包含血凝素的嵌合流感病毒样颗粒.pdf

1、10申请公布号CN102482328A43申请公布日20120530CN102482328ACN102482328A21申请号201080035066422申请日2010062561/220,16120090624USC07K14/11200601A01H5/00200601A61K39/145200601A61P31/16200601C12N15/44200601C12N15/82200601C12N7/00200601C12N7/01200601C07K19/0020060171申请人麦迪卡格公司地址加拿大魁北克72发明人马农科图雷米凯莱达吉斯皮埃尔奥列弗拉瓦路易斯菲利普韦齐纳马克安德烈德

2、奥斯特74专利代理机构北京集佳知识产权代理有限公司11227代理人顾晋伟卢蓓54发明名称包含血凝素的嵌合流感病毒样颗粒57摘要提供了在植物或植物部分中合成嵌合流感病毒样颗粒VIRUSLIKEPARTICLE，VLP的方法。该方法涉及在植物或植物部分中表达嵌合流感HA。本发明还涉及包含嵌合流感HA蛋白和植物脂质的VLP。本发明还涉及编码嵌合流感HA的核酸以及载体。VLP可用于配制流感疫苗，或者可用于加强现有的疫苗。30优先权数据85PCT申请进入国家阶段日2012020786PCT申请的申请数据PCT/CA2010/0009832010062587PCT申请的公布数据WO2010/148511E

3、N2010122951INTCL权利要求书1页说明书45页序列表110页附图45页按照条约第19条修改的权利要求书2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书45页序列表110页附图45页按照条约第19条修改的权利要求书2页1/1页21包含嵌合流感HA的多肽，所述嵌合流感HA包含茎结构域簇SDC、头部结构域簇HDC和跨膜结构域簇TDC，其中A所述SDC包含F1、F2和F亚结构域；B所述HDC包含RB、E1和E2亚结构域；C所述TDC包含TMD和CTAIL亚结构域；而且其中至少一个亚结构域来自第一流感HA，并且其他亚结构域来自一种或更多种第二流感HA。2权利要求1的多

4、肽，其中所述第一和第二流感HA独立地选自包含H1、H3、H5和B的组。3权利要求2的多肽，其还包含信号肽。4编码权利要求1所述多肽的核酸。5编码权利要求3所述多肽的核酸。6在植物中生产嵌合流感病毒样颗粒VLP的方法，其包括A向所述植物或其部分中引入权利要求5的核酸，和B在允许所述核酸表达的条件下孵育所述植物或其部分，从而生产所述VLP。7权利要求6的方法，其中在所述引入步骤步骤A中，以瞬时方式将所述核酸引入所述植物中。8权利要求6的方法，其中在所述引入步骤步骤A中，将所述核酸引入所述植物中以使所述核酸稳定。9权利要求6的方法，其还包括步骤C收获宿主和纯化所述VLP。10包含权利要求1所述多肽的

5、病毒样颗粒VLP。11权利要求10的VLP，其还包含植物特异性N聚糖或修饰的N聚糖。12组合物，其包含有效剂量的权利要求10所述VLP和可药用载体。13在对象中诱导针对流感病毒感染之免疫的方法，其包括施用权利要求20的病毒样颗粒。14权利要求13的方法，其中所述病毒样颗粒经口、皮内、鼻内、肌内、腹腔内、静脉内或皮下施用给对象。15植物或其部分，其包含权利要求1的多肽。权利要求书CN102482328A1/45页3包含血凝素的嵌合流感病毒样颗粒发明领域0001本申请要求于2009年6月24日提交的美国临时申请NO61/220,161的优先权。0002本发明涉及病毒样颗粒。更具体而言，本发明涉及包

6、含嵌合流感血凝素的病毒样颗粒和生产嵌合流感病毒样颗粒的方法。0003发明背景0004流感是由呼吸道病毒引起的人死亡的首要原因，在流感季节，估计全世界1020的人口被感染，每年导致250500,000的死亡。0005目前抗击人流感的方法是每年接种。疫苗通常是几种毒株的组合，这些毒株被预测为即将到来的流感季节的强势毒株DOMINANTSTRAIN，但是每年生产的疫苗剂数量不足以接种全世界人口。例如，根据目前的产量加拿大和美国获得足以免疫其约三分之一人口的疫苗剂，而仅有17的欧洲人口可接种疫苗在世界范围的流感大流行到来时，该产量是不够的。即使在给定年份中所需的年产量可以某种方式实现，但强势毒株逐年变

7、化，因此在一年中的低需求时间大量储备是不实际的。经济、大规模地生产有效的流感疫苗是政府和私营企业等极为关注的。0006流感血凝素HA表面糖蛋白是受体结合蛋白也是膜融合蛋白。它是具有相同亚基的三聚体，每个亚基包含两条二硫键连接的多肽HA1和HA2，它们来自前体HA0的蛋白水解切割，HA0的N端有信号肽序列，HA0的C端有膜锚定序列。形成HA1和HA2的切割产生较小多肽HA2的N端，HA2的C端有膜锚定序列。切割对膜融合活性是必需的，但对免疫原性不是必需的。HA2的N端序列被称为“融合肽”，因为类似疏水序列的切割也是其他病毒融合蛋白所需要的，并且该序列20个残基的合成肽类似物在体外与膜融合。000

8、7一般来说，球形“头部”的表面包含几个柔性环，其具有良好表征并且可变的抗原区域，称为位点A、B、C、D和E综述见WILEY等，1987ANNUREVBIOCHEM56365394。已描述了在一些位点例如B和E插入或替换短肽序列以进行免疫研究GARCIASASTR等1995BIOLOGICALS23171178。大小从53至246个氨基酸的表皮生长因子EGF、单链抗体SCFV和IGG的FC结构域已被插入到H7的N端，并且已成功表达嵌合体HATZIIOANNOU等，1999HUMANGENETHERAPY1015331544。最近，炭疽芽孢杆菌BACILLUSANTHRACIS保护性抗原的90和1

9、40个氨基酸的结构域已被融合到H3的氨基末端LI等，2005JVIROL79100031002。COPELANDCOPELAND等，2005JVIROL7964596471描述了在H3柄STALK上表达GP120ENVHIV表面糖蛋白，其中GP120结构域替换了HA的整个球状头部。0008已开发了几种重组产物作为候选重组流感疫苗。这些方法集中于甲型流感病毒HA和NA蛋白的表达、生产和纯化，包括用杆状病毒感染的昆虫细胞CRAWFORD等，1999VACCINE17226574；JOHANSSON，1999VACCINE17207380、病毒载体和DNA疫苗构建体OLSEN等，1997VACCIN

10、E15114956表达这些蛋白质。0009生产用于疫苗目的的非感染性流感病毒株是避免意外感染的一种方法。作为替代，已研究了用作培养病毒之替代物的病毒样颗粒VIRUSLIKEPARTICLE，VLP。VLP模拟说明书CN102482328A2/45页4病毒衣壳的结构，但缺少基因组，因此不能复制或提供用于再次感染的工具。目前流感病毒VLP的生产技术依赖于多种病毒蛋白的共表达，这种依赖性是这些技术的缺点，因为在大流行和每年流行的情形中，响应时间对于接种来说是至关重要的。需要更简单的VLP生产系统例如依赖于仅一种或几种病毒蛋白的表达而不需要表达非结构病毒蛋白来加快疫苗的开发。0010包膜病毒可在从被感

11、染细胞“出芽”时获得脂质包膜，并且从质膜或内部细胞器的膜获得膜。例如在哺乳动物细胞或杆状病毒细胞系统中，流感病毒从质膜出芽QUAN等2007JVIROL8135143524。已知仅有几种包膜病毒感染植物例如，番茄斑萎病毒TOSPOVIRUS和弹状病毒RHABDOVIRUS的成员。已知的植物包膜病毒的特征在于从宿主细胞的内膜出芽，而不是从质膜出芽。虽然已在植物宿主中生产了少量重组VLP，但它们均不来源于质膜，这引出了如下问题，即是否可以在植物中生产质膜来源的VLP，包括流感病毒VLP。0011在任何系统中形成VLP都对蛋白质结构要求很高改变对应于选定球状结构之表面环的短序列可能对多肽本身的表达没

12、有太大影响，但是缺乏证明这些改变影响VLP形成的结构研究。HA多个区域的协调和结构例如膜锚定序列，将球状头部与膜分隔开的三聚体柄或茎区域随病毒而进化，并且可能不能进行类似的改变而不对HA三聚体完整性和VLP的形成造成损失。0012在WO2009/009876中，本发明人已描述了流感HAVLP的生产。发明内容0013本发明涉及病毒样颗粒。更具体而言，本发明涉及包含嵌合流感血凝素的病毒样颗粒和生产嵌合流感血凝素病毒样颗粒的方法。0014本发明的一个目的是提供改进的嵌合流感病毒样颗粒VLP。0015本发明提供了包含嵌合流感HA的多肽，该嵌合流感HA包含茎结构域簇STEMDOMAINCLUSTER，S

13、DC、头部结构域簇HEADDOMAINCLUSTER，HDC和跨膜结构域簇TRANSMEMBRANEDOMAINCLUSTER，TDC，其中SDC包含F1、F2和F亚结构域；HDC包含RB、E1和E2亚结构域；TDC包含TMD和CTAIL亚结构域；并且其中至少一个亚结构域来自第一流感HA，其他亚结构域来自一种或更多种第二流感HA。第一和第二流感HA可独立地选自H1、H3、H5和B。而且，多肽可以包含信号肽。0016本发明还提供了编码包含嵌合流感HA之多肽的核酸，该嵌合流感HA包含茎结构域簇SDC、头部结构域簇HDC和跨膜结构域簇TDC，其中SDC包含F1、F2和F亚结构域；HDC包含RB、E1

14、和E2亚结构域；TDC包含TMD和CTAIL亚结构域；并且其中至少一个亚结构域来自第一流感HA，其他亚结构域来自一种或更多种第二流感HA。，核酸还可以编码除所述SDC、HDC和TDC外包含信号肽的多肽。0017还提供了在植物中生产嵌合流感病毒样颗粒VLP的方法，该方法包括0018A向植物或其部分引入编码嵌合流感HA的核酸，该嵌合流感HA包含信号肽、茎结构域簇SDC、头部结构域簇HDC和跨膜结构域簇TDC，其中SDC包含F1、F2和F亚结构域；HDC包含RB、E1和E2亚结构域；TDC包含TMD和CTAIL亚结构域；并且其中至少一个亚结构域来自第一流感HA，其他亚结构域来自一种或更多种第二流感H

15、A，和说明书CN102482328A3/45页50019B在允许核酸表达的条件下孵育植物或其部分，从而生产VLP。0020本发明包括上述方法，其中在引入步骤步骤A中，核酸以瞬时方式引入植物中。或者，在引入步骤步骤A中，核酸被引入植物并且稳定整合。该方法还可包括步骤C收获宿主并纯化VLP。0021本发明提供了包含嵌合流感HA或编码嵌合流感HA之核酸序列的植物或其部分，该嵌合流感HA包含茎结构域簇SDC、头部结构域簇HDC和跨膜结构域簇TDC，其中SDC包含F1、F2和F亚结构域；HDC包含RB、E1和E2亚结构域；TDC包含TMD和CTAIL亚结构域；并且其中至少一个亚结构域来自第一流感HA，其

16、他结构域来自一种或更多种第二流感HA。0022该植物或其部分还可包含核酸，该核酸包含与在植物中有活性之调控区有效连接的编码一种或多于一种伴侣蛋白CHAPERONEPROTEIN的核苷酸序列。所述一种或多于一种伴侣蛋白可选自HSP40和HSP70。0023本发明涉及包含嵌合流感HA的病毒样颗粒VLP，该嵌合流感HA包含茎结构域簇SDC、头部结构域簇HDC和跨膜结构域簇TDC，其中SDC包含F1、F2和F亚结构域；HDC包含RB、E1和E2亚结构域；TDC包含TMD和CTAIL亚结构域；并且其中至少一个亚结构域来自第一流感HA，其他结构域来自一种或更多种第二流感HA。VLP还可包含植物特异性的N聚

17、糖或修饰的N聚糖。0024还提供了包含有效剂量的上述VLP和可药用载体的组合物。0025在本发明的另一方面，提供了在对象中诱导对流感病毒感染的免疫的方法，包括向对象施用VLP。VLP可以经口、皮内、鼻内、肌内、腹腔内、静脉内或皮下施用给对象。0026可与编码嵌合HA蛋白之序列有效连接的调控区包括在植物细胞、昆虫细胞或酵母细胞中有效的调控区。这样的调控区可包括质体蓝素调控区、核酮糖1，5二磷酸羧化酶/加氧酶RUBISCO调控区、叶绿素A/B结合蛋白CAB调控区或STLS1调控区。其他调控区包括5UTR、3UTR或终止子序列。质体蓝素调控区可以是苜蓿质体蓝素调控区；5UTR、3UTR或终止子序列也

18、可以是苜蓿序列。0027本发明提供了嵌合流感HA多肽，由第一流感和第二流感构成，第一流感和第二流感可独立地选自B、H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15和H16；前提是第一流感和第二流感不是相同的流感类型、亚型或不具有相同的来源。0028根据本发明的一些方面，嵌合流感HA多肽包含信号肽序列，所述信号肽序列可选自天然信号肽序列、苜蓿PDI信号肽序列、流感H5信号肽序列和流感H1信号肽序列。0029本发明提供了在能够生产VLP的宿主包括植物、昆虫或酵母中生产包含嵌合流感血凝素HA的VLP的方法，其包括在宿主中引入编码嵌合流感HA的核酸，

19、和在允许核酸表达的条件下孵育宿主，从而生产VLP，该嵌合流感HA包含茎结构域簇SDC、头部结构域簇HDC和跨膜结构域簇TDC，其中SDC包含F1、F2和F亚结构域；HDC包含RB、E1和E2亚结构域；TDC包含TMD和CTAIL亚结构域；并且其中至少一个亚结构域来自第一流感HA，其他结构域来自一种或更多种第二流感HA。0030与在昆虫细胞培养物中生产VLP相比，在植物中生产这些颗粒具有若干优点。植物脂质可刺激特定免疫细胞并增强所诱导的免疫应答。植物的膜由脂质、磷脂酰胆碱PC和磷脂酰乙醇胺PE构成，并且还包含植物和一些细菌及原生动物所特有的鞘糖脂。鞘脂说明书CN102482328A4/45页6类

20、不常见的原因是它们不是甘油酯例如PC或PE，而是由与含有多于18个碳的脂肪酸链形成酰胺键的长链氨基醇组成。PC和PE以及鞘糖脂可结合哺乳动物免疫细胞例如抗原呈递细胞APC，如树突状细胞和巨噬细胞和另一些细胞包括胸腺和肝脏中的B淋巴细胞和T淋巴细胞表达的CD1分子。此外，除植物脂质的存在所具有的潜在佐剂作用外，植物N聚糖促进抗原呈递细胞捕获糖蛋白抗原的能力对在植物中生产嵌合VLP也可以是有利的。不希望受理论限制，预计由植物生产的嵌合VLP比在其他生产体系中制得的嵌合VLP诱导更强的免疫反应，并且与由活或减毒全病毒疫苗诱导的免疫反应相比，由这些植物生产的嵌合VLP诱导的免疫反应更强。0031与由全

21、病毒制得的疫苗相比嵌合VLP具有优势，这是因为它们无感染性，因此限制性生物防范问题不再像使用感染性全病毒时那么重要，并且不是生产所必需的。由植物生产的嵌合VLP的另一优点是，允许表达系统生长在温室或田间，从而显著地更经济并适于扩大规模。0032另外，植物不包含参与合成唾液酸残基以及将其添加到蛋白质中的酶。VLP的生产可以不需要神经氨酸酶NA，并且不需要共表达NA或者用唾液酸酶神经氨酸酶处理生产细胞或提取物以确保VLP在植物中的生产。0033该发明概述未必描述本发明的所有发明特征。0034附图简述0035通过参照附图的以下描述，本发明的这些和其他特征会更加明显，在附图中0036图1显示HA亚结构

22、域的示意图。SP信号肽，F1、F2和F融合亚结构域；RB受体结合亚结构域，E1和E2酯酶亚结构域，TMD/CT跨膜和胞质尾区亚结构域。图1B显示基于质体蓝素的表达盒构建体号774、540、660、690、691、696的示意图，该表达盒表达天然和嵌合形式的血凝素H1A/布里斯班/59/2007H1/BRI、血凝素H1A/新喀里多尼亚/20/99H1/NC和血凝素H5A/印度尼西亚/5/05H5/INDO。PLASTOPRO苜蓿质体蓝素启动子，PLASTOTER苜蓿质体蓝素终止子，SP信号肽，RB受体结合亚结构域，E1RBE2酯酶和受体结合亚结构域，TMD/CT跨膜和胞质尾亚结构域，PDI苜蓿蛋

23、白二硫键异构酶。图1C显示几种流感HA的氨基酸序列比对，附加了结构比对B/佛罗里达/4/2006B佛罗里达，SEQIDNO94GENBANK登录号ACA334931；B/马来西亚/2506/2004B马来西亚，SEQIDNO95GENBANK登录号ABU991941；H1/BRIA布里斯班，SEQIDNO96GENBANK登录号ADE287501；H1A/所罗门群岛/3/2006ASOLISL，SEQIDNO97GENBANK登录号ABU991091；H1/NCANEWCAL，SEQIDNO98GENBANK登录号AAP343241；H2A/新加坡/1/1957A新加坡，SEQIDNO99GE

24、NBANK登录号AAA643661；H3A/布里斯班/10/2007A布里斯班，SEQIDNO100GENBANK登录号ACI263181；H3A/威斯康星/67/2005AWCN，SEQIDNO101GENBANK登录号ABO375991；H5A/安徽/1/2005A安徽，SEQIDNO102GENBANK登录号ABD281801；H5A/越南/1194/2004A越南，SEQIDNO103GENBANK登录号ACR488741；H5INDO，SEQIDNO104GENBANK登录号ABW061081。标示了F1、酯酶1、受体结合、酯酶2、F2、肽融合、TMD/CT亚结构域之间的界限以及二硫

25、桥。0037图2显示用构建体690、734SEQIDNO11、696SEQIDNO112上图和691SEQIDNO113下图表达的嵌合HA所示亚结构域的氨基酸序列。SEQIDNO111说明书CN102482328A5/45页7的192位氨基酸是H5/INDO的F1E1结构域；93263位氨基酸是H1/布里斯班的RB头部结构域，264552位氨基酸是H5/INDO的E2F2结构域。SEQIDNO112的192位氨基酸是H5/NC的F1E1结构域；93301位氨基酸是H5/INDO的RB头部结构域，302586位氨基酸是H1/NC的E2F2结构域。SEQIDNO113的142位氨基酸是H5/IND

26、O的F1结构域；43273位氨基酸是H1/布里斯班的E1RBE2头部结构域，274552位氨基酸是H5/INDO的F2结构域。0038图3显示构建体690和734SEQIDNO80编码区的氨基酸序列，其包含H1/BRI的RB亚结构域、H5/INDO信号肽和包含H5/INDOF1、E1、E2和F亚结构域的茎结构域复合体STEMDOMAINCOMPLEX，SDC。0039图4显示构建体691SEQIDNO81编码区的氨基酸序列，其包含H1/BRI头部结构域复合体HDC包含E1、RB、E2、H5/INDO信号肽和包含H5/INDOF1、F2和F亚结构域的茎结构域复合体SDC。0040图5显示构建体6

27、96SEQIDNO82编码区的氨基酸序列，其包含H5/INDO的RB亚结构域、PDI信号肽和包含F1、E1、E2和F2的H1/NC茎结构域复合体。0041图6显示在植物中天然形式、构建体774包含H1/BRI、构建体692包含H1/BRI的头部结构域复合体HDC和构建体690包含与H5/INDO茎结构域复合体SDC融合的H1/BRI的RB亚结构域的H1/BRI表达的免疫印迹分析。对于每个构建体，分析来自3个独立植物的总蛋白提取物。对于所分析的每个植物，上样的蛋白质为20微克。用抗HA单克隆抗体抗H1布里斯班；FII10I50显示WESTERN印迹。构建体774表达具有H1/BRI天然信号肽的H

28、1/BRI；构建体690、691表达具有H5/INDO天然信号肽的HA。0042图7显示天然形式、构建体660包含H5/INDO或构建体696包含与H1/NCSDC、E1和E2亚结构域融合的H1/INDORB亚结构域的H5/INDO表达的免疫印迹分析。对于每个构建体，分析来自3个独立植物的总蛋白提取物。对于所分析的每个植物，上样的蛋白质为20微克。用抗H5印度尼西亚多克隆抗体ITCIT003005V显示WESTERN印迹。构建体660表达具有其天然信号肽的H5/INDO；构建体696表达具有PDI信号肽的嵌合HA。0043图8显示基于35SCPMV/HT的表达盒的示意图，该表达盒表达天然构建体

29、732和嵌合构建体733和734形式的H1/BRI。构建体733包含PDI信号肽和H1/BRI的HDC、SDC和跨膜结构域复合体TRANSMEMBRANEDOMAINCOMPLEX，TDC，构建体734包含H5/INDO信号肽、F1、E1、E2、F2、F和来自H1/BRI的RB。35SDROCAMV35S启动子，NOSTER胭脂氨酸合酶终止子，SP信号肽，RB受体结合亚结构域，E1RBE2酯酶和受体结合亚结构域，TMD/CT跨膜和胞质尾亚结构域，PDI苜蓿蛋白二硫键异构酶；CPMVHT可过量翻译HYPERTRANSLATABLE的豇豆花叶病毒表达系统的5和3元件。0044图9显示天然形式、构建

30、体732包含在基于35SCPMV/HT的表达盒控制下的H1/BRI、构建体733包含与H1/BRI融合的PDI信号肽；在基于35SCPMV/HT的表达盒的控制下或构建体734包含与H5/INDOSDC、E1和E2亚结构域融合的H1/BRIRB亚结构域；在基于35SCPMV/HT的表达盒的控制下的H1/BRI表达的免疫印迹分析。对于每个构建体，分析来自3个独立植物的总蛋白提取物。对于所分析的每个植物，上样蛋白为5微克。用抗HA单克隆抗体检测FII10I50显示WESTERN印迹。0045图10显示基于35SCPMV/HT的表达盒的示意图，该表达盒表达H3A/布里斯班说明书CN102482328A

31、6/45页8/10/2007H3/BRI和B/佛罗里达/4/2006HAB/FLO血凝素。构建体736包含与PDI信号肽融合的H3/BRI。构建体737包含与PDI信号肽融合的H3/BRI和H5/INDOTMD/CT。构建体739包含与PDI信号肽融合的B/FLO。构建体745包含与PDI信号肽融合的B/FLO和H5/INDOTMD/CT。35SPROCAMV35S启动子，NOSTER胭脂氨酸合酶终止子，SP信号肽，RB受体结合亚结构域，E1RBE2酯酶和受体结合亚结构域，TMD/CT跨膜和胞质尾亚结构域，PDI苜蓿蛋白二硫键异构酶；CPMVHT可过量翻译的豇豆花叶病毒表达系统的5和3元件。0

32、046图11显示构建体745和737中的融合边界。HA序列的起始用锥形头箭头标示。跨膜结构域的氨基酸为QILSIYSTVA，其前面是部分胞外结构域的氨基酸。0047图12显示嵌合H5/H3血凝素SEQIDNO83，构建体737的氨基酸序列，其包含PDI信号肽、H3A/布里斯班/10/2007的胞外结构域和H5A/印度尼西亚/5/2005的TMD/CT。0048图13显示嵌合H5/B血凝素SEQIDNO84的氨基酸序列，其包含构建体号745的开放阅读框所编码的B/佛罗里达/4/2006的胞外结构域和H5A/印度尼西亚/5/2005的TMD/CT。0049图14显示天然形式、构建体739包含PDI

33、B/FLO或构建体745包含与H5/INDOTDC融合的B/FLOHDC和SDC的B/FLO表达的免疫印迹分析。对于每个构建体，分析来自3个独立植物的总蛋白提取物。对于所分析的每个植物，上样的蛋白为20微克。用抗HAB/佛罗里达多克隆抗体NIBSC07/356显示WESTERN印迹。0050图15显示天然形式、构建体736包含PDISPH3/BRI或构建体737与H5/INDOTDC融合的H3/BRIHDC和SDC的H3/BRI表达的免疫印迹分析。对于每个构建体，分析来自3个独立植物的总蛋白提取物。对于所分析的每个植物，上样的蛋白为20微克。用抗H3布里斯班多克隆抗体NIBSC08/124显示

34、WESTERN印迹。0051图16显示用构建体号745侵染之植物的叶蛋白质提取物的体积排阻色谱。对于每种级分，显示洗脱级分的相对蛋白含量。在级分7至15中使用抗HAB/佛罗里达多克隆抗体NIBSC07/356对血凝素进行的免疫检测WESTERN印迹在图下显示。箭头标示蓝葡聚糖2000的洗脱峰级分8。0052图17显示合成片段的核酸序列SEQIDNO52，其包含完整H5A/印度尼西亚/5/05H5N1编码区包含信号肽和终止密码子，在5侧翼有HINDIII位点，在3侧翼有SACI位点。0053图18显示构建体660的核酸序列SEQIDNO53，构建体660是HA表达盒，其包含苜蓿质体蓝素启动子和5

35、UTR、H5型A/印度尼西亚/5/05H5N1血凝素的编码序列、苜蓿质体蓝素3UTR和终止子序列。0054图19显示无TMD和CTAIL的野生型H1A/新喀里多尼亚/20/99H1N1GENBANK登录号AY289929编码序列的核酸序列SEQIDNO54。0055图20显示合成片段的核酸序列SEQIDNO55，该合成片段包含缺少TMD和CTAIL的H1A/新喀里多尼亚/20/99H1N1编码序列。在5区，最后几个核苷酸来自PDISP并且包含BGLII限制性位点，在3SACI/STUI双位点位于紧邻终止密码子的下游。0056图21显示包含CTERH1A/新喀里多尼亚/20/99H1N1编码序列

36、包含TMD和CTAIL的合成片段的核酸序列SEQIDNO56，其从KPNI位点至终止密码子3侧翼说明书CN102482328A7/45页9是SACI/STUI双位点。0057图22显示来自紫苜蓿MEDICAGOSATIVA蛋白二硫键异构酶MRNA的核苷酸序列。GENBANK登录号Z11499SEQIDNO57。核苷酸32103编码PDI信号肽。0058图23显示PROMPLASTOPDISPPLASTO3UTR质粒的核苷酸序列。图23A显示PROMPLASTOPDISPSEQIDNO58的核苷酸序列。图23B显示PLASTO3UTRSEQIDNO85的核苷酸序列。蛋白二硫键异构酶PDI信号肽序

37、列用下划线表示。用于克隆的BGLIIAGATCT和SACIGAGCTC限制性位点以黑体显示。0059图24显示HA表达盒的核酸序列SEQIDNO59；构建体540，该表达盒包含苜蓿质体蓝素启动子和5UTR、PDI信号肽和H1型A/新喀里多尼亚/20/99H1N1的编码序列、苜蓿质体蓝素3UTR和终止子序列。来自A/新喀里多尼亚/20/1999的H1编码序列用下划线表示。0060图25显示合成片段的核酸序列SEQIDNO60，其包含完整H1A/布里斯班/59/07H1N1编码区包含信号肽和终止密码子，在5侧翼有以DRAIII位点起始的苜蓿质体蓝素基因序列对应于起始ATG上游前84个核苷酸，3侧翼

38、有SACI位点。0061图26显示HA表达盒的核酸序列SEQIDNO61，构建体774，该HA表达盒包含苜蓿质体蓝素启动子和5UTR、H1型A/布里斯班/59/07H1N1的血凝素编码序列、苜蓿质体蓝素3UTR和终止子序列。0062图27显示表达盒号828SEQIDNO62的核酸序列，从PACI启动子上游至ASCI紧邻NOS终止子的下游。CPMVHT3UTR序列用下划线表示，其中突变的ATG用黑体表示。APA1限制性位点用下划线和斜体表示。0063图28显示嵌合H5/H1表达盒的核酸序列SEQIDNO63，构建体690，该表达盒包含苜蓿质体蓝素启动子和5UTR、嵌合血凝素编码序列、苜蓿质体蓝素

39、3UTR和终止子序列。嵌合HA编码序列用下划线表示。0064图29显示嵌合H5/H1表达盒的核酸序列SEQIDNO64，构建体691，该表达盒包含苜蓿质体蓝素启动子和5UTR、嵌合血凝素编码序列、苜蓿质体蓝素3UTR和终止子序列。嵌合HA编码序列用下划线表示。0065图30显示嵌合H1/H5表达盒的核酸序列SEQIDNO65，构建体696，该表达盒包含苜蓿质体蓝素启动子和5UTR、嵌合血凝素编码序列、苜蓿质体蓝素3UTR和终止子序列。嵌合HA编码序列用下划线表示。0066图31显示HA表达盒的核酸序列SEQIDNO66，构建体732，该HA表达盒包含CAMV35S启动子、CPMVHT5UTR、

40、H1型A/布里斯班/59/07H1N1血凝素编码序列、CPMVHT3UTR和NOS终止子序列。H1/BRI的编码序列用下划线标示。0067图32显示中间构建体787从ATG到终止的编码序列的核酸序列SEQIDNO67。0068图33显示SPPDIH1/BRI表达盒的核酸序列SEQIDNO68，构建体号733，该表达盒包含CAMV35S启动子、CPMVHT5UTR、PDI信号肽编码序列、H1型A/布里斯班/59/07H1N1血凝素编码序列、CPMVHT3UTR和NOS终止子序列。SPPDIH1/BRI编码序列用下划线表示。0069图34显示嵌合H5/H1表达盒的核酸序列SEQIDNO69，构建体

41、734，该表达盒包含CAMV35S启动子、CPMVHT5UTR、嵌合血凝素编码序列、CPMVHT3UTR和NOS终止说明书CN102482328A8/45页10子序列。嵌合HA的编码序列用下划线表示。0070图35显示合成片段的核酸序列SEQIDNO70，该合成片段包含完整H3A/布里斯班/10/07H3N2编码区包含信号肽和终止密码子，5侧翼有以DRAIII位点起始的苜蓿质体蓝素基因序列对应于起始ATG上游前84个核苷酸，3侧翼有SACI位点。0071图36显示HA表达盒的核酸序列SEQIDNO71，构建体736，该HA表达盒包含CAMV35S启动子、CPMVHT5UTR、PDI信号肽编码序

42、列、H3型A/布里斯班/10/07H2N3血凝素编码序列、CPMVHT3UTR和NOS终止子序列。SPPDIH3/BRIS编码序列用下划线表示。0072图37显示嵌合H5/H3表达盒的核酸序列SEQIDNO72，构建体号737，该表达盒包含CAMV35S启动子、CPMVHT5UTR、嵌合血凝素编码序列、CPMVHT3UTR和NOS终止子序列。嵌合HA的编码序列用下划线表示。0073图38显示合成片段的核酸序列SEQIDNO73，该合成片段包含完整HAB/佛罗里达/4/06编码区包含信号肽和终止密码子，5侧翼有以DRAIII位点起始的苜蓿质体蓝素基因序列对应于起始ATG上游前84个核苷酸，3侧翼

43、有SACI位点。0074图39显示HA表达盒的核酸序列SEQIDNO74，构建体739，该HA表达盒包含CAMV35S启动子、CPMVHT5UTR、PDI信号肽编码序列、HA型B/佛罗里达/4/06血凝素编码序列、CPMVHT3UTR和NOS终止子序列。SPPDIB/FLO编码序列用下划线表示。0075图40显示嵌合H5/B表达盒的核酸序列SEQIDNO75，构建体745，该表达盒包含CAMV35S启动子、CPMVHT5UTR、嵌合血凝素编码序列、CPMVHT3UTR和NOS终止子序列。嵌合HA的编码序列用下划线表示。0076图41显示编码MSJ1的核酸序列SEQIDNO76。0077图42显

44、示部分构建体号R850的核酸序列SEQIDNO77，从HINDIII在多克隆位点中，启动子上游至ECORI紧邻NOS终止子的下游。HSP40编码序列用下划线表示。0078图43显示部分构建体号R860的核酸序列SEQIDNO78，从HINDIII在多克隆位点中，启动子上游至ECORI紧邻NOS终止子的下游。HSP70编码序列用下划线表示。0079图44显示部分构建体号R870的核酸序列SEQIDNO79，从HINDIII在多克隆位点中，启动子5上游至ECORI紧邻NOS终止子的下游。HSP40编码序列用下划线和斜体表示，HSP70编码序列用下划线表示。A核苷酸14946；B核苷酸4947949

45、3。0080图45显示构建体R472的示意图。0081图46显示甲型流感的二硫桥模式。桥编号1CYS4HA1CYS137HA2、2CYS60HA1CYS72HA1、3CYS94HA1CYS143HA1、4CYS292HA1CYS318HA1、5CYS144HA2CYS148HA2和6CYS52HA1CYS277HA1。甲和乙亚型之间二硫桥的差异图47用箭头标示。使用成熟H3蛋白的编号。0082图47显示乙型流感HA的二硫桥模式。桥编号1CYS4HA1CYS137HA2、2CYS60HA1CYS72HA1、3CYS94HA1CYS143HA1、4CYS292HA1CYS318HA1、5CYS14

46、4HA2CYS148HA2、6CYS52HA1CYS277HA1、7CYS54HA1CYS57HA1和8CYS178HA1CYS272HA1。甲和乙亚型之间二硫桥的差异图46用箭头标示。使用成熟H3说明书CN102482328A109/45页11蛋白的编号。0083图48显示结构域替换SWAP融合连接的示意图。图48A显示来自H1/BRI、H3/BRI和B/FLO的RB亚结构域与H5/INDOSDC的融合，和H5/INDO的RB亚结构域与H1/NC茎结构域的融合。图48B显示来自H1/BRI、H3/BRI或B/FLO的E1RBE2亚结构域HDC与H5/INDOSDC的融合，和H5/INDOHD

47、C与H1/NCSDC的融合。0084图49A显示H1A/加利福尼亚/04/09的核苷酸序列SEQIDNO86。苜蓿蛋白二硫键异构酶信号肽编码序列用下划线表示，成熟H1编码序列用黑体突出显示。图49B显示H1A/加利福尼亚/04/09的氨基酸序列SEQIDNO87。苜蓿蛋白二硫键异构酶信号肽序列用下划线表示。0085图50显示用未稀释的AGL1/747侵染、与AGL1/443空载体共侵染和与AGL1/R870HSP40/HSP70共侵染后，H5/B嵌合血凝素构建体747，包含与H5/INDOTDC融合的B/FLOHDC和SDC表达的免疫印迹分析。对于每个构建体，分析来自3个独立植物的总蛋白提取物

48、。对于所分析的每个植物，上样的蛋白为20微克。用抗B/佛罗里达多克隆抗体NIBSC显示WESTERN印迹。0086图51A显示2X35S启动子序列SEQIDNO88的核苷酸序列。图51B显示构建体747SEQIDNO93从PACI35S启动子上游至ASCI紧邻NOS终止子下游的核苷酸序列。嵌合HA的编码序列用下划线表示。2X35S启动子序列用斜体表示。0087详细描述0088本发明涉及病毒样颗粒。更具体而言，本发明涉及包含嵌合流感血凝素的病毒样颗粒和生产嵌合流感病毒样颗粒的方法。0089下面描述的是一个优选的实施方案。0090本发明提供了包含编码嵌合流感血凝素HA之核苷酸序列的核酸，其与在植物

49、中有活性的调控区有效连接。0091此外，本发明提供了在植物中生产病毒样颗粒VLP的方法。所述方法包括向植物或植物部分中引入编码嵌合流感HA的核酸序列与在植物中有活性的调控区有效连接，并且在允许该核酸表达的条件下孵育植物或植物部分，从而产生VLP。0092本发明还提供了包含嵌合流感HA的VLP。可以通过本发明提供的方法生产VLP。0093“嵌合蛋白”或“嵌合多肽”是指包含来自于两种或多于两种来源的氨基酸序列的蛋白质或多肽，例如但不限于，作为单个多肽融合的两种或更多种流感类型或亚型或者不同来源的流感。嵌合蛋白或多肽可以包含与剩余多肽或蛋白质相同或异源的信号肽。嵌合蛋白或嵌合多肽可以作为转录本从嵌合核苷酸序列中转录，嵌合蛋白或嵌合多肽在合成后被切割，并且根据需要结合形成多聚体蛋白。因此，嵌合蛋白或嵌合多肽还包括这样的蛋白质或多肽，其包含通过二硫桥连接的亚基即多聚体蛋白。例如，包含来自两种或更多种来源的氨基酸序列的嵌合多肽可被加工成亚基，该亚基通过二硫桥连接，产生嵌合蛋白或嵌合多肽见图46和47。多肽可以是血凝素HA，每个形成多肽的两条或更多条氨基酸序列可以从不同的HA获得，以生产嵌合HA或嵌合流感HA。嵌合HA还可以包