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本发明公开了一种用于增强免疫力的组合物。本发明所提供的用于增强免疫力的组合物，主要由下述重量份的原料制成：黄芪375份-750份和菊苣250份-500份。本发明还提供了该组合物的制备方法及在制备增强免疫力的药物中的应用。经动物试验证明，本发明所提的组合物具有增强免疫力的功能，且具有生产工艺简单，使用方便，副作用小等优点。

权利要求书

用于增强免疫力的组合物及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及组合物的制备方法与应用，尤其涉及用于增强免疫力的组合物及其制备方法与应用。
背景技术
机体的免疫功能是由一个复杂的免疫系统实现的，它包括免疫器官、免疫细胞和免疫因子。免疫系统的存在及功能的正常化是机体免疫功能稳定的基本保证，其中任何一部分的缺损或异常都会导致免疫功能的不全或紊乱，从而降低或丧失免疫功能。免疫功能的不足或低下会对机体健康产生极为不利的影响，使多种传染病或非传染病的发病率和死亡率提高。
现代医学认为免疫系统的生理功能有三：第一是免疫防御，它对抗原物质（病原微生物、菌苗、类毒素、异种蛋白等）发生免于应答，最终消灭抗原物质，起到抗传染免疫的效应。第二是免疫自稳，淋巴细胞能识别并区分哪些是“非己”，哪些是“自己”的抗原物质，因此对传染因子、肿瘤细胞产生免疫应答到达消灭的目的。其三是免疫监视功能（包括特异性和非特异性识别和杀伤），其主要功能表现在机体通过免疫细胞识别癌变的细胞上的抗原，并通过特异或非特异性杀伤细胞将癌细胞破坏。
现代社会，由于竞争激烈，压力增大，生活节奏越来越快，对于饮食，人们往往顾不上合理搭配，均衡营养，造成免疫力下降。在面临外界外界病毒流行的时期，此类人群最易受到感染。体弱多病人群的一大特征就是免疫力低，工作压力大的上班族尤其明显。这种生活状态主要与学习、工作过于疲劳、精神压力、职业应激等诱因有关。现代深灰激烈竞争、快节奏、高压力，加重了人们的身心负担；环境污染、不良的生活习惯和饮酒习惯等，例如暴饮暴食、食用三高食品，导致缺乏维生素和微量元素等，从另一方面降低了人们的身体素质，削弱机体的免疫功能，这些都是导致亚健康状态出现的诱因。因此，应用各种具有免疫增强作用的药物和保健食品治疗和改善机体免疫功能低下具有重要的临床意义。
目前常用的免疫增强剂主要包括：维持机体正常生命活动必需的微量元素‑硒，其在体内以多种生物活性形式参与机体多种生理功能的调节；细菌脂多糖（LPS）是亲脂又亲水的聚阴离子分子，对体液免疫（HI）和细胞免疫（CMI）都有辅佐作用，可引起动物特异性应答；核酸类免疫增强剂在体内经降解后的核苷酸和脱氧核苷酸可被人体吸收利用。核苷酸能改善细胞的活力，提高机体各系统的自身功能和自我调节能力，增强机体免疫力；以香菇多糖、银耳多糖、乙酰甘露聚糖、酵母多糖等为代表的真菌和植物多糖类免疫增强剂。
黄芪是以蒙古黄芪和膜荚黄芪的根为药用。作为常用的“扶正固本，补益中气”的药物，化学成分复杂，含有多糖、多种皂甙、黄酮以及氨基酸、亚油酸、生物碱等。主要功效为补气升阳，益气固表，托毒生肌，利水消肿。成分中多糖尤其是中药多糖具有增强机体免疫等药理作用，而且几乎没有毒性。
菊苣（Cichorium intyb L.）是菊科菊苣属多年生宿根植物，是维吾尔族和蒙古族习用药材。菊苣为菊科植物毛菊苣或菊苣的干燥地上部分，味微苦、咸，凉。具有清肝利胆，健胃消食，利尿消肿之功效，主要用于湿热黄疸，胃痛食少，水肿尿少。国外亦有菊苣要用的报道。
枸杞子为茄科植物宁夏枸杞（Lycium barbarum L.）的干燥成熟果实。味甘，性平。归肝、肾经。具有滋补肝肾，益精明目的功能。用于虚劳精亏，腰膝酸痛，眩晕耳鸣，内热消渴，血虚萎黄，目昏不明。
在现有的免疫增强剂中，未见黄芪、菊苣和枸杞子组成的配方。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种用于增强免疫力的组合物，其特征在于：它主要由下述重量份的原料制成：黄芪375份‑750份和菊苣250份‑500份。
所述组合物是以黄芪提取物和菊苣提取物为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制成。
所述组合物主要由下述重量份的原料制成：
黄芪375份‑750份、菊苣250份‑500份和枸杞子125份‑375份。
所述组合物是以黄芪提取物、菊苣提取物和枸杞子提取物为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制成。
所述黄芪提取物为黄芪水提取物或黄芪有机溶剂提取物，所述菊苣提取物为菊苣水提取物或菊苣有机溶剂提取物，所述枸杞子提取物为枸杞子水提取物或枸杞子有机溶剂提取物。
所述药学上可接受的辅料或辅助性成分为麦芽糊精、微晶纤维素和二氧化硅。
所述组合物在制备增强免疫力的药物中的应用也属于本发明的保护范围。
经动物试验证明，本发明所提供的组合物具有增强免疫力的功能。经口给予小鼠不同剂量的该组合物30天，能增强小鼠迟发型变态反应，即能增强细胞免疫功能；能提高小鼠单核‑巨噬细胞的碳廓清能力，即能增强单核‑巨噬细胞功能；对小鼠半数溶血值、小鼠抗体生成细胞数、小鼠的体重增长、脏器/体重比值、小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力、ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化能力、NK细胞活性无影响。同时毒理学检测结果证明，该组合物经口给予大鼠30天，对血常规、血生化指标、脏器重量、脏器系数及体重、增重、进食量、食物利用率等各项指标均未见不良影响。病理组织学观察，肝、脾、肾、胃、十二指肠、睾丸、卵巢均未见有意义的病理改变。
本发明所提供的用于增强免疫力的组合物，具有生产工艺简单，使用方便，副作用小等优点。
具体实施方式
实施例1、制备增强免疫力的组合物
该实施例中的黄芪提取物和菊苣提取物可用下述方法制备得到，也可从商业途径购买得到；麦芽糊精、微晶纤维素和二氧化硅可从商业途径购买得到。
该实施例制备得到的组合物如下：

该实施例组合物的制备方法如下：
1、制备黄芪提取物：
取黄芪原药材，用8倍重量的水提取2次，每次2小时，合并2次水提取液；在60℃，‑0.08MPa条件下，将水提取液浓缩至相对密度1.1（60℃），得到浓缩液；将浓缩液经减压干燥（‑0.09MPa），得到干浸膏；将干浸膏粉碎，并过80目筛后，得到提取物细粉，即为黄芪提取物。
2、制备菊苣提取物：
取菊苣原药材，用10倍重量的水提取2次，每次2小时，合并2次水提取液；在60℃，‑0.08MPa条件下，将水提取液浓缩至相对密度1.08‑1.10（60℃），得到浓缩液；将浓缩液经减压干燥（‑0.09MPa），得到干浸膏，粉碎，过80目筛后，得到提取物细粉，即为菊苣提取物。
3、过筛：取上述制备得到的黄芪提取物和菊苣提取物，再取麦芽糊精、微晶纤维素和二氧化硅，用漩涡振荡筛（型号ZS‑650）分别过60目筛，备用。
4、混合：将黄芪提取物、菊苣提取物、麦芽糊精、微晶纤维素和二氧化硅倒入槽形混合机（CH‑90型）进行混合，混合40分钟，得到混合粉，即得到本发明的组合物。
5、填充：用胶囊自动填充机填充胶囊，规格为0.45g/粒，得到本发明的组合物胶囊。操作条件要求温度18℃‑26℃，相对湿度45%‑65%。填充时进行装量差异的检查。
6、抛光：填充合格的胶囊置胶囊抛光机中进行抛光，去除表面药粉。过筛、混合、填充和抛光等生产环境的空气洁净度要求30万级，符合GB17405‑1998要求。
实施例2、制备增强免疫力的组合物
该实施例中的黄芪提取物、菊苣提取物和枸杞子提取物可用下述方法制备得到，也可从商业途径购买得到；麦芽糊精、微晶纤维素和二氧化硅可从商业途径购买得到。
该实施例制备得到的组合物如下：

该实施例组合物的制备方法如下：
1、制备黄芪提取物：
取黄芪原药材，用与上述实施例1相同的方法得到黄芪提取物。
2、制备菊苣提取物：
取菊苣原药材，用与上述实施例1相同的方法得到菊苣提取物。
3、制备枸杞子提取物：
（1）取枸杞子用水提取2次，第一次加10倍重量水，提取2小时，过滤；第二次加8倍重量水，提取1.5小时，过滤，合并滤液；
（2）将提取液减压浓缩至相对密度约为1.05‑1.1（60℃）的浓缩液；
（3）将浓缩液用95%的食用酒精调整醇浓度为80%，冷藏6小时，收集沉淀物；
（4）沉淀物经减压干燥（‑0.08MPa），得干膏，粉碎，过80目筛后，的枸杞子提取物干粉。
4、过筛：取上述制备得到的黄芪提取物、菊苣提取物和枸杞子提取物，再取麦芽糊精、微晶纤维素和二氧化硅，用漩涡振荡筛（型号ZS‑650）分别过60目筛，备用。
5、混合：用与上述实施例1相同的方法得到本发明的组合物。
6、填充：用与上述实施例1相同的方法得到本发明的组合物。
7、抛光：与上述实施例1相同。
实施例3、本发明的增强免疫力的组合物功能评价
1.材料与方法
1.1样品：上述实施例1制备的组合物胶囊A1、A2和A3；实施例2制备的组合物胶囊B1、B2和B3；黄芪提取物C；菊苣提取物D；枸杞子提取物E。
1.2实验动物
吉林大学白求恩医学院动物实验中心提供的清洁级ICR雄性小鼠，生产许可证号：SCXK‑（吉）2007‑0003。饲料由长春市亿斯实验动物技术有限责任公司提供，生产许可证号：SCXK‑（吉）2010‑0001。本实验动物环境设施合格证，吉动设字10‑1005，实验动物使用许可证号：SYXK‑（吉）2010‑0011。选健康雄性小鼠48只，体重18g‑22g，分为4组，每组12只，作为免疫一组，进行肝脏/体重比值测定、半数溶血值（HC₅₀）的测定和抗体生成细胞检测；选健康雄性小鼠48只，体重18g‑22g，分为4组，每组12只，作为免疫二组，进行碳廓清实验；选健康雄性小鼠48只，体重18g‑22g，分为4组，每组12只，作为免疫三组，进行ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验和NK细胞活性测定；选健康雄性小鼠48只，体重18g‑22g，分为4组，每组12只，作为免疫四组，进行迟发型变态反应试验；选健康雄性小鼠48只，体重18g‑22g，分为4组，每组12只，作为免疫五组，进行小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验。
1.3剂量选择与配制
上述实施例1和实施例2制备的组合物胶囊、黄芪提取物C、菊苣提取物D、枸杞子提取物E，1.8g/日，即：1.8g/60kg BW，相当于0.03g/kg BW，以成人摄入量的1、10和30倍设置灌胃剂量，即0.03、0.30、0.90g/kg BW，各剂量组以蒸馏水稀释。以纯水作阴性对照组，各组小鼠灌胃量均为0.2mL/10g BW，连续灌胃30天后测各项免疫指标。
取样品4.50g加纯水至100mL混匀定容即为高剂量组受试物；取样品1.5g加纯水至100mL混匀定容即为中剂量组受试物；取样品0.15g加纯水至100mL混匀定容即为低剂量组受试物。各组受试物新鲜配制，每日灌胃给予受试物一次。
1.4仪器与试剂
电子天平（0.1g）、分析天平、洁净工作台、二氧化碳培养箱、离心机、722分光光度计、恒温水浴、酶标仪、显微镜等；无菌手术器械、游标卡尺（精密度0.02mm）、微量注射器（25μL）、细胞计数器、24孔和96孔平底细胞培养板、96孔U型细胞培养板、玻璃平皿、纱布、试管、玻片架、200目筛网、计时器、血色素吸管、载玻片等；绵羊红细胞（SRBC）、生理盐水、Hank’s液（PH7.2‑7.4）、RPMI1640培养液、小牛血清、青链霉素、刀豆蛋白A（ConA）、1%冰醋酸、1mol/L的HCl溶液、酸性异丙醇（96mL异丙醇加4mL盐酸）、MTT、PBS缓冲液（pH7.2‑7.4）、补体（豚鼠血清）、SA缓冲液、琼脂糖、都氏试剂（碳酸氢钠1.0g，高铁氰化钾0.2g，氰化钾0.05g，加蒸馏水至1000mL）、YAC‑1细胞、乳酸钠、硝基氯化四氮唑、吩嗪二甲酯硫酸盐、氧化型辅酶Ⅰ、0.2mol/L的Tris‑HCl缓冲液（Ph8.2）、1%NP40、印度墨汁、Na₂CO₃、鸡红细胞、甲醇、Giemsa染液等。
1.5实验方法与结果
1.5.1肝脏/体重比值测定
测定方法：小鼠称重后脱臼处死，取脾脏和胸腺，去尽筋膜，用滤纸吸干脏器表明血污，称重，计算脾脏/体重比值和胸腺/体重比值。
结果：
（1）受试物对免疫一组小鼠体重的影响
实施例2制备的组合物胶囊B1对免疫一组小鼠体重的影响见表1：
表1受试物B1对免疫一组小鼠体重影响

由表1.4可见，经统计学处理，经口给予受试物A130天，各剂量组小鼠体重、增重与阴性对照组比较差异无显著性（P＞0.05），即受试物对小鼠体重、增重无明显影响。
实施例1制备的组合物胶囊A1、A2和A3，实施例2制备的组合物胶囊B2和B3，黄芪提取物C，菊苣提取物D，枸杞子提取物E对免疫一组小鼠体重的影响与表1无显著差异。
（2）受试物对免疫二组小鼠体重的影响
实施例2制备的组合物胶囊B1对免疫二组小鼠体重的影响见表2。
表2.受试物B1对免疫二组小鼠体重影响

P值：各实验组与阴性对照组比较
由表2可见，经统计学处理，经口给予受试物B130天，各剂量组小鼠体重、增重与阴性对照组比较差异无显著性（P＞0.05），即受试物对小鼠体重、增重无明显影响。
实施例1制备的组合物胶囊A1、A2和A3，实施例2制备的组合物胶囊B2和B3，黄芪提取物C，菊苣提取物D，枸杞子提取物E对免疫二组小鼠体重的影响与表2无显著差异。
（3）受试物对免疫三组小鼠体重的影响
实施例2制备的组合物胶囊B1对免疫三组小鼠体重的影响见表3。
表3.受试物B1对免疫三组小鼠体重影响

P值：各实验组与阴性对照组比较
由表3可见，经统计学处理，经口给予受试物B130天，各剂量组小鼠体重、增重与阴性对照组间比较差异无显著性（P＞0.05），即受试物对小鼠体重、增重无明显影响。
实施例1制备的组合物胶囊A1、A2和A3，实施例2制备的组合物胶囊B2和B3，黄芪提取物C，菊苣提取物D，枸杞子提取物E对免疫三组小鼠体重的影响与表3无显著差异。
（4）受试物对小鼠脏器/体重比值的影响
实施例2制备的组合物胶囊B1对小鼠脏器/体重比值的影响见表4。
表4.受试物B1对小鼠脏器/体重比值的影响

脾脏/体重比值P1值：各实验组与阴性对照组比较；
胸腺/体重比值P2值：各实验组与阴性对照组比较；
由表4可见，经口给予小鼠不同剂量的受试物B130天，各剂量组脾脏/体重比值和胸腺/体重比值与阴性对照组间比较差异无显著性（P＞0.05），即受试物对小鼠脏器/体重比值无明显影响。
实施例1制备的组合物胶囊A1、A2和A3，实施例2制备的组合物胶囊B2和B3，黄芪提取物C，菊苣提取物D，枸杞子提取物E对小鼠脏器/体重比值的影响与表4无显著差异。
1.5.2迟发型变态反应（足跖增厚法DTH）
测定方法：取羊血，生理盐水洗涤，小鼠用2%（V/V）SRBC腹腔免疫，每只鼠注射0.2mL/只。免疫后4天，测量左后足跖部厚度，测量部位皮下注射20%（V/V）SRBC，20μL/只，注射后24h测量左后足跖部厚度三次，计算平均值。
结果：受试物对小鼠细胞免疫功能的影响
受试物对小鼠体重和迟发型变态反应（DTH）的影响见表5：
表5.受试物对小鼠体重和迟发型变态反应（DTH）的影响


P₁值：各实验组与阴性对照组比较。
P₂值：各实验组与阴性对照比较*P＜0.05
由表5可见，经统计学处理，经口给予受试物B130天，各剂量组小鼠体重、增重与阴性对照组间比较差异无显著性（P＞0.05）；低剂量组足跖肿胀度与阴性对照组比较差异无显著性（P＞0.05），中、高剂量组与阴性对照组间比较差异有显著性（P＜0.05），即中、高剂量的受试物B1能增强小鼠的迟发型变态反应。同时，从表5可见，经口给予受试物A1、A2、A3、B1、B2和B3，小鼠体重、增重以及足跖肿胀度均明显高于经口给予受试物C、D、E的小鼠。
1.5.3ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验（MTT法）
无菌取脾，Hank’s液中将脾磨碎制成单细胞悬液，Hank’s液洗2次，每次离心10min（1000r/min）。将细胞悬浮于1mL的完全培养液，台酚兰染色计数活细胞数（应在95%以上），调整细胞浓度至3×10⁶个/mL。将每份细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1mL，一孔加75μL ConA液（相当于7.5μg/mL），另一孔作为对照，置5%CO237℃CO₂培养箱中培养72h。培养结束前4h，每孔吸去上清液0.7mL不含小牛血清的RPMI1640培养液，同时加入MTT（5mg/mL）50mL/孔，继续培养4h。培养结束后，每孔加入1mL酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解，后定OD_570nm。
结果：
实施例2制备的组合物胶囊B1对ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验的影响见表6。
表6.受试物B1对ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验的影响

P值：各实验组与阴性对照组比较
由表6可见，经口给予小鼠不同剂量的受试物B130天，经统计学处理，各剂量组淋巴细胞的增殖能力与阴性对照组间比较差异无显著性（P＞0.05），即受试物对ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化能力无明显影响。
实施例1制备的组合物胶囊A1、A2和A3，实施例2制备的组合物胶囊B2和B3，黄芪提取物C，菊苣提取物D，枸杞子提取物E对ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化能力与表6无显著差异。
1.5.4抗体生成细胞检测（Jerne改良玻片法）
将羊血放入有玻璃珠的灭菌锥形瓶中，朝一个方向摇动，以脱纤维，4℃冰箱保存备用（可保存2周）。压积SRBC以生理盐水配成2%（V/V）细胞悬液，鼠腹腔注射0.2mL/只。将SRBC免疫4‑5天后的小鼠脱臼处死，取脾，放入Hank’s液，将脾磨碎制成细胞悬液，纱布过滤，Hank’s液洗2次，每次离心（1000r/min）10min，后将脾细胞悬液加入RPMI1640培养液中，计数细胞，细胞浓度调至5×10⁶个/mL。琼脂糖加热溶解后，45‑50℃水浴保温，与等量pH7.2‑7.42倍浓度的Hank’s液混合，分装小试管，每管0.5mL，再向管内加10%（V/V，用SA液配制）压积SRBC 50μL、脾细胞悬液20μL，混匀后倾倒于已刷有琼脂糖薄层的玻片上，做平行片，待琼脂凝固后，将玻片水平扣放在片架上，CO₂培养箱中温育1.5h，后用SA缓冲液稀释的补体（1:8）加入到玻片架凹槽内，继续温育1.5h后，计数溶血空斑数。
结果：受试物对体液免疫的影响
实施例2制备的组合物胶囊B1对抗体生成细胞数的影响结果见表7。
表7.受试物B1对小鼠抗体生成细胞数的影响

P值：各实验组与阴性对照组比较
由表7可见，经口给予小鼠不同剂量的受试物B130天，经统计学处理，各剂量组抗体生成细胞数与阴性对照比较差异无显著性（P＞0.05），即受试物对小鼠的抗体生成细胞数无明显影响。
实施例1制备的组合物胶囊A1、A2和A3，实施例2制备的组合物胶囊B2和B3，黄芪提取物C，菊苣提取物D，枸杞子提取物E对ConA诱导的小鼠的抗体生成细胞数与表7无显著差异。
1.5.5半数溶血值（HC₅₀）的测定
取羊血，生理盐水洗涤3次，每次离心（2000r/min）10min，腹腔注射2%（V/V，生理盐水配制）压积SRBC 0.2mL/只进行免疫。4天后，取血于离心管，放置约1h，将凝固血于管壁剥离，使血清充分析出，2000r/min离心10min，收集血清。用SA缓冲液将血清稀释（400倍），稀释后的血清1mL置试管内，依次加入10%（V/V）SRBC 0.5mL，补体1mL（用SA缓冲液按1:8稀释）。另设不加血清的对照管（以SA缓冲液代替）。37℃恒温水浴中保温15‑30min，冰浴终止反应。2000r/min离心10min，取上清1mL，加都氏试剂3mL。同时取10%（V/V）SRBC 0.25mL，加都氏试剂4mL，充分混匀，放置10min后，以对照作空白，分别测定各管OD_540nm，溶血素的量以半数溶血值（HC₅₀）表示，计算：
HC₅₀=样品光密度值/SRBC半数溶血时的光密度值×稀释倍数
结果：受试物对小鼠半数溶血值（HC₅₀）的影响
实施例2制备的组合物胶囊B1对小鼠半数溶血值（HC₅₀）的影响见表8。
表8.受试物对小鼠半数溶血值（HC₅₀）的影响

P值：各实验组与阴性对照组比较
由表8可见，经口给予小鼠不同剂量的受试物B130天，经统计学处理，各剂量组半数溶血值与阴性对照组间比较差异无显著性（P＞0.05），即受试物B1对小鼠半数溶血值无明显影响。
实施例1制备的组合物胶囊A1、A2和A3，实施例2制备的组合物胶囊B2和B3，黄芪提取物C，菊苣提取物D，枸杞子提取物E对ConA诱导的小鼠的抗体生成细胞数与表7无显著差异。
1.5.6小鼠碳廓清实验
小鼠尾静脉注射1:4倍稀释的印度墨汁，立即计时，注入墨汁后2、10min，分别从内眦静脉丛取血20μL，并立刻将其加到2mL 0.1%Na₂CO₃溶液中，以Na₂CO₃为对照，测定OD_600nm。处死小鼠，取肝脏和脾脏，称重。计算吞噬指数a：
k=(lgOD1‑lgOD2)/(t2‑t1)
结果：
受试物对小鼠单核‑巨噬细胞碳廓清功能的影响见表9。
表9.受试物对小鼠单核‑巨噬细胞碳廓清功能的影响

P值：各实验组与阴性对照组比较*P＜0.05。
由表9可见，经口给予小鼠不同剂量的受试物B130天，经统计学处理，低剂量组碳廓清功能与阴性对照组比较差异无显著性（P＞0.05），中、高剂量组与阴性对照组比较差异有显著性（P＜0.05），即中、高剂量组受试物B1能提高小鼠单核‑巨噬细胞碳廓清能力。同时，从表9可见，受试物A1、A2、A3、B1、B2和B3对提高小鼠单核‑巨噬细胞碳廓清功能明显好于受试物C、D和E；受试物B1、B2和B3对提高小鼠单核‑巨噬细胞碳廓清功能明显好于受试物A1、A2和A3。
1.5.7小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验
小鼠腹腔注射20%（V/V用生理盐水配制）压积鸡红细胞（2000r/min，10min）悬液1mL，间隔30min，脱臼处死，取腹腔巨噬细胞洗液1mL，滴于载玻片上，37℃孵箱温育20min，生理盐水中漂洗，以除去未贴片细胞。晾干，甲醇固定，4%（V/V）Giemsa‑磷酸缓冲液染色，蒸馏水漂洗晾干。油镜下计数，每片计数100个巨噬细胞，计算吞噬率和吞噬指数：
吞噬率%=吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/计数的巨噬细胞数×100
吞噬指数=被吞噬的鸡红细胞总数/计数的巨噬细胞数
结果：
实施例2制备的组合物胶囊B1对小鼠体重和巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力的影响见表10。
表10.受试物对小鼠体重和巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力的影响

P₁值：各实验组与阴性对照组比较
吞噬率（%）P₂值：各实验组与阴性对照组比较
吞噬指数P₃值：各实验组与阴性对照组比较
由表10可见，经统计学处理，经口给予受试物30天，各剂量组小鼠体重、增重与阴性对照组比较差异无显著性（P＞0.05）；各剂量组吞噬率与阴性对照组比较差异无显著性（P＞0.05）；各剂量组吞噬指数与阴性对照组比较差异无显著性（P＞0.05），即受试物对小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力无明显影响。
实施例1制备的组合物胶囊A1、A2和A3，实施例2制备的组合物胶囊B2和B3，黄芪提取物C，菊苣提取物D，枸杞子提取物E对ConA诱导的小鼠的抗体生成细胞数与表10无显著差异。
1.5.8NK细胞活性测定（乳酸脱氢酶LDH测定法）
实验前24h传代培养靶细胞YAC‑1，应用前以Hank’s液洗3次，含10%小牛血清的RPMI1640完全培养液调整细胞浓度至4×10⁵个/mL。受试小鼠脱臼处死，取脾脏，制成脾细胞悬液，Hank’s液洗3次，每次1500r/min离心10min，用2mL含10%小牛血清的RPMI1640完全培养液重悬，台酚兰染色计数（活细胞数应在95%以上），调整细胞浓度至2×10⁷个/mL，使效靶比为50:1。取靶细胞和效应细胞各100μL，加入U形96孔培养板中；靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液个100μL，靶细胞最大释放孔加靶细胞和1%NP40各100μL；上述各项均设三个平行孔，37℃，5%CO₂培养箱中培养4h，将96孔板以1500r/min离心5min，每孔吸取上清100μL置酶标板中，加入LDH基质液100μL，反应10min，然后每孔加入1mol的HCl溶液30μL终止反应，测定OD_490nm，计算NK活性：
NK细胞活性%=（反应孔OD–自然释放孔OD）/（最大释放孔OD‑自然释放孔OD）×100%
LDH基质液的配制：乳酸钠5×10^‑2mol/L
硝基氯化四氮唑6.6×10^‑4mol/L
吩嗪二甲酯硫酸盐2.8×10^‑4mol/L
氧化型辅酶Ⅰ1.3×10^‑3mol/L
将上述试剂溶于0.2mol/L的Tris‑HCl缓冲液中（pH8.2）。
结果：
实施例2制备的组合物胶囊B1对小鼠NK细胞活性的影响见表11。
表11.受试物对小鼠NK细胞活性的影响

P值：各实验组与阴性对照组比较
由表11可见，经口给予小鼠不同剂量的受试物B130天，经统计学处理，各剂量NK细胞活性与阴性对照组比较差异无显著性（P＞0.05），即受试物对小鼠NK细胞活性无明显影响。
实施例1制备的组合物胶囊A1、A2和A3，实施例2制备的组合物胶囊B2和B3，黄芪提取物C，菊苣提取物D，枸杞子提取物E对ConA诱导的小鼠的抗体生成细胞数与表10无显著差异。
2.小结
经口给予小鼠不同剂量的受试物30天，能增强小鼠迟发型变态反应，即能增强细胞免疫功能；能提高小鼠单核‑巨噬细胞的碳廓清能力，即能增强单核‑巨噬细胞功能；对小鼠半数溶血值、小鼠抗体生成细胞数、小鼠的体重增长、脏器/体重比值、小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力、ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化能力、NK细胞活性无影响。由此判定，本发明实施例1制备的组合物A1、A2和A3和实施例2制备的组合物B1、B2和B3具有增强免疫力功能作用，且明显好于受试物C、D和E。
以上数据采用SPSS11.5统计软件中单因素方差分析进行均值比较，方差齐时，各组间两两比较用LSD法；方差不齐时，各组间两两比较采用Tamhane法。
实施例4、本发明的增强免疫力组合物的毒理学评价
1.急性毒性（经口LD₅₀）试验
目的：测定LD₅₀，了解受试物的毒性强度、性质和可能得靶器官，为进一步进行毒性试验的剂量和毒性观察指标的选择提供依据，并根据LD₅₀进行毒性分级。
1.1材料和方法
1.1.1样品：上述实施例制备的组合物胶囊，以胶囊内容物为受试物。
1.1.2剂量设置及受试物配制：试验设21.50、10.00、4.64、2.15g/kg BW四个剂量组，分别取26.88g、12.50g、5.80g、2.69g受试物溶于蒸馏水至500mL容量瓶混匀定容，采用经口灌胃方式给予受试物，各剂量组灌胃量为0.4mL/10g BW。
1.1.3实验动物：清洁级ICR小白鼠40只，雌、雄各半，体重：18.0‑22.0g，由吉林大学白求恩医学院动物实验中心提供，生产许可证号：SCXK‑（吉）2007‑0003，小鼠饲料由长春市亿斯实验动物技术有限责任公司提供，生产许可证号：SCXK‑（吉）2010‑0001，本清洁级实验动物环境设施合格证，吉动设字10‑1005，实验动物使用许可证号：SYXK‑（吉）2010‑0011。
1.1.4试验条件：饲养温度20℃‑22℃，相对湿度55%‑65%。
1.1.5主要仪器：德国产Sartorius‑BL610电子天平（d=0.1g）；美国产ELECTRONIC SCALET1000电子天平（d=0.1g）。
1.1.6试验方法：采用霍恩氏法。
1.1.6.1将小鼠禁食16h（当日16点30分至次日8点30分），不限制饮水，按体重要求选用雌、雄小鼠各20只，称重、染号、随机分为四个剂量组，每组10只，雌、雄各半。
1.1.6.2灌胃后观察14天，主要观察小鼠的中枢神经系统及躯体运动有无改变姿势、叫声异常、运动失调等；自主神经有无瞳孔放大或缩小、流涎、流泪等，呼吸系统有无流鼻涕、潮式呼吸等；胃肠系统有无气胀，腹泻或便秘等。并记录出现中毒症状的时间。如果动物有死亡，记录死亡数、死亡时间，对死亡动物做大体解剖，并在第14天称量体重，计算增重。
1.2试验结果：
表1‑1.小鼠急性毒性试验结果

1.2.1主要症状表现：试验期间各组动物，未见中毒症状、死亡数为零。
1.2.2半数致死量，雌、雄小鼠：LD₅₀＞21.5g/kg BW。
1.3试验结论：根据急性毒性半数致死剂量分级，该样品属无毒级。
2.微核试验
目的：对受试物的遗传毒性及是否具有潜在致突变性进行筛选。
2.1材料和方法
2.1.1样品：上述实施例1制备的组合物胶囊，以胶囊内容物为受试物。
2.1.2剂量设置及受试物配制：试验设10.0、5.0、2.5g/kg BW三个剂量组，分别取25.0g、12.5g、6.3g受试物溶于蒸馏水至50mL容量瓶混匀定容，另设阴性对照（蒸馏水）、阳性对照组（环磷酰胺40mg/kg BW：取200mg环磷酰胺加入生理盐水至10mL充分混匀稀释10倍），采用间隔24h两次经口灌胃法进行试验，各组每次灌胃量为0.2mL/10g BW。
2.1.3实验动物：清洁级ICR小白鼠50只，雌、雄各半，体重：25.0‑30.0g，由吉林大学白求恩医学院动物实验中心提供，生产许可证号：SCXK‑（吉）2007‑0003，小鼠饲料由长春市亿斯实验动物技术有限责任公司提供，生产许可证号：SCXK‑（吉）2010‑0001，本清洁级实验动物环境设施合格证，吉动设字10‑1005，实验动物使用许可证号：SYXK‑（吉）2010‑0011。
2.1.4试验条件：饲养温度20℃‑22℃，相对湿度55%‑65%。
2.1.5主要仪器：德国产Sartorius‑BL610电子天平（d=0.1g）；美国产ELECTRONIC SCALET1000电子天平（d=0.1g）；日本产Olympus‑CH显微镜。
2.1.6试验方法
2.1.6.1按体重要求选用雌、雄小鼠各25只，称重，染号随机分为5个剂量组，每组10只，雌、雄各半。
2.1.6.2于第二次灌胃后6h，颈椎脱臼处死小鼠，取股骨以小牛血清稀释涂片，甲醇固定，Giemsa染色。在光学显微镜下，每只动物计数1000个嗜多染红细胞（PCE），微核发生率以含微核的嗜多染红细胞（PCE）千分率计，每只动物记数200个嗜多染红细胞（PCE），计算嗜多染红细胞（PCE）与成熟红细胞（NCE）比值，并进行统计分析。
2.2试验结果
表2‑1.小鼠骨髓PCE微核试验结果

经卡方检验，与阴性对照组比较，阳性对照组微核率有高度显著性差异（P＜0.01），各剂量组微核率无显著性差异（P＞0.05）；经方差分析，各组动物PCE/NCE值无显著性差异（P＞0.05）。
2.3试验结论：该样品骨髓细胞微核试验结果为阴性，各组动物未见细胞毒性作用。
3.精子畸形试验
目的：对受试物的遗传毒性及其是否具有潜在致突变性进行筛选。
3.1材料和方法
3.1.1样品：上述实施例1制备的组合物胶囊，以胶囊内容物为受试物。
3.1.2剂量设置及受试物配制：试验设10.0、5.0、2.5g/kg BW三个剂量组，分别取25.0g、12.5g、6.3g受试物溶于蒸馏水至50mL容量瓶混匀定容，另设阴性对照（蒸馏水）、阳性对照组（环磷酰胺40mg/kg BW：取200mg环磷酰胺加入生理盐水至10mL充分混匀稀释10倍），采用经口灌胃方式给予受试物，每日灌胃一次，连续5d。各组每次灌胃量为0.2mL/10g BW。
3.1.3实验动物：清洁级ICR小白鼠25只，雄性，体重：25.0‑30.0g，由吉林大学白求恩医学院动物实验中心提供，生产许可证号：SCXK‑（吉）2007‑0003，小鼠饲料由长春市亿斯实验动物技术有限责任公司提供，生产许可证号：SCXK‑（吉）2010‑0001，本清洁级实验动物环境设施合格证，吉动设字10‑1005，实验动物使用许可证号：SYXK‑（吉）2010‑0011。
3.1.4试验条件：饲养温度20℃‑22℃，相对湿度55%‑65%。
3.1.5主要仪器：德国产Sartorius‑BL610电子天平（d=0.1g）；美国产ELECTRONIC SCALET1000电子天平（d=0.1g）；日本产Olympus‑CH显微镜。
3.1.6试验方法
3.1.6.1按体重要求选用雄性小鼠各25只，称重，染号随机分为5个剂量组，每组5只。
3.1.6.2末次灌胃后第30d处死小鼠，取附睾制片，伊红染色，每组计数5只动物，每只动物计数1000个结构完整的精子，计算畸变精子发生率，并进行统计分析。
3.2试验结果
表3‑1.小鼠精子畸形试验结果

经Wilconson秩合检验，与阴性对照组比较，各剂量组精子畸形率与阴性对照组比较无显著性差异（P＞0.05），阳性对照组精子畸形率有高度显著性差异（P＜0.01）。
3.3试验结论：该样品精子畸形试验结果为阴性。
4.Ames试验：
目的：检测样品的诱变性，从而评价其致突变作用的可能性。
4.1样品：上述实施例1制备的组合物胶囊，以胶囊内容物为受试物。
4.2溶剂：蒸馏水。
4.3剂量设置及受试物配制：试验设5000、1000、200、40、8μg/皿5个受试物剂量，取2.5g受试物加蒸馏水至50mL混匀即为5000μg/皿剂量，其余各受试物剂量1/5倍比递减稀释：上述受试液经灭菌（时间20min，温度：121℃，压力：0.103Mpa）后使用；另设未处理对照、溶剂对照、阳性对照。
4.4主要仪器设备：
YXQ‑LS‑50G型立式压力蒸汽灭菌仪，上海博迅实业有限公司医疗设备厂产。
FSH‑Ⅱ型匀浆器，江苏金坊金城国胜实验器械厂产。
DH‑500A型电热恒温培养箱，上海基玮试验仪器设备有限公司产。
DK‑600型电热恒温水浴箱，上海基玮试验仪器设备有限公司产。
METTLER TOLEDO‑AB204‑N分析天平，上海产。
4.5测试菌株：采用四株鼠伤寒沙门氏突变型菌株TA97、TA98、TA100、TA102为本实验室鉴定、冻存，生物学性状符合菌株要求。测试菌液浓度每毫升不少于1×10⁹活菌数。
4.6S₉活性鉴定：采用多氯联苯（PCB）诱导的大鼠肝匀浆作为体外代谢活化系统。S₉制成后，经无菌检查，测定蛋白含量（Lowry法），每毫升蛋白含量不超过40mg为宜，并经间接致癌物（1,8‑二羟基蒽醌50.0μg/皿及二氨基芴10.0μg/皿）鉴定其生物活性合格后储存于深低温或冰冻干燥，保存期不超过一年。
4.7阳性对照：非活化系统TA97、TA98、TA102为敌克松50.0μg/皿，TA100为叠氮钠1.5μg/皿。活化系统TA97、TA98、TA100采用二氨基芴10.0μg/皿，TA102为1,8‑二羟基蒽醌50.0μg/皿。
4.8测试方法：在顶层琼脂中加入0.1mL受试物溶液，代谢活化时加入0.5mL S₉混合液，混匀后倒入底层培养基平板上。在37℃培养48h，计数每皿回变菌落数。如果受试物的回变菌落数是自发回变菌落数2倍以上，并具有剂量‑反应关系者则定为阳性。每个剂量做三个平行。整套试验在相同条件下重复做两次并分别统计。
4.9第一次试验测试结果：
表4‑1.第一次Ames试验结果

4.10第二次试验结果
表4‑2.第二次Ames试验结果

4.11结论：本实验条件下，样品Ames试验结果为阴性。
5.30天喂养试验
目的：在急性毒性试验的基础上，通过30天喂养试验，进一步了解其毒性作用，观察对生长发育的影响，并可初步估计最大未观察到有害作用剂量。
5.1样品：上述实施例1制备的组合物胶囊，以胶囊内容物为受试物。
5.2实验动物：
5.2.1来源：由吉林大学白求恩医学院动物实验中心提供的清洁级动物。
5.2.2品系：清洁级Wistar大白鼠，雌雄各40只，批准证号：SCXK‑（吉）‑2007‑0003。
5.2.3试验始重：66.4g‑82.3g。
5.2.4饲养条件：本实验动物环境设施合格证，吉动设字10‑1005，实验动物使用许可证号：SYXK‑（吉）2010‑0010；温度20℃‑22℃、湿度55%‑65%；饲料由长春市亿斯实验动物技术有限责任公司提供，合格证号：SCXK‑（吉）2010‑0001。
5.3试验方法：动物购入后饲养3天，随机分为对照组及三个受试物组，每组雌雄各10只。人体推荐成品量每日2次，每次2粒，0.45g/粒，即1.8/60kg BW，相当于0.03g/kg BW。最高剂量组为A组以成人日摄入量的100倍计，即3.00g/kg BW，B组2.25g/kg BW相当于成人摄入量75倍，C组1.50g/kg BW，相当于成人摄入量的50倍。将高、中、低三个试验组受试物均匀掺入基础饲料中（采用逐渐扩大、充分混匀、反复过筛的方法），含量依次为3.00%、2.25%、1.50%。对照组喂饲基础饲料。大鼠饲料摄入量按体重10%计算，单笼喂养，自由饮食，记录大鼠进食量、体重，连续观察30d。
5.4观察指标：
5.4.1一般情况观察：动物的一般表现、行为、中毒症状及死亡情况，每周称一次体重、两次摄入量，计算食物周利用率及总利用率。
5.4.2血液学指标及血液生化指标：于试验第31天用1%戊巴比妥钠生理盐水溶液，按5mL/kg BW腹腔注射麻醉后，下腔静脉采血（采血前16h禁食），用日本产SYSMEX‑XT1800i进行血液学指标检测，采用深圳迈瑞生物有限公司提供的试剂盒，日本东芝TBA‑120FR型自动生化分析仪测定血液生化指标：谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、尿素（BUN）、肌酐（Cr）、血糖（Glu）、总蛋白（TP）、白蛋白（Alb）、胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）。以上数据均采用SPSS11.5进行方差分析。
5.4.3病理检查：大体解剖、脏器绝对重量（脏/体比值）、组织病理检查（肝、肾、脾、胃、十二指肠、睾丸或卵巢）。
5.5试验结果：
5.5.1对大鼠体重的影响：
表5‑1受试物对大鼠体重的影响

由表5‑1可见，各组动物生长活动正常。各剂量组动物体重与对照组比较，差异无显著性（P＞0.05）。
5.5.2对大鼠食物利用率的影响：
表5‑2受试物对大鼠各周进食量及食物利用率的影响

由表5‑2可见给予受试物后，动物未出现拒食现象，各剂量组动物周食物利用率与对照组比较差异无显著性（P＞0.05）。
表5‑3受试物对大鼠总食物利用率的影响

由表5‑3可见各剂量组大鼠增重、总进食量、与对照组比较差异无显著性（P＞0.05）。5.5.3血液学指标检查结果
表5‑4受试物对大鼠血液的影响

由表5‑4可见，各剂量组的血红蛋白（HGB）、红细胞（RBC）、白细胞（WBC）与对照组比较差异无显著性（P＞0.05）。
表5‑5受试物对大鼠白细胞分类的影响

由表5‑5可见，各剂量组的白细胞分类与对照组比较差异无显著性（P＞0.05）。
5.5.430天喂养试验血液生化指标检验结果：
表5‑6受试物对大鼠生化的影响

由表5‑6可见，各剂量组的谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、尿素（BUN）、肌酐（Cr）、血糖（Glu）、总蛋白（TP）、白蛋白（Alb）、胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）与对照组比较差异无显著性（P＞0.05）。
5.5.5受试物对大鼠脏器重量及脏体比的影响：
表5‑7受试物对大鼠脏体比的影响

由表5‑7可见，各剂量组与对照组比较差异无显著性（P＞0.05）。
5.5.6病理组织学检查
三个剂量组（分别为人体摄入量的100、75、50倍）与对照组雌性动物与雄性动物在实验期内毛发光泽、粘膜红润，活动自如，排泄物无异常，各组间动物体重无明显差异。
大体剖检观察各组实验动物脏器未见异常改变。高剂量组与对照组试验雌、雄各20只动物的肝、脾、肾、胃、十二指肠、性腺（睾丸或卵巢）经病理学检查均未见与受试物无关的病理改变，故对中、低剂量组动物未作组织病理学检查。结果如下：
表5‑8受试物30天喂养试验肝脏病理学检查结果

表5‑9受试物30天喂养试验脾脏病理学检查结果

表5‑10受试物30天喂养试验肾脏病理学检查结果

表5‑11受试物30天喂养试验胃及十二指肠病理学检查结果

表5‑12受试物30天喂养试验睾丸病理学检查结果

表5‑13受试物30天喂养试验卵巢病理学检查结果

肝脏：呈暗红色，质软，表面光滑、平整，未见隆起及包块。镜下所见：对照组雌性3例，雄性2例，高剂量组雌性2例，雄性3例可见肝小叶炎细胞浸润；其余被摸完整，未见增厚，肝小叶结构清晰，肝细胞索、肝窦排列整齐规则。肝细胞胞浆红染，核居中，未见脂肪变性、出血和坏死改变。汇管区三管结构清楚可见，无明显异常病理改变。其余肝组织结构高剂量组与对照组无明显差异。
脾：镜下所见：可清楚看到脾脏实质的红髓、白髓及边缘区三部分，被膜及脾小梁未见纤维结缔组织增生，淋巴滤泡未见反应性增生，余无特别，为正常脾脏结构。高剂量组脾脏结构域对照组相似。
肾脏：双侧肾脏等大似豆形，表面光滑平整，未见明显增大与缩小。镜下观察：肾被膜光滑，肾小球在切片上呈圆形，肾皮质区肾小球未见明显增大或萎缩、纤维化、变性等，毛细血管袢未见坏死，肾小球毛细血管未见扩张充血、管壁未见增厚。小管上皮完好，间质无炎细胞浸润，为正常肾脏组织结构。其余动物肾脏一般结构均未发现异常改变。
胃：镜下主要观察胃粘膜。对照组雄性2例，高剂量组雌性2例，可见胃固有层内少量嗜酸粒细胞浸润，余为正常胃粘膜结构。胃壁可见四层结构，其中粘膜层最厚，上皮完好，胃体腺壁细胞、主细胞、颈粘液细胞、未分化细胞均清晰可见。壁细胞呈圆形或三角形，多为单核，胞浆嗜酸性。主细胞呈柱状，胞浆嗜碱性。胃体粘膜各层未见炎细胞浸润。胃底部主细胞、壁细胞清楚，其余胃粘膜结构高剂量组与对照组无明显差异。
十二指肠：镜下主要观察粘膜，粘膜表面可见大小不一的肠粘膜，呈叶片状，粘膜上皮呈高柱状，可见十二指肠肠腺，各层结构的细胞未见异常，为正常十二指肠组织结构，高剂量组的十二指肠粘膜与对照组无明显差异。
睾丸：镜下观察：曲细精管结构清晰，各级生精细胞形态正常，精子细胞清晰可见，支持细胞未见异常。睾丸间质未见出血、坏死、钙化或精子肉芽肿形成。曲细精管内可见精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞和精子，为正常睾丸组织结构。高剂量组的睾丸结构域对照组相似，未见异常。
卵巢：镜下观察：卵巢表面为扁平或立方细胞，皮质层内可见许多发育不同阶段的卵泡，卵泡间为结缔组织，髓质间由结缔组织组成，含较多细管，高剂量组与对照组的卵巢形态相似。
5.7小结：
该受试物经口给予大鼠30天，对血常规、血生化指标、脏器重量、脏器系数及体重、增重、进食量、食物利用率等各项指标均未见不良影响。病理组织学观察，肝、脾、肾、胃、十二指肠、睾丸、卵巢均未见有意义的病理改变。