技术领域
本发明属中药制药技术领域，具体涉及一种健骨冻干粉针剂及其制备方法。
背景技术
由马鞭草科豆腐柴属植物战骨(亦称：黄毛豆腐柴)为原料制成的健骨注射 液[部颁中药14册，WS3-B-2768-97]，具有活血散瘀、强筋健骨、驱风止痛之功效， 用于脊椎骨质增生证，对风湿性关节炎亦有疗效。文献报道，健骨注射液的主要 有效成分是黄酮类化合物[潘洪平，等。黄毛豆腐柴化学成分、药理研究及临床应 用进展。广西医学，2002，24(3)：365]。专利文献CN94101711公开了健骨注射 液的制备方法：战骨(茎)用20％乙醇浸渍提取，浓缩提取液用80％乙醇沉淀， 上清液调节pH值后回收乙醇，加入注射用水后用活性炭处理，过滤后的溶液加入 聚山梨酯-80和苯甲醇，调节pH值即得。上述制备方法有以下不足之处：用浸渍 法提取，对药材中的有效成分提取效率很低，而且用时很长；乙醇沉淀时，产生 的沉淀对于有效成分的吸附、包裹使得有效成分损失很大；用活性炭处理时，活 性炭对有效成分也有很强的吸附作用，使有效成分损失；增溶剂聚山梨酯-80会造 成溶血现象。健骨注射液自上市以来，虽然在临床上取得了一定的疗效，也未能 达到预期的治疗效果。因此，利用现代的科学技术方法对健骨注射液进行进一步 的开发，使其发挥更好的临床效果是很有必要的。
在资料检索中未发现有关健骨冻干粉针剂的任何报道。
发明内容
为了解决健骨注射液制备方法中存在的问题，本发明的研究人员从制备工艺 入手，采用先进的科学技术方法对制备工艺进行了改进，最大限度的保留了所含 的有效成分的同时有效去除了其中的杂质，并对有效成分进行了分离、纯化。最 终制备成冻干粉针剂，使得制剂更加稳定，贮藏、运输、使用更加方便。
本发明的目的是提供一种有效成分含量高、疗效好、副作用小、使用方便的 健骨冻干粉针剂。
本发明的另一个目的是提供一种健骨冻干粉针剂的制备方法。
本发明通过以下技术方案实现。
一、制备方法
(1)原料药材为：战骨(茎)。
(2)取上述药材饮片，粉碎，加6-10倍量pH8-10的40％-80％的碱性乙醇溶 液，放入超声提取罐中，进行超声振荡提取，时间为20-50分钟，振荡频率为 20-100kHz，控制温度为室温，提取2-3次，合并提取液，过滤，滤液用pH2-4的 稀盐酸溶液调节pH7.0-7.5，以12000-20000转/分的速度离心，离心液用截留分子 量为5000-7000的超滤膜超滤，滤液50℃以下减压浓缩成密度为1.20的清膏，过 已处理好的聚酰胺柱，先用3-5倍柱体积的水洗脱，再用2-5倍柱体积70％-90％ 乙醇溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，50℃以下减压浓缩，干燥，粉碎，得到醇提物 10-25重量份。
(3)将上述醇提物用注射用水溶解，滤过，加入冻干赋型剂25-40重量份， 加注射用水至规定量，用葡甲胺调节pH7.5-8.5，用0.22μm的微孔滤膜过滤，灌装， 冷冻干燥，即得。
超声波是一种弹性机械振动波，它产生强烈振动，高速度，强烈的空化效应， 搅拌作用，因此能破坏植物药材的细胞，使溶液能渗透到药材细胞中，从而加速 药材中有效成分溶解，以提高有效成分的提出率。该方法所需设备简单、操作方 便、提取时间短、提取效率高、节能、无需加热。对于战骨茎药材中长时间遇热 易分解的黄酮类有效成分的提取来说，是非常适合的。
超滤是一种膜分离技术，在常温、加压条件下，使溶液中不同分子量的物质 分离的一种方法，能有效除去溶液中的引起制剂副作用和不稳定的鞣质、树脂、 蛋白质、淀粉等大分子物质，而小分子的有效成分则不被超滤膜截留而滤过。制 备过程中不需要长时间加热，保持了原药材的生物活性和有效成分的稳定性。在 制剂的整个制备过程中，周期短，加热时间少，对有效成分的保留较好。
聚酰胺对黄酮类有效成分有特殊的亲和力，利用这一特点，使黄酮类有效成 分与其它非活性成分得以分离，对黄酮类有效成分起到了纯化的作用。
二、含量分析
测定方法按照健骨注射液[部颁中药14册，WS3-B-2768-97]标准含量测定中的 高效液相色谱法进行测定战骨茎药材中柚皮素的含量。健骨注射液由广西南宁百 会药业集团有限公司生产；本发明健骨冻干粉针剂由广东天之骄药物开发有限公 司提供。测定结果见表1。
表1 健骨制剂中柚皮素的含量测定
原儿茶醛含量(μg/支)
批号
健骨注射液 健骨冻干粉针剂
1 137 165
2 128 172
3 133 168
4 126 170
5 130 167
注：健骨注射液[部颁中药14册，WS3-B-2768-97]标准含量测定项下规定：健 骨注射液每1ml含柚皮素不得少于50μg。健骨注射液规格为2ml/支，所以每支健 骨注射液含柚皮素不得少于100μg。
以上含量测定结果，用新工艺制备的健骨冻干粉针剂中指标成分柚皮素的含 量远远高于健骨注射液中的含量，二者在统计学上有显著差异，说明本发明健骨 冻干粉针剂的工艺合理、科学，具有更好的实用性。
三、安全性考察
编号1：健骨注射液由广西南宁百会药业集团有限公司生产；编号2：本本发 明健骨冻干粉针剂由广东天之骄药物开发有限公司提供。
取家兔心脏血，置有玻璃珠的容器内，振摇数分钟，除去蛋白元，使成脱纤 血，加生理盐水，摇匀，离心，顷去上清液，沉淀的红细胞再用生理盐水洗涤3 次至离心后上清液不显红色为止，然后按所得红细胞体积用生理盐水稀释成2％的 混悬液，当天使用，用时摇匀。取洁净试管5支，1号试管中加入上述1号健骨注 射液0.4ml；2号试管中加入上述2号本发明健骨冻干粉针剂的溶液(一支用2ml 注射用水溶解)0.4ml；3号试管中加入上述1号健骨注射液0.5ml；4号试管中加 入上述2号本发明健骨冻干粉针剂的溶液(一支用2ml注射用水溶解)0.5ml；各 管再按下表配比量加入生理盐水；5号试管加生理盐水2.5ml作为阴性对照，然后 分别加2％红细胞混悬液2.5ml，摇匀，迅速置恒温箱内，保持在36.5±0.5℃，放 置3小时，观察溶血现象。结果见表2。
表2 溶血试验结果
试管号 2％红血球混悬液(ml) 生理盐水(ml) 药液(ml) 溶血现象
1 2.5 2.1 1号0.4 ±
2 2.5 2.1 2号0.4 -
3 2.5 2.0 1号0.5 +
4 2.5 2.0 2号0.5 -
5 2.5 2.5 0.0 -
注：-表示无溶血现象发生；±表示有轻微溶血现象发生；+表示有溶血现象 发生。
以上实验结果说明，两者在相同浓度时，健骨注射液具有明显溶血作用，本 发明的健骨冻干粉针剂则不含有溶血作用的聚山梨酯-80而使溶血反应明显降低。 说明本发明健骨冻干粉针剂副作用小，安全性好。
四、药理实施例
健骨注射液由广西南宁百会药业集团有限公司生产；本发明健骨冻干粉针剂 由广东天之骄药物开发有限公司提供。
1.健骨制剂对二甲苯致小鼠耳肿胀的抑制作用
取健康昆明种小鼠30只，体重20～24g。随机分成对照组、健骨注射液组、 本发明健骨冻干粉针剂组。每组10只，雌雄各半，分笼饲养。以人常规治疗剂量 折算为小鼠的剂量。折算公式为：待测动物试用剂量＝已知动物给药量×待测动物 的体表面积比值/已知动物的体表面积比值。对照组给予蒸馏水，连续给药7天， 最后1次给药后30分钟，每只小鼠左耳前后两面涂布二甲苯0.03ml致炎，30分 钟后颈椎脱臼处死动物，沿耳廓基线剪下两耳，用9mm直径打孔器分别在同一对 称部位打下圆耳片，扭力天平称重，每鼠的左耳片重减去右耳片重量即为肿胀度， 计算各组肿胀度之均值和标准差，并作t检验，比较组间差异性，按下列公式计算 肿胀抑制百分率：抑制率＝(对照组平均肿胀度-给药组平均肿胀度)/对照组平均 肿胀度×100％。结果见表3。
表3 健骨制剂对二甲苯致小鼠耳肿胀的抑制作用(X±SD)
鼠数 耳肿胀率 抑制率
组别
(只) (％) (％)
对照组 10 15.62±2.74 -
健骨注射液组 10 9.44±3.37* 39.6
健骨冻干粉针剂组 10 8.10±3.12*# 48.1
注：与对照组比较：*P＜0.01；
与健骨注射液组比较：#P＜0.05
本发明健骨冻干粉针剂组、健骨注射液组与对照组相比，对二甲苯致小鼠耳 肿胀均有显著的抑制作用(P＜0.01)；本发明健骨冻干粉针剂组和健骨注射液组相 比，对二甲苯致小鼠耳肿胀也有显著差异(P＜0.05)。说明：本发明健骨冻干粉针 剂的药理作用强于健骨注射液。
2.健骨制剂对小鼠的扭体法镇痛试验
小鼠30只分3组，对照组、健骨注射液组、健骨冻干粉针剂组，各组分别给 药连续7天；末次给药后1小时，腹腔注射0.8％醋酸0.2ml/只，记录5～20min 内扭体次数。结果见表4。
表4 健骨制剂对小鼠扭体反应的影响(X±SD)
组别 鼠数(只) 扭体次数(n) 抑制率(％)
对照组 10 34.52±12.57 -
健骨注射液组 10 19.24±15.88* 44.26
健骨冻干粉针剂组 10 15.17±10.46*# 56.05
注：与对照组比较：*P＜0.01；
与健骨注射液组比较：#P＜0.05
本发明健骨冻干粉针剂组、健骨注射液组和对照组相比，均能显著降低小鼠 扭体次数(P＜0.01)；本发明健骨冻干粉针剂组和健骨注射液组相比，扭体次数的 减少也有差异(P＜0.05)。说明：本发明健骨冻干粉针剂的药理作用强于健骨注射 液。
以上药理实验说明，本发明健骨冻干粉针剂的药理作用强于健骨注射液。说 明用新的制备方法制成的本发明健骨冻干粉针剂对于健骨注射液的进一步开发是 成功的，本发明的制备方法更加科学，更加合理，更加具有实用性。
五、制备实施例
以下实施例旨在进一步举例说明，而不是限制本发明。在不违背本发明的精 神和原则的前提下，对发明个别技术步骤进行的任何改动或改变将落入本发明权 利要求范围内。
实施例1
(1)原料药材为：战骨(茎)2500g。
(2)取上述药材饮片，粉碎，加10倍量pH10的用石灰乳碱化的80％乙醇溶 液，放入超声提取罐中，进行超声振荡提取，时间为50分钟，振荡频率为100kHz， 控制温度为室温，提取3次，合并提取液，过滤，滤液用pH4的稀盐酸溶液调节 pH7.5，以20000转/分的速度离心，离心液用截留分子量为5000的超滤膜超滤， 滤液50℃以下减压浓缩成密度为1.20的清膏，过已处理好的聚酰胺柱，先用5倍 柱体积的水洗脱，再用5倍柱体积70％乙醇溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，50℃以 下减压浓缩，干燥，粉碎，得到醇提物25g。
(3)将上述醇提物用注射用水溶解，滤过，加入甘露醇25g，加注射用水至 1000ml，用葡甲胺调节pH8.5，用0.22μm的微孔滤膜过滤，灌装，冷冻干燥，即 得本发明健骨冻干粉针剂500支。
实施例2
(1)原料药材为：战骨(茎)2500g。
(2)取上述药材饮片，粉碎，加6倍量pH8的用碳酸钠碱化的40％乙醇溶液， 放入超声提取罐中，进行超声振荡提取，时间为20分钟，振荡频率为20kHz，控 制温度为室温，提取2次，合并提取液，过滤，滤液用pH2的稀盐酸溶液调节pH7.0， 以12000转/分的速度离心，离心液用截留分子量为7000的超滤膜超滤，滤液50 ℃以下减压浓缩成密度为1.20的清膏，过已处理好的聚酰胺柱，先用3倍柱体积 的水洗脱，再用2倍柱体积90％乙醇溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，50℃以下减压 浓缩，干燥，粉碎，得到醇提物10g。
(3)将上述醇提物用注射用水溶解，滤过，加入葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮40g 加注射用水至1000ml，用葡甲胺调节pH7.5，用0.22μm的微孔滤膜过滤，灌装， 冷冻干燥，即得本发明健骨冻干粉针剂500支。
实施例3
(1)原料药材为：战骨(茎)2500g。
(2)取上述药材饮片，粉碎，加8倍量pH9的用氢氧化钠、石灰乳碱化的 60％乙醇溶液，放入超声提取罐中，进行超声振荡提取，时间为40分钟，振荡频 率为50kHz，控制温度为室温，提取3次，合并提取液，过滤，滤液用pH3的稀 盐酸溶液调节pH7.2，以16000转/分的速度离心，离心液用截留分子量为6400的 超滤膜超滤，滤液50℃以下减压浓缩成密度为1.20的清膏，过已处理好的聚酰胺 柱，先用4倍柱体积的水洗脱，再用3倍柱体积80％乙醇溶液洗脱，收集乙醇洗 脱液，50℃以下减压浓缩，干燥，粉碎，得到醇提物16.5g。
(3)将上述醇提物用注射用水溶解，滤过，加入葡萄糖、果糖、右旋糖苷33.5g 加注射用水至1000ml，用葡甲胺调节pH8.0，用0.22μm的微孔滤膜过滤，灌装， 冷冻干燥，即得本发明健骨冻干粉针剂500支。
实施例4
(1)原料药材为：战骨(茎)2500g。
(2)取上述药材饮片，粉碎，加7倍量pH8的用氢氧化钾碱化的50％乙醇溶 液，放入超声提取罐中，进行超声振荡提取，时间为30分钟，振荡频率为80kHz， 控制温度为室温，提取2次，合并提取液，过滤，滤液用pH3.5的稀盐酸溶液调 节pH7.1，以14000转/分的速度离心，离心液用截留分子量为5600的超滤膜超滤， 滤液50℃以下减压浓缩成密度为1.20的清膏，过已处理好的聚酰胺柱，先用3倍 柱体积的水洗脱，再用5倍柱体积75％乙醇溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，50℃以 下减压浓缩，干燥，粉碎，得到醇提物12.8g。
(3)将上述醇提物用注射用水溶解，滤过，加入聚乙烯吡咯烷酮、乳糖37.2g， 加注射用水至1000ml，用葡甲胺调节pH7.8，用0.22μm的微孔滤膜过滤，灌装， 冷冻干燥，即得本发明健骨冻干粉针剂500支。
实施例5
(1)原料药材为：战骨(茎)25000g。
(2)取上述药材饮片，粉碎，加9倍量pH10的用碳酸钾碱化的70％乙醇溶 液，放入超声提取罐中，进行超声振荡提取，时间为45分钟，振荡频率为40kHz， 控制温度为室温，提取3次，合并提取液，过滤，滤液用pH2.5的稀盐酸溶液调 节pH7.3，以18000转/分的速度离心，离心液用截留分子量为6000的超滤膜超滤， 滤液50℃以下减压浓缩成密度为1.20的清膏，过已处理好的聚酰胺柱，先用5倍 柱体积的水洗脱，再用4倍柱体积85％乙醇溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，50℃以 下减压浓缩，干燥，粉碎，得到醇提物212g。
(3)将上述醇提物用注射用水溶解，滤过，加入甘露醇、葡聚糖、右旋糖苷 288g，加注射用水至10000ml，用葡甲胺调节pH8.3，用0.22μm的微孔滤膜过滤， 灌装，冷冻干燥，即得本发明健骨冻干粉针剂5000支。
本发明健骨冻干粉针剂的用法与用量为：肌内注射，一次1支，一日1-2次； 痛点封闭，一次4ml，一周2次或遵医嘱，10日为一疗程，停药三日再进行下一 个疗程，一般用药1-3个疗程。