用于治疗癌症的针对 CDCP1 的抗体 本发明涉及用于治疗癌症的与 CUB4( 保藏号 DSMACC2551) 结合相同表位的针对人 CDCP1 的抗体。
发明背景
人 CDCP1(( 含有 CUB 域的蛋白 1、 B345、 CD318、 SIMA135、 TRASK ； SEQ ID NO ： 1和 具有突变 R525Q( 即 SEQ ID NO ： 1 的氨基酸位置 525 处用谷氨酰胺 (Q) 替换精氨酸 (R)) 和 / 或突变 G709D( 即 SEQ ID NO ： 1 的氨基酸位置 709 处用天冬氨酸 (D) 替换甘氨酸 (G)) 的 变体 ) 是一种含有三个胞外 CUB 域的跨膜蛋白。发现此蛋白质在结肠和肺癌中过表达。其 表达水平与癌瘤细胞的转移能力相关联。已经显示了它在癌细胞系中是酪氨酸磷酸化的 (WO2002/004508 ； Scherl-Mostageer， M. 等， Oncogene 20(2001)4402-8 ； Hooper， J.D. 等， Oncogene 22(2003)1783-94 ； Perry， S.E. 等， FEBS Lett.581(2007)1137-42 ； Brown， T.A.， J.Bio1.Chem.279(2004)14772-14783 ； Ota， T. 等， Nat.Genet.36(2004)40-45)。已经报告 了编码独特同等型的可变剪接转录物变体。
WO 2002/004508 提及 CDCP1 为肿瘤相关抗原 B345。WO 2004/074481 提及 CDCP1 为转移性肿瘤细胞中表达的糖蛋白抗原 SIMA135。WO2005/042102 提及 CDCP1 为牵涉卵巢 癌的蛋白质。WO 2007/005502 涉及靶向 CDCP1 的用于治疗疾病的方法和组合物。
US 2004/0053343( 及 Conze， T. 等， Ann.N.Y.Acad.Sci.996(2003)222-6 和 Buhring， H.J. 等， Stem Cells 22(2004)334-43) 涉及用于鉴定的 CDCP1 抗体和 / 或某些细 胞干细胞群。
发明概述
本发明的一个方面是用于治疗癌症的特异性结合人 CDCP1 的抗体， 其特征在于 ： 与 CUB4( 保藏号 DSMACC2551) 结合相同表位。
本 发 明 进 一 步 包 括 用 于 治 疗 癌 症 的 抗 体， 其特征在于 ： 与 CUB4( 保 藏 号 DSMACC2551) 结合相同表位， 且进一步的特征在于 ：
a) 重链可变域是 SEQ ID NO ： 7， 且轻链可变域是 SEQ ID NO ： 8，
b) 重链可变域是 SEQ ID NO ： 15， 且轻链可变域是 SEQ ID NO ： 16， 或
c) 重链可变域是 SEQ ID NO ： 23， 且轻链可变域是 SEQ ID NO ： 24， 或
d) 重链可变域是 SEQ ID NO ： 31， 且轻链可变域是 SEQ ID NO ： 32， 或或其人源化型 式。
本 发 明 进 一 步 包 括 用 于 治 疗 癌 症 的 抗 体， 其特征在于 ： 与 CUB4( 保 藏 号 DSMACC2551) 结合相同表位， 且进一步的特征在于 ：
a) 重链可变域包含 CDRH1 区 SEQ ID NO ： 9、 CDRH2 区 SEQ ID NO ： 10、 和 CDRH3 区 SEQ ID NO ： 11， 且轻链可变域包含 CDRL1 区 SEQ ID NO ： 12、 CDRL2 区 SEQ ID NO ： 13、 和 CDRL3 区 SEQ ID NO ： 14， 或
b) 重链可变域包含 CDRH1 区 SEQ ID NO ： 17、 CDRH2 区 SEQ ID NO ： 18、 和 CDRH3 区 SEQ ID NO ： 19， 且轻链可变域包含 CDRL1 区 SEQ ID NO ： 20、 CDRL2 区 SEQ ID NO ： 21、 和 CDRL3 区 SEQ ID NO ： 22， 或
c) 重链可变域包含 CDRH1 区 SEQ ID NO ： 25、 CDRH2 区 SEQ ID NO ： 26、 和 CDRH3 区 SEQ ID NO ： 27， 且轻链可变域包含 CDRL1 区 SEQ ID NO ： 28、 CDRL2 区 SEQ ID NO ： 29、 和 CDRL3 区 SEQ ID NO ： 30。
本发明进一步包括依照本发明的抗体， 其特征在于 ： 所述抗体是人 IgG1 亚类的。
本发明的另一方面是一种用于治疗癌症的药物组合物， 其包含特异性结合人 CDCP1 的抗体， 该抗体的特征在于 ： 与 CUB4( 保藏号 DSMACC2551) 结合相同表位。
本发明的另一方面是特异性结合人 CDCP1 的抗体用于制备供治疗癌症用的药物 中的用途， 所述抗体的特征在于 ： 与 CUB4( 保藏号 DSMACC2551) 结合相同表位。
本发明的另一方面是一种治疗患有癌症的患者的方法， 其通过对需要此类治疗的 所述患者施用特异性结合人 CDCP1 的抗体来进行， 所述抗体的特征在于 ： 与 CUB4( 保藏号 DSMACC2551) 结合相同表位。
本发明进一步包括依照本发明的抗体， 其特征在于 ：
a) 重链可变域是 SEQ ID NO ： 15， 且轻链可变域是 SEQ ID NO ： 16， 或
b) 重链可变域是 SEQ ID NO ： 23， 且轻链可变域是 SEQ ID NO ： 24， 或
c) 重链可变域是 SEQ ID NO ： 31， 且轻链可变域是 SEQ ID NO ： 32， 或或其人源化型 式。 本发明进一步包括依照本发明的抗体， 其特征在于 ：
a) 重链可变域包含 CDRH1 区 SEQ ID NO ： 9、 CDRH2 区 SEQ ID NO ： 10、 和 CDRH3 区 SEQ ID NO ： 11， 且轻链可变域包含 CDRL1 区 SEQ ID NO ： 12、 CDRL2 区 SEQ ID NO ： 13、 和 CDRL3 区 SEQ ID NO ： 14， 或
b) 重链可变域包含 CDRH1 区 SEQ ID NO ： 17、 CDRH2 区 SEQ ID NO ： 18、 和 CDRH3 区 SEQ ID NO ： 19， 且轻链可变域包含 CDRL1 区 SEQ ID NO ： 20、 CDRL2 区 SEQ ID NO ： 21、 和 CDRL3 区 SEQ ID NO ： 22， 或
c) 重链可变域包含 CDRH1 区 SEQ ID NO ： 25、 CDRH2 区 SEQ ID NO ： 26、 和 CDRH3 区 SEQ ID NO ： 27， 且轻链可变域包含 CDRL1 区 SEQ ID NO ： 28、 CDRL2 区 SEQ ID NO ： 29、 和 CDRL3 区 SEQ ID NO ： 30。
优选地， 所述抗体的特征在于所述抗体是人 IgG1 亚类的。本发明进一步包括包含 所述抗体的药物组合物。 本发明进一步包括依照本发明的所述抗体用于制备供治疗癌症用 的药物的用途。本发明进一步包括一种治疗患有癌症的患者的方法， 其通过对需要此类治 疗的所述患者施用所述抗体来进行。
本发明提供了编码依照本发明的抗体的核酸。 本发明进一步提供了含有依照本发 明的核酸且能够在原核或真核宿主细胞中表达所述核酸的表达载体和含有此类载体的用 于重组生成依照本发明的抗体的宿主细胞。
本发明进一步包括包含依照本发明的载体的原核或真核宿主细胞。
本发明进一步包括一种用于生成依照本发明的重组抗体的方法， 其特征在于在原 核或真核宿主细胞中表达依照本发明的核酸， 并自所述细胞或细胞培养物上清液回收所述 抗体。本发明进一步包括通过此类重组方法获得的抗体。
现在已经令人惊讶地发现了， 与结合 CDCP1 的其它表位的 CDCP1 抗体， 如例如 CUB1( 保藏号 DSM ACC2569) 相比， 以与 CUB4( 保藏号 DSM ACC2551) 结合相同表位为特征的
特异性结合 CDCP1 的抗体特别可用于治疗癌症。
发明详述
CUB4 抗 体 指 来 自 DE 10242146(EP 1396501， US 7,541,030) 的 具 有 保 藏 号 DSM ACC2551 的保藏抗体， 其具有重链可变域 (VH)SEQ ID NO ： 7 和轻链可变域 (VL)SEQ ID NO ： 8。所述 CUB4 抗体特异性结合人 CDCP1。( 编号为 DSM ACC2551(DSMZ) 的保藏由 Eberhard-Karls-University Tübingen， Tübingen， Geissweg 3， 72076Tübingen 做出 )。
本发明包括用于治疗癌症的特异性结合人 CDCP1 的抗体， 其特征在于 ：
与 CUB4( 保藏号 DSMACC2551) 结合相同表位。
本发明进一步包括依照本发明的抗体， 其特征在于 ：
重链可变域是 SEQ ID NO ： 7， 且轻链可变域是 SEQ ID NO ： 8， 或其人源化型式。
本发明进一步包括依照本发明的抗体， 其特征在于 ：
重链可变域是 SEQ ID NO ： 15， 且轻链可变域是 SEQ ID NO ： 16， 或或其人源化型式。
本发明进一步包括依照本发明的抗体， 其特征在于 ：
重链可变域是 SEQ ID NO ： 23， 且轻链可变域是 SEQ ID NO ： 24， 或或其人源化型式。
本发明进一步包括依照本发明的抗体， 其特征在于 ：
重链可变域是 SEQ ID NO ： 31， 且轻链可变域是 SEQ ID NO ： 32， 或或其人源化型式。
本发明进一步包括依照本发明的抗体， 其特征在于 ：
重链可变域包含 CDRH1 区 SEQ ID NO ： 9、 CDRH2 区 SEQ ID NO ： 10、 和 CDRH3 区 SEQ ID NO ： 11， 且轻链可变域包含 CDRL1 区 SEQ ID NO ： 12、 CDRL2 区 SEQ ID NO ： 13、 和 CDRL3 区 SEQ ID NO ： 14， 或
本发明进一步包括依照本发明的抗体， 其特征在于 ：
重链可变域包含 CDRH1 区 SEQ ID NO ： 17、 CDRH2 区 SEQ ID NO ： 18、 和 CDRH3 区 SEQ ID NO ： 19， 且轻链可变域包含 CDRL1 区 SEQ ID NO ： 20、 CDRL2 区 SEQ ID NO ： 21、 和 CDRL3 区 SEQ ID NO ： 22， 或
本发明进一步包括依照本发明的抗体， 其特征在于 ：
重链可变域包含 CDRH1 区 SEQ ID NO ： 25、 CDRH2 区 SEQ ID NO ： 26、 和 CDRH3 区 SEQ ID NO ： 27， 且轻链可变域包含 CDRL1 区 SEQ ID NO ： 28、 CDRL2 区 SEQ ID NO ： 29、 和 CDRL3 区 SEQ ID NO ： 30。 术语 “抗体” 涵盖各种形式的抗体结构， 包括但不限于完整的抗体和抗体片段。优 选地， 依照本发明的抗体是人源化抗体、 嵌合抗体、 或进一步遗传工程化改造的抗体， 只要 依照本发明的特征性特性得到保留。 “抗体片段” 包含全长抗体的一部分， 优选地其可变域， 或至少其抗原结合位点。 抗体片段的例子包括双抗体、 单链抗体分子、 和自抗体片段形成的 多特异性抗体。 scFv 抗体例如记载于 Huston， J.S.， Methods in Enzymol.203(1991)46-88。 另外， 抗体片段包含具有结合 CDCP1 的 VH 域或 VL 域的特征 ( 即能够与 VL 域或 VH 域一起 装配成功能性抗原结合位点， 并且由此提供依照本发明的抗体的特性 ) 的单链多肽。如本 文中所使用的， 术语 “单克隆抗体” 或 “单克隆抗体组合物” 指单一氨基酸组成的抗体分子 的制备物。术语 “人源化抗体” 或 “抗体的人源化型式” 指其中的框架和 / 或 “互补决定 区” (CDR) 已经进行过修饰以包含与亲本免疫球蛋白的 CDR 相比不同物种的免疫球蛋白的
CDR( 例如 CDR3) 的抗体。在一个优选的实施方案中， 将小鼠 CDR( 例如 CDR3) 嫁接入人抗体 的框架区中以制备 “人源化抗体” ( 参见例如 Riechmann， L. 等， Nature332(1988)323-327 ； 及 Neuberger， M.S. 等， Nature 314(1985)268-270)。
如本文中所使用的， 术语 “单克隆抗体” 或 “单克隆抗体组合物” 指单一氨基酸组 成的抗体分子的制备物。
术语 “嵌合抗体” 指通常通过重组 DNA 技术制备的包含来自小鼠的可变区， 即结合 区和自不同来源或物种衍生的恒定区的至少一部分的单克隆抗体。 包含小鼠可变区和人恒 定区的嵌合抗体是特别优选的。此类大鼠 / 人嵌合抗体是包含编码大鼠免疫球蛋白可变区 的 DNA 区段和编码人免疫球蛋白恒定区的 DNA 区段的所表达免疫球蛋白基因的产物。本发 明所涵盖的 “嵌合抗体” 的其它形式是那些其中类别或亚类已经自初始抗体的类别或亚类 修饰或改变的。此类 “嵌合” 抗体又称为 “类别转换抗体” 。用于生成嵌合抗体的方法牵涉本 领域现在公知的常规重组 DNA 和基因转染技术 ( 参见例如 Morrison， S.L. 等， Proc.Natl. Acad Sci.USA 81(1984)6851-6855 ； US 5,202,238 和 US 5,204,244)。
人 CDCP1(( 含有 CUB 域的蛋白 1、 B345、 CD318、 SIMA135、 TRASK ； SEQ ID NO ： 1和 具有突变 R525Q( 即 SEQ ID NO ： 1 的氨基酸位置 525 处用谷氨酰胺 (Q) 替换精氨酸 (R)) 和 / 或突变 G709D( 即 SEQ ID NO ： 1 的氨基酸位置 709 处用天冬氨酸 (D) 替换甘氨酸 (G)) 的 变体 ) 是一种含有三个胞外 CUB 域的跨膜蛋白。发现此蛋白质在结肠和肺癌中过表达。其 表达水平与癌瘤细胞的转移能力相关联。已经显示了它在癌细胞系中是酪氨酸磷酸化的 (WO2002/004508 ； Scherl-Mostageer， M. 等， Oncogene 20(2001)4402-8 ； Hooper， J.D. 等， Oncogene 22(2003)1783-94 ； Perry， S.E. 等， FEBS Lett.581(2007)1137-42 ； Brown， T.A.， J.Biol.Chem.279(2004)14772-14783 ； Ota， T. 等， Nat.Genet.36(2004)40-45)。已经报告 了编码独特同等型的可变剪接转录物变体。
除非另有规定， 术语 “Kabat 编号方式” 或 “依照 Kabat 的编号方式” 或 “EU 索引” 定义为使用如在 Kabat 等 (Sequences of Proteins of Immunological Interest， 第 5 版， Public Health Service， National Institutes of Health， Bethesda， MD(1991)) 中的 EU 索引为例如 IgG 抗体中的残基编号。
如本文中所使用的， “特异性结合人 CDCP1” 指特异性结合人 CDCP1 抗原的抗体。 -8 结合亲和力是 1.0x10 mol/l 或更低的 KD 值的， 优选地 1.0x10-9mol/l 或更低的 KD 值的。 用标准的结合测定法， 诸如表面等离振子共振技术 来测定结合亲和力。如此， 如本文中所使用的， “特异性结合人 CDCP1 的抗体”指以 KD1.0x10-8mol/l 或更低 ( 例如 KD1.0x10-8mol/l 至 1.0x10-13mol/l， 优选地 KD1.0x10-9mol/l 至 1.0x10-12mol/l) 的结合亲 和力结合人 CDCP1 抗原的抗体。
本发明进一步包括特异性结合人 CDCP1 的抗体， 其特征在于 ：
重链可变域是 SEQ ID NO ： 15， 且轻链可变域是 SEQ ID NO ： 16， 或其人源化型式。
本发明进一步包括特异性结合人 CDCP1 的抗体， 其特征在于 ：
重链可变域是 SEQ ID NO ： 23， 且轻链可变域是 SEQ ID NO ： 24， 或其人源化型式。
本发明进一步包括特异性结合人 CDCP1 的抗体， 其特征在于 ：
重链可变域是 SEQ ID NO ： 31， 且轻链可变域是 SEQ ID NO ： 32， 或其人源化型式。
本发明进一步包括特异性结合人 CDCP1 的抗体， 其特征在于 ：重链可变域包含 CDRH1 区 SEQ ID NO ： 9、 CDRH2 区 SEQ ID NO ： 10、 和 CDRH3 区 SEQ ID NO ： 11， 且轻链可变域包含 CDRL1 区 SEQ ID NO ： 12、 CDRL2 区 SEQ ID NO ： 13、 和 CDRL3 区 SEQ ID NO ： 14。
本发明进一步包括特异性结合人 CDCP1 的抗体， 其特征在于 ：
重链可变域包含 CDRH1 区 SEQ ID NO ： 17、 CDRH2 区 SEQ ID NO ： 18、 和 CDRH3 区 SEQ ID NO ： 19， 且轻链可变域包含 CDRL1 区 SEQ ID NO ： 20、 CDRL2 区 SEQ ID NO ： 21、 和 CDRL3 区 SEQ ID NO ： 22。
本发明进一步包括特异性结合人 CDCP1 的抗体， 其特征在于 ：
重链可变域包含 CDRH1 区 SEQ ID NO ： 25、 CDRH2 区 SEQ ID NO ： 26、 和 CDRH3 区 SEQ ID NO ： 27， 且轻链可变域包含 CDRL1 区 SEQ ID NO ： 28、 CDRL2 区 SEQ ID NO ： 29、 和 CDRL3 区 SEQ ID NO ： 30。
术语 “表位” 意指人 CDCP1 中能够特异性结合抗体的蛋白质决定子。表位通常由 分子诸如氨基酸或糖侧链的化学活性表面聚集构成， 并且通常表位具有特定的三维结构特 征， 及特定的电荷特征。构象性和非构象性表位的区别之处在于在存在变性溶剂的情况中 丧失对前一种， 而不是后一种的结合。 如本文中所使用的， 术语 “与 CUB4( 保藏号 DSMACC2551) 结合相同表位” 指结合 CDCP1 上抗体 CUB4( 保藏号 DSM ACC2551) 结合的相同表位的本发明的抗 CDCP1 抗体。可以 使用本领域中已知的技术来测定本发明的抗 CDCP1 抗体的表位结合特性。在体外竞争结合 抑制测定法中通过表面等离振子共振 (SPR) 于 25℃测定抗体 CUB4( 保藏号 DSM ACC2551) 抑制测试抗体对 CDCP1 结合的能力， 从而测量 CDCP1 抗体 ( 参见图 2)。与 CUB4 结合相同 表位的抗体的结合受到抑制， 并且在添加测试抗体后没有检出结合信号。( 例如， 测试抗体 的注射时间 ( ＝ 0 秒 ) 后 100 秒， 结合信号不比注射时的信号高 ； 以 RU( 相对单位 ) 测量信 号 )( 例如 CDCP1-004、 CDCP1-012、 CDCP1-015， 参见图 3a)。与 CUB4 结合不同表位的抗体的 结合不受抑制， 并且在添加测试抗体后检出结合信号 ( 例如 CUB1 和 CUB3， 参见图 3b)( 例 如， 注射时间 ( ＝ 0 秒 ) 后 100 秒， 结合信号比注射时的信号高 ； 以 RU( 相对单位 ) 测量信 号 )。这可以通过 BIAcore 测定法 (Pharmacia Biosensor AB， Uppsala， Sweden) 来调查， 如记载于例如实施例 2 的。
如本文中所使用的， “可变域” ( 轻链可变域 (VL)、 重链可变域 (VH)) 意为直接牵涉 抗体结合抗原的轻链和重链域对之每种。轻链和重链可变域具有相同的一般结构， 并且每 个域包含通过三个 “高变区” ( 或互补决定区， CDR) 连接的其序列广泛保守的四个框架 (FR) 区。框架区采用 β- 片层构象， 而 CDR 可以形成连接 β- 片层结构的环。每条链中的 CDR 通过框架区保持其三维结构， 并且与来自另一条链的 CDR 一起形成抗原结合位点。抗体的 重链和轻链 CDR3 区在依照本发明的抗体的结合特异性 / 亲和力中发挥特别重要的作用， 并 且因此提供本发明的别的目的。
在本文中使用时， 术语 “抗体的抗原结合部分” 指抗体中负责抗原结合的氨基酸 残基。抗体的抗原结合部分包含来自 “互补决定区” 或 “CDR” 的氨基酸残基。术语本发明 的抗体的 “抗原结合部分” 可以含有 6 个互补决定区 (CDR)， 其以不同程度促成结合位点 对抗原的亲和力。存在着三个重链可变域 CDR(CDRH1、 CDRH2 和 CDRH3) 和三个轻链可变域 CDR(CDRL1、 CDRL2 和 CDRL3)。通过与汇编的氨基酸序列数据库比较来确定 CDR 和框架区
(FR) 的范围， 在所述数据库中已经依照序列间的可变性限定那些区域。
“框架” 或 “FR” 区是与如本文中所限定的高变区残基不同的那些可变域区。因 此， 抗体的轻链和重链可变域包含自 N 至 C 端的域 FRi、 CDR1、 FR2、 CDR2、 FR3、 CDR3、 和 FR4。 CDR 和 FR 区依照 Kabat 等， Sequences of Proteins of Immunological Interest， 第 5 版， Public Health Service， National Institutes of Health， Bethesda， MD(1991) 的标准定 义和 / 或那些来自 “高变环” 的残基来确定。
如本文中所使用的， 术语 “核酸” 或 “核酸分子” 意图包括 DNA 分子和 RNA 分子。核 酸分子可以是单链或双链， 但是优选的是双链 DNA。
如本申请内所使用的， 术语 “氨基酸” 意指天然存在的羧基 α- 氨基酸的组， 包括 丙氨酸 ( 三字母代码 ： ala， 单字母代码 ： A)、 精氨酸 (arg， R)、 天冬酰胺 (asn， N)、 天冬氨酸 (asp， D)、 半胱氨酸 (cys， C)、 谷氨酰胺 (gln， Q)、 谷氨酸 (glu， E)、 甘氨酸 (gly， G)、 组氨酸 (his， H)、 异亮氨酸 (ile， I)、 亮氨酸 (leu， L)、 赖氨酸 (lys， K)、 甲硫氨酸 (met， M)、 苯丙氨 酸 (phe， F)、 脯氨酸 (pro， P)、 丝氨酸 (ser， S)、 苏氨酸 (thr， T)、 色氨酸 (trp， W)、 酪氨酸 (tyr， Y)、 和缬氨酸 (val， V)。
依照本发明的抗体的特征在于恒定区是人起源的， 且优选的是人 IgG1 亚类的。 恒定区包括抗体的重链和轻链恒定区。重链恒定区包含以 N 端至 C 端方向的抗体重链恒 定域 1(CH1)、 抗体铰链区 (HR)、 抗体重链恒定域 2(CH2)、 和抗体重链恒定域 3(CH3) ； 和任 选地在 IgE 亚类抗体的情况中抗体重链恒定域 4(CH4)。轻链恒定区包含抗体轻链恒定域 (CL)。抗体轻链恒定域 (CL) 可以是 κ( 卡帕 ) 或 λ( 拉姆达 )。此类恒定链是现有技术公 知的， 并且例如由 Kabat， E.， A.， 描述 ( 参见例如 Johnson， G. 和 Wu， T.， T.， Nucleic Acids Res.28(2000)214-218)。 例如， 有用的 IgG1 亚类人重链恒定区包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 3。例如， 有用的人轻链恒定区包含 κ 轻链恒定区的氨基酸序列 SEQ ID NO ： 4； 另一个有用 的人轻链恒定区包含 λ 轻链恒定区的氨基酸序列 SEQ ID NO ： 5。
抗体的 “Fc 部分” 不直接牵涉抗体对抗原的结合， 但是展现出各种效应器功能。 “抗 体的 Fc 部分” 是熟练技术人员公知的术语， 并且基于木瓜蛋白酶对抗体的切割限定。根据 其重链恒定区的氨基酸序列， 抗体或免疫球蛋白分成类 ： IgA、 IgD、 IgE、 IgG 和 IgM， 并且这 些中的数种可以进一步分成亚类 ( 同种型 )， 例如 IgG1、 IgG2、 IgG3、 和 IgG4、 IgA1、 和 IgA2。 依照重链恒定区， 免疫球蛋白的不同类分别称作 α、 δ、 ε、 γ、 和 μ。
抗体的 Fc 部分直接牵涉 ADCC( 抗体依赖性细胞介导的细胞毒性 ) 和基于补体 激活、 C1q 结合和 Fc 受体结合的 CDC( 补体依赖性细胞毒性 )。补体激活 (CDC) 是通过 补体因子 C1q 结合大多数 IgG 抗体亚类的 Fc 部分启动的。虽然抗体对补体系统的影响 依赖于某些条件， 但是对 C1q 的结合是由 Fc 部分中的限定结合位点引起的。此类结合 位 点 是 现 有 技 术 中 已 知 的， 并 且 例 如 由 Boackle， R.J. 等， Nature 282(1979)742-743 ； Lukas ， T.J. 等， J.Immunol.127(1981)2555-2560 ； Brunhouse ， R. 和 Cebra ， J.J. ， Mol.Immunol.16(1979)907-917 ； Burton ， D.R. 等，Nature 288(1980)338-344 ； Thommesen ，J.E. 等，Mol.Immunol.37(2000)995-1004 ； Idusogie ，E.E. 等， J.Immunol.164(2000)4178-4184 ； Hezareh， M. 等， J.Virology 75(2001)12161-12168 ； Morgan， A. 等， Immunology 86(1995)319-324 ； EP 0307434 描述。此类结合位点是例如 L234、 L235、 D270、 N297、 E318、 K320、 K322、 P331 和 P329( 依照 Kabat， E.A. 的 EU 索引的编号方式， 参见下文 )。亚类 IgG1、 IgG2 和 IgG3 的抗体通常显示补体激活及 C1q 和 C3 结合， 而 IgG4 不激活补体系统， 而且不结合 C1q 和 C3。
依照本发明的抗体包含自人起源衍生的 Fc 部分， 且优选地人恒定区的所有其它 部分。如本文中所使用的， 术语 “自人起源衍生的 Fc 部分” 意指作为 IgG1、 IgG2、 IgG3 或 IgG4 亚类的人抗体的 Fc 部分， 优选地来自人 IgG1 亚类的 Fc 部分、 来自人 IgG1 亚类的突 变 Fc 部分 ( 优选地具有 L234A+L235A 方面的突变 )、 来自人 IgG4 亚类的 Fc 部分或来自人 IgG4 亚类的突变 Fc 部分 ( 优选地具有 S228P 方面的突变 ) 的 Fc 部分。最优选的是人 IgG1 亚类 ( 参见例如 SEQ IDNO ： 3)、 具有突变 L234A 和 L235A 的人 IgG1 亚类、 人 IgG4 亚类 ( 参 见例如 SEQID NO ： 6)、 或具有突变 S228P 的人 IgG4 亚类的人重链恒定区。
术语 “抗体依赖性细胞的细胞毒性 (ADCC)” 指在存在效应细胞的情况中通过依照 本发明的抗体来裂解人靶细胞。优选地， 通过在存在效应细胞， 诸如新鲜分离的 PBMC 或来 自血沉棕黄层的纯化的效应细胞， 如单核细胞或天然杀伤 (NK) 细胞或永久生长 NK 细胞系 的情况中用依照本发明的抗体来处理 CDCP1 表达细胞的制备物来测量 ADCC。
术语 “补体依赖性细胞毒性 (CDC)” 意指通过补体因子 C1q 与大多数 IgG 抗体亚类 的 Fc 部分的结合启动的过程。 通过在所谓的结合位点处限定的蛋白质 - 蛋白质相互作用引 起 C1q 与抗体的结合。此类 Fc 部分结合位点是现有技术中已知的 ( 参见上文 )。此类 Fc 部分结合位点例如以氨基酸 L234、 L235、 D270、 N297、 E318、 K320、 K322、 P331、 和 P329( 依照 Kabat 的 EU 索引编号 ) 为特征。亚类 IgG1、 IgG2、 和 IgG3 的抗体通常显示包括 C1q 和 C3 结合的补体激活， 而 IgG4 不激活补体系统， 而且不结合 C1q 和 / 或 C3。
单克隆抗体的细胞介导的效应器功能可以通过工程化改造其寡糖组分来增强， 如记载于 Umana， P. 等， Nature Biotechnol.17(1999)176-180， 及 US6,602,684 的。IgG1 型抗体 ( 最常使用的治疗性抗体 ) 是在每个 CH2 域中具有 Asn297 处的保守的 N 连接 的糖基化位点的糖蛋白。两个附着于 Asn297 的复合双触角寡糖掩埋于 CH2 域间， 这形 成与多肽主链的广泛接触， 并且其存在对于抗体介导效应器功能诸如抗体依赖性细胞 的 细 胞 毒 性 (ADCC) 是 至 关 重 要 的 (Lifely， M.R. 等， Glycobiology 5(1995)813-822 ； Jefferis， R. 等， Immunol.Rev.163(1998)59-76 ； Wright， A. 和 Morrison， S.L.， Trends Biotechnol.15(1997)26-32)。Umana， P. 等 Nature Biotechnol.17(1999)176-180 和 WO 99/54342 显 示 了 β(1， 4)-N- 乙 酰 葡 糖 胺 转 移 酶 III(“GnTIII” )( 即 一 种 催 化 两 分型寡糖形成的糖基转移酶 ) 在中国仓鼠卵巢 (CHO) 细胞中的过表达显著提高抗体的 体外 ADCC 活性。Asn297 碳水化合物的组成改变或其消除还影响与 FcγR 和 C1q 的结 合 (Umana， P. 等， Nature Biotechnol.17(1999)176-180 ； Davies， J. 等， Biotechnol. Bioeng.74(2001)288-294 ； Mimura ，Y. 等，J.Biol.Chem.276(2001)45539-45547 ； Radaev ， S. 等， J.Biol.Chem.276(2001)16478-16483 ； Shields ， R.L. 等， J.Biol. Chem.276(2001)6591-6604 ； Shields， R.L. 等， J.Biol.Chem.277(2002)26733-26740 ； Simmons， L.C. 等， J.Immunol.Methods 263(2002)133-147)。
例如在 WO 2005/044859， WO 2004/065540， WO2007/031875， Umana， P. 等， Nature Biotechnol.17(1999)176-180， WO 99/154342， WO 2005/018572， WO 2006/116260， WO 2006/114700， WO 2004/065540， WO 2005/011735， WO2005/027966， WO 1997/028267， US 2006/0134709， US 2005/0054048， US2005/0152894， WO 2003/035835 和 WO 2000/061739中， 或 者 例 如 在 Niwa， R. 等， J.Immunol.Methods 306(2005)151-160 ； Shinkawa， T. 等， J.Biol.Chem.278(2003)3466-3473 ； WO 03/055993 和 US 2005/0249722 中报告了增强单克 隆抗体的细胞介导的效应器功能的方法。
因此， 在本发明的一个实施方案中， 依照本发明的抗体在 Asn297 处用糖链糖基化 ( 若它包含 IgG1 或 IgG3 亚类的 Fc 部分 )， 由此所述糖链内的岩藻糖量是 65％或更低 ( 依 照 Kabat 的编号方式 )。在另一个实施方案中， 所述糖链内的岩藻糖量是在 5％和 65％之 间， 优选地在 20％和 40％之间。依照本发明的 “Asn297” 意指位于 Fc 区中的约第 297 位的 氨基酸天冬酰胺。基于抗体的次要序列变异， Asn297 也可以位于第 297 位上游或下游的一 些氨基酸 ( 通常不超过 ±3 个氨基酸 )， 即第 294 位和第 300 位之间。在一个实施方案中， 依照本发明的糖基化抗体， IgG 亚类是人 IgG1 亚类的、 具有突变 L234A 和 L235A 的人 IgG1 亚类的或 IgG3 亚类的。在又一个实施方案中， N- 羟乙酰神经氨酸 (NGNA) 的量是 1％或更 小和 / 或 N 端 α-1， 3- 半乳糖的量是所述糖链内的 1％或更小。优选地， 糖链显示了附着于 CHO 细胞中重组表达的抗体的 Asn297 的 N 连接聚糖的特征。
术语 “糖链显示了附着于 CHO 细胞中重组表达的抗体的 Asn297 的 N 连接聚糖的特 征” 意指依照本发明的抗体的 Asn297 处的糖链与未修饰的 CHO 细胞中表达的相同抗体的糖 链， 例如如那些在 WO 2006/103100 中报告的糖链具有相同的结构和糖残基序列 ( 除了岩藻 糖残基外 )。 如本申请内所使用的， 术语 “NGNA” 意指糖残基 N- 羟乙酰神经氨酸。
在 Asn297 处发生人 IgG1 或 IgG3 的糖基化， 作为以多至两个 Gal 残基为末端 的核心岩藻糖化双触角复合寡糖糖基化。Kabat， E.A. 等， Sequences of Proteins of Immunological Interest， 第 5 版， Public Health Service， National Institutes of Health， Bethesda， MD.(1991) 及 Brueggemann， M. 等， J.Exp.Med.166(1987)1351-1361 ； Love， T.W. 等， Methods Enzymol.178(1989)515-527 详细报告了 IgG1 或 IgG3 亚类的人重 链恒定区。根据末端 Gal 残基的量， 这些结构称为 G0、 G1(α-1， 6- 或 α-1， 3-)、 或 G2 聚糖 残基 (Raju， T.S.， Bioprocess Int.1(2003)44-53)。抗体 Fc 部分的 CHO 型糖基化例如由 Routier， F.H.， Glycoconjugate J.14(1997)201-207 描述。在非糖修饰的 CHO 宿主细胞中 重组表达的抗体在 Asn297 处通常以至少 85％的量进行岩藻糖化。抗体的经修饰的寡糖可 以是杂合的或复合的。优选地， 两分型、 还原的 / 非岩藻糖化的寡糖是杂合的。在另一个实 施方案中， 两分型、 还原的 / 非岩藻糖化的寡糖是复合的。
依照本发明， “岩藻糖的量”意指通过 MALDI-TOF 质谱术测量的， 并以平均值计 算的， 相对于附着于 Asn297 的所有糖结构 ( 例如复合的、 杂合的和高甘露糖结构 ) 的总 和， Asn297 处糖链内所述糖的量 ( 参见例如 WO2008/077546)。岩藻糖的相对量是通过 MALDI-TOF， 含有岩藻糖的结构相对于经 N- 糖苷酶 F 处理的样品中鉴定的所有糖结构 ( 例 如分别为复合的、 杂合的及寡和高甘露糖结构 ) 的百分比。
优选地， 通过重组手段来生成依照本发明的抗体。此类方法是现有技术中普遍已 知的， 并且包括在原核和真核细胞中的蛋白质表达， 随后分离抗体多肽， 并且通常纯化至药 学可接受纯度。对于蛋白质表达， 通过标准的方法将编码轻链和重链或其片段的核酸插入 表达载体中。在合适的原核或真核宿主细胞， 如 CHO 细胞、 NS0 细胞、 SP2/0 细胞、 HEK293 细 胞、 COS 细胞、 酵母、 或大肠杆菌细胞中实施表达， 并且自细胞 ( 上清液或裂解后的细胞 ) 回
收抗体。 抗体的重组生成是现有技术中公知的， 并且例如记载于综述文章 Makrides， S.C. ，Protein Expr.Purif.17(1999)183-202 ； Geisse ，S. 等，Protein Expr. Purif.8(1996)271-282 ； Kaufman， R.J.， Mol.Biotechnol.16(2000)151-160 ； Werner， R.G.， Drug Res.48(1998)870-880。
抗体可以存在于整个细胞中， 在细胞溶胞物中， 或者为部分纯化的或基本上纯的 形式。通过标准的技术， 包括碱 /SDS 处理、 CsCl 分带、 柱层析、 琼脂糖凝胶电泳、 和本领域 中公知的其它技术 ( 参见 Ausubel， F. 等编 Current Protocols in Molecular Biology， Greene Publishing and Wiley Interscience， New York(1987)) 来实施纯化以消除其它 细胞组分或其它污染物， 例如其它细胞核酸或蛋白质。
例如， Barnes， L.M. 等， Cytotechnology 32(2000)109-123 ； 及 Barnes， L.M. 等， Biotech.Bioeng.73(2001)261-270 描 述 了 NS0 细 胞 中 的 表 达。 例 如， Durocher， Y. 等， Nucl.Acids.Res.30(2002)E9 描 述 了 瞬 时 表 达。Orlandi， R. 等， Proc.Natl.Acad.Sci. USA 86(1989)3833-3837 ； Carter， P. 等， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(1992)4285-4289 ； 及 Norderhaug， L. 等， J.Immunol.Methods 204(1997)77-87 描 述 了 可 变 域 的 克 隆。 Schlaeger， E.-J. 和 Christensen， K.， 于 Cytotechnology 30(1999)71-83 及 Schlaeger，
E.-J.， 于 J.Immunol.Methods 194(1996)191-199 描述了一种优选的瞬时表达系统 (HEK 293)。
适合于原核生物的控制序列例如包括启动子， 任选地操纵基因序列， 和核糖体结 合位点。已知真核细胞利用启动子、 增强子和多腺苷酸化信号。
在将核酸放置在与另一种核酸序列的功能性关系中时， 它是 “可操作连接的” 。例 如， 若前序列或分泌前导的 DNA 以参与多肽分泌的前蛋白表达， 则它与多肽的 DNA 可操作连 接； 若启动子或增强子影响序列的转录， 则它与编码序列可操作连接 ； 或者若核糖体结合 位点定位为使得便于翻译， 则它与编码序列可操作连接。一般而言， “可操作连接的” 意指所 连接的 DNA 序列是连续的， 并且在分泌前导的情况中， 是连续的且在读码框中。然而， 增强 子不必是连续的。通过在方便的限制性位点处的连接来实现连接。若不存在此类位点， 则 依照常规的实践使用合成的寡核苷酸衔接头或接头。
通过常规的免疫球蛋白纯化规程， 诸如例如蛋白 A-Sepharose、 羟磷灰石层析、 凝 胶电泳、 透析、 或亲和层析来自培养液适当地分离单克隆抗体。 容易使用常规规程将编码单 克隆抗体的 DNA 和 RNA 分离并测序。杂交瘤细胞可以充当此类 DNA 和 RNA 的来源。一旦分 离， 可以将 DNA 插入表达载体中， 然后将所述表达载体转染入在其它情况中不生成免疫球 蛋白蛋白质的宿主细胞诸如 HEK 293 细胞、 CHO 细胞、 或骨髓瘤细胞中， 以获得重组单克隆 抗体在宿主细胞中的合成。
如本文中所使用的， 表述 “细胞” 、 “细胞系” 、 和 “细胞培养物” 可互换使用， 并且所 有此类名称包括后代。如此， 词语 “转化体” 和 “经转化的细胞” 包括原代主题细胞和自其衍 生的培养物， 而不管传递的次数。还应当理解， 由于有意或无意的突变， 所有后代在 DNA 内 容上可能不是正好相同的。 包括具有如在初始转化细胞中筛选的相同功能或生物学活性的 变体后代。在意图独特名称的情况中， 它从上下文看会是清楚的。
如本文中所使用的， 术语 “转化” 指将载体 / 核酸转移入宿主细胞中的过程。若使用没有难以应付的细胞壁屏障的细胞作为宿主细胞， 则例如通过磷酸钙沉淀法来实施转 染， 如 Graham， F.L. 和 van der Eb， A.J.， Virology 52(1973)456-467 所描述的。然而， 也 可以使用其它用于将 DNA 导入细胞中的方法， 诸如通过核注射或者通过原生质体融合来进 行。若使用原核细胞或含有坚固细胞壁构造的细胞， 则例如一种转染方法是使用氯化钙进 行的钙处理， 如 Cohen， S.N. 等， PNAS.69(1972)2110-2114 所描述的。
如本文中所使用的， “表达”指将核酸转录成 mRNA 的过程和 / 或随后将转录的 mRNA( 又称为转录物 ) 翻译成肽、 多肽、 或蛋白质的过程。转录物和编码的多肽统称为基因 产物。若多核苷酸是自基因组 DNA 衍生的， 则真核细胞中的表达可以包括 mRNA 的剪接。
“载体” 指将插入的核酸分子转移入宿主细胞中和 / 或在宿主细胞间转移的核酸分 子， 特别是自我复制的。该术语包括主要在将 DNA 或 RNA 插入细胞 ( 例如， 染色体整合 ) 方 面发挥功能的载体、 主要在 DNA 或 RNA 复制方面发挥功能的复制载体、 和在 DNA 或 RNA 的转 录和 / 或翻译方面发挥功能的表达载体。还包括提供超过一种功能的载体， 如所描述的。
“表达载体” 指在导入合适的宿主细胞中时可以被转录和翻译成多肽的多核苷酸。 “表达系统” 通常指包含能发挥功能以产生期望的表达产物的表达载体的合适的宿主细胞。
本发明的一个方面是包含依照本发明的抗体的药物组合物。 本发明的另一方面是 依照本发明的抗体用于制造药物组合物的用途。 本发明的又一方面是用于制造包含依照本 发明的抗体的药物组合物的方法。在另一方面， 本发明提供了含有与药用载体一起配制的 依照本发明的抗原结合蛋白的组合物， 例如药物组合物。 已 经 证 明 了 与 其 它 抗 CDCP1 抗 体， 如 例 如 CUB1 抗 体 ( 来 自 DE 10242146(EP 1396501， US 7,541,030) 的具有保藏号 DSMACC2569 的保藏抗体 ) 相比， 所述以与 CUB4( 保 藏号 DSMACC2551) 结合相同表位为特征的特异性结合人 CDCP1 的抗体特别可用于治疗癌 症。
因此， 本发明的一个方面是用于治疗癌症的所述药物组合物。
本发明的另一方面是依照本发明的抗体用于制造供治疗癌症用的药物的用途。
本发明的另一方面是治疗患有癌症的患者的方法， 其通过对需要此类治疗的所述 患者施用依照本发明的抗体来进行。
如本文中所使用的， “药用载体” 包括生理学相容的任何和所有溶剂、 分散介质、 涂 层材料、 抗细菌剂和抗真菌剂、 等张剂和吸收延迟剂， 等等。优选地， 载体适合于静脉内、 肌 肉内、 皮下、 胃肠外、 脊柱或表皮施用 ( 例如通过注射或输注 )。
可以通过本领域中已知的多种方法来施用本发明的组合物。 如熟练技术人员会领 会的， 施用的路径和 / 或模式会随期望的结果而变化。为了通过某些施用路径来施用本发 明的化合物， 可能有必要用某种材料包被化合物， 或者与某种材料共施用化合物以阻止其 失活。例如， 可以将化合物在合适的载体， 例如脂质体或稀释剂中对受试者施用。药学可接 受稀释剂包括盐水和水性缓冲溶液。 药用载体包括无菌水溶液或分散体和供临场制备无菌 可注射溶液或分散体用的无菌粉剂。 对药学活性物质使用此类介质和药剂是本领域中已知 的。
如本文中所使用的， 短语 “胃肠外施用” 意指通常通过注射进行的与肠和表面施用 不同的施用模式， 并且包括但不限于静脉内、 肌肉内、 动脉内、 鞘内、 囊内、 眶内、 心内、 皮内、 腹膜内、 经气管、 皮下、 表皮下、 关节内、 囊下、 蛛网膜下、 脊柱内、 硬膜外和胸骨内注射和输
注。 如本文中所使用的， 术语 “癌症” 可以是例如肺癌、 非小细胞肺 (NSCL) 癌、 细支气 管肺泡细胞肺癌、 骨癌、 胰腺癌、 皮肤癌、 头或颈癌、 皮肤或眼内黑素瘤、 子宫癌、 卵巢癌、 直 肠癌、 肛区癌、 胃癌 (stomach cancer)、 胃癌 (gastric cancer)、 结肠癌、 乳腺癌、 子宫癌、 输卵管癌、 子宫内膜癌、 宫颈癌、 阴道癌、 外阴癌、 何杰金 (Hodgkin) 氏病、 食管癌、 小肠癌、 内分泌系统癌、 甲状腺癌、 甲状旁腺癌、 肾上腺癌、 软组织肉瘤、 尿道癌、 阴茎癌、 前列腺癌、 膀胱癌、 肾或输尿管癌、 肾细胞癌、 肾盂癌、 间皮瘤、 肝细胞癌、 胆癌 (biliary cancer)、 中 枢神经系统 (CNS) 新生物、 脊柱轴肿瘤、 脑干胶质瘤、 多形性成胶质细胞瘤 (glioblastoma multiforme)、 星形细胞瘤、 神经鞘瘤 (schwanoma)、 室鼓膜瘤 (ependymona)、 髓母细胞瘤、 脑脊膜瘤、 鳞状细胞癌、 垂体腺瘤、 淋巴瘤、 淋巴细胞性白血病， 包括任何上述癌症的顽固性 型式、 或一种或多种上述癌症的组合。优选地， 此类癌症是乳腺癌、 卵巢癌、 宫颈癌、 肺癌或 前列腺癌， 且更优选地肺癌。优选地， 此类癌症的进一步特征在于 CDCP1 表达或过表达。更 优选地， 此类癌症的进一步特征在于过表达。
这些组合物还可以含有佐剂诸如防腐剂、 湿润剂、 乳化剂和分散剂。可以通过灭 菌规程， 见上文， 及通过包括各种抗细菌剂和抗真菌剂， 例如对羟基苯甲酸酯、 三氯叔丁醇、 酚、 山梨酸等来确保阻止微生物的存在。还可能期望将等张剂， 诸如糖、 氯化钠等纳入组合 物中。另外， 可以通过包括延迟吸收的药剂诸如单硬脂酸铝和明胶来引起可注射药物形式 的吸收延迟。
不管选择的施用路径， 通过本领域技术人员已知的常规方法来将本发明的化合物 ( 其可以以合适的水合形式使用 ) 和 / 或本发明的药物组合物配制成药学可接受剂量形式。
可以改变活性成分在本发明的药物组合物中的实际剂量水平， 从而获得对于实现 特定患者的期望的治疗响应、 组成、 和施用模式有效的， 而对患者无毒的活性成分量。选定 的剂量水平会取决于多种药动学因素， 包括所采用的本发明的特定组合物的活性、 施用路 径、 施用时间、 所采用的特定化合物的排泄速率、 治疗的持续时间、 与所采用的特定组合物 组合使用的其它药物、 化合物和 / 或材料、 所治疗的患者的年龄、 性别、 重量、 状况、 一般健 康和先前的医学史等医学领域公知的因素。
组合物必须是无菌的， 而且是流体的， 其程度使得组合物通过注射器可投递。 在水 外， 载体优选地是等张缓冲盐水溶液。
可以例如通过使用涂层材料诸如卵磷脂、 在分散体的情况中通过维持所要求的粒 度、 及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。 在许多情况中， 优选在组合物中包含等张 剂 ( 例如糖、 多元醇诸如甘露醇或山梨醇、 和氯化钠 )。
提供以下实施例、 序列表和图以帮助理解本发明， 其实际范围在所附权利要求书 中列出。应当理解， 可以在不背离本发明的精神的前提下对所列规程做出修饰。
序列表的描述
SEQ ID NO ： 1 人 CDCP1
SEQ ID NO ： 2 包含胞外域 (ECD) 的人 CDCP1 片段
SEQ ID NO ： 3 来自人起源的 IgG1 重链恒定区
SEQ ID NO ： 4 来自人起源的 κ 轻链恒定区
SEQ ID NO ： 5 来自人起源的 λ 轻链恒定区
SEQ ID NO ： 6 来自人起源的 IgG4 重链恒定区 SEQ ID NO ： 7 重链可变域 VH， CUB4( 保藏号 DSMACC2551) SEQ ID NO ： 8 轻链可变域 VL， CUB4( 保藏号 DSMACC2551) SEQ ID NO ： 9 重链 CDRH1， 单抗 CDCP1-004 SEQ ID NO ： 10 重链 CDRH2， 单抗 CDCP1-004 SEQ ID NO ： 11 重链 CDRH3， 单抗 CDCP1-004 SEQ ID NO ： 12 轻链 CDRL1， 单抗 CDCP1-004 SEQ ID NO ： 13 轻链 CDRL2， 单抗 CDCP1-004 SEQ ID NO ： 14 轻链 CDRL3， 单抗 CDCP1-004 SEQ ID NO ： 15 重链可变域 VH， 单抗 CDCP1-004 SEQ ID NO ： 16 轻链可变域 VL， 单抗 CDCP1-004 SEQ ID NO ： 17 重链 CDRH1， 单抗 CDCP1-012 SEQ ID NO ： 18 重链 CDRH2， 单抗 CDCP1-012 SEQ ID NO ： 19 重链 CDRH3， 单抗 CDCP1-012 SEQ ID NO ： 20 轻链 CDRL1， 单抗 CDCP1-012 SEQ ID NO ： 21 轻链 CDRL2， 单抗 CDCP1-012 SEQ ID NO ： 22 轻链 CDRL3， 单抗 CDCP1-012 SEQ ID NO ： 23 重链可变域 VH， 单抗 CDCP1-012 SEQ ID NO ： 24 轻链可变域 VL， 单抗 CDCP1-012 SEQ ID NO ： 25 重链 CDRH1， 单抗 CDCP1-015 SEQ ID NO ： 26 重链 CDRH2， 单抗 CDCP1-015 SEQ ID NO ： 27 重链 CDRH3， 单抗 CDCP1-015 SEQ ID NO ： 28 轻链 CDRL1， 单抗 CDCP1-01510 SEQ ID NO ： 29 轻链 CDRL2， 单抗 CDCP1-015 SEQ ID NO ： 30 轻链 CDRL3， 单抗 CDCP1-015 SEQ ID NO ： 31 重链可变域 VH， 单抗 CDCP1-015 SEQ ID NO ： 32 轻链可变域 VL， 单抗 CDCP1-015 附图简述 图 1 抗 CDCP1 抗体 CUB4 和 CUB1 在人肺癌 H322M 异种移植物中的体内肿瘤生长抑 图 2 用固定化的 CUB4 抗体、 CDCP1 的胞外域 (ECD)、 和别的抗 CDCP1 测试抗体 ( 例 的示意性测定法形式。制。
如 CUB1 和 CUB3) 的表面等离振子共振 (SPR-) 技术
图 3 固定化的 CUB4 抗体、 CDCP1 的胞外域 (ECD) 和抗 CDCP1 抗体 CUB1 和 CUB3 的 Biacore 传感图 (x 轴＝时间 ； y 轴＝以相对单位 (RU) 计的响应 )
图 3a ： 显示了 CDCP1-004、 CDCP1-012 和 CDCP1-015 抗体结合 CDCP1 上与 CUB4 抗 体相同的表位。
图 3b ： 显示了 CUB1 和 CUB3 抗体结合 CDCP1 上与 CUB4 抗体不同的另一表位。
图 4 依照本发明的 CDCP1 抗体结合人 CDCP1 胞外域 (CDCP1-ECD) 和人 CDCP1-ECD 的亚域图 5 在 HCT 116 细胞中刺激 CDCP1 磷酸化 图 6 在 MDAMB-231 细胞中刺激 CDCP1 内在化和磷酸化实施例 实施例 1
抗 CDCP1 抗体 CUB4 的体内肿瘤生长抑制及与 CUB1 抗体比较
研究名称 ： CDCP1_PZ_H322M_002
实施本体内研究以比较特异性抗 CDCP1 抗体 CUB4 与结合另一表位的抗体， 如例如 CUB1 的功效。
H322M 非小细胞肺癌细胞最初自 NCI 保藏中心获得， 并在扩充后保藏于 Roche 细 胞库， Penzberg。将肿瘤细胞系常规地在补充有 10％胎牛血清和 2mML- 谷氨酰胺的 RPMI 1640 培养基中于 37℃在水饱和的气氛中于 5％ CO2 培养。使用传代 4 来进行细胞移植。
将人非小细胞肺癌细胞系 H322M 与 Matrigel 一起皮下接种 (5x106 个细胞 ) 入小 鼠的右体侧中。
动物处理在细胞移植后 17 天在随机化当天开始。 以 10mg/kg 的指定剂量 i.p.q7d 施用抗体， 直至研究终止第 62 天。还在同一天施用相应的媒介物。施用体积是 10ml/kg。
组：
处理组 1 ： 媒介物
处理组 2 ： 鼠 CUB4 10mg/kg i.p. ；
处理组 3 ： 鼠 CUB1 10mg/kg i.p. ；
TGI( 以％计的肿瘤生长抑制 )
下表显示了肿瘤生长抑制的数值， 其基于均值和中值分别对每组和时间点以 100- 平均值 (T_ 处理 [ 第 x 天 ]-T_ 处理 [ 基线 ])/ 平均值 (T_ 参照 [ 第 x 天 ]-T_ 参照 [ 基线 ])*100 计算。TGI 计算的参照选择为组 “媒介物” 。图 1 中也显示了结果。
表1： 肿瘤生长抑制 (TGI)
令人惊讶地， CUB4 抗体 ( 保藏号 DSM ACC2551) 比 CUB1 抗体 ( 来自 DE 10242146(EP 1396501， US 7,541,030) 的具有保藏号 DSM ACC2569 的保藏抗体 ) 显示明显更高的肿瘤生 长抑制。
类似地， 可以测定依照本发明的抗 CDCP1 抗体 CDCP1_004、 CDCP1_012 和 CDCP1_015 的体内肿瘤生长抑制。
实施例 2
表位结合测定法 (Biacore)
为了测定不同测试抗 CDCP1 抗体的表位区， 使用胺偶联化学将 CUB4( 保藏号 DSMACC2551) 在 CM5 生物传感器芯片表面上固定化。用 0.1M N- 羟基琥珀酰亚胺和 0.4M 1- 乙基 -3-(3- 二甲基氨基丙基 ) 碳二亚胺的 1 ∶ 1 混合物以 5μl/ 分钟的流速活化流动 池。将抗 CDCP1 抗体 CUB4( 保藏号 DSMACC2551) 在乙酸钠， pH 4.5-5.0 中以 10-30μg/ml 注射 12 分钟， 这导致约 15000 个 RU 的表面密度。用 1M 乙醇胺 /HCl pH 8.5 的注射封闭表 面。将人 CDCP1 的可溶性 ECD(SEQ.ID NO. ： 2)( 分析物 1) 和抗 CDCP1 抗体 ( 分析物 2) 在 PBST+0.8M NaCl 中稀释， 并以 30μl/ 分钟的流速注射。接触时间 ( 结合阶段 ) 对于浓度 为 250nM-500nM 的人 CDCP1ECD 是 150-200 秒， 而对于浓度为 100nM 的抗 CDCP1 抗体是 300 秒。然后， 将芯片表面用 PBST+0.8M NaCl 清洗 3 分钟 ( 解离阶段 )。精确地于 25℃ ( 标准 温度 ) 实施所有相互作用。将 10mM 甘氨酸， pH 2.0 的再生溶液注射 60-150 秒以在每个结 合周期后除去任何非共价结合的蛋白质。以每秒一个信号的检测速率检测信号。
为了测定抗 CDCP1 抗体是否与 CUB4 结合人 CDCP1 的相同或不同表位， 注射人 CDCP1 的 ECD， 并被固定化的抗体结合。 在结合后不久， 注射具有未知表位的抗体。 注射后没 有显示结合信号升高 ( 即， 例如测试抗体的注射时间 ( ＝ 0 秒 ) 后 100 秒， 结合信号没有注 射时的信号高 ； 信号以 RU( 相对单位 ) 测量 ) 的测试抗 CDCP1 抗体与 CUB4 结合相同表位。 显示结合信号升高的测试抗 CDCP1 抗体与 CUB4 结合不同表位 ( 例如， 注射时间 ( ＝ 0 秒 ) 后 100 秒， 结合信号比注射时的信号高 ； 信号以 RU( 相对单位 ) 测量 )。 图 3a 和 3b 中显示了三重测定的结果。发现抗体 CUB3、 CUB1( 参见图 3b) 与 CUB4 在不同表位处结合， 而抗 CDCP1 抗体 CDCP1-004、 CDCP1-012 和 CDCP1-015 鉴定为与 CUB4 结 合相同表位 ( 参见表 2 和图 3a， 均为三重实验 )。发现抗体 CUB3 和 CUB1 各自与 CUB4 结合 另一表位， 并且彼此不同 (CUB1 ≠ CUB3)。( 参见表 2 和图 3b， 均为三重实验 )。用 CUB4 和 稀释缓冲液作为阴性对照的对照实验没有显示结合信号的升高。
CUB1 在由胺偶联的单抗 CUB3 组成的实施复合物的情况中没有显示三明治式复合 物形成， 且反之亦然 ( 数据未显示 )。
CDCP1-004、 CDCP1-012 和 CDCP1-015 在分别由单抗 CUB1 或单抗 CUB3 和抗原组成 的这两种实施复合物的情况中显示三明治式复合物形成 ( 数据未显示 )。
表 2( 还可参见图 3) ：
与 CUB4 结合相同表位的抗体 鼠 CUB4 嵌合 CUB4 鼠 CDCP1-004 鼠 CDCP1-012 与 CUB4 结合不同表位的抗体 鼠 CUB1 鼠 CUB3在不同 Biacore 实验中， 已经如下测定了抗 CDCP1 抗体对固定化的 hCDCP1-ECD 的 结合常数和亲和力 ：
ka ： 结合速率常数， kd ： 解离速率常数， KD ： 解离平衡常数 ( 结合亲和力 )， t1/2 ： 复 合物的半衰期时间
实施例 3
抗原特异性 ELISA
将各自与链霉亲合素结合蛋白 (SBP)(SEQ ID No ： 2) 融合的可溶性 CDCP1 胞外 域 (CDCP1-ECD)(SEQ ID No ： 2) 及 Short1(huCDCP1_SH1_ECDaa1-216)_SBP) 和 Short5(hu_ CDCP1_SH5_ECD(aa 1-361)SBP)( 其分别包含 CDCP1 胞外域的氨基酸 1-216 和 CDCP1 胞外 域的氨基酸 1-361) 在链霉亲合素板上捕获。为了限定抗体对 SBP-CDCP1-ECD、 SBP-CDCP1 Short1 和 SBP-CDCP1-Short5 的最佳结合， 已经用纯的或 1 ∶ 4 稀释的 ( 在含有 10 ％胎 牛血清， Pan Biotech ID-No 3302-P251116 的 Dulbecco 氏改良的 Eagle 氏培养基， PAN Biotech 中 溶 解 )HEK293 上 清 液 包 被 96 孔 聚 苯 乙 烯 板 (Roche， 经 链 霉 亲 合 素 包 被 的， ID-No.1989685)。对于标准的包被， 与未稀释的 SBP-CDCP1-Short1 和 SBP-CDCP1-ECD 上 清液相反， 将含有 SBP-CDCP1-Short5 的 HEK293 上清液稀释 (1 ∶ 4)， 并于 2-8 ℃ (60μl) 温 育 过 夜。 对 微 量 滴 定 板 的 强 烈 清 洗 对 于 除 去 剩 余 的 未 结 合 的 SBP-CDCP1-ECD、 SBP-CDCP1-Short1 和 SBP-CDCP1-Short5 是必需的。
使用 ELISA 的封闭试剂 (Roche 11112589)250μl/ 孔通过实施一小时封闭步骤来 封闭经包被的孔。
使用 1 ∶ 500 稀释来测试抗 CDCP1 抗体 CUB4( 保藏号 DSM ACC2551) 和 CDCP1_004、 CDCP1_012 和 CDCP1_015( 在 50μl 含有 1 ％ BSA 级分 V， SigmaA3059 的 PBS 中稀释的 0， 1μg 抗体 )。于室温将每孔 50μl 每种样品温育 60 分钟。使用 PBS-T(PBS 中的 0， 05 ％ Tween 20， Fluka#08057) 强 烈 清 洗 后， 添 加 50μl 与 HRP 偶 联 的 山 羊 抗 小 鼠 IgG 抗 体 (BioRad#1706516， 稀释 1 ∶ 1000)， 并将其于室温温育 1 小时。强烈清洗后， 用 BM 蓝 POD 底 物 (Roche 11484281001)50μl 检测抗体的结合。使用标准的光度计来测量 370nm/492nm 的吸光度。
抗体 CDCP1-004、 CDCP1-012、 CDCP1-015 和 CUB4 的结合区位于 CDCP1 胞外域中的 aa 1 和 216 内。因此， 所有这些抗体也识别 CDCP1 的完整 ECD 和含有 aa 1-361 的构建体 (Short 5)( 参见图 4)。
实施例 4
在 MDAMB-231 或 HCT 116 细胞中刺激 CDCP1 内在化和磷酸化
将 每 6 孔 7x105 个 MDAMB-231 细 胞 在 DMEM+L- 谷 氨 酰 胺 + 丙 酮 酸 盐 (Gibco， 41966)10 ％ FCS(PAN Biotech ID-No 3302-P251116)1 ％ MEM 非 必 需 氨 基 酸 (PAA， P0832100) 中培养过夜。将 MDA-MB-231 细胞用 10μg/ 不同抗体处理 10 分钟和 5 小时 ： 小 鼠 CUB4( 保藏号 DSMACC2551) 和抗体 CDCP1_004、 CDCP1_012 和 CDCP1_015。将 HCT 116 细 胞用 20μg/ 不同抗体处理 10 分钟和 5 小时 ： 小鼠 CUB4( 保藏号 DSM ACC2551)、 小鼠 CUB1 和小鼠 CUB3。用冰冷的新鲜制备的 RIPA 裂解缓冲液 (Thermo Scientific， #89901)( 其含 有乙醇中的 1mM PMSF、 10μg/ml 抑肽酶、 0， 4mM 原钒酸盐 ) 裂解细胞。在冰上 15 分钟后， 将 细胞溶胞物以 13000rpm 离心 20 分钟。通过标准的方案在 SDS-PAGE 上分开溶胞物， 并通过 Western 印迹将其转移至硝酸纤维素。通过抗 CDCP1 抗体 (Cell Signaling#4115)、 抗磷酸 CDCP1 抗体或 PY 4G10( 在 HCT116 的情况中 ) 检测 Western 印迹。
未处理的 HCT116 细胞中存在的 CDCP1 的磷酸化水平在时间点 10 分钟或 5 小时时 是不变的。与 CUB1 相比， CUB4 在细胞温育 10 分钟后介导更强的 CDCP1 磷酸化。与 CUB1 相比， CUB4 对磷酸化的抑制和对 CDCP1 的下调 ( 数据未显示 ) 明显得多。CUB3 温育导致对 CDCP1 磷酸化的刺激较弱， 而且不能介导蛋白质的下调 ( 数据未显示 )。图 5a 和 b 中显示 了结果。
发明背景
人 CDCP1(( 含有 CUB 域的蛋白 1、 B345、 CD318、 SIMA135、 TRASK ； SEQ ID NO ： 1和 具有突变 R525Q( 即 SEQ ID NO ： 1 的氨基酸位置 525 处用谷氨酰胺 (Q) 替换精氨酸 (R)) 和 / 或突变 G709D( 即 SEQ ID NO ： 1 的氨基酸位置 709 处用天冬氨酸 (D) 替换甘氨酸 (G)) 的 变体 ) 是一种含有三个胞外 CUB 域的跨膜蛋白。发现此蛋白质在结肠和肺癌中过表达。其 表达水平与癌瘤细胞的转移能力相关联。已经显示了它在癌细胞系中是酪氨酸磷酸化的 (WO2002/004508 ； Scherl-Mostageer， M. 等， Oncogene 20(2001)4402-8 ； Hooper， J.D. 等， Oncogene 22(2003)1783-94 ； Perry， S.E. 等， FEBS Lett.581(2007)1137-42 ； Brown， T.A.， J.Bio1.Chem.279(2004)14772-14783 ； Ota， T. 等， Nat.Genet.36(2004)40-45)。已经报告 了编码独特同等型的可变剪接转录物变体。
WO 2002/004508 提及 CDCP1 为肿瘤相关抗原 B345。WO 2004/074481 提及 CDCP1 为转移性肿瘤细胞中表达的糖蛋白抗原 SIMA135。WO2005/042102 提及 CDCP1 为牵涉卵巢 癌的蛋白质。WO 2007/005502 涉及靶向 CDCP1 的用于治疗疾病的方法和组合物。
US 2004/0053343( 及 Conze， T. 等， Ann.N.Y.Acad.Sci.996(2003)222-6 和 Buhring， H.J. 等， Stem Cells 22(2004)334-43) 涉及用于鉴定的 CDCP1 抗体和 / 或某些细 胞干细胞群。
发明概述
本发明的一个方面是用于治疗癌症的特异性结合人 CDCP1 的抗体， 其特征在于 ： 与 CUB4( 保藏号 DSMACC2551) 结合相同表位。
本 发 明 进 一 步 包 括 用 于 治 疗 癌 症 的 抗 体， 其特征在于 ： 与 CUB4( 保 藏 号 DSMACC2551) 结合相同表位， 且进一步的特征在于 ：
a) 重链可变域是 SEQ ID NO ： 7， 且轻链可变域是 SEQ ID NO ： 8，
b) 重链可变域是 SEQ ID NO ： 15， 且轻链可变域是 SEQ ID NO ： 16， 或
c) 重链可变域是 SEQ ID NO ： 23， 且轻链可变域是 SEQ ID NO ： 24， 或
d) 重链可变域是 SEQ ID NO ： 31， 且轻链可变域是 SEQ ID NO ： 32， 或或其人源化型 式。
本 发 明 进 一 步 包 括 用 于 治 疗 癌 症 的 抗 体， 其特征在于 ： 与 CUB4( 保 藏 号 DSMACC2551) 结合相同表位， 且进一步的特征在于 ：
a) 重链可变域包含 CDRH1 区 SEQ ID NO ： 9、 CDRH2 区 SEQ ID NO ： 10、 和 CDRH3 区 SEQ ID NO ： 11， 且轻链可变域包含 CDRL1 区 SEQ ID NO ： 12、 CDRL2 区 SEQ ID NO ： 13、 和 CDRL3 区 SEQ ID NO ： 14， 或
b) 重链可变域包含 CDRH1 区 SEQ ID NO ： 17、 CDRH2 区 SEQ ID NO ： 18、 和 CDRH3 区 SEQ ID NO ： 19， 且轻链可变域包含 CDRL1 区 SEQ ID NO ： 20、 CDRL2 区 SEQ ID NO ： 21、 和 CDRL3 区 SEQ ID NO ： 22， 或
c) 重链可变域包含 CDRH1 区 SEQ ID NO ： 25、 CDRH2 区 SEQ ID NO ： 26、 和 CDRH3 区 SEQ ID NO ： 27， 且轻链可变域包含 CDRL1 区 SEQ ID NO ： 28、 CDRL2 区 SEQ ID NO ： 29、 和 CDRL3 区 SEQ ID NO ： 30。
本发明进一步包括依照本发明的抗体， 其特征在于 ： 所述抗体是人 IgG1 亚类的。
本发明的另一方面是一种用于治疗癌症的药物组合物， 其包含特异性结合人 CDCP1 的抗体， 该抗体的特征在于 ： 与 CUB4( 保藏号 DSMACC2551) 结合相同表位。
本发明的另一方面是特异性结合人 CDCP1 的抗体用于制备供治疗癌症用的药物 中的用途， 所述抗体的特征在于 ： 与 CUB4( 保藏号 DSMACC2551) 结合相同表位。
本发明的另一方面是一种治疗患有癌症的患者的方法， 其通过对需要此类治疗的 所述患者施用特异性结合人 CDCP1 的抗体来进行， 所述抗体的特征在于 ： 与 CUB4( 保藏号 DSMACC2551) 结合相同表位。
本发明进一步包括依照本发明的抗体， 其特征在于 ：
a) 重链可变域是 SEQ ID NO ： 15， 且轻链可变域是 SEQ ID NO ： 16， 或
b) 重链可变域是 SEQ ID NO ： 23， 且轻链可变域是 SEQ ID NO ： 24， 或
c) 重链可变域是 SEQ ID NO ： 31， 且轻链可变域是 SEQ ID NO ： 32， 或或其人源化型 式。 本发明进一步包括依照本发明的抗体， 其特征在于 ：
a) 重链可变域包含 CDRH1 区 SEQ ID NO ： 9、 CDRH2 区 SEQ ID NO ： 10、 和 CDRH3 区 SEQ ID NO ： 11， 且轻链可变域包含 CDRL1 区 SEQ ID NO ： 12、 CDRL2 区 SEQ ID NO ： 13、 和 CDRL3 区 SEQ ID NO ： 14， 或
b) 重链可变域包含 CDRH1 区 SEQ ID NO ： 17、 CDRH2 区 SEQ ID NO ： 18、 和 CDRH3 区 SEQ ID NO ： 19， 且轻链可变域包含 CDRL1 区 SEQ ID NO ： 20、 CDRL2 区 SEQ ID NO ： 21、 和 CDRL3 区 SEQ ID NO ： 22， 或
c) 重链可变域包含 CDRH1 区 SEQ ID NO ： 25、 CDRH2 区 SEQ ID NO ： 26、 和 CDRH3 区 SEQ ID NO ： 27， 且轻链可变域包含 CDRL1 区 SEQ ID NO ： 28、 CDRL2 区 SEQ ID NO ： 29、 和 CDRL3 区 SEQ ID NO ： 30。
优选地， 所述抗体的特征在于所述抗体是人 IgG1 亚类的。本发明进一步包括包含 所述抗体的药物组合物。 本发明进一步包括依照本发明的所述抗体用于制备供治疗癌症用 的药物的用途。本发明进一步包括一种治疗患有癌症的患者的方法， 其通过对需要此类治 疗的所述患者施用所述抗体来进行。
本发明提供了编码依照本发明的抗体的核酸。 本发明进一步提供了含有依照本发 明的核酸且能够在原核或真核宿主细胞中表达所述核酸的表达载体和含有此类载体的用 于重组生成依照本发明的抗体的宿主细胞。
本发明进一步包括包含依照本发明的载体的原核或真核宿主细胞。
本发明进一步包括一种用于生成依照本发明的重组抗体的方法， 其特征在于在原 核或真核宿主细胞中表达依照本发明的核酸， 并自所述细胞或细胞培养物上清液回收所述 抗体。本发明进一步包括通过此类重组方法获得的抗体。
现在已经令人惊讶地发现了， 与结合 CDCP1 的其它表位的 CDCP1 抗体， 如例如 CUB1( 保藏号 DSM ACC2569) 相比， 以与 CUB4( 保藏号 DSM ACC2551) 结合相同表位为特征的
特异性结合 CDCP1 的抗体特别可用于治疗癌症。
发明详述
CUB4 抗 体 指 来 自 DE 10242146(EP 1396501， US 7,541,030) 的 具 有 保 藏 号 DSM ACC2551 的保藏抗体， 其具有重链可变域 (VH)SEQ ID NO ： 7 和轻链可变域 (VL)SEQ ID NO ： 8。所述 CUB4 抗体特异性结合人 CDCP1。( 编号为 DSM ACC2551(DSMZ) 的保藏由 Eberhard-Karls-University Tübingen， Tübingen， Geissweg 3， 72076Tübingen 做出 )。
本发明包括用于治疗癌症的特异性结合人 CDCP1 的抗体， 其特征在于 ：
与 CUB4( 保藏号 DSMACC2551) 结合相同表位。
本发明进一步包括依照本发明的抗体， 其特征在于 ：
重链可变域是 SEQ ID NO ： 7， 且轻链可变域是 SEQ ID NO ： 8， 或其人源化型式。
本发明进一步包括依照本发明的抗体， 其特征在于 ：
重链可变域是 SEQ ID NO ： 15， 且轻链可变域是 SEQ ID NO ： 16， 或或其人源化型式。
本发明进一步包括依照本发明的抗体， 其特征在于 ：
重链可变域是 SEQ ID NO ： 23， 且轻链可变域是 SEQ ID NO ： 24， 或或其人源化型式。
本发明进一步包括依照本发明的抗体， 其特征在于 ：
重链可变域是 SEQ ID NO ： 31， 且轻链可变域是 SEQ ID NO ： 32， 或或其人源化型式。
本发明进一步包括依照本发明的抗体， 其特征在于 ：
重链可变域包含 CDRH1 区 SEQ ID NO ： 9、 CDRH2 区 SEQ ID NO ： 10、 和 CDRH3 区 SEQ ID NO ： 11， 且轻链可变域包含 CDRL1 区 SEQ ID NO ： 12、 CDRL2 区 SEQ ID NO ： 13、 和 CDRL3 区 SEQ ID NO ： 14， 或
本发明进一步包括依照本发明的抗体， 其特征在于 ：
重链可变域包含 CDRH1 区 SEQ ID NO ： 17、 CDRH2 区 SEQ ID NO ： 18、 和 CDRH3 区 SEQ ID NO ： 19， 且轻链可变域包含 CDRL1 区 SEQ ID NO ： 20、 CDRL2 区 SEQ ID NO ： 21、 和 CDRL3 区 SEQ ID NO ： 22， 或
本发明进一步包括依照本发明的抗体， 其特征在于 ：
重链可变域包含 CDRH1 区 SEQ ID NO ： 25、 CDRH2 区 SEQ ID NO ： 26、 和 CDRH3 区 SEQ ID NO ： 27， 且轻链可变域包含 CDRL1 区 SEQ ID NO ： 28、 CDRL2 区 SEQ ID NO ： 29、 和 CDRL3 区 SEQ ID NO ： 30。 术语 “抗体” 涵盖各种形式的抗体结构， 包括但不限于完整的抗体和抗体片段。优 选地， 依照本发明的抗体是人源化抗体、 嵌合抗体、 或进一步遗传工程化改造的抗体， 只要 依照本发明的特征性特性得到保留。 “抗体片段” 包含全长抗体的一部分， 优选地其可变域， 或至少其抗原结合位点。 抗体片段的例子包括双抗体、 单链抗体分子、 和自抗体片段形成的 多特异性抗体。 scFv 抗体例如记载于 Huston， J.S.， Methods in Enzymol.203(1991)46-88。 另外， 抗体片段包含具有结合 CDCP1 的 VH 域或 VL 域的特征 ( 即能够与 VL 域或 VH 域一起 装配成功能性抗原结合位点， 并且由此提供依照本发明的抗体的特性 ) 的单链多肽。如本 文中所使用的， 术语 “单克隆抗体” 或 “单克隆抗体组合物” 指单一氨基酸组成的抗体分子 的制备物。术语 “人源化抗体” 或 “抗体的人源化型式” 指其中的框架和 / 或 “互补决定 区” (CDR) 已经进行过修饰以包含与亲本免疫球蛋白的 CDR 相比不同物种的免疫球蛋白的
CDR( 例如 CDR3) 的抗体。在一个优选的实施方案中， 将小鼠 CDR( 例如 CDR3) 嫁接入人抗体 的框架区中以制备 “人源化抗体” ( 参见例如 Riechmann， L. 等， Nature332(1988)323-327 ； 及 Neuberger， M.S. 等， Nature 314(1985)268-270)。
如本文中所使用的， 术语 “单克隆抗体” 或 “单克隆抗体组合物” 指单一氨基酸组 成的抗体分子的制备物。
术语 “嵌合抗体” 指通常通过重组 DNA 技术制备的包含来自小鼠的可变区， 即结合 区和自不同来源或物种衍生的恒定区的至少一部分的单克隆抗体。 包含小鼠可变区和人恒 定区的嵌合抗体是特别优选的。此类大鼠 / 人嵌合抗体是包含编码大鼠免疫球蛋白可变区 的 DNA 区段和编码人免疫球蛋白恒定区的 DNA 区段的所表达免疫球蛋白基因的产物。本发 明所涵盖的 “嵌合抗体” 的其它形式是那些其中类别或亚类已经自初始抗体的类别或亚类 修饰或改变的。此类 “嵌合” 抗体又称为 “类别转换抗体” 。用于生成嵌合抗体的方法牵涉本 领域现在公知的常规重组 DNA 和基因转染技术 ( 参见例如 Morrison， S.L. 等， Proc.Natl. Acad Sci.USA 81(1984)6851-6855 ； US 5,202,238 和 US 5,204,244)。
人 CDCP1(( 含有 CUB 域的蛋白 1、 B345、 CD318、 SIMA135、 TRASK ； SEQ ID NO ： 1和 具有突变 R525Q( 即 SEQ ID NO ： 1 的氨基酸位置 525 处用谷氨酰胺 (Q) 替换精氨酸 (R)) 和 / 或突变 G709D( 即 SEQ ID NO ： 1 的氨基酸位置 709 处用天冬氨酸 (D) 替换甘氨酸 (G)) 的 变体 ) 是一种含有三个胞外 CUB 域的跨膜蛋白。发现此蛋白质在结肠和肺癌中过表达。其 表达水平与癌瘤细胞的转移能力相关联。已经显示了它在癌细胞系中是酪氨酸磷酸化的 (WO2002/004508 ； Scherl-Mostageer， M. 等， Oncogene 20(2001)4402-8 ； Hooper， J.D. 等， Oncogene 22(2003)1783-94 ； Perry， S.E. 等， FEBS Lett.581(2007)1137-42 ； Brown， T.A.， J.Biol.Chem.279(2004)14772-14783 ； Ota， T. 等， Nat.Genet.36(2004)40-45)。已经报告 了编码独特同等型的可变剪接转录物变体。
除非另有规定， 术语 “Kabat 编号方式” 或 “依照 Kabat 的编号方式” 或 “EU 索引” 定义为使用如在 Kabat 等 (Sequences of Proteins of Immunological Interest， 第 5 版， Public Health Service， National Institutes of Health， Bethesda， MD(1991)) 中的 EU 索引为例如 IgG 抗体中的残基编号。
如本文中所使用的， “特异性结合人 CDCP1” 指特异性结合人 CDCP1 抗原的抗体。 -8 结合亲和力是 1.0x10 mol/l 或更低的 KD 值的， 优选地 1.0x10-9mol/l 或更低的 KD 值的。 用标准的结合测定法， 诸如表面等离振子共振技术 来测定结合亲和力。如此， 如本文中所使用的， “特异性结合人 CDCP1 的抗体”指以 KD1.0x10-8mol/l 或更低 ( 例如 KD1.0x10-8mol/l 至 1.0x10-13mol/l， 优选地 KD1.0x10-9mol/l 至 1.0x10-12mol/l) 的结合亲 和力结合人 CDCP1 抗原的抗体。
本发明进一步包括特异性结合人 CDCP1 的抗体， 其特征在于 ：
重链可变域是 SEQ ID NO ： 15， 且轻链可变域是 SEQ ID NO ： 16， 或其人源化型式。
本发明进一步包括特异性结合人 CDCP1 的抗体， 其特征在于 ：
重链可变域是 SEQ ID NO ： 23， 且轻链可变域是 SEQ ID NO ： 24， 或其人源化型式。
本发明进一步包括特异性结合人 CDCP1 的抗体， 其特征在于 ：
重链可变域是 SEQ ID NO ： 31， 且轻链可变域是 SEQ ID NO ： 32， 或其人源化型式。
本发明进一步包括特异性结合人 CDCP1 的抗体， 其特征在于 ：重链可变域包含 CDRH1 区 SEQ ID NO ： 9、 CDRH2 区 SEQ ID NO ： 10、 和 CDRH3 区 SEQ ID NO ： 11， 且轻链可变域包含 CDRL1 区 SEQ ID NO ： 12、 CDRL2 区 SEQ ID NO ： 13、 和 CDRL3 区 SEQ ID NO ： 14。
本发明进一步包括特异性结合人 CDCP1 的抗体， 其特征在于 ：
重链可变域包含 CDRH1 区 SEQ ID NO ： 17、 CDRH2 区 SEQ ID NO ： 18、 和 CDRH3 区 SEQ ID NO ： 19， 且轻链可变域包含 CDRL1 区 SEQ ID NO ： 20、 CDRL2 区 SEQ ID NO ： 21、 和 CDRL3 区 SEQ ID NO ： 22。
本发明进一步包括特异性结合人 CDCP1 的抗体， 其特征在于 ：
重链可变域包含 CDRH1 区 SEQ ID NO ： 25、 CDRH2 区 SEQ ID NO ： 26、 和 CDRH3 区 SEQ ID NO ： 27， 且轻链可变域包含 CDRL1 区 SEQ ID NO ： 28、 CDRL2 区 SEQ ID NO ： 29、 和 CDRL3 区 SEQ ID NO ： 30。
术语 “表位” 意指人 CDCP1 中能够特异性结合抗体的蛋白质决定子。表位通常由 分子诸如氨基酸或糖侧链的化学活性表面聚集构成， 并且通常表位具有特定的三维结构特 征， 及特定的电荷特征。构象性和非构象性表位的区别之处在于在存在变性溶剂的情况中 丧失对前一种， 而不是后一种的结合。 如本文中所使用的， 术语 “与 CUB4( 保藏号 DSMACC2551) 结合相同表位” 指结合 CDCP1 上抗体 CUB4( 保藏号 DSM ACC2551) 结合的相同表位的本发明的抗 CDCP1 抗体。可以 使用本领域中已知的技术来测定本发明的抗 CDCP1 抗体的表位结合特性。在体外竞争结合 抑制测定法中通过表面等离振子共振 (SPR) 于 25℃测定抗体 CUB4( 保藏号 DSM ACC2551) 抑制测试抗体对 CDCP1 结合的能力， 从而测量 CDCP1 抗体 ( 参见图 2)。与 CUB4 结合相同 表位的抗体的结合受到抑制， 并且在添加测试抗体后没有检出结合信号。( 例如， 测试抗体 的注射时间 ( ＝ 0 秒 ) 后 100 秒， 结合信号不比注射时的信号高 ； 以 RU( 相对单位 ) 测量信 号 )( 例如 CDCP1-004、 CDCP1-012、 CDCP1-015， 参见图 3a)。与 CUB4 结合不同表位的抗体的 结合不受抑制， 并且在添加测试抗体后检出结合信号 ( 例如 CUB1 和 CUB3， 参见图 3b)( 例 如， 注射时间 ( ＝ 0 秒 ) 后 100 秒， 结合信号比注射时的信号高 ； 以 RU( 相对单位 ) 测量信 号 )。这可以通过 BIAcore 测定法 (Pharmacia Biosensor AB， Uppsala， Sweden) 来调查， 如记载于例如实施例 2 的。
如本文中所使用的， “可变域” ( 轻链可变域 (VL)、 重链可变域 (VH)) 意为直接牵涉 抗体结合抗原的轻链和重链域对之每种。轻链和重链可变域具有相同的一般结构， 并且每 个域包含通过三个 “高变区” ( 或互补决定区， CDR) 连接的其序列广泛保守的四个框架 (FR) 区。框架区采用 β- 片层构象， 而 CDR 可以形成连接 β- 片层结构的环。每条链中的 CDR 通过框架区保持其三维结构， 并且与来自另一条链的 CDR 一起形成抗原结合位点。抗体的 重链和轻链 CDR3 区在依照本发明的抗体的结合特异性 / 亲和力中发挥特别重要的作用， 并 且因此提供本发明的别的目的。
在本文中使用时， 术语 “抗体的抗原结合部分” 指抗体中负责抗原结合的氨基酸 残基。抗体的抗原结合部分包含来自 “互补决定区” 或 “CDR” 的氨基酸残基。术语本发明 的抗体的 “抗原结合部分” 可以含有 6 个互补决定区 (CDR)， 其以不同程度促成结合位点 对抗原的亲和力。存在着三个重链可变域 CDR(CDRH1、 CDRH2 和 CDRH3) 和三个轻链可变域 CDR(CDRL1、 CDRL2 和 CDRL3)。通过与汇编的氨基酸序列数据库比较来确定 CDR 和框架区
(FR) 的范围， 在所述数据库中已经依照序列间的可变性限定那些区域。
“框架” 或 “FR” 区是与如本文中所限定的高变区残基不同的那些可变域区。因 此， 抗体的轻链和重链可变域包含自 N 至 C 端的域 FRi、 CDR1、 FR2、 CDR2、 FR3、 CDR3、 和 FR4。 CDR 和 FR 区依照 Kabat 等， Sequences of Proteins of Immunological Interest， 第 5 版， Public Health Service， National Institutes of Health， Bethesda， MD(1991) 的标准定 义和 / 或那些来自 “高变环” 的残基来确定。
如本文中所使用的， 术语 “核酸” 或 “核酸分子” 意图包括 DNA 分子和 RNA 分子。核 酸分子可以是单链或双链， 但是优选的是双链 DNA。
如本申请内所使用的， 术语 “氨基酸” 意指天然存在的羧基 α- 氨基酸的组， 包括 丙氨酸 ( 三字母代码 ： ala， 单字母代码 ： A)、 精氨酸 (arg， R)、 天冬酰胺 (asn， N)、 天冬氨酸 (asp， D)、 半胱氨酸 (cys， C)、 谷氨酰胺 (gln， Q)、 谷氨酸 (glu， E)、 甘氨酸 (gly， G)、 组氨酸 (his， H)、 异亮氨酸 (ile， I)、 亮氨酸 (leu， L)、 赖氨酸 (lys， K)、 甲硫氨酸 (met， M)、 苯丙氨 酸 (phe， F)、 脯氨酸 (pro， P)、 丝氨酸 (ser， S)、 苏氨酸 (thr， T)、 色氨酸 (trp， W)、 酪氨酸 (tyr， Y)、 和缬氨酸 (val， V)。
依照本发明的抗体的特征在于恒定区是人起源的， 且优选的是人 IgG1 亚类的。 恒定区包括抗体的重链和轻链恒定区。重链恒定区包含以 N 端至 C 端方向的抗体重链恒 定域 1(CH1)、 抗体铰链区 (HR)、 抗体重链恒定域 2(CH2)、 和抗体重链恒定域 3(CH3) ； 和任 选地在 IgE 亚类抗体的情况中抗体重链恒定域 4(CH4)。轻链恒定区包含抗体轻链恒定域 (CL)。抗体轻链恒定域 (CL) 可以是 κ( 卡帕 ) 或 λ( 拉姆达 )。此类恒定链是现有技术公 知的， 并且例如由 Kabat， E.， A.， 描述 ( 参见例如 Johnson， G. 和 Wu， T.， T.， Nucleic Acids Res.28(2000)214-218)。 例如， 有用的 IgG1 亚类人重链恒定区包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 3。例如， 有用的人轻链恒定区包含 κ 轻链恒定区的氨基酸序列 SEQ ID NO ： 4； 另一个有用 的人轻链恒定区包含 λ 轻链恒定区的氨基酸序列 SEQ ID NO ： 5。
抗体的 “Fc 部分” 不直接牵涉抗体对抗原的结合， 但是展现出各种效应器功能。 “抗 体的 Fc 部分” 是熟练技术人员公知的术语， 并且基于木瓜蛋白酶对抗体的切割限定。根据 其重链恒定区的氨基酸序列， 抗体或免疫球蛋白分成类 ： IgA、 IgD、 IgE、 IgG 和 IgM， 并且这 些中的数种可以进一步分成亚类 ( 同种型 )， 例如 IgG1、 IgG2、 IgG3、 和 IgG4、 IgA1、 和 IgA2。 依照重链恒定区， 免疫球蛋白的不同类分别称作 α、 δ、 ε、 γ、 和 μ。
抗体的 Fc 部分直接牵涉 ADCC( 抗体依赖性细胞介导的细胞毒性 ) 和基于补体 激活、 C1q 结合和 Fc 受体结合的 CDC( 补体依赖性细胞毒性 )。补体激活 (CDC) 是通过 补体因子 C1q 结合大多数 IgG 抗体亚类的 Fc 部分启动的。虽然抗体对补体系统的影响 依赖于某些条件， 但是对 C1q 的结合是由 Fc 部分中的限定结合位点引起的。此类结合 位 点 是 现 有 技 术 中 已 知 的， 并 且 例 如 由 Boackle， R.J. 等， Nature 282(1979)742-743 ； Lukas ， T.J. 等， J.Immunol.127(1981)2555-2560 ； Brunhouse ， R. 和 Cebra ， J.J. ， Mol.Immunol.16(1979)907-917 ； Burton ， D.R. 等，Nature 288(1980)338-344 ； Thommesen ，J.E. 等，Mol.Immunol.37(2000)995-1004 ； Idusogie ，E.E. 等， J.Immunol.164(2000)4178-4184 ； Hezareh， M. 等， J.Virology 75(2001)12161-12168 ； Morgan， A. 等， Immunology 86(1995)319-324 ； EP 0307434 描述。此类结合位点是例如 L234、 L235、 D270、 N297、 E318、 K320、 K322、 P331 和 P329( 依照 Kabat， E.A. 的 EU 索引的编号方式， 参见下文 )。亚类 IgG1、 IgG2 和 IgG3 的抗体通常显示补体激活及 C1q 和 C3 结合， 而 IgG4 不激活补体系统， 而且不结合 C1q 和 C3。
依照本发明的抗体包含自人起源衍生的 Fc 部分， 且优选地人恒定区的所有其它 部分。如本文中所使用的， 术语 “自人起源衍生的 Fc 部分” 意指作为 IgG1、 IgG2、 IgG3 或 IgG4 亚类的人抗体的 Fc 部分， 优选地来自人 IgG1 亚类的 Fc 部分、 来自人 IgG1 亚类的突 变 Fc 部分 ( 优选地具有 L234A+L235A 方面的突变 )、 来自人 IgG4 亚类的 Fc 部分或来自人 IgG4 亚类的突变 Fc 部分 ( 优选地具有 S228P 方面的突变 ) 的 Fc 部分。最优选的是人 IgG1 亚类 ( 参见例如 SEQ IDNO ： 3)、 具有突变 L234A 和 L235A 的人 IgG1 亚类、 人 IgG4 亚类 ( 参 见例如 SEQID NO ： 6)、 或具有突变 S228P 的人 IgG4 亚类的人重链恒定区。
术语 “抗体依赖性细胞的细胞毒性 (ADCC)” 指在存在效应细胞的情况中通过依照 本发明的抗体来裂解人靶细胞。优选地， 通过在存在效应细胞， 诸如新鲜分离的 PBMC 或来 自血沉棕黄层的纯化的效应细胞， 如单核细胞或天然杀伤 (NK) 细胞或永久生长 NK 细胞系 的情况中用依照本发明的抗体来处理 CDCP1 表达细胞的制备物来测量 ADCC。
术语 “补体依赖性细胞毒性 (CDC)” 意指通过补体因子 C1q 与大多数 IgG 抗体亚类 的 Fc 部分的结合启动的过程。 通过在所谓的结合位点处限定的蛋白质 - 蛋白质相互作用引 起 C1q 与抗体的结合。此类 Fc 部分结合位点是现有技术中已知的 ( 参见上文 )。此类 Fc 部分结合位点例如以氨基酸 L234、 L235、 D270、 N297、 E318、 K320、 K322、 P331、 和 P329( 依照 Kabat 的 EU 索引编号 ) 为特征。亚类 IgG1、 IgG2、 和 IgG3 的抗体通常显示包括 C1q 和 C3 结合的补体激活， 而 IgG4 不激活补体系统， 而且不结合 C1q 和 / 或 C3。
单克隆抗体的细胞介导的效应器功能可以通过工程化改造其寡糖组分来增强， 如记载于 Umana， P. 等， Nature Biotechnol.17(1999)176-180， 及 US6,602,684 的。IgG1 型抗体 ( 最常使用的治疗性抗体 ) 是在每个 CH2 域中具有 Asn297 处的保守的 N 连接 的糖基化位点的糖蛋白。两个附着于 Asn297 的复合双触角寡糖掩埋于 CH2 域间， 这形 成与多肽主链的广泛接触， 并且其存在对于抗体介导效应器功能诸如抗体依赖性细胞 的 细 胞 毒 性 (ADCC) 是 至 关 重 要 的 (Lifely， M.R. 等， Glycobiology 5(1995)813-822 ； Jefferis， R. 等， Immunol.Rev.163(1998)59-76 ； Wright， A. 和 Morrison， S.L.， Trends Biotechnol.15(1997)26-32)。Umana， P. 等 Nature Biotechnol.17(1999)176-180 和 WO 99/54342 显 示 了 β(1， 4)-N- 乙 酰 葡 糖 胺 转 移 酶 III(“GnTIII” )( 即 一 种 催 化 两 分型寡糖形成的糖基转移酶 ) 在中国仓鼠卵巢 (CHO) 细胞中的过表达显著提高抗体的 体外 ADCC 活性。Asn297 碳水化合物的组成改变或其消除还影响与 FcγR 和 C1q 的结 合 (Umana， P. 等， Nature Biotechnol.17(1999)176-180 ； Davies， J. 等， Biotechnol. Bioeng.74(2001)288-294 ； Mimura ，Y. 等，J.Biol.Chem.276(2001)45539-45547 ； Radaev ， S. 等， J.Biol.Chem.276(2001)16478-16483 ； Shields ， R.L. 等， J.Biol. Chem.276(2001)6591-6604 ； Shields， R.L. 等， J.Biol.Chem.277(2002)26733-26740 ； Simmons， L.C. 等， J.Immunol.Methods 263(2002)133-147)。
例如在 WO 2005/044859， WO 2004/065540， WO2007/031875， Umana， P. 等， Nature Biotechnol.17(1999)176-180， WO 99/154342， WO 2005/018572， WO 2006/116260， WO 2006/114700， WO 2004/065540， WO 2005/011735， WO2005/027966， WO 1997/028267， US 2006/0134709， US 2005/0054048， US2005/0152894， WO 2003/035835 和 WO 2000/061739中， 或 者 例 如 在 Niwa， R. 等， J.Immunol.Methods 306(2005)151-160 ； Shinkawa， T. 等， J.Biol.Chem.278(2003)3466-3473 ； WO 03/055993 和 US 2005/0249722 中报告了增强单克 隆抗体的细胞介导的效应器功能的方法。
因此， 在本发明的一个实施方案中， 依照本发明的抗体在 Asn297 处用糖链糖基化 ( 若它包含 IgG1 或 IgG3 亚类的 Fc 部分 )， 由此所述糖链内的岩藻糖量是 65％或更低 ( 依 照 Kabat 的编号方式 )。在另一个实施方案中， 所述糖链内的岩藻糖量是在 5％和 65％之 间， 优选地在 20％和 40％之间。依照本发明的 “Asn297” 意指位于 Fc 区中的约第 297 位的 氨基酸天冬酰胺。基于抗体的次要序列变异， Asn297 也可以位于第 297 位上游或下游的一 些氨基酸 ( 通常不超过 ±3 个氨基酸 )， 即第 294 位和第 300 位之间。在一个实施方案中， 依照本发明的糖基化抗体， IgG 亚类是人 IgG1 亚类的、 具有突变 L234A 和 L235A 的人 IgG1 亚类的或 IgG3 亚类的。在又一个实施方案中， N- 羟乙酰神经氨酸 (NGNA) 的量是 1％或更 小和 / 或 N 端 α-1， 3- 半乳糖的量是所述糖链内的 1％或更小。优选地， 糖链显示了附着于 CHO 细胞中重组表达的抗体的 Asn297 的 N 连接聚糖的特征。
术语 “糖链显示了附着于 CHO 细胞中重组表达的抗体的 Asn297 的 N 连接聚糖的特 征” 意指依照本发明的抗体的 Asn297 处的糖链与未修饰的 CHO 细胞中表达的相同抗体的糖 链， 例如如那些在 WO 2006/103100 中报告的糖链具有相同的结构和糖残基序列 ( 除了岩藻 糖残基外 )。 如本申请内所使用的， 术语 “NGNA” 意指糖残基 N- 羟乙酰神经氨酸。
在 Asn297 处发生人 IgG1 或 IgG3 的糖基化， 作为以多至两个 Gal 残基为末端 的核心岩藻糖化双触角复合寡糖糖基化。Kabat， E.A. 等， Sequences of Proteins of Immunological Interest， 第 5 版， Public Health Service， National Institutes of Health， Bethesda， MD.(1991) 及 Brueggemann， M. 等， J.Exp.Med.166(1987)1351-1361 ； Love， T.W. 等， Methods Enzymol.178(1989)515-527 详细报告了 IgG1 或 IgG3 亚类的人重 链恒定区。根据末端 Gal 残基的量， 这些结构称为 G0、 G1(α-1， 6- 或 α-1， 3-)、 或 G2 聚糖 残基 (Raju， T.S.， Bioprocess Int.1(2003)44-53)。抗体 Fc 部分的 CHO 型糖基化例如由 Routier， F.H.， Glycoconjugate J.14(1997)201-207 描述。在非糖修饰的 CHO 宿主细胞中 重组表达的抗体在 Asn297 处通常以至少 85％的量进行岩藻糖化。抗体的经修饰的寡糖可 以是杂合的或复合的。优选地， 两分型、 还原的 / 非岩藻糖化的寡糖是杂合的。在另一个实 施方案中， 两分型、 还原的 / 非岩藻糖化的寡糖是复合的。
依照本发明， “岩藻糖的量”意指通过 MALDI-TOF 质谱术测量的， 并以平均值计 算的， 相对于附着于 Asn297 的所有糖结构 ( 例如复合的、 杂合的和高甘露糖结构 ) 的总 和， Asn297 处糖链内所述糖的量 ( 参见例如 WO2008/077546)。岩藻糖的相对量是通过 MALDI-TOF， 含有岩藻糖的结构相对于经 N- 糖苷酶 F 处理的样品中鉴定的所有糖结构 ( 例 如分别为复合的、 杂合的及寡和高甘露糖结构 ) 的百分比。
优选地， 通过重组手段来生成依照本发明的抗体。此类方法是现有技术中普遍已 知的， 并且包括在原核和真核细胞中的蛋白质表达， 随后分离抗体多肽， 并且通常纯化至药 学可接受纯度。对于蛋白质表达， 通过标准的方法将编码轻链和重链或其片段的核酸插入 表达载体中。在合适的原核或真核宿主细胞， 如 CHO 细胞、 NS0 细胞、 SP2/0 细胞、 HEK293 细 胞、 COS 细胞、 酵母、 或大肠杆菌细胞中实施表达， 并且自细胞 ( 上清液或裂解后的细胞 ) 回
收抗体。 抗体的重组生成是现有技术中公知的， 并且例如记载于综述文章 Makrides， S.C. ，Protein Expr.Purif.17(1999)183-202 ； Geisse ，S. 等，Protein Expr. Purif.8(1996)271-282 ； Kaufman， R.J.， Mol.Biotechnol.16(2000)151-160 ； Werner， R.G.， Drug Res.48(1998)870-880。
抗体可以存在于整个细胞中， 在细胞溶胞物中， 或者为部分纯化的或基本上纯的 形式。通过标准的技术， 包括碱 /SDS 处理、 CsCl 分带、 柱层析、 琼脂糖凝胶电泳、 和本领域 中公知的其它技术 ( 参见 Ausubel， F. 等编 Current Protocols in Molecular Biology， Greene Publishing and Wiley Interscience， New York(1987)) 来实施纯化以消除其它 细胞组分或其它污染物， 例如其它细胞核酸或蛋白质。
例如， Barnes， L.M. 等， Cytotechnology 32(2000)109-123 ； 及 Barnes， L.M. 等， Biotech.Bioeng.73(2001)261-270 描 述 了 NS0 细 胞 中 的 表 达。 例 如， Durocher， Y. 等， Nucl.Acids.Res.30(2002)E9 描 述 了 瞬 时 表 达。Orlandi， R. 等， Proc.Natl.Acad.Sci. USA 86(1989)3833-3837 ； Carter， P. 等， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(1992)4285-4289 ； 及 Norderhaug， L. 等， J.Immunol.Methods 204(1997)77-87 描 述 了 可 变 域 的 克 隆。 Schlaeger， E.-J. 和 Christensen， K.， 于 Cytotechnology 30(1999)71-83 及 Schlaeger，
E.-J.， 于 J.Immunol.Methods 194(1996)191-199 描述了一种优选的瞬时表达系统 (HEK 293)。
适合于原核生物的控制序列例如包括启动子， 任选地操纵基因序列， 和核糖体结 合位点。已知真核细胞利用启动子、 增强子和多腺苷酸化信号。
在将核酸放置在与另一种核酸序列的功能性关系中时， 它是 “可操作连接的” 。例 如， 若前序列或分泌前导的 DNA 以参与多肽分泌的前蛋白表达， 则它与多肽的 DNA 可操作连 接； 若启动子或增强子影响序列的转录， 则它与编码序列可操作连接 ； 或者若核糖体结合 位点定位为使得便于翻译， 则它与编码序列可操作连接。一般而言， “可操作连接的” 意指所 连接的 DNA 序列是连续的， 并且在分泌前导的情况中， 是连续的且在读码框中。然而， 增强 子不必是连续的。通过在方便的限制性位点处的连接来实现连接。若不存在此类位点， 则 依照常规的实践使用合成的寡核苷酸衔接头或接头。
通过常规的免疫球蛋白纯化规程， 诸如例如蛋白 A-Sepharose、 羟磷灰石层析、 凝 胶电泳、 透析、 或亲和层析来自培养液适当地分离单克隆抗体。 容易使用常规规程将编码单 克隆抗体的 DNA 和 RNA 分离并测序。杂交瘤细胞可以充当此类 DNA 和 RNA 的来源。一旦分 离， 可以将 DNA 插入表达载体中， 然后将所述表达载体转染入在其它情况中不生成免疫球 蛋白蛋白质的宿主细胞诸如 HEK 293 细胞、 CHO 细胞、 或骨髓瘤细胞中， 以获得重组单克隆 抗体在宿主细胞中的合成。
如本文中所使用的， 表述 “细胞” 、 “细胞系” 、 和 “细胞培养物” 可互换使用， 并且所 有此类名称包括后代。如此， 词语 “转化体” 和 “经转化的细胞” 包括原代主题细胞和自其衍 生的培养物， 而不管传递的次数。还应当理解， 由于有意或无意的突变， 所有后代在 DNA 内 容上可能不是正好相同的。 包括具有如在初始转化细胞中筛选的相同功能或生物学活性的 变体后代。在意图独特名称的情况中， 它从上下文看会是清楚的。
如本文中所使用的， 术语 “转化” 指将载体 / 核酸转移入宿主细胞中的过程。若使用没有难以应付的细胞壁屏障的细胞作为宿主细胞， 则例如通过磷酸钙沉淀法来实施转 染， 如 Graham， F.L. 和 van der Eb， A.J.， Virology 52(1973)456-467 所描述的。然而， 也 可以使用其它用于将 DNA 导入细胞中的方法， 诸如通过核注射或者通过原生质体融合来进 行。若使用原核细胞或含有坚固细胞壁构造的细胞， 则例如一种转染方法是使用氯化钙进 行的钙处理， 如 Cohen， S.N. 等， PNAS.69(1972)2110-2114 所描述的。
如本文中所使用的， “表达”指将核酸转录成 mRNA 的过程和 / 或随后将转录的 mRNA( 又称为转录物 ) 翻译成肽、 多肽、 或蛋白质的过程。转录物和编码的多肽统称为基因 产物。若多核苷酸是自基因组 DNA 衍生的， 则真核细胞中的表达可以包括 mRNA 的剪接。
“载体” 指将插入的核酸分子转移入宿主细胞中和 / 或在宿主细胞间转移的核酸分 子， 特别是自我复制的。该术语包括主要在将 DNA 或 RNA 插入细胞 ( 例如， 染色体整合 ) 方 面发挥功能的载体、 主要在 DNA 或 RNA 复制方面发挥功能的复制载体、 和在 DNA 或 RNA 的转 录和 / 或翻译方面发挥功能的表达载体。还包括提供超过一种功能的载体， 如所描述的。
“表达载体” 指在导入合适的宿主细胞中时可以被转录和翻译成多肽的多核苷酸。 “表达系统” 通常指包含能发挥功能以产生期望的表达产物的表达载体的合适的宿主细胞。
本发明的一个方面是包含依照本发明的抗体的药物组合物。 本发明的另一方面是 依照本发明的抗体用于制造药物组合物的用途。 本发明的又一方面是用于制造包含依照本 发明的抗体的药物组合物的方法。在另一方面， 本发明提供了含有与药用载体一起配制的 依照本发明的抗原结合蛋白的组合物， 例如药物组合物。 已 经 证 明 了 与 其 它 抗 CDCP1 抗 体， 如 例 如 CUB1 抗 体 ( 来 自 DE 10242146(EP 1396501， US 7,541,030) 的具有保藏号 DSMACC2569 的保藏抗体 ) 相比， 所述以与 CUB4( 保 藏号 DSMACC2551) 结合相同表位为特征的特异性结合人 CDCP1 的抗体特别可用于治疗癌 症。
因此， 本发明的一个方面是用于治疗癌症的所述药物组合物。
本发明的另一方面是依照本发明的抗体用于制造供治疗癌症用的药物的用途。
本发明的另一方面是治疗患有癌症的患者的方法， 其通过对需要此类治疗的所述 患者施用依照本发明的抗体来进行。
如本文中所使用的， “药用载体” 包括生理学相容的任何和所有溶剂、 分散介质、 涂 层材料、 抗细菌剂和抗真菌剂、 等张剂和吸收延迟剂， 等等。优选地， 载体适合于静脉内、 肌 肉内、 皮下、 胃肠外、 脊柱或表皮施用 ( 例如通过注射或输注 )。
可以通过本领域中已知的多种方法来施用本发明的组合物。 如熟练技术人员会领 会的， 施用的路径和 / 或模式会随期望的结果而变化。为了通过某些施用路径来施用本发 明的化合物， 可能有必要用某种材料包被化合物， 或者与某种材料共施用化合物以阻止其 失活。例如， 可以将化合物在合适的载体， 例如脂质体或稀释剂中对受试者施用。药学可接 受稀释剂包括盐水和水性缓冲溶液。 药用载体包括无菌水溶液或分散体和供临场制备无菌 可注射溶液或分散体用的无菌粉剂。 对药学活性物质使用此类介质和药剂是本领域中已知 的。
如本文中所使用的， 短语 “胃肠外施用” 意指通常通过注射进行的与肠和表面施用 不同的施用模式， 并且包括但不限于静脉内、 肌肉内、 动脉内、 鞘内、 囊内、 眶内、 心内、 皮内、 腹膜内、 经气管、 皮下、 表皮下、 关节内、 囊下、 蛛网膜下、 脊柱内、 硬膜外和胸骨内注射和输
注。 如本文中所使用的， 术语 “癌症” 可以是例如肺癌、 非小细胞肺 (NSCL) 癌、 细支气 管肺泡细胞肺癌、 骨癌、 胰腺癌、 皮肤癌、 头或颈癌、 皮肤或眼内黑素瘤、 子宫癌、 卵巢癌、 直 肠癌、 肛区癌、 胃癌 (stomach cancer)、 胃癌 (gastric cancer)、 结肠癌、 乳腺癌、 子宫癌、 输卵管癌、 子宫内膜癌、 宫颈癌、 阴道癌、 外阴癌、 何杰金 (Hodgkin) 氏病、 食管癌、 小肠癌、 内分泌系统癌、 甲状腺癌、 甲状旁腺癌、 肾上腺癌、 软组织肉瘤、 尿道癌、 阴茎癌、 前列腺癌、 膀胱癌、 肾或输尿管癌、 肾细胞癌、 肾盂癌、 间皮瘤、 肝细胞癌、 胆癌 (biliary cancer)、 中 枢神经系统 (CNS) 新生物、 脊柱轴肿瘤、 脑干胶质瘤、 多形性成胶质细胞瘤 (glioblastoma multiforme)、 星形细胞瘤、 神经鞘瘤 (schwanoma)、 室鼓膜瘤 (ependymona)、 髓母细胞瘤、 脑脊膜瘤、 鳞状细胞癌、 垂体腺瘤、 淋巴瘤、 淋巴细胞性白血病， 包括任何上述癌症的顽固性 型式、 或一种或多种上述癌症的组合。优选地， 此类癌症是乳腺癌、 卵巢癌、 宫颈癌、 肺癌或 前列腺癌， 且更优选地肺癌。优选地， 此类癌症的进一步特征在于 CDCP1 表达或过表达。更 优选地， 此类癌症的进一步特征在于过表达。
这些组合物还可以含有佐剂诸如防腐剂、 湿润剂、 乳化剂和分散剂。可以通过灭 菌规程， 见上文， 及通过包括各种抗细菌剂和抗真菌剂， 例如对羟基苯甲酸酯、 三氯叔丁醇、 酚、 山梨酸等来确保阻止微生物的存在。还可能期望将等张剂， 诸如糖、 氯化钠等纳入组合 物中。另外， 可以通过包括延迟吸收的药剂诸如单硬脂酸铝和明胶来引起可注射药物形式 的吸收延迟。
不管选择的施用路径， 通过本领域技术人员已知的常规方法来将本发明的化合物 ( 其可以以合适的水合形式使用 ) 和 / 或本发明的药物组合物配制成药学可接受剂量形式。
可以改变活性成分在本发明的药物组合物中的实际剂量水平， 从而获得对于实现 特定患者的期望的治疗响应、 组成、 和施用模式有效的， 而对患者无毒的活性成分量。选定 的剂量水平会取决于多种药动学因素， 包括所采用的本发明的特定组合物的活性、 施用路 径、 施用时间、 所采用的特定化合物的排泄速率、 治疗的持续时间、 与所采用的特定组合物 组合使用的其它药物、 化合物和 / 或材料、 所治疗的患者的年龄、 性别、 重量、 状况、 一般健 康和先前的医学史等医学领域公知的因素。
组合物必须是无菌的， 而且是流体的， 其程度使得组合物通过注射器可投递。 在水 外， 载体优选地是等张缓冲盐水溶液。
可以例如通过使用涂层材料诸如卵磷脂、 在分散体的情况中通过维持所要求的粒 度、 及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。 在许多情况中， 优选在组合物中包含等张 剂 ( 例如糖、 多元醇诸如甘露醇或山梨醇、 和氯化钠 )。
提供以下实施例、 序列表和图以帮助理解本发明， 其实际范围在所附权利要求书 中列出。应当理解， 可以在不背离本发明的精神的前提下对所列规程做出修饰。
序列表的描述
SEQ ID NO ： 1 人 CDCP1
SEQ ID NO ： 2 包含胞外域 (ECD) 的人 CDCP1 片段
SEQ ID NO ： 3 来自人起源的 IgG1 重链恒定区
SEQ ID NO ： 4 来自人起源的 κ 轻链恒定区
SEQ ID NO ： 5 来自人起源的 λ 轻链恒定区
SEQ ID NO ： 6 来自人起源的 IgG4 重链恒定区 SEQ ID NO ： 7 重链可变域 VH， CUB4( 保藏号 DSMACC2551) SEQ ID NO ： 8 轻链可变域 VL， CUB4( 保藏号 DSMACC2551) SEQ ID NO ： 9 重链 CDRH1， 单抗 CDCP1-004 SEQ ID NO ： 10 重链 CDRH2， 单抗 CDCP1-004 SEQ ID NO ： 11 重链 CDRH3， 单抗 CDCP1-004 SEQ ID NO ： 12 轻链 CDRL1， 单抗 CDCP1-004 SEQ ID NO ： 13 轻链 CDRL2， 单抗 CDCP1-004 SEQ ID NO ： 14 轻链 CDRL3， 单抗 CDCP1-004 SEQ ID NO ： 15 重链可变域 VH， 单抗 CDCP1-004 SEQ ID NO ： 16 轻链可变域 VL， 单抗 CDCP1-004 SEQ ID NO ： 17 重链 CDRH1， 单抗 CDCP1-012 SEQ ID NO ： 18 重链 CDRH2， 单抗 CDCP1-012 SEQ ID NO ： 19 重链 CDRH3， 单抗 CDCP1-012 SEQ ID NO ： 20 轻链 CDRL1， 单抗 CDCP1-012 SEQ ID NO ： 21 轻链 CDRL2， 单抗 CDCP1-012 SEQ ID NO ： 22 轻链 CDRL3， 单抗 CDCP1-012 SEQ ID NO ： 23 重链可变域 VH， 单抗 CDCP1-012 SEQ ID NO ： 24 轻链可变域 VL， 单抗 CDCP1-012 SEQ ID NO ： 25 重链 CDRH1， 单抗 CDCP1-015 SEQ ID NO ： 26 重链 CDRH2， 单抗 CDCP1-015 SEQ ID NO ： 27 重链 CDRH3， 单抗 CDCP1-015 SEQ ID NO ： 28 轻链 CDRL1， 单抗 CDCP1-01510 SEQ ID NO ： 29 轻链 CDRL2， 单抗 CDCP1-015 SEQ ID NO ： 30 轻链 CDRL3， 单抗 CDCP1-015 SEQ ID NO ： 31 重链可变域 VH， 单抗 CDCP1-015 SEQ ID NO ： 32 轻链可变域 VL， 单抗 CDCP1-015 附图简述 图 1 抗 CDCP1 抗体 CUB4 和 CUB1 在人肺癌 H322M 异种移植物中的体内肿瘤生长抑 图 2 用固定化的 CUB4 抗体、 CDCP1 的胞外域 (ECD)、 和别的抗 CDCP1 测试抗体 ( 例 的示意性测定法形式。制。
如 CUB1 和 CUB3) 的表面等离振子共振 (SPR-) 技术
图 3 固定化的 CUB4 抗体、 CDCP1 的胞外域 (ECD) 和抗 CDCP1 抗体 CUB1 和 CUB3 的 Biacore 传感图 (x 轴＝时间 ； y 轴＝以相对单位 (RU) 计的响应 )
图 3a ： 显示了 CDCP1-004、 CDCP1-012 和 CDCP1-015 抗体结合 CDCP1 上与 CUB4 抗 体相同的表位。
图 3b ： 显示了 CUB1 和 CUB3 抗体结合 CDCP1 上与 CUB4 抗体不同的另一表位。
图 4 依照本发明的 CDCP1 抗体结合人 CDCP1 胞外域 (CDCP1-ECD) 和人 CDCP1-ECD 的亚域图 5 在 HCT 116 细胞中刺激 CDCP1 磷酸化 图 6 在 MDAMB-231 细胞中刺激 CDCP1 内在化和磷酸化实施例 实施例 1
抗 CDCP1 抗体 CUB4 的体内肿瘤生长抑制及与 CUB1 抗体比较
研究名称 ： CDCP1_PZ_H322M_002
实施本体内研究以比较特异性抗 CDCP1 抗体 CUB4 与结合另一表位的抗体， 如例如 CUB1 的功效。
H322M 非小细胞肺癌细胞最初自 NCI 保藏中心获得， 并在扩充后保藏于 Roche 细 胞库， Penzberg。将肿瘤细胞系常规地在补充有 10％胎牛血清和 2mML- 谷氨酰胺的 RPMI 1640 培养基中于 37℃在水饱和的气氛中于 5％ CO2 培养。使用传代 4 来进行细胞移植。
将人非小细胞肺癌细胞系 H322M 与 Matrigel 一起皮下接种 (5x106 个细胞 ) 入小 鼠的右体侧中。
动物处理在细胞移植后 17 天在随机化当天开始。 以 10mg/kg 的指定剂量 i.p.q7d 施用抗体， 直至研究终止第 62 天。还在同一天施用相应的媒介物。施用体积是 10ml/kg。
组：
处理组 1 ： 媒介物
处理组 2 ： 鼠 CUB4 10mg/kg i.p. ；
处理组 3 ： 鼠 CUB1 10mg/kg i.p. ；
TGI( 以％计的肿瘤生长抑制 )
下表显示了肿瘤生长抑制的数值， 其基于均值和中值分别对每组和时间点以 100- 平均值 (T_ 处理 [ 第 x 天 ]-T_ 处理 [ 基线 ])/ 平均值 (T_ 参照 [ 第 x 天 ]-T_ 参照 [ 基线 ])*100 计算。TGI 计算的参照选择为组 “媒介物” 。图 1 中也显示了结果。
表1： 肿瘤生长抑制 (TGI)
令人惊讶地， CUB4 抗体 ( 保藏号 DSM ACC2551) 比 CUB1 抗体 ( 来自 DE 10242146(EP 1396501， US 7,541,030) 的具有保藏号 DSM ACC2569 的保藏抗体 ) 显示明显更高的肿瘤生 长抑制。
类似地， 可以测定依照本发明的抗 CDCP1 抗体 CDCP1_004、 CDCP1_012 和 CDCP1_015 的体内肿瘤生长抑制。
实施例 2
表位结合测定法 (Biacore)
为了测定不同测试抗 CDCP1 抗体的表位区， 使用胺偶联化学将 CUB4( 保藏号 DSMACC2551) 在 CM5 生物传感器芯片表面上固定化。用 0.1M N- 羟基琥珀酰亚胺和 0.4M 1- 乙基 -3-(3- 二甲基氨基丙基 ) 碳二亚胺的 1 ∶ 1 混合物以 5μl/ 分钟的流速活化流动 池。将抗 CDCP1 抗体 CUB4( 保藏号 DSMACC2551) 在乙酸钠， pH 4.5-5.0 中以 10-30μg/ml 注射 12 分钟， 这导致约 15000 个 RU 的表面密度。用 1M 乙醇胺 /HCl pH 8.5 的注射封闭表 面。将人 CDCP1 的可溶性 ECD(SEQ.ID NO. ： 2)( 分析物 1) 和抗 CDCP1 抗体 ( 分析物 2) 在 PBST+0.8M NaCl 中稀释， 并以 30μl/ 分钟的流速注射。接触时间 ( 结合阶段 ) 对于浓度 为 250nM-500nM 的人 CDCP1ECD 是 150-200 秒， 而对于浓度为 100nM 的抗 CDCP1 抗体是 300 秒。然后， 将芯片表面用 PBST+0.8M NaCl 清洗 3 分钟 ( 解离阶段 )。精确地于 25℃ ( 标准 温度 ) 实施所有相互作用。将 10mM 甘氨酸， pH 2.0 的再生溶液注射 60-150 秒以在每个结 合周期后除去任何非共价结合的蛋白质。以每秒一个信号的检测速率检测信号。
为了测定抗 CDCP1 抗体是否与 CUB4 结合人 CDCP1 的相同或不同表位， 注射人 CDCP1 的 ECD， 并被固定化的抗体结合。 在结合后不久， 注射具有未知表位的抗体。 注射后没 有显示结合信号升高 ( 即， 例如测试抗体的注射时间 ( ＝ 0 秒 ) 后 100 秒， 结合信号没有注 射时的信号高 ； 信号以 RU( 相对单位 ) 测量 ) 的测试抗 CDCP1 抗体与 CUB4 结合相同表位。 显示结合信号升高的测试抗 CDCP1 抗体与 CUB4 结合不同表位 ( 例如， 注射时间 ( ＝ 0 秒 ) 后 100 秒， 结合信号比注射时的信号高 ； 信号以 RU( 相对单位 ) 测量 )。 图 3a 和 3b 中显示了三重测定的结果。发现抗体 CUB3、 CUB1( 参见图 3b) 与 CUB4 在不同表位处结合， 而抗 CDCP1 抗体 CDCP1-004、 CDCP1-012 和 CDCP1-015 鉴定为与 CUB4 结 合相同表位 ( 参见表 2 和图 3a， 均为三重实验 )。发现抗体 CUB3 和 CUB1 各自与 CUB4 结合 另一表位， 并且彼此不同 (CUB1 ≠ CUB3)。( 参见表 2 和图 3b， 均为三重实验 )。用 CUB4 和 稀释缓冲液作为阴性对照的对照实验没有显示结合信号的升高。
CUB1 在由胺偶联的单抗 CUB3 组成的实施复合物的情况中没有显示三明治式复合 物形成， 且反之亦然 ( 数据未显示 )。
CDCP1-004、 CDCP1-012 和 CDCP1-015 在分别由单抗 CUB1 或单抗 CUB3 和抗原组成 的这两种实施复合物的情况中显示三明治式复合物形成 ( 数据未显示 )。
表 2( 还可参见图 3) ：
与 CUB4 结合相同表位的抗体 鼠 CUB4 嵌合 CUB4 鼠 CDCP1-004 鼠 CDCP1-012 与 CUB4 结合不同表位的抗体 鼠 CUB1 鼠 CUB3在不同 Biacore 实验中， 已经如下测定了抗 CDCP1 抗体对固定化的 hCDCP1-ECD 的 结合常数和亲和力 ：
ka ： 结合速率常数， kd ： 解离速率常数， KD ： 解离平衡常数 ( 结合亲和力 )， t1/2 ： 复 合物的半衰期时间
实施例 3
抗原特异性 ELISA
将各自与链霉亲合素结合蛋白 (SBP)(SEQ ID No ： 2) 融合的可溶性 CDCP1 胞外 域 (CDCP1-ECD)(SEQ ID No ： 2) 及 Short1(huCDCP1_SH1_ECDaa1-216)_SBP) 和 Short5(hu_ CDCP1_SH5_ECD(aa 1-361)SBP)( 其分别包含 CDCP1 胞外域的氨基酸 1-216 和 CDCP1 胞外 域的氨基酸 1-361) 在链霉亲合素板上捕获。为了限定抗体对 SBP-CDCP1-ECD、 SBP-CDCP1 Short1 和 SBP-CDCP1-Short5 的最佳结合， 已经用纯的或 1 ∶ 4 稀释的 ( 在含有 10 ％胎 牛血清， Pan Biotech ID-No 3302-P251116 的 Dulbecco 氏改良的 Eagle 氏培养基， PAN Biotech 中 溶 解 )HEK293 上 清 液 包 被 96 孔 聚 苯 乙 烯 板 (Roche， 经 链 霉 亲 合 素 包 被 的， ID-No.1989685)。对于标准的包被， 与未稀释的 SBP-CDCP1-Short1 和 SBP-CDCP1-ECD 上 清液相反， 将含有 SBP-CDCP1-Short5 的 HEK293 上清液稀释 (1 ∶ 4)， 并于 2-8 ℃ (60μl) 温 育 过 夜。 对 微 量 滴 定 板 的 强 烈 清 洗 对 于 除 去 剩 余 的 未 结 合 的 SBP-CDCP1-ECD、 SBP-CDCP1-Short1 和 SBP-CDCP1-Short5 是必需的。
使用 ELISA 的封闭试剂 (Roche 11112589)250μl/ 孔通过实施一小时封闭步骤来 封闭经包被的孔。
使用 1 ∶ 500 稀释来测试抗 CDCP1 抗体 CUB4( 保藏号 DSM ACC2551) 和 CDCP1_004、 CDCP1_012 和 CDCP1_015( 在 50μl 含有 1 ％ BSA 级分 V， SigmaA3059 的 PBS 中稀释的 0， 1μg 抗体 )。于室温将每孔 50μl 每种样品温育 60 分钟。使用 PBS-T(PBS 中的 0， 05 ％ Tween 20， Fluka#08057) 强 烈 清 洗 后， 添 加 50μl 与 HRP 偶 联 的 山 羊 抗 小 鼠 IgG 抗 体 (BioRad#1706516， 稀释 1 ∶ 1000)， 并将其于室温温育 1 小时。强烈清洗后， 用 BM 蓝 POD 底 物 (Roche 11484281001)50μl 检测抗体的结合。使用标准的光度计来测量 370nm/492nm 的吸光度。
抗体 CDCP1-004、 CDCP1-012、 CDCP1-015 和 CUB4 的结合区位于 CDCP1 胞外域中的 aa 1 和 216 内。因此， 所有这些抗体也识别 CDCP1 的完整 ECD 和含有 aa 1-361 的构建体 (Short 5)( 参见图 4)。
实施例 4
在 MDAMB-231 或 HCT 116 细胞中刺激 CDCP1 内在化和磷酸化
将 每 6 孔 7x105 个 MDAMB-231 细 胞 在 DMEM+L- 谷 氨 酰 胺 + 丙 酮 酸 盐 (Gibco， 41966)10 ％ FCS(PAN Biotech ID-No 3302-P251116)1 ％ MEM 非 必 需 氨 基 酸 (PAA， P0832100) 中培养过夜。将 MDA-MB-231 细胞用 10μg/ 不同抗体处理 10 分钟和 5 小时 ： 小 鼠 CUB4( 保藏号 DSMACC2551) 和抗体 CDCP1_004、 CDCP1_012 和 CDCP1_015。将 HCT 116 细 胞用 20μg/ 不同抗体处理 10 分钟和 5 小时 ： 小鼠 CUB4( 保藏号 DSM ACC2551)、 小鼠 CUB1 和小鼠 CUB3。用冰冷的新鲜制备的 RIPA 裂解缓冲液 (Thermo Scientific， #89901)( 其含 有乙醇中的 1mM PMSF、 10μg/ml 抑肽酶、 0， 4mM 原钒酸盐 ) 裂解细胞。在冰上 15 分钟后， 将 细胞溶胞物以 13000rpm 离心 20 分钟。通过标准的方案在 SDS-PAGE 上分开溶胞物， 并通过 Western 印迹将其转移至硝酸纤维素。通过抗 CDCP1 抗体 (Cell Signaling#4115)、 抗磷酸 CDCP1 抗体或 PY 4G10( 在 HCT116 的情况中 ) 检测 Western 印迹。
未处理的 HCT116 细胞中存在的 CDCP1 的磷酸化水平在时间点 10 分钟或 5 小时时 是不变的。与 CUB1 相比， CUB4 在细胞温育 10 分钟后介导更强的 CDCP1 磷酸化。与 CUB1 相比， CUB4 对磷酸化的抑制和对 CDCP1 的下调 ( 数据未显示 ) 明显得多。CUB3 温育导致对 CDCP1 磷酸化的刺激较弱， 而且不能介导蛋白质的下调 ( 数据未显示 )。图 5a 和 b 中显示 了结果。
未处理的 MDA-MB231 细胞中存在的 CDCP1 的表达水平在时间点 10 分钟或 5 小时 时是不变的。CUB4 温育及细胞与 CDCP1-004、 CDCP1-012 和 CDCP1-0015 抗体一起温育 5 小 时至少导致对 CDCP1 蛋白的部分降解。CDCP1 的磷酸化难以在未处理的细胞中检出。用 CUB4 或抗体 CDCP1-004、 CDCP1-012 和 CDCP1-0015 将细胞处理 10 分钟导致酪氨酸 734 上 的 CDCP1 磷酸化升高。用这些抗体处理 5 小时后， 由于 CDCP1 下调， CDCP1 中的酪氨酸 734 磷酸化几乎不能检出。图 6a 至 c 中显示了结果。19CN 102481366 A
序列表1/21 页
20CN 102481366 A序列表2/21 页
21CN 102481366 A序列表3/21 页
22CN 102481366 A序列表4/21 页
23CN 102481366 A序列表5/21 页
24CN 102481366 A序列表6/21 页
25CN 102481366 A序列表7/21 页
26CN 102481366 A序列表8/21 页
27CN 102481366 A序列表9/21 页
28CN 102481366 A序列表10/21 页
29CN 102481366 A序列表11/21 页
30CN 102481366 A序列表12/21 页
31CN 102481366 A序列表13/21 页
32CN 102481366 A序列表14/21 页
33CN 102481366 A序列表15/21 页
本发明进一步包括依照本发明的抗体， 其特征在于 ： 所述抗体是人 IgG1 亚类的。
本发明的另一方面是一种用于治疗癌症的药物组合物， 其包含特异性结合人 CDCP1 的抗体， 该抗体的特征在于 ： 与 CUB4( 保藏号 DSMACC2551) 结合相同表位。
本发明的另一方面是特异性结合人 CDCP1 的抗体用于制备供治疗癌症用的药物 中的用途， 所述抗体的特征在于 ： 与 CUB4( 保藏号 DSMACC2551) 结合相同表位。
本发明的另一方面是一种治疗患有癌症的患者的方法， 其通过对需要此类治疗的 所述患者施用特异性结合人 CDCP1 的抗体来进行， 所述抗体的特征在于 ： 与 CUB4( 保藏号 DSMACC2551) 结合相同表位。
本发明进一步包括依照本发明的抗体， 其特征在于 ：
a) 重链可变域是 SEQ ID NO ： 15， 且轻链可变域是 SEQ ID NO ： 16， 或
b) 重链可变域是 SEQ ID NO ： 23， 且轻链可变域是 SEQ ID NO ： 24， 或
c) 重链可变域是 SEQ ID NO ： 31， 且轻链可变域是 SEQ ID NO ： 32， 或或其人源化型 式。 本发明进一步包括依照本发明的抗体， 其特征在于 ：
a) 重链可变域包含 CDRH1 区 SEQ ID NO ： 9、 CDRH2 区 SEQ ID NO ： 10、 和 CDRH3 区 SEQ ID NO ： 11， 且轻链可变域包含 CDRL1 区 SEQ ID NO ： 12、 CDRL2 区 SEQ ID NO ： 13、 和 CDRL3 区 SEQ ID NO ： 14， 或
b) 重链可变域包含 CDRH1 区 SEQ ID NO ： 17、 CDRH2 区 SEQ ID NO ： 18、 和 CDRH3 区 SEQ ID NO ： 19， 且轻链可变域包含 CDRL1 区 SEQ ID NO ： 20、 CDRL2 区 SEQ ID NO ： 21、 和 CDRL3 区 SEQ ID NO ： 22， 或
c) 重链可变域包含 CDRH1 区 SEQ ID NO ： 25、 CDRH2 区 SEQ ID NO ： 26、 和 CDRH3 区 SEQ ID NO ： 27， 且轻链可变域包含 CDRL1 区 SEQ ID NO ： 28、 CDRL2 区 SEQ ID NO ： 29、 和 CDRL3 区 SEQ ID NO ： 30。
优选地， 所述抗体的特征在于所述抗体是人 IgG1 亚类的。本发明进一步包括包含 所述抗体的药物组合物。 本发明进一步包括依照本发明的所述抗体用于制备供治疗癌症用 的药物的用途。本发明进一步包括一种治疗患有癌症的患者的方法， 其通过对需要此类治 疗的所述患者施用所述抗体来进行。
本发明提供了编码依照本发明的抗体的核酸。 本发明进一步提供了含有依照本发 明的核酸且能够在原核或真核宿主细胞中表达所述核酸的表达载体和含有此类载体的用 于重组生成依照本发明的抗体的宿主细胞。
本发明进一步包括包含依照本发明的载体的原核或真核宿主细胞。
本发明进一步包括一种用于生成依照本发明的重组抗体的方法， 其特征在于在原 核或真核宿主细胞中表达依照本发明的核酸， 并自所述细胞或细胞培养物上清液回收所述 抗体。本发明进一步包括通过此类重组方法获得的抗体。
现在已经令人惊讶地发现了， 与结合 CDCP1 的其它表位的 CDCP1 抗体， 如例如 CUB1( 保藏号 DSM ACC2569) 相比， 以与 CUB4( 保藏号 DSM ACC2551) 结合相同表位为特征的
特异性结合 CDCP1 的抗体特别可用于治疗癌症。
发明详述
CUB4 抗 体 指 来 自 DE 10242146(EP 1396501， US 7,541,030) 的 具 有 保 藏 号 DSM ACC2551 的保藏抗体， 其具有重链可变域 (VH)SEQ ID NO ： 7 和轻链可变域 (VL)SEQ ID NO ： 8。所述 CUB4 抗体特异性结合人 CDCP1。( 编号为 DSM ACC2551(DSMZ) 的保藏由 Eberhard-Karls-University Tübingen， Tübingen， Geissweg 3， 72076Tübingen 做出 )。
本发明包括用于治疗癌症的特异性结合人 CDCP1 的抗体， 其特征在于 ：
与 CUB4( 保藏号 DSMACC2551) 结合相同表位。
本发明进一步包括依照本发明的抗体， 其特征在于 ：
重链可变域是 SEQ ID NO ： 7， 且轻链可变域是 SEQ ID NO ： 8， 或其人源化型式。
本发明进一步包括依照本发明的抗体， 其特征在于 ：
重链可变域是 SEQ ID NO ： 15， 且轻链可变域是 SEQ ID NO ： 16， 或或其人源化型式。
本发明进一步包括依照本发明的抗体， 其特征在于 ：
重链可变域是 SEQ ID NO ： 23， 且轻链可变域是 SEQ ID NO ： 24， 或或其人源化型式。
本发明进一步包括依照本发明的抗体， 其特征在于 ：
重链可变域是 SEQ ID NO ： 31， 且轻链可变域是 SEQ ID NO ： 32， 或或其人源化型式。
本发明进一步包括依照本发明的抗体， 其特征在于 ：
重链可变域包含 CDRH1 区 SEQ ID NO ： 9、 CDRH2 区 SEQ ID NO ： 10、 和 CDRH3 区 SEQ ID NO ： 11， 且轻链可变域包含 CDRL1 区 SEQ ID NO ： 12、 CDRL2 区 SEQ ID NO ： 13、 和 CDRL3 区 SEQ ID NO ： 14， 或
本发明进一步包括依照本发明的抗体， 其特征在于 ：
重链可变域包含 CDRH1 区 SEQ ID NO ： 17、 CDRH2 区 SEQ ID NO ： 18、 和 CDRH3 区 SEQ ID NO ： 19， 且轻链可变域包含 CDRL1 区 SEQ ID NO ： 20、 CDRL2 区 SEQ ID NO ： 21、 和 CDRL3 区 SEQ ID NO ： 22， 或
本发明进一步包括依照本发明的抗体， 其特征在于 ：
重链可变域包含 CDRH1 区 SEQ ID NO ： 25、 CDRH2 区 SEQ ID NO ： 26、 和 CDRH3 区 SEQ ID NO ： 27， 且轻链可变域包含 CDRL1 区 SEQ ID NO ： 28、 CDRL2 区 SEQ ID NO ： 29、 和 CDRL3 区 SEQ ID NO ： 30。 术语 “抗体” 涵盖各种形式的抗体结构， 包括但不限于完整的抗体和抗体片段。优 选地， 依照本发明的抗体是人源化抗体、 嵌合抗体、 或进一步遗传工程化改造的抗体， 只要 依照本发明的特征性特性得到保留。 “抗体片段” 包含全长抗体的一部分， 优选地其可变域， 或至少其抗原结合位点。 抗体片段的例子包括双抗体、 单链抗体分子、 和自抗体片段形成的 多特异性抗体。 scFv 抗体例如记载于 Huston， J.S.， Methods in Enzymol.203(1991)46-88。 另外， 抗体片段包含具有结合 CDCP1 的 VH 域或 VL 域的特征 ( 即能够与 VL 域或 VH 域一起 装配成功能性抗原结合位点， 并且由此提供依照本发明的抗体的特性 ) 的单链多肽。如本 文中所使用的， 术语 “单克隆抗体” 或 “单克隆抗体组合物” 指单一氨基酸组成的抗体分子 的制备物。术语 “人源化抗体” 或 “抗体的人源化型式” 指其中的框架和 / 或 “互补决定 区” (CDR) 已经进行过修饰以包含与亲本免疫球蛋白的 CDR 相比不同物种的免疫球蛋白的
CDR( 例如 CDR3) 的抗体。在一个优选的实施方案中， 将小鼠 CDR( 例如 CDR3) 嫁接入人抗体 的框架区中以制备 “人源化抗体” ( 参见例如 Riechmann， L. 等， Nature332(1988)323-327 ； 及 Neuberger， M.S. 等， Nature 314(1985)268-270)。
如本文中所使用的， 术语 “单克隆抗体” 或 “单克隆抗体组合物” 指单一氨基酸组 成的抗体分子的制备物。
术语 “嵌合抗体” 指通常通过重组 DNA 技术制备的包含来自小鼠的可变区， 即结合 区和自不同来源或物种衍生的恒定区的至少一部分的单克隆抗体。 包含小鼠可变区和人恒 定区的嵌合抗体是特别优选的。此类大鼠 / 人嵌合抗体是包含编码大鼠免疫球蛋白可变区 的 DNA 区段和编码人免疫球蛋白恒定区的 DNA 区段的所表达免疫球蛋白基因的产物。本发 明所涵盖的 “嵌合抗体” 的其它形式是那些其中类别或亚类已经自初始抗体的类别或亚类 修饰或改变的。此类 “嵌合” 抗体又称为 “类别转换抗体” 。用于生成嵌合抗体的方法牵涉本 领域现在公知的常规重组 DNA 和基因转染技术 ( 参见例如 Morrison， S.L. 等， Proc.Natl. Acad Sci.USA 81(1984)6851-6855 ； US 5,202,238 和 US 5,204,244)。
人 CDCP1(( 含有 CUB 域的蛋白 1、 B345、 CD318、 SIMA135、 TRASK ； SEQ ID NO ： 1和 具有突变 R525Q( 即 SEQ ID NO ： 1 的氨基酸位置 525 处用谷氨酰胺 (Q) 替换精氨酸 (R)) 和 / 或突变 G709D( 即 SEQ ID NO ： 1 的氨基酸位置 709 处用天冬氨酸 (D) 替换甘氨酸 (G)) 的 变体 ) 是一种含有三个胞外 CUB 域的跨膜蛋白。发现此蛋白质在结肠和肺癌中过表达。其 表达水平与癌瘤细胞的转移能力相关联。已经显示了它在癌细胞系中是酪氨酸磷酸化的 (WO2002/004508 ； Scherl-Mostageer， M. 等， Oncogene 20(2001)4402-8 ； Hooper， J.D. 等， Oncogene 22(2003)1783-94 ； Perry， S.E. 等， FEBS Lett.581(2007)1137-42 ； Brown， T.A.， J.Biol.Chem.279(2004)14772-14783 ； Ota， T. 等， Nat.Genet.36(2004)40-45)。已经报告 了编码独特同等型的可变剪接转录物变体。
除非另有规定， 术语 “Kabat 编号方式” 或 “依照 Kabat 的编号方式” 或 “EU 索引” 定义为使用如在 Kabat 等 (Sequences of Proteins of Immunological Interest， 第 5 版， Public Health Service， National Institutes of Health， Bethesda， MD(1991)) 中的 EU 索引为例如 IgG 抗体中的残基编号。
如本文中所使用的， “特异性结合人 CDCP1” 指特异性结合人 CDCP1 抗原的抗体。 -8 结合亲和力是 1.0x10 mol/l 或更低的 KD 值的， 优选地 1.0x10-9mol/l 或更低的 KD 值的。 用标准的结合测定法， 诸如表面等离振子共振技术 来测定结合亲和力。如此， 如本文中所使用的， “特异性结合人 CDCP1 的抗体”指以 KD1.0x10-8mol/l 或更低 ( 例如 KD1.0x10-8mol/l 至 1.0x10-13mol/l， 优选地 KD1.0x10-9mol/l 至 1.0x10-12mol/l) 的结合亲 和力结合人 CDCP1 抗原的抗体。
本发明进一步包括特异性结合人 CDCP1 的抗体， 其特征在于 ：
重链可变域是 SEQ ID NO ： 15， 且轻链可变域是 SEQ ID NO ： 16， 或其人源化型式。
本发明进一步包括特异性结合人 CDCP1 的抗体， 其特征在于 ：
重链可变域是 SEQ ID NO ： 23， 且轻链可变域是 SEQ ID NO ： 24， 或其人源化型式。
本发明进一步包括特异性结合人 CDCP1 的抗体， 其特征在于 ：
重链可变域是 SEQ ID NO ： 31， 且轻链可变域是 SEQ ID NO ： 32， 或其人源化型式。
本发明进一步包括特异性结合人 CDCP1 的抗体， 其特征在于 ：重链可变域包含 CDRH1 区 SEQ ID NO ： 9、 CDRH2 区 SEQ ID NO ： 10、 和 CDRH3 区 SEQ ID NO ： 11， 且轻链可变域包含 CDRL1 区 SEQ ID NO ： 12、 CDRL2 区 SEQ ID NO ： 13、 和 CDRL3 区 SEQ ID NO ： 14。
本发明进一步包括特异性结合人 CDCP1 的抗体， 其特征在于 ：
重链可变域包含 CDRH1 区 SEQ ID NO ： 17、 CDRH2 区 SEQ ID NO ： 18、 和 CDRH3 区 SEQ ID NO ： 19， 且轻链可变域包含 CDRL1 区 SEQ ID NO ： 20、 CDRL2 区 SEQ ID NO ： 21、 和 CDRL3 区 SEQ ID NO ： 22。
本发明进一步包括特异性结合人 CDCP1 的抗体， 其特征在于 ：
重链可变域包含 CDRH1 区 SEQ ID NO ： 25、 CDRH2 区 SEQ ID NO ： 26、 和 CDRH3 区 SEQ ID NO ： 27， 且轻链可变域包含 CDRL1 区 SEQ ID NO ： 28、 CDRL2 区 SEQ ID NO ： 29、 和 CDRL3 区 SEQ ID NO ： 30。
术语 “表位” 意指人 CDCP1 中能够特异性结合抗体的蛋白质决定子。表位通常由 分子诸如氨基酸或糖侧链的化学活性表面聚集构成， 并且通常表位具有特定的三维结构特 征， 及特定的电荷特征。构象性和非构象性表位的区别之处在于在存在变性溶剂的情况中 丧失对前一种， 而不是后一种的结合。 如本文中所使用的， 术语 “与 CUB4( 保藏号 DSMACC2551) 结合相同表位” 指结合 CDCP1 上抗体 CUB4( 保藏号 DSM ACC2551) 结合的相同表位的本发明的抗 CDCP1 抗体。可以 使用本领域中已知的技术来测定本发明的抗 CDCP1 抗体的表位结合特性。在体外竞争结合 抑制测定法中通过表面等离振子共振 (SPR) 于 25℃测定抗体 CUB4( 保藏号 DSM ACC2551) 抑制测试抗体对 CDCP1 结合的能力， 从而测量 CDCP1 抗体 ( 参见图 2)。与 CUB4 结合相同 表位的抗体的结合受到抑制， 并且在添加测试抗体后没有检出结合信号。( 例如， 测试抗体 的注射时间 ( ＝ 0 秒 ) 后 100 秒， 结合信号不比注射时的信号高 ； 以 RU( 相对单位 ) 测量信 号 )( 例如 CDCP1-004、 CDCP1-012、 CDCP1-015， 参见图 3a)。与 CUB4 结合不同表位的抗体的 结合不受抑制， 并且在添加测试抗体后检出结合信号 ( 例如 CUB1 和 CUB3， 参见图 3b)( 例 如， 注射时间 ( ＝ 0 秒 ) 后 100 秒， 结合信号比注射时的信号高 ； 以 RU( 相对单位 ) 测量信 号 )。这可以通过 BIAcore 测定法 (Pharmacia Biosensor AB， Uppsala， Sweden) 来调查， 如记载于例如实施例 2 的。
如本文中所使用的， “可变域” ( 轻链可变域 (VL)、 重链可变域 (VH)) 意为直接牵涉 抗体结合抗原的轻链和重链域对之每种。轻链和重链可变域具有相同的一般结构， 并且每 个域包含通过三个 “高变区” ( 或互补决定区， CDR) 连接的其序列广泛保守的四个框架 (FR) 区。框架区采用 β- 片层构象， 而 CDR 可以形成连接 β- 片层结构的环。每条链中的 CDR 通过框架区保持其三维结构， 并且与来自另一条链的 CDR 一起形成抗原结合位点。抗体的 重链和轻链 CDR3 区在依照本发明的抗体的结合特异性 / 亲和力中发挥特别重要的作用， 并 且因此提供本发明的别的目的。
在本文中使用时， 术语 “抗体的抗原结合部分” 指抗体中负责抗原结合的氨基酸 残基。抗体的抗原结合部分包含来自 “互补决定区” 或 “CDR” 的氨基酸残基。术语本发明 的抗体的 “抗原结合部分” 可以含有 6 个互补决定区 (CDR)， 其以不同程度促成结合位点 对抗原的亲和力。存在着三个重链可变域 CDR(CDRH1、 CDRH2 和 CDRH3) 和三个轻链可变域 CDR(CDRL1、 CDRL2 和 CDRL3)。通过与汇编的氨基酸序列数据库比较来确定 CDR 和框架区
(FR) 的范围， 在所述数据库中已经依照序列间的可变性限定那些区域。
“框架” 或 “FR” 区是与如本文中所限定的高变区残基不同的那些可变域区。因 此， 抗体的轻链和重链可变域包含自 N 至 C 端的域 FRi、 CDR1、 FR2、 CDR2、 FR3、 CDR3、 和 FR4。 CDR 和 FR 区依照 Kabat 等， Sequences of Proteins of Immunological Interest， 第 5 版， Public Health Service， National Institutes of Health， Bethesda， MD(1991) 的标准定 义和 / 或那些来自 “高变环” 的残基来确定。
如本文中所使用的， 术语 “核酸” 或 “核酸分子” 意图包括 DNA 分子和 RNA 分子。核 酸分子可以是单链或双链， 但是优选的是双链 DNA。
如本申请内所使用的， 术语 “氨基酸” 意指天然存在的羧基 α- 氨基酸的组， 包括 丙氨酸 ( 三字母代码 ： ala， 单字母代码 ： A)、 精氨酸 (arg， R)、 天冬酰胺 (asn， N)、 天冬氨酸 (asp， D)、 半胱氨酸 (cys， C)、 谷氨酰胺 (gln， Q)、 谷氨酸 (glu， E)、 甘氨酸 (gly， G)、 组氨酸 (his， H)、 异亮氨酸 (ile， I)、 亮氨酸 (leu， L)、 赖氨酸 (lys， K)、 甲硫氨酸 (met， M)、 苯丙氨 酸 (phe， F)、 脯氨酸 (pro， P)、 丝氨酸 (ser， S)、 苏氨酸 (thr， T)、 色氨酸 (trp， W)、 酪氨酸 (tyr， Y)、 和缬氨酸 (val， V)。
依照本发明的抗体的特征在于恒定区是人起源的， 且优选的是人 IgG1 亚类的。 恒定区包括抗体的重链和轻链恒定区。重链恒定区包含以 N 端至 C 端方向的抗体重链恒 定域 1(CH1)、 抗体铰链区 (HR)、 抗体重链恒定域 2(CH2)、 和抗体重链恒定域 3(CH3) ； 和任 选地在 IgE 亚类抗体的情况中抗体重链恒定域 4(CH4)。轻链恒定区包含抗体轻链恒定域 (CL)。抗体轻链恒定域 (CL) 可以是 κ( 卡帕 ) 或 λ( 拉姆达 )。此类恒定链是现有技术公 知的， 并且例如由 Kabat， E.， A.， 描述 ( 参见例如 Johnson， G. 和 Wu， T.， T.， Nucleic Acids Res.28(2000)214-218)。 例如， 有用的 IgG1 亚类人重链恒定区包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 3。例如， 有用的人轻链恒定区包含 κ 轻链恒定区的氨基酸序列 SEQ ID NO ： 4； 另一个有用 的人轻链恒定区包含 λ 轻链恒定区的氨基酸序列 SEQ ID NO ： 5。
抗体的 “Fc 部分” 不直接牵涉抗体对抗原的结合， 但是展现出各种效应器功能。 “抗 体的 Fc 部分” 是熟练技术人员公知的术语， 并且基于木瓜蛋白酶对抗体的切割限定。根据 其重链恒定区的氨基酸序列， 抗体或免疫球蛋白分成类 ： IgA、 IgD、 IgE、 IgG 和 IgM， 并且这 些中的数种可以进一步分成亚类 ( 同种型 )， 例如 IgG1、 IgG2、 IgG3、 和 IgG4、 IgA1、 和 IgA2。 依照重链恒定区， 免疫球蛋白的不同类分别称作 α、 δ、 ε、 γ、 和 μ。
抗体的 Fc 部分直接牵涉 ADCC( 抗体依赖性细胞介导的细胞毒性 ) 和基于补体 激活、 C1q 结合和 Fc 受体结合的 CDC( 补体依赖性细胞毒性 )。补体激活 (CDC) 是通过 补体因子 C1q 结合大多数 IgG 抗体亚类的 Fc 部分启动的。虽然抗体对补体系统的影响 依赖于某些条件， 但是对 C1q 的结合是由 Fc 部分中的限定结合位点引起的。此类结合 位 点 是 现 有 技 术 中 已 知 的， 并 且 例 如 由 Boackle， R.J. 等， Nature 282(1979)742-743 ； Lukas ， T.J. 等， J.Immunol.127(1981)2555-2560 ； Brunhouse ， R. 和 Cebra ， J.J. ， Mol.Immunol.16(1979)907-917 ； Burton ， D.R. 等，Nature 288(1980)338-344 ； Thommesen ，J.E. 等，Mol.Immunol.37(2000)995-1004 ； Idusogie ，E.E. 等， J.Immunol.164(2000)4178-4184 ； Hezareh， M. 等， J.Virology 75(2001)12161-12168 ； Morgan， A. 等， Immunology 86(1995)319-324 ； EP 0307434 描述。此类结合位点是例如 L234、 L235、 D270、 N297、 E318、 K320、 K322、 P331 和 P329( 依照 Kabat， E.A. 的 EU 索引的编号方式， 参见下文 )。亚类 IgG1、 IgG2 和 IgG3 的抗体通常显示补体激活及 C1q 和 C3 结合， 而 IgG4 不激活补体系统， 而且不结合 C1q 和 C3。
依照本发明的抗体包含自人起源衍生的 Fc 部分， 且优选地人恒定区的所有其它 部分。如本文中所使用的， 术语 “自人起源衍生的 Fc 部分” 意指作为 IgG1、 IgG2、 IgG3 或 IgG4 亚类的人抗体的 Fc 部分， 优选地来自人 IgG1 亚类的 Fc 部分、 来自人 IgG1 亚类的突 变 Fc 部分 ( 优选地具有 L234A+L235A 方面的突变 )、 来自人 IgG4 亚类的 Fc 部分或来自人 IgG4 亚类的突变 Fc 部分 ( 优选地具有 S228P 方面的突变 ) 的 Fc 部分。最优选的是人 IgG1 亚类 ( 参见例如 SEQ IDNO ： 3)、 具有突变 L234A 和 L235A 的人 IgG1 亚类、 人 IgG4 亚类 ( 参 见例如 SEQID NO ： 6)、 或具有突变 S228P 的人 IgG4 亚类的人重链恒定区。
术语 “抗体依赖性细胞的细胞毒性 (ADCC)” 指在存在效应细胞的情况中通过依照 本发明的抗体来裂解人靶细胞。优选地， 通过在存在效应细胞， 诸如新鲜分离的 PBMC 或来 自血沉棕黄层的纯化的效应细胞， 如单核细胞或天然杀伤 (NK) 细胞或永久生长 NK 细胞系 的情况中用依照本发明的抗体来处理 CDCP1 表达细胞的制备物来测量 ADCC。
术语 “补体依赖性细胞毒性 (CDC)” 意指通过补体因子 C1q 与大多数 IgG 抗体亚类 的 Fc 部分的结合启动的过程。 通过在所谓的结合位点处限定的蛋白质 - 蛋白质相互作用引 起 C1q 与抗体的结合。此类 Fc 部分结合位点是现有技术中已知的 ( 参见上文 )。此类 Fc 部分结合位点例如以氨基酸 L234、 L235、 D270、 N297、 E318、 K320、 K322、 P331、 和 P329( 依照 Kabat 的 EU 索引编号 ) 为特征。亚类 IgG1、 IgG2、 和 IgG3 的抗体通常显示包括 C1q 和 C3 结合的补体激活， 而 IgG4 不激活补体系统， 而且不结合 C1q 和 / 或 C3。
单克隆抗体的细胞介导的效应器功能可以通过工程化改造其寡糖组分来增强， 如记载于 Umana， P. 等， Nature Biotechnol.17(1999)176-180， 及 US6,602,684 的。IgG1 型抗体 ( 最常使用的治疗性抗体 ) 是在每个 CH2 域中具有 Asn297 处的保守的 N 连接 的糖基化位点的糖蛋白。两个附着于 Asn297 的复合双触角寡糖掩埋于 CH2 域间， 这形 成与多肽主链的广泛接触， 并且其存在对于抗体介导效应器功能诸如抗体依赖性细胞 的 细 胞 毒 性 (ADCC) 是 至 关 重 要 的 (Lifely， M.R. 等， Glycobiology 5(1995)813-822 ； Jefferis， R. 等， Immunol.Rev.163(1998)59-76 ； Wright， A. 和 Morrison， S.L.， Trends Biotechnol.15(1997)26-32)。Umana， P. 等 Nature Biotechnol.17(1999)176-180 和 WO 99/54342 显 示 了 β(1， 4)-N- 乙 酰 葡 糖 胺 转 移 酶 III(“GnTIII” )( 即 一 种 催 化 两 分型寡糖形成的糖基转移酶 ) 在中国仓鼠卵巢 (CHO) 细胞中的过表达显著提高抗体的 体外 ADCC 活性。Asn297 碳水化合物的组成改变或其消除还影响与 FcγR 和 C1q 的结 合 (Umana， P. 等， Nature Biotechnol.17(1999)176-180 ； Davies， J. 等， Biotechnol. Bioeng.74(2001)288-294 ； Mimura ，Y. 等，J.Biol.Chem.276(2001)45539-45547 ； Radaev ， S. 等， J.Biol.Chem.276(2001)16478-16483 ； Shields ， R.L. 等， J.Biol. Chem.276(2001)6591-6604 ； Shields， R.L. 等， J.Biol.Chem.277(2002)26733-26740 ； Simmons， L.C. 等， J.Immunol.Methods 263(2002)133-147)。
例如在 WO 2005/044859， WO 2004/065540， WO2007/031875， Umana， P. 等， Nature Biotechnol.17(1999)176-180， WO 99/154342， WO 2005/018572， WO 2006/116260， WO 2006/114700， WO 2004/065540， WO 2005/011735， WO2005/027966， WO 1997/028267， US 2006/0134709， US 2005/0054048， US2005/0152894， WO 2003/035835 和 WO 2000/061739中， 或 者 例 如 在 Niwa， R. 等， J.Immunol.Methods 306(2005)151-160 ； Shinkawa， T. 等， J.Biol.Chem.278(2003)3466-3473 ； WO 03/055993 和 US 2005/0249722 中报告了增强单克 隆抗体的细胞介导的效应器功能的方法。
因此， 在本发明的一个实施方案中， 依照本发明的抗体在 Asn297 处用糖链糖基化 ( 若它包含 IgG1 或 IgG3 亚类的 Fc 部分 )， 由此所述糖链内的岩藻糖量是 65％或更低 ( 依 照 Kabat 的编号方式 )。在另一个实施方案中， 所述糖链内的岩藻糖量是在 5％和 65％之 间， 优选地在 20％和 40％之间。依照本发明的 “Asn297” 意指位于 Fc 区中的约第 297 位的 氨基酸天冬酰胺。基于抗体的次要序列变异， Asn297 也可以位于第 297 位上游或下游的一 些氨基酸 ( 通常不超过 ±3 个氨基酸 )， 即第 294 位和第 300 位之间。在一个实施方案中， 依照本发明的糖基化抗体， IgG 亚类是人 IgG1 亚类的、 具有突变 L234A 和 L235A 的人 IgG1 亚类的或 IgG3 亚类的。在又一个实施方案中， N- 羟乙酰神经氨酸 (NGNA) 的量是 1％或更 小和 / 或 N 端 α-1， 3- 半乳糖的量是所述糖链内的 1％或更小。优选地， 糖链显示了附着于 CHO 细胞中重组表达的抗体的 Asn297 的 N 连接聚糖的特征。
术语 “糖链显示了附着于 CHO 细胞中重组表达的抗体的 Asn297 的 N 连接聚糖的特 征” 意指依照本发明的抗体的 Asn297 处的糖链与未修饰的 CHO 细胞中表达的相同抗体的糖 链， 例如如那些在 WO 2006/103100 中报告的糖链具有相同的结构和糖残基序列 ( 除了岩藻 糖残基外 )。 如本申请内所使用的， 术语 “NGNA” 意指糖残基 N- 羟乙酰神经氨酸。
在 Asn297 处发生人 IgG1 或 IgG3 的糖基化， 作为以多至两个 Gal 残基为末端 的核心岩藻糖化双触角复合寡糖糖基化。Kabat， E.A. 等， Sequences of Proteins of Immunological Interest， 第 5 版， Public Health Service， National Institutes of Health， Bethesda， MD.(1991) 及 Brueggemann， M. 等， J.Exp.Med.166(1987)1351-1361 ； Love， T.W. 等， Methods Enzymol.178(1989)515-527 详细报告了 IgG1 或 IgG3 亚类的人重 链恒定区。根据末端 Gal 残基的量， 这些结构称为 G0、 G1(α-1， 6- 或 α-1， 3-)、 或 G2 聚糖 残基 (Raju， T.S.， Bioprocess Int.1(2003)44-53)。抗体 Fc 部分的 CHO 型糖基化例如由 Routier， F.H.， Glycoconjugate J.14(1997)201-207 描述。在非糖修饰的 CHO 宿主细胞中 重组表达的抗体在 Asn297 处通常以至少 85％的量进行岩藻糖化。抗体的经修饰的寡糖可 以是杂合的或复合的。优选地， 两分型、 还原的 / 非岩藻糖化的寡糖是杂合的。在另一个实 施方案中， 两分型、 还原的 / 非岩藻糖化的寡糖是复合的。
依照本发明， “岩藻糖的量”意指通过 MALDI-TOF 质谱术测量的， 并以平均值计 算的， 相对于附着于 Asn297 的所有糖结构 ( 例如复合的、 杂合的和高甘露糖结构 ) 的总 和， Asn297 处糖链内所述糖的量 ( 参见例如 WO2008/077546)。岩藻糖的相对量是通过 MALDI-TOF， 含有岩藻糖的结构相对于经 N- 糖苷酶 F 处理的样品中鉴定的所有糖结构 ( 例 如分别为复合的、 杂合的及寡和高甘露糖结构 ) 的百分比。
优选地， 通过重组手段来生成依照本发明的抗体。此类方法是现有技术中普遍已 知的， 并且包括在原核和真核细胞中的蛋白质表达， 随后分离抗体多肽， 并且通常纯化至药 学可接受纯度。对于蛋白质表达， 通过标准的方法将编码轻链和重链或其片段的核酸插入 表达载体中。在合适的原核或真核宿主细胞， 如 CHO 细胞、 NS0 细胞、 SP2/0 细胞、 HEK293 细 胞、 COS 细胞、 酵母、 或大肠杆菌细胞中实施表达， 并且自细胞 ( 上清液或裂解后的细胞 ) 回
收抗体。 抗体的重组生成是现有技术中公知的， 并且例如记载于综述文章 Makrides， S.C. ，Protein Expr.Purif.17(1999)183-202 ； Geisse ，S. 等，Protein Expr. Purif.8(1996)271-282 ； Kaufman， R.J.， Mol.Biotechnol.16(2000)151-160 ； Werner， R.G.， Drug Res.48(1998)870-880。
抗体可以存在于整个细胞中， 在细胞溶胞物中， 或者为部分纯化的或基本上纯的 形式。通过标准的技术， 包括碱 /SDS 处理、 CsCl 分带、 柱层析、 琼脂糖凝胶电泳、 和本领域 中公知的其它技术 ( 参见 Ausubel， F. 等编 Current Protocols in Molecular Biology， Greene Publishing and Wiley Interscience， New York(1987)) 来实施纯化以消除其它 细胞组分或其它污染物， 例如其它细胞核酸或蛋白质。
例如， Barnes， L.M. 等， Cytotechnology 32(2000)109-123 ； 及 Barnes， L.M. 等， Biotech.Bioeng.73(2001)261-270 描 述 了 NS0 细 胞 中 的 表 达。 例 如， Durocher， Y. 等， Nucl.Acids.Res.30(2002)E9 描 述 了 瞬 时 表 达。Orlandi， R. 等， Proc.Natl.Acad.Sci. USA 86(1989)3833-3837 ； Carter， P. 等， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(1992)4285-4289 ； 及 Norderhaug， L. 等， J.Immunol.Methods 204(1997)77-87 描 述 了 可 变 域 的 克 隆。 Schlaeger， E.-J. 和 Christensen， K.， 于 Cytotechnology 30(1999)71-83 及 Schlaeger，
E.-J.， 于 J.Immunol.Methods 194(1996)191-199 描述了一种优选的瞬时表达系统 (HEK 293)。
适合于原核生物的控制序列例如包括启动子， 任选地操纵基因序列， 和核糖体结 合位点。已知真核细胞利用启动子、 增强子和多腺苷酸化信号。
在将核酸放置在与另一种核酸序列的功能性关系中时， 它是 “可操作连接的” 。例 如， 若前序列或分泌前导的 DNA 以参与多肽分泌的前蛋白表达， 则它与多肽的 DNA 可操作连 接； 若启动子或增强子影响序列的转录， 则它与编码序列可操作连接 ； 或者若核糖体结合 位点定位为使得便于翻译， 则它与编码序列可操作连接。一般而言， “可操作连接的” 意指所 连接的 DNA 序列是连续的， 并且在分泌前导的情况中， 是连续的且在读码框中。然而， 增强 子不必是连续的。通过在方便的限制性位点处的连接来实现连接。若不存在此类位点， 则 依照常规的实践使用合成的寡核苷酸衔接头或接头。
通过常规的免疫球蛋白纯化规程， 诸如例如蛋白 A-Sepharose、 羟磷灰石层析、 凝 胶电泳、 透析、 或亲和层析来自培养液适当地分离单克隆抗体。 容易使用常规规程将编码单 克隆抗体的 DNA 和 RNA 分离并测序。杂交瘤细胞可以充当此类 DNA 和 RNA 的来源。一旦分 离， 可以将 DNA 插入表达载体中， 然后将所述表达载体转染入在其它情况中不生成免疫球 蛋白蛋白质的宿主细胞诸如 HEK 293 细胞、 CHO 细胞、 或骨髓瘤细胞中， 以获得重组单克隆 抗体在宿主细胞中的合成。
如本文中所使用的， 表述 “细胞” 、 “细胞系” 、 和 “细胞培养物” 可互换使用， 并且所 有此类名称包括后代。如此， 词语 “转化体” 和 “经转化的细胞” 包括原代主题细胞和自其衍 生的培养物， 而不管传递的次数。还应当理解， 由于有意或无意的突变， 所有后代在 DNA 内 容上可能不是正好相同的。 包括具有如在初始转化细胞中筛选的相同功能或生物学活性的 变体后代。在意图独特名称的情况中， 它从上下文看会是清楚的。
如本文中所使用的， 术语 “转化” 指将载体 / 核酸转移入宿主细胞中的过程。若使用没有难以应付的细胞壁屏障的细胞作为宿主细胞， 则例如通过磷酸钙沉淀法来实施转 染， 如 Graham， F.L. 和 van der Eb， A.J.， Virology 52(1973)456-467 所描述的。然而， 也 可以使用其它用于将 DNA 导入细胞中的方法， 诸如通过核注射或者通过原生质体融合来进 行。若使用原核细胞或含有坚固细胞壁构造的细胞， 则例如一种转染方法是使用氯化钙进 行的钙处理， 如 Cohen， S.N. 等， PNAS.69(1972)2110-2114 所描述的。
如本文中所使用的， “表达”指将核酸转录成 mRNA 的过程和 / 或随后将转录的 mRNA( 又称为转录物 ) 翻译成肽、 多肽、 或蛋白质的过程。转录物和编码的多肽统称为基因 产物。若多核苷酸是自基因组 DNA 衍生的， 则真核细胞中的表达可以包括 mRNA 的剪接。
“载体” 指将插入的核酸分子转移入宿主细胞中和 / 或在宿主细胞间转移的核酸分 子， 特别是自我复制的。该术语包括主要在将 DNA 或 RNA 插入细胞 ( 例如， 染色体整合 ) 方 面发挥功能的载体、 主要在 DNA 或 RNA 复制方面发挥功能的复制载体、 和在 DNA 或 RNA 的转 录和 / 或翻译方面发挥功能的表达载体。还包括提供超过一种功能的载体， 如所描述的。
“表达载体” 指在导入合适的宿主细胞中时可以被转录和翻译成多肽的多核苷酸。 “表达系统” 通常指包含能发挥功能以产生期望的表达产物的表达载体的合适的宿主细胞。
本发明的一个方面是包含依照本发明的抗体的药物组合物。 本发明的另一方面是 依照本发明的抗体用于制造药物组合物的用途。 本发明的又一方面是用于制造包含依照本 发明的抗体的药物组合物的方法。在另一方面， 本发明提供了含有与药用载体一起配制的 依照本发明的抗原结合蛋白的组合物， 例如药物组合物。 已 经 证 明 了 与 其 它 抗 CDCP1 抗 体， 如 例 如 CUB1 抗 体 ( 来 自 DE 10242146(EP 1396501， US 7,541,030) 的具有保藏号 DSMACC2569 的保藏抗体 ) 相比， 所述以与 CUB4( 保 藏号 DSMACC2551) 结合相同表位为特征的特异性结合人 CDCP1 的抗体特别可用于治疗癌 症。
因此， 本发明的一个方面是用于治疗癌症的所述药物组合物。
本发明的另一方面是依照本发明的抗体用于制造供治疗癌症用的药物的用途。
本发明的另一方面是治疗患有癌症的患者的方法， 其通过对需要此类治疗的所述 患者施用依照本发明的抗体来进行。
如本文中所使用的， “药用载体” 包括生理学相容的任何和所有溶剂、 分散介质、 涂 层材料、 抗细菌剂和抗真菌剂、 等张剂和吸收延迟剂， 等等。优选地， 载体适合于静脉内、 肌 肉内、 皮下、 胃肠外、 脊柱或表皮施用 ( 例如通过注射或输注 )。
可以通过本领域中已知的多种方法来施用本发明的组合物。 如熟练技术人员会领 会的， 施用的路径和 / 或模式会随期望的结果而变化。为了通过某些施用路径来施用本发 明的化合物， 可能有必要用某种材料包被化合物， 或者与某种材料共施用化合物以阻止其 失活。例如， 可以将化合物在合适的载体， 例如脂质体或稀释剂中对受试者施用。药学可接 受稀释剂包括盐水和水性缓冲溶液。 药用载体包括无菌水溶液或分散体和供临场制备无菌 可注射溶液或分散体用的无菌粉剂。 对药学活性物质使用此类介质和药剂是本领域中已知 的。
如本文中所使用的， 短语 “胃肠外施用” 意指通常通过注射进行的与肠和表面施用 不同的施用模式， 并且包括但不限于静脉内、 肌肉内、 动脉内、 鞘内、 囊内、 眶内、 心内、 皮内、 腹膜内、 经气管、 皮下、 表皮下、 关节内、 囊下、 蛛网膜下、 脊柱内、 硬膜外和胸骨内注射和输
注。 如本文中所使用的， 术语 “癌症” 可以是例如肺癌、 非小细胞肺 (NSCL) 癌、 细支气 管肺泡细胞肺癌、 骨癌、 胰腺癌、 皮肤癌、 头或颈癌、 皮肤或眼内黑素瘤、 子宫癌、 卵巢癌、 直 肠癌、 肛区癌、 胃癌 (stomach cancer)、 胃癌 (gastric cancer)、 结肠癌、 乳腺癌、 子宫癌、 输卵管癌、 子宫内膜癌、 宫颈癌、 阴道癌、 外阴癌、 何杰金 (Hodgkin) 氏病、 食管癌、 小肠癌、 内分泌系统癌、 甲状腺癌、 甲状旁腺癌、 肾上腺癌、 软组织肉瘤、 尿道癌、 阴茎癌、 前列腺癌、 膀胱癌、 肾或输尿管癌、 肾细胞癌、 肾盂癌、 间皮瘤、 肝细胞癌、 胆癌 (biliary cancer)、 中 枢神经系统 (CNS) 新生物、 脊柱轴肿瘤、 脑干胶质瘤、 多形性成胶质细胞瘤 (glioblastoma multiforme)、 星形细胞瘤、 神经鞘瘤 (schwanoma)、 室鼓膜瘤 (ependymona)、 髓母细胞瘤、 脑脊膜瘤、 鳞状细胞癌、 垂体腺瘤、 淋巴瘤、 淋巴细胞性白血病， 包括任何上述癌症的顽固性 型式、 或一种或多种上述癌症的组合。优选地， 此类癌症是乳腺癌、 卵巢癌、 宫颈癌、 肺癌或 前列腺癌， 且更优选地肺癌。优选地， 此类癌症的进一步特征在于 CDCP1 表达或过表达。更 优选地， 此类癌症的进一步特征在于过表达。
这些组合物还可以含有佐剂诸如防腐剂、 湿润剂、 乳化剂和分散剂。可以通过灭 菌规程， 见上文， 及通过包括各种抗细菌剂和抗真菌剂， 例如对羟基苯甲酸酯、 三氯叔丁醇、 酚、 山梨酸等来确保阻止微生物的存在。还可能期望将等张剂， 诸如糖、 氯化钠等纳入组合 物中。另外， 可以通过包括延迟吸收的药剂诸如单硬脂酸铝和明胶来引起可注射药物形式 的吸收延迟。
不管选择的施用路径， 通过本领域技术人员已知的常规方法来将本发明的化合物 ( 其可以以合适的水合形式使用 ) 和 / 或本发明的药物组合物配制成药学可接受剂量形式。
可以改变活性成分在本发明的药物组合物中的实际剂量水平， 从而获得对于实现 特定患者的期望的治疗响应、 组成、 和施用模式有效的， 而对患者无毒的活性成分量。选定 的剂量水平会取决于多种药动学因素， 包括所采用的本发明的特定组合物的活性、 施用路 径、 施用时间、 所采用的特定化合物的排泄速率、 治疗的持续时间、 与所采用的特定组合物 组合使用的其它药物、 化合物和 / 或材料、 所治疗的患者的年龄、 性别、 重量、 状况、 一般健 康和先前的医学史等医学领域公知的因素。
组合物必须是无菌的， 而且是流体的， 其程度使得组合物通过注射器可投递。 在水 外， 载体优选地是等张缓冲盐水溶液。
可以例如通过使用涂层材料诸如卵磷脂、 在分散体的情况中通过维持所要求的粒 度、 及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。 在许多情况中， 优选在组合物中包含等张 剂 ( 例如糖、 多元醇诸如甘露醇或山梨醇、 和氯化钠 )。
提供以下实施例、 序列表和图以帮助理解本发明， 其实际范围在所附权利要求书 中列出。应当理解， 可以在不背离本发明的精神的前提下对所列规程做出修饰。
序列表的描述
SEQ ID NO ： 1 人 CDCP1
SEQ ID NO ： 2 包含胞外域 (ECD) 的人 CDCP1 片段
SEQ ID NO ： 3 来自人起源的 IgG1 重链恒定区
SEQ ID NO ： 4 来自人起源的 κ 轻链恒定区
SEQ ID NO ： 5 来自人起源的 λ 轻链恒定区
SEQ ID NO ： 6 来自人起源的 IgG4 重链恒定区 SEQ ID NO ： 7 重链可变域 VH， CUB4( 保藏号 DSMACC2551) SEQ ID NO ： 8 轻链可变域 VL， CUB4( 保藏号 DSMACC2551) SEQ ID NO ： 9 重链 CDRH1， 单抗 CDCP1-004 SEQ ID NO ： 10 重链 CDRH2， 单抗 CDCP1-004 SEQ ID NO ： 11 重链 CDRH3， 单抗 CDCP1-004 SEQ ID NO ： 12 轻链 CDRL1， 单抗 CDCP1-004 SEQ ID NO ： 13 轻链 CDRL2， 单抗 CDCP1-004 SEQ ID NO ： 14 轻链 CDRL3， 单抗 CDCP1-004 SEQ ID NO ： 15 重链可变域 VH， 单抗 CDCP1-004 SEQ ID NO ： 16 轻链可变域 VL， 单抗 CDCP1-004 SEQ ID NO ： 17 重链 CDRH1， 单抗 CDCP1-012 SEQ ID NO ： 18 重链 CDRH2， 单抗 CDCP1-012 SEQ ID NO ： 19 重链 CDRH3， 单抗 CDCP1-012 SEQ ID NO ： 20 轻链 CDRL1， 单抗 CDCP1-012 SEQ ID NO ： 21 轻链 CDRL2， 单抗 CDCP1-012 SEQ ID NO ： 22 轻链 CDRL3， 单抗 CDCP1-012 SEQ ID NO ： 23 重链可变域 VH， 单抗 CDCP1-012 SEQ ID NO ： 24 轻链可变域 VL， 单抗 CDCP1-012 SEQ ID NO ： 25 重链 CDRH1， 单抗 CDCP1-015 SEQ ID NO ： 26 重链 CDRH2， 单抗 CDCP1-015 SEQ ID NO ： 27 重链 CDRH3， 单抗 CDCP1-015 SEQ ID NO ： 28 轻链 CDRL1， 单抗 CDCP1-01510 SEQ ID NO ： 29 轻链 CDRL2， 单抗 CDCP1-015 SEQ ID NO ： 30 轻链 CDRL3， 单抗 CDCP1-015 SEQ ID NO ： 31 重链可变域 VH， 单抗 CDCP1-015 SEQ ID NO ： 32 轻链可变域 VL， 单抗 CDCP1-015 附图简述 图 1 抗 CDCP1 抗体 CUB4 和 CUB1 在人肺癌 H322M 异种移植物中的体内肿瘤生长抑 图 2 用固定化的 CUB4 抗体、 CDCP1 的胞外域 (ECD)、 和别的抗 CDCP1 测试抗体 ( 例 的示意性测定法形式。制。
如 CUB1 和 CUB3) 的表面等离振子共振 (SPR-) 技术
图 3 固定化的 CUB4 抗体、 CDCP1 的胞外域 (ECD) 和抗 CDCP1 抗体 CUB1 和 CUB3 的 Biacore 传感图 (x 轴＝时间 ； y 轴＝以相对单位 (RU) 计的响应 )
图 3a ： 显示了 CDCP1-004、 CDCP1-012 和 CDCP1-015 抗体结合 CDCP1 上与 CUB4 抗 体相同的表位。
图 3b ： 显示了 CUB1 和 CUB3 抗体结合 CDCP1 上与 CUB4 抗体不同的另一表位。
图 4 依照本发明的 CDCP1 抗体结合人 CDCP1 胞外域 (CDCP1-ECD) 和人 CDCP1-ECD 的亚域图 5 在 HCT 116 细胞中刺激 CDCP1 磷酸化 图 6 在 MDAMB-231 细胞中刺激 CDCP1 内在化和磷酸化实施例 实施例 1
抗 CDCP1 抗体 CUB4 的体内肿瘤生长抑制及与 CUB1 抗体比较
研究名称 ： CDCP1_PZ_H322M_002
实施本体内研究以比较特异性抗 CDCP1 抗体 CUB4 与结合另一表位的抗体， 如例如 CUB1 的功效。
H322M 非小细胞肺癌细胞最初自 NCI 保藏中心获得， 并在扩充后保藏于 Roche 细 胞库， Penzberg。将肿瘤细胞系常规地在补充有 10％胎牛血清和 2mML- 谷氨酰胺的 RPMI 1640 培养基中于 37℃在水饱和的气氛中于 5％ CO2 培养。使用传代 4 来进行细胞移植。
将人非小细胞肺癌细胞系 H322M 与 Matrigel 一起皮下接种 (5x106 个细胞 ) 入小 鼠的右体侧中。
动物处理在细胞移植后 17 天在随机化当天开始。 以 10mg/kg 的指定剂量 i.p.q7d 施用抗体， 直至研究终止第 62 天。还在同一天施用相应的媒介物。施用体积是 10ml/kg。
组：
处理组 1 ： 媒介物
处理组 2 ： 鼠 CUB4 10mg/kg i.p. ；
处理组 3 ： 鼠 CUB1 10mg/kg i.p. ；
TGI( 以％计的肿瘤生长抑制 )
下表显示了肿瘤生长抑制的数值， 其基于均值和中值分别对每组和时间点以 100- 平均值 (T_ 处理 [ 第 x 天 ]-T_ 处理 [ 基线 ])/ 平均值 (T_ 参照 [ 第 x 天 ]-T_ 参照 [ 基线 ])*100 计算。TGI 计算的参照选择为组 “媒介物” 。图 1 中也显示了结果。
表1： 肿瘤生长抑制 (TGI)
令人惊讶地， CUB4 抗体 ( 保藏号 DSM ACC2551) 比 CUB1 抗体 ( 来自 DE 10242146(EP 1396501， US 7,541,030) 的具有保藏号 DSM ACC2569 的保藏抗体 ) 显示明显更高的肿瘤生 长抑制。
类似地， 可以测定依照本发明的抗 CDCP1 抗体 CDCP1_004、 CDCP1_012 和 CDCP1_015 的体内肿瘤生长抑制。
实施例 2
表位结合测定法 (Biacore)
为了测定不同测试抗 CDCP1 抗体的表位区， 使用胺偶联化学将 CUB4( 保藏号 DSMACC2551) 在 CM5 生物传感器芯片表面上固定化。用 0.1M N- 羟基琥珀酰亚胺和 0.4M 1- 乙基 -3-(3- 二甲基氨基丙基 ) 碳二亚胺的 1 ∶ 1 混合物以 5μl/ 分钟的流速活化流动 池。将抗 CDCP1 抗体 CUB4( 保藏号 DSMACC2551) 在乙酸钠， pH 4.5-5.0 中以 10-30μg/ml 注射 12 分钟， 这导致约 15000 个 RU 的表面密度。用 1M 乙醇胺 /HCl pH 8.5 的注射封闭表 面。将人 CDCP1 的可溶性 ECD(SEQ.ID NO. ： 2)( 分析物 1) 和抗 CDCP1 抗体 ( 分析物 2) 在 PBST+0.8M NaCl 中稀释， 并以 30μl/ 分钟的流速注射。接触时间 ( 结合阶段 ) 对于浓度 为 250nM-500nM 的人 CDCP1ECD 是 150-200 秒， 而对于浓度为 100nM 的抗 CDCP1 抗体是 300 秒。然后， 将芯片表面用 PBST+0.8M NaCl 清洗 3 分钟 ( 解离阶段 )。精确地于 25℃ ( 标准 温度 ) 实施所有相互作用。将 10mM 甘氨酸， pH 2.0 的再生溶液注射 60-150 秒以在每个结 合周期后除去任何非共价结合的蛋白质。以每秒一个信号的检测速率检测信号。
为了测定抗 CDCP1 抗体是否与 CUB4 结合人 CDCP1 的相同或不同表位， 注射人 CDCP1 的 ECD， 并被固定化的抗体结合。 在结合后不久， 注射具有未知表位的抗体。 注射后没 有显示结合信号升高 ( 即， 例如测试抗体的注射时间 ( ＝ 0 秒 ) 后 100 秒， 结合信号没有注 射时的信号高 ； 信号以 RU( 相对单位 ) 测量 ) 的测试抗 CDCP1 抗体与 CUB4 结合相同表位。 显示结合信号升高的测试抗 CDCP1 抗体与 CUB4 结合不同表位 ( 例如， 注射时间 ( ＝ 0 秒 ) 后 100 秒， 结合信号比注射时的信号高 ； 信号以 RU( 相对单位 ) 测量 )。 图 3a 和 3b 中显示了三重测定的结果。发现抗体 CUB3、 CUB1( 参见图 3b) 与 CUB4 在不同表位处结合， 而抗 CDCP1 抗体 CDCP1-004、 CDCP1-012 和 CDCP1-015 鉴定为与 CUB4 结 合相同表位 ( 参见表 2 和图 3a， 均为三重实验 )。发现抗体 CUB3 和 CUB1 各自与 CUB4 结合 另一表位， 并且彼此不同 (CUB1 ≠ CUB3)。( 参见表 2 和图 3b， 均为三重实验 )。用 CUB4 和 稀释缓冲液作为阴性对照的对照实验没有显示结合信号的升高。
CUB1 在由胺偶联的单抗 CUB3 组成的实施复合物的情况中没有显示三明治式复合 物形成， 且反之亦然 ( 数据未显示 )。
CDCP1-004、 CDCP1-012 和 CDCP1-015 在分别由单抗 CUB1 或单抗 CUB3 和抗原组成 的这两种实施复合物的情况中显示三明治式复合物形成 ( 数据未显示 )。
表 2( 还可参见图 3) ：
与 CUB4 结合相同表位的抗体 鼠 CUB4 嵌合 CUB4 鼠 CDCP1-004 鼠 CDCP1-012 与 CUB4 结合不同表位的抗体 鼠 CUB1 鼠 CUB3在不同 Biacore 实验中， 已经如下测定了抗 CDCP1 抗体对固定化的 hCDCP1-ECD 的 结合常数和亲和力 ：
ka ： 结合速率常数， kd ： 解离速率常数， KD ： 解离平衡常数 ( 结合亲和力 )， t1/2 ： 复 合物的半衰期时间
实施例 3
抗原特异性 ELISA
将各自与链霉亲合素结合蛋白 (SBP)(SEQ ID No ： 2) 融合的可溶性 CDCP1 胞外 域 (CDCP1-ECD)(SEQ ID No ： 2) 及 Short1(huCDCP1_SH1_ECDaa1-216)_SBP) 和 Short5(hu_ CDCP1_SH5_ECD(aa 1-361)SBP)( 其分别包含 CDCP1 胞外域的氨基酸 1-216 和 CDCP1 胞外 域的氨基酸 1-361) 在链霉亲合素板上捕获。为了限定抗体对 SBP-CDCP1-ECD、 SBP-CDCP1 Short1 和 SBP-CDCP1-Short5 的最佳结合， 已经用纯的或 1 ∶ 4 稀释的 ( 在含有 10 ％胎 牛血清， Pan Biotech ID-No 3302-P251116 的 Dulbecco 氏改良的 Eagle 氏培养基， PAN Biotech 中 溶 解 )HEK293 上 清 液 包 被 96 孔 聚 苯 乙 烯 板 (Roche， 经 链 霉 亲 合 素 包 被 的， ID-No.1989685)。对于标准的包被， 与未稀释的 SBP-CDCP1-Short1 和 SBP-CDCP1-ECD 上 清液相反， 将含有 SBP-CDCP1-Short5 的 HEK293 上清液稀释 (1 ∶ 4)， 并于 2-8 ℃ (60μl) 温 育 过 夜。 对 微 量 滴 定 板 的 强 烈 清 洗 对 于 除 去 剩 余 的 未 结 合 的 SBP-CDCP1-ECD、 SBP-CDCP1-Short1 和 SBP-CDCP1-Short5 是必需的。
使用 ELISA 的封闭试剂 (Roche 11112589)250μl/ 孔通过实施一小时封闭步骤来 封闭经包被的孔。
使用 1 ∶ 500 稀释来测试抗 CDCP1 抗体 CUB4( 保藏号 DSM ACC2551) 和 CDCP1_004、 CDCP1_012 和 CDCP1_015( 在 50μl 含有 1 ％ BSA 级分 V， SigmaA3059 的 PBS 中稀释的 0， 1μg 抗体 )。于室温将每孔 50μl 每种样品温育 60 分钟。使用 PBS-T(PBS 中的 0， 05 ％ Tween 20， Fluka#08057) 强 烈 清 洗 后， 添 加 50μl 与 HRP 偶 联 的 山 羊 抗 小 鼠 IgG 抗 体 (BioRad#1706516， 稀释 1 ∶ 1000)， 并将其于室温温育 1 小时。强烈清洗后， 用 BM 蓝 POD 底 物 (Roche 11484281001)50μl 检测抗体的结合。使用标准的光度计来测量 370nm/492nm 的吸光度。
抗体 CDCP1-004、 CDCP1-012、 CDCP1-015 和 CUB4 的结合区位于 CDCP1 胞外域中的 aa 1 和 216 内。因此， 所有这些抗体也识别 CDCP1 的完整 ECD 和含有 aa 1-361 的构建体 (Short 5)( 参见图 4)。
实施例 4
在 MDAMB-231 或 HCT 116 细胞中刺激 CDCP1 内在化和磷酸化
将 每 6 孔 7x105 个 MDAMB-231 细 胞 在 DMEM+L- 谷 氨 酰 胺 + 丙 酮 酸 盐 (Gibco， 41966)10 ％ FCS(PAN Biotech ID-No 3302-P251116)1 ％ MEM 非 必 需 氨 基 酸 (PAA， P0832100) 中培养过夜。将 MDA-MB-231 细胞用 10μg/ 不同抗体处理 10 分钟和 5 小时 ： 小 鼠 CUB4( 保藏号 DSMACC2551) 和抗体 CDCP1_004、 CDCP1_012 和 CDCP1_015。将 HCT 116 细 胞用 20μg/ 不同抗体处理 10 分钟和 5 小时 ： 小鼠 CUB4( 保藏号 DSM ACC2551)、 小鼠 CUB1 和小鼠 CUB3。用冰冷的新鲜制备的 RIPA 裂解缓冲液 (Thermo Scientific， #89901)( 其含 有乙醇中的 1mM PMSF、 10μg/ml 抑肽酶、 0， 4mM 原钒酸盐 ) 裂解细胞。在冰上 15 分钟后， 将 细胞溶胞物以 13000rpm 离心 20 分钟。通过标准的方案在 SDS-PAGE 上分开溶胞物， 并通过 Western 印迹将其转移至硝酸纤维素。通过抗 CDCP1 抗体 (Cell Signaling#4115)、 抗磷酸 CDCP1 抗体或 PY 4G10( 在 HCT116 的情况中 ) 检测 Western 印迹。
未处理的 HCT116 细胞中存在的 CDCP1 的磷酸化水平在时间点 10 分钟或 5 小时时 是不变的。与 CUB1 相比， CUB4 在细胞温育 10 分钟后介导更强的 CDCP1 磷酸化。与 CUB1 相比， CUB4 对磷酸化的抑制和对 CDCP1 的下调 ( 数据未显示 ) 明显得多。CUB3 温育导致对 CDCP1 磷酸化的刺激较弱， 而且不能介导蛋白质的下调 ( 数据未显示 )。图 5a 和 b 中显示 了结果。
未处理的 MDA-MB231 细胞中存在的 CDCP1 的表达水平在时间点 10 分钟或 5 小时 时是不变的。CUB4 温育及细胞与 CDCP1-004、 CDCP1-012 和 CDCP1-0015 抗体一起温育 5 小 时至少导致对 CDCP1 蛋白的部分降解。CDCP1 的磷酸化难以在未处理的细胞中检出。用 CUB4 或抗体 CDCP1-004、 CDCP1-012 和 CDCP1-0015 将细胞处理 10 分钟导致酪氨酸 734 上 的 CDCP1 磷酸化升高。用这些抗体处理 5 小时后， 由于 CDCP1 下调， CDCP1 中的酪氨酸 734 磷酸化几乎不能检出。图 6a 至 c 中显示了结果。19CN 102481366 A
序列表1/21 页
20CN 102481366 A序列表2/21 页
21CN 102481366 A序列表3/21 页
22CN 102481366 A序列表4/21 页
23CN 102481366 A序列表5/21 页
24CN 102481366 A序列表6/21 页
25CN 102481366 A序列表7/21 页
26CN 102481366 A序列表8/21 页
27CN 102481366 A序列表9/21 页
28CN 102481366 A序列表10/21 页
29CN 102481366 A序列表11/21 页
30CN 102481366 A序列表12/21 页
31CN 102481366 A序列表13/21 页
32CN 102481366 A序列表14/21 页
33CN 102481366 A序列表15/21 页
34CN 102481366 A序列表16/21 页
35CN 102481366 A序列表17/21 页
36CN 102481366 A序列表18/21 页
37CN 102481366 A序列表19/21 页
38CN 102481366 A序列表20/21 页
39CN 102481366 A序列表21/21 页