技术领域
本发明一般涉及保健食品组合物以及将它们给药用于治疗炎症或者与炎症有关的疾病，特别是软骨损伤的方法。
本发明还涉及提取自能够治疗炎症或者与炎症有关的疾病的植物的保健食品组合物。
背景技术
在本说明书中，当提到或者讨论知识文献、法案或者条目时，这些参考和讨论并不是认可知识文献、法案和条目或者它们的任一组合在优先权日之前：部分属于公知常识，或已知与试图解决本说明书中所关注的任何问题的相关知识。
软骨退化是困扰所有脊椎动物的问题。
软骨是位于骨关节面的平滑的结缔组织，支撑并保护骨头。当软骨受到损伤时，关节就不能再正常起作用，软骨表面变薄，失去保持水分的能力，软骨自身出现裂缝退化。逐渐地，软骨的弹性降低，其更容易受到损伤和损害。不断的损失会导致在特定关节处的骨头和骨头的接触，而这是极其痛苦的并且会阻止关节接合的正常作用。
NASID已长期以镇痛的形式用于关节炎症的治疗。然而，由于已报道的并发症和副作用，出现了抵制连续使用大量NASID的情况。
在免疫介导的关节炎实验模型中，鲨鱼软骨提供了关节健康的明显改善(Pivnenko等人，2005)，并可提高硫酸盐摄入到新的蛋白多糖分子中。
类似地，有临床证据证明，翡翠贻贝(perna mussel)用于治疗狗的退行性关节病的治疗是有效的(Pollard等人，2006；Bui和Bierer 2003)。鲍鱼也有被纳入，其具有高浓度的n-3多不饱和脂肪酸，已知该脂肪酸能减少炎症类花生酸类物质(Mesa Garcia等人，2006)和一氧化氮(Pearson等人，2007)的形成。
发明目的
本发明的目的在于提供用于治疗炎症或者与炎症有关的疾病的保健食品组合物。
本发明的另一个目的在于提供一种用于刺激软骨形成的保健食品组合物。
本发明的目的在于克服或者至少实质上改善现有技术的不足和缺点。
通过下列结合附图的描述，本发明的其他目的和优点将更加清楚，其中，通过说明和实例，公开了本发明的具体实施方式。
发明内容
在本发明的第一方面，但这不应当被视为以任何方式对本发明的限制，提供了治疗有机体中软骨降解的方法，该方法包括将含有来自植物侧柏的治疗剂量的提取物的组合物给药到有机体。
在一个实施例中，所述组合物包括治疗剂量的来自植物侧柏的提取物，可进一步包括额外的提取物，例如贻贝提取物、鲍鱼提取物或粉末、鲨鱼软骨粉或者它们的组合。
在另一个实施例中，提取物是来自植物侧柏的种子的提取物。
在另一个实施例中，来自植物侧柏的提取物可以通过模拟胃肠功能/处理的模拟消化来制备。
本发明的另一方面在于提供了一种促进软骨细胞生长、发育和形成的方法，所述方法包括向有机体中给药治疗剂量的来自植物侧柏的种子的提取物。
本发明的另一形式在于提供一种协同组合物，其包括治疗剂量用于刺激软骨细胞生长、发育和形成的来自植物侧柏的提取物。
本发明的另一形式在于提供一种治疗患者的方法，该方法包括刺激软骨生长或通过刺激软骨细胞增殖进行体内修复，其包括通过有效量以刺激软骨细胞增殖，从而提高所述患者体内的与软骨细胞增殖有关的前列腺素类受体的活性。
本发明的另一形式在于提供一种方法，其包括提供一种包括来自植物侧柏的提取物的组合物，将治疗剂量的该组合物给药到患者体内，从而提高与软骨细胞增殖有关的至少一种前列腺素类受体的活性，其中向患者给药该组合物刺激了软骨细胞增殖和软骨生长和/或修复。
本发明的另一形式在于提供一种治疗患者的方法，其通过刺激软骨细胞的增殖而刺激软骨的体内生长或修复，该方法包括：通过有效量以刺激软骨细胞增殖，从而产生或提高所述患者体内与软骨细胞增殖有关的前列腺素类受体上的激动效应的步骤。
本发明的另一形式在于提供一种通过刺激软骨细胞增殖从而刺激软骨体内增长或修复的方法，所述方法包括将治疗剂量的侧柏的提取物给药到所述患者体内以刺激软骨细胞增殖的步骤。
优选地，该方法还包括将所述提取物和另外的提取物(例如鲨鱼软骨粉、贻贝提取物、鲍鱼提取物或者它们的组合)一起给药。
在本发明的又一形式中，提供了一种治疗组合物，其包括有效量的能够刺激软骨细胞增殖的侧柏提取物。
在本发明的又一形式中，提供了一种来自植物侧柏的提取物在制造用于软骨退行性病症的治疗和/或预防性治疗的药物中的应用。
在本发明的又一种形式中，使用选自下组的至少一种化合物生产用于软骨退行性病症的治疗和/或预防性治疗的药物，其包括：(9Z，13S，15Z)-12，13-环氧十八烷-9，11，15-三烯酸、顺，顺，顺-9，12，15-十八碳三烯酸(ALA)、顺，顺，顺-6，9，12-十八碳三烯酸(GLA)、顺，顺-9，12-十八碳二烯酸和9-十八碳烯酸。
优选地，药物包括另外的提取物，诸如翡翠贻贝提取物、鲍鱼提取物或粉末、鲨鱼软骨粉或者它们的组合。
本发明的还一种形式在于提供一种用于哺乳动物软骨退行性病症治疗的方法，其包括将治疗上有效量的多不饱和脂肪酸给药到哺乳动物。
优选地，多不饱和脂肪酸选自下组：Ω-3，Ω-6，Ω-9和结合脂肪酸或者它们的混合物。
优选地，Ω-3脂肪酸选自下组：顺，顺，顺-7，10，13-十六碳三烯酸；顺，顺，顺-9，12，15-十八碳三烯酸；顺，顺，顺，顺-6，9，12，15-十八碳四烯酸；顺，顺，顺-11，14，17-二十碳三烯酸；顺，顺，顺，顺-8，11，14，17-二十碳四烯酸；顺，顺，顺，顺，顺-5，8，11，14，17-二十碳五烯酸；顺，顺，顺，顺，顺-7，10，13，16，19-二十二碳五烯酸；顺，顺，顺，顺，顺，顺-4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸；顺，顺，顺，顺-9，12，15，18，21-二十四碳五烯酸；和顺，顺，顺，顺，顺，顺-6，9，12，15，18，21-二十四碳六烯酸或它们的混合物。
优选地，Ω-6脂肪酸选自下组：顺，顺-9，12-十八碳二烯酸；顺，顺，顺-6，9，12-十八碳三烯酸；顺，顺-11，14-二十碳二烯酸；顺，顺，顺-8，11，14-二十碳三烯酸；顺，顺，顺，顺-5，8，11，14--二十碳四烯酸；顺，顺-13，16-二十二碳二烯酸；顺，顺，顺，顺-7，10，13，16-二十二碳四烯酸；和顺，顺，顺，顺，顺-4，7，10，13，16-二十二碳-五烯酸或它们的混合物。
优选地，Ω-9脂肪酸选自下组，包括：顺-9-十八碳烯酸；顺-11-二十碳烯酸；顺，顺，顺-5，8，11-二十碳三烯酸；顺-13-二十二碳烯酸；以及顺-15-二十四碳烯酸或者它们的混合物。
优选地，结合脂肪酸选自：9Z，11E-十八碳-9，11-二烯酸；10E，12Z-十八碳-9，11-二烯酸；8E，10E，12Z-十八碳三烯酸；8E，10E，12E-十八碳三烯酸；8E，10Z，12E-十八碳三烯酸；9E，11E，13Z-十八碳-9，11，13-三烯酸；9E，11E，13E-十八碳-9，11，13-三烯酸；9Z，11Z，13E-十八碳-9，11，13-三烯酸；9Z，11E，13Z-十八碳-9，11，13-三烯酸；9E，11Z，15E-十八碳-9，11，15-三烯酸；9E，11Z，13Z，15E-十八碳-9，11，13，15-三烯酸；反，反，反，反-十八碳-9，11，13，15-三烯酸；(9Z，13S，15Z)-12，13-环氧十八碳-9，11，15-三烯酸；和5Z，8Z，10E，12E，14Z-二十酸或它们的混合物。
优选地，上述为一种药物制剂。
附图说明
通过实施例，此后将参照附图更全面地描述本发明的实施方式，其中：
图1：通过IL-1刺激(图1A)和未刺激(图1B)的软骨外植体的GAG释放。表示刺激(A)和未刺激(B)对照显著不同的治疗。IL-1使得对照外植体中的GAG释放显著提高。不存在在IL-1刺激的外植体上的任何治疗的显著效果。相比未刺激的对照，Indosim和SEQsim(0.06mg/mL)导致刺激的外植体中明显更高的培养基[GAG]。BO(0.06mg/mL)降低了在未刺激的外植体中的培养基[GAG]。
图2：来自IL-1刺激(A)和未刺激(B)的软骨外植体的培养基中的NO(作为亚硝酸盐测量)。表示刺激(A)和未刺激(B)对照显著不同的治疗。IL-1导致通过对照外植体的NO释放显著提高。相比未刺激的对照，SEQsim(两种剂量)导致未刺激的外植体中明显更高的培养基[NO]，以及相比刺激对照，在刺激的外植体中显著更低的培养基[NO]。BOsim对培养基[NO]没有效果。
图3：IL-1刺激和未刺激的软骨外植体中钙黄绿素-AM(C-AM)和溴乙锭同型二聚体(Ethd-1)的荧光比率。每张图中都包含了刺激(stim)和未刺激(unstim)对照以进行比较。*表示与刺激(A)或未刺激(B)的对照显著不同。IL-1刺激引起细胞活力轻微的、非显著的下降。在未刺激外植体中，任何处理对细胞活力都没有影响。相对于刺激对照，SEQsim和BOsim(0.18mg/mL)显著提高了IL-1刺激外植体中的细胞活力。
图4：IL-1刺激(A)和未刺激(B)的软骨外植体中聚集蛋白聚糖RNA的相对表达。每张图中都示出了刺激(stim)和未刺激(unstim)对照以进行比较。对于A和B，处理组同刺激(A)和未刺激(B)的对照进行比较。未刺激和刺激的对照外植体没有可测量的聚集蛋白聚糖表达。所有处理导致未刺激的外植体中聚集蛋白聚糖表达的显著提高，其中最小有效的是ABsim。NZGLMsim(0.06mg/mL)导致了在未刺激和刺激的外植体中聚集蛋白聚糖表达的显著提高。SEQsim(0.18mg/mL)可以提高在刺激和未刺激的外植体中的聚集蛋白聚糖表达。
图5：用关节穿刺术从左边和右边的腕骨间关节以及颈静脉血收集滑液组成样品。食物补充从第0天开始并在实验期内持续。
图6：在CON(A)和SEQ(B)马中注射有IL-1(注射-1为10ng，注射-2为100ng)或盐水的腕骨间关节的周长。健康的马用包含安慰剂(CON)或Sasha’s EQ(SEQ)的食物喂养28天。在补充(注射-1)开始14天之后，将关节内IL-1(500μL无菌生理盐水中含有10ng)注射到腕骨间关节，并使用无菌生理盐水(500μL)向对侧关节进行注射。在其后24小时，将IL-1(500μL无菌生理盐水中含有100ng)或者生理盐水(500μL)的第二次关节内注射在相同的关节内进行注射(注射-2)。在(补充开始之前)、注射-1和注射-2(注射之前)、注射-2-2(第二次IL-1注射之后8小时)之前那天以及第二次IL-1注射后的第1、3、7和14天从腕骨间关节抽取大约1.5mL滑液。*表示在治疗中注射-1变化显著。字母表示生理盐水与IL-1两种处理之间有显著差异。SEQ马中IL-1注射关节的关节周长显著低于在CON马中(p≤0.001)的。当p≤0.05时差异是显著的。
图7：来自在CON(A)和SEQ(B)马中注射了IL-1(注射-1为10ng，注射-2为100ng)或者生理盐水的对照马的腕骨间关节的滑液[PGE2]。健康马用含有安慰剂(CON)或者Sasha’s EQ(SEQ)食物喂养28天。在补充开始14天之后(注射-1)，将关节内IL-1(500μL无菌生理盐水中含有10ng)注射到腕骨间关节，并使用无菌生理盐水(500μL)向对侧关节进行注射。在其后24小时，将IL-1(500μL无菌生理盐水中含有100ng)或者生理盐水(500μL)的第二次关节内注射在相同的关节进行注射(注射-2)。在(补充开始之前)、注射-1和注射-2(注射之前)、注射-2-2(第二次IL-1注射之后8小时)之前那天以及第二次IL-1注射后的第1、3、7和14天从腕骨间关节抽取大约1.5mL滑液。*表示在处理中注射-1的显著变化。字母表示在处理中生理盐水与IL-1之间有显著差异。当p≤0.05时变化是显著的。
图8：来自在CON(A)和SEQ(B)马中注射了IL-1(注射-1为10ng，注射-2为100ng)或者生理盐水的腕骨间关节的滑液[GAG]。健康的马用含有安慰剂(CON)或者Sasha’s EQ(SEQ)食物喂养28天。在补充开始14天之后(注射-1)，将关节内IL-1(500μL无菌生理盐水中含有10ng)注射到腕骨间关节，并使用无菌生理盐水(500μL)向对侧关节注射。在其后24小时，将IL-1(500μL无菌生理盐水中含有100ng)或者生理盐水(500μL)的第二次关节内注射进行相同关节的注射(注射-2)。在(补充开始之前)、注射-1和注射-2(注射之前)、注射-2-2(第二次IL-1注射之后8小时)之前那天以及第二次IL-1注射后的第1、3、7和14天从腕骨间关节抽取大约1.5mL滑液。*表示在处理中注射-1的显著变化。字母表示在处理生理盐水与IL-1之间有显著差异。SEQ马具有比CON马显著更多的滑液[GAG]。当p≤0.05时差异是显著的。
图9：来自在CON(A)和SEQ(B)马中注射了IL-1(注射-1为10ng，注射-2为100ng)或者生理盐水的对照马的腕骨间关节的滑液[蛋白质]。健康的马含有安慰剂(CON)或者Sasha’s EQ(SEQ)食物喂养28天。在补充开始14天之后(注射-1)，将关节内IL-1(500μL无菌生理盐水中含有10ng)注射到腕骨间关节，并使用无菌生理盐水(500μL)向对侧关节注射。在其后24小时，将IL-1(500μL无菌生理盐水中含有100ng)或者生理盐水(500μL)的第二次关节内注射进行相同关节的注射(注射-2)。在(补充开始之前)、注射-1和注射-2(注射之前)、注射-2-2(第二次IL-1注射之后8小时)之前那天以及第二次IL-1注射后的第1、3、7和14天从腕骨间关节抽取大约1.5mL滑液。*表示在处理中注射-1的显著变化。字母表示在处理中生理盐水与IL-1之间有显著差异。SEQ马具有比CON马显著更多的滑液[GAG]。当p≤0.05差异是显著的。
图10：表1示出了用于聚集蛋白聚糖和β-肌动蛋白的引物。
图11：表2示出了制备的Sasha’s EQ粉末的成分，其由鲍鱼(AB)、新西兰绿唇贻贝(NZGLM)、鲨鱼软骨(SC)和BO(Interpath Pty Ltd，Australia)混合制成。
图12：表3示出了用于喂马的SEQ的养分组成。
图13：侧柏油提取物的色谱分析波谱。
图14：示出了馏分F1、F2、F3和F4的Brdu细胞增殖试验结果。
图15：示出了馏分I、ii、V、Vi和Vii的Brdu细胞增殖试验结果。
图16：示出了馏分F1、F1.1、F1.2、F1.3和F1.4的Brdu细胞增殖试验结果。
具体实施方式
为了便于理解本发明，使用的各种术语和缩写定义如下：
“SEQ”是指新西兰绿唇贻贝、鲍鱼、鲨鱼软骨粉和侧柏油的混合物。
“BO”是指从植物侧柏种子中提取的“侧柏油”。
“NZGLM”是指新西兰绿唇贻贝。
“sim”是指模拟的消化。
“COX”或者“cox”是指环氧合酶。
“iNOS”是指可诱导的一氧化氮(NO)合成酶。
侧柏是来自中国西部和北朝鲜的本土草药，并且已知其具有许多别名，诸如Thuja orientalis，Platycladus stricta以及Platycladus orientalis。侧柏是在中医中具有极大的价值，是50种基本草药之一(Duke和Ayensu1985)。通常其用作轻泻药、止痛药和镇静药(Duke和Ayensu 1985)。
早期的报道表明，鲨鱼软骨、NZGLM和鲍鱼的模拟消化在关节炎的软骨外植体模型中通过减少PGE2(前列腺素E2)、GAG和/或一氧化氮而具有抗炎效果(Pearson等人，2007)。
方法
外植体培养
从本地屠宰场获得市售猪(5-7个月大，200-250磅)的前腿。将腿在碎冰上冷冻直到解剖。使用无菌技术，切开腕骨间关节并使软骨表面暴露。将4mm长的皮肤活检穿刺针用于从腕骨间关节的两个关节运动表面的承重区获取健康软骨的外植体(厚度约0.5mm厚；11-15mg/外植体)。将软骨片用添加了NaHCO3的DME培养基(DMEM)中洗涤三次。将两个软骨片置于24孔组织培养板的每个孔中，其中含有添加了氨基酸、亚硒酸钠、硫酸锰、NaHCO3和抗坏血酸(TCM-组织培养基)的DMEM营养液。将培养板在潮湿环境下在37℃，7％ CO2中培养144小时。每24小时将培养液完全抽吸到1mL的微量离心管中，并在将其返回到培养箱中之前立即替换成对照、条件培养基和/或刺激培养基(见下述)。将收集的培养液储存在-80℃下直到分析。在每次实验结束时收集软骨，并以每孔一个外植体进行细胞毒性染色，并将剩余软骨立即在-80℃条件下冷冻保存。
模拟消化和超滤作用
进行模拟消化过程是模仿胃肠道的摄入膳食补充品的过程。该类型的方法先前已经被用于提高假定保健食品的生物评估的准确性(Rininger等人，2000；Pearson等人，2007)。
使用SEQ(0.85g)、BO[2.5mL(0.85g)]和indo(0.074g-阳性抗炎对照)来制备模拟消化液。将每种测试物质单独悬浮在35mL的模拟胃液(37mM NaCl，0.03N HCl，3.2mg/mL胃蛋白酶)中，并在37℃下摇动2小时(Rininger等人，2000)。此后，向酸性溶液中加入等当量体积的2.2N NaOH(1.15mL)进行中和。将36.15mL的模拟肠液(Rininger等人，2000-30mM K2HPO4，160mM NaH2PO4；20mg/mL胰酶；pH调节至7.4)加入到其中并且将得到的混合物在37℃培养箱中继续摇动2小时。使用相同方法处理但不包括任何测试物质来制备“空白”。分离出近似于人类胃中的合适体积的胃液和肠液(Marciani等人，2005)。
当完成4小时的培养之后，SEQ(SEQsim)BO(BOsim)和消炎痛(indosim)的模拟消化液在4℃下以3,000×g离心25分钟。弃去上清，并在4℃下以3,000×g第二次离心15分钟。将得到的上清液加热至室温并过滤(0.22μm)除去微粒。将该滤液使用50kDa截断分子量的超滤离心装置进行进一步的分离(AmiconUltra，Millipore，MississaugaON)，以3,000×g的速度旋转25分钟(室温下)。将滤出的模拟消化液储存在4℃下直到使用，最长贮存7天。
SEQsim和BOsim对IL-1-诱导的炎症的作用
按照上面的介绍制备SEQsim。按照上述方法制备来自12头猪的外植体，并在最初的24小时内将外植体保持在非条件的(unconditioned)培养基中。在培养24小时之后，将SEQsim、BOsim(0、0.06或者0.18mg/mL)或者indosim(0.02mg/mL)添加到TCM(条件培养基)中。在实验期间每24小时更换一次条件培养基。培养72小时后，此后的每24小时，使用IL-1(0或者10ng/mL；Medicorp，Montreal，Quebec；Cat.#PHC0813)刺激外植体。将来自每个动物的外植体在每种处理中进行两次重复。外植体总共培养120小时。分析培养基的[PGE2]、[GAG]、[NO]。每种处理的一个外植体收集于无菌磷酸缓冲液(PBS)中并立即染色以便观察细胞活力(见下)。第二个外植体在-80℃冻存用于RNA提取(见下)。
GAG分析
培养基GAG的浓度使用1，9-DMB分光光度计测定(Chandrasekhar等，1987)。样品以50％稀释度加入到96孔板，连续地1∶2稀释到最终稀释度为1∶64。将盐酸胍加入到所有孔中，然后即刻进行DMB染色。板在黑暗中孵化10分钟，Victor 3酶标仪中吸光度在530nm处进行读取。样品吸光度同硫酸软骨素标准品的相比。每个板都出现标准曲线，R2≥0.99的最佳匹配线性方程用于计算标准品和样品的GAG浓度。
总RNA的分离和cDNA的合成
使用改良的TRIzol程序从软骨外植体中提取总RNA(Chan等人，2005)。将来自每个动物的冻存软骨根据条件和刺激情况进行集中(pool)，并在Tri-Reagent(100mg组织/mL；Sigma，Mississauga ON)中均化。加入氯仿以提取RNA，接着在室温下剧烈震荡并培养2分钟。然后将样品离心(12,000×g，15分钟)并使用等体积的70％乙醇(DEPC)使RNA沉淀。将RNA沉淀物上RNeasy微型柱(Qiagen，Valencia CA，USA)并根据生产商的说明进行RNA纯化。
对于每种集中的样品，根据生产商的说明使用莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶(Invitrogen，Burlington ON)将1μg总RNA转化成单链cDNA。通过UV分光光度计对单链cDNA定量并使用DEPC-H2O稀释至终浓度为10ng/μL。
实时定量RT-PCR
制备用于聚集蛋白聚糖(透明软骨中的主要的大的聚集蛋白聚糖)(Fehrenbacher等人，2003)和β-肌动蛋白(持家基因；Nishimoto等人，2005)(表1)的引物(实验室服务中心，圭尔夫大学)，并储存在-20℃直至使用。对来自SEQsim和BOsim的软骨样品与前面在相同条件下以其他3种SEQ成分进行软骨培养一起进行基因表达改变的评估(见Pearson等人，2007，详细培养条件)。使用ABI Prism 7000序列测定系统(Perkin-Elmer)检测25微升PCR反应液，重复三次。使用SYBR-Rox(Invitrogen，Burlington ON)对每种cDNA样品的50ng扩增物进行测定并将其与含有来自每个样品的等量cDNA的聚合cDNA的标准曲线进行比较。用1.5％琼脂糖凝胶电泳确定PCR产物。将每个样品中每个感兴趣的基因的表达(G)标化为β-肌动蛋白(β)，并与未刺激的对照外植体进行比较(即对于校准器的倍数变化＝1)。
相对于所示的未刺激或刺激的对照，倍数变化(fc)的表达(ΔG/Δβ)在任意单元中呈现。
细胞毒性染色
使用市售细胞活力染色试剂盒(Invitrogen；Burlington ON)(Pearson等人，2007)对细胞活力进行测定。简言之，将外植体在500uLPBS中洗涤三次并将其置于96-孔微孔板(每孔一个外植体)中，并在200uL染色母液(stock stain)(4μM C-AM；8μM EthD-1)中室温下培养1小时。使用10个水平步骤、3个垂直步骤和0.1mm的位移对板从每个孔的底部进行读取。分别使用485/530nm和530/685nm的激发/发射过滤器获得存活和死亡的外植体的C-AM和EthD-1荧光。
数据分析
将来自组织培养基和细胞活力的分析数据以平均±标准误差的方式表示。使用将每次处理与未处理的对照和消炎痛处理的对照相比较的变化的双向重复测定分析对来自每次处理/动物的复本的平均值进行分析。使用史蒂特氏t检验(Student’s t-test)将刺激对照与所有其他处理单独进行比较分析细胞活力数据。当得到的显著的F-比例时，采用Holm-Sidakpost-hoc检验用于确定处理和/或时间之间的显著性差异。如果p≤0.05则显著性是可接受的。
由于软骨外植体的细胞构成密度(cellularity)低，需要将暴露在相同条件和刺激下的外植体的RNA集中以便提取足够的RNA用于逆转录反应。因此，在本文中PCR数据以相对于测定变化的β-肌动蛋白的基因表达(相对于对照校准)的平均变化来表示。校准的倍数表达变化(calibrated fold expression change)≥2时，则被认为是生物学相关性的(Yang等人，2002；Schena等人，1995)，并且这样的表达变化在本文中作为显著差异进行讨论。
结果
基因表达
Cox 1：在未刺激的外植体中所有SEQ中的成分均降低cox 1的表达(范围：76-95％抑制)。重要的是，观察到BOsim(0.06mg/mL)是最有效的cox 1抑制剂，使未刺激和刺激的外植体中cox 1的表达都降低95％。
聚集蛋白聚糖(图4，A和B)：使用IL-1刺激的对照外植体导致聚集蛋白聚糖表达有轻微的、不明显的下降。未使用indosim刺激的外植体的处理导致聚集蛋白聚糖表达增加了v58倍。这种增加通过使用IL-1刺激indosim处理的外植体被完全消除。
在未刺激外植体中SEQ及其所有成分都显著增加了聚集蛋白聚糖的表达。在未刺激外植体中，SEQsim以剂量依赖的方式增加了聚集蛋白聚糖的表达(对于0.06mg/mL和0.18mg/mL分别增加42.8倍和215.7倍)。
在SEQ及其所有成分中使用IL-1刺激的处理的外植体导致聚集蛋白聚糖的表达增加，但SCsim除外(0.18mg/mL；增加1.4倍)。
细胞代谢
GAG：在未刺激的对照外植体中，培养基[GAG]在24小时和48小时显著降低。利用indosim调节未刺激的外植体，导致同未刺激的对照相比在所有时间点上具有明显更高的培养基[GAG](图1)。IL-1刺激(10ng/mL)导致对照外植体中的培养基[GAG]在刺激后24小时显著升高。来自indosim处理的外植体的培养基[GAG]在实验的持续过程中高于刺激的对照，但不是很明显(p＝0.1)。IL-1对indosim处理的外植体没有显著效果。
SEQsim(0.06mg/mL和0.18mg/mL)对IL-1诱导的GAG释放没有显著效果(图1，A)。用SEQsim(0.06mg/mL)处理的未刺激的外植体中的培养基[GAG]显著高于未刺激对照(图1，B)。用SEQsim(0.18mg/mL)调节导致培养基[GAG]的非显著提高(p＝0.06)。
BOsim对IL-1刺激的外植体中的GAG释放没有影响(图1，A)。使用BOsim(0.06mg/mL)调节未刺激的外植体，从而同未刺激的对照相比，培养基[GAG]显著降低。用BOsim(0.18mg/mL)处理的外植体的培养基[GAG]具有降低的趋势(p＝0.06)。
细胞活力：IL-1刺激(10ng/mL)对细胞活力没有显著影响。用indosim调节外植体对在未刺激或IL-1刺激的外植体的细胞活力也没有显著影响(图3)。
SEQsim(0.18mg/mL)导致IL-1刺激的外植体中的细胞活力相比刺激对照显著提高(图3，A)，而用SEQsim(0.06mg/mL)处理的刺激的外植体倾向于细胞活力百分比提高(p＝0.06)。SEQsim调节对于未刺激的外植体不具有效果(图3，B)。
使用BOsim(0.18mg/mL)调节的未刺激的外植体的细胞活力由增加的趋势(p＝0.09)(图3，B)。当该剂量施加到IL-1刺激的外植体时，细胞活力的增加是显著的(图3，A)。
讨论
上述方法评估了在存在和不存在IL-1的情况下，SEQ和BO的模拟消化对软骨代谢在PGE2、NO、GAG和细胞活力上的影响。使用基因表达数据来预测关于SEQ的作用机理。
还示出了indosim不影响IL-1刺激的外植体中IL-1介导的聚集蛋白聚糖表达，在机械加压的软骨外植体中的影响已经有过报道(Iimoto et al.，2005)。
这些数据描述了消炎痛通过对cox抑制作为主要的有效的消炎药物的特征。其不能降低IL-1介导的聚集蛋白聚糖的表达，并且其增加了对IL-1介导的iNOS表达的影响。然而，其表明暴露于消炎痛的软骨将通过在基质形成中减少而继续退化，并可忍受增加的一氧化氮介导的细胞凋亡。
事实上，这些副作用已经在使用预防性消炎痛的患有关节炎的狗中报道过(Hungin和Kean 2001)，并且消炎痛与人类关节炎中的一些生理生理指标的恶化有关(Rashad等人，1989；Huakinsson等人，1995)。在目前的研究中当将indosim施加到软骨外植体上时，IL-1介导的NO产生增加，但这与细胞活力下降无关。据报道，软骨损伤之后的细胞死亡在机械损伤7天后发生，并且一定程度上，该细胞凋亡由特定的iNOS活性的阻断剂介导发生(Green等人，2006)，然而分离的软骨细胞类的细胞在暴露到1ng/mL IL-1 48小时内经历细胞凋亡变化(Yasuhara等人，2005)。
然而，超过120倍的聚集蛋白聚糖的转录上调提供了足够的证据，表明SEQ能够刺激新的软骨的形成而不管通过IL-1激发的发炎。在用SEQ(0.06mg/mL)处理的未刺激的外植体中观察到GAG的增加，这同样也是外源性GAG供给增加的一种反映。很可能地，该增加在用更高剂量处理的外植体中并不显著，这是因为新的蛋白聚糖的形成显著增加，如通过外植体的聚集蛋白聚糖表达的增加所示。
而且，在IL-1刺激外植体中无法看到GAG的增加，这表明除了刺激蛋白聚糖合成之外，SEQ事实上抑制IL-1诱导的GAG释放。
当前的实验中受到SEQ和BO显著影响的终点在IL-1激发后细胞活力增加。该增加不是降低的细胞凋亡，其可从SEQ的iNOS和NO抑制性预测，因为它不反映IL-1刺激的细胞返回到未刺激的状态。另外，细胞活力在未刺激的对照水平上增加。软骨细胞生长的主要机制归因于PGE2与四个细胞表面受体EP1、EP2、EP3和EP4之一结合。该性质特别与EP1(DelToro等，2000；Brochhausen等，2006)或EP2(Aoyama等，2005)相关。
我们现在看到的已经在这里所述的研究中被观察到了，SEQsim和/或BOsim使得软骨细胞增殖增加，从而导致活细胞染色的增加。这也为PGE2的同时抑制提供了一个基础。作为PGE2受体激动剂的物质将起到“欺骗”细胞的作用，使其将激动剂认为是靶分子(即PGE2)。因此，PGE2激动剂的包含物具有提高细胞周围环境中的PGE2的数量的类似作用。
已知由IL-1刺激细胞而产生的PGE2产物被增长的细胞外PGE2浓度所抑制(Akarasereenont等，1999)。
结论
SEQ的模拟消化显著抑制了IL-1刺激的软骨外植体中的PGE2和NO的体外形成，然而对于GAG释放和细胞活力的增加没有作用。侧柏的模拟消化，SEQ中先前未调查的成分，通过未刺激的软骨外植体抑制GAG释放。总之，这些数据表明SEQ具有使软骨免于IL-1损伤的作用并提高软骨细胞活力。
马的软骨炎症模型被广泛报道，包括关节内激发(challenge)诸如脂多糖(Jacobsen等人，2006)、弗式完全佐剂(Toutain和Cester 2004)或者碘乙酸钠(Welch等人，1991)；或者外科破裂，包括骨软骨碎片的形成(Frisbie等人，2007)，局灶性挫伤冲击伤害(focal contusion impactinjuries，Bolam等人，2006)以及韧带横断(Simmons等人，1999)。虽然这些模型能够使得软骨以及相关的软骨下骨和软组织内复杂的炎症机制最大活化，但它们代表了主要的创伤性炎症应答。它们几乎不代表初始或者亚急性关节炎的更细微的生物化学、功能和生理途径变化，这些变化描述了赛马跛行的大多数情况的特征(Steel等人，2006)。
方法
食物：在我们的实验室中，根据表2中提供的组成，通过将鲍鱼(AB)、新西兰绿唇贻贝(NZGLM)、鲨鱼软骨(SC)和侧柏油(InterpathPty Ltd，Australia)混合在一起制备SEQ粉末。混合的SEQ定量通过将SEQ粉末(10g/kg)、糖蜜(20g/kg)和调味料(Essential Sweet HorseEssence D 2344.Essentials Inc.Abbotsford，BC.)(1g/kg)与甜饲料马定量(表2)来制备，并以5kg为一批在食物搅拌器中搅拌直至完全混合。对照定量(CON)使用与糖蜜(～20g/kg)和调味料(1g/kg)混合的相同的甜饲料食物来制备。
马：将11匹健康没有关节炎征兆的马(3匹纯种马，8匹标准竞赛用马，年龄为5-12岁；10匹阉割的公马，1匹母马)随机分配到A组(SEQ；1.5kg/天；n＝6)或者B组(CON；1.5kg/天；n＝5)。28天的实验包括两个阶段-阶段1：预处理(14天)；阶段2：处理(14天)。在第0天开始补充营养直到实验结束(图5)。在第0(前)、14(注射-1)、15(2个样品：注射-2-在注射之前立即收集；注射-2-2-注射后8小时收集)、16(第1天)，18(第3天)、21(第7天)和28天(第14天)进行收集样品；在这些天从颈静脉收集血液，并通过无菌关节穿刺术从两个腕骨间关节获取滑液样品(见下述)。在第14天(注射-1；10ng溶入500μL无菌生理盐水中)和第15天(注射-2；100ng溶入500μL无菌生理盐水中)将炎症激发(inflammatory challenge)-重组白细胞间介素-1β(IL-1)-注射到左右腕骨间关节内。将等体积的无菌生理盐水注射到对侧腕骨间关节内。作为关节积液指示物的关节周长在每次关节液取样时使用带尺测定。
在白天内将所有马关在小牧场里并在夜间关在马厩内。它们躺在木屑上休息并随意提供干草、水和矿物盐。根据加拿大动物管理理事会的指南，所有过程被圭尔夫大学动物管理委员会认可。
关节穿刺术：刮削左右腿的两个膝盖，并使用洗必太(4％)准备进行无菌消毒，使用70％异丙醇冲洗。将无菌的22规格的1.5″针插入到左腕骨间关节的侧面。然后连接一个3cc的无菌注射器，并抽取大约1.5-2mL滑液并立即注入无菌K2-肝素真空采血管。然后对右侧腕骨间关节重复该过程。在第14天(注射-1)和第15天(注射-2)，在抽取滑液之后除去针头借口之前将IL-1(500μL)注射到右侧或左侧对侧的任一个中(将500μL生理盐水注射到对侧关节内)。将大约1.5mL滑液从真空采血管中移去并置于微量离心管中并以11,000xg旋转10分钟以除去细胞杂质。将上清液置于含有10μg消炎痛的另一微量离心管中，并在-80℃下冻存直到用于PGE2、GAG和NO分析。在已经收集到滑液之后将消炎痛加入到滑液中，以便防止样品储存期间PGE2的进一步形成。将剩余～0.5mL滑液送到动物健康实验室(圭尔夫大学)用于细胞学分析。
滑液的细胞学
从真空采血管吸去1.0-1.5mL液体用于PGE2、NO和GAG分析(见下)，并且在动物健康实验室中，用大约0.5ml的液体去分析其总的有核细胞数(Coulter Z2计数器；Beckman Coulter Canada Inc.MississaugaON)，蛋白质(折射计)和细胞分化(对100个有核细胞进行)。
滑液[PGE2]：
将滑液解冻到室温，然后使用20μL透明质酸酶(10mg/mL)在试管摇床上37℃下培养30分钟以便消化透明质酸。然后将样品使用蚁酸(0.1％)按照1∶2稀释。弃去上清，并通过市售ELISA试剂盒(GEAmersham，Baie D′Urfé，Québec)分析PGE2。使用提供的裂解试剂将PGE2从样品中提取从而使PGE2从可溶性膜受体和结合蛋白中分离出来，然后根据试剂盒的使用说明进行定量。使用Victor 3酶标仪(PerkinElmer，Woodbridge ON)将吸收度设定为450nm对板进行阅读。对每个板绘出最佳适配的3阶多项标准曲线(R2≥0.99)，并将这些方程用于计算来自每个板的样品的PGE2浓度。
滑液[GAG]：
按照上面的描述将滑液样品中的透明质酸使用透明质酸酶消化。滑液的GAG浓度使用由Chandrasekhar等人(1987)描述的1，9-DMB分光光度测定法来测定。使用稀释缓冲液将样品以1∶3稀释并置于96-孔微孔板中。将每个孔中加入盐酸胍(275g/L)，然后立即加入150μL DMB试剂。将板在黑暗条件下培养10分钟，并在530nm下使用Victor 3酶标仪读取吸收度。将样品的吸收度与牛硫酸软骨素标准品(Sigma，OakvilleON)的吸收度进行比较。对于每个板绘出最佳适配线性标准曲线(R2≥0.99)，并且将这些方程用于计算对于每个板中样品的GAG浓度。
滑液[NO]：
亚硝酸盐(NO2-)，NO的稳定氧化产物通过格里斯反应(Fenton等人，2002)进行分析。将未稀释的TCM样品加入到96孔板中。将溶解在磷酸(0.085g/L)中的磺胺(0.01g/mL)和N-(1)-萘基乙二胺盐酸盐(1mg/mL)加入到所有孔中，并在5分钟内在530nm处在Victor 3酶标仪上读取吸收度。将样品吸收度与亚硝酸钠标准品进行比较。
数据分析和陈述
将双因素重复测量(RM)方差分析(ANOVA)用于测定处理之间的差异。当得到显著的F-比例时，将Holm Sidak post-hoc测试用于识别处理之间的差异。将单因素RM ANOVA用于测定以时间为参照的处理之间的差异。对于血液和滑液数据，数据的单因素比较可分别针对注射前和注射-1数据来进行，如同对于食物和IL-1注射的每个所表示的基线那样。数据以平均值±SEM来表示。除非另有说明，生物化学和血液学的数据的图示按照生理学参数间隔的比例绘制。参考间隔是由圭尔夫大学的动物健康实验室公布的那些(http://www.labservices.uoguelph.ca/units/ahl/files/AHL-userguide.pdf)。
结果
滑液
PGE2：
CON马：在任何时候，注射了生理盐水的关节中滑液的[PGE2]没有显著变化(图7，A)，相对于注射前的浓度，在IL-1注射的关节中，[PGE2]在注射-2-2中显著增加(321.3±161.8pg/mL；p＝0.04)，此时注射了IL-1的关节中滑液[PGE2]明显比注射生理盐水的关节中高(p＜0.001)。
SEQ马：数据表示n＝5，一个含有非正常值的马被从分析中除去。PGE2在SEQ马注射了生理盐水的关节中没有发生变化。与CON马类似，在SEQ马的IL-1注射的关节中[PGE2]的增加在注射-2-2处被阻止(175.4±89.2pg/mL)(图7，B)。但是，当与注射前浓度相比，这种增加并不显著。与CON马相比对生理盐水注射产生应答的PGE2在SEQ马中没有差别。与注射了生理盐水的SEQ马相比，对IL-1注射产生应答的PGE2没有显著差异。
虽然在SEQ马中在注射-2-2处平均[PGE2]大约是CON马的55％，平均值的变化没有导致食物之间的明显差别。
GAG：
CON马：在注射-1(18.3±6.8μg/mL)和第1天(48.1±9.6μg/mL)之间注射了生理盐水的关节中滑液[GAG]增加(图8，A)。IL-1的注射(10ng)引起了注射-1(24.5±7.3μg/mL)与注射-2(77.6±4.4μg/mL)之间的滑液[GAG]明显增加。与注射前浓度相比，在注射-2-2(66.0±9.6μg/mL)和第1天(53.3±11.4μg/mL)，在注射了IL-1的关节中滑液[GAG]保持显著地提高。注射IL-1的关节中滑液[GAG]增加的数量明显高于注射生理盐水的关节(p＝0.003)。
SEQ马：在注射前(生理盐水：29.3±5.9μg/mL；IL-1：27.0±10.8μg/mL)与注射-1(生理盐水：85.5±28.0μg/mL；IL-1：83.2±27.9μg/mL)之间，注射生理盐水和注射IL-1的关节中滑液[GAG]都趋于增加(p＝0.09)，这表明饮食对滑液[GAG]的影响(图8，B)。在整个实验过程中，注射了生理盐水或者注射了IL-1的关节中滑液[GAG]没有明显变化。注射IL-1和注射生理盐水的关节中滑液[GAG]没有显著差异。
在SEQ马中，注射IL-1和注射生理盐水的关节中滑液[GAG]明显高于CON马(p＜0.001)。这种差异主要是由于食物的作用，而不是IL-1的作用，事实证明，在任何注射IL-1之前GAG浓度已经增加。
NO：
CON马：注射了生理盐水和注射了IL-1的关节中滑液[NO]低，并且在实验过程中是变化的。在CON马中在该时间内无论是注射生理盐水还是注射IL-1对NO水平都没有显著影响。滑液[NO]的量值在注射IL-1与注射生理盐水的关节中是相同的。
SEQ马：在实验过程中的任何时刻，注射IL-1或者注射生理盐水的关节中滑液的[NO]没有变化。在任何时刻，IL-1或者生理盐水之间没有显著差异。
食物对IL-1注射或者生理盐水注射的关节中滑液[NO]没有明显影响。
滑液的细胞学：
CON马：注射前通过在注射-2(40.17±16.1x109/L)给予外源IL-1(10ng)，总细胞数(0.61±0.1x109/L)显著升高。在第二次注射IL-1(100ng)之后细胞数没有进一步增加，但在第1天内，细胞数保持轻微上升(但不显著)。注射了生理盐水的关节中(0.6±0.2x109/L)注射-1细胞数适度增加，在第一天达到最大值(6.0±2.6x109/L)，但这种增加也是不显著的。注射了生理盐水和IL-1的关节中总细胞数在注射-2[即在第一次IL-1注射(10ng)之后24小时]时有明显差异。细胞数的增加主要是由于嗜中性粒细胞相对百分含量的增加。在第一次注射之后嗜中性粒细胞的百分比在注射了生理盐水和注射了IL-1的关节中都明显增加。在第一天到第三天之间在没有进一步增加实验的剩余物的情况下，嗜中性粒细胞计数在注射了生理盐水和注射了IL-1的关节中都明显降低。注射了生理盐水和注射了IL-1的关节中的嗜中性粒细胞百分比没有差异。
SEQ马：注射前通过在注射-2(27.5±8.7x109/L)给予外源IL-1(10ng)，总细胞数(0.4±0.03x109/L)明显升高。细胞数没有在注射-2-2后进一步增加，但在注射的第1天内保持明显上升。注射了生理盐水的关节中(0.4±0.1x109/L)注射-1总细胞数适度增加，在注射-2-2达到最大值(4.0±2.6x109/L)，但这种增加也是不显著的。注射了生理盐水和IL-1的关节中总细胞数在注射-2(即在第一次IL-1注射10ng之后8小时)、注射-2-2(即在第二次IL-1注射100ng之后8小时)以及第一天(即在第二次IL-1注射100ng之后24小时)时有明显差异。在第一次注射之后在注射了IL-1和注射了生理盐水的关节中嗜中性粒细胞的百分比都明显增加。注射了生理盐水的关节的嗜中性粒细胞浓度的增加归因于由注射创伤引起的较小炎症。随着在第7天的第二次显著阻止，在第一天到第三天之间嗜中性粒细胞计数(％)在注射了生理盐水和注射了IL-1的关节中都显著降低。注射了生理盐水和注射了IL-1的关节中的嗜中性粒细胞百分比没有差异。
注射了IL-1和注射了生理盐水的关节中SEQ和CON食物对总细胞计数或者嗜中性粒细胞百分比没有显著影响。
CON马：通过注射10ng IL-1(20±0.0g/L到39.4±4.0g/L)，滑液[蛋白质]明显增加(图9，A)。在注射100ng IL-1后，[蛋白质]不再进一步增加，并且在注射100ng 24小时之后明显下降。生理盐水的注射还导致在第一次注射之后[蛋白质]立即明显增加，然后回到第一天的基线浓度(25.5±1.5g/L)。在整个实验过程中，注射了IL-1的关节中[蛋白质]增加量值明显高于注射了生理盐水的关节(p＝0.01)。
SEQ马：与注射-1(20±0g/L)相比，注射10ng IL-1导致在注射-2(38.7±4.9g/L)、注射-2-2(36.2±4.4g/L)以及第一天(27.8±3.8g/L)滑液蛋白质的明显增加(图9，B)。第二次注射100ng的IL-1注射不再对[蛋白质]产生影响。与注射-1(20.6±0.6g/L)相比，在注射-2-am(27.5±3.0g/L)和注射-2-pm(25.8±2.5g/L)的情况下注射生理盐水也导致[蛋白质]的明显增加。注射了IL-1的关节中[蛋白质]增加量值明显高于注射了生理盐水的关节(p＝0.003)。
注射了IL-1或者生理盐水的关节SEQ和CON食物对滑液[蛋白质]的影响没有显著差异。
关节周长：
CON马：随着时间的变化在注射了IL-1或者生理盐水的关节的周长中没有显著变化，并且在注射了IL-1与生理盐水的关节的周长之间没有显著差异(图6，A)。
SEQ马：在SEQ马中在注射-1(31.1±0.2cm)与注射-2(31.9±0.5cm)之间注射了IL-1的关节的周长存在明显增加(图6，B)。在下降到注射前水平之前，在注射-2-2(31.7±0.4cm)时关节周长保持显著增加。准确地说，注射了生理盐水的SEQ马中出现了同样的情况。
SEQ马中注射了IL-1的关节的周长明显低于CON马(p＜0.001)。
侧柏油的馏分
色谱法
使用装配了二极管阵列探测器和自动分馏收集器的Agilent 1200Preparative HPLC对来自侧柏种子的油进行分馏。所用的色谱柱为Agilent Prep C18，10μm(30×250mm)，流速20mL/分钟，注射900μL的组分4。使用以下的梯度：0-5分钟，80％为水，20％乙脲。5-7分钟梯度变化为10％的水，90％的乙脲。7-25分钟时用10％的水和90％的乙脲。在254nm处实现馏分测定。
质谱测定法：
在Agilent 6210 MSD飞行时间质谱仪上以阳离子和阴离子两种模式进行质谱测定。使用下列电喷雾离子化条件，干燥气体：氮气(7mL分钟-1，350℃)；雾化气体：氮气(15psi)；毛细电压：4.0kV；蒸发温度：350℃以及锥孔电压：60V
图13示出了油的色谱分析图谱，如图所示收集了各种馏分并编号。
侧柏油中的馏分的软骨保护/软骨形成的潜能
在体外对总的10种馏分(Fr1、Fr2、Fr3、Fr4、Fri、Frii、FrV、FrVi和FrVii)进行检测。从Lonza澳大利亚私人有限公司购得正常人类的关节软骨细胞(NHAC-膝盖)，其在补充有生长因子的软骨生长培养基(CGM)中进行生长。整个实验过程中在#3-4通道使用NHACs。
馏分1是水溶性的，馏分2-10以终浓度64mg/mL溶解于细胞培养级二甲基亚砜(DMSO)中。NHAC细胞在存在或缺失上述馏分的培养基中生长24、48小时，在实验过程中进行形态学的观察。下面的实验按照每个试剂盒的说明书进行：
活力/细胞毒性
·细胞毒性(乳酸脱氢酶)试验(Roche Applied Science)
细胞生长与增殖
·BrdU标签与检测试剂盒III(Roche Applied Science)
·CyQUANT细胞增殖检测试剂盒(分子探针：Invitrogen)
细胞凋亡/坏死
凋亡DNA梯度(ladder)提取试剂盒(Biovision)
Annexin-V-Flous试剂盒(Roche Applied Science)
用各种馏分处理并对软骨细胞形态学进行的观察揭示馏分1，即使使用最高浓度(128μg/mL)进行试验，也能保持正常的细胞形态并且帮助维持细胞生长。在较高浓度(128-32μg/mL)引起细胞凋亡和坏死形态的另外的馏分导致贴壁细胞浮起和细胞死亡。
即使使用最高浓度(128μg/mL)进行试验，馏分1对NHACs也没有细胞毒性。而使用最高浓度时，其它馏分具有细胞毒性，然而当使用的浓度≤64μg/mL时，Fr 1、Fr i和Fr V显示出对NHACs较低的细胞毒性。在用Fr 1、Fr i和Fr V处理的软骨细胞中观察到了非常低的(在正常范围内)细胞凋亡和坏死。
在BrdU细胞增殖试验中，馏分1以剂量依赖的方式显著增强了NHACs的增殖。其他馏分在浓度≤8μg/mL时显著刺激了细胞的增殖，但是在高浓度时具有细胞毒性(图14和15)。
已发现馏分1是水溶性的，经过进一步的调查，通过色谱分析发现馏分1含有5种独立的成分。之后对每种化合物的结构鉴定进行确认，结果如下：
F1.1(9Z，13S，15Z)-12，13-环氧十八碳-9，11，15-三烯酸
F1.2a顺，顺，顺-9，12，15-十八碳三烯酸(ALA)；
F1.2b顺，顺，顺-6，9，12-十八碳三烯酸(GLA)；以及
F1.3顺，顺-9，12-十八碳二烯酸；
F1.49-油酸
然后利用之前提到的试验对上述每种馏分的活力/细胞毒性、细胞生长和增殖、凋亡/坏死再次进行单独测定。
1.1-1.4的每种馏分都可溶于水，并且为表现出无细胞毒性。另外，处理过的细胞同未处理的细胞相比，凋亡指数(A/I)和坏死指数(N/I)没有显著差异，都低于10个单位。
图16示出了在BrDu试验条件下，F1.1-1.4的软骨细胞增殖水平，F1.4的细胞生长活性最大。另外示出了标记为F1的结合馏分的活性水平。
可以看出，馏分F1.1-1.4和结合馏分F1，在提高人类膝盖的软骨细胞增殖上都具有高效力。
讨论
该数据显示了早期关节炎的微创的可逆模型，其可以被用于评估假定的抗炎保健食品。IL-1由于其在增殖关节炎中的炎症应答的核心作用，而被选作关节内激发(Jacques等，2006)，PGE2由于其在调节基质代谢中的重要性而被选作主要因变量(Pavlovic等，2006)。为了建立取样方案，调查了IL-1关节内注射之后的PGE2制备的时间过程。在供应外源IL-1后大约4小时，在马的滑液中关节内[IL-1]提升到最大，基于以上事实，可以预测在注射后大约8小时后，发生最多的PGE2应答(Hardy等，1998)。随后PGE2在大约6小时的时候升高(Sedgewick和Lees 1986)。因此可以预测到8小时的试样将提供一个滑液[PGE2]最大增长的合理估计。
初始的供给马的10ng注射远远超出了已知的与马的关节疾病有关的IL-1浓度(≥4.5pg/mL；Bertone等，2001)，并预期可产生显著的PGE2应答。然而，尽管有效激活初始补充到关节空间的炎症细胞并提高滑液[GAG]，但是却展示了单独的10ng的IL-1注射导致较差的8小时PGE2应答。这至少部分可归因于，IL-1蛋白质结构的种类特异性差异以及其与目标组织的相互作用。人类IL-1β的蛋白质序列(LOCUS CAG28607；Ebert等，2004)与马IL-1(LOCUS Q28386；Kato等，1995)只具有66％的同一性，这部分解释了为何马组织对人IL-1的刺激不如对马IL-1的敏感。据报道，提供175ng的外源的关节内重组人IL-1β导致了在马隔离的肢体中急性炎症应答(Hardy等，1998)。在将炎症应答限制到亚临床数量的努力中，注射“第一”IL-1剂量，从而在软骨细胞和滑膜细胞上建立IL-1受体的表达，然后是低于175ng的第二“激发”IL-1剂量以产生显著的PGE2应答。
在第二次注射之后的8小时，双倍IL-1注射方案导致在统计上PGE2的明显增加。在实验过程中，任何时候都没有CON马在行走或者简单小跑时出现明显地跛足现象，尽管平均峰值滑液[PGE2](498pg/mL)与马的跛行状况相关联(488pg/mL；de Grauw等人，2006)。PGE2的上升并不伴随NO的上升。这给马不出现跛足的现象提供了一种解释，可能是因为伤害性疼痛的传递和感受主要是由于升高的PGE2和NO的联合作用。CON马已经可证明适度训练可使他们出现轻度的跛足，但由于训练对滑液[PGE2]的混淆影响而不能进行(van den Boom等人，2005)。在CON马中观察到的滑液[PGE2]的增加提供了对于关节内轻度IL-1诱导的炎症的很好证据。我们假设这种增加会被有效的消炎保健食品饮食方案所降低。
炎症细胞的运输(trafficking)以及粘多糖释放到滑液中对IL-1的刺激比产生PGE2更为敏感，因为在初始10ng IL-1注射之后24小时观察到滑液[GAG]和[嗜中性粒细胞]的增加。滑液[蛋白质]也在第一次IL-1注射之后立即升高。而进行更高的IL-1的激发后，这些参数没有进一步的增加。这些应答与‘关节炎前(pre-arthritic)’炎症状态相一致(Adarichev等人，2006)。在关节炎早期阶段表达的基因主要是与趋化因子、细胞因子(尤其是IL-1)以及金属蛋白酶，尤其是MMP-13和MMP-9的转录相关的那些。趋化因子是炎症细胞迁移到滑膜空间的强有力的信号。由于滑膜膜上的的滑膜细胞和内皮细胞被活化以表达细胞粘附分子并产生趋化因子，使渗入到关节间隙中的嗜中性粒细胞极大地增加，如同在本文中描述的研究中所观察到的滑液[嗜中性粒细胞]急剧增加一样。滑膜的细胞也变得对血清蛋白的可渗透性增加(Middleton等人，2004)，导致观察到滑液[蛋白质]的快速增加。MMP-13(Yammani等人，2006)和MMP-9(Soder等人，2006)在关节软骨中是关键的降解酶，在目前的研究中表明在IL-1诱导的滑液[GAG]观察到的情况支持这些酶在早期关节炎中编码基因的增量调节中起重要作用(Adarichev等人，2006；Kydd等人，2007)。PG-刺激的小鼠中关节炎前软骨的微阵列分析表明，编码磷脂酶C2(催化来自核膜花生四烯酸释放的酶)的基因没有升高(Adarichev等人，2006)。这至少可部分解释为什么在IL-1刺激之后PGE2的增加需要的时间比细胞迁移和GAG的增加更长的原因。
使用IL-1的关节内激发没有导致滑液内一氧化氮的持续上升。IL-1诱导的一氧化氮已经在软骨外植体模型(Pearson等人，2007；Petrov等人2005)，从急性关节炎动物模型中获取的细胞(Kumar等人，2005)以及关节炎的临床案例(Karatay等人，2005)中频繁地被报道。这些数据提供了用于证明编码可诱导一氧化氮合成酶在早期关节炎中没有增加的证据的支持(Kydd等人，2007)，其延迟了IL-1诱导的一氧化氮形成。
SEQ提供了对IL-1刺激的关节的保护，原因如下：1)滑液[PGE2]没有明显增加；2)在IL-1刺激之前滑液中[GAG]增加，然后防止了IL-1诱导的GAG增加；以及3)在IL-1刺激之后有限的积液渗入到关节间隙中。该产品被选作测试保健食品是因为最近的证据表明其个体成分能有效降低在软骨外植体中的PGE2、GAG释放和NO产生(Pearson等，2007)。作为在关节内IL-1激发之前2周的饮食的一部分，SEQ防止了IL-1诱导的PGE2的明显增加。与CON马类似，PGE2对SEQ马中的IL-1产生响应峰值出现在第二次IL-1注射之后的8小时，但该峰值很低，并且随着时间的变化不导致统计学意义上的明显变化或者IL-1与生理盐水注射之间的明显差异。这显示了SEQ减少了在患有早期关节炎的马中与升高的PGE2有关的炎症与疼痛，并且表明在关节损伤之前使用SEQ饲养马可阻止疾病发展到更高级的阶段。
在注射前和注射-1之间，即炎症激发前SEQ马在注射生理盐水和IL-1两者的关节中观察到的滑液[GAG]的增加提供了滑液空间内食物GAG的吸收后积累的证据。为了测量来自SEQ的GAG是否优先进入到滑液间隙或是否均匀地分散在动物体内，在SEQ的饮食供应后，定量血浆[GAG]是很有价值的。在IL-1激发后的[GAG]的显著增长的缺乏是很重要的，这为关节炎早期阶段的马中的SEQ的软骨保护作用提供了支持。由于金属蛋白酶13和9在关节炎早期阶段被快速和实质性地上调(Adarichev等，2006；Kydd等，2007)，SEQ在酶活性和/或酶蛋白的制备以及在聚蛋白多糖酶的表达/活性中的作用，将为软骨保护作用可能的机制提供有用的信息。
依赖四种组分的协同作用，SEQ能够有效预防关节炎早期的生化指标。之前的研究表明，NZGLM和SC的模拟消化能有效抑制在软骨外植体中的IL-1诱导的PEG2产生(Pearson等，2007)。该研究还表明，通过供应外源GAG，SC显著增加了培养基[GAG]，并且NZGLM阻止了IL-1诱导从软骨基质中释放GAG。这些数据支持了那些其他的作者，他们报道了在提供了食物NZGLM的狗种关节炎症状的明显改善(Pollard等人，2006)，以及软骨外植体中的葡糖胺和软骨素-SC的主要生物活性成分-对由IL-1降解的明显保护(Dechant等人，2005)。
生物油提取物F1.2-1.4和F1能够有效提高人膝盖软骨中的软骨细胞增殖，这在之前是不为人知的。F1.1-1.4的化合物可单独应用，或者和一种或多种其他馏分作为混合物应用，这为疾病治疗例如骨关节炎的治疗提供了显著的改进。
在本发明的部分或者全部方法步骤和系统组成可进行任何改进。本文中引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利通过引用结合入本文。除非特别声明，本文中使用的任何和所有实施例或者举例性的语言(例如“诸如”)都用于解释本发明，而不造成对本发明的范围的限制。本文中各有关本发明的本质或者优点或者优选实施方式的任何陈述都不是为了限制本发明，并且所附的权利要求书也不应当被认为受到这些陈述的限制。更通常地说，本发明的说明书的任何语言均不能被当成未声明的部分，成为本发明实施的基础。只要适用法律许可，本发明包括叙述主题的所有修改和等同物。此外，除非在本文中特别指明或者与上下文明显矛盾，本发明包含上面描述的成分及其所有可能变化的任意组合。
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