技术领域
本发明涉及苯甲酸衍生物的药物新用途，进一步涉及肉桂氨茴酸类药物的医药新用途，具体涉及肉桂氨茴酸及其衍生物或其盐、或含有它们的组合物在制备用于抗急性排斥反应或者诱导免疫耐受药物中的应用。
背景技术
器官移植经过近60年的发展，走过免疫抑制药物和器官移植技术两个发展巅峰后，已经能够成功的控制绝大多数的急性排斥反应，成为一些临床终末期疾病的常规治疗手段。但是不论如何努力，现有的临床免疫抑制药物已经很难在长期存活方面给病人带来更进一步的提高，而且因为免疫排斥因素或者免疫抑制药物带来的毒副作用等原因，每年都面临着5-15％的移植器官失去功能，这成为移植病人和移植物长期存活的瓶颈所在。目前的免疫抑制药物，特别是钙调蛋白抑制剂(CNI)如环孢菌素A和FK506等，不仅有严重的肾脏毒性和其他严重副作用，而且还抑制调节性细胞的产生以及分裂和增殖。从这个作用层面看，钙调蛋白抑制剂可能成为阻碍移植物长期存活以及诱导免疫耐受的一个障碍。雷帕霉素与钙调蛋白抑制剂相比，能够增强调节性T细胞的增殖活性及功能，但增加的调节性T细胞与保持移植物功能之间并未显示出相关性。因此，寻找能够诱导产生供体特异性调节性细胞并且由该细胞介导免疫耐受的药物和治疗方案是最终解决这个问题的关键，目前成为移植领域研究的焦点。
移植免疫耐受的定义为：在不服用免疫抑制剂和保持患者正常免疫功能的前提下，受体对移植物无破坏性的免疫应答，使移植物功能保持稳定的一种状态。在器官移植中免疫耐受状态的存在和获得免疫耐受策略的同时，也给自身免疫疾病和变态反应性疾病的治疗提供新思路，很多自身免疫性疾病通过免疫重建或者免疫耐受治疗，可以缓解病情。
目前主动的器官移植免疫耐受诱导工作已经在一些临床研究中心开始临床实验，国际的免疫耐受合作网络协调多中心的合作的研究显示，大约20％的肝移植入选病例可以成功的停止免疫抑制药物，并维持良好的移植物功能。说明主动诱导移植免疫耐受不仅可行，而且具有广阔的前景。
但是，上述免疫耐受的成功，并不能够很好的由免疫嵌合理论来解释，目前临床上主动诱导病人的免疫耐受在理论上还具有一定的盲目性。因为诱导免疫嵌合的治疗方案并没有带给我们预期的免疫耐受，而且免疫耐受的受体内，免疫嵌合的细胞数目也与移植器官的功能并不相关联。
最近几年关于调节性细胞的研究，提示调节性细胞是成功实现诱导免疫耐受的新理论基础。参见Garden OA，Pinheiro D，Cunningham F.All creatures great and small：Regulatory T cells in mice，humans，dogs and other domestic animal species.Int Immunopharmacol.2010Nov 17.[Epub ahead of print]；和Nafady-Hego H，Li Y，Ohe H，The generation of donor-specific CD4+CD25++CD45RA+naive regulatory T Cells in operationally tolerant patients after pediatric living-donor liver transplantation.Transplantation.2010Nov 16.[Epub ahead of print])。
调节性细胞是一类具有较低增殖能力，能够抑制免疫反应的细胞群，其在免疫病理、移植物耐受、阻止自身免疫反应和维持机体免疫平衡方面发挥重要作用，常见的有CD4+CD25+调节性T细胞、CD8+调节性T细胞、调节性B细胞、调节性NK细胞和调节性树突状细胞等。调节性细胞还能把在体内的免疫耐受状态从一个受体过继传输给另一个受体，或者在体外通过细胞培养后过继传输给另一个受体。通常认为在体内的免疫耐受转移是通过对细胞毒性杀伤或细胞增殖抑制的结果。
供体特异性的调节性细胞可以介导免疫耐受，过继传输免疫耐受源性的调节性细胞可以诱导免疫耐受的产生，已经在多个器官移植模型中得到了很好证明。近年，国际上临床免疫耐受病人的研究也纷纷聚焦于移植免疫耐受病人体内调节性细胞的诱导产生和转移，调节性细胞的产生与移植物功能以及移植物的长期存活相关。
2004年日本Kyoto器官移植中心，发现在免疫耐受的肝脏移植病人的外周血液中，CD4+CD25high调节性细胞、B细胞和δ1-γδTCR+T细 胞数量明显增加。Pons发现在肝脏移植免疫耐受的病人外周血中，CD4+CD25high调节性细胞显著增加并伴有明显升高的Foxp3表达。法国研究所的多中心肾脏移植免疫耐受病人研究表明，CD8+调节性细胞在肾脏移植免疫耐受中起到重要作用。2008年Trzonkowski在肾脏移植病人中发现免疫抑制特性的CD8+CD28-细胞存在。其他的一些临床长期存活的器官移植受体和不需要用免疫抑制剂维持的免疫耐受病人观察中，CD8+调节性细胞的作用越来越受到重视。在肾脏移植、心脏移植以及肝脏和小肠联合移植的免疫耐受病人中，都有调节性细胞的报道。
目前临床应用的免疫抑制药物，没有药物可以明确地促进产生供体特异性调节性细胞从而诱导免疫耐受。
肉桂氨茴酸，化学结构式为式I：
化学名称为：2-[[3-(3，4-二甲氧基)苯基-1-氧代-2-丙烯基]氨基]苯甲酸；商品名为曲尼斯特(Tranilast)，它是吲哚胺2，3双加氧酶(IDO)或色氨酸2，3双加氧酶(TDO)降解色氨酸代谢产物之一，曾经广泛用于抗过敏反应，比如治疗呼吸道哮喘、过敏性鼻炎、特应性皮炎、过敏性结膜炎等，以及皮肤疾病，比如瘢痕疙瘩和增生性瘢痕等。因为该类药物被发现可以抑制引起过敏反应的化学介质，同时，也可以抑制纤维母细胞引起的在皮肤组织内过度的胶原聚集。
日本专利申请Hei-6-135829和Hei-9-227371公开了肉桂氨茴酸可以抑制冠状动脉腔内成形术(PTCA)后引起的血管平滑肌细胞的过度增殖，用于治疗和预防PTCA引起的冠状血管再狭窄，该类药物还可以减低动脉粥样硬化的沉积，用于抑制动脉硬化的形成。
美国专利US 6552083B1公开了肉桂氨茴酸类药物可以抑制移植心脏内的血管增厚，并抑制淋巴细胞向移植物的浸润，被应用于器官移植的抗慢性排斥反应治疗。
美国专利申请US 2010/0158905 A1公开了肉桂氨茴酸类药物可以抑制淋巴细胞的增殖，用于类风湿性关节炎的治疗。
目前尚未发现，肉桂氨茴酸类药物用于移植手术后的抗急性排斥反应治疗和诱导免疫耐受的应用。
发明内容
发明人在啮齿类动物的器官移植模型上对肉桂氨茴酸类药物进行了研究，结果发现肉桂氨茴酸类药物不仅能够保护多数移植物度过急性排斥反应期，延长移植物的存活，而且肉桂氨茴酸类药物还使移植受体产生免疫耐受状态。进一步研究发现，肉桂氨茴酸类药物能够诱导移植受体内产生调节性细胞；而且研究还发明，通过过继传输所述调节性细胞，同样可以使移植受体产生免疫耐受状态，本发明首次发现了肉桂氨茴酸类药物可以促进供体特异性调节性细胞的产生。
因此，本发明提供了苯甲酸生物的药物新用途，进一步提供了肉桂氨茴酸类药物的一种新药物用途，即肉桂氨茴酸及其衍生物或其盐，或含它们的组合物在制备用于移植术后的抗急性排斥反应或诱导免疫耐受药物中的应用。
在一实施方案中，本发明还提供一种肉桂氨茴酸及其衍生物或其盐，或含它们的组合物在制备用于诱导移植受体产生调节性细胞的药物中的应用。
在一实施方案中，本发明肉桂氨茴酸及其衍生物或其盐，或含它们的组合物在制备用于移植术后诱导免疫耐受药物中的应用中，将有效治疗量的肉桂氨茴酸及其衍生物或其盐，或含它们的组合物直接向受体给药。
在另一实施方案中，本发明肉桂氨茴酸及其衍生物或其盐，或含它们的组合物在制备用于移植术后诱导免疫耐受药物中的应用中，先将有效治疗量的肉桂氨茴酸及其衍生物或其盐，或含它们的组合物作用于混合培养的供受体细胞，诱导产生调节性细胞，然后将有效治疗浓度的调节性细胞向受体过继传输。在所述应用中，例如，可以用血细胞分离机采集供受体外周血单核细胞。保证细胞数量至少大于1*109个细胞。然后将供受体细胞按照比例进行混合淋巴细胞培养，加入肉桂氨茴酸及其 衍生物或其盐等适宜的药物进行处理。同时应用不同的细胞因子给予诱导和刺激，保证诱导出有供体特异性的淋巴细胞亚群。然后根据调节性细胞的表面标记，用免疫磁珠阴性细胞吸附法选择性收集调节性细胞，进行过继传输。通过外周血管直接回输到受体体内。例如可参考：(F.Cell therapy approaches aiming at minimization of immunosuppression in solid organ transplantation.Curr Opin Organ Transplant.2010 Oct 7.[Epub ahead of print]；Shuiping Jiang，Julia Tsang，Paul Tam.Regulatory T cell immunotherapy for transplantation tolerance：Step into clinic.International Immunopharmacology 2010；10：1486-1490)
另外，本发明还提供一种肉桂氨茴酸及其衍生物或其盐，或含它们的组合物在制备用于移植术后抗急性排斥反应药物中的应用；在肉桂氨茴酸及其衍生物或其盐，或含它们的组合物在制备用于移植术后抗急性排斥反应药物中的应用中，包括但不限于将有效治疗量的肉桂氨茴酸及其衍生物或其盐，或含它们的组合物直接向受体给药。
根据本发明以上所述的应用，所述移植包括但不限于细胞移植、器官移植或组织移植；其中细胞移植包括但不限于干细胞移植、调节性细胞移植、胰岛细胞移植、效应性细胞移植等；器官移植包括但不限于肾移植、肝移植、心脏移植、小肠移植、肺移植、胰腺移植、或者联合器官移植等实体或者空腔脏器器官移植；组织移植包括但不限于角膜移植、肢体移植、脸移植等。在一实施方案中，所述移植优选包括肾移植、肝移植、小肠移植、胰腺移植、心脏移植、肺移植、角膜移植或干细胞移植；在一实施方案中，本发明所述移植进一步为器官移植。
根据本发明以上所述的应用中，所述调节细胞包括但不限于CD4+CD25+调节性T细胞、CD8+调节性T细胞、调节性B细胞、调节性NK细胞、NON-T淋巴细胞和/或调节性树突状细胞；其中作为优选实施方案，所述调节性细胞为NON-T淋巴细胞、调节性树突状细胞；所述调节性树突状细胞包括但不限于pDC细胞、mDC细胞、CD4+mDC细胞、CD4-mDC细胞、CD8+mDC细胞、CD8-mDC细胞，或者其他由单核细胞培养出来的树突状细胞以及由骨髓细胞诱导分化出来的树突状细胞等。
根据本发明以上所述的应用中，所述肉桂氨茴酸及其衍生物或其盐 包括以下化学结构式II的化合物或其盐：
其中，X为羟基、卤素、具有1-4碳的烷基、或具有1-4碳的烷氧基、n为1、2或3的整数；进一步优选X为甲基、乙基、丙基、羟基、氟、氯、溴、甲氧基、乙氧基、丙氧基、亚甲基或亚乙基；所述盐包括无机盐，例如包括但不限于盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐、硝酸盐、碳酸盐、硼酸盐、氨基磺酸盐及氢溴酸盐等；或有机盐，例如包括但不限于如乙酸盐、丙酸盐、丁酸盐、酒石酸盐、马来酸盐、羟基马来酸盐、富马酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、黏液酸盐、葡萄糖酸盐、苯甲酸盐、琥珀酸盐、草酸盐、苯乙酸盐、甲基磺酸盐、对甲苯磺酸盐、苯磺酸盐、对氨基水杨酸盐、天门冬氨酸盐，谷氨酸盐、依地酸盐、硬脂酸盐、棕榈酸盐、油酸盐、月桂酸盐、泛酸盐、鞣酸盐、抗坏血酸盐和戊酸盐；所述的碱基盐包括但不限于钠盐、钾盐、锂盐、镁盐、钙盐、铵盐或烷铵盐。
在一实施方案中，所述肉桂氨茴酸及其衍生物或其盐进一步优选选为：
2-[[3-(2-甲基)苯基-1-氧代-2-丙烯基]氨基]苯甲酸
2-[[3-(3-甲基)苯基-1-氧代-2-丙烯基]氨基]苯甲酸
2-[[3-(4-甲基)苯基-1-氧代-2-丙烯基]氨基]苯甲酸
2-[[3-(2-乙基)苯基-1-氧代-2-丙烯基]氨基]苯甲酸
2-[[3-(3-乙基)苯基-1-氧代-2-丙烯基]氨基]苯甲酸
2-[[3-(4-乙基)苯基-1-氧代-2-丙烯基]氨基]苯甲酸
2-[[3-(2-丙基)苯基-1-氧代-2-丙烯基]氨基]苯甲酸
2-[[3-(3-丙基)苯基-1-氧代-2-丙烯基]氨基]苯甲酸
2-[[3-(4-丙基)苯基-1-氧代-2-丙烯基]氨基]苯甲酸
2-[[3-(2-羟基)苯基-1-氧代-2-丙烯基]氨基]苯甲酸
2-[[3-(3-羟基)苯基-1-氧代-2-丙烯基]氨基]苯甲酸
2-[[3-(4-羟基)苯基-1-氧代-2-丙烯基]氨基]苯甲酸
2-[[3-(2-氯)苯基-1-氧代-2-丙烯基]氨基]苯甲酸
2-[[3-(3-氯)苯基-1-氧代-2丙烯基]氨基]苯甲酸
2-[[3-(4-氯)苯基-1-氧代-2-丙烯基]氨基]苯甲酸
2-[[3-(2-氟)苯基-1-氧代-2-丙烯基]氨基]苯甲酸
2-[[3-(3-氟)苯基-1-氧代-2-丙烯基]氨基]苯甲酸
2-[[3-(4-氟)苯基-1-氧代-2-丙烯基]氨基]苯甲酸
2-[[3-(2-溴)苯基-1-氧代-2丙烯基]氨基]苯甲酸
2-[[3-(3-溴)苯基-1-氧代-2-丙烯基]氨基]苯甲酸
2-[[3-(4-溴)苯基-1-氧代-2-丙烯基]氨基]苯甲酸
2-[[3-(2，3-二甲氧基)苯基-1-氧代-2丙烯基]氨基]苯甲酸
2-[[3-(3，4-二甲氧基)苯基-1-氧代-2-丙烯基]氨基]苯甲酸
2-[[3-(2，4-二甲氧基)苯基-1-氧代-2-丙烯基]氨基]苯甲酸
2-[[3-(2，3-二甲基)苯基-1-氧代-2丙烯基]氨基]苯甲酸
2-[[3-(3，4-二甲基)苯基-1-氧代-2-丙烯基]氨基]苯甲酸
2-[[3-(2，4-二甲基)苯基-1-氧代-2丙烯基]氨基]苯甲酸
2-[[3-(2，3-二乙氧基)苯基-1-氧代-2-丙烯基]氨基]苯甲酸
2-[[3-(3，4-二乙氧基)苯基-1-氧代-2-丙烯基]氨基]苯甲酸
2-[[3-(2，4-二乙氧基)苯基-1-氧代-2-丙烯基]氨基]苯甲酸
2-[[3-(2，3-二乙基)苯基-1-氧代-2丙烯基]氨基]苯甲酸
2-[[3-(3，4-二乙基)苯基-1-氧代-2-丙烯基]氨基]苯甲酸
2-[[3-(2，4-二乙基)苯基-1-氧代-2-丙烯基]氨基]苯甲酸
2-[[3-(2，3-二丙基)苯基-1-氧代-2丙烯基]氨基]苯甲酸
2-[[3-(3，4-二丙基)苯基-1-氧代-2-丙烯基]氨基]苯甲酸
2-[[3-(2，4-二丙基)苯基-1-氧代-2-丙烯基]氨基]苯甲酸
2-[[3-(2-甲氧基-3-甲基)苯基-1-氧代-2丙烯基]氨基]苯甲酸
2-[[3-(2-甲氧基-4-甲基)苯基-1-氧代-2-丙烯基]氨基]苯甲酸
2-[[3-(3-甲氧基-4-甲基)苯基-1-氧代-2丙烯基]氨基]苯甲酸
2-[[3-(2-甲氧基-3-氯)苯基-1-氧代-2-丙烯基]氨基]苯甲酸
2-[[3-(2-甲氧基-4-氯)苯基-1-氧代-2-丙烯基]氨基]苯甲酸
2-[[3-(3-甲氧基-4-氯)苯基-1-氧代-2-丙烯基]氨基]苯甲酸
2-[[3-(2-甲氧基-3-羟基)苯基-1-氧代-2-丙烯基]氨基]苯甲酸
2-[[3-(2-甲氧基-4-羟基)苯基-1-氧代-2-丙烯基]氨基]苯甲酸
2-[[3-(3-甲氧基-4-羟基)苯基-1-氧代-2-丙烯基]氨基]苯甲酸
2-[[3-(3，4-二亚甲基)苯基-1-氧代-2-丙烯基]氨基]苯甲酸
2-[[3-(2，3-二亚甲基)苯基-1-氧代-2-丙烯基]氨基]苯甲酸
2-[[3-(2，3-亚甲基二氧)苯基-1-氧代-2-丙烯基]氨基]苯甲酸，或
2-[[3-(2，3-亚乙基二氧)苯基-1-氧代-2-丙烯基]氨基]苯甲酸；
在本发明中所述肉桂氨茴酸及其衍生物或其盐最佳实施方案为：2-[[3-(3，4-二甲氧)苯基-1-氧代-2-丙烯基]氨基]苯甲酸。其他的实施方案还包括但不限于3-羟基邻氨基苯甲酸[3-Hydroxy-anthranilic acid(3-HAA)]，吡啶酸picolinic acid(PA)，喹啉酸quinolinic acid(QA)，或3-羟基犬尿氨酸[3-hydroxykynurenic acid(3-HKA)]等。
根据本发明的以上所述应用，所述肉桂氨茴酸及其衍生物或其盐的有效治疗剂量依赖于个体差异，其差异依赖于不同的种属如人或动物或不同活性成分的选择，其范围从0.01毫克至500毫克每千克体重之间。在大型动物，包括人但不限于人，使用剂量范围从每天0.5毫克到5000毫克，根据需要可以分为2次到4次，但不限于2-4次给药。剂量的范围可以根据对治疗的反应调整。肉桂氨茴酸适合的口服剂量从每天1毫克到5000毫克，一般来说，肉桂氨茴酸的口服剂量为100-1000毫克，通常的口服剂量为每天300-600毫克。对于不同的受体，可以由医师根据具体受体的体重、年龄、性别、患病程度等因素进行适当调整，口服后该药物在胃肠道吸收迅速，2-3h到达血药浓度峰值，广泛分布于所有脏器、组织中，以支气管、肺浓度最高，肝肾、小肠次之，血浆半衰期5-8.6h，至24h血药浓度明显降低，48h难以检出。当胃肠外给药的剂量为每天0.01毫克到300毫克。该药物在肝脏代谢，主要从尿液排出。
上述肉桂氨茴酸结构式相似的化合物和它们在制药上可以接受的盐都是已知的，其可以采用本领域常规的制备方法进行制备，例如参见US3,940,422。日本专利Sho-56-40710，Sho-57-36905，Sho-58-17186，Sho-58-48545，Sho-58-55138，Sho-58-55139，Hei-1-28013，Hei-1-50219和Hei-3-37539)；比如Saccharomyces cerevisiae酵母发酵法等(详见于2010 年Appl.Microbiol.Biotechnol.，DOI 10.1007/s00253-010-2939-y)。
根据本发明以上所述的应用，在一实施方案中，所述含有肉桂氨茴酸及其衍生物或其盐的组合物包括有效治疗量的一种或多种的肉桂氨茴酸及其衍生物或其盐和选自环孢素/他克莫司(FK506)、霉酚酸酯(MMF)、雷帕霉素、皮质激素或者各类抗淋巴细胞抗体中的一种或多种进行联合形成组合物，或进行联合用药；所述药物组合向受体给药时，可以同时向受体给药、或以先后的循序(如先给药肉桂氨茴酸及其衍生物或其盐，然后再给另一种，或相反)，或以交叉的顺序给药。
实现这种给药方式的手段可以以人工的方式，例如将所述组合物中的各组分制成相互隔离的独立的单元制剂，受体在使用时，只需按照说明书的指示(例如包括但不限于同时服用、或按先后顺序服用等)进行使用就能够实现；或采用本领域常规的制剂制备技术将所述组合物制备成相应制剂的形式来实现，如将所述组合物制备成简单的混合制剂，只需向受体给予这种制剂就能够实现同时给药，或制成先释放一种药物、然后再释放另一种药物的控缓释制剂来实现所述组合物先后顺序的给药；或制备成交叉释放的控缓释制剂来实现药物的交叉释放。
根据本发明以上所述的应用中，所述肉桂氨茴酸及其衍生物或其盐，或肉桂氨茴酸与选自环孢素/FK506、MMF、雷帕霉素、皮质激素或者各类抗淋巴细胞抗体中的一种或多种形成的组合物可以与不同药物辅料采用本领常规的制备方法根据需要制备成不同的药物剂型，例如与赋形剂、分解剂、粘结剂、润滑剂、稀释剂、缓冲剂、等渗稳定剂、防腐剂、保湿剂、乳化剂、分散剂、稳定剂和/或溶解辅助剂制成口服制剂，例如包括但不限于糖浆剂、颗粒剂如细颗粒剂、片剂例如包括但不限于常规片剂、缓释片或控释片、胶囊如软胶囊或硬胶囊；注射剂例如包括但不限于注射液、注射用粉针、注射用冻干制剂、注射用微球和/或注射用脂质体等。
根据以上本发明所述的应用中，所述制剂的制备采用本领域常规的制备方法进行制备，例如片剂是把上述药物与适当的赋形剂、分解剂、粘结剂、润滑剂以及其他必需的添加剂混合，然后通过传统工艺压制成型。如果需要，片剂可以覆盖一层膜衣，比如糖溶衣片剂和肠溶衣片剂 等。胶囊是把上述药物与赋形剂、润滑剂以及其他必需的添加剂混合后形成不同的颗粒或者粉末，加入到胶囊包装中。
本发明通过实验验证，肉桂氨茴酸及其衍生物或其盐，或含有它们的组合物可以用于以下发面的治疗：
1)器官、组织或者细胞移植受者的抗急性排斥反应的治疗；
2)在受者体内诱导器官、组织或者细胞移植病人免疫耐受状态，促进体内产生调节性细胞；
3)作用于离体混合培养的供受体细胞，诱导调节性细胞的产生，进而通过调节性细胞过继传输，诱导器官、组织或者细胞移植受者免疫耐受或者对自体免疫疾病病人进行调节性细胞过继传输治疗。
实验证明肉桂氨茴酸可以抑制大鼠心脏移植物的急性排斥反应，显著延长移植心脏的存活期。这个实验结果在不同种系大鼠实验中得到了证实。肉桂氨茴酸延长大鼠移植心脏存活的机理基于两方面的调节，第一、该药物能够直接杀死或者抑制激活的淋巴细胞，发挥该药物的抗急性排斥反应的作用，第二、该药物可以诱导产生调节性细胞，通过调节性细胞抑制效应性细胞的激活，保护移植物。
通过肉桂氨茴酸诱导长期存活大鼠的脾细胞过继传输实验，可以在全部下一代受体内，成功诱导出了针对同一供体的免疫耐受，证明了肉桂氨茴酸可以在体内直接诱导产生调节性细胞，该细胞不仅可以直接抑制急慢性排斥反应，延长移植物存活，同时也可以诱导免疫耐受的产生。由此我们证明了肉桂氨茴酸类药物可以通过诱导产生调节性细胞进而诱导免疫耐受。
通过进一步的过继传输试验，本发明证明了这种供体特异性的调节性细胞为非T细胞亚群，这是首次发现肉桂氨茴酸类药物可以诱导产生非T调节性细胞亚群。通过流式细胞分选不同细胞亚群进行过继传输，本发明发现肉桂氨茴酸类药物可以诱导产生调节性的树突状细胞，包括浆细胞源性的树突状细胞(pDC)和髓源性的树突状细胞亚群(mDC)。这一发现揭示了肉桂氨茴酸类药物诱导免疫耐受的细胞基础之一，为肉桂氨茴酸类药物在免疫耐受诱导中的应用提供了一种理论依据。树突状细胞是供体抗原提呈的最初识别细胞，因此调节性树突状细胞的产生， 能够从免疫应答的源头开始调控，对于免疫耐受的成功诱导有着重要意义。
离体细胞培养实验发现，肉桂氨茴酸还可以在高浓度时直接杀死激活的效应细胞，在低浓度时可以强烈抑制效应性细胞的分裂增殖，具有强烈的抗急性排斥反应作用。虽然具体的机理尚不清楚，但是由于肉桂氨茴酸类药物具有双重作用机理——诱导调节性细胞以及抑制或者杀死效应细胞，肉桂氨茴酸在移植术后的抗急性排斥反应和免疫耐受诱导过程中具有重要作用。
根据本发明所述的应用，所述含有肉桂氨茴酸及其衍生物或其盐可以成为在体外培养供体特异性的调节性树突状细胞，过继传输该细胞诱导免疫耐受的方法基础之一。而这种体外诱导调节性细胞过继传输方法，也可能成为自体免疫耐受疾病的治疗手段之一。
本发明也曾经用转基因方法诱导IDO在移植大鼠心脏高表达试验组，行脾细胞过继传输，也可以诱导下一代受体获得供体特异性的免疫耐受。继续行细胞亚群过继传输，我们也发现可以诱导产生调节性的树突状细胞，得到与上面实验相似的结论。因此针对色氨酸降解途径的代谢产物及其衍生出来的具有生物活性的类似物，可以成为诱导调节性细胞的基本用药，在此基础上，通过直接体内用药或者过继传输，成为一种诱导免疫耐受的基础方案。
与传统免疫抑制药物相比，本发明中肉桂氨茴酸类药物的优势是不仅可以促进调节性细胞的产生，同时可以抑制分裂增殖的效应细胞并杀死激活的效应细胞，具有免疫耐受诱导和抗急性排斥反应的双重作用功效。而且该药物机理主要是作用于受体的免疫淋巴细胞，而不依赖于移植供体的类型，因此该实验结果也可以在其它器官、组织和细胞移植中得到应用。比如肾移植、肝移植、小肠移植、胰腺移植、心脏移植、肺移植、角膜移植、干细胞移植等。
临床使用肉桂氨茴酸类药物治疗哮喘和过敏性鼻炎的临床观察证实，肉桂氨茴酸类药物具有很低的毒副作用，仅有少见的胃肠道症状如食欲缺乏、恶心偶见神经系统症状，如头痛、嗜睡、眩晕等。当采取减量、停药等适当措施后，即可恢复正常。与其它免疫抑制剂相比，本发明肉桂氨茴酸类药物在用于移植的受体时，没有肾脏毒性、高血压、糖 尿病等威胁移植病人和移植物长期存活的副作用。
附图说明
图1：带圆形的曲线表示肉桂氨茴酸口服实验组n＝24***；带正方形曲线表示DMSO口服对照组n＝10；对数秩检验P＜0.0001。
图2：带圆形的曲线表示肉桂氨茴酸口服实验组n＝6***；带正方形曲线表示DMSO口服对照组n＝6；对数秩检验P＜0.0007。
图3：带正三角形的曲线表示第一代脾细胞过继传输组n＝10***；带正方形的曲线表示第二代脾细胞过继传输组n＝8***；带圆形的曲线表示肉桂氨茴酸治疗组n＝24；对数秩检验P＜0.0007。
图4：带凌形的曲线表示过继传输NON-T淋巴细胞组n＝10***；带正方形曲线表示过继传输T淋巴细胞组n＝5；对数秩检验P＜0.0001。
图5：带圆形的曲线表示过继传输富含mDC细胞亚群组n＝6***；带正方形的曲线表示过继传输pDC细胞亚群组n＝6***；带正三角形的曲线表示过继传输富含T、B细胞亚群组n＝6，对数秩检验，P＜0.0001。
图6：带圆形的曲线表示过继传输富含pDC细胞亚群组n＝10；带正方形的曲线表示过继传输CD4-mDC细胞亚群组n＝6；带正三角形的曲线表示过继传输CD4+mDC细胞亚群组n＝6，对数秩检验，P＝0.4134。
图7：不同浓度的肉桂氨茴酸混合淋巴细胞培养对效应细胞的作用图；其中，SSC反应细胞颗粒性、FSC反应细胞大小、CD4和TCR是效应细胞的表面标志、CFSE是绿色的生物荧光染料。
具体实施方式
本发明通过以下实验例进一步说明本发明，但本发明并不受限于此。
实验例1：肉桂氨茴酸诱导心脏移植大鼠的免疫耐受实验
1.1实验材料
(1)药物及配制
肉桂氨茴酸：粉剂(99％纯度)购于中国上海新晨化工有限公司。肉桂氨茴酸避光溶于二甲基亚砜(DMSO，Sigma)中，以橄榄油稀释，最终浓度是300mg/ml。对照组口服相同浓度的二甲基亚砜和橄榄油混合剂。
(2)实验动物
成年Lewis系大鼠LEW-1A，LEW-1W，雄性，体重200-250g，鼠龄：6-8周；Brown-Norway系(BN)大鼠，雄性，体重200-250g，鼠龄：6-8周；均购于法国Centre d’Elevage Janvier动物中心。
(3)大鼠的心脏移植模型的建立
a)LEW-1W大鼠为供体、LEW-1A大鼠作受体的心脏移植动物模型：选择LEW-1W大鼠做供体，游离后供体心脏保存在0-4℃的盐水中。然后以雄性LEW-1A大鼠作受体，游离腹主动脉和下腔静脉，将供体心脏移植到LEW-1A大鼠腹部。供体主动脉和受体腹主动脉以8-0Prolene血管缝合线连续吻合，供体肺动脉和受体腔静脉以8-0Prolene血管缝合线连续吻合，开放血管后，大鼠心脏会立刻恢复跳动。(参见Guillonneau C，Hill M，Hubert FX，Chiffoleau E，Hervé C，Xian-Liang Li，et al.CD40Ig treatment results in allograft acceptence mediated by CD8+CD45RClow T cells，IFN-γand indoleamine 2，3 dioxygenase.Journal Clinical Investagtion.2007；117(4)：1096-1106)
b)BN大鼠为供体、LEW-1A大鼠作受体的心脏移植动物模型：选择BN大鼠做供体，游离后供体心脏保存在0-4℃的盐水中。然后以雄性LEW-1A大鼠作受体，游离腹主动脉和下腔静脉，将供体心脏移植到LEW-1A大鼠腹部。供体主动脉和受体腹主动脉以8-0Prolene血管缝合线连续吻合，供体肺动脉和受体腔静脉以8-0Prolene血管缝合线连续吻合，开放血管后，大鼠心脏会立刻恢复跳动。
观察指标：关腹后，以触诊检查移植大鼠心脏的跳动，确定移植物生存时间。移植心脏于3周内跳动停止视为急性排斥反应，移植心脏于一个月后跳动停止视为慢性排斥反应，移植心脏正常跳动超过3个月视为免疫耐受。
(4)统计学方法
所有实验组动物存活统计，和对照组比较用对数秩检验(Log-Rank或Mantel-Cox test)方法分析。如果P＜0.05为有统计学意义。
1.2.实验方法和结果
1.2.1肉桂氨茴酸对移植大鼠心脏保护作用
实验方法：取按方法a)建立的供体大鼠为LEW-1W，受体大鼠为LEW-1A的实验大鼠模型34只，分为实验组和对照组两组，实验组24只，对照组10只。实验组大鼠从手术当天开始经胃管口服肉桂氨茴酸(500mg/kg/天)，每天二次，连续四周；对照组大鼠服用同等剂量的DMSO和橄榄油混合剂。四周后，不论受体心脏排斥与否，均停药观察。
实验结果：对照组LEW-1A大鼠的移植心脏均在7-12天内发生急性排斥反应，心脏停止跳动，移植物功能丧失(n＝10)。肉桂氨茴酸口服用药组92％(2/24)的受体克服了急性排斥反应，最终42％(10/24)的受体可以长期存活，诱导出免疫耐受状态(n＝24，P＜0.001相对于对照组)。结果见表1和图1
表1肉桂氨茴酸对LEW-1W供体移植大鼠的心脏存活时间的影响
结论：口服肉桂氨茴酸能够在92％的受体克服急性排斥反应，显著延长移植大鼠心脏存活时间并在42％受体大鼠诱导免疫耐受。
1.2.2肉桂氨茴酸对不同种系大鼠移植大鼠心脏保护作用
实验方法：取按方法b)建立的供体大鼠为BN，受体大鼠为LEW-1A的实验大鼠模型12只，分为实验组和对照组两组，每组6只。实验组大鼠从手术当天开始经胃管口服肉桂氨茴酸药物(500mg/kg/天)，每天二次连续4周；对照组大鼠服用同等剂量的DMSO和橄榄油混合剂。四周后，不论受体心脏排斥与否，均停药观察。
实验结果：如表2显示，对照组LEW-1A大鼠体内的移植心脏均在7-12天内发生急性排斥反应(n＝6)，而肉桂氨茴酸口服用药组100％(6/6)的受体可以克服急性排斥反应，最终50％(3/6)的受体可以长期存活，诱导出免疫耐受状态(P＜0.001相对于对照组)。具体见表2和图2。
表2口服肉桂氨茴酸BN供体移植大鼠的心脏存活时间的影响
结论：口服肉桂氨茴酸能够在不同种系的大鼠心脏移植模型中诱导免疫耐受。
实验例2：肉桂氨茴酸通过过继传输诱导心脏移植大鼠的免疫耐受实验
2.1.实验材料
肉桂氨茴酸：粉剂(99％纯度)购于中国上海新晨化工有限公司。肉桂氨茴酸避光溶于二甲基亚砜(DMSO，Sigma)中，以橄榄油稀释，最终浓度是300mg/ml。对照组口服相同浓度的二甲基亚砜和橄榄油混合剂。
(2)实验动物
成年Lewis系大鼠LEW-1A，LEW-1W，雄性，体重200-250g，鼠龄：6-8周；Brown-Norway系(BN)大鼠，雄性，体重200-250g，鼠龄：6-8周；均购于法国Centre d’Elevage Janvier动物中心。
(3)大鼠的心脏移植模型的建立
a)LEW-1W大鼠为供体、LEW-1A大鼠作受体的心脏移植动物模型：选择LEW-1W大鼠做供体，游离后供体心脏保存在0-4℃的盐水中。然后以雄性LEW-1A大鼠作受体，游离腹主动脉和下腔静脉，将供体心脏移植到LEW-1A大鼠腹部。供体主动脉和受体腹主动脉以8-0Prolene血管缝合线连续吻合，供体肺动脉和受体腔静脉以8-0Prolene血管缝合线连续吻合，开放血管后，大鼠心脏会立刻恢复跳动。
观察指标：关腹后以触诊检查移植大鼠心脏的跳动，确定移植物生存时间。移植心脏于3周内跳动停止视为急性排斥反应，移植心脏于一个月后跳动停止视为慢性排斥反应，移植心脏正常跳动超过3个月视为免疫 耐受。
(4)统计学方法
所有实验组动物存活统计，和对照组比较用对数秩检验(Log-Rank或Mantel-Cox test)方法分析。如果P＜0.05为有统计学意义。
2.2.实验方法和结果
2.2.1脾细胞过继传输诱导免疫耐受证明产生了调节性细胞
第一代过继脾细胞的制备：按上述实验例1中1.2.1部分方法获口服肉桂氨茴酸用药组(相同的移植模型和给药途径方式以及供受体种系)大鼠，取存活60天以上大鼠的脾脏，无菌分离收集脾细胞或者脾细胞亚群，(方法详见Li Xian Liang*，Menoret S，Chabannes D，et al.Mechanism and localization of CD8 regulatory T cells in a heart transplant model of tolerance.Journal of Immunology.2010；185：823-833))。过滤后，该细胞稀释于PBS平衡盐溶液中，稀释到30x106/ml，最低以相当于30x106个脾细胞的数量。
第二代过继脾细胞的制备：取第一代过继传输长期存活的大鼠模型受体脾脏，采用第一代过继脾细胞同样方法分离脾细胞、并稀释到同样的数量，即稀释到30x106/ml，最低以相当于30x106个脾细胞的数量。
实验方法：取方法a)建立的供体大鼠用LEW-1W大鼠，受体大鼠为LEW-1A的大鼠心脏移植模型大鼠42只，分为三组。肉桂氨茴酸实验组(24只)大鼠从手术当天开始经胃管口服肉桂氨茴酸药物(500mg/kg/天)，每天二次，连续4周；第一代过继传输组(10只)，用30x106/ml浓度的第一代过继脾细胞，最低以相当于30x106个脾细胞的数量进行移植传输；第二代过继传输组(8只)，用30x106/ml浓度第二代过继脾细胞，最低以相当于30x106个脾细胞的数量进行移植传输。所有过继传输受体组，均在术前一天接受4.5Gray剂量的X-ray全身照射，除了接受传输的细胞外，没有任何其他药物处理。
实验结果：在长期存活的肉桂氨茴酸口服用药组，取脾细胞行过继传输，在全部第一代受体成功诱导免疫耐受(10/10，P＜0.001)，而且从第一代受体继续收集脾细胞进行过继传输，在第二代受体全部也成功诱导免疫耐受(8/8，P＜0.001)。证明通过肉桂氨茴酸口服用药产生的调节性细胞，作用强而稳定，能够针对特异供体可以诱导免疫耐受。而且，肉桂氨茴酸诱导产生的调节性细胞能够介导免疫耐受的过继传输。具体见表3和图3
表3：肉桂氨茴酸口服用药产生调节性细胞的实验
结论：口服肉桂氨茴酸可以产生调节性细胞介导免疫耐受。
2.2.2 NON-T细胞介导免疫耐受的过继传输试验
T细胞和NON-T过继传输细胞的制备：取2.2.1部分制备的第一代过继脾细胞，然后将脾细胞分别与TCR或者CD45R、3.2.3、CD12、His24、OX42、CD11c等抗体低温(4摄氏度)混合标记。洗脱没有标记的抗体后，通过免疫磁珠阴性选择法对脾细胞进行提纯，去除TCR+或者CD45R+、3.2.3+、CD12+、His24+、OX42+、CD11c+细胞(抗体浓度为5-10μg/ml)，分别得到富含NON-T细胞亚群或者富含T细胞亚群。
实验方法：取由方法a)建立的实验供体大鼠均为LEW-1W，受体大鼠为LEW-1A的心脏移植模型大鼠15只，分为两组，一组为过继传输NON-T细胞组，10只，一组为过继传输T细胞组，5只。所有过继传输受体均在术前一天接受4.5Gray剂量的X-ray全身照射，除了接受传输的细胞外，没有任何其他药物处理。过继传输T细胞组大鼠，接受最低以相当于30x106个脾细胞数量的T细胞于移植当天立即传输给下一代受体；过继传输NON-T细胞组大鼠接受同等数量的NON-T细胞传输。
实验结果：在过继传输NON-T细胞组的移植心脏全部可以长期存活(10/10)，而在T-细胞组全部发生急性排斥反应(5/5)。证明免疫耐受是由NON-T细胞介导，而该受体内T细胞并没有诱导免疫耐受的调节性功能。具体见表4和图4
表4：肉桂氨茴酸产生的免疫耐受是由NON-T细胞介导
结论：肉桂氨茴酸产生的免疫耐受是由NON-T细胞介导。
2.2.3树突状细胞介导免疫耐受的过继传输试验
富含pDC、富含mDC和富含T细胞与B细胞的细胞亚群的细胞的制备：取2.2.1部分制备的第一代过继脾细胞，然后将脾细胞悬液以Nicodenz细胞分离液梯度离心，收集中间层细胞，该细胞为富含mDC的细胞亚群。上述离心后的下层细胞，再以PBS平衡液混悬，然后用Ficoll细胞分离液梯度离心，收集中间层细胞，该层细胞为富含pDC的细胞亚群。收集Ficoll梯度离心后的下层细胞，该层细胞为富含获T细胞与B细胞的细胞亚群。
实验方法：取a)方法建立的供体大鼠均为LEW-1W，受体大鼠为LEW-1A的心脏移植模型大鼠18只。所有过继传输受体均在术前一天接受4.5Gray剂量的X-ray全身照射，除了接受传输的细胞外，没有任何其他药物处理。实验大鼠分为三组，过继传输富含pDC细胞组大鼠6只，接受全部从一个脾脏分离出来的pDC细胞亚群(30-50*106个细胞)；过继传输富含mDC细胞组大鼠6只，接受全部从一个脾脏分离出来的mDC细胞亚群(5-15*106个细胞)。过继传输富含T、B细胞亚群组大鼠6只， 接受全部从一个脾脏分离出来的富含T、B细胞亚群(50-100*106个细胞)。
实验结果：在过继传输富含pDC细胞和富含mDC细胞亚群组的移植心脏可以长期存活(6/6)，而在过继传输富含T、B细胞亚群组发生急性排斥反应(6/6)。证明免疫耐受是由树突状细胞细胞介导，而该受体内T、B细胞并不存在诱导免疫耐受的调节性功能。具体见表5和图5
表5：肉桂氨茴酸产生的免疫耐受是由树突状细胞介导实验
结论：肉桂氨茴酸产生的免疫耐受是由树突状细胞介导。
2.2.4不同种类树突状细胞介导免疫耐受的过继传输试验
pDC、CD4+mDC和CD4-mDC过继细胞的制备：取2.2.1部分制备的第一代过继脾细胞，然后由脾细胞经免疫磁珠去除T淋巴细胞(TCR+细胞)、B细胞淋巴细胞(CD45R+细胞)和NK细胞(3.2.3+细胞)后，经荧光抗体染色标记TCR、CD11c和CD123(抗体浓度为5-10μg/ml)。用流式细胞分选仪，分别收集TCR-CD11c-CD123+细胞为pDC， TCR-CD11c+CD123-细胞为mDC。
实验方法：取按方法a)建立的实验供体大鼠均为LEW-1W，受体大鼠为LEW-1A的心脏移植模型大鼠。所有过继传输受体均在术前一天接受4.5Gray剂量的X-ray全身照射，除了接受传输的细胞外，没有任何其他药物处理。实验大鼠分为三组，过继传输pDC细胞组，接受全部从一个脾脏分离出来的pDC细胞亚群(3-5*106个细胞)；过继传输CD4-mDC细胞组大鼠接受全部从一个脾脏分离出来的CD4-mDC细胞亚群(1-3*106个细胞)。过继传输CD4+mDC细胞亚群组大鼠，接受全部从一个脾脏分离出来的CD4+mDC细胞亚群(1-3*106个细胞)。
实验结果：在过继传输pDC细胞和CD4-mDC细胞亚群组可以在50％(分别为5/10，3/6)的受体诱导免疫耐受，在CD4+mDC组，可以在33％(2/6)的受体诱导免疫耐受。实验说明，肉桂氨茴酸可在供体内诱导产生不同的树突状调节性细胞亚群，这些树突状细胞亚群能够协同作用，共同介导免疫耐受。具体见表6和图6
表6：肉桂氨茴酸诱导不同树突状细胞产生调节性功能实验
结论：肉桂氨茴酸诱导不同树突状细胞亚群产生调节性功能，都可以介导免疫耐受。
实验例3不同浓度的肉桂氨茴酸对混合淋巴细胞培养的效应细胞的作用
实验方法：从未经药物治疗的大鼠(实验例1中的LEW-1A大鼠))体内，按2.2.1部分描述的提取脾细胞的方法提取脾细胞。将脾细胞经荧光标记TCR、CD4、CD25，用流式细胞分选仪，收集TCR+CD4+CD25-细胞为CD4+效应性细胞。脾细胞经免疫磁珠去除T淋巴细胞(TCR+细胞)、B细胞淋巴细胞(CD45R+细胞)和NK细胞(3.2.3+细胞)后，经荧光抗体染色标记TCR、CD11c和CD123(抗体浓度为5-10μg/ml)。用流式细胞分选仪，分别收集TCR-CD11c-CD123+细胞为pDC，TCR-CD11c+CD123-细胞为mDC。
分离好的CD4+效应性细胞和pDC或者mDC以及确定的调节性细胞分别按4/4/1比例加到96孔培养板中，加入200ul培养液，于37摄氏度5％CO2的培养箱中培养4天。培养中加入肉桂氨茴酸(1.2-150μmol)或者对照DMSO溶剂，4天后进行细胞染色标记，用流式细胞仪分析效应细胞的分裂增殖。
CD4+效应性细胞在进行混合培养前，用生物活体染料CFSE标记(10*6细胞/mlin 5μM CFSE)。标记后的CD4+效应性细胞加入到混合淋巴细胞培养实验中，4天后再次标记荧光抗体(TCR，CD4)，然后用流式细胞仪分析(TCR+CD4+门)效应细胞的分裂增殖。
按照不同的浓度(150μM、75μM、37.5μM、18.7μM、9.35μM、4.7μM、2.35μM、1.2μM)加入肉桂氨茴酸。培养4天后进行细胞染色标记，用流式细胞仪分析效应细胞的分裂增殖。
实验结果
肉桂氨茴酸组细胞增殖分裂的情况如图7所示：从第一列流式细胞仪的散点图显示，在高浓度下(150μM和75μM)，肉桂氨茴酸可以直接 杀死激活的CD4效应细胞，活细胞门的细胞数量和药物浓度有直接的依赖关系。第二列在活细胞门的基础上，进一步分选出来CD4效应性T细胞。可以看到高浓度的时候，CD4效应性细胞被直接杀死。而在37.5μM到9.35μM浓度区间，在CD4效应性T细胞门基础上，通过流式细胞直方图，在第三列内可以看到以CFSE染色技术分析的细胞增殖分裂情况。不同浓度下，CD4效应性T细胞的分裂峰百分比和未分裂峰值，均明显表现出剂量依赖的抑制效应，因此肉桂氨茴酸可以强烈抑制CD4效应细胞的增殖。而低浓度区间(4.7μM以下)，该药物并没有显示出抑制效应。
上述的药物剂量试验，阐明了该药物的双重作用机理。除了可以诱导调节性细胞外，还可以直接作用于效应细胞，杀死和抑制效应细胞的增殖和活化。有着双重的免疫调节能力。
上述所有实验中所用到的细胞亚群分离方法和流式细胞仪分析方法请参见(Ménoret S，Guillonneau C，Bezié S，Caron L，Anegon I，Li Xian-Liang.Phenotypic and functional characterization of CD8(+)T regulatory cells.Methods Mol Biol.2011；677：63-83(已经电子版发表，发表日为2010年7月)；Li Xian Liang，Menoret S，Chabannes D，et al.Mechanism and localization of CD8 regulatory T cells in a heart transplant model of tolerance.Journal ofImmunology.2010；185：823-833)。