控区的植物细胞暴露于 诱导物。 诱导型调控元件可来源于植物基因或非植物基因 ( 例如 Gatz， C. 和 Lenk， I.R.P.， 1998， Trends Plant Sci.3， 352-358， 其通过引用并入本文 )。可用的诱导型启动子的实例 包括但不限于四环素诱导型启动子 (Gatz， C.， 1997， Ann.Rev.Plant Physiol.Plant Mol. Biol.48， 89-108， 其通过引用并入本文 )、 类固醇诱导型启动子 (Aoyama， T. 和 Chua， N.H.， 1997， Plant J.2， 397-404， 其通过引用并入本文 ) 和乙醇诱导型启动子 (Salter， M.G 等， 1998， Plant Journal 16， 127-132 ； Caddick， M.X. 等， 1998， Nature Biotech.16， 177-180， 其通过引用并入本文 )、 细胞分裂素诱导型 IB6 和 CKI1 基因 (Brandstatter， I. 和 Kieber， J.J.， 1998， Plant Cell 10， 1009-1019 ； Kakimoto， T.， 1996， Science 274， 982-985， 其 通过引用并入本文 ) 以及生长素诱导型元件 DR5(Ulmasov， T. 等， 1997， Plant Cell 9， 1963-1971， 其通过引用并入本文 )。
     组成型调控区指导基因在植物各部分表达并在整个植物发育过程中持续表达。 已 知的组成型调控元件的实例包括与以下相关的启动子 ： CaMV 35S 转录本 (Odell 等， 1985， Nature， 313 ： 810-812)、 水稻肌动蛋白 1(Zhang 等， 1991， Plant Cell， 3： 1155-1165)、 肌动 蛋白 2(An 等， 1996， Plant J.， 10 ： 107-121) 或 tms 2(U.S.5,428,147， 其通过引用并入本 文 ) 以及磷酸丙糖异构酶 1 基因 (Xu 等， 1994， Plant Physiol.106 ： 459-467)、 玉米泛素 1 基 因 (Cornejo 等， 1993， Plant Mol.Biol.29 ： 637-646)、 拟南芥泛素 1 和 6 基因 (Holtorf 等， 1995， Plant Mol.Biol.29 ： 637-646)、 烟草翻译起始因子 4A 基因 (Mandel 等， 1995， Plant Mol.Biol.29 ： 995-1004)。本文所用的术语 “组成型” 不一定指受所述组成型调控区控制的 基因在所有细胞类型中以相同水平表达， 而是指基因在多种细胞类型中表达， 尽管常常观 察到不同的丰度。 组成型调控元件可与其他序列偶联以进一步增强与其有效连接之核苷酸 序列的转录和 / 或翻译。例如， CMPV-HT 系统源自豇豆花叶病毒 (CPMV) 的非翻译区， 并显 示增强相关编码序列的翻译。
     “天然” 是指核酸或氨基酸序列是天然存在的， 或 “野生型” 。
     “有效连接” 是指特定序列 ( 例如调控元件与目的编码区 ) 直接或间接地相互作用 以实现预定功能 ( 例如介导或调节基因表达 )。例如有效连接的序列之间的相互作用可通过与所述有效连接之序列相互作用的蛋白质来介导。
     本发明的一种或更多种核苷酸序列可在被本发明核苷酸序列、 或构建体或载体转 化的任意合适的植物宿主中表达。合适宿主的实例包括但不限于农作物， 包括苜蓿、 油菜、 芸苔属 (Brassica spp.)、 玉米、 烟草属 (Nicotiana spp.)、 苜蓿、 马铃薯、 人参、 豌豆、 燕麦、 水稻、 大豆、 小麦、 大麦、 向日葵、 棉花等。
     本发明的一种或更多种嵌合基因构建体还可包含 3’ 非翻译区。3’ 非翻译区是指 这样的基因部分， 其包含含有多腺苷酸化信号和能够影响 mRNA 加工或基因表达之任意其 他调控信号的 DNA 区段。多腺苷酸化信号的特征一般在于向 mRNA 前体的 3’ 端添加多腺苷 酸链。多腺苷酸化信号常通过存在经典形式 5’ AATAAA-3’ 的同源物来鉴定， 但是也会出现 变体。
     合适的 3’ 区的非限制性实例是含有以下基因的多腺苷酸化信号的 3’ 转录的非翻 译区 ： 农杆菌致瘤 (Ti) 质粒基因 ( 例如胭脂氨酸合酶 (Nos 基因 )) 以及植物基因 ( 例如大 豆贮藏蛋白基因 )、 核酮糖 -1， 5- 二磷酸羧化酶的小亚基基因 (ssRUBISCO ； US 4,962,028， 其通过引用并入本文 )、 用于调节质体蓝素表达的启动子 ( 描述于 US 7,125,978( 其通过引 用并入本文 ))。 本发明的一种或更多种嵌合基因构建体还可以进一步包括增强子， 根据需要可以 是翻译或转录增强子。增强子可以位于被转录序列的 5’ 或 3’ 。增强子区域是本领域技术 人员公知的， 并且可包括 ATG 起始密码子、 邻近序列等。如果存在起始密码子， 则其可在编 码序列的读码框的相 (phase) 中 (“框内” (“in frame” ))， 以提供转录序列的正确翻译。
     为了帮助鉴定转化的植物细胞， 可进一步处理本发明的构建体使其包含植物选择 标记。可用的选择标记包括提供针对化学品 ( 例如抗生素， 如庆大霉素、 潮霉素、 卡那霉素 ； 或除草剂， 如膦丝菌素 (phosphinothrycin)、 草甘膦、 氯磺隆等 ) 的抗性的酶。 类似地， 可使 用产生可通过颜色变化进行鉴定之化合物的酶 ( 例如 GUS(β- 葡萄糖醛酸酶 )) 或提供发 光的酶 ( 如萤光素酶或 GFP)。
     认为是本发明一部分的还有包含本发明嵌合基因构建体的转基因植物、 植物细胞 或种子。由植物细胞再生完整植物的方法也是本领域已知的。一般而言， 将转化植物细胞 培养在合适的培养基中， 所述培养基可包含选择剂 ( 例如抗生素 )， 其中使用选择标记以帮 助鉴定转化的植物细胞。愈伤组织形成后， 可根据已知方法应用合适的植物激素来促进芽 的形成， 将芽移至生根培养基中以再生植物。然后， 通过种子或利用植物无性繁殖技术， 植 物可用于建立可重复的世代。还可以不使用组织培养物来形成转基因植物。
     认为是本发明一部分的还有包含嵌合基因构建体的转基因植物、 树木、 酵母、 细 菌、 真菌、 昆虫和动物细胞， 所述嵌合基因构建体含有编码本发明之用于产生 VLP 的重组嵌 合 HA 或 HA0 的核酸。
     为了在多种可用于转化或瞬时表达的宿主生物中表达， 还可以将本发明的调控元 件与目的编码区相组合。这样的生物包括但不限于植物 ( 单子叶植物和双子叶植物 )， 例 如但不限于玉米、 谷类植物、 小麦、 大麦、 燕麦、 烟草属、 芸苔属、 大豆、 菜豆、 豌豆、 苜蓿、 马铃 薯、 番茄、 人参和拟南芥。
     用于这些生物的稳定转化和再生的方法已在本领域中建立并且是本领域技术人 员已知的。获得转化植物和再生植物的方法对本发明来说不是关键的。
    
     “转化” 是指表现为基因型、 表型或二者兼有的遗传信息 ( 核苷酸序列 ) 在种间转移。 遗传信息从嵌合构建体向宿主的种间转移可以是可遗传的并且认为遗传信息的转移是 稳定的， 或者转移可以是瞬时的并且遗传信息的转移是不可遗传的。
     术语 “植物物质” 是指来源于植物的任何材料。 植物物质可包括完整植物、 组织、 细 胞或其任意部分。此外， 植物物质可包括细胞内植物组分、 细胞外植物组分、 植物的液体或 固体提取物或者其组合。此外， 植物物质可包括来自植物叶、 茎、 果实、 根或其组合的植物、 植物细胞、 组织、 液体提取物或其组合。 植物物质可包括未进行任何处理步骤的植物或其部 分。植物的一部分可包含植物物质。然而， 还考虑可对所述植物材料施加下定义的最少处 理步骤或更严格的处理， 包括使用本领域公知的技术 ( 包括但不限于色谱、 电泳等 ) 进行部 分或大量蛋白质纯化。
     术语 “最少处理” 是指部分纯化包含目的蛋白的植物物质 ( 例如植物或其部分 ) 以 得到植物提取物、 匀浆、 植物匀浆的级分等 ( 即最少处理 )。部分纯化可包括但不限于破坏 植物细胞结构从而产生含有可溶性植物组分和不溶性植物组分的组合物， 不溶性植物组分 可通过例如但不限于离心、 过滤或其组合进行分离。 在此方面， 可使用真空或离心提取容易 地获得叶或其他组织的细胞外间隙中分泌的蛋白质， 或可以通过穿过滚轴或研磨等在压力 下进行组织提取， 从而将蛋白从细胞外间隙中挤压或释放。最少处理还可包括制备可溶性 蛋白质的粗提物， 因为这些制备物中将具有可忽略的来自次级植物产物的污染。 另外， 最少 处理可包括从叶中水性提取可溶性蛋白质， 然后用任意合适的盐进行沉淀。其他方法可包 括大规模的浸渍和汁液提取， 以允许直接使用提取物。
     可将植物物质 ( 形式为植物材料或组织 ) 经口递送给对象。植物物质可作为膳食 补充剂的一部分与其他食物一起施用， 或者被装入胶囊中。植物物质或组织还可以被浓缩 以改善或增进适口性， 或者按照需要与其他材料、 成分或药物赋形剂一起提供。
     可施用本发明 VLP 的对象或目标生物的实例包括但不限于人、 灵长类、 鸟类、 水 禽、 候鸟、 鹌鹑、 鸭、 鹅、 家禽、 鸡、 猪、 绵羊、 马科动物、 马、 骆驼、 犬科动物、 狗、 猫科动物、 猫、 虎、 豹、 麝猫、 水貂、 石貂、 雪貂、 宠物、 家畜、 兔、 小鼠、 大鼠、 豚鼠或其他啮齿动物、 海豹、 鲸 等。这些目标生物是示例性的， 并且不视为限制本发明的应用和用途。
     考虑根据需要和情形， 以多种方式将含有本发明一些实施方式的嵌合 HA 或表达 含有本发明一些实施方式之嵌合 HA 的 VLP 的植物施用给对象或目标生物。例如， 可在使用 之前将得自植物的嵌合 HA 以粗提物、 部分纯化或纯化的形式被提取。如果嵌合 HA 是至少 部分纯化的， 那么其可以在可食用植物或不可食用植物中产生。此外， 如果经口施用嵌合 HA， 则可以收集植物组织并直接给对象食用， 或者可在食用之前干燥收集的组织， 或者可以 不预先收集而使动物在植物上进食。 认为在本发明范围内的还有将收集的植物组织作为动 物饲料的食物补充剂。如果向动物饲喂的植物组织不进行或几乎不进行进一步处理， 则优 选所施用的植物组织是可食用的。
     转录后基因沉默 (PTGS) 可参与限制转基因在植物中的表达， 来自马铃薯 Y 病毒的 沉默抑制子 (HcPro) 的共表达可用于抵抗转基因 mRNA 的特异性降解 (Brigneti 等， 1998)。 可替代的沉默抑制子是本领域熟知的， 并且可如本文所述使用 (Chiba 等， 2006， Virology 346 ： 7-14， 其 通 过 引 用 并 入 本 文 )， 例 如 但 不 限 于 TEV-p1/HC-Pro( 烟 草 蚀 纹 病 毒 -p1/ HC-Pro)、 BYV-p21、 番茄丛矮病毒的 p19(TBSV p19)、 番茄皱缩病毒的衣壳蛋白 (TCV-CP)、 黄瓜花叶病毒的 2b(CMV-2b)、 马铃薯 X 病毒的 p25(PVX-p25)、 马铃薯 M 病毒的 p11(PVM-p11)、 马铃薯 S 病毒的 p11(PVS-p11)、 蓝莓枯黄病毒的 p16(BScV-p16)、 柑橘衰退病毒 (Citrus tristexa virus) 的 p23(CTV-p23)、 葡萄卷叶相关病毒 -2 的 p24(GLRaV-2 p24)、 葡萄病 毒 A 的 p10(GVA-p10)、 葡萄病毒 B 的 p14(GVB-p14)、 白芷潜伏性病毒 (Heracleum latent virus) 的 p10(HLV-p10) 或大蒜普通潜伏性病毒的 p16(GCLV-p16)。因此， 沉默抑制子 ( 例 如但不限于 HcPro、 TEV-p1/HC-Pro、 BYV-p21、 TBSV p19、 TCV-CP、 CMV-2b、 PVX-p25、 PVM-p11、 PVS-p11、 BScV-p16、 CTV-p23、 GLRaV-2p24、 GBV-p14、 HLV-p10、 GCLV-p16 或 GVA-p10) 可与 编码目的蛋白的核酸序列共表达以进一步确保在植物中生产高水平的蛋白质。
     此外， 如本文所述生产的 VLP 不包含神经氨酸酶 (NA)。然而， 如期望包含 HA 和 NA 的 VLP， 可以将 NA 与 HA 共表达。
     因此， 本发明还包括合适的载体， 其含有适用于稳定或瞬时表达系统中的嵌合 HA 序列。还可在一种或多于一种的构建体中提供遗传信息。例如， 可将编码目的蛋白的核苷 酸序列引入一种构建体， 将编码修饰目的蛋白糖基化之蛋白质的第二核苷酸序列引入单独 的构建体中。然后， 可将这些核苷酸序列在植物中共表达。然而， 也可使用这样的构建体， 其包含编码目的蛋白和修饰目的蛋白糖基化之蛋白质两者的核苷酸序列。在此情形中， 核 苷酸序列将包含第一序列和第二序列， 所述第一序列包含与启动子或调控区有效连接的编 码目的蛋白的第一核酸序列， 所述第二序列包含编码修饰目的蛋白糖基化模式之蛋白质的 第二核酸序列， 该第二核酸序列与启动子或调控区有效连接。
     “共表达” 是指两种或两种以上核苷酸序列大致同时在植物中以及在植物的同一 组织中表达。然而， 核苷酸序列不必严格地同时表达。而是两种或更多种核苷酸序列的表 达方式使得所编码产物有机会相互作用。例如， 修饰目的蛋白糖基化的蛋白质可在目的蛋 白表达前或表达期间表达， 使得发生对目的蛋白的糖基化修饰。可使用瞬时表达系统共表 达两种或两种以上的核苷酸序列， 其中所述两种或更多种序列大致同时在适于这两种序列 表达的条件下被引入植物中。或者， 可以用编码目的蛋白的额外序列以瞬时或稳定方式转 化含有核苷酸序列之一 ( 例如编码修饰目的蛋白糖基化模式的蛋白质的序列 ) 的平台植物 (platform plant)。在此情形中， 编码修饰目的蛋白糖基化模式之蛋白质的序列可在期望 的发育阶段表达在期望的组织内表达， 或者可使用诱导型启动子诱导其表达， 而编码目的 蛋白的额外序列可在相似条件下在同一组织内表达， 以确保核苷酸序列的共表达。
     可使用 Ti 质粒、 Ri 质粒、 植物病毒载体、 直接 DNA 转化、 显微注射、 电穿孔、 侵染等 将本发明的构建体引入植物细胞中。这些技术的综述参见例如 Weissbach 和 Weissbach， Methods for Plant Molecular Biology， Academy Press， 纽约 VIII， 421-463 页 (1988) ； Geierson 和 Corey， Plant Molecular Biology， 第 2 版 (1988) 以 及 Miki 和 Iyer， Fundamentals of Gene Transfer in Plants.Plant Metabolism，第 2 版， DT.Dennis， DH Turpin， DD Lefebrve， DB Layzell( 编 )， Addison Wesly， Langmans Ltd.London， 561-579 页 (1997)。其他方法包括直接 DNA 摄取、 使用脂质体、 电穿孔 ( 例如使用原生质 体 )、 显微注射、 微弹 (microprojectile) 或 whisker 以及真空侵染。参见例如 Bilang 等 (Gene 100 ： 247-250(1991))、 Scheid 等 (Mol.Gen.Genet.228 ： 104-112， 1991)、 Guerche 等 (Plant Science 52 ： 111-116， 1987)、 Neuhause 等 (Theor.Appl Genet.75 ： 30-36， 1987)、 Klein 等， Nature 327 ： 70-73(1987)、 Howell 等 (Science 208 ： 1265， 1980)、 Horsch 等(Science 227 ： 1229-1231， 1985)、 DeBlock 等， Plant Physiology 91 ： 694-701， 1989)、 Liu 和 Lomonossoff(J.Virol Meth， 105 ： 343-348， 2002) ； 美国专利 No.4,945,050 ； 5,036,006 ； 5,100,792 ； 6,403,865 ； 5,625,136( 所有这些文献均通过引用并入本文 )。
     可使用瞬时表达法表达本发明的构建体 ( 参见 Liu 和 Lomonossoff， 2002， Journal of Virological Methods， 105 ： 343-348， 其通过引用并入本文 )。或者， 可使用基于真空的 瞬时表达法， 如 Kapila 等 1997 Plant Science 122 ： 101-108( 其通过引用并入本文 ) 所 述。这些方法可包括， 例如但不限于农杆菌接种法或农杆菌侵染法， 然而， 也可使用如上文 所述的其他瞬时方法。使用农杆菌接种法或农杆菌侵染时， 含有期望核酸的农杆菌混合物 进入组织 ( 例如叶、 植物的地上部分 ( 包括茎、 叶和花 )、 植物的其他部分 ( 茎、 根、 花 ) 或整 个植株 ) 的细胞间隙中。穿过表皮后， 农杆菌感染细胞并将 t-DNA 拷贝移至细胞中。t-DNA 以附加体形式转录并且 mRNA 被翻译， 使目的蛋白在感染细胞中产生， 然而， t-DNA 在核内的 传代是瞬时的。
     本发明提供的包含嵌合 HA 的 VLP 可与现有流感疫苗组合使用， 以补充所述疫苗使 其更加有效， 或降低所需的施用剂量。 如本领域技术人员所已知的， 疫苗可针对一种或更多 种流感病毒。 合适的疫苗的实例包括但不限于从 Sanofi-Pasteur、 ID Biomedical、 Merial、 Sinovac、 Chiron、 Roche、 MedImmune、 GlaxoSmithKline、 Novartis、 Sanofi-Ayentis、 Serono、 Shire Pharmaceuticals 等购得的疫苗。
     如期望， 可将本发明的 VLP 与本领域技术人员已知的合适佐剂混合。此外， VLP 可 用于疫苗组合物， 其含有用于治疗上述靶标生物的有效剂量 VLP。此外， 根据本发明生产的 VLP 可与使用不同流感蛋白质 ( 例如神经氨酸酶 (NA)) 得到的 VLP 相组合。
     因此， 本发明提供了用于诱导动物或靶标生物中针对流感病毒感染的免疫的方 法， 其包括施用有效剂量的疫苗， 所述疫苗含有一种或多于一种 VLP。疫苗可经口、 皮内、 鼻 内、 肌内、 腹腔内、 静脉内或皮下施用。
     本发明多个实施方案的组合物可包含两种或更多种流感毒株或亚型的 VLP。 “两种 或更多种” 是指两种、 三种、 四种、 五种、 六种、 七种、 八种、 九种、 十种或更多种毒株或亚型。 所示毒株或亚型可以是单一亚型 ( 例如， 所有都为 H1N1， 或所有都为 H5N1)， 或者可以是亚 型的组合。示例性亚型和毒株包括 H5/Indo、 H1/Bri、 H1/NC、 H3/Bri、 B/Flo。对毒株和亚 型之组合的选择可取决于对象可能暴露于流感的地区， 动物物种 ( 例如水禽类、 农业动物 ( 例如猪 ) 等 ) 与待免疫人群的接近程度以及所述动物物种携带、 暴露于或可能暴露于的 毒株， 对亚型或毒株内抗原漂移的预测， 或者这些因素的组合。 过去几年所使用的组合的实 例可见于世界卫生组织 (WHO) 保存的数据库 ( 见 URL ： who.int/csr/dieease/influenza/ vaccine recommendations1/en)。
     两种或更多种 VLP 可单独表达， 随后将纯化的或半纯化的 VLP 相组合。或者， VLP 可在同一宿主 ( 例如植物、 植物部分或植物细胞 ) 中共表达。VLP 可以期望的比例 ( 例如大 致相等的比例 ) 组合或生产， 或者可以组合以使一种亚型或毒株占组合物中 VLP 的大部分。
     因此， 本发明提供了包含两种或更多种毒株或亚型的 VLP 的组合物。
     还提供了包含包装材料和包含含有嵌合 HA 之 VLP 的组合物的产品。该组合物包 含生理上或药理上可接受的赋形剂， 包装材料可以包含标明组合物活性成分 ( 例如 VLP) 的 标签。还提供了包含组合物的试剂盒， 所述组合物包含编码本文所述嵌合 HA 之核酸以 及使用该核酸生产嵌合 HA 或包含嵌合 HA 的 VLP 的说明书。该试剂盒可用于生产包含嵌合 HA 的 VLP， 说明书可以包括， 例如在植物或植物细胞中表达核酸的信息， 从植物或植物组织 中收获和获得 VLP 的说明。
     在另一个实施方案中， 提供了用于制备药物的试剂盒， 其包含含有嵌合 HA 的 VLP 及其使用说明书。说明书可以包含制备药物的一系列步骤， 药物可用于在施用对象中诱导 治疗性或预防性免疫应答。 该试剂盒还可包含说明剂量浓度、 剂量间隔、 优选施用方法等的 说明书。
     本发明将通过下面的实施例更详细的说明。但是应当理解， 这些实施例仅用于说 明的目的， 不应以任何方式用于限制本发明的范围。
     本文描述的序列汇总如下。
    
    
    材料与方法
     1.HA 表达盒的组装
     A-pCAMBIAPlasto
     使用 Sambrook 和 Russell(2001 ； 其通过引用并入本文 ) 的一般分子生物学方案 完成所有操作。表 1 显示用于表达盒组装的寡核苷酸引物。第一个克隆步骤是组装受体 质粒， 其包含苜蓿质体蓝素基因的上游和下游调控元件。使用寡核苷酸引物 XmaI-pPlas. c(SEQ ID NO ： 1) 和 SacI-ATG-pPlas.r(SEQ ID NO ： 2) 从苜蓿基因组 DNA 中扩增质体蓝 素启动子和 5’ UTR 序列。所得扩增产物用 XmaI 和 SacI 消化并与预先经同样的酶消化的 pCAMBIA2300(Cambia， Canberra， Australia) 连接， 以形成 pCAMBIApromoPlasto。类似地， 使用引物 SacI-PlasTer.c(SEQ ID NO ： 3) 和 EcoRI-PlasTer.r(SEQ ID NO ： 4) 从苜蓿基因 组 DNA 中扩增质体蓝素基因的 3’ UTR 序列和终止子， 所得产物用 SacI 和 EcoRI 消化， 然后 插入到 pCAMBIApromoPlasto 的相同位点中， 以形成 pCAMBIAPlasto。
     B-Plasto- 天然 SP-H5A/ 印度尼西亚 /5/05( 构建体号 660)
     Epoch Biolabs(Sugar Land， TX， USA) 合 成 了 编 码 流 感 毒 株 A/ 印 度 尼 西 亚 /5/05(H5N1 ； 登录号 LANL ISDN125873) 之血凝素的片段。所产生的包含完整 H5 编码区 的片段示于 (SEQ ID NO ： 52， 图 17)， 该编码区包含天然信号肽， 其侧翼为紧邻起始 ATG 上 游 的 HindIII 位 点 以 及 紧 邻 终 止 密 码 子 (TAA) 下 游 的 SacI 位 点。 通 过 Darveau 等 (1995) 所示的基于 PCR 的连接方法将 H5 编码区克隆到基于质体蓝素的表达盒中。简 言 之， 使 用 引 物 Plato-443c(SEQ ID NO ： 5) 和 SpHA(Ind)-Plasto.r(SEQ ID NO ： 6)， 以 pCAMBIApromoPlasto 作为模板进行第一 PCR 扩增。平行地， 使用引物 Plasto-SpHA(SEQ ID NO ： 7) 和 HA(Ind)-Sac.r(SEQ ID NO ： 8)， 以 H5 编码片段 (SEQ ID NO ： 52 ； 图 17) 作为模板 进行第二扩增。 将由两个反应得到的扩增物混合， 将混合物作为模板， 使用 Plato-443c(SEQ ID NO ： 5) 和 HA(Ind)-Sac.r(SEQ ID NO ： 8) 作 为 引 物 进 行 第 三 反 应 ( 组 装 反 应 )。 用 BamHI( 在质体蓝素启动子中 ) 和 SacI( 在片段的 3’ 端 ) 消化所得片段， 并将其克隆到预先 用相同酶消化的 pCAMBIAPlasto 中。所得质粒称为 660， 其示于图 18 中 (SEQ ID NO ： 53)。
     C-Plasto-PDI SP-H1A/ 新喀里多尼亚 /20/99( 构建体号 540)
     将流感毒株 A/ 新喀里多尼亚 /20/99(H1N1)H1 基因的开放阅读框合成为两个片段 (Plant Biotechnology Institute， National Research Council， Saskatoon， Canada)。 所 合成的第一片段对应于缺少 5’ 端信号肽编码序列和 3’ 端跨膜结构域编码序列的野生型 H1 编码序列 (GenBank 登录号 AY289929 ； SEQ ID NO ： 54 ； 图 19)。片段的 5’ 端由编码 PDISP 的 末端核苷酸 ( 含有 BglII 限制性位点 ) 构成， 并且将 SacI/StuI 双位点添加在紧邻该片段 3’ 端终止密码子下游， 得到 SEQ ID NO ： 55( 图 20)。还合成了编码 H1 蛋白 C 端 ( 包含跨膜 结构域和胞质尾 ) 的第二片段， 其从 KpnI 位点至终止密码子， 其 3’ 侧翼是 SacI 和 StuI 限 制性位点 (SEQ ID NO.56 ； 图 21)。
     第一 H1 片段用 BglII 和 SacI 消化， 并克隆到含有质体蓝素启动子和 5’ UTR( 与苜 蓿蛋白质二硫键异构酶 (PDI) 基因 (32-103 位核苷酸 ； 登录号 Z11499 ； SEQ ID NO ： 57 ； 图
     22) 的信号肽融合 ) 之二元载体 (pCAMBIAPlasto) 的同样位点中， 得到位于质体蓝素调控 元件的下游的 PDI-H1 嵌合基因。基于质体蓝素的表达盒序列示于 SEQ ID NO.58( 图 23)， 其含有启动子和 BglII 限制性位点上游的 PDI 信号肽， 以及 SacI 位点下游的质体蓝素终止 子。通过将预先用 KpnI 和 SacI 消化的合成片段 (SEQ ID NO ： 56 ； 图 21) 插入到 H1 表达质 粒中来添加 H1 编码区的 C 端 ( 编码跨膜结构域和胞质尾 )。所得构建体称为 540， 其示于 SEQ ID NO.59( 图 24)。
     D-Plasto- 天然 SP-H1A/ 布里斯班 /59/07( 构建体号 774)
     按照下列步骤组装指导 A/ 布里斯班 /59/07 的 H1 表达的表达盒号 774。合成包含 完整血凝素编码序列 ( 从 ATG 到终止 ) 的合成片段， 其 3’ 侧翼是对应于质体蓝素 ATG 上游 前 84 个核苷酸以 DraIII 限制性位点起始的的苜蓿质体蓝素基因序列。该合成片段还包含 紧邻终止密码子下游的 SacI 位点。
     合成片段由 Top Gene Technologies(Montreal， QC， Cahada) 合成。所合成的片段 示于 SEQ ID NO.60( 图 25)。对于完整表达盒的组装， 将合成片段用 DraIII 和 SacI 消化并 克隆到预先用同样的酶消化的 pCAMBIAPlasto 中， 得到构建体 774(SEQ ID NO.61 ； 图 26)。
     E-CPMV HT-LC C51( 构建体号 828)
     CPMV-HT 表达盒使用 35S 启动子来控制包含目的编码序列之 mRNA 的表达， 目的编 码序列的 5′侧翼为来自豇豆花叶病毒 (CPMV)RNA2 的 1-512 位核苷酸 ( 其在 115 和 161 位 具有突变的 ATG) 并且 3′侧翼为来自 CPMV RNA2 的 3330-3481 位核苷酸 ( 对应于 3′ UTR) 和其后的 NOS 终止子。使用质粒 pBD-C5-1LC(Sainsbury 等， 2008 ； Plant Biotechnology Journal 6 ： 82-92 以及 PCT 公开 WO 2007/135480) 来组装基于 CPMV-HT 的血凝素表达盒。 使用基于 PCR 的连接方法 (Darveau 等， Methods in Neuroscience 26 ： 77-85(1995)) 实现 CPMV RNA2 第 115 和 161 位的 ATG 的突变。 使用 pBD-C5-1LC 作为模板进行两个单独的 PCR。 用于第一扩增的引物是 pBinPlus.2613c(SEQ ID NO ： 9) 和 Mut-ATG115.r(SEQ ID NO ： 10)。 用于第二扩增的引物是 Mut-ATG161.c(SEQ ID NO ： 11) 和 LC-C5-1.110r(SEQ ID NO ： 12)。 将 获得的两片段混合， 并用作使用引物 pBinPlus.2613c(SEQ ID NO ： 9) 和 LC-C5-1.110r(SEQ ID NO ： 12) 之第三扩增的模板。所得片段用 PacI 和 ApaI 消化， 并克隆至用同样的酶消化 的 pBD-C5-1LC 中。所得构建体称为 828， 其示于图 27 中 (SEQ ID NO ： 62)。
     F-H5A/ 印度尼西亚 /5/05 骨架中的 H1A/ 布里斯班 /59/07 受体结合 (RB) 结构域 ( 构建体号 690)
     使用 Darveau 等 (Methods in Neuroscience 26 ： 77-85(1995)) 报道的基于 PCR 连接方法， 用 H1A/ 布里斯班 /59/07 的 RB 结构域替换 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 中的 RB 结 构域来制备嵌合 HA。在第一轮 PCR 中， 将质体蓝素启动子区段融合到天然信号肽上， 使用 引物 Plasto-443c(SEQ ID NO ： 5) 和 E1H1B-E1H5I.r(SEQ ID NO ： 13)， 以构建体号 660(SEQ ID NO ： 53， 图 18) 为模板扩增 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 的 F’ 1 和 E1 结构域。使用引物 E1 H5N-E1 H1B.c(SEQ ID NO ： 14) 和 E2 H5I-RB H1B.r(SEQ ID NO ： 15)， 以构建体号 774(SEQ ID NO ： 61 ； 图 26) 为模板扩增含有 H1A/ 布里斯班 /59/07 之 RB 结构域编码序列的第二片 段。使用引物 RBH1B-E2 H5I.c(SEQ ID NO ： 16) 和 HA(Ind)-SacI.r(SEQ ID NO ： 8)， 以构 建体号 660(SEQ ID NO 53 ； 图 18) 为模板扩增含有 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 的 E2、 F’ 2、 F、 跨膜和胞质结构域的第三片段。然后混合扩增产物， 并用作使用引物 Plasto-443c(SEQ IDNO ： 5) 和 HA(Ind)-SacI.r(SEQ ID NO ： 8) 之第二轮扩增 ( 组装反应 ) 的模板。所得片段用 BamHI( 在质体蓝素启动子中 ) 和 SacI( 在终止密码子后 ) 消化， 并克隆进预先用同样的限 制性酶消化的构建体号 660(SEQ ID NO ： 53 ； 图 18) 中， 得到构建体号 690(SEQ ID NO ： 63)。 该构建体示于图 28 中。
     G-H5A/ 印度尼西亚 /5/05 骨架中的 H1A/ 布里斯班 /59/07 酯酶和受体结合结构域 (E1-RB-E2)( 构建体号 691)
     使用 Darveau 等 (Methods in Neuroscience 26 ： 77-85(1995)) 报道的基于 PCR 连接方法， 用 H1A/ 布里斯班 /59/07 的 E1-RB-E2 结构域替换 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 中的 E1-RB-E2 结构域来组装嵌合 HA。在第一轮 PCR 中， 将质体蓝素启动子区段融合到天然信号 肽上， 使用引物 Plasto-443c(SEQ ID NO ： 5) 和 E1H1B-F’ 1H5I.r(SEQ ID NO ： 17)， 以构建体 号 660(SEQ ID NO ： 53， 图 18) 为模板扩增 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 的 F’ 1 结构域。平行地， 扩增其他两个片段。使用引物 F’ 1H5N-E1H1B.c(SEQ ID NO ： 18) 和 F’ 2H5I-E2H1B.r(SEQ ID NO ： 19)， 以构建体号 774(SEQ ID NO ： 61 ； 图 26) 为模板扩增含有 H1A/ 布里斯班 /59/07 之 E1-RB-E2 结构域编码序列的第二片段。对于第三片段， 使用引物 E2H1B-F’ 2H5I.c(SEQ ID NO ： 20) 和 HA(Ind)-SacI.r(SEQ ID NO ： 8)， 以构建体号 660(SEQ ID NO 53 ； 图 18) 为 模板扩增 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 的 F’ 2、 F、 跨膜和胞质结构域。然后混合扩增产物， 并用 作使用引物 Plasto-443c(SEQ ID NO ： 5) 和 HA(Ind)-SacI.r(SEQ ID NO ： 8) 之第二轮扩增 ( 组装反应 ) 的模板。所得片段用 BamHI( 在质体蓝素启动子中 ) 和 SacI( 在终止密码子 后 ) 消化， 并克隆进预先用同样的限制性酶消化的构建体号 660(SEQ ID NO ： 53 ； 图 18) 中， 得到构建体号 691(SEQ ID NO ： 64)。该构建体示于图 29 中。
     H-H1A/ 新喀里多尼亚 /20/99 骨架中的 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 受体结合 (RB) 结 构域 ( 构建体号 696)
     使用 Darveau 等 (Methods in Neuroscience 26 ： 77-85(1995)) 报道的基于 PCR 连接方法， 用 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 的 RB 结构域替换 H1A/ 新喀里多尼亚 /20/99 中的 RB 结构域来制备嵌合 HA。在第一轮 PCR 中， 将质体蓝素启动子区段融合到苜蓿蛋白二硫键异 构酶信号肽 (PDISP ； 登录号 Z11499， SEQ ID NO ： 57 第 32-103 位核苷酸 ； 图 22) 上， 使用引 物 Plasto-443c(SEQ ID NO ： 5) 和 E1H5I-E1H1NC.r(SEQ ID NO ： 21)， 以构建体号 540(SEQ ID NO ： 59， 图 24) 为模板扩增 H1A/ 新喀里多尼亚 /20/99 的 F’ 1 和 E1 结构域。使用引物 E1H1NC-E1H5I.c(SEQ ID NO ： 22) 和 E2H1NC-RB H5I.r(SEQ ID NO ： 23)， 以构建体号 660(SEQ ID NO ： 53 ； 图 18) 为模板扩增含有 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 之 RB 结构域编码序列的第二片 段。 使用引物 RB H5I-E2 H1NC.c(SEQ ID NO ： 24) 和 HA-SacI.r(SEQID NO ： 25)， 以构建体号 F’ 2、 F、 跨膜 540(SEQ ID NO ： 59 ； 图 24) 为模板扩增含有 H1A/ 新喀里多尼亚 /20/99 的 E2、 和胞质结构域的第三片段。然后混合扩增产物， 并用作使用引物 Plasto-443c(SEQ ID NO ： 5) 和 HA-SacI.r(SEQ ID NO ： 25) 之第二轮扩增 ( 组装反应 ) 的模板。所得片段用 BglII 和 SacI 消化， 并克隆至预先用同样的限制性酶消化的构建体号 540(SEQ ID NO ： 59， 图 24) 中， 获得构建体号 696(SEQ ID NO ： 65)。该构建体示于图 30 中。
     I- 将 H1A/ 布里斯班 /59/2007 组装进 CPMV-HT 表达盒 ( 构建体号 732)
     按照以下所述将来自 H1A/ 布里斯班 /59/2007 的 HA 编码序列克隆进 CPMV-HT 中。 通过使用构建体号 774(SEQ ID NO ： 61 ； 图 26) 作为模板， 用引物 ApaI-H1B.c(SEQ ID NO ：26) 和 StuI-H1B.r(SEQ ID NO ： 27) 进行 PCR 扩增， 从而将限制性位点 ApaI( 紧邻 ATG 上游 ) 和 StuI( 紧邻终止密码子下游 ) 添加至血凝素编码序列中。所得片段用 ApaI 和 StuI 限制 性酶消化， 并克隆至用同样的酶消化的构建体号 828(SEQ ID NO ： 62， 图 27) 中。所得的盒 称为构建体号 732(SEQ ID NO ： 66， 图 31)。
     J- 将 SpPDI-H1A/ 布里斯班 /59/2007 组装进 CPMV-HT 表达盒 ( 构建体号 733)
     按照以下所述将编码苜蓿蛋白二硫键异构酶信号肽的序列 (PDISP ； SEQ ID NO ： 57 第 32-103 位核苷酸， 图 22 ； 登录号 Z11499) 与来自 A/ 布里斯班 /59/2007 之 H1 的 HA0 编码 序列融合， 并将所得片段克隆至 CPMV-HT 中。 通过使用构建体 774(SEQ ID NO ： 61， 图 26) 作 为模板， 用引物 SpPDI-H1B.c(SEQ ID NO ： 28) 和 SacI-H1B.r(SEQ ID NO ： 29) 扩增得到 H1 编码序列。所得片段在 H1 编码序列 5’ 侧翼为编码 PDISP 的最后几个核苷酸 ( 包含 BglII 限制性位点 )， 3’ 侧翼为 SacI 限制性位点。将该片段用 BglII 和 SacI 消化， 并克隆至预先 用同样的限制性酶消化的构建体号 540(SEQ ID NO ： 59， 图 24) 中。称为构建体号 787(SEQ ID NO 67) 的中间盒编码序列显示于图 32 中。通过使用构建体号 787(SEQ ID NO ： 67 ； 图 32) 作为模板， 用引物 ApaI-SpPDI.c(SEQ ID NO ： 30) 和 StuI-H1B.r(SEQ ID NO ： 27) 进行 PCR 扩增， 从而将限制性位点 ApaI( 紧邻 ATG 上游 ) 和 StuI( 紧邻终止密码子下游 ) 添加 至血凝素编码序列中。所得片段用 ApaI 和 StuI 限制性酶消化， 并克隆至用同样的酶消化 的构建体号 828(SEQ ID NO ： 62， 图 27) 中。所得的盒称为构建体号 733(SEQ ID NO ： 68， 图 33)。
     K- 在 CPMV-HT 表达盒中组装 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 骨架中的 H1A/ 布里斯班 /59/07 受体结合 (RB) 结构域 ( 构建体号 734)
     按 照 以 下 所 述 将 嵌 合 HA 的 编 码 序 列 ( 在 H5A/ 印 度 尼 西 亚 /5/05 骨 架 中 具 有 H1A/ 布 里 斯 班 /59/07 的 RB 结 构 域 ) 克 隆 到 CPMV-HT 中。 通 过 使 用 构 建 体 690(SEQ ID NO ： 63 ； 图 28) 作 为 模 板， 用 引 物 ApaI-H5(A-Indo).1c(SEQ ID NO ： 31) 和 H5(A-Indo)-StuI.1707r(SEQ ID NO ： 32) 进行 PCR 扩增， 从而将限制性位点 ApaI( 紧邻 ATG 上游 ) 和 StuI( 紧邻终止密码子下游 ) 添加至嵌合血凝素编码序列中。所得片段用 ApaI 和 StuI 限制性酶消化， 并克隆至用同样的酶消化的构建体号 828(SEQ ID NO ： 62， 图 27) 中。 所得的盒称为构建体号 734(SEQ ID NO ： 69， 图 34)。
     L- 将 SpPDI-H3A/ 布里斯班 /10/2007 组装进 CPMV-HT 表达盒 ( 构建体号 736)
     按照以下所述将编码苜蓿 PDI 信号肽的序列与来自 H3A/ 布里斯班 /10/2007 的 HA0 融合， 并克隆至 CPMV-HT 中。首先， 合成包含完整血凝素编码序列 ( 从 ATG 到终止 ) 的 合成片段， 其 3’ 侧翼是对应于质体蓝素 ATG 上游前 84 个核苷酸 ( 以 DraIII 限制性位点起 始 ) 的苜蓿质体蓝素基因序列。该合成片段还包含紧邻终止子之后的 SacI 位点。合成片 段由 TopGene Technologies(Montreal， QC， Canada) 合成。所合成的片段示于 SEQ ID NO ： 70( 图 35)， 并进一步用作基于 PCR 的连接的模板。
     其次， 按照以下所述将苜蓿蛋白二硫键异构酶 (PDISP)( 核苷酸 32-103 ； 登录号 Z11499 ； SEQ ID NO ： 57 ； 图 22) 信号肽与紧邻 ATG 上游的 ApaI 限制性位点和终止密码子下 游的 StuI 限制性位点一起连接到来自 A/ 布里斯班 /10/2007 之 H3 的 HA0 编码序列上。使 用 Darveau 等 (Methods in Neuroscience 26 ： 77-85(1995)) 报道的基于 PCR 的连接方法， 将 PDISP 与 H3 编码序列连接。在第一轮 PCR 中， 使用引物 ApaI-SpPDI.c(SEQ ID NO ： 30)和 H3B-SpPDI.r(SEQ ID NO ： 33)， 以构建体 540(SEQ ID NO ： 59 ； 图 24) 为模板扩增 PDISP 信号肽。平行地， 使用引物 SpPDI-H3B.c(SEQ ID NO ： 34) 和 StuI-H3B.r(SEQ ID NO ： 35)， 以先前合成的片段 (SEQ ID NO ： 70 ； 图 35) 为模板扩增含有 H3A/ 布里斯班 /10/2007 部分 编码序列 ( 从密码子 17 到终止密码子 ) 的另一片段。然后混合扩增产物， 并用作使用引 物 ApaI-SpPDI.c(SEQ ID NO ： 30) 和 StuI-H3B.r(SEQ ID NO ： 35) 之第二轮扩增 ( 组装反 应 ) 的模板。所得片段用 ApaI 和 StuI 限制性酶消化， 并克隆至用同样的酶消化的构建体 号 828(SEQ ID NO ： 62， 图 27) 中。所得的盒称为构建体号 736(SEQ ID NO ： 71， 图 36)。
     M- 在 CPMV-HT 表 达 盒 中 组 装 嵌 合 SpPDI-H3A/ 布 里 斯 班 /10/2007( 胞 外 结 构 域 )+H5A/ 印度尼西亚 /5/2005(TmD+Cyto tail)( 构建体号 737)
     按照以下所述将编码苜蓿 PDI 信号肽的序列融合到 H3A/ 布里斯班 /10/2007 胞外 结构域和 H5A/ 印度尼西亚 /5/2005 的跨膜和胞质结构域上， 并克隆到 CPMV-HT 中。使用 Darveau 等 (Methods in Neuroscience 26 ： 77-85(1995)) 报道的基于 PCR 的连接方法， 将 PDISP-H3 编码序列与 H5 跨膜结构域融合。在第一轮 PCR 中， 通过使用引物 ApaI-SpPDI. c(SEQ ID NO ： 30) 和 TmD H5I-H3B.r(SEQ ID NO ： 36)， 以构建体号 736(SEQ ID NO ： 71 ； 图 36) 为模板扩增产生包含 PDISP 信号肽和 H3 布里斯班胞外结构域的片段。平行地， 使 用 引 物 H3B-TmD H5I.c(SEQ ID NO ： 37) 和 H5(A-Indo)-StuI.1707r(SEQ ID NO ： 32)， 以 构建体号 660(SEQ ID NO ： 53 ； 图 18) 为模板扩增含有 H5 印度尼西亚之跨膜和胞质结构 域的另一片段。然后混合扩增产物， 并用作使用引物 ApaI-SpPDI.c(SEQ ID NO ： 30) 和 H5(A-Indo)-StuI.1707r(SEQ ID NO ： 32) 之第二轮扩增 ( 组装反应 ) 的模板。所得片段用 ApaI 和 StuI 限制性酶消化， 并克隆至用同样的酶消化的构建体号 828(SEQ ID NO ： 62， 图 27) 中。所得的盒称为构建体号 737(SEQ ID NO ： 72， 图 37)。
     N- 将 SpPDI-HA B/ 佛罗里达 /4/2006 组装进 CPMV-HT 表达盒 ( 构建体号 739)
     按照以下所述将编码苜蓿 PDI 信号肽的序列与来自 HA B/ 布里斯班 /4/2006 的 HA0 融合， 并克隆至 CPMV-HT 中。首先， 合成包含完整血凝素编码序列 ( 从 ATG 到终止 ) 的 合成片段， 其 3’ 侧翼是对应于质体蓝素 ATG 上游前 84 个核苷酸 ( 以 DraIII 限制性位点起 始 ) 的苜蓿质体蓝素基因序列。合成片段还包含紧邻终止密码子之后的 SacI 限制性位点。 该合成片段由 Epoch Biolabs(Sugar Land， Texas， USA) 合成。所合成的片段示于 SEQ ID NO73( 图 38)， 并进一步用作基于 PCR 的连接的模板。
     其次， 按照以下所述将苜蓿蛋白二硫键异构酶 (PDISP)(SEQ ID NO ： 57 核苷酸 32-103 位 ； 图 22 ； 登录号 Z11499) 信号肽与紧邻上游 ATG 的 ApaI 限制性位点和终止密码 子下游的 StuI 限制性位点一起连接到来自 B/ 佛罗里达 /4/2006 之 HA 的 HA0 编码序列上。 使用 Darveau 等 (Methods in Neuroscience 26 ： 77-85(1995)) 报道的基于 PCR 的连接方 法， 将 PDISP 与 HA 编码序列连接。在第一轮 PCR 中， 使用引物 ApaI-SpPDI.c(SEQ ID NO ： 30) 和 HBF-SpPDI.r(SEQ ID NO ： 38)， 以构建体号 540(SEQ ID NO ： 59 ； 图 24) 为模板扩增 PDISP 信号肽。平行地， 使用引物 SpPDI-H3B.c(SEQ ID NO ： 39) 和 StuI-HBF.r(SEQ ID NO ： 40)， 以先前合成的片段 (SEQ ID NO ： 73 ； 图 38) 为模板扩增含有来自 B/ 佛罗里达 /4/2006 之 HA 的部分编码序列 ( 从密码子 16 到终止密码子 ) 的另一片段。然后混合扩增产物， 并 用作使用引物 ApaI-SpPDI.c(SEQ ID NO ： 30) 和 StuI-HBF.r(SEQ IDNO ： 40) 之第二轮扩增 ( 组装反应 ) 的模板。所得片段用 ApaI 和 StuI 限制性酶消化， 并克隆至用同样的酶消化的构建体号 828(SEQ ID NO ： 62， 图 27) 中。所得的盒称为构建体号 739(SEQ ID NO ： 74， 图 39)。 O- 在 CPMV-HT 表达盒中组装嵌合 SpPDI-HA B/ 佛罗里达 /4/2006( 胞外结构域 )+H5A/ 印度尼西亚 /5/2005(TmD+Cyto tail)( 构建体号 745)。
     按照以下所述将编码苜蓿 PDI 信号肽的序列融合到 HA B/ 佛罗里达 /4/2006 胞外 结构域和 H5A/ 印度尼西亚 /5/2005 的跨膜和胞质结构域上， 并克隆到 CPMV-HT 中。使用 Darveau 等 (Methods in Neuroscience 26 ： 77-85(1995)) 报道的基于 PCR 的连接方法， 将 PDISP-B/ 佛罗里达 /4/2006 胞外结构域编码序列与 H5 跨膜和胞质结构域融合。在第一轮 PCR 中， 使用引物 ApaI-SpPDI.c(SEQ ID NO ： 30) 和 TmD H5I-B Flo.r(SEQ ID NO ： 41)， 以构 建体号 739(SEQ ID NO ： 74 ； 图 39) 为模板扩增产生包含与 HA B/ 佛罗里达 /4/2006 胞外结 构域融合的 PDISP 信号肽的片段。平行地， 使用引物 B Flo-TmD H5I.c(SEQ ID NO ： 42) 和 H5(A-Indo)-StuI.1707r(SEQ ID NO ： 32)， 以构建体号 660(SEQ ID NO ： 53 ； 图 18) 为模板扩 增含有 H5 印度尼西亚跨膜和胞质结构域的另一片段。然后混合扩增产物， 并用作使用引物 ApaI-SpPDI.c(SEQ ID NO ： 30) 和 H5(A-Indo)-StuI.1707r(SEQ ID NO ： 32) 之第二轮扩增 ( 组装反应 ) 的模板。所得片段用 ApaI 和 StuI 限制性酶消化， 并克隆至用同样的酶消化 的构建体号 828(SEQ ID NO ： 62， 图 27) 中。所得的盒称为构建体号 745(SEQ ID NO ： 75， 图 40)。
     P- 在 2X35S-CPMV-HT 表达盒中组装嵌合 SpPDI-HA B/ 佛罗里达 /4/2006+H5A/ 印 度尼西亚 /5/2005(TmD+Cyto tail)( 构建体号 747)
     按照以下所述将编码苜蓿 PDI 信号肽的序列融合到来自 HA B/ 佛罗里达 /4/2006 的 HA0 和 H5A/ 印度尼西亚 /5/2005 的跨膜和胞质结构域上， 并克隆到 2X35S-CPMV-HT 中。 使用 Darveau 等 (Methods in Neuroscience 26 ： 77-85(1995)) 报道的基于 PCR 的连接方 法进行启动子转换。使用引物 PacI-MCS-2X35S.c(SEQ ID NO ： 89) 和 CPMV 5’ UTR-2X35S. r(SEQ ID NO ： 90) ：
    以含有 2X35S 启动子的质粒为模板通过 PCR 扩增含有 2X35S 启动子 (SEQ ID NO ： 88 ： 图 50A) 的第一片段。 平行地， 使用引物 2X35S-CPMV 5’ UTR.c(SEO ID NO ： 91) 和 ApaI-M prot.r(SEO ID NO ： 92) ：
    以构建体 745(SEQ ID NO ： 75 ； 图 40) 为模板进行第二 PCR。然后混合所得的两种 片段并用作使用引物 PacI-MCS-2X35S.c(SEQ ID NO ： 89) 和 ApaI-M prot.r(SEQ ID NO ： 92) 之第二轮 PCR( 组装反应 ) 的模板。所得片段用 PacI 和 ApaI 消化， 并克隆至用同样的酶消 化的构建体 745(SEQ ID NO ： 75， 图 40) 中。 表达盒称为构建体 747(SEQ ID NO ： 93)， 其序列 示于图 50B 中。
     2. 伴侣蛋白表达盒的组装
     组装了两种热休克蛋白 (Hsp) 表达盒。在第一种盒中， 拟南芥 ( 哥伦比亚生态 型 ) 胞浆 HSP70(Lin 等 (2001)Cell stress and Chaperones 6 ： 201-208 中的 Athsp70-1) 的表达被苜蓿亚硝酸还原酶 (Nir) 和苜蓿质体蓝素启动子的嵌合启动子组合元件 (Nir/ Plasto) 控制。还组装了第二种盒， 其包含嵌合 Nir/Plasto 启动子控制下的苜蓿胞浆 HSP40(MsJ1 ； Frugis 等 (1999)Plant Molecular Biology 40 ： 397-408) 编码区。
     首先， 组装了在植物二元载体中含有苜蓿亚硝酸还原酶启动子 (Nir)、 GUS 报 告基因和 NOS 终止子的接纳质粒 (acceptor plasmid)。用 HindIII 和 EcoRI 消化质粒 pNir3K51( 先前描述于美国专利 No.6,420,548 中 )。将所得片段克隆进用同样的限制性酶 消化的 pCAMBIA2300(Cambia， Canberra， Australia) 中， 得到 pCAMBIA-Nir3K51。
     通 过 基 于 PCR 的 连 接 方 法 (Darveau 等， Methods in Neuroscience 26 ： 77-85(1995))， 将 Hsp70 和 Hsp40 的编码序列分别克隆进接纳质粒 pCAMBIANir3K51 中。
     对于 Hsp40， 使用引物 Hsp40Luz.1c(SEQ ID NO ： 43) 和 Hsp40Luz-SacI.1272r(SEQ ID NO ： 44)， 通 过 RT-PCR 从 苜 蓿 (Rangclander 生 态 型 ) 叶 总 RNA 中 扩 增 Msj1 编 码 序 列 (SEQ ID NO ： 76 ； 图 41)。使用构建体 660(SEQ ID NO ： 53 ； 图 18) 作为模板， 用引物 Plasto-443c(SEQ ID NO ： 5) 和 Hsp40Luz-Plasto.r(SEQ ID NO ： 45) 进行第二扩增。然后 混合 PCR 产物， 并用作使用引物 Plasto-443c(SEQ ID NO ： 5) 和 Hsp40Luz-SacI.1272r(SEQ ID NO ： 44) 之第三扩增 ( 组装反应 ) 的模板。所得片段用 HpaI( 在质体蓝素启动子中 ) 消 化， 并克隆进预先用 HpaI( 在 Nir 启动子中 ) 和 SacI 消化并用 T4DNA 聚合酶处理以产生平 末端的 pCAMBIANir3K51 中。筛选正确取向的所得克隆， 并测序以检验序列完整性。所得质 粒称为 R850， 其示于图 42 中 (SEQ ID NO ： 77)。使用引物 Hsp70Ara.1c(SEQ ID NO ： 46) 和 Hsp70Ara-SacI.1956r(SEQ ID NO ： 47)， 通过 RT-PCR 从拟南芥叶 RNA 中扩增 Athsp70-1 的 编码区。使用构建体 660(SEQ ID NO ： 53， 图 18) 作为模板， 用引物 Plato-443c(SEQ ID NO ： 5) 和 Hsp70Ara-Plasto.r(SEQ ID NO ： 48) 进行第二扩增。然后混合 PCR 产物， 并作使用引 物 Plasto-443c(SEQ ID NO ： 5) 和 Hsp70ARA-SacI.1956r(SEQ ID NO ： 47) 之第三扩增 ( 组 装反应 ) 的模板。所得片段用 HpaI( 在质体蓝素启动子中 ) 消化， 并克隆进用 HpaI( 在 Nir 启动子中 ) 和 SacI 消化并用 T4DNA 聚合酶处理以产生平末端的 pCAMBIANir3K51 中。筛选 正确取向的所得克隆， 并测序以检验序列完整性。所得质粒称为 R860， 其示于图 43 中 (SEQ ID NO ： 78)。
     按照以下所述组装双 Hsp 表达质粒。 R860(SEQ ID NO ： 78 ； 图 43) 用 BsrBI(NOS 终 止子下游 ) 消化， 用 T4DNA 聚合酶处理以产生平末端， 并用 SbfI( 嵌合 NIR/Plasto 启动子 的上游 ) 消化。将所得片段 ( 嵌合 Nir/Plasto 启动子 -HSP70 编码序列 -Nos 终止子 ) 克 隆进预先用 SbfI 和 SmaI( 均位于嵌合 Nir/Plasto 启动子上游的多克隆位点中 ) 消化的 R850(SEQ ID NO ： 77 ； 图 42) 中。所得质粒称为 R870， 其示于图 44 中 (SEQ ID NO ： 79)。3. 其他表达盒的组装
     HcPro 表达盒
     如 Hamilton 等 (2002) 所述制备 HcPro 构建体 (35HcPro)。对所有克隆进行测 序以证实构建体的完整性。通过电穿孔 (Mattanovich 等， 1989) 用质粒转化根瘤农杆菌 (Agrobacteium tumefaciens)(AGL1 ； ATCC， Manassas， VA 20108， USA)。通过限制性图谱证 实所有根瘤农杆菌株的完整性。
     P19 表达盒
     通 过 基 于 PCR 的 连 接 方 法 (Darveau 等， Methods in Neuroscience 26 ： 77-85(1995)) 将番茄丛矮病毒 (TBSV)p19 蛋白的编码序列与苜蓿质体蓝素表达盒连接。 在 第一轮 PCR 中， 使用构建体 660(SEQ ID NO ： 53) 作为模板， 用引物 Plasto-443c(SEQ ID NO ： 5) 和 supP19-plasto.r(SEQ ID NO ： 49) 扩增质体蓝素启动子的区段。平行地， 使用构建体 35S ： p19( 如 Voinnet 等， The Plant Journal 33 ： 949-956(2003) 所述 ) 作为模板， 用引物 supP19-1c(SEQ ID NO ： 50) 和 SupP19-SacI.r(SEQ ID NO ： 51) 扩增含有 p19 编码序列的另 一片段。 然后混合扩增产物， 并用作使用引物 Plasto-443c(SEQ ID NO ： 5) 和 SupP19-SacI. r(SEQ ID NO ： 51) 之第二轮扩增 ( 组装反应 ) 的模板。所得片段用 BamHI( 在质体蓝素启 动子中 ) 和 SacI( 在 p19 编码序列末端 ) 消化， 并克隆进预先用同样的限制性酶消化的构 建体号 660(SEQ ID NO ： 53 ； 图 18) 中， 得到构建体号 R472。质粒 R472 示于图 45 中。
     构建体号 443
     构建体号 443 对应 pCAMBIA2300( 空载体 )。
     表 1. 用于表达盒组装的寡核苷酸引物。
    
    
    表2： 用于表达带有天然或 PDI 信号肽的流感血凝素的农杆菌菌株农杆菌菌株 AGL1/540 AGL1/774 AGL1/787 AGL1/732 AGL1/736 AGL1/660 AGL1/739 AGLI/828 AGLI/690 AGLI/691 AGLI/696 AGLI/733 表达的 HA H1(A/ 新喀里多尼亚 /20/99) H1(A/ 布里斯班 /59/2007) H1(A/ 布里斯班 /59/2007) H1(A/ 布里斯班 /59/2007) H3(A/ 布里斯班 /10/2007) H5(A 印度尼西亚 /5/2005) B(B/ 佛罗里达 /4/2006) CPMV HT-LC C51 H1/Bris RB+H5/Indo SDC H1/Bri E1-RB-E2+H5SDC H5/Indo RB+H1/NC SDC H1/Bri 信号肽 PDI 天然 PDI 天然 PDI 天然 PDI C51LC 天然 天然 PDI PDI 表达盒 质体蓝素 质体蓝素 质体蓝素 35S/CPMV-HT 35S/CPMV-HT 质体蓝素 35S/CPMV-HT 35S/CPMV-HT Plasto Plasto Plasto 35S/CPMV-HT40CN 102482328 A AGLI/734 AGLI/737 AGLI/745 AGL1/747
    说H1/Bri RB+H5/Indo SDC明书天然 PDI PDI PDI 35S/CPMV-HT 35S/CPMV-HT 35S/CPMV-HT 2X35S/CPMV-HT39/45 页H3/Bri 胞外结构域 +H5/Indo TDC B/Flo 胞外结构域 _H5/Indo TDC B/Flo 胞外结构域 _H5/Indo TDC4. 植物生物质的准备、 接种、 农杆菌侵染和收获
     在 填 装 市 售 泥 炭 基 质 的 平 地 上 从 种 子 培 养 本 塞 姆 氏 烟 草 (Nicotiana benthamiana)。使植物以 16/8 光照周期生长在温室中， 温度放方案白天 25℃ / 晚上 20℃。 播种 3 周后， 挑出各株幼苗， 移栽到盆中， 并在同样的环境条件下在温室中再生长 3 周。转 化前， 在以下所述的不同时间通过掐掉植物的芽或通过化学处理植物而除去顶芽和腋芽。
     在补充有 10mM 2-[N- 吗啉 ] 乙磺酸 (MES)、 20μM 乙酰丁香酮、 50μg/ml 卡那霉 素和 25μg/ml 羧苄青霉素的 YEB 培养基 (pH 5.6) 中培养用每种构建体转染的农杆菌， 直 至其 OD600 为 0.6 至 1.6。使用前将农杆菌混悬液离心并重悬在侵染培养基 (10mM MgCl2 和 10mM MES， pH 5.6) 中。如 Liu 和 Lomonossoff(2002， Journal of Virological Methods， 105 ： 343-348) 所述进行注射器侵染。对于真空侵染， 将根瘤农杆菌混悬液离心， 重悬在侵 染培养基中， 并储存在 4℃过夜。在侵染当天， 将分批培养物在 2.5 倍培养物体积中稀释并 在使用前温热。在 20-40 托真空下， 使本塞姆氏烟草或普通烟草 (N.tabacum) 的整个植株 倒置于气密性不锈钢罐中的细菌混悬液中 2 分钟。注射器或真空侵染后， 将植株移回温室 中培养 4-5 天直至收获。除非另外指明， 否则所有侵染均通过与 AGL1/35S-HcPro 以 1 ∶ 1 共侵染来进行， 具有 CPMV-HT 盒的毒株除外 ( 其与毒株 AGL1/R472 以 1 ∶ 1 共侵染 )。
     5. 叶片取样和总蛋白质提取
     培养后， 收获植株的地上部分， 冷冻在 -80℃， 破碎成碎片。通过将每个冷冻破碎 植物材料的样品在 3 倍体积的冷 50mM Tris(pH 8.0)0.15M NaCl， 0.04％焦亚硫酸钠和 1mM 苯甲基磺酰氟中匀浆 (Polytron) 来提取总的可溶性蛋白质。匀浆后， 于 4℃下以 20,000g 离心浆液 20 分钟， 将这些澄清的粗提物 ( 上清液 ) 用于分析。使用牛血清白蛋白作为参照 标准， 通过 Bradford 测定 (Bio-Rad， Hercules， CA) 来测定澄清的粗提物的总蛋白质含量。
     6. 蛋白质分析和免疫印迹
     蛋白浓度通过 BCA 蛋白测定 (Pierce Biochemicals， Rockport IL) 来测定。在还 原条件下通过 SDS-PAGE 分离蛋白质， 并用考马斯蓝染色。对经染色的凝胶进行扫描， 并使 用 ImageJ Software(NIH) 进行密度分析。
     用丙酮来沉淀来自 SEC 洗脱级分的蛋白质 (Bollag 等， 1996)， 重悬在 1/5 体积的 平衡 / 洗脱缓冲液中， 在还原条件下通过 SDS-PAGE 分离并电转移到聚偏氟乙烯 (PVDF) 膜 (Roche Diagnostics Corporation， Indianapolis， IN) 上用于免疫检测。 在免疫印迹之前， 用 Tris 缓冲盐水 (TBS-T) 中 5％脱脂奶和 0.1％ Tween-20 在 4℃下封闭膜 16-18 小时。
    通过用 2μg/ml 的合适抗体 ( 表 6)( 在 2％脱脂奶、 0.1％ TBS-Tween20 中 ) 孵育 进行免疫印迹。 用于化学发光检测的第二抗体示于表 4 中， 如所示将其在 2％脱脂奶、 0.1％
     TBS-Tween 20 中稀释。使用 luminol(Roche Diagnostics Corporation) 作为底物， 通过 化学发光检测免疫反应性复合物。使用 EZ-Link Plus 活化辣根过氧化物酶缀合试剂盒 (Pierce， Rockford， IL) 进行人 IgG 抗体的辣根过氧化物酶缀合。用作检测 H1、 H3 和 B 亚 型之对照的失活全病毒 (WIV) 从 National Institute for Biological Standards and Control(NIBSC) 购得。
     表3： 用于所表达蛋白质免疫印迹的电泳条件、 抗体和稀释
    FII ： Fitzgerald Industries International， Concord， MA， USA ；
     NIBSC ： National Institute for Biological Standards and Control ；
     JIR ： Jackson ImmunoResearch， West Grove， PA， USA ；
     ITC ： Immune Technology Corporation， Woodside， N Y， USA ；
     7.SEC 前的澄清和浓缩
     为了改善分辨率和增加洗脱级分的信号， 使用以下方法对待加载到体积排阻色谱 上的提取物粗蛋白提取物进行澄清和浓缩。 提取物在 4℃下以 70000g 离心 20 分钟， 沉淀通 过用 1 体积 ( 相比最初的提取物体积 ) 的提取缓冲液 (50mM Tris， pH8.0， 0.15M NaCl) 重 悬来清洗两次， 并在 4℃下以 70000g 离心 20 分钟。获得的沉淀重悬在 1/3 体积 ( 相比最初 的提取物体积 ) 中， 加入 20％ (w/v)PEG3350 然后在冰上孵育 1 小时使蛋白 ( 包括 VLP) 沉 淀。在 4℃下以 10000g 离心 20 分钟回收沉淀的蛋白质， 并重悬在 1/15 体积 ( 相比最初的 提取物体积 ) 的提取缓冲液中。完全重悬蛋白质后， 在 4℃下以 20000g 离心 5 分钟沉淀不 溶物， 回收清澈的上清液。
     8. 蛋白质提取物的体积排阻色谱
     装 填 32ml SephacrylTMS-500 高 分 辨 率 珠 (S-500HR ： GE Healthcare， Uppsala， Sweden， 货 号 17-0613-10) 的 体 积 排 阻 色 谱 (SEC) 柱， 用 平 衡 / 洗 脱 缓 冲 液 (50mM 的
     Tris(pH8)， 150mM NaCl) 平衡。将 1.5mL 粗蛋白质提取物加载到该柱上， 然后用 45mL 平 衡 / 洗脱缓冲液进行洗脱步骤。以 1.5mL 级分收集洗脱液， 洗脱级分的相对蛋白质含量这 样通过将 10μL 级分与 200μL 稀释的 Bio-Rad 蛋白染色试剂 (Bio-Rad， Hercales， CA) 混 合来监测。用 2 倍柱体积的 0.2N NaOH 清洗该柱， 然后用 10 倍柱体积的 50mM Tris(pH8)、 150mM NaCl 和 20％乙醇清洗。 每次分离之后用蓝葡聚糖 2000(GE HealthCare Bio-Science Corp.， Piscataway， NJ， USA) 校准柱。在每次分离之间对蓝葡聚糖 2000 和宿主可溶性蛋白 质的洗脱曲线进行比较， 以确保所用柱之间的洗脱曲线的一致性。
     实施例 1 ： 流感亚型茎上 RB 和 / 或酯酶结构域的替换策略
     H5/Indo 的 RB 亚结构域可以用 H1、 H3 或 B HA 的 RB 亚结构域替换。 得到的嵌合 HA 提供 SDC H5/Indo 以形成 VLP， 并显示包含 H1、 H3 或 B 免疫原性位点的 RB 亚结构域。H5/ Indo RB 亚结构域可以插入到 H1 茎上 (H1/NC)。图 15A 和 15B 显示了所示亚结构域融合位 点的氨基酸序列， 相应亚结构域的氨基酸序列显示在图 2( 构建体 690、 734、 696 和 691) 和 表 4( 构建体 900 和 745) 和表 5( 构建体 910、 920 和 930) 中。图 2 和表 4、 5 中显示的氨基 酸序列不包含信号肽序列。
     表 4 亚结构域和嵌合流感 HA。包含异源 RB 亚结构域的嵌合流感 HA。
    序列 SEQ ID NO ： 105 的 1-92 位氨基酸是 H5/Indo 的 F’ 1+E1 结构域 ； 93-259 位氨 基酸是 H3/ 布里斯班的 RB 头部结构域， 260-548 位氨基酸是 H5/Indo 的 E2+F’ 2 结构域。
     序列 SEQ ID NO ： 106 的 1-92 位氨基酸是 H5/Indo 的 F’ 1+E1 结构域 ； 93-276 位氨 基酸是 B/ 佛罗里达的 RB 头部结构域， 277-565 位氨基酸是 H5/Indo 的 E2+F’ 2 结构域。
     表 5 亚结构域和嵌合流感 HA。包含异源 RB 亚结构域的嵌合流感 HA。
    
    SEQ ID NO ： 107 的 1-42 位氨基酸是 H5/Indo 的 N 端 F’ 1 结构域 ； 43-228 位氨基 酸是 H3/ 布里斯班的 E1-RB-E2 头部结构域， 229-507 位氨基酸是 H5/Indo 的 F’ 2 结构域。
     SEQ ID NO ： 108 的 1-42 位氨基酸是 H5/Indo 的 N 端 F’ 1 结构域 ； 43-281 位氨基 酸是 B/ 佛罗里达的 E1-RB-E2 头部结构域 ； 282-556 位氨基酸是 H5/Indo 的 F’ 2 结构域。
     SEQ ID NO ： 109 的 1-42 位氨基酸是 H1/NC 的 N 端 F’ 1 结构域 ； 43-273 位氨基酸 是 H5/Indo 的 E1-RB-E2 头部结构域， 274-548 位氨基酸是 H1/NC 的 F’ 2 结构域。
     各个嵌合体的融合位点选择在邻近 ( 但不必然直接位于 ) 各个亚结构域的 N 和 C 端——不希望被理论约束， 选择这些融合位点以使嵌合 HA 的稳定性最大化。例如， 在 RB 亚 结构域的 N 端观察到结构和序列的保守性 (Ha 等 2002， EMBO J.21 ： 865-875 ； 在此通过引用 并入本文 )。 发现初级序列中变化较少的区域位于 E1 亚结构域 15 个氨基酸之前的 C-F Y-P 三联体中。此半胱氨酸参与在 HA 中保守的 3 号二硫桥 ( 参见图 46 和 47)。此半胱氨酸处 的连接可以为嵌合 HA 提供相对天然序列更加适合或更优的稳定性。RB 的 C 端提供保守特 征： 例如， 在比对中， 在所有 HA 中观察到的位点 1 处的保守丝氨酸残基和以 β 折叠起始的 E2 亚结构域 (Ha 等， 2002， EMBO J.21 ： 865-875 ； 其通过引用并入本文 )。因此， 此 RB 的 C 端 可以融合到 E2 亚结构域该 β 折叠结构的起始氨基酸上。并且， 对于在 H5/Indo SDC 上包 含 H1/NC、 H1Bri、 H3/Bri 或 B/Flo 的 RB 亚结构域的嵌合体和在 H1SDC 上包含 H5/Indo RB 但是在 H5 茎上 亚结构域的嵌合体 ( 共 6 个 )， 二硫桥模式没有变化或者没有实质性的变化， B RB 的杂交 HA 上添加了二硫桥 (8 号二硫键 )。添加此二硫桥不应当干扰 HA 的折叠 ( 因 为其位于 RB 结构域中， 并且半胱氨酸在序列中邻近 )， 并且可以提供更加稳定的杂交 HA。
     第一流感类型的 E1-RB-E2 亚结构域被替换为第二流感类型的 E1-RB-E2 亚结构 域。这种安排可以在 H5-VLP 表面显示更多的第二流感类型的氨基酸。在此实施例中， 将 H1、 H3 或 B 的 HDC 放置在 H5/IndoSDC 上， 将 H5/Indo 的 HDC 放置在 H1/NC SDC 上 ( 表 5)。
     用保守的半胱氨酸残基 ( 构成 HA 类型 A 中的 6 号二硫桥和 HA 类型 B 中的 7 号二 硫桥 ) 确定 HDC 的连接。E2 亚结构域 C 端的 HDC 连接用另一保守半胱氨酸残基确定， 其构 成 H5/Indo SDC 上流感类型 H1 或 H3 或者 H1SDC 上流感类型 H5 的 6 号二硫桥 (F’ 2 亚结构 域的第二氨基酸 )。对于乙型流感嵌合体， 在第一个半胱氨酸处建立连接， 该半胱氨酸构成 4 号二硫桥 ( 在 F’ 2 亚结构域上相隔 4 个氨基酸的位置， 并在 HA 之间保守 )。所得嵌合体 的二硫桥模式没有显示任何变化—— H1/H3/H5 杂交 HA 含有 6 个二硫桥， B 杂交 HA 具有 7 个二硫键。
     实施例 2 ： 用 H1A/ 布 里 斯 班 /59/2007 的 受 体 结 合 (RB) 或 受 体 结 合 和 酯 酶 (E1-RB-E2) 亚结构域替换 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 的相应部分 ： 嵌合体和天然形式的表达 的比较。
     为了将 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 的 VLP 高累积水平与 H1A/ 布里斯班 /59/2007 的 抗原性特点相联合， 设计了包含与 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 茎结构域簇融合的 H1A/ 布里斯 班 /59/2007 结构域的嵌合血凝素。表达 H5/H1 血凝素融合蛋白的表达盒显示于图 1， 产生 的成熟融合蛋白的氨基酸序列显示于图 2。
     为了比较 H5/H1 嵌合血凝素与其天然形式的累积水平， 用 AGL1/774、 AGL1/691 和 AGL1/690 侵染本塞姆氏烟草 (Nicotiana Benthamiana) 植株， 经过 6 天的孵育期后收获 叶。为了确定农杆菌侵染的叶中每种 HA 形式的累积水平， 从被侵染的叶组织中提取蛋白并 用抗 HA 单克隆抗体进行 Western 印迹分析。在用 AGL1/690 侵染的叶子提取物中检测到 约为 75kDa 的独特条带 ( 图 3)， 大小对应流感血凝素未切割的 HA0 形式， 但是在 AGL1/774 或 AGL1/691 中未检测到， 这表明包含与 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 骨架融合的 H1A/ 布里斯班 /59/2007 受体结合区的嵌合血凝素的累积水平高于 H1A/ 布里斯班 /59/2007 的天然形式 (AGL1/774)， 也高于联合 H1A/ 布里斯班 /59/2007 的酯酶和受体结合区和 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 骨架的嵌合血凝素。 用作阳性对照的灭活全病毒 (WIV)(H1A/ 布里斯班 /59/2007) 检 测为多个条带， 主要条带在约 80kDa 处， 对应 H1A/ 布里斯班 /59/2007 前体 HA0 的分子量。 这 些结果证明， 用 H1A/ 布里斯班 /59/2007 的受体结合区替换 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 的相应 部分产生嵌合血凝素， 其显示 H1 的抗原区并且其在植物中比天然 H1A/ 布里斯班 /59/2007 累积水平更高。但是， 其中 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 中酯酶和受体结合区被 H1A/ 布里斯班 /59/2007 的对应部分替换的嵌合血凝素在植物中没有累积到可以检测的水平。
     对将 H1A/ 布里斯班 /59/2007 的受体结合区与 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 骨架的融合 作为植物中呈递 H1 抗原之 VLP 的累积水平增加方法在基于 CPMV-HT 的强表达盒控制下进 行了再次评价。 还将此融合策略与增加累积水平的信号肽替换方法进行了比较。 在 CPMV-HT 控制下表达 H5/H1 血凝素融合蛋白的表达盒显示于图 8， 产生的成熟融合蛋白的氨基酸序 列显示于图 2。
     用 AGL1/732、 AGL1/733 或 AGL1/734 侵染本塞姆氏烟草植株， 6 天的孵育期后收 获烟草叶。为了确定农杆菌侵染的叶中每种 HA 形式的累积水平， 首先从被侵染的叶组织 中提取蛋白并用抗 H1( 布里斯班 ) 多克隆抗体进行 Western 印迹分析。在用 AGL1/732、AGL1/733 和 AGL1/734 侵染的叶提取物中检测到约为 75kDa 的独特条带 ( 图 6)， 大小对应 流感血凝素未切割的 HA0 形式， 但是， 虽然在所有分析的提取物中均检测到血凝素， 仍然可 以观察到累积水平的重要差异。在这些条件下， H1A/ 布里斯班 /59/2007 表达使用其天然 信号肽 (732) 几乎检测不到， 用 PDI 的信号肽替换信号肽后得到高累积水平的成熟 H1A/ 布 里斯班 /59/2007(733)， 嵌合 H5/H1 血凝素 (734) 累积水平最高。总之， 这些结果表明， 将 H1 的受体结合结构域与 H5 骨架融合导致呈递 H1 抗原之血凝素的高累积， 并且在植物中这 些融合蛋白的累积水平高于信号肽替换或未替换的天然形式所获得的累积水平。
     实施例 3 ： 用 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 的受体结合 (RB) 亚结构域替换 H1A/ 新喀里 多尼亚 /20/99 的相应部分。嵌合和天然形式的表达的比较。
     还评价了 H1 骨架 ( 来自 A/ 新喀里多尼亚 /20/99) 在呈递 H5 抗原区中的用途。 表 达 H1/H5 血凝素融合蛋白的表达盒显示于图 1， 产生的成熟融合蛋白的氨基酸序列显示于 图 2。
     为了比较 H1/H5 嵌合血凝素与其天然形式的累积水平， 用 AGL1/660 和 AGL1/696 侵染本塞姆氏烟草植株， 经过 6 天的孵育期后收获烟草叶。为了确定农杆菌侵染的叶子中 每种 HA 形式的累积水平， 从被侵染的叶组织中提取蛋白病用抗 H5( 印度尼西亚 ) 多克隆 抗体进行 Western 印迹分析。在用 AGL1/660 和 AGL1/696 侵染的叶提取物中检测到约为 75kDa 的独特条带 ( 图 7)， 大小对应流感血凝素未切割的 HA0 形式， 表明天然 H5A/ 印度尼 西亚 /5/05 和 H1/H5 嵌合血凝素两者均在植物中高水平累积。
     实施例 4 ： 用 H3 或 B 型流感的相应部分替换 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 的胞外结构 域。嵌合体和天然形式的表达的比较。
     评价了呈递 H3 和 B 型毒株血凝素抗原区同时增加它们在植物中的累积的以下策 略： 将 H3A/ 布里斯班 /10/2007 或 B 佛罗里达 /4/2006 的胞外结构域与来自 H5A/ 印度尼西 亚 /5/05 的跨膜和胞质亚结构域融合。表达 H5/H3 和 H5/B 血凝素融合蛋白的表达盒显示 于图 10， 融合边界的氨基酸显示于图 11。
     比较 H5/B 嵌合血凝素 (745) 与天然 HA B(739) 在本塞姆氏烟草植株中的累积水 平。 用 AGL1/739 和 AGL1/745 侵染植株， 经过 6 天的孵育期后收获烟草叶。 为了确定农杆菌 侵染的叶中每种 HA 形式的累积水平， 首先从被侵染的叶组织中提取蛋白并用抗 B( 佛罗里 达 ) 多克隆抗体进行 Western 印迹分析。 在用 AGL1/739 侵染的一个植株的叶提取物中检测 到约为 75kDa 的独特条带 ( 图 14)， 大小对应流感血凝素未切割的 HA0 形式， 而用 AGL1/745 侵染的 3 个植株显示相应血凝素阳性信号， 表明血凝素的 H5/B 嵌合形式比 B 血凝素天然形 式更经常获得高累积水平。
     类似地， 比较 H5/H3 嵌合血凝素 (737) 与其天然形式 (736) 在本塞姆氏烟草中的 累积水平。用 AGL1/736 和 AGL1/737 侵染植株， 经过 6 天的孵育期后收获烟草叶。为了确 定农杆菌侵染的叶子中每种 HA 形式的累积水平， 从被侵染的叶组织中提取蛋白病并用抗 H3( 布里斯班 ) 多克隆抗体进行 Western 印迹分析。在用 AGL1/736 和 AGL1/737 侵染的叶 提取物中检测到约为 75kDa 的独特条带 ( 图 15)， 大小对应流感血凝素未切割的 HA0 形式。 该结果表明来自 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 的跨膜和胞质亚结构域与 H3A/ 布里斯班 /10/2007 胞外结构域的融合获得与天然 H3A/ 布里斯班 /10/2007 累积水平类似的嵌合血凝素。
     使用体积排阻色谱评价来自 H5/B 嵌合血凝素 ( 构建体号 745) 表达的 VLP 生产。通过体积排阻色谱 (SEC) 在 SephacrylTM S-500HR 柱 (GE Healthcare Bio-Science Corp.， Piscataway， NJ， USA) 上对来自 AGL1/745 侵染植株的浓缩蛋白提取物 (1.5mL) 进行分级。 如图 16 所示， 蓝葡聚糖 (2M Da) 洗脱峰早在组分 8 中出现。将 200μL 每种 SEC 洗脱级分 中的蛋白质用丙酮沉淀法浓缩 (5 倍 ) 并用抗 B( 佛罗里达 ) 多克隆抗体进行 Western 印迹 分析 ( 图 16)， 嵌合血凝素主要出现在组分 7 中， 表明 HA 整合成高分子量结构。不希望被理 论束缚， 这表明嵌合 HA 蛋白组装成大型超结构或者其粘附到高分子量结构上。所获得的结 果表明， HA B 佛罗里达 /4/2006 胞外结构域与 H5A/ 印度尼西亚 /5/05 的跨膜和胞质亚结 构域构成的嵌合 HA 组装成高分子量颗粒， 并且这些高分子量颗粒的洗脱谱与流感 VLP 的不 同。
     实施例 5 ： H5/B 嵌合血凝素 ( 构建体 747 ； 包含与 H5/Indo TDC 融合的 B/Flo HDC 和 SDC) 与 Hsp70 和 Hsp40 共表达并与信号肽修饰相组合。
     在共同待决申请 PCT/CA2009/000032 中描述了在植物中表达 Hsp40 和 Hsp70 以及 与流感血凝素共表达。植物来源的胞浆 Hsp70 和 Hsp40( 构建体号 R870) 可以与嵌合血凝 素共表达以增加它们在植物中的累积水平。用含有表达期望嵌合 HA 之表达盒的 AGL1 和 AGL1/R870 以及 AGL1/35ShcPro 的混合物 ( 比例为 1 ∶ 1 ∶ 1) 的细菌悬液农杆菌侵染本塞 姆氏烟草植物进行共表达。
     评价在塞姆氏烟草植株中与 HSP40 和 HSP70 共表达的 H5/B 嵌合血凝素 ( 融合 H5/ Indo TDC 的 B/Flo HDC 和 SDC) 的累积水平。用 AGL1/747、 AGL1/747+AGL1/443( 空载体 ) 或 AGL1/747+AGL1/R870(HSP40/HSP70) 侵染植株， 经过 6 天的孵育期后收获烟草叶。为了 确定农杆菌侵染的叶中 H5/B 嵌合 HA 的累积水平， 首先从被侵染的叶组织中提取蛋白并用 抗 B( 佛罗里达 ) 多克隆抗体进行 Western 印迹分析。在用 AGL1/747+AGL1/R870 侵染的 3 株植株的叶提取物中检测到约为 75kDa 的独特条带 ( 图 50)， 大小对应流感血凝素未切割的 HA0 形式， 而 AGL1/747+ 对照载体 (443) 侵染的 3 个植株未显示信号 ( 在所使用的暴露条件 下 )， 表明 H5/B 嵌合形式的血凝素在与 HSP40 和 HSP70 伴侣蛋白共表达时高水平累积。
     所有引用的文献均通过引用并入本文， 就如同每个具体的文献均具体和单独显示 为通过引用并入本文的一样， 并且如同它们在本文中被完全给出一样。本文对参考文献的 引用不被解释为或认为是认同这些参考文献是本发明的现有技术。
     在说明书中大量使用了一些术语， 并且提供了定义帮助理解本发明的多个方面。 在说明书中使用的实例 ( 包括术语的实例 ) 仅用作说明目的， 而不旨在限制本发明实施方 案的范围和含义。数值范围包括定义范围的数值。在说明书中， 词语 “包含” 用作开放式术 语， 基本上等同于术语 “包括但不限于” ， 词语 “含有” 具有相应的含义。
     本发明的一个或多个目前优选的实施方案已通过示例方式进行了描述。 本发明包 括基本如上文所述和参照实施例和附图的所有实施方案、 修饰和变化。对本领域技术人员 来说显然的是， 在不偏离权利要求中限定的本发明范围的前提下， 可以进行一些变化和修 饰。 这些修饰的实例包括本发明任何方面以基本相同的方法为获得相同结果而进行的已知 等价方案的替换。47CN 102482328 A
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