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具有增强稳定性和生存力的包被的脱水微生物
    【技术领域】
     本发明涉及具有增强的稳定性和生存力的包被的脱水微生物。背景技术 冻干方法经常被用于保存微生物。事实上， 冻干方法的低操作温度会导致微生物 有小的损伤。而且， 本领域内已知低储存温度可能是维持这种冻干细胞的生存力和稳定性 的关键因素。本领域内还已知， 在保护剂存在情况下冻干的细胞比不添加所述保护剂情况 下冻干的细胞更适于保持其生存力和稳定性。例如， US6,919,172(Wisconsin Alumni 研 究基金 ) 涉及在生物介质进行至少一种保存处理 ( 例如冷冻、 冻干、 真空干燥或喷雾干燥 ) 前， 将保护混合物 ( 即蔗糖和磷酸钾 ) 与生物材料混合以形成保存介质的用途。在进行保 存处理后， 当在室温干燥条件下储存时， 该生物材料能保持稳定。然而， 在密封容器中运输 及储存过程中保存以提供增强稳定性的 US 6,919,172 的益生微生物通常不能耐受同时的 高温和 / 或高湿条件， 这些条件通常在饲料产品、 食物产品 ( 例如谷物、 营养棒、 调制奶酪、 婴儿配方食品 )、 消费者保健产品 ( 包括膳食补充剂、 保健营养品、 非处方产品 ) 以及农产品 所使用的长期储存和二次处理中遇到。事实上， 有活力的微生物经常被热和 / 或湿汽和 / 或其它处理条件或储存条件灭活， 从而在储存和 / 或消费过程中随时间降低其在最终产品 中的生存力， 使得包含微生物的最终产品的预期效果最终丧失。
     为了克服这个问题， 已经开发了许多用于微生物的包被方法以保护其对抗如高温 和高湿水平的不利因素。这些包被方法通常基于如脂肪或低渗透性聚合物的包被材料， 比如虫胶和羟丙基甲基纤维素 (HPMC)。例如， US 7,157,258(Lallemand) 涉及用熔点高 于 60℃的疏水性屏障 ( 如脂肪和蜡 ) 来包被脱水的微生物， 而 EP 1753440B1(Merck)、 US 6,365,148(Il Yang Pharm Co.Ltd.) 和 EP 0778778B1(University New South Wales) 则 使用如 HPMC 或淀粉的聚合物屏障。这些防潮屏障旨在通过防止或延迟水进入包被层而提 供对脱水微生物的保护， 从而避免湿汽扩散进入下层的脱水微生物。如果包被层允许湿汽 通过， 那么脱水微生物可能吸收水分， 因此改变其生存力。
     然而， 申请人制备了以常用的化合物如脂肪、 虫胶或 HPMC 包被的脱水微生物， 并 注意到含有这种微生物的产品的生存力并没有充分地得到保持。事实上， 正如在本专利申 请的结果部分 ( 特别是实施例 4， 表 5 和实施例 7， 表 8) 中可以看到的， 与未包被脱水微生 物相比， 现有技术中用于包被微生物的材料既没有增加微生物的热稳定性， 在中等或高湿 度环境中也没有提供较长时间内的增强的生存力。
     因此， 尽管有上述教导， 本领域仍然存在对包被脱水微生物的需求， 藉此微生物能 够在制备期间及制备后保持其大部分活性， 并且能够抵御例如在用于饲料 / 食物产品、 消 费者保健产品或农产品制备的二级处理或这些产品长期储存期间所遇到的损伤条件 ( 其 中所述处理 / 长期储存通常涉及高温和 / 或高湿的组合 )， 因此符合了对于具有改进稳定性 的脱水微生物的普遍追求但当前仍未满足的需求。
     发明简述
     申请人惊异地发现加入至少一个包裹脱水微生物的吸湿盐层能提高这些脱水微 生物的存活率 ( 即生存力 )， 尤其在高湿和 / 或高温条件下。事实上， 鉴于本领域技术人员 通常使用疏水性 ( 例如脂肪 )、 低渗透性化合物 ( 例如虫胶或 HPMC) 或非吸湿盐作为包被层 以防止吸湿， 申请人惊异地发现包含吸湿盐的至少一个包被层能使得在高湿和 / 或高温条 件下处理和储存脱水微生物而不改变微生物生存力。
     因此本发明特别涉及一种包被的脱水微生物， 其包含被至少一个包被层包裹的脱 水微生物， 所述包被层包含按干重计为至少 25％的下文定义的吸湿盐或其混合物， 且其中 包被层的 pH 与包被脱水微生物的生存力相容。因此本发明的 “至少一个包被层” 是 “至少 一个吸湿盐包被层” 。
     包被层也可以包含按干重计为 0 至 60％的至少一种非吸湿盐。
     可选择地， 包被层可包含其它成分， 比如多羟基化合物、 抗粘剂、 具有保健和 / 或营养益处的化合物 ( 抗氧化剂、 维生素、 矿物质、 益生元、 多肽、 蛋白质、 ...)、 水胶体 (hydrocolloids)、 填充剂、 润滑剂、 粘合剂、 酸、 碱、 疏水物质、 聚合物及其混合物。 这些其他 任选成分的量优选按干重计为 0 至 70％。
     因此本发明特别涉及包被的脱水微生物， 其包含被至少一个包被层包裹的脱水微 生物， 所述包被层包含按干重计为 ：
     - 至少 25％的吸湿盐或其混合物，
     -0 至 60％的非吸湿盐或其混合物，
     -0 至 70％的其它任选成分，
     并且其中包被层的 pH 与包被脱水微生物的生存力相容。
     本发明的一层或多层的吸湿盐包被层 ( 分别命名为 “第一吸湿盐包被层” “第二吸 、 湿盐包被层” ...) 可以相同或不同的组成用于包被脱水微生物。因此本发明特别地涉及包 被的脱水微生物， 其包含由本发明定义的至少一个、 或至少两个、 或至少三个、 或至少四个 包被层包裹的脱水微生物。也可以增加包裹吸湿盐包被层的一个或多个外包被层 ( 分别命 名为 “第一外包被层” 、 “第二外包被层” ...)。这些任选的外包被层可以包含常规化合物如 脂肪 ； 脂肪酸 ( 例如硬脂酸 ) ； 乳化剂 ( 如单和双甘油酯 ) ； 油； 蜡； 树脂 ； 低渗透性聚合物 ( 例如虫胶、 sepiflm、 聚乙烯吡咯烷酮、 聚乙二醇 ) ； 水胶体 ( 例如角叉菜胶、 藻酸盐或阿拉 伯树胶或黄原胶或瓜尔胶 ) ； 可作为来源于土豆、 玉米、 乳清、 稻、 马铃薯、 木薯的天然或改 性淀粉使用的淀粉 ； 环糊精 ； 多元醇 ( 例如甘露醇 ) ； 纤维素和纤维素衍生物 (HPMC、 纤维素 酯、 纤维素醚 ) 及其混合物。
     外包被层可用于为脱水微生物提供进一步的抗性， 尤其是保护以使其免受胃和 / 或氧化环境和 / 或具有不利的 pH 条件的灭活。这些层也可以为包被脱水微生物提供增强 的机械抗性、 增强的对蒸汽处理的抗性或增强的操作性能 ( 例如改良的固体流动性 )。
     已经显示， 本发明的包被层提供了对用于食品、 饲料、 消费者保健产品或农产品的 制备的二次处理期间灭活的增强的抗性， 和 / 或提供了食品、 饲料、 消费者保健产品和农产 品所需的长期储存稳定性。
     因此， 本发明的包被脱水微生物可用于功能性食品、 饲料产品、 消费者保健产品和 农产品中。预期这种新技术增加关键脱水微生物， 尤其是关键益生微生物和直接饲喂微生 物的销售， 因为它符合了使得在如食品、 饲料、 消费者保健产品和农产品的新的应用 ( 其中目前商业化的冻干微生物缺乏长期和加工稳定性 ) 中能够使用脱水微生物的所追求的市 场需求。
     所有引用的参考文献以引用方式并入。
     定义
     本发明所用的术语 “包被层” 是指在液体包被组合物施加并干燥后包裹脱水微生 物的任何层 ( 或包被的层 )。
     包被层的组分量以百分比表示， 其是干重百分比 ( 干重 wt％ )， 而且是相对于包被 层本身 ( 不是相对于包被的脱水微生物 )。所述百分比包括任何结合的结晶水。
     在本发明中， 术语 “盐” 也包括水合盐。因此吸湿盐包括吸湿盐水合物， 且非吸湿 盐包括非吸湿盐水合物。
     “至少 25％的一种或多种吸湿盐” 的表述与 “至少 25％的吸湿盐及其混合物” 的表 述同义。这也意味着 ：
     - 至少 25％的单一吸湿盐 ； 或
     - 至少 25％的数种吸湿盐的混合物 ( 例如至少 20％的第一种吸湿盐 + 至少 5％的 另一种吸湿盐 )。 本申请中后面提及的其它优选的百分比作同样的解释。
     “吸湿性是物质从空气中吸收水分的倾向” 。吸湿解读为 “( 物质 ) 倾向于从空气 中吸收水分” (《牛津英语词典》 )。
     吸湿性可由这两个参数来表征 ： (a) 保水能力 (MHC) 以及 (b) 吸湿速率 (MUR)。
     吸湿性可以定义为材料可以吸收的水的相对量。因此， 保水能力 (MHC) 是当暴露 于给定的相对湿度时材料可以吸收的水的平衡量。 “空气相对湿度 (RH) 是水蒸气分压与该 温度下其蒸汽压的比值” (Atkins， Physical Chemistry， OUP， 1978， p199)。在本申请中， 保 水能力 (MHC) 是指当暴露于受控相对湿度的环境时， 基于重量分析的包被层或包被脱水微 生物所吸收水分的平衡量。它可以通过记录包被层或包被脱水微生物的重量增加 ( 直到观 察不到进一步的重量增加 ) 而测定。
     MHC 可以基于暴露于水分前的初始材料， 以体积 ( 单位为 mg/cm3) 或重量 ( 重量 百分比 (％ w/w)) 来表示。重要的是， 要注意 MHC 可能取决于材料的暴露表面积的量和厚 度。MHC 可以根据 Sharma 和 Patel 所述的公式进一步分析″ study and evaluation of hygroscopic behaviour of phosphatic fertilizers″ IFA Technical Conference， 1-4 October 2000， New Orleans， Louisiana， USA ：
     MHC ＝ MA/MP， 其中 ：
     MA ＝水分吸收量 (mg/cm2)， 多少水分被吸收进材料的给定表面积中的量度 (mg/ 2 cm ) ； 以及
     MP ＝水分渗透量 (cm)， 水分渗透深度的量度。
     (b) 吸湿速率 (MUR) ：
     盐的吸湿性可以用 MUR 测定 (″ Additive to biological substances.III.The moisture content and moisture uptake of commonly used carrier agents undergoing processing conditions similar to those used in the preparation of international biological standards″， E Tarelli 等， Journal of Biological Standardization， 1987，
     15， 331-340)。吸湿性也有动力学因素 (kinetic dimension)。吸湿速率 (MUR) 是每单位 时间的 MHC， 对于特定％ RH， 在特定温度下和对于特定时间长度测量， 在数小时或数天内测 定。在本发明中， 在 25℃、 75％ RH 下 7 天后的 MUR 最少为 20％ w/w 的盐将被视为吸湿盐， 而在 25℃、 75％ RH 下 7 天后的 MUR 小于 20％ w/w 的盐将被视为非吸湿盐。实施例 9 给出 了 MUR 测定的详细方案。可以理解的是盐的 MUR 以及因此其吸湿或非吸湿的性质取决于其 进行测量的大气条件 ( 尤其是温度或％ RH)。本申请中提供的吸湿或非吸湿盐的定义限制 为如下特定条件 ： 盐在 25℃、 75％ RH 下储存 7 天后。例如在文献中， 取决于环境湿度和温 度， 硫酸钠有时被称为吸湿盐， 而在其它时候称为非吸湿盐。在本发明中， 它被归类为非吸 湿盐， 因为在 25℃、 75％ RH 下 7 天后测定其 MUR 为小于 20％ w/w。在其他文献或专利中， 它 可能被视为吸湿盐， 例如当 MUR 在更高％ RH 下测定时。.
     因此， 如本发明所使用的， 吸湿盐必须被理解为在 25℃、 75％ RH 下 7 天后的 MUR 为 至少 20％ w/w 的无机或有机盐 ( 包括水合盐 )。吸湿盐之间的吸湿度差异很大 ( 也就是说 某些盐与其它盐相比吸湿性很高 )。
     优选本发明的吸湿盐在 25℃、 75％ RH 下 7 天后的 MUR 为至少 30％ w/w， 更优选在 25℃、 75％ RH 下 7 天后的 MUR 为至少 40％ w/w， 更优选在 25℃、 75％ RH 下 7 天后的 MUR 为 至少 50％ w/w， 甚至更优选在 25℃、 75％ RH 下 7 天后的 MUR 为至少 60％ w/w。 本发明的吸湿盐的一些实例为磷酸氢二钾 (K2HPO4)、 无水磷酸氢二钠 (Na2HPO4)、 六偏磷酸钠 (NaPO3)6、 无水醋酸钠 (CH3COONa)、 硝酸镁 (Mg(NO3)2)、 溴化钙 (CaBr)、 溴化 锂 (LiBr)、 氯化钙 (CaCl2)、 氯化镁 (MgCl2)、 氯化锂 (LiCl)、 五氧化二磷 (P4O10)、 二水合磷 酸氢二钠 (Na2HPO4-2H2O)、 七水合磷酸氢二钠 (Na2HPO4-7H2O)、 醋酸铵 (CH3COONH3)、 醋酸钙 (CH3COO)2Ca、 醋酸钾 (CH3COOK)、 碳酸钾 (K2CO3)、 碳酸钠 (Na2CO3)、 甲酸钠 (NaCHO2)、 一水合 柠檬酸钾 (K3C6H5O7·H2O)、 五水合柠檬酸钠 (C6H5Na3O7·5H2O) 及其混合物。
     例如 ：
     K2HPO4 在 25℃、 75％ RH 下 7 天后的 MUR 为 45.6％ w/w，
     K2CO3 在 25℃、 75％ RH 下 7 天后的 MUR 为 50.7％，
     MgCl2 在 25℃、 75％ RH 下 7 天后的 MUR 为 53.7％。
     另外， “吸湿盐或其混合物” 的表述包括以下两个方面 ：
     (a) 一种或多种盐起初是吸湿的 ( 本身 )， 也就是说在施加到脱水的包被微生物上 之前是吸湿的， 因此， 该一种盐 / 多种盐在 25℃、 75％ RH 下 7 天后的 MUR 为至少 20％ w/w ； 和/或
     (b) 一种或多种盐起初是非吸湿的， 但是在施加到脱水微生物上时 ( 即， 在处理 时 ) 它 / 它们变得吸湿。 换句话说， 在施加到脱水微生物上之前， 该一种盐 / 多种盐在 25℃、 75％ RH 下 7 天后不具有为至少 20％ w/w 的 MUR， 但是在包被层施加到微生物时， 该一种盐 / 多种盐在 25℃、 75％ RH 下 7 天后的 MUR 为至少 20％ w/w。例如， 在样品 28 中令人惊讶地 显示出， 将一定量的 NaOH 加入如 KH2PO4 的非吸湿盐而由 KH2PO4 和 NaOH 的反应提供了包含 吸湿盐的合适的包被层 ( 这种盐的非吸湿性质的改变， 产生了吸湿的盐 )。
     因此， 所述吸湿盐本身是吸湿的盐和 / 或在施加到脱水微生物上后变为吸湿盐。
     另外， 材料本身、 施加包被层时的温度、 湿度和干燥条件将影响包被层的 “水化 度” ， 从而影响包被层中盐的吸湿性。
     如此处所使用， 本发明的非吸湿盐是在 25 ℃、 75 ％ RH 下 7 天后的 MUR 低于 20 ％ w/w 的有机或无机盐 ( 包括水合盐 )。本发明的非吸湿盐优选在 25℃、 75％ RH 下 7 天后的 MUR 低于 10％ w/w， 更优选低于 5％ w/w。
     本 发 明 的 非 吸 湿 盐 的 实 例 为 磷 酸 二 氢 钾 (KH2PO4)、三 水 合 醋 酸 钠 (CH3COONa·3H2O)、 二水合硫酸钙 (CaSO3·2H2O)、 硫酸钠 (Na2SO4)、 硫酸镁 (MgSO4)、 硫酸钾 (K2SO4)、 氯化钠 (NaCl)、 氯化钾 (KCl)、 碳酸钙 (CaCO3)、 乳酸钙 ((CH3CHOHCOO)2Ca)、 四水合 柠檬酸钙 ((Ca3C6H5O7)2·4H2O)、 二水合柠檬酸钠 (HOC(COONa)(CH2COONa)2·2H2O) 及其混合 物。
     在本申请中， 包被层的 pH“与包被的脱水微生物的生存力相容” 是指以不改变微 生物生存力的方式选择 pH。它随菌株而变化， 但它通常为 5.5 到 7.9， 优选 6 到 7.5。在本 发明的含义中， 该 pH 是指在本发明的包被的脱水微生物以 10wt％的量悬浮于水中后测定 的 pH。
     在本申请中， “最终产物” 是指引入本发明的包被脱水微生物的食物产品、 饲料产 品、 消费者保健产品或农产品。
     发明详述 发明人惊异地发现包被层中足量的特定盐， 即吸湿盐的存在导致包被的脱水微生 物生存力的增加。不希望被理论束缚， 发明人推测该包被层获得的微生物稳定效应取决于 包被层吸湿的能力， 这与易吸收水分的吸湿盐的存在直接相关。 另外， 当进行处理以包被脱 水微生物时， 包含这种吸湿盐的吸湿盐层可以采用无定形或部分无定形 ( 半晶体 ) 状态的 形式， 这允许水分增强扩散和 / 或更大量水分吸收进入包被层体相中。发明人已经表明当 包被层在处理 ( 即施加到脱水微生物上 ) 时为无定形或非完全晶体时， 其吸湿能力和 / 或 其吸湿速率显著更高， 并且令人惊讶的是生存力相比于显示低吸湿性的包被层增强。
     因此本发明特别涉及包被的脱水微生物， 其包含被至少一个包被层包裹的脱水微 生物， 所述包被层包含按干重计为至少 25％的吸湿盐或其混合物， 其中包被层的 pH 与包被 脱水微生物的生存力相容。
     本发明也涉及包被的脱水微生物， 其由被至少一个包被层包裹的脱水微生物组 成， 所述包被层包含按干重计为至少 25％的吸湿盐或其混合物， 其中包被层的 pH 与包被脱 水微生物的生存力相容。
     优选地， 包被层包含按干重计为至少 28％的吸湿盐或吸湿盐的混合物， 更优选至 少 30％， 更优选至少 40％， 更优选至少 50％， 更优选至少 60％， 更优选至少 70％， 更优选至 少 80％的吸湿盐或吸湿盐的混合物。
     在特定实施方式中， 包被层由按干重计为 100％的吸湿盐或吸湿盐的混合物组成。
     在一个实施方式中， 本发明包被层的吸湿盐选自于包括磷酸氢二钾 (K2HPO4)、 无水 磷酸氢二钠 (Na2HPO4)、 六偏磷酸钠 (NaPO3)6、 无水醋酸钠 (CH3COONa)、 硝酸镁 (Mg(NO3)2)、 溴化钙 (CaBr)、 溴化锂 (LiBr)、 氯化钙 (CaCl2)、 氯化镁 (MgCl2)、 氯化锂 (LiCl)、 五氧化二 磷 (P4O10)、 二水合磷酸氢二钠 (Na2HPO4-2H2O)、 七水合磷酸氢二钠 (Na2HPO4-7H2O)、 醋酸铵 (CH3COONH3)、 醋酸钙 (CH3COO)2Ca、 醋酸钾 (CH3COOK)、 碳酸钾 (K2CO3)、 碳酸钠 (Na2CO3)、 甲酸 钠 (NaCHO2)、 一水合柠檬酸钾 (K3C6H5O7·H2O)、 五水合柠檬酸钠 (C6H5Na3O7·5H2O) 及其混合 物或由其组成的组。
     氯化镁 (MgCl2) 和磷酸氢二钾 (K2HPO4) 是优选的吸湿盐， 磷酸氢二钾 (K2HPO4) 是 最优选的吸湿盐。因此， 在一个特定实施方式中， 脱水微生物被至少一个包被层所包裹， 所 述包被层包含 K2HPO4 作为吸湿盐或包含包括 K2HPO4 的吸湿盐的混合物。
     在特定实施方式中， 脱水微生物被包含 MgCl2 的至少一个包被层所包裹。在特定 实施方式中， 脱水微生物被由 MgCl2 组成的至少一个包被层所包裹 ( 表 1 的样品 25)。
     在特定实施方式中， 包被层包含至少两种吸湿盐的混合物。
     重要的是， 包被层的 pH 与包被脱水微生物的生存力相容。用于包被本发明脱水微 生物的合适 pH 可以通过几种方法获得。取决于选择用于制备本发明包被层的化合物的性 质， 包被层的 pH 可以很容易地与微生物的生存力相容。例如， 制备由中性吸湿盐组成的包 被层可以得到适合的 pH。在那种情况下， 不需要调节包被层的 pH。
     由于一些材料比其它材料的酸性更强， 可以通过合适地组合包被层的化合物而获 得相容的 pH。
     或者， 可以通过将标准碱 ( 例如 NaOH、 KOH) 或酸 ( 例如乳酸 ) 加入包被层溶液中 来调节 pH。例如， 欲制备含 K2HPO4 作为吸湿盐的包被层的人可以加入如乳酸的酸以降低所 得包被层的 pH， 因为 K2HPO4 是弱碱性盐。他也可以通过加入一定比例量的 KH2PO4 和 K2HPO4 而制备混合物以降低所得包被层的 pH( 因为 KH2PO4 的酸性 )。
     因此在特定实施方式中， 脱水微生物被包含至少 K2HPO4 和至少一种酸的至少一个 包被层所包裹。在另一个特定实施方式中， 包被层包含至少 K2HPO4 和 KH2PO4。
     与包被的脱水微生物生存力相容的 pH 根据菌株不同而变化， 但它通常应为 5.5 到 7.9， 优选 6 到 7.5。根据其组成， 在包被层施加到脱水微生物上的过程中、 包被的脱水微生 物在干燥条件下储存的过程中、 将包被脱水微生物加入最终产物和储存期间以及在微生物 复水之后， 本发明的包被层具有适于增强微生物生存力的 pH 值。通常， 当以 10wt％的量再 溶解 / 重悬于水中时， 本发明的包被的脱水微生物提供了 pH 为 5.5 至 7.9 的溶液 / 悬浮液。
     包被层也可以包含按干重计为 0 至 60％的非吸湿盐或其混合物。 在特定实施方式 中， 包被层包含 5％至 60％， 优选 10％至 60％， 优选 15％至 50％， 更优选 20 至 35％的非吸 湿盐或其混合物。在特定实施方式中， 包被层包含小于 50％， 或小于 40％， 或小于 30％， 或 小于 20％， 或小于 10％或小于 5％的非吸湿盐或其混合物。
     在一个实施方式中， 本发明包被层的非吸湿盐选自于包括磷酸二氢钾 (KH2PO4)、 三 水 合 醋 酸 钠 (CH3COONa·3H2O)、 二 水 合 硫 酸 钙 (CaSO3·2H2O)、 硫 酸 钠 (Na2SO4)、 硫 酸 镁 (MgSO4)、 硫 酸 钾 (K2SO4)、 氯 化 钠 (NaCl)、 氯 化 钾 (KCl)、 碳 酸 钙 (CaCO3)、 乳酸钙 ((CH3CHOHCOO)2Ca)、 四水合柠檬酸钙 ((Ca3C6H5O7)2·4H2O)、 二水合柠檬酸钠 (HOC(COONa) (CH2COONa)2·2H2O) 及其混合物或由其组成的组， 磷酸二氢钾 (KH2PO4) 是最优选的非吸湿 盐。
     在一个实施方式中， 包被层包含磷酸二氢钾 (KH2PO4)。
     在特定实施方式中， 本发明包被层包含至少一种吸湿盐和至少一种非吸湿盐的混 合物。在特定实施方式中， 脱水微生物被至少一个包含磷酸氢二钾 (K2HPO4) 和磷酸二氢 钾 (KH2PO4) 的包被层所包裹。在特定实施方式中， 脱水微生物被至少一个由磷酸氢二钾 (K2HPO4) 和磷酸二氢钾 (KH2PO4) 组成的包被层所包裹。 在特定实施方式中， 包被层包含磷酸 氢二钾 (K2HPO4) 和三水合醋酸钠 (CH3COONa· 3H2O)。它们的比例可以是 1 ∶ 99 至 99 ∶ 1。它们可以等摩尔比例存在。
     任选地， 包被层可包含其它成分， 比如多羟基化合物、 抗粘剂、 具有保健和 / 或营 养益处的化合物 ( 抗氧化剂、 维生素、 矿物质、 益生元、 多肽、 蛋白质 ...)、 水胶体、 填充剂、 润滑剂、 粘合剂、 酸、 碱、 疏水物质、 聚合物及其混合物。这些其他任选成分的量优选为按干 重计 0 至 70％， 更优选 10％至 60％， 甚至更优选 17 至 40％。
     这些任选组分可以用于改善包被层的可加工性 ( 即施加到脱水微生物上 )。例如 滑石和淀粉 ( 乳清淀粉、 大米淀粉 ) 是可用作包被层的抗粘剂的惰性成分。这些任选成分 也可以用于为最终产物带来另外的益处 / 效果 ( 例如补充维生素 )。它们也可以用于将包 被层的 pH 调节至 “与包被的脱水微生物的生存力相容” 的值。
     “多羟基化合物” 通常选自于糖类、 碳水化合物、 聚醇 ( 或多元醇 )、 其衍生物和其 混合物。甘露醇可以作为多元醇的一个实例。糖可以是天然和合成的单糖和多糖。多糖是 指含两个或更多个单糖单元的糖。淀粉和改性淀粉可以作为多糖的实例。
     单个多羟基化合物可以单独使用或与其它类型的多羟基化合物组合使用。在种 类广泛的可用的多羟基化合物中， 优选使用单糖和多糖或如糊精的淀粉水解产物及其混合 物。在本发明中， 优选使用如麦芽糖、 乳糖和蔗糖的双糖， 最优选蔗糖。 依照本发明可使用的 “抗粘剂” ( 也被称为 “抗粘结剂” 或 “抗结块剂” ) 包括滑石、 二氧化硅 ( 沉淀或煅制二氧化硅 )、 淀粉 ( 包括来源于土豆、 玉米、 乳清、 大米、 马铃薯的天然 淀粉 )。滑石和大米淀粉是最优选的试剂之一。
     本发明的包被层可以包含具有保健和 / 或营养益处的化合物， 如抗氧化剂、 维生 素、 矿物质、 益生元、 多肽、 蛋白质 ...
     通常， 本发明的包被层可以包含的 “抗氧化剂” 可以选自于谷氨酸一钠、 抗坏血酸 ( 维生素 C)、 乳糖酸、 叔丁基氢醌、 谷胱甘肽、 没食子酸丙酯、 抗坏血酸棕榈酸酯、 α- 生育酚 ( 维生素 E)、 多酚、 过氧化氢酶、 葡萄糖氧化酶、 EDTA。
     “益生元” 被定义为通过选择性地刺激一种或有限数目的有益细菌的生长和 / 或 活性而对宿主产生有益影响的非消化性食物成分。益生元通常为在上消化道不被降解或 吸收的非消化性碳水化合物 ( 寡糖或多糖 ) 或糖醇。市售产品中使用的并根据本发明有 用的已知益生元包括菊粉 ( 果寡糖或 FOS) 和反式半乳寡糖 (GOS 或 TOS)。其它适宜的益 生元包括帕拉金糖寡糖 (palatinoseoligosaccharides)、 大豆寡糖、 龙胆寡糖、 木糖寡聚体 (xylooligomer)、 非可降解淀粉、 乳蔗糖 (lactosaccharose)、 乳果糖、 乳糖醇、 麦芽糖醇、 葡 聚糖 ( 即 ) 等等。
     通常， “肽” 是一般含有少于 50 个氨基酸的化合物。肽可以是寡肽 (10 个氨基酸或 更少 ) 或多肽 ( 多于 10 个氨基酸 )。
     “蛋白质” 是一般包含多于 100 个氨基酸的化合物。作为蛋白质的实例， 我们可以 提到成膜蛋白， 如乳清蛋白、 酪蛋白酸盐、 酪蛋白和球蛋白。 在特定实施方式中， 蛋白质是非 酶性蛋白。
     通常， 本发明的包被层中可以包含的 “填充剂” 选自于滑石和二氧化硅 ( 沉淀或煅 制二氧化硅 )。
     通常， 可以特别地加入 “酸” 和 “碱” 以获得与本发明的包被脱水微生物的生存力 相容的 pH。在可以使用的种类广泛的酸和碱中， 优选乳酸、 氢氧化钠和氢氧化铵。
     通常， 本发明的包被层中可以包含的 “润滑剂” 选自于硬脂酸镁和丙二醇。
     通常， 本发明的包被层中可以包含的 “水胶体” 是角叉菜胶、 藻酸盐或阿拉伯树胶 或黄原胶、 瓜尔胶。
     通常， 本发明的包被层中可以包含的 “粘合剂” 可以是例如麦芽糊精。
     通常， 本发明的包被层中可以包含的 “疏水物质” 选自于脂肪、 脂肪酸、 如单和双甘 油酯的乳化剂、 油、 蜡 ...
     通常， 本发明的包被层中可以包含的 “聚合物” 的部分实例是来源于土豆、 玉米、 乳 清、 大米、 马铃薯、 木薯的天然或改性淀粉 ； 环糊精 ； 纤维素和纤维素衍生物 ( 纤维素酯、 纤 维素醚 ) ； 低渗透性聚合物 ( 例如虫胶、 HPMC、 聚乙烯吡咯烷酮、 聚乙二醇 )。
     因此在特定实施方式中， 本发明特别地涉及包被的脱水微生物， 其包含被至少一 个包被层包裹的脱水微生物， 所述包被层包括按干重计为 ：
     - 至少 25％的吸湿盐或其混合物，
     -15％至 50％的非吸湿盐或其混合物和 / 或 10 至 60％的任选成分，
     并且其中包被层的 pH 与包被的脱水微生物的生存力相容。
     根据典型的实施方式， 包被层由 K2HPO4( 吸湿盐 ) 和 KH2PO4( 非吸湿盐 ) 组成。在 特定实施方式中， 包被层由 K2HPO4(50-85％ ) 和 KH2PO4(15-50％ ) 组成。在特定实施方式 中， K2HPO4 和 KH2PO4 为等摩尔的量 (50％ )。
     根据典型实施方式， 包被层包含或由 K2HPO4( 吸湿盐 ) 或含 K2HPO4 的盐混合物以 及任选成分 ( 滑石、 大米淀粉和 / 或蔗糖 ...) 组成。优选包被层为 K2HPO4(60-90wt ％干 重 ) 和滑石 (10-40wt％干重 )。本发明的尤其优选的包被层为 K2HPO4(83wt％干重 ) 和滑 石 (17wt％干重 )( 见表 1 的样品 27)。
     本发明的另一种尤其优选的包被层可以通过混合 KH2PO4( 非吸湿盐 ) 和 NaOH( 任 选成分 ) 而获得。加入 NaOH 使得可以将包被层的 pH 调节至 pH 6.5， 且它也可以与 KH2PO4 反应而令人惊讶地提供适宜的吸湿性包被层。非束缚于任何理论， 发明人相信 NaOH 的加入 改变了溶液中盐的平衡， 并且在施加到脱水微生物上时， KH2PO4 的非吸湿特性发生改变。例 如特定的包被层为 K2HPO4(83wt％干重 ) 和滑石 (17wt％干重 )( 见表 1 的样品 28)。
     磷酸的三个 pKa 值为 2.16、 7.21 和 12.32。因此， 对于低于 2.16 的 pH， 磷酸盐 将主要以 H3PO4 的形式存在于水性溶液中。对于 2.16 和 7.21 之间的 pH， 磷酸盐将主要以 H2PO4 的形式存在于水性溶液中。对于 7.21 和 12.32 之间的 pH， 磷酸盐将主要以 HPO4-- 的 形式存在于水性溶液中。pH 高于 12.32 时， 磷酸盐将主要以 PO4--- 的形式存在于水性溶液 中。
     至于样品 28(KH2PO4)， 磷酸盐将主要以 H2PO4- 的形式存在于溶液中。在用碱调节 pH 之前， 这一盐溶液的 pH 为 5( 见样品 16 的 pH 值， 表 20)。当碱加入 K2HPO4 中 时， 平衡从 H2PO4 的形式向形成 HPO4 的形式转变。* 因此， 通过加入碱 ( 或酸 ) 改变盐的 pH 可以显著 改变溶液中的磷酸盐形式。因此， 通过加入碱 ( 或酸 ) 改变盐的 pH 也可以因为溶液中磷酸 盐形式的改变而在处理时显著改变盐的吸湿性。 事实上， 我们知道 K2HPO4( 在溶液中主要为 HPO4 的形式 ) 在干燥状态下是吸湿盐， 而 KH2PO4( 在溶液中主要为 H2PO4- 的形式 ) 在干燥 状态下是非吸湿盐。事实上， 样品 28 进行的 pH 调节导致 HPO4- 形式的增加， 然后在处理后 这产生吸湿盐的包被层。 通过调节盐溶液的 pH， 处理后可以在包被层中获得吸湿盐， 即使在液体包被组合物中所用的盐初始为非吸湿性的。
     根据典型的实施方式， 包被层包含或由 K2HPO4( 吸湿盐 ) 和非吸湿盐 ( 三水合醋 酸钠、 KH2PO4...) 和至少一种任选成分 ( 滑石、 淀粉、 蔗糖 ...) 组成。本发明的尤其优选的 包被层为 K2HPO4(30wt％干重 )、 三水合醋酸钠 (30wt％干重 )、 蔗糖 (17wt％干重 ) 和滑石 (14wt％干重 )( 见表 1 的样品 26)。
     另一种优选包被层为 K2HPO4(25-65wt ％干重 )、 KH2PO4(15-50wt ％干重 ) 和滑石 (10-30wt％干重 )。本发明的特别优选的包被层为 K2HPO4(48wt％干重 )、 KH2PO4(35wt％干 重 ) 和滑石 (17wt％干重 )( 见表 1 的样品 10)。另一种尤其优选的包被层由 K2HPO4(63wt％ 干重 )、 KH2PO4(20wt％干重 ) 和滑石 (17wt％干重 ) 组成 ( 见表 1 的样品 22)。
     另一种特别的包被层由等摩尔量的 K2HPO4 和 KH2PO4 与滑石组成。
     根据另一个典型实施方式， 包被的脱水微生物包含被含有或由 K2HPO4( 吸湿盐 ) 和 KH2PO4( 非吸湿盐 ) 及几种任选成分 ( 例如蔗糖及滑石或淀粉 ) 组成的至少一个包被层包 裹的脱水微生物。优选的包被层为 K2HPO4(25-50wt％干重 )、 KH2PO4(20-40wt％干重 )、 蔗 糖 (10-30wt％干重 ) 和滑石 (10-30wt％干重 )， 更优选包被层为 K2HPO4(30-45wt％干重 )、 KH2PO4(25-35wt ％干重 )、 蔗糖 (15-25wt ％干重 ) 和滑石 (10-20wt ％干重 )。本发明的尤 其优选的包被层为 K2HPO4(40wt％干重 )、 KH2PO4(29wt％干重 )、 蔗糖 (17wt％干重 ) 和滑石 (14wt％干重 )( 见表 1 的样品 11)。
     发明人推测包被层的高 MHC 或高 MUR 是包被层中所含的吸湿盐的物理特性和包被 层的结构所导致的结果。事实上， 吸湿盐能够在不改变微生物生存力的情况下吸收或保留 包被的层中的水分， 这是令人惊讶的。当发明人制备包含被含有吸湿盐的至少一个包被层 包裹的脱水微生物的包被脱水微生物时， 他们发现含这种吸湿盐的这一包被层产生无定形 或部分无定形 ( 半晶体 ) 的状态， 尤其当使用导致包被层快速脱水的技术 ( 喷雾干燥或流 化床涂覆 ) 时。吸湿将取决于吸湿盐的量和性质以及最终包被层的结构。不希望被理论束 缚， 发明人假设这种无定形或部分无定形状态可以部分地解释增强的微生物生存力。事实 上发明人已经证明当包被层在被处理以获得干燥包被层时 (“在被处理时” 是指在施加到 脱水微生物上时 ) 不完全是晶体时， 其吸湿能力显著较高， 并且生存力相比于非吸湿性的 包被层令人惊讶地增强。 干燥状态的包被层赋予的益处与固体包被层可吸收的水分的量有 关， 对于无定形 ( 非晶体 ) 或对于部分无定形 ( 半晶体 ) 包被层来说， 该量较大。无定形或 部分无定形 ( 半晶体 ) 状态允许更多的水分吸收进入包被层体相中。包被层中无定形结构 的存在导致更高的 MUR 以及吸湿百分比的持续增加。相对低百分比的无定形材料可以将相 当大量的水分吸收入其结构中 (Encyclopedia of Pharma tech， 卷 6)。MUR 和 MHC 将取决 于吸湿盐的量和性质以及最终包被层的结构。
     发明人已经表明当包被层在处理时 ( 即施加到脱水微生物上时 ) 为无定形或非完 全晶体时， 其吸收水分的能力显著更大， 并且生存力相比于非吸湿性的包被层令人惊讶地 增强 ： 干燥状态的包被层所赋予的益处与固体包被层可以吸收的水分量有关， 且对于无定 形 ( 非晶体 ) 或部分无定形 ( 半晶体 ) 包被层来说， 该量较大。
     根据本发明， “晶体状态” 是指该状态的特征为具有长范围原子序列的完全有序的 晶格， 而 “非晶体” (或 “无定形” ) 状态的特征为不存在原子位置的长范围序列的无序晶格。 这代表两种极端晶格序列， 且中间状态是可能的。原则上， 假定在足够高的干燥状态下， 任何液体组合物都可以制成无定形固体。干燥降低了分子移动性。如果干燥速率比分子可组 织成热力学更有利的晶体状态的速率更快， 那么将会形成无定形固体。 相反， 如果分子具有 足够时间组织成具有二维或三维序列的结构， 那么将会形成晶体 ( 或半晶体 ) 固体。也可 以通过干扰初始组分的结晶能力的添加剂来产生无定形材料。
     当一种吸湿盐 / 多种吸湿盐以单独 / 共同或以与至少一种非吸湿盐和 / 或至少一 种其它任选成分的混合物形式使用使得能够快速脱水的技术如流化床涂覆处理时， 会产生 低结晶度的无序固体。这种 “低结晶度” 状态在干燥状态中具有有益的效果。事实上， 干燥 状态所赋予的益处与固体可以吸收的水分量有关， 对于表现无定形结构的包被层， 该量较 大。
     为了制备本发明的脱水包被微生物， 因此优选使用能获得产生部分或完全无定形 包被层的干燥固体的工艺。 例如， 流化床涂覆是制备包被脱水微生物的最优选技术之一， 因 为它导致快速脱水并且能产生无定形结构。
     在一个实施方式中， 在包被层被处理 ( 即包被层被施加到脱水微生物上 ) 时， 所述 存在于包被层中的盐 ( 吸湿盐和非吸湿盐 ) 具有最高达 60％， 优选最高达 50％， 更优选最 高达 40％， 甚至更优选最高达 30％的盐结晶度 ( 晶体形式盐的克数除以包被层的克数 )。
     包被层中存在的盐的结晶度在处理时的包被层上测定， 也就是说在液体包被组合 物施加到脱水微生物上并干燥之后。根据本发明， “结晶度” 的表述是指包被层中盐的分数 量， 表示为通常以结晶状态存在的质量百分比， 包被层中剩余的盐以无定形状态存在。
     结晶度可以用本领域技术人员已知的各种技术测定， 比如 i)X- 射线衍射 ( 见 Encyclopaedia of Pharmaceutical Technology， 2002) 或 ii) 等温差示扫描量热法 ( 等温 DSC)(Kedward， MacNaughtanm Blanchard and Mitchell， 1998)。
     当使用 X- 射线衍射 (XRD) 时， 化合物的每种晶体形式的 X- 射线衍射图是独 特的， 该技术广泛应用于固相的鉴定和表征。该技术也可以揭示化合物结晶性的差异。 无定形 ( 非晶体 ) 化合物的 XRD 图将由一个或多个宽扩散晕组成 (Encyclopaedia of Pharmaceutical Technology， 2002， 第 3005 页 )。
     根据本发明的结晶度也可以用 DSC( 差示扫描量热法 ) 测定。例如， 配备内容冷却 器的 Netzch DSC 204(Netzsch， 德国 ) 用于所有测定， 根据测试 A， 以 N2 为冲洗剂。测试 A 由下列实验方案构成 ： 称取 10mg 包被层样品， 立即气密封闭入铝制 DSC 盘中。 通过首先冷却 并将中样品在初始温度 -50℃下保持 2 分钟来进行扫描。 然后将样品以 12℃ min-1 从 -50℃ 加热至 330℃， 并在 330℃保持 3 分钟。在实施例 11 中使用该测试以表征通过流化床干燥 获得的包被层的无定形状态。如实施例 11 所述， 对与用于包被脱水微生物的同样条件下制 备的包被层本身进行测试。因此， 图 10-12 中所示的温谱图即为本发明包被层结构的特征。 包被层的盐的结晶度与下层脱水微生物的存在无关， 因为其各自由独立的层构成。
     也可以用其它合适的技术测定结晶度， 比如测量包被层对温度变化的响应的 TMA( 热机械分析 ) 技术， 并可以测定无定形结构的玻璃转化温度特征。该技术采用置于包 被层内的探针。
     根据特定实施方式， 包被层在 25 ℃和 75 ％相对湿度 (RH) 下 7 天后的吸湿速率 (MUR) 为至少 15％， 优选至少 20％， 优选至少 30％。
     根据特定实施方式， 包被的脱水微生物在 25℃， 75％相对湿度 (RH) 下 7 天后的吸湿速率为至少 8％。
     完成吸湿等温线来表征包被的脱水微生物的吸湿性。包被的脱水微生物 ( 或本发 明的包被层 ) 表现出含水量随相对湿度变化的强烈变化， 从而表明了很高的吸湿特性。另 外， 该图显示了含水量的持续增加， 这是无定形或部分无定形结构的特征。
     而且， 正如已提及的， 用确保快速干燥速率 ( 例如用流化床涂覆 ) 的方式来加工包 被层是有益的， 因为这防止了有序结构的产生， 从而导致了固溶体的形成。因此， 低晶体结 构是处理过程中相变的结果， 且不反映各单个盐的初始固体状态。包含至少 25％吸湿盐或 其混合物的部分结晶包被层具有明显更大的吸湿能力。令人惊讶的是， 如果 pH 与包被的脱 水微生物的生存力相容， 脱水微生物的生存力因这种增强的吸湿能力而提高。不希望被理 论所束缚， 发明人认为这种现象可能与在处理 ( 尤其当采用快速干燥技术时 ) 时包被层不 是完全晶体的事实部分相关。
     在特定实施方式中， 本发明的包被脱水微生物在制备后， 在干燥条件下储存期间 和最终使用前， 在密封条件下 15 ℃至 40 ℃储存长达 2 年时间的稳定性为最低 40 ％存活， 优选至少 50％存活， 优选至少 60％存活， 优选至少 70％存活， 优选至少 80％存活以及优选 90％存活。
     包含本发明的包被脱水微生物的最终产品 ( 例如在食物产品、 饲料产品、 消费者 保健产品或农产品中 ) 在储存数个月后 ( 例如储存 1 个月后， 甚至 2 个月后， 甚至 3 个月后， 甚至 5 个月后， 甚至 9 个月后， 甚至 12 个月后， 甚至 2 年后， 甚至更长 ...) 在预期应用中获 得高的有活力细菌的存活率， 尤其当储存于环境温度时 ( 例如， 从 15℃至 40℃， 尤其 20 至 35℃， 例如在 23℃或 30℃时 )， 且尤其当最终产物的水活性 (aw) 高于 0.10 时。因此， 本发 明的包被层是脱水微生物的稳定包被层。
     在特定实施方式中， 在 aw 高于 0.10 的饲料产品、 食物产品、 消费者保健产品或农 产品在 15℃至 40℃的温度下储存 12 个月后， 本发明的包被脱水微生物能够具有＜ 1.5LOG， 最优选＜ 1.0LOG， 最优选＜ 0.5LOG， 最优选＜ 0.2LOG 以及最优选＜ 0.1LOG 的生存力损失。
     生存力损失是在任何暴露之前和之后用 cfu( 集落形成单位 ) 测定的活细胞数的 减少。其通常用 LOG 表示。根据本发明， 术语 LOG 或 E 或 E 是指十进制对数， 即十的倍乘因 子。
     在另一种特定实施方式中， 在 aw 高于 0.10 的饲料产品、 食物产品、 消费者保健 产品或农产品于 15 ℃至 40 ℃的温度下储存 2 年后， 本发明的包被脱水微生物能够具有 ＜ 3LOG， 最优选＜ 1.5LOG， 最优选＜ 1.0LOG， 最优选＜ 0.5LOG 以及最优选＜ 0.2LOG 的生存 力损失。
     本发明的包被层是包裹并保护脱水微生物对抗湿汽和 / 或热的稳定包被层。本技 术可用于敏感的脱水微生物。 “敏感” 是指当暴露于高湿和 / 或高热时具有低生存力。这些 包被的脱水活微生物在压迫性条件和延长的储存期限 ( 例如至少 1 个月， 或至少 2 个月， 或 至少 5 个月或至少 12 个月或至少 2 年或甚至更长， 尤其当储存于环境温度时， 例如， 从 15℃ 至 40℃， 尤其 20-35℃， 例如在 23℃或 30℃， 尤其当最终产物的 aw 高于 0.10 时 ) 下具有增 加的存活率。 另外， 如果添加常规外包被层 ( 比如脂肪 ； 脂肪酸 ( 例如硬脂酸 ) ； 乳化剂 ( 如 单和双甘油酯 ) ； 油； 蜡； 树脂 ； 低渗透性聚合物 ( 例如虫胶、 sepifilm、 聚乙烯吡咯烷酮、 聚 乙二醇 ) ； 水胶体 ( 例如角叉菜胶、 藻酸盐或阿拉伯树胶或黄原胶或瓜尔胶 ) ； 可以来源于土豆、 玉米、 乳清、 大米、 马铃薯、 木薯的天然或改性淀粉使用的淀粉 ； 环糊精 ； 多元醇 ( 例如 甘露醇 ) ； 纤维素和纤维素衍生物 (HPMC、 纤维素酯、 纤维素醚 ) 及其混合物 )， 则包被的脱 水微生物， 尤其是包被的敏感脱水微生物， 将对胃肠道中对增强的生存力不利的 pH 和 / 或 氧化环境和 / 或对包括蒸汽处理的工艺更加耐受， 且它将保持其大部分活性。
     本发明提供的另一个优势是， 尽管使用吸湿盐， 获得的包被脱水微生物不会在环 境条件粘在一起。因此获得了具有增强生存力的脱水微生物的自由流动微粒。
     本发明的脱水微生物通常选自于酵母、 霉菌、 真菌、 细菌或其任意混合物。可以包 被一种或数种微生物。
     适用的酵母的实例为 ： 克鲁维酵母菌属的种 (Kluyveromyces spp)、 德巴利氏酵 母属的种 (Debaryomyces spp)、 耶罗威亚酵母属的种 (Yarrowia spp)、 拟威尔酵母属的种 (Williopsis spp)、 毕赤酵母属的种 (Pichia spp)、 酵母属的种 (Saccharomyces spp)。
     适用的真菌 / 霉菌的实例为 ： 青霉菌属的种 (Penicillium spp)、 地丝菌属的种 (Geotrichum spp)、 轮枝菌属的种 (Lecanicillium spp)、 单端孢霉属的种 (Trichothecium spp)。
     适用的细菌的实例为 ： 例如土壤细菌属的种 (Arthrobacter spp)、 棒状杆菌属的 种 (Corynebacterium spp)、 短杆菌属的种 (Brevibacterium spp) 的棒状杆菌细菌或乳酸 细菌。 脱水微生物优选是乳酸细菌。根据本发明， 术语 “乳酸细菌” 包括能产生作为碳水 化合物发酵的主要代谢终产物的乳酸或至少一种其衍生物 ( 包括但不限于丙酸 ) 的任何细 菌。因此该术语包括能产生作为碳水化合物发酵产物的丙酸的丙酸细菌 (PAB)。
     用于本发明中的细菌优选为通常被认为对动物或人类消费安全的 ( 即 GRAS 批准 的 ) 乳酸细菌。
     合适的乳酸细菌可选自于乳球菌属 (Lactococcus)、 乳杆菌属 (Lactobacillus)、 明 串 珠 菌 属 (Leuconostoc)、 双 歧 杆 菌 属 (Bifidobacterium)、 肉 杆 菌 属 (Carnobacterium)、 肠球菌属 (Enterococcus)、 丙酸菌属 (Propionibacterium)、 小球菌属 (Pediococcus)、 链球菌属 (Streptococcus) 及其混合物。
     通常， 微生物是益生微生物或 DFM( 直接饲喂微生物 )。 根据本发明， “益生微生物” 或 “DFM” 是指足量施用时能赋予宿主健康利益的活的微生物， 就益生微生物而言， 宿主是 人； 就 DFM 而言， 宿主则是动物。最常用的益生微生物或 DFM 主要是下列属的细菌和酵母 ： 乳杆菌属的种、 链球菌属的种、 肠球菌属的种、 双歧杆菌属的种和酵母属的种。
     在一个典型实施方式中， 本发明的包被的脱水微生物选自于乳杆菌属。通常， 所 用的微生物为嗜酸乳杆菌 (L.acidophilus) 或植物乳杆菌 (L.plantarum)， 更优选申请人 所使用的名为嗜酸乳杆菌 的商用嗜酸乳杆菌 NCFM 或植物乳杆菌 Lp115( 其根据 布达佩斯条约在 2009 年 2 月 9 日以 Danisco Deutschland GmbH， Busch-Johannsen-Str.1 25899， Niebull， Germany 的 名 义 保 藏 在 位 于 Inhoffenstr.7B， D-38124 Braunscheiwg， Germany 的 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen， 保 藏 号 DSM22266)。
     包被的脱水微生物中， 以包被脱水微生物的重量计， 可包含 104 至 1014cfu/g， 优选 7 11 10 至 10 cfu/g。
     通常， 脱水微生物可以通过如 “冷冻干燥” 的常规使用的方法或通过 “将微生物喷 涂于惰性核心上” 而获得。
     脱水微生物的制备可以， 但不限于冷冻干燥和将微生物喷涂于惰性核心上。其它 可能的方法为 1) 将微生物或油悬浮的微生物吸附于多孔惰性载体上， 2) 微生物的喷雾干 燥， 随后任选地进行微生物的团聚、 喷雾制粒或高剪切制粒， 以及 3) 本领域技术人员已知 并能提供适于进一步包被的形式的脱水微生物的任何其它方法。
     根据典型的实施方式， 将液体包被组合物喷涂于脱水微生物上以获得本发明的包 被的脱水微生物。
     因此本发明的优选实施方式是经液体组合物喷涂的脱水微生物以获得包含被至 少一个包被层包裹的脱水微生物的包被脱水微生物， 所述包被层包含按干重计为至少 25％ 的吸湿盐或其混合物， 且其中包被层的 pH 与包被的脱水微生物的生存力相容。
     通常， 可使用允许液体包被组合物快速干燥的任何方法将包被层喷涂于微生物 上， 以形成非晶体或部分晶体的包被层。包被优选在流化床类型的包被装置中进行。
     在典型实施方式中， 已经被至少一层本发明的包被层 ( 也被称为第一包被层 ) 包 被的包被脱水微生物随后可以被至少一个其他包被层 ( 也被称为外包被层 ) 包被， 例如其 包含任何常规包被成分， 比如脂肪 ； 脂肪酸 ( 例如硬脂酸 ) ； 乳化剂 ( 如单和双甘油酯 ) ； 油； 蜡； 树脂 ； 低渗透性聚合物 ( 例如虫胶、 sepifilm、 聚乙烯吡咯烷酮、 聚乙二醇 ) ； 水胶体 ( 例 如角叉菜胶、 藻酸盐或阿拉伯树胶或黄原胶或瓜尔胶 ) ； 可作为来源于土豆、 玉米、 乳清、 大 米、 马铃薯、 木薯的天然或改性淀粉使用的淀粉 ； 环糊精 ； 多元醇 ( 例如甘露醇 ) ； 纤维素和 纤维素衍生物 (HPMC、 纤维素酯、 纤维素醚 ) 及其混合物。 除了本发明的包被层 ( 第一包被层 ) 提供的对高温和 / 或高湿水平的增强的抗性 外， 外包被层还允许获得脱水微生物对胃和 / 或氧化环境和 / 或具有不利 pH 的条件 ( 尤其 当包被的脱水微生物特别敏感时 ) 的增强抗性。它在帮助这些脱水微生物耐受使用蒸汽处 理的工艺 ( 在制备例如饲料产品或调制奶酪的大多数过程中正是如此 ) 时也是有利的。
     通常， 本发明的包被层的量为包被的脱水微生物重量的至少 10％， 优选为包被的 脱水微生物重量的至少 20％， 更优选至少 30％， 更优选至少 50％， 甚至更优选至少 70％， 甚 至更优选至少 80％， 甚至更优选至少 90％。在特定实施方式中， 包含脱水微生物的包被脱 水微生物被数层可包含不同组成的本发明的包被层包裹。 然后可以添加包含例如任何常规 包被组分的外包被层。
     本发明的另一个目的是包含重量至少为包被层组合物中包含的干燥固体的 25％ 的吸湿盐或其混合物的液体包被组合物。作为液体包被组合物， 必须理解该液体混合物在 施加到脱水微生物上并进行干燥之前制备。所有前面描述的优选实施方式， 例如涉及组分 类型和 pH 范围， 也适用于液体包被组合物。
     本发明另一个目的是包被脱水微生物的方法， 所述方法包括如下步骤 ：
     (a) 制备液体包被组合物，
     (b) 用步骤 (a) 后获得的液体包被组合物包被脱水微生物， 优选通过喷涂法获得 包被的脱水微生物。
     在特定实施方式中， 液体包被组合物包含吸湿盐或其混合物。
     该工艺使得能够获得本发明的包被脱水微生物， 即包含被至少一个包被层包裹的
     脱水微生物， 所述包被层包含按干重计为至少 25％的吸湿盐或其混合物， 且其中包被层的 pH 与包被的脱水微生物的生存力相容。
     吸湿盐优选溶解于水性介质中。按干重计为 0 至 60％的非吸湿盐或其混合物， 和 / 或按干重计为 0 至 70％的其它任选成分也可以是液体包被组合物的组分。它们可以溶解 或悬浮加入液体包被组合物中。
     所有前面描述的优选实施方式， 比如例如涉及包被层中所含组分类型、 包被层性 质 ( 例如结晶度、 MUR...) 和 / 或微生物， 也适用于包被脱水微生物的方法。
     根据优选的实施方式， 步骤 (b) 必须在适于确保快速干燥的温度下进行， 从而在 保持包被微生物生存力的同时防止包裹脱水微生物的包被层的盐的结晶。 选择处理的温度 和持续时间以确保处理过程中由相变所导致的本发明包被层的无定形或部分结晶性质。
     步骤 (a) 和 (b) 可重复数次以提供被数层包被的包被脱水微生物。这些不同层的 组成可以是相同或不同的。
     包被脱水微生物的方法可以进一步包括步骤 (c) ：
     (c) 用至少一个外包被层包被步骤 (b) 后获得的包被的脱水微生物。这种至少的 外包被层优选使用常规化合物制成， 比如脂肪 ； 脂肪酸 ( 例如硬脂酸 ) ； 乳化剂 ( 如单和双 甘油酯 ) ； 油； 蜡； 树脂 ； 低渗透性聚合物 ( 例如虫胶、 sepifilm、 聚乙烯吡咯烷酮、 聚乙二 醇)； 水胶体 ( 例如角叉菜胶、 藻酸盐或阿拉伯树胶或黄原胶或瓜尔胶 ) ； 可作为来源于土 豆、 玉米、 乳清、 大米、 马铃薯、 木薯的天然或改性淀粉使用的淀粉 ； 环糊精 ； 多元醇 ( 例如甘 露醇 ) ； 纤维素和纤维素衍生物 (HPMC、 纤维素酯、 纤维素醚 ) 及其混合物。
     本发明的液体包被组合物将施加到脱水微生物上， 即在单独的包被层中。
     包被的脱水微生物可以用在稳定性上比商购冻干微生物粉末显示出显著改进的 两种优选方法来制备 ：
     1) 液体途径 ( 即包括通过流化床干燥将微生物的液体培养物施加到惰性核心上， 见图 1A)， 或者
     2) 固体途径 ( 即包括干燥培养物的制备， 见图 1B)。
     “液体途径” 方法的概述
     制备在压迫性条件和延长的储存期限下具有增加的存活率的本发明高度稳定脱 水微生物的一种方法是 “液体途径” 方法。该方法涉及通过用微生物的液体制剂喷涂惰性 载体颗粒 ( 即， 惰性核心 ) 而制备初级颗粒。因此初级颗粒由被至少一薄层脱水的活微生 物包被的惰性核心所组成。然后进一步用本发明的包被层包被初级颗粒。在这种情况下， 当微生物的液体培养物喷射到惰性核心上的情况下， 有必要控制含微生物层的配方和处理 条件， 以使微生物存活最大化。就含微生物层而言， 配方的构成和配方的 pH 都需要优化。
     制备初级颗粒和包被颗粒的优选方法是通过流化床涂覆。在这种方法中， 通过将 惰性核心材料在空气流中流化并将微生物的液体培养物喷射于核心材料上来制备初级颗 粒。选择处理条件以确保 ： i) 物理产量 ( 即在处理结束时回收的材料与处理过程中加入材 料的比值 ) 最大化， ii) 微生物生存力的保持， iii) 含微生物层中的水分残留最小化。
     然后进一步用本发明的液体包被组合物喷涂初级颗粒。 通过确保需要量的期望组 分和任选组分完全溶解于水性介质 ( 例如蒸馏水 ) 中或悬浮于液体包被组合物中来制备液 体包被组合物。然后将该液体包被组合物喷涂于以空气流流化的初级颗粒上。选择处理条件以确保 ： i) 产生部分晶体状态的包被层， ii) 物理产量 ( 即在处理结束时回收的材料与处 理过程中加入材料的比值 ) 最大化， iii) 干燥的含活微生物层的再润湿最小化， iv) 颗粒表 面上包被溶液的快速干燥， v) 在初级颗粒表面上形成均匀分布的多层包被层结构 ( 见实施 例 1)。
     “固体途径” 方法的概述
     制备在压迫性条件和延长的储存期限下具有增加的存活率的本发明的含有活的 脱水微生物的高度稳定干燥组合物的另一种方法是 “固体途径” 方法。在该方法中， 本发明 的液体包被组合物在流化床工艺中直接喷涂于干燥的脱水微生物上。 干燥的脱水微生物可 以是冻干粉末。其它用于获得干燥的脱水微生物的可能方法为 α) 将微生物或油悬浮的微 生物吸附于多孔惰性载体上， β) 微生物的喷雾干燥， 随后任选地进行微生物的团聚、 喷雾 制粒或高剪切制粒以及 δ) 本领域技术人员已知的任何其它合适方法。在优选实施方式 中， 干燥粉末是冻干粉末。干燥的脱水微生物粉末可以通过如 WO03/018778 的现有技术中 描述的方法获得。
     本发明的另一个目的是一种保护脱水微生物的方法， 所述方法包括通过用包含按 干重计为至少 25％的吸湿盐或吸湿盐混合物的至少一个包被层包裹脱水微生物来制备包 被的脱水微生物， 其中包被层的 pH 与包被的脱水微生物的生存力相容。本发明的另一个目 的是包含按干重计为至少 25％的吸湿盐或其混合物的至少一个包被层用于保护脱水微生 物的用途， 其中包被层的 pH 与包被的脱水微生物的生存力相容。
     在特定实施方式中， 脱水微生物被数层所包被。这些不同层的组成可以是相同或 不同的。
     在另一个特定实施方式中， 存在至少一个外包被层， 其优选使用常规化合物制成， 比如脂肪 ； 脂肪酸 ( 例如硬脂酸 ) ； 乳化剂 ( 如单和双甘油酯 ) ； 油； 蜡； 树脂 ； 低渗透性聚合 物 ( 例如虫胶、 sepifilm、 聚乙烯吡咯烷酮、 聚乙二醇 ) ； 水胶体 ( 例如角叉菜胶、 藻酸盐或 阿拉伯树胶或黄原胶或瓜尔胶 ) ； 可作为来源于土豆、 玉米、 乳清、 大米、 马铃薯、 木薯的天 然或改性淀粉使用的淀粉 ； 环糊精 ； 多元醇 ( 例如甘露醇 ) ； 纤维素和纤维素衍生物 (HPMC、 纤维素酯、 纤维素醚 ) 及其混合物。
     正如已提及的， 本发明的包被脱水微生物在制备后， 在干燥条件下储存期间和最 终使用前， 在密封条件 ( 例如在密封囊中 )15℃至 40℃ ( 尤其从 20℃至 35℃， 例如在 23℃ 或 30℃时 ) 下储存高达 2 年时间的稳定性为最低 40％存活， 优选至少 50％存活， 优选至少 60％存活， 优选至少 70％存活， 优选至少 80％存活以及更优选 90％存活。
     在特定实施方式中， 在饲料产品、 食物产品、 消费者保健产品或农产品中， 尤其 aw 高于 0.10 的情况下， 于 15℃至 40℃的温度 ( 尤其从 20℃至 35℃， 例如在 23℃或 30℃ ) 下 储存 12 个月后， 本发明的包被脱水微生物的生存力损失＜ 1.5LOG， 最优选＜ 1.0LOG， 最优 选＜ 0.5LOG， 最优选＜ 0.2LOG 以及最优选＜ 0.1LOG。
     在特定实施方式中， 在饲料产品、 食物产品、 消费者保健产品或农产品中， 尤其 aw 高于 0.10 的情况下， 于 15 ℃至 40 ℃的温度 ( 尤其从 20 ℃至 35 ℃， 例如在 23 ℃或 30 ℃ ) 下储存 2 年后， 本发明的包被脱水微生物的生存力损失＜ 3LOG， 最优选＜ 1.5LOG， 最优选 ＜ 1.0LOG， 最优选＜ 0.5LOG 以及最优选＜ 0.2LOG。
     因此， 本发明的包被层是脱水微生物的稳定包被层。所有前面描述的优选实施方式， 例如涉及包被层中所含组分的类型、 包被层性质 ( 例如结晶度、 MUR...) 和 / 或微生物， 也适用于保护脱水微生物的方法 ( 或用途 )。
     本发明的另一个目的是制备食物产品、 饲料产品、 消费者保健产品或农产品的方 法， 其中将本发明定义的或根据本发明的制备方法获得的包被脱水微生物加入食物产品、 饲料产品、 消费者保健产品或农产品中。
     根据本发明， “食物” 是指适于人类食用的产品。它们是包含或由人体必需营养物 ( 比如碳水化合物、 脂肪、 蛋白质、 维生素或矿物质 ) 组成的材料， 并被有机体消化和吸收以 产生能量、 刺激生长和维持生命， 以用于实际消费的固体、 液体或糊状形式存在。这些材料 经常在高温下组合并混合， 而且湿度较高。 本发明的包被脱水微生物适合用于食物产品中。 它们可以与随后可能烘焙、 蒸汽处理、 压制、 制粒和 / 或模制的食品材料 ( 营养棒、 奶酪串、 早餐谷物食品等 ...) 相混合。对于蒸汽处理， 优选包被的脱水微生物含有至少一个用常规 化合物制成的外包被层， 尤其是对于敏感性微生物。
     本发明的包被脱水微生物可用作用于制备如下食品的成分 ： 营养棒、 早餐谷物 食品、 婴儿配方食品、 饼干糕点、 糕点混合配料、 零食、 均衡食物和饮料、 水果馅、 蛋糕外皮 (cake glaze)、 巧克力面包馅、 干酪饼风味馅、 水果味蛋糕馅、 蛋糕和甜甜圈酥衣、 即食冰激 凌面包馅、 饼干馅、 即用型面包馅、 低热馅、 甜点、 糖果产品 ( 例如橡皮糖、 糖果、 巧克力和巧 克力块、 果仁糖、 口香糖、 棒棒糖 )、 饮料如饮料粉末、 软饮料、 果汁、 含乳清蛋白的饮料、 保 健茶、 可可饮料、 奶基饮料、 钙强化的豆浆和巧克力奶、 钙强化的咖啡饮料、 基于乳酸菌的饮 料、 成人营养饮料、 酸化大豆 / 果汁饮料、 无菌 / 灭菌巧克力饮料、 酸奶、 饮用酸奶、 奶酪、 奶 酪串、 调制奶酪、 冰激凌、 冰冻果子露。 在食物产品中， 尤其优选营养棒、 早餐谷物食品、 婴儿 配方食品和饮料粉末。
     根据本发明， “饲料” 是指适合动物食用的产品， 且可以选自于 “宠物食品” ( 宠物 的蛋糕、 饼干、 咀嚼食物、 零食 ...)， 青储饲料产品和粒状饲料。术语 “动物” 必须广义理解。 它可以是指 “多胃草食动物” ， 包括但不限于， 牛科、 鹿科、 叉角羚科和骆驼科。 它可以指例如 “多胃反刍动物” 包括但不限于， 牛、 绵羊、 母羊、 山羊、 鹿、 骆驼、 长颈鹿。它也可以是指如马 和猪的 “单胃食草动物” 以及驯养动物或宠物 ( 狗、 猫、 兔、 鸟、 大鼠、 小鼠、 豚鼠、 鱼、 爬行动 物 ...)。它也可以是指家禽、 鸡、 小鸡， 还可以是指如虾等来自水产养殖领域的任何类型的 动物。
     本发明的包被脱水微生物可以加入非粒化的饲料混合物中， 其可随后用蒸汽处理 和 / 或蒸汽制粒或干燥。非粒化混合物是指预混合料和糊浆。″预混合料″通常包含维生 素和矿物质。如谷粒和粘土的其他成分也可以加入预混合料中。″糊浆″通常包含完全的 动物食料。 ″粒″是通常通过压缩可以包含本发明的包被脱水微生物的原始饲料混合物所 产生的球形或圆柱形的颗粒。在压缩前， 饲料混合物在调理器中 60℃至 95℃的温度下用注 入蒸汽进行蒸汽处理 30 秒至 5 分钟。正如上文所述的， 因为蒸汽处理， 优选包被的脱水微 生物含有至少一个用常规化合物制成的外包被层， 尤其是对于敏感性微生物。然后将蒸汽 处理的饲料混合物转移至制粒机或挤出机并最终转移至粒料冷却器。
     本发明的包被脱水微生物可以包括在凝胶或其它油递送系统中以直接补充给动 物。它也可以是用于例如表面处理饲料 (top dreesing feed) 的粉末或其它干燥制剂。
     根据本发明， “消费者保健产品” 包括膳食补充剂、 营养品和非处方产品。消费者可以是人和 / 或动物。
     根据本发明， “膳食补充剂” ( 也被称为食品补充剂或营养补充剂 ) 是指意图提 供在个人的膳食中缺失或没有足量消耗的营养物 ( 如维生素、 矿物质、 纤维、 脂肪酸或氨基 酸 ) 的制剂。膳食补充剂可以用于人和 / 或动物消费。
     根据本发明， 术语 “营养品” 是指不仅能提供营养效果和 / 或口味满意度而且能为 消费者产生治疗 ( 或其他有益 ) 效果的功能性食品。
     根据本发明， “非处方产品” 是指能防止某种疾病或减少与肠道健康或免疫健康相 关的症状， 从而促进肠道健康或改善免疫功能的非处方药品。 例如， 这些产品使得可以预防 和治疗过敏， 预防和治疗呼吸道感染以及益生微生物和直接饲喂微生物 (DFM) 的其它新兴 应用。
     根据本发明， “农产品” 的表述包括生物杀虫剂、 生物肥料、 植物护理产品、 堆肥和 副产品以及生物能产品 ( 生物乙醇， 生物酯 )。
     这些产品 ( 食品、 饲料、 消费者保健产品和农产品 ) 可以以任何形式制备， 比如液 体、 悬浮液、 半固体、 片剂、 胶囊、 颗粒、 丸剂、 粉末、 凝胶或其它递送体系等等。 在典型的实施 方式中， 本发明的包被脱水微生物可以引入微穿孔吸管或任何其它微穿孔包装技术或设备 中。
     所有前面描述的优选实施方式， 例如涉及包被层中所含组分的类型、 包被层性质 ( 例如结晶度、 MUR...) 和 / 或微生物， 也适用于制备食物产品、 饲料产品、 消费者保健产品 或农产品的方法。
     本发明的另一个目的是包含本发明定义或获得的包被脱水微生物的食物产品、 饲 料产品、 消费者保健产品或农产品。包含本发明的包被脱水微生物的最终产品在储存数个 月后获得了高细菌存活率 ( 例如储存 1 个月后， 甚至 2 个月后， 甚至 3 个月后， 甚至 5 个月 后， 甚至 9 个月后， 甚至 12 个月后， 甚至 2 年后， 甚至更长 ...)， 尤其当储存于环境温度下时 ( 例如， 从 15℃至 40℃， 尤其 20℃至 35℃， 例如 23℃或 30℃ )， 且尤其当最终产品的 aw 高 于 0.10 时。
     所有前面描述的优选实施方式， 例如涉及包被层中所含组分的类型、 包被层性质 ( 例如结晶度、 MUR...) 和 / 或微生物， 也适用于包含所述包被的脱水微生物的食物产品、 饲 料产品、 消费者保健产品和农产品。
     本发明另一个目的是可通过本发明的制备方法获得的包被的脱水微生物。
     本发明另一个目的是通过本发明的制备方法直接获得的包被的脱水微生物。
     所有前面描述的优选实施方式， 例如涉及包被层中所含组分的类型、 包被层性质 ( 例如结晶度、 MUR...) 和 / 或微生物， 也适用于用本发明的制备方法可获得的 / 获得的包 被脱水微生物。
     本发明另一个目的是本发明的包被脱水微生物在生产调制奶酪中的用途， 通过下 列步骤生产所述调制奶酪 ：
     i) 研磨凝乳，
     ii) 加入水胶体 ( 无熔化盐 ) 以获得最终产物的适当质地，
     iii) 加热至 60℃， 以及
     iv) 在 60℃搅拌， 同时加入包被的脱水微生物。所有前面描述的优选实施方式， 例如涉及包被层中所含组分的类型、 包被层性质 ( 例如结晶度、 MUR...) 和 / 或微生物， 也适用于包被脱水微生物在生产调制奶酪中的应用。 然而， 由于在调制奶酪生产中通常使用蒸汽处理， 优选本发明的包被脱水微生物包含至少 一个外包被层， 其优选用常规化合物制成， 比如脂肪 ； 脂肪酸 ( 例如硬脂酸 ) ； 乳化剂 ( 如单 和双甘油酯 ) ； 油； 蜡； 树脂 ； 低渗透性聚合物 ( 例如虫胶、 sepifilm、 聚乙烯吡咯烷酮、 聚乙 二醇 ) ； 水胶体 ( 例如角叉菜胶、 藻酸盐或阿拉伯树胶或黄原胶或瓜尔胶 ) ； 可作为来源于 土豆、 玉米、 乳清、 大米、 马铃薯、 木薯的天然或改性淀粉使用的淀粉 ； 环糊精 ； 多元醇 ( 例如 甘露醇 ) ； 纤维素和纤维素衍生物 (HPMC、 纤维素酯、 纤维素醚 ) 及其混合物。
     本发明的其它特征和优势将在阅读下列非限制性实施例时显现出来。 附图说明 图 1A) 是经由液体途径的包被脱水微生物的示意图， 其中起始生物材料是液体微 生物浓缩液。
     图 1B) 是经由固体途径的包被脱水微生物的示意图， 其中起始生物材料是冻干微 生物粉末。
     图 2A 是储存在 23℃的巧克力棒中的包被 ( 样品 11) 的嗜酸乳杆菌 NCFM 的生存 曲线图。样品 11 的组成为 ： K2HPO4(40％干重 )、 KH2PO4(29％干重 )、 蔗糖 (17％干重 )、 滑石 (14％干重 )。
     图 2B 是储存在 30℃的巧克力棒中的包被 ( 样品 11) 和未包被的 ( 样品 2) 嗜酸乳 杆菌 NCFM 的生存曲线图。* 样品 11 的包被层为 ： K2HPO4(40％干重 )、 KH2PO4(29％干重 )、 蔗 糖 (17％干重 )、 滑石 (14％干重 )。
     图 3 是 75 ％ RH、 37 ℃时包被的嗜酸乳杆菌 NCFM 的吸湿曲线图。全部都是通过 液体途径制备并且被下列包被层包裹的脱水嗜酸乳杆菌 NCFM ： 样品 10 ： K2HPO4(48 ％干 重 )、 KH2PO4(35％干重 )、 蔗糖 (0％干重 )、 滑石 (17％干重 )。样品 11 ： K2HPO4(40％干重 )、 KH2PO4(29 ％干重 )、 蔗糖 (17 ％干重 )、 滑石 (14 ％干重 )。样品 12 ： K2HPO4(14 ％干重 )、 KH2PO4(11％干重 )、 蔗糖 (54％干重 )、 滑石 (22％干重 )。样品 13 ： Na2SO4。样品 14 ： MgSO4。
     图 4 是通过液体途径获得的包被脱水微生物的 X- 射线衍射图， 其中包被层是以喷 涂共处理的 K2HPO4(48％干重 )、 KH2PO4(35％干重 )、 滑石 (17％干重 ) 和 0％蔗糖的混合物 ( 样品 10)。
     图 5 是通过液体途径获得的包被脱水微生物的 X- 射线衍射图， 其中包被层是以喷 涂共处理的 K2HPO4(40％干重 )、 KH2PO4(29％干重 )、 滑石 (14％干重 ) 和蔗糖 (17％干重 ) 的混合物 ( 样品 11)。
     图 6 是通过液体途径获得的包被脱水微生物的 X- 射线衍射图， 其中包被层是以喷 涂共处理的 K2HPO4(14％干重 )、 KH2PO4(11％干重 )、 滑石 (22％干重 ) 和蔗糖 (54％干重 ) 的混合物 ( 样品 12)。
     图 7 是通过液体途径获得的包被脱水微生物的 X- 射线衍射图， 其中包被层是以喷 涂处理的一种非吸湿盐 (KH2PO4) 和滑石 ( 样品 16)。
     图 8 是通过固体途径获得的包被脱水微生物的 X- 射线衍射图， 其中包被混合物是 以喷涂共处理的 K2HPO4(40％干重 )、 KH2PO4(29％干重 )、 滑石 (14％干重 ) 和蔗糖 (17％干
     重 )( 样品 20)。
     图 9 是通过固体途径获得的包被脱水微生物的 X- 射线衍射图， 其中包被混合物是 以喷涂共处理的 Na2SO4( 样品 21)。
     图 10 是样品 A(KH2PO4) 的 DSC 温谱图。
     图 11 是样品 B(K2HPO4) 的 DSC 温谱图。
     图 12 是样品 C(KH2PO4/K2HPO4/ 蔗糖 ) 的 DSC 温谱图。
     图 13 是被包含不同组成的包被层包裹的脱水微生物在 25℃下暴露于 0-75％ RH 28 天时的 25℃的水蒸气吸附等温线。全部都是被如下包被层包裹的流化床干燥的 NCFM ： 样品 10 ： K2HPO4(48 ％干重 )、 KH2PO4(35 ％干重 )、 蔗糖 (0 ％干重 )、 滑石 (17 ％干重 )。样 品 11 ： K2HPO4(40％干重 )、 KH2PO4(29％干重 )、 蔗糖 (17％干重 )、 滑石 (14％干重 )。样品 12 ： K2HPO4(14％干重 )、 KH2PO4(11％干重 )、 蔗糖 (54％干重 )、 滑石 (22％干重 )。样品 13 ： Na2SO4。 样品 14 ： MgSO4。 样品 15 ： K2HPO4(83％干重 )、 滑石 (17％干重 )。 样品 16 ： KH2PO4(83％ 干重 )、 滑石 (17％干重 )。样品 23 ： K2HPO4(23％干重 )、 KH2PO4(60％干重 )、 滑石 (17％干 重 )。样品 24 ： K2HPO4(19％干重 )、 KH2PO4(15％干重 )、 蔗糖 (52％干重 )、 滑石 (14％干重 )。
     图 14 是未包被颗粒 ( 核心 ； 核心 + 脱水微生物 ) 和具有对应于样品 11 的盐组成 的包被颗粒 ( 核心 + 盐包被层 ； 包被的脱水微生物 ) 在 25℃下暴露于 0-75％ RH 28 天时的 水蒸气吸附等温线。样品 11 的包被层 ： K2HPO4(40％干重 )、 KH2PO4(29％干重 )、 蔗糖 (17％ 干重 )、 滑石 (14％干重 )。
     图 15 是未包被颗粒 ( 核心 ； 核心 + 脱水微生物 ) 和具有对应于样品 10 的盐组成 的包被颗粒 ( 核心 + 盐包被层 ； 包被的脱水微生物 ) 在 25℃下暴露于 0-75％ RH 28 天时的 水蒸气吸附等温线。样品 10 的包被层 ： K2HPO4(48％干重 )、 KH2PO4(35％干重 )、 蔗糖 (0％干 重 )、 滑石 (17％干重 )。
     图 16 是未包被颗粒 ( 核心 ； 核心 + 脱水微生物 ) 和具有对应于样品 15 的盐组成 的包被颗粒 ( 核心 + 盐包被层 ； 包被的脱水微生物 ) 在 25℃下暴露于 0-75％ RH 28 天时的 水蒸气吸附等温线。样品 15 的包被层 ： K2HPO4(83％干重 )、 滑石 (17％干重 )。
     图 17 是未包被颗粒 ( 核心 ； 核心 + 脱水微生物 ) 和具有对应于样品 13 的盐组成 的包被颗粒 ( 核心 + 盐包被层 ； 包被的脱水微生物 ) 在 25℃下暴露于 0-75％ RH 28 天时的 水蒸气吸附等温线。样品 13 的包被层 ： Na2SO4。
     图 18 是未包被颗粒 ( 核心 ； 核心 + 脱水微生物 ) 和具有对应于样品 12 的盐组成 包被的脱水微生物 ) 在 25℃下暴露于 0-75％ RH 28 天时的 的包被颗粒 ( 核心 + 盐包被层 ； 水蒸气吸附等温线。样品 12 的包被层 ： K2HPO4(14％干重 )、 KH2PO4(11％干重 )、 蔗糖 (54％ 干重 )、 滑石 (22％干重 )。
     图 19 是未包被颗粒 ( 核心 ； 核心 + 脱水微生物 ) 和具有对应于样品 16 的盐组成 的包被颗粒 ( 核心 + 盐包被层 ； 包被的脱水微生物 ) 在 25℃下暴露于 0-75％ RH 28 天时的 水蒸气吸附等温线。样品 16 的包被层 ： KH2PO4(83％干重 )、 滑石 (17％干重 )。 实施例
     表 1 是所有测试样品的总结。一些是指用本发明的包被层包被的脱水微生物， 而 其它是用不同组成包被和在压迫条件下不显示增强的微生物稳定性的脱水微生物。表1
     注： 所有的百分比都是指 “干燥的” 包被层 (wt％干重 )， 样品以包被的脱水微生物 重量的 30wt％的第 1 包被层制备。
     实施例 1- 液体途径 - 典型组成
     在 Aeromatic MP-1 流化床中， 以顶喷模式， 用含 8％开口的分布板进行本试验。 喷 雾嘴是 Schlick 的 1mm 喷嘴， 其置于整个过程的最低位置。使用 Watson-Marlow 泵将喷射 物质输送至喷嘴。
     初级颗粒的制备 ：
     通过将含有嗜酸乳杆菌 NCFM 的液体组合物喷涂惰性载体颗粒 ( 即惰性核心 ) 来 制备初级颗粒。
     通过混合以下成分来制备含有微生物 ( 培养混合物 ) 的液体组合物 ：
     成分 液体培养浓缩物 * 蔗糖 乳蛋白 (Promilk 852A) 麦芽糖醇 小麦淀粉 总计
     含量 (％ ) 64.0 6.7 6.7 12.0 10.6 100.0* 所用液体培养浓缩物为嗜酸乳杆菌 NCFM。 混合物的 pH 以 10M NH4OH 调节至 7.5。 流化床装有 2.8kg 蔗糖核心。然后以下列工艺参数将 0.8kg 培养混合物喷涂于核心上 ：
     参数 产品空气温度 进气温度 流化空气流速 喷射温度 设定值 40℃ 55℃ 90m3/hr 5℃28CN 102482635 A说明书2.2 巴 40℃ 1.00kg/hr25/46 页雾化空气压力 雾化空气温度 喷射速率
     成分 蔗糖 KH2PO4 K2HPO4 滑石 蒸馏水 总计 量 (％ ) 7.5 12.6 17.2 6.2 56.5 100包被层的制备 制备下列液体包被组合物 ：量 (wt％干重 ) 17 29 40 14 100通过将蔗糖和钾磷酸盐溶解于水然后分散滑石 ( 作为抗结块剂加入 ) 来制备该液 体包被组合物。混合物的干固体含量为 43.5％。
     流化床装有 2.4kg 初级颗粒。以下列工艺参数将 2.8kg 液体包被组合物喷涂于初 级颗粒上 ：
     参数 产品空气温度 进气温度 流化空气流速 喷射温度 雾化空气压力 雾化空气温度 喷射速率 29 设定值 50℃ 56℃ 150m3/hr 20℃ 2.2 巴 40℃ 0.50kg/hrCN 102482635 A
     说明书26/46 页液体包被组合物喷涂于初级颗粒上之后， 进行后干燥步骤， 直至排出空气中得到 稳定的湿度值。得到的包被脱水微生物对应于样品 11。它的最终组成为 ： 59％惰性核心 ； 8％培养混合物 ； 33％本发明的包被层。
     表 1 的其它相关的包被脱水微生物 ( 样品 10、 12-19、 22-28) 以同样的方式制备但 使用不同的第 1 包被层组成配方。
     一些包被的脱水微生物用常规的外包被层进一步包被以获得样品 17、 18 和 19。 使 用了下列材料之一 ：
     - 由羟丙基甲基纤维素、 微晶纤维素以及来自 Seppic(Air Liquid Group 的子公 司 ) 的硬脂酸组成的 LP30 ；
     -Shellac( 125， 水 基 虫 胶 溶 液 (25 ％ )， 来 自 Innovative Material Technologies) ；
     样品 4 至 9 的颗粒仅用常规的外包被层包被 ( 不加入本发明的吸湿盐包被层 )。 使用了下列材料之一 ：
     LP30 ；
     - 虫胶 ；
     - 甘油三酯 ( 来自于 Danisco 的 PS 101)，
     - 来 自 于 Exaflor 的 TM 50/50( 硬 脂 酸 和 棕 榈 酸 的 混 合 物 50/50)。
     羟丙基甲基纤维素 (HPMC， 来自于 Dow Chemicals 的 E15)。
     也可以使用以下其它的常规外包被层材料 ：
     - 改性淀粉 ( 来自于 Roquette Freres SA 的 RS780 或来自于 Grain Processing Corporation 的 PURE)；
     - 单甘油酯，
     - 单甘油酯和双甘油酯的混合物，
     - 完全氢化的甘油三酯，
     - 脂肪酸，
     - 水胶体。
     实施例 2- 固体途径 - 典型成
     用 GF-3( 德国 Binzen 的 Glatt Air Techniques 制造 ) 以底喷模式在流化床工艺 中制备包被的脱水微生物。
     制备下列液体包被组合物 ( 与实施例 1 中的第一包被层组合物相同 ) ：
     成分 蔗糖 KH2PO4 K2HPO4 量 (％ ) 7.5 12.6 17.2 量 (wt％干重 ) 17 29 4030CN 102482635 A 滑石 蒸馏水 总计
     说6.2明书14 10027/46 页56.5 100通过将蔗糖和钾磷酸盐溶解于水中然后分散滑石 ( 作为抗结块剂加入 ) 来制备该 液体包被组合物。混合物的干固体含量为约 43％。
     装入 1000g 嗜酸乳杆菌 NCFM 的冻干粉末并使用 55℃的热床温度流化。然后用下 列工艺参数将 1180g 本发明的液体包被组合物喷涂于冻干粉末上 ：
     参数 产品空气温度 进气温度 流化空气流速 喷射温度 雾化空气压力 雾化空气温度 喷射速率
     设定值 50℃ 60℃ 150m3/hr 20℃ 2.5 巴 40℃ 0.70kg/hr液体包被组合物喷涂于冻干粉末上之后， 进行后干燥步骤， 直至排出气体中得到 恒定的湿度。
     得到的包被脱水微生物的最终组成为 ： 66 ％冻干微生物 ； 34 ％本发明的包被层。 得到的颗粒对应于样品 20。
     表 1 的其它相关的包被脱水微生物 ( 即样品 21) 以同样的方式制备但使用不同的 第 1 包被层配方。
     可以用常规的外包被层进一步包被该包被的脱水微生物 ( 样品 20 和 21 无外包被 层 )。此处可以使用实施例 1 中所用的同样的外包被层材料。
     实施例 3- 热稳定性
     比较根据实施例 1( 液体途径 ) 制备的用第一包被层包被的脱水嗜酸乳杆菌 NCFM 与用常规包被层 ： 脂肪 (PS101/ 葵花籽油 ) 或低渗透性聚合物 (Sepifilm LP30) 包被的脱 水嗜酸乳杆菌 NCFM 的耐热性。对照由未包被的脱水嗜酸乳杆菌 NCFM 细胞组成。 将各制剂的 1g 样品加入单独的密封囊袋中并保持于 50℃的水浴中。
     然后， 24 小时后将各制剂的密封囊袋从水浴中取出， 适当稀释后用标准平板培养 方法立即测定有活力的细菌的浓度 ( 表 2)。
     表2
     31CN 102482635 A
     样品 1 4 6 11
     热处理前 (RT) 2.50E+10 1.70E+10 7.10E+09 1.40E+10说明书生存力损失 (Log) 1.36 4.99 4.31 0.3528/46 页热处理后 (24hrs/50℃ ) 1.10E+09 1.72E+09 3.48E+05 6.30E+09RT ＝室温
     从表 2 的结果可以观察到， 与未包被的脱水微生物 ( 样品 1)、 脂肪包被层包被的脱 水微生物 ( 样品 4) 以及 SepifilmLP30 包被层包被的脱水微生物 ( 样品 6) 相比， 本发明的 包被层 ( 样品 11) 显著改善了脱水微生物的热稳定性。
     而且， 如下面表 3 所示， 可以观察到包被层 K2HPO4(48％干重 )、 KH2PO4(35％干重 )、 滑石 (17％干重 ) 和蔗糖 (0％干重 )( 样品 10) 以及 K2HPO4(40％干重 )、 KH2PO4(29％干重 )、 滑石 (14％干重 ) 和蔗糖 (17％干重 )( 样品 11) 在保护细菌嗜酸乳杆菌 NCFM 抵御热方面 更有效。事实上， 这两个样品的热稳定性远高于 ： - 包含被含太少量吸湿盐的包被层包裹的脱水微生物的包被脱水微生物的热稳定 性， 比如样品 12(K2HPO4(14％干重 )、 KH2PO4(11％干重 )、 滑石 (22％干重 ) 和蔗糖 (54％干 重 ))。
     - 或包含被不含任何吸湿盐的包被层包裹的脱水微生物的包被脱水微生物的热稳 定性 ( 样品 13 和 14 仅包含一种非吸湿盐， 分别为硫酸钠和硫酸镁 )。
     表3
     样品 10 11 12 13 14
     热处理前 (RT) 1.00E+10 1.40E+10 5.00E+09 5.50E+09 5.50E+09 热处理后 (24hrs/50℃ ) 2.80E+09 6.30E+09 2.60E+07 1.90E+06 2.80E+06 生存力损失 (Log) 0.55 0.35 2.28 3.46 3.29RT ＝室温
     为了更好地区分提供高热保护性的盐包被层和提供低热保护性的盐包被层， 还在 更严格的条件下测试了样品， 例如 64℃下 18 小时。
     表4
     32CN 102482635 A 样品 热处理前 (RT)说明书生存力损失 (Log)29/46 页热处理后 (18 hrs/64℃ )26 27 28 11 25 12 13 16 14 15
     1.61E+10 1.20E+10 1.90E+10 3.85E+09 1.49E+09 2.88E+09 3.38E+09 9.30E+08 1.48E+09 2.20E+094.81E+09 2.70E+09 5.00E+09 1.60E+08 4.60E+07 3.30E+06 1.30E+06 ＜ 10000 ＜ 10000 ＜ 100000.5 0.6 0.6 1.4 1.5 2.9 3.4 ＞ 5.0 ＞ 5.2 ＞ 5.3正如可以从表 4 中看到的， 可以观察到下列包被层在保护细菌嗜酸乳杆菌 NCFM 抵 御热方面非常有效 ：
     -K2HPO4(30％干重 )、 三水合醋酸钠 (30％干重 )、 滑石 (14％干重 ) 和蔗糖 (17％ 干重 )( 样品 26) ；
     -K2HPO4(83％ )、 滑石 (17％ )， pH 调节至 6.5( 样品 27) ；
     -KH2PO4(83％ )、 滑石 (17％ )， pH 调节至 6.5( 样品 28) ； 以及
     -K2HPO4(40％干重 )、 KH2PO4(29％干重 )、 滑石 (14％干重 ) 和蔗糖 (17％干重 )( 样 品 11)，
     -MgCl2(100％干重 )( 样品 25)
     相反， 与样品 25、 26、 27、 28 和 11 相比， 被不含任何吸湿盐 ( 样品 13 和 14) 或含不 足量的吸湿盐 ( 样品 12) 或 pH 不合适 ( 样品 15 和 16) 的包被层包裹的包被的细菌嗜酸乳 杆菌 NCFM 对热的耐受性差得多。
     实施例 4- 调制奶酪加工期间的稳定性
     调制奶酪试验涉及下列步骤 ：
     i) 研磨凝乳，
     ii) 加入水胶体 ( 无熔化盐 ) 以获得最终产物的适当质地
     iii) 加热至 60℃， 以及
     iv)60℃下搅拌。
     将未包被 ( 对照 ) 或包被的嗜酸乳杆菌 NCFM 样品在 60℃搅拌条件下加入熔融混 合物。继续搅拌约 1 分钟， 随后进入模制阶段。最后， 迅速冷却含嗜酸乳杆菌 NCFM 的模制 的调制奶酪。然后评价包被的嗜酸乳杆菌 NCFM 在调制奶酪加工过程中的生存力， 并与未包 被的脱水嗜酸乳杆菌 NCFM( 对照 ) 进行比较。结果如表 5 所示。
     表5
     RT ＝室温， n.a. 不适用 ( 对照 )
     从实验可以观察到， 包含被由本发明包被层组成的第一包被层包裹并具有含聚合 物的外包被层的脱水微生物的包被脱水微生物 ( 样品 17 和 18) 在调制奶酪加工过程后具 有显著增强的存活率。而且， 它们也比未包被细菌 ( 样品 2)、 脂肪包被的细菌 ( 样品 5)、 聚 合物包被的细菌 ( 样品 8) 和脂肪包被 + 聚合物底层包被的细菌 ( 样品 9) 具有改进的稳定 性。这表明了本发明包被层的功效。
     实施例 5- 饲料制粒稳定性
     用由本发明包被层组成的第一包被层和随后用聚合物外包被层包被的脱水嗜酸 乳杆菌 NCFM 或植物乳杆菌 Lp115 用严苛条件 ( 见下面 ) 制粒。制粒后将这些细菌的稳定 性与未包被的脱水嗜酸乳杆菌 NCFM 或植物乳杆菌 Lp115( 对照 ) 相比较。
     具体地， 将各测试样品 ( 即 240g 包被的脱水细菌 ) 混合入 10kg 预混合饲料中并 混合 10 分钟。然后将这 10kg 预混合饲料 ( 含 240g 包被的脱水细菌 ) 加入大型卧式搅拌 器中的 150kg 饲料中， 并在调理前混合 15 分钟。然后在饲料制粒前通过将 “干蒸汽” (即 3.5 至 4.5wt％的水 ) 直接注入饲料中在 75℃下处理饲料 30 秒。用 3mm 染料获得饲料颗 粒。然后通过用风扇吹动其周围空气而使颗粒冷却。5 分钟后， 温度降至 30℃。在另外 15 分钟后， 温度再次降至室温。此时， 颗粒的干物质含量 (％ DM) 为约 80-90％且 aw ＞ 0.10。 随后用标准平板培养法测定制粒后剩余的有活力细菌的浓度。
     预混合饲料的组成 ( 玉米基饲料 ) ：
     34CN 102482635 A 玉米饲料成分 玉米 大豆粉 48 大豆油 碳酸氢钠 DL 甲硫氨酸 石灰石 磷酸二钙说明书百分比 61.01％ 31.52％ 4.00％ 0.40％ 0.20％ 1.16％ 1.46％ 0.25％ 100.00％31/46 页VIT/MIN Beta Avitren 90 总计
     表6RT ＝室温， n.a. 不适用 ( 对照 )
     正如上面表 6 中所观察到的， 与未包被脱水细菌 ( 样品 2 和 3) 相比， 用本发明的 包被层包被的脱水细菌 ( 样品 17 和 19) 在制粒后的稳定性增强了。
     实施例 6- 在中间湿度粉末中的稳定性
     以下列条件研究冻干形式的脱水嗜酸乳杆菌 NCFM( 对照 ) 和包被的脱水嗜酸乳杆 菌 NCFM( 以液体途径制备 ) 的生存力 ：
     将初始具有等于 0.2 的水活性 (aw) 的来自 Roquette 的麦芽糖糊精粉末 Glucidex IT6 暴露于相对湿度为 40％的环境中， 直到麦芽糖糊精的′ aw ′达到 aw ＝ 0.4 并在该值 下平衡。
     以 10％ wt 的包被细菌和 90％ wt 的麦芽糖糊精粉末的比例将细菌制剂混入麦芽 糖糊精粉末 (aw ＝ 0.4) 中。然后将 10g 混合物置于随后以防湿帽密封的玻璃小瓶中。将
     小瓶在培养箱中保持在 30℃。 每月以标准平板培养方法分析小瓶混合物的有活力细胞的含 量。结果列在表 7 中。有活力细胞的浓度以 CFU/g 表示， 并表示为各样品在 T ＝ 0 时的浓 度的百分比。
     表7
     样品 2 10 11 15 16
     T＝0 1.50E+11 8.80E+09 1.40E+10 1.90E+09 5.10E+09 1 个月 6.80E+09 1.56E+09 9.00E+09 1.08E+08 6.65E+07 ％存活 5％ 18％ 64％ 6％ 1％ 相比对照的保护系数 n.a. 4 13 1 0n.a. 不适用 ( 对照 )
     包含如 K2HPO4 的吸湿盐但 pH 不相容的包被层 ( 样品 15) 或包含如 KH2PO4 的非吸湿 盐的包被层 ( 样品 16) 无效果或提供很有限的效果， 而本发明的包被层 ( 样品 10 和 11) 在 中间湿度时明显地改善了脱水嗜酸乳杆菌 NCFM 的生存力， 并且相比于未包被的脱水嗜酸 乳杆菌 NCFM 生存力有着高达 13 倍的提高 ( 见表 7)。参见实施例 13， 其证明了 pH 对 K2HPO4 包被层的影响。
     实施例 7- 在营养棒中的稳定性
     如下制备 棒：
     - 剧烈搅拌条件下使果胶 (GRINDSTED Pectin CF 140B) 在热水中水化，
     - 使其与玉米糖浆 (42DE Corn Syrup) 和糖一起混合，
     - 将果胶浆 - 玉米糖浆 + 糖混合物加热至 106℃ ( 约 12.5％水分损失， 82％干物 质 ) 以制备结合糖浆，
     - 使结合糖浆冷却至 55℃，
     - 将 410g 冷 却 的 结 合 糖 浆 浇 于 590g Cascadian 格兰诺拉燕麦 (granola) 谷物上， 并彻底混合，
     - 将该制剂在两张油性羊皮纸之间碾平， 并使之冷却，
     - 将碾平的制剂切成 34g 的棒 ( 生产时各棒的含水量＝ 8.1％并且 aw ＝ 0.5)，
     - 将巧克力融化并在 28℃时加入含细菌嗜酸乳杆菌 NCFM 的试验样品，
     - 将 6g 巧克力 - 细菌混合物沉积于棒上 ( 即 6g 巧克力 - 细菌混合物涂覆于约 34g 格兰诺拉燕麦棒上 )。
     - 具有巧克力 - 细菌混合物的棒储存于 23 ℃ ( 表 8 和 9) 或 30 ℃ ( 表 10)， 并在 23℃或 30℃储存 1、 2、 3、 5、 9 和 12 个月期间后， 用标准平板培养方法测定有活力细胞的浓 度。
     表8n.a. 不适用 ( 对照 )
     表 8 中结果表明， 当储存于 23℃时， 如现有技术中之前描述的用如脂肪 ( 样品 4)、 低渗透性聚合物 Sepifilm LP30( 样品 6) 或虫胶 ( 样品 7) 的常规包被层包被的脱水嗜酸 乳杆菌 NCFM 没有保持生存力， 在 25℃储存 5 个月格兰诺拉燕麦棒中有活力细胞浓度下降大 于 1.5LOG， 且与未包被脱水细菌 ( 样品 2) 相比未提供改善的稳定性。
     由于一些最终产品具有可能更低的水活性″ aw″， 进行相似的实验， 但是具有降 低的 aw， 从而产生稍微更干燥的条件。
     表9
     n.a. 不适用 ( 对照 )*25℃储存 9 个月时计算的保护系数
     表 9 的结果表明， 当储存于 23℃时， 本发明的包被层的存在 ( 样品 11、 17 和 18) 导 致了比未包被脱水细菌 ( 样品 2) 改进的细菌稳定性。样品 11 提供了长时间周期内 (12 个 月 ) 的最大保护。
     棒的巧克力包被层在 23℃下储存 12 个月后， 用本发明的包被层包被 的嗜酸乳杆菌 NCFM 的生存力仍然很高， 例如， 样品 11 在储存 12 个月后获得 60％的生存力 ( 见图 2A)。
     表 10
     n.a. 不适用 ( 对照 )*30℃下储存 9 个月时计算的保护系数
     当储存于 30℃时， 与未包被脱水细菌 ( 样品 2) 相比， 本发明的包被层 ( 样品 11、 17 和 18) 提供的保护显著增加。
     棒的巧克力包被层在 30℃下储存 9 个月后， 用本发明的包被层包被的 嗜酸乳杆菌 NCFM 的生存力比未包被微生物获得的生存力明显更高， 例如， 样品 11 在储存 9 个月后具有 1.5LOG 或高出 24 倍 ( 见图 2B)。样品 17 和 18 大于 2LOG 或超过 80 倍。
     在表 11 中， 在制备燕麦棒并将其在室温下储存之前， 将含微生物嗜酸乳杆菌的试 验样品直接加入冷却的结合糖浆和 Cascadian 格兰诺拉燕麦谷物中， 并彻底混 合。储存 6 个月后， 用本发明的包被层包被的嗜酸乳杆菌 NCFM( 样品 11) 的稳定性比未包 被细菌改进了 300 倍。
     表 11
     n.a. 不适用 ( 对照 )*25℃储存 6 个月时计算的保护系数
     实施例 8Optima 法式香草奶昔混合物中的稳定性
     以下列条件研究冻干形式 ( 样品 2) 和包被颗粒 ( 样品 11、 17 和 18) 中的嗜酸乳 杆菌 NCFM 的生存力 ：
     试验样品与 粉末为 1 ∶ 10 的比例将试验样品混入 粉末 ( 商售的 aw ＝ 0.35 的 Optima 法式香草奶昔混合物 ) 中。
     然后在单独的密封囊袋中将混合物分为 10g 的样品。
     将囊袋在培养箱中保持在 30℃下。
     在 0 时和在 30℃储存 3、 6、 9 和 12 个月后， 以标准平板培养方法分析各混合物囊袋 的有活力细胞的含量。
     表 12
     n.a. 不适用 ( 对照 )*30℃储存 12 个月时计算的保护系数
     表 12 的结果表明， 本发明的包被层的存在 ( 样品 11、 17 和 18) 导致比未包被脱水 细菌 ( 样品 2) 更高的稳定性。
     实施例 9- 吸湿速率 (MUR) 测定
     含有 NaCl 饱和盐溶液 ( 为了将封闭的盐调节至 75 ％ RH) 的玻璃干燥器保存于 25℃下。将开放托盘中的各种样品装入干燥器中并随时间温育。
     为确保精确称重调节所用的试验材料的重量 ( 例如样品质量＞ 2 克 ) 和小的样品 厚度 ( 例如小于 1cm) 以避免试验样品中水分含量的不均匀性。
     例如， 通过在塑料托盘中加入 4.7 克 K2HPO4 盐而进行 K2HPO4 盐的 MUR 测试。塑料 托盘有如下特征 ：
     托盘质量 ： 3.4 克
     托盘面积 ： 10.2cm2( 直径为 3.6cm 的圆形托盘 )
     托盘高度 ： 1.5cm
     对于 MUR 实验， 用待测试样品将圆形塑料托盘填装至其高度的一半。随后， 通过以 不同时间间隔对温育期之前和期间的样品称重而测定样品的吸湿。根据方程 1 测定各个测 试的 MUR。
     方程 1 ： MUR(t)( 以％计 ) ＝ (mt-mt0)/mt0 MUR(t) ： 吸湿百分比 mt0 ： 样品的初始质量 mt ： 在测试时间的样品质量 表 13 给出了各种盐在 25℃， 75％ RH 暴露 2、 5 和 7 天后的吸湿速率 (MUR) ： 表 13从该表可以得出结论， 氯化钙 (CaCl2)、 无水醋酸钠 (CH3COONa)、 氯化镁 (MgCl2)、 磷酸氢二钾 (K2HPO4) 和碳酸钾 (K2CO3) 被视为本发明的吸湿盐， 因为它们在 7 天时的 MUR 值 (25℃， 75％ RH) 显著高于 20％ w/w。
     从同一表中也可以得出结论， 硫酸镁 (MgSO4)、 乳酸钙 ((CH3CHOHCOOCa)、 硫酸钠 (Na2SO4)、 碳酸钙 (CaCO3)、 磷酸二氢钾 (KH2PO4)、 三水合醋酸钠 ((CH3COO)2Na·3H2O) 和二水 合柠檬酸三钠 (HOC(COONa)(CH2COONa)2) 被视为本发明的非吸湿盐， 因为它们在 7 天时的 MUR 值 (25℃， 75％ RH) 显著低于 20％ w/w。
     图 3 显示包被的脱水微生物样品的吸湿速率。含有 NaCl 饱和盐溶液的玻璃干燥 器 ( 为了将包被的脱水微生物样品调节至 75％ RH) 保存于 37℃。 将开放托盘中的各种样品 装入干燥器中并培养 3 天。随后， 通过在不同时间间隔的培养期之前和期间称重样品而测 定样品的吸湿。图 3 显示 3 天时间内 75％ RH 和 37℃下随时间变化的包被脱水微生物的％ 重量增加。
     从表 3 可以得出结论， 包含 40％或 48％吸湿盐 (K2HPO4) 的包被层 ( 样品 10 和 11) 比仅包含 14％吸湿盐 (K2HPO4) 和 76％其它任选成分 ( 滑石和蔗糖 ) 的包被层 ( 样品 12) 更
     适合于吸收水分。这种吸湿的差别与吸湿盐的量和 / 或与包含吸湿盐的包被层的结构 ( 例 如与处理时的包被层的部分结晶度 ) 有关。以太高其它任选成分含量 ( 即高于 70％， 样品 12) 为代价而具有太少量吸湿盐 ( 即低于 25％ ) 的包被层或仅用非吸湿盐 ( 即样品 13 中 的 Na2SO4， 样品 14 中的 MgSO4) 的包被层不能有效吸收足够量的水分。
     实施例 10-X- 射线粉末衍射
     对盐包被层涉及对脱水微生物的稳定性影响的性质进行了研究。使用 X- 射线衍 射分析测定不同盐包被层的 “晶体” 对 “无定形” 的性质。
     方法描述 ：
     通过将材料置于样品支架中和使上表面水平进行 XRD 粉末分析。样品置于 X 射线 衍射仪中， 其中 X 射线聚焦于样品上。X 射线根据样品中原子排列而散射。如果原子以有 序的重复结构排列， 如在晶体中， XRD 图将显示一系列尖峰。由于每种晶体材料产生独特的 X- 射线衍射图， 可通过从样品图中将已知成分除去， 然后将剩余谱图与文库 ( 例如国际衍 射数据中心 (ICDD) 标准集 ) 或已知参考谱图比较而确定样品成分。
     包被的脱水微生物 ：
     - 通 过 液 体 途 径 获 得 的 包 被 脱 水 微 生 物， 其中包被层是以喷涂共处理的 K2HPO4(48％干重 )、 KH2PO4(35％干重 )、 滑石 (17％干重 ) 和 0％蔗糖 ( 样品 10)( 图 4- 弱 结晶 )。
     - 通过液体途径获得的包被微生物， 其中包被层是以喷涂共处理的 K2HPO4(40％干 重 )、 KH2PO4(29％干重 )、 滑石 (14％干重 ) 和蔗糖 (17％干重 )( 样品 11)( 图 5- 弱结晶， 盐 不结晶 )。
     - 通过液体途径获得的包被微生物， 其中包被层是以喷涂共处理的 K2HPO4(14％干 重 )、 KH2PO4(11％干重 )、 滑石 (22％干重 ) 和蔗糖 (54％干重 )( 样品 12)( 图 6- 弱结晶， 少 量蔗糖晶体为无水的， 盐不结晶 )。
     - 通过液体途径制备的包被微生物， 但具有通过喷涂共处理的一种非吸湿盐 (K2HPO4) 和滑石的包被层 ( 样品 16)( 图 7- 主要为晶体 )。
     - 通过固体途径获得的包被微生物， 其中包被层是以喷涂共处理的 K2HPO4(40％干 重 )、 KH2PO4(29％干重 )、 滑石 (14％干重 ) 和蔗糖 (17％干重 )( 样品 20)( 图 8- 弱结晶， 因 此主要为无定形的 )。
     - 通过固体途径获得的包被微生物， 其中包被层是以喷涂共处理的 Na2SO4( 样品 21)( 图 9- 主要为晶体， 因此少量为无定形的 )。
     根据本发明产生的包被层的物理状态表现为部分结晶的。在高蔗糖含量时 ( 样品 12)， 盐和蔗糖混合物表现出蔗糖结晶的开始， 但没有盐结晶。然而， 如图 3 所示， 高蔗糖含 量包被层 ( 例如样品 12) 降低了包被层的 MUR， 并因此低晶体固体状态赋予的效益显著降低 了。
     实施例 11- 差示扫描量热法 (DSC) 测定结晶度和玻璃转化温度
     方法 ：
     用 DSC 获得本发明包被层的玻璃转化温度和包被层中盐的结晶度。配备内部冷 却器的 Netzch DSC 204(Netzsch， 德国 ) 用于所有测定， 以 N2 为冲洗剂。尽可能迅速地将 10mg 样品称量至标准铝盘中以避免水分吸附。封闭盘， 冷却各样品并在初始温度 -50℃下保持 2 分钟。然后将样品以 12℃ min-1 从 -50℃加热至 330℃， 在 330℃保持 3 分钟。
     样品的制备 ：
     在用于将包被层施加到本发明脱水微生物上的同样的处理条件下对制备的干燥 包被层进行测试。 该测试中分析的包被层不施加到初级颗粒上以避免核心的干扰。 事实上， 发现来自核心材料的峰与包被材料的一些峰在同样的温度下出现。
     制备磷酸二氢钾 (KH2PO4)、 磷酸氢二钾 (K2HPO4) 及 45％ K2HPO4、 35％ KH2PO4 和 20％ 蔗糖的混合物的 30wt％水溶液， 并在流化床中将各种溶液雾化和干燥， 分别得到样品 A、 B 和 C。
     表 14 描述了通过 DSC 分析的干燥盐包被层 ( 样品 A、 B 和 C) 的组成， 表 15 总结了 用于这些样品的处理参数。样品在 55℃的产物温度时进行后干燥 15 分钟。
     表 14
     表 15处理参数 设置 喷嘴 进口温度 产物温度 雾化压力 空气流速 值 底喷 1.2mm 70℃ 55℃ 3.5 巴 120m3/h
     DSC 数据的解释 ( 第 1 部分 ) ：
     根据样品 A、 B 和 C 测定的峰的结晶热来确定本发明的包被层中盐的结晶度。结晶 热取决于样品中存在的结晶材料的量。图 10、 11 和 12 显示了这三种样品的温谱图的解释。 测定观察的各结晶峰的晶体熔点 ( 开始温度 ) 和结晶热 ( 以 J/g 计的面积 ) 并表示在表 16 中。
     表 16
     * 面积对应于结晶热 对于 KH2PO4， 测定开始 T℃＝ 255℃的晶体熔点和 -244.2J/g 的结晶热。 对于 K2HPO4， 测定开始 T℃＝ 45℃的晶体熔点和 -38J/g 的结晶热。 对于 KH2PO4/K2HPO4/ 蔗糖混合物，- 在 256.3℃， 即与 KH2PO4 相同的 T℃范围测定了一个峰， 但其结晶热 -13.1J/g 低 于 KH2PO4( 样品 A) 的测得值， 而且
     - 在 46.8℃， 即与 K2HPO4 相同的 T℃范围测定了一个峰， 但其结晶热 9.2J/g 低于 K2HPO4( 样品 B) 的测得值。
     考虑到混合物中存在的各磷酸盐的量， 例如 35wt％ KH2PO4 和 45wt％ K2HPO4， 而且 如果混合物中两种盐都是 100％晶体， 各产生的结晶热为
     -KH2PO4 为 85.5J/g(85.5J/g ＝ -244.2J/gxKH2PO4 的 35wt％ ) 和
     -K2HPO4 为 17.4J/g(17.4J/g ＝ -38.7xK2HPO4 的 45wt％ )
     然而， 该包被层 ( 样品 C) 测量值比混合物中两种盐都是 100％晶体时估算的值低 得多。
     - 对应于 KH2PO4 的开始温度 256.3℃的峰为 13.1J/g
     - 对应于 K2HPO4 的开始温度 46.8℃的峰为 9.2J/g
     因此包被层中各盐的结晶度可以如下确定 ：
     -13.1/-85.5 ＝ 15.3％， 例如 K2HPO4 为 15.3％晶体， 84.7％无定形
     -9.2/-17.4 ＝ 52.9％， 例如 K2HPO4 为 52.9％晶体， 47.1％无定形
     在 1g 包被层中， 有 0.35g KH2PO4 和 0.45g K2HPO4
     0.35gx15.3％结晶度＝ 0.053g 晶体形式的 KH2PO4
     0.45gx52.9％结晶度＝ 0.238g 晶体形式的 K2HPO4
     因 此， 晶 体 形 式 的 盐 的 总 量 (KH2PO4+K2HPO4) 为 每 g 包 被 层 0.2916g(0.053g+0.238g)， 因此， 在处理时， 包被层中盐的结晶度为 29.1％。
     DSC 数据的解释 ( 第 2 部分 ) ： 另外， 图 4 显示了样品 C(35％ KH2PO4、 45％ K2HPO4 和 20％蔗糖 ) 测得的玻璃转化温度。Tg 的存在暗示包被层的无定形结构的存在， 用结晶热的 方法验证了上述途径。
     DSC 数据解释的结论 ： 以玻璃转化温度确定了流化床干燥的样品 C 的半晶体结构。包被层中盐的结晶度被定量为约 29％。
     实施例 12- 水蒸气吸附等温线
     样品的制备 ：
     根据本发明的方法制备具有各种包被层的包被脱水微生物。 这些包被层等同于表 1 中所述的那些， 样品号 10、 11、 13、 14、 15、 16、 23、 24、 25、 26、 27 和 28 的 “第一包被层” 。
     将包被层施加到脱水微生物上 ( 标记为 “+ 细胞” ) 或直接施加到不含脱水微生物 的核心上 ( 标记为 “- 细胞” )。所施加的包被层的量为 30wt％。处理参数为 ：
     处理参数 设置 喷嘴 进口温度 产物温度 雾化压力 空气流速
     值 底喷 1.2mm 65-70℃ 55℃ 2-2.5 巴 120-200m3/h方法 ： 为了产生吸附等温线， 将各个不同的样品置于一系列玻璃干燥器中， 各干燥 器包含特定盐的饱和盐溶液， 以将样品的相对湿度 (％ RH) 调节为 11.3％、 22.5％、 32.8％、 43％和 75％。表 17 总结了用于在 25℃达到目标相对湿度的盐。
     表 17
     盐 ％ RH(25℃ )
     LiCl 11.3％ KCH2CO2 22.5％ MgCl2 32.8％ K2CO3 43％ NaCl 75％将包含样品的玻璃干燥器置于恒定温度， 例如 25 ℃下。各样品按规则时间间隔 (t) 称重。根据方程 1( 前面在实施例 9 中所述 ) 测定各测量的吸湿速率 MUR(t)， 并绘出水 蒸气吸附等温线 (MUR(t) ＝ f(t))， 其中 MUR(t) 代表通过在测量时样品的％重量增加而测 定的吸湿百分比。
     附图简要说明
     图 13 是用不同盐包被层组合物包被的微生物在 25 ℃下暴露于 11.3 ％、 22.5 ％、 32.8％、 43％和 75％ RH 的相对湿度条件下 28 天的水蒸气吸附等温线。
     图 14 至 19 涉及包含包被脱水微生物的颗粒暴露于 11.3％、 22.5％、 32.8％、 43％ 和 75％ RH 的各种相对湿度条件下 28 天的 25℃的水蒸气吸附等温线。
     颗粒由如下组成 ：
     - 仅仅核心 (·)- 核心 + 细胞层 (*)- 称为 “参照样品”
     - 核心 + 盐包被层 ()
     - 核心 + 细胞层 + 盐包被层 ( ◇ )- 称为 “产物” 或包被的脱水微生物
     盐包被层是表 1 中描述为第 1 包被层的样品， 即样品 11( 图 14)、 样品 10( 图 15)、 样品 15( 图 16)、 样品 13( 图 17)、 样品 12( 图 18)、 样品 16( 图 19)。
     数据解释 ( 图 13、 表 18 和表 19) ：
     水蒸气吸附等温线的吸湿曲线容许对湿度对包被脱水微生物的含水量的影响进 行定量。 在 25℃， 75％ RH 下， 2、 7 和 28 天时测定包被脱水微生物或 “产物” 的吸湿速率 (MUR) ( 表 18)。表 19 所示包被层的 MUR 值为根据方程 2 计算所得。
     方程 2 ： 脱水包被微生物 MUR(t)， 以％计＝ (mt-mt0)/mt0
     MUR(t) ： 在时间 T 时脱水包被微生物的吸湿百分比
     mt0 ： 脱水包被微生物样品的初始质量
     mt ： 在测定时间的脱水包被微生物的质量
     表 18
     表 18 的结果显示， 取决于所用的盐包被层， 包被脱水微生物吸收水分的量差异很 大。 样品 25、 15、 10 和 11 是高度吸湿性的， 每单位重量包被脱水微生物吸收 9wt％至 19wt％ 的水分。样品 25(MgCl2) 和样品 15(K2HPO4) 是最吸湿的。另外， 图 13 中的吸湿分布图显示 了含水量的逐渐增高， 这是无定形或部分无定形结构的特征。 相反， 之前显示几乎不对微生 物提供保护的样品， 例如样品 13(Na2SO4)、 样品 14(MgSO4) 和样品 16(KH2PO4) 吸收可忽略量 的水。
     根据方程 3 测定盐包被层的 MUR 并表示于表 19 中。
     方程 2 ： 脱水包被微生物的 MUR(t)， 以％计＝ (mt-mt0)/mt0
     MUR(t) ： 在时间 T 时脱水包被微生物的吸湿百分比
     mt0 ： 脱水包被微生物样品的初始质量
     mt ： 在测定时间的脱水包被微生物的质量
     方程 3 ： 参照 MUR(t)， 以％计＝ (mt-mt0)/mt0
     MUR(t) ： 在时间 T 时参照样品 ( 核心 + 细胞层 ) 的吸湿百分比
     mt0 ： 参照样品的初始质量
     mt ： 在测定时间的参照样品的质量
     方程 4 ： 盐包被层 MUR(t)， 以％计＝ [ 产物 MUR(t)-( 参照 MUR(t)* 参照 wt％ )]/ 盐包被层 wt％，
     其中参照样品 wt％＝ 70％，
     其中盐包被层 wt％＝ 30％
     表 19
     表 19 的结果显示， 取决于用于包被脱水微生物的盐， 在不同包被层中吸收水分的 量差异很大。样品 25、 15、 10 和 11 吸收大量水分并显示出包被层含水量的强烈改变。样品 25(MgCl2) 和样品 15(K2HPO4) 是最吸湿的。相反， Na2SO4( 样品 13 中 )、 MgSO4( 样品 14 中 ) 和 KH2PO4( 样品 16 中 ) 吸收可忽略量的水分， 并导致包被层含水量的非常小的改变。
     从图 14 至 17 的图形显示了具有不同核心材料 ( 仅仅核心， 核心 + 细胞层 ) 但具 有相同盐包被层的颗粒吸收水分量的显著差异。
     如图 14、 图 15 和图 16 所示， 包含吸湿盐的盐配方 ( 样品 10、 11 和 15) 显示具有和 没有细胞的颗粒吸湿量没有差异。
     如图 17、 图 18 和图 19 所示， 包含少于 25％的吸湿盐 ( 样品 12) 或仅仅由非吸湿盐
     组成 ( 样品 13 和 16) 的盐配方显示具有和没有细胞的吸湿量的显著性差异。具有细胞层 的颗粒 ( 例如包被的脱水微生物 ) 与不具有细胞层的颗粒相比吸收了更大量的水分。该结 果显示如果包被层允许水分通过， 下层材料将吸收更大量的水分。当包被层包含少于 25％ 的吸湿盐 ( 样品 12) 或不含任何吸湿盐而含非吸湿盐 ( 样品 13 和 16) 时， 含细胞层的样品 可以观察到这一点。在压迫性条件下这些样品不能维持细胞生存力。
     实施例 13- 盐包被层的 pH 对包被脱水嗜酸乳杆菌 NCFM 存活的影响。
     盐包被层的 pH 对包被的脱水嗜酸乳杆菌 NCFM 存活的影响的结果在表 20 中给出。
     K2HPO4 是碱性盐， 在包被前用乳酸将 K2HPO4 溶液的 pH 调节至 pH ＝ 6.5。这导致 当以包被的脱水微生物的 10wt％水溶液测量时包被的脱水微生物的 pH 从 pH 8 降低至 pH 6.5。观察到嗜酸乳杆菌 NCFM 抗性的显著增强 ：
     i) 在流化床包被期间， 嗜酸乳杆菌 NCFM 的处理存活率从 65％提高至 90％
     ii) 在干燥条件下 37℃储存 14 天后， 有活力的嗜酸乳杆菌 NCFM 的回收率从 7％增 加至 83％，
     iii) 在热处理 (64 ℃ /18hrs) 后， 嗜酸乳杆菌 NCFM 的 LOG 损失从大于 5.3 减至 0.6。
     pH 调节至 6.5 的 K2HPO4 包被层保持了吸湿性， 其中包被脱水微生物的吸湿性为 ： 在 pH 调节前吸收 12.8wt％水分， 在 pH 调节后吸收 11.6wt％水分。( 条件 ： 75％ RH、 25℃、 6 天 )。
     这些结果显示， 需要具有与微生物的生存力相容的包被层 pH。
     KH2PO4 是酸性盐， 在包被前用氢氧化钠 (NaOH) 将 KH2PO4 溶液的 pH 调节至 pH 6.5。 这导致当包被的脱水微生物以 10wt％悬浮在水中后测定时， pH 从 pH 5.0 增加至 pH 6.5。 观察到嗜酸乳杆菌 NCFM 生存力损失的显著降低 ：
     i) 在流化床包被期间， 嗜酸乳杆菌 NCFM 的处理存活率从 47％提高至 100％，
     ii) 在干燥条件下 30℃储存 14 天后， 有活力的嗜酸乳杆菌 NCFM 的回收率从 2％增 加至 95％，
     iii) 在热处理 (64℃ /18hrs) 后， 有活力的嗜酸乳杆菌 NCFM 的 LOG 损失从＞ 5.0 减至 0.6，
     iv) 在 Aw ＝ 0.4 的麦芽糖糊精中储存 (37℃ /9 天 ) 后， 有活力的嗜酸乳杆菌 NCFM 的回收率从 1％增加至 44％。
     pH 调节至 6.5 的 KH2PO4 包被层的吸湿性可能急剧增加， 其中包被的脱水微生物的 吸湿性从 pH 调节前的 1.3％变为以 NaOH 调节 pH 后的 12.8wt％吸湿 ( 条件 ： 75％ RH、 25℃、 6 天 )。这些结果显示， 通过 pH 调节， 可通过将非吸湿性质转化为吸湿性质而获得适合的包 被层， 从而能够在各种压迫性条件下稳定嗜酸乳杆菌 NCFM。
     表 20
     * 包被脱水微生物 10％水溶液的 pH
     实施例 14- 固体途径
     在实施例 6 所述条件下研究冻干形式和包被颗粒 ( 固体途径 ) 中的脱水嗜酸乳杆 菌 NCFM 的生存力。
     以 10％ wt 的包被细菌和 90％ wt 的麦芽糖糊精粉末的比例将细菌制剂混入麦芽 糖糊精粉末 (aw ＝ 0.4) 中。将小瓶在培养箱中保持在 30℃。在 30℃储存 2 个月后， 以标 准平板培养方法分析小瓶混合物的有活力细胞的含量。结果列在表 21 中。有活力细胞的 浓度以 CFU/g 表示， 并表示为各样品在 T ＝ 0 时浓度的百分比。
     表 21
     样品 2 20
     T＝0 2.52E+11 1.84E+11 2 个月 9.78E+08 5.30E+10 ％存活 0.4％ 29％ 相比对照的保护系数 n.a. 74n.a. 不适用 ( 对照 )*30℃储存 2 个月时计算的保护系数
     施加到冻干嗜酸乳杆菌 NCFM 粉末上的本发明包被层 ( 样品 20 ： K2HPO4(40 ％干 重 )、 KH2PO4(29％干重 )、 滑石 (14％干重 ) 和蔗糖 (17％干重 )) 能在中间湿度下非常有效 地维持嗜酸乳杆菌 NCFM 的生存力。本发明包被层稳定脱水微生物的效果已经在之前按照 液体途径制备的包被脱水微生物中证明。 现在在本实施例中证明了本发明包被层对按照固 体途径制备的包被脱水微生物也是有效的。
     实施例 15- 在婴儿配方食品中的稳定性以下列条件研究冻干形式 ( 样品 2) 和本发明的包被脱水微生物 ( 样品 11) 中嗜 酸乳杆菌 NCFM 的生存力。
     以 测 试 样 品 与 婴 儿 配 方 粉 末 1 ∶ 10 的 比 例 将 测 试 样 品 混 入 来 自 雀 巢 的 商 售″ Good Sense Gentle Plus″ Instant Baby Formula(Aw ＝ 0.157) 中。然后在单独的 密封囊袋中将混合物分为 10g 样品。将囊袋在培养箱中保持在 30℃。在 0 时和在 30℃下 储存 1、 3、 6 和 9 个月后， 以标准平板培养方法分析各混合物囊袋的有活力细胞的含量。
     表 22
     n.a. 不适用 ( 对照 )*30℃储存 9 个月时计算的保护系数
     表 22 的结果显示， 本发明包被层的存在 ( 样品 11) 导致稳定性比未包被脱水细菌 ( 样品 2) 提高。